Caracterizacin de una alcohol deshidrogenasa de la cianobacteria Synechocystis sp.

Cepa PCC 6803 que responde a las condiciones de estrs ambiental a travs del Sistema Hik34-Rre1 de dos componentes

RESUMEN
En el presente trabajo, una caracterizacin bioqumica de la protena slr1192 (designado aqu Adha) de Synechocystis se ha realizado, revelando que la enzima tetramrica de 140 kDa es activa frente a los alcoholes primarios lineales y aromticos, y que preferentemente reduce aldehdos y no alcoholes oxidantes.

INTRODUCCIN
Las Hidrogenasas/ Reductasas de cadena media constituyen una superfamilia de alcohol deshidrogenasas que catalizan la reaccin reversible del NAD(P) dependiente de la oxidacin de alcoholes aldehdos y cetonas. Constituyen una gran familia de protenas estructuralmente parecidas. La alcohol deshidrogenasa es de gran importancia en la fabricacin de biocombustibles

MATERIALES Y METODOS

CEPAS Y CONDICIONES DE CULTIVO

Synechocystis sp. cepa PCC 6803 clulas fueron cultivadas en medio fotoautotrofico BG-11C a BG30 C bajo condiciones de iluminacin continua (50 E m -2 s 1) y burbujea con el 1% de CO 2 en el aire. Para precultivos de la cepa adha o rre1, rre1 kanamicina se aadi a una concentracin final de 100 mg ml -1, y para precultivos de la cepa hik34, espectinomicina se aadi a hik34, una concentracin final de 5 mg ml -1.

CULTIVO DE CIANOBACTERIAS
Cultivos en la mitad de la fase Log Se someten a choque osmtico de NaCl Se aumenta la concentracin de ion para inducir el estres

Incuban a 45 C

0.6 a 0.7 mg de clorofila

Mantenimiento a temperatura controlada

Tratamiento en luz de alta intensidad

Dilucin de la alcuota en medio fresco

CONSTRUCCION DE MUTANTES E INACTIVACION DEL GEN ADHA

}

Para inactivar el gen de la Adha, la regin de codificacin fue amplificado por PCR para producir un fragmento de 1011 pb usando parejas de cebadores y ADH1 ADH2. ADH1 ADH2

El producto de PCR fue clonado en el vector pGEM-T para pGEMgenerar pADH1 plsmido. Un fragmento de ADN que contiene pADH1 plsmido. el gen npt (neomicina fosfotransferasa) bajo el control de la fosfotransferasa) Synechocystis sp. cepa PCC 6803 psbA promotor se introdujo sp. en el sitio HindIII de la regin codificante del Adha (712 pb del codn de iniciacin), lo que genera una estructura que se utiliz para transformar Synechocystis sp. cepa PCC 6803. sp. 6803.

PURIFICACION DE LA PROTEINA ADHA

CULTIVO E INCUBACION las clulas transformantes se cultivaron a 37 C en medio LB a una densidad ptica a 580 nm de 0,5, 1 mM de isopropil- -Dthiogalactopyranoside (IPTG) se aadi, y el cultivo se incub por 2,5 h SEPARACION Posteriormente, las clulas fueron separadas por centrifugacin, centrifugacin se resuspendi en 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) suplementado con 50 mM de NaCl y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo

RUPTURA LAS CELULAS SE ROMPEN POR ULTRASONIFICACION

PURIFICACION Adha se purific mediante cromatografa de intercambio inico con DEAE-celulosa equilibrada de resina con 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) y la aplicacin de un 0 a 0,5 M gradiente de NaCl. ANALISIS Las muestras de protenas se analizaron por electroforesis de sodio al 12% de dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDSPAGE

Filtracin en gel.
} Filtracin

en gel. Una alcuota de 200 l de gel. nativos Adha (30 M) se aplic a una Superose 6 10 / 300 GL (GE Healthcare) conectado a una Healthcare) columna de cromatografa lquida de rpido rendimiento (Akta, Amersham Biosciences) a Akta, Biosciences) 0,8 ml min -1. La columna fue previamente equilibrada con 30 mM Tris-HCl (pH 8,0) Trissuplementado con 0,5 M de NaCl. Los NaCl. estndares de peso molecular utilizados fueron la tiroglobulina bovina (670.000 Da), -globulina 670. bovina (158.000 Da), el pollo ovoalbmina 158. (44.000 Da), el caballo mioglobina (17.000 Da), 44. 17. y vitamina B 12 (1350 Da). Da).

ANALISIS FINALES
} Alcohol

deshidrogenasa ensayo. La actividad enzimtica fue ensayada a 25 C mediante el control de cambios en la absorcin de la NAD (P) H a 340 nm en un Ultrospec Pharmacia LKB Adems con un espectrofotmetro de 1 cm de luz de la ruta cubeta. Las reacciones se realizaron con 30 mM TrisTrisHCl (pH 8,0) que contena 0,2 mM de NAD (P) H para la reduccin de aldehdos o 0,5 mM NAD (P) + para la oxidacin de alcoholes.

anlisis de la extensin. Oligonucletidos PEX1 y PEX2 fueron extremo PEX1 PEX2 32P] marcado con T4 polinucletido quinasa y [ -32P] ATP (3000 Ci mmol) y se utiliza para el anlisis de primer mmol) extensin del Adha y genes sll1106, respectivamente. sll1106, respectivamente. Primer extensin reacciones se llevaron a cabo como se describi previamente .La mitad de la mezcla de reaccin se someti a electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% de secuenciacin, y el Adha y sll1106 regiones promotoras se somete a una sll1106 reaccin de secuenciacin utilizando los oligonucletidos descritos anteriormente y pEXAdh plsmido como plantilla. plantilla.

} Primer

RESULTADOS

Adha es una tetramrica de cadena media Zn que contienen alcohol deshidrogenasa. Con el fin de deshidrogenasa. adquirir conocimientos sobre la actividad y las propiedades de la protena Adha, el gen fue clonado adha, y una versin de 6 etiquetados Su de adha, la protena se expresa en E. clulas de E. coli. coli. Preparacin homognea de Adha fueron obtenidos por DEAE-celulosa cromatografa de intercambio DEAEinico seguido por cromatografa de afinidad en NiNiNTA. NTA. Intentos de purificacin utilizando extractos de E. clulas de E. coli crecido en un medio qumicamente definido M9 revel que la presencia de metales divalentes en el medio era un requisito para la disponibilidad de la enzima en una forma soluble. soluble.

Por lo tanto, cuando los metales estaban ausentes del medio de crecimiento, expresado Adha no aparece en la fraccin soluble, pero apareci all, sin embargo, si el medio fue suplementado con zinc, cobalto, o iones ferrosos. Las diferencias en ferrosos. las actividades especficas de la enzima purificada a partir de cultivos crecidos en medios con diferentes contenidos de metales mostr que Adha puede utilizar cualquiera de zinc o cobalto con eficacias anloga (2 0,2 y 1,9 0,12 mU mg de protena total de -1, respectivamente), mientras que ion ferroso fue menos eficiente (0,3 0,05 mU mg de protena total de -1).

CONCLUSION

A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe de la caracterizacin molecular de un alcohol deshidrogenasa en las cianobacterias. cianobacterias. Se demuestra que la protena codificada por el gen Synechocystis Adha es una enzima dependiente de zinc homotetrameric con NADPNADPdependiente de la actividad de la alcohol deshidrogenasa que acta sobre una amplia variedad de sustratos. sustratos.

ADICIONAL
PROCESOS DE BIOSEPARACION RUPTURA CELULAR POR ULTRASONIFICACION CENTRIFUGACION CROMATOGRAFIA LIQUIDA CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONOCO ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA FILTRACION EN GEL