15.

Propiedades de las protenas

Titulacin cido-base de una protena

14 12

Carga negativa neta

10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100

pH

pI

Carga positiva neta

Base aadida (uu.arbitrarias)

Grupos disociables de una protena

(Se indica el pKa de la cadena lateral en cada caso) cidos (aninicos, - ) Asp Cys Glu Tyr 3.86 10.78 4.25 10.07 Bsicos (catinicos, + ) Arg His Lys 12.48 6.00 10.53

Aninicos: carga negativa neta por encima de su pKa Catinicos: carga positiva neta por debajo de su pKa

Protenas cidas: punto isoelctrico (pI) inferior a 7 Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentan carga negativa neta. Protenas bsicas: punto isoelctrico (pI) superior a 7 Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentan carga positiva neta.

En el medio biolgico, son, por lo general, ms abundantes las protenas cidas.

Muestra

Electroforesis
1. Se realiza sobre un soporte slido o semislido, para minimizar efectos de difusin

2. Se somete el conjunto a un campo elctrico constante, a un pH fijo; las protenas migran conforme a su carga elctrica 3. Terminada la carrera electrofortica, las protenas se tien con un colorante adecuado (p.e., Azul de Coomassie)

Muestra: tres componentes mezclados

Fundamento de la cromatografa
Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria

Fase estacionaria

Se hace fluir una fase mvil sobre la estacionaria

Dependiendo de la afinidad relativa por ambas fases, los componentes de la mezcla primitiva se separan

Fase mvil

Tipos de cromatografa
1. Intercambio inico - Separa segn carga elctrica - Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble - Fase mvil: gradiente de sal o de pH 2. Particin - Separa segn solubilidad en solventes - Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte slido - Fase mvil: El otro solvente fluyendo

3. Afinidad - Separa segn la afinidad de la protena por un ligando inmovilizado - Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble - Fase mvil: (1) solucin sin ligando (2) solucin con ligando libre 4. Hidrofbica - Separa segn hidrofobicidad - Fase estacionaria: grupos hidrofbicos unidos a un soporte insoluble - Fase mvil: gradiente inverso de sal 5. Exclusin molecular - Separa segn tamao molecular - Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados - Fase mvil: solucin tamponada

+ + + + + + + + +

Intercambio inico
+ + + + + + + + +

--

- - - -

+ + + + + + + + +

- - - - - - - - -

Protenas adsorbidas al intercambiador inico

A baja concentracin de sal, se desprenden las protenas menos electronegativas

A mayor concentracin de sal se desprenden las protenas ms electronegativas

HOCH2 O O O OH H H OH Celulosa H

HOCH2 H OH H O O H OH n H

Soportes cromatogrficos

O CH2
Agarosa HOCH2 OH O CH2 O H OH H n H O H OH O O H

H OH OH H

O H OH

H O

Dextrano

CH2 H OH OH H O H OH H O n

H O

CH3 CH2 CH2 CH3 CH2 CH2 NH+ CH2 CH3 Dietilaminoetil (DEAE) CH3 CH2 CH2 CH2 N+ CH2 CHOH CH3 CH2 CH3 Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE) CH2 CH2 N+ CH2 CH3 CH2 CH3 Trietilaminoetil (TEAE)

O CH2 COOCarboximetil (CM) CH2 CH2 S OO Sulfoetil (SE)

O CH2 CH2 CH2 S OO Sulfopropil (SP)

O O P OOFosfo (P)

B o

r is t

lt ic

G d C

e e o

n e ra d o r g r a d ie n t e lu m n a R e s in a in t e r c a i n ic o d m e b io

C o le c t o r d e f r a c c io n e s

Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de adsorcin a colorantes

O

O CH2 N O HN NH N SO3Cibacron Blue F3GA NH SO3N

Matriz de agarosa

Cromatografa de afinidad

Solubilidad

pI Punto isoelctrico

pH

Solubilidad Salting out Salting in

Fuerza inica, (M)

Solubilidad, g/L 100

0 0 100 Temperatura, C

Peso molecular de las protenas

1. Mtodos primitivos: presin osmtica, ultracentrifugacin analtica, etc. 2. Cromatografa de exclusin molecular 3. Electroforesis SDS-PAGE 4. Clculo directo a partir de estructura primaria

Cromatografa de exclusin molecular

V o l u m 2 8 0 2 4 0 2 0 0 1 6 0 1 2 0 8 0 4 0
3

e n
G l u c a g o C n i t o c r o m o c

i b

o n

u c l e a s a S e r o a l b m i n a

I g

T i r o g

l o b

1 0

1 0

1 0 P e s o m

1 0

o l e c u l a

Electroforesis en poliacrilamida-SDS (PAGE)

P m
S D S

s o o le c u la r

o v i lid

+
+

Mtodo de Kjeldahl
Digestin cida total de la protena y conversin cuantitativa de nitrgeno a NH3, que se valora por titulacin. Poco sensible. En desuso. Se sigue empleando para anlisis elemental (p.e., alimentos)

Protena total= N x 100/16

Absorcin a 280 nm
Se fundamenta en la absorcin a 280 nm producida por los aminocidos aromticos Phe, Tyr y Trp - Sensible y fcil de practicar - Requiere soluciones puras de protena; no es aplicable a mezclas - Distintas protenas dan diferente grado de absorcin, dependiendo de su contenido en aa. aromticos

H N H 2N C O C NH2 O

H C NH

H HN C

O NH O

HN C NH
-

Cu++ O

HN C H

Biuret

Complejo cprico coloreado

Al tratar con Cu++ en medio alcalino, los compuestos con grupos -CO-NH- dan una coloracin violeta. Muy especfica; relativamente poco sensible

Reaccin del biuret

Mtodo de Lowry
Reaccin en dos fases: 1. Reaccin del biuret 2. Tratamiento con reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteu - Muy sensible (muestras de 10 g) y sencillo - Resultados variables con distintas protenas, pues depende del contenido en aminocidos aromticos

Mtodo de Bradford
La fijacin de un colorante (Azul de Coomassie) a una protena modifica las caractersticas de absorcin visible de aqul. Sensible, fcil de practicar y resultados muy constantes

0.4 0.3 0.2

Colorante

0.4 0.3 0.2

Colorante + protena

400

500

600

400

500

600

700