Вы находитесь на странице: 1из 8

БИОЛОГИЯ

НЕРАДИОАКТИВНО МЕЧЕНЫЕ
ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫЕ ЗОНДЫ – ИНСТРУМЕНТ
ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА И ДИАГНОСТИКИ

Г. М. ДЫМШИЦ
Новосибирский государственный университет

ВВЕДЕНИЕ
NON-RADIOACTIVELY LABELED В начале третьего тысячелетия в результате реализации
OLIGO- AND POLYNUCLEOTIDE PROBES: международной программы “Геном человека”, старто-
TOOL FOR STUDYING GENOME вавшей в 1988 году и рассчитанной на 15 лет, заверша-
ется расшифровка нуклеотидных последовательностей
STRUCTURE AND DIAGNOSTICS всех молекул ДНК, содержащихся в ядре одной клетки
G. M. DYMSHITS человека, – его геном. Определение первичной структу-
ры (секвенирование) генома человека, то есть выяснение
последовательности расположения всех нуклеотидов в
The use of non-radioactively labeled probes for молекулах, являющихся основой его наследственности,
the genome structure analysis, and for the вскрывает новый пласт информации, необходимой для
diagnostics of contagious and inherited dis- познания молекулярных механизмов жизнедеятельно-
eases, is described. Various kinds of molecular сти высших эукариот. Объем этой информации огро-
мен. Если напечатать все нуклеотидные последова-
hybridization of nucleic acids and the means to
тельности одной половой клетки человека, обозначая
introduce reporter (signal) compounds to каждый нуклеотид буквой (А, Г, Т или Ц), на страни-
oligo- and polynucleotide probes are discussed. цах, вмещающих по 2500 печатных знаков, они займут
The advantages of fluorescent and colorimetric 1200 томов по 1000 страниц каждый. (Для сравнения:
detection of probe-target interaction are геном бактерии E. coli может быть записан всего в двух
подобных томах.)
described.
Для того чтобы нуклеотидные последовательности,
записанные мертвыми символами, «ожили и заговори-
В статье описано применение нерадиоак-
ли», нужно раскрыть их функции. Структурно-функ-
тивно меченых зондов для анализа струк- циональный анализ генома позволяет установить, в ка-
туры генома и диагностики наследствен- ком именно месте и в какой хромосоме находится
ных и инфекционных заболеваний. Рассмот- конкретный ген, какое влияние на экспрессию этого
рены разные виды молекулярной гибридиза- гена оказывают другие гены, расположенные как в той
же хромосоме, так и в негомологичных хромосомах;
ции нуклеиновых кислот и способы введе- какое значение имеют последовательности, не кодиру-
ния в олиго- и полинуклеотидные зонды ре- ющие белки (на их долю в некоторых районах хромо-
портерных (сигнальных) соединений. Изло- сом приходится до 90–95% нуклеотидного материала);
© Дымшиц Г.М., 2001

жены достоинства флуоресцентной и ко- какие изменения в гене сказываются на фенотипе са-
мого носителя мутации, а какие могут проявляться
лориметрической детекции результатов
лишь у его потомков.
взаимодействия зонд-мишень.
Одним из основных экспериментальных подходов
www.issep.rssi.ru при изучении структурно-функциональной организа-
ции генома и механизмов генной экспрессии является

30 С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1
БИОЛОГИЯ
метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кис- Несмотря на непревзойденную чувствительность
лот. Он основан на возможности образования двуцепо- (10−19 М), использование радиоактивно меченых зон-
чечных гибридов между искусственно создаваемыми дов ограничено, в первую очередь в прикладных облас-
на основе одноцепочечных последовательностей (ри- тях для диагностических целей. Это связано с возмож-
бо- или дезоксирибо-, олиго- или полинуклеотидных) ностью радиолиза как самого зонда, так и мишени,
мечеными зондами и комплементарными им последо- коротким (8–14 дней) временем полураспада боль-
шинства радионуклидов, а также связанной с ними
вательностями в мишенях – анализируемых молекулах
опасностью для здоровья персонала. Кроме того, нель-
ДНК или РНК (рис. 1). Зонд метится какой-либо репор-
зя не учитывать психологические и экологические про-
терной группой: радиоактивным изотопом, флуорохро-
блемы, возникающие при работе с радионуклидами и
мом, ферментом, дающим окрашенный или люминес- при утилизации отходов. В связи с этим в последние
цирующий продукт, гаптеном, с которым связывается 20 лет во всем мире уделяется большое внимание раз-
меченое антитело, и т.д. Выявляя гибрид благодаря на- работке различных методов введения в олиго- и поли-
личию в зонде репортерной группы, исследователь мо- нуклеотидные зонды нерадиоактивных репортерных
жет оценить число генов, кодирующих определенный групп и их выявления [1].
вид РНК, определить долю нетранскрибируемой ДНК
в геноме, установить сцепление определенных генов ВИДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
друг с другом и их точное расположение на хромосо-
Метод молекулярной гибридизации включает следую-
мах. Высокая чувствительность, то есть возможность
щие этапы: подготовку анализируемого образца, полу-
выявить очень малое количество (10−15–10−19 М) мече- чение меченого зонда, саму процедуру гибридизации,
ного зонда и соответственно комплементарной ему по- выявление и анализ ее результатов.
следовательности в мишени, а также быстрота анализа
Способы выделения и подготовки анализируемого
(от нескольких часов до трех дней) позволяют исполь- образца нуклеиновых кислот к гибридизации многооб-
зовать метод молекулярной гибридизации не только в разны и определяются помимо цели и конкретной за-
исследовательской деятельности, но и для диагностики дачи исследователя спецификой изучаемого объекта.
наследственных и инфекционных заболеваний в меди-
При картировании хромосом проводят гибридиза-
цине, ветеринарии и растениеводстве. цию in situ (на месте). Метафазные хромосомы фикси-
руют на стекле, входящие в их состав молекулы ДНК
денатурируют и добавляют меченый зонд. Если меткой
является радиоактивный изотоп, то результат гибриди-
зации выявляют авторадиографией под световым мик-
роскопом после проявления прозрачной фотоэмуль-
сии. В случае использования флуоресцентно меченых
зондов смотрят свечение хромосом под люминесцент-
ным микроскопом. Существуют две модификации
флуоресцентной гибридизации in situ: прямая флуорес-
центная in situ гибридизация (direct fluorescence in situ hy-
bridization или DFISH ) и непрямая – FISH. В последнем
варианте флуорохромы несет не сам зонд, а белок, име-
ющий высокое сродство к репортерной группе зонда.
Гибридизация in situ позволяет устанавливать локали-
зацию в определенном районе хромосомы того или
иного маркера. В качестве последнего могут выступать
отдельный ген или его часть, не кодирующая белок
нуклеотидная последовательность, нетранскрибируе-
мые повторяющиеся последовательности различной
длины, мобильные генетические элементы и т.д.
Рис. 1. Олигонуклеотидный зонд ТЦАГТЦЦЦТАГЦТАГ При диагностике инфекционных заболеваний час-
за счет присоединенной к нему испускающей сигнал то используют метод дот-гибридизации (от англ. dot –
репортерной группы позволяет выявить единствен- точка). Этот метод применяется, когда необходимо ус-
ную комплементарную ему последовательность сре-
ди более чем 3 ⋅ 109 букв (нуклеотидов), составляю- тановить факт наличия определенной нуклеотидной
щих текст генома человека последовательности в исследуемых образцах и оценить

Д Ы М Ш И Ц Г . М . Н Е РА Д И О А К Т И В Н О М Е Ч Е Н Ы Е О Л И ГО - И П О Л И Н У К Л Е О Т И Д Н Ы Е З О Н Д Ы 31
БИОЛОГИЯ
ее количество. Из подходящей ткани исследуемого ор- Высокополимерная ДНК
ганизма (крови, амниотической жидкости, плаценты,
удаленной опухоли или спермы человека; печени или
хвоста мыши; листьев растения и т.д.) выделяют суммар-
ную ДНК. Образцы ДНК наносят на микропористый Рестриктаза 1 Рестриктаза 2

(нитроцеллюлозный или капроновый) фильтр, денату-


рируют и иммобилизуют облучением ультрафиолетом,
после чего инкубируют фильтр с меченым зондом. При
этом на один фильтр могут быть нанесены десятки об-
разцов нуклеиновых кислот, выделенных из биологи-
ческих жидкостей разных пациентов. Меченые зонды,
используемые в диагностике, комплементарны какой-
либо последовательности ДНК или РНК (в случае за-
ражения РНК-содержащими вирусами), специфичной
для возбудителя заболевания. За несколько часов мож-
но получить ответ, инфицирован ли пациент опреде-
ленным вирусом или микроорганизмом и как много
чужеродной нуклеиновой кислоты присутствует в об- Электрофорез Перенос, денатурация Гибридизация
в геле и иммобилизация с меченым
разце. От результатов такого анализа зависит тактика на фильтре зондом и детекция
лечения больного.
В некоторых случаях, когда требуется более деталь- Рис. 2. Схема блот-гибридизации
ная информация о расположении выявляемой после-
довательности в геноме, применяется другая модифи-
случаях перед нанесением образца на фильтр прибега-
кация метода молекулярной гибридизации – блот-
ют к процедуре амплификации (умножения) нуклеотид-
гибридизация (от англ. to blot – промакать фильтроваль-
ного материала с помощью полимеразной цепной ре-
ной бумагой). В этом случае расщепляют образец ДНК
акции (ПЦР ) [2]. Последняя возможна, если известна
на фрагменты подходящими рестриктазами, разделяют
первичная структура хотя бы небольшого участка (по-
фрагменты с помощью электрофореза в геле, переносят
рядка сотни нуклеотидов) анализируемой ДНК-мише-
разделенные фрагменты на микропористый фильтр,
ни. На автоматическом синтезаторе получают олиго-
наложенный на гель, иммобилизуют перенесенные и
нуклеотиды из 15–25 звеньев, комплементарные краям
денатурированные фрагменты облучением ультрафио-
известной последовательности, гибридизуют их с де-
летом и инкубируют с меченым зондом (рис. 2). После
натурированной ДНК из анализируемого образца и с
отмывания фильтра от несвязавшегося зонда выявляют
помощью термостабильного фермента – Taq-полиме-
результат гибридизации. Способ выявления определя-
разы, – выделенного из термофильной бактерии Termus
ется тем, какую именно репортерную группу несет зонд.
aquaticus, проводят многократное удвоение синтезиру-
Если в зонде содержится радиоактивная метка, фильтр
емых цепей ДНК, до нескольких десятков циклов
в темноте накрывают рентгеновской пленкой, а по про-
(принципиальная схема полимеразной цепной реак-
шествии определенного времени (от нескольких часов
ции будет рассмотрена ниже). За 2–3 ч работы на ком-
до нескольких суток) ее проявляют и по засвеченным
мерческих амплификаторах можно достичь увеличе-
полосам определяют, в фрагментах какой длины нахо-
ния количества интересующей последовательности в
дится комплементарная зонду нуклеотидная последо-
десятки миллионов раз. Ее содержание при этом растет
вательность. Если зонд несет флуоресцентную метку,
в геометрической прогрессии, в то время как содержа-
фильтр фотографируют в ультрафиолетовом свете.
ние последовательностей, прилегающих к ней, – лишь
В некоторых случаях искомая нуклеотидная по- в арифметической (рис. 3, а).
следовательность присутствует в недостаточном для
обнаружения количестве. Содержание отдельных уни- Амплификация ничтожных количеств исходного
кальных последовательностей в геноме может быть не- биологического материала в сочетании с молекуляр-
достаточным для выявления гибридизацией in situ. ной гибридизацией позволяет обнаружить одну клетку,
Иные последовательности нуклеотидов могут присутст- инфицированную ВИЧ, среди 105 неинфицированных
вовать лишь в небольшой доле клеток пациента (напри- клеток носителя СПИДа. Применение ПЦР делает
мер, ДНК и РНК вируса иммунодефицита человека – возможным однозначное установление личности пре-
ВИЧ). Недостаточным может быть само количество ступника по одному волосу, засохшей капле спермы,
ткани, доступной для проведения анализа. Во всех этих слюны или крови с использованием метода “геномной

32 С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1
БИОЛОГИЯ
а б
3' 5' 3' 5'

5' 3' 5' 3'


Денатурация ДНК
и гибридизация с затравками Денатурация ДНК
3' 5' 3' 5'
5' 3' 3' 5'
5' 3' 5' 3'
Гибридизация
Taq-полимераза + 4 дНТФ с олигонуклеотидной
затравкой
3' 5' 3' 5'

5' 3' 5' 3'


3' 5' ДНК-полимераза
+ 4 дНТФ
5' 3' 3' 5'
Денатурация ДНК
и гибридизация с затравками 5' 3'

3' 5' в
5' 3' 3' 5'
3' 5'
5' 3'
5' 3'
3' 5' Обработка ДНКазой

3' 5' 3' 5'

5' 3' 5' 3'


ДНК-полимераза
Taq-полимераза + 4 дНТФ + 4 дНТФ

3' 5' 3' 5'

5' 3' 5' 3'


3' 5'
5' 3'

3' 5'
5' 3'
Денатурация ДНК
3' 5' и гибридизация
5' 3' с затравками

3' 5'
5' 3'
Taq-полимераза + 4 дНТФ
3' 5'
5' 3'

3' 5'
5' 3'
3' 5'
5' 3'

Рис. 3. Включение метки в полинуклеотидные зонды различными способами: а – полиме-


разной цепной реакцией; б – удлинением затравки; в – ник-трансляцией. Меченые нуклео-
тиды обозначены кружками

Д Ы М Ш И Ц Г . М . Н Е РА Д И О А К Т И В Н О М Е Ч Е Н Ы Е О Л И ГО - И П О Л И Н У К Л Е О Т И Д Н Ы Е З О Н Д Ы 33
БИОЛОГИЯ
дактилоскопии”, также основанного на принципах мо- путем обработки ферментом ДНКазой. Образующиеся
лекулярной гибридизации [2]. в местах разрезов свободные 3'-ОН концы используют-
С помощью ПЦР можно не только нарабатывать ся ДНК-полимеразой для их наращивания. Фермент
ДНК-мишень в количестве, достаточном для анализа с при этом расчищает себе дорогу, удаляя дНМФ с 5'-
использованием меченых олигонуклеотидных зондов, конца стоящего рядом фрагмента ДНК. При этом он
но и получать значительные количества полинуклео- включает в растущую цепочку меченые нуклеотиды,
тидных зондов, несущих радиоактивную или нерадио- идентичные только что отщепленным немеченым. В
активную метку. результате получают меченые полинуклеотиды, кото-
рые могут служить зондами для выявления ДНК, пер-
ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СПОСОБЫ вичная структура которой неизвестна.
ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕНЫХ В том случае, когда нужно получить большое коли-
ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫХ ЗОНДОВ чество нерадиоактивно меченого зонда, например, для
проведения массовой диагностики, прибегают к хими-
Среди методов нерадиоактивного мечения полинуклео-
ческим, а не ферментативным способам включения
тидных зондов наибольшее распространение получили
метки. В ДНК- или РНК-полинуклеотиды вводят ре-
хорошо отработанные ранее для радиоактивного мече-
акционноспособные группы, к которым присоединя-
ния процедуры удлинения затравки (рис. 3, б ), ник-
ют тот или иной репортер. Химический способ более
трансляции (рис. 3, в) или полимеразной цепной реак-
воспроизводим, так как не зависит от удельной актив-
ции (см. рис. 3, а). Все эти способы основаны на спо-
ности лабильных ферментов; он не требует также син-
собности ДНК-полимераз синтезировать полинуклео-
теза дорогостоящих нуклеозидтрифосфатов, несущих
тидную цепочку, комплементарную одноцепочечной
сигнальное соединение.
матрице, используя 3'-гидроксильный конец спарен-
ного фрагмента ДНК в качестве затравки [3].
НЕРАДИОАКТИВНЫЕ МЕТКИ
Удлинение затравки. Химическим путем синтезиру-
И ИХ ВЫЯВЛЕНИЕ
ют олигонуклеотид (менее 20 звеньев), комплементар-
ный какому-либо известному участку анализируемой Биотин. Наиболее распространенной нерадиоак-
ДНК, гибридизуют его с денатурированной ДНК, по тивной репортерной группой, включаемой в состав
матрице которой синтезируется зонд, после чего в олиго- и полинуклеотидных зондов, является витамин
реакционную смесь добавляют ДНК-полимеразу и на- биотин (природный кофактор группы ферментов –
бор всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов карбоксилаз). Биотинилированное производное дУТФ
(дНТФ), один из которых несет метку. Используя оли- (био-УТФ) включается в образуемые ДНК-полимера-
гонуклеотид в качестве затравки, полимераза удлиняет зами цепи вместо тимина и способно к комплементар-
его, встраивая в растущую цепь меченый нуклеотид. В ным взаимодействиям с аденином. Биотин обладает
результате образуется полинуклеотидный меченый зонд чрезвычайно высоким сродством к содержащемуся в
(см. рис. 3, б ). курином яйце белку авидину, а также к его бактериаль-
Полимеразная цепная реакция. ПЦР предусматри- ному аналогу – стрептавидину (константа диссоциации
вает наличие двух олигонуклеотидных затравок, ком- комплекса биотин–авидин 10−15 М). Эти белки кова-
плементарных участкам, фланкирующим выбранный лентно сшивают (конъюгируют) либо с флуорохромами,
район ДНК. После денатурации двуцепочечной матри- либо с ферментами, катализирующими образование ок-
цы и гибридизации олигонукдеотидов с каждой из двух рашенных продуктов. Как флуорохромы, так и фермен-
однонитевых цепей проводится полимеразная реак- ты можно сшивать и с антителами к (стрепт)авидину
ция, результатом которой является удвоенное количе- (рис. 4, а). Такие конъюгаты, прочно связываясь с био-
ство последовательностей ДНК, заключенных между тином, введенным в олиго- или полинуклеотидный
затравками (см. рис. 3, а). При повторении процедуры зонд, позволяют выявлять до 0,1 пг (1 пикограмм =
денатурации, гибридизации и полимеризации получа- = 10−12 г) ДНК-мишени. Наличие в биотине карбок-
ют четыре копии, а за 30 циклов можно получить не- сильной группы, не участвующей во взаимодействии
сколько миллионов меченых полинуклеотидов, ис- со (стрепт)авидином, позволяет легко присоединять его
пользуемых в качестве зондов. ковалентно к различным молекулам, в том числе к мо-
Ник-трансляция. Если последовательность нуклео- нонуклеотидам и синтетическим олигонуклеотидам [4].
тидов в анализируемой ДНК неизвестна, то меченый Помимо использования ДНК-полимеразы есть и
зонд получают процедурой, называемой ник-трансля- другие способы введения биотина в зонд. Это может
цией (от англ. nick – разрез) (см. рис. 3, в). В ДНК вно- быть осуществлено при помощи терминальной дезок-
сят некоторое количество одноцепочечных разрывов синуклеотидилтрансферазы. Этот фермент, подобно

34 С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1
БИОЛОГИЯ
Субстрат ультрафиолетом с длиной волны 485 нм имеет макси-
а
Ф мум испускания в видимой области – 515 нм и светится
Продукт
зеленым. Тот факт, что одна молекула флуоресцентного
hν1 hν2 красителя способна многократно претерпевать цикл
АТ Субстрат
“возбуждение–излучение”, обеспечивает высокую чув-
Фл Ф ствительность зондов, меченных флуорохромами.
Продукт
Использование нескольких зондов, несущих флуо-
Б (С)А Б (С)А Б (С)А рохромы с отличающимися спектрами испускания,
позволяет одновременно локализовать в хромосомах
разные нуклеотидные последовательности гибридиза-
цией in situ. Это невозможно проделать с радиоактивно
б hν1 hν2 мечеными зондами, выявляемыми авторадиографией.
Субстрат
В качестве аналогии сравните цветную и черно-белую
Ф Фл
фотографии радуги.
Продукт
При кариологическом анализе пациентов с хромо-
АТ АТ сомной патологией метод FISH позволяет надежно
идентифицировать метафазные хромосомы и наличие
ДГ ДГ
в них перестроек (рис. 5, а), выяснять происхождение
лишнего хромосомного материала (рис. 5, б ).
В том случае, если необходимо избавиться от фо-
Рис. 4. Различные способы выявления зондов, не- новой флуоресценции подложки, на которую нанесен
сущих биотин (а) и дигоксигенин (б ). Б – биотин;
(С)А – (стрепт)авидин; ДГ – дигоксигенин; АТ – анти- анализируемый образец, используют разрешенную во
тело; Ф – фермент, катализирующий образование времени флуориметрию. Она основана на том, что хелаты
окрашенного продукта; Фл – флуорохром, излучаю- некоторых редкоземельных металлов характеризуются
щий свет определенной длины волны относительно долгим периодом затухания флуоресцен-
ции. Так, ионы европия сохраняют возбужденное состо-
ДНК-полимеразе, удлиняет олигонуклеотид, однако яние на несколько порядков дольше, чем большинство
осуществляет это при отсутствии матрицы. Кроме того, органических флуорофоров. Поэтому если возбуждать
разработаны способы химического введения биотина в анализируемый образец короткими (наносекундными)
полинуклеотиды, содержащие модифицированные ге- лазерными импульсами, а регистрацию излучения на-
тероциклические основания. Его присоединяют по та- чинать с задержкой в 100 нс, то будет регистрироваться
ким положениям оснований, которые не принимают лишь излучение возбужденных ионов Eu3+.
непосредственного участия в образовании водородных В олигонуклеотидные зонды флуорохромы вво-
связей с комплементарными нуклеотидами [5]. дятся различными химическими способами [4], а в по-
Дигоксигенин. Подобно биотину, нерадиоактивной линуклеотидные – либо химическим путем после мо-
репортерной группой может служить дигоксигенин – дификации гетероциклических оснований [5], либо
стероид из растения наперстянки (Digitalis purpurea). ферментативным в полимеразных реакциях, аналогич-
Основной способ введения в зонд дигоксигенина такой ных описанным выше, с использованием флуорохро-
же, как для биотина, – включение дНТФ, несущего это мированных аналогов НТФ или дНТФ.
соединение, в полинуклеотид в ходе полимеразной ре- Ферменты, используемые в качестве репортерных
акции. И дигоксигенин и биотин являются гаптенами, групп. В качестве репортерной группы используют так-
то есть антигенными детерминантами, с которыми же некоторые ферменты, способные катализировать
специфично и прочно связываются соответствующие образование большого числа молекул окрашенного
антитела, конъюгированные с ферментом, образую- продукта. Широко применяют, например, пероксидазу
щим окрашенный продукт, или с каким-либо флуоро- и щелочную фосфатазу. Первый фермент в присутствии
хромом (рис. 4, б ). перекиси водорода окисляет некоторые ароматические
Флуорохромы. В отличие от биотина и дигоксиге- соединения до нерастворимых в воде темноокрашен-
нина флуорохромы сами по себе являются сигнальными ных продуктов. Второй способен дефосфорилировать
соединениями. Они способны излучать свет опреде- органические соединения, которые при этом превра-
ленной длины волны при возбуждении их более корот- щаются в окисленные кислородом сильноокрашенные
коволновым светом. Так, флуоресцеин, один из наибо- продукты. Если эти ферменты конъюгированы с син-
лее распространенных красителей, при возбуждении тетическими олигонуклеотидами, то они выступают

Д Ы М Ш И Ц Г . М . Н Е РА Д И О А К Т И В Н О М Е Ч Е Н Ы Е О Л И ГО - И П О Л И Н У К Л Е О Т И Д Н Ы Е З О Н Д Ы 35
БИОЛОГИЯ
а непосредственно как нерадиоактивные метки [4]. Од-
нако их чаще используют для непрямого выявления
зондов, меченных биотином или дигоксигенином (см.
5
der(5)t(5; 20) рис. 4). При дот-гибридизации темноокрашенные про-
дукты видны невооруженным глазом, при гибридиза-
ции in situ – в световом микроскопе. Если нужна коли-
чественная оценка образовавшегося продукта, то
der(20)t(5; 20) проводят колориметрическую детекцию на фотоколо-
риметре или денситометре.
20
Наибольшая чувствительность (до 10−19 М) дости-
гается с нерадиоактивными зондами, выявляемыми с
помощью щелочной фосфатазы, в варианте хемилюми-
б
несценции. Субстрат щелочной фосфатазы адамантил-
1,2-диокситанфосфат после дефосфорилирования рас-
падается с испусканием света при длине волны 470 нм.
Детекция осуществляется предельно просто – экспо-
зицией фотопленки от нескольких минут до несколь-
ких часов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нерадиоактивно меченые зонды для молекулярной


гибридизации нуклеиновых кислот являются важным
инструментом изучения структурно-функциональной
организации генома, позволяя выявлять нуклеотидные
последовательности с большей точностью, скоростью
и надежностью, чем их радиоактивно меченые аналоги.
При картировании хромосом, когда детальное прост-
Рис. 5. Флуоресцентная гибридизация in situ: а –
анализ сбалансированной транслокации хромосом ранственное разрешение является необходимым тре-
5 и 20 человека. Зонды к хромосоме 5 мечены биоти- бованием, зонды, несущие биотин, дигоксигенин или
ном и выявлялись конъюгатом авидин-флуоресцеин флуорохромы, в гибридизации in situ не могут быть за-
(зеленое свечение); зонды к хромосоме 20 мечены менены на меченные радиоактивными изотопами. Мас-
дигоксигенином и выявлялись конъюгатом антите- совая диагностика инфекционных заболеваний чело-
ло-цианиновый флуорохром (красное свечение). века, животных и растений сегодня не обходится без
Стрелки указывают на нормальные хромосомы 5 и
нерадиоактивных тест-систем, включающих ДНК- или
20, а также на хромосомы, являющиеся результатом
транслокации. Хромосома der (20) t (5; 20) содержит РНК-зонды. Описание диагностики некоторых наслед-
короткое плечо и небольшой прицентромерный ственных патологий, выявляемых с помощью метода
район длинного плеча хромосомы 20, а также часть молекулярной гибридизации еще до рождения ребенка
длинного плеча хромосомы 5. Хромосома der (5) t на основе анализа генома в клетках амниотической
(5; 20) содержит материал хромосомы 5, за исклю- жидкости, может составить материал отдельной статьи.
чением части длинного плеча, а также часть длинно-
го плеча хромосомы 20. Автор благодарен студенту НГУ М.К. Иванову за
Выявленная хромосомная аномалия у здорового творческий подход к подготовке иллюстративного ма-
мужчины указывает на необходимость дородовой териала.
диагностики его будущего ребенка.
Любезно предоставлено Н.Б. Рубцовым (Институт
цитологии и генетики, Новосибирск); б – анализ ЛИТЕРАТУРА
происхождения малой сверхчисленной хромосомы
1. Кнорре Д.Г. ДНК- и РНК-зонды как альтернатива и допол-
(МСХ) у человека. ДНК МСХ была амплифицирована
нение иммунохимического анализа // Журн. Всесоюз. хим.
с включением биотина, гибридизована на метафаз-
о-ва им. Д.И. Менделеева. 1989. Т. 34, № 1. С. 52–60.
ные хромосомы пациента и детектирована конъюга-
том авидин-флуоресцеин. Сигнал (зеленое свечение) 2. Янковский Н.К. Молекулярно-генетические методы в руках
был выявлен как на МСХ, так и в прицентромерных детектива, или опыт исследования останков семьи последне-
районах обеих хромосом 4. Любезно предоставлено го российского императора // Соросовский Образовательный
Н.Б. Рубцовым Журнал. 1996. № 2. С. 21–27.

36 С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1
БИОЛОГИЯ
3. Фаворова О.О. Сохранение ДНК в ряду поколений: репли- ***
кация ДНК // Там же. № 4. С. 11–17.
Григорий Моисеевич Дымшиц, доктор биологических
4. Коршун В.А., Берлин Ю.А. Введение нерадиоактивных ре-
портерных групп в синтетические олигонуклеотиды и их де- наук, профессор кафедры молекулярной биологии
текция // Биоорган. химия. 1994. Т. 20, № 6. С. 565–616. Новосибирского государственного университета, зав.
лабораторией структуры генома Института цитологии
5. Адаричев В.А., Дымшиц Г.М., Калачиков С.М., Поздняков П.И.,
Салганик Р.И. Получение ДНК, несущей алифатические ами- и генетики СО РАН. Область научных интересов –
ногруппы, и использование ее флуоресцентного производно- структурно-функциональная организация генома, хи-
го в качестве зонда при молекулярной гибридизации // Там мическая модификация нуклеиновых кислот. Автор и
же. 1987. Т. 13. № 8. С. 1066–1069. соавтор более 140 научных публикаций. Соавтор и со-
редактор четырех учебников по общей биологии для
Рецензенты статьи В.А. Гвоздев, Л.И. Корочкин общеобразовательных учреждений.

Д Ы М Ш И Ц Г . М . Н Е РА Д И О А К Т И В Н О М Е Ч Е Н Ы Е О Л И ГО - И П О Л И Н У К Л Е О Т И Д Н Ы Е З О Н Д Ы 37