Anlisis por HPLC del 2-Fluoro2,3-dideoxiadenosina y del 2Fluoro-2,3-dideoxiinosina en plasma y orina de perro.

ANLISIS FARMACUTICO I ALUMNOS: ARQUIETA FIGUEROA XITLALI ELIZABETH VIRUETE GONZALEZ ALEXANDRA LPEZ PALOMARES VANIA MARLENE SUREZ MONTES ANGEL ANTONIO

Resumen
Un

ensayo por HPLC fue desarrollado y validado para una determinacin simultanea de 2-fluoro-2,3dideoxiadenosina (FddA) y su metabolito, 2-fluoro-2,3-dideoxiinosina (FddI) en plasma y la orina de perro. In vitro, el FddA y el FddI presentaron actividad en contra del virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

 Una

extraccin en fase slida se aplic para extraer FddA, FddI, y un estndar interno (3,5anhidrotimidina) de las biomatrices. Las muestras procesadas en el cromatgrafo fueron usando una columna de C8 junto con una fase mvil que consista en fosfato monobsico, fosfato dibsico, etilenglicol, monometilter y agua.

 La

deteccin se realiz a 257nm. Los tiempos de retencin fueron: 9, 14 y 26 minutos para el FddI, el estndar interno y el FddA, respectivamente. Los lmites inferiores de cuantificacin fueron 0.1 y 0.2g/mL en plasma y orina, respectivamente, para ambas muestras. La exactitud del ensayo fue 10% de las concentraciones normales, y la precisin fue 14% del coeficiente de variacin

 En

la matriz, ambos analitos se mantuvieron estables durante al menos tres ciclos de congelacin-descongelacin y en los medios de comunicacin de la inyeccin durante al menos 54hrs. Las recuperaciones de las extracciones de los analtos fueron superiores al 80%. La aplicacin de este ensayo fue demostrado en un estudio farmacocintico preliminar del FddA y del FddI en perros.

 Dos

perros (machos) por nivel de dosis recibieron 100, 250, o 500mg/Kg de dosis oral de FddA una vez al da por 14 das. La aparicin temprana de FddI en plasma (0.25h; el primer perodo de muestreo) y mayores niveles plasmticos de FddI que de FddA (<50 veces de la Cmax), sugirieron que la conversin de FddA a FddI fue rpida y extensiva. La excrecin renal pareca ser la principal va de eliminacin del FddI.

Introduccin

En el desarrollo de agentes teraputicos contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), anlogos de 2,3-dideoxi nuclesido (ddN) han emergido como una clase de compuestos tiles. En general, la actividad in vitro de los anlogos de ddN se atribuyen a una inhibicin competitiva de la reserva de transcriptasa viral o a un cese de la proliferacin de ADN mediante el bloqueo del grupo 3'-hidroxi.

El 2-Fluoro-2,3-dideoxiadenosina (FddA) es un anlogo del ddN. Similar al 2,3-dideoxiadenosina (ddA) y al 2,3-dedioxiinosina (ddI), in vivo el FddA sufre desanimacin para formar 2-fluoro-2,3dideoxiinosina (FddI), que tambin presenta actividad contra el VIH.
La farmacocintica del ddA, ddI y del FddA han sido reportadas en perros.

dosis de 50, 100, 250, y 500 mg/Kg, la biodisponibilidad del ddI fue del 43, 46, 48 y 12%, respectivamente. Tras la administracin oral de 50mg/Kg de ddA en solucin salina, solucin de acetato de sodio, capsulas de gelatina, y grnulos revestidos entricos, la biodisponibilidad de la ddI fue del 30, 61, 52, y 67%, respectivamente.

Sin embargo, la biodisponibilidad oral del FddI despus de una dosis de 50 mg/kg de FddA, aumento a 83% debido a una mayor estabilidad de FddA/FddI respecto al ddA/ddI en las condiciones de pH gstrico.

En este trabajo se describe un ensayo recin desarrollado y validado por un anlisis simultneo de FddA y FddI en muestras de plasma y orina de perro. La aplicacin del mtodo en un estudio farmacocintico preliminar de FddA y de FddI en perros tras la administracin oral repetida de FddA tambin se presenta

Materiales
FDDA

(N de lote E90D718), FDDI (Lote N. 27625-73-2), y el estndar (5'-anhydrothymidine, N de Lote 25.867-753 el plasma control de perro beagle fue comprado en Cocalico Biologicals (Reamstown, PA). La orina Control de perro beagle fue recogida en casa.

Metanol grado HPLC (aplicacin de la Cromatografa Lquida de Alta Presin), fosfato de potasio monobsico y dibsico, y 85% de cido fosfrico Etilenglicol monometil ter Trietilamina, TEA. Tampones y la fase mvil se prepararon utilizando agua purificada columnas de extraccin, con envases C18

Equipo
El sistema cromatogrfico consisti en :
un

sistema de distribucin del disolvente, modelo de agua 590 un autoinyector WISP 712 y un detector ultravioleta, Kratos Spectroflow 783 (ABI analtica, Ramsey, NJ).

 Un

procesador de vaco, que se utiliza para realizar la extraccin de la fase slida (SPE). Un evaporador de Turbo-Vap, utilizada para evaporar la fase orgnica de las muestras obtenidas mediante una suave corriente de nitrgeno.

Preparacin de patrones y muestras de control de calidad

El

plasma y la orina contiene FDDA y FDDI Se prepararon las curvas de concentracin. en plasma y orina vari desde 0,1 hasta 20 g / ml y de 2 a 257 g / ml, respectivamente. 3 muestras de plasma de control de calidad (QC) con FDDA y FDDI y dos muestras de orina de control de calidad que contiene tanto FDDA (36,0 o 366 g / ml) y FDDI (42,0 o 420 g / ml) se

Extraccin de muestra
En plasma: El plasma fue obtenido por un extractor utilizando una columna C18 de SPE. las columnas de SPE fueron activadas con 1 ml de metanol 1 ml de tampn fosfato 10 mM (pH 8).

Una alcuota de 0,5 ml de muestra de plasma del perro fue colocada en la columna de la SPE, adicionndole 0.15ml de estndar (5 g /mL).

 Las

columnas se lavaron con 0,8 ml de tampn fosfato 10 mM (pH 8), y la elucin final se realiz con 0,5 ml. de metanol que contiene 0,25% de trietilamina. El efluente de plasma se evapor bajo una corriente ligera de nitrgeno (40 C), seguida de la reconstruccin de los residuos en 0.15 mL de fase mvil, la incorporacin de trietilamina en el proceso de elucin final lleva a la recuperacin constante de los analtos.

Orina hubo interferencias endgenas en la orina que, no pudieron ser eliminadas por la SPE. antes de la extraccin, las columnas se lavaron con 3 ml de metanol, seguido de 6 ml de tampn 20 mM fosfato (pH 8). Un volumen de 0,5 ml de la muestra de orina fue colocado en la columna, seguido por la adicin de una alcuota de 0,1 mL de patrn (400 g / ml). las columnas se lavaron secuencialmente con 3 ml de cada una de las siguientes:

 fosfato

monobsico20 mM, fosfato dibsico 20 mM y agua. Las columnas se secaron al vaco y la elucin se realiz con dos alcuotas separadas de 0,5 ml de metanol al 70% que contiene 0,02% de trietilamina. El fluido se mezcl con 1 ml de 20 mM de tampn fosfato (pH 7.2) antes de la transferencia de automuestreador.

Condiciones de cromatografa
Se

utiliza cromatografa de DuPont Zorbax columna C8 La deteccin se realiz a 257 nm a temperatura ambiente. Las condiciones cromatogrficas empleadas para el anlisis de plasma se utiliza para muestras de orina.

Validacin de La precisin intraensayo y precisin del mtodo se procedimientos

evaluaron mediante anlisis de rplicas de dos (orina) y tres (plasma) a diferentes concentraciones. La exactitud y la precisin interensayo se determin de manera similar, excepto que el anlisis se llev a cabo en por lo menos tres das diferentes. La estabilidad si FDDA, FDDI, y el patrn interno en la inyeccin de solventes se determin mediante la inyeccin peridica. Las respuestas de los analitos obtenidos en 0 h se utiliz como referencia para determinar la estabilidad.

 La

estabilidad de la FDDA y FDDI despus de congelacin y descongelacin fue investigado durante 3 ciclos. La recuperacin de la extraccin de cada analto en la matriz apropiada se determin mediante la comparacin de las pendientes de las normas de procesado frente a las normas ordenadas en el mismo intervalo de concentracin.

Animales protocolo
Seis

perros beagle macho (edad, desde 1,5 hasta 2,5 aos, peso, 7.13 kg) fueron asignados aleatoriamente a uno de los tres grupos de tratamiento: 100, 250 y 500 mg / kg / da de FDDA. Cada perro recibi una cpsula de FDDA por va oral, administrada con 50 ml de agua, una vez al da alrededor de las 8:00 AM para 14 das. Las muestras de sangre (3mL) fueron obtenidas por puncin venosa yugular, inmediatamente transferidos a tubos de

 Las

muestras de plasma fueron cosechadas y almacenadas a -20 C hasta su anlisis. Una muestra de orina acumulada 0-24 h se recogi el da 13. Despus de la salida total de orina se midi, una alcuota de 3 mL de muestra de orina de cada perro. Las muestras de orina buffer fueron almacenadas a -20 C hasta su anlisis.

Los clculos farmacocinticos

Los

parmetros farmacocinticos, como la concentracin plasmtica mxima (Cmax), tiempo hasta la concentracin plasmtica mxima (tmax), la vida media (t1 / 2) se determinaron por mtodos convencionales. La cantidad de cambios FDDA o FDDI en la orina se reporta como el porcentaje de la dosis administrada de FDDA.

Ensayo de validacin

La comparacin de los cromatogrmas procesados entre el plasma de perro blanco y el plasma enriquecido, y la orina del perro en blanco y la punta de la orina (datos no mostrados) indicaron que no hubo picos significativos de interferencia en los tiempos de retencin de FDDA, FDDI, o el estndar interno. Las relaciones de mximo observado de altura, para FDDA o FDDI, fueron lineales (R ^ (2) 0.998) en los 2-257g/mL rango de concentracin en la orina del perro. Los valores LLQ se establecieron como 0.1 y 0.2 g / ml en plasma y orina,

 Los

valores observados media de FDDA y FDDI en el plasma del perro fueron 0,094 y 0.097g/mL, respectivamente, se desviaron menos de 6% de la concentracin normal correspondiente. Los valores observados media de FDDA y FddI en la orina del perro fueron 1.95 y 2.14g/mL, respectivamente, que se desviaron menos del 7% de la concentracin normal correspondiente. El coeficiente de variacin, para analto en el lmite inferior de cuantificacin fue

 los

valores de precisin para las tres concentraciones de control de calidad de FDDA o FDDI fueron 14% CV y los valores de exactitud fueron de 10% de desviacin de la concentracin normal correspondiente. FDDA, FDDI, y el estndar interno se mantuvieron estables en el proceso de las muestras de control de calidad (plasma u orina) reconstituidas en el medio de la inyeccin.

Durante un perodo de 54h de la inyeccin, las respuestas observadas HPLC para FDDA (normal: 1,5 y 14,6 g / ml), FDDI (normal: 1.6 y 16.3 g / ml), y de patrn interno (normal: 5.0 g / ml) se desviaron menos de 15% de las correspondientes respuestas HPLC obtenidas a partir de la primera inyeccin. Durante un perodo de 76 h de la inyeccin, la respuesta observada en la orina FDDA (normal de 8.3 y 416 g / ml), FDDI (normal: 8.1 y 403 g / ml), y de patrn interno (normal: 400g/mL) desviado a menos de 9% de las respuestas correspondientes obtenidas a

Datos de congelacindescongelacin

La estabilidad obtenida a partir de muestras de control de calidad sugerido por FDDA y FDDI, en el plasma y la orina del perro se mantuvieron estables durante al menos 3 ciclos de congelacin y descongelacin. En el plasma, las concentraciones observadas de FDDA (normal de 0.9, 4.0 y 13.6 g / ml) se desvi < 14,0% de la normal con una precisin de CV 6,9%. En la orina, las concentraciones observadas de FDDA (normal: 19,3 y 302 g / ml) y FDDI (normal: 20,3 y 294 g / mL) se desvi <12,1% de la normal con una precisin de CV 2,2%. FDDA y FDDI se mantuvieron estables en el plasma

La media de las concentraciones observadas de control de calidad de FDDA (normal: 0.5, 5.1 un 15,4 g / ml) y FDDI (normal: 0.6, 5.2, y 15.8 g / mL) en el plasma estaban dentro de 15% de la concentracin normal respectiva. La media de las concentraciones observadas de control de calidad de FDDA (normal: 44,6 y 446 g / ml) y FDDI (normal: 48,0 y 480 g / mL) en la orina, desviada menos del 3,4% de la concentracin normal respectiva. Las recuperaciones de muestra procesada de FDDA y FDDI en el plasma del perro fueron de un 98,5% y 89,8%, respectivamente. Las recuperaciones correspondientes en la orina fueron 85,4% y 94%, la recuperacin del estndar interno se encontr que el 84,5% y 99,1% en el plasma y la orina de perro, respectivamente.

Aplicacin al estudio farmacocintico preliminar.

Slo

pequeas cantidades de FDDA (<1% de la dosis) se encontraron la orina sin importar el nivel de dosis. Por otro lado los valores de recuperacin urinaria de FDDI disminuyeron a medida que la dosis administrada se excreta como FDDI disminuy a medida que aument la dosis administrada.

 La

recuperacin urinaria de FDDI disminucin en el nivel de dosis ms alta, junto con el aumento menos que proporcional en la exposicin sugiere que la absorcin de FDDA / FDDI disminuy a medida que la gama administrados.

En conclusin

Los mtodos de anlisis para la cuantificacin simultnea de FDDA y FDDI en el plasma y la orina del perro son sensibles, exactos, precisos y reproducibles.

Aplicacin de la prueba a un estudio preliminar de farmacocintica en perros

indicaron que FDDI fue la fraccin principal

circulante despus de la administracin de FDDA. En la conversin in vivo de FDDA a