You are on page 1of 9

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

(19)

RU

(11)

2 466 401

(13)

C1

(51) МПК

G01N 33/49

(2006.01)

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(12) ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка: 2011109741/15, 15.03.2011
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
15.03.2011

C 1
2 4 6 6 4 0 1
R U

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УПРУГОСТИ КЛЕТОК КРОВИ
(57) Реферат:
Изобретение
относится
к
области
физиологии крови и может быть использовано
для изучения свойств поверхности нативных
клеток методом силовой спектроскопии.
Способ включает изготовление кантилевера,
сканирование
клеток
ткани,
получение
силовых кривых, расчет модуля Юнга.
Кантилевер изготавливают, на основе полых
полимерных микросфер, диаметром 10 мкм,
которые прикрепляют в режиме силовой
спектроскопии на типлесс. Полые полимерные
микросферы
расположены
на
противоположном участке той же стеклянной
подложки, что и суспензия с живыми клетками,
стеклянную подложку помещают в камеру,
насыщенную парами воды, и сначала проводят
силовую спектроскопию на участке стеклянной
подложки,
где
расположены
полые

полимерные микросферы, осуществляя подвод
типлеса на отдельно лежащую полую
полимерную
микросферу,
а
после
прикрепления
ее
к
типлессу
область
сканирования переводят на суспензию клеток
и, не отрываясь от образца, производят
регистрацию силовых кривых. Предлагаемый
способ технически прост, позволяет исключить
повреждение клеток в процессе проведения
силовой спектроскопии, не изменяет свойств
поверхности
исследуемых
образцов,
обеспечивает сохранение нативности и формы
клеток
крови,
обеспечивает
получение
наиболее достоверных результатов. Способ
может быть использован в общей и
клинической физиологии для исследования
упругости клеток крови. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 1
пр.
Ñòð.: 1

ru

C 1

Адрес для переписки:
308015, г.Белгород, ул. Победы, 85, БелГУ,
отдел интеллектуальной собственности, Н.Д.
Цуриковой

2 4 6 6 4 0 1

(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное автономное
(45) Опубликовано: 10.11.2012 Бюл. № 31
образовательное учреждение высшего
(56) Список документов, цитированных в отчете о
профессионального образования
поиске: ЛЕБЕДЕВ Д.В. и др. Измерение модуля
"Белгородский государственный
Юнга биологических объектов в жидкой
национальный исследовательский
среде с помощью специального зонда атомноуниверситет"(НИУ "БелГУ") (RU)
силового микроскопа. - Письма в ЖТФ 35,
вып.8, 54-61 (2009). DD 216541 А, 12.12.1984.
RU 2347224 C2, 20.02.2009. ГОЛОВКО С.И.
Сравнительная характеристика мембранного
резерва ядерных клеток крови позвоночных
животных: Дисс. к.м.н. - (см. прод.)

R U

Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 15.03.2011

(72) Автор(ы):
Скоркина Марина Юрьевна (RU),
Федорова Марина Зотовна (RU),
Забиняков Никита Александрович (RU),
Сладкова Евгения Анатольевна (RU)

83(5 Pt 1):051925. 2011 May. et al. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2010. PubMed. PARK Y. PMID: 21728589. R U R U 2 4 6 6 4 0 1 C 1 C 1 2 4 6 6 4 0 1 Ñòð. Epub 2011 May 27. 18 с. реф. Measurement of the nonlinear elasticity of red blood cell membranes.: 2 .(56) (продолжение): Ярославль.

Cl. Sladkova Evgenija Anatol'evna (RU) (21)(22) Application: 2011109741/15.2011 (45) Date of publication: 10. causes no changes of the properties of the analysed samples. Fedorova Marina Zotovna (RU).03. calculating a Young 's modulus. enables eliminating the cell damage during force spectroscopy. 85. otdel intellektual'noj sobstvennosti. Pobedy. 1 ex R U 2 4 6 6 4 0 1 (57) Abstract: FIELD: medicine. Zabinjakov Nikita Aleksandrovich (RU). ul.03.2012 Bull. and force curves are recorded with staying attached to the sample. The hollow polymer microspheres are arranged on the opposite section of the same glass substrate with a live cell suspension.: 3 en C 1 C 1 (54) METHOD FOR BLOOD CELL ELASTICITY TEST 2 4 6 6 4 0 1 Mail address: 308015. Tsurikovoj (73) Proprietor(s): Federal'noe gosudarstvennoe avtonomnoe obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego professional'nogo obrazovanija "Belgorodskij gosudarstvennyj natsional'nyj issledovatel'skij universitet"(NIU "BelGU") (RU) R U Priority: (22) Date of filing: 15. BelGU. provides maintaining nativity and form of the blood cells. 1 tbl. producing force curves. and at first force spectroscopy is performed at the section of the glass substrate comprising the hollow polymer microspheres with Ñòð.11.03. enables producing the most reliable results. The cantilever is made of hollow polymer microspheres of the diametre of 10 mcm attached on a tipless in the mode of force spectroscopy.RUSSIAN FEDERATION (19) RU (11) 2 466 401 (13) C1 (51) Int. the substrate is placed in a chamber saturated with water vapour. The presented method is technically simple. g. and after attached to the tipless the scanned area is induced to cover the cell suspension.2011 . SUBSTANCE: method involves making a cantilever. scanning tissue cells. 31 delivering the tipless on a separate hollow polymer microsphere.01) FEDERAL SERVICE FOR INTELLECTUAL PROPERTY (12) ABSTRACT OF INVENTION (72) Inventor(s): Skorkina Marina Jur'evna (RU).Belgorod. N. EFFECT: method may be used in general and clinical physiology for blood cell elasticity test. G01N 33/49 (2006. 15.D.2011 (24) Effective date for property rights: 15.

вступают с ними во взаимодействие за счет сил адгезии. закрепляют на твердом основании в жидкостной ячейке АСМ. а затем опускают на отдельно лежащий кварцевый шарик (под контролем оптического микроскопа). В результате довольно сложно получить количественные значения упругости. С помощью созданного зонда проводят измерения упругих свойств поверхности брюшной аорты лабораторной крысы. Известны способы изучения свойств поверхности биологических объектов с использованием сенсоров. Помимо этого биологические сенсоры не пригодны для измерения упругости клеток крови.RU 2 466 401 C1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Изобретение . Для этого фрагмент кровеносного сосуда разрезают вдоль. Использование в процессе прикрепления шарика к tipless контилеверу эпоксидного клея создает риск получения хрупкого tipless контилевера Ñòð. Для осуществления способа изготавливают зонд следующим образом: 1) высаживают кварцевые шарики диаметром 5 мкм на стеклянную подложку и высушивают их.: 4 DE . на основании которых рассчитывают модуль Юнга в соответствии с моделью Герца. Сканирование производят в жидкостной ячейке с помощью микроскопа «Solver-Bio» (производитель НТ-МДТ). 2) наносят небольшое количество эпоксидного клея на другую часть стеклянной подложки. Получают серию силовых кривых. включающий измерение упругости поверхности кровеносного сосуда. Наиболее близким по своей сущности к заявляемому является способ измерения модуля Юнга биологических объектов в жидкой среде с помощью специального зонда АСМ [4]. Для АСМ спектроскопии рекомендованы способы измерения упругости зондами с «мягкой балкой».к. Однако главным недостатком этих способов является малый радиус АСМ-зонда. не откалиброванных размеров. константа жесткости которой находится в пределах 10 ‐2-10 ‐1 Н/м. В области сканирующей зондовой микроскопии известны способы определения упругости биологических объектов методом силовой спектроскопии. марки CSC12 фирмы MicroMash (жесткость 0. т. Основным недостатком таких способов является использование в качестве сенсоров биологических объектов. который легко нарушает целостность биологической мембраны. Недостатком изложенного способа является использование в качестве зонда кварцевых шариков. которые являются жесткими. позволяющей исследовать мягкие биологические образцы [2]. протыкая ее своим острием. т. пьезосканер которого используется в качестве прецизионного манипулятора.6 Н/м). В основе этого метода лежит измерение степени деформации поверхности образца при взаимодействии его с вершиной зонда АСМ [1]. оставляя на ней вдавливания. в держатель АСМ. 4) свободный конец tipless контилевера приводят в соприкосновение с каплей жидкости клея. точная форма вершины каждого конкретного зонда неизвестна. 5) tipless контилевер извлекают из микроскопа и оставляют до полного затвердевания эпоксидного клея. несмотря на большой радиус закругления. в результате они изменяют свойства клеточной поверхности. в качестве которых выступают биологические молекулы. 3) устанавливают tipless контилеверы. одиночные клетки и слои.способ определения упругости клеток крови относится к области физиологии крови и может быть использован для изучения свойств поверхности нативных клеток методом силовой спектроскопии. иммобилизованные на титановых tipless кантилеверах [3].е.

которые являются инертными и мягкими. которые не будут изменять свойства поверхности. Поставленная задача решается с помощью предлагаемого способа определения упругости клеток крови. таким образом. включающего изготовление tipless контилевера. кроме того.к. а после прикрепления ее к tipless контилеверу область сканирования переводят на суспензию клеток и. Сканирование стенки сосуда. Модификация tipless контилеверов полыми полимерными микросферами на одной стеклянной подложке с клетками крови позволяет сократить время исследования и увеличивает скорость манипулирования объектами. Длительная сушка (до 1 суток) зондов до полного затвердевания клея ограничивает время исследования живых клеток. Полые полимерные микросферы расположены на противоположном участке той же стеклянной подложки. использование в процессе выполнения силовой спектроскопии жидкостной ячейки. что позволяет избежать воздействия на поверхность Ñòð.: 5 . не нарушает целостность их мембран и сводит к минимуму адгезию зонда к поверхности клетки.RU 2 466 401 C1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 при несоблюдении пропорций при разведении эпоксидной смолы с отвердителем. причем tipless контилевер изготавливают на основе полых полимерных микросфер диаметром 10 мкм. Кроме того. где расположены полые полимерные микросферы. и сначала проводят силовую спектроскопию на участке стеклянной подложки. Отличительными признаками заявленного способа являются: . что негативно влияет на достоверность полученных результатов. использования влажной камеры. полые полимерные микросферы являются инертными и достаточно мягкими. Задачей предлагаемого изобретения является создание способа исследования упругих свойств клеток крови. производят регистрацию силовых кривых не менее 20 клеток. предварительно обработанный густым раствором желатина и охлажденный на воздухе в течение 2-3 минут. изменяет силы поверхностного натяжения клеточной поверхности. не будут оставлять повреждений после контакта с клеточной поверхностью. Предлагаемый способ позволит получить объективные данные об упругих свойствах клеток крови за счет использования модифицированных АСМ-зондов. позволяющего получать наиболее достоверные результаты. заполненной физиологическим раствором. насыщенную парами воды. исключается повреждение клеток в процессе их контакта. получение силовых кривых. создает дополнительные силы при отводе зонда от поверхности образца. осуществляя подвод tipless контилевера на отдельно лежащую полую полимерную микросферу. за счет быстрой смены областей сканирования. . сканирование клеток ткани. не отрываясь от образца. закрепление биологической ткани. расчет модуля Юнга. что приводит к завышенным значениям модуля Юнга. Для сохранения нативных свойств клеток стеклянную подложку помещают в камеру. которые прикрепляют в режиме силовой спектроскопии на tipless контилевер. применение желатина для их приклеивания позволит сохранить оптимальный баланс сил при выдвижении пьезосканера и надавливании на клетку с определенной силой. т. исключения механического воздействия на клетку в процессе приготовления препарата. который не вызывает механического повреждения клеток.использование густого раствора желатина для обработки tipless контилеверов поддерживает оптимальный баланс сил при выдвижении пьезосканера и надавливании на клетку с определенной силой. создающей оптимальные условия для сохранения нативной формы клеток.использование модифицированных АСМ-зондов на основе полых полимерных микросфер диаметром 10 мкм. что и суспензия с живыми клетками. закрепленного на твердом основании.

обеспечивающих сохранение нативного функционально активного и морфологически неизменного состояния клеток в течение времени.RU 2 466 401 C1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 чрезмерных нагрузок при силовом надавливании.использование в процессе сканирования влажной камеры для создания условий. Производят забор крови больных лейкозом и здоровых доноров в гепаринизированные вакуумные пробирки. не доводя до превращения желатина в гель. примесь эритроцитов разрушают 0. находящиеся в виде водной суспензии. В этой области регистрируют силовые кривые 20 клеток. Полученные лимфоциты трижды отмывают физиологическим раствором. Регистрируют силовые кривые отвода и подвода tipless контилевер с поверхности 20 клеток. где расположена суспензия лимфоцитов здоровых доноров. Готовят густой раствор желатина. Результаты измерений представлены в таблице. на другой край стекла наносят водную суспензию полых полимерных микросфер (PS. а с противоположного . больных лейкозом. Подсушивают его на воздухе при комнатной температуре. Пример. Посередине стекла оставляют область. Германия). Готовят суспензию клеток крови путем нанесения ее на один край предметного стекла. Помещают препарат во влажную камеру и производят силовую микроскопию в области расположения полимерных микросфер. Производят выделение лимфоцитов крови путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин. . Лимфоциты суспендируют в физиологическом растворе. что позволяет экономить время исследования и увеличивает скорость манипулирования объектами за счет быстрой смены областей сканирования на одной подложке. передвигают препарат к одному из краев. дают ему немного остыть и подсохнуть на воздухе в течение 2-3 минут. Изменяют область сканирования. Рассчитывают упругость клеток с помощью программного обеспечения Nova. Помещают во влажную камеру.суспензию лимфоцитов больных острым лимфобластным лейкозом. осуществляя подвод tipless контилевера к отдельно лежащей полой микросфере. предметное стекло с исследуемым препаратом на одном его участке. Отбирают плазму и лимфоцитарное кольцо. где расположены микросферы. После приклеивания одной микросферы к tipless контилеверу (фиг. Способ определения упругости лимфоцитов крови больных лейкозом и здоровых доноров во влажной камере с помощью модифицированного АСМ-зонда.83% раствором хлорида аммония. Сначала проводят процедуру силовой микроскопии на участке предметного стекла. Параметры Лимфоциты здоровых доноров Ñòð.изготовление АСМ-зондов в процессе проведения силовой спектроскопии. . производитель Micropartieles GmbH. Готовят густой раствор желатина. в котором ополаскивают tipless контилевер CSG 11 /tipless. куда высаживают полимерные полые микросферы.: 6 Лимфоциты больных лейкозом . На стеклянную подложку с одного края наносят суспензию лимфоцитов здоровых доноров. где расположена суспензия клеток.1) меняют область сканирования. перемещаясь на противоположный край препарата. в котором ополаскивают tipless контилевер. Полученные силовые кривые обрабатывают с помощью программы Nova и рассчитывают упругость лимфоцитов. достаточного для сканирования образцов. а на противоположном участке нанесены полые полимерные микросферы. затем передвигают препарат на противоположный край стекла и осуществляют снятие силовых кривых 20 клеток в области расположения лимфоцитов. насыщенную парами воды. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. и осуществляют процедуру силовой микроскопии клетки.

P. . Бухараев А. Используемая литература 1.F. Наносклерометрия и наноидентирование // www. полые полимерные микросферы расположены на противоположном участке той же стеклянной подложки. Вып.С.V. Ñòð. Оценка упругих свойств трансформированных клеток позволит расширить арсенал средств диагностики лейкозов.8.E. .С. что tipless кантилевер изготавливают на основе полых полимерных микросфер. J. и сначала проводят силовую спектроскопию на участке стеклянной подложки. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации // Канцерогенез/ Под ред. Ровенский Ю. Лебедев Д. Предлагаемый способ определения упругости клеток крови во влажной камере с использованием модифицированного АСМ-зонда технически прост. M. которые прикрепляют в режиме силовой спектроскопии на tipless кантилевер.1564-1578. Способ может быть использован в общей и клинической физиологии для исследования упругости клеток крови. нарушении прикрепления клеток к подложке. насыщенную парами воды. . . Способ определения упругости клеток крови. 6. позволяет исключить повреждение клеток в процессе проведения силовой спектроскопии. диаметром 10 мкм. 4. µРа 3..376-414. что и суспензия с живыми клетками.2009.ru/page/nanoindent. расчет модуля Юнга. . отличающийся тем. . не отрываясь от образца.54-61. Heinz W.. Измерение модуля Юнга биологических объектов в жидкой среде с помощью специального зонда атомно-силового микроскопа // Письма в ЖТФ.Дружинина.Т.В.М..18±7. 2004. О. Gaub H. получение силовых кривых. . обеспечивает сохранение нативности и формы клеток крови.1204-1221. Вып. .D et al. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Как видно из представленных данных упругость лимфоцитов больных лимфобластным лейкозом снижена в два раза.С..А. а после прикрепления ее к tipless кантилеверу область сканирования переводят на суспензию клеток и.П. V. включающий изготовление tipless кантилевера.Заридзе.С.: 7 CL . осуществляя подвод tipless кантилевера на отдельно лежащую полую полимерную микросферу. обеспечивает получение наиболее достоверных результатов. Формула изобретения 1. .63.2002.1998. сканирование клеток ткани.А. 35.174-189. Measuring cell adhesion force with the atomic force microscope at the molecular level // Cell tissues organs. фокальными контактами и являются ключевыми в приобретении клетками способности к метастазированию [5.172.83±0. стеклянную подложку помещают в камеру.16±3. системой микротрубочек. где расположены полые полимерные микросферы.9.А.74 (3). проявляющимися в усилении распластывания и изменении локомоторного поведения неопластических клеток. 3. нм 345. 5. A-Hassan E.Г. При этом глубина погружения зонда возрастает на 67%.: Медицина.05 в сравнении с лимфоцитами здоровых доноров.Т. Эти процессы контролируются актиновым цитоскелетом. . . 2. Antonik M.45±0. Клеточные и молекулярные механизмы опухолевой инвазии // Биохимия.. не изменяет свойств поверхности исследуемых образцов. производят регистрацию силовых кривых.76 1035.P. Наблюдаемые различия в упругости поверхности связаны с морфологическими трансформациями цитоскелета в опухолевых клетках. Д. Васильев Ю. .RU 2 466 401 C1 Е. Ровенский Ю. Microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy // Biophys. Чукланов А..ntmdt.18 1..07* Погружение зонда.02* Примечание: * Статистически достоверные различия при р<0. модуль Юнга. 6].1998. Benoit M.

не доводя до гелеобразования.RU 2 466 401 C1 5 2. 3. Способ по п. отличающийся тем. отличающийся тем.1. что производят регистрацию силовых кривых не менее 20 клеток. что tipless кантилевер обрабатывают густым раствором желатина и дают ему остыть на воздухе в течение 2-3 мин.: 8 . 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ñòð. Способ по п.1.

: 9 DR .RU 2 466 401 C1 Ñòð.