Вы находитесь на странице: 1из 9

©2002-2009 ЗАО "Силекс"

тел.: (495) 998 42 88 Эл.почта: info@sileks.com


тел.: (495) 737 42 24 Интернет: www.sileks.com
факс: (495) 737 42 24

Обратная транскрипция (ОТ)


и
обратная транскрипция совмещенная с полимеразной цепной
реакцией (ОТ-ПЦР)

В основе наборов нашей фирмы для обратной транскрипции мы используем рекомбинантную обратную
транскриптазу являющейся продуктом гена pol вируса лейкоза мышей Молони (Moloney Murine Leukemia
Virus, M-MLV). Обратная транскриптаза M-MLV является РНК-зависимой ДНК полимеразой, обладающая
как РНК-, так и ДНК-полимеразной активностью, и может быть использована для синтеза
комплиментарной цепи ДНК (кДНК) длиной свыше 5 т.п.о.. В отличие от обратной транскриптазы вируса
миелобластоза птиц (AMV) у обратной транскиптазы M-MLV РНазная Н (RNase H activity) активность
значительно ниже.
РНазная Н активность – активность проявляется в специфической деградации РНК в РНК:кДНК гибридах. Эта
активность может не иметь особого значения, если скорость синтеза комплиментарной цепи ДНК значительно
превышает скорость деградации РНК.

В качестве двухвалентного иона, необходимого для реализации активности обратной транскриптазы M-


2+
MLV требуется Mg . Температурный оптимум работы – +37 °С.

Для проведения реакции обратной транскрипции мы предлагаем следующие наборы:

Название набора Особенности набора


В состав набора не входят праймеры. Предполагается использование
Синтез первой цепи кДНК (базовый) специфических праймеров заказчика.
В состав набора входят случайные 6-мерные праймеры (hexo
Синтез первой цепи кДНК (рендом) random).
В состав набора входят 15-мерные олиго(дТ) праймеры.
Синтез первой цепи кДНК (олиго(дТ)15)
Набор расчитан на двухэтапный процесс: ОТ в первой пробирке,
ОТ-ПЦР затем ПЦР – во второй. В состав набора входит набор по синтезу
первой цепи кДНК и ПЦР набор на основе ColoredTaq полимеразы.
2

Выделение РНК
Для выделения РНК Вы можете воспользоваться любым методом, приводимым в многочисленных пособиях, лишь бы
полученная вами РНК не была деградирована РНазой. В случае, если выделение РНК является для вас дебютом,
воспользуйтесь стандартным набором. Ваши шансы выделить нормальную РНК с первого раза при этом
увеличиваются.
Для выделения РНК мы рекомендуем следующие наборы, которые можно приобрести в нашей фирме:
• Выделение полноразмерной поли(А) мРНК на магнитных частицах
• Выделение полноразмерной специфической мРНК на магнитных частицах
• Выделение тотальной РНК (YELLOWSOLVE) (производитель - Клоноген, С.-Петербург)
• Выделение мРНК (производитель - Клоноген, С.-Петербург)
Чтобы эффективность вашей работы была выше, обратите внимание на следующие моменты:
• старайтесь максимально уменьшить вероятность попадания РНаз в реактивы, которыми вы пользуетесь для
выделения РНК. Растворы для выделения должны готовиться на воде, проверенной на отсутствие РНаз.
• при выделение РНК применяйте, если есть возможность, препараты, которые оказывают ингибирующее действие на
РНазы: β-меркаптоэтанол, ДТТ, РНазин.
• для реакции синтеза первой цепи кДНК в качестве матрицы лучше использовать очищенную мРНК, чем тотальную
РНК. Использование для синтеза первой цепи поли(А)мРНК в значительной степени повышает чувствительность
выявления редких мРНК, так как содержание мРНК в тотальной РНК достаточно мало (обычно, 0.1-5% от тотальной
РНК эукариотических клеток).
• если есть возможность, проверьте перед началом работы качество выделенной вами мРНК на электрофорезе. мРНК
должна идти в виде размазанного шмера в диапазане от 300 оснований до 8 тыс.п.о.. Основная плотность мРНК, как
правило, наблюдается в диапазоне от 1 до 2 т.п.о..
Содержание мРНК может сильно варьировать в зависимости от материала. Например, 100 мг клеток печени крысы
7
содержат прибл. 15 мкг мРНК, а 10 клеток HeLa - прибл. 3 мкг мРНК. Немаловажную, если не решающую роль, играет
качество материала. Чем свежее материал, тем больше шансов получить много чистой мРНК. Для сохранение мРНК в
образце можно использовать следующии способы:
- заморозить образец в жидком азоте и хранить при температуре не выше -70 °С;
- как можно быстрее обработать образец лизирующим буфером.
(Фирма Clonogene (Санкт-Петербург), выпустила реагент под названием EverFresh, который инактивирует РНазы и
позволяет сохранять материал даже при комнатной температуре в течении длительного времени).

Предупреждение возможности загрязнения рибонуклеазами (РНазами)

Помните, что успешное выделение мРНК зависит от чистоты используемых материалов. Если все в работе готово
заранее, то это не будет вызывать задержек в работе и уеньшит возможность загрязнения РНазами.
Основными источниками РНаз являются руки, бактерии и грибы , которые могут распространяться с пылью. Чтобы
избежать загрязнений, достаточно стандартной микробиологической техники работы. Работайте в перчатках и
открывайте используемые реактивы на минимальное время. Для работы с мРНК лучше применять одноразовый
пластик. Он, как правило, не содержит РНаз и не требует предварительной анти-РНазной обработки, но для надежности
его можно дополнительно проавтоклавировать.
Если приходится работать с многократно используемым стеклом и пластиком, то эти материалы необходимо перед
работой обрабатывать. Стекло рекомендуется “прожаривать” при +200 °С в течении ночи, а пластик промыть раствором
0.1 М NaOH & 1 мМ ЭДТА, затем водой, свободой от РНаз и также проавтоклавировать при температуре, которую
выдерживает данный пластик.
Применяемые растворы желательно обработать 0.05% диэтил пирокарбонатом в течении ночи при комнатной
температуре и затем проавтоклавировать 30 мин для удаления следов диэтил пирокарбоната (следовые количества
этого реактива могут сильно ингибировать работу многих ферментов, поэтому, если есть возможность, не используйте
диэтил пирокарбонат).
Многие системы очистки воды, такие как MilliQ, производят воду, свободную от РНаз, но в любом случае, старайтесь
предварительно убедиться, что РНазы в воде отсутствуют.

Работа с материалом, источником мРНК

Чтобы обеспечить успешное выделение мРНК, необходимо правильно собрать и подготовить материал для выделения.
Свежий образец ткани нужно как можно быстрее обрабатывать лизирующим буфером , чтобы избежать деградацию
РНК. Если образцов много и они не могут быть обработаны сразу, образцы нужно измельчить, заморозить в жидком
азоте и хранить при -70 °С. Измельчение проводите стерильным лезвием.
+
Непосредственная процедура выделения поли(А) -РНК одинакова для образцов ткани и культур клеток.

© Copyright 2002-2009 • ЗАО “Силекс” : тел.: (495) 998 42 88 • тел./факс: (495) 737 42 24 • info@sileks.com • www.sileks.com
3
Расчет концентрации и чистоты полученной мРНК
Определить концентрацию и чистоту полученной мРНК можно спектофотометрически и электрофоретически.

Спектрофотометрическое определение концентрации и чистоты мРНК

Концентрацию мРНК определяют по адсорбции при длине волны 260 нм (А260). А260 равное 1 соответствует 40 мкг мРНК.
Для определения концентрации в полученном образце, возьмите часть образца, разведите до необходимого для
измерения в кювете объема, измерьте А260 и рассчитайте концентрацию образца по следующей формуле:

А260 х [фактор разведения] х 40 мкг/мл = [ваш образец] мкг/мл мРНК

Чистоту образца определяют исходя из соотношения А260/А280. Если А260/А280 ≥2.0, то препарат достаточно чист.
(Кювета должа быть свободна от РНаз. Для этого перед внесением в кювету образца, ополосните кювету
раствором 50 мМ NaOH, а затем стерильной водой)

Почти во всех способах выделения мРНК, полученный препарат обычно содержит небольшие примеси рибосомальной
РНК. Примеси этой РНК следует учитывать, когда идет расчет количества полученной мРНК. Чтобы оценить количество
этих примесей, в случаях, когда количество полученного материала это позволяет, мы рекомендуем провести
денатурирующий электрофорез в агарозном геле.

Определение концентрации и чистоты мРНК в агарозном геле

Количество и качество мРНК может быть быстро определено при помощи электрофореза в агарозном геле с
последующим окрашиванием этидиум бромидом. Для проведения электрофореза обработайте электрофоретическую
ванну раствором 50 мМ NaOH, а затем ополосните стерильной водой, чтобы избавиться от РНаз. Для проведения
электрофореза РНК используйте отдельную электрофоретическую ванну, так как препараты ДНК содержат очень много
РНаз.

1. Приготовьте 1%-ый агарозный гель, используя стерильный ТВЕ буфер. Добавьте в гель при его
приготовлении этидиум бромид до концентрации 0.5 мкг/мл.
2. Смешайте образец (0.5-2 мкг РНК) с буфером для нанесения (10% сахарозы, 90% деионизованного
формамида (готовится путем обработки формамида хелатирующими смолами), 0.05% бромфенолового
синего, 0.05% ксилен цианолового). Объем образца не должен быть больше 50% от объема буфера.
3. Прогрейте образец при 60-65 °С в течении 3 мин, охладите до комнатной температуры и наносите образец на
гель.

мРНК выглядит как шмер от 8000 до 300 оснований. Регион с наибольшей интенсивностью расположен в районе прибл.
2000 оснований. мРНК обычно содержит 10-25% примеси рибосомальной РНК (рРНК), видимой на геле в качестве
полос в районе 2000 оснований (18s рРНК), 5000 оснований (28s рРНК) и иногда в районе 100 оснований (5s рРНК)
(примеси рРНК не влияют функционально на большинство областей применения мРНК). Полосы рРНК обычно не
видны после второго раунда очистки.

© Copyright 2002-2009 • ЗАО “Силекс” : тел.: (495) 998 42 88 • тел./факс: (495) 737 42 24 • info@sileks.com • www.sileks.com
4

Наборы
Синтез первой цепи кДНК
Наборы для синтеза первой цепи кДНК предназначены для получения полноразмерной первой цепи
кДНК из матрицы РНК. Размер синтезируемой кДНК за счет низкой РНазной активности у обратной
траскриптазы M-MLV может достигать 9 т.п.о..
Минимальное время получения полноразмерной кДНК – 30 мин.
Стандартное время получения полноразмерной кДНК – 1 час 30 мин.

Для получения первой цепи кДНК могут быть использованы различные праймеры. Каждый тип
праймеров имеет свои небольшие особенности, которые желательно учитывать при планировании
синтеза кДНК.

Специфические праймеры
Избирательно работают на строго определенной мРНК. Этот тип праймеров наиболее применим
для диагностических целей.

Случайные гексонуклеотиды (random)


Неспецифически связываются на мРНК, нарабатывая небольшие (короткие) перекрывающиеся
кДНК практически по всей матрице мРНК. Эти праймеры идеально подходят для преодоления
сложных участков с вторичной структурой матрицы. Ими можно эффективно транскрибировать 5’
район мРНК и изучать всю последовательность мРНК.

Олиго(дТ)15
Синтез первой цепи идет с 3’ конца поли(А)+ мРНК, часто прочитывается вся мРНК. Удобен для
работы с 3’ районом или с мРНК, длина которых не превышает 5 т.п.о..

Первая синтезированная цепь может затем быть использована для дальнейшего исследования в
ПЦР или для гибридизации в Нозер (Northern) блоте.

Состав наборов рассчитан на 100 реакций


Название набора Состав набора Хранение
M-MLV обратная транскриптаза 10’000 ед.
Синтез первой цепи кДНК (базовый) х10-кратный буфер для фермента 300 мкл -20 °С
2.5 mM смесь dNTP 400 мкл
Вода, свободная от РНаз 2 мл
M-MLV обратная транскриптаза 10’000 ед.
Синтез первой цепи кДНК (рендом) х10-кратный буфер для фермента 300 мкл -20 °С
2.5 mM смесь dNTP 400 мкл
Гекса праймеры,
0.5 мкг/мл (15 опт.ед./мл) 100 мкл
Вода, свободная от РНаз 2 мл
M-MLV обратная транскриптаза 10’000 ед.
Синтез первой цепи кДНК (олиго(дТ)15) х10-кратный буфер для фермента 300 мкл -20 °С
2.5 mM смесь dNTP 400 мкл
Олиго(дТ)15 праймеры,
0.5 мкг/мл (15 опт.ед./мл) 100 мкл
Вода, свободная от РНаз 2 мл

© Copyright 2002-2009 • ЗАО “Силекс” : тел.: (495) 998 42 88 • тел./факс: (495) 737 42 24 • info@sileks.com • www.sileks.com
5

Протокол проведения процедуры обратной транскрипции


(В приводимом ниже протоколе мы предлагаем процедуру, которую считаем оптимальной. В соответствии со
своими задачами вы можете модифицировать данную процедуру.)

Как уже отмечалось выше, обратная транскрипция может проводится с использованием различных праймеров.
Используйте набор с олиго(дТ)15 праймерами, если вы собираетесь исследовать 3’ район РНК или хотите в
дальнейшем клонировать кДНК. Набор со случайными гексапраймерами более универсален. Он пригоден для
исследования РНК по всей длине и в особенности 5’ района РНК.

1. В пробирке, помещенной в лед, смешайте следующие компоненты:


• РНК матрица 2 мкл
тотальная РНК 0.1 - 5 мкг
или поли(А)+ РНК 10 - 0.5 нг
или специфическая РНК 0.01 пг и меньше
• праймер 1 мкл
специфический 15 - 20 пмолей
или случайный гексапраймер 0.5 мкг (1мкл)
или олиго(дТ)15 0.5 мкг (1мкл)
• вода, свободная от РНаз до 18 мкл
Перемешайте, осадите капли кратковременным центрифугированием.
2. Инкубируйте смесь 5 мин при +70 °С, перенесите пробирку в лед и соберите капли
кратковременным центрифугированием.
3. Поместите пробирку в лед и добавьте следующие компоненты:
• х10-кратный ОТ буфер 2.5 мкл
• 2.5 mM смесь dNTP 4 мкл
• M-MLV обратная транскриптаза 0.5 мкл
4. Инкубируйте смесь в течении 60 мин при +37 °С (при использовании случайных гексапраймеров
перед инкубацией при +37 °С проинкубируйте смесь в течении 10 мин при +25 °С и затем
инкубируйте смесь в течении 60 мин при +37 °С).
5. Остановите реакцию прогреванием смеси в течении 10 мин при +70 °С. Перенесите смесь в лед.
Полученная кДНК может быть непосредственно сразу же использована для ПЦР или синтеза
второй цепи и последующего клонирования.

Храните синтезированную кДНК при -20 °С или при -70 °С для долгосрочного хранения.

Примечания
+
- использование поли(А) РНК вместо тотальной РНК позволяет существенно повысить специфичность и
эффективность синтеза кДНК.
- в отличие от использования олиго(дТ)15 праймеров, которые, как правило, не требуют оптимизации, от
соотношения случайных гексапраймеров по отношению к РНК зависит длина синтезируемой кДНК. Увеличение
концентрации гексапраймеров по отношению к РНК будет приводить к преимущественному синтезу коротких
(около 600 нуклеотидов) кДНК, и наоборот, уменьшение концентрации гексапраймеров по отношению к РНК
будет способствовать синтезу более длинных кДНК.
- проблемы, обусловленные наличием вторичной структуры в GC богатых молекулах РНК можно попробовать
обойти повышением температуры реакции до +45 °С или добавлением в реакционную смесь ДМСО. Правда,
эти изменения могут привести к уменьшению выхода кДНК.

© Copyright 2002-2009 • ЗАО “Силекс” : тел.: (495) 998 42 88 • тел./факс: (495) 737 42 24 • info@sileks.com • www.sileks.com
6

Наборы
Обратной транскрипции совмещенные с полимеразной
цепной реакцией (ОТ ПЦР)
ОТ ПЦР может проводиться в нескольких вариантах: А - две пробирки, два этапа (в одной пробирке ОТ, затем
в другой ПЦР), В - одна пробирка, два этапа (в одной и той же пробирке ОТ и затем ПЦР), С - одна пробирка,
один этап (в одной и той же пробирке ОТ, совмещенная с последующией ПЦР) .

А. Две пробирки, два этапа


В первой пробирке осуществляется синтез кДНК при наиболее оптимальных условиях с использованием любых
праймеров. Аликвота из пробирки с ОТ переносится в другую пробирку с термостабильной ДНК полимеразой,
соответствующим буфером и ПЦР праймерами, где проводится ПЦР.
Преимущество такого подхода – полученную в ОТ кДНК можно использовать для разных целей и в нескольких
2+
повторах и вариантах. Можно подобрать наиболее оптимальные условия (концентрация Mg , dNTP, праймеров,
фермента) как для ОТ, так и для ПЦР, что, в конечном итоге даст наибольший выход и специфичность.

В. Одна пробирка, два этапа


В одной и той же пробирке осуществляется ОТ с использованием любых праймеров и затем в эту же пробирку
добавляется оптимальная для ПЦР смесь с термостабильной ДНК полимеразой, соответствующим буфером,
ПЦР праймерами и проводится ПЦР.
Преимущество такого подхода – когда концентрация РНК матрицы очень мала и вся наработанная в ходе ОТ
кДНК идет в ПЦР.

С. Одна пробирка, один этап


И синтез кДНК и ПЦР проходят в одной и той же пробирке с одним и тем же буфером и одними и теми же
специфическими праймерами. Нет необходимости открывать пробирку между ОТ и ПЦР и довносить в пробирку
дополнительные компоненты.
Преимущество такого подхода – высокая чувствительность, как и в варианте В, но при этом риск контаминации
значительно ниже, поскольку пробирка в ходе процесса не открывается.

Преимущество ОТ ПЦР в Преимущество ОТ ПЦР в


один этап два этапа
Экономия времени Возможность оптимизации условий
Экономится время за счет смешивания реакции
компонентов Можно максимально оптимизировать по
отдельности ОТ и ПЦР
Уменьшается риск контаминации Широкий выбор действий
Поскольку материал не переносится из Одну и ту же полученную кДНК можно
пробирки в пробирку, риск контаминации использовать не только для ПЦР, но и
существенно снижается для других молекулярно-генетических
приложений
Повышается чувствительность Получение длинных продуктов
синтеза кДНК Комбинируя ОТ с ПЦР с применением
Т.к. вся кДНК используется для ПЦР, термостабильных полимераз с
чувствительность метода повышается различными свойствами, в результате
ОТ ПЦР можно получать очень длинные
последовательности (длиннее 10 т.п.о.)

Итак, если вам нужен эффективный ОТ ПЦР, остановите ваш выбор на двух этапном варианте.
Если вас привлекает быстрый и аналитический ОТ ПЦР – выбирайте одноэтапный вариант.

© Copyright 2002-2009 • ЗАО “Силекс” : тел.: (495) 998 42 88 • тел./факс: (495) 737 42 24 • info@sileks.com • www.sileks.com
7

Набор
ОТ-ПЦР (базовый, гексануклеотидный (random), олиго (дТ)15 )

Набор рассчитан на проведение ОТ ПЦР по любому описанному выше варианту.


Как основной рекомендуемый вариант, мы предлагаем использовать этот набор для варианта А -
две пробирки, два этапа.
Если вы хотите использовать набор для других вариантов, самостоятельно внесите коррективы в
предлагаемый протокол постановки ОТ ПЦР.
В состав набора входит один из наборов Синтез первой цепи кДНК и набор ПЦР с
термостабильной полимеразой. По умолчанию, базовый ПЦР набор комплектуется ColoredTaq
2+
полимеразой (2.5 ед./мкл) и х10-кратным буфером с рН 8.6, 25 mM Mg . При комплектовании
другими полимеразами стоимость набора может отличаться от базовой.

Состав наборов рассчитан на 100 реакций

Название набора Состав набора Хранение


M-MLV обратная транскриптаза 10’000 ед.
ОТ-ПЦР х10-кратный буфер для фермента 300 мкл -20 °С
2.5 mM смесь dNTP 800 мкл
(базовый,
Без праймеров или
гексануклеотидный (random), Гекса праймеры или
Олиго(дТ)15 праймеры,
олиго (дТ)15 )
0.5 мкг/мл (15 опт.ед./мл) 100 мкл
Вода, свободная от РНаз 4 мл
ColoredTaq (2.5 ед./мкл) 250 ед.
х10-кратный буфер для полимеразы 500 мкл
Минеральное масло 2 мл
Краска для нанесения на гель 200 мкл

© Copyright 2002-2009 • ЗАО “Силекс” : тел.: (495) 998 42 88 • тел./факс: (495) 737 42 24 • info@sileks.com • www.sileks.com
8

I. Протокол проведения процедуры обратной транскрипции


(В приводимом ниже протоколе мы предлагаем процедуру, которую считаем оптимальной. В соответствии со
своими задачами вы можете модифицировать данную процедуру.)

Как уже отмечалось выше, обратная транскрипция может проводится с использованием различных праймеров.
Используйте набор с олиго(дТ)15 праймерами, если вы собираетесь исследовать 3’ район РНК или хотите в
дальнейшем клонировать кДНК. Набор со случайными гексапраймерами более универсален. Он пригоден для
исследования РНК по всей длине и в особенности 5’ района РНК.

1. В пробирке, помещенной в лед, смешайте следующие компоненты:


• РНК матрица 2 мкл
тотальная РНК 0.1 - 5 мкг
или поли(А)+ РНК 10 - 0.5 нг
или специфическая РНК 0.01 пг и меньше
• праймер 1 мкл
специфический 15 - 20 пмолей
или случайный гексапраймер 0.5 мкг (1мкл)
или олиго(дТ)15 0.5 мкг (1мкл)
• вода, свободная от РНаз до 18 мкл
Перемешайте, осадите капли кратковременным центрифугированием.
2. Инкубируйте смесь 5 мин при +70 °С, перенесите пробирку в лед и соберите капли
кратковременным центрифугированием.
3. Поместите пробирку в лед и добавьте следующие компоненты:
• х10-кратный ОТ буфер 2.5 мкл
• 2.5 mM смесь dNTP 4 мкл
• M-MLV обратная транскриптаза 0.5 мкл
4. Инкубируйте смесь в течении 60 мин при +37 °С (при использовании случайных гексапраймеров
перед инкубацией при +37 °С проинкубируйте смесь в течении 10 мин при +25 °С и затем
инкубируйте смесь в течении 60 мин при +37 °С).
5. Остановите реакцию прогреванием смеси в течении 10 мин при +70 °С. Перенесите смесь в лед.
Полученная кДНК может быть непосредственно сразу же использована для ПЦР или синтеза
второй цепи и последующего клонирования.

Храните синтезированную кДНК при -20 °С или при -70 °С для долгосрочного хранения.

Примечания
+
- использование поли(А) РНК вместо тотальной РНК позволяет существенно повысить специфичность и
эффективность синтеза кДНК.
- в отличие от использования олиго(дТ)15 праймеров, которые, как правило, не требуют оптимизации, от
соотношения случайных гексапраймеров по отношению к РНК зависит длина синтезируемой кДНК. Увеличение
концентрации гексапраймеров по отношению к РНК будет приводить к преимущественному синтезу коротких
(около 600 нуклеотидов) кДНК, и наоборот, уменьшение концентрации гексапраймеров по отношению к РНК
будет способствовать синтезу более длинных кДНК.
- проблемы, обусловленные наличием вторичной структуры в GC богатых молекулах РНК можно попробовать
обойти повышением температуры реакции до +45 °С или добавлением в реакционную смесь ДМСО. Правда,
эти изменения могут привести к уменьшению выхода кДНК.

© Copyright 2002-2009 • ЗАО “Силекс” : тел.: (495) 998 42 88 • тел./факс: (495) 737 42 24 • info@sileks.com • www.sileks.com
9

II. Протокол проведения процедуры полимеразной цепной реакции


(В приводимом ниже протоколе мы предлагаем процедуру, которую считаем оптимальной. В соответствии со
своими задачами вы можете модифицировать данную процедуру.)

1. В пробирке для проведения ПЦР смешайте следующие компоненты:


• х10-кратный Taq буфер 2.5 мкл
• 2.5 mM смесь dNTP 2 мкл
• ColoredTaq полимераза 0.5 мкл
• кДНК матрица 2 мкл
• праймер 1 (50 пмолей) 1 мкл
• праймер 2 (50 пмолей) 1 мкл
• вода, свободная от РНаз до 25 мкл
Перемешайте, осадите капли кратковременным центрифугированием.
При отсутствии у амплификатора нагревающей крышки, препятствующей испарению
реакционной смеси в ходе реакции, добавьте к смеси минеральное масло, так, чтобы
поверхность смеси была бы полностью закрыта и испарение смеси было бы невозможно.
2. Поместите пробирку в амплификатор и установите параметры цикла, оптимальные, для
получения желаемого результата.

Полученный в ходе амплификации продукт (если амплификация проводилась с ColoredTaq


полимеразой) может сразу из пробирки наносится на гель для анализа и не требует
предварительного смешивания с краской. Обычно для анализа следует брать 5-10 мкл реакционной
смеси.

Храните амплификат при -20 °С или при -70 °С для долгосрочного хранения.

Полученный амплификат может быть использован для второго раунда ПЦР (ПЦР с внутренними
праймерами – nested PCR). В этом случае повторите ПЦР, смешивая компоненты в соответствии с
рекомендациями п.1 этого раздела, но вместо кДНК матрицы внесите 2 мкл смеси из пробирки с
первым раундом ПЦР.
3 Помните, что ПЦР в два раунда имеет очень высокий риск контаминации. Поэтому при
постановке ПЦР в два раунда используйте для переноса образца наконечники с антиаэрозольным
вкладышем (в самом простом варианте можно поместить в наконечник маленький ватный тампон).
Не держите поблизости от открываемых пробирок с результатами ПЦР реактивы, которые
используются для выделения нуклеиновых кислот и постановки ПЦР, пластик, пипетки и т.д и т.п..
Всегда используйте отрицательные контроли. При малейшем признаке контаминации откажитесь от
использования всех компонентов рабочей системы (буфера, праймеры, ферменты, минеральное
масло, пипетки, даже рабочее место).

© Copyright 2002-2009 • ЗАО “Силекс” : тел.: (495) 998 42 88 • тел./факс: (495) 737 42 24 • info@sileks.com • www.sileks.com