ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ

АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ»
Кафедра естественнонаучных дисциплин и информационных технологий

ОТЧЕТ

о прохождении производственной практики

с

в ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси»

специальность 1-31 80 01 Биология

Магистрант _______ _________________________

подпись Ф.И.О.

Руководитель практики
от предприятия ________ ______________________________________

Руководитель практики
от кафедры ________ Дромашко С. Е., д.б.н., профессор

Минск, 2019
 СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................3
Раздел I. Характеристика ГНУ “Центральный Ботанический сад”..........................................3
1.1 Основные достижения Центрального ботанического сада НАН Беларуси...................5
1.2 Перспективы ЦБС................................................................................................................6
1.3 Описание материальной и теоретической базы для производственной практики.......7
1.4 База биологических объектов для исследования............................................................10
1.5 Заключение.........................................................................................................................12
Раздел II. Обзор источников литературы..................................................................................13
2.1 Основные параметры характеристики ростовых процессов.........................................14
2.2 Скорость роста. Удельная скорость роста......................................................................14
2.3 Время удвоения биомассы................................................................................................15
2.4 Экономический коэффициент..........................................................................................16
2.3 Кривая роста и определение длительности фаз роста...................................................16
2.4 Особенности характеристики роста каллусных культур...............................................19
2.5 Протокол определения жизнеспособности клеток.........................................................22
2.6 Протокол определения сухой и сырой биомассы клеток..............................................23
2.5 Заключение.........................................................................................................................25
Раздел III. Экспериментальная часть.........................................................................................27
3.1 Материалы и методы.........................................................................................................27
3.1 Заключение.........................................................................................................................31
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................................................32
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................33

2
 ВВЕДЕНИЕ

В данном отчёте рассматривается вопрос о изучении динамики роста

культур клеток высших растений и возможности исследования этой
проблемы на базе предприятия, на котором проводилась практика.
В рамках производственной практики мною будет изучена литература
по данной тематике, будут оценены возможности материальной и
теоретической базы ГНУ “Центральный ботанический сад НАН РБ”, а также
будет разработан собственный метод оценки динамики роста культур клеток.
В связи с этим, целью настоящей работы является анализ литературных
источников по данной теме, и разработка собственной методики оценки
динамики роста культур клеток.
Задачи исследования:
1. Подготовить обзор источников литературы.
2. Разработать методику анализа динамики роста культур клеток.

Раздел I. Характеристика ГНУ “Центральный Ботанический сад”

Государственное научное учреждение "Центральный ботанический сад

Национальной академии наук Беларуси" – одно из старейших ботанических
учреждений Беларуси. Центральный ботанический сад (ЦБС) был
организован в 1932 г. по решению Совета Народных Комиссаров БССР. В
1999 г. по решению Правительства Республики Беларусь ему придан статус
научного объекта, составляющего национальное достояние. ЦБС объявлен
памятником природы республиканского значения и памятником
ландшафтной архитектуры. Сегодня он является уникальным природным
объектом садово-паркового искусства, сочетающего функции столичной
достопримечательности и важнейшего культурно-просветительского,
эколого-воспитательного и образовательного центра. В настоящее время

3
руководит деятельностью Центрального ботанического сада НАН Беларуси
доктор биологических наук, член-корреспондент НАН Беларуси В.В. Титок.

ЦБС самый крупный в стране центр по сохранению биоразнообразия

живых растений, ведущее научное учреждение в области интродукции,
акклиматизации, физиологии, биохимии, биотехнологии и экологии
растений, охраны окружающей среды. Он принадлежит к числу крупнейших
ботанических садов Европы как по площади (93 га), так и по составу
коллекций растений (более 15 тысяч наименований).

Основные направления научной деятельности Центрального

ботанического сада:

● эффективное использование, возобновление и охрана ресурсов

растительного мира;
● выявление физиолого-биохимических закономерностей и
механизмов формирования устойчивости и продуктивности
растений;
● создание научных основ интродукции, защиты, селекции и
управления процессами акклиматизации и биологической
продуктивности хозяйственно полезных растений на основе
традиционных и современных методов биотехнологии и генной
инженерии;
● биологический мониторинг, экология;
● промышленная ботаника;
● зеленое строительство и фитодизайн;
● использование растительных ресурсов в промышленности, сельском
хозяйстве, медицине;
● решение проблем биобезопасности биологических методов и
технологий.
4
 Научный коллектив ботанического сада разрабатывает теоретические
основы и методы использования мировых растительных ресурсов для нужд
народного хозяйства и культуры Беларуси. Разработки вносят значительный
вклад в решение практических вопросов зеленого строительства,
нетрадиционного плодоводства, лекарственного растениеводства, охраны
окружающей среды.

В ЦБС в разное время работали видные ученые: академики АН БССР

Томин М.П., Смольский Н.В., Нестерович Н.Д., Годнев Т.Н., член-
корреспондент АН БССР Мельник С.П., доктора наук Пидопличко А.П.,
Бойко А.В., Кудинов М.А., Шкутко Н.В., Горленко С.В., член-корреспондент
НАН Беларуси Сидорович Е.А. и другие. На сегодняшний день в ЦБС
работают академик НАН Беларуси Решетников В.Н. и члены-
корреспонденты НАН Беларуси Рупасова Ж.А., Титок В.В., Торчик В.И.

1.1 Основные достижения Центрального ботанического сада НАН

Беларуси

Благодаря исследованиям и интродукционным испытаниям таксонов

мировой флоры за период 2010−2018 гг. национальный генофонд
декоративных, лекарственных, пряно-ароматических, кормовых,
биоэнергетических и др. групп растений пополнен почти на 5000 образцов.
Полный состав коллекционного фонда Центрального ботанического сада в
2019 году представлен 15169 образцами (5500 видами), из них: 11614 (3422
вида) – в открытом грунте, 3232 (2100 видов) – в закрытом грунте, 323 – в
культуре in vitro.

Обобщены результаты многолетних исследований и научно-

практического опыта по интродукции голубики высокой, на основании
которых разработана программа развития промышленного голубиководства в
Республике Беларусь.

5
 Осуществлены интродукция и введение в промышленную культуру на
мелиорированных землях и выбывших из промышленной эксплуатации
торфяных месторождениях Беларуси североамериканских видов вересковых
(клюквы крупноплодной, голубики высокорослой) и сортовой брусники.

Проведены испытания более 50 марок удобрений, биостимуляторов,

средств защиты для использования на территории Беларуси (включены в
Государственный реестр средств защиты растений).

Разработаны методы ускоренного размножения на основе культуры in

vitro, позволяющие увеличить производство посадочного материала редких и
находящихся под угрозой исчезновения видов белорусской флоры.

Осуществляется научное обеспечение работ по развитию

отечественного лекарственного и пряно-ароматического растениеводства.
Ботанический сад является правообладателем 165 свидетельств на сорта
декоративных, оранжерейных, лекарственных, пряно-ароматических и
кормовых растений собственной селекции. В учреждении разработано около
40 рецептур продукции пищевого назначения: напитки, сиропы, соусы,
джемы, цукаты и др.

Сотрудниками Центрального ботанического сада опубликовано более

100 книжных изданий и 1500 статей в научных журналах.

1.2 Перспективы ЦБС

Разработка научных основ и практических мер по эффективному

устойчивому использованию растительных ресурсов в экономике и
социальной сфере страны, по сохранению генофонда редких и находящихся
под угрозой исчезновения видов и мест обитания представителей
белорусской флоры.

6
 Создание новых конкурентоспособных сортов декоративных,
лекарственных, пряно-ароматических, биоэнергетических растений и
проектов оригинальных декоративных композиций для различных объектов
озеленения, в т.ч. интерьеров.

Разработка эффективных методов ускоренного получения посадочного

материала на основе культуры in vitro и методов идентификации и защиты от
бактериального и вирусного заражения с целью получения оздоровленного
посадочного материала.

Исследование генетического разнообразия растений и растительных

сообществ, их мест обитания и экосистем, решение вопросов систематики и
таксономии с использованием традиционных и молекулярно-генетических
подходов.

1.3 Описание материальной и теоретической базы для производственной

практики

Моя практика проходила на базе лаборатории прикладной биохимии

отдела биохимии и биотехнологии растений, под руководством заведующей
лабораторией, кандидатом биологических наук Спиридович Еленой
Владимировной.

Лаборатория прикладной биохимии входит в состав отдела биохимии и

биотехнологии растений.

Заведующий отделом – доктор биологических наук, профессор,

академик НАН Беларуси, Заслуженный деятель науки Республики Беларусь
Владимир Николаевич Решетников.

Отдел создан в 2003 году на базе лаборатории (с 1958 по 2002)

биохимии и биотехнологии растений. Основателем и первым руководителем
7
лаборатории биохимии растений в составе Института биологии АН БССР
был кандидат биологических наук Мироненко Алексей Викторович. В 1959 г.
его сменил доктор биологических наук Вечер Александр Степанович. В 1962
г. после реорганизации Института биологии АН БССР лаборатория
биохимии растений перешла в состав новосозданного Института
экспериментальной ботаники АН БССР, в котором находилась до 1998 г. С 1
апреля 1998 г. и по настоящее время лаборатория (отдел) входит в состав
Центрального ботанического сада НАН Беларуси. В 1985 г. лабораторию
биохимии и биотехнологии растений возглавил доктор биологических наук
Решетников Владимир Николаевич, который руководит отделом и сегодня.

Отдел биохимии и биотехнологии растений включает в себя

лабораторию прикладной биохимии (руководитель – кандидат
биологических наук Спиридович Елена Владимировна), лабораторию
клеточной биотехнологии (руководитель – кандидат биологических наук
Чижик Ольга Владимировна) и 3 тематические группы: «Системная
биология» (руководитель – кандидат биологических наук Кузовкова Анна
Антоновна), «Молекулярная биотехнология» (руководитель – кандидат
биологических наук Чижик Ольга Владимировна), «Техническая биохимия»
(руководитель – кандидат биологических наук Паромчик Инесса Ивановна).

В отделе работают 28 сотрудников, в т.ч. 2 заведующих

лабораториями, 4 ведущих научных сотрудников, 3 старших научных
сотрудников, 10 научных сотрудников, 5 младших научных сотрудников, 3
инженера. Девять сотрудников имеют ученую степень.

Лаборатория прикладной биохимии осуществляет деятельность по

следующим направлениям:

8
Фундаментальные исследования:

● Фитобиохимия, протеомика и эпигенетика растительной клетки и

субклеточных структур;
● Физиология и биохимия деи дифференциации тканей и клеток
растений.

Прикладные исследования:

● Молекулярно-генетическое тестирование и паспортизация

интродуцированных и аборигенных видов природной флоры,
создание банка культур in vitro и ДНК;
● Разработка технологий клонального микроразмножения наиболее
ценных видов, сортов и форм растений;
● Разработка препаратов биологически активных веществ
растительного происхождения.

Инновационные разработки:

● Создание маточных плантаций и опытного производства саженцев

на основе культуры in vitro (сирень, голубика, рододендроны,
клюква и др.);
● Создание опытного поля для испытаний трансгенных растений
нетрадиционных ягодных культур;
● Получение опытных партий субстанций и препаратов пищевого и
медицинского назначения на основе местного и интродуцированного
растительного сырья.

9
1.4 База биологических объектов для исследования

В настоящее время коллекция сирени ЦБС НАН Беларуси включает 2

подрода: лигустрина и сирени. Подрод лигутрина представлен всем видовым
разнообразием входящими в его состав, т.е. с. пекинской и с. сетчатой
(подвиды амурская и сетчатая). Сорта этих видов в коллекции отсутствуют.
Подрод сирени представлен тремя сериями: пушистые, волосистые и
обыкновенные сирени. Серия пушистые сирени включает 6 таксонов,
которые представлены 3 сортами, 2 вариациями и 1 подвидом. Серия
волосистые сирени включает 7 видов, 2 подвидов, 1 форму и 11 сортов.
Серия обыкновенные сирени состоит из 1 вида, 1 подвида. Серия
перистолистные сирени, включающая 1 вид, в коллекции отсутствует.
Таблица 3.1. Список видовой сирени коллекции Центрального ботанического
сада и их географические координаты
Таксон Происхо- Широта/B Долгота/L
ждение,
год
Ligustrina, серия Трескуны
1 S. reticulata subsp. amurensis Италия, 53° 54' 27° 36' 50.5" В
1 (Rupr.) P.S.Green&M.C.Chang 1935 56.8" С
С. Амурская
2 S. reticulata subsp. amurensis Венгрия, 53° 54' 27° 37' 02.8" В
2 (Rupr.) P.S.Green&M.C.Chang 1937 56.5" С
С. Амурская
3 Syringa reticulata subsp. amurensi Украина, 53° 54' 27° 37' 03.0" В
3 s (Rupr.) P.S.Green&M.C.Chang 1951 56.2" С
С. Амурская
4 S. reticulate subsp. pekinensis Неизвестно 53° 54' 27° 37' 06.6" В
4 (Rupr.) P.S.Green&M.C.Chang 53.1" С
С. Пекинская
Продолжение таблицы 2.1
55 S. reticulate subsp. pekinensis Неизвестно 53° 54' 46.3" 27° 36' 26.1"
(Rupr.) P.S.Green&M.C.Chang С В
С. Пекинская
66 S. reticulate (Blume) H.Hara Неизвестно 53° 54' 47.3" 27° 36' 25.5"
С. Сетчатая С В
Серия Сирени Волосистые
77 S. villosa subsp. wolfii Россия, 1951 53°54'58.1"С 27°36'48.7"В

10
 (C.K.Schneid.)
 JinY.Chen&D.Y.Hong. С.
Вольфа
88 S. villosa Vahl. Бельгия, 53° 54' 57.6" 27°36'51.6"В
С. Волосистая 1949 С
99 S. villosa Vahl. Финлянд., 53° 54' 57.2" 27°36'51.3"В
С. Волосистая 1950 С
11 S. villosa subsp. Эстония, 53° 54' 56.9" 27°36'50.9"В
0 wolfii (C.K.Schneid.) 1949 С
JinY.Chen&D.Y.Hong.
С. Вольфа
11 S. villosa Vahl. неизвест., 53° 54' 56.5" 27°36'52.5"В
1 Сирень волосистая 1935 С
11 S. josikaeaJ. Jacq. exRchb.f. Россия, 1986 53° 54' 53.3" 27°36'44.6"В
2 сирень венгерская С
11 S. josikaea J.Jacq. exRchb.f. Россия, 1950 53° 54' 53.4" 27°36'44.38"В
3 Сирень венгерская С
11 S. josikaea J.Jacq. exRchb.f. Россия, 1948 53°54' 27°36'44.1"В
4 С. Венгерская 52.9"С
11 S. emodi Wall. ex Royle Румыния, 53°54'58.6"С 27°36'52.4"В
5 Сирень гималайская 1936
11 S. komarowii C.K.Schneid. Россия, 1957 53°54'53.5"С 27°37'01.5"В
6 Сирень Комарова
Серия Сирени Пушистые
11 S. pubescens Turcz Неизвестно 53°54'45.3"С 27°36'27.2"В
7 С. Пушистая
11 S.  tomentella  subsp. yunnanensi Нидерланды, 53°54'57.9"С 27°36' 50.6"В
8 s (Franch.) 1951
JinY.Chen&D.Y.Hong
С. Юньнаньская
22 S. tomentella subsp. sweginzowi Польша, 53° 54' 55.4" 27°37'03.0"В
0 i (Koehne & Lingelsh.) Jin 1938 С
Y.Chen & D.Y.Hong
Сирень Звегинцова
22 S. tomentella Bureau & Franch. неизвестно, 53° 54' 56.3" 27° 37' 00.0"
1 С. Тонковолосистая 1936 С В
Серия Сирени настоящие
22 S. oblata Lindl. Казахстан, 53° 54' 52.2" 27° 37' 06.6"
11
2 С. Широколистная 1963 С В
22 S. vulgaris L. Неизвестно 53° 54' 52.1" 27° 36' 44.4"
3 С. Обыкновенная С В
22 S. vulgaris L. неизвестно 53° 54' 52.1" 27° 36' 44.8"
4 С. Обыкновенная 1937 С В

1.5 Заключение

В соответствии с этим отдел имеет все необходимые элементы

материальной базы, такие как, секвенаторы, пцр-термостаты, ламинар-боксы,
ультраморозильники, центрифуги, автоклавы и т.д. А также очень
дружелюбный и ответственный коллектив, осуществлявший поддержку в
поиске теоретических ресурсов и осуществлении научной деятельности.

12
 Раздел II. Обзор источников литературы

Культура клеток высших растений широко используется в качестве

объекта для решения разнообразных задач физиологии и биохимии растений.
Кроме того, она является основой для создания многих растительных
биотехнологий. Для корректной интерпретации получаемых результатов
необходима адекватная оценка используемой культуры клеток, прежде всего
характеристика ее роста и физиологического состояния. Для некоторых задач
бывает достаточно качественной характеристики роста культуры, однако для
подавляющего большинства случаев необходима строгая количественная
оценка этого процесса. В частности, многие процессы (поглощение клетками
минеральных элементов, интенсивность и специфика дыхания клеток,
особенности первичного и вторичного метаболизма и др.) существенно
различны в разных фазах роста культуры. Поскольку интенсивность роста
культур клеток может сильно различаться, «привязка» исследуемых
характеристик к возрасту культуры (сутки после пересева) может приводить
к серьезным ошибкам в интерпретации полученных результатов. Более верно
с физиологической точки зрения сопоставлять процессы по фазам роста
культуры, что требует их четкого разграничения. Достаточно эффективно для
этого использовать принципы и методы, принятые в микробиологии.
Результаты количественного изучения роста могут быть достаточно
информативны и точны, если для анализа брать различные параметры:
индекс роста, удельную скорость роста (или время удвоения биомассы),
экономический коэффициент [6].

В работах А.М. Носова считается, что полное и достаточно точное

определение ростовых характеристик возможно лишь для суспензионной
культуры клеток, то есть для системы, состоящей из хорошо
перемешиваемой гомогенной взвеси клеток. Предполагается, что
интенсивность перемешивания достаточна для диспергирования клеток и что

13
в среде нет перепада концентраций. Характеристика роста культур, растущих
на поверхности среды (каллусных культур клеток), представляет собой более
сложную и трудоемкую задачу. Однако представленный мной метод в
экспериментальной части, на основе редактора цифровых изображений
культур клеток на мой взгляд решает проблемы многих методик,
представленных в обзоре литературы.

2.1 Основные параметры характеристики ростовых процессов

Основные принципы характеристики ростовых процессов и

используемые параметры Индекс роста [6]. Индекс роста является
простейшей характеристикой роста и определяется как I = (Xmax X0) / X0,
где Х0 и Xmax — количество биомассы (или другого измеряемого критерия
роста — например, числа клеток) в начале цикла выращивания и
максимальное ее значение соответственно. Следует отметить, что некоторые
исследователи предпочитают вычислять индекс роста без учета начального
содержания биомассы, т. е. по формуле I = Xmax / X0. При хорошем росте
культуры значения индекса роста, вычисляемые по обеим формулам, близки.
Основным недостатком использования индекса роста для характеристики
роста культур является его зависимость от уровня начальной плотности
культуры. Известно, что максимальный уровень накопления биомассы Xmax
определяется в основном количеством углеводного субстрата в среде, но не
начальной плотностью культуры, которая в основном влияет на длительность
лаг-фазы роста. Таким образом, при высокой начальной плотности клеток
можно получить очень низкий индекс роста, несмотря на то что другие
ростовые характеристики (например, удельная скорость роста) будут весьма
высокими. Следовательно, индекс роста является объективным критерием
роста только при выровненной начальной плотности культур.

2.2 Скорость роста. Удельная скорость роста.

14
 В простейшей модели роста предполагается, что в течение бесконечно
малого промежутка времени dt увеличение биомассы dx должно быть
пропорционально количеству биомассы χ и интервалу времени, т. е. dx =
μxdt(3), откуда dx/dt = μx(4). Дифференциальное отношение dx/dt выражает
скорость роста популяции клеток. Параметр μ, обозначающий скорость роста
единицы биомассы (1/х) (dx/dt), называется удельной скоростью роста и
измеряется в единицах, обратных времени (l/t). Этот параметр аналогичен
сложным процентам. Например, удельная скорость роста 0,1 сут-1 означает
прирост биомассы на 10% за сутки. Если μ постоянна, то интегрирование
уравнения (4) дает lnх = lnx0 + μt, (5) где х0 — биомасса в начальный момент
времени t = 0.

График зависимости lnх от времени будет иметь вид прямой линии с

наклоном μ (μ = tg α). Из уравнения следует, что ln(x/x0) = μt. График
зависимости ln(x/x0)= μt =от времени будет иметь вид прямой линии,
исходящей из начала координат, с наклоном μ. Из уравнения следует: x=x0e
μt
(7)

Рост, подчиняющийся этому закону, называется экспоненциальным,

или логарифмическим. Удельная скорость роста μ является основным
параметром, характеризующим скорость роста.

2.3 Время удвоения биомассы

Зависимость между удельной скоростью роста и временем удвоения (t d

или τ) биомассы можно получить, подставив в уравнение (4) x = 2х0 и t = τ.

Тогда τ = ln2/μ или τ ~= 0,692/μ (8).

Таким образом, время удвоения биомассы однозначно определяется

удельной скоростью роста. Например, при удельной скорости роста, равной
0,1 сут-1, время удвоения биомассы составляет около 7 суток.

15
2.4 Экономический коэффициент.

Экономический коэффициент (или выход биомассы) определяют из

уравнения Δх/Δs = Y (9), где Ах — увеличение биомассы, соответствующее
потреблению субстрата в количестве As. Более строго экономический
коэффициент определяется пределом, к которому стремится отношение
Ах/As при As —» 0, т. е. Y = Δх/Δs (10). Знак «минус» вводится потому, что
значения x и s изменяются в противоположные стороны. Важность
экономического коэффициента и его физиологический смысл состоят в том,
что он выражает соотношение энергетического и конструктивного
метаболизма клеток в популяции, иными словами — эффективность
использования субстрата среды для построения биомассы клеток. Если х0 и
s0 — начальные концентрации биомассы и субстрата соответственно, а х и s
— соответствующие концентрации во время роста в культуре, то x-х 0 = Y(s0-
s) (11). Когда концентрация биомассы достигает своего максимума, х max,
обычно субстрат среды (сахароза или другой источник углерода)
поглощается клетками полностью, в этом случае экономический
коэффициент можно с достаточной точностью определить как Υ = (x max -
x0)/s0 (12). Например, при начальной концентрации сахарозы в среде 3% (30
г/л среды) и начальном содержании биомассы в культуре 1,0 г/л (по сухой
биомассе) в конце выращивания получили 11,0 г сухой биомассы, тогда
экономический коэффициент Y составляет (11-1) / 30 = 1/3=0,33. Это
означает, что треть субстрата клетки используют на конструктивный обмен
(построение биомассы), а две трети — на энергетический (дыхание).

2.3 Кривая роста и определение длительности фаз роста.

Рост культур клеток описывается S-образной кривой роста, типичная

форма которой представлена на рис. 2.1 [6]. В процессе роста культура
проходит ряд фаз, каждая из которых соответствует определенному
физиологическому состоянию популяции клеток. Длительность каждой из
16
фаз роста является важной характеристикой роста культуры клеток. Кривые
роста часто изображают в обычной системе координат, когда по оси абсцисс
откладывают время культивирования (для культур клеток высших растений
— сутки), по оси ординат — критерии роста (сухая или сырая биомасса,
число клеток, упакованный объем). Такое представление роста культур носит
преимущественно иллюстративный характер, поскольку не позволяет
определить границы фаз ростового цикла. Для детального анализа роста
культур необходимо построение графика ростовой кривой в
полулогарифмической системе координат, то есть по оси ординат
необходимо откладывать не фактическое значение критерия роста, а его
натуральный логарифм (lnx). Более удобным является использование
нормированного значения ростового критерия, то есть значение ln x/x0. В
этом случае кривые роста для любого критерия будут идти из начала
координат, что значительно облегчает их сопоставление. Обычно на
ростовой кривой выделяют шесть фаз роста. Латентная, или лаг-фаза, роста
— период, в который видимый рост не наблюдается ни по одному из
ростовых критериев [2]. После нее идет фаза

17
 Рисунок 2.1 [6]. Типичная S-образная кривая роста с шестью фазами
роста. 1 —лаг-фаза; 2 — фаза ускорения роста; 3 — фаза экспоненциального
роста; 4 — фаза замедления роста; 5 — стационарная фаза; 6 — фаза
деградации

ускорения роста, за которой следует фаза экспоненциального роста

культуры, в которой удельная скорость роста постоянна и имеет
максимальное значение (μmax)· После экспоненциальной фазы роста или из-за
недостатка источников питания, и/или из-за накопления ингибирующих
продуктов наступает фаза замедления роста. После того как биомасса (или
другой критерий роста) достигнет максимума, наступает стационарная фаза,
в которой рост прекращается, то есть не происходит видимого изменения
значения исследуемого ростового критерия. Заключительной фазой роста
принято считать фазу деградации, в которой биомасса (или другой критерий
роста) уменьшается в результате метаболических процессов, связанных с
поддержанием жизнедеятельности клеток, или их автолиза. Следует особо
отметить, что линейная фаза роста, часто упоминаемая в литературе по
культурам клеток растений, в которой увеличение биомассы происходит по
линейному закону в нормальной системе координат, для суспензионных
культур отсутствует (точнее, ее можно выделить в фазе ускорения роста, но
ее длительность крайне мала). Линейную фазу роста можно зафиксировать
для каллусных культур клеток, выращиваемых поверхностным способом.
При таком способе культивирования наличие линейной фазы роста
обусловлено особенностью поглощения клетками субстрата из питательной
среды — не из всего объема среды, а с определенной поверхности путем
диффузии. Преимущество построения кривой роста в полулогарифмических
координатах состоит в том, что в этом случае экспоненциальная фаза роста
будет выражена в виде прямой линии, тангенс угла наклона которой к оси t
равен максимальной удельной скорости роста μmax. Границы фазы

18
экспоненциального роста определяют по точкам расхождения проведенной
прямой от графика S-образной кривой роста (рис 2.1 [6]). Длительность лаг-
фазы определяют методом Лоджа и Хиншельвуда [6] – 5 это ссылка на сайт
ЦБС. Для этого на графике зависимости логарифма биомассы от времени
необходимо экстраполировать прямую линию, соответствующую
экспоненциальной фазе роста, до уровня начальной биомассы. В случае
построения графика зависимости в нормированных координатах (ln х/х0 от
времени) — до пересечения с осью абсцисс. Отрезок, отсекаемый при этом
на оси абсцисс, будет соответствовать длительности лаг-фазы (фаза 1 на рис.
2.1). Для определения длительности стационарной фазы роста через точку
максимального накопления биомассы проводят прямую, параллельную оси
абсцисс. Границы стационарной фазы роста определяют по точкам
расхождения проведенной прямой от графика S-образной кривой роста. Фаза
ускорения роста будет находиться между

Этим методом можно корректно определить длительность фаз роста с

точностью до суток. Для полной и надежной характеристики роста культур
клеток растений используют разные критерии: сухую массу клеток т, сырую
массу клеток ms, количество клеток в миллилитре суспензии (концентрацию
клеток) п. В качестве ориентировочных и быстро определяемых критериев —
осажденный объем клеток (SCV — settled cell volume) и упакованный объем
клеток (PCV — packed cell volume). Достоинство этих критериев —
возможность возврата клеток в колбу для последующего культивирования,
что в ряде случаев важно [2]. Для культур клеток растений характерно
явление несбалансированности роста по различным ростовым критериям.
Это выражается в различной длительности фаз ростовой кривой при
построении ее по сухой массе клеток, сырой массе клеток или концентрации
клеток. В частности, по сырой массе клеток фаза стационара наступает, как

19
правило, существенно позже, что связано с ростом клеток растяжением (за
счет формирования и увеличения центральной вакуоли).

2.4 Особенности характеристики роста каллусных культур

Каллусные культуры клеток (?) выращивают на поверхности среды, и

отбор проб для анализа роста невозможен. Поэтому методика определения
ростовых характеристик более трудоемка и существенно отличается от
анализа суспензионных культур клеток. В качестве основной характеристики
роста каллусов обычно применяют индекс роста. Построение кривой роста и
определение основных ростовых характеристик используют реже, однако для
корректного определения индекса роста и оптимального срока пересадки
культуры это необходимо. Для исследования роста каллусных культур
приходится для каждого определения брать индивидуальный каллус.
Поскольку цикл выращивания каллусных культур составляет не менее 30
суток [3], с учетом аналитических повторностей, для анализа необходимо
одновременное культивирование минимум 50-60 каллусов. Каллусы можно
выращивать в чашках Петри (по 5-6 каллусов в чашке) либо по одному в
широких пробирках. Начальный вес каллусов должен быть одинаковым (0,5-
0,7 г сырой массы с точностью не менее ±5%). Для анализа на каждую точку
ростовой кривой используют не менее трех каллусов. Следует отметить, что
в качестве критериев роста для каллусных культур используют лишь сухую и
сырую массу клеток, а кривая роста в нормальных системах координат часто
имеет линейный участок (см. «Экономический коэффициент»). Для
получения достоверных и воспроизводимых результатов на культурах
клеток в качестве объекта исследования весьма важно оптимизировать
выращивание культуры по основным факторам культивирования. В
зависимости от задач, для выращивания культур можно использовать колбы
объемом от 0,25 до 2,0 л. Степень заполнения колб суспензией не должна
превышать 10-15% от общего объема колбы. Важно оптимизировать объем

20
инокулюма и начальную плотность культуры. Обычно начальная плотность
культуры находится в пределах 1-2 г/л по сухой массе клеток и подбирается
таким образом, чтобы лаг-фаза находилась в пределах 1-3 суток. Для
пересадки в качестве инокулюма используют культуру клеток в фазе
замедления роста. Выращивание проводят в темноте при температуре 26 °С,
и влажности 60-70%, на качалке с круговым вращением, скорость вращения
качалки — около 100 об./мин (95-105 об./мин). В процессе культивирования
из колб отбирают пробы для анализа. Для точного определения ростовых
характеристик желательно отбирать пробы ежедневно (это особенно важно в
начальных фазах роста) в одно и то же время. Однако для большинства
случаев приемлемо отбирать пробы через день. При определении ростовых
характеристик желательно параллельно в каждой отобранной пробе
определять жизнеспособность клеток в популяции.

21
2.5 Протокол определения жизнеспособности клеток.

Жизнеспособность клеток обычно определяют по их прокрашиванию

витальными красителями (обычно 0,025% синькой Эванса или 0,1%
раствором феносафранина) и выражают как процент непрокрашенных
(«жизнеспособных») клеток [6]. Доля жизнеспособных клеток в культуре
должна быть не менее 60%, для хорошо растущих культур — 80-90%.
Жизнеспособность клеток обычно несколько изменяется в цикле
выращивания, существенно снижаясь к началу фазы деградации. При
жизнеспособности клеток в популяции менее 50% исследовать ростовые
характеристики культуры и использовать ее для физиологических
экспериментов нецелесообразно. В этом случае необходимо проводить
работы по оптимизации физиологического состояния данной культуры
клеток. Поскольку суспензионные культуры клеток состоят из агрегатов
клеток различного размера, применяют два способа определения
жизнеспособности культур — по подсчету клеток или по подсчету
культивируемых единиц. Последний способ более предпочтителен, для
крупноагрегированных суспензий он единственно возможен. Протокол
определения жизнеспособности культуры по количеству жизнеспособных
клеток

1. Готовят 10 мл водного раствора витального красителя: 0,025%

синьки Эванса или 0,1% раствор феносафранина. Раствор можно хранить
длительное время при комнатной температуре. Следует иметь в виду, что для
разных культур результаты, полученные с различными красителями, могут
несколько различаться.

2. В ламинар-боксе стерильно отбирают пробу, используя пипетку

объемом 1 мл с обрезанным «носиком» (это необходимо для попадания в
пробу всех клеточных агрегатов, размер которых может достигать для
крупноагрегированных суспензий 2-3 мм). При отборе пробы необходимо
22
вращать колбу, чтобы не образовалось осадка клеток, от этого в большой
степени зависит точность и воспроизводимость результатов.

3. На предметное стекло наносят пипеткой каплю суспензии клеток,

рядом наносят капилляром небольшую каплю красителя (объем красителя
должен быть в 8-10 раз меньше объема суспензии). Капли смешивают и
накрывают покровным стеклом.

4. Через минуту после смешивания стекло просматривают под

микроскопом и подсчитывают количество прокрашенных клеток (при
просмотре не менее 500 клеток). Для подсчета удобны счетчики клеток,
используемые в гематологических исследованиях(камеры Горяева).
Жизнеспособность культуры выражают как процент непрокрашенных клеток
к общему числу просмотренных клеток. Для более точного определения
жизнеспособности культуры желательно провести для каждой пробы 2-3
независимых анализа (пп. 2-4).

5. Через минуту после смешивания стекло просматривают под

микроскопом и подсчитывают количество жизнеспособных агрегатов клеток
(при просмотре не менее 200 агрегатов). Жизнеспособным считается агрегат,
в котором количество непрокрашенных клеток больше половины
(определяется визуально). Жизнеспособность культуры выражают как
отношение количества жизнеспособных агрегатов к общему числу
просчитанных агрегатов в процентах. Необходимо провести минимум два
независимых анализа на каждую пробу.

2.6 Протокол определения сухой и сырой биомассы клеток

1. В ламинар-боксе стерильно отбирают пробы, используя пипетку

объемом 10 мл с обрезанным «носиком». При отборе пробы необходимо
вращать колбу, чтобы не образовалось осадка клеток (см. п. 2 Протокола

23
определения жизнеспособности культур по количеству жизнеспособных
клеток).

2. Отобранную пробу суспензии клеток объемом 10 мл

отфильтровывают на воронке Бюхнера через бумажный или нейлоновый
фильтр под вакуумом. Для этого по каплям суспензию из пипетки наносят в
центр фильтра и выдерживают 15-20 с (время фильтрации должно быть
одинаковым для всех проб). В некоторых случаях (например, большое
количество экзометаболитов в среде, необходимость использования
высушенной биомассы для дальнейших анализов) можно промыть клетки на
фильтре по каплям дистиллированной водой или соответствующим буфером.
Однако для большинства случаев это не требуется.

3. Получившуюся в центре фильтра «горку» клеток шпателем

переносят в стеклянный бюкс, доведенный до постоянного веса; бюкс
закрывают крышкой для предотвращения испарения воды.

4. Закрытый бюкс с клетками взвешивают на аналитических весах и,

после вычитания веса бюкса (с крышкой), получают значение сырой массы
клеток в 10 мл суспензии.

5. Открывают крышку бюкса и помещают его на сутки в термостат,

установленный на температуру 60 °С.

6. После высушивания бюкс с клетками закрывают крышкой,

переносят в эксикатор и охлаждают до комнатной температуры (1,5-2 ч).

7. Бюкс взвешивают на аналитических весах и после вычитания веса

бюкса получают значение сухой массы клеток в 10 мл суспензии.

8. Для контроля полноты высушивания клеток желательно повторить

процедуры пп. 5-7, повторно выдерживая клетки в термостате в течение 2-3

24
ч. При этом сухая масса клеток должна изменяться не более чем на 5-6% .
Однако для большинства культур клеток 18-24 ч вполне достаточно для
полного высушивания. Высушенную биомассу можно использовать для
химического анализа или иных целей. Описанный протокол определения
сухой и сырой массы клеток дает более точные результаты по сравнению с
распространенным вариантом без использования бюксов, когда биомассу
взвешивают вместе с фильтром или на алюминиевой фольге. Для анализа
числа клеток в мл суспензии используют подсчет клеток. Для этого служит
гемоцитометр, используемый для подсчета форменных элементов крови —
камеру Фукса—Розенталя. Следует особо отметить, что из-за значительных
размеров растительных клеток камеру Горяева, предназначенную для
подсчета эритроцитов, использовать нельзя. Перед подсчетом числа клеток
необходимо провести дезинтеграцию (мацерирование) клеточных агрегатов,
из которых состоит суспензионная культура клеток растений. Для этого
обычно используют два подхода — мацерирование в растворе хромовой
кислоты или действие ферментов (пектиназ и целлюлаз). Метод с хромовой
кислотой более быстрый и менее сложный, однако требует подбора
оптимального времени мацерации. [6]

2.5 Заключение

В данном литературном обзоре были освещены основные понятия и

методики для изучения динамики роста культур клеток высших растений. У
методик, описанных здесь, имеется ряд преимуществ, такие как - точность,
относительная простота воспроизводимости, возможность интерпретации
данных в статистическом анализе. Однако есть и ряд недостатков - прежде
всего это потеря изучаемого материала для анализа. Для метода на основе
изучения массы невозможно использовать проверяемый материал для
последующего размножения. В соответствии с этим требуется большое

25
количество материала, что энерго и ресурсозатратно. В экспериментальной
части мною был разработан метод, решающий эту проблему.

26
 Раздел III. Экспериментальная часть

3.1 Материалы и методы

Методика измерения динамики роста каллусной ткани с помощью

программы Photoshop

Для измерения динамики прироста каллусной ткани, были сделаны

фотографии каллусов с шагом в 14 дней и анализ их с помощью
программного пакета Photoshop. (полтора интервала)

Рисунок 3.1. - Образец 8, на среде 4, 13.02.19

Рисунок 3.2. - Образец 8, на среде 4, 03.06.2019

27
 Для измерения площади каллусной ткани была использована
возможность измерения области выделенной области в пикселях.
Для этого нужно открыть программу Photoshop/ Зайти в раздел Окно/
Поставить галочку напротив пункта Журнал измерений/ Выделить
интересующую область с помощью функции Быстрое выделение/ Нажать
кнопку Записать измерения/ Занести данные из графы Площадь в таблицу.
(полтора интервала)

Рисунок 3.3. - Пример получения данных с изображения клеточной культуры

Для объективности измерений, все вычисления были переведены в

квадратные сантиметры, полученные с помощью вычисления площади
квадратного сантиметра на линейке в пикселях.(рис. 3.4) (то же)

28
 Рисунок 3.4 - Получение площади квадратного сантиметра для
объективизации данных

Вычисление площади, занимаемой колонией клеток в сантиметрах

производилось по формуле S= Spix/S(см,кв).

Таким образом была получена таблица с площадью каждой колонии каждого

образца на всех этапах роста клеточной колонии.(Таблица 3.1) (то же)

29
Таблица 3.1 - Динамика площади агрегатов клеточных культур в квадратных
сантиметрах (позиция агрегата определялась по часовой стрелке, например
объект на 6 часов является самым нижним объектом на чашке Петри)

13/02/ 24/02/ 07/03/ 22/03/ 05/04/ 19/04/ 03/05/ 17/05/ 03/06/

19 19 19 19 19 19 19 19 19
объект
на 6 0,42 0,84 1,26 1,68 2,1 2,32 2,64 2,96 3,54
объект
на 7 0,56 0,58 0,6 0,62 0,64 0,68 0,7 0,72 0,82

объект
на 9 0,07 0,12 0,17 0,22 0,27 0,31 0,34 0,37 0,45
объект
на 10 0,54 0,58 0,62 0,66 0,7 0,74 0,79 0,82 0,88
объект
центр 1,01 1,37 1,73 2,09 2,45 2,81 3,17 3,53 4,58
объект
на 12 0,45 0,58 0,71 0,84 0,97 1,1 1,23 1,36 1,82
объект
на 13 0,1 0,16 0,22 0,28 0,34 0,4 0,46 0,52 0,66
объект
на 16 1,35 1,47 1,59 1,71 1,83 1,84 1,89 1,91 2,14
объект
на 17 1,33 1,37 1,41 1,45 1,49 1,53 1,54 1,57 1,63

30
Диаграмма роста клеток выглядит следующим образом (рис. 3.5)

Рисунок 3.5 - Динамика роста клеток

Из этого мы можем легко видеть что коэффициент R близок к 1, из чего

исходит, что рост каллусов близится к линейной зависимости, а значит среда
4 оптимальна для выращивания каллусов сирени, таксона 8.

Данная культура клеток ещё не успела войти в фазу стационарного

роста, поэтому на этих графиках мы не видим классическую S-образную
кривую динамики роста. Однако последующие измерения с большой
вероятностью покажут, что данный метод соответствует действительности и
является хорошим инструментом для решения проблем данного вопроса. (то
же)

3.1 Заключение

В отличие от представленных методик в обзорной части, данный метод

не требует извлечения клеток из стерильных условий, и позволяет
продолжить цикл их размножения. Данный метод достаточно точный, ведь
31
он использует ресурсы точной вычислительной техники, и в нём отсутствует
такая погрешность, как наличие примесей во взвешиваемом материале, или
недостаточная степень просушки. Недостатками данного метода является то,
что он изучает площадь покрытия клеточной массы, что даёт мало
возможностей для интерпретации этих данных в анализе классических
показателей динамики роста клеточной культуры.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В данном отчёте был рассмотрен вопрос о изучении динамики роста

культур клеток высших растений и возможности исследования этой
проблемы на базе предприятия, на котором проводилась практика.
В рамках производственной практики мною была изучена литература
по данной тематике, были оценены возможности материальной и
теоретической базы ГНУ “Центральный ботанический сад НАН РБ”, а также
был разработан собственный метод оценки динамики роста культур клеток.
В связи с этим, был выполнен анализ литературных источников по
данной теме, и разработка собственной методики оценки динамики роста
культур клеток.

32
 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Из-во

«Мир», 1978. 331 с.

2. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология

морфогенеза растений. Москва.: «Наука», 1964. 272 с.

3. Plant Cell Culture. A practical approach. Edited by R. A. Dixon and R. A.

Gonzales. 2nd. ed. Oxford University Press, 1994. 156 pp.

4. Plant Cell Culture Protocols. Edited by V. M. Loyola-Vargas and F.

Vazquez-Flota, 2nd. ed. Totowa, New Jersey: Humana Press, 2006. 393 pp.

5. Сайт Центрального ботанического сада в сети Интернет. Адрес сайта:

http://cbg.org.by/

6. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной

биологии растений / под ред. Вл. В. Кузнецова, В. В. Кузнецова, Г. А.
Романова. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012.—487 с. : ил.—
(Методы в биологии). ISBN 978-5-9963-0738-8

33