Diagnsticos Moleculares para enfermedades infecciosas.

Yi-Weiclic para modificar el estilo de subttulo del Haga Tang,* Gary W. Procop, and David H. Persing

patrn

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Enfermedades infecciosas

Enfermedadinfecciosa es aquella que ha sido provocada por un microorganismo, en especial cuando se trata debacteriasovirus. En el caso de otros agentes vivos patgenos, (protozoos,parazoos, etc.), se habla deinfestacin.

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Diagnostico molecular de enfermedades infecciosas.

El anlisis de secuencias amplificadas de ADN microbiano permite la identificacin y mejor caracterizacin del patgeno. Variacin Subespecies, identificadas mediante diversas tcnicas,importanteen el pronstico deenfermedades. Otros avancesimportantes sonla determinacin dela carga viral yla deteccin directa degenes omutaciones genticasresponsables de laresistencia a los medicamentos.
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Identificacin microbiana tradicional.

Biotipaje Los mtodos tradicionales deidentificacin microbiana normalmente se basan en los fenotipos, tales como las caractersticas morfolgicas, las variables de crecimiento, y la utilizacin de bioqumica de sustratos orgnicos.El perfil biolgico de un organismoque se denomina unbiograma.La determinacin de la relacinde organismosdiferentes sobrela base de susbiogramasse denominabiotipaje.

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Anlisis de protenas

Anticuerpos disponibles comercialmente se utilizan habitualmente para identificar especficamente protenas antignicasdeunaamplia variedad de organismos.En algunos casos,la pruebaslo podrn ser utilizadospara identificar elgnero y la especiede un organismo.Tcnicastipificacion electroforticas hansido utilizados para examinarlas protenasde membrana externa, lisadosde clulas enteras, y las enzimasparticulares

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Anlisis de Fago

El perfil de bacterifago puede utilizarse para escribir cepas bacterianas dentro de una especie dada. Cuanto ms estrechamente relacionada con las cepas bacterianas, mayor es la similitud de losperfiles de bacterifagos.

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El anlisiscromatogrfico

Se utiliza para determinar bacterias anaerobias y es esencialparaidentificarlas correctamente, pues muchas son metablicamente muy inactivas. Por esta necesidad metodolgicano todos los laboratorios pueden identificar lasbacteriasanaerobiasa nivel de especie.

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Sistemas de Tipificacin Basados en cidos Nuclecos AnlisisPlsmido

El anlisis de plsmidos se ha empleado para la bsqueda de resistencia a antibacterianos en brotes nosocomiales. Los estudios de epidemiologa molecular han avanzado en gran parte por el anlisis de fragmentos de restriccin, que permite monitorear la diseminacin de los plsmidos codificantes de resistencia entre organismos y entre hospitales, comunidades e incluso pases.

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Patrn de enzimas de restriccin

La relativa simpleza de los perfiles de restriccin generados por PFGE, facilita la aplicacin del procedimiento de identificacin y epidemiologia de patgenos bacterianos. Las huellas de DNA (DNA finger-print), combinan PFGE con la transferencia e hibridacin de tipo Southern, y ha sido empleada para el estudio de brotes nosocomiales de diversos microorganismos.

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ADN Plimorfico amplificado al azar (RAPD)

Incluye el uso de un primer o cebador corto (oligonucletido sintetizado de 10 a 15 pb), para amplificar secuencias homlogas de ADN genmico con condiciones de baja astrigencia.RAPD se ha utilizado para diferenciar las cepas de varias especies, serotiposdiferentesdentro delas especies,y los subtipos diferentesdentro deunserotipo.

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Anlisis de cidos NuclecosSinAmplificacin

Sondas

de cidos nuclecos

Facilitan la identificacin de agentes infecciosos que no crecen rpidamente y permite el diagnstico de infecciones producidas por organismos que no se cultivan con facilidad o que no pueden ser cultivados. Ha sido aplicada a diversos organismos, incluyendo bacterias virus, micobacterias, hongos y parsitos. Tambin permite detectar genes asociados a resistencia bacteriana

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Amplificacin de la seal del ADNramificado

En este proceso, mltiplesoligonucletidos sintticos especficos hibridan con el material gentico y lo capturan el objetivosobre una superficie slida, se adicionan molculas amplificadoras de bADN sinttico (conjugadas con una enzima) y se produce una hibridacin entre los amplificadores y los hbridos inmovilizados. Se adiciona un sustrato quimioluminiscente para cuantificar la luz emitida, la cual es proporcional a la cantidad de material gentico de la muestra

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Reaccin en Cadena dela Polimerasa

La PCR se basa en la capacidad de la DNA polimerasa para copiar una hebra de ADN por el alargamiento de cadenas complementarias iniciadasa partir de un par de estrechamente espaciados qumicamente sintetizados oligonucletidos.

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 Transcriptasa

inversa (RT)-PCR

RT-PCR sedesarrollpara amplificarlos objetivosde ARN.En este proceso, los objetivosde ARNse convierten primero enADN complementario (ADNc)por RT,y luegoamplificadopor PCR.RT-PCRha jugadoun papel importante en el diagnstico de ARN que contienen las infecciones de virus, la deteccin de especies de micobacterias viables, y supervisar la eficacia de la terapia antimicrobiana

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PCR anidada

Diseado principalmentepara aumentar la sensibilidad (deteccin de pequeas cantidades deblanco). Un conjunto de cebadoresse utiliza parala primera ronda deamplificacin, que consta de15 a30ciclos.Losproductos dela primera reaccinsesomete a unasegunda ronda deamplificacin conotroscebadoresque son especficos paraunasecuencia internaquese amplific porla primera pareja de cebadores.PCRtiene una sensibilidadmuy alta, debido ael proceso de amplificacindual.

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 PCR

mltiple

En esta modificacin de la PCR se incluyen dentro de la misma reaccin de amplificacin mltiples pares de primers especficos para diferentes dianas, por lo que se produce una coamplificacin de diferentes dianas.

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Otrastcnicasde amplificacin de cidosnuclecos

Basado en la transcripcinsistema de amplificacin (TAS).

TASincluyela sntesisdeunamolcula de ADNcomplementario alcidonucleico diana (generalmenteARN) y la transcripcin in vitro con el cDNA recientemente sintetizado comouna plantilla.Tresenzimas,RT,RNasa H,y T7 ADN polimerasa dependiente de ARN se utilizan en la reaccin. La amplificacin deARNno slo haceposible 3/27/12

Reaccin en cadena deligasa(LCR)

LCR es unatcnica de amplificacinde la sonda, el mtodo utiliza la DNA ligasa para unir dos pares de sondas complementarias despus de que stas se hayan unido a la secuencia diana in vitro.

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Cadenade amplificacinde desplazamiento (SDA)

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Anlisisde productos de amplificacin

Producto de electroforesis en gel deagarosadespus detincin con bromuro deetidio.

Despus de la electroforesis en gel de agarosa el ADN se transfiere a una fase slida para luego agregarse la sonda especfica.
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Hibridacin deensayo de proteccin (HPA)

La sonday el productose incubanjuntos enunsolo tubo de ensayo, yla unin de lasonda a ladianase midesinmanipulacin adicional. Unasonda

marcadaconunster deacridiniose aunamuestra que contieneproductos PCRpara la identificacin.

Inmunoensayo

aade de la

enzimtico ADN (Deia)

Un anticuerpo anti-dsDNA exclusivamente reconoce el productode hibridacinresultante de la reaccin entre el ADNdiana yunasonda de ADN.El producto finalse revelapor medio deuna reaccin colorimtrica
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Secuenciacin la tecnologa

automatizadade

La secuenciacin directaofreceun anlisis directo, rpidoy preciso de losproductos de amplificacin. La secuencia de amplificacin se determina en primer lugar, a continuacin, una Anlisis secuencia RFLP ADN basado en el anlisis de filogentico se realiza y se utiliza para Enpostamplificationanlisis de RFLP,los patgeno. fragmentos identificar especficamente el
de ADNamplificadosse cortanporun endonucleasas de restriccin, separados por electroforesis en gel,y luego transferido aunamembrana de nylononitrocelulosa.
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Aplicacin actual de Diagnstico Molecular

La tecnologa permite la identificacin rpida y precisa del agente etiolgico en un tiempo sustancialmente ms corto que los mtodos tradicionales.Esto permite un inicio ms temprano de un rgimen antimicrobiano especfico y disminuye la probabilidad de progresin de la enfermedad

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