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Tacna 20/12/96
CONFIRMACION DEL DIAGNOSTICO DE VIH EN EL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA VIH/SIDA/INS PERU 1988-2009
MUESTRAS CONFIRMADAS
1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 7 201 239 479 838 594 895 1050 1524 2134 TOTAL CONFIRMADOS *hasta 11 de Septiembre |2009
AO
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009
MUESTRAS CONFIRMADAS
2305 2416 2899 3639 2932 3014 3585 4560 4325 4210 4679 *5378 45124
IMPLEMENTACION DE UN SISTEMA DESCENTRALIZADO DE EVALUACION Y MONITOREO DE LABORATORIO PARA PERSONAS VIVIENDO CON VIH/SIDA EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL PERIODO 2004 - 2009
OBJETIVO GENERAL Implementar un sistema descentralizado para evaluacin y monitoreo por laboratorio de la terapia antiretroviral que utilice tcnicas validadas y desarrolladas de acuerdo a los niveles de complejidad, equipamiento de los laboratorios y recursos disponibles, que favorezca el acceso nacional de las PVVIH a la terapia y se constituya en un eje importante de integracin intersectorial.
Fases de la implementacion
Evaluar validez de la prueba 1 en el pais 2 Capacitacion de profesionales del INS 3 Seleccion de los laboratorios regionales 4 Coordinaciones y supervision de las DISAS Capacitacion en servicio de profesionales de las DISAS
Organizacion del sistema en cada DISA y capacitacion de los equipos locales
5 6 7 8
LABORATORIO DE LA RED
Jurisdiccin
TOTAL PVVIH
Cobertura
Macro region del Norte: SEDE LAMBAYEQUE Centro de Investigacin: Loreto Macro region del Sur: SEDE TACNA Laboratori os referencial es regionales de Lima
Laboratorio regional Lima Ciudad Laboratorio regional Lima norte
439
35
474
6.7
225 Arequipa,Puno, Cusco, Tacna, Moquegua PVVIH del Hospital Dos de Mayo, INEN y Loayza PVVIH del Hospital Cayetano, Ser.Bernales, Hospital de Huacho Ica,Ayacucho, Junin, Pasco, Apurimac, Huanuco, Ancash, Huancavelica y el resto de Hospitales de Lima(Lima Sur, Este y Callao)
14
239
3.4 3 34.2
186
17
203
2456
2456
1380
1380
19.4
784
55
1329
200
2368
33.3
1634
121
5165
200
7120
100%
SISTEMA NACIO NAL DE LABORATO RIOS P ARA EL MONITO REO DE PACIENTES CO N VIH S IDA EN TERAP IA ANTIRETROVIRAL: MO DELO MACRO REGIONALDEL P ERU
IQUITOS 5%
Laboratorios pblic os proces adores de recuento de CD4: -Lima Ciudad -Lima Norte -Lambayeque (sede norte) -T ac na (s ede sur)
LAMBAYEQUE 7% LIMA NORTE 20%
Mac ro regin Norte: T umbes, Piura, Lambayeque, Cajamarca, La Libertad, Amazonas y San Martin.
3 1 1
Ins tituto Nacional de Salud dirige el sistema nacional de monitoreo para la terapia ARV : procesa CD4 para las regiones no descentralizadas y el 100% de las pruebas carga viral de todo el pais.
SISTEMA NACIONAL DE LABORATORIOS PARA EL MONITOREO DE PACIENTES CON VIH S IDA EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL: II FASE DE DESCENTRALIZACION IMPLEM ENTACION DE M ETODO ALTERNATIVO PARA CD4 EN CINCO REGIONES
11 Lab oratori os pb licos procesa dores d e recue nto de CD4: -Lima Ci uda d -Lima Norte -Lima Sur (pi loto nu evo metodo) -Lambay equ e (sede n orte) -Tacna (sede sur) -Loreto -Ucayal i -Madre de D ios -San Martin -Ayacuah o LAMBAYEQUE 7% LIMA NORTE 20% PERUVIAN NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH 35% Instituto Nacion al de Salud d irig e el sistema nacio nal d e monitor eo para la tera pia ARV : procesa C D4 par a las regio nes no descentra liza das y el 100% d e las pru ebas carga vira l Lima Sur Ucayal i San Martin IQUITOS 5%
Areas de mayor prevalencia de VIH: Loreto (Iquitos), Lima and Callao. Macro regin Norte: T umbes, Piura, Lambayeque, Cajamarca, La Libertad, Amazonas y San Martin.
3 1 1
Madre de D ios
Macro region Sur: T acna, Arequipa, Cusco, Moquegua y Puno. Regiones que dependen directamente del INS.
TACNA 3%
SISTEMA NACIONAL DE LABORATORIOS PARA EL MONITOREO DE PACIENTES CON VIH SIDA EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL: I Y II Y III FASE DE DESCENTRALIZACION
-Lima Ciudad -Lima Norte -Lima ESTE metodo) -Lambayeque (sede norte) -Tacna (sede sur) -Loreto -Ucayali -Madre de Dios -San Martin LAMBAYEQUE 7% LIMA NORTE 12% Huancavelica INSTITUTO NACIONAL Lima DE Ciudad SALUD 58% CALLAO Huanuco Pasco Ucayali
Macro regin Norte: Tumbes, Piura, Lambayeque, Cajamarca, La Libertad, Amazonas y San Martin.
3 1 1
Macro region Sur: Tacna, Arequipa, Cusco, Moquegua y Puno. Macro Region Centro : Huanuco, Pasco, Junin, Huancavelica Regiones que dependen directamente del INS.
MACRO CENTRO-JUNIN
Instituto Nacional de Salud dirige el sistema nacional de monitoreo para la terapia ARV : procesa CD4 para las regiones no descentralizadas y el 100% de las pruebas carga viral
Ayacuaho
ICA
20% Ayacucho TACNA 3%
tat : regulador de expresin vira rev:regulador expresin mRNA vif:incrementa la infectividad viral vpr:replicacin viral vpu (VIH-1) : liberacin viral Vpx(VIH-2) : infectividad viral nef:regulador inmunolgico
Targets of Antivirals
V I H
Africa central
SUBTIPO
Norte y Sur Amrica,Europa,Asia,Oceana Sur y Este de Africa Africa Central Tailandia,Africa Central,Sur-Este Asia Africa central,Brasil,Rumana Africa Central,Taiwan,Rusia Africa Central. Camern, Gabn
VIH-2
Africa Occidental,Francia,India
PATHOGENESIS
Progression to AIDS
PRUEBAS DE MONITOREO
La citometra de flujo es una tecnologa que permite la medicin simultanea de mltiples caractersticas fsicas y qumicas de las clulas en suspensin
Data Analysis
Teido de las muestras con perlas de referencia Celulas T marcadas con Ac CD3
Side Scatter
400
600
Monocitos
200
Linfocitos
0
0
200
400
600
800 1000
COMPONENTES
Sistema de Fluidos Sistema ptico: - Fuente de luz - Separacin espectral Sistema Electrnico: - Control electrnico de luz y detectores - Coleccin y anlisis de pulsos Sistema Informtico: - Anlisis y presentacin de datos
Fluorescencia
1. El fluorocromo absorve energia del laser incidente 2.El fluorocromo libera energa absorvida: -Vibrando y emitiendo color - Emitiendo fotones de una longitud de onda mayor (fluorescencia) Fluorocromos utilizados: - Fluoresceina (FITC) - Phycoeritrina (PE) - Alophycocianina (APC)
10 1
CD8 PE
10 2
10 10 3 4
10 1
CD3 APC
CD8 PE
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
10
10 0
10 1
CD4 FITC
10 2
10
10 3
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
10 4
10
10 1
10 2
10 3
10 4
CD3 APC
BD FACSCount System
Sumario:
El BD Facscount mide rapidamente caractersticas mltiples fluorescentes de una clula o partcula. El sistema de fluidos , opticos , y electrnicos trabajan juntos para proveer informacin acerca de las caractersticas fluorescentes de poblaciones mliples. Los datos del paciente son automticamente analizadas y reportadas en la impresora.
PCR Cuantitativo
Aplicaciones clnicas
Pronstico: El nivel de Carga Viral correlaciona directamente con el tiempo de progresin a SIDA y de supervivencia del paciente Control de la terapia: Fluctuaciones significativas de la Carga viral permiten determinar si el tratamiento es uso esta siendo efectivo Desarrollo de nuevas terapias: Usado en los estudios clnicos para evaluar drogas potenciales anti-VIH
and OR and
2 +
Mix, Incubate 10 @ RT
400 L 50L
Specimen Diluent
Resuspend Pellet
HIV Copias/ ml =
Copias QS
4 0
NASBA - Nuclisens
Kits NucliSens
Deteccin ECL
R u++
Magnetic Particle
RN A amplicon
Ele ctrod e
R u++
Deteccin
Deteccin de la fluorescencia se realiza en cada ciclo. Pero se muestra al final de la reaccin de PCR.
Anlisis de la data
q Los resultados de fluorescencia son analizados mediante un software que elimina el background y normaliza los valores . Existen softwares ms complejos que brindan opciones adicionales.
Extensi n
Polymerase & dNTPs
Amplificacin
cDNA
Primers
Transcripcin Reversa
Denaturaci n
Tubo de Reaccin
PCR en tiempo real permite identificar los productos en la fase exponencial Es sensible y cuantitativa Es un proceso homogneo, que no requiere proceso de deteccin, reduciendo el tiempo total de la reaccin de PCR Amplio rango dinmico de deteccin. Permite la trazabilidad de las muestras y reactivos. Versatilidad de aplicaciones en todas las reas de la medicina clnica y la industria Nos dirigimos hacia la automatizacin total.
El propsito del tratamiento es reducir la carga viral a niveles indetectables tanto como sea posible
INFECCION ASINTOMTICA:
201- 350 CD4+ T Cells/mm3 : RIESGO DE PROGRESION 38.5% 350 CD4+ T Cells/mm3 : RIESGO DE PROGRESION 14.3 % CARGA VIRAL : < 20000 COPIAS/mL : RIESGO DE PROGRESION 4.1% >20000 55000 COPIAS/mL : RIESGO DE PROGRESION 36.4% >55000 : RIESGO DE PROGRESION 64.4%
GUIDELINES FOR THE USE OF ANTIRETROVIRAL AGENTS IN HIV-1-INFECTED ADULTS AND ADOLESCENTS; 2003 NIH A. Martinez-Lab Virologa-CEMIC
Tamao y duracin de la disminucin Indetectable no significa que el virus es eliminado-el nivel del virus es menor que la sensibilidad del test Ejm. CV 10,000 copias/ml = 104 copias/ml = 4 logs Un cambio de 2-veces es 0.3 log
RECOMENDACIONES
Ensayos no deben realizarse despus de un mes de vacunados o de un proceso infeccioso agudo (vacunas contra la gripe, hepatitis provocan aumento de carga viral)
Evaluacin de la correlacin de Carga viral para VIH-1 mediante las tcnicas de PCR Amplicor HIV-1 Monitor V. 1.5 y carga viral por Tiempo Real COBAS TaqMan HIV-1 en el Laboratorio de Referencia Nacional de VIH/SIDA del Instituto Nacional de Salud-Per Ada Valverde R1. ,Fany Crdenas B1.,Soledad Romero R1.,John Caldern E1.,Gabriela Salinas C1., Flor Urcia A1. 1Laboratorio de Referencia Nacional de VIH/SIDA-Instituto Nacional de Salud (Per) RESUMEN Antecedentes: Determinar el nivel de correlacin de la carga viral para VIH-1 mediante las tcnicas Amplicor HIV-1 Monitor Versin Estndar y carga viral Tiempo Real COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan HIV-1 Mtodo: Se seleccionaron 152 muestras de plasma de personas viviendo con VIH/SIDA pertenecientes al Sistema de Monitoreo TARGA del Instituto Nacional de Salud, con C.V en el rango de 400 a 750,000 copias/ml., las muestras fueron procesadas por el Mtodo Amplicor HIV-1, la tcnica utilizada es RT-PCR, que realiza la extraccin de ARN manual, la amplificacin se realiz en un termociclador modelo 9700, deteccin colorimtrica a longitud de onda de 450 nm., los resultados obtenidos con este mtodo se tomaron como valores referenciales comparndolos con los resultados del Mtodo COBAS Ampliprep/TaqMan HIV-1, tecnologa automatizada, utiliza PCR en Tiempo Real. Los resultados obtenidos fueron comparados por correlacin Pearson, regresin lineal para dos variables cuantitativas. Resultados: Las 152 muestras procesadas por las tcnicas Amplicor y Tiempo Real muestran medias de log 4.31 y log 4.22, una media valor mximo para Amplicor de 6.03 C.V(2.67) y Tiempo Real con log. 6.7 C.V(2.22), regresin lineal R=0.89 con una confianza del 95%, coeficiente de correlacin Pearson = 0.87 con valor significativo del 95% y los valores del coeficiente de correlacin interclase (CCI) calificada como bueno. Conclusiones: Las dos tcnicas para cuantificacin de carga viral muestran un alto nivel de correlacin, la determinacin de la C.V por Tiempo Real permite contar con una tecnologa automatizada para procesar mayor numero de muestra en menor tiempo que la plataforma manual. Palabras clave: Carga viral VIH; Tiempo Real PCR; correlacin; TARGA
Relationship between baseline viral load and median survival time. The median time for the patients in each of these viral load categories was more than 10 years, 7.7 years, 5.3 years and 3.5 years
La citometra de flujo es la prueba que se implemento en la fase inicial de la organizacin del sistema por su elevada precisin y por ser el mtodo patrn en el que se basar el control de calidad. Dado que no pueden adquirirse equipos para cada una de las regiones, estos fueron instalados en los laboratorios que seran designados como procesadores de CD4, que recibiran muestras de la jurisdiccin cercana. El mtodo Dynabeads es implementado en una II fase en aquellos lugares en donde la demanda de pacientes que reciben tratamiento es menor y exista poca accesibilidad geogrfica hacia el laboratorio procesador de CD4.
CONTROL DE CALIDAD
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
El propsito del AC es mantener la calidad global de los resultados de recuentos CD4 de los pacientes Toma en cuenta todos los factores que afectan los resultados de la prueba desde el momento en que se ordena la prueba hasta el momento en el que se reporta el resultado
Pre-analtico Analtico
Post-analtico
Toma de la muestra Reporte de resultados Registros para paciente Transporte muestra Precisin del Resultado y CC Calidad de la muestra Errores administrativos Errores de anlisis ndice de repeticin de pruebas
RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD4/CD8/CD3 CON MUESTRA COMERCIAL-2007
REFERENCIA RANGO MULTICHECK CONTROL INS LIMA NORTE LIMA CIUDAD JUNIN LAMBAYEQUE TACNA CD4 382,2-679,5 CD8 160,8-302,0 CD3 589,3-961,6 CD4/CD8 2,25-2,38 CD4/CD3 0,65-0,71 CD8/CD3 0,27-0,31
* REPRODUCIBILIDAD
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 CD4 CD8 CD3
RA NGO INFERIOR RA NGO SUPERIOR MULTICHECK CONTROL INS LIMA NORTE LIMA CIUDA D JUNIN LA MBA Y EQUE TA CNA
20 0 0 ,0
10 0 0 ,0
IN S L AC D D IM IU A L AN R IM O TE
0 0 ,0 C4 D -1 0 0 0 ,0 C8 D C3 D
L MA QE A B YE U TA N CA JU IN N
-2 0 0 0 ,0
RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD4 CON MUESTRA COMERCIAL-2007-2009
200.0
100.0 LAMBAYEQUE residual TACNA residual 0.0 LIMA NORTE residual LIMA CIUDAD residual J UNIN residual -100.0 INS residual
-200.0 Dic- Ene- Feb- Mar- Abr- May- J un- J ul- Ago- Sep07 08 08 08 08 08 08 08 08 08
RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD4 CON MUESTRA COMERCIAL-2007-2009
200.0
100.0 LAMBAYEQUE residual TACNA residual 0.0 LIMA NORTE residual LIMA CIUDAD residual J UNIN residual -100.0 INS residual
-200.0 Dic- Ene- Feb- Mar- Abr- May- J un- J ul- Ago- Sep07 08 08 08 08 08 08 08 08 08
RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD8 CON MUESTRA COMERCIAL-2007-2009
20 0 .0 10 0 .0 0 .0 -1 0 0 .0 -2 0 0 .0 LAM BAYEQ E U r sid a e ul T ACN r sid a A e ul LIM N RT r sid a A O E e ul LIM CIU AD A D r sid a e ul JU IN r sid a N e ul May-08 Ene-08 J un-08 Ago-08 Sep-08 Feb-08 Mar-08 Abr-08 Dic-07 J ul-08 IN r sid a S e ul
RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD3 CON MUESTRA COMERCIAL-2007-2009
20 0 .0 10 0 .0 0 .0 -1 0 0 .0 -2 0 0 .0
D ic E -07 ne F 08 eb M 08 ar A 08 br M -08 ay J u 08 n0 Ju 8 l A -08 go S -08 ep -0 8
LAM BAYEQ E U r sid a e ul T ACN r sid a A e ul LIM N RT A O E r sid a e ul LIM CIU AD A D r sid a e ul JU IN r sid a N e ul IN r sid a S e ul
EVALUACIN DE LA CALIDAD Y NORMALIZACIN INMULOGICA DE MEDIDAS NECESARIAS PARA VIH / SIDA ( QASI)
200 100 0 -100 200 -200
Ju lS e 07 p0 No 7 vE n 07 e0 M 8 ar M 08 ay -0 8 Ju l-0 Se 8 p0 No 8 vE 08 ne -0 9
GRACIAS
carlosjavieroblitasramos@hotmail.com