МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет

А.М. Семенов, Е.В. Семенова

Практическое определение
функциональной активности почвенной
экосистемы

Учебное пособие

Москва
2018
УДК 579(075.8)
ББК 28.4я73

Учебно-методическое пособие печатается по решению Учёного и

Методического советов биологического факультета МГУ.

Практическое определение функциональной активности

почвенной экосистемы / А.М.Семенов, Е.В.Семенова - М.: изд.
Биологический факультет МГУ, 2018 - 32 с.

Учебное пособие предназначено для проведения летней

производственной практики студентов 3 курса бакалавриата
кафедры микробиологии по программе «Экология микроорганизмов.

УДК 579(075.8)
ББК 28.4я73

Учебно-методическое издание

Тираж 100 экз.

Изд. Биологический факультет МГУ

 АННОТАЦИЯ
Настоящее пособие относится к области экологии микроорганизмов и
предназначено для практического обучения студентов оценке активности
микроорганизмов в почвенной экосистеме. Пособие создано на основе
программы по «почвенной» микробиологии, исследований, проведенных
отечественными и зарубежными коллегами, а также - на основе оригинальной
методической разработки авторов, которая запатентована и представлена
в многочисленных публикациях. В пособии приведены современные
представления о почве, почвенной экосистеме и вводится такое современное
понятие, как «здоровье почвы». Учебное пособие предназначено для студентов
микробиологов и биотехнологов МГУ, вместе с тем может быть рекомендовано
широкому кругу читателей – магистрам, аспирантам, научным сотрудникам
университетов и сельскохозяйственных образовательных учреждений, а также
специалистам в области сельскохозяйственной биотехнологии и экологии.

This manual refers to the field of ecology of microorganisms and is intended

for practical training of students to assess the activity of microorganisms in the soil
ecosystem. The manual was created on the basis of a program on “soil” microbiology,
research conducted by domestic and foreign colleagues, and also on the basis
of original methodological development of the authors, which is patented and
presented in numerous publications. The manual presents modern ideas about soil,
soil ecosystem and introduces a modern concept, such as “soil health.” The textbook
is intended for the students of microbiology and biotechnology at Moscow State
University, but at the same time it can be recommended to a wide range of readers
- masters, graduate students, university researchers and agricultural educational
institutions, as well as specialists in agricultural biotechnology and ecology.

1
 ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время экология микроорганизмов вместе с

биотехнологией занимают ведущие направления в микробиологии,
потеснив такие традиционные направления в изучении микробного
мира как биохимия и физиология микроорганизмов. Смена
приоритетов в микробиологии связана, во-первых, с развитием
методов определения активности и разнообразия микроорганизмов в
природе, а во-вторых, с практической необходимостью использовать
активность микроорганизмов в природных экосистемах, например,
для удаления ксенобиотиков и сохранения здоровой почвы, как
жизненно необходимой экосистемы, служащей источником и стоком
биоразнообразия.
Настоящее пособие относится к области экологии микроорганизмов
и предназначено для обучения практической работе студентов
кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени
М.В. Ломоносова во время производственной практики в 6-ом
семестре бакалавриата, которая традиционно посвящена знакомству с
многообразием микроорганизмов в природных экосистемах и навыкам
работы с природными образцами почвы и воды.
Настоящее пособие дополняет используемую программу
введением в задание студентов четкой практической цели, а именно,
расчета на основе полученных результатов параметра здоровья почвы.
Сохранение и накопление результатов, полученных на таких занятий,
приведет к получению важных научных результатов, необходимых для
создания «банка» данных о микробной активности почвы, почвенных
экосистем.
По существу, это методическое пособие предлагает студентам, на
основе полученных знаний, проведение краткого самостоятельного
исследованияпочвеннойэкосистемы,гдеспомощьюмикробиологических
процессов и методов проводится не просто учет микроорганизмов ради
учета, а определяется параметр «здоровья почвенной экосистемы».
Настоящее пособие создано на основе оригинальной методической
разработки авторов, которая запатентована и представлена в
многочисленных публикациях (7, 10, 11, 13).
Цель методического пособия – разработать содержание
проведения практических занятий о последовательности определения
численности бактерий в виде колонии образующих единиц (КОЕ)
или численности клеток бактерий в образцах почвы и определения
активности почвенных микроорганизмов в виде эмиссии СО2
почвенными образцами, позволяющее рассчитывать параметр здоровья
почвенной экосистемы, что обеспечит глубокое смысловое содержание
занятий по определению численности и активности микроорганизмов
в почвенной экосистеме. Представленная в пособии задача, позволит
2
подготовить специалистов, способных диагностировать здоровье самой
сложной экологической системы, традиционно называемой - почва.
Почва - служит объектом изучения геологов и почвоведов,
агрохимиков и агрономов, экологов, биологов и даже грунтоведов.
Её исследуют с разных сторон, нередко одними и теми же или
сходными методами, для достижения при этом, разных целей и задач.
Поэтому возникли различные определения объекта, традиционно
именуемого почвой. При определении термина почва все еще
превалирует эволюционно - филогенезисный подход, оперирующий
преимущественно физико-химическими понятиями и глобальными
масштабами. Современные знания позволяют и рассматривают
почву, как многофазную систему с ее биоразнообразием, глобально
значимыми и уже ощущаемыми антропогенныими воздействиями.
К настоящему времени накоплено достаточно знаний, чтобы
использовать понятие почвенная экосистема (ПЭ) вместо традиционного,
лаконичного, но мало информативного понятия - почва. Понятие ПЭ
более объективно характеризует эту биологическую систему с научной,
практической и повседневной точек зрения. Использование понятия
ПЭ сразу ориентирует и теоретика и практика на необходимость,
различать несколько категорий почвенным экосистем, по крайней
мере, природную, не используемую экосистему и экосистему,
эксплуатируемую человеком, в первую очередь - агроэкосистему. Тем
не менее, в дальнейшем термин «почва» будет использоваться, но лишь
для краткости изложения.
Почвенная экосистема - это продукт длительной взаимной
ассимиляционно-диссимиляционной жизнедеятельности микроорга-
низмов и растений в доминирующем минерально-органическом веще-
стве. Современная ПЭ (почва) - это органоминеральный природный
продукт, созданный и поддерживаемый в соответствии с локальным
климатическим режимом непрерывными микробно-растительными
взаимодействиями в изначально количественно доминирующем
неорганическом веществе. Продукт, включает биоту, ее остатки и
метаболиты, биофильные элементы. В этом продукте происходят
биологические и физико-химические процессы - биогеохимические
циклы элементов и циклы микроорганизмов. Продукт обладает значи-
тельными буферными свойствами в отношении разнообразных стрес-
соров, обеспечивает питательными веществами растения и различную
почвенную биоту, является источником и стоком биоразнообразия.
Именно биологическая составляющая ПЭ выполняет функции образо-
вания и поддержания среды - продукционные, сохранения и поддер-
жания в активном состоянии разнообразие биоты. Именно поэтому к
нормально, т.е. устойчиво и автономно функционирующей ПЭ, право-
мерны и применимы такие биолого-экологические характеристики,
как здоровье почвы и патология почвы. Среди множества характе-
3
ристик способностей биологического компонента почвы следует
особенно подчеркнуть его самовоспроизводимость, само обеспечение
и динамичность.
Среди традиционных, распространенных категорий, используемых
для характеристик почвы широко, употребляются следующие - качество
почвы и плодородие почвы. Качество почвы в основном выражается в
физико-химических понятиях и характеристиках. Плодородие почвы -
(«рождение плода») - потребительская характеристика, характеристика
пользователя. Нужна категория, отражающая биологический компонент
экосистемы почвы. Современной категорией, которая характеризует
и отражает биологический компонент почвенной экосистемы,
учитывает отмеченные выше характеристики этого компонента, связь
его с неживой составляющей почвы и аналогию с другими живыми
системами, является здоровье почвенной экосистемы (ЗП).
Здоровье почвенной экосистемы - это биологическая категория,
отражающая состояние динамики активности биотического компонента
в органоминеральном комплексе почвы; эта биологическая категория
характеризуется, в соответствии с природно-климатической зоной,
адекватной активностью биотических процессов (синтеза и гидролиза),
их устойчивостью к нарушающим воздействиям (биотическим и
абиотическим стрессорам), «замкнутостью» циклов биофильных элементов
и микроорганизмов (само обеспечением). Здоровье почвы агроэкосистемы,
характеризуется еще и соответствием своего вещественного и биотического
состава нормативным показателям и адекватным плодородием. Такое
определение ЗП, применимое к любой почве (исключая аномальную),
не противоречит содержательной сути традиционных характеристик,
интегрируя их содержание, поскольку показатели динамики активности
биотического компонента взаимосвязаны и с качеством почвы, и с
актуальным почвенным плодородием.
Итак, отметим ключевые понятия, рассматриваемые в настоящем
пособии. Это почвенная экосистема, здоровье почвы и, конечно,
микробное сообщество. Для любой экосистемы, а особенно для
почвенной более реалистично представлять микробное разнообразие
не в виде множества однородных популяций (“чистых культур”), а в
виде микробных сообществ (МС). Кратко, “микробное сообщество”
следует, представят как “некую совокупность таксономически разных,
но функционально взаимодействующих популяций микроорганизмов,
существующих некоторое время в соответствующем месте. Компоненты
МС могут быть, как сильно взаимосвязанными между собой, в том
числе и физически, а МС – может быть высокоспециализированным,
так и слабо связанными, а МС - низко специализированным”.
Отметим, что чем более объективна концепция структуры МС, тем
выше ее объяснительные и прогностические свойства, тем вероятнее
принятие правильного решения в экологической и промышленной
4
биотехнологии (7, 16). Концепцию структуры МС дополняют
концепции: r –K – континуума, как отражение непрерывности и
дискретности свойств и распространения организмов; концепция
олиготрофии, которая объясняет причину олиготрофикации экосистем,
как механизма создания и поддержания здоровых экосистем (почв);
концепция регуляции активности природного МС, согласно которой
изменения активности МС происходит не столько через изменение
активности доминирующих компонентов сообщества, сколько через
смену состава сообщества – через сукцессию.

5
 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ И АКТИВНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВЕННОЙ ЭКОСИСТЕМЕ,
АКТУАЛЬНЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ ПОЧВЫ

Для микробиолога почвенная экосистема - это обитающие в

минерально-органическом субстрате разнообразные микроорганизмы.
Хотя понятие микроорганизмы включает все, что не различимо
не вооруженным глазом, в повседневном научном представлении
обычно отмечают бактерии (прокариоты) и грибы (эвкариоты),
т.е. мицелиальные - микромицеты и одноклеточные - дрожжи.
Микроскопические простейшие, водоросли и другая микробиота в
силу биологических традиций и функций этих организмов в почвенной
экосистеме, хотя и тоже может подвергаться учету, но только для
решения специальных задач.
Зачем нужно имеет информацию о численности и активности
микроорганизмов, обитающих в почвенной экосистеме? Для
понимания роли микроорганизмов в природе и для использования
этих знаний в практических целях.
Известно несколько методов определения численности
микроорганизмов в природных средах, методов, принятых повсеместно.
Каждый метод имеет какие-то допущения и ограничения и в силу этого
разные методы имеют какие-то преимущества и недостатки. Решение
задачи, определения тотальной численности прокариотических клеток
в ПЭ, которые в основном представлены бактериями, позволяет
метод прямого учета (счета) бактерий, при использовании светового
микроскопа с его модификациями и соответствующими красителями.
Достоинства этого метода в том, что метод позволяет учесть
практически все микроорганизмы. Это необходимо для решения
познавательных задач, например, чтобы знать количество
бактериальных клеток в грамме почвы, а также - для определения
микробной биомассы в почве и др. Для практики, является актуальным
выявление распространения патогенных микроорганизмов, их,
замкнутое в цикл, движение (перемещение) из одного местообитания
в другие (2). Недостатки метода прямого счета бактерий под
микроскопом - трудоемкость, при использовании современных
микроскопов и дифференцирующих красителей - это достаточно
дорогой метод, требует высокой квалификации пользователя, тем
более при возникновении «сложностей», например, при учете
многоклеточных, нитчатых и мицелиальных форм микроорганизмов.
Описание наиболее распространенных и доступных прописей прямого
счета бактерий и красителей, используя световой микроскоп, можно
найти в методическом пособии (14).
Определение численности активных, жизнеспособных,
вырастающих на разнообразных средах микроорганизмов, т.е.
6
численности культивируемого, активного множества, осуществляют
выращиванием их на питательных средах. Эти методы основаны
на предположении и допущении, что в среде вырастают все клетки,
находящиеся в исследуемом образце. В идеале для этого нужно иметь
универсальную среду, обеспечивающую условия для роста всего
многообразия микроорганизмов, что недостижимо и в первую очередь
именно из-за многообразия свойств микроорганизмов. Отметим, что
микробиологи преуспели в создании элективных сред и условий, т.е. в
дифференциации, но не в интеграции (3, 4, 5, 6).
В настоящее время, для прагматических целей, используют или
твердые среды, где в качестве отвердителя в основном используют
агар-агар или (реже) жидкие среды. На твердых средах учитывают
выросшие колонии, предполагая, что каждая колония есть результат
размножения одной клетки! Поскольку это тоже является допущением,
то говорят не о количестве клеток, определяемых методом высева, а о
количестве колонии образующих единиц (КОЕ).
Метод определения численности микроорганизмов в почвенной
экосистеме в жидких средах используется реже. Этот метод еще
известен как «метод предельных разведений» (МПР) (most probable
number method). Метод основан на таком же предположении и
допущении, что каждая клетка размножается, и рост (помутнение
среды), обнаруженный в последней пробирке серии разведений, есть
результат той одной клетки, которая оказалась в одном миллилитре,
отобранном из предпоследнего разведения. Для расчета количества
микроорганизмов в анализируемом образце, нужно иметь таблицу
Мак-Креди, которая создана на основании обработки многочисленных
экспериментальных результатов методом вариационной статистики,
что еще увеличивает степеней допущения.
Отметим, что метод предельных разведений для метода
определения здоровья почвы, по-видимому, не применим. Метод
определения здоровья почвы предусматривает активацию микробных
популяций в образцах почвы, внесением субстрата (в нашем
методе - глюкозы) в образцы почвы. Приготовление разведений
микроорганизмов в свежей (!) среде затруднит или даже не позволит
выявить волнообразное развитие в виде циклов роста и отмирания
микробных популяций и сообществ, потому что происходит «двойная»
стимуляция роста субстратом (3, 4, 5, 6).
Наблюдение и количественное определение активности
микроорганизмов, обитающих в почвенной экосистеме тоже
можно осуществлять разными методами. На планете Земля нет
веществ, не подверженных воздействию гидролизно-синтетической
активности микроорганизмов. Глубина и скорость проявления
этого воздействия очень различаются. Разнообразие и значимость
активности микроорганизмов по существу - безграничны. Сама
7
почва – продукт активного взаимодействия микроорганизмов и
растений, что дает основания и определяет необходимость выявления
микробной активности. Помня экологическое правило, согласно
которому: «микробный процесс только тогда значим и заметен,
если осуществляющих этот процесс микроорганизмов много и они
активны», мы ограничимся рассмотрением активных почвенных
аэробных гетеротрофных микробных сообществ. Кроме того, мы
ограничимся определением только такой активности, которую можно
быстро определить и количественно учесть (см. глава 2).

1.1. Отбор почвенных образцов из почвенной экосистемы и

подготовка их к микробиологическому анализу
Традиционно микробиологическому анализу почвы, подвергаются
так именуемые средние, усредненные пробы почвы. Согласно
рекомендациям почвоведов, среднюю почвенную пробу готовят,
смешивая отдельные образцы, отобранных из 3 - 5-и точек на площади
100 м2, а с гектара - из 15 точек. Рекомендуется отбирать образцы
почвенным буром. При отборе образцов из обрабатываемой (пахотной)
почвы, погружать, ввинчивая бур от поверхности почвы на глубину 20 см.
Перед каждой операцией производят стерилизацию поверхностей бура
этанолом. В случае отбора образцов из залежной почвы, рекомендуется
срезать дерновину, слой ≈ 2 см, покрытый растительностью, а потом
отбирать образцы, как описано выше. Образцы из бура собирают в
новые полиэтиленовые пакеты, закрывают и подписывают (дата,
время, адрес участка и т.д.).
Подготовка каждого образца к анализу включает - перемешивание
каждого образца с удалением камешков, корешков и биоты
макроскопических размеров, просев через сито (2 мм). Перед каждой
операцией производят стерилизацию поверхностей сита этанолом.
Из каждого образца берут навесу почвы от 1 до 5 г. в температуро -
устойчивые емкости для определения влажности (весовой) почвы,
навески помещают в сушильный шкаф с to до 105o на сутки.

Оборудование и инструменты.
1. Почвенный бур, с внутренним диаметром 2 см.
2. Новые полиэтиленовые пакеты.
3. Этиловый спирт.
4. Стерильные салфетки для протирания (стерилизации) бура.
5. Маркер.
6. Сито (размер пор 2 мм).
7. Металлические шпатели для удаления почвы из бура и для
перемешивания почвы.

8
 1.2. Метод определения численности бактерий в почвенной
экосистеме в виде количества колоний образующих единиц (КОЕ)
высевом почвенной суспензии на агаризованные среды
Определение численности целостных, жизнеспособных и
активных микроорганизмов, особенно бактерий в ПЭ, позволяет
метод выращивания их на питательных средах. При этом нужно
помнить некоторые теоретические положения микробиологии.
К микроорганизмам, как и ко всему живому применимо
понятие - биоразнообразие. Микробное биоразнообразие
включает (подразумевает наличие) различий по биологическим
и физико-химическим характеристикам. К физико-химическим
характеристикам относятся to, pH, Rh, E и концентрации элементов.
К биологическим характеристикам относятся в первую очередь
разнообразие метаболизма микроорганизмов, энергетического:
литотрофы, фототрофы и органотрофы, и углеродного: автотрофы
и гетеротрофы. Для удобства оперирования с метаболическим
многообразием микроорганизмов микробиологи, микробные экологи,
подразделяют микроорганизмы по их метаболическим способностям
и возможностям на «специалистов» и «генералистов». По реакции
на концентрацию органического углерода в среде на «копиотрофов»
и «олиготрофов». По реакции микроорганизмов на обогащение/
истощение среды обитания органическим субстратом и по скоростям
роста - на r-L-K- стратегов (7, 16). Широко известно подразделение
микроорганизмов по функциональным способностям, группирование
микроорганизмов в физиологические группы.
Из выше отмеченного уже становится очевидным, что не может
существовать универсальной питательной среды и условий, на которых
можно вырастить все микробное разнообразие. Поэтому оправдано
использование такого условного подразделения микроорганизмов,
которое объективно применимо для разных метаболических групп,
как «majority» и «minority», т.е. большинство и меньшинство, хотя
такое подразделение в период расцвета так именуемых молекулярно
биологических методов, пересматривается. Тем не менее, уже в
конце XX века, культуральными методами на умеренно «бедных»
гетеротрофных средах, при стремлении к оптимальным физико-
химическим условиям культивирования, в почвенной суспензии,
удавалось учитывать количество бактериальных клеток вполне
сопоставимое с количеством клеток, учитываемых методом
прямого счета бактерий в почвенной суспензии под световым
(люминесцентным) микроскопом. Поэтому, несмотря на приоритет
молекулярно-биологических методов, вполне допустимо и оправдано
в учебных и практических целях, использовать имеющиеся
оптимальные среды и условия культивирования, для определения
количества микроорганизмов (бактерий и микромицетов) (17, 18,19).
9
 1.2.1. Состав и приготовление среды для выращивания бактерий с
получением колоний образующих единиц (КОЕ)
Для определения численности целостных, жизнеспособных и
активных микроорганизмов в почве нужны подходящие среды и
условия культивирования. Для учета культивируемых сапротрофных
микроорганизмов, бактерий и микромицетов, используют жидкие и
«твердые», в подавляющем большинстве - агаризованные среды. Известно
много прописей таких сред, изданы сборники прописей сред и условий
культивирования разных физиологических групп бактерий (3, 15).
[1]. Однако для целей, поставленных в настоящем пособии -
учета мезофильных, сапротрфных, копиотрофных бактерий (т.е.
культивируемого, активного множества) в почвенной суспензии,
рекомендуется следующий состав среды (г/л дистиллированной
воды): MgSO4*7H2O - 0,5; KNO3 - 0,5; K2HPO4*3H2O - 1,3; Ca(NO3)2*4H2O;
глюкоза - 2,5; энзиматический гидролизат казеина - 0,2; агар
бактериологический - 15,0. pH - 7. Стерилизация осуществляется
дважды. Первый раз стерилизуется состав без глюкозы и казеина
при 1 атм. Повторно, после внесения глюкозы и казеина при 0,5 атм.
Многократная экспериментальная проверка показала, что состав
такой среды позволяет получать максимальное количество КОЕ, как из
ризосферой так и не ризосферой почв (18, 20).
[2]. Количество среды готовят исходя из количества анализируемых
образцов почвы и количества обучаемых студентов. Продолжитель-
ности анализа каждого образца (4 - 5 дней, один анализ (посев)/день).
Среды, за день до их использования, «расплавляют» и охлаждают до ~
50оС для предотвращения образования обильного конденсата на по-
верхности застывшего агара и у пламени газовой горелки, разливают
их в подготовленные стерильные чашки с учетом: количества анализи-
руемых образцов почвы, количества студентов, длительности анализа
(4 - 5 дней). В зависимости от используемых чашек – стеклянные или
пластиковых - в каждую чашку вливают 13 - 17 мл агаризованной среды.
После застывания агаризованной среды, чашки переворачивают
вверх дном и оставляют чашки, как минимум до следующего дня для
подсыхания поверхности среды. На наружной поверхности дна чашек
маркером наносят необходимую информацию, дату и др.

Необходимое оборудование, инструменты и реактивы.

1. Весы (аналитические).
2. Маркер.
3. Посуду и реактивы для приготовления питательной среды.
4. Автоклав.
5. Чашки Петри.
6. Горелка, газовая (спиртовка).
7. Ламинарный бокс.
10
 1.2.2. Порядок проведения посева почвенной суспензии на
агаризованную среду
[1]. Подготовленную, как описано выше (см. раздел 1.1), почву
взвешивают по - 1 г. Навески переносят в пробирки с 9 мл стерильной
дистиллированной воды. Шпатели для отбора почвенных навесок,
перед каждой операцией стерилизуют этанолом.
[2]. Почвенные суспензии (ПС) полученные в первых пробирках, для
большей десорбции микроорганизмов с почвенных частиц, подвергают
обработке ультразвуком. Обработку проводят или согласно инструкции к
ультразвуковому прибору или согласно рекомендациям Звягинцева Д.Г.,
частота 15 кГц сила тока 0,4 А, продолжительность обработки - 3 мин, не
допуская нагревания почвенной суспензии при этой операции (1).
[3]. После ультразвуковой обработки сразу приступают к
«десятикратным» разведениям суспензий. Для этого, из пробирки
после встряхивания ее на «встряхивателе», например, фирмы
«Вортекс» (не менее 5 сек., не замочить пробки во встряхиваемой
пробирки!), отбирают 1 мл почвенной суспензии (стерильным
наконечником или стерильной пипеткой на 1 мл) и переносят в другую
пробирку с 9 мл стерильной (дистиллированной) воды. Эту процедуру
производят до получения разведений ПС 10-5 или/и 10-6 в зависимости
от предполагаемого обилия микроорганизмов (бактерий) в образцах.
Встряхивание пробирки с почвенной суспензией на «Вортекс» (не
менее 5 сек.), производят каждый раз перед отбиранием из этой
пробирки суспензии; процедуру разведения почвенной суспензии
всегда производят только стерильными наконечниками (пипетками).
[4]. Посев почвенной суспензии рекомендуется производить
минимум в 3-х повторностях, (на три чашки!). Для этого асептически
из последнего (избранного!) разведения, отбирают 50 мкл и вносят
на поверхность питательного агара чашки Петри (в средину чашки).
Асептически, у пламени газовой горелки под крышкой чашки,
производят распределение (растирание) круговыми движениями
стерильным (желательно стеклянным, изготовленным в виде
треугольника) шпателем суспензии по поверхности агаризованной
среды, закончив распределение - закрывают крышку чашки. Каждую
чашку Петри подписывают маркером с наружной стороны дна чашки,
указывая, необходимую информацию об анализируемых образцах,
степень «разведения» высеваемой суспензии, дату посева и другую
необходимую информацию. Чашки, помещают термостат (28оС),
инкубируя их вверх дном.

Необходимое оборудование, инструменты

1. Пробирки с 9 мл стерильной дистиллированной воды, рН
нейтральный, по 5 - 6 пробирок на каждый анализируемый образец
почвы и с учетом количества обучаемых студентов.
11
 2. Шпатели для отбора почвы.
3. Ультразвуковой прибор.
4. Этанол.
5. Шпатели, желательно стеклянные, стерильные, для «распределения» поч-
венной суспензии на поверхности агаризованной среды в чашке Петри.
6. Встряхиватель «Вортекс».
7. Автоматические пипетки и стерильные наконечники емкостью 0,1
и 1.0 мл или традиционные стерильные пипетки (с ваткой!).
8. Маркер.
9. Термостат на 28о.
10. «Контактный» счетчик колоний.

1.2.3. Подсчет КОЕ

[1]. По истечении времени инкубирования при термостатировании
(≈ 60 час.) посевов, производят подсчет выросших колоний, в виде
колоний образующих единиц (КОЕ) с последующим расчетом
количества КОЕ на грамм сухой почвы. Для удобства, учтенную колонию
на наружной стороне дна чашки отмечают маркером. Показателем
оптимальности используемого разведения почвенной суспензии
является вырастание на чашке от 50 до 150 колоний. При большом
количестве колоний на чашках и/или при большом количестве чашек
для учета КОЕ желательно использовать контактный счетчик колоний.
[2]. Цифровые результаты подсчета колоний, заносят в файл Excel,
в таблицы. В файл Excel, в таблицы, заносят и все другие данные и
результаты, например, касающиеся определения влажности почвенных
образцов и др. Предлагается следующий порядок оформления и
заполнения таблиц в файле Excel, который апробирован для операций
с большим массивом данных.
Таблицы Excel имеют колонки, обозначенные буквами и строки,
обозначенные цифрами. Предлагается первую колонку в таблице,
назвать (обозначить) в ячейке строки как [№ п/п] и последующем
разместить вертикально порядковые номерами образцов, даты
посевов или др. Настоятельно рекомендуется вносить в таблицы все,
все так именуемые «промежуточные» данные, на основании которых
в дальнейшем будут производиться расчеты «основных» показателей.
Далее, несколько колонок (до пяти) будет занято данными,
необходимыми для расчета влажности почвы. Следующие, по крайней
мере, три колонки будут заняты данными КОЕ, посчитанными в каждой
чашке и колонка расчета среднего значения для трех чашек.
[3]. В следующей колонке (№ 11), данные о количестве КОЕ,
рассчитанные по формуле: КОЕ= (a*b*c/d). Обозначения: a - количество
КОЕ, среднее значение из трех чашек; b - числовой коэффициент, для
приведения вносимого объема почвенной суспензии в чашку Петри к 1
мл; c - числовой коэффициент, равный порядку разведения суспензии,
12
например, 10-5 или 10-6; d - вес почвенного образца, после высушивания 1 г
исходной (влажной) почвы. Такие результаты рассчитывают, как минимум
для трех повторностей образцов почвы, что позволяет рассчитать среднее
значение количества КОЕ и стандартное отклонение (11).
Рекомендуется «распространить» формулу расчета КОЕ на всю
колонку, чтобы при постепенном внесении результатов подсчета КОЕ
вычисления количества КОЕ/г.с.п. происходили «автоматически».

Необходимое оборудование и инструменты.

1. Компьютер с программой Excel.
2. Контактный счетчик.

1.3. Метод определения (учета) численности клеток бактерий в

почве микрокопированием разведений почвенной суспензии
Данные, необходимые для определения параметра ЗП можно
получить и методом учета микроорганизмов под микроскопом. Уже
отмечалось (см. в начале гл. 1), что этот метод имеет ряд сложностей и
ограничений. Помимо трудоемкости метода, при использовании самого
простого подхода к учету клеток бактерий в почвенной суспензии,
учитываются все клетки: живые, активные; живые, но не активные,
например, переживающие (не размножающиеся, но жизнеспособные
клетки получили название некультивируемых форм бактерий (НФБ));
мертвые, но все еще интактные клетки. Для определения здоровья
почвы, конечно значимы только живые и активные организмы. Если
использовать дифференцирующие красители, например, «live - dead kit»,
то все равно в учтенные организмы попадут живые, но малоактивные
или не активные, переживающие (время и место!) клетки, что
может привести к существенным заблуждениям. Опытами автора
было проведено сравнение учета бактерий под люминесцентным
микроскопом с использованием люминесцентных красителей
Fluorescein isothioceanate (FITC) - выявление всех интактных клеток
прокариот и Fluorescein diacetate (FDA) или 5-Sulfofluorescein diacetate
(SFDA) - выявление физиологически активных прокариот. Обнаружено,
что лишь ~ 10% выявляются при окрашивании с помощью FDA или SFDA,
по сравнению с количеством, выявляемым с помощью FITC. Другими
словами, определение численности клеток бактерий в почве методом
микрокопирования разведений почвенной суспензии не рекомендуется
к использованию для метода определения параметра здоровья почвы.
Детальное описание оборудования и реактивов, приготовление
красителей, процедура окрашивания, подсчет и расчет количества
клеток в почвенном образце приведено в методическом пособии (14).

13
 ГЛАВА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПОЧВЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ

Наблюдение и количественное определение активности

микроорганизмов, обитающих в почвенной экосистеме можно
осуществлять несколькими методами. Эти методы также и тоже
имеют свои ограничения в их применимости, специфичности
и чувствительности. Известны методы более общие и более
специфические, групповые. Например, известны методы определения
микробной активности при разложении в почве (микробным
сообществом почвы) разных полимеров, а типы активностей называют:
целлюлозолитической, протеолитической, нуклеазой, хитиназной и
др. активностями. Известны методы определения метаногенной и
метанотрофной активностей, сульфат редуцирующей активности и т.д.
Однако для определения наиболее общей активности
гетеротрофных, мезофильных, аэробных прокариотических и
эукариотических микроорганизмов наиболее часто используют
метод измерения дыхательной (окислительной) активности.
Так как часто для стимуляции дыхательной активности вносят в
местообитание микроорганизмов какой-то субстрат, что повышает
«порог» чувствительности метода определения, этот метод получил
аббревиатуру - СИД - субстрат индуцированное дыхание.
Методически дыхательную активность определяют и рассчитывают
по количеству поглощаемого кислорода или по количеству
выделяемого углекислого газа (СО2). Между количеством поглощенного
О2 или выделяемого СО2 для большинства известных органических
субстратов уже рассчитаны стехиометрические соотношения.
Благодаря развитию хроматографической техники, миниатюризации
и ее высокой чувствительности, метод количественного определения
СО2, выделяемого почвенными образцами, получил повсеместное
распространение (8, 9, 13, http://bankpatentov.ru/node/62779).
В настоящем пособие мы ограничимся рассмотрением активности
почвенного микробного сообщества методом количественного
определения СО2, выделяемого почвенными образцами после
инициации дыхания нарушающим воздействием - внесением в
почвенные образцы раствора глюкозы (12).

2.1. Определение активности почвенных микроорганизмов

методом субстрат индуцированного дыхания (СИД)
газоаналитическим (хроматографическим) методом
Активность микроорганизмов - это динамическая величина и протекает
в пространстве и во времени. Поэтому расчет активности микроорганизмов
включает такие размерности, как время и «материя» (объем, вес).

14
 [1]. При определении любого типа активности почвенных
микроорганизмов требуется использовать максимально свежие
образцы почвы. Образцы, длительное время (даже несколько недель)
хранившиеся в сухом состоянии не пригодны для определения здоровья
почвы. Потому что, некоторое количество из наиболее «активной»
части МС может уже погибнуть, а сохранившая жизнеспособность часть
МС может существенно отличаться от исходного МС, что, несомненно,
отразится на активности микроорганизмов.
[2]. Так как отобранные образцы могут иметь разную исходную
влажность, что оказывает влияние на физиологическое состояние
почвенных микробных сообществ образцы, рекомендуется подсушить
на воздухе (не пересушить!). Для этого следует рассыпать почву на
чистую сухую поверхность очень тонким слоем, подсушить без прямого
солнечного света, без принудительного вентилирования, прикрыв
большими чистыми бумажными салфетками. При температуре
«комфорта» такая процедура займет несколько часов (~ 2 - 5 час).
Процедура подсушивания полезна и при транспортировке образцов к
месту анализа.
[3]. Провести с отобранными образцами их подготовку, как это
описано в разделе 1.1. пособия, т.е. перемешивание, просев через сито,
определение влажности (весовой) и др.
[4]. Перед определением ЗП, для активизации микроорганизмов
образцы почвы нужно увлажнить. Многочисленные опыты показали, что
проводить увлажнение нужно не просто стерильной дистиллированной
водой, а низкой концентрацией раствора глюкозы - 0,5 мг/г почвы.
Объем такого глюкозного раствора для увлажнения образца почвы,
подбирается так, чтобы конечное значение весовой влажности образцов
почвы для определения СИД не превышала 18 - 20%.
Пример, если влажность образцов почвы, после подсушивания
составляла 5 %. Для получения конечного значения весовой влажности
этой почвы, например, 20 % нужно внести 0,15 мл жидкости в каждый
грамм почвы. При этом во вносимом объеме - 0.15 мл/г должно,
содержатся такое количество глюкозы, чтобы конечная концентрация
глюкозы в 1 г почвы была равной 0,5 мг/г., следовательно, при
использовании 100 г образца нужно приготовить соответствующий
объем раствора глюкозы. Увлажнение почвы рекомендуется проводить
в чистом полиэтиленовом пакете. После внесения в почву влаги, закрыть
пакет и встряхиваниями тщательно перемешать образец. Увлажненные
и активированные почвы сразу закрывают полиэтиленовой пленкой
(пищевой, «saran wrap») для предотвращения высыхания.
[5]. Почву фасуют в чистые сухие флаконы («пенициллинового
типа») с таким объемом флакона, чтобы после внесения почвы
объем воздушного пространства над почвой составлял не менее
трех объемов, занимаемого почвой. Например, если будет внесено
15
по 5 г почвы во флакон, общий объем флакона должен быть не
менее 15 мл. Предварительно флаконы маркируют с обозначением
вариантов вносимой почвы. Процедуры взвешивания почвы, фасовку,
производить максимально быстро. После внесения почвы во флакон
его сразу закрывают полиэтиленовой пленкой (пищевой, «saran wrap»)
для предотвращения высыхания.
[6]. Заполненные почвой флаконы помещают в термостат с
постоянной температурой например, 22±1ºС [на 2 - 4 часа] для
выравнивания температуры почвы во флаконах. Время выдерживания
флаконов в термостате, которое зависит от анализируемых почв и
количества почвы во флаконе, определяем экспериментально.
[7]. Готовят к работе газоанализатор, например, газовый
хроматограф для определения концентрации (потока) СО2.
Заметим, что проточные газоанализаторы не рекомендуются к
использованию для определения потоков СО2 в методе определения
здоровья почвы в силу постоянного дополнительного внешнего
воздействия на микробное сообщество почвы (аэрирование почвы!).
[8]. После некоторого выдерживания флаконов с почвой в термостате,
флаконы изымают из термостата, удаляют полиэтиленовую пленку и
оставляют ~ 10 или 15 мин для проветривания от накопившегося под
пленкой СО2.
[9]. После проветривания, плотно закрывают флаконы резиновыми
(не проницаемые для СО2, но легко прокалываемые иглами одноразовых
шприцов) пробками. Для уменьшения погрешностей при измерении
концентраций СО2 очень желательно выдерживать флаконы, как
открытыми и особенно закрытые пробками равное, выбранное время,
например, один час. Для этого рекомендуется помещать флаконы,
закрытые пробками в термостат поочередно, с необходимыми равными
интервалами, используя нумерацию флаконов, чтобы и изымать
для замеров СО2 тоже поочередно по истечении, ровно одного часа,
нахождения флаконов на инкубации.
[10]. Из флаконов закрытых пробками поочередно шприцем
объемом 1 или 2 мл, отбирают газовую пробу объемом 1 мл. Для этого,
вводят иглу шприца в газовое пространство под крышкой флакона,
держа поршень шприца в крайнем, нулевом положении, придерживая
поршень шприца пальцами руки. Конец иглы шприца, рекомендуется
вводить в газовое пространство под крышкой флакона на ~ 1 - 1,5 см
от внутренней поверхности крышки, но и от поверхности почвы.
Плавным подъемом поршня шприца вверх до конца делений на шприце
забирают газовую фазу. Не вынимая иглу шприца из флакона, плавным
движением поршня шприца вниз до упора, выдавливают газовую фазу
во флакон, производя перемешивание фазовой фазы. Для более полного
перемешивания газовой фазы во флаконе эту процедуру повторяют

16
еще два (три) раза, После завершения перемешивания газовой фазы во
флаконе над почвой, производят отбор пробы для анализа.
[11]. Набрав в шприц газовую пробу, аккуратно изымают иглу из
крышки флакона, придерживая поршень шприца пальцами руки и
сразу переворачивают шприц иглой вверх для уменьшения возможной
утечки газа. Устанавливают поршень шприца максимально точно на
отметке 1 мл, вводят иглу шприца в газовый анализатор и равномерно,
но энергично выдавливают газовую пробу в анализатор до упора
поршня. Энергично изымают иглу шприца из анализатора, и, проследив
на мониторе или на ленте самописца завершение процесса анализа
введенной пробы, повторяют процедуру с этой же почвенной пробой
еще не менее 2-х раз, т.е. анализ каждой почвенной пробы - минимум
троекратный, а на каждую почвенную пробу готовят три флакона – то
есть, проверяют троекратно. На ленте самописца делают необходимые
отметки (дату, время, № образца почвы и др.).
Отметим, что вышеописанная последовательность процедуры
определения СИД почвы относится к самому первому этапу или
нулевой процедуре анализа каждого образца почвы. Последующая
процедура анализа состоит из двух фаз. Первая фаза (I) - определение
концентрации (скорости эмиссии) СО2 из образцов почвы во флаконах,
закрытыми крышками до их инкубации (часовой!) в термостате. Вторая
(II) - определение концентрации (скорости эмиссии) СО2 образцами
после часовой инкубации в термостате с закрытыми крышками на всех
флаконах.
[12]. После завершения определения концентрации СО2 во всех
флаконах (т.е., выполнения двух фаз), снимают резиновые крышки с
флаконов, проветривают флаконы до 15 мин, тщательно покрывают
пищевой пленкой и помещают в термостат до следующего измерения
СО2., т.е. через сутки. Для определения параметра здоровья почвы,
определение динамики количества выделяемого СО2 за час инкубации
образцов почвы во флаконах, закрытых крышками повторяется раз в
день, каждый день, в одно и тоже время в течение 4 -5 дней.
[13]. Производят расчет концентрации СО2 в виде нг С-СО2 /
ч*г сухой почвы для проб, отобранных до их часовой инкубации
с закрытой крышкой на всех флаконах и концентрации СО2 после
часовой инкубации с закрытой крышкой на всех флаконах. Если
определение СО2 проводится на традиционных хроматографах с
ленточными самописцами, измеряют линейкой высоту пиков выхода
СО2 на ленте самописца и вносят цифровые значения в файл Excel, в
таблицы. В файл Excel, в таблицы, заносят и все другие результаты,
например, касающиеся определения влажности почвенных образцов,
количественные результаты калибрования прибора с разными
концентрациями СО2 и др.

17
 Предлагается следующий порядок построения и заполнения таблиц
в файле Excel, который апробирован экспериментально и позволил
автору оперировать с большим массивом данных.
Колонки файле Excel для данных проб СО2, отобранных до часовой
инкубации с закрытой крышкой на всех флаконах и такой же порядок
колонок для результатов после часовой инкубации с закрытой
крышкой для всех флаконов располагаются в следующем порядке. [1]
№ образца; [2] М - «множитель» (числовой коэффициент), отражающих
чувствительность прибора; [3] L - высота пика СО2 на ленте, мм; [4] V
- газовая фазы во флаконе над почвой, см3; [5] t - время инкубации,
час; [6] m - массы почвы, сухой, г.; [7] К - числовой коэффициент для
пересчета высоты пика СО2 (мм) на ленте в концентрация СО2, %
согласно калибрования прибора; [8] СО2, % концентрация объемная; [9]
V - эмиссия СО2, мкг С-СО2/час* г. сухой почвы.
[14] Производят расчет потока СО2, выделившегося из исследуемых
образцов почвы за час инкубации путем вычитания из результатов,
полученных после часового инкубирования флаконов с закрытыми
крышками, результатов, полученных до часового инкубирования
флаконов с закрытыми крышками. Рекомендуется «распространить»
формулу расчета V эмиссии СО2 в строке колонки [9] на всю колонку,
чтобы при постепенном внесении результатов, вычисления
количества эмиссия СО2, мкг С-СО2/час* г. сухой почвы происходили
«автоматически».
Источники погрешностей, возникающие при определении
концентрации СО2 в образцах почвы: объем и вес используемой почвы,
влажность почвы, условия инкубации образцов (температура), время
инкубации, отбираемый объем газовой пробы, качество анализатора,
индивидуальные особенности оператора.

Необходимые реактивы и оборудование.

1. Дистиллированная стерильная вода.
2. Раствор глюкозы.
3. Газовый хроматограф, или другой анализатор, например,
инфракрасный анализатор с чувствительностью к СО2 не ниже
концентрации СО2 в окружающем атмосферном воздухе (~ 300 ppm).
4. Набор калибровочных газов (СО2) для анализаторов.
5. Флаконы объемом не менее 10 - 15 мл, (традиционно
пенициллиновые), закрывающиеся резиновыми (не проницаемые
для СО2) пробками, но легко прокалываемые иглами шприцов.
6. Шприцы на 1 - 2 мл.
7. Полиэтиленовая (пищевая, «saran wrap») пленка.
8. Весы технические.
9. Маркер.
10. Компьютер с соответствующим программным обеспечением.
18
 ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРА ЗДОРОВЬЯ ПОЧВЫ
НА ОСНОВАНИИ ЧИСЛЕННОСТИ КОЕ ИЛИ СИД

Категория здоровье - биологическая категория, применимая

только к живому, - категория динамическая. В медицине категория
«здоровье», характеризуется перечнем установленных качественно-
количественных показателей и стандартов. Для микробного
сообщества в почве также правомерна такая категория, как здоровье.
Осознание необходимости введения такой категории, как здоровье
для почвенной экосистемы возникло совсем недавно а, следовательно,
и оценки качественно-количественных показателей, характеристик,
стандартов и параметров здоровья почвы нуждаются в дальнейшей
разработке. Образцом такой разработки, является приводимый ниже
способ определения параметра здоровья у образцов почвы, компостов
и других твердых субстратов (9, 10, 11, 12, 13).

3.1. Специфические требования к состоянию почвенных образцов и

процессу проведения анализа при определении параметра здоровья почвы
При определении здоровья почвы непременным условием
является соблюдение требований к состоянию почвенных образцов
и процессу проведения анализа. Ключевыми положениями для
успешного проведения этого метода и получения результатов, является
обязательность выполнения следующих требований (принципов).
1). Сравнение исследуемой почвы с избранной здоровой (условно
эталонной) почвой одного и того же генезиса и территориального
ландшафта (принцип сравнительности). 2). Использование для
определения параметров ЗП только свежеотобранных почвенных
образцов (принцип нативности). 3). Воздействие на почвы адекватного,
одного и того же нарушающего воздействия (принцип инициации
процесса). 4). Проведение динамических наблюдений и определений
(принцип динамичности) (9, 11, 13).
Экспериментально установлено, что любое стрессовое
(нарушающее) воздействие на образцы почвы, компостов и других
твердых субстратов, с последующим определением количества КОЕ
или дыхательной активности при частоте определения не реже чем раз
в день, в одно и тоже время, в течение до 5 дней, проявляется в виде
волнообразной динамики численности КОЕ и дыхательной активности
- СО2. Нарушающие воздействия на образцы почвы, компостов и других
твердых субстратов, могут быть в виде физического (высушивание
- увлажнение, замораживания - оттаивание), или биохимического
воздействия - внесение легкодоступного субстрата, например,
глюкозы, как это в нашем методе. При ежедневном определении
количества КОЕ или измерении дыхательной активности (СО2) т.е.
динамических показателей КОЕ и СО2 во времени, то на графике вид
19
такой кинетической кривой может быть как унимодальным, так и
полимодальным (иметь один пик или несколько) (9).

3.2. Метод определения параметра здоровье почвы по

результатам динамики учета численности КОЕ бактерий
Производить посевы суспензий образцов почв, рекомендуется
«парами» студентов. Так как посевы следует проводить не менее 4-х
дней, то проводить посевы образцов и учет результатов следует по
очереди – для избегания системной ошибки.
Состав и приготовление среды для выращивания бактерий с
получением колоний образующих единиц (КОЕ) описано в разделе
1.2.1. Количество среды готовят исходя из количества анализируемых
образцов почвы, продолжительности анализа каждого образца (4 - 5
дней, раз/день) и количества студентов. Порядок проведения посева
почвенной суспензии на агаризованную среду проводят согласно
описанию в разделе 1.2.2. Подсчет КОЕ осуществляют согласно
описанию в разделе 1.2.3.
Если определение количества КОЕ проводили в разных почвах, а
суспензии приготавливали хотя бы один раз в день из каждого образца
почв, то будут получены ежедневные, динамические результаты. Такие
данные, полученные при определении количества КОЕ из разных, хотя
бы двух образцов почвы, например, контрольной и анализируемой,
в течение избранного промежутка времени, например, 4 - 5 дней и

Динамика КОЕ бактерий в загрязненных почвах

после НВ (0,5 мг гл. /г с. почвы) и расчет
параметра
[ЗП=|(Lc - Le)/Lc|]

8,00E+08
ЗП=|(Lп0 - Lп2)/Lп2|
6,00E+08
КОЕ/ г с.п.

4,00E+08
Пестицид Low
2,00E+08 (1)
Пестицид High
0,00E+00 (2)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Контроль
3,5 4 (0) 4,5
Время, дни

Рис. 1. Динамика КОЕ бактерий в загрязнённых почвах после нарушающего

воздействия в виде 0,5 мг глюкозы/г с.п. и расчет параметра здоровья почвы

20
рассчитанные в виде количества КОЕ/ г. сухой почвы, записывают в
отдельную колонку напротив колонки с данными времени определения
количества КОЕ/ г. сухой почвы с размерностью - дни. На основании
таких результатов следует построить графики зависимости количества
КОЕ/ г. сухой почвы от времени, в днях. Такие графики позволят
рассчитать параметр здоровья почвы (рис. 1).
Рекомендуется, полученный график напечатать странице размером
M4, произвести необходимые промеры кривых, ширину кривых на их
полувысоте (L), т.е. для исследуемой почвы и контрольной (здоровой).
Рассчитать параметр здоровья почвы по формуле: ЗП = | (Lc-LE)/Lc |.
Параметр рассчитывают по абсолютной величине (рис. 1). Более
детальное описание расчета ЗП приведено ниже, в разделе 3.3.

3.3. Метод определения параметра здоровье почвы по

результатам динамики СИД
Производить подготовку образцов почв для определения параметра
здоровье почвы по результатам динамики учета потока СО2,
рекомендуется «парами» студентов. Так как измерять динамику потоков
СО2 нужно проводить не менее 4-х дней, то проводить замеры и учет
результатов следует по очереди, чтобы избежать системной ошибки.
Определение потока СО2 следует проводить одновременно для разных
почв, один раз в день для всех образцов почв, как это описано в разделах: 1.1.
и 2.1., для получения ежедневных, динамических результаты. Такие данные,
полученные для двух почв, например, контрольной и анализируемой, в
течение избранного промежутка времени, например, в течение 4 - 5 дней и
рассчитанные в виде количества мкг С-СО2/час* г. сухой почвы, записывают в
Динамика СО2 почв после НВ (0,5 мг гл /г с.п.) и
расчет параметра [ЗП=|(Lc - Le)/Lc|]

2400
2100 Почва 1 (минеральная)
нг С-СО2 /ч * г с.п

1800 Почва 2 (органическая)

1500
1200
900
ЗП=|(Lп2 - Lп1)/Lп2|
600
ЗП=|(1,4 - 1,35)/1,4|=0,04
300
0
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00
Время, дни

Рис. 2. Динамика СИД микроорганизмов в почвах после нарушающего воз-

действия в виде 0,5 мг глюкозы/г с.п. и расчет параметра здоровья почвы.
21
отдельную колонку файле Excel, например, в следующую за колонкой с данными
определения количества КОЕ/ г. сухой почвы, временная размерность - дни.
На основании таких результатов необходимо построить графики зависимости
количества мкг С-СО2/час* г. сухой почвы от времени в днях (рис. 2).
Расчета параметра здоровья почвы проводят по формуле: ЗП=|(Lc-
Le)/Lc| где, в числителе находится разность между цифровым значением
контрольного образца, полученного измерением ширины максимального
по амплитуде пика на его полувысоте [Lc] и таких же характеристик
исследуемого образца [Le]. Исследуемый образец считается более здоровым,
чем меньше он (в численном выражении) отличается от нулевого значения
модуля дроби, полученных для контрольного образца.

3.4. Описание определения параметра здоровья почвы,

представленного в патенте №2408885: “Способ определения параметра
здоровья у образцов почвы, компостов и других твердых субстратов” (9)
Определения параметра здоровья проводится у образцов почвы,
которые по своей консистенции должны быть твердыми. Каждая
повторность каждого образца, должны быть по своему количеству (весу)
не менее 5 грамм, но желательно и не более 100 г. С учетом требований,
приведенных в разделе 3.1. виде принципов, должны быть использованы,
как минимум два типа образцов почв, один тип - исследуемая, другой -
контрольная, и все образцы почвы, подвергаются нарушающему
(стрессовому) воздействию. Нарушающее (стрессовое) воздействие
на образцы почвы, исследуемые и контрольные, следует проводить
в виде внесение раствора глюкозы в концентрации 0,5 мг/г почвы, с
предварительно установленной (весовой) влажностью почвы около 18%.
Рекомендуется проводить нарушающее воздействие на используемые
образцы почвы одновременно, до деления их на повторности. Следует
вносить такой объем раствора глюкозы, чтобы конечная влажность
используемых образцов почвы оказалась не более 20% (что составит
внесение 1 мл раствора в 5 г сухой почвы). Последующее измерение
и сравнение ответной реакции используемых образцов почвы на
стрессовое воздействие проводят или в виде определения количества
КОЕ бактерий согласно методике, приведенной ранее или в виде
измерения скорости (V) выделения углекислого газа (СО2). Для измерения
и сравнения ответной реакции, используемых образцов почвы на
стрессовое воздействие в виде измерения скорости (V) выделения СО2
все используемые в экспериментах образцы инкубируют в термостате
при температуре 25оС. После выполнения всех описанных выше
требований строят графические зависимости V от времени, прошедшего
с момента стрессового воздействия на образцы (T), и сравнивают ширину
максимальных по амплитуде пиков на их полувысоте.
Экспериментально было установлено, что любое стрессовое
воздействие на образцы почвы, компостов и других твердых субстратов
22
вызывает появление волнообразной динамики на зависимости
V от T, причем вид данной кинетической кривой может быть как
унимодальным, так и полимодальным. В отсутствие стрессового
воздействия на образцы динамики значений V могут любыми другими
с учетом точности ее определения.
Здоровая почва, характеризуется сбалансированным
биоразнообразием и оптимальной численностью функциональных
групп, обитающих в ней микроорганизмов и способна активно
противодействовать различным стрессовым воздействиям на нее. В этой
связи сравнение амплитуд максимальных пиков на зависимости V от T у
контрольного (условно здоровой почвы) и исследуемых образцов является
информативным. При этом принимается, что если у исследуемого
образца амплитуда максимального пика превышает соответствующую
амплитуду пика контрольного образца, считаемого здоровым, то это
может свидетельствовать о том, что состав микробного сообщества
в исследуемом образце не сбалансирован, т.е. у исследуемой почвы
есть проблемы со здоровьем. Если у исследуемого образца амплитуда
максимального пика не достигает амплитуды пика контрольного образца,
то это говорит о том, что микробное сообщество в исследуемом образце
или недостаточно обильно или недостаточно активно, т.е. супрессировано
каким-либо неизвестным фактором. В обоих случаях почва нездорова.
Показателем состояния микробного сообщества может являться учет
периода времени, прошедшего с момента появления возрастающего
пика до затухания максимального по амплитуде пика в вышеописанной
колебательной динамике выделения СО2 у исследуемого и контрольного
образца после стрессового воздействия на них (t). Если t у исследуемого
образца превышает t у контрольного (здорового) образца, это может
свидетельствовать о том, что микробное сообщество в исследуемом
образце недостаточно активно (супрессировано каким-либо неизвестным
фактором). Если t у исследуемого образца меньше t контрольного образца,
то это может говорить о том, что микробное сообщество такого образца
несбалансированно по численности и разнообразию. Как в первом, так и
во втором случае исследуемая почва должна рассматривается не здоровой.
Для повышения эффективности процесса определения параметра
ЗП предлагается одновременно учитывать значение амплитуды (высоту
пикой), и значение t (ширину пиков) в параметр здоровья. Необходимо
сравнивать у исследуемого и контрольного образца (здорового),
ширину максимального по амплитуде пика на его полувысоте на
графике зависимости V от T.
Возрастание скорости выделения СО2 образцами почв в качестве ответной
реакции образцов на стрессовое воздействие, как и увеличение численности
КОЕ позволяет учесть вклад именно биологической составляющей в ЗП,
поскольку увеличение численности КОЕ, как и выделение СО2, обусловлено
только жизнедеятельностью организмов, обитающих в этих образцах.
23
 Сравнение параметров максимальных по амплитуде
вышеназванных пиков обусловлено тем, что это позволяет учесть
наиболее активные, наибольшие по численности и, следовательно,
наиболее значимые микробные популяции в исследуемых образцах
почвы, которые и определяют ЗП.
В случае полимодальной графической зависимости V от T на
кинетической кривой при необходимости проводят экстраполяционное
разделение максимального по амплитуде пика от остальных
пиков, которые осуществляют традиционными для таких случаев
математическими методами.
Итак, как было сказано, образец считается тем более здоровым,
чем меньше отличается от нуля значение модуля следующей дроби:
т.е., ЗП=|(Lc - Le)/Lc|. В числителе такой дроби находится разность
между шириной максимального по амплитуде пика на его полувысоте у
контрольного образца [Lc] и у исследуемого образца [Le]. В знаменателе
находится ширина пика на его полувысоте у контрольного образца
[Lc]. Тем самым удается получить безразмерный и достаточно
информативный параметр, отражающий величину ЗП. Ввиду того,
что ширина вышеназванного пика на его полувысоте у исследуемого
образца может, как превышать ширину пика на полувысоте у
контрольного образца, так и быть равной или быть меньше ее,
необходимо использовать именно модуль вышеназванной дроби.
Использование модуля вышеуказанной дроби, а не просто модуля
разницы между шириной вышеназванных пиков на их полувысоте,
дает возможность устранить размерность у параметра ЗП. Такой
подход, позволяет получать и сравнивать просто цифровые значения
состояния ЗП у исследуемого и контрольного образцов.
Необходимость дополнительного построения графической зависимости
обусловлено тем, что только графическое изображение позволяет
определять вышеназванную разность в ширине пиков на их полувысоте
у различных образцов, а данные по зависимости V от T, представленные,
например, только в виде таблицы, такой возможности не дают.
На основе экспериментальных данных предложена следующая шкала
предварительной оценки полученных значений ЗП. Если у исследуемого
образца предлагаемый параметр ЗП оказывается в интервале от 0 до 0,1, то
образец считается здоровым. Если параметр ЗП превышает 0,1, но меньше
0,2, то образец считается практически здоровым. Если параметр ЗП
превышает 0,2, но меньше 0,4, то образец, считается умеренно нездоров.
При больших значениях параметра ЗП образец нездоров.
В заключение работы каждый студент представляет отчет по теме
исследования, который должен включать - обзор литературы, цель
работы, описание методов, представление и обсуждение полученных
резудьтатов, выводы, список использованной литературы.

24
 СОДЕРЖАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМИНОВ И
СОКРАЩЕНИЙ

* Биота — собирательное обозначение всего живого от микроскопи-

ческого до макроскопического, обитающего в почвенных экоси-
стемах, в почве и на почве.
* Биофильные элементы — условное, собирательное обозначение
тех минеральных элементов, которые нужны всему живому в
макроколичествах, и в первую очередь это азот, фосфор, калий, а
также натрий, сера, магний, железо и другие элементы, согласно их
количественному содержанию в клетках про- и эвкариот.
* Биогеохимические циклы элементов – под этим подразумевается в
первую очередь биосферный оборот таких элементов как углерод,
азот, фосфор, сера, железо и некоторых других.
* Здоровья почвы — см. полное определение в тексте.
* КОЕ — колонии образующие единицы, используются при количе-
ственном учете микроорганизмов (бактерий и микромицетов).
* Питательные среды — в традиционном понимании это среды
для выращивания гетеротрофных микроорганизмов, богатые
органическим углеродом, содержащие от сотен миллиграмм до
многих десятков грамм органического углерода в литре.
* Почвенный образец — минимально необходимое количество
почвы для осуществления соответствующих анализов, отобранное
из почвенной экосистемы (ПЭ) с указанием места, даты и времени
отбора, количества образца и типа тары.
* Почвенная экосистема — см. полное определение в тексте.
* Олиготрофные питательные среды — среды для выращивания
микроорганизмов, содержащие не более 200 мг органического
углерода в литре.
* СИД — субстрат индуцированное дыхание.
* Цикл микроорганизмов — под этим подразумевается способность
многих бактерий и грибов выживать и проявлять активность
при перемещении из одного субстрата или экониши в другие
субстраты/экониши, в первую очередь из почвы на (в) растения, на
(в) животных, с экскрементами животных опять в почву или воду,
таким образом, совершая серию перемещений в виде цикла.

25
 ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ ОБУЧАЮЩИХСЯ

1. Почему, для чего и кому нужна информация о количестве и

активности микроорганизмов в экосистемах, в почве?
2. Какое из перечисленных понятий: микробное сообщество,
почвенная экосистема, почва - микробиологически, экологически
более широкое?
3. Что есть питательные среды для микроорганизмов? Указать их
универсальность и ограниченность.
4. Адекватно ли применять к почве понятие - здоровье?
5. Зачем и как проводят подготовку почвы, почвенные образцы к
микробиологическому анализу?
6. Перечислить методы определения общего количества
микроорганизмов в образцах почвы.
7. Методы определения общего количества бактерий в образцах почвы.
8. Метод определения численности бактерий в почвенной экосистеме
в виде количества колоний образующих единиц (КОЕ), объективен
ли этот метод?
9. Методы определения количества жизнеспособных (активных)
бактерий в образцах почвы.
10. Методы определения общей активности микроорганизмов, в
экосистемах, в образцах почвы.
11. Методы определения дыхания микроорганизмов в образцах почвы,
12. Правила отбора газовой пробы при определении дыхания
микроорганизмов в образцах почвы.
13. Методы определения СИД микроорганизмов в образцах почвы.
14. Почему для определения здоровья почвы проводят динамические
наблюдения?

26
 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Очевидно, что активность почвенной экосистемы – разнообразна, и

определение активности можно и нужно, оценивать разными подходами
и методами. Однако настоящее пособие не преследует цели, собрать и дать
все известное многообразие методов определения активности почвенной
экосистем, а только обосновывает главенство никоторых из них и затем
дает четкое описание наиболее простых и эффективных методов. В
связи с этим в пособии приведены современные представления о почве,
почвенной экосистеме и здоровье почвы. В пособии обосновывается
объективность и уместность использования учета и подсчета
микроорганизмов методом посева на питательные среды, приводиться
детальное описание последовательности процедур проведения посева
почвенной суспензии на агаризованную среду. В пособие представлено
обоснование объективности и адекватности использования определения
биологической активности ПЭ методом СИД.
Настоящее пособие ориентирует студентов на выполнение четкой
научно-практической задачи - учету и подсчету микроорганизмов и
их активности с целью определения новой характеристики почвенной
экосистемы - здоровье почвы. В пособии вводится и обосновывается
очевидное, но по существу редко употребляемое понятие - почвенная
экосистема вместо традиционного термина - почва. С введением
понятия - почвенная экосистема, получает более содержательное
обоснование и понятие - микробное сообщество, которым только и может
быть представлена биологическая составляющая функционирующей
почвенной экосистеме.
В соответствии с тенденциями современной методики образования,
настоящее пособие ставит целью формирование практического интереса
у студентов. Отсутствие практической задачи и получение формальных,
не имеющих практической значимости результатов, подавляет интерес и,
следовательно, вызывает у студентов формальное отношение к обучению.
Творческий интерес у студентов при их обучении определению количества
и активности микроорганизмов вызовет введение в задание четкой
практической цели, а именно, расчета на основе полученных результатов
параметра ЗП, позволит придать целенаправленность работе. Сохранение
и накопление преподавателями, результатов, полученных на таких
занятий, приведет к накоплению важных и нужные научных результатов,
необходимых для создания «банка» данных о микробной активности
почвы, почвенных экосистем.
По существу, этим методическим пособием предлагается
студентам, проведение краткого исследования почвенной экосистемы,
где на основе микробиологических процессов и с помощью методов
определяется параметр «здоровья почвенной экосистемы». Настоящее
пособие не является повторение методик, описанных в практикумах для
27
микробиологов. Содержание, структура и даже стиль пособия является
современным и оригинальным. Пособие обучает и воспитает не просто
оператора, а специалиста для диагностирования здоровья самой
сложной экологической системы, традиционно называемой - почва.
Настоящее методическое пособие по существу, подводит обучаемого и
к понятию диагностики почвенной экосистемы, так как определение
здоровья переходит в оценку здоровья, а диагноз и есть важнейшая
составляющая оценки здоровья.

28
 ЛИТЕРАТУРА

1. Звягинцев Д.Г., Асеева И.В., Бабьева И.П., Мирчинк Т.Г. Методы

почвенной микробиологи и биохимии. М.. Изд. МГУ. 1980. 224 с.
2. Куприянов А.А., Семенов А.М., Ван Бругген А.Х.К.. 2010.
Перемещение энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в цикле
экониш: животные – экскременты – почва – растения – животные. Изв.
Ак. Наук. Сер. биол. № 3. С.318-323.
3. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф. Герхарда и др. В 3-х
томах. Т. 1. М. Мир. 1983. 536 с.
4. Методическое руководство к лабораторно-практическим
занятиям по микробиологии. Коллектив авторов. Часть III. М. ТСХА.
1977. 48 с.
5. Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова. Учебное
пособие. М. МГУ. 1976. 307 с.
6. Практикум по микробиологии. Коллектив авторов. Учебное
пособие. М. «Академия». 2005. 608 с.
7. Семёнов А.М. 2011. Фундаментальные законы экологии в
разработке способов определения здоровья почвы. В материалах
Всероссийской научной конференции, «Биосфера – почвы –
человечество: устойчивость и развитие», посвященной 80-летию
профессора А.Н. Тюрюканова. М., 14-16 марта 2011 г. Фонд «Инфосфера»
- НИА- Природа. 2011. с. 371-381.
8. Семенов А.М., Ван Бругген А.Х.К., Бубнов И.А., Семенова Е.В.
2009. Система для количественного определения эмиссии газов из
образцов почвы, компостов и других твердых субстратов. Патент №
90212. РФ 27.12.2009. www.freepm.ru/Models/90212
9. Семенов А.М., Ван Бругген А.Х.К., Бубнов И.А., Семенова Е.В. 2011.
Способ определения параметра здоровья у образцов почвы, компостов
и других твердых субстратов. Патент № 2408885 РФ 10.01.2011. . http://
bankpatentov.ru/node/62779.
10. Семенов А.М., Семенов В.М., Ван Бругген А.Х.К. 2011.
Диагностика здоровья и качества почвы. Агрохимия. № 12. с. 5-20.
11. Семенов А.М., Бубнов И.А., Семенов В.М., Семенова Е.В., Зеленев
В.В., Семенова Н.А. Ежедневная динамика численности бактерий и
эмиссии СО2 почвы и связь их волнообразных колебаний с сукцессией
микробного сообщества. Почвоведение, 2013, № 8, с. 963–979.
12. Семенов А.М., Бубнов И.А., 2013. Определение параметра
здоровья почвы при использовании различных нарушающих
воздействий. Проблемы агрохимии и экологии, 2013, № 3. Стр. 23-30.
13. Семенов А.М, Соколов М.С. Концепция здоровья почвы:
фундаментально - прикладные аспекты обоснования критериев
оценки. Агрохимия. 2016. № 1, с. 3–16.

29
 14. Семенов А.М., Шаталов А.А. 2002. “Флуоресцентно-
микроскопические методы учета микроорганизмов в экологических
исследованиях” Методическое пособие. Москва. МАКС Пресс. 2002. 24 с.
15. Microbiology Manual. (Bachofen R., Siegrist J.). Microbiology
products for general microbiology, food analysis, environmental analysis,
molecular biology and clinical microbiology. 4th Edition. 2015. Sigma –
Aldrich Corporation. St. Louis. USA. 603 p.
16. Semenov, A.M. 1991. Physiological bases of oligotrophy of
microorganisms and concept of microbial community. Microb. Ecol. 22:239-247.
17. Semenov A.M., Van Bruggen A.H.C., Hu. S., Maloney P.E. Dynamics
of different trophic groups of bacteria and soluble carbon and nitrogen after
cover crop incorporation. 97-th General Meet. of the ASM. Miami Beach.
USA. 1997, May 4-8, 1997. p.400.
18 Semenov A.M., van Bruggen A.H.C., Zelenev V.V.1999. Moving waves
of bacterial populations and total organic carbon along roots of wheat.
Microb. Ecol. 37:116-128.
19. Van Bruggen A.H.C., Semenov A.M. Relation between oligotrophic
and copiotrophic bacterial colonies on agar plates and direct microscopic
counts during initial stages of cover crop decomposition in soil. Ninth Int.
Symposium on Microb. Ecol. (ISME-9). Amsterdam, The Netherlands. 2001.
August 26-31, 2001. p.126.
20. Zelenev V.V., van Bruggen A.H.C., Semenov A.M. 2005. Short-term
wave-like dynamics of bacterial populations in response to nutrient input
from fresh plant residues. Microb. Ecol. 49:83-93.

30
 ОГЛАВЛЕНИЕ
АННОТАЦИЯ ..................................................................................................... 1
ВВЕДЕНИЕ .......................................................................................................... 2
ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ И АКТИВНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВЕННОЙ ЭКОСИСТЕМЕ,
АКТУАЛЬНЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ ПОЧВЫ .............. 6
1.1. Отбор почвенных образцов из почвенной экосистемы и
подготовка их к микробиологическому анализу ..............................8
1.2. Метод определения численности бактерий в почвенной
экосистеме в виде количества колоний образующих единиц
(КОЕ) высевом почвенной суспензии на агаризованные среды ......9
1.2.1. Состав и приготовление среды для выращивания бактерий с
получением колоний образующих единиц (КОЕ) ...........................10
1.2.2. Порядок проведения посева почвенной суспензии на
агаризованную среду ........................................................................11
1.2.3. Подсчет КОЕ....................................................................................12
1.3. Метод определения (учета) численности клеток бактерий в почве
микрокопированием разведений почвенной суспензии ...............13
ГЛАВА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПОЧВЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ ............................................................................ 14
2.1. Определение активности почвенных микроорганизмов методом
субстрат индуцированного дыхания (СИД) газоаналитическим
(хроматографическим) методом ......................................................14
ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРА ЗДОРОВЬЯ ПОЧВЫ НА
ОСНОВАНИИ ЧИСЛЕННОСТИ КОЕ ИЛИ СИД ................................ 19
3.1. Специфические требования к состоянию почвенных образцов
и процессу проведения анализа при определении параметра
здоровья почвы..................................................................................19
3.2. Метод определения параметра здоровье почвы по результатам
динамики учета численности КОЕ бактерий ..................................20
3.3. Метод определения параметра здоровье почвы по результатам
динамики СИД ...................................................................................21
3.4. Описание определения параметра здоровья почвы,
представленного в патенте № 2408885: “Способ определения
параметра здоровья у образцов почвы, компостов и других
твердых субстратов” (9) ....................................................................22
СОДЕРЖАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМИНОВ И СОКРАЩЕНИЙ .. 25
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ ОБУЧАЮЩИХСЯ .......................... 26
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................. 27
ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................... 29

31
32