КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Г.Н. Чупахина
СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ
КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ

Калининград
1997
КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Г.Н. Чупахина
СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ
КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ
Монография

Калининград
1997
 Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений: Монография. -
Калинингр. ун-т. - Калининград, 1997. - 120 с. - ISBN 5-88874-063-2.

В монографии дана характеристика системы аскорбиновой кислоты растений,

включающей аскорбиновую, дегидроаскорбиновую и дикетогулоновую кислоты, а
также ферменты, окисляющие и восстанавливающие аскорбат. Приведены результаты
исследования действия полихроматического и монохроматического света на
компоненты системы, обсуждается вопрос о фоторецепторе светозависимого синтеза
аскорбиновой кислоты. Рассматриваются пути биосинтеза аскорбата, компартментация
данного процесса и субклеточная локализация кислот системы аскорбиновой кислоты.
Исследована зависимость биосинтеза указанных кислот от фотосинтеза и дыхания.
Впервые исследовалась дикетогулоновая кислота как компонент системы аскорбиновой
кислоты. Приводится метод получения альбиносных проростков, их физиолого-
биохимическая характеристика, рекомендация использования в качестве модели для
изучения светозависимых процессов не связанных с фотосинтезом.
Для физиологов, биохимиков, преподавателей вузов, аспирантов и студентов.
Иллюстр. 30. Библиогр.: 461 назв.

Рецензент - зав. отделом химии фотосинтеза Института биоорганической химии и

нефтехимии АН Украины, чл.-кор. АН Украины А.А. Ясников.

Печатается по решению редакционно-издательского Совета Калининградского

государственного университета.

ISBN 5-88874-063-2 © Калининградский государственный

университет, 1997
 Галина Николаевна Чупахина

СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ

Монография

Лицензия № 020345 от 27.12.1991 г.

Редактор Л.Г. Ванцева.
Оригинал-макет подготовлен Д.В. Голубиным.
Подписано в печать 25.12.1996 г. Формат 60×90 1/16.
Бумага для множительных аппаратов. Усл. печ. л. 7,5.
Уч.-изд. л. 8,0. Тираж 200 экз. Заказ 92.

Калининградский государственный университет,

236041, г. Калининград, ул. А. Невского, 14.
 ВВЕДЕНИЕ

Аскорбиновая кислота - уникальное полифункциональное соединение.

Обладая способностью обратимо окисляться и восстанавливаться, она
принимает участие в важнейших энергетических процессах растительной клетки
- фотосинтезе [341, 378] и дыхании [451, 362]; является признанным
антиоксидантом [8]. Несомненно ее участие в процессах роста, цветения,
вегетативной и репродуктивной дифференциации [230], в водном обмене [151],
регуляции ферментативной активности [46], стимуляции реакций метаболизма,
связанных с обменом нуклеиновых кислот и синтезом белка [207, 365], в
защитных реакциях растений [200, 2].
Особый интерес для биотехнологии представляет факт накопления
аскорбиновой кислоты в культуре растительных тканей и активации их роста
аскорбатом [288, 295]. В связи с этим знание условий, формирующих пул
аскорбиновой кислоты зеленых растений, необходимо не только для
программированного получения высоковитаминных растительных продуктов,
что само по себе является важным для решения проблемы качества пищи, но и
для понимания механизмов, определяющих продуктивность растений.
Возросший интерес к аскорбиновой кислоте как к лекарственному препарату
[257] обусловлен противовирусным [395] и противоопухолевым действием
аскорбиновой кислоты и ее дериватов [450], а также авторитетной рекламой
дважды лауреата Нобелевской премии Л.Полинга [116]. При определении
витаминной ценности растительного сырья витамин С определяется как сумма
взаимопревращающихся восстановленной и окисленной форм аскорбиновой
кислоты [152]. Однако дегидроаскорбиновая кислота не всегда переходит в
аскорбиновую, так как разрыв ее лактонового кольца ведет к необратимому
образованию дикетогулоновой кислоты, не обладающей витаминной актив-
ностью и практически не исследованной у растений. Поэтому для всесторонней
оценки роли аскорбиновой кислоты в метаболизме растений необходимо
одновременное исследование всей системы аскорбата, включающей
вышеназванные органические кислоты, а также ферментные системы,
способствующие окислению и восстановлению аскорбиновой кислоты. Именно

3
такие подходы к исследованию витамина С [258, 430] являются наиболее
перспективными.
Со времени открытия аскорбиновой кислоты интерес к этому соединению не
проходит, хотя в последние годы он значительно снизился. Но это не говорит о
том, что решены все проблемы, связанные с аскорбатом. Они есть. В частности,
до сих пор не выяснены пути синтеза аскорбиновой кислоты, не до конца ясна ее
роль в жизни автотрофных организмов, являющихся продуцентами и
поставщиками витамина С для человека. Решение этих вопросов требует нового
уровня исследований, чему, несомненно, может служить изучение аскорбиновой
кислоты как компонента системы органических кислот: аскорбиновая ↔
дегидроаскорбиновая → дикетогулоновая кислота.
В предлагаемой работе обобщены литературные данные и результаты
собственных исследований автора, касающиеся путей биосинтеза аскорбиновой
кислоты и субклеточной локализации аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и
дикетогулоновой кислот. Рассматривается действие полихроматического и
монохроматического света на компоненты системы, зависимость биосинтеза
анализируемых кислот от фотосинтеза и дыхания. Для решения этих вопросов
использовались данные по биосинтезу кислот в проростках ячменя с
измененным пигментным составом, в экспериментально полученных
альбиносных проростках, а также при ингибировании и стимуляции дыхания
интермедиатами цикла Кребса.

4
 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - аскорбиновая кислота
АО - аскорбатоксидаза
ГН - глютатион восстановленный
ГS-SГ - глютатион окисленный
ДАК - дегидроаскорбиновая кислота
ДКГК - дикетогулоновая кислота
ДКС - дальний красный свет
2,4 - ДНФ - 2,4 - динитрофенол
ИУК - индолилуксусная кислота
КС - красный свет
МДАК - монодегидроаскорбиновая кислота
НАД - никотинамидадениндинуклеотид
НАДФН+Н+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
ОПФЦ - окислительный пентозофосфатный цикл
ПААГ - полиакриламидный гель
СМ - стрептомицин
УФ - ультрафиолет
ФАР - физиологически активная радиация
Фдк - фитохром с максимумом поглощения в области дальнего красного
света около 730 нм
ФС I - фотосистема I
ФС II - фотосистема II
Хл - хлорофилл
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

5
 Глава 1. КИСЛОТЫ И ФЕРМЕНТЫ СИСТЕМЫ
АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

В 1927 году A.Сцент-Гиорги впервые выделил из некоторых растений и

коры надпочечников неустойчивое вещество с сильно выраженными
восстановительными свойствами, которое сначала назвал гексуроновой
кислотой, затем - аскорбиновой, учитывая ее антискорбутное (скорбут - цинга)
действие. Химическая формула АК была предложена в 1933 году Хирстом и
независимо от него Эйлером, а в конце 1933 г. ее правильность окончательно
доказана Михеелем. Химический синтез АК осуществлен Рейхштейном в 1932
г., когда структура ее еще не была известна. В 1933 г. Рейхштейн и Хаворс с
Хирстом опубликовали методы синтетического получения АК. История
открытия и изучения АК подробно описана Б.А. Кудряшовым [69].
В химическом отношении АК является лактоном 2,3-диэнол-l-гулоновой
кислоты с эмпирической формулой С6Н8О6. Она обладает сильно выраженными
восстанавливающими свойствами благодаря наличию в молекуле диэнольной
группы:
С ОН

С ОН
Окисляясь, АК легко переходит в дегидроформу:
O O

C C

НО-С О=С

НО-С О - 2H О=С О

H-C + 2H H-C

HO-C-H HO-C-H

СH2-OH СH2-OH
L-аскорбиновая Дегидроаскорбиновая
кислота кислота
(восстановленная форма) (окисленная форма)

Этот процесс обратимый, и ДАК может вновь восстановиться до l-AK.

Окисление АК до ДАК происходит в результате отдачи двух протонов и
двух электронов. При окислении АК в особых условиях (УФ свет, температура
жидкого воздуха) за счет отдачи только одного протона возникает свободный
радикал - монодегидроаскорбиновая кислота. Это нестабильная,
реакционноспособная форма АК.

6
 O O O O

C C C C

НО-С HO-С O-С O=С

НО-С О -H+ О-С О -H+ О-С О -2e О=С О

H-C H-C H-C H-C

HO-C-H HO-C-H HO-C-H HO-C-H

СH2-OH СH2-OH СH2-OH СH2-OH

L-аскорбиновая Монодегидро- Анион дегидро- Дегидроаскор-

новая кислота аскорбиновая аскорбиновой биновая кис-
кислота кислоты лота

Переход l-АК в ДАК двухэтапный. На первом этапе две молекулы l-AK дают
начало двум молекулам монодегидроаскорбиновой кислоты. Далее они
дисмутируют: одна молекула превращается в ДАК, другая - в l-АК [60].
Лактоновое кольцо в молекуле l-AK стабильно, а в ДАК легко гидролизует с
образованием кислоты с открытой цепью - 2,3-дикетогулоновой кислоты [84].
Последняя может подвергаться окислительному распаду под действием
гипоиодида натрия с образованием щавелевой и треоновой кислот:

O O

C C - OH COOH

О=С С=O COOH

О=С О +H2O С=О Щавелевая

кислота
H-C H - C - OH

HO - C - H HO - C - H COOH

СH2 - OH СH2 - OH H - C - OH

HO - C - H

CH2OH
Дегидроас- 2,3-дикето-
корбиновая l-гулоновая L-треоновая
кислота кислота кислота

7
 Введенная экзогенно дикетогулоновая кислота при освещении хлоропластов
фотоокисляется [453]. Под влиянием окисляющих АК ферментов происходит
декарбоксилирование ДАК и ДКГК с образованием l-ксилоновой и l-ликсоновой
кислот.
У растений, аккумулирующих щавелевую кислоту (шпинат, бегония,
кислица), окисление введенной 1-14С-АК или 1-14С-ДАК происходит с
образованием щавелевой и винной кислот. В проростках ячменя, которые не
накапливают щавелевую кислоту, включение метки в последнюю происходит
слабо. Отмечено, что метка из 1-14C-ДАК легко включалась в щавелевую
кислоту шпината и кислицы, а 1-14С-ДКГК очень медленно метаболизировалась
в щавелевую кислоту. Вероятно, для образования щавелевой кислоты
существенно наличие лактонового кольца в предшественнике [453].
У герани также два первые атома углерода АК включаются в молекулу
щавелевой кислоты, а С4-фрагмент - в винную кислоту [445, 448]. Однако судьба
двух первых атомов углерода АК может быть иной. Например, у винограда
отрезок цепи с первого по четвертый атом углерода включается в l-винную
кислоту, а оставшийся С2-фрагмент повторно вовлекается в цикл гексоз и
продуктов их метаболизма. [445, 383]. При этом углерод первого атома АК
может высвобождаться в форме CO2 [272].
Изолированные листья Parthenocissus quinquefolia L метаболизируют АК с
образованием l-треоновой и винной кислот. Показано, что треоновая кислота не
является промежуточным метаболитом обмена аскорбата, превращающегося в
винную кислоту [271]. Такими метаболитами могут быть l-идониновая, 2-кето-l-
идониновая и 5-кето-l-идониновая кислоты. В молодых тканях винограда вве-
денная АК превращается в 5-кето-l-идониновую кислоту через 2-кето-l-
идониновую и l-идониновую кислоты. Из С4-фрагмента 5-кето-l-идониновой
кислоты далее синтезируется l-(+)винная кислота. Считается [318], что именно l-
АК. является физиологическим интермедиатом на пути биосинтеза винной
кислоты в листьях винограда. Радиоактивность от 5-кето-l(6-14С)идониновой
кислоты обнаруживалась в сахарах и нерастворимом осадке [381, 382].
Следовательно, обмен АК в растениях связан с органическими кислотами и
углеводами, которые в одних условиях являются субстратом в биосинтезе АК, а
в других для их образования используются фрагменты молекулы АК,
полученные после ее деградации.
Таким образом, АК в растительных тканях может присутствовать в
восстановленной форме, окисленной и в виде нестабильной
монодегидроаскорбиновой кислоты. Восстановленная и окисленная АК
находятся в свободном состоянии. Известны три связанные формы АК:
аскорбиген - соединение АК с полипептидом; комплекс АК с витамином Р и,
вероятно, еще с каким-то неизвестным веществом; третья связанная форма АК -
это соединение АК с нуклеиновой кислотой через посредство минерального
железа
Обычно
[158].в растениях преобладает восстановленная форма АК. Накоплению
ДАК препятствует ее нестабильность (особенно при рН выше 5), поэтому при
измельчении тканей наблюдается быстрая потеря ДАК. Тем не менее измеримые
количества ДАК присутствуют во многих тканях. Содержание окисленной
формы АК в разных условиях неодинаково и иногда достигает высоких

8
значений. Так, в яблоках в начале созревания ДАК составляла 55% от общего
количества АК и ДАК, а в конце - только 5-6% [35]. Соотношение двух форм АК
может служить показателем физиологического состояния растений: высокая
интенсивность процессов жизнедеятельности - больше восстановленной АК,
низкая интенсивность - растет содержание дегидроформы [68,34].
Для красных водорослей показано сезонное изменение соотношения
АК/ДАК. В апикальной части таллома птерокладии оно достигало максимума в
декабре, а к лету значительно снижалось. В базальной части соотношение
АК/ДАК в течение года было низким и мало менялось [303].
АК в чистых растворах с сильно кислой реакцией среды и в растительных
соках с нормальной кислотностью при рН ниже 7 не способна к самоокислению.
Однако в других растворах на воздухе АК быстро окисляется. Катализирующее
действие на процесс неферментативного окисления АК оказывают
гидроксильные ионы, двух- и трехвалентные металлы, особенно медь.
Известны четыре ферментные системы, принимающие участие в окислении
АК. Это специфическая оксидаза АК - аскорбатоксидаза (1.10.3.3), цитохромная
система, полифенолоксидаза (1.14.18.1) в присутствии полифенолов и
пероксидаза (1.11.1.7) в присутствии перекиси водорода [35].
Аскорбатоксидаза - медьсодержащий фермент, окисляет АК кислородом
воздуха, но имеет ограниченное сродство к кислороду [26]. Механизм окисления
АК пероксидазой и полифенолоксидазой - с помощью хинонов. Коферментами
пероксидаз являются различные фенольные соединения, они окисляются до
хинонов, последние окисляют АК до ДАК:
кислород + фенол → хинон;
хинон + АК → ДАК + фенол.
Окислительно-восстановительные превращения АК ↔ ДАК тесно связаны с
системой глютатиона: 2ГSН ↔ ГS - SГ + 2Н+, в которой восстановление
окисленного глютатиона катализируется ферментом глютатионредуктазой
(1.6.4.2), а окисление идет при участии глютатиондегидрогеназы (аскорбата)
(1.8.5.1) [409]. Есть мнение, что превращение ДАК в АК - неферментативный
процесс
Окислительно-восстановительная
[59]. система АК у эвглены, по данным
Шигеоки и др. [402, 403], включает следующие компоненты:

H2O2 (1) H2O

(3)
l-АК (3) Монодегидро-l-АК Дегидро-l-АК

(2)

НАДФ+ НАДФН+Н+

(4)

ГS - SГ Г - SH
где:
(1) - l-аскорбатпероксидаза,

9
 (2) - монодегидро-l-аскорбатредуктаза,
(3) - неферментативная реакция,
(4) - дегидро-l-аскорбатредуктаза.

Таким образом, система АК растений включает АК, монодегидро-АК, ДАК

[239], которые обладают витаминной активностью. ДКГК, образующаяся из
ДАК, уже лишена биологической активности. Количественный анализ ДКГК
может служить показателем направленности процессов в системе АК ↔ ДАК,
которая зависит от активности ферментов, окисляющих AК: аскорбатоксидазы,
полифенолоксидазы, цитохромоксидазы и пероксидазы, а также ферментов,
восстанавливающих кислоты системы АК: монодегидро-l-аскорбатредуктазы и
дегидро-l-аскорбатредуктазы. В качестве восстановителя выступает система
глютатиона ГS - SГ ↔ Г - SН и НАДФН+Н+. Высокий уровень АК стимулирует
биосинтез аскорбатоксидазы [240,3] и подавляет аскорбатредуктазу [3].
ДКГК растений, рассматриваемая нами в системе АК, практически не
исследована, исключая единичные работы [85,405,279,334,205] и работы автора
[181, 174, 178], хотя следует подчеркнуть, что ее уровень дает информацию для
понимания функционирования системы АК ↔ ДАК.

Глава II. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

В ЖИЗНИ АВТОТРОФНЫХ ОРГАНИЗМОВ

2.1. Участие аскорбиновой кислоты в энергетических процессах растений

В хлоропластах содержится значительное количество АК, по весу не

уступающее содержанию хлорофилла, а выраженное в молях даже
превосходящее его [123]. Этот факт, а также способность АК обратимо
окисляться и восстанавливаться могут определять ее участие в важнейшем
энергетическом процессе зеленых растений - в фотосинтезе. Действительно,
многие экспериментальные исследования подтверждают такую возможность. В
частности, показано, что аскорбат способствует биосинтезу хлорофилла [237,
218] и восстановлению его в темноте при участии активной МДАК [38]. В
семенах японской редьки при 48-часовом освещении возрастало содержание АК
и пропорционально - содержание хлорофилла. Между количеством хлорофилла
и АК отмечалась линейная зависимость при коэффициенте корреляции 0,96
Основываясь на опытах по обратимому фотохимическому восстановлению
[437].
хлорофилла АК в растворах пиридина, А.А.Красновский [62, 66] полагал, что
этот процесс может представлять одну из стадий фотосинтеза. Подтверждая
наличие реакции А.А. Красновского, в результате которой образовывалась
красная восстановленная форма хлорофилла при освещении его растворов в
пиридине в присутствии АК, Т.Баннистер [213] уточнил, что донором электрона

10
при фотовосстановлении хлорофилла может быть анион АК, возникающий при
ее диссоциации в среде воды и пиридина.
На роль АК как донора электронов в фотосинтетических реакциях или в
реакциях, тесно связанных с ними, указывал и Л.Мапсон [325]. Он считал, что
АК может участвовать в переносе электрона от пластохиона к цитохрому f.
Другие авторы также рассматривали АК как переносчика электронов при
фотосинтезе [250, 335, 343]. По мнению Л.Мапсона, действительным перенос-
чиком электронов является нестабильная МДАК, способная участвовать в цепи
реакций нециклического фосфорилирования в растениях [324].
При изучении фотоокисления аскорбата изолированными хлоропластами
шпината было показано [221], что АК может замещать воду как донор
электронов для ФС II и что обе световые реакции и электрон-транспортная
система между ними принимают участие в фотоокислении АК.
В ныне признанных схемах циклического и нециклического переноса
электронов в процессе фотосинтеза среди переносчиков электронов нет АК, но в
модельных системах АК часто используется как экзогенный донор электрона
для ЭТЦ фотосинтеза [298, 376, 384]. При блокировании переноса электронов
между ФС I и ФС II дихлорфенилдиметилмочевиной электроны от АК могут
поступать в ФС I [85].
АК необходима для фотофосфорилирования [51]. В ее присутствии лучше
сохраняется без инактивации фотосинтетический аппарат клетки, увеличивается
фосфорилирование изолированных хлоропластов [227, 203, 204, 249, 333],
стабилизируется фотофосфорилирование фрагментов фотосинтетических
мембран [341].
Таким образом, участие АК в процессе фотосинтеза может проявляться или
в биосинтезе фотосинтетического аппарата растительной клетки, или в его
стабилизации, что будет способствовать повышению его фотохимической
активности, а в конечном итоге - фотофосфорилированию.
Предположение о том, что, обладая окислительно-восстановительными свой-
ствами, АК может участвовать в процессе дыхания, впервые было выдвинуто
А.Сцент-Дьерди в 1927 г. Позднее ряд исследователей рассматривал АК как
существенный фактор дыхания [77, 328, 323]. К.Е.Овчаров [95] отмечал, что не
случайно при прорастании семян имеет место энергичное образование АК, ведь
энергия дыхания прорастающих семян очень высока.
Усиление дыхания под действием АК наблюдали многие авторы [313, 43,
46]. Так, в присутствии аскорбата увеличивалось поглощение кислорода
изолированными проростками ячменя [278], суспензией хлоропластов шпината
[199] и хлореллы, находящейся в темноте [59], срезанными стеблями томатов
[377].
В процессе воздействия на дыхание важная роль принадлежит соотношению
АК/ДАК, так как последняя, функционируя как переносчик водорода в
дыхательной цепи растений [323], отвлекает часть водорода окисляемого
субстрата, что, вероятно, и приводит к торможению дыхания. Показано, что
ДАК тормозит активность дегидрогеназ, интенсивность восстановительных
синтезов, образование макроаргических связей. Поэтому повышение отношения

11
АК/ДАК за счет уменьшения ДАК сопровождается усилением дыхания и роста
растительных клеток [434].
При окислении субстрата за счет отнятия водорода последний при участии
переносчиков передается в зависимости от вида растения, сорта или стадии
индивидуального развития на цитохромную систему, флавиновую или
аскорбатоксидазу. Этот фермент может отдать водород непосредственно на
кислород и выполнить функцию терминальной оксидазы [134]:

Глютатион Редуктаза Аскорбат-

редуктаза ДАК оксидаза

SH2 НАДФ 2 глютатион-SH ДАК Н2О

S НАДФ⋅Н2 глютатион-S-S- АК 1/2 О2

глютатион

Так как аскорбатоксидаза имеет ограниченное сродство к кислороду, можно

полагать, что окисление через систему АК/ДАК имеет подчиненное значение.
Однако Мапсон и Мустафа [328] нашли, что у проростков гороха дыхание на
25% осуществляется за счет системы аскорбатоксидазы. При прорастании семян
гороха примерно через пять дней в них появлялась аскорбиноксидазная система,
для функционирования которой требовалась АК, восстановленный глютатион,
НАД+Н+ и в качестве окисляемого субстрата - яблочная кислота.
Аскорбиноксидазная система проростков была связана с растворимой частью
цитоплазмы и не обнаруживалась в митохондриях.
По мнению Б.А.Рубина и М.Е.Ладыгиной [134], аскорбатоксидаза участвует
и в дыхании хлоропластов, дыхательная цепь которых схематически
изображается следующим образом:

Система пероксидазы
ДАК ↔ АК — Аскорбинатоксидаза
НАДФ+Н2+ О2
Хинон ↔ фенол — о-Дифенолоксидаза
Цитохром в6

В молодых плодах лимона система переноса электронов от дыхательного

субстрата - яблочной кислоты на кислород также включает АК, оксидоредуктазу
АК и глютатион [410]. Интересно отметить, что, как показано в данной работе,
глютатион и АК стимулировали дыхание только в августе - декабре, а в январе-
июне угнетали.
Наряду с фактами активации дыхания в присутствии АК известны примеры
прямо противоположного ее действия. Так, наблюдалось ингибирование
аскорбатом дыхания корней проростков пшеницы в условиях торможения

12
окислительной активности эндоплазматического ретикулума, что, вероятно,
связано с усилением аскорбатзависимого перикисного окисления липидов [25].
Возможность стимуляции окисления жирных кислот (особенно стеариновой) в
присутствии увеличивающихся доз АК (до 106,56 мМ) была показана ранее
[255].
Исследуя взаимосвязь между биосинтезом АК и развитием
нечувствительного к цианиду дыхания в срезах клубней картофеля, авторы [206]
предположили, что АК необходима для синтеза белков, участвующих в дыхании
по нечувствительному к цианиду пути. В связи с чем АК рассматривается как
фактор, контролирующий данный тип дыхания.
Таким образом, АК может участвовать в дыхательном процессе как
непосредственный переносчик водорода и как ко-фактор, стимулирующий
процесс, о чем говорят данные только что рассмотренного исследования.
Причем доля дыхания через систему АК/ДАК может колебаться и в некоторых
случаях становиться доминирующей. Так, у растений табака, пораженных
картофельным вирусом У основной вклад в интенсивность дыхания вносила
система глютатион - аскорбат [315].

2.2. Влияние аскорбата на экспрессию генома, ферментативную активность,

водный режим, ростовые и другие процессы

Рассматривая вопрос о физиологической роли АК в растениях, Чикай и

Сингх [230] указывают, что АК активирует реакции метаболизма, связанные с
обменом нуклеиновых кислот. Это возможно за счет того, что АК играет роль
дерепрессора, снимающего репрессорное действие гистонов на ДНК. Таким
путем АК освобождает большее число матриц для синтеза мРНК [230, 398].
Наиболее существенное физиологическое воздействие АК на растения
обусловлено тем, что она оказывает влияние на ферментативную активность. В
ее присутствии активируется тиоглюкозидаза [276], мирозиназа [361],
ферментативный гидролиз бензилглюкозинолата [269], протеазы, амилазы,
усиливается синтез РНК [231] и активность РНК-азы [338], хотя другие
исследования [231] последнее не подтверждают.
Характер действия окисленных форм АК на ферментативную активность
может быть иным, чем у восстановленной АК. Так, если восстановленная АК
активировала фосфоглюкомутазу семян гороха, то ДАК снижала, а ДКГК - не
оказывала влияния [205]. Другой пример: АК и ДКГК в анаэробных условиях не
меняли активность ферментных систем, окисляющих сукцинат и глюкоза-6-фос-
фат, а ДАК при этом оказывала тормозящее действие [334].
Известны случаи ингибирующего влияния на активность ферментов и
восстановленной формы АК. Это показано для полифенолоксидазы [4] и
протеолитических ферментов, для которых АК является антагонистом [390]. АК
вызывала лаг-фазу в активности пероксидазы, которая снималась
аскорбатоксидазой [224].

13
 Механизм действия АК на ферментативную активность различных энзимов,
вероятно, не одинаков. Активацию претеолитических ферментов аскорбатом
объясняют [45, 46] тем, что в присутствии АК восстанавливаются дисульфидные
группировки. Стимуляция тиоглюкозидазы может происходить за счет того, что
АК вызывает конформационное изменение молекулы фермента,
сопровождающееся увеличением сродства к субстрату [276]. Есть мнение [231],
что действие АК затрагивает геном растений: она контролирует кодирующий
механизм, дифференцированно влияя на синтез РНК и скорость реакций
различных ферментов. Полагают, что АК может играть роль гормона,
Таким образом,
мобилизующего действие АК на ферментативную активность может
ферменты.
проявляться или в изменении активности уже имеющихся ферментов, или в
изменении скорости их синтеза.
АК оказывает существенное влияние на водный режим растений. Оно
проявляется в торможении поступления воды [44, 431, 433], уменьшении
оводнённости [44], в изменении подвижности внутриклеточной воды [153],
ускорении транспирации [431, 433, 151]. Хотя в отношении последнего имеются
и прямо противоположные данные [44].
Под действием АК изменяется соотношение свободной и связанной воды за
счет увеличения свободной. Механизм действия АК на поступление и потерю
воды объясняют [44] изменением коллоидно-химических свойств протоплазмы,
а также деполяризацией протоплазменных мембран.
Важную роль АК играет в процессах роста и развития растений. Она
обеспечивает дружное и более быстрое прорастание семян у пшеницы, овса,
кукурузы, кунжута и других растений [241, 230, 408]; активирует рост
гипокотиля и корней [432, 400, 236], проростков люпина, растений ячменя [176]
и помидоров, семядоли которых были удалены после прорастания [300],
пазушных побегов [58]. Имеются данные о стимуляции роста стеблей тростника
окисленной формой АК [443]. Определяя содержание АК в 5-7-дневных
проростках гороха и кукурузы, Г.Ф.Проценко [122] показала, что растения,
отличающиеся быстрым ростом, содержали меньше АК, чем медленно
растущие. На основании чего автор полагает, что АК принимает участие в
биохимических превращениях, лежащих в основе роста. Действительно, АК
меньше используется карликовыми сортами сорго [291], хотя ее содержание, как
показано в данной работе, почти одинаково у высоко-, средне- и низкорослого
сортов.
Определенную роль АК играет в процессах цветения, вегетативной и
репродуктивной дифференциации. Она стимулирует растяжение и морфогенез
клетки [385], цветение некоторых растений [166]. Уровень АК резко повышается
в начале дифференциации цветков [424]. Обработка растений АК увеличивает
количество мужских и женских цветков, но уменьшает их соотношение по
сравнению с контролем [396]. Отмечено стимулирующее действие АК на
клубнеобразование картофеля и его прорастание [270, 393]. Введение АК в
питательную среду значительно усиливало прорастание пыльцы хлопчатника, а
обработка растений АК ускоряла образование и уменьшала опадение завязей
[96]. Плоды абрикоса и сливы быстрее созревали в присутствии АК [417]. Общее

14
воздействие АК на растение проявляется в задержке старения листьев, то есть
распада хлорофилла, РНК, ДНК [252].
Стимулирующее действие АК на ростовые процессы для каждого вида и
сорта растений проявляется в определенных пределах концентраций. Обработка
семян яровой пшеницы АК в концентрации 0,01% стимулировала ростовые про-
цессы, а в концентрации 0,1% - подавляла их [43]. Для корней кукурузы
стимулирующим рост оказался раствор АК в концентрации 0,05-0,005%, а в
концентрации 0,05-2,5% - ингибирующим [88]. В ряде опытов [372] стимуляция
роста отрезков колеоптилей овса под действием АК наблюдалась в узких
пределах концентраций (0,3·10-3 - 4,5·10-3 М).
Наряду со стимуляцией роста при обработке растений АК происходит
увеличение содержания последней [245, 184, 168, 264, 248, 253, 407], тем самым
увеличивается суммарное воздействие АК на ростовые процессы.
Отмеченное в ряде работ отсутствие стимуляции или даже угнетение роста
под действием АК [334, 352, 369, 428, 435] можно объяснить тем, что АК при
окислении быстро превращается в ДАК, которая замедляет рост [47, 436]. Так,
ингибирование роста, наблюдаемое у карликовых мутантов кукурузы, имело
место при более высоком отношении ДАК/АК по сравнению с нормально
растущими растениями и, как заключает автор, рост связан с более
восстановленным состоянием клетки [340]. Хотя поддерживать его за счет
восстановленной АК непросто, так как у карликовых и нормально растущих
растений кукурузы наибольшая активность свободного и связанного с
клеточными стенками фермента, окисляющего АК, - АО - обнаружена в тканях
мезокотиля с активным растяжением клеток. Таким образом, для активного
роста растений необходимо высокое содержание восстановленной формы АК
при Ингибирующее
активной АО. действие АК на ростовые процессы находит и другое
объяснение с учетом результатов следующего опыта: 30-дневные растения
пшеницы опрыскивали в течение 11 дней 0,001 и 0,005 М растворами АК [412].
Это привело к снижению высоты растений, количества побегов, массы
надземной части, содержания общего количества свободных аминокислот. В
связи с чем угнетающее действие АК на рост автор связывает с влиянием ее на
синтез аминокислот. Конкретнее, это может проявляться в ингибировании
переаминирования глутаминовой кислоты и аланина [398].
Таким образом, в литературе имеются данные о стимуляции и
ингибировании ростовых процессов у растений под действием АК. Естественно,
это можно объяснить и видовой специфичностью объектов исследования, и
конкретными условиями опытов. Но в любом случае для окончательного
решения вопроса необходим одновременный анализ всех кислот системы АК:
АК ↔ ДАК → ДКГК, так как свойства АК и ДАК как доноров электронов,
источников водорода - прямо противоположные, что, несомненно, сказывается
на их воздействии на ростовые процессы. При этом легкость перехода АК в ДАК
и наоборот усложняет ситуацию определения действующего начала. Тем не
менее большинство авторов разделяет точку зрения о том, что в присутствии АК
отмечается стимуляция ростовых процессов.

15
 Механизм действия АК на рост может быть двояким. С одной стороны, АК
может выполнять функцию дерепрессора, снимающего репрессию синтеза ДНК
гистонами, что определяет ее участие в работе кодирующего механизма клетки
[230, 398]. С другой стороны, действие АК на рост может быть опосредовано
через ауксины. Показано, что АК может тормозить окисление индолилуксусной
кислоты, катализируемое пероксидазой, возможно, прямо связываясь с ИУК. В
этом случае АК выступает как конкурентный ингибитор пероксидазы, защищая
ИУК от разрушения [357]. Стоит отметить, что существовало мнение, согласно
которому специфическая активность ауксинов сама является результатом их
первичного воздействия на обмен АК [332].
Особый интерес для биотехнологии, и в частности для отработки методов
культивирования растительных тканей, представляют данные о накоплении АК
этими тканями и о стимуляции их роста АК [288, 295].
АК оказывает влияние на азотистый обмен растений. Обработка пшеницы
раствором АК приводила к уменьшению в листьях количества свободных
аминокислот и некоторому повышению содержания нерастворимого азота [412].
Присутствие АК в функционирующих клубеньках вигны говорит о возможном
ее участии в процессе азотфиксации [253].
Под действием АК активируются некоторые биосинтетические процессы.
Показана необходимость АК для биосинтеза оксипролинсодержащих белков в
растениях [207, 365] и синтеза алкалоидов в недифференцированной каллюсной
ткани мака снотворного [295]. АК вызывала снижение окислительно-восстано-
вительного потенциала березы, что ускоряло переход к вегетации, связанной с
синтезом биополимеров [144].
Экзогенный аскорбат оказывает действие на разность поверхностных
биопотенциалов, сдвигая ее в область положительных значений у набухающих
семян кукурузы и пшеницы [139]. АК снимала индуцируемое феррицианидом
увеличение рО2 у элодеи и валлиснерии [93].
Таким образом, даже конспективное перечисление тех процессов, в которых
принимает участие АК: фотосинтез, дыхание, рост, развитие, устойчивость,
экспрессия генома, ферментативная активность, биосинтетические и
биофизические процессы, азотфиксация, восстановление нитритов [214] -
говорит о том, что АК затрагивает практически все стороны жизнедеятельности
растений и относится к числу важнейших полифункциональных соединений
автотрофных организмов.
2.3. Защитная функция аскорбиновой кислоты

АК выполняет важную защитную функцию, что прежде всего проявляется в

отношении растений к пониженным температурам. В ряде работ показана роль
АК в формировании зимостойкости [1, 117, 147, 170, 202]. Это касается
интродуцируемых растений [72], плодово-ягодных культур [118, 188] и злаков
[122, 126], зимостойкие сорта которых накапливали больше АК, чем менее
зимостойкие.
Большое количество работ посвящено исследованию действия АК на
иммунные свойства растений, так как считается, что одним из проявлений

16
активного иммунитета растений является нормальное или повышенное
образование в них АК [27, 112, 119]. Например, содержание АК в плодах манго,
превышающее 40 мг %, увеличивает их устойчивость к поражению бактериями,
вызывающими черную пятнистость плодов [439].
Ответной реакцией на многие поражения растений является усиленный
биосинтез АК. Так, в листьях виноградной лозы, восприимчивых к антракнозу,
обнаружено повышенное содержание АК при высокой активности АО [44].
Высоким был уровень АК в листьях баклажана, подверженных вертициллезному
увяданию [389]. Обработка восприимчивых к нематоде сортов томатов
раствором АК (45 мМ) на 96-99% снижала их поражаемость. Полагают, что АК
используется для синтеза митохондриальных оксипролин-содержащих белков,
которые определяют устойчивость томатов к нематоде [208].
Известно мнение, что защитную функцию выполняет не восстановленная
АК, а ее окисленная форма [112], так как у устойчивого к пероноспорозу сорта
гороха в клетках, расположенных у очага поражения, часть АК была
представлена окисленной формой. Она-то, как считают авторы, и служит
барьером на пути возбудителя. У восприимчивых сортов гороха в местах
проникновения патогена обнаружена только восстановленная форма АК.
Защитное действие АК проявляется и при радиационном поражении
растений. Предпосевное облучение сухих семян кукурузы различными дозами
рентгеновских лучей (до 22 тыс. рентген) и гамма-лучей (до 33 тыс. рентген)
вызывало при больших дозах радиации увеличение у растений содержания АК
[145]. В связи с этим предпринимаются попытки выяснить защитное действие
пре- и постобработки экзогенной АК на семена, подвергнутые воздействию
гамма-излучения [426]. Уже имеются данные о том, что замачивание семян яч-
меня в 0,5 М растворе АК за час до облучения снижало количество
поврежденных облучением проростков и стимулировало их рост [449]. При
облучении в летальных дозах количество АК может уменьшаться, возможно, за
счет того, что возрастает ее расход на окисление липидов [94, 406].
Столь же актуальным, как исследование защитной роли АК при
радиационном облучении, является изучение защитных свойств соединений
системы АК в отношении растений, обрабатываемых гербицидами [397]. Для
практики сельского хозяйства определенный интерес может представлять тот
факт, что коэффициент восстановления - окисления ДАК и АК соответственно
был значительно выше у сортов, устойчивых к полеганию [82].
Повышенным уровнем АК отличаются пораженные раком органы картофеля
[76]. По данным Р.Маковер [316], АК ослабляет его побурение. Некоторые
производные АК - аскорбат калия, аскорбат кальция - способны защищать
листья фасоли от повреждений, вызываемых озоном [248]. Каким образом
растения могут защищать себя от губительного действия озона, используя АК ?
Предполагается, что диффундирующий в листья озон прежде всего реагирует с
АК, сконцентрированной в клеточных стенках, и это ограничивает его
проникновение в наиболее уязвимые ткани. Другие механизмы инактивации
озона в клеточной стенке, такие, как разрушение его в результате образования
перекисей и реакций с этиленом, вероятно, не столь эффективны [225].

17
 Экзогенный аскорбат может снимать ингибирование нитратредуктазы в
листьях овса в темноте вызванное перекисью [293]. Возможная функция АК и
компонентов ее системы в растениях, находящихся в условиях стресса,
рассматривается в ряде работ [455, 457-461].
Таким образом, при участии АК формируется устойчивость растений по
отношению ко многим неблагоприятным воздействиям: к пониженной
температуре, радиации, вирусной и бактериальной инфекции и т.д. Учитывая
результаты цитированных выше работ, можно рекомендовать использование
обработки АК для борьбы с возбудителями некоторых заболеваний растений.
Кроме этого, уровень эндогенной АК может служить тестом, характеризующим
устойчивость растений. В перспективе растения, обладающие высоким пока-
зателем тестирования по данному признаку, можно использовать при получении
растений с заданными свойствами методами соматической гибридизации и
генной инженерии.

Глава 3. БИОСИНТЕЗ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ДЕРИВАТОВ

3.1. Субстраты для новообразования аскорбата

Способностью синтезировать АК обладают растения различных уровней

организации: грибы, водоросли, мхи, лишайники, хвощи, плауны, голосеменные
и покрытосеменные растения. Присутствует она и в бактериях [152].
Содержание АК в растениях колеблется в значительных пределах, достигая
рекордной величины в плодах австралийского растения терминалии
фернандианы и мальпигии - около 4000 мг % [162]. Виды растений, листья
которых отличаются повышенным содержанием АК, могут иметь самое
различное таксономическое положение [198]. Растения легко синтезируют АК,
но каким образом они это делают, до сих пор полностью не ясно [28].
Изучение путей синтеза АК началось с установления природы веществ,
являющихся исходными при ее новообразовании. Первые убедительные
доказательства того, что АК образуется из гексоз, были получены в
экспериментах С.Рай [371], которая показала, что у отрезанных зародышей
гороха, растущих на стерильной синтетической среде, гексозосахара
увеличивали содержание витамина С. Со времени первых экспериментов
прошло немало лет, однако до сих пор не ясно, какие именно сахара являются
исходными
К.Л.Поволоцкая
для синтеза
[115],
АК. испытав различные моно- и дисахара: глюкозу,
фруктозу, галактозу, лактозу, маннозу и сахарозу - показала, что все они, за
исключением лактозы, используются в синтезе АК. Необходимость глюкозы для
синтеза АК отмечала и К.З.Тульчинская [159].
Инфильтрируя в проростки овса различные соединения, В.Н.Девятнин [32]
установил, что синтез АК усиливается при введении веществ, содержащих 6

18
углеродных атомов и сходных по расположению отдельных атомов в положении
С5-С6 с l-АК. Соединения, не отвечающие этим требованиям, как полагает автор,
в биосинтезе АК непосредственного участия не принимают. Основным
материалом для синтеза АК, по его мнению, являются углеводы, и в первую
очередь такие углеводы и их производные, как инозит, сорбит, 2-кето-l-
гулоновая кислота, левулоза и сорбоза.
Большое влияние на биосинтез аскорбиновой кислоты из экзогенных
субстратов оказывают условия освещенности. Так, в опытах Аберга [193]
выдерживание в темноте в течение 1-5 суток листьев овса и петрушки на 2,5-5%-
ных растворах сахарозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, ксилозы
снижало в них содержание аскорбиновой кислоты и только при длительном
выдерживании листьев (2-4 суток) на 10-20%-ных растворах сахарозы и 5%-ных
растворах глюкозы и ксилозы в темноте наблюдалось некоторое увеличение
содержания аскорбиновой кислоты по сравнению с исходным. В наших
исследованиях [98, 103] также подчеркивается необходимость света в
образовании аскорбиновой кислоты из глюкозы.
Иного характера данные приводит Е.Ассольбергс [209]. Из большого набора
исследованных им соединений (d-глюкоза, d-фруктоза, l-сорбоза, d-глюкуроно-
вая кислота, 2-кета-l-гулоновая кислота, глюкозоциклоацетоуксусная кислота и
др.) только γ-лактон глюкуроновой кислоты вызывал значительное увеличение
содержания аскорбиновой кислоты в листьях молодых побегов яблони,
находящихся на свету (18 тыс.люкс, 24,48 часов). Автор не нашел положи-
тельного действия глюкозоциклоацетоацетата на биосинтез АК, в то время как
ряд исследователей [350, 427] рассматривал это соединение как промежуточное
при биосинтезе АК. Семена фасоли при проращивании в присутствии
радиоактивной глюкозы или радиоактивного глюкозоциклоацетоацетата
использовали последний в пять раз лучше, чем глюкозу [427]. М.Натх и
М.Белкходе [350] также отмечали преимущественное использование
глюкозоциклоацетоацетата в биосинтезе АК по сравнению с глюкозой и
ацетоацетатом.
В опытах М.Накатани [З48] ферментный препарат, выделенный из
зародышей 6-дневных зеленых проростков гороха, способных интенсивно
синтезировать АК, катализировал образование АК из d-глюкуроновой, d-
галактуроновой и особенно из диацетон-2-кето-l-гулоновой кислот. В
присутствии d-глюкозы и d-галактозы синтез АК не шел.
Использование углеводов в биосинтезе АК в настоящее время не вызывает
сомнения [368, 402]. Что касается исследования органических кислот как
субстрата для образования АК, то здесь следует снова обратиться к работе
В.А.Девятнина [32], в которой помимо уже названных соединений изучалось
действие щавелевой, винной, фумаровой, янтарной, лимонной, альгиновой, АК и
2-кета-l-гулоновой кислот. При инфильтрации в проростки овса из них лишь
последняя увеличила содержание АК на 20% по сравнению с исходным.
Введение АК поднимало собственный уровень лишь на 6%, фумаровой и

19
лимонной - на 2,6. Винная и альгиновая кислоты не меняли содержание АК,
щавелевая - снижала его на 15%. В опыте использовались растения, выращенные
на свету.
В своей работе по изучению действия органических кислот на биосинтез АК
мы строго контролировали условия освещения во время опыта. В качестве
субстрата использовали α-кетоглутаровую, янтарную, винную, щавелевую,
яблочную и лимонную кислоты в концентрации 0,005 М. Опытные 7-9-дневные
проростки ячменя, предварительно выдержанные в темноте в течение 48 часов,
помещали на растворы кислот в темноте и на свету люминесцентных ламп ЛЦД-
40 (17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на 6 часов. В связи с тем, что использование глюкозы в
процессе биосинтеза АК является доказанным, в параллельных вариантах листья
помещались на 0,005 М раствор глюкозы и на воду. Контролем служили
растения, растущие во время опыта в темноте.
В таблице 1 представлены данные о действии винной кислоты на биосинтез
АК в проростках ячменя. На растворе винной кислоты на свету содержание АК в
листьях увеличилось в 2,5 раза по сравнению с контролем, тогда как на растворе
глюкозы - общепризнанном субстрате для биосинтеза АК - в 2 раза, на воде -
лишь на 38%. Положительное действие на биосинтез АК винная кислота, так же
как и глюкоза, оказывала только на свету.
Таблица 1
Влияние винной кислоты на биосинтез АК в 8-9-дневных
проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)
Вариант опыта АК t
мкг/г %
Контроль (а) 49,3 100
На воде:
свет (б) 67,8 138 а
темн. (в) 50,9 103 = 0,41
в
На 0,005 М растворе винной кислоты: б
свет (г) 126,5 256 = 9,27
г
темн. (д) 44,4 90 г
= 12,39
е
а
= 0,85
д
На 0,005 М растворе глюкозы: б
свет (е) 99,0 201 = 6,09
е
темн. (ж) 49,1 100 а
= 0,07
ж

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05

20
 Достаточно хорошо используется в биосинтезе АК и α-кетоглутаровая
кислота (табл.2): содержание АК в листьях, плавающих на 0,005 М растворе α-
кетоглутаровой кислоты, на свету увеличилось на 47%, на растворе глюкозы - на
44. В этой серии опытов использовались проростки с более высоким исходным
содержанием АК, поэтому прибавка АК в абсолютных величинах не столь
высока, как в предыдущих опытах, однако и здесь достоверно показано, что α-
кетоглутаровая кислота используется в биосинтезе АК так же хорошо, как и
глюкоза. Использование α-кетоглутаровой кислоты в этом процессе идет только
на свету.
Положительное действие на биосинтез АК оказала и янтарная кислота
(табл.3). Содержание АК в листьях, находившихся на растворах янтарной
кислоты и глюкозы, увеличилось соответственно на 51 и 58%, на воде - на 39. В
данных опытах выявлено достоверное накопление АК в листьях, находившихся
в темноте на растворе янтарной кислоты и на воде. Вероятно, в определенных
условиях проростки содержат достаточное количество предшественника АК, что
позволяет им осуществлять синтез АК и в темноте, независимо от наличия экзо-
генных субстратов.
В проростках ячменя, помещенных на 0,005 М раствор щавелевой кислоты
на свету (табл.4), за 6 часов освещения содержание АК увеличилось на 55% по
сравнения с контролем. В листьях на растворе глюкозы прибавка в содержании
АК составила 56%, на воде - 32. Следовательно, щавелевая кислота наряду с
винной, янтарной и α-кетоглутаровой может использоваться как субстрат в
биосинтезе АК.

Таблица 2
Влияние α-кетоглутаровой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных
проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)
Вариант опыта АК t
мкг/г %
Контроль (а) 104,2 100
На воде: а
свет (б) 142,7 137 = 5,54
в
темн. (в) 115,0 110
На 0,005 М растворе α-кетоглутаровой кислоты: б
свет (г) 152,8 147 = 3,62
г
темн. (д) 98,3 94 г
= 0,48
е
а
= 1,41
д
На 0,005 М растворе глюкозы: б
свет (е) 150,1 144 = 8,70
е

21
 темн. (ж) 111,0 106 а
= 1,33
ж

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05

Таблица 3
Влияние янтарной кислоты на биосинтез АК в 8-дневных
проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)
Вариант опыта АК t
мкг/г %
Контроль (а) 126,6 100
На воде:
свет (б) 175,7 139 а
= 4,96
темн. (в) 140,9 111 в
На 0,005 М растворе янтарной кислоты: б
свет (г) 191,7 151 = 3,76
г
темн. (д) 137,8 109 г
= 1,38
е
а
= 9,58
д
На 0,005 М растворе глюкозы: б
свет (е) 199,6 158 = 4,60
е
темн. (ж) 135,8 107 а
= 1,23
ж

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05

Таблица 4
Влияние щавелевой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных
проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)
Вариант опыта АК t
мкг/г %
Контроль (а) 113,8 100
На воде:
свет (б) 150,0 132 а
= 2,79
темн. (в) 125,6 110 в
На 0,005 М растворе щавелевой кислоты: б
свет (г) 176,4 155 = 7,45
г
темн. (д) 144,4 127 г
= 0,54
е
а
= 3,55
д

22
На 0,005 М растворе глюкозы: б
свет (е) 178,2 156 = 3,61
е
темн. (ж) 130,5 115 а
= 1,93
ж

n = 8, tтабл. = 2,36 для Р ≤ 0,05

Наиболее активно биосинтез АК идет в проростках, помещенных на раствор
щавелевой кислоты на свету, однако щавелевая кислота может использоваться и
в темноте.
Содержание АК в проростках, используемых в опытах по изучению
действия яблочной кислоты на биосинтез АК, было низким (табл. 5), поэтому
отмечалось резкое возрастание содержания АК в освещенных листьях,
находящихся на воде и на глюкозе (на 113 и 140%). В варианте же с яблочной
кислотой увеличение АК составило всего лишь 48%, т.е. меньше, чем на воде.
Таблица 5
Влияние яблочной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 7-дневных
проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)
Вариант опыта АК t
мкг/г %
Контроль (а) 50,4 100
На воде:
свет (б) 107,5 213 а
= 1,39
темн. (в) 47,6 94 в
На 0,005 М растворе яблочной кислоты: б
свет (г) 74,4 148 = 6,32
г
темн. (д) 58,2 115 г
= 7,35
е
а
= 0,91
д
На 0,005 М растворе глюкозы: б
свет (е) 121,2 240 = 3,46
е
темн. (ж) 43,5 86 а
= 3,85
ж

n = 8, tтабл. = 2,36 для Р ≤ 0,05

В следующей серии опытов исследовалось действие лимонной кислоты на

накопление АК (табл. 6). Здесь также отмечено резкое возрастание содержания
АК в освещенных проростках, причем прибавка АК была почти одинаковой во
всех вариантах: на воде - 89%, на растворе лимонной кислоты - 94%, несколько
большее увеличение на растворе глюкозы - 104%. Во всех темновых вариантах
прибавка АК составила 19-26%. Следовательно, в присутствии экзогенной

23
лимонной кислоты скорость новообразования АК на свету не увеличивается по
сравнению с контролем на воде, а в случае с яблочной кислотой даже
уменьшается.
Таким образом, наряду с углеводами в процессе биосинтеза АК могут
использоваться соединения, содержащие более короткую углеродную цепочку, в
частности некоторые органические кислоты, такие, как щавелевая, янтарная,
винная и α-кетоглутарозая. Причем использование их идет преимущественно на
свету, а в случае с винной и α-кетоглутаровой кислотами - только на свету [110].
Стимуляцию накопления АК в присутствии экзогенной щавелевой и винной
кислот можно объяснить исходя на того факта, что деградация АК в растениях
идет с образованием данных кислот. Следовательно, при их избытке, когда воз-
можно ингибирование процесса деструкции молекулы АК конечными про-
дуктами реакции, снижаются ее потери.

Таблица 6
Влияние лимонной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 8-дневных
проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)
Вариант опыта АК t
мкг/г %
Контроль (а) 73,8 100
На воде:
свет (б) 139,6 189 а
= 19,91
темн. (в) 92,3 125 в
На 0,005 М растворе лимонной кислоты: б
свет (г) 143,6 194 = 0,71
г
темн. (д) 87,6 119 г
= 1,08
е
а
= 5,05
д
На 0,005 М растворе глюкозы: 150,6 204 б
свет (е) 92,9 126 = 1,56
е
темн. (ж) а
= 2,47
ж

n = 6, tтабл. = 2,57 для Р ≤ 0,05

Стимуляцию синтеза АК экзогенными субстратам вообще, и органическими

кислотами в частности, нельзя интерпретировать однозначно, как
непосредственное использование этих соединений при новообразовании АК.
Возможно опосредованное ускорение биосинтеза АК через стимуляцию других
процессов, например, ЦТК в случае с органическими кислотами -
интермедиатами цикла [15]. Это предположение проверялось в опытах по
исследованию действия экзогенного пирувата, декарбоксилирование которого

24
дает уксусную кислоту, используемую в ЦТК. Исследования показали
стимуляцию синтеза АК в листьях ячменя, плавающих на 0,005 М растворе
пирувата, по сравнению с вариантом, где в качестве субстрата использовался
0,005 М раствор глюкозы (рис.1). Положительное действие пирувата
наблюдалось только у освещенных растений (рис. 2). Следовательно,
существует связь биосинтеза АК с функционированием ЦТК на свету.

Рис. 1. Накопление АК в освещенных (31,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) листьях ячменя,

плавающих на 0,005 М растворе глюкозы (1) и 0,005 М растворе пирувата (2)
различное время

25
Рис. 2. Действие экзогенного пирувата (0,005 М) на накопление АК в листьях ячменя в
темноте (1) и на свету (31,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) (2)
Более достоверные и информативные данные при исследовании
возможности использования в биосинтезе АК тех или иных соединений,
несомненно, дает метод меченых атомов. Показано, что изолированные листья
девичьего винограда пятилисточкового (Parthenocissus quinquefolia α.)
трансформируют меченую d-глюкозу (5-3H-1-14С-глюкозу и 3H-, 14С-глюкозу) в
АК с сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной
группы [271, 272]. Таким образом, метод позволяет не только однозначно
решить вопрос о возможности использования конкретного субстрата в
биосинтезе АК, но и дает материал для решения вопроса о путях ее биосинтеза.
Подробнее эти два взаимосвязанных вопроса будут рассматриваться в следую-
щем разделе.
3.2. Химизм биосинтеза

Установление веществ, необходимых для образования АК, является лишь

первым этапом в изучении путей ее синтеза, которые до сих пор полностью не
исследованы [28, 306]. Наиболее значительные работы в этой области
выполнены двумя группами исследователей: Ф.Ишервуд, Л.Мапсон, Г.Чжень и
Ф.Ловус, Р.Джанг, а в последние годы - Ф.Ловус в сотрудничестве с
Я.Хелспером, К.Саито и др. уже больше внимания обращали не на биосинтез, а
на метаболизм АК.
Большинство авторов наиболее вероятными предшественниками АК
считают d-глюкозу и d-галактозу [150]. Это значит, что при превращении их в l-
АК гидроксильные группы у пятого углеродного атома должны быть
перемещены из d, положения в l. Это может осуществиться прямой инверсией
групп у С5 или инверсией всей цепи так, что С-1 d-глюкозы станет С-6
углеродной цепи АК. Имеется несколько возможных механизмов для
реализации этих Г.Чжень,
Ф.Ишервуд, изменений.
Л.Мапсон [282, 283] считают, что превращение d-глю-
козы и d-галактозы в l-АК включает инверсию всей молекулы и идет без
предварительного расщепления углеродной цепи:

CHO CHO СH2OH CO

Н-С-OH H-С-OH H-С-OH HO-С

НО-С-H HО-С-H HО-С-H * HО-С О

H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C

H-C-OH H-C-OH H-C-OH HO-C-H

26
 СH2OH СOOH СOOH СH2-OH

D-глюкоза D-глюкуро- L-гулоно- L-АК

новая кислота вая кислота

* инверсия
Биосинтез АК, по их мнению, более вероятно протекает из d-галактозы
путем окисления ее в d-галактуроновую кислоту, восстановления d-
галактуроновой кислоты в l-галактоновую и окисления γ-лактона последней в l-
АК:
CHO CHO СH2OH CO

Н-С-OH H-С-OH H-С-OH HO-С

НО-С-H HО-С-H HО-С-H * HО-С О

HO-C-H HO-C-H HO-C-H H-C

H-C-OH H-C-OH H-C-OH HO-C-H

СH2OH СOOH СOOH СH2-OH

D-галактоза D-галактуро- L-галактоно- L-АК

новая кислота вая кислота

Приведенная схема не включает всех промежуточных соединений на пути

синтеза АК. Л.Мапсон и Ф.Ишервуд [327] более подробно анализируют
превращение d-галактуроновой кислоты в l-АК растительными экстрактами. Под
влиянием экстракта из проростков гороха происходит превращение
производных d-галактуроновой кислоты в производные l-галактоновой кислоты
и дальше в l-АК. Этот процесс in vitro осуществляется в две стадии:
1) восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно-γ-лактон под
влиянием фермента, локализованного в растворимой части цитоплазмы; процесс
идет за счет восстановленного НАД⋅Н;
2) окисление лактона в АК, требующее присутствия ферментного ком-
понента, заключенного в митохондриях.
Эффективность использования l-галактоно-γ-лактона в биосинтезе АК
показана и другими авторами [287], наблюдавшими при его введении в листовые
пластинки Petroselinum crispum резкое возрастание АК, содержание которой
через 190 часов достигало 12% от сухого веса.
Правильность предлагаемой схемы синтеза проверяется следующим
образом: в качестве субстрата растениям дается предполагаемое промежуточное
вещество и регистрируется, насколько быстро из него синтезируется АК. В том
случае, когда образование АК идет из d-глюкозы, непосредственным
предшественником l-АК будет l-гулоно-γ-лактон [74, 283, 388]. Возможность

27
использования в синтезе АК d-галактуроновой кислоты и гулонолактона
отрицалась Е.Ассольбергсом [209], который показал, что в отрезанных листьях
яблони они вызывали меньший синтез АК, чем водный контроль. Автор
предполагал, что промежуточное вещество между глюкуроновой и АК может
быть иным, чем γ-лактон.
Схема биосинтеза АК, предложенная Ф.Ишервудом с сотрудниками,
находит подтверждение в экспериментах с использованием экзогенных
субстратов (in vivo) и ферментных препаратов (in vitro). Подкормка проростков
салата, бобов и гороха l-галактоно-γ-лактоном легко дает l-АК. Д-глюкуроно-γ-
лактон и l-гулоно-γ-лактон также дают l-АК, но в намного меньшем количестве,
чем соответствующие производные галактозы.
Ф.Ишервуд с сотрудниками первыми демонстрировали образование l-АК in
vitro в экстрактах из проростков гороха, используя l-галактоно-γ-лактон как
субстрат. Ответственные ферменты были всецело локализованы внутри
митохондрий. L-галактоно-γ-лактон быстро превращался в l-АК. Скорость
превращения l-гулоно-γ-лактона в l-АК составляла лишь 1/20 от скорости
предыдущей реакции [282].
Таким образом, группой Ф.Ишервуда получены экспериментальные данные
в подтверждение того, что в биосинтезе АК могут быть использованы
производные d-глюкозы и d-галактозы, причем последние: d-галактуроновая
кислота, l-галактоно-γ-лактон - являются лучшими субстратами, чем
соответствующие производные d-глюкозы. Этот путь образования АК, по
мнению авторов, включает инверсию углеродного скелета исходной молекулы и
образование промежуточных фосфорилированных продуктов.
Схема путей биосинтеза l-АК у Euglena gracilis, предложенная С.Шигеока
[402], предусматривает возможность обмена метаболитами, образующимися из
d-глюкозы и d-галактозы при перестройке их в молекулу АК:

Д-глюкоза Д-галактоза

UДР-глюкоза UДР-галактоза
(А)
UДР-глюкуроновая кислота UДР-галактуроновая кислота

Д-глюкуроновая кислота Д-галактуроновая кислота

(В)
Д-глюкуроно-γ-лактон L-галактоновая кислота
(В)
L-гулоно-γ-лактон L-галактоно-γ-лактон
(С) (С)
L-аскорбиновая кислота

Жирные линии на схеме показывают главный путь синтеза АК, в ней

приведены некоторые ключевые ферменты, катализирующие данный процесс:

28
 (А) - UДР-глюкозо дегидрогеназа;
(В) - NАДР: l-гексонат дегидрогеназа;
(С) - l-гулоно-γ-лактон дегидрогеназа.
Эффективным приемом в выяснении путей синтеза АК является ис-
пользование радиоактивных метчиков, что дает возможность проследить путь от
исходного вещества до конечного продукта. Такие исследования с
использованием радиоактивных веществ проведены Ф.Ловусом с сотрудниками.
В отделенные созревающие плоды земляники вводились растворы гексоз,
меченых по определенному атому углерода. Через 24-120 часов из плодов
выделялась АК, в ней определялось место меченого углерода и величина его
активности. Кроме земляники анализировались листья винограда, петрушки,
проростки кресс-салата, молодые побеги фасоли,
Изолированные листья винограда трансформировали d-глюкозу в l-АК с
сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной
группы [272]. В ягодах земляники и побегах фасоли [217] исследовался
биосинтез l-АК из l-гулоно-1,4-лактона и l-галактоно-1,4-лактона.
Радиоактивность в l-АК была локализована в том же атоме углерода, что и в
предшественнике. Результаты некоторых исследований, выполненных
Ф.Ловусом с сотрудниками [308, 309, 310, 311, 312], суммированы в таблице 7.
Из представленных данных видно, что в плодах земляники и проростках
кресс-салата молекула глюкозы, меченая по 1,2 или 6-му углеродному атому,
превращается в l-АК, меченую соответственно по 1, 2 или 6-му атому углерода.
Это дало возможность авторам предполагать, что образование l-АК из d-
глюкозы и d-галактозы идет без разрыва углеродной цепи и без специфического
использования одной или другой триозы. Данный случай рассматривается как
один из путей образования АК в растениях, включающий образование
фосфорилированных гексоз.
Иная картина была получена, когда в зеленые плоды земляники ввели d-глю-
куронолактон, меченый по первому углеродному атому. После 66-часовой
экспозиции 97% метки было сосредоточено в 6-м углеродном атоме l-АК, что
возможно только при перестройке углеродного скелета [311].
Подобная инверсия цепи углерода имела место при введении в плоды
земляники d-галактуроновой кислоты [304]. Данные эксперименты
подтверждают мнение Ф.Ишервуда и его коллег о том, что образование l-АК
предусматривает инверсию молекул исходных гексоз. Однако необходимо иметь
в виду, что в данном случае образование АК зависело от введения
специфического углеродного источника, такого, как d-глюкуронолактон. В
нормальном процессе биосинтеза АК этот путь, очевидно, не будет главным.
Таблица 7
14
Включение субстратов - С в l-АК
Распределение меченого С в
Объект Субстрат молекуле АК, в % от общей ак-
С1 С2 тивности
С3 С4 С5 С6

29
Проростки кресс- d-глюкоза-1-14С 64
- - - - -
салата 73
d-глюкоза-1-14С 65-70 7-8 2-8 14-19
Созревающие плоды d-глюкоза-2-14С 69-73 0-6 22-23 2-5
земляники d-глюкоза-6-14С 24 <1 1 2 73
d-глюкуронолактон-1- - - - 97
14
С
d-галактоза-1-14С 45 - 8 6 - 41
Следовательно, в растениях существует и другой путь синтеза l-АК из d-
глюкуронолактона и d-галактуроновой кислоты, который не включает
образование промежуточных фосфорилированных продуктов и предусматривает
образование l-АК с инвертным порядком углерода С-цепочки по сравнению с
исходной уроновой кислотой или лактоном.
Предположение о существовании в растениях двух путей синтеза l-АК,
выдвинутое Ф.Ловусом и др., встретило возражение со стороны Ф.Ишервуда и
Л.Мапсона [282]. Так как экспериментальные доказательства в пользу
отсутствия инверсии углеродной цепи глюкозы при образовании АК зависят от
чистоты ее изолирования, то можно предположить, что существует
радиоактивное загрязнение АК, которое трудно удалить. Таким загрязняющим
веществом авторы считают d-арабоаскорбиновую кислоту, которая может быть
образована следующим образом: d-глюкоза → 6-фосфо-d-глюконовая кислота →
3-окси-6-фосфо-d-глюконовая кислота → 3-окси-d-глюконовая кислота →
d-арабоаскорбиновая кислота. Важно отметить, что глюкоза, меченая по
первому углеродному атому, даст d-арабоаскорбиновую кислоту, меченую
также по первому углеродному атому, так что действительная картина
превращения d-глюкозы в l-АК будет завуалирована.
В связи с тем, что в синтезе АК галактоза используется лучше, чем глюкоза,
а радиохимические доказательства отсутствия инверсии в отношении галактозы
менее определенны, чем в отношении глюкозы, то необходимы дальнейшие
работы, чтобы решить вопрос, существуют ли два пути синтеза l-АК в
растениях, как предполагает Ф.Ловус [305], или один путь, включающий
инверсию углеродной цепочки d-глюкозы или d-галактозы при образовании l-
АК, как считает Ф.Ишервуд и др.

3.3. Компартментация процесса биосинтеза аскорбиновой,

дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот

Внутри растительной клетки АК распределена неравномерно. Содержание ее

в субклеточных структурах во многом зависит от их функционального
состояния [195, 289] и от внешних условий [181, 273]. Обнаружение АК в тех
или иных органоидах еще не дает основания связывать ее биосинтез с данными
компартментами, так как между клеточными структурами постоянно идет обмен
метаболитами. Поэтому при решении вопроса о внутриклеточной локализации
биосинтеза АК в листьях ячменя нами не только учитывались данные по

30
количественному распределению аскорбата [178], но и исследовалось
накопление АК и ее дериватов - ДАК и ДКГК - при ингибировании
хлоропластных, митохондриальных и цитоплазматических рибосом в зеленых,
этиолированных и альбиносных листьях ячменя.
Содержание АК, ДАК и ДКГК определяли по методу В.В.Соколовского,
Л.В.Лебедевой, Т.Б.Лиелуп, приспособленному нами для анализа растительного
материала [172]. В качестве ингибитора хлоропластных рибосом использовали
стрептомицин, связывающийся с 30S-субъединицами 70S-рибосом.
Цитоплазматические рибосомы блокировали циклогексимидом в концентрации
15 мкг/мл [155], митохондриальные - хлорамфениколом (100 мкг/мл) [185],
учитывая, что к нему чувствительны и рибосомы хлоропластов [7].
Растения, полученные из обработанных СМ семян (альбиносы), имели
альбиносное основание, зеленую верхушку и желто-зеленую переходную зону.
Анализ содержания АК, ДАК и ДКГК в участках листа с различной
пигментацией (рис.3) показал присутствие анализируемых кислот и в
альбиносной ткани, где уровень АК и ДАК был несколько ниже, чем в верхней и
средней зоне листа, но в большем количестве обнаруживалась окисленная форма
АК. Таким образом, альбиносная ткань обладает способностью синтезировать
АК и ее производные, несмотря на значительные нарушения структуры
некоторых клеточных органоидов.

Рис. 3. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней (1), средней (2) и нижней
альбиносной (3) частях мутантных листьев ячменя

Правомерно возникает вопрос о возможности транспорта АК из зеленой

ткани листа в альбиносную, так как в растениях АК может из листьев
передвигаться по проводящим пучкам флоэмы, по центральной полости стебля и

31
по межклетникам паренхимы даже в корни [169]. Исследования, выполненные
на листьях хлорофитума с различным содержанием белой ткани, показали, что в
срезанных листьях не происходит переброса меченых ассимилятов из зеленой
ткани в белую ни на свету, ни в темноте [14], хотя стоит учесть, что характер
расположения белых зон у хлорофитума и у частично альбиносных листьев
ячменя различный.
С целью изучения компартментации процесса биосинтеза АК исследовалось
накопление ее в одновозрастных зеленых, этиолированных и альбиносных
проростках ячменя. В опытах использовались не целые листья, а лишь нижние
их участки, по размеру соответствующие альбиносной зоне мутантных листьев.
Длительное выдерживание зеленых проростков ячменя в темноте снижало в них
уровень АК, а последующее освещение стимулировало ее накопление [181].
Этюд определялась постановка наших опытов, в которых масштаб
светозависимого накопления АК определялся в проростках, отличающихся по
степени сформированности фотосинтетического аппарата после длительного
выдерживання их в темноте (рис.4). После 48-часовой темновой экспозиции
проростки значительно отличались по содержанию восстановленной формы АК:
максимальное количество аскорбата обнаружено в этиолированных проростках,
минимальное - у альбиносных, зеленые проростки содержали лишь 62% АК от
уровня ее в этиолянтах.

Рис. 4. Действие света (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на содержание АК (1), ДАК (2)
и ДКГК (3) в 7-дневных зеленых (а), этиолированных (б) и альбиносных (в)
проростках ячменя, выдержанных 48 часов в темноте

Последующее освещение в течение 24 часов увеличило количество АК во

всех типах проростков, но масштаб светозависимого накопления аскорбата был

32
неодинаков; если у зеленых проростков произошло удвоение содержания АК, то
у альбиносов и этиолированных проростков прирост АК составил лишь 36 и
19% соответственно.
Следовательно, проростки, отличающиеся по пигментному составу и по
степени сформированности фотосинтетического аппатара, обладают разной
способностью накапливать АК. Пул АК на свету определяется
новообразованием и одновременно идущими процессами ее использования, в
которых восстановленная форма АК обратимо окисляется до
дегидроаскорбиновой кислоты, а разрыв лактонового кольца в последней
приводит к необратимому образованию дикетогулоновой кислоты.
Одновременный анализ указанных кислот показывает направленность
процессов в системе АК ↔ ДАК → ДКГК. Так, в зеленых проростках на свету
уменьшается уровень ДАК при одновременном возрастании количества ДКГК,
тогда как у этиолированных проростков сумма дериватов не меняется и остается
на более низком уровне, чем в пигментированных листьях. В связи с этим можно
полагать, что у зеленых проростков на свету восстановленная форма АК
используется активнее, чем у этиолированных и, следовательно, действительный
уровень светозависимого биосинтеза АК в зеленых проростках выше
определяемого. Следует отметить, что если у этиолированных проростков на
свету количество ДАК увеличивается, то у зеленых уменьшается, что, вероятно,
происходит за счет фотовосстановления ДАК до АК, которое имеет место в
хлоропластах [286].
Таким образом, учитывая структурные и физиологические различия
зеленых, этиолированных и альбиносных проростков и их способность
синтезировать АК на свету, можно было бы связывать биосинтез аскорбата с
хлоропластами и, вероятно, с процессом фотосинтеза. Но, как показали
проведенные опыты, АК накапливается в больших количествах в
этиолированных проростках в темноте, а светозависимый биосинтез ее идет и у
альбиносных проростков при увеличивающемся использовании АК на свету, так
как в этих условиях нарастало количество продуктов окисления АК - ДАК и
ДКГК. Альбиносные проростки были получены из семян, обработанных
стрептомицином, который взаимодействует с 30S-субъединицами 70S-рибосом.
Следовательно, светозависимое накопление АК может идти при ингибировании
хлоропластных рибосом, и можно предположить, что ферменты, участвующие в
метаболизации углеводов до АК, синтезируются без участия данных структур.
В последующих опытах выяснялось влияние ингибирования
митохондриальных рибосом на биосинтез АК, так как ранее при исследовании
количественной локализации АК в листьях ячменя было показано
светозависимое накопление АК во фракции, включающей митохондрии [178].
Ингибирование митохондриальных рибосом осуществлялось хлорамфениколом
(100 мкг/мл), к которому чувствительны и рибосомы хлоропластов. В опытах
использовались зеленые и альбиносные проростки, выдержанные 48 часов в
темноте. Нижние участки листьев данных проростков, а также этиолированных
вырезались и помещались основанием в воду (контроль) или раствор
хлорамфеникола на свет (рис. 5).

33
 У контрольных зеленых проростков на свету количество АК увеличилось на
134%, ДКГК - почти вдвое. В присутствии хлорамфеникола уровень
светозависимого накопления АК и ДКГК понизился с одновременным
возрастанием содержания окисленной формы. В этиолированных проростках,
также как и у зеленых, в присутствии хлорамфеникола на свету синтез АК
тормозился, и только у альбиносов светозависимое наколение АК не
ингибировалось хлорамфениколом. Таким образом, в присутствии
хлорамфеникола светозависимое накопление восстановленной формы АК
снижалось у этиолированных и зеленых проростков и не менялось у альби-
носных.

34
 Рис. 5. Действие хлорамфеникола на содержание АК, ДАК и ДКГК в зеленых (а),
этиолированных (б) и альбиносных (в) листьях ячменя, находящихся на свету
(33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1). Проростки предварительно 48 часов выдерживались в темноте
Хлорамфеникол оказывает ингибирующее действие на 80S-рибосомы
митохондрий, но известно его влияние и на синтез белков хлоропластов,
преимущественно высокомолекулярных [81]. Поэтому снижение уровня АК у
зеленых и этиолированных проростков в присутстсвии хлорамфеникола может
быть результатом действия его на оба типа рибосом. У альбиносных проростков
на свету масштаб накопления АК в присутствии хлорамфеникола не менялся, и
это дает основание считать, что синтез ферментов, участвующих в
метаболизации углеводов до АК, может идти без участия не только
хлоропластных рибосом, но и митохондриальных.
Светозависимое накопление АК, блокируемое хлорамфениколом,в зеленых
проростках составило 35% от всей синтезированной на свету АК, в
этиолированных - 54. Следовательно, как минимум половина АК листьев ячменя
синтезировалась в присутствии ингибитора хлоропластных и митохондриальных
рибосом. Разницу в масштабе ингибирования светового синтеза АК в зеленых и
этиолированных проростках хлорамфениколом можно объяснить, допустив, что
фотовосстановление ДАК в хлоропластах - чисто фотохимический процесс,
идущий без участия ферментов, хотя восстановление ДАК до АК возможно с
помощью дегидроаскорбатредуктазы. Скорее всего, эти проростки отличаются
разной скоростью использования АК на свету и неодинаковой обеспеченностью
субстратом процесса биосинтеза АК.
Рибосомы митохондрий высших растений по седиментационным свойствам
и плотностной характеристике не отличаются от 80S-рибосом [29], но
отношение к ингибиторам белкового синтеза у них иное, чем у
цитоплазматических, имеющих константу седиментации тоже 80S: если
митохондриальные рибосомы ингибируются хлорамфениколом, то
цитоплазматические - цикдогексимидом [7], угнетающим синтез белка. Действие
циклогексимида на светозависимое накопление АК проверялось в следующих
опытах (рис. 6).

35
 Рис. 6. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в зеленых проростках ячменя
после 48 часов темноты (а) и 24 часов освещения (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на воде (б)
и растворе циклогексимида (15 мкг/мл) (в)
Уровень АК в проростках ячменя подвержен сезонным колебаниям: зимой
он выше, летом ниже. В данных опытах использовались зеленые проростки с
низким содержанием АК, чему способствовало и предварительное
выдерживание их в темноте в течение 24 часов. Такие проростки обычно
активно накапливают на свету аскорбат. В условиях опыта часть проростков
после темноты освещалась на воде (контроль), другая - на растворе
циклогексимида. В контрольном варианте уровень АК повысился более чем в 3
раза, в присутствии же циклогексимида светозависимое накопление АК было
полностью блокировано. Следовательно, в процессе биосинтеза АК в растениях
на свету принимают участие ферменты, биосинтез которых идет на 80S-
рибосомах
Как говорилось выше, АК в растениях может синтезироваться из глюкозы и
цитоплазмы.
(с большей скоростью) из галактозы, но путь этого синтеза окончательно не
изучен. В общем виде он представляется следующим образом: d-галактоза →
d-галактуроновая кислота → l-галактоновая кислота → l-галактоно-γ-лактон →
l-аскорбиновая кислота. По данным [327], восстановление метил-d-галактурона-
та в l-галактоно-γ-лактон в системе in vitro идет при участии фермента,
локализованного в растворимой части цитоплазмы, а окисление лактона в l-АК
требует ферментного комплекса или одного фермента, заключенного в
митохондриях. В случае использования в качестве субстрата при биосинтезе АК
глюкозы этими ферментами будут глюкуронатредуктаза и
гулонолактоноксидаза [74] соответственно (рис. 7). Для второго фермента
показано [402], что в митохондриях эвглены его содержание составляет только
11,6% от общего количества, а больная часть (86,7%) обнаруживается в ци-
тозоле.
Учитывая полученные данные по полному ингибированию биосинтеза
аскорбиновой кислоты циклогексимидом, можно полагать, что биосинтез
глюкуронатредуктазы идет на 80S-рибосомах. Возможно, и биосинтез
гулонолактоноксидазы связан с цитоплазматическими рибосомами, если же она
синтезируется на митохондриальных рибосомах, то блокирование синтеза АК в
этом случае обусловлено отсутствием субстрата для фермента-l-гулонолактона.
В работе [178] показано, что при длительном освещении проростков ячменя
значительно увеличивается количество АК во фракции, содержащей
митохондрии, тогда как во фракции хлоропластов содержание аскорбата
уменьшается (или не меняется) при 10-минутной экспозиции [243], а в темноте -
наоборот. Эти факты могут говорить об активном использовании АК в
митохондриях в процессе дыхания и в хлоропластах в процессе фотосинтеза,

36
поэтому при отсутствии в темноте фотосинтеза АК накапливается в
хлоропластах, а на свету, когда в зрелых тканях ячменя с хорошо
сформированным фотосинтетическим аппаратом понижается темновое дыхание
[161], количество АК увеличивается в митохондриях.
Накопление АК в митохондриях на свету может быть и результатом
субстратной стимуляции новообразования аскорбата. Однако показано, что
экзогенный субстрат - глюкоза - в темноте не стимулирует синтез АК [103]. Если
же предположить, что в биосинтезе АК лучше используются "молодые"
продукты фотосинтеза [125] или восстановитель - НАДРН+Н+
фотосинтетического проис-

37
 Рис. 7. Схема биосинтеза аскорбиновой кислоты (по А.Ленинжеру, 1985 г.)

38
хождения, тогда становится понятным факт более активного накопления АК в
зеленых проростках на свету по сравнению с этиолированными и альбиносными.
Таким образом, масштаб светозависимого накопления восстановленной
формы АК в проростках ячменя определяется степенью сформированности
хлоропластов и является максимальным у зеленых проростков по сравнению с
этиолированными и альбиносными. Пополнение пула АК на свету тормозится в
присутствии хлорамфеникола у всех типов проростков, кроме альбиносных. У
зеленых растений светозависимое накопление АК полностью ингибировалось
циклогексимидом, что говорит об участии цитоплазматических 80S-рибосом в
биосинтезе ферментов, принимающих участие в метаболизации углеводов в l-
АК.

Глава 4. ДЕЙСТВИЕ ПОЛИХРОМАТИЧЕСКОГО

И МОНОХРОМАТИЧЕСКОГО СВЕТА НА БИОСИНТЕЗ
КИСЛОТ СИСТЕМЫ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

4.1. Светозависимый синтез аскорбиновой кислоты

в зеленых и этиолированных проростках

Биосинтез АК в растениях в основном рассматривается как темновой

специфически направленный окислительный процесс, в котором происходит
аэробное окисление молекулы сахара. К.Л.Поволоцкая [115], наблюдая
образование АК в этиолированных проростках, сделала вывод о том, что свет не
является безусловно необходимым для биосинтеза АК, но в случае зерновых
обеспечивает большее (в 1,5-2 раза) накопление АК.
При изучении природы предшественников АК в этиолированных растениях
коровьего горошка М. Рейд [374] отмечала увеличение АК в темноте в
проростках, находящихся 4 дня на 0,5%-ном растворе глюкозы. Эти данные
подтверждают возможность темнового биосинтеза АК и стимуляцию его
экзогенной глюкозой в то время, когда собственные запасы семядолей уже
израсходованы.
Наблюдаемое рядом авторов [77] увеличение содержания АК в ломтиках
лука на воздухе В.А.Девятнин [33] рассматривал как свидетельство наличия в
луке ферментативной системы, осуществляющей биосинтез АК. Им была
сделана попытка экспериментально показать ферментативный характер
образования АК. С этой целью свежеотжатый луковый сок помещался в колбу с
раствором глюкозы. Через колбу пропускалась сильная струя воздуха,
содержимое колбы охлаждалось до 0°С и освещалось. При соотношении сока к
раствору глюкозы 1:20 в присутствии сернокислого марганца синтезировалась
АК. Прекращение аэрации останавливало процесс. Если в опыте использовался
сок, предварительно нагретый до 100°С, биосинтез АК не шел. Этот факт автор
рассматривал как подтверждение того, что биосинтез АК идет при участии

39
фермента, который ингибируется высокой температурой. Освещение и
температура, как указывает автор, играют второстепенную роль в данном
процессе.
Таким образом, биосинтез АК В.А.Девятнин [33] рассматривал как
ферментативный процесс, который протекает при достаточном снабжении
растительных тканей кислородом и катализируется солями марганца. Природа
ферментативной системы осталась не выясненной им, но было показано, что в
ней принимают участие органические соединения марганца. Однако сама
посылка, из которой исходил В.А.Девятнин,-наличие раневого синтеза АК в
кусочках лука - вскоре стала подвергаться сомнению. Так, И.П.Митев, Р.Белева-
Стайкова [86] показали, что при поранении луковицы возрастает содержание
сульфгидрильных групп и невитаминных редуктонов, которые при
титрационном способе определения АК с 2,6-дихлорфенолиндофенолом дают
завышенные результаты.
В.Франке [244] на основании анализа литературных данных сделал вывод о
косвенном влиянии света на процесс образования АК. Это мнение разделял
К.Е.Овчаров [95], отрицающий прямое участие света в биосинтезе АК. Он
говорил, что то обстоятельство, что содержание витаминов в растениях,
произрастающих в темноте, как правило, снижается, позволило некоторым
авторам прийти к выводу о прямом участии света в биосинтезе витаминов.
Однако достоверные факты, говорящие о непосредственном действии света,
имеются лишь в отношении витамина Д, а что касается других витаминов, в том
числе и витамина С, то такое утверждение ошибочно. В подтверждение этого
положения он приводит факт темнового образования витаминов в
изолированных корнях гороха, хлопчатника и других культур. К.Е.Овчаров
считал, что нельзя говорить о прямом, непосредственном действии света в
процессе образования витаминов, а наблюдаемое снижение биосинтеза
некоторых витаминов в темноте правильнее объяснить глубокими нарушениями
обмена веществ, вызванными длительным пребыванием зеленых растений без
освещения. Это может задержать биосинтез не только витаминов, но и многих
других жизненно необходимых веществ, играющих важную роль в образовании
витаминов.
Таким образом, сторонники темнового образования АК указывали на факт
накопления АК в этиолированных проростках и в неосвещенных частях
растений: в корнях, клубнях. Говоря о накоплении АК в этиолированных
проростках, Т.Н.Кузнецова-Зарудная [70] полагала, что в этих условиях
происходит не новообразование АК, а переход ее из неактивной формы в
активную. Это предположение автор сделал на основании того, что накопление
витамина С в семенах достигает максимума в момент налива семени, а затем
снижается в процессе созревания. При прорастании в темноте накопление
витамина С в проростке ограничено тем максимумом, которого оно достигало в
стадии налива семени. К тому же наблюдаемое в темноте образование АК,
возможно, происходит за счет предшественников, которые синтезируются на
свету. Такого мнения придерживалась М.Рэйд [374]. Б.Оберг [192] отмечал
бóльшее накопление АК в листьях гороха в темноте, чем на свету, но количество
синтезированной АК зависело от интенсивности света предыдущих дней.

40
 Несмотря на отрицание рядом исследователей прямого участия света в
образовании АК, в литературе накапливались данные, указывающие на
увеличение ее содержания под действием света. Еще М.Рэйд [374] отмечала
большое влияние света на накопление АК при прорастании и на ранних стадиях
роста коровьего горошка. Семидневные растения, растущие на свету, содержали
в четыре раза, а одиннадцатидневные - в 8 раз больше АК, чем проростки
соответствующего возраста, растущие в темноте. В листьях тюльпана,
находящихся на свету, по данным Ф.Ажена [266], количество АК было в 4-5 раз
больше,
Со чемвременем
в темноте.
появляются наблюдения, указывающие на то, что
преимущественное накопление АК происходит у растений, растущих на
открытых участках, по сравнению с затененными; в солнечные дни - по
сравнению с пасмурными. Такие данные для томатов были получены Н.Восом
[444], а также Мао Ляном [322], исследовавшим содержание АК у 48 видов
дикорастущих овощных культур, 8 видов древесных и у некоторых других
растений. У деревьев и кустарников было найдено повышенное содержание АК
в наиболее освещенных частях кроны [446], а у хлопчатника в наиболее
освещенных
Высокое ярусах
содержание
листьевАК
[140].
в солнечную погоду наблюдалось в листьях
люцерны [36], кукурузы [37]. Д.И.Шматок [186] на основе определения АК в 242
видах растений из 31 семейства, растущих в полярно-альпийском ботаническом
саду (Мурманская область), также отмечает большее накопление АК в
солнечную погоду, чем в пасмурную. Аналогичный вывод сделан для плодово-
ягодных культур Алтая [188].
Биосинтез АК из меченой 1-14С-,6-14C-,1-4Н- и 6-3Н-Д-глюкозы идет
значительно быстрее на свету, чем в темноте [274].
Стимулирующее действие света на биосинтез АК зависит от его
интенсивности. Это показано в опытах с этиолированными проростками ряда
растений, выполненных Т.Сугаварой [413]. Пятидневные проростки кукурузы,
редиса, китайской капусты освещались 6-42 часов светом различной
интенсивности (10-1000 люкс). Установлено, что увеличение содержания АК
при освещении шло пропорционально увеличению интенсивности света, по
крайней мере в пределах эксперимента автора. В этиолированных проростках,
находящихся в ходе эксперимента в темноте, количество АК оставалось почти
без изменения.
Зависимость биосинтеза АК от интенсивности действующего света показана
для целого ряда растений: огурцов, кукурузы, проса, конопли, мака, которые
выращивались в парниках при интенсивности света, составляющей 1-1/20 от
полного летнего освещения. Оказалось, что уменьшение интенсивности
освещения в 10 раз у всех растений привело к уменьшению количества АК в 3-5
раз [67]. С увеличением интенсивности света (0, 3000, 10000, 20000 люкс, 43
часа) возрастало содержание АК в проростках капусты [346] и семядолях
японской редьки (О, 500, 2500, 10000 люкс, 24 часа) [284]. При выращивании
растений в фитотроне уровень АК также повышался с увеличением мощности
ФАР [183]. Работы такого плана продолжаются в связи с решением вопросов
выращивания овощей в закрытом грунте и получения витаминной пищи [260,
421].

41
 В литературе имеется лишь несколько указаний на то, что содержание АК в
растениях снижается в солнечные дни, но при этом или отмечалась очень жаркая
погода, или опытные растения находились на прямом солнечном свету [317].
Для гороха показано увеличение содержания АК в ночное время [70].
Первые данные о накоплении АК на свету в нефотосинтезирующих органах
приведены М.Рэйд [375]. При искусственном культивировании на питательной
смеси отрезанных верхушечных долей корешков Calonyction aculeatum на свету
и в темноте спустя 4-8 недель было обнаружено, что содержание АК в темноте
не изменилось, а на свету возросло в 4-10 раз. Аналогичные данные приведены
А.М.Смирновым и К.Е.Овчаровым [148]. Однако авторы указывали на
замедление роста корней на свету, что могло привести к концентрированию АК
на единицу веса корня.
Позднее стали появляться работы, указывающие на возможное прямое
участие света в образовании АК. Так, А.А.Ничипорович [92] отмечал, что
наряду с углеводами прямыми продуктами фотосинтетической деятельности
растений могут быть аминокислоты, а также вещества высокой
физиологической активности типа витаминов и фитогормонов; что состав и
количественное соотношение первичных продуктов фотосинтеза сильно
меняются в зависимости от типа и физиологического состояния растений, от
минерального питания, от условий водного режима, от интенсивности и
спектрального
А.Мицуи, состава
Я.Ои [344],
света. изучая природу восстанавливающего вещества,
образующегося при освещении реакционной смеси, состоящей из суспензии
хлоропластов и цитоплазматической фракции листьев шпината, нашли, что весь
неизвестный фотопродукт или большая его часть является АК. Гомогенаты из
зеленых и этиолированных проростков ячменя в анаэробных условиях на свету
также накапливали восстанавливающие вещества [343]. Данный факт авторы
объяснили тем, что на свету происходит фотовосстановление предшественника
АК. Если вытяжки содержали не целые хлоропласты, а их фрагменты, то
фотовосстановительного образования АК не происходило.
Е.Ассолбергс [209] уточняет, что только некоторые ступени синтеза АК
являются светозависимыми. Данное заключение он делает на основании того,
что отрезанные листья яблони, выдержанные в атмосфере 14СО2, продолжали
включать радиоактивный углерод в молекулу АК, находясь в нормальной
атмосфере и в темноте, и на свету. Однако с увеличением интенсивности света
включение 14С в АК возрастало.
Увеличение содержания АК при освещении связывается многими
исследователями с процессом фотосинтеза. Так, Т.Н.Кузнецова-Зарудная [70]
показала, что при световом голодании взрослого растения происходит
прогрессивная потеря АК. При перенесении растения в нормальные условия
содержание АК вновь возрастает, но во время активной ассимиляции сильно
снижается. Отсюда автор делает вывод об участии АК в процессе фотосинтеза и
новообразовании ее в том же самом процессе. Предположение о существовании
прямой связи между содержанием АК и фотосинтезом высказал Т.Сугавара
[413]. Соответствие между количеством АК и площадью поверхности

42
изолированных листьев яблони, по мнению Е.Ассолбергса [209], указывает на
прямую зависимость содержания АК от интенсивности фотосинтеза.
Большинство авторов [77,138, 152] стимулирующее действие света
объясняют тем, что в процессе фотосинтеза создаются особые активные сахара,
из которых легко может синтезироваться АК. С.Д.Львов, Г.К.Гуцевич,
А.Пантелеев [77] писали, что связь процесса образования АК с фотосинтезом не
прямая, а косвенная, что в условиях оживленного фотосинтеза действительно
наблюдается накопление витамина С, поскольку в процессе фотосинтеза
создаются особые активные сахара, из которых легче может синтезироваться
молекула АК. При отсутствии фотосинтеза для образования АК из наличных
сахаров требуются более сложные условия для переработки их в
соответствующую форму, поэтому накопление АК идет здесь, если оно вообще
имеет место в таких условиях, гораздо более замедленным темпом и не
достигает того высокого уровня, как на свету. Подтверждением положения,
высказанного С.Д.Львовым с соавторами, может служить наблюдение того, что
суточные кривые накопления АК не совпадают с кривыми фотосинтеза, но
всегда максимальное накопление АК в растениях отмечается после наибольшего
подъема фотосинтеза. В корнях, где отсутствует фотосинтез и сахара вновь не
образуются, влияние света, по мнению К.Е.Овчарова [96], осуществляется через
активирование ферментов.
Связь АК с фотосинтезом В.Франке [244, 246] также считает косвенной, так
как синтез АК может идти в бесхлорофильных органах при наличии
ассимилятов. У 4-недельных альбиносных проростков конских бобов он
наблюдал значительное содержание АК - не меньшее, чем у одновозрастных
зеленых. По мнению Г.Менера и В.Франке [339], АК не относится к числу
прямых продуктов фотосинтеза, так как при усиленном фотосинтезе в
атмосфере, богатой углекислым газом, образование ее ослабевает.
Таким образом, имеющиеся в литературе данные не дают возможности
однозначно оценить роль света в биосинтезе АК. С одной стороны, известны
факты темнового образования АК в этиолированных проростках, корнях и
клубнях, с другой стороны, множество наблюдений говорит об увеличении ее
содержания на свету. В связи с этим возникает вопрос: ограничивается ли
действие света в процессе образования АК только тем, что на свету
увеличивается количество продуктов фотосинтеза - углеводов, необходимых
для биосинтеза АК в качестве субстрата, или свет непосредственно участвует в
процессе новообразования аскорбата?
Важную роль в процессе образования АК играет качественный состав света.
К 1939 году накопилось немало данных о действии света различного
спектрального состава на фотосинтез. Согласно этим данным, продуктивность
фотосинтеза в зеленых растениях в большинстве случаев уменьшалась с
уменьшением длины волны действующего света.
Т.Сугавара [414], признавая наличие прямой связи между фотосинтезом и
содержанием АК, попытался установить влияние качества света на биосинтез
АК. Им исследовалось действие красного (670 нм), оранжево-красного (645 нм),

43
зеленого (560-455 нм), синего (505-380 нм) и белого света на образование АК в
этиолированных проростках кукурузы, гороха, сои, китайской капусты, редиса,
ячменя и др. растений. Фильтры, необходимые для получения света различной
длины волны, изготавливали, покрывая стеклянные пластинки окрашенной
пленкой желатина. Используемый свет выравнивался не по общей энергии, а по
величине максимума пропускания. Учитывая эффективность действия на
образование АК, свет различных участков спектра можно было расположить в
следующем порядке: белый свет > красный ≥ оранжево-красный > зеленый >
синий. В опыте с редисом результаты не совпадали с основными наблюдениями:
процент АК был относительно высок в зеленой и синей частях спектра. Данный
факт автор объяснил тем, что на синем и зеленом свету проростки редиса росли
энергичнее.
Б.И.Щербаков [187], исследуя проростки пшеницы, нашел, что среди
отдельных лучей солнечного спектра наиболее активная роль в стимуляции
образования АК принадлежит красному свету (680-620 нм и на линии 344,061
нм). Действие сине-фиолетовых лучей в комплексе с голубыми и зелеными было
слабее. Наиболее активным для синтеза АК автор считает свет тех участков
спектра, которые активны в отношении фотосинтеза. Однако в опытах с
листьями традесканции И.Руге [379] отметил, что содержание АК в листьях при
освещении светом с длиной волны 650 нм и выше было больше, чем в
неосвещенных листьях, а свет с длиной волны меньше 480 нм тормозил синтез
АК, так что наиболее активные для фотосинтеза области спектра - 440 и 630 нм -
не совпадали с точками наибольшей стимуляции синтеза АК.
Имеются примеры положительного влияния зеленого света на биосинтез АК
в растениях [95, 98, 187], что также нельзя связать с процессом фотосинтеза.
Результаты исследования действия синего света на биосинтез АК крайне
противоречивы. К.Е.Овчаров [95], выращивая проростки хлопчатника под
люминесцентными лампами различного спектрального состава, нашел, это
синий свет задерживал образование в них АК. По данным И.А.Чернавиной [167],
синий свет, напротив, повышал в листьях яровой и озимой пшеницы содержание
восстановленной и окисленной форм АК. Только на синем свету (380-440 нм)
отмечено увеличение общего количества АК у эвглены, тогда как зеленый и
красный свет не проявили активности [404]. К.Богдански, Н.Богданска [220]
исследовали накопление АК в плодах яблонь, завязи которых прикрывали
цветными пленками из полиэтилена. Определение содержания АК через 6
недель показало, что количество ее в плодах, затененных синей пленкой, было
выше, чем в плодах под желтой и особенно под красной пленкой.
Эффективность сине-зеленого света для образования АК в проростках фасоли
отмечали
В большинстве
Нива и Катаяма
работ,[351].
анализирующих влияние качества света на биосинтез
АК, отмечается бóльшая эффективность белого (полихроматического) света по
сравнению с монохроматическим [98,108, 187, 194, 220, 414]. Обзор
литературных данных о действии света различного спектрального состава на

44
биосинтез АК показывает, что имеется незначительное число работ,
освещающих эту тему. К тому же представленные данные, особенно по
действию синего света, неоднозначны. Это может быть следствием того, что в
работах использовались различные источники света, различные виды растений.
Исследованиями же Т.А.Парибок [111] показано, что реакция растений на
освещение светом различного спектрального состава имеет видовую
специфичность. Так, для томатов и сельдерея наиболее активным в образовании
АК был свет розовых люминесцентных ламп, а для гороха - синих ламп.
Кроме этого специфичность действия лучей различных областей ФАР на
биосинтез АК зависит от мощности лучистого потока. У пшеницы и редиса при
низкой интенсивности света (50 Вт/м2) максимальное количество АК
накапливалось на красном свету, а с повышением интенсивности света до 100
Вт/м2 и выше - на синем свету [48]. В большинстве работ для освещения
растений использовался свет широких участков спектра, данные по действию на
биосинтез АК света спектральных линий практически отсутствуют.
При изучении действия света на биосинтез АК в растениях нами было
показано, что свет является одним из важнейших факторов в этом процессе
[173]. Стимуляция светом накопления АК в зеленых проростках ячменя
проявлялась уже при интенсивности света, равной около 100 эрг⋅см-2⋅с-1 [98], и
во многом зависела от первоначального содержания АК в проростках. Поэтому
предварительное выдерживание растений в темноте, снижающее общее
количество АК, способствовало большему накоплению ее на свету (табл. 8). На
основании этого в наших исследованиях проростки перед опытами около 40
часов выдерживались в темноте для снижения в них уровня АК, что в
дальнейшем способствовало повышению отзывчивости проростков на
освещение.
По имеющимся представлениям, биосинтез АК в растениях усиливается при
дополнительном снабжении их гексозами, однако роль света в этом процессе не
выяснена. Как показали наши исследования, положительное действие углеводов
на биосинтез АК в зеленых листьях ячменя проявлялось только на свету (рис.8).
В освещенных проростках, находившихся в течение 10 часов на растворе
глюкозы, значительно увеличилось содержание АК. За это же время в листьях
ячменя, плавающих на растворе глюкозы в темноте, количество АК не
повысилось, хотя следовало бы ожидать увеличения содержания АК от
дополнительно поступившей в лист глюкозы, если бы биосинтез АК был только
темновым процессом. За 6-7 часов пребывания листьев на растворе глюкозы-1,6-
14
С в темноте в них входит глюкоза: по нашим данным, активность 0,1 мл сока,
выделенного из освещенных листьев, составила 2504 имп/мин, а из темновых
листьев - 778 имп/мин. К тому же за это время в листьях, плавающих на 1%-ном
растворе глюкозы, происходит увеличение редуцирующих углеводов на 20%
[100]. Следовательно, хотя в лист в темноте входит значительное количество
глюкозы, увеличения содержания АК не наблюдается. Только при очень
длительном выдерживании растений, дополнительно снабженных углеводами, в

45
темноте (от 64 часов до 4 суток) на сильно концентрированных растворах (10-
20%-ная сахароза) отмечается некоторое увеличение содержания АК [193, 374],
что подтверждается и нашими данными [98]. Однако необходимо иметь в виду,
что при столь длительном пребывании зеленых растений в темноте в них могли
произойти глубокие изменения в обмене веществ.

- темнота;
- свет

Рис. 8. Влияние света на биосинтез АК в растущих проростках ячменя (а)

и проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы (б).
Интенсивность света 25 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, экспозиция 10 часов

Таблица 8
Влияние предварительного затемнения на содержание АК в 8-дневных
проростках овса, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы в темноте
и на белом свету (интенсивность света 25 эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 8 часов)
Условия выращивания Условия Содержание АК
проростков до опыта опыта мкг/г %
Нормальная смена дня и ночи Исходное содержание 537,6±4,8 100
В темноте 541,6±8,9 101
На свету 621,2±13,1 116
40 часов в темноте Исходное содержание 468,4±3,5 100
В темноте 474,4±1,5 101
На свету 600,8±3,0 128
69 часов в темноте Исходное содержание 386,8±0,3 100

46
 В темноте 431,6±2,0 112
На свету 516,2±9,6 133

Приведенные данные позволяют заключить, что свет имеет значение не

только для фотосинтетического процесса, дающего исходный материал для
биосинтеза АК, но и играет определенную роль в преобразовании углеводов в
молекулу АК. Можно предположить, что в зеленых листьях ячменя в процессе
биосинтеза АК наряду с темновыми реакциями имеют место фотохимические.
Одним из доказательств наличия фотохимической реакции является
постоянство продукта реакции в том случае, если не изменяется произведение
интенсивности действующего света на время его действия [156]. Из
приведенных данных (табл.9) видно, что количество синтезированной АК
всегда оставалось постоянным, если произведение интенсивности света на
время действия не менялось и равнялось 90 (10 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 × 9 часов; 15
тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 × 6 часов; 30 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 × 3 часа). Следовательно,
результаты этого опыта подтверждают выдвинутое нами предположение о
возможности существования в биосинтезе АК фотохимических реакций. При
биосинтезе АК в растениях фотохимическая реакция или реакции, вероятно,
чередуются с биохимическими, так как при понижении температуры до минус
1°С наблюдалось замедление образования АК в проростках, плавающих на 1%-
номУвеличение содержания
растворе глюкозы на свету.
АК в растениях на свету многие исследователи
связывают с процессом фотосинтеза [42, 70, 209], в результате которого
образуются углеводы, необходимые для темнового синтеза АК. В этом случае
спектры действия биосинтеза АК и фотосинтеза должны совпадать. Нами
исследовалось действие света различного спектрального состава на биосинтез
АК в зеленых и этиолированных проростках ячменя. Монохроматический свет
получали с помощью цветных стеклянных светофильтров с известными
характеристиками. В качестве источника света использовались лампы
накаливания и люминесцентные лампы БС-30. В табл. 10 приведены результаты
действия света той максимальной интенсивности, которую удалось получить от
указанных источников света.
Экспериментальные данные показывают, что содержание АК значительно
увеличилось только на свету красного участка спектра 620-740 нм, активного
для фотосинтеза. Некоторое накопление АК отмечено на зеленом свету 480-560
нм, тогда как активные для фотосинтеза синий 430-520 нм и фиолетовый 370-
460 нм участки спектра [11, 128] не оказали положительного действия на
биосинтез АК.
Таблица 9
Влияние света различной интенсивности и времени освещения (при постоянстве
их произведения) на биосинтез АК в 6-дневных зелёных проростках ячменя
Условия Интенсивность Время Произведение времени Содержание АК
опыта света в тыс. освещения освещения на мкг/г %
эрг⋅см-2⋅с-1 в часах интенсивность света

47
В темноте - - - 65,9±1,3 100
На свету 10 9 90 126,8±8,6 192
На свету 15 6 90 134,0±1,3 203
На свету 30 3 90 138,0±8,9 209

Таблица 10
Влияние света различного спектрального состава на биосинтез АК
в зеленых и этиолированных проростках ячменя (экспозицая 10 ч)

№ Условия Интенсивность Содержание АК в проростках

опы- опыта света, тыс. зеленых этиолированных
та эрг⋅см-2⋅с-1 мкг/г % мкг/г %
1 В темноте - 71,8±1,1 100 89,8±2,7 100
На УФ свету 320-400 нм 1,6 72,6±1,6 101 114,2±2,6 127
На белом свету 16,0 156,2±3,8 218 178,0±1,5 198
2 В темноте - 155,7±12,7 100 151,6±1,8 100
На фиолетовом свету
370-460 нм 1,3 164,4±0,9 106 183,2±9,2 121
3 В темноте - 188,8±10,2 100 236,6±3,9 100
На синем свету
430-520 нм 6,5 193,4±2,4 102 280,3±4,9 118
4 В темноте - 86,0±0,1 100 184,8±2,8 100
На зеленом свету
480-560 нм 4,4 98,8±0,8 115 230,2±4,2 125
5 В темноте - 143,6±3,2 100 - -
На красном свету
620-740 нм 5,0 187,2±7,8 130 - -
- // - 50,0 208,4±1,2 145 - -
6 В темноте - 210,4±17,9 100 334,2±1,4 100
На красном свету
600-1100 нм 26,0 217,2±9,0 103 362,8±5,5 109
7 В темноте - 81,0±1,0 100 - -
На красном свету
690-1100 нм 32,0 100,3±0,1 124 - -
На красном свету
720-1100 нм 32,0 114,4±5,6 141 - -
8 В темноте - 210,4±17,9 100 128,4±0,6 100
На инфракрасном свету
880-3000 нм 75,0 195,2±12,0 93 160,0±0,4 125

Красный свет с ближним инфракрасным 600-1100 нм, включающий

активную для фотосинтеза область спектра, также оказался неэффективным для
биосинтеза АК, что, возможно, объясняется добавлением к красному свету
инфракрасной радиации. В то же время положительно действовал на биосинтез

48
АК длинноволновый красный свет с ближним инфракрасным 690-1100 и 720-
1100 нм, который малоактивен для фотосинтеза. Таким образом, спектры
действия фотосинтеза и биосинтеза АК в отдельных областях не совпадают. Это
дает основание предположить, что биосинтез АК в зеленых проростках ячменя
прямо не связан с фотосинтезом.
Этиолированные проростки ячменя, несмотря на не полностью
синтезированный за 10 часов опыта пигментный аппарат, отличались большей
чувствительностью к освещению, чем зеленые. Так, содержание АК в них
увеличилось на синем 430-520 нм, фиолетовом 370-460 нм, ультрафиолетовом
320-400 нм и инфракрасном 880-3000 нм свету, т.е. в тех участках спектра,
которые не стимулировали биосинтез АК в зеленых проростках.
На зеленом свету 480-560 нм АК накапливалась как в зеленых, так и в
этиолированных проростках, однако в последних более интенсивно, что тоже
говорит о большой чувствительности к освещению этиолянтов.
Для этиолированных проростков ячменя, так же, как и для зеленых,
неактивным оказался красный свет с ближним инфракрасным 600-1100 нм
интенсивностью 26 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. Увеличение содержания АК в
этиолированных проростках на УФ и инфракрасном свету - неактивных для
фотосинтеза участках спектра - подтверждает высказанное ранее предположение
о том, что биосинтез АК в растениях прямо не связан о фотосинтезом, а
протекает при участии специфических фотобиохимических реакций. Об этом же
говорят и данные опытов с использованием экзогенной глюкозы-14С [171].
Вывод об отсутствии прямой связи между фотосинтезом и биосинтезом АК
находит подтверждение в исследовании роли зеленых пигментов в накоплении
АК. При решении этого вопроса мы исходили из следующего положения: если
существует прямая зависимость между биосинтезом аскорбиновой кислоты и
наличием хлорофилла, то освещение проростков светом с длиной волны,
соответствующей пикам поглощения хлорофилла А и В в листе [123] как в
красной, так и в сине-фиолетовой области, способствовало бы накоплению
аскорбиновой кислоты. Этим самым была сделана попытка выяснить спектр
действия биосинтеза аскорбиновой кислоты.
В результате исследований [104,109] было выяснено, что свет с длиной
волны 370-460 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в
фиолетовой области, и 440-520 нм, включающей пик поглощения хлорофилла В
в синей области, не оказал влияния на биосинтез аскорбиновой кислоты в
проростках ячменя при интенсивности 6 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1. Красный свет 670-740
нм, соответствующий пику поглощения хлорофилла А, оказывал положительное
действие на биосинтез АК лишь при высокой интенсивности, равной 12 тыс.
эрг⋅см-2⋅с-1.
При добавлении к свету данного участка спектра более коротковолнового
красного света, включающего пик поглощения хлорофилла В в красной области,
накапливалось значительное количество АК уже при интенсивности света
500 эрг⋅см-2⋅с-1.
49
 Одновременное освещение проростков светом, соответствующим пикам
поглощения хлорофилла А в фиолетовой и красной областях, практически не
изменило содержания АК (табл. 11), хотя, как известно, хлорофилл А является
основным пигментом фотосинтеза. Следовательно, спектры действия
фотосинтеза и биосинтеза АК в области поглощения хлорофилла А не
совпадают. Таблица 11
Влияние света с длиной волны, включающей пики поглощения
хлорофилла А и В в красной и сине-фиолетовой областях, на биосинтез
аскорбиновой кислоты в проростках ячмени (экспозиция 10 ч)
Интенсивность Содержание
Условия опыта света в тыс. восстановленной
АК
-2 -1
эрг⋅см ⋅с - в мкг/г в%
В темноте - 147,8 100
На свету с длиной волны:
370-460 нм, соответствующей пику поглощения
хлорофилла А в фиолетовой области; 0,7
670-740 нм, соответствующей пику поглощения
хлорофилла А в красной области 5,0 159,6 108
На свету с длиной волны:
440-520 нм, соответствующей пику поглощения
хлорофилла В в синей области; 0,7
635-780 нм, соответствующем пикам
поглощения хлорофилла А и В в красной области 5,0 184,4 125
На свету лампы накаливания 5,7 180,6 122

К сожалению, с помощью стеклянных светофильтров точно выделить свет,

включающий пик поглощения хлорофилла В в красной области, нам не удалось,
поэтому исследовали свет, включающий пики поглощения хлорофилла В в
синей в хлорофиллов А и В в красной областях. Этот свет оказался активным
для биосинтеза АК и по своему действию был идентичен действию света лампы
накаливания равной интенсивности. Физиологическая роль хлорофилла В в
растениях еще не достаточно ясна. Возможно, что он, поглощая свет
соответствующей части красной области спектра, участвует и в
фотобиохимическом синтезе АК. В то же время не исключено, что активность
света 635-780 нм объясняется добавлением к неактивному участку спектра 670-
740 нм, соответствующему пику поглощения хлорофилла А в красной области,
более коротко- и длинноволновой радиации, т.е. расширением спектра
действующего
Во всех наших
света.
опытах белый свет (полихроматический) был эффективнее в
биосинтезе АК, чем монохроматический. При сочетании света нескольких
участков видимой области спектра также синтезировалось больше АК, чем при
действии света одного участка спектра; в иных случаях активным оказался свет,
полученный при смешении неактивных для биосинтеза АК областей спектра.

50
Так, под действием синего света 430-520 нм интенсивностью 25 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1
содержание АК в зеленых проростках не изменилось (рис. 9). Неэффективным
оказался и фиолетовый свет 370-460 нм интенсивностью 6 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, тогда
как сине-фиолетовый свет 370-500 нм уже при интенсивности, равной 3 тыс.
эрг⋅см-2⋅с-1, положительно влиял на накопление АК. Данный эффект, вероятно,
не является точной копией эффекта Эмерсона, наблюдаемого в фотосинтезе и
заключающегося в усилении активности действующего света при
дополнительном освещении светом другой длины волны. В наших опытах
активным для биосинтеза АК оказался свет, полученный при сочетании двух
неактивных участков спектра. В связи с этим и активность белого света в
биосинтезе АК, по-видимому, нельзя рассматривать только как простое
складывание активных для биосинтеза АК участков спектра.

Рис. 9. Процент увеличения биосинтеза АК на синем свету 430-520 нм интенсивностью

25 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 (1), фиолетовом 370-460 нм интенсивностью 6 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 (2)
и сине-феолетовом 370-500 нм интенсивностью 3 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 (3)
по отношению к контролю (темнота). Экспозиция 10 часов

Обзор литературных данных по действию света различного качественного

состава на биосинтез АК показывает, что изучается в основном действие света
широких участков спектра и остается невыясненной роль света чистых
спектральных линий. Нами [107] исследовался свет синей спектральной линии
436 нм, выделенной из излучения ртутно-кварцевой лампы ПРК-7, при
использовании светофильтров СС5, С3С18, ЖС11, а также свет зеленой линии
546 нм (светофильтры ЖС17, С3С10, ПС7) и желтой - 577 нм (светофильтры
С3С10; ОС13; 3С7). Инфракрасная радиация устранялась водным экраном.
Действие света спектральных линий сравнивалось с действием света
соответствующих участков спектра равной интенсивности (6,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1,
рис. 10). Неэффективным для биосинтеза АК оказался свет синей спектральной
линии и синего участка спектра (430-520 нм). Свет зеленой спектральной линии

51
не изменил содержания аскорбиновой кислоты ни при интенсивности света,
равной 6,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, ни при 13 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, тогда как свет зеленого
участка спектра (480-600 нм), как всегда, проявил большую активность. Из трех
исследованных спектральных линий только свет желтой линии оказал
положительное действие на образование аскорбиновой кислоты. Однако свет
желто-оранжевого участка спектра оказался более благоприятным для
биосинтеза АК, чем свет желтой спектральной линии. Следовательно, в
биосинтезе АК свет широких участков спектра используется лучше, чем свет
соответствующих спектральных линий при равных интенсивностях.

Рис. 10. Биосинтез АК проростками ячменя:

А - в темноте; Б - на синем свету 430-520 нм; В - на свету синей спектральной линии
436 нм; Г - на белом свету; Д - на зеленом свету 480-600 нм, с резким уменьшением
интенсивности в желтой части спектра; Е - на свету зеленой спектральной линии
436 нм; Ж - на желто-оранжевом свету 550-780 нм со значительным уменьшением
интенсивности в красной части спектра; З - на свету желтой линии 577 нм.
Экспозиция 6 часов. Интенсивность света 6,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1

Известно, что энергия кванта света коротковолновой области спектра

превосходит таковую в более длинноволновой области. Поэтому при сравнении
действия света различных участков спектра друг с другом необходимо
выравнивать их по квантам. Это было учтено в следующей серии опытов, где
исследовалось действие красного 652 и 645 нм, желтого 587 нм и зеленого света
553 нм интенсивностью 1,44⋅1015 квантов⋅см-2⋅с-1 на биосинтез АК в 9-10-
дневных проростках озимого ячменя сорта Паллидум 330/2.
Монохроматический свет был выделен с помощью интерференционных
светофильтров от кинопроекционной лампы, мощностью 400 Вт, являющейся
точечным источником света. С помощью специальной установки на

52
интерференционный светофильтр проектировали параллельный пучок света, что
давало возможность выделить монохроматический свет с шириной в максимуме
пропускания 9-12 нм.
Приведенные данные (табл. 12) подтвердили сделанный ранее вывод о
высокой активности в биосинтезе АК красного света, соответствующего пику
поглощения хлорофилла В в красной области спектра (645 нм), а также зеленого
света с длиной волны в максимуме пропускания светофильтра 553 нм. Однако
наибольшую активность в биосинтезе АК проявил желтый свет - 587 нм, на
котором уровень АК увеличился на 160% по сравнению с темновым контролем.
Сказанное дает основание заключить, что акцепторами света в процессе
светозависимого накопления АК могут быть соединения, поглощающие свет в
коротковолновой красной области спектра и в желто-зеленой области.
Таблица 12
Влияние зеленого, желтого и красного света интенсивностью
1,44⋅1015 квантов⋅см-2⋅с-1 на биосинтез АК в 9-10-дневных
проростках озимого ячменя (экспозиция 8 ч)
№ Вариант Содержание АК
опыта опыта мкг/г %
1 В темноте 58±1,5 100
На зеленом свету 553 нм 110±4,0 190
2 В темноте 30±2,0 100
На желтом свету 587 нм 78±2,0 260
3 В темноте 36±0,5 100
На красном свету 645 нм 76±3,5 211
4 В темноте 22±0,5 100
На красном свету 652 нм 33±1,0 150

Продукты фотосинтеза во многом определяются качеством действующего

света: работами Н.П.Воскресенской [18, 19] и других [280, 215] показано слабое
образование углеводов на синем свету, поэтому можно предположить, что
неэффективность синего света (430-520 нм) в процессе образования АК
объясняется недостаточной обеспеченностью данного процесса углеводами.
Однако в серии опытов, проведенных с зелеными проростками ячменя,
плавающими на 0,5%-ном растворе глюкозы, где не было недостатка в
исходном материале, также наблюдалась слабая активность синего света по
сравнению с красным (620-740 нм) и зеленым (480-600 нм) светом (рис. 11)
[102].
На синем свету в проростках, получивших экзогенную глюкозу, накопление
АК отмечалось лишь при высокой интенсивности синего света, равной 20 тыс.
эрг⋅см-2⋅с-1, тогда как на белом свету в проростках даже без дополнительного
снабжения углеводами биосинтез АК шел уже при интенсивности света, равной
около 100 эрг⋅см-2⋅с-1, на зеленом свету - при интенсивности света, равной 4,4
тыс. эрг⋅см-2⋅с-1, а на коротковолновом красном - при 2,3 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1.
Следовательно, активный для фотосинтеза синий участок спектра (430-520 нм)

53
проявляет некоторую активность в биосинтезе аскорбиновой кислоты лишь при
высоких интенсивностях света и при дополнительном снабжении углеводами.
Вероятно, спектры действия фотосинтеза и биосинтеза аскорбиновой кислоты в
отдельных областях не совпадают, а свет оказывает специфическое действие на
биосинтез АК помимо фотосинтетического процесса. Аналогичный вывод
делает И.Руге [379]. Однако в литературе имеется ряд указаний о
положительном действий синего света на биосинтез АК: Нива, Катаяма [351],
И.А. Чернавина [167], К. Богдански, Н. Богданска [220]. Но так как большинство
авторов для выделения синего света использовало цветные пленки, то, скорее
всего, они имели дело не с чисто выделенным синим участком спектра, а с
комплексным светом, который используется в биосинтезе АК лучше, чем свет
монохроматический [186].

- ДАК
- АК

Рис. 11. Биосинтез АК и ДАК листьями ячменя, находящимися на 0,5%-ном

растворе глюкозы в темноте (а), на синем 430-520 нм (б), зеленом 480-600 нм (в),
красном 620-740 нм (г) и белом свету (д) интенсивностью 20 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 8 часов

Обобщая вышеизложенное, можно заключить, что свет играет важную роль

в биосинтезе АК, причем большое значение в этом процессе имеет качественный

54
состав света. Действие света на биосинтез АК не только осуществляется через
фотосинтез, дающий субстрат для аскорбата, но и носит специфический
характер, что дает основание рассматривать в целом образование АК как
фотохимический процесс; хотя, скорее всего, лишь некоторые реакции (или
реакция) на пути от углеводов к АК являются фотохимическими. Таким может
быть последний этап в образовании АК из предшественника [343].

4.2. Биосинтез аскорбиновой кислоты проростками

с измененным соотношением зеленых и желтых пигментов

При прорастании семян даже в темноте в проростках образуется АК.

Содержание ее в первые дни увеличивается до определенного предела, затем
понижается, что связывается с исчезновением субстратных ресурсов семени
[374,379]. Для новообразования же АК необходим свет. При перенесении на
свет этиолированных проростков наряду с накоплением АК происходит их
зеленение, поэтому естественным было связывать новообразование АК с
накоплением пигментов.
Работами многих авторов показано, что хлорофиллоносные ткани растений
наиболее богаты АК [39, 52, 142]. Подтверждением этого положения могут
служить исследования Т.Сугавары [414], в которых 5-дневные этиолированные
проростки редиса, кукурузы и китайской капусты при прозеленениии на свету
высокой интенсивности внешне были тёмно-зелёными и содержали больше АК,
чем желто-зеленые проростки, находящиеся на свету низкой интенсивности. В
других опытах освещение 5-дневных проростков кукурузы, содержащих
хлорофилл, приводило к накоплению в них АК, в то время как альбиносные
проростки при освещении не меняли уровня АК. Увеличивающийся синтез АК
на свету, по мнению автора, был, несомненно, прямо или косвенно обусловлен
влиянием света на деятельность хлоропластов.
Как считает Ф.Я.Механик [83], прямая зависимость между содержанием АК
и хлорофилла имеет место лишь в определенных пределах уровней этих
показателей. Количество АК растет параллельно с увеличением содержания
хлорофилла лишь до 85% от его содержания в нормальных листьях. У зеленых
овощей, по данным А.Акао [197], отношение содержания хлорофилла к АК
составляет 0,81, а в семядолях японской редьки при 48-часовом освещении
между содержанием хлорофилла и АК отмечалась линейная зависимость при
коэффициенте корреляции 0,96 [284].
Детальные исследования динамики зеленения этиолированных проростков
подсолнечника, кукурузы, репы, конских бобов и овса [415] показали, что через
30-60 минут после начала освещения в проростках появляется хлорофилл А и
начинается фотосинтез. Только после этого отмечается новообразование АК.
Хлорофилл В появляется через 2-3 часа после хлорофилла А, отсюда следует,
что присутствие хлорофилла В не обязательно для начала образования АК. В то
же время И.Руге [379] считал, что природа листовых пигментов,

55
обусловливающих синтез АК, еще не ясна и что они не идентичны ни
хлорофиллу, ни каротину. М.Мириманов [342] предполагал наличие в
клеточном соке связи АК с флавонолами.
Однако, хотя большее количество АК обычно находится в
хлорофиллоносных тканях, ряд авторов [233 363, 374, 415] указывает на
отсутствие параллелизма в образовании АК и хлорофилла. М.Рэйд [374]
отмечала, что листья могут иметь очень мало хлорофилла, но содержать много
АК или иметь очень много хлорофилла, но сравнительно мало АК. В работе
К.Г.Врублевской [22] показано, что в отдельные фазы онтогенеза конских бобов
значительное количество АК находится в корнях, куда она может
транспортироваться из листьев [169]. Независимость образования АК от
содержания хлорофилла А.М.Смирнов и К.Е.Овчаров [148] подтверждают
опытами с изолированными корнями ряда растений, в которых на свету
отмечалось увеличение содержания АК. Корни более 25 месяцев росли без
надземных органов, поэтому, как считают авторы, нет оснований считать, что в
синтезе
Вопрос
АК принимал
о взаимоотношении АК и желтых пигментов изучен крайне
участие хлорофилл.
недостаточно. В.А.Бунаков и др. [10, 363], исследуя плоды томата, моркови,
шиповника, отмечают отсутствие определенного соотношения между
содержанием АК и каротина. Некоторые авторы считают, что существует
антогонизм между процессами образования каротина и АК. В.С.Фёдорова [160],
напротив, наблюдала одновременное накопление АК и каротина у лиственницы,
кедра и кипрея с поднятием их в горы до верхних границ массового
распространения
Такие противоречивые
видов. сведения дают основание сказать, что
функциональные связи между хлорофиллоносностью клеток и синтезом в них
АК остаются пока неясными [247]. То же самое с еще большим правом, можно
сказать о взаимосвязи биосинтеза АК и желтых пигментов.
В работе М.М.Окунцова и др. [109] было показано, что, создавая различные
условия освещения для этиолированных проростков, можно получить растения с
определенным соотношением зеленых и желтых пигментов и что особенно
большим различием в содержании зеленых пигментов отличаются проростки,
выращенные на синем и зеленом свету. В своих исследованиях мы использовали
это свойство проростков для получения растений, отличающихся по
содержанию пигментов, с тем чтобы на этих объектах выяснить зависимость
образования АК от количественного содержания пигментов (хлорофилла А,
хлорофилла В, каротина, лютеина, виолаксантина). В результате проведенных
опытов не обнаружено количественной зависимости в содержании АК и
пигментов, а в некоторых случаях растения, содержащие больше зеленых и
желтых пигментов, отличались даже более низким уровнем АК (табл.13).
Возможно, здесь имеет место такое же явление, как в случае фотосинтеза и
хлорофилла, где также не наблюдается количественной зависимости
интенсивности фотосинтеза от содержания зеленых пигментов, хотя роль
хлорофилла в фотосинтезе общеизвестна.

56
 4.3. Исследование способности альбиносных проростков
накапливать аскорбиновую кислоту на свету

Освещенные части растений обычно содержат больше АК, однако при

исследовании действия света на ее биосинтез рядом исследователей
высказывалось предположение, что этот процесс прямо не связан с
фотосинтезом [244, 246, 339]. Подтверждением такого мнения могут служить
данные о несовпадении в некоторых областях спектров действия биосинтеза АК
и фотосинтеза [101, 103]. Неясными пока остаются функциональные связи
между хлорофиллоносностью клеток и синтезом в них АК [24, 109].

57
 Таблица 13

Влияние белого света на образование аскорбиновой кислоты и пигментов в проростках ячменя,

выращенных на синем (430-520 нм) и красном свету (620-1100 нм) интенсивностью 9 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1
Содержание пигментов в γ на 1 г Содержание АК
Условия выращивания проростков хлорофилл каро- люте- виолак- в мг % в%
А В тин ин сантин
1, 2 день - в темноте 0,00 0,00 6,70 23,91 17,84 13,42 100
3, 4, 5 день:
в темноте
по 8 часов на синем свету ежедневно
по 8 часов на красном свету ежедневно 192,83 47,85 14,97 31,44 23,11 107,2±1,3 154
6 день:
в темноте
8 часов на белом свету интенсивностью 5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1 725,58 245,01 36,86 48,26 35,75 184,0±2,2 137
179,2±4,4 134
После освещения 15 часов в темноте 846,26 285,41 43,60 50,03 36,40

58
 При исследовании этих вопросов наиболее перспективными могут быть
работы с беспигментными мутантами или с растениями, имеющими измененный
пигментный состав, которые можно получить при обработке растений
некоторыми антибиотиками: хлорамфениколом или СМ. Исследование
механизма действия СМ на прокариотные организмы показало его
ингибирующее влияние на функцию рибосом. СМ связывается с 70S-
рибосомами [31, 261], в результате чего появляются ошибки при считывании
информации с природной матрицы [420]. Наличие 70S-рибосом и у высших
растений объясняет факт подавления в присутствии СМ синтеза хлорофилла,
РНК, развития структуры хлоропластов [222], уменьшение скорости включения
аминокислот
Угнетениев биосинтеза
белки пластид
хлорофилла
[228]. и развития хлоропластов под действием
СМ отмечено у этиолированных проростков томатов, турнепса, капусты,
горчицы [319, 320, 321]. Другим исследователям, используя обработку растений
СМ, удалось получить альбиносные особи эвглены [366] и альбиносные
растения пшеницы [6]. По данным Р.С.Бабаяна и др. [6], СМ в концентрации
150-200 мкг/мл вызывает появление альбиносных проростков у пшеницы,
однако эффективные для пшеницы дозы СМ не оказывали существенного
действия на семена ячменя, поэтому в начале своей работы мы определили
концентрации СМ, вызывающие альбинизм у ячменя. Эти концентрации
примерно в десять раз превосходили активные для пшеницы дозы и равнялись 1-
2,5 мг/мл. Такое большое колебание величины концентрации действия,
вероятно, объясняется тем, что 30S-субъединицы рибосом в зависимости от
температуры могут присоединять одну или две молекулы СМ [31].

Проростки ячменя, выросшие из семян, обработанных стрептомицином

(справа - контроль). Фото Я.Д. Кесельман

59
 Для получения альбиносных проростков семена ячменя, помещенные в
чашки Петри или плоские кюветы, смачивались раствором СМ [181]. Чаще всего
использовалась концентрация 2,5 мг/мл. Через сутки обработка семян раствором
повторялась; через двое-трое суток проклюнувшиеся семена высаживались в
почву. Первый лист проростков, полученных из обработанных СМ семян, на две
трети был альбиносным, верхушка оставалась пигментированной (см. фото на
с. 57). Зона раздела имела желто-зеленую окраску. В опытах использовались
вырезки из альбиносных участков мутантных листьев. В них определено
содержание пигментов по Нибому [75]. Действие света (люминесцентные лампы
ЛЦЦ-40) на содержание хлорофилла и каротиноидов представлено в таблице 14.
Кроме альбиносного материала исследовались зеленые и этиолированные
проростки.
В зеленых листьях ячменя, плавающих на растворе СМ, при освещении
происходит уменьшение количества хлорофиллов и суммы каротиноидов по
сравнению с контрольным вариантом - листьями, плавающими на воде.
Таблица 14
Биосинтез пигментов (мкг/г) листьями ячменя в присутствии СМ на свету
(интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 24 ч)
Вариант опыта Хлорофилл А Хлорофилл В Каротиноиды
3еленые листья
Исходное содержание 360,2±3,0 295,4±13,0 156,3±9,2
На воде 442,7±20,8 305,9±7,9 212,4±7,4
На воде + СМ 314,2±10,9 233,8±7,1 158,5±5,1
Этиолированные
Исходное содержание 0 0 16,0±0,1
На воде 147,8±2,9 113,2±7,6 94,3±6,5
На воде + СМ 42,0±1,8 41,2±10,4 37,4±1,0
Световые альбиносы
Исходное содержание 0 0 4,1±0,1
На воде 0 0 4,8±0,4
На воде + СМ 0 0 3,2±0,1
Темновые альбиносы
Исходное содержание 0,2±0,3 0,3±0,66 5,0±0,2
На воде 0,9±0,03 1,7±0,1 8,4±0,6
На воде + СМ 0 0 5,5±0,5

В этиолированных проростках в присутствии СМ за 24 часа освещения

синтезируется некоторое количество хлорофилла А, В и каротиноидов, однако в
контроле синтез указанных пигментов был в три раза выше. Можно
предположить, что ингибирование биосинтеза зеленых пигментов СМ не
затрагивает процесс перехода протохлорофиллида в хлорофилл и
синтезированные в этиолированных проростках предшественники хлорофилла
на свету переходят в хлорофилл даже в присутствии СМ; новообразование

60
предшественников хлорофилла, вероятно, ингибируется антибиотиком, что и
ведет к меньшему накоплению зеленых пигментов в варианте с СМ.
Вырезки из альбиносных частей листьев ячменя, выращенных на свету (в
таблице - световые альбиносы) и в темноте (темновые альбиносы), или не имели
зеленых пигментов, или содержали их в небольшом количестве, которое
убиралось дальнейшим освещением в присутствии СМ.
Таким образом, используя обработку семян СМ, удалось получить
растительный материал, практически лишенный зеленых пигментов и
содержащий незначительное количество каротиноидов. Распределение АК, ДАК
и ДКГК по зонам в зеленых и мутантных листьях демонстрирует рис. 12, из
которого видно, что по содержанию восстановленной формы АК опытные и
контрольные зеленые растения отличались незначительно, в то время как
окисленная форма АК и ДКГК преобладали в верхней зеленой и нижней
альбиносной части мутантных растений.

- листья с альбиносным основанием

- зеленые листья

Рис. 12. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней части (1) и основаниях (2)
зеленых и частично альбиносных листьев ячменя

61
 В дальнейшем исследовалась способность альбиносных листьев
синтезировать АК, ДАК и ДКГК. Поскольку используемый материал не
содержал зеленых пигментов и фотосинтез в нем был блокирован, субстрат для
биосинтеза АК вводился экзогенно: вырезки из листьев помещались на 1%-ный
раствор глюкозы. В связи с этим была проверена способность синтезировать
хлорофилл А, В и каротиноиды вырезками из листьев ячменя, плавающими на
1%-ном растворе глюкозы (табл. 15). Ингибирующий эффект СМ сохранялся и в
этих условиях, а вырезки из листьев темновых и световых альбиносов
содержали следовые количества зеленых пигментов и через 24 часа освещения,
если они находились на растворе глюкозы с СМ.
Таблица 15
Биосинтез пигментов (мкг/г) вырезками из листьев ячменя,
плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ на свету
(интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 24 ч)
Вариант опыта Хлорофилл А Хлорофилл В Каротиноиды
Зеленые листья
Исходное содержание 429,1 ± 7,6 336,1 ± 24,1 184,2 ± 17,3
На глюкозе 496,0 ± 20,0 364,0 ± 9,5 211,7 ± 8,8
На глюкозе + СМ 432,7 ± 10,8 356,5 ± 4,5 191,7 ± 6,1
Этиолированные
Исходное содержание 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,1 1,5 ± 0,1
На глюкозе 135,7 ± 13,0 141,6 ± 3,0 70,3 ± 3,0
На глюкозе + СМ 25,6 ± 3,6 12,7 ± 2,3 24,7 ± 1,4
Световые альбиносы
Исходное содержание 0 0 5,8 ± 0,2
На глюкозе 1,2 ± 0,5 1,0 ± 0,02 6,2 ± 0,1
На глюкозе + СМ 0,6 ± 0,02 0,4 ± 0,01 3,8 ± 0,5
Темновые альбиносы
Исходное содержание 2,0 ± 0,1 1,7 ± 0,1 4,5 ± 0,3
На глюкозе 3,4 ± 0,2 2,3 ± 0,4 8,6 ± 1,0
На глюкозе + СМ 2,1 ± 0,1 1,7 ± 0,1 5,6 ± 1,0

При исследовании зависимости биосинтеза антоцианов от зеленых

пигментов Манцинелли, Янг и др. [320] использовали этиолированные
проростки, обрабатывая их СМ. Как видно из представленных данных, такие
проростки и в присутствии СМ продолжают синтезировать некоторое
количество хлорофиллов, вырезки же из альбиносов в этом плане представляют
собой лучший материал. Поэтому нами для исследования биосинтеза АК, ДАК и
ДКГК в зависимости от содержания зеленых пигментов были взяты
альбиносные участки первых листьев проростков ячменя, выращенных на свету,
а в качестве контроля - соответствующие участки зеленых листьев.
В вырезках из зеленых и альбиносных листьев ячменя было определено
исходное содержание всех исследуемых кислот и, как видно из таблицы 16,

62
альбиносы по количественному содержанию в них АК, ДАК и ДКГК мало
отличались от зеленых проростков.
Таблица 16
Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками
листьев ячменя, плавающими на 1% растворе глюкозы в присутствии
СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 24 ч)
Вариант опыта АК ДАК ДКГК
Зеленые участки
Исходное содержание 178,3 ± 10,6 57,3 ± 13,4 39,1 ± 10,9
В темноте 85,7 ± 13,1 40,8 ± 7,7 21,0 ± 4,8
На свету 220,2 ± 15,3 22,7 ± 9,1 69,7 ± 15,8
Альбиносные участки
Исходное содержание 166,4 ± 8,5 44,5 ± 2,2 37,2 ± 6,1
В темноте 91,4 ± 2,0 35,6 ± 7,8 19,1 ± 5,5
На свету 217,5 ± 19,7 13,9 ± 3,3 71,1 ± 17,6

Выдерживание в темноте зеленых проростков в течение 24 часов привело к

уменьшению содержания всех кислот: в большей степени АК и ДКГК, в
меньшей - ДАК. 24-часовое освещение способствовало накоплению АК и
особенно ДКГК, но в три раза уменьшило количество ДАК.
Изменение содержания АК, ДАК и ДКГК в зависимости от освещения у
альбиносов имело такой же характер, как и у зеленых проростков, т.е. не
зависело от наличия зеленых пигментов.
Накопление АК и ДКГК в зеленых и альбиносных проростках, плавающих
на 1%-ном растворе глюкозы, наблюдалось только на свету. Необходимо
отметить, что поступление в лист экзогенной глюкозы зависит от условий
освещения: так, в опытах М.М.Окунцова, Р.А.Карначук, Н.М.Фроловой [106] на
свету в листья овса входило почти в два раза больше 14С-глюкозы, чем в
темноте. Следовательно, в нашем опыте проростки, находящиеся на свету,
лучше снабжены субстратом, чем темновые, но это, вероятно, не является
единственной причиной, обусловливающей световой биосинтез АК и ДКГК, так
как если бы он был темновым, мы наблюдали бы накопление кислот и в темноте,
но в меньших масштабах, чем на свету. На самом же деле в темноте количество
указанных кислот резко снижается. По-видимому, помимо субстрата решающее
значение в процессе накопления АК и ДКГК имеет свет.
Исследована реакция на свет зеленых и альбиносных проростков,
предварительно выдержанных в темноте в течение 45 часов (табл. 17). Такое
длительное пребывание в темноте способствовало снижению в зеленых
проростках содержания окисленной формы АК и в два раза уменьшило
количество восстановленной АК и ДКГК. Последующее 20-минутное
освещение почти полностью восстановило исходное содержание АК и ДКГК и
резко снизило (в 2,5 раза) количество окисленной формы АК, тогда как в
темноте за это время существенных изменений не произошло.

63
 Таблица 17
Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками
листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ
(экспозиция 20 мин; предварительное выдерживание проростков в темноте 45 ч;
интенсивность света 15,2 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)
Вариант опыта АК ДАК ДКГК
Зеленые участки
Исходное содержание 299,6 ± 2,3 57,8 ± 2,2 86,5 ± 4,8
45 ч темноты 99,0 ± 5,3 50,8 ± 2,8 42,2 ± 4,3
45 ч темноты + 20 мин темноты 95,2 ± 1,3 47,5 ± 1,8 40,5 ± 1,7
45 ч темноты + 20 мин света 200,8 ± 9,1 19,3 ± 1,2 79,3 ± 5,7
Альбиносные участки
Исходное содержание 177,2 ± 10,1 42,2 ± 2,7 67,9 ± 4,5
45 ч темноты 87,6 ± 6,6 31,1 ± 2,5 13,0 ± 0,1
45 ч темноты + 20 мин темноты 90,0 ± 13,8 31,7 ± 2,0 12,8 ± 3,6
45 ч темноты + 20 мин света 169,7 ± 6,4 8,0 ± 0,0 25,0 ± 1,0

45-часовое пребывание в темноте альбиносов особенно сильно сказалось на

содержании ДКГК, количество которой уменьшилось с 67,9 до 13,0 мкг/г.
Последующее 20-минутное освещение увеличило ее содержание почти в 2 раза,
но оказалось недостаточным для восстановления исходного уровня. Характер
изменений восстановленной и окисленной форм АК у альбиносов был таким же,
как и у зеленых проростков.
Таким образом, альбиносные участки листьев ячменя на свету при наличии
экзогенного субстрата интенсивно синтезируют АК и ДКГК, следовательно, их
образование не связано с наличием зеленых пигментов и представляет собой не
зависимый от фотосинтеза светозависимый процесс.
Следует отметить, что под действием СМ количество желтых пигментов в
листьях ячменя уменьшается в десятки раз, но это тоже не оказывает
существенного влияния на накопление АК и ДКГК, хотя нужно учитывать, что
регуляторные функции пигменты могут выполнять и в небольших
концентрациях, когда поглощенная ими световая энергия используется лишь для
переключения метаболических путей [20, 64].
Механизм светоактивации образования АК и ДКГК пока неясен. Однако,
учитывая то, что некоторые органические кислоты (щавелевая, янтарная, винная,
α-кетоглутаровая) способствуют накоплению АК на свету [110], можно
предположить, что зависящее от света накопление АК (возможно, и ДКГК) в
зеленых, и особенно в альбиносных, проростках связано с функционированием
цикла Кребса, деятельность которого, как теперь известно, продолжается и на
свету [12, 16, 97]. В связи с чем на свету усиливается поступление
радиоактивного углерода из 1,6-14С-глюкозы в ди- и трикарбоновые кислоты
[97]. О возможности биосинтеза С4-кислот непигментированными клетками уже
сообщалось [18].

64
 Светозависимое накопление АК альбиносными проростками говорит об
отсутствии прямой связи данного процесса с фотосинтезом. Реальнее выглядит
зависимость биосинтеза АК от дыхательного процесса, для которого работами
последних лет показана возможность функционирования на свету не только
ЦТК, но и гликолиза, а также ОПФЦ [5, 13, 16, 80]; тем более, что на свету в
анализируемых альбиносных проростках стимулируется дыхание в целом и
отдельные его этапы: гликолиз, ОПФЦ, ЦТК [49].
Исследование действия света различного спектрального состава на
биосинтез АК в альбиносных проростках ячменя показало (рис. 13), что
наибольшую активность в этом процессе проявил зеленый свет (480-600 нм) и
далее по мере уменьшения активности - синий (430-520 нм) и красный (620-740
нм).

Рис. 13. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в альбиносных проростках ячменя
на свету различного спектрального состава в % к количеству кислот в темновом
варианте - 100% (интенсивность света - 2,5 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция - 1 ч)

Таким образом, и в опытах с альбиносными проростками ячменя

подтвердился факт стимулирующего действия зеленого света на накопление АК.
Зеленый свет длительное время рассматривался как малоактивный для растений,
и его обычно использовали для выполнения препаративной работы перед
световым экспериментом и во время фотоморфогенетических исследований.
Работами, выполненными в 60-70-е годы, нам удалось показать, что на зеленом
свету, а также на желто-зеленом активно синтезируется АК в этиолированных и
зеленых проростках [98, 103, 104]. Далее было установлено, что зеленый свет
оказывает влияние на ростовые процессы [53, 297, 302, 394], на
фотосинтетический аппарат [24, 40, 55, 91, 314] и содержание органического

65
углерода у растений [79]. Активация некоторых реакций метаболизма зеленым
светом рассматривается рядом авторов как опосредованная фитохромом,
возбуждаемым зеленым светом [54, 120, 146]. Следовательно, зеленый свет
нельзя рассматривать как физиологически инертный, а уточнение механизма его
действия на растения - дело будущих исследований.

4.4. Субклеточная локализация аскорбиновой кислоты

и ее окисленных форм в связи с освещением

Гистохимическое исследование распределения АК в листьях чистяка

весеннего (Ficaria verna Huds.) показало, что она сосредоточена в хлоропластах,
около ядер и во внешнем слое цитоплазмы. В стебле этого растения
центральный цилиндр и кора богаты АК, которая содержится главным образом в
хлоропластах [195]. Более 30 - 40% АК листьев шпината также находится в
хлоропластах [243]. В клетках корня конских бобов (Vicia faba L.) и лука
репчатого (Allium сера L.) повышенное содержание АК обнаружено в области,
близкой к клеточной стенке, а в клетках меристемы она распределена по всей
цитоплазме равномерно [289]. Много АК и в самой клеточной стенке [225]. В
клетках корня хрена весь аскорбат сосредоточен в больших центральных
вакуолях
Субклеточная
[262]. локализация АК в большой степени определяется
физиологическим состоянием клетки и ее структур. В зависимости от
функционального состояния хлоропластов содержание АК в протоплазме может
быть выше, чем в хлоропластах [195]. Делящиеся клетки культивируемых
верхушек корней кукурузы накапливали АК в цитоплазме, но картина
распределения АК менялась после начала элонгации клеток. В полностью
вытянувшихся клетках основная часть АК была связана с клеточной стенкой
Имеющиеся в литературе фрагментарные данные не дают цельной картины
[236].
количественной локализации АК в клетке. Исследование же этого вопроса,
несомненно, имеет большое значение для всесторонней оценки
физиологической роли АК в обмене веществ растений.
Для клеточных структур свойственен постоянный обмен метаболитами,
поэтому, решая вопрос о субклеточной локализации АК, мы провели
одновременный анализ ее содержания в хлоропластах и митохондриях,
клеточном соке и структурных элементах - фракции целых листьев, оставшейся
после извлечения сока [177, 178]. При этом учитывались условия освещенности,
которые оказывают существенное влияние на содержание АК [181, 275]. Наряду
с анализом восстановленной АК исследовалась ее окисленная форма -
дегидроаскорбиновая кислота и продукт необратимого окисления АК -
дикетогулоновая кислота, практически не исследованная в растениях [172]. В
опытах использовались 7-9-дневные проростки ячменя сорта Надя. Источник
света - люминесцентные лампы ЛДЦ-40 интенсивностью 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1.
Хлоропласты выделяли по методике, описанной в работе Г.А. Могилевой и
др. [87]. Супернатант, полученный при осаждении фракции хлоропластов,
подвергали центрифугированию при 9 тыс. об/мин (ЦЛР-1) в течение 15 минут
для отделения митохондрий. Целостность структур в выделенных фракциях

66
контролировали микроскопированием соответствующих образцов. Клеточный
сок извлекали центрифугированием (1 мин при 2 тыс. об/мин, ЦЛС-3)
обработанных хлороформом листьев в специальных стеклянных контейнерах
[105].
Расчет количества исследуемых кислот проводился на сухой и сырой вес
хлоропластов, митохондрий и целых листьев. Закономерности изменения
содержания кислот в условиях опытов сохранялись при обеих формах расчета,
поэтому приводим только данные, полученные при пересчете на сырое вещество
с тем, чтобы была возможность сопоставить содержание кислот в структурах и
клеточном соке.
Одновременный анализ АК, ДАК и ДКГК в клеточном соке и структурных
элементах листьев ячменя (рис. 14) показал, что все исследованные кислоты
количественно преобладают в клеточном соке, превосходя содержание АК в
структурных элементах почти в 4 раза, а ДАК - более чем в 2 раза.
Длительное выдерживание проростков в темноте (40 ч) привело к
выравниванию содержания кислот в анализируемых фракциях за счет
повышения уровня АК в структурных элементах и одновременного снижения
окисленной формы АК в обеих фракциях.
Последующее 24-часовое освещение, снизив уровень АК в структурных
элементах и повысив его в клеточном соке, вновь вернуло к исходному
соотношение в них АК (1 : 4). Свет повысил содержание ДАК и ДКГК в
структурных элементах и в клеточном соке, в последнем особенно резко.
Таким образом, основным местом сосредоточения АК, ДАК и ДКГК в
листьях ячменя является клеточный сок. Содержание АК и ДКГК в нем
довольно стабильно, не меняется даже при длительном пребывании растений в
темноте и увеличивается только при продолжительном освещении [180].
Наиболее существенные изменения содержания кислот в связи с освещением
происходят во фракции "структурные элементы": в темноте резко возрастает
количество АК, что сопровождается снижением ее окисленной формы - ДАК, на
свету характер изменений становится противоположным. Вероятно, повышение
содержания АК в структурных элементах в темноте является результатом
неиспользования ее в процессе фотосинтеза, где она может идти на поддержание
в восстановленном состоянии хлорофилла [63], пластоцианина [425], возможно,
и других соединений электрон-транспортной цепи [301].
Длительное освещение изменило содержание АК в клеточном соке, увеличив
его на 49% по сравнению с исходным содержанием. Это увеличение
коррелировало с нарастанием продуктов окисления АК - ДАК и ДКГК. Можно
предположить, что в данных условиях увеличивается и светозависимое
использование АК, идущее с накоплением ее окисленной формы и ДКГК,
образующейся при разрыве лактонового кольца ДАК.
Стимулируемое светом накопление АК в клеточном соке может идти или за
счет ее новообразования, или за счет усиливающихся на свету притоков АК из
клеточных структур. Скорее всего, решающим является второе событие, так как
в обеих анализируемых фракциях на свету увеличивается содержание ДАК,
которое, обладая повышенной по сравнению с АК способностью растворяться в

67
липидах, довольно легко может проходить через клеточные мембраны и
выполнять роль транспортной формы АК [154].

- свет
- темнота

Рис. 14. Действие света (33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1) на содержание АК (1), ДАК (2)

68
 и ДКГК (3) в клеточном соке (а) и структурных элементах (б) листьев ячменя

- АК - ДАК - ДКГК

Рис. 15. Содержание АК, ДАК и ДКГК в целых листьях ячменя (1), хлоропластах (2)
и митохондриях (3) после 40 часов пребывания в темноте (а) и последующего

69
 24-часового освещения (б) (интенсивность света - 33 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1)
В следующей серии опытов проводился одновременный анализ АК, ДАК и
ДКГК в целых листьях, хлоропластах и митохондриях, выделенных из растений,
находящихся в различных условиях освещения (рис. 15), с тем, чтобы
исследовать способность к биосинтезу АК данных клеточных структур,
входящих в состав анализируемой нами фракции "структурные элементы".
Из представленных данных видно, что в одном грамме хлоропластов,
выделенных из листьев проростков ячменя, находящихся 40 часов в темноте,
содержится больше восстановленной АК, чем в грамме целых листьев, а в
митохондриях - меньше.
Последующее освещение растений, длительное время находившихся в
темноте, увеличило содержание аскорбата в целых листьях и существенным
образом повлияло на распределение АК в структурах: в хлоропластах уровень
кислоты понизился, а в митохондриях увеличился в 3 раза. Таким образом,
показано светозависимое накопление АК в беспигментных структурах -
митохондриях.
Что касается окисленной формы АК, то в структурах, выделенных из
темновых листьев, она практически отсутствовала; ДКГК, напротив,
накапливалась в больших количествах. Эти данные дают возможность
представить направленность обмена исследуемых кислот: в темноте в
хлоропластах и митохондриях идет необратимое окисление ДАК до ДКГК.
При освещении в хлоропластах появляется ДАК, а в митохондриях ее
количество увеличивается с 5,3 мкг/г до 33,3 мкг/г. Следовательно, на свету
начинается использование АК с образованием окисленной формы. Последняя в
митохондриях в больших размерах необратимо окисляется до ДКГК, а в
хлоропластах этот процесс идет не так активно, вероятно, за счет того, что часть
ДАК подвергается фотовосстановлению до АК [286].
Способность хлоропластов синтезировать АК в зависимости от освещения
исследовалась и в опытах с изолированными хлоропластами. Последние
выделялись из листьев 7-9-дневного ячменя, находившегося 40 часов без
освещения. В хлоропластах определялся уровень АК, ДАК и ДКГК, затем часть
их освещалась 2 часа в склянках Тищенко при постоянном продувании через
среду выделения (0,4 М сахароза, 1/15 М фосфатный буфер, 0,01 N NaCl)
воздуха со скоростью 1 л/мин; другая часть находилась в аналогичных условиях
в темноте (табл. 18). За два часа освещения в изолированных хлоропластах
уровень АК увеличился в 4 раза, и только в этом варианте была обнаружена
ДАК. Количество ДКГК, напротив, в освещенных хлоропластах было ниже, чем
у неосвещенных. Из анализируемых кислот в среде выделения накапливалась
только ДКГК, причем в значительном количестве, не уступающем ее
содержанию в изолированных хлоропластах и хлоропластах целого листа.
По всей видимости, при инкубации изолированных хлоропластов АК,
активно синтезируемая в них, выделяется в среду. В темноте она разрушается до

70
ДКГК, на свету этот процесс тормозится, поэтому в среде выделения
обнаруживается ДАК - промежуточный продукт окисления АК до ДКГК.
Таблица 18
Влияние света на накопление АК, ДАК и ДКГК изолированными хлоропластами
листьев ячменя (интенсивность света 15,7 тыс. эрг⋅см-2⋅с-1; экспозиция 2 ч)
Вариант опыта АК ДАК ДКГК
мкг/г t мкг/г мкг/г t
Хлоропласты листьев ячменя,
находящегося 40 часов в темноте - 210,2 0 233,9
(а)
+ 2 часа темноты: a a
= 1,61 = 0,82
изолированные хлоропласты (б) 278,2 б 0 266,9 б
среда выделения (в) 0 0 225,4 a
= 104
,
в
+ 2 часа света: a a
= 19,2 = 0,11
изолированные хлоропласты (г) 840,4 г 55,6 228,7 г
среда выделения (д) 0 б 0 221,4 б
= 10,3 = 3,04
г г
a
= 0,78
д

n =8, tтабл. = 2,37 для Р ≤ 0,05

Таким образом, субклеточная локализация АК, ДАК и ДКГК в листьях

ячменя в значительной степени определяется условиями освещения.
Светозависимое накопление АК при длительной экспозиции связано с
увеличением ее содержания в клеточном соке и митохондриях. В хлоропластах
на свету также идет новообразование АК за счет или фотовосстановления
предшественника [344], или фотовосстановления окисленной формы [286],
однако наряду с этим имеет место активное использование восстановленной
формы АК в светозависимых процессах, масштаб которого превышает
биосинтез. Поэтому при длительном освещении растений содержание АК в
хлоропластах начинает снижаться. Можно допустить и другое: синтезированная
на свету в хлоропластах АК быстро поступает в клеточный сок, тем самым
определяя высокое содержание в нем аскорбата. Обмен восстановителем может
идти не только с клеточным соком, но и с митохондриями, и такая возможность
ужеПредставляется
обсуждается [56].интересным подробнее обсудить возможный механизм
выявленного нами стимулируемого светом накопления АК в митохондриях. В
литературе известны факты светозависимых изменений некоторых процессов в
альбиносных растениях [456], в беспигментных структурах: в клеточных ядрах
[71], в митохондриях, где при включении света резко возрастает НАД ⋅ Н2 [267].
Что касается биосинтеза АК, то известно, что ферменты, ответственные за
превращение l-галактоно-γ-лактона в АК, содержатся в митохондриях [282].
Можно предположить, что эта заключительная реакция в биосинтезе АК
является светозависимой. Возможными акцепторами света в митохондриях

71
могут быть цитохромы, в частности, цитохром С, для которого показано
небольшое ускорение окислительно-восстановительных превращений при
действии “белого” света [63, 65]. К тому же цитохромы имеют поглощение в
зеленой области спектра - довольно активной в биосинтезе АК [104].
Последняя ступень биосинтеза АК у эвглены катализируется l-гулоно-лактон
дегидрогеназой, сосредоточенной преимущественно в цитозоле (86,7%); 11,6%
ее находится в митохондриях [402]. На свету активность данного фермента
увеличивается [404], что может обусловливать светозависимое накопление АК
не только в цитозоле, но и в митохондриях.
Если же стимуляция светом б