!

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Tecnche d sepcrczone Tecnche d sepcrczone
Esperimento di TSWETT: Esperimento di TSWETT:
studi suIIa cIorofiIIa studi suIIa cIorofiIIa
.....
a

A
B
C
D
E
!
$
0e]nzon dellc cromctoyrc]c 0e]nzon dellc cromctoyrc]c
Iase mob||e
o e|uente
Iase f|ssa o staz|onar|a
e|u|to
Co|onna d| Co|onna d|
separaz|one separaz|one
!
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\eloctc (o tempo) d eluzone \eloctc (o tempo) d eluzone
!
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Pcrcmetr cncltc Pcrcmetr cncltc
W W #f : #f : rat|o front|s (rapporto tra || fronte
de||'e|uente e |o spaz|o percorso da||'e|u|to)
W W Tr : Tr : tempo d| r|tens|one (tempo |mp|egato
da ogn| e|u|to a percorrere uno stesso spaz|o
!
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Prncp dellc sepcrczone Prncp dellc sepcrczone
Maggiore interazione Maggiore interazione
minore velocit minore velocit
Minore interazione Minore interazione
maggiore velocit maggiore velocit
!
$
Tp d cromctoyrc]c Tp d cromctoyrc]c
1LC (Lhln layer chromaLography)
cromaLografla su sLraLo soLLlle
LLC llquldllquld chromaLography
PLC Plgh erformance Llq Chrom
lLC lon Lxchange ChromaLography
CC Cas ChromaLography
1LC (Lhln layer chromaLography)
cromaLografla su sLraLo soLLlle
LLC llquldllquld chromaLography
PLC Plgh erformance Llq Chrom
lLC lon Lxchange ChromaLography
CC Cas ChromaLography
!
$
Tp d cromctoyrc]c n bcse cll'e]]etto dellc ]cse Tp d cromctoyrc]c n bcse cll'e]]etto dellc ]cse
stczoncrc stczoncrc
CromaLografla dl assorblmenLo (C) CromaLografla dl afflnlL (C L) CromaLografla dl scamblo lonlco (L)
CromaLografla dl rlparLlzlone
a fase lnversa (L)
CromaLografla dl escluslone
molecolare (CC molsleve) (L)
CromaLografla dl accopplamenLo
lonlco (L)
!
$
TLC TLC
!
$
Prncpo dellc TLC cscendente Prncpo dellc TLC cscendente
!
$
Cromctoyrc]c su ccrtc Cromctoyrc]c su ccrtc
La clorofllla separaLa
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Colonne HPLC Colonne HPLC
CromaLografla
preparaLlva
ulmenslonl
!
$
Eluzon dellc Cromctoyrc]c Lqudc Eluzon dellc Cromctoyrc]c Lqudc
lsocraLlco eluenLe a
concenLrazlone cosLanLe
CradlenLe 1 eluenLe a due
concenLrazlonl o 2 eluenLl
!
$
HPLC: cromctoyrc]c lqudc cd clte prestczon HPLC: cromctoyrc]c lqudc cd clte prestczon
Computer Computer
e data e data
store store
Unita di Unita di
pompaggio pompaggio
eluenti e eluenti e
iniezione iniezione
campioni campioni
Colonna di Colonna di
separazione separazione
detector detector
!
$
Cromctoyrcmm HPLC Cromctoyrcmm HPLC
!
$
Cromctoyrcmm HPLC Cromctoyrcmm HPLC
!
$
Schemc d 6cs cromctoyrc]o Schemc d 6cs cromctoyrc]o
!
$
6C: prncpo d ]unzoncmento 6C: prncpo d ]unzoncmento
!
$
Tempercturc sotermc e proyrcmmctc Tempercturc sotermc e proyrcmmctc
1
1empo
1
1empo
1
1empo
!
$
!
$
44330 44330
mpaccate
Capillari
!
$
ll "pcco" cromctoyrc]co ll "pcco" cromctoyrc]co
.~.. ~.
.~..,..~. -
-.. .
....~.

.
~
.
.

.

~
.

.
.
,
~
.

.
.~.. ~.
..~...~.
!
$
Potere rsolutvo cumentcto Potere rsolutvo cumentcto
!
$
Chromctoyrcms Chromctoyrcms 551.1 551.1
!
$
Chromctoyrcms Chromctoyrcms 04 04
$:pelco

PTE-5 $:pelco

$PB-50
!
$
Spettrometrc d Mcssc Spettrometrc d Mcssc
% La SpeLLromeLrla dl Massa (MS Mass SpecLromeLry) e una Lecnlca che consenLe dl separare
anallLlcamenLe lonl aLomlcl o molecolarl con una o plu carlche eleLLrlche per mezzo dl un campo
LleLLrlco e dl un campo MagneLlco opporLunamenLe accopplaLl
% ll camplone vlene lnLrodoLLo ln fase gassosa nella camera dl lonlzzazlone ad alLo vuoLo qul vlene
faLLo lnLeraglre con una fonLe dl alLa energla (bombardamenLo)
% vvlene cosl
lonlzzazlone della molecola con formazlone dl lone molecolare
8oLLura del legaml con frammenLazlone dello lone molecolare
lonlzzazlone del frammenLl
% Cll lonl sono acceleraLl da un campo LleLLrlco v e deflessl da un campo MagneLlco P ad esso
perpendlcolare
% ll parameLro fondamenLale e ll rapporLo massa/carlca (m/z) dello lone con 8 ragglo della
LraleLLorla curva
mm P P
22
8 8
22
z z 2v 2v

!
$
Cosc ]c lc 6C Cosc ]c lc 6C MS MS
% La Cas cromaLografla produce frazlonl pure da mlscele
8esponsablle della Lrasformazlone dl mlscele complesse ln eluenLl purl
% La SpeLLromeLrla dl massa fornlsce lnformazlonl quallLaLlve assoluLe a
proposlLo delle slngole frazlonl
La comblnazlone del rlsulLaLl del due meLodl ln 3 La comblnazlone del rlsulLaLl del due meLodl ln 3 u u
fornlsce sla lnformazlonl quallLaLlve e quanLlLaLlve fornlsce sla lnformazlonl quallLaLlve e quanLlLaLlve
!
$
Spettrometrc d Mcssc Spettrometrc d Mcssc
% La MS e una comblnazlone dl lonlzzazlone frammenLazlone separazlone
e rlconosclmenLo del frammenLl oLLenuLl
ll rlsulLaLo e ll caraLLerlsLlco speLLro dl massa
. .
..


!
$
6C e sensbltc de vcr detectors / ]rcmmentczone 6C e sensbltc de vcr detectors / ]rcmmentczone
Lu Lomlc Lmlsslon ueL Lu Lomlc Lmlsslon ueL
1Cu 1hermal ConducLlvlLy ueL 1Cu 1hermal ConducLlvlLy ueL
llame lonlsaLlon ueL llame lonlsaLlon ueL
LCu LlecLronlc CapLure ueL LCu LlecLronlc CapLure ueL
nu nlLrogen hosphorous ueL nu nlLrogen hosphorous ueL
lu llame hoLomeLrlc ueL lu llame hoLomeLrlc ueL
l1l8 lourler 1ransformed l8 ueL l1l8 lourler 1ransformed l8 ueL
MS (SlM) MS Slngle lon Mass MS (SlM) MS Slngle lon Mass
!
$
Schemc strumento MS e nter]cccc 6C Schemc strumento MS e nter]cccc 6C
!
$
lnter]cccc 6C / MS lnter]cccc 6C / MS
FIusso daI Gascromatografo
SoIo
pochissima
sostanza
entra
neII'interfac
cia MS
!
$
Tp d lonzzczone Tp d lonzzczone
Ci sono svariati metodi di ionizzazione
!
$
El = Electron lmpcct El = Electron lmpcct
% LleLLronl con energla dl 70 ev lmpaLLano le molecole neuLre
% ;uesLo sconLro espelle un eleLLrone dalla molecola generando uno lone
molecolare (plu un po' dl energla)
% L'energla ln eccesso produce vlbrazlonl roLazlonl e rlarranglamenLl molecolarl
% La molecola sl frammenLa ln pezzl sLablll e rlproduclblll secondo la sua
archlLeLLura
!
$
eagente + Mo|eco|a
Ione camp|one
lonzzczone Chmcc lonzzczone Chmcc
Dn meLodo dl lonlzzazlone blando
ConslsLe ln una carlca lonlca che vlene LrasferlLa da un reagenLe lonlzzaLo
ad una molecola camplone da lonlzzare
Lo schema e ll seguenLe
ll rlsulLaLo prodoLLo e una frammenLazlone mlnore con una
produzlone magglore dello lone molecolare
eagente + mo|eco|a
|on|zzata
!
$
Scopo e mecccnsmo dellc MS Scopo e mecccnsmo dellc MS
!
$
Mecccnsmo d selezone Mecccnsmo d selezone
2
!
$
Schemc c blocch d un MS Schemc c blocch d un MS

!
$
Frcmment tpc Frcmment tpc
!
$
Accoppcmento 6C Accoppcmento 6C MS MS
!
$
lnterpretczone MS lnterpretczone MS
ll plcco a plu alLo m/z e chlamaLo "picco mo/eco/ore" e rappresenLa ll frammenLo a
plu alLo M che colnclde con quello della molecola
ll plcco plu abbondanLe e chlamaLo "picco podre" e rappresenLa ll frammenLo plu
sLablle e rappresenLaLlvo della molecola
Lsemplo metono/o
... ~.....
... ..~.
!
$
Esemp d ]rcmmentczone Esemp d ]rcmmentczone
4-eptanone
C
7
H
14
O
MW = 114.19
1-Bromopropano
C
3
H
7
Br
MW = 123.00
acetato di etiIe
C
4
H
8
O
2
MW = 88.11
!
$
Esemp J Esemp J
n-ButiIammina
C
4
H
11
N
MW = 73.13
NaftaIene
C10H8
MW = 128.17
acido 2-Butenoico
C
4
H
6
O
2
MW = 86.09
!
$
Esemp 2 Esemp 2
n-esano
C
6
H
14
MW = 86.18
3-feniI-2-propenaIe
C
9
H
8
O
MW = 132.16
3-PentanoIo
C
5
H
12
O
MW = 88.15
!
$
Accoppcmento 6C Accoppcmento 6C MS MS
!
$
MS MS - - MS o spettrometrc d Mcssc TAN0EM MS o spettrometrc d Mcssc TAN0EM
% a spettrometr|a d| massa 1andem (MSMS) e molLo plu dl uno
sLrumenLo anallLlco e pu essere usaLa per sLudl sLruLLural e per
sequenze (ad es roLelne un genl)
% uue Lre e anche quaLLro anallzzaLorl possono essere messl ln serle
quesLl possono anche essere dl Llpl dlversl ln quesLo caso sl prla dl
rlvelaLorl l88lul
% l plu uLlllzzaLl sono l quadrupo|o quadrupo|o settore magnet|co
quadrupo|o e plu recenLemenLe l quadrupo|o 1CI (LlmeoffllghL
Lempo dl volo)
!
$
l ycscromctoyrc] l ycscromctoyrc]
!
$
Strument ndspenscbl per l trcttcmento de ccmpon Strument ndspenscbl per l trcttcmento de ccmpon
&ltramicrobilancia:
precisione = 0,0001 mg
Vial Pan
!
$
lmportcnzc dellc dervctzzczone n 6C lmportcnzc dellc dervctzzczone n 6C MS MS
!
$
Prey de sstem d dervctzzczone Prey de sstem d dervctzzczone
% % 8esa quanLlLaLlva su mlnlmo camplone (declne dl g) 8esa quanLlLaLlva su mlnlmo camplone (declne dl g)
% % lML lML
derlvaLlzzazlone del gllcerolo (quanLlLaLlva degll oll) derlvaLlzzazlone del gllcerolo (quanLlLaLlva degll oll)
derlvaLlzzazlone degll acldl reslnlcl (reslne) derlvaLlzzazlone degll acldl reslnlcl (reslne)
derlvaLlzzazlone degll ac blcarbosslllcl lnferlorl acldo ossallco derlvaLlzzazlone degll ac blcarbosslllcl lnferlorl acldo ossallco
(alLerazlone) (alLerazlone)
% % MlnCClul MlnCClul
derlvaLlzzazlone successlva sullo sLesso camplone derlvaLlzzazlone successlva sullo sLesso camplone
oLLenlmenLo del masslmo numero dl derlvaLl dl ammlnoacldl senza oLLenlmenLo del masslmo numero dl derlvaLl dl ammlnoacldl senza
perdlLa dl lnformazlonl perdlLa dl lnformazlonl
!
$
#ecyent d dervctzzczone #ecyent d dervctzzczone
% % cldl grassl lML (faLLy acld meLhyl cldl grassl lML (faLLy acld meLhyl
esLhers) esLhers)
(m (m Lrlfluoro meLll Lrlfluoro meLll fenll) LrlmeLll ammonlo fenll) LrlmeLll ammonlo
ldrossldo ldrossldo
esLerl meLlllcl rapldl (forma l sall con gll acldl esLerl meLlllcl rapldl (forma l sall con gll acldl
ldrollzzaLl e LransesLerlflca nell'lnleLLore ldrollzzaLl e LransesLerlflca nell'lnleLLore
caldo) caldo)
molLo plu efflclenLe del meLllanLl Lradlzlonall molLo plu efflclenLe del meLllanLl Lradlzlonall
(gllcerolo blcarbosslllcl lnferlorl molLo (gllcerolo blcarbosslllcl lnferlorl molLo
reaLLlvl e polarl reaLLlvl e polarl
sallflca a LemperaLura amblenLe o Lleplda sallflca a LemperaLura amblenLe o Lleplda
(40 (40 C) C)
% % mmlnoacldl eLllcloroformlaLo (LCl) derlvaLl mmlnoacldl eLllcloroformlaLo (LCl) derlvaLl
oLLenlmenLo dl derlvaLl plu pesanLl" e oLLenlmenLo dl derlvaLl plu pesanLl" e
separazlonl mlgllorl separazlonl mlgllorl
derlvaLlzzazlone quanLlLaLlva derlvaLlzzazlone quanLlLaLlva
Lempl rldoLLl dl anallsl Lempl rldoLLl dl anallsl
oLLlmo rapporLo Lra ll peso del camplone e l oLLlmo rapporLo Lra ll peso del camplone e l
rlsulLaLl anallLlcl rlsulLaLl anallLlcl
aLLacco dl ClCCCLL anche su alLrl Lermlnall aLLacco dl ClCCCLL anche su alLrl Lermlnall
polarl (n C S) posslblllL dl derlvaLlzzazlone polarl (n C S) posslblllL dl derlvaLlzzazlone
anche dl alLre molecole anche dl alLre molecole
C
F
F
F
N
+
CH
3
CH
3
CH
3
OH
-
H
2
N CHR CO
2
H
+
CI CO
2
Et
EtO
2
CHN CHR CO
2
Et
+ 2
CO
2 +
HCI
!
$
6otto: Croc]sso d S.M. Novellc, vernc e leycnt 6otto: Croc]sso d S.M. Novellc, vernc e leycnt
C. 8 = G1v
w=37 g
C. 12 = G2b
w=87 g
!
$
Croce d 6otto: c. 8 spettr MS pcch 21.' e 24.4' Croce d 6otto: c. 8 spettr MS pcch 21.' e 24.4'
!
$
Croc]sso d 6otto: cdesv dcl retro Croc]sso d 6otto: cdesv dcl retro
C. 21 = G4g
w=3S g
C. 22 = G5g
w=33 g
C. 24 = G6g
w=128 g
!
$
Conjronto tra due standard ed tre adesv dal retro della Conjronto tra due standard ed tre adesv dal retro della
Croce d Cotto Croce d Cotto
standard caseina standard caseina
standard colla di ossa standard colla di ossa
Ciotto c.21: colla dal retro Ciotto c.21: colla dal retro

Ciotto c.22: colla dal retro Ciotto c.22: colla dal retro
Ciotto c.23: colla dal retro Ciotto c.23: colla dal retro
!
$
6otto (Croce e Stmmcte): cmmcnnture 6otto (Croce e Stmmcte): cmmcnnture
C. 18 = G3a
w=134 g
C. 19 = G7a
w=1S8 g
!
$
Cotto: conjronto de leyant dell'ammanntura de due Cotto: conjronto de leyant dell'ammanntura de due
dnt dnt - - Croce d S. Mara Novella e Stmmate del Louvre Croce d S. Mara Novella e Stmmate del Louvre
&timmate Louvre
Croce &. Naria Nov.

Narkers tipici Narkers tipici

dell'olio di lino dell'olio di lino

Picco acido Picco acido

ossalico ossalico

!
$
Croce d #oscno: vernc, leycnt e cdesv Croce d #oscno: vernc, leycnt e cdesv
C. 11 = R1v
w=46 g
C. 15 = R2b
w=68 g
C. 24 = R3g
w=110 g
!
$
Coppo d Mcrcovcldo: vernc e leycnt Coppo d Mcrcovcldo: vernc e leycnt
C. 14 = C4b
w=23 g
C. 10 = C3v
w=107 g
C. 9 = C1v
w=71 g
C. 14 = C2b
w=66 g
!
$
Coppo: cromctoyrcmm delle vernc Coppo: cromctoyrcmm delle vernc
!
$
Coppo: SlC deyl on 121 e 201 m/z Coppo: SlC deyl on 121 e 201 m/z cltobollent cltobollent
!
$
Coppo: dettcylo delle vernc Coppo: dettcylo delle vernc cltobollent cltobollent
LrlLerpenl
!
$
Multscher Altcre: leycnt Multscher Altcre: leycnt
C. 17 = F2b
w=6S g
C. 16 = F1b
w=113 g
!
$
Lc Prols Lc Prols
!
$
Prolzzctore con sondc c sprcle (col probe) Prolzzctore con sondc c sprcle (col probe)
!
$
6C con Prolzzctore 6C con Prolzzctore
!
$
Pl#LlSl Pl#LlSl
% rocesso dl degradazlone Lermlca dl molecole organlche che sl
rlarranglano ln frammenLl LermodlnamlcamenLe sLablll
plrollzzaLore
CCMS con plrollzzaLore
!
$
Proyrcmm d ]bre e polmero Proyrcmm d ]bre e polmero
!
$
Esemp d pctterns proltc d polmer sntetc Esemp d pctterns proltc d polmer sntetc
!
$
Proyrcmmc Acd 0mc Proyrcmmc Acd 0mc
230
2
!
$
Proyrcmm d mctercl usct nelle tecnche crtstche Proyrcmm d mctercl usct nelle tecnche crtstche
Cera d'apl grezza (L23' acldo esadecanolco)
lrogramml dl Lre Llpl dl reslna mbra
ua 1homas Wampler pplled pyrolysls handbook"
!
$
6C 6C MS d unc vernce MS d unc vernce
ua Marla erla Colomblnl uCClDnll
!
$
Esempo d Proyrcmmc: Polenc Esempo d Proyrcmmc: Polenc
(Jo C cblovotl et ol uNl8O)
C Chlavarl Dnl8C
!
$
Proyrcmmc: resnc 0cmmcr Proyrcmmc: resnc 0cmmcr
C Chlavarl Dnl8C
!
$
Proyrcmmc: lo sccctvo Proyrcmmc: lo sccctvo
C Chlavarl Dnl8C
!
$
Esempo: Mcttc Pret Esempo: Mcttc Pret
1
2
3
4
9
5
6
8
7
FIgura 4: Spettro dI massa con II
caratterIstIco pattern IsotopIco deI
mercurIo (Camp. 2)
192 194 196 198 200 202 204 206 208
m/z
198
199
200
201
202
203
204
C Chlavarl Dnl8C
!
$
Esempo: Mcttc Pret Esempo: Mcttc Pret
100 12 10 1 200
m/z
2
6

92
104
120
133
10
16
194
209
Spettro dI massa deII'acIdo benzoIco
2 amIno ThS estere, marker
deII'Indaco neI campIone 3
C Chlavarl Dnl8C