MARCADORES MOLECULARES

Jueves 31-03-2011

Marcadores
Marcador:Carcterorasgodetectable,variabley diferenciableentreindividuosquepermitediscriminarlos

Tipos

Morfolgicos Bioqumico Molecular

NiveldeAnlisis
Fenotipo

Productognico SecuenciadeADN

ObtencindeMaterial Biolgico
Sepuedetrabajarcontejidodecualquier organismohastadeaquellosextintos. Depreferencia:organismosfrescos, congeladosofijados. Lacantidaddetejidonoestanimportante, dependedelmtododeextraccin. Noserequieresacrificaralosanimales (plumas,pelos,escamas,fecas,sangre).

Tipos de Marcadores genticos

Codominancia: Condicin en la cual ambos alelos de un gen (en diploides) en estado heterocigtico estn expresados siendo ninguno de los dos dominante o recesivo. Dominancia: Condicin en la cual uno de los alelos enmascara el efecto del otro completamente en estado heterocigtico.

MarcadorDominante
Slosedetectandosclases genotpcas(AA+Aa)yaa,el heterocigotoseconfundeconuna clasehomocigota. Ungelconpatrndebandasde marcadordominanteparaunlocus presentarparacadaindividuo, presenciaoausenciadebanda. Codificacion: Presencia=1;Ausencia=0.

AA

Aa

aa

MarcadorDominante

MarcadorCodominante
PuedenobservarseunlocusAcon nalelosyfrecuenciasallicasp1, p2,p3yademslosheterocigotosse reconocenfcilmente Losresultadosobservadospueden sercomparadosconlosesperados bajoelsupuestodeHardy weinberg

AA

Aa

aa

MarcadorCodominante

Tiposdemarcadores moleculares
Singlelocus Flexibles,informativosycomparablesentreestudios. Analizablescomoarreglosgenotpicos,aleloscon frecuenciasocomogenealogasdegenes. Singlelocustambinpuedetransformarseamultilocus analizandomsdeunlocus. Microsatlites,regionesdeADNsinglecopy,(scnADN), Alozimas.

Tiposdemarcadores moleculares
Multiloci Convenientes(tcnicay$)dbilesylimitados. Slosepuedencompararsuperficialmenteenestudios similares. Raravezanalizanfrecuenciasallicas. Fragmentosregistradoscomopresenteoausente marcadorescodominantesdondecadaalelodeun individuosepuedeidentificar,caracterizarycomparar RAPDs,AFLPs,RFLPs,

Alozimas: electroforesis de protenas Forma de una enzima que difiere en la secuencia de sus aminocidos y se reconoce por electroforsis o por alguna propiedad. Marcador Codominante Permite indentificar distintos alelos de protenas (enzimas) por su tasa de migracin en un gel Clculo de frecuencias gnicas Utilizadas para comparar poblaciones

Preparacinycorridadelgel

Inoculacindelasmuestras

Corrida electofortica

Lasdistintasprotenasmigransegn: Sucarganeta Supesomolecular

Corteytincinespecficadelgel Anlisis:Distintospaquetescomputacionales(Biosys, Genepop,Popgene,Arlequin,Genetix,etc)

Locus:ESTERASA

DIVERSIDADGENTICA: Nmerodealelos Frecuenciadecadaalelo Heterocigocidad

Locus:ESTERASA A1 A2

DIVERSIDADGENTICA: Nmerodealelos2 FrecuenciadecadaaleloA1:24/50A2:26/50 Heterocigocidad12/25

Protena dimrica

Protena monomrica

Unatcnicadelpasado?
Pros: Tcnicarelativamentesencillaeimplementable Contras: Protenasfcilmentesedenaturan(mantenerlasa70C) MenorgradodevariacinquelasecuenciadeDNA Neutralidad Muchasmutacionespuedenpasarinadvertidas(cdigo genticodegeneradooAminocidosconmismacargay tamao)

Marcadores Moleculares
Marcadores genticos: permiten detectar varicin gentica Entregan informacin a distintos niveles: - Estructura poblacional - Niveles de flujo gnico - Relaciones filogenticas - Patrones de biogeografa histrica - Anlisis de parentezco o de relacin - Deteccin de enfermedades Existen distintos tipos de polimorfismos

DNAMitocondrial
Multicopia ~16.5Kbp Herenciadetipomaterna Enalgunoscasosposeeheteroplasmia(formas originalesymutadascoexisten) Nosufrerecombinacin Menortasadecambio Msestableparaanlisisforenses ElmayorgradodevariacinseencuentraenlaDloop

DNANuclear
Unasolacopiaporclula Tamaovariabledependiendodelorganismo(paradoja delvalorC) Herenciabiparental(enlamayorpartedelasregiones) Endiploideslaprogenieheredaunalelodecadaparental Sufrederecombinacin Mayortasadecambio Algunasregionesmuestranmayortasadevariacin(ITS) CiertasregionesdelDNAnuclearfuncionantienen herenciauniparental(genesligadosalareginno recombinantedelcromosomaY)

DNA Nuclear (nucDNA) vs DNA Mitocondrial (mtDNA)

nucADN Forma Nmero de copias Tamao Tipo de herencia Nmero de alelos Recombinacin Estabilidad Tasa de mutacin Anlisis Linear 2 por clula Variable ~16.5Kbp Biparental Ploida Si Baja Mayor Complejo
Transformacin Clonacin y minipreps

mtADN Circular Miles por clula (6 x 109) Uniparental 1 haplotipo No Alta Menor Simple
Secuenciacin

ExtraccindeADN
Qumica Lisiscelular Enzimtica Mecnica Solventes orgnicos Remocindeprotenas Salt UninalADN Precipitacin ADN Alcoholes
SDS,sarcosyl CTAB ProteinasaK Lisozimas Fro Sonicacin Molienda Fenol Cloroformo Clorurodesodio AcetatodeSodio Membrana Ethanol Isopropanol

PCR

PCR:ReaccinenCadenadelaPolimerasa.Reaccindeextencinde partidores(cebadores,primers)utilizadaparaamplificarcidosnucleicos. Unpequeofragmentode ADN(<3000pb)esamplificado millonesdeveces Permitedeterminartamao, secuenciadenucleotidos,etc

Tcnicamuyutilizadaen Biologadepoblaciones. Permitetrabajarconpequeas cantidadesdeADN Permitetrabajarconmuestrasde museomuyantiguas

Diseodepartidores
Distintasaproximacionesdependiendolaespecieenestudiooelgena analizar(partidoresuniversales) Noeslomismotrabajarenorganismosmodelos,queconespeciestotalmente desconocidas
Especie A

Descargolassecuencias(COI)delabasededatosGenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)yhagounalineamiento (ClustalX)

Reginconservada1(125175pb)

Especie B Especie C

GenCOI

Especie D Especie E

Reginnoconservada176700pb
Especie F Especie G

Especie H

Reginconservada2(700750pb)

Consideracionesgenerales
Temperaturadeanillamiento:directamenterelacionadaconel contenidodeGC,AT.LatemperaturadePCRdependedela longitudycomposicindelospartidores.

TA=x2GC=x3
Longituddelprimer:debeserlosuficientementecomplejoparaque laprobdeanillamientoconotrasecuenciaseabaja.Serecomienda queunprimertengacomomnimo17basesdelongitud.
a) Primersdebentenerunalongitudde1728b b) ContenidoGCdebeserdealrededordel5060% c) SerecomiendanTmsentre5075C d) Evitar3omsCoGsenlareginterminal3 e) Terminaciones3nodebensercomplementariasparaevitarlaformacinde dmeros f) Losprimersnodebenformarsecuenciasautocomplementariasparaevitarla formacindeestructurassecundarias.

PCR

Partidores
LCO1490:5GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3 HCO2198:5TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3 (Folmeretal.,1994) Adems:

MgCl2 10xPCRBuffer
800 pb

DNTPs Taqpol

H20 enviadoasecuenciar ADN(20ng)

Geldeagarosa(1%)teidoconEtBr

Fragmentoespurificadoy

CitocromoOxidasaIenmuestrasdeADNdeNacella

Secuenciacin
Mtodoenzimticodeterminacindecadenao mtododidesoxideSanger
FragmentodeADNabundante(clonacino PCR) PolimerasaADN Primer Cuatronucletidostrifosfato(dATP,dCTP, dGTPydTTP). Cuatrodidesoxinucletidos(ddATP,ddTTP, ddCTPyddGTP). Didesoxinucleotidossonnucletidos modificadosqueterminanlaelongacin.
FrederickSanger

Mtodo enzimtico de terminacin de cadena o mtodo didesoxi de Sanger

MtodoAutomticodeSecuenciacin

Variabilidad de la secuencia de ADN

ATTCGCTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG

Hebraoriginal

ATTCGTTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG ATTCGCTATCGAATACGCTGCGAACGGG ATTCGCTATCGAACGCCGCTACGCTGCGAACGGG ATTCGCGAACGCTACGCTGCTATCGAACGGG

Sustitucin Delecin Repeticin Transposicin

RAPD(RandomAmplifiedPolimorphismDNA)
EspecmenA EspecmenB

Polimorfismode secuenciaenel sitiodelpartidor

Marcadordominante(presenciaausencia) Utilizapartidoresuniversalesalazar(10pb) Permiteamplificarfragmentosentre2002000pb Permiteamplificarvarioslocialmismotiempo

Utilidad:
- Cartografa gentica - Hibridacin - Estructura gentica de poblaciones

1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 0 1 0 1 0

1 1 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 0 1 1 1 1 1

1 0 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 1 0 1 1 1 1

1 1 1 1 0 1 1 1 1

1 1 1 0 1 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 1 0

Matriz de datos es llevada a al programa TFPGA

Ventajas
Fcilybarato Aproximacinmultilocus Norequiereeldiseodepartidoresespecficos Permiteanalizarungrannmerodelocianivelgenmico Suvariabilidadesneutraalosefectosdelaseleccinnatural

Desventajas

Reduccindeladiversidadallica(slo2alelos) Esunmarcadordominante,nosepuedendetectarheterocigotos AltoniveldeHomoplasia Dosbandasdeigualtamaopuedentenerdistintas secuencias Ausenciadebandapuedeserproductodeunaovarias mutaciones Exhibegravesproblemasdereproducibilidadypococomparables Enmuchoscasossonimprecisos Tcnicasyanalticas

AFLP(AmplifiedFragmentLength Polymorphism)
Tcnicapopularque permitedetectaruna grancantidadde marcadoresdeADN polimrficos rpidamente. Involucraunadigestin conenzimasde restriccinydosrondas dePCR
1) Digestion con enzimas de restriccin (EcoRI, MseI)

ADN

CAATTCC GTTAAGG

CGTAACC GCATTGG

2) Ligacin de adaptadores AATTC TTAA G T TA AAT

Permitedetectar presenciaausenciade Adaptador EcoR I fragmentosde restriccin.

Adaptador Mse I

3) PCR preselectivo Fragmentos de ADN con adaptadores

Primer 1 5 --------- + A EcoR I

AATTCN TTAA GN

NT TA NAAT
C --------- 5 Primer Mse I

Genera fragmentos de ADN entre 100-1500pb

4) PCR selectivo con partidores fluorescentes
Primer 3 5 --------- + AAC

AATTCA TTAAGT AATTCAAAC TTAAGTTTG

GTTA CAAT
AAC --------- 5 Primer Mse I

GTTGTTA AACCAAT

Corrida electrofortica en gel de poliacrilamida bajo condiciones denaturantes Fuentes de polimorfismo: Prdida de sitios de restriccin In-dels

Ventajas
MseficientequeRAPD Norequiereeldiseodepartidoresespecficos Permiteelanlisisdeunaltonmerodelocienelgenoma

Desventajas:
Diversidadallicaporlocusreducidasloapresencia ausencia. Marcadordominantenopermitedetectarheterocigotos RequieredeADNdealtacalidadypureza

Microsatelites
SecuenciassimplesrepetidasentandemaniveldelADN sinfuncinconocidaextremadamentevariables TambinconocidoscomoSSR(SimpleSequenceRepeats)
SSRMononucleotdica(A)11 ctgttgAAAAAAAAAAAtgagag SSRDinucleotdica(GT)6 ccaagtGTGTGTGTGTGTtgaat SSRTrinucleotdica(CTG)4 cagagtCTGCTGCTGCTGgtaat SSRTetranucleotdica(ACTC)4 actgtACTCACTCACTCACTCtgaat

Homocigotos:
CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG(CT)7 CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG(CT)7

Heterocigotos:
CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG(CT)7 CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG(CT)9

Losmicrosatelitessonconsideradoscomo: DNAbasura Fuentenecesariadediversidadgentica Reguladoresdelaexpresinyfuncindeprotenas

Microsatelites (SSR)
Secuencia de microsatelite (CA)5 Alelo A

Especmen A

Especmen B Secuencia de microsatelite (CA)3 Alelo B

Direccin de la electroforesis

Aplicaciones
Anlisisforenses Diagnsticoeidentificacindeenfermedades Estudiosdemogrficos Estudiosdeestructurapoblacional Estudiosengenticadelaconservacin Determinacindestocks

Ventajas
Marcadorcodominante Usorelativamentesimple Engeneralsonneutrosalefectodelaseleccinnatural Altapresicinenladeterminacindealelos Altamentevariables Muchosalelosporlocus(polimrficos)

Desventajas

Requierendiseodepartidoresespecieespecficos(500.000c/u) Requierendeunsecuenciadorparaelanlisisdefragmentos Dinmicaevolutivadesconocida Bandasstutteryalelosnuloscomplicansuanlisis ExhibensignificativosnivelesdeHomoplasia

Usos potenciales de los distintos tipos de marcadores en ecologa, filogeografia y filogenia

Nivel Jerarquico Identidad gentica Parentezco Poblaciones coespecficas Especies relacionadas Niveles taxonmicos intermedios Separaciones profundas Adecuado, altamente informativo Marginalmente informativo No apropiado Tomado de Sunnucks, 2000 TREE
Electroforesis de proteinas Secuencia DNA/RNA Secuenciacin DNA fingerprint mtDNA, scnDNA, intrones, RAPD, AFLP

AproximacionesOMICAS
DesarrollodenuevastcnicasenBiologa Molecular AvancesenBioinformticaydelostiempos requeridosparaestos
Nuevocampodeinvestigacin Seasociaalaidentificacincaracterizacindegenestranscritosy traducidosquerespondenapresionesdeseleccin. Hanaumentadolacapacidaddecomprensindelosmecanismosde adaptacinyespeciacin. Lavariacinenlaexpresindegenesjuegaunrolimportanteatravs deprocesosdedivergenciaadaptativaentrepoblacionesnaturales. Lospatronesdeexpresinentreganunaestimacindirectadelgradode divergenciagenticaadaptativaadistintosniveles.

Genmica:estudiodelafuncinde losgenomas. Transcriptmica:estudiaelconjunto demolculasdeARNs(mARN, rARN,tARNyARNnocodificante), enunaclulaounconjuntocelular.Se hanaplicadoadistintosnivelescomo alconjuntototaldetranscritosenun organismooalsubconjuntode transcritospresentesenuntipo particulardeclulas.Permiteobtener unperfildelaexpresingnicaglobal bajocondicionesespecficas. Protemica:seencargadecaracterizar elconjuntodeprotenas,enespecial susestructurasyfunciones. Metabolmica:estudiosistemticode lashuellasqumicasometabolitosque dejanlosprocesoscelulares especficos.

Relacinentrelasramasdelabiologamolecularconocidas como omicas. Modificado de Van Straalen & Roelofs (2006).

Desarrolloeimpactodelasecuenciacin454
Polimerasa

Hebratemplado(DNA,RNA) Sulfurilasa Luciferina La luciferasa usa el ATP para convertir luciferina en oxiluciferina, lo que produceluz Al incorporar la base complementaria (G) se genera Pyrofosfato inorgnico(PPi)quees convertido a ATP por lasulfurilasa Partidor

DNA, RNA es aislado, fragmentado, ligado a adaptadores y separado en hebras simples

Fragmentos son unidos a partculas redondas bajo condiciones que favorecen un fragmento por partcula. Las partculas son aisladas y compartimentarizadas en gotas de reaccin de PCR en emulsin de aceite. Amplificacin por PCR ocurre en cada gota, cada partcula contiene millones de copias del mismo templado. La emulsin es separada, las hebras de DNA son denaturadas y las partculas que contienen templados hebra simple son enriquecidos y colocados en posillos en una placa de fibra ptica.

Las partculas que portan las enzimas inmovilizadas requeridas para la fase slida de reaccin por pirosecuenciacin son depositadas en cada posillo.

Secuenciador454

Ensamblefludico

CmaraCCD Cluladeflujo

Mapagenticobasadoenperfiles transcriptmicos
Ensamblaje,Anotacion,Mapeo

Identificacin de los transcritos mayormente expresados en cada especie Bsqueda de genes candidatos y generacin de nuevos marcadores moleculares para cada especie Validacin expresin

Microarrays

Debidoa: 1)Aumentoenlasecuenciacingenmicade distintasespecies 2)Incrementoenelconocimientodel funcionamientodelosgenes Apareceunanuevatcnicaqueanalizagenes funcionales,Microarrays(microarreglos) Permiteestimarelniveldeexpresindede cientosdegenesenunamuestra

Portaobjetoconunamatrizdecientosdepuntos CadapuntotienesecuenciasdeADNelcualcodificapara ungenespecfico

Microarray:

Demonstration

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html

Aplicacin
Mejordiagnstico(ej.cancer)y terapias Genesimplicadosenla especiacin Diferenciaenlaexpresinde genesenpoblacionesdiferentes Estudiodecomunidades bacterianas,microalgas,larvas planctnicas

Desventajas
Actualmenteesextremadamentecara ($50.000laplaca) Serequieredisearelbancodegenes: tiempoytecnologa Pordiferenciasentremuestras, siempreesnecesarioponerdosmuestras juntasenunaplaca.