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Proteasas
Definicin
Se trata de enzimas capaces de hidrolizar los enlaces peptdicos (subclase E.C 3.4) Protelisis limitada: limitado nmero de enlaces hidrolizables Protelisis ilimitada: proteasoma, lisosomas
Enlace Peptdico
Caractersticas
Plano Rgido Polar Restringe conformacin de la cadena polipeptdica
El Problema Qumico
Proteasas Nomenclatura
Proteasas
Nomenclatura de Schercher y Berger
Proteasas
Clasificacin segn mecanismo de accin
Serina proteasas Cistena proteasas Metaloproteasas Asprtico proteasas Treonina proteasas Glutmico proteasas
Proteasas
Clasificacin
Familia: homologa significativa a nivel de secuencia de amino cidos en la porcin cataltica. Clan: Grupos de familias que han evolucionado a partir de una protena ancestral. Similitud a nivel de estructura tridimensional
Serina proteasas
Generalidades
Familia de Qumiotripsina: Tripsina, elastasa, factores de la coagulacin XIIa, XIa, IXa, plasmina Familia Subtilisina, enzimas bacterianas Trada cataltica
Serina Proteasas
Mecanismo de Accin Cataltica
Trada Cataltica: His57, Asp102 y Ser195 -Formacin de acil intermediario entre el substrato y la Ser Formacin de este intermediario covalente se produce a travs de un intermediario tetrahdrico de transicin cargado negativamente Se cliva el enlace pepttico
Serina Proteasas
Mecanismo de Accin Cataltica (cont.)
Fase de deacilacin El intermediario acilenzima se hidroliza por una molcula de agua liberado el pptido y restaurando el hidroxilo en Ser La His provee una base y acepta el OH de la Ser reactiva
Cistena Proteasas
Generalidades
Papana, catepsinas lisosomales B, H y L Calpanas citoslicas Dada cataltica: Cis25, His159 juegan los mismos roles que Ser e His en serina proteasas
Cistena Proteasas
Mecanismo de Accin Cataltica
La catlisis tambin se produce a travs de la formacin de un intermediario covalente e involucra a Cys e His El nuclefilo es en este caso un ion tiolato en lugar de un grupo hidroxilo El tiolatio se estabiliza por la formacin de un par inico con el imidazol vecino en la His El ataque nucleflico es en este caso el par inico tiolatoimidazol en ambos pasos, por tanto no se requiere una molcula de H2O2
Metaloproteasas
Generalidades
Amplias differencias en secuencias y estructura La gran mayora contienen Zn en sitio activo Ej: Termolisina, metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs), algunas aminopeptidasas
Metaloproteasas
Mecanismo de Accin
El mecanismo cataltico lleva a la formacin de un intermediario tetrahdrico no covalente luego del ataque de la molcula de H2O unida al Zn sobre el grupo carbonilo del enlace peptdico. El intermediario se descompone por la transferencia del protn del cido glutmico al grupo NH
Asprtico Proteasas
Generalidades
Ejemplos: Familia de la Pepsina:catepsina D, renina Familia de proteasas del HIV (retropepsina). Son monomricas, por lo que la dimerizacin se requiere para formar la enzima activa Se trata de enzimas bilobuladas donde el sitio activo est entre dos lbulos homlogos. Cada lbulo contribuye con un aspartato El pH ptimo es cido para la mayora de las asprtico proteasas, donde un protn est compartido por los dos aspartatos del sitio activo El agua es activada por los aspartatos para realizar el ataque nucleoflico
Asprtico Proteasas
Mecanismo de Accin
Los 2 residuos aspartil tienen una gran proximidad geomtrica en la molcula Un aspartato se ioniza mientras que el segundo no lo est al rango de pH ptimo de 2-3 La catlisis de las asprtico proteasas no involucra la gneracin de un intermediario covalente si bien existe un intermediario tetrahdrico. El ataque nucleoflico se consigue por 2 transferencias simultneas de protones: una desde el H2O2 a la dada de dos carboxilos y otra desde la dida al oxgeno carbonilo del substrato con el consiguiente clivaje CO-NH En trminos generales es una catlisis cidobase.
Inhibidores de Proteasas
Bajo Peso Molecular
Cistena: E-64, Leupeptin Serina: Di isopropilfluorofosfato (DFP), PMSF, Benzamidina, Dicloroisocumarina Metalo: EDTA, EGTA, Fenantrolina, Bestatina Asprtico: Pepstatina
Inhibidores de Proteasas
Inhibidores Naturales
Mas de 100 compuestos naturales identificados Desde bacterias a animales y plantas Reversibles o seudo-irreversibles Impiden acceso al sitio activo Proteicos, de 50 a 400 aa Clase especficos excepto familia de Macroglobulina Inhibidores de Serina y Cistena proteasas son los mejor caracterizados. Ej. -1 antitripsina y cistatinas
Metodologa de Estudio
Substratos Cromognicos
Estos substratos, al clivarse generan un compuesto cromognico. La tasa de hidrlisis se mide en Los ms utilizados son pptidos 4-nitroanilides pNA) y pptidos thioesteres
Metodologa de Estudio
Sustratos Fluorgnicos
Generan un compuesto fluorognico al producirse el clivaje. La tasa de hidrlisis se cuantifica por medio de un espectrofluormetro o fluormetro en forma continua o ensayos puntuales. Los sustratos ms usados son los que tienen acoplado AMC (peptidyl 4-metil-7 cumarilamidas).
Metodologa de Estudio
Sustratos con Quenching intramolecular
En estos substratos, la secuencia peptdica separa un grupo fluorescente dador de un grupo aceptor que acta como mitigador (quencher) de fluorescencia. El fenmeno se llama transferencia de energa resonante. El clivaje del enlace peptdico lleva a separacin del par dadoraceptor produciendo un incremento de la fluorescencia. Existen varios pares de dadoraceptor reportadoss, por ej. o-aminobenzoic acid (Abz) como dador y 2, 4 dinitrophenyl (Dnp) como aceptor.
Substratos sintticos
Ejemplos
Cathepsin B Bz-Arg-pNA Pyr-Phe-Leu-pNA Z-Arg-Arg-pNA Z-Phe-Arg-pNA Z-Arg-Arg-MCA Z-Phe-Arg-MCA MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Suc-Ala-Val-Pro-Phe-pNA Suc-Phe-Leu-Phe-pNA H-Arg-pNA Bz-Arg-pNA H-Arg-MCA Z-Phe-Arg-pNA Z-Phe-Arg-AMC
Cathepsin G
Cathepsin H Cathepsin L
CL1 gelatinolytic activity CL2 29 kDa CL1 27,5 kDa CL2 gelatinolytic activity
Invasin y Migracin
Membranas Basales y Matrz Extracelular
Nutricin
Hemoblobina Protenas del suero Protenas intracelulares Protenas extracelulares (MEC)
Inmunomodulacin
La cistena proteasa CPB2.8 de Leishmania mexicana induce una fuerte respuesta de tipo Th2 asociada a la progresin de la enfermedad
Enfermedad de Chagas
Causada por el flagelado Trypanosoma cruzi Parsito heteroxeno 3 formas: Forma replicativa intracelular obligatoria amastigote, forma tripomastigote circulante y forma epimastigota replicativa en el insecto vector
Cruzipana
Responsable de la actividad cistena proteasa ms promienente de T. Cruzi Se expresa en todos los estados parasitarios La mayora tiene localizacin lisosomal, pero hay isoformas asociadas a membrana plasmtica y habra alguna secretada Endoproteasa, digiere protenas como casena, SAP, hemoglobina y sustratos sintticos a pH 7-9. Prefiere Arg o Lys en P1 y un hidrofbico o con carga + en P2 (Leu>Tyr>Phe>Val)
Cruzipana
Especificidad intermediaria entre Catepsinas L y B en funcin de AA en P2 Inhibida por organomercuriales, E-64, leupeptin, TLCK, cistatina, stefina, chagasina y derivados peptidil fluorometanos Peptidos con secuencia YHNGAA del pro-dominio tambin la inhiben
E-64
Z-Phe-Ala-fluorometilketona
Cruzipana
Corte de subclases de IgG
Cruzipana
Corte de subclases de IgG
Cruzipana
Corte de subclases de IgG
Malaria
Causada por protozoarios apicomplexa del gnero Plasmodium 300 millones de infectados, ms de un milln de muertes anuales Ciclo complejo, transmitidos por vector invertebrado (mosquito Anopheles)
Plasmepsinas
Nutricin
Degradacin inicial de Hb nativa (plasmepsina I) Clivan enlace Leu203-His204 en regin bisagra de cadena
Plasmepsinas
Invasin
Clivaje de espectrinas (CH3) del esqueleto de la membrana plasmtica del GR
Amebiasis
Infeccin intestinal o extraintestinal causada por Entamoeba histolytica 50 millones de infectados y 110 mil muertes anuales 2 especies reconocidas Entamoeba histolytica patgena Entamoeba dispar comensal (10% poblacin mundial)