CURSO DE BIOTECNOLOGIA MEDICA P.P.

de Ingeniera Biotecnolgica 2011

BENJAMN PAZ ALIAGA Profesor de la UCSM

LOS GENES ESTAN LOCALIZADOS EN LOS CROMOSOMAS ( Thomas Hunt Morgan-1901)

PEDIGRI DE LA ALCAPTONURIA

ARCHIBALD GARROD

UN GEN = UNA ENZIMA

(1905)

LOS GENES SON QUIMICAMENTE ADN

WATSON Y CRICK CUANDO DESCUBRIERON LA DOBLE HELICE

1953

TECNICA DE LA DIFRACCION DE RAYOS X PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DEL DNA

1955

. Kornberg

descubre la ADN polimerasa

1961

JACOB Y MONOD PUBLICAN LA TEORIA DEL RNA MENSAJERO

DNA

RNA

PROTEINA

UUU UUC UCU UCC UCA UCG

Fen

Ser

1966 Se dilucida el
Codigo Gentico

1972

Se produce la primera molcula de ADN recombinante

1. Las ranas fueron los primeros animales transgnicos producidos. 2. Se usaron los ncleos para la transferencia en lugar del DNA, en la forma que se indica en el esquema. 3. Se estableci la metodologa de la microinyeccin..

1973 Es clonado el primer

gen animal

En Stanford y UCSF unen un segmento de ADN de Xenopus laevis que contena un gen con el ADN de E. coli. El ADN obtenido se regresa a la bacteria, el gen de Xenopus se copia y se transcribe en la bacteria, produciendo esta una protena especfica de Xenopus. .PNAS. 71(5) 1743-7, 1974

 Poco tiempo despus se consigui insertar fragmentos de DNA (genes) de bacterias en organismos superiores (plantas). Tambin se incorporaron secuencias gnicas a cultivos de tejidos para permitir la sntesis de ciertas protenas que despus se purificaban del medio de cultivo

 El uso de los animales en la investigacin tuvo su origen hace varios siglos; pero la modificacin de su genoma con la idea de obtener organismos transgnicos comenz hace slo 24 aos (Palmiter y col.)

ANTECEDENTES
Gordon y col en 1980 inyectaron ADN de ratn en uno de los proncleos de un huevo de la misma especie. Palmiter y col (1982)inyectaron en el proncleo de un cigoto de ratn el gen de la hormona de crecimiento de rata. En 1983 se hizo el mismo experimento en ratn pero usando hormona de crecimiento humana.

A comienzo de los 80 se transfirieron genes de un animal a otro

Nature 294 (5836) 9-10, 1981 Science 218 (4570): 348-350, 1982

METODOLOGA EN LA PRODUCCION DE ANIMALES TRANSGENICOS

ANIMAL TRANSGENICO

Produccin de otros animales transgnicos

Posteriormente se comenzaron a usar otros animales, como conejos, ovejas, cerdos, vacas, etc. En estos casos tambin se les introdujo el gen de la hormona del crecimiento humana con la misma tcnica que la usada para ratn. Se consiguieron los animales transgnicos correspondientes pero con algunos efectos no deseables

CREACION DE UN ANIMAL TRANSGENICO

IMPORTANCIA DEL USO DE LOS ANIMALES TRANSGENICOS

1. En la investigacin:
En el estudio de la funcin del gen Estudio de las enfermedades humanas Modelos para el estudio de las enfermedades humanas Produccin industrial farmacutica de ciertas protenas Produccin de animales anatmica y fisiologicamente ventajosos

2. Desde un punto de vista general:

MODELOS DE ANIMALES PARA ESTUDIAR ENFERMEDADES HUMANAS

Se dispone de varios modelos de roedores transgnicos para estudiar una serie de enfermedades humanas, por ejemplo:
Enfermedades cardiovasculares Cncer SIDA Anemia falciforme Enfermedades neurolgicas Enfermedades metablicas Enfermedades genticas

PROTEINAS TERAPEUTICAS SINTETIZADAS POR ANIMALES TRANSGENICOS ANIMAL USO TERAPEUTICO PROTEINA
AAT (Alfa-1 tripsina) tPA (Activador plasmin-geno tisular) Factores VIII, IX Hemoglobina Lactoferrina CFTR Protena C humana anti- Oveja del Cabra Tratar la deficiencia de E-1 antitripsina Tratamiento miocardio del infarto de

Oveja Cerdo Vaca Oveja, ratn Cerdo

Tratamiento de la hemofilia Sustituto de transfusiones la sangre para

En los nios como frmula aditiva Tratamiento de la fibrosis qustica Anticoagulante

METODOS PARA EL DESARROLLO DE ANIMALES TRANSGENICOS

1. Tranferencia de ADN clonado a oocitos fertilizados.
El procedimiento que se sigue es la microinyeccin pronuclear El animal que se obtiene ser completamente transgnicos, la totalidad de clulas, incluyendo las germinativas tendrn el transgen Producida la fecundacin, el pronucleo macho y hembra son claramente visibles para hacer la microinyeccin

Pronucleo hembra

Pronucleo macho

Solucin de ADN

Pipeta usada para la microinyeccin

Los oocitos microinyectados son reimplantados en el oviducto de la nueva madre

RATON TRANSGENICO

CONSTRUCCION DEL RATON TRANSGENICO

DESVENTAJAS DEL METODO DE LA MICROINYECCION PRONUCLEAR

La integracin del transgen en el cromosoma del hospedero se da en un solo lugar pero al azar Se encuentran en el lugar de insercin mltiples copias del transgen ( 50 ms) Las diferencias en la expresin del transgen se explican por su lugar de insercin antes que por el nmero de copias El lugar de insercin puede afectar el funcionamiento de genes endgenos La insercin determina un estado hemicigoto

METODOS PARA EL DESARROLLO DE ANIMALES TRANSGENICOS

2. Transferencia a embriones - Se aprovecha la capacidad de las clulas embrionarias de los primeros estados de ser pluripotenciales -Generalmente se utiliza clulas madre embrionarias, que derivan de embriones de ratn de 3 a 4 das posteriores al coito. -Se tomas las clulas de la masa celular interna del blastocisto -Estas clulas se les puede cultivar in vitro y retienen su capacidad de originar todos los tejidos del ratn

AISLAMIENTO DE LAS CELULAS MADRE EMBRIONARIAS

TRANSFERENCIA A LAS CELULAS EMBRIONARIAS

1.-Clulas embrionarias stem

2.- Blastocistos 3.- Incorporacin a la cavidad del blastocisto 4.- Clulas inyectadas se incorporan a la masa celular interna del blastocisto 5.- Introduccin de tales blastocistos a la nueva madre 6.- Nacimiento 7.- Ratn transgnico

DESVENTAJAS DEL METODO DE TRANSFERENCIA A EMBRIONES

El embrin que se desarrolla en la hembra receptora corresponde a una quimera, es decir tienen dos poblaciones derivadas una de las clulas con el transgen y la otra derivada de los blastocistos naturales. Se obtienen ratones parcialmente transgnicos pero a partir de ellos se pueden derivar los completamente transgnico por cruzamientos entre la progenie.

ANALISIS DE LA PROGENIE TRANSGENICA

Generalmente se obtiene un porcentaje menor al 20% de progenie transgnica. Las tcnicas usadas para el anlisis de la progenie transgnica, son:
Southern blot Slot o Dot blot PCR Anlisis de los tejidos (Wester blotting, inmunohistoqumica inmunofluorescencia

UTILIDAD DE LOS RATONES MODELO DE ENFERMEDADES HUMANAS A. Son fisiologicamente similares a los humanos B. Hay un gran reservorio gentico de modelos potenciales que han sido generado a travs de la identificacin de ms de 1000mutantes espontaneas generadas quimicamente o por radiacin.

UTILIDAD DE LOS RATONES MODELO DE ENFERMEDADES HUMANAS A. Los avances tecnolgicos recientes han aumentado dramaticamente la habilidad para crear modelos de ratones de enfermedades humanas.
El desarrollo del mapa fsico y gentico del genoma del ratn y recientemente su secuenciacin total. Las tecnologas transgnicas como el knock-out y el knock-in

UTILIDAD DE LOS RATONES MODELO DE ENFERMEDADES HUMANAS

D. Se dispone de ms de 100 ratones modelo de enfermedades humanas y en donde el gen homlogo est mutado tanto en el humano como en el ratn. 1. El fenotipo del ratn semeja muy estrechamente a los fenotipos de la enfermedad humana. 2. Es de gran valor para entender como la enfermedad se desarrolla y para prevenir y tratar la enfermedad.

Un ratn modelo knock-in de la porfiria eritropoytica congnita

A knock-in mouse model of congenital erythropoietic porphyria. Ged C. y col. Genomics 87:64-92,2006

Caso Clnico
Un hombre de 43 aos, soltero, que desde su nacimiento tuvo piel oscura, exceso de vellos y orina oscura. Desde los 8 aos sus dientes tomaron un color rojizo y aparecieron lesiones en la piel a manera de ampollas, en zonas de exposicin a la luz solar, con el paso de los aos estas ampollas se conviertieron en lceras y la piel de la zona comprometida se comenz a esclerosar..

Caso Clnico (continuacin)

Los abuelos maternos eran primos hermanos. El paciente tuvo 9 hermanos, uno de los cuales tena las mismas alteraciones en la piel . El examen de piel revel hiperqueratosis, hipopigmentacin y fibrosis en las zonas expuestas al sol.

Caso Clnico (continuacin)

El recuento de hemates, la hemoglobina y las constantes corpusculares estaban normales, al igual que el recuento leucocitario y plaquetario. Las enzimas hepticas estaban discretamente aumentadas en actividad en el suero (TGP,TGO y gammaGT).

Caso Clnico (continuacin)

El anlisis de orina demostr un marcado aumento de las coproporfirinas y uroporfirinas. En los hemates tambin se encontraron niveles altos de porfirinas.

LESIONES EN LA PIEL DEL PACIENTE DEL CASO CLINICO 1

POFRFIRIA ERITROPOYETICA CONGENITA

NIO DE 3 AOS DE EDAD PORTADOR DE PORFIRIA ERITROPOYETICA CONGENITA (Indian J Dermatol. 2011 Jan-Feb; 56(1): 9497.) .

mitocondria

Glicina + Succinil CoA Acido H aminolevulnico (ALA) citosol

HEMO
PROTOPORFIRINA III PROTOPORFIRINOGENO III

Porfobilingeno (PBG) COPROPORFIRINOGENO III

OH Metilbilano

UROPORFIRINGENO III
(uroporfiringeno III sintasa)

UROPORFIRINOGENO I

MUTACIONES EN EL GEN DE LA UROS

Se han descrito hasta el momento 35 tipos de mutaciones que pueden causar la Porfiria Eritropoytica Congnita (PEC). Una de las ms frecuentes es la : ms del 30% de pacientes con CEP Otra frecuente es la P248Q

C73R ,encontrada en

CARACTERSTICAS DEL GEN DE LA UROS

En 1988 Tsai y col. Clonaron el cDNA completo que codificaba para la UROS por seleccin de una biblioteca cDNA construda de hgado humano adulto. Astrin en 1991 usando el gen cDNA ubicaron el gen de la UROS en el cromosoma humano10 (10q25.2-q26.3).

GEN UROS

LOCALIZACION DEL GEN UROS EN EL BRAZO LARGO DEL CROMOSOMA 9

Localizacin citogentica 10q25.2- q26.3 Localizacin molecular del 127,467,141 bp a 127,501,756

CARACTERSTICAS DEL GEN DE LA UROS

Xu y col. ( 1995) clonaron el gen de la UROS en el ratn y lo ubicaron en el cromosoma 7 de este animal. En el 2000 Aizenkang y col. secuenciaron los 34Kb del gen de la UROS y determinaron que tena 10 exones

OBJETIVO DEL TRABAJO

Obtener ratones con porfiria eritropoytica congnita humana mediante una mutacin knock-in

METODOLOGA
1. Se obtuvo un fragmento mutante de 6.22 Kb de ADN genmico de ratn y contiene los 2 ltimos exones ( 9 y 10). 2. La recombinacin homloga entre el locus blanco (genomic locus) y el fragmento mutante determin la obtencin del gen modificado|.

METODOLOGA
3. El gen modificado contiene un gen adicional que confiere resistencia a la neomicina(NEO) y otro que corresponde al gen de la timidina quinasa del virus herpes simple (HS-TK)que confiere sensibilidad al ganciclovir. 4. La mutacin que pas el fragmento mutante es una transversin (CCA CAA)y est en el exn 10.

RESULTADOS
Se consiguieron 205 clonas resistentes a ambas drogas indicando que tenan el fragmento mutado en el lugar correspondiente Para la seleccin de los recombinantes homlogos se utiliz PCR, Southern blot, secuenciacin del exn 10 y medida de la actividad de la UROS

RESULTADOS
Cinco clonas se identificaron como recombinantes homlogas, pero solo dos tenan la mutacin esperada (P248Q) y tenan 50% de decrecer en la actividad de la UROS. Despus se reimplantaron los blastocistos y finalmente se obtuvieron 17 ratones heterocigotos de 63 estudiados.

RESULTADOS
Los cruzamientos entre los ratones heterozigotos dieron 59 nacimientos procedentes de 16 camadas. El estudio gentico determin las siguientes frecuencias de genotipos:
18.6% (11/59) eran UROS (P248Q-P248Q) 44.1% ( 26/59) eran UROS (P248Q-N) 37.3% (22.59) eran UROS (N-N)

Cambios histolgicos en hgado, bazo y rin en un ratn con ECP y en un normal

DETERMINACION DE PORFIRINAS EN LOS ANIMALES TRANSGENICOS

PORFIRINAS ACUMULADAS
Hemates (pmoles/mg de Hb). PORFIRINAS TOTALES Promedio

Mut/Mut n=5 72 498 88.6

Mut/N n=6 3.7 ND ND

N/N n=6 3.8 ND ND

Orina ( umoles/litro) PORFIRINAS TOTALES. Promedio

Orina (% como uroporfirina I)