REPASO PRUEBAS BIOQUIMICAS

Catalasa
Bacterias en ambientes aerobios. Convertir el H2O2 en H2O y O2. Es positiva cuando produce burbujas de oxgeno (H2O2 3%). Diferencia gnero: Staphylococcus (catalasa positivo) Micrococcus y Listeria. Streptococcus (catalasa negativo).

Observacin hemlisis
Agar sangre Medio de cultivo enriquecido Hemolisinas (enzimas que lisan los hematies) Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematies. Se siembra por agotamiento

Coagulasa
La coagulasa, enzima activadora del fibringeno transformndolo en fibrina. Staphylococcus aureus (Rx +) y los no patgenos Se coloca en un tubo de ensayo 0,5 ml de plasma (conejo, humano), se coloca de 3-4 colonias de bacterias, se incuba a 37C de 4-6 h.

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Fermentacin de manitol
Medio selectivo y diferencial para S. aureus. NaCl 7,5% le proporciona lo selectivo ya que son microorganismos osmotolerantes u osmfilos se multiplican en l. Manitol nico azcar fermentado por las cepas patgenas de este gnero. La produccin de cidos es detectada por el viraje del indicador de pH del (rojo fenol) a amarillo. Staphylococcus epidermidis no fermenta el manitol. Estra, se incuba por 24 h a 37C .

Sensibilidad o resistencia a ciertos antibioticos

Novobicina: Dx diferencial de S. epidermidis (sensible o S. aureus, halo de inhibicin: 16mm) y S. saprophyticus. (resistente) Bacitracina: diferenciacin de Streptococcus. Sensible (B-hemoltico grupo A, S. pyogenes) halo mayor o igual a 10mm. (resistentes <10mm).

Optoquina: Streptococcus pneumoniae (15mm). Demas Streptococcus a-hemoliticos no presentan halo de inhibicin.

Agar Mller Hinton

Se incuba a 24 h y 37C

S. pyogenes

CAMP
Objetivo: Separar S. agalactiae de los dems estreptococos hemolticos. Fundamento: Se basa en que los estreptococos del grupo B producen un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cclica) que aumenta la zona de hemlisis producida por un estafilococo productor de -lisina. Procedimiento: Se realiza estriando un cultivo de estreptococo hemoltico a una estra de un estafilococo productor de -lisina en agar sangre. Se incuba 18-24 horas a 37C. Interpretacin de los resultados: positiva si se evidencia presencia de una zona de potenciacin de la hemlisis en forma de punta de flecha.

Se incuba por 24 h a 37C

S. agalactiae

S. pyogenes

DNAsa
Diferencia S. aureus de las otras especies de Staphylococcus. Presencia de la enzima termoestable DNAsa, cliva enlaces fosfodister internos de la molcula de ADN. Se siembra la estria, se incuba 18 h a 35C. Positivo: formacin de DNAsa despues de revelar con HCL 1N

Hidrlisis de PYR
Identificacin de Streptococcus pyogenes y Enterococcus spp. Los discos contienen pirrolidonil-betanaftilamida, determina la presencia de la enzima l-pirrolidonil arilamidasa. Si contiene enzima hidroliza sustrato presente en discos, libera grupo pirrlico y reacciona con el reactivo N-N dimetilamino cinamaldehido.

Solubilidad en bilis
Capacidad de especies bacterianas de lisarse en presencia de sales biliares. Taurocolato y el desoxicolato de sodio al 10% Descenso en la tensin superficial junto con actuacin de enzimas autolticas, destruyen la clula. Se aaden colonias a 0,5 ml de una sln de desoxicolato de sodio al 10%, se mezcla y se incuba a 35-37C en incubadora o bao maria por 3 h. Si se produce aclaramiento es soluble en bilis ( Streptococcus pneumonia) turbio (otros Streptococcus)

Fermentacin de azcares
Capacidad de un microorganismo de fermentar un CH especfico (glucosa, sacarosa, maltosa, lactosa), produciendo cido o cido con gas. Se suspende la colonia en la muestra a 37C por 48-72 h.

+ con produccin de gas

+ sin produccin de gas

resultado negativo

medio sin inocular

Reduccin de nitratos
Determinar la capacidad de un microorganismo para reducir nitratos a nitritos o gas nitrgeno libre. Caldo nitratado:

 Reactivo de griess: Sln A: Sln B: Se transfiere la muestra al tubo y se incuba a 35C por 12 a 24 horas. Se aade 2 gotas de la sln A y luego 2 de la sln B

Resultado positivo

Resultado negativo

Si la Rx es negativa se aade polvo de zinc, si aparece color rosa o rojo confirma si no hay desnitrificacin +.

MIO
INDOL: determina la capacidad de las bacterias para producir indol a partir del triptfano. Caldo triptonado:

 Reactivo de Kovac:

Se inocula un tubo del medio y se incuba a 37C por 40 a 48 horas. Luego se aaden 0,5 mL del reactivo de Kovac y se agita. Color Rojo positivo Color Amarillo Negativo (no se liber indol porque la bacteria no tiene triptofanasa)

 Descarboxilacion de Ornitina La ornitina descarboxilasa es una enzima que acta a pH 6.5 Si tiene sta enzima descarboxila al aa ornitina y tambin se desamina. Los productos son CO2 + H2O + AMINA (putresina o cadaverina) los cuales son compuestos alcalinos. Debido a los productos alcalinos se alcaliniza el medio y los resultados son: Positivo Color Morado (Alcalino) Negativo Amarillo (cido)

 MOVILIDAD: Movilidad Negativa: Si la cepa crece solo en la picadura es inmvil. Movilidad Positiva: Si crece en todo el medio, es mvil.

AGAR YEMA DE HUEVO

Produccin de (1) lecitinasa, (2) lipasa y (3) protelisis. 1- hidrolisa fosfolpidos, es el de mayor formacin en la zona opaca (alrededor del crecimiento de la bacteria). 2- presenta brillo aperlado alrededor de la colonia. 3- produce suspensin del medio y se decolora (halo transparente).

Clostridium perfringes (+ lecitina)

Oxidasa
La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e-. Este test se usa para diferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo) Se impregnan discos de papel con parafenilandiamina y se coloca en un cultivo creciendo en placas de agar nutritivo.

TSI
Tiene Glucosa, lactosa, sacarosa, azufre, y sal de hierro. Se realizan las pruebas: Fermentacin de glucosa Fermentacin de lactosa cido sulfhdrico Gas de Glucosa

 Color original sin sembrar: Rojo (Naranja) Gas de Glucosa positivo Formacion de burbuja pequea o botado del medio. H2S positivo Precipitado Negro. Realice una puncin en el taco y una estra en el bisel. Incube a 35C. Observar a las 18-24.

FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS Fondo Amarillo: Glucosa + Bisel Rojo: Lactosa - , Sacarosa Bisel Amarillo y Fondo Amarillo: GLuc + Lac + y Sac+. El medio tiene 1 g de glucosa, 10 gramos de lactosa y 10 gramos de sacarosa, por litro.

CITRATO
No tiene carbohidratos Tiene Azul de Bromotimol como Indicador Se ve si la bacteria utiliza citrato como fuente de carbono, el cual se encuentra en el ciclo de krebs. El medio tiene Citrato de Sodio y Sal de Amonio. POSITIVO: Color Azul NEGATIVO: Color Verde (original)

 Tambin puede cambiar de color y utiliza la sal de amonio (NH4), porque se alcaliniza el medio: Color Azul: Cit POSITIVO (pH Acalno) Color Verde: Cit NEGATIVO (Neutro) Color Amarillo: Cit NEGATIVO (cido) Puede no cambiar de color, pero si hay crecimiento es positivo, ver otras pruebas.

SIM
INDOL, MOVILIDAD, ACIDO SULFIDRICO ACIDO SULFHIDRICO H2S El medio tiene tiosulfato, el cual libera cido sulfhdrico que es un gas. ste reacciona con la Sal de Hierro y forma un precipitado negro que es sulfuro ferroso. Color Negro: Positivo (debido al precipitado) Sin precipitado Negro: Negativo.

VP-MR
Es un caldo glucosado PRUEBAS QUE SE REALIZAN: ROJO DE METILO, VOGES PROSKAUER ROJO DE METILO Algunas bacterias obtienen energa de la glucosa del medio. Se forma piruvato (cido piruvico) y toma diferentes vas:

 algunas bacterias fermentan (se usan en productos lcteos) otras forman alcoholes (levaduras) Otras utilizan el ciclo de krebs. En otras hay vas que producen cidos mixtos. Las que producen cidos mixtos, acidifican el medio (bajan el pH) Estas bacterias son rojo de metilo positivas. POSITIVO: Color Rojo NEGATIVO: Color Amarillo

 VOGES PROSKAUER Esta prueba se utiliza para ver la produccin de Acetona (Acetil Metil Carbinol) Se le agregan 6 gotas de Alfa Naftol que es un catalizador. Al agregar 3 gotas de KOH reacciona con la Acetona y forma un precipitado: POSITIVO: Color ROJO NEGATIVO: Amarillo, caf, oscuro

LIA
Este medio, tiene peptonas y aminocidos (lisina). Se realiza la prueba: H2S (mismo fundamento) Descarboxilacin de Lisina. (o desaminacin) La prueba consiste en buscar la enzima lisina descarboxilasa de ciertas bacterias la cual descarboxila a la Lisina (aminoacido).

 Descarboxilacin de Lisina Al descarboxilar queda solo la amina (putresina o cadaverina). La cual da al medio un pH alcalino. POSITIVO: Color Morado (alcalino) NEGATIVO: Color Amarillo (cido) Proteus (lisina-) no descarboxila, solo desamina.

UREA
Caldo Original Color Amarillo TIENE: Rojo fenol como indicador Peptonas Carbohidratos como fuente de C. UREA FUNDAMENTO: Ver la hidrlisis de la urea.

 Ver si la bacteria tiene la enzima Ureasa que hidroliza la urea y produce amoniaco. Si se produce Amoniaco es Positivo. Positivo: Rojo o Rosa Mex (Alcalino). Negativo: Color Amarillo(Acido).

HIDRLISIS DEL HIPURATO

El hipurato es un compuesto orgnico aromtico que puede ser hidrolizado enzimticamente originando benzoato y glicina. Este test se usa a menudo para diferenciar especies de Streptococcus. Una suspensin de bacterias se aade a una solucin de hipurato y se incuba 2 horas. En ese momento se aade la nihidrina.

MEDIO TCBS
Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y otras especies de Vibrio (Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa). Fundamento El extracto de levadura, la peptona de carne y la triptena aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. Tiosulfato y citrato, presencia de bilis y un pH fuertemente alcalino: inhibicion de enterobacterias. Las colonias son verdes para las cepas que no la utilizan y amarillas para las que producen cido a partir de este azcar. (viraje del color de los indicadores de pH azul de timol y azul de bromotimol) El tiosulfato de sodio aporta azufre y junto con el citrato frrico permiten la deteccin de produccin de cido sulfhdrico.

microorganismo Vibrio cholerae V. parahae molyticus V. alginolyticus Aeromonas spp.

Crecimiento bueno bueno bueno inhibido

Caracteristicas de las colonias Amarillas de 2-3 mm de dm, de borde traslcido Centro verde azulado, borde traslcido Amarillas grandes

E. coli

inhibido

HIDRLISIS DE GELATINA
La mayora de los polmeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las clulas. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polmeros transportando al interior de la clula en monmeros que les sirven para crecer. La produccin de proteasas es evaluada por incorporacin de una protena (gelatina o casena) en un medio slido en placa. La placa se inunda con cido que precipita la proteina no hidrolizada.

AGAR CENTRIMIDA
Se utiliza para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa

Inocule el microorganismo a identificar en la superficie del agar cetrimida eincube a 37C durante 18-24 horas. Slo los microorganismos resistentes a la cetrimida pueden crecer en este medio.

 la peptona: fuente de nitrgeno Glicerol: fuente de carbono y energa. La produccin de piocianina se estimula mediante el cloruro de magnesio y el sulfato potsico en el medio. La cetrimida (bromuro de cetil trimetil amonio) inhibe una amplia variedad de otros organismos, incluidos otras especies de Pseudomonas.

ESPECIE M tuberculosis M avium M bovis M kansasii CRECIMIENTO M smegmatis M chelonae

CREC 5% NaCl

REDUCCION DE NITRATOS

CREC A 45

PATOGENO DE HUMAN

PIGMENTACION

RAPIDO + +

+ +

+ -

+ + + +

ninguna Colonias viejas ninguna fotocromogeni ca Ninguna Ninguna

+ -

+ -

N BACILOS ENCONTRADOS

CAMPOS DE INMERSION OBSERVADOS

FORMA DE REPORTE

NO SE OBSERVAN BAAR 100 CAMPOS

DE 0 A 1 + POR CAMP DE 1 A 10 BAAR POR C > 10 BAAR POR C 100 CAMPOS 50 CAMPOS 20 CAMPOS

NEGATIVO
POSITIVO + POSITIVO ++ POSITIVO +++