Вы находитесь на странице: 1из 60

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ
«ГОМЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Д.В. Тапальский, Л.В. Лагун, А.И. Козлова

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРИКЛАДНАЯ
МЕДИЦИНСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Рабочая тетрадь
для студентов 2 курса лечебного факультета

Гомель
ГомГМУ
2019
ПРАВИЛА РАБОТЫ В
УЧЕБНОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Для предотвращения инфицирования изучаемыми микроорганизмами,


возможной контаминации ими личных вещей, дальнейшего неосознанного
выноса и инфицирования посторонних лиц, при работе в учебной
микробиологической лаборатории необходимо постоянно соблюдать
следующие правила:

1. Личные вещи складывать в специально отведенном месте.


2. За рабочим столом находиться только в халате. Не принимать пищу и не
пить.
3. Во время выполнения практических заданий убирать со стола все
посторонние предметы (в том числе тетради и учебники.
4. Перед зажиганием спиртовки удалить пары спирта, накопившиеся под
крышкой, приподняв фитиль. Осторожно поджечь спиртовку. Не бросать
горящих спичек, не зажигать спиртовку от спиртовки, не переносить
зажженную спиртовку с одного места на другое.
5. При работе с культурами микроорганизмов быть предельно
внимательным, не допускать попадания содержимого пробирки на
поверхность стола, одежды и т.д. В случае аварии (разбилось,
пролилось) немедленно поставить в известность преподавателя и
принять меры к дезинфекции.
6. Не ставить бактериологическую петлю на место не стерилизовав ее
пламенем. Не оставлять открытыми чашки Петри и пробирки с
культурами микроорганизмов.
7. После работы с микроскопом: выключить осветитель, удалить
иммерсионное масло с объектива и накрыть чехлом.
8. В конце работы привести в порядок рабочее место, вымыть руки с
мылом. Для вытирания рук иметь индивидуальные салфетки.

Группа __________ Ф.И.О._____________________ Дата ________

Подnись_____________________

2
ЗАНЯТИЕ № 1ТЕМА: ОСНОВНЫЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ГРУППЫ МИКРООРГАНИЗМОВ.
МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Предмет, задачи, методы и связи микробиологии. Задачи медицинской микробиологии. История микробиологии.
Эволюция микроорганизмов.
2. Формы и размеры истинных бактерий. Характеристика шарообразных, палочковидных и извитых форм истинных
бактерий.
3. Структура бактерий. Основные отличия прокариотной клетки от эукариотной. Клеточная стенка
грамположительных и грамотрицательных бактерий.
4. Типы микроскопических препаратов. Техника приготовления фиксированных препаратов.
5. Тинкториальные свойства микробов. Красители. Простые способы окраски фиксированных препаратов.
6. Техника микроскопии в световом микроскопе.
7. Систематика и номенклатура микроорганизмов. Принципы классификации патогенных прокариот.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1►Ознакомление с организацией работы кафедры, оснащением и режимом работы бактериологической
лаборатории.
2►Приготовление препаратов-мазков стафилококка со скошенного агара, фиксация, окраска водно-
спиртовым раствором метиленового синего.
3►Изучение правил и техники иммерсионной микроскопии.
4►Приготовление мазков из смеси бульонных культур кишечной палочки (Escherichia coli), бацилл
(Bacillus сereus), сарцин (Micrococcus flava), зафиксировать, окрасить водным раствором фуксина.

Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования - изучение живых или убитых


микроорганизмов в окрашенном или неокрашенном виде с помощью микроскопа. С помощью этого метода
определяют форму, величину, взаимное расположение клеток, подвижность, отношение к окраске.
Типы микроскопических препаратов: нативные (живые) и фиксированные (убитые):
неокрашенные и окрашенные анилиновыми красителями

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА1►Ознакомиться с организацией работы кафедры, оснащением и режимом работы


бактериологической лаборатории.2►Приготовить препараты-мазки стафилококка со скошенного агара, зафиксировать,
окрасить водно-спиртовым раствором метиленового синего.3►Изучить правила и технику иммерсионной микроскопии.
4►Приготовить мазки из смеси бульонных культур кишечной палочки, бацилл, сарцин, зафиксировать, окрасить водным
раствором фуксина.
Staphylococcus aureus Смесь бульонных
Окраска: метиленовым культур
синим Окраска: фуксином
Увеличение Escherichia coli,
объектив 90 окуляр 15 Bacillus cereus,
=1350 Micrococcus flava
Увеличение х=1350

5►В демонстрационных препаратах изучить морфологию микроорганизмов:

Стрептококки Кишечная палочка в Вибрионы Боррелии


в чистой культуре чистой культуре в чистой культуре в мазке крови

Окраска Окраска Окраска водным Окраска азур-эозином


метиленовым синим водным фуксином фуксином х 630 по Романовскому
х=1350 x 630 х 900
кокки расположены палочки расположены слегка изогнутые палочки изогнутые, среди
цепочкой беспорядочно расположены беспорядочно эритроцитов

3
Классификация микроорганизмов
Классификация - это распределение организмов на основе учета их общих признаков на группы или таксоны.
Классификация основывается на внешних признаках организмов (фенотипе) и генетических особенностях организмов
(генотипе). В настоящее время мир микробов подразделяют на следующие формы:
1. Неклеточные 2. Клеточные формы:
формы:
2.1. Прокариоты: 2.2. Эукариоты:
- прионы; Домен Bacteria: - бактерии без клеточной - простейшие;
- вироиды; - бактерии с тонкой клеточной стенкой стенки (микоплазмы). - грибы.
- вирусы. (грамотрицательные); Домен Archaea:
- бактерии с толстой клеточной стенкой - архебактерии
(грамположительные);
В классификации микробов используются следующие таксономические категории: царство, отдел, класс,
порядок, семейство, род, вид. Основной таксономической единицей является вид. Название микроорганизмам
присваивается в соответствии с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий. Для обозначения видов
бактерий принята двойная (бинарная) номенклатура, предложенная еще в XVIII веке Карлом Линнеем. Согласно
номенклатуре, латинскими буквами сначала пишется название рода (родовое название) с заглавной буквы, а затем -
название вида (видовое название) со строчной буквы. В тексте все название выделяется курсивом. Если микроорганизм
идентифицирован только до рода, то вместо видового названия пишется слово sp. (species - вид). Родовую
принадлежность микроба обозначает какой-либо морфологический признак или фамилия ученого, открывшего микроб, а
видовую принадлежность обозначает либо вид колоний, либо среда обитания микроорганизма. Например, Escherichia
coli указывает на то, что микроб открыл Т. Эшерих, а обитает микроб в кишечнике. Образование и применение научных
названий микроорганизмов регламентируют “Международный кодекс номенклатуры бактерий”, “Международный
кодекс ботанической номенклатуры” (грибы), “Международный кодекс зоологической номенклатуры” (простейшие) и
решения Международного комитета по таксономии вирусов.
Бактерии обладают высокой изменчивостью. Для внутривидовой дифференциации бактерий, отличающихся
по определенному признаку, используют понятие “вариант” (сокращенно – «вар»). Выделяют варианты, отличающиеся
по антигенным признакам (серовары), варианты, устойчивые к бактериофагам (фаговары), а также варианты,
различающиеся по биохимическим (хемовары), биологическим или культуральным признакам (биовары).
В микробиологии используются специализированные термины: чистая культура, смешанная культура,
штамм, клон.
Культура - это совокупность микроорганизмов, выращенных на плотной или жидкой питательной среде в
условиях лаборатории. Культуру микроорганизмов, состоящую из особей одного вида называют чистой культурой.
Смешанной культурой называют смесь микроорганизмов разных видов, выросших в питательной среде при посеве
исследуемого материала или при попадании в питательную среду, засеянную одним видом микроба, других видов
микроорганизмов из внешней среды.
Штамм (нем. Stamm, буквально — ствол, основа) - это чистая культура определенного вида микроорганизма,
выделенная из исследуемого материала, взятого в определенный момент из конкретного объекта. Может быть выделен
из различных источников (почвы, воды, пищевых продуктов и т.д.) или из одного источника в разное время. Поэтому
один и тот же вид бактерий, дрожжей, микроскопических грибов может иметь большое число штаммов, отличающихся
по ряду свойств, например по чувствительности к антибиотикам, способности к образованию токсинов, ферментов и др.
Клон (греч. klon – отводок) - это потомство (культура) одной материнской клетки (вирусной частицы)
определенного вида микроорганизмов.

Принципы классификации микроорганизмов


Минимальный перечень признаков, необходимых для описания бактерий:
1. Морфологические и тинкториальные свойства - величина, форма, клеток, наличие капсулы, спор, жгутиков,
способность окрашиваться красителями.
2.Тип дыхания –потребность в газообразном кислороде.
3. Биохимические свойства - способность ферментировать углеводы, расщеплять белки.
4. Антигенная структура – наличие антигенов.
5. Чувствительность к бактериофагам.
6. Генетическое родство с другими бактериями.

4
В микробиологии созданы определители для идентификации микроорганизмов: “Определитель бактерий и
актиномицетов” Н.А. Красильникова (1949 г.), “Определитель микробов” Р.А. Циона (1948 г.) и “Определитель
бактерий” Д.Х. Берджи. Наиболее распространенной является классификация американского бактериолога Д.Х. Берджи,
систематизирующий все известные бактерии на 4 отдела:
Отдел I. Gracilicutes (лат. gracilis - изящный, тонкий, cutis – кожа) - виды с тонкой клеточной стенкой,
окрашивающиеся грамотрицательно.
Отдел II. Firmicutes (лат. firmus - крепкий, cutis – кожа) - бактерии с толстой клеточной стенкой,
окрашивающиеся грамположительно.
Отдел III. Tenericutes (лат. tener - нежный, cutis – кожа) - бактерии, не имеющие клеточной стенки –
микоплазмы.
Отдел IV. Mendosicutes (лат. mendosus - неправильный, cutis – кожа) - архебактерии. В этот отдел включены
метанобразующие, сероокисляющие, микоплазмоподобные, термоацидофильные и другие наиболее древние
по происхождению бактерии.

Морфология бактерий
Бактерии невооруженным глазом не видны. Клетки бактерий измеряют в микрометрах (1 мкм равен 10 -3 мм), а
элементы тонкого строения бактерий измеряют в нанометрах (1 нм равен 10-3 мкм). Средние размеры бактерий
составляют 0,5-3 мкм. По форме клеток бактерии подразделяются на 3 основные группы:
- шаровидные формы или кокки; - палочковидные формы; - извитые формы.
Кокки имеют сферическую форму в виде правильного шара, эллипса, боба. В зависимости от взаимного
расположения клеток после деления различают следующие виды кокков:
- микрококки делятся в разных плоскостях и располагаются одиночно, парами или беспорядочно;
- стафилококки делятся в различных плоскостях и располагаются гроздьями;
- диплококки делятся в одной плоскости, располагаются попарно;
- стрептококки делятся в одной плоскости, располагаются в виде цепочки;
- тетракокки делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях, располагаются по четыре;
- сарцины делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и образуют правильные пакеты по 8-16
клеток.
Палочковидные бактерии имеют цилиндрическую форму с округлыми, заостренными или тупыми концами.
Палочковидные бактерии подразделяются на 2 группы:
1. бактерии – не образующие спор палочки; 2. бациллы - палочки, образующие споры. Палочки, у которых
диаметр споры превышает ширину вегетативной клетки, называют клостридиями. Извитые бактерии объединяют:
- вибрионы - имеют цилиндрическую изогнутую форму, образуя 1/2-1/4 завитка спирали, по форме
напоминают запятую;
- спириллы имеют форму спирально извитых палочек с 4-6 витками;
- спирохеты спирально извитые формы, у которых существуют 2 типа витков: первичные витки, образованные
изгибами протоплазматического цилиндра, и вторичные витки, представляющие изгибы всего тела.

Методы определения вида (идентификации) микробов


Определение вида микроорганизмов проводится с использованием следующих методов
исследования:

1.- микроскопический метод – изучение микроорганизмов в живом или окрашенном состоянии


наблюдения в световом микроскопе;
2.- микробиологический метод – изучение характера роста микробов на плотных и в жидких
питательных средах, определение ферментативной активности микробов;
3.- серологический метод – изучение антигенного строения микробов;
4.- биологический метод – изучение патогенных свойств бактерий с использованием лабораторных
животных;
5.- аллергологический метод – метод диагностики инфекционных заболеваний с помощью
постановки кожных проб;
6.- молекулярно-биологический метод – изучение генетических особенностей микробов;
7.- время-пролетная масс спектрометрия органических молекул (MALDI- TOF масс-
спектрометрия) – высокоточный метод, позволяющий идентифицировать микроорганизмы в течение
нескольких минут по спектру рибосомальных белков.

5
ЗАНЯТИЕ № 2

ТЕМА: МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД


ИССЛЕДОВАНИЯ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ


1. Защитные приспособления у микроорганизмов. Споры, стадии и условия образования спор, биологическое значение.
2. Капсулы бактерий, их значение.
3. Жгутики, их строение. Реснички. Секс-пили.
4. Сложные способы окраски. Техника окраски по Граму, Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Нейссеру.
5. Методы исследования микроорганизмов в живом состоянии.
6. КОН-тест. Принцип метода.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Техника окраски по Граму (использовать соответствующие цвета при заполнении таблицы):

6
Основные морфологические группы бактерий

1►Окраска по Граму мазков из бульонной культуры стафилококка, агаровой культуры кишечной палочки и их
смеси. Зарисовка препаратов.

Смесь бактерий
Обозначить на рисунке:
1 - Staphylococcus aureus,
2 - Escherichia coli
Окраска по Граму
Увеличение x 630

2►Приготовление мазка из культуры дифтерийной палочки, окраска метиленовым синим по Леффлеру и по


Нейссеру. Зарисовка препаратов.
Corynebacterium Corynebacterium
diphtheriae diphtheriae
Окраска по Леффлеру Окраска по Нейссеру
Увеличение x 630 Увеличение x 630

3►Постановка и учет результатов КОН-теста с культурами золотистого стафилококка и кишечной палочки.


Результат КОН-теста (с 3% раствором) Staphylococcus aureus стенка не разрушается, Escherichia coli стенка
разрушается образуются тянущиеся за петлей слизистые нити .

7
4►Приготовление препарата «раздавленная капля» или «висячая капля» из сенного настоя для изучения
подвижности (указать особенности микроскопии препарата)

Принцип приготовления препарата «висячая капля»: используют специальное стекло с углублением


(лункой), каплю исследуемого материала наносят на покровное стекло, края лунки смазывают вазелином
Принцип приготовления препарата «раздавленная капля»: используют обычное предметное стекло,
наносят исследуемый материал и накрывают («раздавливают») покровным стеклом
Техника микроскопии данных препаратов: готовый препарат, микроскопируют с иммерсионным обьективом
при приспущенном конденсоре (в темном поле)

5►Приготовление мазка из мокроты, окраска по Цилю-Нильсену, микроскопия и зарисовка препарата.


Этапы окраски по Цилю-Нильсену:
1.Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают карболовым фуксином Циля или
окрашенной фуксином бумагой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до
кипения.
2.Дают препарату остыть, бумагу снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой.
3.Окрашенный препарат обесцвечивают 5 % раствором серной кислоты в течение3-5 сек.
4.Тщательно промывают водой.
5.Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель).

6►►Микроскопия препаратов микроорганизмов, окрашенных по Ожешко (бациллы - выявление спор) и Цилю-


Нильсену (выявление кислотоустойчивых бактерий). Зарисовка препаратов.

Bacillus сereus Mycobacterium


Окраска спор по tuberculosis в мокроте
Ожешко Окраска по Цилю-
Увеличение x 630 Нильсену.
Увеличение x 630

7►Приготовление мазков из агаровой культуры клебсиелл, окраска по Бурри-Гинсу, микроскопия и зарисовка.

Klebsiella pneumonia Окраска по по Бурри-Гинсу Увеличение x 630

Этапы окраски: 1. Черную тушь смешивают в культурой и


высушивают. 2. Фиксируют препарат пламенем и окрашивают тела
микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты
и промывают водой 5-10 секунд. В результате на темном фоне
хорошо видна бесцветная капсула и красные тела микробов.

8
Метод Циля-Нильсена предназначен для выявления кислотоустойчивых бактерий
(возбудителей туберкулеза и лепры).
1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают карболовым фуксином Циля или
окрашенной фуксином бумагой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель
до кипения
2. Дают препарату остыть, бумагу снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают
водой.
3. Окрашенный препарат обесцвечивают 5 % раствором серной кислоты в течение 3-5 сек.
4. Тщательно промывают водой.
5. Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель).
Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с
трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой.
Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и
окрашиваются дополнительным красителем.

Метод Ожешко используется для выявления спор. Для этого на нефиксированный мазок наносят
0,5% р-р HСl, подогревают 1-2 минуты над пламенем, промывают водой, фиксируют и далее
окрашивают по методу Циля-Нильсена. При этом цитоплазма клетки окрашивается в синий цвет, а
споры в красный.

Метод Бурри-Гинса используется для окраски капсул бактерий и основан на том, что капсула не
воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бури. Для
этого черную тушь смешивают в культурой и высушивают. После этого проводят фиксацию в
пламени горелки, окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1
минуты и промывают водой 5-10 секунд. В результате на темном фоне хорошо видна бесцветная
капсула и красные тела микробов.

Леффлера окраска способ метахроматического выявления волютиновых (РНК + полифосфаты)


зерен у коринебактерий и скоплений нуклеиновых соединений у др. бактерий. Для окраски
используют щелочной р-р метиленового синего, который наносят на 3 - 5 мин на фиксированный
мазок, после чего смывают водой, мазок высушивают и микроскопируют. Протоплазма бактерий
окрашивается в голубой цвет, волютиновые зерна - в темно-синий.

Нейссера метод окраски используют для выявления зерен волютина у возбудителей дифтерии и др.
коринебактерий. Фиксированный мазок 2 - 3 мин красят уксуснокислым синим,10 - 30 с
обрабатывают р-ром Люголя, слегка промывают водой и докрашивают в течение 30 с р-ром
везувина, высушивают и микроскопируют. Бактерии окрашиваются в желтый цвет, волютин -в
темно-синий.
Здродовского метод (холодный Циль-Нильсен) используют для выявления риккетсий внутри
пораженных клеток. Для этого: 1. Окрашивают мазок разведенным фуксином Циля (10—15 капель
на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 мин.;. 2. Промывают водой; 3.Обрабатывают мазок
0,5% раствором лимонной кислоты или 0,01% раствором НCl; 4. Промывают водой. 5. Окрашивают
метиленовым синим в течение 1 мин.; 6. Промывают водой, высушивают препарат. Риккетсии
окрашиваются в красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют,— в голубой, ядра
— в синий.
Окраска по Романовскому-Гимзе (азур II +эозин) основной метод изучения морфологии
риккетсий, хламидий, спирохет, простейших, а также форменных элементов крови. Непосредственно
перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды нейтральной реакции прибавляют 10 капель
готовой фабричной краски и тотчас же наливают на препарат, предварительно фиксированный
жидким фиксатором, на один час. Затем краску сливают, препарат промывают водой, высушивают
на воздухе и микроскопируют. Окрашивание происходит быстрее (30-40 минут), если препарат с
краской поместить в термостат при 37°С. Бактерии вследствие окрашивания приобретают
фиолетово-красный оттенок, цитоплазма клеток — голубой цвет, ядра — красный.

9
ЗАНЯТИЕ № 3ТЕМА: МОРФОЛОГИЯ СПИРОХЕТ, АКТИНОМИЦЕТОВ, РИККЕТСИЙ,
ХЛАМИДИЙ, МИКОПЛАЗМ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Спирохеты. Систематическое положение и морфология спирохет. Особенности ультраструктуры и химического
состава. Методы исследования.
2. Актиномицеты, морфология, ультраструктура, химический состав. Патогенные виды. Роль актиномицетов в природе
и медицине. Методы выявления.
3. Таксономия хламидий. Морфология, структура, способы выявления. Цикл развития хламидий.
4. Риккетсии, морфология, ультраструктура, химический состав. Патогенные виды.
5. Микоплазмы. Классификация. Филогенез. Способы выявления.
Дефектные формы микробов: протопласты, сферопласты, L-формы
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1► Микроскопия и зарисовка риккетсий Провацека в готовом препарате, окрашенного по
Здродовскому (холодный Циль-Нильсен).

Rickettsia prowazekii
вакцинный штамм
Окраска Окраска по Здродовскому
Увеличение х 1000

2► Заполнение таблицы:
Особенности структуры и
Микроорганизм Способы выявления
жизнедеятельности
1. Спирохеты – грамотрицательные Отличаются строением органа 1.Микроскопия: (трепонемы плохо
извитые, тонкие, подвижные движения. Фибриллы, состоящие красятся , поэтому их.выявляют:
микроорганизмы. Царство: Procaryotae; из флагеллина - белка жгутиков 1. по подвижности в темном поле;
Отдел: Gracilicutes; Порядок: Spirochetales: прикреплены к блефаропластам ― 2.негативной окраской по Бурри;
1.Семейство: Spirochaetaceae ; дисковидным образованиям на 3.серебрением по Морозову;
1. Род: Treponema (8 -12 изгибов): обоих концах цилиндра и 4.окраской по Романовскому-Гимзе;
Вид: T. pallidum – возбудитель сифилиса ; расположены внутри клетки (трепонемы бледно-розовые,
2.Род: Borrelia (3-10изгибов ): Вид Borrelia между наружной мембраной и боррелии сине-фиолетовые,
recurrentis – возвратный тиф; Вид Borrelia цитоплазмой. Сокращения лептоспиры розовые)
burgdorferi – болезнь Лайма фибрилл вызывают вращательные, 2.Культивируют лептоспиры и
2.Семейство: Leptospiraceae сгибательные и поступательные боррелии на питательных средах, а
Род: Leptospira (20 -40 изгибов), движения. трепонемы в яичке кролика, так как
Вид: Leptospira interrogans –возбудитель на питательных средах они не
желтушного лептоспироза. растут
2. Актиномицеты от греч. actis - луч, Почвенные анаэробы 1. Микроскопия: Грам + палочки
mykes - гриб - палочковидные или факультативные или облигатные. (0,2-1,0 х 2,0-5,0мкм) или нити.
нитевидные (10-50мкм) ветвящиеся Некоторые обитают в полости рта, Неподвижны. В гное образуют
бактерии, образующие как и грибы, мицелий ЖКТ, влагалище. Размножаются скопления - актиномикотические
- нитевидные переплетающиеся клетки. поперечным делением, а также друзы - образования в виде
Царство: Procaryotae; Отдел: Firmicutes; спорами и почкованием как грибы. желтоватых зерен, состоящие из
Порядок: Actinomycetales ; A. bovis , A. israelii вызывают густо переплетенных гиф.
Семейство: Actinomycetaceae : актиномикоз - хронический 2. Культивирование на среде
Род: Actinomyces 1.Сем-во: Nocardiaceae гнойный процесс с развитием Сабуро (МПА + 2% глюкозы)
Род: Nocardia Вид Nocardia asteroides гранулем, абсцессов и свищей.
Виды: A. Bovis и A. Israelii
3. Риккетсии – мелкие грамотрицательные Облигатные внутриклеточные Микроскопия при окраске по:
кокковидные или палочковидные бактерии. паразиты (используют АТФ клетки), 1.Романовскому (азур – синий,
Царство: Procaryotae; не растущие на питательных эозин - красный): в цитоплазме или
Отдел: Gracilicutes; Порядок: Rickettsiales; средах. Культивируют риккетсии: ядре сине-фиолетовые риккетсии на
1.Сем-: Rickettsiaceae : Роды: Rickettsia и 1. В организме морских свинок голубом фоне.
Orientia Вид: Rickettsia prowazekii ― или белых мышей. 2. Здродовскому (аналог метода
эпидемический сыпной тиф; Orientia 2. В организме членистоногих: Циля – Нильсена, но без кипячения)
tsutsugamushi – лихорадка цуцугамуши вшей, клещей, блох и др. ― рубиново-красные на голубом
2. Семейство: Bartonellaceae Род: Bartonella 3. В желточном мешке куриного фоне цитоплазмы клетки хозяина.
Bartonella quintana ― возбудитель эмбриона. 3.по Граму ― грамотрицательны.
волынской лихорадки 4. На клеточных культурах.
10
Особенности структуры и
Микроорганизм Способы выявления
жизнедеятельности
4. Хламидии ― грамотрицательные Облигатные внутриклеточные 1.Окраска по Романовскому-Гимзе:
кокковидные бактерии, облигатные паразиты, не растущие на пурпурные на фоне голубой
внутриклеточные паразиты, не питательных средах. В отличие от цитоплазмы клетки.
синтезирующие АТФ (энергетические риккетсий существуют в 2 х 2.Метод РИФ : обработка мечеными
паразиты). Царство: Procaryotae ; Отдел: формах: активной (заразной)- флюорохромами сыворотками -
Gracilicutes; Порядок: Chlamydiales ; элементарное тельце и люминисценция.
Сем-во: Chlamydiaceae 1.Род: Chlamydia пассивной (репродуцирующей) 3.Цитологическое обнаружение
Вид: Chlamydia trachomatis ― возбудитель ретикулярное тело. Вызывают внутриклеточных включений -
трахомы, коньюктивитов и венерического поражения глаз, урогенитального приядерных шапочек (метод
лимфогранулематоза. тракта, легких и др. инфекции. Туревича, Муромцева и др. ).
2.Род: Chlamydophila: Вид C. psittaci ―
возбудитель орнитоза; Вид C. pneumoniae
― возбудитель пневмонии
5. Микоплазмы мелкие сферические или Произошли от грамположительных 1 Молекулярно-генетические
овоидные клетки диаметром 0,2 мкм.. бактерий утративших клеточную методы по ДНК.
Царство: Procaryotae; Отдел: Tenericutes; стенку в результате мутации. Роль 2. Культивирование:
Класс: Mollicutes; Порядок: клеточной стенки выполняет а) на плотных питательных средах
Mycoplasmatales ;Сем-во: Mycoplasmataceae цитоплазматическая мембрана, (уреаплазмы растут виде «яичницы
1.Род: Mycoplasma Виды: M. pneumoniae ― отличающаяся высоким – глазуньи»);
возбудитель. пневмонии и M. hominis ― содержанием стеролов. Способны б) на жидких изменяют цвет
возб. урогенитальных инфекций. 2. к размножению. Чаще всего это индикатора из-за биохимической
Род: Ureaplasma; Вид U. urealyticum – клетки сферической формы. активности.
возбудитель урогенитальных инфекций Воспалительные процессы 3.Электронная микроскопия или
вызываемые микоплазмами - цитоиммунно-элетронная
причина преждевременных родов, микроскопия.
мужского и женского бесплодия и
6. Протопласты и сферопласты бактерии Сферопласты - Можно наблюдать в виде
лишенные клеточной стенки и не грамотрицательные - бактерии шаровидных или нитевидных
способные к размножению. Возникают частично лишены клеточной клеток при микроскопии в темном
при обработке ферментами или стенки (слоя пептидогликана), поле препаратов, приготовленных
антибиотиками, разрушающими наружная мембрана сохраняется. из питательной среды, при условии
пептидогликан (например, лизоцимом - Протопласты – сбалансирования осмотического
ферментом, содержащимся в яичном белке, грамположительные бактерии, давления внутри клетки с
слезной жидкости или пенициллином) . В полностью лишенные клеточной давлениием питательной среды.
живых организмах переходят в L-формы. стенки.
7. L-формы – это способные к Осмотически чувствительные, 1. Культивируют на средах с
размножению сферо- или протопласты, шаровидные или колбовидные высоким осмотическим давлением.
утратившие способность к синтезу клетки различной величины, часто На плотной среде образуют
пептидогликана под влиянием антибиотиков проходящие через бактериальные колонии, врастающие в агар и
или других факторов в живых организмах . фильтры. При удалении фактора, напоминающие форму
приведшего к изменениям, перевернутой шляпы.
реверсируют в исходную 2. Микроскопия мазков из чистых
бактериальную клетку с культур в темном поле –
восстановлением вирулентности, шаровидные, нитевидные клетки
приводя к рецидиву болезни. Не содержащие т крупные вакуоли.
чувствительны к препаратам,
действующим на клеточную
стенку

11
ЗАНЯТИЕ № 4
ТЕМА: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ (КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ)
МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Питание бактерий. Питательные вещества – источники углерода и азота. Классификация бактерий по типам
питания. Аутотрофы и хемоорганотрофы. Факторы роста и их источники. Источники минеральных элементов.
Способы и механизмы переноса питательных веществ через мембрану.
2. Энергетические потребности бактерий. Пути получения энергии у аутотрофов (фотосинтез, хемосинтез). Источники
и пути получения энергии у хемоорганотрофов.
3. Аэробный и анаэробный типы биологического окисления у бактерий. Аэробные, анаэробные, факультативно
анаэробные и микроаэрофильные бактерии. Способы создания анаэробных условий.
4. Задачи, этапы, преимущества и недостатки бактериологического (культурального) метода исследования.
5. Рост и размножение микроорганизмов. Способы размножения. Бинарное (простое) деление, механизм.
Размножение бактериальных популяций.
6. Принципы и методы культивирования бактерий. Питательные потребности микробов. Питательные среды для
культивирования бактерий. Требования к питательным средам. Классификация питательных сред.
7. Условия и техника культивирования бактерий. Техника посева на питательные среды. Закономерности и характер
роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.
8. Способы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Свойства, используемые для идентификации
выделенных культур.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Бактериологический (микробиологический ) метод исследования – метод выделения чистой


культуры микроорганизмов на питательных средах с целью идентификации (определения) вида

Чистая культура – совокупность микроорганизмов одного вида .


Колония - видимые невооруженным взглядом скопления микроорганизмов на поверхности или в
толще плотной среды;

Штамм – идентифицированная чистая культура микроорганизмов выделенная из того или иного


источника (организма, внешней среды);

Классификация питательных сред.

1. По консистенции: жидкие (мясо- пептонный бульон, желчный, сахарный бульон), плотные


(добавляют 2- 3% агара) и полужидкие (0,15- 0,7 % агара) среды.

2. По происхождению: Естественные – из молока, мяса. яиц, картофеля, сыворотки крови


человека, животных и др продуктов; Искусственные – а) натуральные из смеси питательных
веществ с универсальным источником азота и углерода – пептоном ( продукт неполного
расщепления белка пепсином) или гидролизатом ( казеиновым, дрожжевым). б) синтетические c
точным химическим составом (Сотона для микобактерий, 199 для клеток).

3. По составу: простые - питательные среды (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный
агар- МПА) и сложные МПА или МПБ + добавки каких либо компонентов, например кровяной агар
- КА это МПА +5- 10% крови барана

4. По целевому назначению:
1.Общего назначения - универсальные , предназначенные для культивирования любых
микроорганизмов (МПА, КА );
2.Специальные для выращивания микроорганизмов не растущих на универсальных средах
(например, среда: Левенштейна – Йенсена для микобактерий возбудителей туберулеза);
элективные (селективные) для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления
роста сопутствующих – (солевой агар для стафилококков c 10% NaCl);
12
дифференциально-диагностические (ДДС) - среды, позволяющие дифференцировать
(различать) виды микроорганизмов по ферментативной активности; В состав этих сред входят:
1)МПА или КА); 2)дифферецирующий фактор - химический субстрат (например, углевод), различное
отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба.3) Индикатор,
изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции. (это среды Эндо,
Плоскирева, Гисса и другие).
дифференциально-селективные (ДС) - среды, позволяющие выделять бактерии
определенного вида по их физиологическим особенностям. Содержат: 1) МПА 2) элективный
химический субстрат, препятствующий росту других видов бактерий.; 3.) Индикатор, изменение
цвета которого свидетельствует о биохимической реакции. (например, желточно-солевой агар
(ЖСА) для выделения стафилококков).
3.Хромогенные питательные среды позволяют выявить ферментативные активность
специфическую для разных микроорганизмов. Поэтому идентификация микроорганизмов возможна
уже на этапе первичного посева по изменению цвета индикатора что ускоряет исследование
(например на среде Рамбах кишечная палочка образует колонии синего цвета, а сальмонеллы
красного.);
4.Среды обогащения применяют для размножения и накопления бактерий определенного вида в
клиническом материале ( например 20% желчный бульон среда обогащения для сальмонелл при
выделении их из крови.);
5.Транспортные и консервирующие среды применяют для забора и доставки (консервации)
клинического материала , например универсальная среда Амиеса (полужидкий агар+уголь
активированный).)сохраняет неизменным клинический материал 48 часов, что позволяет
доставить его в любую лабораторию современного мира.

Питательные среды (написать состав сред):


Среда Эндо Тип среды дифференциально-диагностическая для энтеробактерий Питательная
основа МПА Дифференцирующий фактор лактоза 1%. Индикатор основной фуксин, обесцвеченный
сульфитом натрия. Е.сoli разлагают лактозу до кислоты – колонии красные с металлическим
блеском, патогенные энтеробактерии не разлагают лактозу поэтому колонии бесцветные ;

Среда Левина Тип среды дифференциально-диагностическая для энтеробактерий Питательная


основа МПА Дифференцирующий фактор лактоза 1% Индикатор эозин-метиленовый синий. Е.сoli
разлагают лактозу до кислоты –колонии сине-фиолетовые с зеленым блеском, колонии патогенных
бактерий бесцветные;

Среда Плоскирева Тип среды дифференциально-селективная для шигелл (дизентерия) и сальмонелл.


Питательная основа- МПА. Элективный фактор - соли желчных кислот Дифференцирующий
фактор лактоза. Индикатор нейтральный красный. Е.сoli не почти не растут из-за солей
желчных кислот . Единичные растущие Е.сoli разлагают лактозу до кислоты – колонии красные;
колонии шигелл бесцветные, сальмонелл бесцветные или с черным центром, так как сальмонеллы
способны образовывать сероводород;

Солевой агар Тип среды селективная для стафилококков.. Питательная основа МПА Элективный
фактор хлористый натрий 10% . При такой концентрации соли растут только стафилококки

Солевой бульон Тип среды Селективная для стафилококков Питательная основа МПБ Элективный
фактор хлористый натрий 10% . При такой концентрации соли растут только стафилококки

Кровяной агар Тип среды универсальная, сложная по составу. Питательная основа МПА +5- 10%
крови барана. Позволяет культивировать все микроорганизмы, растущие на питательных средах;

Желточно-солевой агар Тип среды дифференциально-селективная для S. aureus._Питательная


основа МПА. Элективный фактор хлористый натрий 10% .Дифференцирующий фактор яичный

13
желток .S. aureus имеет фермент – лецитовителлазу, разрушающий лецитин желтка, поэтому
колонии S. aureus окружены «радужным» венчиком из липидов в отличие от других стафилококков

Этапы выделения чистых культур аэробных бактерий


► 1-й этап: 1 день
а) забор материала для исследования;
б) транспортировка, хранение, подготовка к исследованию;
в) приготовление мазков из патологического материала, окраска по Граму и микроскопия;
Мазок из г) посев патологического материала на плотные
патологического пластинчатые питательные среды (лучше ДДС или
материала селективные) с целью получения изолированных
Окраска по Граму колоний. Инкубация в термостате.
Увеличение
7х90=630 раз

► 2-й этап : 2 й день


а) изучение характера роста изолированных колоний на средах (культуральные признаки) с целью
отбора подозрительных колоний; приготовление мазков из подозрительных колоний (окраска по
Граму);
б) пересев оставшейся части колоний на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.
Инкубация в термостате. Изучение подозрительных колоний (эшерихий, стафилококка)

Изучаемые культуральные 1-й тип колоний 2-й тип колоний


свойства стафилококка эшерихий
- форма колонии круглые круглые
- размер колонии средние (размером 2-4 мм) крупные,
- цвет белые серые
- характер края с ровными краями с ровными краями
- характер поверхности выпуклые плоские

Приготовление мазков из отобранных колоний (окраска по Граму).


Морфология микроорганизмов из изолированных колоний (окраска по Граму)

Мазок колонии 1 типа Мазок колонии 2 типа


Окраска по Граму Окраска по Граму
Увеличение 7х90=630 Увеличение 7х90=630 раз
раз

► 3-й этап:
Идентификация выделенных чистых культур:
а) морфологические и тинкториальные свойства (приготовление мазка со скошенного агара, окраска по
Граму, при необходимости – другие способы окраски);
б) культуральные свойства;
в) биохимические свойства;
г) антигенные свойства.
Также в ряде случаев проводится определение чувствительности культуры к антибиотикам.

► Заключение: указывается вид выделенного микроорганизма, при необходимости указываются


результаты по чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

Этапы выделения чистых культур анаэробных бактерий


► 1-й этап: 1 день
а) забор материала для исследования;

14
б) транспортировка, хранение, подготовка к исследованию;
в) приготовление мазков из патологического материала, окраска по Граму и микроскопия;
г) посев патологического материала на жидкие питательные среды для анаэробов. Инкубация в
термостате в анаэробных условиях.

► 2-й этап: 2 день


а) изучение характера роста на жидких средах, приготовление мазков, окраска по Граму, микроскопия;
б) пересев на плотную пластинчатую питательную среду с целью получения изолированных колоний.
Инкубация в термостате в анаэробных условиях.
► 3-й этап: 3 день
а) изучение характера роста изолированных колоний на средах (культуральные признаки) с целью отбора
подозрительных колоний, приготовление мазков из подозрительных колоний (окраска по Граму);
б) пересев оставшейся части колонии в жидкую питательную среду с целью накопления чистой культуры.
Инкубация в термостате в анаэробных условиях.
► 4-й этап:
Идентификация выделенных чистых культур:
а) морфологические и тинкториальные свойства (приготовление мазка, окраска по Граму);
б) культуральные свойства;
в) биохимические свойства;
г) антигенные свойства;
д) определение токсигенности.
Также в ряде случаев проводится определение чувствительности культуры к антибиотикам.
► Заключение: указывается вид выделенного микроорганизма, при необходимости указываются
результаты по чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

Методы создания анаэробиоза:


Физический Химический Биологический
Удаление кислорода воздуха физическим Удаление кислорода Удаление кислорода воздуха биологическим
путем: воздуха химическим путем:
1.откачиванием воздуха, затем введение путем: 1. Метод Фортнера – совместное
безкислородной газовой смеси ( N2- 85%, 1.Применение пакетов культивирование строгих аэробов и анаэробов
CO2- 10%, H2- 5%); с солями железа или (аэробы поглощают кислород и создают
2. кипячением питательных сред; пластика, условия для размножения анаэробов.
3. посевом в глубокий столбик агара; поглощающих Применяют аэроба – синегнойную палочку
4.заливкой сред вазелиновым маслом для атмосферный кислород (P.aeruginosa)
сокращения доступа кислорода; до необходимых 2. Поглощение кислорода при окислении
5. использованием флаконов и пробирок, концентраций; тканей - жидкая среда Китта- Тароцци
шприцев с инертным газом; содержащая МПБ, 0,5 % глюкозы и кусочки
6.использованием эксикаторов с горящей печени при окислении которых кислород
свечой. поглощается в пробирке с предварительно
прокипяченой и залитой вазелиновым маслом
после посева средой.

Питательные среды для культивирования анаэробных бактерий:


1.Среда Вильсона-Блера (пробирки или чашки): Питательная основа МПА Дыхательный субстрат
глюкоза. Редуцирующий фактор сульфит натрия и двуххлористое железо сульфит-натрия Na2SO3 →Na2S.
Клостридии образуют на этой среде колонии чёрного цвета за счет восстановления сульфита до сульфида,
который соединяясь с катионами железа (II) дает соль чёрного цвета. Черные колонии появляются в глубине
агарового столбика.
2.Тиогликолевая среда (среда для контроля стерильности): (пробирки):Питательная основа МПБ
Дыхательный субстрат глюкоза Редуцирующий фактор тиогликолят натрия Индикатор резазурин (в
присутствии 02 среда краснеет)
3.Глюкозо-кровяной агар Цейсслера: (чашки): Питательная основа МПА, кровь Дыхательный
субстрат глюкоза Редуцирующий фактор гемоглобин
4.Среда Кита-Тароцци: (пробирки):Питательная основа МПБ Дыхательный субстрат глюкоза
Редуцирующий фактор кусочки печени
5.Сахарный агар: Питательная основа МПА Дыхательный субстрат глюкоза

15
Схема микробиологического исследования с определением чувствительности к
антимикробным препаратам диско-диффузионным методом (бумажными дисками,
содержащими АМП)

1Й-
ДЕНЬ

1. Доставка образцов материала от больного, приготовление и окраска мазков; 2)Микроскопия мазка из образца для
выбора питательной среды для выращивания бактерий; 3) посев исследуемого материала на питательную среду в
чашку Петри.
Культивирование ( выращивание) 16-18 часов при + 37 °С в термостате

2Й-
ДЕНЬ

1)Выбор 1-2 колоний болезнетворной бактерии 2) пересев пробирку для получения чистой культуры бактерий в
количестве, необходимом для постановки тестов.
Культивирование 16-18 часов при + 37 °С в термостате

3Й-
ДЕНЬ

1) 2) 3) 4)
1)Постановка биохимических тестов для определения вида; 2)Приготовление взвеси в 0,9 % р-ре NaCl по стандарту
мутности McFarld → содержащей 150 млн. микробов в 1 мл или 0,5 ЕД McFarld ;3)Нанесение взвеси (посев) бактерий
на среду для определения чувствительности – среду Мюллера-Хинтона; 4) Постановка бумажных дисков с АМП на
чашку со средой Мюллера-Хинтона с посевами бактерий
Культивирование 16-18 часов при + 37 °С в термостате

4Й-
ДЕНЬ

1)Определение вида бактерии по биохимическим тестам 2) Измерение диаметров задержки роста бактерий
вокруг дисков с АМП и определение чувствительности по таблицам;3)Выдача результатов
Чувствительные S - (susceptible, англ.) к антибиотику бактерии не имеют механизмов резистентности→ терапия успешна при
использовании обычных доз; Устойчивые R- (resistant, англ.) бактерии имеют механизмы резистентности→ нет эффекта от
терапии при использовании даже максимальных доз; Промежуточные I (intermediate, англ.) субпопуляци бактерий, находящиеся
между чувствительной и резистентной→ терапия успешна при использовании максимальных доз или при локализации инфекции в
местах, где АМП накапливается в высоких концентрациях

16
ЗАНЯТИЕ № 5ТЕМА: БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДЫ
ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ.
БАКТЕРИОФАГИЯ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Ферменты бактерий, классификация. Способы изучения биохимических свойств микроорганизмов. Практическое
использование биохимической активности в идентификации бактерий
2. Определение сахаролитических свойств, состав сред Гисса; определение протеолитических свойств, определение
каталазной и оксидазной активности.
3. Принцип работы и особенности применения приборов автоматической идентификации бактериальных культур
(гемокультиватор, автоматический анализатор).
4. Особенности культивирования риккетсий и хламидий.
5. Бактериофаги (фаги). История открытия. Морфология, структурные особенности, химический состав и свойства
фагов.
6. Вирулентные фаги. Фазы взаимодействия с бактериальной клеткой. Результаты взаимодействия фага и клетки.
Умеренные фаги. Профаг. Явление лизогении. Фаговая конверсия.
7. Методы выделения и титрования бактериофагов на плотных и жидких питательных средах.
8. Применение фагов в микробиологии и медицине. Фагодиагностика и фаготипирование.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

1►Изучение биохимических свойств микроорганизмов для идентификации чистой культуры бактерий.


Способы изучения биохимических свойств бактерий:
1. "Пестрый ряд" Гисса («пробирочный» классический тест):
Состав среды Гиса: 1% пептона +0,5% NaCl+0,4% ага-агар+ 1% углевода+ 1% индикатора (
например бромтимоловый синий синий, если образуется кислота - к+-желтый;
Принцип действия при разложении образуется К или КГ
Учет результатов биохимической активности эшерихий и стафилококка на "пестром ряду" Гисcа:
Сахара (определение сахаролитических ферментов) МПБ (определение протеолитических ферментов)
Лак- Глю- Манн- Маль- Саха Индол - индикаторная Сероводород
тоза коза нит тоза -роза бумага пропитана индикаторная бумажка
раствором щавелевой пропитана уксуснокислым
кислоты (при выделении свинцом (при выделении
индола - она краснеет) Н2S - она чернеет)
E.coli КГ+ КГ+ КГ+ - - +
S. aureus К+ К К К К + -

2. Определение каталазной активности:


Принцип метода Катала́за (оксидоредуктаза) фермент, катализирующий реакцию разложения
перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: Н2О2 + Н2О2 = О2 + 2Н2О.
Результат: при внесении в каплю 3% перекиси бактерий, имеющих каталазу (стафилококки,
эшерихии) образуются видимые пузырки из выделяющегося кислорода. Если внести бактерии не
имеющих каталазы (стрептококки) пузырьки не образуются.
Каталаза нейтрализует перекись водорода, как эндогенного
происхождения, образующейся в результате аэробного окисления, так и
экзогенного характера, вырабатываемой клетками иммунной системы
хозяина, кроме того, каталаза участвует в окислительном
фосфорилировании. Поскольку стафилококки и энтеробактерии
продуцируют каталазу, перекись водорода, образующаяся как метаболит
при аэробных условиях, для них не токсична.

3. Определение оксидазной активности (Оксидаза фермент катализирующий


конечный этап переноса элетронов на кислород в процессе окислительного
фосфорилирования (дыхания) у аэробов).
Принцип метода: при нанесение бесцветного реактива тетраметил-п-
фенилендиамина дигидрохлорида на бактерии, имеющие оксидазу
(синегнойная палочка, нейссерии) он окисляется и приобретает темно-
фиолетовый цвет (синеет). Если бактерии не имеют оксидазы (E.coli и
др. энтеробактерии ) цвет реактива не изменяется
17
3. Система индикаторная бумажная – СИБ.
Принцип действия: бумажки содержащие углевод + индикатор, помещают в пробирки с физ. р-ром – вносят
взвесь микроорганизмов при разложении образуется К или КГ

4. Планшетные тест-системы – это системы с лиофильными субстратами и индикаторами в микроемкостях


(лунках) в виде специальных планшетов (панель биохимической дифференцировки энтеробактерий – ПБДЭ).
Принцип действия из 1-2 колоний выросших на
питательной среде микроорганизмов готовят взвесь в
физиологическом растворе, которую вносят в лунки ;
при разложении субстратов и образовании кислоты
изменяется цвет индикатора в лунке +, - цвет не
изменяется. Учитывают по кодовым таблицам.

Учет результатов биохимической активности бактерий может проводиться визуально (с помощью


кодовых карточек) или с помощью автоматических анализаторов (например, ATB-expression см далее).
Принципы работы анализатора: - колориметрический для биохимической идентификации бактерий и
грибов; - турбидиметрический для определения антибиотикочувствительности.

2►5.Автоматизация микробиологических исследований


1.Бактериологические анализаторы предназначены для идентификации и определения чувствительности
микроорганизмов

1. Анализаторы биохимической активности (учитывают реакции на панелях)

ATB Expression (BioMerieux,Франция) VITEK 2 Compact (BioMerieux,Франция)


1991-2012 (снят с производства) С 2001 по настоящее время
2. Анализаторы молекулярно-генетического
3. Анализаторы масс-спектров белковых молекул
строения генома.

ПЦР - Амплификатор Corbett Масс –спектрограф MALDI Biotyper


С 2003 по настоящее время С 2009 по настоящее время
18
2. Система контроля стерильности Bact/Alert (гемокультиватор)

Гемокультиваторы предназначены для выделения микроорганизмов из


крови и других стерильных жидкостей. Принцип их работы основан
на автоматизированном выявлении роста микроорганизмов в образцах
крови, помещенных во флакон со специальной средой по индикации
образующегося СO2 с помощью флюоресценции или
колориметрически. Работой системы управляет компьютер. Ход
исследования: образец шприцом вносят во флакон со средой,
помещают в ячейку инкубационного блока (в одном блоке 60 ячеек) и
инкубируют при температуре 37°С, каждые 10-15 минут
автоматически определяя микробный рост во флаконе по изменению
цвета индикаторного диска на дне флакона. При появлении роста
микроорганизмов срабатывает звуковая и световая индикация, флакон
извлекают из аппарата для дальнейшей работы – выделения чистой
культуры и ее идентификации.

3► Бактериофа́ги или фа́ги (от др.-греч. φᾰγω «пожираю»)


— вирусы, избирательно лизирующие бактериальные клетки
применяют для индикации и идентификации бактерий. Для
бактериофагов характерна строгая специфичность, что может
выражаться в способности лизировать бактерии только одного
вида - видовая специфичность, либо внутри вида – типовая
специфичность. По конечному результату взаимодействия с
клеткой все фаги можно разделить на вирулентные и
умеренные.

Схема выделения, индикации и идентификации бактериофага


1. Этап ВЫДЕЛЕНИЕ ФАГА: Фильтрация исследуемого материала через бактериальные фильтры,
нагревание до 75°С и /или обработка хлороформом с целью устранения сопутствующей микрофлоры
2. Этап ИНДИКАЦИЯ ФАГА: полученный фильтрат вносят: а) в пробирку с бульонной культурой
микроорганизма (например E.coli) к которому мы хотим выделить вирулентный бактериофаг; б) на чашку с
МПА засеянной микроорганизмом:

19
А) на жидких
Б) на плотных
питательных
средах; зоны
среда лизиса
просветление
свидетельствуют
бульона
о присутствии
свидетельствует о
фагов
присутствии фагов

3 ЭТАП ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФАГА в исследуемом фильтрате качественными пробами по методам


Фишера, Фюрта, и Отто ( «стекающая капля »).

3.1 Метод Фишера (идентификация) 3.2 Метод Фюрта (идентификация)


Неизвестный фаг наносится на поверхность 1. S.flexneri Неизвестный фаг вносится в расплавленный и
засеянной на МПА культуры микроба (дизентерия) остуженный агар, на который штрихом
2. S.sonnei засевают культуры микроба
(дизентерия)
3. S. Typhi
( брюшной тиф )
4. E.coli

Зона лизиса

Отсутствие
роста

Вывод : это бактериофаг E.coli


Вывод : это бактериофаг S.sonnei

3.3 Метод «стекающей капли» по Отто (идентификация )

На чашку с МПА засевают газоном кишечную палочку и


пипеткой наносят исследуемый фильтрат. Инкубация в
термостате.

Вывод: исследуемый фильтрат содержит бактериофаг E.coli

E.coli (газон) лизис культуры

4ЭТАП ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ И АКТИВНОСТИ ФАГА


Титрование это определение количественного содержания бактериофага в исследуемом
материале. Для этого пользуются двумя показателями: количеством активных частиц
бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, или величиной наибольшего
разведения, при котором бактериофаг проявляет свое литическое действие. Полученную при этом
величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разведение фага.

4.1 Определение титра активности фага в жидкой питательной среде (пробирках) по


Аппельману основано на внесении различного количества титруемого бактериофага в бульон,
засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов, с целью получения феномена
бактериофагии.
20
Разве-
дения 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 КК КФ
фага
Лизис Лизис Лизис Лизис Лизис Лизис Лизис Лизис Мут Мут Муть- Лизи
Лизис + + + + + + + + ь- ь-- -- с
+
Результат: (+) - фаголизис индикаторного штамма ; - муть -рост индикаторного штамма
Вывод: Титр активности бактериофага равен 10-8

3.2 Определение количества фага методом агаровых слоев по Грациа


Количество бактериофагов выражают в количестве бляшкообразующих
единиц на 1 мл исследуемого материала (БОЕ / мл). Бляшки – это зоны
отсутствия роста бактерий в местах нанесения фага. Для расчета
содержания количества бактериофагов в 1 мл фаголизата необходимо
умножить количество негативных колоний в газоне индикаторной
бактериальной культуры на разведение исследуемого материала.
Пример расчета: на чашке Петри из 1мл разведения 10-3 образовалось 43
негативных колонии (бляшек). В 1мл фаголизата содержится 43 х 10
3
=43 000 фаговых частиц, т.е концентрация бактериофагов в
фаголизате 43 000 БОЕ / мл

Практическое использование бактериофагов:


1.Фаготерапия и фагопрофилактика - кишечных инфекций (фаги дизентерийный,
сальмонеллезный, брюшнотифозный; гнойно-воспалительных заболеваний ( стафилококковый,
стрептококковый, синегнойный, протейный, клебсиеллезный, коли-фаг). Комбинированные фаги
коли-протейный, пиобактериофаг (против стафилококков, стрептококков, клебсиелл, протея,
синегнойной и кишечной палочек), интести-фаг (против шигелл, сальмонелл, стафилококков,
энтерококков, кишечной и синегнойной палочек, протея).
2.Фагодифференцировка для дифференциации бактерий, cхожих по биохимической активности
(например сальмонелл и бактерий рода Citrobacter).
3.Фаготипирование для выявления источника инфекции при стафилококковых инфекциях и
брюшном тифе, так как фаги штаммоспецифичны и лизируют бактерии происхождением из одного
источника

Фаготипирование стафилококков набором из 21 фагов


Культура стакфилококка засевается в бульон, инкубируется три часа, а затем пересевается «газоном» на чашки с МПА. Дно
чашки предварительно разграфляют на квадраты, количество которых соответствует числу фагов .
Стандартный набор включает 21 фаг (80, 79, 52А, 52, 29, 71, 55, 3С, 3В, 3А, 53,47,42Е, 7, 6, 42Д, 77,75,
83А, 54, 81, 187.
Засеянные чашки подсушивают при температуре 37° в течение 30—40 минут, затем петлей наносят каплю
соответствующего фага всегда в одном и том же порядке.
После -высыхания капель фагов чашки помещают в перевернутом
положении на 5—6 часов в термостат (температура 37°) и до утра
оставляют при комнатной температуре. Учет результатов производят
простым глазом и при помощи лупы, отмечая номер фага, давшего лизис
на + + и выше, а в скобках отмечают номер фага, давшего лизис на +.

21
Штамм N1 S. aureus 3В/53/81; Штамм N2 S. aureus 3В/42E/187
На штаммы S.aureus, посеянные газоном, в квадраты нанесены капли индикаторных стафилококковых
фагов (21 фаг).
Разные фаготипы стафилококков свидетельствуют о разных источниках заражения, одинаковые о
едином источнике. (Например, совпадение фаготипа стафилококков, выделенных из послеоперационной
раны и с поверхности хирургического инструмента или с рук хирурга указывает на источник инфекции.)

История открытия бактериофагов.

В 1896 г. русский Владимир Ааронович Хавкин обнаружил антимикробную активность


водных образцов из рек Индии. Эти препараты, предварительно пропущенные через бактериальные
фильтры, ингибировали рост культуры холерного вибриона.
В 1898 г. русский Н.Ф. Гамалея наблюдал растворение культуры возбудителя сибирской
язвы под действием фильтрата этого микроорганизма и назвали его (фильтрат) бактериолизином.
В 1915 г. англичанин Эдвард Творт описал агент, проходящий через бактериальный фильтр и
вызывающий лизис стафилококков.
В 1917 г. француз Феликс Д'Эррель – обнаружил феномен литического действия фильтрата
испражнений переболевшего дизентерией, что выразилось в просветлении бульонной культуры и
образовании «стерильных пятен» на агаровой культуре возбудителя. Он назвал это явление
бактериофагией, а литический агент, способный размножаться на гомологичных бактериях, -
бактериофагом (от лат. phagos - пожираюший бактерии). В книге "Бактериофаги" (1922)
Д'Эррель рассмотрел природу фага, методы его выделения.

22
ЗАНЯТИЕ № 6 ТЕМА: ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Наследственность. Организация генетического аппарата у бактерий (нуклеоид, плазмиды, IS-последовательности,
транспозоны). Принципы функционирования бактериального генома. Организация оперона. Генотип и фенотип.
2. Плазмиды, классификация, структура и свойства плазмид. R-плазмида, особенности структуры и функции. Плазмиды
бактериоциногении.
3. Изменчивость микробов. Модификации у бактерий, значение, основные проявления и свойства
(ненаследственный характер, адаптивность, высокая частота прямых и обратных изменений, множество
индуцирующих факторов).
4. Генотипическая изменчивость. Мутации и их классификация. Мутагены. Фенотипические проявления мутаций.
Судьба мутантов. Диссоциация у бактерий. Влияние отбора. Система репарации повреждений генома.
5. Рекомбинационная изменчивость. Механизмы образования комбинированных геномов. Частота изменений
отдельных признаков. Трансформация, трансдукция, конъюгация.
6. Практическое значение знаний о генетике микробов. Принципы генетического картирования.
7. Методы генетического анализа (молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция ПЦР,
секвенирование).
8. Понятие о генной инженерии и использование ее методов в микробиологии и биотехнологии. Получение и
применение генно-инженерных вакцин и цитокинов.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА


1► Исследование H- и О- модификаций Proteus vulgaris на МПА с фенолом и без него.
Модификационная изменчивость культуральных свойств штамма Proteus vulgaris.
Чашки с МПА (одна с фенолом, другая без фенола) засеваются штриховым методом культурой
Proteus vulgaris. Учет результатов проводится через сутки после посева.
МПА без фенола МПА с фенолом

Н-форма подвижна О-форма неподвижна

Вывод: Фенол вызывает модификационную изменчивость Proteus vulgaris


2►Изучение и описание S- и R- форм колоний энтеробактерий на пластинчатом МПА.
Сравните культуральные свойства энтеробактерий в S- и R- форме:
S-колония - (англ. Smooth — гладкий) – колония с гладкой
поверхностью, ровными краями ;
$
R- колония (англ. rough — неровный) — колония с неровными
краями и шероховатой поверхностью.
3► Выявление ауксотрофных мутантов методом отпечатков
(реплик).Взвесь бактерий обрабатывают мутагеном (УФО) и
разведения засевают на чашки с МПА. После инкубации выросшие
колонии переносят с помощью репликатора на чашки с МПА и
минимальным агаром. После инкубации в термостате производят
сравнение роста колоний на обычном и минимальном агаре. Отсутствие роста колоний на минимальном агаре
соответствует расположению колоний ауксотрофных мутантов на полноценном МПА.
На рисунке колонии ауксотрофных мутантов обведите красным карандашом.
23
МПА Минимальный агар

Вывод: Штаммы 1-3(обведены) - АУКСОТРОФЫ (от греч. auxo - выращиваю - увеличиваю и


trophe - пища, питание), микроорганизмы, утратившие способность синтезировать одно из
веществ, необходимых для их роста (аминокислоту, витамин или др.). Без добавления в
питательную среду этого вещества ауксотрофы не растут.

4►Изучение роста лактозоположительных и лактозоотрицательных колоний E.coli на


среде Эндо.

ЛАК +

ЛАК-

Укажите формы изменчивости модификационная изменчивость

5►Учет опытов по трансформации, трансдукции, конъюгации.


1.Опыт по трансформации:
Трансформация передача генетической информации (ДНК) между бактериальными клетками
через внешнюю среду.
Донор (указать генотип) E.coli TRP+
Материал
Реципиент (указать генотип) E.coli TRP-
исследования
Среда без триптофана растут только E.coli TRP+
Приготовить смыв реципиентной культуры. Смыв внести в две
пробирки. В пробирку №1 добавить физраствор (контроль). В пробирку
Ход исследования
№2 внести ДНК, выделенную из культуры донора. Инкубация в
термостате. Пересев из обеих пробирок на среду без триптофана.
Рекомбинат (указать генотип) E.coli TRI+растет на среде без
Учет опыта триптофана Пример трансформации: Капсулообразование у
пневмококков

24
2.Опыт по трансдукции:

ТрансдукциЯ передачА генетической информации (ДНК) между бактериальными клетками с


помощью фагов.
Донор (указать генотип) E.coli Лак +
Материал исследования Реципиент (указать генотип) E.coli Лак -
Среда Эндо растут E.coli Лак-
Приготовить смыв реципиентной культуры (E.coli). Смыв
внести в две пробирки. В пробирку №1 добавить физраствор
Ход исследования (контроль). В пробирку №2 внести фаголизат из культуры
донора. Инкубация в термостате. Пересев из обеих пробирок
на среду Эндо.
Учет опыта (сделать рисунок)

Лак +
Рекомбинат (указать генотип) E.coli

Пример трансдукции
Способность продуцировать токсин у коринебактерий
дифтерии

3.Опыт по конъюгации:
Конъюгация передача генетической информации (ДНК) между бактериальными клетками путем
непосредственного контакта.
Донор (указать генотип) ) E.coli TRP+, Leu+
Материал
Реципиент (указать генотип) E.coli TRP-, Leu-
исследования Среда без триптофана и лейцина растет только E.coli TRP+, Leu+
Приготовить смыв реципиентной культуры. Смыв внести в две пробирки. В
пробирку №1 добавить физраствор (контроль). В пробирку №2 внести смыв
Ход исследования
культуры донора. Инкубация в термостате. Пересев из обеих пробирок на
среду без триптофана и лейцина
Рекомбинат (указать генотип) растет рекомбинант E.coli TRP+, Leu+
Учет опыта Пример коньюгации: Способность бактерий передавать гены
резистентности

6► Определение бактериоциногенности культур микроорганизмов.


Бактериоцины - вещества белковой природы - антибиотики с узким (видовым) спектром действия;
Бактериоциногенность способность бактерий продуцировать бактериоцины
Бактериоциногенотипирование выявление генов у бактерий способных продуцировать бактериоцины

Бактериоцинотипирование типирование бактерий по способности продуцировать бактериоцины с


целью выявления источника инфекции (например при дизентерии).

25
Принцип метода определения бактериоциногенности: исследуемые культуры бактерий засевают
уколом в чашку с МПА. Выросшие культуры
убивают парами хлороформа. После испарения
хлороформа поверхность агара заливается
расплавленным и остуженным 0,7% МПА,
смешанным с индикаторной культурой. Учет
результатов проводится через сутки после
посева по зонам подавления роста
индикаторной культуры вокруг колоний,
обладающих бактериоциногенностью.

Вывод: Штаммы E.coli № 1-4 несут


плазмиду бактериоциногенности,
образуют колицины подавляющие рост
индикаторного штамма E.coli.

Молекулярно-генетический метод
исследования основан на анализе
нуклеиновых кислот микроорганизмов

Реакция молекулярной
гибридизации (метод ДНК-зондов)
основана на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически
соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с
образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.
Позволяет ыявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного
анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии
генов.
Варианты проведения молекулярной гибридизации. 1). В растворе. 2). В тканевых
срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и
наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят
денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют
детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.3) На микрочипах (эррей гибридизация –
наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч
ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все
гены, присутствующие в ДНК микроорганизма. 4) На мембранах. Изучаемую ДНК фиксируют на
мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые
зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов
регистрируют флюоресценцию.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) разработана в 1983 г. американским биохимиком Кэри


Мюллисом, который в 1993 г. был удостоен за это открытие Нобелевской премии. Метод ПЦР
основан на принципе естественной репликации ДНК и заключается в получении множественных
копий (ампликонов) ДНК размером до 5000 п. о.

Варианты и модификации ПЦР:

1.ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) — используется


для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности РНК. В отличие
от обычной ПЦР вначале реакции на базе исследуемой РНК с помощью обратной транскриптазы
получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этот метод
применяют для обнаружения и идентификации РНК- вирусов.
2. ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ. Real-time PCR, qPCR, qRT-PCR) —
вариант ПЦР включает в себя одновременно детекцию и количественное определение количества
26
копий ДНК в образце. В этом методе используют праймеры меченые флуоресцентным краситетелем
Sybr Green I, который связываясь с двухцепочечной ДНК ПЦР продуктов при облучении синим
лазером испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал.
Таким образом Real-time PCR позволяет определить количество микроорганизмов в
исследуемом материале.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – классический вариант

а) раствор выделенной искомой ДНК; б) смесь четырёх дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов) 


строительный материал ДНК; в) термостабильная ДНК-полимераза  Taq-полимераза (не денатурирует
при 960С), осуществляющая полимеризацию нуклеотидов; ее получают из термофильных
Исходные микроорганизмов Termophilus aquaticus; г) два синтетических праймера (прямой и обратный) 
компоненты короткие, длиной 15  30 оснований, одноцепочечные олигонуклеотиды, которые связываются с
комплементарными структурами исследуемой ДНК и с которых начинается биосинтез множественных
копий; д) специфический буфер: ионы Mg+2, определённые значение рН и концентрации солей,
необходимые для функционирования Taq-полимеразы.
Стадия Т-°С Экспозиция Описание стадии
Большие двухцепочечные молекулы ДНК
Начальная
90–95 3–10 мин раскручиваются с образованием одноцепочечных
денатурация
молекул.
Небольшие двухцепочечные ампликоны
Денату-
90–95 25с – 1 мин раскручиваются с образованием одноцепочечных
рация
Этапы молекул.
каждого 25–40 Праймеры прикрепляются к комплементарным
Отжиг 48–65 25с – 4 мин
цикла ПЦР циклов фрагментам ДНК-матрицы, образуя дуплексы.
ДНК полимераза прикрепляется к 3’-концу праймера,
Элонга-
72 25с – 4 мин соединившегося с ДНК-матрицей, и синтезирует копию,
ция
комплементарную ДНК-матрице.
Конечная
72 510 мин Образуются дуплексы ДНК.
элонгация
Хранение 4 - -
Учет
Выявление продуктов ПЦР методом электофореза и ( или ) флюресценции в УФ.
результатов

Секвенирование - определение нуклеотидной последовательности ДНК. В результате


секвенирования получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной м РНК и
даже полных геномов организмов. Для определения нуклеотидной последовательности больших
фрагментов ДНК используются автоматизированные машины (ДНК-секвенаторы).

Области применения молекулярно-генетического метода:


Клиническая микробиология :
а) идентификация микроорганизмов в патологическом материале без выделения чистой
культуры;
б) определение резистентности к антимикробным препаратам по генам резистентности.
Эпидемиология
a) генотипирование микроорганизмов для выявления источника инфекции.
Клиническая лабораторная диагностика
а) определение отцовства
б) диагностика генных болезней (выявление мутаций)
в) судебная медицина (напр. идентификация личности)
Фундаментальная наука и практика
а) секвенирование (определение нуклеотидной последовательности )
б) клонирование генов
в) генная инженерия (создание трансгенных животных и растений)
г) генная терапия
д) направленный мутагенез

27
ЗАНЯТИЕ № 7 ТЕМА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИОТЕРАПИИ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ. АНТИСЕПТИКА.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ


1. Противомикробные мероприятия. Влияние экологических факторов на микробы. Действие физических факторов
(температуры, высушивания, излучений, ультразвука, осмотического давления). Действие химических факторов.
2. Цели, способы, средства и объекты стерилизации и дезинфекции в медицинской и микробиологической практике.
Контроль качества дезинфекции. Контроль стерилизации и стерильности. Способы проведения.
3. Антисептика. Определение. Антисептические средства, требования, происхождение, свойства, группы, механизмы
действия на микробы. Типы антисептики.
4. Химиотерапевтические препараты. Свойства. Основные группы химиопрепаратов. Механизмы действия на
бактерии. Понятие об избирательности и "мишенях" действия. Органические и неорганические соединения металлов
и металлоидов. Сульфаниламидные препараты. Препараты нитрофуранового ряда. Противогрибковые,
противовирусные, противопаразитарные химиопрепараты.
5. Антибиотики. Определение. Продуценты антибиотиков. Синтетические и полусинтетические антибиотики. Основные
группы антибиотиков по химической структуре.
6. Классификация антибиотиков по механизму действия на бактериальную клетку.
7. Механизмы устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам и другим химиопрепаратам. Техника постановки,
учета и оценки чувствительности методом дисков, Е-теста, серийных разведений. Приборы и тест-системы для
автоматизированного определения антибиотикочувствительности микроорганизмов
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1► Изучения нормальной микрофлоры.
Посев для изучения нормальной микрофлоры кожи рук на среду Эндо и кровяной агар методом реплик.
Принцип метода: стерильные кусочки фильтровальной бумаги 1х1 см в чашке Петри увлажнить стерильным физ.
раствором. Стерильным пинцетом поместить кусочек бумаги на исследуемую поверхность кожи рук на 0,5 мин. Поместить
бумагу на поверхность плотной питательной среды (отпечаток) на 1 мин. Бумагу удалить. Чашки с отпечатками
инкубировать при 370С, 24-48 часов. Провести учет посева микрофлоры, приготовить препараты из разных типов
колоний, окрасить по Граму, микроскопировать (в демонстрационных посевах).
Учет посева микрофлоры Микроскопия препаратов

Препарат со среды
кровяной агар
количество и характер
36 различных Окраска по Граму
колоний на кровяном
колоний Увеличение 90 х
агаре
100

Препарат со среды
Эндо
Окраска по Граму
количество и характер 12 однотипных
Увеличение 90 х
колоний на среде Эндо колоний
100

Стерилизация полное уничтожение на абиотических объектах жизнеспособных микроорганизмов


и их спор (обеспложивание объектов); Способы: физические ( действие высокой температуры,
ионизирующие излучение, фильтрование) и химические (растворами химических веществ ( 6% H2O2, и газовая
(окись этилена, парами формалина).

Дезинфекция уничтожение на абиотических объектах патогенных микробов (обеззараживание объектов.)


Способы: физические (механические (вытряхивание, проветривание, влажная уборка, стирка с моющим
средством); действие высокой температуры (проглаживание утюгом, кипячение, пастеризация); УФО (облучение
бактерицидными лампами); ультразвук) и химические (хлорсодержащие препараты и т.д)

28
Антисептика уничтожение или ограничение роста микроорганизмов в живых тканях; Способы:
физические (хирургическая обработка ран, наложение повязки,) , химические ( 3% H2O2, иод и др.),
биологические (антибиотики, бактериофаги);

Асептика комплекс мероприятий направленный на предотвращение попадания микроорганизмов в


рану, лекарственные препараты, питательные среды.
2► Впишите в таблицу способы и режимы стерилизации указанных объектов:
Стерилизуемые объекты Способы и режимы стерилизации
Бактериологические петли Стерилизация пламенем мгновенно
Стерилизация паром под давлением 2 атм (132ºС)
Перевязочный материал (марля, вата, бинт)
20 минут
Стерилизация паром под давлением 1 атм (121ºС)
Резиновые, пластиковые изделия
45 минут, газовая стерилизация (окись этилена),
Стеклянные изделия Стерилизация сухим жаром 180ºС 1 час
Стерилизация паром под давлением 1 атм (121ºС)
Основные питательные среды (МПА, МПБ)
20 минут
Дробная стерилизация (тиндализация) 56ºС в
Питательные среды, содержащие белок
течение часа 5-6 суток подряд
Растворы, содержащие вещества, которые
Стерилизация фильтрованием, Ɣ излучением
инактивируются при температуре свыше 60оС,

Антимикробные препараты (АМП) это антибиотики и химиотерапевтические препараты


способные избирательно подавлять рост и размножение патогенных микроорганизмов в
организме больного. Антибиотики, в отличие от химиотерапевтических препаратов
(например сульфаниламидов) - это вещества биологического (большинство микробного)
происхождения, а также их полусинтетические или синтетические аналоги.
Методы определения чувствительности бактерий к АМП основаны на задержке роста
микроорганизмов препаратом, присутствующим в ростовой среде в определенной концентрации.
Главным показателем чувствительности микроорганизма к АМП. является величина минимальной
ингибирующей концентрации – МИК т. е. наименьшей концентрации АМП, (мг/л или мкг/мл),
которая in vitro полностью ингибирует видимый рост испытуемого штамма микроорганизма.
Критерием чувствительности является величина терапевтического индекса (Т): Т= МИК/К, где К -
концентрация данного антибиотика (мкг/мл) в очаге инфекции (или в крови) при введении
терапевтических доз препарата. Микроорганизм считают чувствительным, а антибиотик
клинически эффективным, если Т менее 0,3. Значения К определяют при клинических
испытаниях АП и их можно найти в специальных таблицах. Величину МИК определяют
методом серийных разведений или методом диффузии в агар. Поэтому методы определения
чувствительности делятся на 2 группы: методы разведения (в жидкой питательной среде и
разведение в агаре) и диффузионные (с использованием дисков и Е-тестов).

Таблица 1. Критерии интерпретации чувствительности бактерий


Категория Микробиологическая Клиническая характеристика
чувствительности характеристика
Чувствительный Не имеет механизмов Терапия успешна при использовании
(susceptible) резистентности обычных доз
Умеренно- Субпопуляция, Терапия успешна при использовании
устойчивый находящаяся между максимальных доз или при локализации
(intermediate) чувствительной и инфекции в местах, где антибиотик
резистентной накапливается в высоких концентрациях
Устойчивый Имеет механизмы Нет эффекта от терапии при использовании
(resistant) резистентности максимальных доз

29
Чувствительным (Susceptible) считают микроорганизм, у которого нет механизмов
резистентности к данному АМП и при лечении стандартными дозами этого препарата отмечается
хорошая терапевтическая эффективность.
Устойчивым (Resistant) к АМП считают микроорганизм, если он имеет механизмы
резистентности к данному препарату и при лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом,
нет клинического эффекта даже при использовании максимальных терапевтических доз этого
препарата.
Умеренно-устойчивый (Intermediate) микроорганизм занимает промежуточное значение
между чувствительными и устойчивыми штаммами и при лечении инфекций, вызванных данным
возбудителем. Хорошая клиническая эффективность наблюдается только при использовании
высоких терапевтических доз АМП (или при локализации процесса в местах концентрации
антимикробного препарата, например в почках при инфекциях МПС)).
Для определения категорий чувствительности (или резистентности) используют
пограничные концентрации (breakpoint) АП или пограничные значения диаметра зоны задержки
роста микроорганизма.
Пограничные концентрации не являются неизменными величинами. Они пересматриваются, в
зависимости от изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром
критериев интерпретации занимаются химиотерапевты и микробиологи специальных институтов. Ведущими
являются институт клинических лабораторных стандартов США (Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) и Европейский комитет по определению чувствительности к антимикробным
препаратам (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing - EUCAST).
В настоящее время в Беларуси и России для оценки результатов определения чувствительности
бактерий применяются стандарты EUCAST.
Cамым точным методом определения МИК («золотым стандартом» ) является метод серийных
разведений в жидкой питательной среде, который однако, отличается высокой трудоемкостью и
стоимостью. Создание микробиологических анализаторов типа «Vitec 2 (Франция), «Sceptor» (США), в основе
которых заложен этот метод, позволил снизить его трудоемкость, но стоимость исследования остается
достаточно высокой, для того чтобы широко использовать метод разведений в клинической микробиологии.
Из-за высокой стоимости диагностических полосок не получил широкого распространения и метод Е-
тестов. По этой причине наиболее часто для определения чувствительности микроорганизмов в большинстве
практических лабораторий используют диско-диффузный метод определения чувствительности
микроорганизмов, что связано с технологичностью и относительно невысокой себестоимостью исследований.

3► Определение чувствительности разных штаммов стафилококков к антибиотикам методом стандартных


дисков
Антибиотик Диаметр зон подавления роста, мм Характеристика штамма (Ч, УУ, У)
Доксициклин 22 чувствительный
Оксациллин 13
Ципрофлоксацин 23
Эритромицин 15
Гентамицин 25
Пограничные значения зон подавления роста (мм) антибиотиков в отношении стафилококков
Антибиотик Обозначение диска Диаметры зон подавления роста (мм)
Устойчивые Промежуточные чувствительные
Доксициклин Dо ≤12 13-15 ≥16
Оксациллин Ox ≤10 11-12 ≥13
Ципрофлоксацин C ≤15 16-20 ≥21
Эритромицин E ≤13 14-22 ≥23
Гентамицин G ≤12 13-14 ≥15

Достоинства метода: легковоспроизводимый

Недостатки метода: качественный метод, не позволяет определить МПК препарата./

30
Механизмы действия АМП
1. Ингибиторы синтеза клеточной стенки (пенициллины, монобактамы, цефалоспорины,
карбапенемы, гликопептиды);
2. Ингибиторы функции цитоплазматической мембраны (полимиксин);
3. Ингибиторы синтеза белка (тетрациклины, аминогликозиды, макролиды, хлорамфеникол,
линкомицин);
4. Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот (рифампицин, хинолоны

Механизмы устойчивости бактерий к АМП


( в результате мутаций или приобретении плазмид резистентности):
1. Модификация мишени действия
(пенициллин связывающие
белки, участвующих в синтезе
клеточной стенки
стафилококков теряют сродство
к бета-лактамам)
2. Инактивация (разрушение
ферментами) АМП (например,
бета-лактамазы разрушают все
пенициллины и цефалоспорины).
3. Активное выведение (эффлюкс)
АМП из микробной клетки
(например, эффлюкс бета-
лактамов у P.aeruginosa)
4. Нарушение проницаемости для АМП изменением внешних структур микробной клетки
(например, утрата поринов у энтеробактерий).
5. Формирование метаболических "шунтов" (у бактерий появляются новые пути синтеза фолиевой
кислоты и они утрачивают чувствительность к сульфаниламидам ).

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам


(АМП).
Методы определения чувствительности
Схема метода
микроорганизмов к антибиотикам
Диско-диффузионный метод
Принцип: Исследуемую культуру
микроорганизмов сплошным газоном засевают
на поверхность плотной питательной среды,
помещают на ее поверхность не менее 8
бумажных дисков, содержащих АМП и
инкубируют 18-24 час в термостате при 35-37
°С. АМП диффундируя в среду, образуют зоны
отсутствия роста вокруг дисков. Полное
отсутствие роста вокруг диска свидетельствует
об устойчивости микроба к антибиотику. Для
оценки чувствительности к АМП измеряют
диаметр зоны задержки роста и используются
специальные таблицы. Результаты могут быть
представлены как: чувствителен, умеренно-
устойчив и устойчив (S, I, R).

31
Метод Е-тестов
Принцип: метод аналогичен диско-
диффузионному. Только вместо диска с АМП
применяют Е-тест - пластисковую полоску со
стабильным градиентом из 15 концентраций
АМП (от максимальной к минимальной),
нанесенным с использованием инновационной
технологии сухой химии. В месте пересечения
эллипсовидной зоны подавления роста с
полоской Е-теста получают значение
минимальной подавляющей концентрации
(МПК).
Метод серийных разведений в жидкой среде
Принцип: в пробирках с жидкой средой,
готовят серийные двукратные разведения АМП,
например 32 мкг/мл – 1-я, 16 мкг/мл – 2-я, 8
мкг/мл – 3-я, 4 мкг/мл – 4-я и т.д. Затем в
каждую пробирку вносят 0,1 мл испытуемой
бактериальной суспензии. Одновременно ставят
контроль роста (1 мл жидкой среды + 0,1 мл
суспензии бактерий). Посевы инкубируют при
37°С в течение 18-24 ч., после чего отмечают
результаты. Отсутствие помутнения среды
свидетельствует о задержке роста бактерий в
МПК (МИК) = 4 мкг/мл
присутствии данной концентрации препарата.
Автоматизированные методы определения
чувствительности микроорганизмов к
антибиотикам. Принцип: В основе метод
серийных разведений в жидкой среде, однако
разведения АМП на панелях представлены
только в 2- концентрациях минимальной и
максимальной. Результаты исследования
определяются по наличию роста в лунках
панели и сравнению с контролем и могут быть
представлены как: чувствителен, умеренно-
устойчив и устойчив (S, I, R). Микробиологический анализатор Vitec 2

Молекулярно-генетические методы
выявления у микроорганизмов ифических
генов резистентности. Принцип: метод ПЦР и
секвенирование нуклеиновых кислот
(мультилокусное секвенирование (MLST),
мультилокусный анализ областей генома с
вариабельным числом тандемных повторов
(MLVA), полногеномное секвенирование),
секвенирование следующего поколения «next-
generation sequencing (NGS)».

32
ЗАНЯТИЕ № 8
ТЕМА: ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ №1 ПО ТЕМЕ: «МОРФОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА
МИКРООРГАНИЗМОВ».

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Предмет, задачи, методы и связи микробиологии. Задачи медицинской микробиологии. История


микробиологии. Эволюция микроорганизмов.
2. Формы и размеры истинных бактерий. Характеристика шарообразных, палочковидных и извитых форм
истинных бактерий.
3. Структура бактерий. Основные отличия прокариотной клетки от эукариотной. Клеточная стенка
грамположительных и грамотрицательных бактерий.
4. Типы микроскопических препаратов. Техника приготовления фиксированных препаратов.
5. Тинкториальные свойства микробов. Красители. Простые способы окраски фиксированных препаратов.
6. Техника микроскопии в световом микроскопе.
7. Систематика и номенклатура микроорганизмов. Принципы классификации патогенных прокариот.
8. Защитные приспособления у микроорганизмов. Споры, стадии и условия образования спор, биологическое
значение.
9. Капсулы бактерий, их значение.
10. Жгутики, их строение. Реснички. Секс-пили.
11. Сложные способы окраски. Техника окраски по Граму, Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Нейссеру.
12. Методы исследования микроорганизмов в живом состоянии.
13. КОН-тест. Принцип метода.
14. Спирохеты. Систематическое положение и морфология спирохет. Особенности ультраструктуры и
химического состава. Методы исследования.
15. Актиномицеты, морфология, ультраструктура, химический состав. Патогенные виды. Роль актиномицетов в
природе и медицине. Методы выявления.
16. Таксономия хламидий. Морфология, структура, способы выявления. Цикл развития хламидий.
17. Риккетсии, морфология, ультраструктура, химический состав. Патогенные виды.
18. Микоплазмы. Классификация. Филогенез. Способы выявления.
19. Дефектные формы микробов: протопласты, сферопласты, L-формы.
20. Питание бактерий. Питательные вещества – источники углерода и азота. Классификация бактерий по типам
питания Аутотрофы и хемоорганотрофы. Факторы роста и их источники. Источники минеральных элементов.
21. Способы и механизмы переноса питательных веществ через мембрану.
22. Энергетические потребности бактерий. Пути получения энергии у аутотрофов (фотосинтез, хемосинтез).
Источники и пути получения энергии у хемоорганотрофов.
23. Аэробный и анаэробный типы биологического окисления у бактерий. Аэробные, анаэробные, факультативно
анаэробные и микроаэрофильные бактерии. Способы создания анаэробных условий.
24. Задачи, этапы, преимущества и недостатки бактериологического (культурального) метода исследования.
25. Рост и размножение микроорганизмов. Способы размножения. Бинарное (простое) деление, механизм.
Размножение бактериальных популяций.
26. Принципы и методы культивирования бактерий. Питательные потребности микробов. Питательные среды
для культивирования бактерий. Требования к питательным средам. Классификация питательных сред.
27. Условия и техника культивирования бактерий. Техника посева на питательные среды. Закономерности и
характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.
28. Способы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Свойства микроорганизмов,
используемые для идентификации выделенных культур.
29. Ферменты бактерий, классификация. Способы изучения биохимических свойств микроорганизмов.
Практическое использование биохимической активности в идентификации бактерий
30. Определение сахаролитических свойств, состав сред Гисса; определение протеолитических свойств,
определение каталазной и оксидазной активности.
31. Принцип работы и особенности применения приборов автоматической идентификации бактериальных
культур (гемокультиватор, автоматический анализатор).
32. Особенности культивирования риккетсий и хламидий.
33
33. Бактериофаги (фаги). История открытия. Морфология, структурные особенности, химический состав и
свойства фагов.
34. Вирулентные фаги. Фазы взаимодействия с бактериальной клеткой. Результаты взаимодействия фага и
клетки. Умеренные фаги. Профаг. Явление лизогении. Фаговая конверсия.
35. Методы выделения и титрования бактериофагов на плотных и жидких питательных средах. Применение
фагов в микробиологии и медицине. Фагодиагностика и фаготипирование.
36. Наследственность. Организация генетического аппарата у бактерий (нуклеоид, плазмиды, Is-
последовательности, транспозоны).
37. Принципы функционирования бактериального генома. Организация оперона. Генотип и фенотип.
38. Плазмиды, классификация, структура и свойства плазмид. R-плазмида, особенности структуры и функции.
Плазмиды бактериоциногении.
39. Изменчивость микробов. Модификации у бактерий, значение, основные проявления и свойства
(ненаследственный характер, адаптивность, высокая частота прямых и обратных изменений, множество
индуцирующих факторов).
40. Генотипическая изменчивость. Мутации и их классификация. Мутагены. Фенотипические проявления
мутаций. Судьба мутантов. Диссоциация у бактерий. Влияние отбора. Система репарации повреждений генома.
41. Рекомбинационная изменчивость. Механизмы образования комбинированных геномов. Частота изменений
отдельных признаков. Трансформация, трансдукция, конъюгация.
42. Практическое значение знаний о генетике микробов. Принципы генетического картирования.
43. Методы генетического анализа (молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция, блотинг,
секвенирование).
44. Понятие о генной инженерии и использование ее методов в микробиологии и биотехнологии. Получение и
применение генно-инженерных вакцин и цитокинов.
45. Противомикробные мероприятия. Влияние экологических факторов на микробы. Действие физических
факторов (температуры, высушивания, излучений, ультразвука, осмотического давления). Действие
химических факторов.
46. Цели, способы, средства и объекты стерилизации и дезинфекции в медицинской и микробиологической
практике. Контроль качества дезинфекции. Контроль стерилизации и стерильности. Способы проведения.
47. Антисептика. Определение. Антисептические средства, требования, происхождение, свойства, группы,
механизмы действия на микробы. Типы антисептики. Терапевтическая антисептика. Профилактическая
антисептика.
48. Химиотерапевтические препараты. Свойства. Основные группы химиопрепаратов. Механизмы действия на
бактерии. Понятие об избирательности и "мишенях" действия.
49. Органические и неорганические соединения металлов и металлоидов. Сульфаниламидные препараты.
Препараты нитрофуранового ряда. Противогрибковые, противовирусные, противопаразитарные
химиопрепараты.
50. Антибиотики. Определение. Продуценты антибиотиков. Синтетические и полусинтетические антибиотики.
51. Основные группы антибиотиков по химической структуре. Бета-лактамные антибиотики Тетрациклины.
Аминогликозиды. Макролиды и азолиды. Анзамицины (рифампицины). Левомицетин. Фторхинолоновые
антибиотики. Линкомицин. Полимиксины. Гликопептиды
52. Классификация антибиотиков по механизму действия на бактериальную клетку.
53. Механизмы устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
54. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам и другим химиопрепаратам. Техника
постановки, учета и оценки чувствительности методом дисков, Е-теста, серийных разведений. Приборы и
тест-системы для автоматизированного определения антибиотикочувствительности микроорганизмов.

34
ЗАНЯТИЕ № 9ТЕМА: ЭКОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ. ИНФЕКЦИЯ. ПАТОГЕННЫЕ
МИКРООРГАНИЗМЫ. ТОКСИНЫ МИКРОБОВ. БИОЛОГИЧЕСКИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ)
МЕТОД.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ


1. Основные понятия экологической микробиологии (популяция, биотоп, микробиоценоз, экосистема, биосфера).
Экологические связи микробов (симбиоз, комменсализм, нейтрализм, конкуренция, паразитизм, хищничество).
2. Микрофлора тела человека. Нормальная (резидентная) микрофлора человека. Аутохтонная и аллохтонная,
пристеночная и просветная микрофлора. Формирование и развитие нормальной микрофлоры. Функции
нормальной микрофлоры: противоинфекционная, метаболическая, иммунобиологическая, антитоксическая.
Дисмикробиоценоз (дисбактериоз), причины, виды, принципы коррекции.
3. Понятие об инфекции. Определение, общая характеристика. Причины и условия возникновения инфекционного
процесса.
4. Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Патогенность и вирулентность. Облигатно-патогенные и
условно-патогенные микроорганизмы. Факторы, повышающие и снижающие вирулентность микробов. Методы
определения вирулентности, единицы. Генетический контроль патогенности и вирулентности.
5. Факторы патогенности микроорганизмов. Адгезины. Факторы колонизации. Инвазины. Факторы агрессии
микробов. Токсичность и токсигенность микроорганизмов. Эндотоксины, свойства, получение, применение.
Экзотоксины, свойства, получение, единицы измерения. Типы экзотоксинов, механизм действия.
6. Роль макроорганизма в развитии и течении инфекционных болезней. Наследственные факторы. Анатомо-
физиологическое состояние организма. Роль условий жизни в развитии и течении инфекционных болезней.
Природные и социальные факторы.
7. Отличия инфекционных болезней от неинфекционных. Механизмы и пути передачи инфекции. Входные ворота.
Динамика инфекционного процесса, его особенности.
8. Классификация инфекционных процессов по тяжести, характеру возбудителя, по источнику инфекции, способу
передачи возбудителя и механизму заражения, по распространенности. Классификация инфекционных
процессов по локализации микробного очага, длительности течения и кратности заражения.
9. Биологический (экспериментальный) метод исследования, этапы, оценка. Лабораторные животные. Способы
заражения.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1► Изучения нормальной микрофлоры.
Посев для изучения нормальной микрофлоры кожи рук на среду Эндо и кровяной агар методом реплик.
Принцип метода: стерильные кусочки фильтровальной бумаги 1х1 см в чашке Петри увлажнить стерильным
физ. раствором. Стерильным пинцетом поместить кусочек бумаги на исследуемую поверхность кожи рук на
0,5 мин. Поместить бумагу на поверхность плотной питательной среды (отпечаток) на 1 мин. Бумагу удалить.
Чашки с отпечатками инкубировать при 370С, 24-48 часов.
Провести учет посева микрофлоры, приготовить препараты из разных типов колоний, окрасить по Граму,
микроскопировать (в демонстрационных посевах).
Учет посева микрофлоры:
биотоп
количество и характер колоний на кровяном агаре 36 различных колоний
количество и характер колоний на среде Эндо 12 однотипных колоний

Микроскопия препаратов

Препарат со среды Эндо Окраска по Граму Препарат со кровяного агара Окраска по Граму
Увеличение 90 х 100 Увеличение 90 х 100

35
1► Оценка адгезивности E.coli по их способности к адсорбции на поверхности эритроцитов
Принцип метода: к суспензии эритроцитов добавляют испытуемую культуру микроорганизмов. После
инкубации готовят мазки, окрашивают и под микроскопом определяют среднее количество бактерий,
адсорбировавшихся на одном эритроците.Эритроциты в данном случае используются в качестве модели
клетки восприимчивого микроорганизма.

Окраска по Романовскому
Увеличение x1350

1 – эритроцит

2 - E.coli

2► Определение ферментов вирулентности у стафилококков


1. Плазмокоагулаза Принцип метода: в пробирку, содержащую цитратную плазму крови кролика, вносится
испытуемая культура. После инкубации в термостате учитывается результат. При положительном результате
плазма свертывается (коагулирует).
S. aureus Штамм № 1 Штамм № 2
плазма свертывается плазма не свертывается
Результат
Плазмокоагулаза + Плазмокоагулаза -
2. Фибринолизин
Принцип метода: в пробирку с фибрином (отмытый от эритроцитов сгусток крови) вносят испытуемую
культуру. После инкубации в термостате учитывается результат. При положительном результате сгусток
растворяется.
S. aureus Штамм № 1 Штамм № 2
Результат сгусток растворился Фибринолизин + сгусток не растворился Фибринолизин –

3. Гиалуронидаза Принцип метода: в пробирку с гиалуроновой кислотой (ГУК) вносят испытуемую


культуру. После инкубации в термостате добавляют реактив, вызывающий свертывание ГУК и учитывают
результат. При положительном результате (вследствие расщепления ГУК) сгустка не образуется.
S. aureus Штамм № 1 Штамм № 2
Результат сгусток не образуется Гиалуронидаза+ сгусток образуется Гиалуронидаза-

4. Лецитовителлаза (лецитиназа) Принцип метода: выделенные культуры стафилококка засевают на


желточно-солевой агар (ЖСА), который содержит 7,5% хлорида натрия и желточную суспензию. При
положительном результате вокруг колоний вирулентных стафилококков образуется радужный ореол
вследствие расщепления лецитина, содержащегося в желтке куриного яйца.
S. aureus Штамм № 1 Штамм № 2
вокруг колоний стафилококков образуется вокруг колоний стафилококков нет
Результат
радужный ореол Лецитовителлаза + радужного ореола Лецитовителлаза –

Вывод: (перечислите ферменты вирулентности каждого из двух изученных штаммов) Штамм № 1 S. аureus
вирулентный (плазмокоагулаза+, фибринолизин+, гиаоуронидаза+, лецитовителлаза+); Штамм № 2 S.
аureus не вирулентный (плазмокоагулаза- , фибринолизин-, гиалуронидаза-, лецитовителлаза-).

Бактериальные токсины
Токсичность свойство эндотоксина бактерий вызывать нарушение функций отдельных клеток,
органов и тканей макроорганизма. Эндотоксин липополисахаридный комплекс клеточной стенки
бактерий, освобождающийся после ее гибели
Токсигенность свойство бактерий продуцировать и выделять во внешнюю среду экзотоксин
белковый яд продуцируемый и выделяемый бактериями во внешнюю среду.

36
Анатоксин экзотоксин утративший свои токсические свойства в результате химической и
термической обработки

Схема получения экзотоксина и анатоксина.


1. Получение экзотоксина от культивируемого производственного штамма продуцента (
например для получения дифтерийного экзотоксина используют производственный штамм C.
diphtheriae PW-8, который продуцирует токсина в 1000 раз больше чем дикий штамм вызывающий
дифтерию.)
2. Выделение и очистка экзотоксина из питательной среды, на которой культивируется
производственный штамм – продуцент экзотоксина
3. Обезвреживание экзотоксина формалином (0,3 - 0,8% конечной концентрации) в нейтральной среде
при 35 -40°С в течение 3 - 4 нед. В результате получают анатоксин – это токсин утрачивший
токсические свойства, но сохраняющий антигенные и иммуногенные свойства.
4. Очистка анатоксина от балластных веществ, концентрирование и адсорбция на гидроксиде алюминия
или др. сорбентах. После проверки полученного препарата на стерильность, безвредность и активность
анатоксин используют для иммунизации с целью профилактики инфекционных заболеваний.
Практическое применение анатоксинов:
1. Для получения диагностических и лечебных антитоксических сывороток (путем вакцинации
животных анатоксинами) используемых для выявления продукции токсинов микроорганизмами
(определение токсигенности или выявления токсинов в продуктах питания и лечения инфекционных
заболеваний (например, для лечения дифтерии необходимо прежде всего обезвредить токсин C.
diphtheriae, для чего пациенту вводится антитоксическая дифтерийная сыворотка, полученная
гипериммунизацией лошадей дифтерийным анатоксином.
2. Для создания вакцин для профилактики инфекционных заболеваний (например,
адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин в составе АКДС для профилактики дифтерии и
столбняка, холероген-анатоксин - в составе холерной вакцины.

Периоды развития инфекционного заболевания


1. Инкубационный период - от момента заражения до первых клинических признаков (процесс активного
размножения возбудителя).
2. Продромальный период (предвестников) характеризуется общими неспецифическими проявлениями-
недомоганием, головной болью, повышением температуры и другими симптомами преимущественно
токсического генеза
3. Период развития (разгара) болезни характеризуется типичными (специфическими) для данной инфекции
клиническими проявлениями.
4. Период исхода 1) летальный исход или переход в хроническую форму;2) реконвалесценция: а) полное
выздоровление ; здоровое (реконвалесцентное) микробоносительство;

Биологический метод исследования (экспериментальный) метод исследования состоит в


искусственном воспроизведении клинической картины инфекционных болезней на лабораторных
животных.
Диагностики инфекционных болезней, выделения и идентификация чистой
культуры возбудителя, индикации и идентификации экзотоксинов. Кроме того,
Цели метода
его широко применяют в экспериментальной микробиологии и иммунологии, а
также для контроля иммунопрепаратов.
1.Сбор и подготовка биологического материа а (культуры микроорганизмов) для
заражения;
Этапы проведения 2. Заражение животных;
3. Наблюдение за динамикой инфекционного процесса;
4.Вскрытие погибших или умервщленных животных с целью изучения.
Способ заражения зависит от типа материала, вида животного,
Способы заражения
предполагаемого повреждающего агента. Материал может быть введён
лабораторных
накожно, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно,
животных
внутривенно, через нос, рот и прямую кишку, в сердце, желудок, мозг, в вагину,
яичко, конъюнктиву, в суставные полости.
Оценка метода Длительный, трудно воспроизводимый метод исследования используют в только
в тех случаях, если другие методы неэффективны

37
ЗАНЯТИЕ № 10
ТЕМА: МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СИСТЕМЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
МАКРООРГАНИЗМА. АНТИГЕНЫ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ


1. Иммунология. Определение. История возникновения и развития. Задачи медицинской иммунологии,
межпредметные связи, значение для практической медицины.
2. Факторы и механизмы неспецифической резистентности. Барьерные и противомикробные свойства кожи,
слизистых оболочек, лимфатических узлов, ареактивность тканей, нормальная микрофлора.
3. Гуморальные факторы неспецифической защиты: эндогенные пептиды-антибиотики, пропердин, лизоцим, -
лизины, фибронектин, белки острой фазы воспаления.
4. Интерфероны. Группы интерферонов по продуцентам, типы ИФН по способу образования. Механизм действия
интерферонов
5. Система комплемента. Структура. Пути активации (классический, альтернативный). Активаторы системы
комплемента. Ингибиторы и инактиваторы комплементарного каскада. Биологические функции активированных
компанентов комплемента. Биологически активные фрагменты, их функции. Анафилатоксины, их биологическая
роль. Мембраноатакующий комплекс (МАК). Методы определения активности системы комплемента.
6. Полиморфноядерные и мононуклеарные фагоциты (происхождение, характеристика, функции). Фагоцитарная
реакция (фазы, механизмы и факторы внутриклеточной бактерицидности). Исходы фагоцитоза. Показатели
фагоцитоза и методы их определения.
7. Естественные киллеры. Механизмы распознавания и цитолиза клетки-мишени.
8. Антигены: определение, принцип строения, свойства антигенов. Классификации антигенов. Групповые, видовые,
вариантные, стадийные антигены. Перекрестные антигены. Антигенная мимикрия. Антигены бактерий.
Антигенные свойства грибов.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА


1. Оценка бактерицидной активности кожи по Клемпарской
Принцип метода: На поверхность кожи предплечья наносится культура E.coli. Через определенные промежутки
времени определяют количество жизнеспособных бактерий методом отпечатков. На основании полученных
результатов рассчитывается индекс бактерицидности (ИБ) по формуле:
ИБ = КО-К20 /КО х 100 , где КО - количество колоний сразу после контаминации кожи; К20 - количество колоний
через 20 минут. В норме ИБ более 95%
Время, мин 0* 5* 10* 15* 20*
Количество колоний 43 32 28 7 2
ИБ = = 43 – 2 / 43 х 100 = 95,3% Вывод: бактерицидная активность кожи сохранена
2. Определение активности комплемента (С) в реакции иммунного гемолиза
Цель постановки определение количества комплемента в крови обследуемого
Ингредиенты реакции: Исследуемый материал сыворотка крови обследуемого (содержит
комплемент) Диагностические препараты Гемолитическая сыворотка (инактивированная нагреванием 56°С
сыворотка крови кролика, иммунизированного бараньими эритроцитами), стандартная 5% взвесь
эритроцитов барана, физиологический раствор
Разведения
1/10 1/15 1/20 1/25 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 КГС КЭ
сыворотки
Гемолиз +/-

Гем+ Гем+ Гем+ Гем+ Гем - Гем- Гем- Гем - Гем - Гем - Гем - Гем -

Вывод: Сыворотка крови обследуемого содержит комплемент с титром активности 1/25


Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну 50 % гемолитическую
единицу комплемента (CH50) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50 % 0,5 мл
стандартной суспензии сенсибилизированных эритроцитов при 37 °С за 45 мин.
Расчет ведут по формуле: 0,25 мл (1:10) CH50=1 мл. В связи с тем что 0,25 мл — это испытуемая сыворотка,
разведенная 1:10, результат надо умножить на 10, т. е. в 1 мл исследуемой сыворотки будет 40 CH50. В сыворотках
здоровых доноров обычно содержится 20—40 гемолитических единиц комплемента. Уровень комплемента у
женщин ниже, чем у мужчин, в пределах 10 %.

38
3. Определение активности лизоцима
Титр лизоцима - это максимальное разведение исследуемого материала, в котором еще проявляется
литическая активность лизоцима по отношению к эталонному штамму микроорганизмов.
Ингредиенты реакции: Исследуемый материал сыворотка крови обследуемого Тест-объект: Micrococcus
lysodeicticus
Разведения 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 КК КС
слюны
Лизис +/- Нет осадка Нет осадка Нет осадка осадок осадок осадок осадок Нет
Лизис + Лизис + Лизис + Лизис - Лизис - Лизис - Лизис - осадка
Вывод: Титр активности лизоцима 1/8.
Методы определения Лизоцима. основаны на измерении ФЭК-М оптической плотности стандартной живой
суспензии М. lysodeikticus (штамм 2665) У здоровых людей среднее значение активности Л. с-ки крови по
этому методу равно 10,66± 00,34 мкг/мл., носовой слизи - 76,6 7± 04,81 мкг/мл.
4. Оценка фагоцитоза.
►Определение фагоцитарного числа (процент активных фагоцитов)
Принцип метода: в цитратную кровь вносят культуру стафилококка инкубируют в термостате 30 минут.
Затем готовят мазки, окрашивают их по Романовскому-Гимзе, микроскопируют, подсчитывают 100
лейкоцитов, из них – число фагоцитирующих. Считаем также число фагоцитированных микробов в активных
фагоцитах.
Фагоцитарное число (ФЧ) или процент активных фагоцитов - это число фагоцитирующих клеток,
деленное на общее число лейкоцитов (в %). В норме – не менее 50%.
Фагоцитарный индекс (ФИ) – это среднее количество микробов, поглощенных одним фагоцитом, т. е.
число фагоцитированных микробов делят на число активных фагоцитов. В норме - 4-8.

►Оценка завершенности фагоцитоза (ЗФ).


Принцип метода: в цитратную кровь вносят культуру кишечной палочки и делают высев на питательную
среду. После 120 минутной инкубации в термостате высев повторяют и инкубируют оба посева в термостате.
Через сутки проводят подсчет колоний и рассчитывают процент завершенности фагоцитоза (ЗФ) по
формуле: ЗФ =КО-К120 / КО х 100, где где КО - количество колоний сразу после внесения культуры; К120 -
количество колоний через 120 мин. инкубации в термостате. В норме завершенность фагоцитоза - 50-99%.
Количество колоний в первом высеве 25
ЗФ =25-12=10 х 100/ 25 = 52 %
Количество колоний во втором высеве 12
Вывод: Фагоцитарная активность крови обследуемого по завершенности фагоцитоза сохранена
соответствует норме).

Незавершенный фагоцитоз N.gonorrhoeae Схема иммунного фагоцитоза : Опсонины – антитела и


Окраска по Граму Увеличение x630 комплемент ; Рецепторы к Fc антител и к комплементу С3.

39
ЗАНЯТИЕ № 11 ТЕМА: В-ЛИМФОЦИТЫ. ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Иммунокомпетентные органы (центральные и периферические), иммунокомпетентные клетки, факторы
межклеточного взаимодействия иммунной системы. Главный комплекс гистосовместимости (ГКГС). Молекулы I, II
и III классов ГКГС, строение, распределение на клетках и тканях. Биологическое значение молекул ГКГС, роль в
распознавании и элиминации чужеродного материала.
2. В-лимфоциты: развитие, маркеры. В-клеточный рецептор: структура (константные и вариабельные участки,
полипептидные цепи). Механизмы В-клеточной активации. Функция В-лимфоцитов.
3. Антитела. Структура молекулы иммуноглобулинов: вариабельные и константные области, расположение и
структура доменов. Антигенсвязывающие участки. Механизм взаимодействия антител с антигенами.
Валентность, аффинность и авидность антител. Полные и неполные антитела. Иммунные комплексы.
4. Классы и субклассы иммуноглобулинов; изотипы, аллотипы, идиотипы.
5. Антителогенез, динамика синтеза антител. Поликлональные и моноклональные антитела
6. Биологические эффекты взаимодействия антител с антигенами: активация комплемента, нейтрализация
токсинов и вирусов, лизис, агглютинация и опсонизация микроорганизмов, торможение адгезии, инвазии,
подавления фагоцитарной реакции.
7. Гуморальный иммунный ответ, динамика развития. Первичный и вторичный иммунный ответ, переключение
биосинтеза классов иммуноглобулинов.
8. Прямая и непрямая реакция Кумбса.
9. Простая радиальная иммунодиффузия в агаре по Манчини.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

1. Изучить структурную организацию молекул иммуноглобулинов:

Отметьте на рисунке:
1 – H-цепь
2 – L-цепь
3 - Шарнирный участок
4 – Fab-фрагмент
5 – Fc-фрагмент
6 – Вариабельный домен легкой цепи
7 – Константный домен легкой цепи
8 – Эпитоп антигена
9 – Паратоп антитела (активный центр)
10 - Вариабельный домен тяжелой цепи
11 – Константные домены тяжелой цепи

Валентность данного Ig = 2

1 – IgG, 2 – IgM 3 – IgA 4 – s IgA 5 – IgD 6 – IgE

40
Характеристика иммуноглобулинов
Концент-
Класс Ig Характеристика
рация (г/л)
Молекулярная масса 154 кДа. 85% всех иммуноглобулинов. Четыре субкласса.
Мономер. Единственный класс антител, проникающий через плаценту и
IgG 12
обеспечивают иммунологическую защиту плода, активирующий систему
комплемента и обладающий цитофильной активностью.
Молекулярная масса 900 кДа. 5-10% всех иммуноглобулинов. Пентамер.
Ig M 1
Образуются преимущественно при первичном иммунном ответе.
Молекулярная масса 160 кДа. 5-15% всех иммуноглобулинов. Два субкласса.
Мономерные, димерные, тримерные. Сывороточный является мономером, а
IgA 2,5
секреторный ди- или триммером. Секреторный выделяется на поверхность
слизистой, обеспечивая местный иммунитет.
Молекулярная масса 190 кДа. ‹ 1% всех иммуноглобулинов. Мономер. Высокая
IgE 0,00025
цитофильность. Участвуют в аллергических реакциях немедленного типа.
Молекулярная масса 185 кДа. 1% всех иммуноглобулинов. Мономер.
IgD 0,03 Экспрессируются в основном на мембране В-лимфоцитов, участвуют в их
дифференцировке, выполняют рецепторную функцию.

2. Проба Кумбса (антиглобулиновый тест)


Антиглобулиновая сыворотка (АГС) – сыворотка крови кролика содержащая антитела против
человеческих иммуноглобулинов (IgG), получают иммунизируя кроликов (IgG) человека; Неполные антитела -
(моновалентные или блокирующие антитела ) имеют один активный центр и не дают при соединении с
антигеном видимых серологических реакций._Пример: резус-фактор
Варианты Прямая проба Кумбса) Непрямая проба Кумбса
Принцип Реакция агглютинации для выявления Реакция агглютинации для выявления
неполных антител, фиксированных на неполных антител в сыворотке крови
поверхности эритроцитов.
Исследуемый Кровь из вены (взрослый пациент) или Сыворотка пациента
материал пуповинная кровь новорожденного
Диагностические 1) Эритроциты группы 0 (I) Rh+
АГС
препараты 2) АГС

Нарисовать схему

1) Диагностика гемолитической болезни 1) Выявление неполных антител к


новорожденных (ГБН) эритроцитарным антигенам реципиента и
2) Выяснение причин гемолитической донора перед проведением гемотрансфузии
Применение трансфузионной реакции 2) Выявление анти-Rh-антител в крови матери
3) Диагностика гемолитических анемий, 3) Диагностика приобретенной гемолитической
обусловленных аутоиммунными реакциями анемии
или некоторыми препаратами

3. Методы оценки В-системы.


►Количественная оценка.
Определение количества В-лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитами мыши
Принцип метода: на 1 этапе из крови выделяют лимфоциты. На 2 этапе с помощью реакции
розеткообразования с эритроцитами мыши определяют процент В-лимфоцитов от общего числа лимфоцитов.
При добавлении к суспензии лимфоцитов эритроцитов мыши, последние адсорбируются В-лимфоцитами, а
образующиеся при этом структуры называются розетками. Общее количество лимфоцитов подсчитывают под
микроскопом по количеству розеток.
41
Кровь (10 мл) пациента вносят в пробирку с раствором гепарина и осторожно наслаивают на смесь фиколл-гипака,
который способствует выделению лимфоцитов, и центрифугируют. После центрифугирования эритроциты оседают на
дно пробирки, а лимфоциты располагаются тонким слоем на границе раствора фиколл-гипака и плазмы. Взвесь
лимфоцитов осторожно извлекают из этого слоя (интерфазы), доводят до концентрации 4x10 6/мл –4x109/л) и смешивают
с взвесью эритроцитов мыши в соотношении 1:1. Полученную смесь инкубируют при 37°С в течении 10 минут и снова
центрифугируют, после чего выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С в течение нескольких часов. Подсчет
клеток производят в камере Горяева . Подсчитывают число “розеток” на 100 лимфоцитов и определяют процентное
содержание В-лимфоцитов. Для определения абсолютного количества В-лимфоцитов в день исследования производят
общий клинический анализ крови. В норме содержание В-лимфоцитов в периферической крови колеблется от 30 до 50%
от общего количества лимфоцитов (в среднем 46,7±1,0%). Лимфоциты 19-37 % от общего числа лейкоцитов (4,0 – 9,0 х
10 9 – в 1 л крови).

Препарат мазок крови


Окраска по Романовскому Увеличение 900
Метод выявляет маркер CD 20 на поверхности В-лимфоцитов;
Содержание В-лимфоцитов – (CD 20) = 8-20% от общего числа лимфоцитов.

►Качественная (функциональная) оценка

Определение концентрации иммуноглобулинов G класса в сыворотке крови методом простой


радиальной иммунодиффузии по Манчини (в реакции преципитации).

Принцип метода: на стеклянную пластинку (или чашку Петри) наливают агар, смешанный с антителами против
IgG. После застывания в агаре делают лунки диаметром 2 мм. В один ряд лунок вносят разведения стандартной
сыворотки с известной концентрацией IgG. В другие лунки добавляют исследуемые сыворотки крови больных.
Иммуноглобулины диффундируют в агар и на месте встречи с антителами, которые находятся в агаре,
образуется зона кольца преципитации. Диаметр этого кольца зависит от концентрации Ig (чем больше Ig, тем
больше диаметр). Измеряют диаметр зоны преципитации для трех разведений стандартной сыворотки и по ней
на полулогарифмической бумаге строят график зависимости квадрата диаметра кольца преципитации (Д) от
количества Ig в сыворотке крови. Затем измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки,
наносят на построенный график и определяют концентрацию Ig. Стандарт IgG = 10-20 г/л.- содержание в крови у
человека.

Вывод: диаметр кольца преципитации равен (2,5 мм)2 =6,25 концентрация иммуноглобулина ~5 г /л
, т.е. она снижена (норма содержания в крови у здорового человека IgG = 10-20 г/л).

42
ЗАНЯТИЕ № 12 ТЕМА: Т-ЛИМФОЦИТЫ. КЛЕТОЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ.
ИММУНОДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ


1. Т-лимфоциты: развитие, маркеры. Субпопуляции Т-лимфоцитов (Т-хелперы нулевые, Т-хелперы 1, 2 типов, Т-
регуляторы; Т-эффекторы: цитотоксические Т-лимфоциты, Т-лимфоциты памяти).
2. Т-клеточный рецептор: строение, типы, генетический контроль, разнообразие. Роль Т-клеточного рецептора. Т-
зависимые антигены.
3. Клеточный иммунный ответ, динамика развития, мишени действия Т-килеров, проявления.
4. Серологический метод исследования: задачи, этапы, оценка. Общая классификация иммунологических методов
диагностики: серотипирование, серодиагностика. Диагностикумы. Диагностические иммунные сыворотки. Методы
получения. Поливалентные, монорецепторные адсорбированные (поликлональные) и моноклональные
диагностические сыворотки и тест-системы.
5. Качественная и количественная оценка серологических реакций: титр иммунных сывороток, диагностический титр,
нарастание титра антител, аффинность антител, их авидность.
6. Механизмы течения и проявления реакций агглютинации. Нагрузочные реакции агглютинации: постановка и учет
реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), латекс-агглютинации. Реакция ко-агглютинации.
7. Реакции иммунопреципитации: варианты постановки (кольцепреципитация по Асколи, двойная диффузия в агаре,
иммуноэлектрофорез), методы учета и оценки.
8. Реакции нейтрализации токсина антитоксической сывороткой: варианты постановки.
Серологический метод исследования идентификация микроорганизмов и диагностика инфекционных
заболеваний на основе выявления in vivo иммунных комплексов антиген+антитело.
Иммунологическая реакция–это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется
специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.
Применение иммунологических реакций
Направление Цель
Антиген Антитела
исследования исследования
Серологическая Установление Неизвестный Известные
идентификация родовой и видовой (чистая культура микроорганизма (иммунная
(серотипирование, принадлежности или исследуемый материал, диагностическая
экспресс-диагностика) микроорганизма содержащий микроорганизмы) сыворотка)
Серодиагностика Обнаружение Известный Неизвестные
антител в (антигенный диагностикум) (сыворотка крови
сыворотке крови обследуемого пациента)

Диагностическая сыворотка содержит антитела, получают гипериммунизацией лабораторных


животных (в основном кроликов) стандартными антигенами микроорганизмов известной видовой
принадлежности;Диагностические сыворотки бывают антимикробные. антивирусные,
агглютинирующие, преципитирующие, иммунофлюоресцирующие сыворотки (меченные
флюоресцентными красителями) и сыворотки, меченые ферментами и радионуклидами;
Диагностикумы стандартные антигены, которые используются в иммунологических реакциях для
выявления соответствующих им (специфических) антител в исследуемых сыворотках для
диагностики инфекционных заболеваний;Виды диагностикумов бактериальные (взвесь бактерий
убитых нагреванием или формалином), риккетсиозные (взвесь убитызх риккетсий или их
антигенных фракций),вирусные (инактивированные формалином или эфиром), эритроцитарные
(антигенные- эритроциты нагруженные антигенами и антительные – эритроциты нагруженные
антителами-иммуноглобулинами);

Критерии серодиагностики:
1) Диагностический титр- разведение исследуемой сыворотки образующее видимый иммунный
комплекс антиген+ антитело, свидетельствующий о заболевании;
2) Нарастание титра Ат - увеличение титра разведения исследуемой сыворотки, свидетельствующее
об активности инфекционного процесса;

43
Основные серологические реакции
а) Реакция агглютинации (лат.склеивание) взаимодействие нерастворимого (корпускулярного)
антигена с антителом с образованием видимого иммунного комплекса (мелкозернистого осадка);
Агглютинирующая диагностическая сыворотка содержит антитела (агглютинины) получают
гипериммунизацией кроликов стандартными антигенами (убитыми микроорганизмами или
отдельными их антигенами;
Титр агглютинирующей сыворотки максимальное разведение агглютинирующей сыворотки
способное вызвать видимую агглютинацию (склеивание) бактерий;
Агглютинирующие диагностические сыворотки бывают адсобированными и
неадсорбированными (в зависимости от степени очистки), поливалентными (могут давать
реакцию агглютинации с 2-3 родственными бактериями, имеющими общий антиген), и
моновалентными, содержащими антитела только к одному антигену.

Варианты постановки прямой реакции агглютинации:


►1. Постановка ориентировочной реакции агглютинации на стекле (реакция Грубера) для
идентификации бактерий (применение РА в серотипировании)
Исследуемый материал: выделенная
от больного с кишечной инфекцией
чистая культура бактерий;

Диагностический препарат:
адсорбированная поливалентная
дизентерийная сыворотка к
шигеллам Зонне I-II типов.;
Поливалентная шигеллезная
сыворотка + взвесь исследуемой
Физиологический р-р + взвесь Вывод: выделен возбудитель
исследуемой культуры дизентерии шигелла Зонне .;
культуры

►2. Постановка развернутой реакции агглютинации в пробирках для определения титра


антител в сыворотке (применение РА в серодиагностике).

Развернутая реакция агглютинации с целью серодиагностики брюшного тифа

Исследуемый материал: сыворотка крови больного брюшным тифом ;


Диагностический препарат: сальмонеллезный диагностикум (взвесь убитых сальмонелл);

Разведение сыворотки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 КА КС

Результат

Диагностический титр 1:200 : Титр Ат в реакции 1:400 ; Вывод: обследуемый болен брюшным тифом.

Варианты постановки непрямой реакции агглютинации:


1.Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА);2. Реакция коагглютинации (РКА);
3.Реакция латекс-агглютинации (РЛА).
44
►3. Постановка и учет реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)
Эритроцитарный антигенный диагностикум (что представляет, для чего используется): обработанные
формалином эритроциты (барана или I группы крови человека) нагруженные (сенсибилизированные)
антигенами бактерий, риккетсий или вирусов, используются для выявления специфических антител
с целью диагностики инфекций.
Эритроцитарный антительный диагностикум (что представляет, для чего используется) формализированные
эритроциты нагруженные специфическими антителами (иммуноглобулинами), используются для
выявления антигенов вирусов, бактерий или их токсинов, с целью диагностикий.
РНГА с целью серодиагностики
Исследуемый материал: сыворотка крови больного брюшным тифом;
Диагностический препарат: Эритроцитарный брюшнотифозный Vi диагностикум (эритроциты
барана сенсибилизированные антигеном вирулентности возбудителя брюшного тифа).

Разведения сыворотки 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 КД


Учет результатов
(зарисовать)

Диагностический титр 1:80 : Титр Ат в реакции 1:80; Вывод: обследуемый болен брюшным тифом.

б) Реакция преципитации _(лат.осаждение) взаимодействие растворимого (молекулярного) антигена


с антителом с формированием и осаждением иммунного комплекса в виде помутнения,
называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных
количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

Преципитирующие сыворотки) содержат антитела (преципитины) к мелкодисперсным антигенам и


используются для идентификации антигенов при диагностике инфекционных заболеваний
(сибирской язвы, чумы), серотипирования стрептококков и менингококков; их получают
иммунизацией кроликов мелкодисперсными молекулярными антигенами (очищенными белковыми
антигенными фракциями, токсинами и т. д.).

Титр преципитирующей сыворотки максимальное разведение антигена, которое преципитируется


цельной сывороткой. Выпускают диагностические преципитирующие сыворотки с титром не
меньше 1: 100 000.Это связано с тем, что антиген, определяемый в реакции преципитации, имеет
молекулярную дисперсность и из-за этого громадную суммарную поверхность, для покрытия
которой нужно очень много антител.
Разновидности реакций преципитации:
1.реакция кольцепреципитации;2. реакция микропреципитации (к капле плазмы или сыворотки добавляют
Аг, образуется помутнение, используется при диагностике сифилиса); 3.простая радиальная
иммунодиффузия по Манчини; 4.двойная встречная иммунодиффузия по Оухтерлони;
5.иммуноэлектрофорез (преципитация + электрофорез).

►4. Постановка и учет реакции кольцепреципитации по Асколи (обнаружение антигенов возбудителя


сибирской язвы- Bаcillus anthracis).
Принцип метода взаимодействие растворимых молекулярных антигенов Bаcillus anthracis
(термоэкстракты, полученные кипячением кожи, шерсти, мяса животных, почвы, выделенной
культуры) с антителами против возбудителя (сыворотка крови вакцинированного крупного
рогатого) с образованием видимого в пробирке преципитата кольцеобразной формы.

45
Схема постановки и учета реакции Асколи — реакции преципитации
(термопреципитации) для обнаружения возбудителя сибирской язвы или его
антигенов в различных субстратах (кожа, шерсть, войлок, щетина, сукно, мясо,
земля, испражнения животных и т. д.). Из исследуемого материала готовят
вытяжку в изотоническом растворе хлорида натрия путем кипячения в течение 5—
45 мин. или экстрагируют антиген 0,5% карболовой или уксусной кислотой в
изотоническом растворе хлорида натрия. Экстракт фильтруют через бумажный
фильтр или центрифугируют при 1000—3000 об/мин. В узкую пробирку для
преципитации наливают иммунную преципитирующую противосибиреязвенную
сыворотку и осторожно наслаивают на нее испытуемый экстракт. В течение 10
минут на границе между сывороткой и экстрактом в положительных случаях
появляется кольцо помутнения (кольцепреципитация).
а) Схема взаимодействия; б) Положительная реакция Асколи.

►5. Реакция двойной встречной иммунодиффузии по Оухтерлони (реакция преципитации в геле)


Принцип метода: В агаровом геле формируют лунки, в которые вносят антигены и сыворотку. Антитела и
антигены диффундируют навстречу друг другу в агар и образуют линии преципитации. Возможны три
варианта расположений линий преципитации:

Обе линии преципитации полностью сливаются, что говорит об идентичности обоих антигенов.

Линии преципитации пересекаются, что говорит о неидентичности антигенов.

Если антигены частично идентичны, образуется одна, оторванная от общей, линия


преципитации («шпора»), что говорит о наличие как общих детерминант между антигенами, так и
дополнительных детерминант у одного из антигенов.

►6. Выявление токсигенности возбудителя дифтерии в


реакции преципитации в геле (тест Илека)
Исследуемый материал – выделенные чистые культуры
возбудителя дифтерии (посев «бляшками»)
Диагностический препарат – антитоксическая сыворотка,
содержащая антитела - антитоксины (в бумажной
полоске)
Принцип реакции: антиген и антитело диффундируют в
гель, при встрече образуют комплексы, которые
осаждаются в виде линий преципитации. Если линия
преципитации появляется, следовательно, культура микроорганизмов токсигенная, т. е.
продуцирует экзотоксин. Если отсутствует – культура нетоксигенная.

в) Реакции нейтрализации (РН) токсинов антитоксической сывороткой


Антитоксические сыворотки (что содержат, как получают) содержат антитела против токсинов
бактерий, их получают иммунизацией лошадей анатоксинами (обезвреженными формалином и
нагреванием токсинами,напримерстолбнячным,дифтерийным или ботулотоксином).
Варианты учета РН: а) in vivo - на белых мышах; б) in vitro – в РНГА (планшеты или пробирки).

46
ЗАНЯТИЕ № 13 ТЕМА: СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ КОМПЛЕМЕНТА.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНЫХ КОМПОНЕНТОВ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Реакции иммунного лизиса и связывания комплемента: методика постановки, учета и оценки, применение в
диагностике инфекционных заболеваний.
2. Реакции иммунофлюоресценции. Диагностическое значение, информативность, варианты постановки реакций:
прямой и непрямой.
3. Иммуноферментный анализ. Варианты постановки. Возможные ошибки и ограничения метода,
иммуноферментного анализа.
4. Иммуноблотинг (вестерн- блотинг). Проведение и учет результатов. Варианты применения метода.
5. Радиоиммунный анализ, сущность, способы постановки, методы учета и оценки реакций, достоинства и недостатки
метода.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА


1. Реакция иммунного бактериолиза (РИБ) - лизис бактерий в присутствие специфических антител и
комплемента (использовали для диагностики холеры, сифилиса и лептоспироза)
Ингредиенты РИБ: антиген (представлен на клеточной стенке бактерий); антитела (в данном случае их
называют бактериолизины) иммунной сыворотки; комплемент
Исследуемый материал: сыворотка крови пациента при подозрении на заболевание
Диагностические препараты:1. Взвесь суточной культуры известных бактерий – диагностикум из живых
бактерий (лептоспир) содержит антиген (представлен на клеточной стенке бактерий) 2. Комплемент –
коммерческий препарат получают из сыворотки крови морских свинок
Варианты постановки: in vitro (в пробирках ) и in vivo (на морских свинках).
опыт контроль
Ингредиенты
1 антигена комплемента
Сыворотка крови обследуемого прогретая при 56º 30 мин 1:10 0,5 0,5 -
Антиген из живых лептоспир ~ 1 млрд. бактерий в 1 мл 0,1 0,1 0,1
Комплемент 0,1 - 0,1
Физиологический р-р 0,1 0,5
Результат: лизис +/- Лизис+ Лизис- Лизис-

В настоящее время используют для только in vitro и только для диагностики лептоспирозов. Для этого к 0,2 мл
разведенной сыворотки (1:100, 1:200 ,1:400,1:800 и т.д) обследуемого добавляют 0,2 мл взвеси культуры лептоспир
инкубируют 2 часа в термостате и микроскопируют в темном поле. Лизис характеризуется сильным набуханием и
зернистостью лептоспир, потерей подвижности с последующим распадом на отдельные зерна, которые иногда
полностью растворяются. Лизис лептоспир сывороткой крови обследуемого пациета в титрах 1:200 и выше позволяет
подтвердить диагноз лептоспироза (Leptospira interrogans)

2. Реакция иммунного гемолиза - лизис эритроцитов в присутствие специфических антител и


комплемента
Ингредиенты реакции гемолиза: 1. 3% взвесь эритроцитов барана (антиген); 2. Гемолитическая
сыворотка- (гемолизин) антитела против эритроцитов барана готовят на производстве, иммунизируя
кролика эритроцитами барана, затем сыворотку лиофилизируют и на этикетке указывают титр
3. Комплемент – коммерческий препарат получают из сыворотки крови морских свинок.

Цели применения: 1) как индикаторная система в реакции связывания комплемента; 2) определения


активности комплемента

3. Реакция связывания комплемента (РСК)


Ингредиенты РСК: 1. исследуемая сыворотка 2.
антиген – диагностикум ( взвесь убитых бактерий);
3.комплемент (сыворотка крови морской свинки 4.
гемолитическая система состоящая из: а)
гемолитической сыворотки (сыворотки крови кролика,
иммунизированного эритроцитами барана) б)
эритроцит антигена - 3% взвеси эритроцитов барана

Перед постановкой РСК проводят:


А)Титрование гемолитической сыворотки в реакции
иммунного гемолиза. За титр гемолитической сыворотки – принимают максимальное ее разведение, обеспечивающее
полный гемолиз эритроцитов в присутствии комплемента. Рабочая доза гемолитической сыворотки в 3-4 раза выше
титра.

47
Б) Титрование комплемента в реакции иммунного гемолиза. Рабочая доза комплемента на 20-25% выше титра
(обычно берут предыдущее разведение). Так если титр комплемента составляет 0,25 мл, то рабочая доза будет 0,2 мл.
1.Применение РСК в серодиагностике (выявлении антител) сифилиса.

Исследуемый материал: сыворотка крови пациента, содержит антитела против возбудителя сифилиса
(Treponema palidum) Диагностические препараты: 1.комплемент (сыворотка крови морской свинки
2.кардиолипиновый антиген или антиген из убитых ультразвуком трепонем 3. гемолитическая система
состоящая из : а) гемолитической сыворотки (сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами
барана) б) эритроцит антигена - 3% взвеси эритроцитов барана

ОСНОВНОЙ ОПЫТ РСК (изучить схему постановки)


Ингредиенты, мл п р о б и р к и
1 2 3
(сыворотка пациента) (Контроль (Контроль
положительной отрицательной сыворотки)
сыворотки)
Испытуемая сыворотка 0,2 - -
Положительная сыворотка - 0,2 -
Отрицательная сыворотка - - 0,2
Антиген 0,2 0,2 0,2
Изотонический раствор - - -
Комплемент (в рабочей дозе) 0,2 0,2 0,2
Инкубация в термостате (20-30) минут
Гемолитическая система 0,4 0,4 0,4
Инкубация в термостате (20-30) минут до гемолиза в контроле

Результат
Гем- Гем- Гем+

Вывод: Исследуемая сыворотка содержит антитела против возбудителя сифилиса, обследуемый болен
сифилисом;

2. Применение РСК в диагностике гонореи (выявление антигенов гонококков).

Исследуемый материал: гнойные выделения больного, содержит микробные антигены (гонококков)


Диагностические препараты: 1.комплемент (сыворотка крови морской свинки 2. антититела против
гонококков,полученные иммунизацией животных 3. гемолитическая система состоящая из: а) гемолитической
сыворотки (сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами барана) б) эритроцит антигена - 3% взвеси
эритроцитов барана
Больной Опыт Контроль гемолитической системы Контроль сыворотки
А
Гем+; РСК- Гемолиз - Гемолиз -
В
Гем-; РСК+ Гемолиз - Гемолиз -
Вывод: пацинет А здоров, пациет В болен гонореей

3.Применение РСК в серодиагностике сыпного тифа.


Исследуемый материал: кровь больного, содержит антитела против риккетсий Провачека – возбудителя сыпного
тифа Диагностические препараты: 1.комплемент (сыворотка морской свинки) 2. риккетсиозный корпускулярный
антиген 3. гемолитическая система состоящая из: а) гемолитической сыворотки (сыворотка кролика,
иммунизированного эритроцитами барана) б) эритроцит антигена - 3% взвеси эритроцитов барана
РСК с целью серодиагностики сыпного тифа
Разведения сывороток больного 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 КАг КС

Сыворотка на 5 день болезни


Гем- Гем+ Гем+ Гем+ Гем+ Гем- сыворотка

Сыворотка на 14 день болезни


Гем- Гем- Гем- Гем+ Гем+ Гем сыворотка
Результат: титр антител на 5 день болезни 1:20, на 14 день 1:80
48
Вывод: нарастание титра в 4 раза (1:20→1:80) свидетельствует о заболевании сыпным тифом
Схема реакции иммунофлюоресценции (РИФ)
Прямой метод РИФ Непрямой метод РИФ
выявление антигенов выявление иммунного
фиксированных в мазке на комплекса антиген —
стекле путем нанесения антитело фиксированных в
антител, меченных мазке на стекле с помощью
флюорохромами, способных меченных флюорохромами
светиться в УФ-лучах антител. Вначале на мазки
люминесцентного микроскопа. наносят антитела
При этом бактерии в мазке, диагностической кроличьей
обработанные такой люминесцирующей сывороткой, сыворотки. Затем мазки промывают для удаления не
светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета связавшиеся с антигенами антител, и наносят
антиглобулиновую (антикроличью) сыворотку,
меченную флюорохромами. Образующийся комплекс
антиген+ кроличьи антитела + антикроличьи антитела,
меченные флюорохромом светится УФ-лучах
люминесцентного микроскопа, как и при прямом
методе.

Принципиальная схема твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (


Определение антигенов Определение антител
в лунках планшета с адсорбированными антителами в лунках планшета с адсорбированными антигенами

Иммуноблоттинг (син. вестернблоттинг) — высокочувствительный метод выявления белков,


основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.

Радиоиммунный метод, или анализ (РИА) , основан выявлении иммунных комплексов антиген — антитело
с помощью меченных радионуклидами (125J, 14С, 3Н, 51Сr и др.) антигенов или антител. Измерение

49
интенсивности бета- или гамма-излучения образовавшегося радиоактивного иммунного комплекса прямо
пропорционально количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Иммунохроматографический анализ (ИХА) — иммунохимический метод, основан на принципе
тонкослойной хроматографии и включает реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в
биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест-кассет.
Биологическая жидкость вместе с антителами с красителем движется вдоль полоски по принципу
тонкослойной хроматографии. Исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер)
связывается антителами тестовой и контрольной зон, что является уже иммунологическим методом анализа.
В тестовой зоне ИХА-полоски происходит накопление антител с красителем вокруг иммобилизованных
антител, что проявляется в виде яркой темной полосы. Не связавшиеся антитела с красителем мигрируют
далее вдоль полоски и взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где наблюдается
вторая темная полоса. Контрольная полоса должна проявляться всегда, независимо от присутствия
исследуемого антигена в жидкости (см. рис). Результаты определяются визуально или компьютерной
обработкой отсканированного изображения

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕАКЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ


Наименование метода Метка Выявление меток
Реакция флюорохромы наблюдают свечение в люминесцентном микроскопе
иммунофлюоресценции – РИФ
Иммуноферментный ферменты изменение окраски определяют спектрофотометрически (с помощью
анализ – ИФА иммуноферментного анализатора) – по оптической плотности
окрашенного раствора
Радиоиммунный анализ – РИА радиоизотопы определяют радиоактивность образовавшегося иммунного комплекса
в соответствующем счетчике радиации
Иммунохромотогафический Красители, ферменты, изменение окраски определяют визуально или компьютерной
анализ – ИХА флюорохромы, обработкой отсканированного изображения
парамагниты, липосомы
.

50
ЗАНЯТИЕ № 14ТЕМА: АЛЛЕРГИЯ. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ.
ИММУНОПРОФИЛАКТИКА И ИММУНОТЕРАПИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Аллергия, определение, стадии аллергии. Аллергены. Бытовые, пыльцевые, эпидермальные, пищевые, химические,
лекарственные, микробные экзоаллергены. Пути проникновения аллергенов в организм. Эндоаллергены.
2. Гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ). Медиаторный тип ГНТ (I). Анафилактический шок, механизм развития.
Атопии, механизм развития, клинические формы. Цитотоксический тип ГНТ (II). Иммунокомплексный тип ГНТ (III).
3. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ, IV). Контактная аллергия. Инфекционная аллергия.
4. Методы диагностики аллергических болезней. Кожные пробы. Провокационные тесты. Элиминационные тесты.
Методы аллергодиагностики in vitro – определение антигенспецифических и антигеннеспецифических IgЕ.
5. Общие принципы специфической и неспецифической профилактики и терапии аллергических заболеваний.
Проведение специфической аллерговакцинации. Профилактика аллергических заболеваний на производстве, в быту,
при оказании медицинской помощи.
6. Противоинфекционный иммунитет. Понятие о естественном и искусственном, активном и пассивном, общем и
местном, постинфекционном и инфекционном (нестерильном) типах иммунитета.
7. Иммунопрофилактика инфекционных болезней. Определение. Активная иммунопрофилактика. Вакцины,
требования, предъявляемые к ним (иммуногенность, безопасность, ареактогенность, стабильность,
ассоциируемость). Типы вакцин (инактивированные, живые, анатоксины, химические, субъединичные, генно-
инженерные). Адъюванты. Основные бактериальные, вирусные и паразитарные вакцины. Методы оценки
поствакцинального иммунитета. Защитный титр антител.
8. Пассивная иммунопрофилактика. Определение. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины. Типы и способы
получения. Показатели активности. Показания к применению.
9. Иммунотерапия. Определение. Препараты для иммунотерапии. Механизм действия. Показания к применению.
Осложнения иммунопрофилактики и иммунотерапии.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

Аллергия –гипертрофированный (извращенный) иммунный ответ организма–на антиген.


К аллергическим реакциям относят два типа реагирования на чужеродное вещество:
гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ) и гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). К ГНТ
относятся аллергические реакции, проявляющиеся уже через 20-30 мин после повторной встречи с
антигеном, а к ГЗТ – реакции, возникающие через 6-8 ч и позже. Механизм и клинические проявления ГНТ и
ГЗТ различны. ГНТ связана с выработкой антител, а ГЗТ – с клеточными реакциями.
Выделяют 4 типа реакций гиперчувствительности (классификация Джелла и Кумбса).
реакции 1–го типа – анафилактические ; реакции 2-го типа – цитотоксические; реакции 3-го типа – «болезни
иммунных комплексов»;реакции 4-го типа – опосредованные т-клетками
Принципы диагностики аллергических заболеваний в зависимости от типа аллергической реакции
Основные
Принципы диагностики
Тип Ведущее звено патогенеза клинические
аллергических заболеваний
формы
1.Кожно-аллергические пробы с
Ig класса E (антитела) аллергенами: а)аппликационные
продуцируемые организмом в (накожные); б) скарификационные
ответ на воздействие антигена, (проба уколом или прик-тест);
которые связываются с в)внутрикожные.
I тип
рецепторами тучных клеток и 2.Провокационные тесты:
Анафилактические
базофилов. При повторной анафилактический (конъюнктивальный, назальный,
реакции
встрече с антигеном реакция шок, аллергический ингаляционный и др.)
немедленного типа
антиген – антитело происходит ринит. 3.Тесты с элиминацией аллергенов
(развиваются
уже на поверхности на этих (диета).
внезапно)
клеток раздражая их и вызывая 4. Лабораторные методы:
выделение медиаторов а)ИФА определения количества общих
(активных веществ) типа Ig E
гистамина. б) ИФА определения аллерген-
специфических Ig E
II тип Ig E, Ig M реагирующие с аутоиммунные
Цитотоксические антигенами, фиксированными гемолитические РИФ, РИА , проба Кумбса при
аллергические на мембранах собственных анемии, лекарствен-
реакции развиваются клеток организма. Активация ные аллергии, забо-
аутоиммунной гемолитической
в течение нескольких комплемента ведет к лизису левания щитовидной анемии.
минут или часов своих собственных клеток. железы.

51
Основные
Принципы диагностики
Тип Ведущее звено патогенеза клинические
аллергических заболеваний
формы
III тип Фиксированные иммунные
Иммунокомплексные комплексы антиген-антитело,
Сывороточная
аллергические образующиеся при избытке
болезнь, Выявление иммунных комплексов
реакции развиваются антигена откладываются в
инфекционный
в течение 3-10 часов кровеносных сосудах и других
эндокардит,
методом осаждения
(феномен Артюса) тканях, активируют систему полиэтиленгликолем
некоторые формы
или 6-7 дней комплемента и привлекают к
громелуронефрита.
сывороточная месту фиксации нейтрофилы ,
болезнь. т.е воспалительной реакции.
Все аллергические
IV тип проявления при
аллергические инфекционных
реакции клеточного болезнях, проба с Кожно-аллергические пробы
Взаимодействие Т-лимфоцитов (отличаются временем и
типа или туберкулином,
(Т киллеров или
аллергические
цитотоксических ) с антигеном
отторжение критериями оценки при учете
реакции трансплантата, реакции). Например, проба Манту (
при участии макрофагов
замедленного типа контактный туберкулиновый тест).
развиваются в дерматит,
течение 1-3 суток противоопухолевый
иммунитет.

Аллергологический метод диагностики инфекционных заболеваний основан на регистрации реакции


кожи в ответ на введение аллергенов возбудителей, сохраняющих антигенные свойства, но лишены
инфекциозности. Постановка внутрикожных проб с аллергеном производится на внутренней стороне
предплечья, вводится 0,1 мл аллергена (бруцеллин, тулярин, токсоаплазмин). Ответ оценивается спустя 1-2
суток по диаметру папулы, зоны гиперемии и отека.

Иммунопрофилактика - способ предупреждения инфекционных заболеваний путем создания


искусственного специфического иммунитета. Выделяют вакцинопрофилактику (создание активного
иммунитета за счет вакцин, антигенов) и серопрофилактику (пассивный иммунитет за счет введения в
организм специфических антител - иммуноглобулинов).

Иммунотерапия - метод лечения, при котором осуществляется воздействие на иммунную систему:


подавление иммунного ответа (иммуносупрессия), стимуляция ответа (иммуностимуляция), восстановление
иммунодефицитов (иммунокоррекция). В более узком смысле это применение иммунных сывороток,
иммуноглобулинов и вакцинотерапия для лечения инфекционных заболеваний. а) серотерапия применение
иммунных сывороток, иммуноглобулинов
б) вакцинотерапия применение вакцин с лечебной целью

Вакцина (от лат. vacca — корова) — препарат приготовленный из ослабленных или убитых
микроорганизмов, продуктов их жизнедеятельности, или из их антигенов, полученных генноинженерным или
химическим путём и, предназначенный для создания искусственного иммунитета к инфекционным болезням.
Живые вакцины воспроизводят в организме человека легко протекающую инфекцию, в ходе которой
формируются и активируются те же механизмы защиты, что и при развитии инфекционного иммунитета,
создают напряженный и длительный иммунитет. По способам получения различаю аттенуированные,
дивергентные и векторные рекомбинантные живые вакцины. Аттенуированные вакцины - АТТЕНУАЦИЯ
(от лат. attenuatio - уменьшение) - искусственное стойкое ослабление вирулентности патогенных
микроорганизмов, сохраняющих способность вызывать иммунитет. Дивергентные штаммы - штаммы
близкородственных в антигенном отношении, неболезнетворных для человека микроорганизмов, например,
для прививки против оспы используют вирус оспы коров. Векторные рекомбинантные вакцины-
конструируют, встраивая в геном (ДНК) вакцинного штамма вируса или бактерий ген чужеродного
антигена.
Убитые (корпускулярные) вакцины готовят из микроорганизмов, инактивированных прогреванием,
УФ-лучами, химическими веществами, в условиях, исключающих денатурацию антигенов. Это вакцины
против коклюша, гриппа, гепатита А, герпеса, клещевого энцефалита
Химические вакцины субъединичные содержат химически чистые антигены возбудителей, выделенные
из бактерий или вирусов после их разрушения. Их приготовление сложнее, чем цельноклеточных убитых,
52
однако они содержат меньше балластных компонентов микроорганизмов. Примеры вакцины против
брюшного тифа (на основе О-, Н- и Vi-антигенов), дизентерии, гриппа (на основе нейраминидазы и
гемагглютинина), сибирской язвы (на основе капсульного антигена) и др. Обладают слабой иммуногенностью
Генно-инженерные вакцины получают с помощью рекомбинантныхе штаммов, продуцирующих
антигены бактерий и вирусов в молекулярной форме. Например вакцина против гепатита В содержит
антигены вируса гепатита В, продуцируемые рекомбинантными клетками дрожжей.
Анатоксин (столбнячный, дифтерийный, ботулиновый, стафилококковый, против газовой гангрены)
получают путем выращивания возбудителей,продуцирующих токсины. После отделения микробных клеток
сепарированием культуральную жидкость (токсин) обезвреживают формалином в концентрации 0,3.0,4 %
при 37ºС в течение 3.4 нед. Обезвреженный токсин – анатоксин, потерявший токсичность, но
сохранивший антигенность, подвергают очистке и концентрированию, стандартизации и фасовке. К
очищенным анатоксинам добавляют консервант и адъювант. Такие анатоксины называют очищенными
сорбированными. Применяют анатоксины подкожно, внутримышечно; 2-3 прививки с последующими
ревакцинациями
Иммунные сыворотки получают из крови гипериммунизированных (интенсивно иммунизированных)
животных (лошади, ослы, кролики) соответствующей вакциной или крови иммунизированных людей
(используется донорская, плацентарная, абортная кровь). Очищенные от балластных белков (спиртами,
ферментами, ультрафильтрацией) и концентрированные иммунные сыворотки называют
иммуноглобулинами. Иммунные сыворотки, полученные из крови животных, называют гетерологичными, а
из крови людей – гомологичными. Сывороточные иммунные препараты применяют для специфического
лечения и экстренной профилактики. Основной механизм лечебного и профилактического действия сводится
к связыванию и нейтрализации антителами бактерий, вирусов и их антигенов, в том числе токсинов в
организме. В связи с этим различают противовирусные, антибактериальные, антитоксические иммунные
сывороточные препараты.
Антитоксические сыворотки: противодифтерийная очищенная, получают иммунизируя лошадей
дифтерийным анатоксином, используют для лечения дифтерии; противогангенозные сыворотки, получают
иммунизируя лошадей анатоксинами клостридий возбудителей газовой гангрены; противоботулиновые и
противостолбнячные атитоксические лечебные сыворотки.
Антимикробные (антивирусные) сыворотки получают из крови лошадей, гипериммунизированных
соответствующими убитыми бактериями, вирусами или их антигенами. Эти сыворотки не нашли широкого
применения в связи с аллергическими реакциями (анафилактический шок, сывороточная болезнь). Из них
получают Гамма-глобулины.
Гамма-глобулины получают спиртовым осаждением сыворотки крови при низких температурах. Из
крови человека получают гомологичные иммуноглобулины - иммуноглобулин нормальный человеческий
(для профилактики кори, менингококковой инфекции, полиомиелита), антирезусный иммуноглобулин, для
иммунопрофилактики гемолитической болезни новорожденных. Его вводят первородящим резус-
отрицательным женщинам. Из крови животных, иммунизированных вакцинными штаммами вирусов или
соответствующими вирусами получают гетерогенные иммуноглобулины- гамма-глобулин против
клещевого энцефалита, антирабический гамма-глобулин и др.
Для вакцинотерапии используют лечебные вакцины они нужны людям, которые уже инфицированы,
и их цель вызвать эффективный иммунный ответ. Это гонококковая , стафилококковая , дизентерийная,
протейная, бруцеллезная, герпетическая вакцины. Вакцина БЦЖ (имуром) может использоваться для
лечения рака мочевого пузыря -, лечебные аллерговакцины- содержащие солевые экстракты аллергенов для
лечения аллергий.

53
Приложение 1 к постановлению Министерства здравоохранения Республики Беларусь 18.07.2012 № 106 с изменениями
от 12.02.2016 г. (постановление Министерства здравоохранения РБ 12.02.2016 г. № 25)
Национальный календарь профилактических прививок
Перечень Группы физических лиц и
инфекций, против сроки проведения Наименование вакцины
которых профилактических
проводятся прививок
ВГВ – вакцина против вирусного гепатита В (генно-
профилактические Новорожденные в первые
инженерная дрожжевая жидкая - антиген вируса
прививки
Вирусный гепатит В 12 часов жизни, дети 1 и 5
гепатита В (HBsAg), выделенный из штамма
месяцев
продуцента Saccharomyces cerevisae
БЦЖ – вакцина против туберкулеза, или БЦЖ-М –
вакцина против туберкулеза с уменьшенным
Новорожденные на 3–5-й
Туберкулез содержанием антигена (сухая для внутрикожного
день жизни
введения- живые бактерии Mycobacterium bovis
вакцинного штамма БЦЖ-1)
Пневмококковая Дети в возрасте 2, 4 и 12 Пневмо-23 (содержит полисахариды капсулы 23
инфекция * месяцев основных серотипов пневмококков )
АКДС – адсорбированная (цельноклеточная) коклюшно-
дифтерийно-столбнячная вакцина, состоит из взвеси
убитых коклюшных микробов и очищенных
дифтерийного и столбнячного анатоксинов,
Дифтерия, столбняк, Дети в возрасте 3, 4, 5, 18
сорбированных на геле гидроксида алюминия или
коклюш месяцев
АаКДС (Инфанрикс) – адсорбированная
(ацеллюлярная) коклюшно-дифтерийно-столбнячная
вакцина сдержит антигены возбудителя коклюша и
очищенных дифтерийный и столбнячный анатоксины
Дети в возрасте 3, 4, 5
Полиомиелит ИПВ – инактивированная полиомиелитная вакцина
месяцев, 7 лет
Хиберикс – вакцина против гемофильной инфекции
Гемофильная Дети в возрасте 3, 4, 5, 18
типа b (cодержит капсульные полисахариды
инфекция * месяцев
гемофильной палочки тип b)
Комбинированная тривакцина «Тримовакс» (
Корь,
Дети в возрасте 12 месяцев содержит живые аттенуированные штаммы вирусов
эпидемический
и 6 лет кори, краснухи и эпидемического паротитаи) или
паротит, краснуха
живые моновакцины)
Дети в возрасте 6 лет, 16 АДС – адсорбированный дифтерийно-столбнячный
Дифтерия и лет, взрослые в 26 лет и анатоксин, или АДС-М – адсорбированный
столбняк каждые последующие 10 лет дифтерийно-столбнячный анатоксин с
до 66 лет уменьшенным содержанием антигенов
АД-М – адсорбированный дифтерийный анатоксин с
Дифтерия Дети в возрасте 11 лет
уменьшенным содержанием антигенов
Грипп ** Дети с 6 месяцев и взрослые Гриппол, Ваксигрип, Инфлювак и др.

Примечания: * прививки против пневмококковой и гемофильной инфекций проводят детям в


соответствии с возрастом и имеющим одно из следующих заболеваний или состояний: хронический гепатит,
цирроз печени; хронические заболевания почек, сердца и легких; иммунодефицитные состояния;
муковисцидоз);
** профилактические прививки против гриппа проводятся: детям от 6 месяцев до 3 лет; детям от 3 лет и
взрослым с хроническими заболеваниями; лицам с иммуносупрессией; лицам в возрасте старше 65 лет;
беременнм; медицинским работникам детям и взрослым, в учреждениях с круглосуточным режимом
пребывания; работникам госорганов, обеспечивающие безопасность государства .
В Республике Беларусь применяются комбинированные многокомпонентыные вакцины –
Пентаксим (для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша, полиомиелита, гемофильной инфекции,
вызываемой Haemophilus influenzae тип b) и Инфанрикс Гекса (адсорбированная ацеллюлярная (бесклеточная)
коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина, инактивированная полиомиелитная вакцина,
рекомбинантная вакцина против вируса гепатита В и вакцина для профилактики H.influenzae тип b).
54
ЗАНЯТИЕ № 15 ТЕМА: ОСНОВЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ. ИММУНОДЕФИЦИТЫ.
АУТОИММУННЫЕ БОЛЕЗНИ. ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ИММУНИТЕТ. ТРАНСПЛАНТАЦИОННЫЙ
ИММУНИТЕТ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ


1. Иммунный статус организма. Популяционные и возрастные особенности иммунного статуса. Показатели и методы
определения и оценки.
2. Иммунограмма. Показания к назначению иммунограммы. Основные правила интерпретации иммунограмм.
Принципы постановки иммунологического диагноза. Аналитическое заключение по результатам оценки иммунного
статуса. Соответствие с другими лабораторными тестами.
3. Иммунодефициты: наследственные и приобретенные. Клинические синдромы.
4. Аутоиммунные болезни. Механизмы развития. Клинические формы. Аутоантигены.
5. Противоопухолевый иммунитет. Концепция иммунного надзора. Характеристика антигенов опухолей. Механизм
элиминации опухолевых клеток под действием цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров.
Гуморальный тип иммунного ответа на опухолевые антигены, роль в противоопухолевом иммунитете. Механизмы
ускользания опухолей от иммунного надзора.
6. Трансплантационный иммунитет. Типы трансплантатов. Трансплантационные антигены. Условия развития реакции
иммунного отторжения трансплантата и его механизмы. Способы подавления трансплантационной реакции
Осложнения.
7. Особенности изменений иммунного статуса при различных иммунопатологических состояниях: первичных и
вторичных иммунодефицитах, органоспецифических и органонеспецифических аутоиммунных заболеваниях,
аллергических заболеваниях, опухолях.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

Клиническая иммунология - изучает этиологию и патогенез заболеваний, вызванных нарушениями


функций иммунной системы человека и разрабатывает методы их диагностики и лечения. К таким
заболеваниям относятся: 1. Реакции гиперчувствительности или аллергии; 2. Аутоиммунные
реакции; 3. Иммунодефицитные состояния.
ИММУНОГРАММА ( комплекс лабораторных показателей состояния иммунной системы.)

Показания 1.Инфекционный синдром (длительный субфебрилитет, лихорадка неясной этиологии;


к назначению хронические или часто повторяющиеся заболевания бактериальной вирусной, грибковой,
паразитарной природы; 2.Аллергический синдром (аллергопатология кожи, лор-органов,
иммунограммы бронхиальная астма, непереносимость пищевых продуктов и т.п.)
3.Аутоиммунный синдром (воспалительные заболевания опорно-двигательного аппарата,
громерулонефриты, патология щитовидной железы, инсулинзависимый сахарный диабет,
болезнь Аддисона и другие гормональные нарушения, рассеянный склероз, миастения ,
цитопенические болезни крови; аутоиммунные заболевания печени; аутоиммунные формы
бесплодия, патологии беременности, тяжелые формы течения климактерического синдрома;
4.Первичные иммунодефициты (у детей); 5. Вторичные иммунодефициты;
6.Иммунопролиферативный синдром (опухоли в иммунной системе (лимфолейкозы,
лимфосаркомы, болезнь Ходжкина, лимфомы, саркома Ка-поши); гиперплазия всех групп
лимфатических узлов с воспалительными процессами в них в сочетании с частыми
бактериальными инфекциями другой локализации; спленомегалия; мононуклеоз в анамнезе.
Основные Основной принцип оценки результатов комплексного исследования иммунного статуса
правила у больного — количественная и функциональная оценка всех его звеньев
интерпретации (антигеннеспецифических и антигенспецифических факторов) и их сравнение с
иммунограммы нормальными величинами. Под нормальным состоянием иммунного статуса
подразумевают показатели иммунной системы, определяемые у практически здоровых
лиц различных возрастных групп. Определение параметров иммунной системы при
различных патологических состояниях даёт возможность разделить последние на три
главные группы:
■ без существенных изменений в иммунном статусе;
■ с недостаточностью иммунной системы (иммунодефициты);
■ с гиперактивацией иммунокомпетентных клеток (аутоиммунная патология,
аллергия).
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС - совокупность показателей специфического и неспецифического характера
определяющий иммунное состояние организма. Эти показатели могут быть измерены и выражены в
количественной форме, так как известен их уровень при нормальном функционировании иммунной системы и
можно наблюдать отклонения при нарушениях ее работы.
55
Тесты первого уровня (ориентировочные) Тесты второго уровня (аналитические)
1. подсчет общего числа лимфоцитов (абсолютное 1. определение Т- и В-лимфоцитов и их
и относительное содержание в периферической субпопуляций (CD4+, CD8+);
крови); 2. определение циркулирующих иммунных
2. определение количества Т- и В-лимфоцитов; комплексов (ЦИК);
3. оценка фагоцитарной активности нейтрофилов; 3. постановка реакции бласттрансформации
4. определение основных классов сывороточных лимфоцитов (РБТЛ);
иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG); 4. определение специфических IgE;
5. определение титра комплемента (не всегда). 5. любые другие исследования состояния
иммунной системы.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОГО СТАТУСА


Количественная оценка лимфоцитов
Содержание Т- и В-лимфоцитов подсчитывают в люминесцентном микроскопе в реакции
иммунофлюоресценции (РИФ). Принцип метода: лимфоцитарная взвесь обрабатывается
моноклональными антителами против CD-маркеров отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов, а
затем меченой флюорохромом антиглобулиновой сывороткой. Подсчет флюоресцирующих клеток
проводят под люминесцентным микроскопом).
Современными методами оценки содержания и
дифференцировки Т-лимфоцитов, их субпопуляций, и других
иммунокомпетентных клеток являются методы, также основанные
на использовании моноклональных антител к CD-маркерам –
проточная цитометрия.
Принцип метода: «поштучный анализ» клеток,
обработанных меченными флюорохромами
моноклональными антителами в потоке жидкости по
показателям светорассеяния и флуоресценции с помощью
лазера.

Для определения Т- и В-лимфоцитов более доступным и простым, но менее точным и устаревшим является
метод розеткообразования. Определение количества Т-лимфоцитов (CD3+) методом иммунных розеток в
готовых препаратах Принцип метода: На 1 этапе методом центрифугирования в градиенте плотности из крови
выделяют лимфоциты. На 2 этапе с помощью реакции розеткообразования с эритроцитами барана определяют
процент Т-лимфоцитов от общего числа лимфоцитов. Реакция розеткообразования основана на наличии на
поверхности Т-лимфоцитов рецепторов, способных фиксировать эритроциты барана. При добавлении к суспензии
лимфоцитов эритроцитов барана, последние адсорбируются Т-лимфоцитами, а образующиеся при этом структуры
называются розетками. Общее количество лимфоцитов подсчитывают под микроскопом по количеству розеток.

Препарат мазок крови краска по Романовскому Увеличение 900


Метод выявляет маркер CD 3 на поверхности T-лимфоцитов;
Содержание В-лимфоцитов – (CD 3) = 45-70% от общего числа лимфоцитов

Ис с ле дова н ие ф ун кцион а льн ого с ос тоя н ия лим ф оц итов


Определеляют способность лимфоцитов размножаться (оценка способности к пролиферации) в ответ на введение митогенов
(веществ, стимулирующих размножение) в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).
Оценка способности к пролиферации в реакции бластной трансформации лимфоцитов

56
Принцип метода: Т-лимфоциты под воздействием некоторых биостимуляторов, например, фитогемагглютинина (ФГА) в культуре in
vitro способны превращаться в большие бластоподобные клетки с разрыхленным ядром и базофильной цитоплазмой, активно
синтезирующие ДНК.

Пример иммунограммы
.

57
ЗАНЯТИЕ № 16 ТЕМА: ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ ПО РАЗДЕЛАМ «ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И
ПРИКЛАДНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ»
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Патогенность и вирулентность. Облигатно-патогенные и
условно-патогенные микроорганизмы. Факторы, повышающие и снижающие вирулентность микробов.
Методы определения вирулентности, единицы. Генетический контроль патогенности и вирулентности.
2. Факторы патогенности микроорганизмов. Адгезины. Факторы колонизации. Инвазины. Факторы агрессии
микробов. Токсичность и токсигенность микроорганизмов. Эндотоксины, свойства, получение, применение.
Экзотоксины, свойства, получение, единицы измерения. Типы экзотоксинов, механизм действия.
3. Роль макроорганизма в развитии и течении инфекционных болезней. Наследственные факторы. Анатомо-
физиологическое состояние организма. Роль условий жизни в развитии и течении инфекционных болезней.
Природные и социальные факторы.
4. Отличия инфекционных болезней от неинфекционных. Механизмы и пути передачи инфекции. Входные
ворота. Динамика инфекционного процесса, его особенности.
5. Классификация инфекционных процессов по тяжести, характеру возбудителя, по источнику инфекции,
способу передачи возбудителя и механизму заражения, по распространенности. Классификация
инфекционных процессов по локализации микробного очага, длительности течения и кратности заражения.
6. Биологический (экспериментальный) метод исследования, этапы, оценка. Лабораторные животные. Способы
заражения.
7. Иммунология. Определение. История возникновения и развития. Задачи медицинской иммунологии,
межпредметные связи, значение для практической медицины.
8. Факторы и механизмы неспецифической резистентности. Барьерные и противомикробные свойства кожи,
слизистых оболочек, лимфатических узлов, ареактивность тканей, нормальная микрофлора.
9. Гуморальные факторы неспецифической защиты: эндогенные пептиды-антибиотики, пропердин, лизоцим,
-лизины, фибронектин, белки острой фазы воспаления.
10. Интерфероны. Группы интерферонов по продуцентам, типы ИФН по способу образования. Механизм
действия интерферонов.
11. Система комплемента. Структура. Пути активации (классический, альтернативный). Активаторы системы
комплемента. Ингибиторы и инактиваторы комплементарного каскада. Биологические функции
активированных компанентов комплемента. Биологически активные фрагменты, их функции.
Анафилатоксины, их биологическая роль. Мембраноатакующий комплекс (МАК). Методы определения
активности системы комплемента.
12. Полиморфноядерные и мононуклеарные фагоциты (происхождение, характеристика, функции).
Фагоцитарная реакция (фазы, механизмы и факторы внутриклеточной бактерицидности). Исходы
фагоцитоза.Показатели фагоцитоза и методы их определения.
13. Естественные киллеры. Механизмы распознавания и цитолиза клетки-мишени.

14. Антигены: определение, принцип строения, свойства антигенов. Классификации антигенов. Групповые,
видовые, вариантные, стадийные антигены. Перекрестные антигены. Антигенная мимикрия. Антигены
бактерий. Антигенные свойства грибов.
15. Иммунокомпетентные органы (центральные и периферические), иммунокомпетентные клетки, факторы
межклеточного взаимодействия иммунной системы. Главный комплекс гистосовместимости (ГКГС).
Молекулы I, II и III классов ГКГС, строение, распределение на клетках и тканях. Биологическое значение
молекул ГКГС, роль в распознавании и элиминации чужеродного материала.
16. В-лимфоциты: развитие, маркеры. В-клеточный рецептор: структура (константные и вариабельные
участки, полипептидные цепи). Механизмы В-клеточной активации. Функция В-лимфоцитов.
17. Антитела. Структура молекулы иммуноглобулинов: вариабельные и константные области, расположение и
структура доменов. Антигенсвязывающие участки. Механизм взаимодействия антител с антигенами.
Валентность, аффинность и авидность антител. Полные и неполные антитела. Иммунные комплексы.
18. Классы и субклассы иммуноглобулинов; изотипы, аллотипы, идиотипы.
19. Антителогенез, динамика синтеза антител. Поликлональные и моноклональные антитела
20. Биологические эффекты взаимодействия антител с антигенами: активация комплемента, нейтрализация токсинов
и вирусов, лизис, агглютинация и опсонизация микроорганизмов, торможение адгезии, инвазии, подавления
фагоцитарной реакции.
21. Гуморальный иммунный ответ, динамика развития. Первичный и вторичный иммунный ответ,
переключение биосинтеза классов иммуноглобулинов.
22. Прямая и непрямая реакция Кумбса. Простая радиальная иммунодиффузия в агаре по Манчини.

58
23. Т-лимфоциты: развитие, маркеры. Субпопуляции Т-лимфоцитов (Т-хелперы нулевые, Т-хелперы 1, 2
типов, Т-регуляторы; Т-эффекторы: цитотоксические Т-лимфоциты, Т-лимфоциты памяти).
24. Т-клеточный рецептор: строение, типы, генетический контроль, разнообразие, его роль. Т-зависимые
антигены.
25. Клеточный иммунный ответ, динамика развития, мишени действия Т-килеров, проявления.
26. Серологический метод исследования: задачи, этапы, оценка. Общая классификация иммунологических
методов диагностики: серотипирование, серодиагностика
27. Диагностикумы. Диагностические иммунные сыворотки. Методы их получения. Поливалентные,
монорецепторные адсорбированные (поликлональные) и моноклональные диагностические сыворотки и тест-
системы.
28. Качественная и количественная оценка серологических реакций: титр иммунных сывороток,
диагностический титр, нарастание титра антител, аффинность и авидность антител.
29. Механизмы течения и проявления реакций агглютинации. Нагрузочные реакции агглютинации: постановка
и учет реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), латекс-агглютинации. Реакция ко-агглютинации. Оценка
результатов.
30. Реакции иммунопреципитации: варианты постановки.(кольцепреципитация по Асколи, двойная диффузия
в агаре, иммуноэлектрофорез), методы учета и оценки.
31. Реакции нейтрализации токсина антитоксической сывороткой.
32. Реакции иммунного лизиса и связывания комплемента: методика постановки, учета и оценки, применение
в диагностике инфекционных заболеваний.
33. Реакции иммунофлюоресценции. Диагностическое значение, информативность, варианты постановки
реакций.
34. Иммуноферментный анализ. Варианты постановки. Возможные ошибки и ограничения метода.
35. Иммуноблотинг (вестерн-блотинг). Проведение и учет результатов. Варианты применения метода.
36. Радиоиммунный анализ, сущность, способы постановки, методы учета и оценки реакций, достоинства и
недостатки.
37. Аллергия, определение, стадии аллергии. Аллергены. Бытовые, пыльцевые, эпидермальные, пищевые,
химические, лекарственные, микробные экзоаллергены. Пути проникновения аллергенов в организм.
Эндоаллергены.
38. Гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ). Медиаторный тип ГНТ (I). Анафилактический шок,
механизм развития. Атопии, механизм развития, клинические формы. Цитотоксический тип ГНТ (II).
Иммунокомплексный тип ГНТ (III).
39. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ, IV). Контактная аллергия. Инфекционная аллергия.
40. Методы диагностики аллергических болезней. Кожные пробы. Провокационные тесты. Элиминационные
тесты. Методы аллергодиагностики in vitro – определение антигенспецифических и антигеннеспецифических
IgЕ.
41. Общие принципы специфической и неспецифической профилактики и терапии аллергических заболеваний.
Проведение специфической аллерговакцинации. Профилактика аллергических заболеваний на производстве, в
быту, при оказании медицинской помощи
42. Противоинфекционный иммунитет. Понятие о естественном и искусственном, активном и пассивном,
общем и местном, постинфекционном и инфекционном (нестерильном) типах иммунитета.
43. Иммунопрофилактика инфекционных болезней. Определение. Активная иммунопрофилактика. Вакцины,
требования, предъявляемые к ним. Типы вакцин (инактивированные, живые, анатоксины, химические,
субъединичные, генно-инженерные). Адъюванты. Основные бактериальные, вирусные и паразитарные
вакцины. Методы оценки поствакцинального иммунитета. Защитный титр антител.
44. Пассивная иммунопрофилактика. Определение. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины. Типы и
способы получения. Показатели активности. Показания к применению.
45. Иммунотерапия. Определение. Препараты для иммунотерапии. Механизм действия. Показания к
применению. Осложнения иммунопрофилактики и иммунотерапии.
46. Иммунный статус организма. Популяционные и возрастные особенности иммунного статуса. Показатели и
методы определения и оценки.
47. Иммунограмма. Показания к назначению иммунограммы. Основные правила интерпретации
иммунограмм. Принципы постановки иммунологического диагноза.
48. Иммунодефициты: наследственные и приобретенные. Клинические синдромы.
49. Аутоиммунные болезни. Механизмы развития. Клинические формы. Аутоантигены.
50. Противоопухолевый иммунитет. Концепция иммунного надзора. Характеристика антигенов опухолей.
Механизм элиминации опухолевых клеток под действием цитотоксических лимфоцитов и естественных
киллеров. Гуморальный тип иммунного ответа на опухолевые антигены, роль в противоопухолевом
иммунитете. Механизмы ускользания опухолей от иммунного надзора.

59
51. Трансплантационный иммунитет. Типы трансплантатов. Трансплантационные антигены. Условия развития
реакции иммунного отторжения трансплантата и его механизмы. Способы подавления трансплантационной
реакции Осложнения.
52. Особенности изменений иммунного статуса при различных иммунопатологических состояниях: первичных
и вторичных иммунодефицитах, органоспецифических и органонеспецифических аутоиммунных
заболеваниях, аллергических заболеваниях, опухолях.

Рекомендуемая литература (электронные версии ):

Рекомендуемая литература (электронные версии):

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / под. ред. В. В. Зверева, А.С. Быкова


2016. — 816 с.
2. Павлович С.А., Пяткин К Л. Медицинская микробиология: Практикум. - Мн.: Выш. шк., 993. -
200 с.
3. Курс лекций по микробиологии, вирусологии, иммунологии / Тапальский Д.В. и др. ⎯ГГМУ,
2012. — 317 с.
4. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии; / Под. ред. А. А. Воробьева.
— 2003. — 230 с.
5. Атлас по иммунологии и аллергологии ; / Под. ред. А. А. Воробьева. — 2006. — 287

60

Оценить