Biologa Molecular

Temas: 7.9 Hibridacion de sondas tipo Southern 7.10 Hibridacion de sondas tipo Northern Alumno: Jos Ulises Montes Amparn.

 Comprender los conceptos y principios bsicos de la hibridacin de cidos nucleicos. Explicar los procedimientos de la hibridacin tipo Souther para la identificacin de genes y genomas, as como aplicaciones en diferentes campos y actividades humanas.

Explicar los procedimientos de la hibridacin tipo Northem para analizar la expresin de genes, as como aplicaciones en diferentes campos y actividades humanas.

 Considerar que las tcnicas se basan en metodologas inflexibles, siendo que stas son adaptadas a la muestra que es analizada y a las posibilidades de quien las practica. No comprender la naturaleza y propiedades de los cidos nucleicos. No comprender los fundamentos de la hibridacin. molecular.

No tener clara la diferencia entre mtodos de marcaje y pensar que slo un tipo de tcnica es til para un propsito particular.

 Hibridizacin: Formacin de dplex a partir de cualquier combinacin de cidos nucleicos. Estringencia: Son las condiciones a las cuales desarrolla la hibridizacin y la deteccin del duplex. se

Baja estringencia: Permite mayor cantidad de hibridacin pero con menor especificidad (baja temperatura, alta concentracin de sales). Alta estringencia: Menor cantidad de hibridacin pero mayor especificidad.

 Copia nica: Secuencia de DNA que se encuentra una sola vez por genoma.

DNA repetido: Secuencias presentes en ms de una copia.

Dplex: Estructura de cidos nucleicos de doble cadena.

Desnaturalizacin: Proceso por el cual se generan cadenas sencillas a partir de un dplex.

Reasociacin/Renaturalizacin: Unin de dos secuencias complementarias por medio de apareamiento de bases.

 Temperatura. La concentracin de sales.

Bases no complementarias.
Longitud del fragmento.

Es importante tomar en cuente estos factores ya que las condiciones optimas no son las mismas para cada experimento.

 Son oligonucletidos sintticos, cDNA, fragmentos de DNA genmico o RNA de cadena sencilla complementarias a la regin de DNA o RNA blanco.

Contienen alguna marca que revela su unin (hibridacin) a la secuencia elegida, generalmente se trata de P32.

 El mtodo tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern en 1975 para la deteccin de genes especficos en el ADN celular.

El ADN es digerido con una enzima de restriccin y los fragmentos son separados por tamaos mediante una electroforesis en un gel.

El DNA del gel se fragmenta con HCl y se desnaturaliza con NaOH.

Las bandas de DNA se visualizan por tincin y se toma fotografa.

Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una rplica de la disposicin de los fragmentos de ADN presentes en el gel. .

A continuacin el filtro se incuba con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubacin la sonda se va hibridando a las molculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposicin a una pelcula de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una pelcula sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo

 Caracterizar la identidad de genes especficos. Identificar fragmentos de DNA que contienen un gen determinado, entre una mezcla de muchos fragmentos.

Investigar la organizacin molecular de las secuencias genmicas.

Detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermedades genticas humanas y a cncer. Deteccin de restriction site polymorphism (RSP). Deteccin de mutaciones puntuales mediante RFLP

 El mtodo, tipo northern o northern blot, se utiliza para identificar ARN a diferencia de l metodo Southern que se utoliza para identificar ADN. Las molculas de RNA son separadas por electroforesis en geles desnaturalizantes. Las bandas de RNA y marcadores de peso molecular se visualizan por tincin y se toma fotografa. Los bandas del gel se transfieren a membranas de nylon. La membrana se seca y se fija. Se aplica la sonda previamente marcada. Se permite la hibridizacin a diferentes condiciones de estringencia en buffer desnaturalizante.

Detecta la presencia de RNA de uno o varios tipos celulares o tejidos, complementario a la sonda.

 Proporciona informacin de la presencia de un transcrito de RNA complementario a la sonda. Es posible examinar patrones de expresin gnica. Permite detectar cortes y empalmes del mRNA y mltiples tipos de transcritos provenientes de un solo gen. Es posible caracterizar y cuantificar transcripcional de un gen determinado. la actividad

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www.gfmer.ch/Educacion_medica_Es/Pdf/Analisis-geneticamolecular.pdf