Вы находитесь на странице: 1из 20

In Vitro Trans Translation Mediated by

Alanine-charged 10Sa RNA


H. Himeno et al, J. Mol.Biol. (1997)
Гипотеза транс-трансляции
(Keller, 1996)

(малая стабильная бактериальная РНК)


Предпосылки к гипотезе транс-трансляции:
1. 5’ и 3’ концы всех бактериальных 10Sa
РНК образуют тРНК-подобную
вторичную структуру.

A 10Sa РНК E.coli B Каноническая дрожжевая тРНКPhe

(x1, x2 – места образования сшивок при облучении УФ)


Предпосылки к гипотезе транс-трансляции:
3’ ССA
1. 5’ и 3’ концы всех бактериальных 10Sa
РНК образуют тРНК-подобную
вторичную структуру.
Акцепторный
стебелек

TψC петля
Предпосылки к гипотезе транс-трансляции:
3’ ССA
1. 5’ и 3’ концы всех бактериальных 10Sa
РНК образуют тРНК-подобную
вторичную структуру. Эта укладка
соответствует минимальным Акцепторный
структурным требованиям для стебелек
узнавания EF-Tu.

Причем G*U пара в третьем


положении характерна для
аланиновых тРНК.
TψC петля
Предпосылки к гипотезе транс-трансляции:
2. 10Sa РНК содержит небольшую ORF.
Предпосылки к гипотезе транс-трансляции:
2. 10Sa РНК содержит небольшую ORF.
У бактерий при трансляции с мРНК, не
содержащих стоп-кодон, образуются
белки, С-котерминальные по 11
аминокислотным остаткам
(AANDENYALAA).
И последние 10 аминокислот ORF
10Sa совпадают с десятью
С-концевыми аминокислотами
этой последовательности.
Причем единственная
несовпадающая
аминокислота – аланин!
Гипотеза транс-трансляции:
“гибридная” РНК – tmRNA –
переключает рибосому на себя в
качестве матрицы. Для этого tmRNA
вначале выступает как tRNAAla.
Альтернативные гипотезы: белковый транс-сплайсинг:

N-extein tag protein C-extein

dimerization Tagged protein

Protein splicing
Альтернативные гипотезы: белковый транс-сплайсинг

Предсказание: при 10Sa РНК – зависимом синтезе белка будет


происходить включение не только последних десяти аминокислот
ORF, но и предыдущих.

Например, не только Ala, Tyr, Asp, Glu, но и Val, Ile, Arg.


Отрицательным контролем будет аминокислота, вообще не
встречающаяся в ORF, например, Ser. Внутренний контроль –
молярное соотношение включающихся аминокислот.

Включение меченой аминокислоты проверяют в бесклеточной


системе трансляции на основе S-30 фракции, полученной из ΔssrA
штамма E. coli (ssrA – это ген 10Sa РНК). Матрицей служит
искусственная мРНК без стоп-кодонов (polyU). В систему добавляют
10Sa РНК, предварительно загруженную аланином.
Альтернативные гипотезы: белковый транс-сплайсинг
Предсказание: при 10Sa РНК – зависимом синтезе белка будет происходить
включение не только Ala, Tyr, Asp, Glu, но и Val, Ile, Arg. Отрицательным
контролем будет Ser. Закрашенные кружочки соответствуют опытам без
добавления polyU.

Ala Tyr Asp Glu

Val Ile Arg Ser


Альтернативные гипотезы: белковый транс-сплайсинг
Предсказание: при 10Sa РНК – зависимом синтезе белка будет происходить
включение не только Ala, Tyr, Asp, Glu, но и Val, Ile, Arg. Отрицательным
контролем будет Ser. Закрашенные кружочки соответствуют опытам без
добавления polyU.
Результаты и выводы: ORF внутри 10Sa РНК служит матрицей для трансляции,
но не вся, а последние 10 смысловых кодонов.
Гипотеза белкового транс-сплайсинга неверна.
Первая аминокислота – аланин, не кодируемый матрицей.
Ala Tyr Asp Glu

Val Ile Arg Ser


Проверка важности аланин-акцепторной способности
10Sa РНК для стимуляции трансляции
Была получена мутантная 10Sa РНК, неспособная аминоацилироваться
аланином in vitro (G*U заменен на A*U в третьем положении)

Пустые кружочки – нормальная 10Sa РНК, заполненные – мутантная.


Проверка важности аланин-акцепторной способности
10Sa РНК для стимуляции трансляции
Мутантная 10Sa РНК (квадратики) неспособна стимулировать включение
кодируемых ею аминокислот. Кружочки соответствуют нормальной 10Sa РНК

Ala Tyr
Альтернативные гипотезы: транс-сплайсинг РНК:

мРНК 10Sa РНК

Побочный продукт
транс-сплайсинга
Альтернативные гипотезы: транс-сплайсинг РНК:
Предсказание: нозерн-блот с зондами к некодирующей части 10Sa РНК
позволит детектировать продукты иной длины, чем 10Sa РНК.
Ассоциация 10Sa РНК с рибосомой в градиенте сахарозы не будет более
существенной, чем для мРНК

мРНК 10Sa РНК

Побочный продукт
транс-сплайсинга
Альтернативные гипотезы: транс-сплайсинг РНК:
Результаты и выводы: продукты транс-сплайсинга отсутствуют.
Ассоциация с рибосомой кореллирует со способностью 10Sa РНК к
аминоацилированию аланином. Гипотеза транс-сплайсинга неверна.

Нормальная Мутантная
10Sa РНК 10Sa РНК
Вывод:

Описанные эксперименты по 10Sa РНК -зависимой


трансляции in vitro исключают возможности транс-
сплайсинга на уровне белка или РНК. Опыты
согласуются с гипотезой транс-трансляции.

В пользу существования особого механизма транс-


трансляции также говорит наличие участка
комплементарности между 10Sa РНК и 16S рибосомной
РНК. Такое взаимодействие подтверждается
результатами экспериментов со сшивками.
Согласно современным представлениям, транс-трансляция является
системой контроля качества РНК (и в какой-то степени белка).