Вы находитесь на странице: 1из 14

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНЖЕНЕРНЫЙ ИНСТИТУТ

КАФЕДРА УПРАВЛЕНИЕ КАЧЕСТВОМ

РЕФЕРАТ
по дисциплине
БИОТЕХНОЛОГИИ

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНОВ

Выполнил
Студент группы 16-701
«___»_________20__г. _____________________ (Н.Н. Нуриев)

Проверил
Преподаватель
«___»_________20__г. _____________________ (Р.Р. Хузина)

Казань 2021
СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ .......................................................................................................... 3
1 ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНА ИЗ ДНК .......................................................................... 5
2 ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ................................................... 7
3 ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ...................................................................... 8
4 ВВЕДЕНИЕ ГЕНА В ВЕКТОР ......................................................................... 9
5 ПЕРЕНОС ГЕНОВ В КЛЕТКИ ОРГАНИЗМА РЕЦИПИЕНТА .................. 11
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................. 13
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ ............ 14

2
ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день существует три способа получения гена:


выделение его из ДНК; путем химико-ферментативного синтеза и
воссозданием на основе ферментативного синтеза.
Выделение нужного гена из ДНК. Один из первых способов получения
гена, который был предложен, — выделение ДНК из подходящего источника
при помощи специфических ферментов — эндонуклеаз рестрикции, или
рестриктаз. Этот метод обычно применяют в том случае, если структура
ДНК, из которой выделяют нужный ген, хорошо известна, как и сайты
рестрикции. В общем виде схема эксперимента выглядит следующим
образом. Вначале получают гомогенную ДНК, затем ее обрабатывают
комплексом рестриктаз. Рестрикты встраивают в подходящую плазмиду (как
правило, из серии pBRдля Е. coli), которую в свою очередь вводят в клетки-
реципиенты, и исследуют просинтезированные белки. Отбирают те клетки,
которые синтезируют нужный белок, а, следовательно, несут нужный ген.
Описанный метод на первый взгляд кажется весьма простым и доступным.
Однако у него существует ряд недостатков: обработка рестриктазой нативной
ДНК может привести к расщеплению нужного гена или к отщеплению
вместе с ним лишних участков этой кислоты, тогда полученные рестрикты не
будут иметь никакой ценности, в выделенные таким способом гены нельзя
встроить какие-то регуляторные элементы, поскольку неизвестна их
структура и функциональная активность.
Химико-ферментативный синтез нужного гена. В качестве
альтернативы вышеописанному методу был предложен второй метод —
химико-ферментативный. Его сущность заключается в следующем. На
первом этапе химическим синтезом получают короткие олигонуклеотиды,
которые затем соединяют при помощи фермента лигазы. В результате
получают нужный ген, не имеющий лишних участков, полностью
соответствующий природному гену. Кроме того, в процессе синтеза в его

3
структуру можно встроить необходимые регуляторные элементы, ввести
какие-то замены и т. д. Однако описанный метод применим лишь в том
случае, когда известна структура нужного гена или хотя бы структура
кодируемого им белка. К недостаткам данного способа относится еще и
трудоемкость.
Воссоздание путем ферментативного синтеза. Это наиболее
популярный метод синтеза генов. Матричной РНК обычно много в клетках,
специализирующихся на синтезе определенного белка. Она не содержит
интронов соответствующих генов, поэтому может транслироваться в
бактериальной клетке. Обратная транскриптаза — РНК-зависимая ДНК-
полимераза — образует копии ДНК с геномов мРНК.

4
1 ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНА ИЗ ДНК

Данный процесс происходит следующим образом, изолированную


ДНК подвергают фрагментации. Для этого используют ферменты -
рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), катализирующие расщепление
ДНК на участках, имеющих определенные последовательности нуклеотидов
(обычно длиной в 4-7 нуклеотидных пар). Расщепление может происходить
по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар, и тогда обе нити ДНК
«разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты имеют
двунитевые (тупые) концы. Другие рестриктазы расщепляют нити ДНК со
сдвигом, образуется ступенька – одна из нитей ДНК выступает на несколько
нуклеотидов. Образуются однонитевые (липкие) концы. Если встречаются
два липких фрагмента ДНК, полученных действием одной и той же
рестриктазы, то они легко вступают во взаимодействие (по принципу
комплементарности) При необходимости тупые концы могут быть
превращены в липкие. Нуклеотидная последовательность с липкими концами
может быть присоединена к вектору, предварительно обработанному той же
рестриктазой или превращена из линейной молекулы в кольцевую путем
сшивания взаимно комплементарных концов.

Однако данный метод выделения генов из ДНК имеет недостатки:

1) Достаточно трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать


из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену. Наряду с
интересующим геном фрагменты ДНК, как правило, включают лишние
нуклеотидные последовательности, мешающие использованию гена.
Рестриктаза может отщепить часть нуклеотидной последовательности гена, в
результате ген теряет функциональную полноценность.

5
2) Гены эукариот имеют сложное строение: включают экзоны и
интроны. Первичная РНК, синтезированная на такой ДНК-матрице,
подвергается модификации (сплайсингу), в результате участки,
соответствующие интронам, удаляются, а участки, соответствующие
экзонам, соединяясь, образуют зрелую матричную РНК. Наличие интронов
является препятствием для нормального функционирования
трансплантированных генов.

3) При обработке ДНК рестриктазами образуется смесь фрагментов.


Выделить из нее фрагменты, несущие нужный ген – сложная задача.
Бактериальная клетка содержит около 5 тыс. генов, а эукариотная клетка – от
10 до 200 тыс. генов.

6
2 ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ

Данный метод является альтернативой «вырезанию» генов с помощью


рестриктаз из нативной ДНК. Метод включает химический синтез коротких
(8-16-звенных) одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет
поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшивку
олигонуклеотидов между собой посредством ДНК-лигазы с образованием
двухцепочечных полинуклеотидов.
Химико-ферментативный синтез позволяет точно воссоздать
минимально необходимую последовательность нуклеотидов. Кроме того,
существует возможность введения в гены участков узнавания различных
рестриктаз, регуляторных последовательностей.
Применимость данного метода ограничена возможностями получения
информации о нуклеотидной последовательности гена. Эта
последовательность может быть воссоздана на основе первичной структуры
соответствующего белка.
Методом химико-ферментативного синтеза получены гены
соматостатина, А- и В-цепей инсулина, проинсулина и др.

7
3 ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ

Ферментативный синтез генов на основе выделенной из клетки м-РНК.


Это наиболее широко распространенный метод синтеза генов. Обратная
транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной
мРНК. Полученную одноцепочечную ДНК (комплементарная ДНК, кДНК)
используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с
применением ДНК-полимеразы или ревертазы.

Достоинством данного метода является то, что ген получается без


интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Кроме того,
легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем
отбирать ген из смеси фрагментов ДНК.

С помощью этого метода в 1979 г. был получен ген соматотропин


(гормон роста человека).

8
4 ВВЕДЕНИЕ ГЕНА В ВЕКТОР

Ген, полученный одним из выше описанных способов, содержит


информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту
информацию. Для этого нужны дополнительные механизмы, управляющие
действием, поэтому перенос генетической информации в клетку
осуществляется в составе векторов.
Векторы – это, как правило, кольцевые молекулы, способные к
самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует
рекомбинантную ДНК.
Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro.
Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Полученная
линейная молекула ДНК должна содержать липкие концы, комплементарные
концам вводимой ДНК. Комплементарные липкие концы вектора и
вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК
с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой
кольцевой молекулы
Различают два основных класса векторов: вирусы и плазмиды. При
использовании в качестве генетических векторов вирусов возникает
проблема – ослабление их патогенности для хозяина. Большое значение для
биотехнологии имеет способность вирусов быстро транспортироваться из
клетки в клетку, распространяясь по растительной или животной ткани так,
что в короткие сроки развивается генерализованная инфекция по всему
организму. Такое свойство вирусов дает возможность генетической
модификации соматических клеток взрослого организма, что является
перспективным при лечении наследственных заболеваний человека путем
введения вирусов, разносящих недостающие гены по всем ~ 1011клеткам
человеческого тела.
Однако наибольшее применение в генетической инженерии нашли
бактериальные плазмиды, особенно плазмиды E. coli. Бактериальные

9
плазмиды подразделяются на конъюгативные, т.е. способные к переносу
генетической информации от клетки к клетке путем конъюгации бактерий, и
неконъюгативные, передающиеся от одной клетки к другой посредством
механизма бактериальной трансформации. Некоторые плазмиды способны к
амплификации, т.е. образуют в клетке большое число копий, что резко
повышает уровень фенотипического выражения генов.
При конструировании векторов в них вводят участки узнавания
рестриктаз, а также гены-маркеры, кодирующие легко распознаваемые
признаки. По этим признакам отбирают клетки, являющиеся носителями
вектора.

10
5 ПЕРЕНОС ГЕНОВ В КЛЕТКИ В ОРГАНИЗМА РЕЦИПИЕНТА

Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем


трансформации или конъюгации. Если гены встраиваются в геном вируса, то
наиболее распространенным способом передачи информации является
трансформация.
Чтобы клетку легко можно было трансформировать она должна быть
компетентной. Компетентность бактериальных клеток достигают обработкой
СаСl2, полиэтиленгликолем, воздействием теплового удара. ДНК легко
проникают в клетку через цитоплазматическую мембрану протопластов.
Протопласты бактерий получают при обработке лизоцимом, который
гидролизирует мукопептиды клеточной стенки. Протопласты клеток
растений и дрожжей получают, разрушая ферментами полисахариды
оболочки. Эффективность трансформации протопластов эукариот
увеличивает диэтиламиноэтилдекстран и полиэтиленгликоль. ДНК в клетки
высших организмов вводят микроинъекцией.
Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь
передачи генетической информации, она имеет наибольшее значение для
генетической инженерии. Однако существуют еще два способа передачи
генетической информации – конъюгация и трансфекция, которые можно
рассматривать как варианты трансформации.
При конъюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид
(конъюгативных). Неконъюгативные плазмиды также могут передаваться
путем конъюгации при участии плазмид-помощников.
Трансфекция – передача всего набора генов вируса или фага,
приводящая к развитию вирусных частиц в клетке. Трансфекция бактерий
включает следующие этапы: получение сферопластов, очистка среды
инкубации от внеклеточных нуклеаз и добавление очищенной ДНК фага (с
добавлением протаминсульфата, повышающим эффективность
трансфекции). Трансфекцию клеток растений и животных осуществляют
11
двумя способами: использованием очищенной ДНК и протопластов, а так же
заражением целых многоклеточных организмов (в этом случае говорят об
инфекции) вирусными частицами или ДНК. Кроме того, сконструированы
многочисленные челночные векторы, способные к репликации в животной и
бактериальной клетке и поддерживающие эффективный синтез
клонируемого гена в животной клетке.

12
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важная роль генетической инженерии заключается в создании


организмов, способных синтезировать различные вещества, или организмов,
способных перерабатывать субстраты с образованием продуктов
необходимых для человека (например, переработка отходов в биомассу). До
сих пор перспектива применения генетической инженерии для лечения и
профилактики заболеваний остаётся актуальной. Широкое развитие
получают проекты по секвенированию и анализу геномов патогенных
микроорганизмов, что позволяет изучать механизмы их воздействия на
организм. Это создаёт базу знаний, необходимых для эффективной
разработки современных средств и методов лечения от патогенных
микроорганизмов.

13
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ

1. Зуев Л., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и


применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с., илл. ISBN 5-03-003328
2. Волков С.Н. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. унив.
изд-во, 2004. — 496 с.; илл. ISBN 5-94087-098-8
3. Пигаев Л.И. Искусственные генетические системы — М.: Наука,
2005 — В 2 т. — ISBN 5-02-033278-X
4. Лужин В.В. Основы полимеразной цепной реакции. – М.: ДНК-
технология, 2012 – 80 с.
5. Молекулярная клиническая диагностика. Методы /пер. с англ.; под
ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. – М.: Мир,1999 – 558 с.
6. Щербо С.Н. ПЦР в клинической лабораторной диагностике:
реальности и перспективы //Справочник заведующего КДЛ 2006. №10 с. 45-
48
7. Чухловин.А.Б. Метод ПЦР в клинической лабораторной диагностике
// Справочник заведующего КДЛ. 2008. №4 с.46-50
8. Херсонская А.М. Современные методы клинической диагностики:
ПЦР в режиме реального времени // Справочник заведующего КДЛ 2007.
№11 с.31-36
9. Херсонская А.М., Амон Е.П. Типовые ошибки при диагностике
методом ПЦР // Справочник заведующего КДЛ 2008. №5 с.30-36
10. Скала Л.З. Современные аспекты клинической микробиологии. -
М., 1999. - 323 с.
11. Бонецкий А., к.м.н. Таирова М.М., Кутукеев Т.С. Использование
полимеразной цепной реакции в клинической практике. - Методические
рекомендации, Бишкек. - 2003г.
12. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-
генетический анализ биоптатов. В кн.: "Молекулярно-клиническая
диагностика. Методы".- М., "Мир", 1999г. - с.395-425.
14