Marcadores Moleculares

Introduo e Histrico Descrio de Marcadores Comparao entre Marcadores Moleculares Classificao de Marcadores Moleculares Caractersticas do Genoma de Planta Aplicaes
diversidade gentica mapeamento e seleo assistida

INTRODUO E HISTRICO Marcadores Moleculares

Gentica
arte e seleo inconsciente
da inveno da agricultura at sc. XIX

1900s - Descoberta dos princpios genticos 1920-50 - Melhoramento gentico cientfico

gentica quantitativa e biometria (fentipo previsor ruim do valor gentico!)

1970-80 - Utilizao de marcadores genticos moleculares

 Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genticos herdveis dos ambientais Marcadores genticos so unidades herdveis simples

cromossoma

marcadores

 Polimorfismo de DNA resulta acmulo de mutaes

pontual ou insero/deleo macro-rearranjos: translocaes, inverses, delees

Origem do Polimorfismo Molecular

1. Mutaes pontuais - SNPs
A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ATCTCGTGATTATAGTCGTA TAGAGCACTAATATCAGCAT ex. Stio EcoRI B.

2. Pequenas delees e/ou inseres - InDels

A. ATCTCGTCTAGTCGTA TAGAGCAGATCAGCAT ATCTCGT---GTCGTA TAGAGCA---CAGCAT B.

Histrico de Marcadores
1. Karl Sax (1923): props mtodo para localizao de QTLs
ligao entre genes de caracterstica qualitativa (cor de semente) e quantitativa (peso de semente);

Problema: ausncia de mutaes mltiplas em estoque de elite, baixa viabilidade

2. Hunter & Markert (1957) - marcas bioqumicas

desenvolveram isoenzimas em gel de amido

Histrico de Marcadores
3. Hubby & Lewotin (1966)
demonstraram que 30% de loci de isoenzimas exibiam polimorfismo em populaes selvagens de Drosophila;

4. 1970s - ferramentas moleculares

desenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrio; polimerases; ligases; Southern (1977);

Histrico de Marcadores
5. RFLP proposto por Botstein et al. (1980)
descrito para humanos

6. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987)

7. VNTR por Jeffrey (1987) 8. RAPD por Rafalski et al. (1990)

Histrico de Marcadores
9. SSR em plantas por Akkaya et al. (1992)
10. AFLP por Zabeau & Vos (1993) 11. CAPS por Konieczny & Ausubel (1993)

12. SCAR por Paran & Michelmore (1993)

13. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis

DESCRIO DOS MARCADORES MOLECULARES

Marcadores Moleculares
RFLP VNTR (minissatlite) RAPD, AP-PCR, DAF PCR-especfico - SSR, ISSR, CAPS, SCARs AFLP SNPs

Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP

RFLP examina diferena em tamanho de fragmentos de restrio de DNA especficos Polimorfismo deriva de mutao pontual, insero, deleo Utiliza-se DNA celular total Requer DNA puro de alto peso molecular

Metodologia de RFLP
1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos 2. Separao dos fragmentos por gel eletroforese 3. Transferncia de fragmentos de DNA para filtro

Fonte: IPGRI

Metodologia de RFLP
4. Visualizao dos fragmentos de DNA
sondas marcadas (32P) ou a frio

5. Anlise dos resultados

bandas analisadas para alelos e/ou presena/ausncia diferenas em padro de bandas reflete diferenas genticas

A escolha de sonda/enzima de restrio crucial

Fonte: IPGRI

Digesto de DNA Genmico e Separao em Gel

digesto

2
3 4

DNA
Separao em gel 1 2 3 4 5

Transferncia para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose

2 3
1

Hibridizao em Nylon ou Nitrocelulose

Construo de biblioteca genmica ou de cDNA

mRNA ou DNA

cDNA

Clone cDNA

Biblioteca de cDNA

Eletroforese

Exposio em filme de Raios-X

Hibridizao com sonda marcada

Interpretao de resultados
1 1 2 3 4 2 3 4 5 6

Stio alvo para sonda

6 Stio de restrio Insero

Fonte: IPGRI

RFLP em Cana de Acar

Sorgo

Cana

P1 P2

1:1 3:1

Hibridizao com sonda de sorgo

1:1

3:1

Hibridizao com sonda de Cana

Herana de RFLPs
B
6 Kb

F1
8 Kb

8 Kb

6 Kb

F2
6 Kb 8 Kb 6 Kb 8 Kb 6 Kb 8 Kb

Anlise de Diversidade e Filogenia por RFLP

13 5 6 2 8 A
13 8 6 5 2

11 9

RFLP: sondas de locos nico

DNA Nuclear
biblioteca genmica biblioteca de cDNA

DNA Citoplasmtico
biblioteca de DNA cloroplstico e mitocondrial

Sondas de RFLP so:

locos-especfica, co-dominante espcie-especfica

RFLP: sondas multi-locus

Repeties em linha (tandem) - til
encontrada em vrios loci altamente polimrficas

Sequncia de Minissatlite

VNTR: variable number of tandem repeats uso em DNA fingerprinting uso de seqncias repetidas de fago M13

Interpretao dos resultados

A1A1 A1 A1 A1 A2 A2 A3

A1A2

A2A3

Repetio
Stio de Restrio

Fonte: IPGRI

Vantagens e Desvantagens de RFLP

Reprodutvel Marcadores co-dominantes Simples Trabalhoso Caro Uso de sondas radioativas*
Fonte: IPGRI

Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD

Amplifica seqncias annimas de DNA usando primers arbitrrios PCR com um nico primer Mtodo rpido para deteco de polimorfismos Marcador dominante Problemas de reproducibilidade
10 bases com >50% G+C

RAPD
AA Aa
AA Aa aa

aa

Interpretao de RAPDs
Marcadores RAPD so annimos Dados binrios (presena x ausncia) RAPD so dominantes (AA = Aa) Problemas de co-migrao
mesma banda, mesmo fragmento? uma banda, um fragmento?

Questionamento para filogenia

banda homlogas?

PCR com primers arbitrrios:

acmulo de siglas!
RAPD DAF
Random Amplified Polymorphic DNA DNA Amplification Fingerprinting Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por incluir todas as pequenas variaes na tcnica)
Fonte: IPGRI

AP-PCR MAAP

Diferenas entre ensaios com primers arbitrrios

RAPD
10mers, gel de agarose corado com brometo

DAF
5mers, gel de acrilamida e reao marcada
32P

AP-PCR
10mers, gel de acrilamida e reao marcada
32P

Microssatlites

Seta: alelos genoma B