Primeros trabajos con ADN recombinante

Produccin de somatostatina e insulina humana

Insulina
La insulina (del latn insula, "isla") es una hormona polipeptdica formada por 51 aminocidos, producida y secretada por las clulas beta de los islotes de Langerhans del pncreas, en forma de precursor inactivo llamado proinsulina. Esta pasa al aparato de Golgi, donde se modifica, eliminando una parte y uniendo los dos fragmentos restantes mediante puentes disulfuro. La insulina interviene en el aprovechamiento metablico de los nutrientes, sobre todo con el anabolismo de los carbohidratos. Su dficit provoca la diabetes mellitus y su exceso provoca hiperinsulinismo con hipoglucemia. Gran nmero de estudios demuestran que la insulina es una alternativa segura, efectiva, bien tolerada y aceptada para el tratamiento a largo plazo de la diabetes tipo 1 y la diabetes tipo 2, incluso desde el primer da del diagnstico. Frederick Grant Banting, Charles Best, James Collip, y J.J.R. Macleod de la Universidad de Toronto, Canad, descubrieron la insulina en 1922. El Doctor Banting recibi el Premio Nobel de Fisiologa o Medicina por descubrir esta hormona aunque se demuestro que el verdadero descubridor fue Nicolae Paulescu en 1921.

Islotes de Langerhans

Funciones de la insulina

La insulina tiene una importante funcin reguladora sobre el metabolismo, sobre el que tiene los siguientes efectos:
Estimula la glucogenognesis. Inhibe la gluconeognesis y la glucogenolisis. Promueve la gluclisis. Favorece la sntesis de triacilgliceroles (triglicridos). Para ello, estimula la produccin de acetil-CoA (por ejemplo, al acelerar la gluclisis), y tambin estimula la sntesis de cidos grasos (componentes de los triacilgliceroles) a partir de la acetil-CoA. Estimula la sntesis de protenas. Utilizacin diaria de insulina por los humanos: 1.8 mg aproximadamente.

Insulina y diabetes

El organismo humano la utiliza para regular el metabolismo del azcar, y la incapacidad para producir la insulina, genera la enfermedad conocida como diabetes. Normalmente es producida en el pncreas y los diabticos que no producen esta protena, pueden contender con la enfermedad mediante la inyeccin de la hormona. Antes de que la insulina se produjera por mtodos de DNA recombinante, se obtena del pncreas de animales; sin embargo, la insulina de origen animal no es idntica a la humana y en algunos individuos genera reacciones alrgicas.

La figura muestra la hormona insulina humana. sta es una molcula formada por dos pptidos llamados A y B, de 21 y 30 residuos de aminocidos, respectivamente. Las dos cadenas A y B de insulina estn unidas entre s por dos puentes disulfuro. Existe adems, un puente disulfuro adicional entre residuos de aminocidos de la cadena A.

Mecanismo de liberacin de insulina dependiente de glucosa en las clulas del pncreas.

Sntesis de insulina en las clulas islotes del pncreas

Se representa un gen de insulina tpico de una clula de un mamfero, con intrones, secuencias codificadoras (exones) y secuencia de regulacin, que se utilizan para la transcripcin.

Brevemente, antes del inicio del gen de la insulina (en la regin que bordea el extremo 5), se encuentran varios elementos de secuencia que son decisivos para la produccin de insulina. Diversas protenas de regulacin se unen a estas secuencias y se activan. Diversas protenas de regulacin se unen a estas secuencias y se activan. En las clulas que no producen insulina se bloquean los fragmentos de ADN mediante otras protenas.

Sntesis de insulina en las clulas islotes del pncreas

La ARN polimerasa empieza su trabajo de transcripcin tras estas secuencias. Los finales del ARNm transcrito en eucariotas se modifican con un 5-cap (caperuza) y una cola de 3-poliA (adeninas). La caperuza debe proteger de la degradacin por enzimas (fosfatasas y nucleasas) y refuerza la traduccin. La cola poliA no se codifica en el ADN y estabiliza abiertamente el ARNm.

Sntesis de insulina en las clulas islotes del pncreas

Tambin la velocidad de la sntesis de insulina puede regularse incluso tras la traduccin en el ribosoma; la preproinsulina (128 aminocidos) es ms larga que la hormona activa. Enzimas especiales fragmentan en el extremo amino a una corta parte (24 aminocidos), que sirve como secuencia seal para atravesar la membrana del retculo endoplasmtico. A continuacin, la proinsulina creada de esta manera se separa de ella liberando la parte central de la cadena polipeptdica (pptido C). Las dos cadenas cortas A y B forman la insulina terminada. Mediante puentes disulfuro entre cistenas se mantienen unidas. Tras su sntesis, la cantidad de protena activa se regula frecuentemente en el cuerpo por retroacoplamiento.

Experimento de Gilbert y Villa-Komaroff (1977)

En 1977, Walter Gilbert y Lydia Villa-Komaroff, de la Universidad de Harvard, utilizaron un tumor de clulas beta en pncreas de rata y a partir de ellas, introdujeron los genes para la insulina en bacterias. Insertaron los genes de la insulina de rata en un plsmido junto con los genes de resistencia de penicilina y tetraciclina. Utilizando tcnicas de radioinmunoensayo se detect la produccin de la insulina en las bacterias y posteriormente se purific, utilizando enzimas digestivas que retiraron el aminocido tripsina y el pptido C.

El primer ensayo de insulina obtenida por tcnicas de ADN recombinante se dieron en Inglaterra en 1980, utilizando 17 voluntarios. Dos aos despus se autoriz el uso mdico en humanos de esta insulina.

Esquema en el que se muestran los procedimientos para sintetizar y clonar un gene hbrido que permiti la produccin de la hormona humana somatostatina en la bacteria Escherichia coli. Este fue el primer experimento en que se demostr que es posible producir protenas humanas en bacterias. En este caso, el gene sinttico que codifica para la hormona, el cual estuvo construido a partir de ocho fragmentos de DNA sintticos, fue unido al extremo del gene que codifica para la enzima bgalactosidasa de la bacteria E. coli y ambos fueron clonados en el plsmido pBR322. Despus de transformar a la bacteria con el DNA recombinante, el plsmido hbrido permiti la sntesis de una protena hbrida b-galactosidasasomatostatina (con el segmento de somatostatina en el extremo carboxilo de la protena), que al ser purificada y tratada con bromuro de ciangeno, permiti liberar a la hormona somatostatina, a la cual se le comprob su actividad biolgica.

Conversin enzimtica de la insulina de cerdo a humana Mtodo desarrollado por la Hoechst Inc. en 1980

Obtencin de insulina humana mediante dos cepas de Escherichia coli

La insulina humana recombinante fue la primera protena recombinante producida comercialmente por estos mtodos. Fue elaborada originalmente mediante la expresin, por separado, de los dos genes sintticos que codifican para las cadenas A y B que forman esta hormona. Una vez sintetizadas cada una de estas cadenas por separado en cultivos diferentes de E. coli, fueron purificadas y unidas por mtodos qumicos para generar la insulina. Cada uno de los genes codificantes para cada cadena fueron sintetizados y ligados a un vector de expresin para que pudieran ser correctamente transcritos y traducidos en forma de una protena de fusin con la enzima b-galactosidasa. El vector de expresin fue introducido en E. coli, y la protena hbrida b-gal-cadena A o B de insulina se sintetiz y se acumul en el citoplasma de las bacterias productoras. Las clulas se cosecharon y cada una de las protenas de fusin se purific por separado. Entre la regin codificadora de las cadenas y el precursor de b-galactosidasa se agreg un triplete con el codn ATG el cual codifica para el aminocido metionina, por lo que el tratamiento con bromuro de ciangeno que produce rompimiento de los residuos de metionina, libera intactas las cadenas de insulina. Las cadenas A y B se unen qumicamente para producir insulina activa.