СОЧЕТАННЫЕ МЕТОДИКИ
Юлия Кирова Анна Куприянова
Код да Винчи
Репрограммирование дермы как важнейший этап
репарации и реновации кожи.
Введение
Исследование сукцинатзависимых механизмов актив‑
ности Hyalual (Куприянова А. В., Кирова Ю. И., 2019),
в ходе которого был выявлен сукцинатный рецептор
SUCNR1 в коже, позволило методом иммуногистохимии
установить наличие сукцинатного рецептора SUCNR1
в фибробластах, кератиноцитах, эндотелиоцитах, тучных
клетках, макрофагах. Наиболее высокий уровень экспрес‑
сии SUCNR1 был обнаружен в макрофагах, что позволило
рассматривать их главной мишенью воздействия с целью
стимуляции процессов регенерации и реновации (редер‑
мализации) кожи препаратом Hyalual.
Недавние исследования (2016 – 2018 гг.) регуляции
морфофункционального состояния макрофагов свиде‑
тельствуют о вовлечении системы сукцинат / SUCNR1
в формирование репаративного (противовоспалительно‑
го, М2) фенотипа макрофагов [8, 10, 14].
Дермальные макрофаги представляют собой основную
популяцию иммунных клеток кожи, которые, помимо им‑
мунной функции (фагоцитоз, секреция цитокинов и пре‑
зентация антигена), опосредуют механизмы развития
ткани, тканевого гомеостаза, воспаления и репарации [5, 7].
Макрофаги первого типа (провоспалительный фенотип,
М1) играют ключевую роль в воспалении. Одной из ши‑
роко известных теорий старения является теория инфла‑
мейджинга (хронического воспаления в коже, в процессе
которого и формируются основные признаки старения:
тусклый цвет лица, нарушения микрорельефа кожи, фор‑
мирование дермальных депрессий, пигментации и дру‑
гих признаков, по которым мы привыкли определять
состояние кожи). В настоящее время придаётся большое
значение резидентным макрофагам в развитии инфла‑
мейджинга. В начале воспаления макрофаги активируют‑
16  ОБЛИК. ESTHETIC GUIDE
д. б. н., Москва. врач-дерматолог,
косметолог, Москва.
ся, происходит индукция более 400 генов, необходимых
для элиминации бактерий и регуляции других клеток
посредством секреции цитокинов и хемокинов.
Макрофаги первого типа являются самыми активными
тканевыми продуцентами янтарной кислоты, что связа‑
но с активацией в них гликолитической продукции АТФ
и частичной блокадой цикла Кребса [2]. Выброс янтарной
кислоты М1‑макрофагами во внеклеточное пространство
приводит к индукции SUCNR1 и последующей их поляри‑
зации в репаративный / противовоспалительный М2‑фе‑
нотип. Экспрессия SUCNR1 в М2 увеличена по сравне‑
нию с М1 (Diepen S. et al., 2017).
Таким образом, рецепторы SUCNR1 вовлекаются
в регуляцию смены фаз воспаления и формирование
М2‑фенотипа макрофагов, реализующих экспрессию
широкого спектра ростовых факторов, которые реализу‑
ют механизмы ангиогенеза, пролиферации фибробластов,
формирования дермального матрикса, что в целом влияет
на скорость и качество репаративных процессов в коже,
в том числе и на процессы восстановления внешнего вида
кожи и активации в ней процессов омоложения.
Маркерами М2‑фенотипа макрофагов являются VEGF
(фактор роста эндотелия сосудов), TGF-β1 (трансформи‑
рующий фактор роста, иммуносупрессивный цитокин,
ограничивает хемотаксис нейтрофилов, инициирует
дифференциацию миофибробластов и синтез коллагена),
FGF2 (фактор роста фибробластов) [6, 9, 11].
Учитывая результаты предыдущего этапа исследования
(увеличение количества фибробластов, плотности сети
микрососудов и коллагеновых волокон), было принято
решение о дальнейшем изучении SUCNR1‑зависимых
механизмов активности препарата Hyalual из‑за больших
Ноябрь 2019
 400
350
300
250
200
150
100
50
0
1 сутки 3 сутки 7 сутки 1 сутки 3 сутки
Физраствор Hyalual
Рис. 1. Сводная диаграмма динамики уровня экспрессии SUCNR1 / GPR91, VEGF, FGF2, TGF-β1 в образцах кожи в первые семь суток после однократной процедуры внутрикожного введения
сукцинатсодержащих препаратов (Hyalual, раствор сукцината Na) и препаратов сравнения (физраствор, гиалуроновая кислота, пептидсодержащий препарат).
перспектив его использования для эстетической и других
отраслей медицины, где вопрос реновации и регенерации
кожи является основным.
Целью следующего этапа исследования являлось изу‑
чение роли сукцинат / SUCNR1 в регуляции экспрессии
ростовых факторов в коже. Главная задача заключалась
в определении уровня экспрессии сукцинатного рецепто‑
ра SUCNR1 / GPR91 и ростовых факторов VEGF, TGF-β1,
FGF2 в коже передней брюшной стенки крыс на первые,
третьи и седьмые сутки после однократной процедуры
внутрикожного введения препарата Hyalual.
Материалы и методы
Работа выполнялась на базе ФГБНУ «НИИ общей пато‑
логии и патофизиологии», были использованы следующие
препараты: коммерческий сукцинатсодержащий препарат
Hyalual (препарат для курсовой процедуры редермализа‑
ции, инъекционная форма, концентрация гиалуроновой
кислоты — 1,1 %, 1,8 %, 2,2 %, содержание сукцината — 1,6 %),
физраствор (инъекционная форма) — 1,6 % раствор сук‑
цината натрия, раствор гиалуроновой кислоты (коммер‑
ческая инъекционная форма), препарат с содержанием
пептидов (коммерческая инъекционная форма).
Введение препаратов было произведено 18 декабря
2018 года. Внутрикожное введение препарата Hyalual
(и препаратов сравнения) проводилось однократно. Взя‑
тие образцов кожи выполняли на первые, третьи и седь‑
мые сутки после введения препаратов.
Объективизацию данных проводили через имму‑
ноблоттинг (вестерн-блот). Метод позволяет, сочетая
белковый электрофорез и применение антител, прово‑
— GPR91
— VEGF
— TGF-β1
— FGF2
7 сутки 1 сутки 3 сутки 7 сутки 1 сутки 3 сутки 7 сутки 1 сутки 3 сутки 7 сутки
Сукцинат Na Гиалуроновая кислота Опиоиды
дить высокоспецифичную идентификацию белков в лиза‑
тах биологических тканей.
Для экстракции SUCNR1, VEGF, TGF-β1, FGF2 исполь‑
зовали два буфера:
1. гипотонический,
2. цитоплазматический.
Затем вестерн-блоты инкубировали в растворе первых
поликлональных антител (Abcam, США, anti-GPR91
antibody (ab41505), anti-VEGF antibody (ab53465), anti-
TGF-β1 antibody (ab92486), anti-FGF2 antibody (ab8880))
в разведении 1:500.
Детектирование белков осуществляли в реакции
с ECL-реагентами (Pierce Biotechnology, Inc., США)
на плёнку фирмы Kodak с последующей денситометрией
в программе Adobe Photoshop. О содержании искомых
белков судили по плотности окрашивания полосы свя‑
зывания антител с белком. Результат выражали в относи‑
тельных денситометрических единицах (ОДЕ).
Статистический анализ данных проводили с помощью
программы Statistica 10 с использованием непараметри‑
ческого рангового U-критерия Уилкоксона (Уилкоксона-­
Манна-Уитни). Различия между сравниваемыми группа‑
ми считали статистически достоверными при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Вестерн-блот-анализ показал, что уровень экспрессии
сукцинатного рецептора Hyalual в растворе сукцината
Na [Рис. 1, 2a] увеличивался в образцах кожи, инъецирован‑
ных Hyalual и раствором сукцината Na [Рис. 1, 2a]. В других
образцах, инъецированных однократно физраствором,
гиалуроновой кислотой, пептидсодержащим препаратом,
ОБЛИК. ESTHETIC GUIDE  17
СОЧЕТАННЫЕ МЕТОДИКИ

400 400

2a — GPR91 2b — VEGF
350 350

300 300

250 250

200 200

150 150

100 100

50 50

0 0
1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки
Физраствор Hyalual Сукцинат Na ГК Опиоиды Физраствор Hyalual Сукцинат Na ГК Опиоиды

Рис. 2. Фотографии и количественный анализ иммуноблотов лизатов кожи крыс, подвергнутых однократной процедуре внутрикожного введения Hyalual и препаратов сравнения
(физраствор, раствор сукцината Na, гиалуроновая кислота, пептидсодержащий препарат).

изменения в уровне экспрессии SUCNR1 отсутствова‑ экспрессии FGF2 на 200 % выявляли только в образцах,
ли [Рис. 1, 2a]. Это подтверждает высочайшую тропность получавших Hyalual либо раствор сукцината Na. В дру‑
SUCNR1 именно к Hyalual в растворе сукцината Na [Рис. 1, 2a] гих группах сравнения (гиалуроновая кислота, пептиды)
и отсутствие влияния других веществ, участвовавших уровень экспрессии факторов роста не превышал 140 %
в эксперименте на активацию SUCNR1‑рецептора. от контроля (первые сутки после инъекции физраство‑
Уровень VEGF значительно увеличивался только ра). Соответственно, Hyalual является более активными
в образцах кожи, инъецированных Hyalual либо раство‑ в отношении стимуляции пролиферации фибробластов
ром сукцината Na [Рис. 1, 2b], составляя 150 % в сравнении и именно эти вещества необходимо рассматривать в пер‑
с контролем (первые сутки после введения физраствора). вую очередь для стимуляции синтеза коллагена в коже.
У инъецированных гиалуроновой кислотой также отме‑ Максимальное увеличение уровня экспрессии отмеча‑
чалось увеличение уровня VEGF, которое не превышало лось для TGF-β1 и составляло в образцах, инъецирован‑
20 % относительно контроля. Экспрессия VEGF не меня‑ ных Hyalual либо раствором сукцината Na (в 2 и 3 раза,
лась в образцах кожи, инъецированных физраствором, соответственно), в то время как в других группах сравне‑
и в образце, обработанном препаратом, содержащим ния (гиалуроновая кислота, пептидсодержащий препарат)
пептиды экспрессия VEGF, составила не более 15 % от на‑ не превышало 50 % [Рис. 1, 2d]. В образцах, инъецированных
чального уровня. физраствором, уровень TGF-β1 не менялся.
Индукция FGF2 отмечалась в образцах кожи всех экс‑ Слабая индукция ростовых факторов наблюдалась
периментальных групп [Рис. 1, 2c], однако увеличение уровня в группах сравнения (инъекция физраствора, гиалуроновой
кислоты, пептидсодержащий препарат) не была связана
с индукцией сукцинатного рецептора SUCNR1 и могла быть
вызвана повреждением кожи в ходе однократной проце‑
Полученные данные подтверждают дуры внутрикожного введения (20 инъекций на площади
связь сукцинат / SUCNR1‑сигнали‑ кожи в 10 см2). Данный факт подтверждает, что травма
иглой также вызывает репаратцию кожи в месте травмы.
зации с механизмами ангиогенеза Таким образом, в проведённом исследовании была вы‑
явлена сопряжённая индукция сукцинатного рецептора
и демонстрируют универсальность ан- SUCNR1 / GPR91 и всех исследованных ростовых факто‑
гиогенных эффектов системы сукци- ров (VEGF, FGF2, TGF-β1) в образцах, инъецированных
сукцинатсодержащими препаратами (Hyalual и сукцинат
нат / SUCNR1, проявляющихся в разных Na). Формула Hyalual является при этом максимально
эффективной (выраженная индукция всех ростовых фак‑
тканях. торов) и безопасной (отрицательная динамика к седьмым
суткам фактора роста VEGF — фактора роста сосудов,

18  ОБЛИК. ESTHETIC GUIDE Ноябрь 2019

 400 400

2c — FGF2 2d — TGF-β1
350 350

300 300

250 250

200 200

150 150

100 100

50 50

0 0
1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки

1 сутки
3 сутки
7 сутки
Физраствор Hyalual Сукцинат Na ГК Опиоиды Физраствор Hyalual Сукцинат Na ГК Опиоиды

Диаграммы отражают динамику уровня экспрессии SUCNR1 / GPR91, VEGF, FGF2, TGF-β1 в образцах кожи через первые, третьи, седьмые сутки после введения препаратов.

Литература
в отличии от монокомпонентного сукцината Na, который
к седьмым суткам показал положительную динамику, 1. Chernykh E. R., Shevela E. Y., Sakhno L. V., Tikhonova M. A., Petrovsky Y. L., Ostanin A. A. The generation
что является неблагоприятным прогностическим призна‑ and properties of human M2‑like macrophages: potential candidates for CNS repair? Cell. Ther. Transplant.,
ком в прогнозе развития опухолевых процессов). 2010, 2.
Полученные данные согласуются с результатами перво‑ 2. Diepen J. A., Robben J. H., Hooiveld G. J., Carmone C., Mohammad A., Boutens L. et al. SUCNR1‑mediated
chemotaxis of macrophages aggravates obesity-induced inflammation and diabetes. Diabetologia, 2017,
го этапа исследования, в ходе которого стандартный курс № 60. P. 1304 – 1313.
введения Hyalual (трёхкратно с двухнедельными интерва‑ 3. Diskin C., Palsson-McDermott E. M. Metabolic modulation in macrophage effector function. Frontiers in
лами) сопровождался увеличением количества фибробла‑ Immunology, 2018, V. 9. P. 270 – 287.
стов, плотности сосудистой сети и коллагеновых волокон. 4. Hamel D., Sanchez M., Duhamel F., Roy O., Honore J.‑C., Noueihed B., Zhou T., Nadeau-Vallee M., Hou X.,
В ходе первого этапа исследования использовались ме‑ Lavoie J.‑C., Mitchell G., Mamer O. A., Chemtob S. G-protein — coupled receptor 91 and succinate are key
тодики иммуногистохимического анализа кожи и анализ contributors in neonatal postcerebral hypoxia-ischemia recovery. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2014,
№ 34. P. 285 – 293.
гистологических срезов.
5. Harvey N. L., Gordon E. J. Deciphering the roles of macrophages in developmental and inflammation stimu-

Заключение
lated lymphangiogenesis. Vascular Cell., 2012, 4: 1 – 15.
6. Jetten N., Verbruggen S., Gijbels M. J., Post M. J., De Winther M. P., Donners M. M. Anti-inflammatory M2,
but not pro-inflammatory M1 macrophages promote angiogenesis in vivo. Angiogenesis, 2014, V. 17, № 1.
В ходе выполнения второго этапа исследования было P. 109 – 118.
обнаружено прямое влияние введения Hyalual на уровень 7. Kasraie S., Werfe T. Role of Macrophages in the pathogenesis of atopic dermatitis. Mediators of Inflamma-
синтеза эндогенных факторов роста, которые влияют tion, 2013, V. 2013, № 942375. P. 1 – 15.
на скорость регенерации и реновации тканей. 8. Littlewood-Evans A., Sarret S., Apfel V., Loesle P., Dawson J., Zhang J. et al. GPR91 senses extracellular succi-
Также была доказана возможность непосредственно nate released from inflammatory macro-phages and exacerbates rheumatoid arthritis. J. Exp. Med., 2016, 213
(9): 1655 – 62. doi:10.1084 / jem. 20160061 88.
влиять на процессы хронического воспаления и выявлена
9. Lucas T., Waisman A., Ranjan R., Roes J., Krieg T., Muller W. et al. Differential roles of macrophages in diverse
возможность с помощью сукцинатсодержащего препа‑ phases of skin repair. The Journal of Immunology, 2010, № 184. P. 3964 – 3977.
рата Hyalual осознанно запускать процессы поляриза‑ 10. Rubic-Schneider T., Carballido-Perrig N., Regairaz C., Raad L., Jost S., Rauld C. et al. GPR91 deficiency
ции макрофагов в коже (провоспалительного фенотипа exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice. Allergy, 2017, 72 (3): 444 – 52.
М1 в противовоспалительный фенотип М2), что в свою doi:10.1111 / all. 13005 89.
очередь открывает огромные возможности для врачей 11. Ruckerl D., Allen J. E. Macrophage proliferation, provenance, and plasticity in macroparasite infection. Immu-
различных специальностей, в том числе — для космето‑ nological Reviews, 2014, V. 262. P. 113 – 133.
логов, дерматологов, пластических хирургов, в заплани‑ 12. Sapieha P., Sirinyan M., Hamel D., Zaniolo K., Joyal J. S., Cho J. H. et al. The succinate receptor GPR91 in
neurons has a major role in retinal angiogenesis. Nat Med., 2008, № 14. P. 1067 – 1076.
рованной инициации процессов регенерации, репарации
13. Sorrell J. M., Caplan A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of Cell Science, 2004, V. 117,
и омоложения, а также блокаде негативных процессов № 5. P. 667 – 675.
в тканях, связанных с наличием хронического воспаления,
14. Van Diepen J. A., Robben J. H., Hooiveld G. J., Carmone C., Alsady M., Boutens L. et al. SUCNR1‑mediated
так как широко известен факт, что процессы хронического chemotaxis of macrophages aggravates obesi-ty-induced inflammation and diabetes. Diabetologia, 2017, 60
воспаления являются основными в патогенезе старения. (7): 1304 – 13.

ОБЛИК. ESTHETIC GUIDE  19