Instituto de Agricultura Sostenible CSIC IFAPA Alameda del Obispo. Junta de Andaluca.

Tesis Doctoral
CARACTERIZACIN RACIAL DE Fusarium oxysporum f. sp. dianthi Y DETERMINACIN DE SU VIABILIDAD EN SUELOS SOMETIDOS A DIFERENTES REGMENES TRMICOS
ELENA SUREZ BONNET PROGRAMA DE PRODUCCIN Y PROTECCIN VEGETAL DEL DEPARTAMENTO DE AGRONOMA DE LA E.T.S.I.A.M. UNIVERSIDAD DE CRDOBA.

Introduccin
EL CULTIVO
corte ms importante del mundo.

Introduccin

El clavel (Dianthus caryophyllus L., Cariophyllaceae) es la flor de

Colombia, con ms de 4.000 hectreas dedicadas a este cultivo, es el principal productor y exportador mundial.

En 2004 la superficie nacional de flor cortada fue de 2745 Has.

628 Has en Andaluca 411 Has en Cdiz Andaluca 50% de la produccin de flor cortada 70% en Cdiz

1231 Has de clavel, a nivel nacional

ENFERMEDADES DEL CLAVEL

Enfermedades fngicas Roya del clavel Marchitamiento por Phialophora Tizn por Alternaria Mancha foliar anillada del clavel Moho gris Pudricin por Fusarium

Introduccin

ENFERMEDADES CAUSADAS POR MICROORGANISMOS FITOPATGENOS. Enfermedades causadas por nematodos

Agallas radiculares causadas por Meloidogyne incognita M. javanica

Fusariosis vascular del clavel (FVC)

Agente causal
Reino: Fungi Divisin: Ascomycota Clase: Sordariomycetes Orden: Hypocreales Familia: Hypocreaceae Genero: Fusarium Especie: oxysporum Forma specialis:dianthi Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr. f. sp. dianthi (Prill. & Delacr.) W. C. Snyder & H. N. Hans., (Fod)

El PATGENO OBJETO DE ESTUDIO

Fod produce colonias de rpido
crecimiento, (1 cm en PDA a 25C). El micelio, areo o no, generalmente es abundante, algodonoso, con una coloracin, de blanco a rosado durazno, con un tinte prpura o violeta en la superficie del agar.
Produce tres clases de esporas
Microconidias Macroconidias

Introduccin

Clamidosporas

1-3 clulas Redonda u elipsoidal

5-13 m X 1,6-5 m

3 a 6 clulas

Pared gruesa Globosas 5-15 m

Forma de huso
36-70 m X 3-6.3 m

Temperatura

Introduccin

Desarrollo y expresin de
sntomas de la FVC.

Nutricin

Clorosis

Marchitamiento

Muerte de la planta

Para el control de la enfermedad se han propuesto diferentes mtodos. Seleccin de variedades resistentes.

Introduccin

Control fsico (vapor de agua, solarizacin del suelo). Control qumico (desinfestantes del suelo: 1,3 D+CP). Lucha biolgica, con microorganismos antagonistas. Uso de enmiendas orgnicas. Control integrado (solarizacin + antagonistas, qumico + solarizacin, gallinaza + solarizacin)

Introduccin

SELECCIN DE VARIEDADES RESISTENTES.

Utilizacin de cvs. de clavel resistentes a distintas razas de Fod.

El contenido de fenol se correlaciona con los niveles de resistencia a Fod de los cvs. de clavel (Higuera y De Gmez, 1996).

Existen cvs. con resistencia a Fod, aunque no es completa.

Condiciones ambientales

Presencia de distintas razas de Fod

Introduccin

CONTROL FSICO (VAPOR DE AGUA, SS). VAPOR DE AGUA

Se llegan a alcanzar temperaturas de 100C en los 10 primeros cm del suelo.

Agua a 50 60C durante 3 min., capaz de eliminar el 100% de patgenos, semillas de malas hierbas y nematodos.

VACIO BIOLGICO

Inconvenientes:

FCIL RECOLONIZACIN
BACTERIAS AMONIFICANTES SALINIDAD

La solarizacin del suelo (SS) es una tcnica de desinfestacin que consiste en el calentamiento, mediante la radiacin solar de un suelo hmedo, con un acolchado de plstico transparente de reducido grosor.

Propiedades Trmicas: Capacidad calorfica

Conductividad trmica
Difusividad trmica Contenido de humedad

REFLEXIN
TRANSMITANCIA

Radiacin Conduccin Conveccin Evaporacin

NO PRODUCE VACIO BIOLGICO Como ventajas:

MENOR RECOLONIZACIN
EFICACIA CONTRA PATGENOS

Introduccin

CONTROL QUMICO (DESINFESTANTES DEL SUELO: (BM). Mediante fumigantes a dosis que disminuyen el potencial infeccioso a niveles aceptables para los cultivos. Afectan al ambiente biolgico, fsico y qumico del suelo.

Beneficios

Moderado coste Alta efectividad

BM Dazomet Metham-sodio Telopic (1,3-D + CP)

Otros fumigantes en estudio Inconvenientes

BM, CAPACIDAD DESTRUCTORA DE LA CAPA DE OZONO 1,3-D +CP EFECTO TXICO Y CONTAMINANTE DAZOMET ES TXICO, LARGO PERIODO DE ESPERA.

Introduccin

Lucha biolgica, con microorganismos antagonistas o Agentes de Control Biolgico (ACBs). Diferencias entre el biocontrol por ACBs para los diferentes genotipos de una especie vegetal. Las condiciones medioambientales influyen decisivamente en la capacidad supresiva del ACB, como tambin lo es el monocultivo prolongado. Uso de enmiendas orgnicas.

Sustancias voltiles producidas en la biodegradacin de la materia orgnica, con accin biofumigante frente a los patgenos, cuya eficacia depende de la dosis, del tipo de enmienda, y del mtodo de aplicacin. Control integrado (SS + antagonistas, qumico + SS, enmiendas orgnicas + SS).
Conjunto de mtodos de control que satisfacen a la vez exigencias de orden ecolgico, econmico y social, recurriendo en especial a mtodos de control no contaminantes. FAO, 1974

Para la determinacin racial del patgeno se han propuesto diferentes mtodos.

Introduccin

Pruebas de patogenicidad (Bosland, 1988) Test de compatibilidad vegetativa (Baayen et al., 1997) Anlisis de cariotipo (Baayen et al., 1997) RFLP (Baayen et al., 1997) RAPD (Williams et al., 1990) Anlisis de secuencias de las regiones ribosmicas ITS1 e ITS2 (Edel et al., 2000).

Objetivos de la investigacin
1. Determinar la prdida de viabilidad de Fod en funcin del tiempo de incubacin a distintas temperaturas constantes in vitro. La determinacin del efecto de las diferentes temperaturas en la progresiva prdida de viabilidad del patgeno, nos ayudar a comprender el modelo de comportamiento de Fod frente a los tratamientos trmicos. 2. Estudiar el efecto, a lo largo del tiempo, de la solarizacin del suelo sobre la viabilidad de los propgulos de Fod a distintas profundidades del suelo, y bajo rgimen fluctuante de temperaturas. El anlisis de la prdida de viabilidad de las estructuras de resistencia del patgeno permitir una aproximacin prctica del tiempo requerido de solarizacin para el control del patgeno en el suelo. 3. Puesta a punto de tcnicas moleculares de caracterizacin de razas de Fod mediante marcadores moleculares especficos descritos en Italia.

4. Caracterizar las principales razas de Fod en Andaluca e Italia, mediante el empleo de variedades de clavel diferenciadoras de razas de Fod y mediante el empleo de marcadores moleculares.

Captulo 1

PRDIDA DE VIABILIDAD DE Fod A TEMPERATURA CONSTANTE

Determinar

la prdida de viabilidad de Fod in vitro, en funcin del tiempo de incubacin a distintas temperaturas constantes.

PRDIDA DE VIABILIDAD DE Fod. Materiales y Mtodos.

SELECCIN DE AISLADOS DE Fod.

Caracterizacin morfolgica de los aislados monocondicos testados, tras 7 y 14 das de incubacin.

Captulo 1

INFESTACIN DE SUSTRATO CON AISLADOS DE Fod.

Aislados de Fod crecidos 5 das en placas con PDA. 4 discos en 150 mL de CPD. Agitacin a 150 rpm, 12 h de fotoperiodo y 241C.

Suspensiones de 2x106 conidias/mL, de cada aislado de Fod. 4 Tubos de 10 mL con 3 g de mezcla arena:limo (2:1, v/v).
Incubacin 241C, con 12 h de fotoperiodo durante 10 das.

4 experimentos de incubacin
Tubos en baos termostticos a las diferentes Ts. Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4

Diseo estadstico:
40 C
42C 43 C 45 C 47 C

Parcelas divididas

Cuatro repeticiones totalmente al azar

Factor principal:
Temperaturas

Factor secundario: Aislados de Fod

40 y 42C 40 y 42C 43, 45 y 47C 43, 45 y 47C

480 y 204 h 1032 y 240 h 360, 24 y 264 h 340, 168 y 312 h

DETERMINACIN DE LA VIABILIDAD DE Fod.

Mtodo de dilucin en A-A (0.1%) de mezcla de suelo infestado con Fod. a) Aporte de suelo infestado a erlenmeyer con 150 mL de A-A b) Agitacin de las muestras durante 1 min c) Lectura del nmero de colonias (UFC) de Fod en medio semiselectivo.

Captulo 1

PARMETROS UTILIZADOS.

N de propgulos de Fod, para cada una de las muestras extradas, expresado en % con respecto del inculo inicial del correspondiente aislado de Fod.
Se calcularon los grados-hora (C-h) acumulados de las sucesivas extracciones de muestras, para cada uno de los experimentos considerados, utilizando un umbral de 37C.

Se represent la evolucin de los IS segn cada temperatura y aislado a lo largo de 12 semanas.

ANLISIS ESTADSTICOS.

Anlisis de varianza, de ABCVE de Fod.

PRDIDA DE VIABILIDAD DE Fod. Resultados.

40C Exp. 1
Aislados % 0,60 A3 A4 A7 Aislados A3

42C
%

0,50
720C-h (240h)

0,76 0,10
%

0,81 0,46
%

480C-h (96h)

0,11 0,34 2,87

1152C-h (384h)

0,30 0,18
480C-h (96h)

Exp.2
A4

A7

0,55

100

90
80 70 60 % 50 40 30 20

40C Exp. 1

10
0 0 48 96 144 192 A3 A4 Aislados A7 384 432

240

288

A
100 90 80 70

Tiempo (horas)

336

480

42C
Exp. 1

60
% 50 40 30 20 10 0 0 72 96

120

A3 A4
144 168 180 A7

Aislados

Tiempo (horas)

192

204

Resultados.
100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 0 96 192 A3 288 384 Tiempo (horas) 480 A4 576 672 A7 768 936 1032 Aislados

Exp. 2

40C

A
100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 0 24

42C

Exp. 2

A3 48 72 96 A4 120 144 168 A7 192 216 240 Aislados

Tiempo (horas)

PRDIDA DE VIABILIDAD DE Fod. Resultados.

43C
Aislados Exp. 3 A3 A4 A7 Aislados A3 Exp. 4 % 0,07 0,55 0,41 % 47,3 360C-h 0,64 (60h) 0,73 576C-h (96h)

45C
% 0,24 0,18 0,31 % 184C-h (23h)

47C
% 3,42 0,32 3,59 % 70C-h (7h)

0,05
0,01 0,18 192C-h (24h)

4,08
0,16 0,82 90C-h (9h)

A4
A7

100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 0 A3 96 168 192 A4 216 Tiempo (horas) 240 264 288 A7 312 336 360 Aislados

43C

Exp. 3

100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 A3 5 6 7 8 9 10 11 A4 12 13 14 15 16 17 18 A7 19 20 21 22 23 24 Aislados

45C

Exp. 3

Tiempo (horas)

100 90 80 70 60 % 50 40 30

47C 47C

Exp. 3

20
10 0 1/3 2/3 1 2 3 4

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Tiempo (horas) 23 24

A3 A4 96 192 264 A7

Resultados.
100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 0 24 30 36 48 A4 60 72 84 102 126 A7 168 216 264 324 390

Exp. 4

43C

A3 54 Aislados

Tiempo (horas)

100

45C

90

80

Exp. 4

70 60
%

50 40 30 20 10 0 1/3 2/3 A3 1 24 48 Tiempo (horas) A4 72 96 120 A7 144 168 Aislados

100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 0 1/3 2/3 1 2 3

47C

Exp. 4

A3 4 9 10 11 12 13 16 23 24 36 48 72 96 120144168 Tiempo (horas) 192 5 6 7 8 A4 A7 240264 Aislados

PRDIDA DE VIABILIDAD DE Fod. Resultados.

Anlisis de varianza ABCVE de Fod

Exp. 1 Exp. 2 A* A* A3 A4 A7 T 40C 42C T*A 40C*A3 40C*A4 40C*A7 42C*A3 42C*A4 42C*A7 12.402 12.019 13.091 5.816 A 19.192 B 6.454 5.582 A 5.412 A 18.35 18.456 20.769 C C D B 5.6229 A** 5.3212 A 9.3687 8.0961 5.4457 A 5.839 AB 5.110 A 13.339 5.407 A 5.532 A 5.398 A 47C*A7 0.569 A 0.368 A C B B T*A A3 A4 A7 43C 45C 47C 43C*A3 43C*A4 43C*A7 45C*A3 45C*A4 Exp. 3 Exp. 4

6.304

4.678 2.424 A 2.616 A

5.519 AB 4.932 A 13.421 B

5.850 3.456 0.412 A E E E 9.246 3.361 B 4.942 4.267 3.563 C C B

2.371 A 0.963 A 13.372 13.45 13.441 3.609 2.716 C D

45C*A7
47C*A3 47C*A4

0.787 A
1.931 0.390 A B

2.538 B
0.521 A 0.346 A

* Aislado (A); Temperatura (T). ** Para cada columna, e interaccin segn el factor y sus interacciones, los valores seguidos por la misma letra, no difirieron significativamente de acuerdo con el test de Tukey (P 0,05).

INOCULACIN EN PLANTAS DE CLAVEL CV. EXTICA. Materiales y Mtodos.

CARACTERIZACIN PATOGNICA. Materiales y Mtodos. Experimentos 3 y 4 92 aislados de 43C 91 aislados de 45C 42 aislados de 47C

Diseo estadstico:
Completamente al azar Cinco repeticiones

Inoculacin en plantas de clavel cv. Extica

Lecturas de IS (semanal) de 1 a 5.

Patognicos: Tras 12 semanas (IS)2.

TESTS DE PATOGENICIDAD DE LOS DIFERENTES TIPOS DE COLONIAS DE FOD. Resultados.

A3 A4 10 A7 7

43C

12 grupos morfolgicos (GM)

45C

47C

10

Resultados. 92 aislados

43C

100 90

80
70 60

% de plantas de clavel

50 40 30 20 10 A3 A4 1=IS<2 2=IS<3 3=IS<4 IS 4=IS5 A7 Aislados

Evolucin de la severidad media de sntomas (IS)

5 4.5 4 3.5 IS 3 2.5 2 1.5 1 1 2 3 4 5

10

11

12

Evolucin de la enfermedad (semanas)

GM 1 GM 7 GM 2 GM 8 GM 3 GM 9 GM 4 GM 10 GM 5 GM 11 GM 6 GM 12

Resultados. 91 aislados

45C

90 80 70 60

% de plantas de clavel

50 40 30 20 10 A3 A4 Aislados 1=IS<2 2=IS<3 IS 3=IS<4 A7

Evolucin de la severidad media de sntomas (IS)

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 1 2 3 4 5 6

4=IS5
4=IS5

4=IS5

10

11

12

Evolucin de la enfermedad (semanas)

GM 1 GM 7 GM 2 GM 9 GM 3 GM 10 GM 4 GM 11 GM 5 GM 12 GM 6

Resultados. 42 aislados

47C

100 90 80 70 60

% de plantas de clavel

% 50
40 30 20 10 A3 A4 Aislados 1=IS<2 2=IS<3 IS A7 3=IS<4 4=IS5

Evolucin de la severidad media de sntomas (IS)

5 4.5 4 3.5 3

IS 2.5
2 1.5 1 1 2
GM1 GM7

4
GM2 GM8

5
GM3 GM9

7
GM4 GM10

9
GM5 GM11

10

11
GM6 GM12

12

Evolucin de la enfermedad (semanas)

Captulo 2

PRDIDA DE VIABILIDAD DE LOS PROPGULOS DE Fod MEDIANTE LA SOLARIZACIN DEL SUELO

Estudiar

el efecto de la solarizacin a diferentes profundidades sobre aislados de Fod en el suelo.

Dos experimentos de SS desarrollados en un invernadero del IFAPA Centro de Chipiona (Cdiz). Se utiliz polietileno CP-129. En el ao 2002 SS del 3 de Julio al 15 de Agosto. En el ao 2003 SS del 1 de Julio al 12 de Agosto.

Aislados monocondicos de Fod Infestacin de suelo con Fod

A3, A4 y A7
Materiales y mtodos del captulo 1 Experimento 1: 3,5x106 conidias/g suelo Experimento 2: 7x106 conidias/g suelo

7x106 conidias/mL

INFESTACIN DE SUSTRATO CON AISLADOS DE Fod. Materiales y Mtodos.

Inculo 2002

Inculo 2003

Se mantuvieron durante 10 das en oscuridad a 241C Agitacin en das alternos

Parcelas subdivididas

Diseo estadstico:
Cuatro repeticiones totalmente al azar

PARCELA PRINCIPAL: 2, 5 x 1,25 m

Tratamientos 2 das despus de la preparacin del suelo.

15 cm Bolsas con 20 g de suelo infestado. 30 cm 45 cm

Disposicin de los tratamientos SS y Testigo dentro del invernadero.

Se registraron las temperaturas, a las diferentes profundidades.

15 das de SS se extrajeron muestras de suelo cada 7 das.

1 da de secado a T ambiente.

Pesadas de 1-8 g segn tratamiento, profundidad , extraccin y aislado.

Cuantificacin de la dosis de inculo superviviente en el suelo, mediante cultivo en placas de medio semiselectivo a Fusarium.

Captulo 1

Parmetros Utilizados.
Para cada una de las muestras extradas, se expres el n de

propgulos de Fod como % del inculo inicial del correspondiente aislado de Fod.
Se calcularon los grados-hora (C-h) acumulados de las sucesivas

extracciones de muestras, para cada uno de los experimentos considerados, utilizando un umbral de 37C.

Anlisis Estadsticos.
Transformacin angular de la viabilidad de Fod y anlisis de

varianza a los 15, 22, 29, 36 y 46 das de la SS en 2002 y 2003.

Anlisis de varianza para el ABCV de Fod de la SS en 2002 y 2003

Efecto de la SS en la temperatura mxima diaria de las medias horarias del suelo a diferentes profundidades, dentro de invernadero cerrado (3 Julio-15 Agosto, 2002)
50 T 15 cm SS 30cm 45 T 30 cm SS 45 cm T 45 cm

Temperatura (C)

40

35

30

25
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34

Periodo de solarizacin (das)

Efecto de la SS en la temperatura mxima diaria de las medias horarias del suelo a diferentes profundidades, dentro de invernadero cerrado

(1 Julio-12 Agosto, 2003)

50

T 15 cm SS 15 cm

T 30 cm SS 30cm

T 45 cm SS 45 cm

Temperatura (C)

45

40

35

30

25 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43

Periodo de solarizacin (das)

80

2002

70 60 50 40 % 30 20 10 0

A3

80 70 60

15 22 Duracin de los tratamientos (das). 29 36 43 -SA3 cm 51

TA3-45 TA3-30 cm TA3-15 cm -SA3 cm -SA3 cm 54 cm 03 Tratamientos

50

2003

40 % 30

SA3-15 cm

SA3-30 cm

SA3-45 cm

TA3-15 cm

TA3-30 cm

TA3-45 cm

20 10 0 15 22 TA3-45 TA3-30 cm TA3-15 cm SA3-45 cm SA3-30 cm SA3-15 cm cm Tratamientos TA3-15 cm TA3-30 cm TA3-45 cm

Duracin de los tratamientos (das).

29 36 43

SA3-15 cm

SA3-30 cm

SA3-45 cm

2002

80 70 60 50 40 % 30 20 10 0

A4

80 70 60

15 22 Duracin de los tratamientos (das). 29 36 43 -SA4 cm 51

TA4-45 TA4-30 cm TA4-15 cm -SA4 cm -SA4 cm 54 cm 03 Tratamientos

2003

50 40 % 30 20 10 0 15 22 29 TA4TA4- 45 cm TA4- 30 cm SA4- 15 cm SA4- 45 cm 30 cm Tratamientos

SA4-15 cm SA4-30 cm SA4-45 cm TA4-15 cm TA4-30 cm TA4-45 cm

Duracin de los tratamientos 36 (das).

43

SA415 cm

SA4-15 cm

SA4-30 cm

SA4-45 cm

TA4-15 cm

TA4-30 cm

TA4-45 cm

2002

80 70 60 50 40 % 30 20 10 0 15 22 -TA7 -TA7 cm 54 -TA7 cm 03 -SA7 cm 51 cm 54

A7

80 70 60 50 40 %

2003

Duracin de los tratamientos (das).

29 36 43 -SA7 cm 51 -SA7 cm 03

Tratamientos

30 20 10 0 15 22 TA7-45 TA7-30 cm TA7-15 cm SA7-45 cm Tratamientos SA7-30 cm SA7-15 cm cm TA7-15 cm TA7-30 cm TA7-45 cm

SA7-15 cm

SA7-30 cm

SA7-45 cm

TA7-15 cm

TA7-30 cm

TA7-45 cm

Duracin de los tratamientos (das).

29 36 43

SA7-15 cm

SA7-30 cm

SA7-45 cm

Resultados.
2002
y = -0.5715Ln(x) + 3.4729 R2 = 0.736 y = -0.1744Ln(x) + 1.1159 R2 = 0.389

PARCELAS TESTIGO 15 CM 2003

y = -0.9767Ln(x) + 5.9359 R2 = 0.744
y = -0,472Ln(x) + 16,376 R2 = 0,125 60 y = -5,120Ln(x) + 21,750 R2 = 0,390 y = -5,9441Ln(x) + 29,594 R2 = 0,308

1.4

Viabilidad del inculo(%)

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

0 1 2 3 3 4 5 6 7 8 8 9 10 11 12 13 13 14 15 16 17 18 18 19

Viabilidad del inculo(%)

50 40

A3 A4 A7

A3
30 20 10 0
0 1 2 3 3 4 5 6

A4 A7

Integral trm ica (C/da) con um bral 37C

Integral trm ica (C da) con um bral 37C

PARCELA TESTIGO 30 CM 2002

y = -0.7023Ln(x) + 2.4216 R2 = 0.588 y = -4,051Ln(x) + 29,762 R2 = 0,642 y = -5,0022Ln(x) + 37,478 R2 = 0,703

5 4.5

Viabilidad del inculo(%)

4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

0 1 Inte gral t rm ica (C/da) con um bral 37C 2

A3 A4 A7

Resultados.
2

PARCELA SOLARIZADA 15 CM 2003

y = -0.9509Ln(x) + 2.8527 R = 0.7779 y = -0.2242Ln(x) + 0.6736 R = 0.7964
2

y = -0.2013Ln(x) + 0.6213 R = 0.7652

2

5 4.5

Viabilidad del inculo(%)

4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

0 1 Integral trm ica (C/da) con um bral 37C 2

A3 A4 A7

2002
y = -0.1483Ln(x) + 1.0713 R2 = 0.983 6 5 4

PARCELAS SOLARIZADAS 30 CM
y = -0.1177Ln(x) + 0.8377 R2 = 0.822

2003
y = -4.6744Ln(x) + 30.302 R2 = 0.727

y = -0.5755Ln(x) + 4.0941 R2 = 0.816

y = -1,381Ln(x) + 7,698 R2 = 0,797 30 25 20

y = -3,250Ln(x) + 17,314 R2 = 0,715

Viabilidad del inculo(%)

Viabilidad del inculo(%)

A3
3 2 1 0
0 4 8 13 17 21 25 29 33 38 42 46 50 54 58

A3
15 10 5 0
0 4 8 13 17 21 25 29 33 38 42

A4 A7

A4 A7

Integral trm ica (C/da) con um bral 37C

Integral trm ica (C da) con um bral 37C

Resultados.
2002
y = -1,522Ln(x) + 6,722 R2 = 0,395 6 5 4 3 2 1 0
0 3 6 9 12 15 18 20 23

PARCELAS SOLARIZADAS 45 CM 2003

y = -0,961Ln(x) + 4,156 R2 = 0,461 y = -3,039Ln(x) + 13,257 R2 = 0,347

y = -0.1617Ln(x) + 1.2446 R2 = 0.712

4 3.5

y = -0.52Ln(x) + 3.6132 R2 = 0.9182

y = -0.2144Ln(x) + 2.648 R2 = 0.9097

Viabilidad del inculo(%)

Viabilidad del inculo(%)

3 2.5 2 1.5 1 0.5

A3 A4 A7

A3 A4 A7

26

29

32

35

38

41

0
0 1 3 4 5 6 8 9 10 11 13 14 15 16 18 19

Integral trm ica (C/da) con um bral 37C

Integral trm ica (C/da) con um bral 37C

Anlisis de varianza para el ABCV de Fod en 2002 y 2003

Factoresx T A 2002 Media 765.2 By 753.6 A 762.0 756.1 760.1 754.7 A 758.0 A 765.5 B 771.0 753.0 757.8 754.4 766.7 753.5 758.9 750.4 762.9 753.1 773.7 757.4 754.5 752.4 757.2 763.3 755.6 755.2 768.2 760.4 768.0 758.4 750.6 754.6 750.1 763. 9 750.6 774.5 752.1 755.1 756.1 759.1 751.3 780.2 756.3 763.6 757.1 777.3 758.7 2003 Media 1518.9 B 996.6 A 1050.5 A 1299.7 B 1423.1 C 1201.2 A 1217.2 A 1354.8 B 1217.8 C 883.2 A 1542.2 D 978.9 B 1672.7 E 1042.3 B 1343.0 909.2 1440.7 931.9 1649.0 1049.1 987.6 A 1058.4 A 1332.3 B 1024.9 A 1207.8 AB 1326.4 B 1127.1 A 1515.3 C 1413.8 BC 1123.5 AB 851.6 A 1195.7 AB 921.2 A 1709.7 CD 955.0 A 1185.3 AB 864.4 A 1497.2 C 918.3 A 1639.7 CD 1013.1 A 1344.5 BC 891.3 A 1933.6 E 1097.1 A 1668.8 CD 1158.7 AB

TT*A

TT*P

A*P

TT*A*P

T SS A3 A4 A7 15 cm 30 cm 45 cm T-A3 SS-A3 T-A4 SS-A4 T-A7 SS-A7 T-15 cm SS-15 cm T-30 cm SS-30 cm T-45 cm SS-45 cm 15 cm-A3 15 cm-A4 15 cm- A7 30 cm-A3 30 cm-A4 30 cm- A7 45 cm-A3 45 cm-A4 45 cm- A7 T- A3-15 cm SS -A3-15 cm T-A4-15 cm SS-A4-15 cm T-A7-15 cm SS-A7-15 cm T- A3-30 cm SS -A3-30 cm T-A4-30 cm SS-A4-30 cm T-A7-30 cm SS-A7-30 cm T- A3-45 cm SS -A3-45 cm T-A4-45 cm SS-A4-45 cm T-A7-45 cm SS-A7-45 cm

DISCUSIN CAPTULO 1 Y 2
T de incubacin constantes vs. integrales trmicas

720C-h (240h)
40

480C-h (96h)

576C-h (96h)

184C-h (23h)

70C-h (7h)
47

45 43 T a 42 que se obtiene la prdida de la 1152C-h viabilidad con el tratamiento del suelo a T 480C-h 360C-h 192C-h (384h) (96h) (60h) (24h) constante comparadas con las de SS y

90C-h (9h)

tiempos de exposicin, se consiguen con un umbral ms bajo en menor tiempo de T vs. integrales trmicas SS 30 cm 2002 incubacin.
T vs. integrales trmicas SS 30 cm 2003
1392C-h 29 das de SS 1008C-h 36 das de SS 31,2C-h

T vs. integrales trmicas SS 15 cm 2003

22 das de SS

INOCULACIN EN PLANTAS DE CLAVEL CV. EXTICA. Materiales y Mtodos

Experimento 1: Experimento 2: 84 aislados 78 aislados

Materiales y Mtodos del captulo 1

Se describieron GM entre los aislados recuperados de ambos experimentos. Se calcularon los IS media en plantas de clavel cv. Extica y se represent su evolucin durante 12 semanas, segn: Aislado. Profundidad del suelo. Tratamientos. GM.

INOCULACIN EN PLANTAS DE CLAVEL CV. EXTICA. Resultados.

100 90 80 70 60 (%) 50 40 30 20 10 0 2 IS< 1 3 IS< 2 IS 4 IS<3 5 IS<4 A7 Aislados A4 A3

2002

100 90 80 70 60 (%) 50 40 30 20 10 0 2IS<1

2003

A3 A4

Aislad

3IS<2 IS 4IS<3 5IS<4

A7

12 GM 84 aislados Patognicos 69%

10 GM 78 aislados Patognicos 99%

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 15cm 30 cm 45cm

2002

IS media en plantas de clavel cv. Extica segn profundidad:

1.5
1

1
5

4 5 6 7 8 9 10 11 Evolucin de la enfermedad (semanas)

12

13

4.5
4 3.5 IS 3 2.5 2 1.5

2003

15 cm 30 cm 45 cm

4 5 6 7 8 9 10 11 12 Evolucin de la enfermedad (semanas)

13

14

2002 IS2 a partir de la 4 semana IS de 2,9-3,5

2003 IS2 a partir de la 2 semana IS4,5

Los IS media en plantas de clavel segn aislado

Los IS media en plantas de clavel segn Tratamiento

IS2 a partir de la 5 semana IS de SS y T: 2,6 y 3,2 IS2 a partir de la 3 semana en 3 GM. El resto a partir de la 6 semana.

IS2 a partir de la 2 semana

IS4,5

Los IS media en plantas de clavel segn GM

IS2 a partir de la 2 semana, menos en 3GM a partir de la 3 semana

Captulo 3

CARACTERIZACIN RACIAL DE
Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

Desarrollar

un mtodo de diagnstico especfico para Fod basado en la PCR especfica utilizando los cebadores R8.1, R2.1 y R4.2 (Chioccheti et al., 1999), que detectara la presencia de aislados de Fod de las razas 1 u 8, 2 y 4, respectivamente.

CARACTERIZACIN MOLECULAR DEL PATGENO

PCR (REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA)

PCR CON CEBADORES ESPECFICOS PARA RAZAS DE Fod. AMPLIFICACIN DEL ADN MTSSU RIBOSMICO. AMPLIFICACIN DE LAS REGIONES DEL GEN TEF. AMPLIFICACIN DEL ADN DE Fod USANDO CEBADORES BACTERIANOS. IRAP (INTER RETROTRANSPOSON AMPLIFIED POLYMORPHISM). SSAP (SEQUENCE SPECIFIC AMPLIFIED POLYMORPHISM).

EXTRACCIN DE ADN. Materiales y Mtodos

Material Fngico

Raspado y liofilizacin del micelio Medio Selectivo Komada PDA-celofn

Extraccin de ADN
Se extrajo el ADN de 88 aislados: 72 aislados de Fod 2 aislados de F. oxysporum 1 aislado de F. solani 1 aislado de F. proliferatum 5 aislados de F. oxysporum f. sp. lilii 1 aislado de F. roseum 6 aislados control de razas 1, 2, 4,6, 8 y 11

1. Raeder y Broda (1985) 2. Chiocchetti et al., 1999

3. Puregene DNA Isolation Kit

4. Genomic DNA from Plant NucleoSpin

EXTRACCIN DE ADN. Resultados.

ADN (200 ng/L) 1. Raeder y Broda (1985)

Alta calidad genmica

2. Chiocchetti et al. (1999)

Menor calidad genmica

ADN (400 ng/L) 3. Puregene DNA Isolation Kit Menor calidad genmica

ADN (450 ng/L) 4. Genomic DNA from Plant NucleoSpin Alta calidad genmica Eficiente y rpido

Materiales y Mtodos.
PCR CON CEBADORES ESPECFICOS PARA RAZAS DE Fod. Materiales y Mtodos.
Se usaron cebadores descritos como especficos del ADN genmico que flanqueaban los sitios de insercin de Fot1 asociados a razas de Fod (razas 1 u 8 y 2) o Impala (de raza 4). Desarrollar un mtodo de diagnstico especfico de Fod basado en la PCR especfica que detectara la presencia de aislados de estas razas.

Cebadores empleados (Chioccheti, et al., 1999) : R2.1: TTGTTTCTCGATTTCTGTCTCACG Ft3: GGCGATCTTGATTGTATTGTGGTG

R8.1: CGATGAAGTCGGTTTGCGATT Ft3: GGCGATCTTGATTGTATTGTGGTG R4.2: GGTGATTGGAGGAGGAATACC IMP2: AATCCTATAGAGAATCTGTGG

PCR CON CEBADORES ESPECFICOS PARA RAZAS DE Fod. Materiales y Mtodos.

Cada aislado fue testado de cuatro a seis veces, y siempre se incluyeron controles negativos (sin ADN molde).

ADN de 88 aislados

Visualizacin en gel de Agarosa al 1%

Amplificacin del ADN

PCR CON CEBADORES ESPECFICOS PARA RAZAS DE Fod. Materiales y Mtodos.

Controles pertenecientes al Di.Va.P.R.A, no incluidas en la coleccin PAIDI-AGR-217.

PCR raza 4 de Fod

Fod 578, Fod 775, Fod 752 (raza 4), Fod raza 5, y Fod raza 10 Fod 1024, Fod 218, Fod 1178, Fod 451 (raza 2), Fod raza 5 , y Fod raza 10

PCR raza 2 de Fod

PCR raza 1 y 8 de Fod

Fod 1031 (raza 8), Fod 617 (raza 1), Fod raza 5, y Fod raza 10.

+ Aislados control de la coleccin PAIDI-AGR-217 seleccionados para realizar una PCR con las tres parejas de cebadores especficos descrita.

Aislados al azar

PCR CON CEBADORES ESPECFICOS PARA RAZAS DE Fod. Materiales y Mtodos.

Las PCR especficas con las tres parejas de cebadores se realizaron con el ADN extrado de los protocolos de extraccin 1, 3 y 4 . Se repitieron de cuatro a seis veces, para descartar falsos positivos. Amplificaciones positivas, si el ADN amplificaba ms de un 70% de las veces en las repeticiones de las PCR.

Amplificaciones indistintas para las parejas de cebadores, no se consideraron pertenecientes a ninguna raza. Amplificaciones dbiles no se consideraron.

PCR CEBADORES ESPECFICOS PARA RAZAS DE Fod. Resultados

Cebadores IMP2/R4.2 1315 pb

Cebadores IR2.1/ Ft3

564 pb

Cebadores R8.1/ Ft3

295 pb

PCR CEBADORES ESPECFICOS PARA RAZAS DE Fod. Resultados.

88 aislados 21 aislados 11 aislados de 10 Fusarium

spp.

F. oxysporum
8 aislados de

Fod

F. oxysporum
C2 C3

3 aislados de

5 F.o f. sp. lilii

F. solani
F. moniliforme F. proliferatum F. roseum

MC 116-DT-1

P-131

AMPLIFICACIN DEL ADN RIBOSMICO MTSSU. Materiales y Mtodos. Amplificacin de una regin del ADN ribosmico mtSSU de 750 pb.

Cebadores empleados :
MS1: CAGCAGTCAAGAATATTAGTCAATG MS2: GCGGATTATCGAATTAAATAAC Visualizacin en gel de ADN de 88 aislados de Fusarium Clonados y secuenciados Amplificacin Productos Agarosa al 1%

AMPLIFICACIN DE LAS REGIONES DEL GEN TEF. Materiales y Mtodos. Amplificacin de una del gen TEF de 700 pb

Cebadores empleados (ODonnell et al., 1998):

Ef1 (cebador anverso; 5`-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3) Ef2 (cebador reverso; 5`-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3)

Visualizacin
en gel de ADN de 88 Amplificacin Productos Agarosa al 1%

aislados de
Fusarium

Clonados y secuenciados

AMPLIFICACIN DEL ADN MTSSU RIBOSMICO. Resultados.

Secuenciacin Escasas amplificaciones 88 aislados
100% de homologa con dos bases de datos con la especie

23 Aislados

Fusarium oxysporum

AMPLIFICACIN DE LAS REGIONES DEL GEN TEF. Resultados.

Secuenciacin 88 aislados 2 Aislados

P-160 y P-142
78 aislados
100% de homologa con dos bases de datos con la especie

Fusarium oxysporum

AMPLIFICACIN DEL ADN DE FOD USANDO CEBADORES BACTERIANOS. Materiales y Mtodos. Amplificacin de manera previa a las amplificaciones con cebadores especficos de Fusarium, al objeto de comprobar la ausencia o presencia de ADN eubacteriano que pudiera interferir con los resultados Cebadores empleados (Minerdi et al, 2002) :
704f Minerdi (5`-GTAGCGGTGAAATGCGTAGA-3) 1495r Minerdi [5`-G(AT)ATTACCGCGGCGGC(GT)GCTG-3]. Visualizacin en gel de Amplificacin Productos Clonados y secuenciados

ADN de 88
aislados de Fusarium

Agarosa al 1%

AMPLIFICACIN DEL ADN DE FOD USANDO CEBADORES BACTERIANOS. Resultados.

88 aislados
FNP 6 MC-116 DT

Secuenciacin

Pseudomonas reactans

Microscopia confocal Bacterias exgenas

TCNICA I-RAP. Materiales y Mtodos.

Tcnica que genera polimorfismos que pueden ser detectados despus de la amplificacin de la regin genmica ubicada entre dos retrotransposones adyacentes.
Se utilizan iniciadores complementarios a las secuencias flanqueantes del retrotransposn. Uno est marcado con la finalidad de evidenciar ms fcilmente los polimorfismos. Cebadores empleados: HANA, GAGA, HANI-GAGI, GAGA-GAGI, HANA-GAGI, HANI-HANA (Di.Va.P.R.A secuencias de cebadores no publicadas). Secuencia LTR llamada Han. Visualizacin

ADN de 88
aislados de Fusarium

Amplificacin Productos

en gel de Agarosa al 1%

Clonados y secuenciados

TCNICA I-RAP. Resultados.

Las secuencias polimrficas en la regin del inter-transposn, generalmente, son causadas por mutaciones.

El nivel de polimorfismo detectado por la tcnica IRAP puede ser pequeo, ya que depende solamente de la cantidad de mutaciones presentes en las regiones flanqueantes(Valadez y Kahl, 2000).

No se obtuvieron patrones de amplificacin suficientes para diferenciar aislados.

TCNICA S-SAP. Materiales y Mtodos.

Se amplifica una regin comprendida entre un cebador complementario a una secuencia del RTN (cebador especfico) y un cebador complementario a un oligonucletido adaptador unido a un sitio de restriccin cercano (cebador selectivo) (Waugh et al.,1997)

DIGESTIN-RESTRICCIN LIGACIN A LOS ADAPTADORES AMPLIFICACIN PRESELECTIVA AMPLIFICACIN SELECTIVA VISUALIZACIN EN GEL DE PA

TCNICA S-SAP. Materiales y Mtodos.

25 aislados de Fusarium.
Aislados P-116 P-117 P-122 P-123 P-127 P-132 P-134 P-136 P-137 P-140 P-141 P-142 P-146 Husped Fusarium sp.* Lilium Fol* Clavel Fod* Clavel Fod Clavel Fod Clavel Fod Clavel Fod Clavel Fod Clavel Fod Clavel Fod Clavel Fod Clavel Fod Clavel Fod Clavel Fod Origen** Espaa (A) Espaa (A) Espaa (A) Espaa (A) Espaa (A) Italia (N) Italia (N) Italia (N) Italia (N) Italia (N) Italia (N) Italia (N) Italia (N) Aislados P-149 P-152 P-161 P-162 A4 2B C6 Fancesco37/61/4 MC 76 A-2 Fol 1 Fod 523 R4 Fod 256 R6 Fod 256 R6 Husped Clavel Clavel Clavel Clavel Clavel Clavel Clavel Clavel Clavel Lilium Clavel Clavel Clavel Fusarium sp*. Fod Fod Fod Fod Fod Fod Fod Fod Fod Fol Fod Fod Fod Origen** Italia (N) Italia (N) Italia (N) Italia (N) Espaa (A) Italia (N) Espaa (C) Kenya Espaa (A) Espaa (A) Italia Italia Italia

ADN molde 500 ng/L Enzimas de restriccin Cebadores selectivos Cebadores Especficos MseI EcoRI

M Skippy

E Foxy

TCNICA S-SAP. Materiales y Mtodos.

Placas de 96 pocillos

Desnaturalizacin 5 min 100C

Se carga 25 L en gel de PA al 6%

Precarga 30 min

Electroforesis 5h a 80W

Matriz binaria
Distancias de Nei y Li Mtodo neighbor-joining: dendogramas

TCNICA S-SAP. Resultados.

De los 25 aislados, 14 se situaron en una primera rama que los agrupaba como aislados cercanos entre s y otros 9 que no tenan una relacin significativa.
Los 14 pertenecan a la raza 2 de Fod Los aislados P-116 y Fol 1 sin ninguna coincidencia con los aislados de Fod

Caracterizacin

fenotpica de una coleccin de aislados de Fod muestreados en las zonas de produccin andaluzas e italianas.
INOCULACIN DE AISLADOS DE FOD EN PLANTAS DE CLAVEL DIFERENCIADORAS DE RAZAS. Materiales y Mtodos.
Metodologa anteriormente descrita
CV: Annelies, Extica, Sangra y Solar

Experimento 1: 63 aislados de Fod

Hidrolizado de casena

Experimento 2: 54 aislados de Fod CV: Annelies, Eilat, Elsy, Extica y Solar

INOCULACIN DE AISLADOS DE FOD EN PLANTAS DE CLAVEL DIFERENCIADORAS DE RAZAS. Resultados.

Raza 1 u 8 Experimento 1: 63 aislados de Fusarium

Raza 2

Raza 4

Raza 6

NE

9,1% Raza 8 7,5%

53,7%

0%

0%

36,5%

Raza 1

1,6%

12,5% Raza 1 Experimento 2: 54 aislados de Fusarium Raza 2 Raza 4 Raza 6

79,2% NE

13%

50%

0%

5,5%

31,5%

INOCULACIN DE AISLADOS DE FOD EN PLANTAS DE CLAVEL DIFERENCIADORAS DE RAZAS. Resultados.

Del total de los 72 aislados de Fusarium testados: 39 aislados Fod raza 2 8 Fod raza 1 1 Fod raza 8 3 Fod raza 6

21 aislados de Fusarium no pudieron atribuirse a ninguna de las razas de Fod por no presentar patogenicidad en planta de clavel.
La caracterizacin racial de 38 aislados espaoles de Fusarium result en incidencias, para Fod en Espaa, de: 47% de raza 2 10% de raza 1 2 % de raza 8 7% de raza 6 34% sin determinar

CONCLUSIONES

1. Los aislados A3, A4 y A7 de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod) incubados a 40 y 42C, perdieron la viabilidad de forma paulatina con el tiempo, mientras que las prdidas de viabilidad a 43, 45 y 47C ocurrieron tras un menor periodo de incubacin.

2. De estos tres aislados, A7 mostr un efecto diferencial, resultando ms difcil de

erradicar a temperaturas ms bajas. A temperaturas ms altas, se comport de forma irregular, siendo A3 ms difcil de eliminar que A7.

3. Todos los aislados recuperados tras la incubacin a 47C fueron patognicos, mientras que en los resultantes de las incubaciones a 43 y 45 C hubo 7 y 2 aislados que se mostraron no patognicos.

4. La solarizacin del suelo en invernadero cerrado logr la reduccin de los inculos de Fod A3, A4 y A7 enterrados a 15, 30 y 45 cm, a niveles inferiores al 3% tras un periodo de 29-43 das. La eficacia de la solarizacin del suelo fue superior en muestras enterradas a 15 y 30 cm que en las ubicadas a 45 cm de profundidad.

5. Todos los aislados recuperados tras la solarizacin de 2003 fueron patognicos, pero un 31% de los recuperados en 2002 resultaron no patognicos. La virulencia de los aislados menor patognicos la de recuperados los en 2002 en fue 2003,

significativamente

que

recuperados

independientemente de profundidad, tratamiento del suelo, extraccin y grupo morfolgico examinados.

6. De cuatro protocolos de extraccin de ADN ensayados en nuestro estudio, Genomic DNA from Plant NucleoSpin result ser el ms eficaz en cuanto a

la velocidad de la extraccin y la calidad del ADN.

7. La PCR especfica no es un mtodo determinante para el diagnstico molecular de Fod, debiendo ser apoyado por otro tipo de tcnicas, como los tests de patogenicidad.

8. La S-SAP se considera una tcnica de alta sensibilidad y precisin para la caracterizacin racial del patgeno. Se requiere una puesta a punto que la desarrolle y perfeccione.

9. Mediante PCR con cebadores especficos para la deteccin de eubacterias, y con observaciones en microscopa confocal, se confirm la presencia de bacterias exgenas. La secuenciacin de los productos de amplificacin de la PCR result en la identificacin de Pseudomonas reactans en slo dos aislados monocondicos de Fod (FNP6 y MC116DT-1) de los 88 evaluados.

10. Los aislados de Fod caracterizados fenotpicamente pertenecieron en su

mayora a la raza 2, y una minora a la raza 1, siendo ambas razas tanto de origen geogrfico espaol como italiano. La raza 4 no se detect en la coleccin de aislados espaoles evaluados, por lo que parece no estar

presente en Andaluca.