4.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1 Характеристика хозяйства

Экспериментальная часть была проведена на территории Ульяновского производственного

управления, находящегося в городе Москва, непосредственно на культуре декоративных роз в
теплице, а также в лаборатории по выращиванию нематод. Experimental part was conducted on
territory of production department of Ulyanovsk located in Moscow directly on culture of decorative
roses in the greenhouse, also in laboratory of nematodes cultivation.

На территории управления расположены три участка с теплицами. Экспериментальная часть

выполнена на участке №3, площадь которого составляет 3 га.. Площадь одной теплицы с розами
занимает 3100 м².There are three parcels with greenhouses on the territory of the Department.
Experimental part was performed on the parcel number three, it's plottage is three hectares. The
plottage of one greenhouse with roses is tree thousand one hundred square meters.

Roses were planted on the soil(substrate) in greenhouses and presented by the following types :

В теплицах розы размещены на грунтах и представлены следующими видами:

Роза чайно-гибридная Шакира (Rose Shakira)- Стебель практически без шипов, весьма устойчивы к
болезням. Куст рослый, прямой, лист зеленый, крупный, блестящий.

Rose tea-hybrid Shakira – stem almost hasn't thorns,highly resistant to the pests and deseases. Bush is
tall, straight,leaves are green, big, glance.

Роза Грин Романтика (Green Romantica). Эта роза относится к чайно-гибридной группе. Куст
рослый, прямой, лист зеленый, крупный, блестящий. Средняя высота стебля розы Грин Романтика
– пятьдесят-семьдесят сантиметров.

Rose Green Romántica. This rose refers to the tea-hybrid group. The Bush is tall, straight, leaves are
green, big, glance. Middle high of stem of rose Green Romántica –from fifty to seventy centimeters.

Роза спрей Файер Кинг (Fire King) – яркие, огненно-красные цветки среднего размера 6 см,
собраны в соцветия в количестве от 6 до 15 штук. Куст густой, с темно-зеленой блестящей листвой,
до 85 см в высоту. Высокая устойчивость к заболеваниям.

Rose spray Fire King has bright, flame red flowers middle size six centimeters, collected in
inflorescencias in amount of fifteen. Bush is thick, leaves are green, glance, high is up to eighty-five
centimeters. High resistance to deseases.

Свит Сара (Sweet Sara) — спрэй. Цветки бокаловидной формы, диаметром до 5 см, густомахровые,
по 5—10 шт в соцветии. Цветет обильно.Высота 60-70 см.
Rose Sweet Sara spray. Flowers looks like a goblet, they can be up to five centimeters in diameter.
Flowers are lush and terry, from five to ten in inflorescencias.

4.2 Культивирование нематод

Cultivation of nematodes

Суть патогенности нематод вида родов Steinernema и Heterorhabditis напрямую связана с

симбиозом с двумя родами бактерий: Xenorhabdus и Protorhabdus.

The essence of pathogenicity of nematodes type sorts Steinernema and Heterorhabditis directly
connected to the symbiosis with two sorts of bacterias: Xenorhabdus and Protorhabdus

В условиях лаборатории проводится разведение энтомопатогенных нематод в составе препарата

Немабакт. Суть которого сводится к использованию личинок мучного хруща или гусениц вощиной
моли. Заражение часто проводят на фильтровальной бумаге.

In the laboratory conduct breeding of entomopathogenic nematodes in structure of product Nemabact.

The essence of it is using larvaes of flour crunch (latin. Tenebrio molitor) or caterpillars of wax
moth. (latin. Galleria mellonella L.) Infestation of larvaes often conduct on the filter paper.

Для этого на кружок фильтровальной бумаги выпускают пипеткой несколько сотен инвазионных
личинок энтомопатогенных нематод. Количество воды должно быть таким, чтобы вода полностью
пропитала всю бумагу, но не выступала бы в виде перетекающей влаги.

For doing this, on the round of filter paper they let out several hundred of invasive larvaes of
entomopathogenic nematodes with help of pipette. Amount of water have to be enough to completely
impregnate paper, but the water must not appears on the paper surface as flowing moisture.

Добавляют три-пять гусениц вощиной моли. Через два-три дня после заражения проверяют чашки
Петри и насекомых с явным признаком заражения переносят в новые чашки Петри ( лучше
небольшие диаметром 40-50мм) на сухую фильтровальную бумагу. Это делается для
предотвращения развития плесени.

After it they add three – five caterpillars of wax moth. Two or three days later infestation they check
Petri dishes. Insects, that have clear signs of infestation they transport to another Petri dishes with dry
filter paper. ( It's better to use not very big Petri dishes , fourty-fifty millimeters in diameter ) They do it
for preventing appearance of mold. Через 5-7 дней после заражения надо слегка увлажнить бумагу,
так чтобы была еле заметна влага. Иногда оказывается удобным поставить на дно от пластиковых
чашек Петри диаметром 40 мм со слегка увлажненной фильтровальной бумагой в закрывающиеся
контейнеры со слоем воды в 2-3 мм. В таком случае влажность будет достаточно высокой и
появляющиеся из трупа инвазионные личинки будут свободно мигрировать на дно большого
контейнера с водой.

Five-seven days later,, after infestation they have to wet the filter paper. A little amount of moisture
must appear on surface. Sometimes it is conveniently to put it on the bottom of the plastic Petri dishes
fourty millimeters in diameter with lightly moistened filter paper in lockable containers, two – three
centimeters in level of water. In that case the moisture will be enough high to help to invasion larvaes to
migrate from corpse to the bottom of big container with water freely.

Такой подход позволяет избегать неожиданного пересыхания чашек Петри с зараженными

насекомыми. Если личинки начинают мигрировать на сухую бумагу, то часто наступает их гибель
из-за сухости. При удачном заражении и качественных гусеницах оказывается возможным
получить до 100, а редко и до 350 тысяч инвазионных личинок из одной гусеницы вощиной моли
или личинки мучного хрущака. Суспензию инвазионных личинок со дна пробирки или контейнера
надо отфильтровать.

This approach helps to avoid unexpected drying out of Petri dishes with infestated insects. If larvaes
begin to migrate to dry paper, they can often die because of drying. If infestation is successful and they
use high quality larvaes, it is possible to get one hundred, or sometimes three hundred and fifty
invasion larvaes from one larvae of flour crunch or caterpillar of wax moth. They have to filter the
suspension of invasion larvaes from the bottom of container or test tube.

Промышленное разведение энтомопатогенных нематод (препарат Немабакт) основывается на

применении искусственных сред. Наибольшее распространение получили измельченные отходы
обработки мяса птиц.

Industrial breeding of entamopathogenic nematodes (Nemabact product) based on using artificial?

growth mediums. Crushed wastes of poultry meat processing are the most common components.

Вариант искусственной смеси используемой в лаборатории: используют обрезки мяса и кожи, а

головы, лапы и желчный пузырь выкидывают. Варят отходы до размягчения. Полученные
фрагменты автоклавируют при 121ºC в течение 20-25 минут, затем измельчают в гомогенизаторе.
Куриные кишки разрезают ножницами на фрагменты по 5-10 см. Гомогенат можно замораживать
или же сразу использовать для приготовления среды.

This is a variant of growth medium (substrate)that can be used in the laboratory :they use meat and skin
cuttings( They throw out other parts - heads, feet and gallbladder) Then, they cook cuttings until softing.
Pieces, that they get have to be autoclaved, temperature has to be one hundred twenty one degrees
Celsius during twenty – twenty five minutes, then they grind them in homogenizer.

При культивировании штейнернематид для это смешивают восемь частей гомогената и две части
воды и одну часть коровьего жира. Полученную среду выливают тонким слоем в контейнеры и
автоклавируют. После охлаждения инокулируют взвесь клеток первой фазы симбиотических
бактерий. Через 1-2 дня инкубации при 25-28 ºC вносят трупы зараженных гусениц с
инвазионными личинками нематод внутри (от нескольких сотен до нескольких тысяч).When they
cultivate steinernematids, they mix eight parts of the homogenate, two parts of water and one part of
cow fat. Received growth medium they pour thin layer to containers and autoclave it. After cooling they
inoculate suspension of cells of the first phase of symbiotic bacterias. One – two days later after
incubation (The temperature have to be twenty five – twenty eight degrees Celsius) they put there
corpses of infestated caterpillars with invasive larvaes of nematodes inside. (from several hundreds to
several thousands)

При внесении инвазионных личинок в жидкую питательную среду лишь незначительная их часть
продолжает дальнейшее развитие и выходит из состояния физиологического покоя. На развитие
нематод воздействует какой-то сигнал, возникающий в теле насекомого жертвы. Не похоже,
чтобы сигнал был связан с бактериями, поскольку отмечены случаи выхода личинок нематод из
инвазионной стадии даже в аксенных гусеницах.

Only minor part of invasive larvaes can continue further growth and can passed from a state of
physiological rest, after introducing them into a liquid growth medium. Some signal, arising in
the body of Insect- victim provokes the growth of nematodes. The signal can't be connected
with bacterias activity,because there have been cases of the release of nematode larvaes from
the invasive stage, even in axenic (sterile) caterpillars.

4.3 Эксперимент подбора температурного режима для поддержания активности нематоды

The experiment for selection of temperature conditions, that will be suitable for maintenance of
nematodes activity
В условиях лаборатории был проведен эксперимент по выживаемости энтомопатогенных нематод
в субстрате питательной среды.

The experiment, researching survival of entomopathogenic nematodes in substrate of growth media

was conducted in laboratory.

Методика проведения эксперимента: были отобраны 4 пробы субстрата с нематодами и

помещены в условия разных температур. The method of the experiment: four samples of substrate
with nematodes were taken and placed in conditions of different temperatures.

Проба №1 хранилась при отрицательной температуре (от -2 до-5ºC).

Sample № 1 was stored at negative temperature (from minus two to minus five degrees of Celsius ).

Проба №2 хранилась при температуре 4-5 ºC. Sample n2 was stored at temperature from four to five
degrees Celsius.

Проба №3 хранилась при температуре 15 ºC.

Sample n 3 was stored at temperature fifty degrees Celsius.

Проба №4 хранилась в условиях свободного колебания температуры открытого пространства ( от

10 до 35 ºC).

Sample n 4 was stored under condition of free temperature variations of open space (from ten to thirty
five)

Каждая из проб и наблюдались в течении месяца на наличие живых особей в субстрате при
помощи бинокулярного микроскопа МБС-10 при увеличении 2 ͯ. Every sample was observed during
the month for the presence of living individuals in the substrate using a binocular microscope MBS-10
with increasing

Таблица №5. Результаты обработки испытаний:

Проба Количество дней Активность нематоды(%)

Проба №1 (от -2 до -5 ºC) 1 50

Проба №2 (4-5 ºC) 1 100

Проба №3 (15 ºC) 1 100

Проба №4 ( от 10 до 27 ºC).

1 99
2

Таблица №6. Результаты обработки испытаний:

Проба Количество дней Активность нематоды (%)

Проба №1 (от -2 до -5 ºC) 3 50

Проба №2 (4-5 ºC) 3 90

Проба №3 (15 ºC) 3 65

Проба №4 ( от 10 до 27 ºC).

3 50
4

Таблица №7 Результаты обработки испытаний:

Проба Количество дней Активность нематоды

Проба №1 (от -2 до -5 ºC) 7 50

Проба №2 (4-5 ºC) 7 90

Проба №3 (15 ºC) 7 60

Проба №4 ( от 10 до 27 ºC).

7 10
Таблица №8. Результаты обработки испытаний:

Проба Количество дней Активность нематоды

Проба №1 (от -2 до -5 ºC) 15 50

Проба №2 (4-5 ºC) 15 70

Проба №3 (15 ºC) 15 40

Проба №4 ( от 10 до 27 ºC).

15 5

Таблица №9. Результаты обработки испытаний

Проба Количество дней Активность нематоды

Проба №1 (от -2 до -5 ºC) 30 50

Проба №2 (4-5 ºC) 30 50

Проба №3 (15 ºC) 30 20

Проба №4 ( от 10 до 27 ºC).

30 0
Выводы:

1. Нематода погибает в условиях повышенных температур, предположительно из-за

жизнедеятельности бактерий питательной среды, что приводит к подавлению
жизнедеятельности нематоды.

2. При повышении температурного режима увеличивается активность жизнедеятельности

бактерий питательной среды.

3. Недостаток кислорода питательной среды также приводит к ускоренной гибели нематод в

составе питательной среды.

4. Температурный режим хранения оптимальный для сохранности жизнедеятельности

нематод в течении длительного времени равен 4-10ºC.

5. Максимально допустимая температура хранения 27 ºC, при большей температуре

хранения наступает мгновенная гибель нематод.

6. Оптимальным сроком хранения нематоды при температуре 4-10ºC является отрезок до

15 дней.

7. Оптимальным сроком хранения нематод может выступать отрезок времени более 15

дней, при условии подачи кислорода в питательную среду, а также отчищенная
питательная среда.

4.4 Испытание активности препарата на основе нематод в производственных теплицах

4.5

Также были проведены исследования использования готового препарата на розах в теплице.

Обработки производились из расчета 1 литр препарата на тонну воды. Производились замеры
температуры почвы и анализ выживаемости и адаптации нематод в грунте.

Методика проведения испытаний: Энтомопатогенная нематода из образцов почвы была

извлечена методом смыва водой. Анализ суспензии и наличие в ней нематоды проводился с
помощью бинокулярного микроскопа МБС-10 при увеличении 2 .ͯ Активность нематоды
проверялась с помощью тест –насекомых – личинок Galleria mellonella.
Таблица № 10 Результаты обработки испытаний:

Место применения препарата Температурный режим, ºC Наличие нематоды

активность

Теплица №1 Розы кустовые T воздуха – 25

Т почвы – 15 -

Теплица №2 Розы чайно-гибридные T воздуха -27

Т почвы -15,5 -

Теплица №3 розы чайно-гибридные T воздуха – 22

Т почвы – 10,5 + +

Теплица №4

Гидропоника Розы чайно-гибридные T воздуха – 15 (Min)

Теплица №5 Розы кустовые T воздуха - 15-17

Т почвы – 10-11 + +
Выводы:

1. В теплице № 1 и 2 энтомопатогенные нематоды препарата не обнаружены. Вероятная

причина – пониженная влажность почвы.

2. В образцах, взятых в телице № 3 нематода найдена в очень небольшом количестве.

Вероятная причина – пониженная влажность почвы из-за высоких температур воздуха, в
том числе и кратковременная

3. В других образцах почвы нематода обнаружена, условия для ее выживания соблюдены.

4. В теплице №4 обнаружена наибольшая концентрация нематоды. Вероятная причина

более высокая температура субстрата.

5. Температура почвы, равная 10-11 ºC, позволяет нематоде сохранять жизнедеятельность и

активность, однако оптимальная температура почвы для поражения вредителей
нематодой – 20-25 ºC.

Заключение

Практическое использование биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод

(ЭПН) как и других средств защиты растений от вредных организмов во многом определяется
возможностями массовой наработки в объемах, удовлетворяющих спрос на потребительском
рынке.

В настоящее время в мировой практике получили развитие три направления в разработке

технологий массового производства ЭПН: на насекомых, жидкофазное – в ферментах,
твердофазное – с использованием инертных носителей. Большинство доступных методов
хранения нематоды связаны и ориентированы в основном на условия научно-исследовательских
учреждений , когда требуются небольшие объемы нематодных культур для лабораторных и
полевых испытаний.
С учетом актуальности проблемы разработки промышленных технологий а также факт
затруднения хранения использования нематоды в крупных масштабах, были проведены ряды
экспериментов по хранению ЭПН в питательной среде с целью отработки отдельных элементов
технологии производства нематод на ПС растительного и животного происхождения с адаптацией
и совершенствованием методов.

Биологическую основу получения массовой культуры нематоды на питательной среде составляют

чистые маточные культуры симбиотических бактерий и моноксенные культуры инвазийных
личинок нематод. В опытах использованы нематоды вида Steinernema carpocapsae , выделенные
из личинок жуков-щелкунов. На основе нематод S. Carpocapsae в Российской Федерации создан и
зарегистрирован биологический препарат «Немабакт».

В результате произведенных экспериментов и исследовании выживаемости нематоды в

препарате питательной среды, а также непосредственно в почве на теплице можно сделать
выводы об эффективности нематоды как одного из биологических средств защиты растений.

Данные показали, что выживаемость нематод значительно варьируется от температуры хранения

в питательной среде, было замечено существенное угнетение жизнедеятельности и повышение
смертности нематод в питательной среде при температуре свыше 15ºC.

Допускается возможность хранения нематоды в пительной среде до нескольких лет, однако

обязательным условием при этом должно выступать обеспечение подачи кислорода воздуха и
температуры хранения 4-10 ºC.

Суспензия хранения нематоды должна быть достаточно чистой и не слишком густой – без
формалина.

При соблюдении данных условий возможна транспортировка нематоды на расстояния и

длительное хранение ЭПН в составе уже готового к применению средства защиты растений.