Enzimas Parte 2

JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO

Estgio em Docncia Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008

Enzimas

Atividade enzimtica Produo industrial de enzimas O processo fermentativo; Separao de enzimas intra e extracelulares; Purificao; Controle de pureza; Produto final.

Atividade Enzimtica

As medidas de [ ] em m/V, no tem aplicao para solues enzimticas O que importa no a massa, mas a atividade Conserva a massa protica

Protenas desnaturadas

Sem atividade cataltica

Atividade Enzimtica

Dosagem: atravs da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reao que a enzima cataliza ([S] ou [P]) uma amostra da soluo contendo a enzima incubada com [ ] de substratos (Vmx.)

Produto mol/mL

velocidade constante

Tempo (min.)

Atividade Enzimtica

Dosagem: atravs da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reao que a enzima cataliza uma amostra da soluo contendo a enzima incubada com [ ] de substratos (Vmx.)

Produto mol/mL

velocidade decresce
[ ] de substrato:
-inativao parcial da enz.,
Tempo (min.)

-inibio por produto.

Atividade Enzimtica

Dosagem: atravs da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reao que a enzima cataliza uma amostra da soluo contendo a enzima incubada com [ ] de substratos (Vmx.)

Produto mol/mL

Tempo (min.)

velocidade constante Para evitar a influncia destes fatores associar- se: velocidade decresce atividade medida da velocidade de reao em [ ] de substrato: inativao parcial da enz., condio inicial inibio por produto e deslocamento do (Veloc. equilbrio (reao reversvel).

Atividade Enzimtica

A velocidade da reao medida e expressa em Unidades Internacionais (UI).

1 UI a quantidade de enzima capaz de formar 1mol de produto por minuto em condies timas

Atividade Enzimtica

Mtodos para a determinao da atividade de enzimas: Conhecimento prvio da faixa de [ ] enzimtica que permite obter uma variao linear da [P] (ou [S]) com o tempo.

Mtodos para avaliar as [ ] das espcies:

Muito

diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria... Menos diretos: - Medida da Viscosidade.

Atividade Enzimtica

A medida da atividade enzimtica imprescindvel para monitorar a purificao de uma enzima. A atividade especfica: nmero de Unidades de enzima miligramas de protena Portanto se a etapa de purificao for bem sucedida a atividade especfica deve

Significa que o procedimento adotado eliminou protenas indesejveis.

Atividade Enzimtica

Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo.

2 mL 8 mL: Soluo de Amido (4%) a pH 4,2 e 60C

Caldo contendo a enzima

Aps 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml

Atividade Enzimtica

Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo.

2 mL 8 mL: Soluo de Amido (4%) a pH 4,2 e 60C

Caldo contendo a enzima

Aps 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml 1 mL - 60mg amido 1 h

Produo Industrial de Enzimas

Fonte

Animais

Lpase Pancretica, Pepsina Bromelina, Papana Lactase: S.fragilis, Lipase: A.niger

Vegetais

Microrganismos

Produo Industrial de Enzimas

A produo se faz majoritariamente por fermentao submersa Nos pases orientais h uma tradio estabelecida de utilizao da fermentao semi-slida.

Interessante para pases que dispem de resduos agroindustriais - baixo custo

Produo Industrial de Enzimas

Processo importantes prvios fermentao preparo do inculo.

Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada.

Decorrido o tempo suficiente, essa cultura inoculada no fermentador principal. Quantidade de inoculo: 1 a 10% (p/v) A produo da enzima pode ser afetada por esse parmetro.

Produo Industrial de Enzimas

Linhagem microbiana

Composio dos meios de cultivo

Sigilosamente protegida

Quimicamente conhecidos (sintticos) Matrias-primas naturais Fontes de carbono e energia, nitrognio, substncias minerais e fatores de crescimento

Produo Industrial de Enzimas

Fermentadores Mecanicamente agitados; 10.000 a 100.000 litros; Operados de modo descontnuo (batelada); Munidos de camisas ou serpentinas internas para as necessidades de aquecimento e refrigerao; Sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxignio dissolvido e espuma); As fermentaes em batelada para produo de enzimas tem durao da ordem de 30 a a150 h.

Produo Industrial de Enzimas

Processo a jusante (downstream) da fermentao

As operaes que se seguem ao processo fermentativo Dependem da localizao da enzima de interesse

Intracelular Extracelular

Extrao Enzimas Extracelulares

O caldo resfriado a cerca de 5C, o Estabilidade do produto e o Evitar o crescimento de microrganismos contaminantes.
O pH geralmente ajustado para o valor timo de atuao da enzima. A separao das clulas Centrifugao

Filtrao

Extrao Enzimas Extracelulares

Soluo clarificada contendo a enzima (livre de clulas)

Concentrao

Ultrafiltrao (utiliza a tecnologia de processos com menbranas)

Evaporao a vcuo (conduzida a T > 35C)

Extrao Enzimas Extracelulares

Soluo clarificada contendo a enzima (livre de clulas)

Concentrao

Ultrafiltrao Esta soluo diluda a nveis convenientes e (utiliza Evaporao a vcuo a tecnologia de processos acondiciona com estabilizantes da atividade enzimtica pode ser embalada (conduzida a T > 35C) com menbranas) para comercializao.

Extrao Enzimas Intracelulares

Caldo de Cultivo

Centrifugao

Romper as Clulas

Biomassa

Extrao Enzimas Intracelulares

Moagem com Esferas de Vidro

Homogeneizao em Alta Presso

Tratamentos Enzimticos

Romper as Clulas Sonificao

Tratamentos Qumicos

Extrao Enzimas Intracelulares

A ruptura das clulas libera substncias para o meio aquoso cidos Nuclicos Precipitao inmeras

Mn II

Sobrenadante

Filtrao Ultrafiltrao Concentrado

Concentrao vcuo

Purificao
Forma de apresentao e pureza
Concentrado Enzimtico

Processo Iguais

Purificao
Forma de apresentao e pureza
Concentrado Enzimtico

Processo Iguais
Forma slida: seco a vcuo ou por atomizao (spray drying)

diluda pode ser um produto comercializvel

Purificao
Forma de apresentao e pureza
Concentrado Enzimtico

Processo Iguais
Forma slida: seco a vcuo ou por atomizao (spray drying)

diluda pode ser um produto comercializvel

Peletizacao ou aglomerao

Padronizao da atividade com material slido inerte

Purificao

Quando pretende-se obter uma preparao enzimtica com > grau de pureza deve submeter-se a uma srie de tcnicas de fracionamento e purificao.
(NH4)2SO4

Concentrado Enzimtico

Precipitao

Molculas Proteicas

Centrifugao

Purificao
Quando pretende-se obter uma preparao enzimtica com > grau de pureza deve submeter-se a uma srie de tcnicas de fracionamento e purificao. solventes (NH4)2SO4 (etanol, metanol) Concentrado Precipitao Enzimtico

Molculas Proteicas

Centrifugao

Purificao
Quando pretende-se obter uma preparao enzimtica com > grau de pureza deve submeter-se a uma srie de tcnicas de fracionamento e purificao. solventes (NH4)2SO4 (etanol, metanol) Concentrado Precipitao Enzimtico

Molculas Proteicas

Centrifugao

ultrafiltrao, microfiltrao e osmose inversa

Purificao

Quando busca-se um alto grau de pureza do produto, tcnicas cromatogrficas so empregadas Carga das Molculas

Cromatografia de Troca Inica

Cromatografia de partio ou de filtrao em gel

Cromatografia de Afinidade

Tamanho da Molculas Ligao bio-especfica da enzima com os ligantes (substratos ou inibidores)

Purificao

A concentrao pode ser obtida das seguintes formas: Purificao por Cromatografia

Concentrao

Poros pequenos. Remove cerca de 70% da H2O

Remoo do solvente por membrana semi-permevel Liofilizao

Adio de um polmero tipo Sephadex G-25

Ultrafiltrao
Remoo de gua sob vcuo

Purificao

Controle de Pureza:

Eletroforese. o Tcnica de separao de molculas que envolve a migrao de partculas com a aplicao de uma diferena de potencial o As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga. Das muitas tcnicas de anlise de protenas, a eletroforese em gel a + verstil e facilmente aplicvel, o to sensvel que se podem detectar protenas que s diferem em um aa.

Purificao

O grau de purificao almejado esta relacionado aplicao do produto. No mercado esto disponveis:

Preparaes pouco purificadas, para uso tcnico ou industrial; Preparados de alto grau de pureza para uso analtico ou farmacutico.

Purificao

Produo Industrial de Enzimas

Caldo Fermentado Enzima Intracelular Separao slido/lquido
Separao slido/lquido Rompimento Celular

Enzima Extracelular

Concentrao

Precipitao c. Nuclicos
Concentrao

Purificao

Produo Industrial de Enzimas

Benefcios enzimas: ambientais de trabalhar com

- So produzidas de fontes renovveis. - So completamente degradveis. - Propiciam economia de energia, gua, (condies brandas de temperatura, pH e presso minimizando a degradao trmica dos produtos finais).