МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

ЕВРАЗИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ
имени Л. Н. ГУМИЛЕВА

Р.М.Турпанова, А.М.Гаджимурадова,
Г.Ж.Исмуканова

ОСНОВЫ
БИОТЕХНОЛОГИИ
Курс лекций для студентов
специальности 5В070100 – «Биотехнология»

Астана, 2017
 УДК
ББК
О-

Рекомендовано к печати Ученым советом Евразийского

национального университета им. Л. Н. Гумилева
От «___» __________2017 г, протокол № ___

Рецензенты:
А. П. Науанова – доктор биологических наук, профессор кафедры
«Почвоведения и агрохимии» КазАТУ им. С. Сейфуллина, г. Астана;
Р.Н.Календарь - кандидат биологических наук, доцент, заведующий
лабораторией геномики растений и биоинформатики РГП «Национальный
центр биотехнологии» КН МОН;
Ж.Ш. Ургалиев – кандидат биологических наук, доцент кафедры
«Биотехнологии и микробиологии» ЕНУ им. Л. Н. Гумилева.

О- Основы биотехнологии: Учеб. пособие / Р.М.Турпанова,

А.М.Гаджимурадова, Г.Ж.Исмуканова– Астана, 2017. – 219 с.

ISBN
Учебное пособие по дисциплине "Основы биотехнологии"
адресованы студентам специальности «Биотехнология» и направлены на
более полное освоение ими современного материала в области
биотехнологии.
В пособии изложен теоретический материал по основным разделам
изучаемого курса: биологические объекты, используемые в биотехнологии,
методы биотехнологии, отдельные темы посвящены отраслевым
биотехнологиям: промышленная биотехнология на основе
микробиологического синтеза, процессы и аппаратура
биотехнологического производства, инженерная энзимология, генная и
клеточная инженерия, экологические аспекты биотехнологии.

УДК
ББК
ISBN

© Р.М. Турпанова,
© А.М. Гаджимурадова,
© Г.Ж. Исмуканова 2017
 Список применяемых в тексте сокращений

TNF - фактор некроза опухоли

АТФ – аденозинтрифосфорная кислота
КПД – коэффициент полезного действия
ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения
ЛП – лекарственные препараты
БАВ – биологически активные вещества
БАП – 6-бензиламинопурин
АК – аминокислота
УАТФ - энергетический коэффициент АТФ
ПАВ – поверхностноактивные вещества
ПЭГ – полиэтиленгликоль
ФЖЭ - ферментеры эжекционные
ФЖС - ферментеры струйные
ФЖСМ - ферментеры с самовсасывающими мешалками
6-АПК – 6-аминопенициллановая кислота
ГК – гибберелловая кислота
2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
ИТФ - изотахофорез
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ИФА – иммуноферментный анализ
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
рДНК – рекомбинантная дезоксирибонуклеиновая кислота
ИМК – индолилмасляная кислота
ИУК – β-индолил-3-уксусная кислота
НУК – α-нафтилуксусная кислота
Кинетин – 6-фурфуриламинопурин
ПС – питательная среда
МКБ – молочнокислые бактерии
MС – питательная среда Мурасиге-Скуга
РНК – рибонуклеиновая кислота
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
ДМСО – диметилсульфоксид
МКА – моноклональные антитела
ДАП – диаминопимелиновая кислота
MEM - minimal essential medium
BME (basal medium, Eagle) – среда Игла
ES(ЭСК) – embryonic stem – эмбриональные стволовые клетки
 Введение

Биотехнология базируется на протекающих в живых системах

физиолого-биохимических процессах, в результате которых
осуществляются выделение энергии, синтез и расщепление продуктов
метаболизма, формирование химических и структурных компонентов
клетки.
Биотехнология – это наука об использовании биологических
процессов в технике и промышленном производстве.
Название ее происходит от греческих слов «bios» – жизнь, «teken» –
искусство, «logos» – слово, учение.
Биотехнология создает возможность получения разнообразных
веществ и соединений из сравнительно дешевых, доступных и
возобновляемых материалов. Сегодня биотехнология – это наука,
промышленность и многомиллионный бизнес.
В конспектах лекционных занятий проанализированы и обобщены
современные технологии биотехнологического производства. Особо
рассмотрены вопросы, касающиеся технологической схемы производства
продукции микробиологического, растительного и животного
происхождения, раскрытие их природы в соответствии с законами
биологии.
Важнейшая цель дисциплины «Основы биотехнологии» - дать
обучающимся посредством теоретических и практических занятий навыки
по основным направлениям современной биотехнологии. В целом учебное
пособие формирует у студентов научное мировоззрение, благодаря
которым он сможет полученные теоретические знания применить в
практической оценке современного состояния исследований по
биотехнологии.
Студентам, желающим углубить знания по биотехнологии, полезно
использовать руководства и монографии по отдельным проблемам
современной биотехнологии, список которых приведен в конце пособия.
Структурно весь материал разбит на 4 раздела. В первом разделе
рассматриваются этапы развития биотехнологии, основные объекты и
методы биотехнологии, во втором основной упор сделан на
технологические аспекты биотехнологического производства метаболитов
на основе микробиологического синтеза, в третьем – рассмотрены
современные методы инженерной энзимологии, клеточной и генной
инженерии, в четвертом освещены прикладные аспекты экологической
биотехнологии.

4
 ТЕМА 1
ПРЕДМЕТ БИОТЕХНОЛОГИИ, ЗАДАЧИ, МЕТОДЫ И
ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ

Биотехнология (в традиционном понимании) – наука о методах и

технологиях производства веществ и продуктов с использованием
природных биологических объектов и процессов, направленной на
производство лекарственных препаратов, ферментов, белков, красителей,
ароматических веществ, витаминов и целого ряда биологически активных
соединений, использовании биотехнологических методов в селекции и
конструировании принципиально новых организмов, ранее не
существовавших в природе.
Биотехнология (современное определение) – это наука о генно-
инженерных и клеточных методах и технологиях создания и
использования генетически трансформированных биологических объектов
для интенсификации производства или получения новых видов продуктов
различного назначения (по В.С. Шевелуха, 2008).
Согласно предложению Международного союза теоретической и
прикладной химии (1981), биотехнология – это «практическое применение
биохимии, микробиологии и химической технологии в промышленных
процессах, создание новой продукции и защита окружающей среды».
Более современное понятие, биотехнология - это управляемое
получение полезных для народного хозяйства, а также медицины целевых
продуктов с помощью биологических агентов: микроорганизмов, вирусов,
клеток животных и растений, а также с помощью внеклеточных веществ и
компонентов клеток.
Основной отличительной особенностью всех биотехнологических
процессов является участие в них живых клеток растений, животных,
микроорганизмов и человека.
Некоторые исследователи подразделяют биотехнологию на
следующие отрасли.
Красная биотехнология – производство лекарственных препаратов
для медицины, коррекция генетического кода человека, лечение
наследственных заболеваний, экстракорпоральное оплодотворение.
Белая (серая) биотехнология – применение биотехнологии в
промышленности, например, получение химических (косметических)
веществ, добыча драгоценных металлов, биодеградация отходов,
производство биотоплива.
Зеленая биотехнология - производство, относящееся к земледелию
и растениеводству. Производство безвирусного семенного материала
картофеля. Создание генетически модифицированных растений.

5
 Голубая биотехнология – производство морепродуктов и водная
(аква) культура. Искусственное выращивание ценных пород рыб, морских
водорослей.
Термин «биотехнология» ввел в 1917г Карл Эрике.
Биотехнология сформировалась на стыке наук: микробиология,
биохимия, молекулярная биология, генетика, органическая, аналитическая
и неорганическая химия, а также включает процессы и аппараты
химической и пищевой промышленности.
Таким образом, биотехнология представляет собой
мультидисциплинарное научно-практическое направление, основанное на
биологических и инженерных подходах.

История биотехнологии (периоды развития)

В истории развития биотехнологии можно выделить несколько

периодов: эмпирический (допастеровский период), научно-практический
(послепастеровский, эра антибиотиков), биотехнологический,
молекулярный (или геннотехнический) и новейший
(нанобиотехнологический).
Эмпирический период (около 6 тыс. л. до н.э. – до 1856 г.). Этот
период характеризуется интуитивным поиском приемов и способов
получения ценных веществ, например: использование спиртового
брожения в производстве пива и вина, молочнокислого брожения – при
переработке молока, уксуснокислого брожения – в производстве уксусной
кислоты, получение хлебопекарных и пивных дрожжей. Во всех
перечисленных процессах использовались биологические объекты (пусть
даже без достаточных знаний о них), и все эти процессы на протяжении
многих лет совершенствовались, правда, эмпирически. Начало этого эмпи-
рического (от греч. «empeirikos» – опытный) или доисторического этапа
биотехнологии теряется в глубине веков, и продолжался он примерно до
конца XIX в.
Археологические раскопки доказывают, что ряд процессов
биотехнологии зародились в древности. На территории древнейших очагов
в Месопотамии, Египте сохранились остатки пекарен, пивоваренных
заводов, сооруженных 4–6 тысячелетий назад.
В 3 тысячелетии до н. э. шумеры изготавливали около двух десятков
сортов пива. В Древней Греции и Риме широкое распространение
получили виноделие и изготовление сыра. В основе пивоварения и
виноделия лежит деятельность дрожжевых грибков, а в сыроделии –
молочнокислых бактерий и сычужного фермента. Получение льняного
волокна происходит с разрушением пектиновых веществ
микроскопическими грибами и бактериями. Иными словами, зарождение
биотехнологии тесно связано с сельским хозяйством, переработкой расте-
ниеводческой и животноводческой продукции.
6
 Работы великого французского ученого Луи Пастера
(1822–1895) заложили фундамент практического использования
достижений микробиологии и биохимии в традиционных биотехнологиях
(пивоварение, виноделие, производство уксуса, консервация продуктов –
пастеризация) и ознаменовали начало нового, научного этиологического
(от греч. «aitia» – причина) периода (1856–1933 гг.) развития
биотехнологии.
Л. Пастер – основоположник научной микробиологии и ее
дисциплин (промышленной, медицинской, химической и санитарной
микробиологии). Он установил микробную природу процессов брожения,
доказал анаэробный путь метаболизма и возможности жизни в
бескислородных условиях, заложил научные основы
вакцинопрофилактики и вакцинотерапии (иммунология), разработал
метод стерилизации (Пастеризация). де Бари – основоположник
микологии, заложил основу современных классификационных схем макро
и микромицетов. Д.И. Ивановский в 1892 г открыл вирус табачной
мозаики, после этого открыты другие вирусы.
Важнейшие достижения данного периода: доказана видовая
индивидуальность микробов; микроорганизмы выделены в чистых
культурах и размножены и выращены на питательных средах для
воспроизведения природных процессов (брожения, окисления и пр.);
начато изготовление пищевых прессованных дрожжей, получены
бактериальные метаболиты (ацетон, бутанол, лимонная и молочная
кислоты), созданы биоустановки для микробиологической очистки
сточных вод.
Третий период в развитии биотехнологии – биотехнический (1933–
1972 гг.). Этот период связан с началом бурного развития биологических
наук: генетики, микробиологии, вирусологии, цитологии, физиологии,
эмбриологии.
В конце 40-х годов XX века, с организацией крупномасштабного
производства антибиотиков (пенициллин), стала развиваться микробиоло-
гическая промышленность. Антибиотики нашли широкое применение не
только в медицине, но и в сельском хозяйстве для лечения животных и
растений, а также в качестве биодобавок в корма.
Были созданы высокоэффективные формы мутантных штаммов
микроорганизмов. Возникли предприятия, на которых с помощью
микроорганизмов производились аминокислоты, витамины, органические
кислоты, ферменты. В конце 60-х годов получила развитие технология
иммобилизованных ферментов.
Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехно-
логического оборудования был отмечен в период становления и развития
производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939–1945 гг.,
когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для
лечения больных с инфицированными ранами). Все прогрессивное
7
в области биологических и технических дисциплин, достигнутое к тому
времени, нашло свое отражение в биотехнологии.
Накопленные научные данные стали побудительным мотивом для
разработки способов крупномасштабного культивирования клеток
различного происхождения. Это было необходимо для получения клеток и
продуктов их жизнедеятельности для нужд человека и, прежде всего,
в качестве или в составе лечебных и профилактических средств:
пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов, декстрана, ряда ами-
нокислот и многих других веществ.
К 1950 г. Ж. Моно (Франция) разработал теоретические основы
непрерывного управляемого культивирования микробов; в 50-е годы
вопросам практической реализации непрерывного культивирования
микроорганизмов посвятили свои исследования М. Стефенсон, И. Малек,
Н. Д. Иерусалимский и др.
Примерно за 40 лет третьего периода были решены основные задачи
по конструированию, созданию и внедрению в практику необходимого
оборудования, в том числе главного из них – биореакторов.
Однако термин «биотехнология» в большей степени ассоциируется с
новым, четвертым, генотехническим (начиная с 1972 по настоящее
время) периодом развития этой науки, начало которому положено в 1973
г., когда Стэнли Коэн и Герберт Бойер получили рекомбинантные
плазмиды и произвели трансформацию ими клеток E.coli. Этот период
характеризуется развитием генной инженерии, которая позволяет целена-
правленно изменять геном микроорганизмов, переносить в него свойства,
заимствованные из растений и животных.
В 1982 г. получен коммерческий генноинженерный человеческий
инсулин. Также были получены генноинженерные препараты:
интерфероны, фактор некроза опухоли (TNF), интерлейкин-2,
соматотропный гормон человека.
К основным достижениям, которые определили развитие генной
инженерии, можно отнести следующие открытия:
1) доказательство в 1944 г. О. Эйвери (в соавторстве) роли ДНК как
носителя генетической информации и открытие в 1953 г. Дж. Уотсоном и
Ф. Криком структуры ДНК;
2) экспериментальное подтверждение универсальности
генетического кода;
3) интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой
стали бактерии Esherichia coli, а также вирусы и плазмидные ДНК;
4) разработка методов выделения и очистки неповрежденных ДНК
вирусов и плазмид, а также методов введения в клетки реципиента
рекомбинантных ДНК, конструируемых in vitro, обеспечивающих
репликацию и экспрессию кодируемых ими генов.
8
 Для генотехнического периода характерно использование
генетической и клеточной инженерии для получения новых продуцентов,
получение моноклональных антител, гибридов и изолированных
протопластов, трансплантация эмбрионов, разработка и внедрение
экологически чистых и безотходных технологий, автоматизация и
компьютеризация промышленного производства биотехнологической
продукции.
Развитие биотехнологии в данный период революционизировало
биологическую науку и дало мощный толчок развитию фармацевтической
промышленности на основе рекомбинантных ДНК.
Появились «трансгенные» микроорганизмы, растения и животные, в
которых осуществлялось целенаправленное конструирование генома.
Пятый период в развитии биотехнологии (начиная с 2000 года по
настоящее время) ознаменовался развитием нанобиотехнологии,
изучающей взаимодействие нанообъектов с живыми системами, получение
наночастиц с использованием биореакторов и применение
бионаноструктур для решения актуальных вопросов медицины, экологии,
сельского хозяйства и других отраслей практической или теоретической
деятельности.
Новые биотехнологии осуществили революционные перевороты,
например: предотвратили деградацию лесов и обеспечили прогрессивное
развитие лесного хозяйства, гарантировали перспективу
горнодобывающей промышленности за счет извлечения металлов из
бедных руд.
Без новейшей биотехнологии невозможны такие экологические
важные процессы, как очистка стоков, ликвидация загрязнений от
использования нефти и нефтепродуктов, рекультивация земель, отказ от
применения в сельском хозяйстве химических удобрений и пестицидов.
В настоящее время наноматериалы используют для изготовления
защитных и светопоглощающих покрытий, спортивного оборудования,
транзисторов, светоиспускающих диодов, топливных элементов, лекарств
и медицинской аппаратуры, материалов для упаковки продуктов питания,
косметики и одежды. Нанопримеси на основе оксида церия уже сейчас
добавляют в дизельное топливо, что позволяет на 4–5% повысить КПД
двигателя и снизить степень загрязнения выхлопных газов.
Общемировые затраты на нанотехнологические проекты превышают
$9 млрд в год. На долю США приходится примерно треть всех мировых
инвестиций в нанотехнологии. Другие главные игроки на этом поле –
Европейский Союз и Япония. Исследования в этой сфере активно ведутся
также в странах СНГ, Австралии, Канаде, Китае, Южной Корее, Израиле,
Сингапуре, Бразилии и Тайване.

9
 Контрольные вопросы

1. Кем и когда был введен термин «биотехнология»?

2. Дайте определение термина биотехнология?
3. Назовите основные этапы развития биотехнологии?
4. На стыке каких наук сформировалась биотехнология?
5. Какие основные задачи решает биотехнология?
6. Основные этапы становления биотехнологии.
7. Дифференциация и специализация биотехнологии.
8. Современные направления биотехнологии и основные проблемы
на решение которых они нацелены?
9. Какой ученый установил, что процессы брожения имеют
микробиологическую природу и каждый вид брожения обусловлен своим
специфическим возбудителем?
10. Кто является основоположником современной генной
инженерии?

ТЕМА 2
БИООБЪЕКТЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Главным звеном биотехнологического процесса, определяющим всю

его сущность, является биологический объект, способный осуществлять
определенную модификацию исходного сырья и образовывать тот или
иной необходимый продукт.
Биообъект – центральный и обязательный элемент
биотехнологического производства, определяющий его специфику.
Биологический объект, способен осуществлять определенную
модификацию исходного сырья и образовывать тот или иной
необходимый продукт.
В качестве таких объектов биотехнологии могут выступать клетки
микроорганизмов, животных и растений, трансгенные животные и
растения, а также многокомпонентные ферментные системы клеток,
отдельные ферменты и биомолекулы. В зависимости от вида объекта
различают микробиотехнологию, фитобиотехнологию и
зообиотехнологию.
Современная биотехнология является преимущественно
микробиотехнологией, так как наиболее часто в качестве ее объектов
применяются микроорганизмы. При определенных условиях они, как
правило, легко размножаются в питательных средах. Относительная
простота строения генетического аппарата и наличие плазмид у бактерий
позволяет использовать их в генной инженерии. Микроскопические грибы,
характеризующиеся высоким разнообразием видов и форм, широко
применяются для производства кормовых добавок, богатых белками и
10
витаминами, а также для получения антибиотиков. В ряде стран из грибов
получают белки пищевого назначения – микопротеины.
В природе существует огромное число микроорганизмов. Все они
способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, которые
могут быть полезны для биотехнологии. Однако практическое применение
нашли не более 100 видов микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи,
вирусы, водоросли), так как остальные мало изучены.
Дрожжи широко используют в хлебопечении, пивоварении,
виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для
выращивания бактерий и культур животных клеток. Из 500 известных видов
дрожжей используется только несколько видов — Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.
Среди бактерий чаще всего применяют в биотехнологии
представителей следующих родов: Acetobacter, которые превращают
этанол в уксусную кислоту и уксусную кислоту в углекислый газ и воду;
Bacillus - для получения ферментов (В. subtilis), средств защиты растений
(В. thuringiensis); Clostridium — для сбраживания cахаров в ацетон, этанол,
бутанол; молочнокислые бактерии (Lactobacillus, Leuconostoc,
Streptococcus); псевдомонады — например Р. glutamatum — для получения
витамина В12, Copynebacterium — для получения аминокислот и др.
Для получения разнообразных антибиотиков в биотехнологии
применяют актиномицеты (род Streptomyces), грибы Penicillium
chrysogenum, Cephalosporium и др.
Многие микроорганизмы — бактерии, дрожжи, вирусы —
используют в качестве реципиентов чужеродного генетического материала
с целью получения рекомбинантных штаммов — продуцентов
биотехнологической продукции. Получены рекомбинантные штаммы Е.
coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены
вируса СПИДа; штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы
дрожжей, продуцирующих интерлейкин-2, антиген вируса гепатита В;
рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита
В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др.
Для получения вакцин и диагностических препаратов используют
также патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии,
столбняка и др.).
Широкое применение в биотехнологии нашли культуры
животных и растительных клеток. Известно, что строе ние,
физиология и биотехнология животных и растительных клеток более
сложны, чем бактериальных клеток. Из культур животных и растительных
клеток можно извлечь более широкий ассортимент сложной и ценной
продукции, однако процесс культивирования растительных и животных
клеток более трудоемкий и дорогостоящий. Из культур тканей растений
можно получать разнообразные соединения, используемые в медицине
(алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и про-
11
тивоопухолевые, противобактериальные, сердечные и почечные средства,
ферменты, витамины, опиаты и др.), сельском хозяйстве, химической и
других отраслях промышленности.
Животные клетки используют как для получения продукции,
синтезируемой клетками, так и для выращивания в клетках вирусов с целью
получения из них вакцин и диагностических препаратов,
высокоэффективных иммуномодуляторов, применяющихся для коррекции
нарушений иммунитета. В настоящее время разработаны способы
промышленного получения противовирусного белка интерферона из
лимфобластов человека и моноклональных антител. Они основаны на том,
что клетки-гибридомы образуются при слиянии лимфобластов человека
(опухолевые клетки, способные к неограниченному росту) и
моноклональных антител (которые вырабатывают лимфоциты). Именно
такие гибридомы и способны синтезировать белок интерферон.
Эмбриональные ткани используются для репродукции вирусов и в
производстве противовирусных вакцин.

Основные методы биотехнологии

К основным методам биотехнологии относят: микробиологический

синтез, генетическая и клеточная инженерия, инженерная энзимология.
Микробиологическим синтезом называется синтез самых
разнообразных веществ с помощью микроорганизмов.
Основные особенности микробиологического синтеза заключаются в
следующем:
1) синтез осуществляется ферментными системами самой клетки и
протекает преимущественно внутриклеточно вне зависимости от
локализации целевого продукта после проведения технологических
операций по его получению;
2) синтез осуществляется из низкомолекулярных предшественников,
которые в ходе реакции, как правило, должны быть активированы;
3) синтез является энергозависимым процессом;
4) пути синтеза связаны с катаболизмом, но могут существенно
отличаться от них и в большинстве своём осуществляются ферментными
системами, специфичными для реакций анаболизма.
В настоящее время микроорганизмы используются в различных
высоких технологиях: для производства антибиотиков, кормового белка и
аминокислот, биологически активных соединений (витаминов, гормонов,
ферментов, стимуляторов роста) и т.д. Превращение одних веществ в
другие с помощью микроорганизмов называется биоконверсия.
При микробиологическом синтезе исходным сырьем служат
разнообразные источники углерода (природные углеводороды,
органические отходы), минеральные соли и атмосферный азот.

12
 В качестве микроорганизмов используются прокариоты (бактерии,
актиномицеты) и грибы.
Развитие микробной биотехнологии началось ранее, чем других
разделов (генетической, клеточной инженерии и инженерной
энзимологии). Этому способствовало в течение тысячелетий применение
метода микробиологической ферментации для получения пищевых
продуктов (уксуса, хлеба, сыра). Первые микробиологические
производства появились в начале XX века – это производство
органических растворителей (метанола, этанола, бутанола и
изопропанола).
Важным этапом было широкое промышленное производство
антибиотиков после Второй мировой войны.
Период с 1940 по 1960 год XX в. называют эрой антибиотиков или
фармацевтическим периодом развития биотехнологии. В 60-70-е годы
развивается «метаболическая инженерия» - получение с помощью
микроорганизмов аминокислот, бактериальных полисахаридов, ферментов,
белка, одноклеточных.

Технология микробиологического синтеза

Чистые культуры микроорганизмов предварительно размножают на

питательной среде. Затем их вносят в специальные ёмкости–
ферментаторы с подготовленным и простерилизованным сырьем.
Ферментация протекает при определенной температуре,
определенной кислотности, в аэробных или анаэробных условиях. После
ферментации производится очистка требуемого продукта от примесей
(например, при производстве лекарственных препаратов).
Разновидностью микробиологического синтеза является
ферментативный синтез. При этом используются не сами микроорганизмы,
а выделенные из них ферменты. Для увеличения продолжительности
службы ферментов их подвергают иммобилизации, соединяя с
полимерными матрицами. Иммобилизации могут подвергаться и живые
клетки. Иммобилизованные ферменты и клетки позволяют осуществлять
непрерывный процесс ферментации.
Промышленный биосинтетический процесс, в котором для
производства коммерческой продукции используются микроорганизмы,
состоит из 3 этапов:
Промышленный биосинтетический процесс, в котором для
производства коммерческой продукции используются микроорганизмы,
состоит из 3 этапов:
1. Исходная обработка сырья, чтобы его можно было использовать в
качестве питательных веществ для микроорганизмов-продуцентов.

13
 2. Ферментация и биотрансформация: рост микроорганизмов в
биореакторе (более 100 л) с последующим образованием нужного
метаболита (антибиотиков, ферментов, гормонов).
3. Конечная обработка: очистка продукта от компонентов
культуральной жидкости или от клеточной массы.

Технология генетической инженерии

Генетическая инженерия – это конструирование функционально

активных генетических структур и наследственно измененных
организмов.
Технология рекомбинантных ДНК (молекулярное клонирование
или генетическая инженерия) – это совокупность экспериментальных
процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала
(ДНК) из одного организма в другой.
Генетическая инженерия по существу сводится к генетической
рекомбинации, т.е. обмену генами между двумя хромосомами, которая
приводит к возникновению клеток или организмов с двумя и более
наследственными детерминантами (генами), по которым родители
различались между собой.
Метод рекомбинации заключается в следующем:
1. Получение ДНК чужеродного фрагмента, который необходимо
включить (вклеить) в клетку хозяина.
2. соединение фрагментов ДНК in vitro с помощью ферментов (в
пробирке) с последующим введением изолированной ДНК в живую
клетку.
3. перенос ДНК в клетку продуцента: вектор в виде плазмид,
космиды, фага.
Вектор вводится разными путями:
- конъюгация – генетический материал клеток при сближении
переходит из одной клетки в другую в виде плазмиды.
- трансдукция – передача клетке генетического материала через
вирус или фаг.
- трансформация – передача клетке генетического материала
изолированной ДНК, в результате чего изменяется геном. Процесс
трансформации – перенос генетического материала, при котором фрагмент
ДНК, выделенный из клетки донора, поступает в клетку-реципиент.
Гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются
(клонируются) из хромосом или плазмид, прицельно выщепляются из
этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции или
синтезируются химически. Набор ферментов (известно более 500
рестриктаз), способных резать ДНК по определенным связям (сайтам),
является важным инструментом генетической инженерии. В последнее
время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям
14
РНК наподобие рестрикции ДНК. Эти ферменты названы рибозимами.
Их роль еще пока не выяснена.
С помощью химического синтеза могут быть получены сравнительно
небольшие гены. Для этого вначале расшифровывают число и
последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим
данным узнают очередность нуклеотидов в гене, поскольку каждой
аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). С помощью
синтезатора создают химическим путем ген, аналогичный природному
гену.
Полученный целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с
другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания
гибридного гена в клетку.
В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы
человека, животных и растений.
Количество плазмид в бактериальной клетке может колебаться от
одной до нескольких сотен, причем, чем большие размеры имеет
плазмида, тем меньше ее копий в клетке. С помощью ампфликации генов,
т. е. увеличения числа копий определенного гена в клетке, можно резко
повысить производство кодируемого вещества клеткой. Ампфликацией
удается добиться получения до 3000 копий плазмидных генов на клетку.
Бактериофаг как вектор используется аналогично. Целевой ген
встраивается в геном фага, реплицируется вместе с генами вируса при
размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего
используется фаг ламбда, который содержит ДНК, состоящую из 50 тыс.
пар нуклеотидов. Преимущество фага ламбда перед плазмидами в том, что
фаговый вектор позволяет клонировать большие фрагменты чужеродной
ДНК.
В случае использования в качестве векторов вирусов человека,
животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса, и он
реплицируется вместе с размножением последнего в клетке. Применяют в
качестве вектора космиды, представляющие собой гибрид плазмиды с
фагом. Космиды используются для клонирования больших (до 45 тыс. пар
нуклеотидов) фрагментов ДНК эукариот.
Для РНК-содержащих вирусов передача генетической информации
возможна с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), передающей
информацию о структуре белка от РНК к ДНК, которая является
комплементарной иРНК.
Экспрессируемый ген в виде рекомбинантной ДНК (плазмида, фаг,
космида, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или животную
клетку, которая приобретает новое свойство — способность
продуцировать не свойственное этой клетке вещество, кодируемое
экспрессируемым геном. Для лучшего проникновения вектора через
стенку бактерий иногда прибегают к воздействию на стенку (например,
хлоридом кальция), чтобы увеличить ее проницаемость.
15
 В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего
используют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. Реципиента
подбирают не только с учетом возможности встройки чужеродного гена,
но и уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого
геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и
доступности массового культивирования, экологической безопасности.
Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на
синтез чужеродного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего
синтетического потенциала. Такие штаммы — суперпродуценты целевых
продуктов — уже получены и применяются в биотехнологической
промышленности; они носят название промышленных штаммов. В
качестве примера можно привести штаммы — суперпродуценты
интерферона, интерлейкина, белков ВИЧ и др.
Некоторые штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют
чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду. В
таких случаях приходится применять дезинтеграцию (разрушение) клетки
с целью высвобождения из нее синтезированного продукта.
В некоторых случаях, несмотря на наличие экспрессии и секреции,
продукт не удается получить из-за разрушения в процессе синтеза или
после него протеазами и другими ингибиторами. Это, прежде всего,
относится к низкомолекулярным пептидам.
С целью повышения уровня секреции целевого белка пользуются
следующим приемом: к гену целевого белка присоединяют ген белка,
хорошо секретируемого клеткой реципиента. Образующийся в результате
такой манипуляции химерный белок, хорошо секретируемый клеткой,
собирают и от него отщепляют целевой белок. Возможно, также к гену
целевого белка присоединить ген-индикатор, т. е. ген, кодирующий легко
узнаваемый белок, в результате чего получают химерный индикаторный
белок, а из него — целевой белок. В качестве индикатора можно
использовать, например, галактозидазу.

Технология клеточной инженерии

Клеточная инженерия это техника обмена генетическим материалом

между организмами, которые в обычных условиях не вступают в половой
процесс, что открывает большие возможности в создании продуцентов, т.е.
нет видовых и родовых барьеров. С помощью методов клеточной
инженерии можно создавать клетки нового типа на основе их
гибридизации, реконструкции и культивирования. В случае
эукариотических организмов и в зависимости от объекта генетических
манипуляций процесс может подразделяться на хромосомную (перенос
больших групп генов или хромосом) и геномную (полный перенос генома)
инженерию.
Базовым методом клеточной инженерии служит слияние (гибри-
дизация) клеток микроорганизмов или соматических клеток животных и
16
растений. Слияние клеток может быть проведено с использованием
факторов слияния различного происхождения: физического (переменное
электрическое или магнитное поле), химического (катионы,
полиэтиленгликоль и др.), биологического (вирусы).
Растительные клетки перед слиянием превращают в протопласты
клетки, лишенные внешней жесткой клеточной стенки. Последующий
скрининг полученных гибридных клеток позволяет отобрать те из них,
которые объединили геномы или фрагменты ДНК родительских клеток.
Клеточная инженерия позволяет получать гибридные клетки или даже
целые растения (растения-регенераты), скрещивая между собой
филогенетически (т. е. эволюционно) отдаленные организмы. В случае
неполного слияния клеток клетка-реципиент получает отдельные участки
ядерного генетического материала или части клетки-донора (органеллы) с
образованием асимметричнх гибридов.
Клеточная инженерия расширяет возможности получения новых
ценных штаммов микроорганизмов, сортов культурных растений и пород
сельскохозяйственных животных, для создания которых ранее
использовались методы классической селекции, требующие десятилетий.
За последнее время создан ряд межвидовых и межродовых гибридов
табака, картофеля, томата и других растений. Использование достижений
клеточной инженерии позволило разработать технологии получения
безвирусных растений (например, картофеля) путем регенерации целого
растения из одной соматической клетки.
На рисунке 1 представлена схема регенерации растения из про-
топластов. При получении клеток используется комплекс методов,
включающий культивирование, клеточную гибридизацию и генетическую
инженерию. Однако основой является гибридизация, позволяющая
конструировать клетки с новыми свойствами.

17
 Рисунок 1- Схема регенерации растения из протопластов

В настоящее время культуры клеток широко применяются для

производства противовирусных вакцин. Они дополняют, а возможно,
когда-нибудь и заменят использование животных для тестирования
безопасности и эффективности вакцин и лекарственных препаратов.
Клетки насекомых, так же как растительные клетки и клетки животных,
могут быть использованы для производства живых рекомбинантных
противовирусных вакцин, сконструированных, например, на основе
бакуловирусов. Их применение позволяет решить проблему безопасности,
возникающую при получении и применении живых вакцин традиционным
методом на основе аттенуированных штаммов. Кроме того, с их помощью
можно синтезировать лекарственные вещества, особенно некоторые белки
животных, слишком сложные для того, чтобы синтезировать их с
помощью генетически модифицированных микроорганизмов.

Технология иммобилизованных ферментов

Технология иммобилизованных ферментов получила свое развитие в

последние 30-40 лет. Иммобилизованные ферменты на гелевых или
пористых носителях оказались высокотехнологичными при
промышленном ферментативном выделении или синтезе различных
химических веществ, включая пищевые продукты (получение концентрата
фруктозы из крахмала, этанола и др.).
Методы иммобилизации универсальны для всех видов
иммобилизованных биокатализаторов – индивидуальных ферментов,
клеток, субклеточных культур, комбинированных препаратов.
18
Использование иммобилизированных клеток удобно, поскольку отпадает
необходимость выделения, очистки и хранения изолированного фермента.
Иммобилизованные клетки микроорганизмов применяют для
биотрансформации органических соединений, разделения рацемических
смесей, гидролиза ряда сложных эфиров, инверсии сахарозы,
восстановления и гидроксилирования стероидов. Иммобилизованные
хроматофоры используют в лабораторных установках для синтеза АТФ, а
пурпурные мембраны – для создания искусственных фотоэлектрических
преобразователей – аналогов солнечных батарей. Разрабатывается реактор
на основе иммобилизованных клеток дрожжей для получения этанола из
мелассы, в котором дрожжи сохраняли бы способность к спиртовому
брожению в течение 1800 ч. Из более чем 2000 известных в настоящее
время ферментов иммобилизована и используется для целей инженерной
энзимологии примерно десятая часть (преимущественно оксидоредуктазы,
гидролазы и трансферазы).
Для осуществления химических процессов с помощью
иммобилизованных ферментов применяют колоночные, трубчатые,
пластинчатые и танкерные реакторы разного объема и
производительности.
Иммобилизованные ферментные системы функционируют в
биореакторе в виде неподвижной фазы, через которую протекает среда с
субстратом, подлежащим химическому превращению (гетерогенный
катализ).

Контрольные вопросы:

1. Что является объектами биотехнологии?

2. Перечислите основные разделы современной биотехнологии.
3. Что такое микробиологический синтез?
4. Что изучает клеточная инженерия?
5. Какие преимущества имеет клеточная инженерия перед
классическими методами селекции?
6. Что такое генетическая инженерия?
7. Какие открытия способствовали появлению и развитию
генетической инженерии?
8. Перечислите области использования иммобилизованных ферментов.

19
 ТЕМА 3
ТИПОВАЯ СХЕМА И ОСНОВНЫЕ СТАДИИ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

Биотехнологические процессы весьма разнообразны, однако можно

проследить общие для различных процессов стадии, на каждой из которых
сырье претерпевает определенные технологические воздействия и
последовательно превращается во все более сложные полупродукты и,
наконец, в конечный продукт.
Типовая схема биотехнологических производств – это последова-
тельность стадий производства, в каждой из которых сырье претерпевает
определенные технологические воздействия и последовательно
превращается во все более сложные полупродукты и, наконец, в конечный
биотехнологический продукт.
Стадии биотехнологического процесса включают:
1) подготовку сырья (питательной среды) субстрата с заданными
свойствами для культивирования промышленного микроорганизма;
2) подготовку биообъекта – посевной культуры (чистой культуры)
или фермента, в том числе и иммобилизованного для внесения в основной
аппарат – ферментер;
3) основную ферментацию (биосинтез, биотрансформация
(ферментация) – образование целевого продукта за счет превращения
компонентов питательной среды в биомассу, затем, если это необходимо, в
целевой метаболит.
4) выделение и очистка целевого продукта.
5) получение товарных форм продукта.
Продукты биотехнологии получают по индивидуальным
технологиям со своими биологическими агентами, сырьем, числом стадий
производства и их технологическими режимами. Тем не менее, можно
представить себе обобщенную типовую схему биотехнологических
производств.
Схема состоит из стадий, в каждой из которых сырье претерпевает
определенные технологические воздействия и последовательно
превращается во все более сложные полупродукты и, наконец, в конечный
продукт.
Общий вид такой типовой схемы представлен на рисунке 2.

20
 Рисунок 2 - Типовая схема, основные стадии и технологические процессы в
биотехнологических производствах

В классическом варианте биотехнологический процесс состоит из

подготовительной (предферментационной), биотехнологической
(ферментационной) и заключительной (постферментационной) стадий.
На начальной, подготовительной (предферментационной) стадии
осуществляется приготовление необходимого для биотехнологической
стадии сырья с заданными свойствами (приготовление и стерилизация
среды, подготовка и стерилизация воздуха, подготовка посевного
материала, подготовка биокатализатора).
На основной, биотехнологической (ферментационной) стадии с
помощью тех или иных биообъектов происходит преобразование
исходного сырья в желаемый продукт. Данный этап включает в себя
синтез новых органических соединений, а также следующие процессы:
биотрансформацию, ферментацию, биокатализ, биоокисление, метановое

21
брожение, биокомпостирование, бактериальное выщелачивание,
биосорбцию, биодеградацию.
На последней, заключительной (постферментационной) стадии
биотехнологического процесса осуществляется выделение целевого
продукта, который может находиться в виде биомассы или жидкости, с
помощью отстаивания, фильтрации (в том числе микро- и
ультрафильтрации), сепарирования/центрифугирования и др. В случае
необходимости удалить ненужные примеси после выделения целевого
продукта следует этап очистки, который реализуется на основе
хроматографии, диализа, кристаллизации, а также ректификации,
ферментолиза, обратного осмоса и др. В целях повышения выхода
целевого продукта применяют его концентрирование (например,
выпариванием, сушкой, нано- и гиперфильтрацией). Приготовление
питательных сред проводится в специальных реакторах, оборудованных
приспособлениями для перемешивания. В различных процессах
применяются разные по происхождению и содержанию субстраты,
поэтому их приготовление и стерилизация имеют свои особенности и
осуществляются по специальной технологии в соответствии с нормативно-
технической документацией.

Сырье для питательных сред

Для культивирования микроорганизмов (выращивание в

искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты, сырье –
питательные среды.
На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы
(питаются, дышат, размножаются и т. д.), поэтому их еще называют
«средами для культивирования».
Элементы питания, необходимые для роста клеток и производства
биотехнологического продукта можно подразделить на следующие
группы:
– источники основных элементов;
– источники элементов, требуемых в меньших количествах;
– аминокислоты;
– витамины и гормоны;
– источники микроэлементов.
В состав сред входят источники углерода и энергии, а также
микроэлементы и ростовые факторы. В качестве источников углерода и
энергии используют различные углеродсодержащие соединения (углеводы,
спирты, органические кислоты), комплексные среды, содержащие отходы
различных производств, в том числе и пищевых, продукты переработки
растительного сырья и т.п.
Минеральные элементы, необходимые для роста биологических
агентов и входящие в состав питательных сред, подразделяются на
22
макроэлементы и микроэлементы. Среди макроэлементов на первом месте
стоит азот, т.к. потребность в нем у биологических агентов на порядок
выше чем в других элементах – фосфоре, сере, калии и магнии. Азот
обычно используется микроорганизмами в востановленной форме
(мочевина, соли аммония). Концентрация макроэлементов в среде обычно
составляет 10-3 – 10-4 М. Потребность в микроэлементах невелика и их
концентрация в средах существенно ниже 10-6 -10-8 М (железо, медь, цинк).
Некоторые продуценты в силу специфичности метаболизма нуждаются в
наличии ростовых факторов в среде (аминокислоты, витамины,
фитогормоны).
Микроорганизмы могут использовать для жизни любое органическое
соединение, поэтому весь мировой запас органики (растения, почва,
химикаты) потенциально является пищей для микроорганизмов.
Однако для того, чтобы продуцент производил нужный продукт, ему
необходимо индивидуальное питательное соединение (питательная среда).
Питательная среда является сложной трёхфазной системой и как бы
продолжением микробной клетки.
Кроме индивидуальных органических соединений, в
промышленности используют различные отходы. Например: 1 тонна
кукурузного крахмала стоит 64-91 $, меласса - 140 $, этанол- 430 $,
глюкоза- 290 $, сахароза- 629 $.
Сырье, используемое для получения целевого продукта, должно
быть доступным, дешевым, иметь стандартный состав, быть стабильным
при хранении, хорошо растворяться в воде, легко усваиваться
микроорганизмами, не должно относиться к пищевым продуктам. В
качестве такого сырья используются отходы сельского хозяйства,
деревообрабатывающей и бумажной промышленностей и т.д. Наиболее
часто в качестве компонентов питательных сред используются отходы
пищевых производств.
В качестве сырья используются отходы сельского хозяйства,
деревообрабатывающей и бумажной промышленностей и т.д. Наиболее
часто в качестве компонентов питательных сред используются отходы
пищевых производств.
Свекловичная меласса - отход производства сахара из свеклы, богата
органическими и минеральными веществами, необходимыми для развития
микроорганизмов. Она содержит 45-60 % сахарозы, 0,25-2,0 % инвертного
сахара, 0,2-3,0 % рафинозы. Кроме того, в мелассе содержатся
аминокислоты, органические кислоты и их соли, бетаин, минеральные
вещества, а также некоторые витамины. Используется для промышленного
производства лимонной кислоты, этанола и других продуктов.
Мелассная барда - отход мелассно-спиртового производства. По
химическому составу мелассная барда является полноценным сырьем для
производства кормовых дрожжей, не требующим добавок ростовых
веществ, так как содержит достаточное количество витаминов.
23
Содержание сухих веществ в натуральной барде - 8-12 %, в упаренной
барде - 53 %.
Зерно-картофельная барда - отход спиртового производства.
Содержание растворимых сухих веществ обычно составляет 2,5-3,0 %, в
том числе 0,2-0,5 % редуцирующих веществ, имеются источники азота и
микроэлементы. Применяется для получения микробного белка.
Отходы пивоварения (пивная дробина и солодовые ростки), а также
отходы подработки несоложеного ячменя являются подходящим, для
получения микробного белка. Для производства кормовых дрожжей это
сырье соответствующим образом гидролизуют и вводят в питательную
среду в соотношении 8:0,2:0,05 (дробина : ростки : отходы ячменя).
Пшеничные отруби - отход мукомольного производства,
используются для приготовления питательных сред при твердофазном
способе культивирования. Имеют богатый химический состав и могут
использоваться в качестве единственного компонента питательной среды.
Молочная сыворотка - отход производства сыров, творога и казеина.
Молочная сыворотка очень богата различными биологически активными
соединениями, ее сухой остаток содержит в среднем 70-80% лактозы, 7-
15% белковых веществ, 2-8 % жира, 8-10 % минеральных солей.
Используется для производства белковых препаратов в промышленных
масштабах.
Приготовление питательных сред
В промышленных условиях питательные среды готовят в отдельном
цехе. Выбор аппаратуры и технологии приготовления питательной среды
зависит от количества и вида компонентов. При необходимости отдельные
компоненты подвергают дополнительной обработке: измельчению,
просеиванию, отвариванию, экстрагированию и др.
При приготовлении питательных сред для глубинного
культивирования особое внимание уделяют их тщательной гомогенизации.
Твердые частицы нерастворимых компонентов должны быть достаточно
мелкими. Это облегчает их потребление микроорганизмами и
обеспечивает надежность стерилизации, так как крупные частицы
медленнее прогреваются и резко повышается вероятность сохранения в
них посторонних микроорганизмов.
Для лучшего растворения компонентов среду нагревают до
температуры 80оС острым паром. Среды готовят в емкостях, снабженных
механическими мешалками, добавляя в определенной последовательности
растворимые и нерастворимые компоненты. Если с точки зрения
совместимости и стерилизации это возможно, все они могут быть
растворены в одном смесителе. В противном случае компоненты
растворяют по группам и затем соединяют в смесителе. Среды
стерилизуют по периодическому или непрерывному методу.
При периодическом методе в стерилизаторе сначала подогревают
весь объем среды до 100-120 оС, выдерживают 30-60 мин при этой
24
температуре и охлаждают до температуры ферментации. Температура и
продолжительность стерилизации зависят от состава и назначения среды,
ее количества и обсемененности.
Недостатком этого способа стерилизации является длительность,
неоднородность температурного воздействия на среду, особенно при
стерилизации больших объемов среды.
Непрерывный способ стерилизации осуществляется в специальных
установках, где нагревание среды до температуры стерилизации, выдержка
и охлаждение происходят в потоке.
Преимущества этого способа:
 повышается производительность оборудования;
 обеспечивается большая скорость нагревания;
 сокращается время стерилизации.

Получение посевного материала

Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - ключевая

задача любого биотехнологического производства. Культуры
микроорганизмов-продуцентов заводы получают из коллекций в
пробирках на агаризованных питательных средах или в ампулах. Чистая
культура микроорганизма может постоянно или по мере необходимости
использоваться в производстве. При длительном хранении чистых культур
могут происходить случайные нерегулируемые мутации. Для избежания
мутаций следует не только соблюдать правила хранения и поддержания
исходной культуры, но и периодически проводить пересев культуры и
проверку ее однородности как по морфологическим, так и по
физиологическим признакам.
Перед началом технологического процесса культуру размножают в
лаборатории в стерильных условиях при оптимальном составе среды и
режиме выращивания. Полученную культуру смывают с поверхности
твердой фазы среды стерильной водой и переносят в «маточные» колбы с
50-100 мл жидкой питательной среды, состав которой соответствует
составу среды, используемой в производстве.
Засеянные колбы устанавливают в термостаты или на качалки в
зависимости от потребности культуры в кислороде. Дальнейшее
размножение посевного материала идет в цехе инокуляции.
Выращенным в колбах посевным материалом засевают инокулятор,
загруженный предварительно простерилизованной питательной средой,
где процесс роста культуры продолжается. В ходе культивирования
осуществляют аэрацию и перемешивание среды, регулирование
температуры, рН. Полученный на последней стадии вегетативный
посевной материал передается в ферментатор.
Передачу чистых культур из одного аппарата в другой осуществляют
в конце логарифмической фазы роста. Качество полученного посевного
25
материала контролируют путем микроскопирования. Число пересевов
может быть более 10-12. В главный ферментатор вносят 5-20 % инокулята
от объема среды.
В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи,
актиномицеты (грамположительные бактерии, не образующие спор),
бактерии и водоросли в виде чистых и смешанных культур. В
традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается
смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных
процессов - монокультурам (чистым культурам), выращиваемым в
асептических условиях. Большинство используемых сегодня культур
получено из природных источников, однако затем эти культуры были
улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного
процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов),
или с помощью мутагенеза или генетической инженерии (для
производства вторичных метаболитов).

Способы культивирования микроорганизмов

Для биотехнологических процессов существует три основных

способа выращивания микроорганизмов, а именно – периодическое,
полунепрерывное, непрерывное.
При периодическом культивировании микроорганизмы вносят в
определенный объем среды. По мере роста происходит потребление
питательных веществ и накапливаются продукты роста – биомасса и
метаболиты. Концентрация питательных веществ в биореакторе
снижается, что приводит к изменению метаболизма клетки и прекращению
прироста клеток из-за исчерпания питательных веществ и накопления
токсичных продуктов.
В промышленности периодическое культивирование используется
для оптимизации условий роста организма, а затем для того, чтобы
позволить организму осуществить специфические биохимические
трансформации, такие как образование конечного продукта (аминокислот,
ферментов), или для декомпозиции различных субстратов (очистка
сточных вод). Многие важные продукты, например, антибиотики,
оптимально образуются в стационарную фазу цикла роста при
периодическом культивировании.
В полунепрерывном способе культивирования полная загрузка и
разгрузка ферментера осуществляются однократно, однако в процессе
роста культуры часть культуральной жидкости сливается, а
освободившийся объем заливается свежей питательной средой. Таким
образом, функционирует сливно-доливная система. Различные варианты
полунепрерывных систем используются в производстве дрожжей,
водорослей, антибиотиков и лимонной кислоты.

26
 При непрерывном способе культивирования питательная среда
непрерывно подается в ферментер (биореактор), в котором создают
оптимальные условия для роста микроорганизмов, а из ферментера
(биореактора) также непрерывно вытекает культуральная жидкость вместе
с микроорганизмами.
В непрерывных процессах биообъект поддерживается в
экспоненциальной фазе роста. При этом существует равновесие между
приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате
разбавления свежей средой.
Из непрерывных процессов лучше всего изучен метод глубинной
ферментации. Процесс может быть гомогенно или гетерогенно-
непрерывным.
При гомогенно-непрерывном процессе в аппарате, где идет
интенсивное перемешивание, все параметры постоянны во времени. При
гетерогенно-непрерывном процессе несколько ферментеров соединены
вместе. Питательная среда поступает в первый аппарат, готовая
культуральная жидкость вытекает из последнего. При непрерывном
культивировании микроорганизмов необходимо предотвратить вымывание
культуры из системы, т. е. обеспечить постоянную концентрацию клеток.
В стерильных условиях непрерывный, проточный метод обеспечивает
сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное
время.
Выделение целевых продуктов

Завершающая стадия биотехнологического процесса - выделение

целевого продукта. Стадия выделения продукта существенно зависит от
того, накапливается продукт в клетках или он выделяется в культуральную
жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса.

Контрольные вопросы

1. Какие стадии характерны для всех биотехнологических

процессов? Укажите назначение каждой и дайте краткую характеристику.
2. Основные задачи постферментационной стадии
биотехнологических процессов.
3. В биотехнологии существует два метода культивирования
микроорганизмов: периодический и непрерывный. Каковы преимущества
каждого из них?
4. Дайте характеристику поверхностному и глубинному методам
культивирования микроорганизмов.
5. Для чего при глубинном методе осуществляют концентрирование
фильтрата перед его выделением?
6. Какое сырье может быть использовано в биотехнологических
производствах?
27
 7. Охарактеризуйте сходство и различие процессов основной и
тонкой биотехнологии.
8. Сравните химическую технологию и биотехнологию, укажите их
сходство и различия.

ТЕМА 4
АППАРАТЫ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ
КУЛЬТИВИРОВАНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ И ПОЛУЧЕНИИ
КОНЕЧНОГО ПРОДУКТА

Классификация процессов культивирования (ферментации)

Ферментация (культивирование) - это создание искусственных

условий для обеспечения процессов жизнедеятельности и размножения
микроорганизмов.
Выбор процесса культивирования зависит не только от потребностей
организма, но и от того, для чего будет использована культура, то есть, от
конечной цели эксперимента. Процессы культивирования
классифицируют:
1) по состоянию питательной среды или по основной фазе
(поверхностные и глубинные);
2) по наличию или отсутствию перемешивания (динамические
или статические);
3) по содержанию кислорода (на аэробные или анаэробные);
4) по способу действия (закрытые, чаще периодические, и
открытые, чаще непрерывные);
5) по количеству ферментеров (одно-, дву- и многостадийные);
6) по способу управления (хемостатные, турбидостатные,
оксистатные, рН-статные и другие);
7) по степени защищенности от посторонней микрофлоры;
8) по числу видов микроорганизмов.

Процессы культивирования на твердой поверхности

Культура на твердой среде имеет ряд преимуществ:

1. Простота конструкций биореакторов (растильных, или
бродильных, камер), систем подачи воздуха и регулирования
температурно-влажностного режима. Нет необходимости использовать
оборудование для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки
находятся уже в сконцентрированном состоянии.
2. Твердые культуры относительно свободны от макромолекулярных
компонентов и полностью свободны от частиц питательной среды, так как
последние обычно находятся внутри агарового геля. Более того, твердые

28
культуры относительно свободны от низкомолекулярных питательных
веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов.
3. На твердых средах можно получать результаты, которые
невозможно достичь другим путем.
4.Дешевое производство и возможность использования субстратов,
которые непригодны для других способов культивирования.
Недостатки твердых культур:
1. Твердая культура имеет ограничения при выращивании больших
количеств биомассы.
2. Твердые культуры не обеспечивают однородность популяции
клеток, т.е. культура гетерогенна в физиологическом отношении.
Гетерогенна культура и в техническом смысле, так как клетки
микроорганизмов и питательная среда распределены неравномерно.
3. Твердые культуры характеризуются небольшим числом клеток в
пересчете на данное количество среды.
4. Низкая эффективность использования субстрата и
продуктивность;
5. Сложность механизации и автоматизации процесса
культивирования, стерилизации, загрузки-разгрузки лотков и кювет;
нестерильность процесса.
Варианты твердофазного культивирования:
В качестве твердой фазы могут выступать различные виды
растительного сырья. Используется в основном для культивирования
грибов.
1. Поверхностное («тонкий слой»),
2. Глубинное в неперемешиваемом слое («высокий слой»),
3. Культивирование в перемешиваемой и аэрируемой массе.
В поверхностных твердофазных процессах роль биореакторов
выполняют большие, площадью до нескольких кв. метров, лотки, или
подносы, из алюминия или культивационные камеры (рис. 3).

Рисунок 3 - Твердофазный биореактор

29
 При твердофазной ферментации процесс также протекает в
вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах размещают лотки,
в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10–15 мм. Для лучшей
аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит через
перфорированное днище лотков.
В кюветы наливают жидкую питательную среду, высота слоя
составляет 80–150 мм, затем с потоком подаваемого воздуха среду
инокулируют спорами продуцента. В камере стабилизируется влажность,
температура и скорость подачи воздуха.
После завершения процесса культуральная жидкость сливается из
кювет через вмонтированные в днища штуцера и поступает на обработку.
При твердофазной ферментации процесс также протекает в
вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах размещают лотки,
в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10–15 мм. Для лучшей
аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит через
перфорированное днище лотков.
Жидкофазное поверхностное культивирование. Поверхностные
жидкофазные процессы в биотехнологических производствах используют
для культивирования мицелиальных грибов при получении органических
кислот, ферментных препаратов, кормовой биомассы. Для этих целей
применяется кюветный способ культивирования. Среда загружается в
стерильные кюветы, размещаемые на открытых стеллажах в растильных
камерах с регулируемым температурно-влажностным режимом.
Вентиляцию помещений осуществляют очищенным стерильным воздухом,
который одновременно выполняет функцию теплового агента.
Микроорганизмы растут в виде пленки биомассы на поверхности жидкой
питательной среды. После завершения процесса культуральная жидкость
сливается из кювет через вмонтированные в днища штуцеры и поступает
на обработку.

Процессы суспензионного или глубинного культивирования

Простейшая классификация процессов суспензионного или

глубинного культивирования:
1) периодическое культивирование;
2) продленное оптимизированное периодическое культивирование с
подпиткой или без нее;
3) многоциклическое культивирование;
4) полунепрерывное культивирование;
5) непрерывно-синхронное культивирование;
6) непрерывное культивирование.
Периодическое культивирование. Периодический метод
культивирования предусматривает внесение посевного материала в

30
питательную среду (инокуляция клетками среды) в начале процесса и
получение культуры по достижении заданной фазы развития популяции.
Концентрация микроорганизмов в периодической культуре
нарастает и останавливается либо из-за лимитирования субстратом, либо
из-за ингибирования токсичными продуктами жизнедеятельности.
Практически все системы периодического культивирования
являются закрытыми, поскольку микроорганизмы в них размножаются и
проходят все фазы развития без притока питательной среды и оттока
культуральной жидкости.
Параметры кривой роста

Под урожаем клеток (Х) понимают разность между максимальной и

исходной массой бактерий:
X = Xmaх – Хо.
Особенно важно отношение урожая клеток к количеству
потребленного субстрата (X/S). Если обе эти величины выражают в
весовых единицах, то отношение Х/S, называемое экономическим
коэффициентом, обозначают через Y:
Y = dХ/dS,

где dX – увеличение биомассы, соответствующее потреблению

субстрата в количестве dS.
Важность экономического коэффициента состоит в том, что он
выражает количественные потребности организма в пище.
Если же урожай (в граммах) относят к числу молей потребленного
субстрата, то экономический коэффициент, называемый в этом случае
молярным экономическим коэффициентом, обозначают через Уm.
Молярный экономический коэффициент позволяет связать урожай
клеток с полученным из какого-либо источника энергии (т. е. какого-либо
субстрата) количеством АТФ. УАТФ - энергетический коэффициент,
выражается в граммах клеточной массы на 1 моль АТФ.
Скорость потребления субстрата культурой в данный момент
времени выражается соотношением:
dS/dT = qX,

где X – биомасса, а коэффициент q известен как метаболический

коэффициент или удельная скорость метаболизма. Метаболический
коэффициент можно выразить также через экономический коэффициент и
удельную скорость роста и представить еще в таком виде:
q = /Y.
Если удовлетворены все необходимые требования, то в течение
единицы времени dt увеличение биомассы dX должно быть
пропорционально количеству биомассы X и интервалу времени, т. е.:
dX = Х.dt,
31
 откуда dХ/dt = Х или  = dХ/dt . 1/X
Дифференциальное отношение dХ/dt выражает скорость роста
популяции клеток. Параметр , обозначающий скорость роста единицы
биомассы (I/Х) (dХ/dt), называется удельной скоростью роста.
Для того, чтобы рассчитать время генерации клеток можно
использовать уравнение, учитывая геометрическую прогрессию роста:
N = No . 2n ,
откуда lgN = lgNo + n lg2,
где N число клеток.
Отсюда число клеточных делений (n) составит:

n = lgN-lgNo/lg2

Константа скорости деления или число клеточных делений в

единицу времени t-to можно вычислить по формуле: ν=n/t, а время одной
генерации (g) по формуле:
g=t/n=1/ν

Многоциклическое культивирование. Многоциклическими

процессами культивирования называют такие, в которых цикл
выращивания культуры повторяется многократно без многократной
стерилизации емкости. Зависимость концентрации микроорганизмов и
удельной скорости роста от времени в каждом цикле многоциклического
процесса имеет характер, аналогичный таковому в периодическом
процессе.
Продленное периодическое оптимизированное культивирование.
Продленный периодический процесс культивирования, как и
периодический, предусматривает одноразовую загрузку и разгрузку
ферментера. Однако цикл развития микроорганизмов в продленном
периодическом процессе удлиняется либо за счет подпитки
(периодической или непрерывной), либо за счет длительного удержания
клеток в системе (диализ).
Культивирование с подпиткой. Если зависимость удельной
скорости роста от количества субстрата имеет насыщение, то исходную
концентрацию субстрата можно задать сразу побольше в пределах плато,
где влияние субстрата на скорость роста биомассы невелико или вообще
отсутствует. В этом случае пока концентрация субстрата не снизится до
критического уровня подпитку можно не производить. Если зависимость
удельной скорости роста биомассы от концентрации субстрата имеет
экстремум, то подпитка требуется уже с самого начала процесса для
поддержания его на оптимальном уровне.
Подпитка может осуществляться импульсно или по каплям на
протяжении всего процесса. Практически получается, что скорость
32
подпитки возрастает во времени по экспоненте. И концентрация биомассы
возрастает по экспоненте из-за почти постоянной удельной скорости роста
при постоянной величине субстрата. Такие культуры часто называют
«расширенными» или «экспоненциальными».
Варианты способа управления подпиткой:
1. Заранее рассчитывается программа изменения подпитки во
времени, и субстрат подается в аппарат без информации о том, с какой
скоростью его потребляет культура. Это может привести как к избытку,
так и к недостатку субстрата в среде.
2. Субстрат подается по одному из косвенных параметров, связанных
с ростом культуры.
Полунепрерывное культивирование. В полунепрерывных системах
полная загрузка и разгрузка ферментера осуществляются однократно,
однако в процессе роста культуры часть ее сливается, а освободившийся
объем заливается свежей питательной средой, т.е. функционирует
отъемно-доливная или сливно-доливная система. Следовательно,
полунепрерывное культивирование характеризуется частотой и объемом
сливаемой выросшей культуры и добавлением свежей питательной среды в
рабочую емкость ферментера.
Установившиеся режимы полунепрерывного культивирования
характеризуются колебанием концентрации микроорганизмов около одной
и той же постоянной величины и относительным постоянством средней
удельной скорости роста популяции.
Полунепрерывное культивирование микроорганизмов
осуществляется в открытой динамической гомогенной одностадийной
системе в любом ферментере для периодического культивирования,
оснащенном системой перемешивания и аэрации.
Различные варианты полунепрерывных систем используются в
производстве дрожжей, водорослей, антибиотиков, лимонной кислоты и
других.
Непрерывное культивирование. В отличие от периодического
культивирования в непрерывных процессах питательная среда подается
непрерывно, удаление биомассы и продуктов ее жизнедеятельности также
осуществляется непрерывно.
По такому принципу организуются 2 разновидности процессов
непрерывного культивирования: процессы полного (идеального) смешения,
или хемостатные процессы, и процессы полного вытеснения, или
тубулярные процессы.
Установившиеся режимы непрерывного культивирования
характеризуются постоянством концентрации микроорганизмов и
удельной скорости роста популяции.
Непрерывное культивирование проводится в открытой
динамической системе, которая может быть как гомогенной, так и

33
гетерогенной. Эта система способна к длительной работе в постоянном
установившемся режиме.
Хемостатные процессы непрерывного культивирования.
Гомогенные системы идеального смешения. Любой периодический
процесс можно перевести в непрерывно-проточный. Непрерывно-
проточное культивирование открывает возможности для поддержания
постоянных условий роста путем создания такого состава питательной
среды, чтобы только один желаемый фактор лимитировал рост. Если в
таком процессе плотность популяции определяется химическим составом
среды (концентрацией лимитирующего рост фактора), его называют
хемостатным культивированием.
Изменяя концентрацию лимитирующего рост фактора, можно
изменять плотность популяции, т.е. изменяя скорость разбавления, можно
получать режимы, обеспечивающие различную скорость роста популяции.
При таком методе, регулируя скорость протока, можно воспроизвести
любую точку роста периодической культуры.
В системе идеального смешения микроорганизмы растут в
биореакторе при интенсивном перемешивании в культуральной среде,
постоянной по своему составу, и, следовательно, в каждый данный момент
времени находятся в одном и том же физиологическом состоянии, т.е. в
состоянии установившегося динамического равновесия, которое называют
«steady state». В установившемся режиме скорость протока среды,
отнесенная к единице объема культуры в ферментере, называется
коэффициентом разбавления (D) и равняется удельной скорости роста. При
этом культура находится в устойчивом стационарном состоянии
динамического равновесия и обладает способностью самопроизвольно
автоматически подстраиваться к изменениям условий.
При таком способе культивирования нельзя получить устойчивого
состояния только при максимальной скорости роста. В хемостате
практически можно только приблизиться к максимальной удельной
скорости роста, но не достичь ее, потому что такая скорость роста
соответствует критической скорости разбавления, при которой биомасса
вымывается из ферментера, что является одним из существенных
недостатков хемостата.
Для борьбы с данным явлением возможно использовать комплекс
«ферментер-сепаратор». В этом комплексе выходящая из ферментера
жидкость сгущается на сепараторе, и часть сгущенного потока непрерывно
возвращается в ферментер, остальная часть идет как товарный продукт.
Осветленная жидкость сбрасывается в стоки. Основными направлениями
использования реципкуляции являются: повышение производительности
системы непрерывного культивирования и более полное потребление
субстрата из среды.

34
 Одностадийный хемостат применяется при необходимости
воспроизвести на протоке любую скорость роста клеток, кроме
максимальной.
Двухстадийный хемостат позволяет создавать культуры при
скорости роста, близкой к максимальной, и определять условия ее
повышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирование при
скорости разбавления, меньшей, чем удельная скорость роста, а во второй
подается культура из первого.
Особенности двухстадийного хемостата:
1. Вымывания культуры во втором ферментере не происходит из-за
непрерывного поступления культуры из первого. Следовательно,
концентрация биомассы никогда не сможет стать равной нулю при любой
скорости разбавления. Будет возрастать удельная скорость роста клеток и
экономический коэффициент.
2. Концентрация субстрата во втором аппарате всегда меньше, чем в
первом. Субстрат расходуется из запаса входящего потока. Это имеет
значение в тех случаях, когда важен не только выход биомассы, но и ее
чистота.
3. Концентрация биомассы во втором аппарате всегда выше, чем в
первом (учитывается прирост биомассы).
4. Двухстадийный хемостат часто оказывается удобней для тех
процессов, в которых целевым продуктом является не биомасса, а
метаболиты (рис.4).

А В
Рисунок 4 – Двухстадийный хемостат с дополнительной подачей во вторую
стадию (А); двухстадийный хемостат (В): S0 – концентрация субстрата в подаваемой
среде; S1 – в первом ферментере; S2 - во втором ферментере; Х1 – концентрация клеток
в первом вферментере; Х2 - концентрация клеток во втором ферментере

Другой широко известный принцип управления процессом –

турбидостат. В нем подача питательной среды осуществляется по
команде фотоэлектрического элемента, регистрирующего оптическую

35
плотность культуры (рис. 5). Скорость разбавления сама устанавливается в
соответствии с заданной плотностью популяции.
Этим турбидостат отличается от хемостата, в котором фиксируется
скорость разбавления, соответственно которой устанавливается
концентрация биомассы. Турбидостат позволяет получать максимальные
скорости роста, которые применяются при культивировании клеточных
культур, фиксированных в стадии экспоненциального роста. Хемостаты же
применяют при скоростях разбавления от самой низкой до только
приближающейся к максимальной удельной скорости роста.

Рисунок 5 - Схема работы турбидостата: So – концентрация субстрата в

подаваемой среде, S1 – концентрация субстрата в вытекающей культуре, Х –
концентрация клеток

В настоящее время разработаны различные варианты непрерывного

культивирования микроорганизмов, работающие по принципу
турбидостата – pH-стат, оксистат, СО2-стат, теплостат, респиростат,
вискозистат и т. д., названия которых соответствуют задаваемому
параметру. Любой параметр, который изменяется в периодической
культуре и на который существует датчик, может быть использован для
управления ростом по типу турбидостата.
Управляющими параметрами могут быть комплексные параметры,
например, содержание кислорода и углекислоты в отходящем воздухе,
характеризующие дыхательный коэффициент.

Тубулярные процессы непрерывного культивирования

Системы культивирования полного вытеснения. Этот способ
культивирования используется для анаэробных условий. Открытая система
полного вытеснения отличается от системы идеального смешения тем, что
культура в ней не перемешивается и представляет собой поток жидкости
через трубку. Наиболее распространенным аппаратом является трубчатый
реактор, который может иметь различную форму (прямую, S-образную,
36
спиральную) и устанавливается горизонтально или вертикально.
Питательная среда и посевной материал смешиваются на входе и
непрерывно поступают в аппарат без обратного смешения. В аппарате
башенного типа жидкость движется снизу вверх.
В момент подачи среды и посевного материала на входе в трубчатый
реактор, популяция клеток находится в начале цикла развития. По ходу
трубки культура стареет, субстрат исчерпывается, накапливаются
продукты метаболизма, и вытекающая культура находится в состоянии,
аналогичном стационарной фазе роста периодической культуры.
Следовательно, система полного вытеснения представляет собой
пространственный, проточный вариант периодической культуры. Такая
культура за время от посева до выгрузки проходит через все стадии
периодической культуры, т. е. фазы роста распределены не во времени, а в
пространстве, причем каждой части ферментера в установившемся режиме
соответствует определенный отрезок ростовой кривой.
Преимуществом тубулярного процесса является возможность более
полного исчерпания субстрата (как и в периодическом процессе),
недостатком – большая склонность к контаминации и невозможность
организовать аэрацию по всей длине аппарата.

Классификация ферментеров
по размерам, целевым назначениям (лабораторные, опытно-
промышленные или пилотные, промышленные);
по режиму работы (периодического и непрерывного действия);
по условиям культивирования (аэробные и анаэробные,
мезофильные и термофильные, для поверхностного и глубинного
выращивания, для жидких и твердых питательных сред, газофазные).
по способу перемешивания и аэрации биореакторы
подразделяются на аппараты с механическим, пневматическим и
циркуляционным перемешиванием.
Конструктивные различия ферментеров (биореакторов)
определяются в основном способами подвода энергии и аэрации среды:
С точки зрения конструктивных особенностей ферментеры
различаются способами подвода энергии и аэрации среды по способу
осуществления процессов аэрирования и перемешивания):
- ферментеры с подводом энергии к газовой фазе;
- ферментеры с подводом энергии к жидкой фазе;
- ферментеры с комбинированным подводом энергии
(классификации ферментационных аппаратов для аэробной глубинной
ферментации по подводу энергии (Виестур и др., 1986; 1987).

37
 Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ)

В ферментерах с подводом энергии к газовой фазе аэрация и

перемешивание субстрата происходит сжатым воздухом.
1) барботажные ферментеры. Подача воздуха в них осуществляется
через барботажные устройства, которые расположены в нижней части
аппарата;
2) аппараты с диффузором. Смешивание субстрата с воздухом,
который поступает по распределительным трубам в данных ферментерах
происходит в нижней части аппарата посредством внутреннего
цилиндрического диффузора;
3) трубчатые ферментеры. Под действием потока воздуха жидкость
циркулирует по реактору и сепаратору;
4) ферментеры с форсуночным распределением воздуха. Воздух в
таких ферментерах подается через форсунки, расположенные в нижней
части аппаратов;
5) ферментеры колонного типа выполнены в виде цилиндрической
колонны, которая разделена горизонтальными перегородками на несколько
секций. В таких устройствах воздух барботирует через слой жидкости
каждой тарелки, за счет движения жидкости через кольцевую щель
обеспечивается противоточное движение двух фаз – газовой и жидкой.
Общим признаком этих аппаратов является ввод энергии газовой
фазой, которая является ее носителем и за счет которой
осуществляется процесс перемешивания. Эта группа ферментеров
характеризуется, прежде всего, простотой конструктивного исполнения и
38
высокой эксплуатационной надежностью в связи с отсутствием
движущихся узлов и деталей.
В простейшем виде такой ферментер представляет собой сосуд в
который через барботер подводится воздух или какая нибудь специальная
газовая смесь (рис.6). Пузырьки, выходящие из барботера, осуществляют
процессы аэрирования, перемешивания и термостатирования в
культуральной жидкости. Для улучшения процессов массо- и теплообмена
используют различные конструктивные решения, направленные на
прежде всего на более равномерное и быстрое распределение пузырьков
воздуха по всему объему аппарата. Среди конструкций таких ферментеров
наиболее распространены барботажные, барботажно-газлифтные,
тарельчатые колонные, насадочные колонные и ряд других. Подвод или
отвод (по необходимости) тепла в таких аппаратах осуществляется
встроенными внутри аппарата теплообменниками различной конструкции.

Рисунок 6- Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ): А-

эрлифтный; В – пузырькового типа

Наибольшее использование в предшествующие годы получили

барботажные биореакторы с принудительным диспергированием газа.
Они представляют собой вертикальную емкость, в основном
цилиндрической формы, снабженную теплообменником, барботером и
технологическими штуцерами (рис.7). Характерным признаком работы
барботажного реактора является неорганизованная и слабая циркуляция
жидкости. Одним из важнейших требований, предъявляемых к условиям
проведения ферментации, является поддержание температуры в
реакционной зоне на оптимальном уровне. Однако непрерывный отвод
тепла из зоны реакции аппаратов барботажного типа с мешалками
39
затруднен. Это обуславливает необходимость оснащения реакторов этого
типа выносными теплообменниками, что приводит к еще большему
увеличению энергозатрат.

Рисунок 7- Барботажные биореакторы группа ФГ: 1- корпус; 2-рубашка; 3-

барботер; 4-теплообменник; 5-механическое перемешивающее устройство; 6-ребра; 7-
решетка; 8-подвижная насадка (гранулы); 9-сепаратор; 10- циркулярный контур (цит.
рис. Н.А. Войнова). Реактор с принудительным диспергированием газов большой
высоты для увеличения степени насыщения культуральной жидкости газом (в); аппарат
с подвижной насадкой (б); аппарат с применением перемешивающих устройств (г)

Газлифтные реакторы (рис. 8). Для таких аппаратов характерно

интенсивное пенообразование и высокий удельный расход воздуха. В
промышленной практике выращивания кормовых дрожжей во время
работы воздух проходит в аппарат по центральной трубе в кювету, где из
подаваемого сусла и жидкости, содержащейся в нижней части аппарата,
образуется газожидкостная смесь, которая движется по внутреннему
циркуляционному контуру. Для увеличения скорости транспорта
кислорода устанавливают перемешивающие устройства в циркуляционном
контуре, что приводит к резкому увеличению энергетических затрат.

40
 Рисунок 8- Газолифтные биореакторы системы Лефрансуа-Марийе (группа
ФГ): 1-корпус; 2- циркуляционный стакан с рубашкой; 3- система
воздухораспределения; 4- патрубок для подачи ферментационной среды (цит. рис. Н.А.
Войнова). Отличительной особенностью газлифтных аппаратов является наличие в
аппарате циркуляционного контура в виде одного (а) или нескольких стаканов (б) или
газлифтных труб (в, г), в полости которых поддерживается повышенное
газосодержание, что позволяет обеспечить циркуляцию газожидкостной смеси со
скоростью 0, 1– 0, 6 м/с.

К недостаткам ферментаторов этой группы следует отнести: низкую

интенсивность массообмена по кислороду.

Ферментеры с подводом энергии жидкой фазой (группа ФЖ)

Обычно энергия в аппаратах этой группы передается жидкой фазе с

помощью насоса. При этом подаваемая в ферментер жидкость вводится в
аппарат через специальное устройство (сопло, эжектор, диспергатор и т. д.
Различают в общем случае три типа конструкций таких аппаратов:
а) ферментеры эжекционные (ФЖЭ);
б) ферментеры струйные (ФЖС);
в) ферментеры с самовсасывающими мешалками (ФЖСМ).
В ферментерах эжекционного типа, работающих в режиме
рециркуляции, подаваемая в ферментер культуральная жидкость проходит
под давлением через специальное устройство называемое эжектором
(инжектором), в котором происходит ее интенсивное перемешивание с
воздухом и насыщение кислородом. Далее образовавшаяся газо-воздушная
струя под большим давлением вводится в ферментер с боку, перемешивая
содержимое и распределяя пузырьки воздуха по всему объему аппарата.
Недостатком аппаратов является необходимость применения специальных
насосов для перекачивания газосодержащих культуральных жидкостей.

41
 В струйных биореакторах (рис. 9) используется эффект инжекции
воздуха струей культуральной жидкости, вытекающей из насадки (сопла).
Проникая вместе со струей жидкости на глубину до одного метра, газ
дробится на мелкие пузыри, образуя газожидкостную систему с развитой
межфазной поверхностью.
.

Рисунок 9 - Струйные биореакторы группа ФЖ: 1- корпус; 2 - струйная

насадка (эжектор); 3 - насос; 4 – циркуляционный стакан (труба); 5 – теплообменник; 6
-воздухоход (цит. рис. Н.А. Войнова)

Разработано около десятка конструкций струйных биореакторов со

сплошной или кольцевой струей жидкости (сплошная струя образуется при
истечении жидкости из цилиндрического патрубка, кольцевая – из
кольцевого зазора, образованного патрубком и цилиндрической вставкой).
При внедрении струи в жидкость происходит захват газа ее поверхностью
и образование аэрируемой зоны. В струйных аппаратах, как и в аппаратах
барботажного типа, ярко выражен эффект флотации биомассы,
значительно снижающий интенсивность микробиологического синтеза.
Конструктивные особенности струйных биореакторов не дают
возможности отводить тепло непосредственно из зоны реакции, что
обуславливает необходимость использования выносного теплообменника
для обеспечения оптимального температурного режима процесса.
Струйные ферментеры конструктивно разделяются на два типа: с
«затопленной» и «падающей» струей (рис. 10).

42
 А

Рисунок 10- Струйные ферментеры группа ФЖ: А - с «затопленной» струей;

В - с «падающей» струей

В первом случае струя газо-жидкостной смеси вводится в

культуральную жидкость сверху через погруженную в нее трубу, во
втором - подается в нее под давлением с определенной высоты.
Образование газожидкостной смеси, как и в случае эжекционных
ферментеров, осуществляется при помощи эжектора, находящегося во
внешнем циркуляционном контуре. Недостатки струйных ферментеров
аналогичны недостаткам эжекционных.
Одним из наиболее существенных недостатков струйных аппаратов
является неравномерное распределение газа в объеме жидкости. Кроме
того, для обеспечения оптимальной скорости течения струи необходима
высота слоя жидкости, равная трем и более метров, что не позволяет
обеспечить требуемое газосодержание.
В отличие от эжекционных и струйных, ферментеры с
самовсасывающими мешалками являются довольно простыми аппаратами,
так как не требуют специальных воздуходувных машин для подачи
воздуха в аппарат. Поступление воздуха осуществляется за счет
разрешения, возникающего за задней кромкой лопасти мешалки при ее
43
движении в жидкости. В лопастях такой мешалки воздушные каналы,
которые через полый вал соединяются с воздуховодом.
Такие аппараты широко применялись раньше при
микробиологическом производстве кормового белка. К недостаткам этой
схемы можно отнести трудность оптимизации и управления всей
совокупностью массообменных и гидродинамических процессов в таком
ферментере.
Ферментеры комбинированные (ФЖКХ)

Ферментеры с комбинированным подводом энергии представляют

собой цилиндрический сосуд, внутри которого расположена механическая
мешалка и барботер. В аппаратах этого типа подвод энергии к газовой фазе
осуществлен для аэрации, а к жидкой фазе – для перемешивания (рис.11).
Перемешивание в данных ферментерах осуществляется тремя способами.
Аппараты с механическим перемешиванием снабжены
механической мешалкой. Аэрация осуществляется путем барботажа. С
целью разбрызгивания воздуха рядом с барботером установлен
механический вибратор.
Аппараты с пневматическим перемешиванием. Перемешивание и
аэрацию усиливают с помощью вращающихся дисков с отверстиями или
придонных пропеллеров. Такие аппараты могут быть также дополнены
диффузором.
В аппаратах с циркуляционным перемешиванием жидкость
циркулирует по замкнутому контуру. Движение субстрату придает насос
или другое аналогичное устройство. Ферментеры выполнены в виде
цилиндра. В аппаратах такого типа перемешивание осуществляется
насосом или одновременно мешалкой и насосом. Воздух в аппарат при
этом подается через барботер.

Рисунок 11- Ферментер комбинированный (ФЖКХ) производства фирмы

«Process Engineerig Company»: 1-барбатер; 2- теплообменник; 3- турбинная
многоярусная мешалка; 4- нижний привод; 5- ввод аэрирующего агента (воздух); 6-
пеногаситель; 7- опора ферментера
44
 Лабораторные, пилотные и промышленные биореакторы,
масштабирование биотехнологических процессов

Технология производственного процесса отрабатывается поэтапно: в

лабораторных, пилотных (опытно-промышленных) и промышленных
установках. Обычно встречаются следующие объемы аппаратов:
1) для лабораторных – 0, 5 – 100 л; 2) для пилотных – 100 л – 5 м 3;
3) для промышленных биореакторов – 5 – 1000 м 3 и более.
Лабораторные биореакторы используют для решения следующих
задач:
1) кинетических – измеряют скорость роста клеток, утилизации
субстратов и образования целевого продукта;
2) массообменных – рассчитывают коэффициенты массопередач,
скорость поступления в среду кислорода и других газов, скорость
освобождения среды от газообразных продуктов жизнедеятельности (СО2);
3) стехиометрических – определяют коэффициенты реакций,
связывающих утилизируемые субстраты и О2 с получаемыми целевым и
побочными продуктами.
В лабораторных условиях наиболее часто применяются аппараты с
механическим перемешиванием и барботажем (рис.12).

Рисунок 12 - Универсальный лабораторный биореактор: минимальный

объем – 1.2 л; максимальный объем – 10л

По принципу теплообмена и стерилизации лабораторные аппараты

делятся на две категории: 1) аппараты, лишенные собственных систем
теплообмена и стерилизации (их помещают в водяные бани с постоянной
температурой, а стерилизацию проводят в автоклаве); 2) аппараты,
имеющие собственные системы теплообмена и стерилизации.
Одноразовые биореакторы - это новое поколение одноразовых
биореакторов с использованием колебательного движения с низким
сдвигом для выращивания клеток. Он идеален для: — клеточной культуры,
45
выращивания клеток животных, растений и насекомых — клеток бактерий
— засевного культивирования для биореакторов промышленного
масштаба (рис.13).

Рисунок 13 - Одноразовые биореакторы Bostat RM

На этапе пилотных биореакторов, в общих чертах, возможно

дублировать конструкционные детали промышленного аппарата и
исследовать макрокинетику процесса – динамику потоков жидкости, газа,
теплоты. На этом этапе выбирают тип аппарата, который далее применяют
в промышленном масштабе (рис.14).

Рисунок 14 - Один из вариантов пилотного биореактора

На этапе промышленного реактора производят синтез кинетических

и стехиометрических характеристик, полученных на лабораторном
46
аппарате, с гидродинамическими, массо- и теплообменными
закономерностями процесса, выявленными на пилотном биореакторе.
Однако при масштабировании параметры процесса не могут сохраниться в
неизменном виде. Из этого следует, что при переходе от лабораторного
биореактора к пилотному и далее к промышленному необходимо наряду с
объемом менять конструкцию и режим работы аппарата.
Таким образом, центральной проблемой при масштабировании
является выбор надежных критериев масштабирования с целью
высокоэффективного и экономичного биосинтеза целевого продукта в
промышленных условиях.

Стерилизация ферментера и сохранение асептики

Важнейшим условием успешного протекания любого

биотехнологического процесса является поддержание стерильности
среды в ферментере и во всей ферментационной установке в целом.
Всю совокупность операций по подготовке оборудования и
коммуникаций с целью создания в них асептических условий можно
разделить на два важнейших процесса: стерилизация внутренних
полостей и герметизация всех элементов и узлов. Первый процесс
проводится в подготовительный период перед запуском оборудования (в
ходе процесса ферментации осуществляются лишь профилактические
мероприятия по стерилизации отдельных узлов вспомогательного
оборудования). Второй процесс осуществляется и при подготовке, и при
эксплуатации оборудования.
Наиболее распространенный метод стерилизации аппаратов и
трубопроводов - тепловая обработка перегретым выше 1000С насыщенным
водяным паром. Этот метод надежнее, экономичнее и удобнее в
производственных условиях, чем обработка химическими средствами.
При стерилизации важнейшим условием ее эффективности
является возможность создания во всех точках внутренних полостей
необходимой температуры и поддержания ее в течение заданного
времени. В производственных условиях выполнение этого требования
связано со значительными трудностями ввиду наличия в ферментере
многочисленных тупиковых полостей, областей и зон в которые затруднен
доступ пара («слабые точки»). Наиболее трудно стерилизуемыми
местами в аппаратах являются участки расположения теплообменников,
барботеров, штуцера (места ввода трубопроводов, датчиков КИП),
загрузочные люки, а в разводках трубопроводов - тупиковые места,
которые образуются на ответвлениях и в местах присоединения к
аппаратам.
Расчетным путем показано, что для достижения равной степени
стерилизации в перечисленных «слабых» точках и в основном

47
обьеме аппарата продолжительность выдержки различается примерно в
100 раз, если принять температуру пара в них 1000С.
Наличие большого количества «слабых точек» обусловлено тем,
что конструкционные решения большинства узлов промышленного
ферментера часто заимствуются из химической технологии и поэтому они
не соответствуют требованиям стерилизации.
Наиболее действенной мерой повышения эффективности
стерилизации оборудования и коммуникаций является разработка
оборудования с наименьшим числом таких «слабых» точек или
принудительная подача пара в эти зоны через дополнительные
термические затворы, специально встроенные в те участки ферментера, где
наблюдается максимальная концентрация таких «слабых» точек. Так же
такими термическими затворами должны быть снабжены и все
трубопроводные линии аппаратов.
Химические методы стерилизации, несмотря на свою
эффективность, применяются редко. Это связано с тем, что после
окончания стерилизации необходимо удалить стерилизующий агент, а это
достаточно трудно сделать и может привести к повторной контаминации.
Наиболее удобно использование газообразных или легколетучих веществ
(этиленоксид, β-пропиолактон), которые легко удалить продувая систему
стерильным воздухом.
Второй процесс, определяющий конструктивные особенности
аппаратуры - ее герметизация. Она решает две задачи - защиту
внутреннего объема от посторонней микрофлоры и защиту окружающей
среды от продуктов биосинтеза.
Проблема обеспечения герметичности обусловлена рядом причин:
параметры проведения разных стадий технологического процесса резко
различаются (например, термическая стерилизация (1000С и выше) и
культивирование (25-450С), сильная вибрация при работе
перемешивающих устройств, перепад температуры в различных зонах
установки, все это приводит к возникновению трещин и щелей в
конструкциях и узлах аппаратуры.
Большинство случаев дегерметизации приходится на запорную
арматуру, в которой наиболее опасные места - уплотнение седло-
клапан и уплотнение штока, на фланцевые соединения, уплотнение
валов и мешалок и места ввода датчиков КИП.
Одним из важных направлений повышения эффективности
герметизации является переход на сварные соединения вместо
фланцевых (соединение отдельных узлов за счет болтов), на сильфонные
или мембранные вентили вместо обычных, на создание торцевых
уплотнений для валов перемешивающих устройств с контролируемой
герметичностью.
Для снижения риска попадания извне посторонней
микрофлоры внутри ферментера создают небольшое избыточное давление.
48
 В зависимости от требований предъявляемых к чистоте продукции
(лекарственные, пищевые продукты) проводят работы по дезинфекции
рабочих мест и целых производственных участков, очистке воздуха
рабочих зон.
Термостатирование
Обеспечение оптимальной температуры процесса
культивирования является одной из самых сложных и ответственных
технических проблем. На практике теплоотвод связан с большими
капиталовложениями и необходимостью строительства сложных систем
оборотного водоснабжения, теплообменных устройств в ферментерах, а
иногда и дополнительных холодильных установок. Затраты на
теплоотвод соизмеримы с затратами на обеспечение клеток
кислородом (аэрирование, перемешивание) и поэтому они могут быть
решающими при выборе конструкции ферментера.
Проблема обусловлена следующими причинами:
а) низким коэффициентом теплопередачи (малой
теплопроводностью) клеточной стенки, и как следствие малоинтенсивной
теплоотдачей со стороны микробной суспензии, а также с образованием
отложений клеток на внешней стороне охлаждающих элементов. Малый
коэффициент теплопередачи объясняется так же практически ламинарным
обтеканием вязкой микробной суспензией поверхности охлаждающих
элементов;
б) небольшой величиной движущей силы теплопереноса, т.е.
перепада температур между охлаждающей водой (в летнее время 26-280С)
и микробной суспензией (обычно 32-340С);
в) необходимость отводить не только тепло, выделяющееся
при жизнедеятельности микроорганизмов, но и все тепло, которое
выделяется при работе перемешивающих устройств за счет трения слоев
жидкости друг о друга и о стенки и внутренние узлы аппарата.
В зависимости от тепловой нагрузки для отвода тепла используют
поверхность корпуса аппарата (тепловые рубашки) или встроенные
внутрь аппарата теплообменники змеевикового типа. Наилучшим
решением проблемы является использование выносных теплообменников
(кожухотрубных, пластинчатых), располагаемых на внешних
циркуляционных трубах, если такие имеются.
При использовании встроенных теплообменников очень важно
правильно выбрать место их размещения, чтобы можно было обеспечить
интенсивный циркуляционный поток жидкости. Всегда необходимо
помнить, что встроенные теплообменники повышают вероятность
инфицирования ферментеров (дополнительные “слабые” точки),
ухудшают гидродинамический режим, уменьшают полезный объем,
усложняют их промывку, стерилизацию и ремонт.

49
 Пеногашение
Большинство микробиологических процессов сопровождается
интенсивным выделением различных газов (CO2, H2, CH4 и др.), что
часто приводит к обильному пенообразованию. Это является крайне
нежелательным процессом, так как чрезмерное вспенивание в
ферментере ограничивает полезную емкость аппарата, нередко является
причиной заражения среды посторонней микрофлорой, приводит к
потерям культуральной жидкости, уходящей с пеной из аппарата. В
большинстве случаев пеногашение осуществляют с помощью добавления
химических пеногасителей - поверхностно-активных веществ (ПАВ)
природного и химического происхождения. Однако в последнее время
все больше внимания обращается на механические пеногасители,
использование которых исключает или резко сокращает введение
химических пеногасителей, которые иногда бывают токсичными для
микроорганизмов-продуцентов или являются ингибиторами ферментов.
Все механические пеногасители разделяются на два типа -
роторные и циклонные. Принцип действия механических
пеногасителей заключается в разрушении пузырьков воздуха или их
дроблении при контакте с рабочим органом. Применяются как
встроенные в аппарат, так и выносные механические пеногасители.
В случае роторных пеногасителей рабочим органом является
обычно вращающийся диск с лопастями, выступами, прорезями либо
пакет конических сепарационных тарелок.
Довольно широко используются пеногасители циклонного типа.
Поступающая из аппарата воздушно-пенная струя двигается по винтовому
каналу в верхней части циклона и после попадания в полую нижнию часть
его закручивается как в вихре. В результате жидкость собирается в центе
вихря и падает вниз, удаляясь через нижний патрубок, а воздух уходит
через верх. Наилучший эффект в этом случае достигается обычно при их
совместном использовании с химическими пеногасителями.

Контроль и управление процессами культивирования

Основное искусство технолога при проведении управляемого
культивирования состоит в умении создать наиболее «комфортные»
условия для растущей культуры. Для этого необходимо прежде всего
знать, каковы они - эти условия, или иными словами:
а) состояние процесса в пределах бесконечно малого промежутка
времени;
б) реакцию микроорганизмов на любые изменения
подвергаемых измерению и контролируемых параметров процесса.
Однако непосредственно изучить состояние («самочувствие») клеток
в промышленном аппарате не представляется возможным. Поэтому
физиологическое состояние культуры продуцента оценивается обычно
50
косвенно по различным кинетическим параметрам: скорости роста,
потребления кислорода и различных субстратов, выделению
углекислого газа и других продуктов метаболизма (в том числе и
целевых), скорости закисления или защелачивания (по значению рН),
тепловыделению и т.д.
Основными управляющими воздействиями для поддержания и
корректировки режима культивирования являются режим аэрации и
перемешивания, подача теплоносителя, регулировка величины рН,
поддержание уровня пены, скорость дозирования субстрата.
Одной из основных проблем промышленной биотехнологии
является отсутствие специализированных датчиков, поскольку
общепромышленная номенклатура приборов и средств автоматизации,
зачастую, не соответствует асептическим условиям процессов, не
выдерживает многократной термической стерилизации, не может работать
в сложных по составу ферментационных средах, включающих биомассу,
пузыри воздуха, жировые компоненты, жидкие эмульсии и твердые
частицы.
Дозирование субстратов. Как уже отмечалось насосы,
трубопроводы и запорная арматура - сплошная “слабая” точка. В
условиях асептических производств лучшими дозирующими насосами
являются перистальтические или мембранные в которых рабочий орган
взаимодействует с жидкостью через непроницаемую мембрану. Возможно
дозирование и без насосов, с помощью дозировочных бачков. При этом
давление в линиях должно на 1,5-2 атм превышать давление в ферментере.
Концентрация водородных ионов. Измерение рН без особых
проблем осуществляют с помощью стеклянных электродов сравнения,
которые хорошо выдерживают паровую стерилизацию. Иногда используют
выносные системы с циркуляцией через них жидкости из ферментера.
Концентрация растворенных газов. Наибольшее
распространение получили амперометрические датчики. Они
выдерживают 20-кратную стерилизацию, не теряя чувствительности.
Однако перед началом процесса ферментации они нуждаются в
градуировке. Наиболее широко такие датчики используются на
определение количества растворенного кислорода.
Концентрация CO2 в выхлопных газах. Этот параметр обычно
измеряется по теплопроводности газов при помощи катарометра. Иногда
пользуются инфракрасными анализаторами.
Температура. При биосинтезе температура может изменяться по
определенной программе, обеспечивающей максимальный выход
продукта. Температуру можно контролировать ртутными термометрами,
термопарами или металлическими термометрами сопротивления.
Давление. Для измерения этого параметра используют относительно
простые диафрагмовые манометры, способные работать в условиях
стерильности. Результирующий пневматический сигнал может быть
51
реализован непосредственно на исполнительном устройстве или
преобразован в электронный. Давление в ферментере обычно
регулируется простым клапаном обратного давления.
В случае аварийного выключения компрессора,
сопровождающегося падением избыточного давления в ферментере,
необходимо загерметизировать аппарат для защиты от внешней
посторонней микрофлоры. Для этого манометр в ферментере соединяется
в единую схему с заслонками на линии ввода и вывода газа и в случае
падения давления ниже допустимого эти заслонки автоматически
закрываются.
Скорость подачи газа и жидкости. Предпочтение обычно
отдается расходомерам переменного сечения - ротаметрам и
диафрагмам. Положение поплавка в ротаметре трансформируется в
электрический сигнал, который передается на регулятор, управляющий
вентилем на трубопроводе.
Уровень жидкости в ферментере. Интенсивное перемешивание
и пенообразование не позволяют применять обычные методы
измерения уровня, распространенные в химической технологии
(смотровые окна, мерные трубки и тд.).
В ферментерах и биореакторах целесообразно применять
весовой тип уровнемера, в котором датчики, фиксирующие массу
аппарата, передают свой сигнал на прибор, отградуированный в единицах
уровня.

Контрольные вопросы:

1. Напишите кинетическое уравнение роста микробной

культуры. Назовите основные параметры роста культуры, сформулируйте
их физико-химический смысл.
2. Классификация ферментеров.
3. Особенности и основные виды ферментеров с подводом
энергии к газовой фазе.
3. Особенности и основные виды ферментеров с подводом
энергии к жидкой фазе.
4. Особенности и основные виды ферментеров с
комбинированным подводом энергии.
5. Конструктивные особенности барботажных биореакторов.
6. Отличительные особенности газлифтных биореакторов.
7. Особенности работы струйных биореакторов.
8. Какие механизмы перемешивания применяют в биоректорах?
9. Какие системы стерилизации используют при осуществлении
биотехнологических процессов?
10. Какие задачи решаются с помощью лабораторных
биореакторов?
52
 11. Для каких целей используют пилотные установки?

ТЕМА 5
АППАРАТУРА И МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЕВЫХ
ПРОДУКТОВ БИОТЕХНОЛОГИИ (БИОСИНТЕЗА)

После завершения процесса выращивания культуры продуцента

получается система, содержащая наряду с целевым продуктом все
остальные компоненты: остатки питательной среды, компоненты клеток
микроорганизмов и продукты их метаболизма. Дальнейшие стадии
процесса направлены на выделение из этой сложной смеси целевого
продукта (рис.15).

Рисунок 15 – Конечные стадии биотехнологических производств

53
 Методы выделения и очистки целевых продуктов в процессе
культивирования микроорганизмов

Полученная на стадии ферментации культура продуцента содержит

целевой продукт либо в биомассе клеток (внутриклеточный продукт), либо
в культуральной жидкости (внеклеточный продукт).
В любом из этих вариантов первой стадией фракционирования
культуры является отделение клеточной массы от жидкой фазы –
культуральной жидкости. Разделение твердой (биомасса) и жидкой фаз
сводится к задаче разделения суспензий.
Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является
разделение культуральной жидкости и биомассы – сепарация.
Виды сепарации:
1) флотация, если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой
смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости, то
жидкость предварительно вспенивают, затем отделяют ее верхний слой с
клетками (рис.16).

Рисунок 16- Схема флотации культуральной жидкости: 1- внешняя оболочка

флотатора; 2- пена; 3-флотируемая жидкость; 4- внутренняя обечайка флотатора; 5-
скоалесцированная пена; I- воздух; II – флотат; III – обедненный раствор

Поверхностные свойства частиц используются в процессе флотации.

За основу в этом методе принимается не размер, а способность клеток
удерживаться пузырьками воздуха; ориентировочный диапазон размеров
флотируемых частиц варьирует от 1 до 200 мкм.
Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или
соскребают пену, состоящую из пузырьков газа с прилипшими к ним
54
клетками. Флотацию широко используют как первый этап отделения
дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости.
2) фильтрация - задержание биомассы на пористой фильтрующей
перегородке (рис.17).

А В

Рисунок 17 – А: Схема фильтрации культуральной жидкости через ситовую

перегородку: 1- клетки и агломераты микроорганизмов; 2- ситовая фильтрующая
перегородка; I- культуральная жидкость; II – фильтрат. В: Схема фильтрации
культуральной жидкости через слой осадка: 1- слой осдка; 2- фильтрующая
перегородка; I- культуральная жидкость; II – фильтрат.

По размеру частиц методы разделения биологических суспензий

могут быть следующими:
1) фильтрация через тканевые фильтры — для частиц размером от 10
мкм до 1 мм;
2) микрофильтрация — для частиц размером от 200 нм до 10 мкм;
3) ультрафильтрация, позволяющая отделять частицы размером от 10
нм до 5 мкм.
Для сведения: размеры микроорганизмов следующие: вирусы — чуть
больше 10 нм, бактерии — 0,3—1,0 мкм (т. е. 300—1000 нм), дрожжи —
3—5 мкм, мицелий грибов и эритроциты — до 10 мкм.
Мицелиальные грибы имеют размеры микроколоний до 1 мм, что
упрощает их отделение от жидкости. Есть также нерастворимые
компоненты среды (мука, дробина в спиртовом производстве). Гранулы
биокатализаторов имеют размеры около 1 мм (чтобы их легче было
отделять).
Макромолекулы имеют размеры частиц в диапазоне 10-120 нм,
микрочастицы — от 120 нм до 10 мкм, тонкие взвеси — от 10 до 100 мкм и
грубые взвеси — от 100 мкм до 1 мм.
Применяют фильтры однократного или многократно использования:
барабанные, дисковые, ленточные, тарельчатые, карусельные, вакуум-
фильтры, фильтр-прессы различных конструкций, мембранные фильтры.
Диаметр пор может превышать размеры клеток. Иногда биомассу сдувают
55
с поверхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным
ножом.
3) центрифугирование - осаждение взвешенных в жидкости частиц
с применением центробежной силы (рис.18).

Рисунок 18 - Центрифугирующая установка и схема установки центрифуги:

1 – приемник суспензии; 2 – смотровой фонарь; 3- центрифуга

Требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование.

Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтруется
медленно; б) поставлена задача максимального освобождения
культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо
наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры
рассчитаны только на периодическое действие.
Вторым этапом при получении продукта, накапливающегося в
клетках, является разрушение клеток, которое проводят физическим,
химическим и химико-ферментативным методами.
Физическое разрушение проводят ультразвуком, с помощью
вращающихся лопастей или вибраторов, встряхиванием со стеклянными
бусами, продавливанием под высоким давлением через узкое отверстие,
раздавливанием замороженной массы, растиранием в струнке,
осмотическим шоком, замораживанием - оттаиванием, сжатием с
последующим резким снижением давления.
Этим способам дезинтеграции клеток присуща определенная не
избирательность: обработка может отрицательно влиять на качество
получаемого продукта.
Физические методы позволяют целенаправленно выделять какую-
либо одну фракцию внутриклеточного содержимого.

56
 Химическое и химико-ферментативное разрушение клеток
избирательно, не всегда пригодно. Его проводят обработкой клеток
толуолом или бутанолом при промышленном получении дрожжевого
автолизата и ряда ферментов. Эффективный лизис клеток вызывают
антибиотики полимиксины, тироцидины, новобиоцин, нистатин и другие,
некоторые поверхностно-активные вещества, а также глицин.
Третий этап - выделение целевого продукта из культуральной
жидкости или гомогената разрушенных кислот проводят путем его
осаждения, экстракции или адсорбции.
Осаждение растворенных веществ возможно физическими
(нагревание, охлаждение, разбавление или концентрирование раствора)
или химическими методами, переводящими отделяемый продукт в
малорастворимое состояние. Так, пенициллин переводят в
кристаллический осадок в присутствии соединений калия или натрия.
Белки осаждают добавлением сульфата аммония, органических
растворителей (этанола, ацетона). Нуклеиновые кислоты осаждают с
помощью полииминов, основные группы которых вступают во
взаимодействие с их фосфатными группами. Современной модификацией
метода является аффинное осаждение.
Аффинное осаждение - affinity precipitation - система, в которой
осадок образуется в результате реакции между двумя типами молекул
благодаря связыванию в месте специфического взаимодействия (например,
фермента и субстрата, антитела и антигена).
Экстракция извлечение продукта из твердого (твердо-
жидкофазная) или жидкого (жидко-жидкофазная) образца.
К твердо-жидкофазной экстракции относится обливание образца
водой с целью извлечения из него растворимых веществ, например солей
металлов из руд, подвергнутых бактериальной обработке, или
растворимых продуктов из массы субстрата (соломы и т.д.) при
твердофазном культивировании. Применяют органические растворители,
например, при экстракции клеточной массы ацетоном, переводящим в
раствор ряд липидных и белковых компонентов
Экстракция может быть разовой (однократной или многократной)
или непрерывной (перколяция).
Жидко-жидкофазная экстракция - добавление органических
растворителей для извлечения из культуральной жидкости антибиотиков,
витаминов, каротиноидов, липидов, некоторых гидрофобных белков.
Витамин В12 экстрагируют фенолом и его производными (крезол, другие
алкилфенолы, галогениды). Используют бензиловый спирт, особенно в
щелочных условиях. Фосфолипиды извлекают путем экстракции
хлороформом.
Полностью избежать нагревания, губительного для многих ценных
веществ, позволяют методы холодовой экстракции (криоэкстракции). Она

57
как бы нивелирует различие между твердым субстратом и культуральной
жидкостью, поскольку и то и другое находится в замороженном состоянии.
Криоэкстракция осуществляется растворителями, кипящими при
низких температурах и находящимися при комнатной температуре в
газообразном состоянии. Криоэкстракция может использоваться в
комбинации с криоконсервацией клеток. Урожай клеток длительное время
хранится без потери свойств в условиях глубокого замораживания.
Адсорбция - частный случай экстракции, при котором экстрагирую-
щим веществом из жидкой или газовой фазы является твердое тело.
Хорошими адсорбентами являются древесный уголь, глины с
развитой пористой поверхностью. Путем адсорбции из культуральной
жидкости выделяют антибиотики и витамины.
К современным методам разделения веществ, основанным на
принципах экстракции и адсорбции, относятся хроматография,
электрофорез, изотахофорез, электрофокусировка.
Хроматография метод разделения, анализа и физико-химического
исследования веществ.
Хроматография основана на различной растворимости в
несмешивающихся растворителях (рис. 19).

5 6

Рисунок 19 - Аппаратурная схема установки для хроматографии: 1 – слой

сорбента; 2,3 – устройства ввода элюента и вывода элюата соответственно; 4 – рубашка
для термостатирования колонки; 5 – смеситель; 6 – резервуар.

В настоящее время используются различные виды

хроматографического разделения, основанные на различных типах
взаимодействия компонентов разделяемой смеси и сорбента:
Распределительная хроматография – сорбент представляет собой
нейтральный твердый носитель, на котором сорбирована неподвижная
фаза. Подвижной фазой в данном случае является растворитель, процесс
основан на распределении компонентов смеси между подвижной и
неподвижной жидкими фазами, разделение достигается за счет различия в
коэффициентах распределения компонентов разделяемой смеси между
подвижной и неподвижной фазами.
Ионообменная хроматография является одним из наиболее
распространенных типов хроматографического разделения. Сорбент -
58
твердый носитель, содержащий ионизируемые в водных растворах
функциональные группы, с которыми связываются с тем или иным
сродством компоненты разделяемой смеси.
Хроматография на молекулярных ситах (гель-проникающая
хроматография, гель-фильтрация); сорбент представляет собой гранулы
геля, имеющие поры, в которые могут проникать молекулы компонентов с
размером ниже некоторой величины и не могут проникать молекулы
большего размера. При этом в колонке объем растворителя, доступный для
молекул разного размера, оказывается различным: относительно малые
молекулы диффундируют как в межгранульном, так и во
внутригранульном объеме, крупные молекулы могут диффундировать
лишь в межгранульном пространстве. Разделение достигается за счет
разной скорости перемещения частиц с разными размерами молекул по
колонке, при этом частицы большего размера движутся с большей
скоростью.
Адсорбционная хроматография - сорбент представляет собой
твердый носитель, на котором происходит обратимая сорбция
компонентов разделяемой смеси за счет дисперсионного взаимодействия
их с поверхностными структурами твердой фазы; разделение достигается
за счет различия в константах равновесия связывания компонентов смеси с
поверхностью сорбента;
Аффинная хроматография. Сорбент представляет собой твердый
носитель, к которому химически присоединены специальные группировки
- лиганды, избирательно связывающие какой-либо из компонентов
разделяемой смеси; остальные компоненты раствора не взаимодействуют с
носителем и выходят в свободном объеме колонки).
Существуют приемы хроматографии, основанные и на других
принципах, так что арсенал хроматографических методов достаточно
разнообразен.
Электрофорез — направленное движение коллоидных частиц или
макроионов под действием внешнего электрического поля.
изотахофорез (ИТФ) — метод разделения различных типов ионов по
их подвижности в электрическом поле. При ИТФ все виды ионов
мигрируют в одном направлении, образуя набор зон, находящихся в
равновесном состоянии и перемещающимися с одинаковыми скоростями.
электрофокусирование - метод разделения белков, основанный на
перемещении их молекул под действием постоянного напряжения в
область с величиной pH, соответствующей, изоэлектрической точке
данного белка
Мембранные технологии

Мембранные методы используют в биотехнологии для выделения,

очистки и концентрирования продуктов. Все они внешне похожи на
фильтрацию (поскольку схема процесса включает в себя
59
полупроницаемую перегородку), но предназначены для разделения частиц
разного размера и несколько отличаются по движущей силе процесса и
аппаратурному оформлению (табл.1).

Таблица 1- Границы применения мембранных методов

разделения

Метод Пределы, Примеры Области

мкм объектов применения
-4
диализ, 5•10 -5 аминокислоты обессоливание
обратный -2 , сахара, прочие воды, очистка
осмос •10 низкомолекулярные низкомолекулярных
метаболиты продуктов
-3
ультрафильт 5 •10 - биополимеры очистка
рация -1 вирусы, рибосомы, биополимеров,
5•10 мелкие бактерии стерилизация
питательных сред и
продуктов
-1
микрофильт 10 – 10 крупные удаление
рация бактерии, мелких частиц
микроскопические примесей,
грибы, предварительная
культивируемые стерилизация
эукариотические
клетки
обычная >1,0 мкм механические удаление
фильтрация частицы, пыльца механических
растений примесей

В процессах выделения и очистки продукта чаще используют

мембранные методы другого типа: диализ, ультрафилътрация и обратный
осмос, которые позволяют «фильтровать» уже не только твердую фазу, но
и просто растворенные в жидкости молекулы, причем не обязательно
очень большие по размеру.
Процесс заключается в том, что на пути потока суспензии
устанавливается полупроницаемая перегородка - фильтр, через которую
свободно проникает дисперсионная среда - жидкость или газ - и не
проникает дисперсная фаза - пыль, частицы осадка и т.п. Простейшими
материалами, используемыми для приготовления полупроницаемых
перегородок являются ткани, специальные сорта бумаги, слои
волокнистых материалов (вата, асбест, стекловолокно), которые
задерживают достаточно крупные частицы дисперсной фазы.
С их помощью появляется возможность не только разделять
суспензии, но и фракционировать смеси белков по размерам молекул,
концентрировать белковые фракции различного молекулярного веса,
производить обессоливание воды и т.п.

60
 В последние годы интенсивно разрабатывается технология
препаративной очистки различных продуктов биосинтеза с
использованием ионообменных или содержащих аффинные лиганды
мембран (мембранная хроматография). Применение мембранной
хроматографии позволяет обеспечить высокую производительность по
потоку в сочетании с высокой селективностью. Повышенная по сравнению
с гранульными хроматографическими материалами производительность
по потоку у мембранных адсорберов достигается за счет снятия
диффузионных ограничений для разделяемых компонентов.

Общие принципы фракционирования экстрактов

биологического сырья

После отделения биомассы продуцента от культуральной жидкости

начинается процесс очистки целевого продукта, который содержится либо
в клеточной массе, либо в культуральной жидкости.
Если продукт находится в культуральной жидкости (внеклеточный
продукт), можно сразу переходить к ее фракционированию.
Если продукт находится в составе биомассы (внутриклеточный
продукт), необходимо предварительно разрушить клетки (процедура
дезинтеграции), чтобы получить некоторый раствор, из которого далее
можно выделять продукт.
Механическая дезинтеграция. Наиболее распространенными в
промышленности являются физические методы, среди которых, в свою
очередь, чаще всего применяются баллистические методы дезинтеграции
клеточной массы. Сущность этой группы методов состоит в том, что
биомассу подвергают воздействию удара или истирания (рис. 20).

Ввод и вывод
охлаждения

Загрузка и выгрузка
биомассы

Рисунок 20 - Механическая дезинтеграция: вращающийся барабан с

рубашкой для охлаждения. В барабан загружены шары из твердого материала
(керамики), а затем загружается разрушаемая биомасса. При вращении барабана
происходит раздавливание клеток за счет столкновения с шарами, которые вращаются
вокруг собственных осей, падают сверху на частицы биомассы. В конце концов, это
приводит к разрушению клеточных стенок и получению сравнительно однородного
вязкого раствора, в котором находится содержимое клеток.

61
 Другим способом механической дезинтеграции клеток является
экструзия. Сущность этого способа заключается в том, что суспензию
клеточной массы под высоким давлением (до 100 атм) продавливают через
узкое отверстие в камеру с нормальным давлением. При этом из-за
большого перепада давления вода, попавшая под действием высокого
давления в клетки, быстро выходит из них и разрушает клеточную стенку.
При создании высокого давления и продавливании суспензии через узкое
отверстие происходит разогрев, так что во избежание потерь продукта из-
за термоинактивации и в этом случае необходимо охлаждение суспензии.
Степень разрушения клеток при таком способе составляет до 90%.
В лабораторной практике применяется способ разрушения клеток,
основанный на чередовании быстрого замораживания и оттаивания
клеточной массы. При этом вода, входящая в состав клеток, замерзает,
образовавшиеся частицы льда, превосходящие по объему воду в жидком
состоянии, разрывают клеточную стенку. Повторение таких процедур
несколько раз приводит к достаточно полному разрушению клеточных
стенок.
Ультразвуковая дезинтеграция. Помимо механических способов
разрушения клеток, используются приемы, основанные на воздействии на
клетки ультразвука. Под действием ультразвукового поля клетки
испытывают попеременные сжатия и растяжения, скручивание в
различных направлениях, что, в конце концов, приводит к разрыву
клеточной стенки и разрушению клетки.
Как и в случае баллистических методов, операция дезинтеграции с
помощью ультразвука может осуществляться как в периодическом, так и в
непрерывном (проточном) режиме. Для этой цели сконструированы
специальные ячейки, позволяющие прокачивать суспензию разрушаемой
биомассы (со скоростью до нескольких литров в минуту при концентрации
клеток в суспензии до 20 %) и поддерживать при этом температуру не
свыше 2–4oС.
Степень разрушения и в этом случае оценивается по выходу белка в
раствор и составляет до 60 % за один цикл. Для более полного разрушения
биомассу можно возвращать в цикл.
Химическая дезинтеграция. Иногда более удобным оказывается
разрушение клеточной оболочки за счет перевода в раствор отдельных ее
компонентов – изменения ее состава и структуры, что делает ее более
проницаемой для клеточного содержимого.
Одним из таких методов является детергентный лизис клеток
(рис.21). Биомасса продуцента обрабатывается каким-либо из детергентов,
который растворяет липидные компоненты клеточной стенки, после чего
внутриклеточное содержимое через образовавшиеся поры вытекает в
окружающую среду. Подобный процесс также может проводиться в
непрерывном режиме.
62
 1 2 3 2

Рисунок 21 – Схема детергентного лизиса клеток: 1- резервуар с суспензией

биомассы в растворе литического агента; 2 – теплообменники; 3 – реактор для
экстракции: В аппарат 1 загружается суспензия биомассы в растворе литического
агента. Этот аппарат является резервуаром, из которого суспензия попадает в
теплообменник 2, где подогревается до температуры, при которой происходит лизис (в
аппарате 3). После пребывания в реакторе 3 суспензия попадает в другой
теплообменник, где она охлаждается – во избежание длительного пребывания при
повышенной температуре, что может привести к разрушению целевого продукта.
Время контакта биомассы с литическим агентом задается скоростью прокачивания
суспензии через систему и рассчитывается, исходя из скорости лизиса данной
биомассы данным литическим агентом.

В качестве литических агентов используются детергенты, но по

аналогичной схеме могут использоваться и ферменты, разрушающие
клеточные стенки продуцента.
Известны ферменты, пригодные для лизиса клеток различных
микроорганизмов. В случае бактерий часто используют лизоцим куриных
яиц, который расщепляет гликопротеидный каркас клеточных стенок.
Наиболее приемлемо использование лизоцима для разрушения клеточных
стенок грамположительных бактерий, однако и грамотрицательные
бактерии в достаточной степени восприимчивы к действию лизоцима.

Концентрирование, обезвоживание, модификация и

стабилизация продукта

За отделением продукта следует его концентрирование. Основные

методы концентрирования — обратный осмос, ультрафильтрация,
выпаривание.
Если мембрана пропускает воду, задерживая растворенные в ней
вещества, речь идет об осмосе.
Прямой осмос — диффузия веществ через мембрану, разделяющую
раствор и растворитель. Как правило, раствор помещают в мешок из
полупроницаемого материала, и этот мешок погружают в сосуд с
63
растворителем. Растворитель, поступающий извне, оказывает на мешок
давление, называемое осмотическим. Если к раствору приложить внешнее
давление, превышающее осмотическое, то растворитель вытекает через
полупроницаемую мембрану против градиента концентрации
растворенного вещества, т. е. происходит дальнейшее концентрирование
раствора. Подобный процесс представляет собой обратный осмос,
используемый как метод концентрирования продукта.
Ультрафильтрация — отделение веществ с помощью мембранных
фильтров. Некоторые марки фильтров предназначены для отделения лишь
сравнительно крупных частиц: иммуноглобулинов, коллоидных агрегатов,
вирусов. Мембраны с наиболее мелкими порами задерживают молекулы
органических кислот. При умеренно высоком давлении (200—400 кПа),
приложенном к жидкости, скорость ее протока через фильтр достаточно
высока для быстрой и эффективной ультрафильтрации. Технология
ультрафильтрации подкупает своей простотой, относительной
экономичностью и мягким, щадящим обращением с продуктом. Здесь не
требуется изменения рН, ионной силы раствора или перевода продукта в
другую фазу. Этим объясняется перспективность ультрафильтрации для
концентрирования таких малостабильных продуктов, как молочная и
глутаминовая кислоты, некоторые антибиотики и ферменты, витамин В12.
Метод выпаривания, наиболее древний и известный еще
алхимикам, обладает очевидным недостатком: для удаления воды или
иного растворителя раствор необходимо нагревать. В производственных
условиях чаще используют вакуум-выпарные аппараты, и температура
выпаривания, соответственно и вред, причиняемый термолабильным
веществам, могут быть снижены в зависимости от уровня снижения
давления в выпарном аппарате по сравнению с атмосферным.
Нагревающим агентом чаще всего служит водяной пар, хотя используют
также обогрев жидким теплоносителем или электрообогрев. Пар
характеризуется большой теплотой конденсации и облегчает регулировку
процесса выпаривания.
Выпарные аппараты бывают периодически и непрырывно
действующие, с однократной и многократной циркуляцией кипящего
раствора. Теплообмен между нагревающим агентом и выпариваемым
раствором обеспечивается системой труб, змеевиков или паровой
рубашкой. Необходимо добиваться равномерного обогрева раствора без
локального перегрева. Перспективные методы выпаривания
чувствительных к нагреванию веществ состоят в использовании дисковых
и пленочных выпарных аппаратов, в которых испарение стимулируется в
результате растекания жидкости тонким слоем по нагретой поверхности.
Выпаривание может быть ограничено стадией получения густого
сиропообразного раствора целевого продукта. В этом случае вся процедура
называется упариванием, а полученный продукт относится к категории
жидких. Исчерпывающее удаление влаги, оставшейся после упаривания,
64
обратного осмоса, ультрафильтрации, ведет к получению «сухого
продукта» и выделяется технологами в особую стадию — обезвоживание
продукта (сушка).
Обезвоживание продукта - сушка на подносах, на ленточном
конвейере с подогревом, подачей газообразного нагревательного агента
(воздух, СО2, дымовые или топочные газы и др.) в сушильный аппарат, в
вакуум - сушильных шкафах, в барабанных и распылительных сушилках.
Для удаления влаги применяется распылительная сушка (рис. 22).

Рисунок 22 - Распылительная сушка: 1 – камера сушилки; 2- форсунка; 3-

шнек для выгрузки высушенного материала; 4- циклон; 5- рукавный фильтр; 6-
вентилятор; 7- калорифер

Раствор продукта подается в форсунку, через которую распыляется в

противоположно направленный поток горячего воздуха. Мелкие капли
раствора быстро испаряются, продукт при этом нагревается мало за счет
отдачи тепла на испарение, термоинактивации не происходит. Имеет место
унос продукта током воздуха, необходимо улавливание.
Модификация продукта - перестройка полученных соединений
животного, растительного или микробного происхождения с целью
придания им специфических свойств, необходимых человеку.
Химическая модификация необходима в тех случаях, когда
биотехнологический процесс дает лишь «заготовку» целевого продукта.
Модификация - необходимый этап в получении ряда ферментов,
гормонов, препаратов медицинского назначения. Например, у бычьего
инсулина «отстригают» аминокислотные остатки, после чего он
становится идентичным человеческому гормону.
Химическая модификация необходима в тех случаях, когда
биотехнологический процесс сам по себе дает лишь «заготовку» целевого
продукта. Так, антибиотик, продуцируемый микробной культурой, путем
химических перестроек может быть превращен в различные медицинские
препараты. Пенициллин G, образуемый Penicillium notatum,
модифицируют с целью получения ампициллина, метициллина и других
полусинтетических пенициллинов. В некоторых случаях достаточно,
65
чтобы организм синтезировал определенную структуру, к которой
химическим путем присоединяют необходимые заместители.
Иногда биообъект участвует лишь на одном каком-либо этапе (или
немногих этапах) в цепи химических процессов, ведущих к синтезу
целевого продукта. Важный пример — придание продукту оптической
асимметрии, что позволяет избежать трудоемких химических синтезов.
Биообъект (скажем, дрожжи) избирательно потребляет один из изомеров
(например, только L-аминокислоты), в среде остается его оптический
антипод. Подобная технология известна со времен Луи Пастера. Биообъект
в подобных случаях уподобляется одному из реактивов в наборе химика-
органика, т. е. речь идет о микробной,, говоря шире, биотехнологической
химии (Г. К- Скрябин, Л. А. Головлева, 1985).
Модификация — необходимый этап в получении ряда ферментов,
гормонов, препаратов медицинского назначения. Речь идет о перестройке
соединений животного, растительного или микробного происхождения с
целью придания им специфических свойств, необходимых человеку. У
бычьего инсулина «отстригают» аминокислотные остатки, после чего он
становится идентичным человеческому гормону.
Генно-инженерные белки часто наряду с нужными человеку несут
балластные аминокислотные последовательности. Короткие пептиды
(соматостатин и др.) обычно получают в составе химерных белков,
включающих аминокислотную последовательность р-галактозидазы Е. coli
или другого бактериального белка. Химическая модификация сводится в
этом случае к отщеплению лишних аминокислотных последовательностей.
Если продукт получают в виде мультимера (способ защиты от
внутриклеточных протеаз), необходимо его последующее «нарезание» на
функционально активные мономеры.
Стабилизация продукта направлена на сохранение свойств
продукта в период его хранения и использования потребителем
(добавление наполнителей, модификация и др.). Включает физико-
химические воздействия на продукт.
Сушка повышает устойчивость продукта к внешним воздействиям.
Обезвоживание ферментов вызывает их устойчивость к нагреванию.
К стабилизации продуктов, в том числе кормового микробного
белка, ведет добавление наполнителей из грибного мицелия, пшеничных
отрубей, кукурузной муки, которые сами обладают питательной
ценностью.
Стабильность - неизменность свойств содержащихся в растворах
лекарственных веществ - достигается подбором оптимальных условий
стерилизации, использованием консервантов, применением
стабилизаторов, соответствующих природе лекарственных веществ.
Стабилизация солей сильных оснований и слабых кислот
осуществляется добавлением щелочи или натрия гидрокарбоната.

66
 К числу солей, стабилизируемых едким натрием или натрия
гидрокарбонатом, относятся: никотиновая кислота, кофеин-бензоат натрия,
натрия тиосульфат, натрия нитрит.

Товарная форма продукта

Для продуктов, предназначенных для длительного хранения в

крупных фасовках, в качестве наполнителя в составе товарной формы
должны присутствовать компоненты, препятствующие слеживанию
продукта.
Для продуктов, предназначенных для применения в виде
распыляемых порошков или растворов (микробиологические средства
защиты растений и т.п.) в состав рецептур вводят компоненты,
обеспечивающие смачивание поверхности, на которой продукт должен
находиться для проявления своих свойств (например, поверхностно
активные вещества).
Для ферментных и других белковых препаратов в качестве
наполнителей используются компоненты, стабилизирующие белковые
вещества по отношению к внешним воздействиям.

Правила GMP, GLP, GAP

Как биотехнологическая продукция, так и процесс ее производства

подвергаются строгому контролю качества. Наиболее строгий контроль за
качеством продукции осуществляется при производстве лекарственных
средств и их компонентов.
GMP – единая система требований к организации производства и
контролю качества лекарственных средств от начала переработки сырья до
получения готовых продуктов.
Существуют национальные Правила GMP, региональные (Правила
стран Европейского Экономического Сообщества, Правила стран-
участников «Соглашения по фармацевтическому контролю» –
Pharmaceutical Inspection Convention, PIC, Правила стран-членов
Ассоциации стран Юго-Восточной Азии) и международные правила GMP
– Правила Всемирной организации здравоохранения.
ХАССП — это предупреждающая система, которая используется
в пищевой промышленности как гарантия безопасности производимых
продуктов. Эта система определяет систематический подход к анализу
обработки и производства продуктов питания, распознаванию любых
возможных рисков химического, физического и биологического
происхождения и контроля.

67
 Контрольные вопросы

1. Назовите границы использования различных методов разделения

суспензий по размеру частиц.
2. В чем состоят особенности методов отстаивания для отделения
биомассы микроорганизмов?
3. Какую роль играют процессы коагуляции и флокуляции при
отделении биомассы микроорганизмов от культуральной жидкости?
5. Как определяется сепарируемость культуральных жидкостей?
6. Какова движущая сила процессов сепарирования и
цеитрифугирования биомассы микроорганизмов?
7. Поясните различие между ситовым и объемным принципами
фильтрации суспензий.
8. Какие материалы используются в биотехнологии в качестве
фильтровальных порошков?
9. Микрофильтрация: что обеспечивает возможность высоких
скоростей фильтрации при достаточно концентрированных суспензиях?
10. На чем основана флотация микроорганизмов?
11. Чем отличаются ферментативные методы дезинтеграции от
автолиза?
12. Какие существуют разновидности хроматографии?
13. Объясните необходимость введения международных правил
организации биотехнологических производств.

ТЕМА 6
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ:
ПРОИЗВОДСТВО МИКРОБНОГО БЕЛКА

Промышленная биотехнология – это наука о получении различных

целевых продуктов на основе жизнедеятельности микроорганизмов.
Промышленная микробиология биотехнология (или техническая
микробиология) в настоящее время представляет собой крупнотоннажную
отрасль современной промышленной биотехнологии.
Микробиологический синтез – промышленный способ получения
химических соединений и продуктов (например, дрожжей),
осуществляемый благодаря жизнедеятельности микробных клеток. В
настоящее время в различных процессах промышленной микробиологии
получают различные соединения.
Важнейшие среди них: алкалоиды, аминокислоты, антибиотики,
антиметаболиты, антиоксиданты, белки, витамины, гербициды,
инсектициды, коферменты, липиды, нуклеиновые кислоты, органические
кислоты, пигменты, ПАВ, полисахариды, полиоксиалканоаты,

68
противоопухолевые агенты, растворители, сахара, стерины, ферменты,
нуклеотиды, нуклеозиды, эмульгаторы.

История промышленной биотехнологии

1. Допастеровский период до 1865г. (приготовление хлеба,

молочных продуктов (сыры, йогурт), получение спиртосодержащих
напитков (вино, пиво) и других продуктов на основе процессов брожения
(уксус).
2. Пастеровский период (1865-1940гг.), включающий
промышленное культивирование микроорганизмов с целью получения
продуктов брожения (этанол, бутанол, ацетон, глицерол, органические
кислоты).
3. Производство антибиотиков (1940-1960гг.), период,
включающий промышленное производство пенициллина, стрептомицина,
хлортетрациклина и др. и микробное превращение стероидов (получение
кортизона, тестостерона, эстрогена).
4. Период расширения круга промышленно производимых
микробных продуктов (1960-1975гг.) Микробиологическое производство
аминокислот (глутамин и лизин), разработка методик производства
микробного белка, производство ферментов (протеазы, амилазы,
глюкозоизомеразы), промышленное применение иммобилизованных
ферментов (глюкозоизомераза), производство бактериальных
полисахаридов (ксантан).
5. Развитие синтетической биотехнологии (с 1975г. по настоящее
время), включающий разработку технологий рекомбинантной ДНК и
получение с ее использованием первых продуктов в 1982г. (инсулин
человека, вакцины против диареи животных).

Промышленное производство микробного белка

Наиболее распространенным видом сырья для производства

белковых препаратов в промышленных масштабах является молочная
сыворотка. На молочной сыворотке хорошо растут и накапливают
значительное количество белка дрожжи K l u y v e r o m y c e s и C a n d i d a .
Большое значение имеет и то обстоятельство, что применение молочной
сыворотки не требует специальной, сложной подготовки, а культуральная
жидкость после выращивания микроорганизмов может быть использована
в пищевых и кормовых целях без обработки.
При всестороннем исследовании микробной массы, полученной на
молочной сыворотке, была выявлена ее высокая технологическая и
экономическая эффективность для мясного и молочного животноводства,
птицеводства и целого ряда других направлений.
Для получения белка на гидролизатах растительного сырья
наиболее часто используют дрожжи рода C a n d i d a , реже - дрожжи рода
69
T r i c h o s p o r o n . Также дрожжи рода C a n d i d a способны к синтезу белка
на сульфитных щелоках и жидких углеводородах. Газообразные
углеводороды хорошо потребляются бактериями родов M y c o b a c t e r i u m
и Pseudоmonas.
Применение биомассы микроорганизмов в качестве белковой
добавки в корма требует всестороннего изучения ее состава и свойств, в
частности перевариваемости и усвояемости. Испытанию на токсичность
должны подвергаться не только живые клетки, но и продукты их
метаболизма, а также готовые белковые продукты. Обязательным
условием должно быть отсутствие в них живых клеток штамма-
продуцента, чтобы не происходил вторичный рост.
Независимо от вида используемого сырья, технологический процесс
производства микробных белковых препаратов состоит из следующих
основных стадий: подготовки сырья и приготовления питательных сред
для выращивания микроорганизмов; получения посевного материала;
культивирования микроорганизмов; выделения биомассы продуцента из
культуральной жидкости; термообработки суспензии; концентрирования
биомассы; сушки биомассы; фасовки и упаковки готового препарата (рис.
23).
Технологические потоки из всех подготовительных отделений
поступают на главную стадию производства - стадию ферментации. После
стадии ферментации получают микробную суспензию, которая поступает в
отделение сгущения суспензии микроорганизмов.
Основной задачей стадии сгущения или выделения является
повышение концентрации биомассы за счет механического отделения
большей части межклеточной влаги. Наиболее широко используется
разделение на центробежных сепараторах, иногда в сочетании с
коагуляцией, флотацией или декантацией. Сконцентрированная микробная
суспензия должна пройти стадию термообработки, в процессе которой при
температуре 75-85ºС в течение 10-40 мин погибает штамм-продуцент и
практически вся сопутствующая микрофлора. Наличие этой стадии
необходимо для получения готового продукта из инактивированных
клеток.
Дальнейшее концентрирование суспензии проводят в вакуум-
выпарной установке, где температура кипения постепенно снижается (1-й
корпус - 90ºС, 2-й - 75, 3-й - 60ºС).
Суспензия с определенной концентрацией поступает в отделение
сушки, где и происходит образование готового продукта влажностью 10 %.
В процессе сушки из клеток микроорганизмов удаляется большая часть
межклеточной влаги, что позволяет получить стабильную при хранении и
удобную в потреблении кормовую биомассу.

70
 Сырье

Подработка сырья
(измельчение, гидролиз и т.д.)

Приготовление питательной среды

Культивирование микроорганизмов

Сгущение суспензии
микроорганизмов

Термообработка суспензии

Концентрирование биомассы

Сушка

Фасовка и упаковка

Рисунок 23 - Основные стадии процесса производства микробных белковых

препаратов

В основном используются конвективные сушилки (распылительные,

кипящего слоя, ленточные и барабанные). В крупнотоннажном
производстве белковых веществ применяются распылительные сушилки,
обеспечивающие малые потери биомассы и большую производительность.
Иногда готовый продукт необходимо получить в виде гранул, тогда в
технологический процесс включают отделение грануляции. Сухая и
влажная биомасса 1:1 поступает во вращающийся барабанный гранулятор.
Влажная биомасса налипает на сухие частицы, и вся масса влажностью 45-
50 % движется по аппарату, формируя гранулы, которые шнековым
транспортером подаются в сушилку кипящего слоя. Гранулы
подсушиваются до влажности 8-10 % и подаются на классификатор.
Товарные гранулы попадают в сборник готового продукта, мелкие гранулы
возвращаются в гранулятор.
Заключительной стадией процесса получения кормовой биомассы
является стадия фасовки и упаковки готового продукта. Сухая биомасса
71
(порошок или гранулы) поступает в приемный бункер и фасуется в
бумажные мешки с клапаном массой 25-30 кг.
Кроме того, технологический процесс получения белковых веществ
включает стадию очистки газовоздушных выбросов, представляющих
собой большие объемы воздуха, содержащего живые клетки
микроорганизмов, белковую пыль, другие продукты микробного синтеза.

Возможности использования белковых препаратов

в производстве пищевых продуктов

Наиболее эффективным путем использования микробного белка для

ликвидации белкового дефицита в питании человека является его
применение непосредственно для пищевых целей. Микробный белок
используется в пищевой промышленности для изготовления различных
продуктов и полуфабрикатов начиная с 1985 г.
В производстве пищевых продуктов рассматриваются 3 основные
формы использования микробного белка:
1. Цельная биомасса (без специального разрушения клеточных
стенок).
2. Частично очищенная биомасса (разрушение клеточных стенок и
удаление нежелательных компонентов).
3. Выделенные из биомассы белки.
Выделенные белки (и з о л я т ы) являются наиболее приемлемыми
формами использования белковых препаратов. Однако недостаток их
применения связан с тем, что при их выделении используются кислоты и
щелочи, высокая температура, давление, что приводит к частичному
разрушению аминокислот.
При микробном синтезе белка следует подбирать культуры, у
которых состав белка по незаменимым аминокислотам был бы близок к
эталону, установленному Всемирной организацией здравоохранения
(ВОЗ), - яичному белку, белку женского молока.
По заключению, белок микроорганизмов может использоваться в
продуктах питания, но допустимое количество нуклеиновых кислот,
вводимых вместе с микробным белком в диету взрослого человека, не
должно превышать 2 г в сутки. Обычно 2 г нуклеиновых кислот
содержится в 20-30 г высушенной биомассы дрожжей или 10-20 г
бактерий. Клетки могут быть освобождены от нуклеиновых кислот по
методу теплового шока, вызывающего активизацию внутриклеточных
РНКаз. По этому методу дрожжи в течение нескольких секунд подвергают
действию высокой температуры, а затем выдерживают несколько часов
при температуре 50-55оС.

72
 Контрольные вопросы

1. Каковы преимущества микробного белка перед другими

источниками?
2. Перечислите требования к продуцентам белка.
3. Назовите достоинства и недостатки получения белка с
помощью дрожжей, микроскопических грибов, бактерий, водорослей.
4. Охарактеризуйте основные стадии процесса производства
микробных белковых препаратов.
5. Приведите основные формы использования микробного белка.
6. Какие существуют ограничения по применению микробного
белка в пищу человека?

ТЕМА 7
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ: ПРОИЗВОДСТВО
АМИНОКИСЛОТ

Аминокислоты - это органические соединения, содержащие

одновременно щелочную аминную группу (NH2-) и кислотную
карбоксильную (СООН-). Отсюда и их название: Амино-Кислоты.
Важным свойством аминокислот является их способность к
поликонденсации и образованию полимеров в виде полиамидов, в том
числе пептидов, белков, нейлона, капрона, энанта.
Из определённого класса аминокислот (альфа-аминокислоты)
собираются молекулы природных белков.
По объему производства среди соединений, производимых
биотехнологическими способами, аминокислоты стоят на первом месте,
а по стоимости – на втором, уступая в этом только антибиотикам.
Объем мирового производства аминокислот составляет более 500
тыс. т. в год. Из них – 300 тыс. т. – глутамат натрия, 100 тыс. т. – лизин,
140 тыс. т. – метионин. Однако эти объемы – лишь небольшая часть
требуемого количества аминокислот.

Способы получения аминокислот

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1. Гидролизом природного белковосодержащего сырья.
2. Химическим синтезом.
3. Микробиологическим синтезом.
4. Биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью
микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-
микробиологический метод).
Гидролиз природного белковосодержащего сырья. В качестве
источников для гидролиза используют: отходы мясоперерабатывающей
73
промышленности (отходы обработки животного сырья, кровь и т.д.),
яичный белок, казеин молока, клейковина пшеницы, соевый шрот, мясо,
молоко (казеин), семена бобовых культур (соя) и т.д. В Китае налажено
производство L-цистеина (3000 т) из человеческого волоса.
При гидролизе белоксодержащее сырье нагревают с растворами
кислот и щелочей, при температуре от 100 до 105ºС в течение 20-48 часов.
При этом аминокислоты переходят в гидролизат. Кислотный гидролиз
белка обычно приводит к образованию смеси из 18 L-аминокислот.
Раньше методом гидролиза получали аминокислоты исключительно
для фармацевтических и научных целей. Сейчас сфера использования
белковых гидролизатов существенно расширилась. Их применяют в
медицине, животноводстве, пищевой и микробиологической
промышленности.
Недостатки метода:
Для выделения отдельных аминокислот из гидролизата проводят
сложную многостадийную очистку, включающую в себя:
- нейтрализацию среды выделения,
- ионообменную хроматографию,
- аффинную хроматографию,
- концентрирование АК,
- лиофилизацию АК с последующей фасовкой.
Основные недостатки данного способа:
1. Сложность процесса выделения и очистки.
2. Кроме того, само сырье считается дефицитным и дорогим,
поэтому аминокислоты имеют высокую себестоимость.
3. Часть аминокислот может разрушиться (таких как триптофан,
цистеин, метионин, тирозин).
Химический синтез аминокислот занимает второе место по объему
производства (около 30%). Аминокислоты синтезируются химически на
основе определённых (не биогенных) соединений, обычно в несколько
этапов. Используя метод химического синтеза аминокислот целевой
продукт получают в виде рацемической смеси D- и L-стереоизомерных
форм. Подавляющее большинство природных аминокислот относится к L-
ряду.
Основные недостатки химического синтеза:
1. Получение смеси аминокислот, состоящей из D- и L-изомеров
(биологической активностью в организме человека и животных обладают
лишь L-изомеры).
Некоторые из D-изомеров токсичны для человека и животных.
Исключением в этом отношении является метионин, у которого
биологически активными являются как D-, так и L-изомеры, в связи, с чем
данная аминокислота производится преимущественно путем химического
синтеза.

74
 2. Производство аминокислот связано с использованием
дорогостоящего оборудования и агрессивных токсических соединений в
качестве исходного сырья.
3. Процесс, как правило, протекает при высокой температуре,
4. Требует дорогостоящих катализаторов,
5. Сопровождается образованием побочных продуктов,
6. Загрязняет окружающую среду,
7. Небезопасно и вредно для обслуживающего персонала.
Химико-энзиматический синтез осуществляется в два этапа. На
первом этапе получают предшественник аминокислоты, например
карбоновую кислоту.
На втором этапе это предшественник превращают с помощью
ферментов микроорганизмов в соответствующую L-аминокислоту.

Недостатки метода:
Первый этап – это химический синтез предшественника, со всеми
особенностями этого метода.
В ряде случаев синтез предшественника и его последующее
превращение в аминокислоту являются трудоёмкими и дорогостоящими.
Метод используется для получения L-аспарагиновой кислоты
из фумаровой кислоты и аммиака в присутствии фермента аспартазы.
Источник фермента – иммобилмзованные клетки бактерий, например,
Escherichia coli или Serratia marcescens. Аналогичным образом из
коричной кислоты в присутствии клеток дрожжей получают L-
фенилаланин.

Микробиологический способ производства аминокислот

Более 60 % всех производимых чистых препаратов аминокислот

получают путем микробиологического синтеза. Это значительно облегчает
выделение и очистку аминокислот и позволяет получать препараты с
низкой себестоимостью. Микроорганизмы, образующие аминокислоты, не
накапливают их в клетке, а постоянно выделяют в питательную среду.
Поэтому аминокислоты выделяют из фильтата культуральной жидкости.
При прямом микробиологическом синтезе специально полученные
бактерии-продуценты при росте на жидких средах простого состава
потребляют источники углерода и азота, а взамен выделяют в среду
целевую аминокислоту.
Преимущества метода:
1. Микроорганизмы синтезируют биологически активные L-
аминокислоты.
2. Используется сравнительно простое оборудование.
3. Используются возобновляемые сырьё и простые минеральные
соли
75
 4. Отходы производства небольшие. Возможно организация
безотходного экологически чистого процесса.
5. Процесс биосинтеза осуществляется при невысоких температурах
и производство не сопряжено с серьёзной опасностью для работающего
персонала.
С помощью микробиологического синтеза сегодня получают многие
заменимые и незаменимые аминокислоты: глутаминовую кислоту, лизин,
треонин, триптофан, аргинин, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин,
пролин, серин. В процессе разработки и продуценты других аминокислот.
В качестве продуцентов аминокислот используют генетически
измененные штаммы, обладающие способностью к сверхсинтезу
аминокислот.
Лучшими продуцентами аминокислот являются ауксотрофные
мутанты (микроорганизмы, лишенные ряда ферментных систем, поэтому
очень требовательны к составу питательной среды, в которой должно
присутствовать большое количество факторов роста). Ауксотрофные
мутанты применяются, когда необходимо синтезировать соединения
являющиеся конечными продуктами разветвленных цепей метаболических
реакций, например: L-аспартат является общим предшественником для L-
лизина, L-треонина, L-метионина и L-изолейцина. Первая реакция в
процессе образования этих аминокислот катализируется аспартокиназой,
активность, которой может быть ингибирована по механизму
отрицательной обратной связи при совместном действии L-лизина, L-
треонина. У мутантов ауксотрофных по гомосерину или треонину
(метионину) существенно уменьшается внутриклеточная концентрация L-
треонина, что снимает блокаду с аспартокиназы и позволяет клеткам
накапливать L-лизин.
Ауксотрофные мутанты способны накапливать конечные продукты
неразветвленных путей биосинтеза. В таких случаях приходится отбирать
мутанты с частично нарушенной регуляцией биосинтеза, что позволяет
получить повышенный выход конечного продукта. Такие
мутанты называются регуляторными, их отбирают по устойчивости к
аналогам аминокислот или среди ревертантов ауксотрофов. В основе
использования аналогов аминокислот лежит сходство с природными
аминокислотами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект может
быть уменьшен путем добавления соответствующей аминокислоты.
Таким образом, аналоги выступают в роли искусственных,
работающих по принципу отрицательной обратной связи, ингибиторов
ферментов, обеспечивающих биосинтез природных аминокислот и
одновременно подавляют процесс включения их в белки.
Для увеличения выхода аминокислот можно воспользоваться как
ауксотрофией, так и дефектами регуляции одновременно. Например, у
Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum сверхпродукции L-
треонина не наблюдается, т.к. не происходит сочетанного ингибирования
76
по механизму отрицательной обратной связи аспартокиназы L-треонином,
и L-лизином, а L-треонин ингибирует гомосеридегидрогеназу. Мутант,
устойчивый к аналогу треонина синтезирует в избыточном количестве
треонин, т.к. его ферменты ингибированные этой аминокислотой,
десенсибилизированы. Гомосеридегидрогеназа и киназа, принимающие
участие в синтезе треонина также «выключаются» L-метиокином, и
поэтому ауксотрофы по метионину образуют L-треонин с еще большим
выходом.
Регуляторные мутанты можно получить путем трансдукции, проводя
отбор мутаций, вызывающих полное рассогласование регуляторных
механизмов, затем объединяя эти признаки путем трансдукции.
Также в качестве продуцентов аминокислот используют
грамположительные бесспоровые бактерии родов: Corynebacterium,
Brevibacterium, Micrococcus. Виды Corynebacterium или Brevibacterium,
выращиваемые на углеродном сырье, на этиловом спирте или ацетате при
наличии достаточного количества биотина в питательной среде способны
синтезировать до 30 г/л глутамата.
Организацию промышленного производства L-аминокислот с
помощью микроорганизмов осуществляют по двум технологическим
схемам. Они различаюся стадией получения культуральной жидкости. В
первой предполагается производство культуральной жидкости в две
ступени (двухступенчатый способ), во второй - в одну ступень
(одноступенчатый способ).
Двухступенчатый способ основан на использовании в качестве
источника сырья одного из предшественников необходимой
аминокислоты, полученного химическим или биологическим методом.
Образование и подготовка необходимого предшественника является
первой ступенью производства. На этой же стадии получают ферментный
препарат (как правило, микробного происхождения), при участии которого
будет осуществляться трансформация предшественника в целевую
аминокислоту.
Вторая стадия представляет собой собственно процесс
трансформации предшественника в целевую аминокислоту с помощью
ферментных систем микроорганизма, выращенного на первой стадии.
Одноступенчатый способ синтеза аминокислот получил наибольшее
распространение. Он основан на культивировании строго определенного
штамма - продуцента целевой аминокислоты на среде заданного состава
при соответствующих параметрах процесса ферментации. Используемый
штамм обладает способностью к сверзсинтезу необходимой
аминокислоты. Для этой цели выбирают полиауксотрофные мутанты, то
есть те микроорганизмы, которые утратили способность самостоятельно
синтезировать необходимые для роста и развития различные
аминокислоты, но имеют способность к сверхсинтезу целевой
аминокислоты. Такие мутанты получают либо путем воздействия
77
различных мутагенов физической и химической природы на исходную
культуру микроорганизма с последующей селекцией штамма по заранее
заданным признакам, либо методом генной инженерии.

Технология получения аминокислот микробиологическим

методом

Для получения аминокислоты штамм-продуцент культивируют, т.е.

выращивают в ферментёре. Процесс включает следующие этапы:
1. Приготовление питательных сред и добавок.
2. Подготовка ферментёров к работе.
3. Засев «посевного» ферментера и выращивание в нём
посевного материала.
4. Засев ферментационной среды в рабочем ферментёре
посевным материалом.
5. Процесс «ферментации» аминокислоты в ферментёре в условиях
интенсивной аэрации и pH-статирования при дробной подаче источника
углерода и азота.
6. По завершению «ферментации» отделяют биомассу (фильтрацией,
сепарированием или центрифугированием на проточной центрифуге).
7. Выделение аминокислоты из культуральной жидкости обычно
проводят методом ионного обмена на колоннах с ионообменной смолой.
8. Раствор, полученный после элюции водой с колонны, упаривают и
отделяют выпавшие кристаллы.
9. После повторных прцедур перекристаллизаций и дополнительной
очистки получают апирогенные препараты медицинского назначения.

Микробный синтез глутаминовой кислоты

Глутаминовая кислота - первая аминокислота, полученная
микробным синтезом. Глутаминовая кислота относится к заменимым
кислотам, обладает приятными органолептическими свойствами и находит
самое широкое применение в пищевой промышленности и медицине при
лечении заболеваний, связанных с отравлениями печени и почек. В виде
глутамата натрия применяется как добавка в пищу для усиления вкусовых
качеств приготовленных продуктов и сохранения их в изделиях,
предназначенных для длительного хранения в консервированном и
замороженном состоянии.
В промышленности глутаминовую кислоту и на ее основе глутамат
натрия получают несколькими способами: многостадийным химическим
синтезом из акрилонитрила, микробиологическим синтезом по
одноступенчатой и двухступенчатой технологии, выделением из
свекловичной мелассы или из белковых гидролизатов.
Продуцентами глутаминовой кислоты являются бактерии,
относящиеся к различным родам. В промышленном производстве
78
используют бактерии Corinebacterium glutamicum и
B r e v i b a c t e r i u m f l a v u m и др. В состав питательной среды в качестве
источника углерода включают легкоассимилируемые углеводы (сахарозу и
глюкозу), содержащиеся в свекловичной мелассе, гидроле, гидролизатах
крахмала. Источником азота являются мочевина, хлорид и сульфат
аммония. Все продуценты глутаминовой кислоты нуждаются в биотине
(витамин Н). Однако содержание биотина строго регламетировано и не
должно превышать 2-5 мкг на 1 л среды. Более высокая концентрация
этого витамина способствует образованию побочных продуктов (аланина,
молочной, янтарной, аспарагиновой кислот), а выход глутаминовой
кислоты при этом значительно снижается.
Ферментация длится 2 сут, за это время в культуральной жидкости
накапливается до 50 г/л глутаминовой кислоты. Клеточную массу
выделяют центрифугированием. Фильтрат сгущают до 40-50 %, а затем
кристаллизуют глутаминовую кислоту. Для получения глутамата натрия
кислоту нейтрализуют раствором NaOH. Раствор глутамата натрия
упаривают и передают на кристаллизацию.
Двухступенчатый способ получения глутаминовой кислоты
возможно осуществить из α-кетоглутаровой кислоты с помощью
ферментов трансамидазы или глутаматдегидрогеназы в результате
следующих превращений:
1-й вариант - переаминирование аминокислот

трансамидаза
α-кетоглутаровая кислота + аминокислота
L-глутаминовая кислота + α-кетокислота

2-й вариант - восстановительное аминирование

глутаматдегидрогеназа
α-кетоглутаровая кислота + NН4+ + НАДН
L-глутаминовая кислота + Н2О + НАД+

В каждом из этих процессов α-кетоглутаровая кислота играет роль

предшественника. Для осуществленияч этих превращений необходимы
источники α-кетоглутаровой кислоты и соответствующей ферментной
системы. Продуцентами α-кето-глутаровой кислоты могут быть бактерии
рода P s e u d o m o n a s и E s c h e r i c h i a . В роли продуцента фермента
трансамидазы могут выступать различные микроорганизмы, например, E.
coli. Донором аминогрупп может быть аспарагиновая кислота или аланин.

79
 Применение аминокислот
Основными потребителями аминокислот являются сельское
хозяйство и пищевая промышленность. Аминокислоты, чаще всего лизин,
используют в качестве обогатителя кормов и пищевых продуктов
растительного происхождения для повышения их питательной ценности и
для сбалансирования пищи по незаменимым аминокислотам.
Использование 1 т лизина в комбикормовой промышленности позволяет
экономить 40-50 т фуражного зерна.
Введение незаменимых аминокислот в кормовые концентраты
позволяет сбалансировать корма сельскохозяйственных животных.
Добавление в рацион 3-4 дефицитных аминокислот к 1 т комбикорма
приводит к уменьшению общего расхода кормов на 15-20%. Выход
продукции при этом увеличивается на 20%.
Некоторые аминокислоты используют в качестве приправ, так как
они обладают определенными вкусовыми свойствами и могут сообщать
продукту приятные аромат и вкус. Большое распространение имеет
глутаминовая кислота и ее натриевая соль (глутамат натрия), которая
является эффективным усилителем вкуса мясных и овощных блюд.
Данную аминокислоту добавляют во многие продукты при
консервировании, замораживании и длительном хранении. Растет спрос на
глицин и аланин, их также применяют в качестве приправ.
Многие аминокислоты обладают оригинальным вкусом и участвуют
в образовании вкусовых особенностей пищевых продуктов. Например,
аспарагиновая и глутаминовая кислоты, кислые на вкус, в нейтральных
растворах имеют очень приятный оригинальный вкус, глицин обладает
характерным вкусом «освежающей» сладости, которая по интенсивности
близка к сахарозе.
Особый интерес представляет подсластитель аспартам, молекулу
которого образуют 2 аминокислоты - фенилаланин и аспарагиновая
кислота. Эти аминокислоты синтезируются микробиологическим путем, а
аспартам из этих мономеров - с помощью ферментов. Сладость аспартама
в 200 раз превышает сладость сахара.
Многие аминокислоты: лизин, аланин, пролин, валин и др. - могут
снимать неприятные запахи и используются в качестве дезодорантов
пищевых продуктов.
Для улучшения органолептических показателей мясных продуктов,
придания им специфического приятного вкуса и аромата используют
цистин, лизин, гистидин. Цистеин и цистин с глутаматом натрия создают
имитацию запаха и вкуса мяса, что используется при приготовлении
приправ. Цистеин, кроме того, используется для создания пористой
структуры хлеба. Добавка к порошковому молоку гистидина и триптофана
снимает неприятный «окисленный» привкус.

80
 При температуре 100-120оС и сильнощелочной реакции некоторые
аминокислоты взаимодействуют с сахарами и образуют пищевые
красители, которые обладают антиокислительным действием.
Таким образом, самые различные аминокислоты находят широкое
применение во многих отраслях пищевой промышленности: они
повышают питательную ценность пищевых продуктов, участвуют в
улучшении их органолептических показателей и повышают их
стабильность при длительном хранении.
В медицинской и фармацевтической практики на основе
аминокислот получают лекарственные препараты, смеси для ЛП, для
терапии послеоперационных больных, язвенной болезни, печени,
психических заболеваний (серотонин, аспарагин, валин, гистидин, глицин
и др.).
В химической промышленности аминокислоты используют как
предшественники в производстве детергенов, полиаминокислот,
полиуретана и т.п.

Контрольные вопросы
1. В чем преимущества получения аминокислот с помощью
микроорганизмов?
2. Какие аминокислоты получают путем микробного синтеза?
3. В чем заключается двухступенчатый способ получения
аминокислот?
4. Какие микроорганизмы используются для производства
глутаминовой кислоты?
5. В каких условиях осуществляется сверхсинтез глутаминовой
кислоты?
6. В чем сущность одноступенчатого микробного синтеза
аминокислот?
7. Какие микроорганизмы являются продуцентами лизина?
8. Назовите особенности ферментации при производстве лизина.
9. Какие существуют товарные формы выпускаемых аминокислот?
10. Каково применение аминокислот в пищевой промышленности?

ТЕМА 8
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ: ПРОИЗВОДСТВО
ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ

В настоящее время рынок органических кислот составляет 800 млн

долларов в год. Потребность в этих соединениях постоянно повышается.
Сегодня микробиологическим способом получают около 60 органических
кислот и их производных.
Пищевыми принято называть 4 органические кислоты: лимонную,
молочную, уксусную и винную. Иногда к ним причисляют яблочную и
81
глутаминовую. В настоящее время биотехнологическими (микро-)
способами в промышленных масштабах синтезируют ряд органических
кислот, лимонная, итаконовая, глюконовая, 2-кетоглюконовая, уксусная,
молочная. Из них лимонную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовые
кислоты получают лишь микробиологическим способом, молочную,
салициловую и уксусную – как химическим, так и микробиологическим
способами, а яблочную – химическим и энзиматическим.
Микробиологические процессы получения органических кислот
можно разделить на две группы: анаэробные (молочная, пропионовая) и
аэробные (уксусная, лимонная, итаконовая, глюконовая).
Все органические кислоты являются промежуточными или
конечными продуктами катаболизма углеводов.
Для биосинтеза органических кислот используют различные
бактерии и грибы. Так, в синтезе глюконовой кислоты участвуют
продуценты Gluconobacter suboxydans, синтезе итаконовой кислоты –
Aspergillus terreus, молочной – Lactobacillus sp., Lactobacillus bulgaricus,
яблочной кислоты – Br. ammoniagenes.
Органические кислоты находят широкое применение в
фармацевтической, химической, текстильной и других отраслях
промышленности. Пищевая промышленность традиционно является
основным потребителем лимонной, уксусной и молочной кислот, так как
продукты естественного брожения более предпочтительны, чем
синтетические кислоты в связи с безвредностью для организма человека
содержащихся в них примесей.

Получение лимонной кислоты

Лимонная кислота (С 6 Н 8 О 7 ) - трехосновная оксикислота, широко

распространена в природе, относительно много ее содержится в некоторых
ягодах, фруктах, особенно в цитрусовых (в лимоне 5-10 %), в листьях и
стеблях некоторых растений.
Ранее лимонную кислоту выделяли в виде лимоннокислого кальция
из продуктов переработки листьев хлопчатника, стеблей махорки, хвои ели
и в значительных количествах из плодов лимонов. Однако это
производство является крайне дорогим и небольшим по объему. Поэтому
лимонная кислота была дефицитным и дорогим продуктом.
В настоящее время лимонная кислота по объему производства
является одним из главных продуктов микробного синтеза, ее общий
выпуск в разных странах достигает до 400 тыс. т в год.
Впервые лимонная кислота была выделена в 1784 году из сока
недозрелых лимонов шведским аптекарем Карлом Шееле и до 30-х годов
ХХ века вырабатывалась из цитрусовых, в основном в Италии. В 1933 году
в Чехословакии, а в 1935 году в Советском Союзе было создано
производство лимонной кислоты методом биохимического синтеза с
82
помощью плесневых грибов Aspergillus niger из сахара. В настоящее время
сырьём для получения лимонной кислоты является меласса свекловичная.
Для получения лимонной кислоты используют микроскопические
грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Ustinia и др. В настоящее
время основными продуцентами лимонной кислоты являются различные
штаммы гриба Aspergillus niger, которые отличаются большой скоростью
роста, легкостью культивирования и высоким выходом лимонной кислоты
по отношению к массе окисляемого углевода.
Производство лимонной кислоты основано на культивировании
микроскопических грибов Aspergillus niger, которые сбраживают сахара
питательной среды, образуя лимонную кислоту. Этот процесс может быть
выражен суммарным уравнением:

С12Н22О11 + 3О2 → 2С6Н8О7 + 3Н2О.

сахароза лимонная
кислота

Общая технологическая схема производства лимонной кислоты

включает следующие этапы:

1 . П о д г о т о в к а п и т а т е л ь н о й с р е д ы . Мелассу загружают в
варочный котел, разбавляют водой до определенной концентрации
углеводов (16 %), добавляют источники азота, фосфора и микроэлементы.
Устанавливают необходимое значение рН среды (6,8-7,2) добавлением
кислоты или щелочи. Для осаждения солей тяжелых металлов (железа,
магния и т.д.), находящихся в мелассе, ее раствор обрабатывают желтой
кровяной солью. Затем среду стерилизуют и охлаждают до температуры
ферментации.
2 . П о л у ч е н и е п о с е в н о г о м а т е р и а л а . В отдельном цехе
выращивают посевной материал в виде спор (конидий) A s p e r g i l l u s
n i g e r . Затем размножают его в три стадии: в пробирках, колбах и
алюминиевых кюветах. Длительность каждой стадии - 2-4 сут при
температуре 32 оС. Для выращивания в пробирках используют твердую
агаризованную питательную среду, а в колбах и кюветах - жидкую.
3 . Ф е р м е н т а ц и я может осуществляться поверхностным или
глубинным способом. Заводы небольшой или средней мощности
используют поверхностный способ. Глубинный способ экономически
выгоден тогда, когда мощность завода превышает 2500 т лимонной
кислоты в год.
Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании
роста грибов минеральными компонентами среды и одновременно
избыточном содержании источника углерода.
При поверхностном способе ферментация проводится на открытых
металлических кюветах высотой 7-20 см, в которых мицелий продуцента
развивается на поверхности среды. Кюветы размещаются на многоярусных
83
стеллажах, в специальных камерах. На каждом стеллаже помещается 8-10
кювет, расстояние между которыми (по вертикали) 30-40 см. Кюветы
изготавливают из нержавеющей стали или чистого алюминия -
материалов, не подвергающихся коррозии и не загрязняющих среду
ионами железа. В растильные камеры подают стерильный
кондиционированный воздух. Температура поддерживается около 28-30
о
С, цикл брожения заканчивается через 8-9 сут.
При глубинном способе мицелий гриба погружен в питательную
среду в ферментаторах, туда же подается стерильный воздух.
Длительность культивирования - 5-9 сут.
4 . С е п а р а ц и я . По окончании ферментации мицелий отделяют от
культуральной жидкости: при глубинной ферментации - фильтрованием на
фильтрах; при поверхностной ферментации - вручную, предварительно
слив жидкость с кювет. Мицелий промывают, высушивают и направляют
для использования в качестве добавки к животным кормам. Фильтрованная
культуральная жидкость (фильтрат) представляет собой водный раствор
лимонной кислоты. В 1 л фильтрата содержится 40-50 г лимонной
кислоты.
5 . В ы д е л е н и е л и м о н н о й к и с л о т ы . Лимонную кислоту
выделяют из культуральной жидкости в виде плохорастворимой соли -
цитрата кальция, которая образуется при точном добавлении 1 части
гидротированной извести на 2 части жидкости, рН (7,2+0,2) и повышении
температуры до 95 оС. Перевод лимонной кислоты в свободное состояние
достигается при добавлении строго определенного количества Н2SO4:

2С6Н8О7 + 3Са(ОН)2 Са(С6Н5О7)2 + 3Н2О

лимонная известковое цитрат вода
кислота молоко кальция

Са(С6Н5О7)2 + 3Н2SО4 2С6Н8О7 + 3СаSО4

цитрат серная лимонная гипс
кальция кислота кислота

Гипс удаляют фильтрованием. Раствор лимонной кислоты осветляют

активным углем, упаривают, сливают в кристаллизаторы, в которых
постепенно снижают температуру. Выделившиеся кристаллы
центрифугируют, промывают водой, сушат, фасуют.
Схема производства лимонной кислоты представлена на рисунке 24.

84
 Рисунок 24 - Схема производства лимонной кислоты

Лимонная кислота используется в кондитерской промышленности

для подкисления карамели, пастилы, вафель, так как она хорошо
подчеркивает фруктовый вкус. Данную органическую кислоту в целях
подкисления добавляют в мороженое, пищевые концентраты, маргарин,
некоторые сорта колбас и сыра.
Лимонную кислоту применяют для торможения образования
меланоидинов в сгущенном молоке с сахаром, ее раствором промывают и
дезодорируют жировое сырье, обрабатывают перед холодным хранением
свежее мясо, рыбу, фрукты с целью стабилизации их цвета, вкуса и запаха.
Соли лимонной кислоты используют для изготовления шампуней и других
моющих средств, так как они стимулируют вспенивание и обеспечивают
механическую устойчивость пен.

85
 Получение молочной кислоты

Молочная кислота с 1881 г. производится промышленным способом

с помощью молочнокислых бактерий. В СССР производство молочной
кислоты было организовано в 1923 г. Для промышленного изготовления
молочной кислоты пригодны только гомоферментативные молочнокислые
бактерии, образующие до 98 % молочной кислоты. Применяемые штаммы
L a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i i (дельбрюкки), L . b u l g a r i c u s не
предъявляют высоких требований к питательной среде и за короткое время
дают высокий выход молочной кислоты.
С6Н12О6 2СН3СНОНСООН
глюкоза молочная кислота

Молочнокислые бактерии преобразуют в молочную кислоту самые

разные углеводы, поэтому для промышленного получения этой кислоты
используют мелассу, молочную сыворотку, глюкозу, мальтозу, сахарозу,
лактозу, осахаренный крахмал и пр. В каждом случае подбирают наиболее
подходящий продуцент. Для сбраживания глюкозы или мальтозы обычно
применяют штаммы L a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i i , L . L e i c h m a n n i i
или L . b u l g a r i c u s . Для сбраживания осахаренного крахмала
используют смесь молочнокислых бактерий L . d e l b r u e c k i i или с L .
b u l g a r i c u s , или со S t r e p t o c o c c u s l a c t i s . При сбраживании
мальтозы выход молочной кислоты выше при использовании L .
b u l g a r i c u s или L . c a s e i .
В качестве основного сырья используют мелассу, картофельный
осахаренный затор, которые разбавляют водой до определенной
концентрации (12 %), вносят дополнительные источники аминного азота
(свободные аминокислоты), витаминов и других биологически активных
веществ в виде кукурузного или дрожжевого экстракта или вытяжки
солодовых ростков (так как на молочнокислое брожение биологически
активные вещества оказывают положительное влияние). Питательную
среду нагревают до температуры 70 оС, пастеризуют 1 час и охлаждают до
48-50 оС. Эта температура оптимальна для термофильных молочнокислых
бактерий.
Молочную кислоту в промышленных условиях получают методом
анаэробной глубинной ферментации. Начальное значение рН 5,5-6,0. Во
время ферментации периодически вносят Са(ОН)2, СаСО3 для
нейтрализации образующейся кислоты, высокое накопление которой
угнетает рост бактерий. Периодически включается мешалка для
перемешивания мела. Образующийся лактат кальция остается
растворенным, и к концу брожения его накапливается примерно 15 %. По
окончании ферментации культуральная жидкость нейтрализуется и
фильтруется для отделения бактериальных клеток. Фильтрат упаривают до
86
концентрации 27-30 %, затем охлаждают до температуры 25-30 оС и
выдерживают в кристаллизаторах 36-48 час. Кристаллы лактата кальция
отделяют центрифугированием. Молочную кислоту из лактата кальция
получают при помощи серной кислоты. Реакция идет при 60-70 оС в
соответствии с уравнением:

Ca(C3H5O3)2 + H2SO4 CaSO4 + 2C3H6O3

лактат серная гипс молочная
кальция кислота кислота

Молочную кислоту обрабатывают активированным углем,

фильтруют и фасуют. Конечный продукт - жидкий концентрат молочной
кислоты концентрацией 65 %.
Молочную кислоту применяют для приготовления джемов, в
которых она способствует хорошей консистенции. Молочная кислота как
регулятор рН, улучшитель вкуса применяется в производстве многих
сыров, квашении капусты, в сухом концентрате кваса. В хлебобулочном
производстве молочная кислота и лактаты увеличивают объем мякиша и
улучшают корку хлеба при использовании муки низкого качества.
Способность лактатов удерживать влагу применяют в производстве
колбас, сыров, детского питания. Молочную кислоту также используют
для ускорения получения молочно-белкового сгустка при производстве
творога.
Получение уксусной кислоты

Продуцентами уксусной кислоты являются уксуснокислые бактерии

рода A c e t o b a c t e r . Эти бактерии приспособлены к сахаристым и
спиртовым субстратам, растут при сильнокислых условиях (рН 4,0). К
быстроокисляющим бактериям относят высокопроизводственный штамм
A c e t o b a c t e r c u r v u m (курвум). Недостатком этого продуцента является
то, что он может терять свойство образовывать уксусную кислоту, поэтому
его постоянно поддерживают в среде с высокой концентрацией спирта и
уксусной кислоты и низкой концентрацией питательных веществ.
Уксус получают при окислительной ферментации, при которой
разведенные спиртовые растворы при участии уксуснокислых бактерий
кислородом воздуха окисляются до уксусной кислоты и воды:

С2Н5ОН + О2 СН3СООН + Н2О

В качестве сырья для получения пищевого уксуса используют

виноградное вино, пивное сусло, мед, соки различных фруктов и ягод
после спиртового брожения или водный раствор этилового спирта для
получения белого уксуса. Кроме спирта среда содержит уксусную кислоту
и минеральные соли N, P, S, Mn, K. Иногда добавляют источники
87
витаминов в виде различных экстрактов. Уксусная кислота служит
источником углерода и энергии для бактерий.
Процесс получения уксуса не требует соблюдения стерильности
ввиду высокой активности питательной среды (рН 2,5-3,0) и ее состава,
элективного для уксуснокислых бактерий.
Спиртовой уксус получают путем периодического или непрерывного
культивирования уксуснокислых бактерий, закрепленных на поверхности
древесных стружек, древесного угля или кокса. Этим материалом
заполняют производственные аппараты различной конструкции.
При непрерывном способе используют деревянные чаны.
Питательную среду разбрызгивают сверху, и она протекает по стружкам.
При этом слой жидкости, покрывающий стружку, не превышает 0,5 мм,
что обеспечивает бактериям хорошие условия аэрации. Снизу в аппарат
подается воздух, который проходит через весь аппарат и выходит сверху.
По мере медленного протекания питательной среды по стружкам,
содержащийся в ней сприт превращается бактериями в уксусную кислоту,
и готовый уксус непрерывно поступает в сборник, расположенный в
нижней части аппарата. Производительность 1,4 кг/сут с 1 м3 стружек.
При периодическом (циркуляционном) способе питательная среда
протекает по стружкам с большей скоростью, чем при непрерывном
способе. Количество уксусной кислоты в культуральной жидкости
увеличивается, но она не собирается в сборнике, а снова возвращается в
аппарат и так циркулирует до тех пор, пока концентрация уксусной
кислоты в ней не достигает 10-11 %. Тогда цикл заканчивается и в аппарат
поступает вновь приготовленная питательная среда. Производительность
составляет 5-12 кг уксусной кислоты в сутки на 1 м3 стружек.
В столовом уксусе содержится 5-9 % уксусной кислоты. Уксус с
концентрацией кислоты 20-30 % получают путем вымораживания
исходного раствора. Путем перегонки получают 70-80%-ю уксусную
кислоту, называемую уксусной эссенцией. Ледяная уксусная кислота
содержит 98,0-99,8 % кислоты.
Уксус, полученный при брожении, имеет приятные аромат и вкус.
Уксусную кислоту или уксус широко используют в пищевой
промышленности. Уксус, полученный микробиологическим путем
(пищевая уксусная кислота, столовый уксус), различается по сортам в
зависимости от характера сбраживаемого субстрата. Известен яблочный,
виноградный, грушевый и другие сорта уксуса.
Уксус также применяют для растворения органических красителей,
при получении медикаментов, пластмасс и т.д.
В заключение необходимо отметить, что современное производство
органических кислот, существующее в большинстве развитых стран,
основано на использовании в качестве продуцентов различных штаммов
плесневых грибов, чаще всего рода A s p e r g i l l u s . С помощью
микроорганизмов возможно получение более 50 различных органических
88
кислот: лимонной, уксусной, итаконовой, глюконовой (аэробной
ферментацией), молочной и пропионовой (анаэробным способом). Все
органические кислоты являются промежуточными или конечными
продуктами катаболизма углеводов. Основным механизмом регуляции их
образования является лимитация роста продуцента факторами среды.

Контрольные вопросы
1. Назовите условия, необходимые для сверхсинтеза лимонной
кислоты.
2. Как готовится питательная среда при производстве лимонной
кислоты?
3. Каким образом выделяют лимонную кислоту из культуральной
жидкости?
4. Какое сырье используют для получения молочной кислоты?
5. Какие микроорганизмы являются основными продуцентами
уксусной кислоты?
6. Как осуществляется ферментация при производстве лимонной
кислоты?
7. Какое значение имеет молочная кислота в пищевой
промышленности?
8. Какими способами получают уксусную кислоту в
промышленности?
9. Назовите продуценты лимонной кислоты.
10. Какое сырье используется для получения уксусной кислоты?
11. Каковы товарные формы молочной кислоты?

ТЕМА 9
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ: ПРОИЗВОДСТВО
ВИТАМИНОВ

Общая характеристика витаминов

Витамины (от лат. «vita» – жизнь + амины) – низкомолекулярные

органические соединения различной химической природы, необходимые
для человека в ничтожных количествах, но имеющие огромное значение.
Витамины являются естественными компонентами ферментативных
систем и катализируют широкий круг биохимических реакций,
обеспечивающих жизнедеятельность организма.
Основоположник учения о витаминах русский врач Н. И. Лунин
установил (1880г), что при кормлении белых мышей только
искусственным молоком, состоящим из казеина, жира, молочного сахара и
солей, животные погибают. Следовательно, в натуральном молоке
содержатся и другие вещества, незаменимые для питания. В 1912 г.
польский врач К. Функ, предложивший само название «витамины»,
89
обобщил накопленные к тому времени экспериментальные и клинические
данные и пришел к выводу, что такие заболевания, как цинга, рахит,
пеллагра, бери-бери — болезни пищевой недостаточности, или
авитаминозы. С этого времени наука о витаминах (витаминология) начала
интенсивно развиваться, что объясняется значением витаминов не только
для борьбы со многими заболеваниями, но и для познания сущности ряда
жизненных явлений.
Метод обнаружения витаминов, примененный Луниным (содержание
животных на специальной диете — вызывание экспериментальных
авитаминозов), был положен в основу исследований. Было выяснено, что
не все животные нуждаются в полном комплексе витаминов. Отдельные
виды животных могут самостоятельно синтезировать те или иные
витамины. В то же время многие плесневые и дрожжевые грибы и
различные бактерии развиваются на искусственных питательных средах
только при добавлении к этим средам вытяжек из растительных или
животных тканей, содержащих витамины. Таким образом, витамины
необходимы для всех живых организмов.
Изучение витаминов не ограничивается обнаружением их в
естественных продуктах с помощью биологических тестов и другими
методами. Из этих продуктов получают активные препараты витаминов,
изучают их строение и, наконец, получают синтетически. Исследована
химическая природа всех известных витаминов. Оказалось, что многие из
них встречаются группами по 3-5 и более родственных соединений,
различающихся деталями строения и степенью физиологической
активности. Было синтезировано большое число искусственных аналогов
витаминов с целью выяснения роли функциональных групп. Это
способствовало пониманию действия витаминов. Так, некоторые
производные витаминов с замещенными функциональными группами
оказывают на организм противоположное действие, по сравнению с
витаминами, вступая с ними в конкурентные отношения за связь со
специфическими белками при образовании ферментов или с субстратами
воздействия последних.
Витамины имеют буквенные обозначения, химические названия или
названия, характеризующие их по физиологическому действию. В 1956г.
принята единая классификация витаминов, которая стала
общеупотребительной.
Наличие химически чистых витаминов дало возможность подойти к
выяснению их роли в обмене веществ организма. Витамины либо входят в
состав ферментов, либо являются компонентами ферментативных реакций.
При отсутствии витаминов в организме нарушается деятельность
ферментных систем, в которых они участвуют, а следовательно, — и
обмен веществ. Известно несколько сот ферментов, в состав которых
входят витамины, и огромное количество катализируемых ими реакций.
Многие витамины — преимущественно участники процессов распада
90
пищевых веществ и освобождения заключѐнной в них энергии (витамины
B1, В2, PP и др.). Участвуют они и в процессах синтеза: B 6 и В12 — в
синтезе аминокислот и белковом обмене, В3 (пантотеновая кислота) — в
синтезе жирных кислот и обмене жиров, Вс (фолиевая кислота) — в
синтезе пуриновых и пиримидиновых оснований и многих физиологически
важных соединений — ацетилхолина, глутатиона, стероидов и др.
Таким образом, витамины имеют огромное физиологическое
значение. Выяснение физиологической роли витаминов позволило
использовать их для витаминизации продуктов питания, в лечебной
практике и в животноводстве. Особенно широко стали применяться
витамины после освоения их промышленного синтеза.
Витамины не образуются у гетеротрофов. Способностью к синтезу
витаминов обладают лишь автотрофные организмы.
Микробиологическим способом можно получить практически все
известные витамины. Однако экономически более целесообразно получать
витамины выделением из природных источников или с помощью
химического синтеза.
С помощью микроорганизмов целесообразно получать сложные по
строению витамины: β-каротин (провитамин А), В2, В12 и предшественники
витамина D.
Витамин В12 (цианокобаламин). В тканях животных концентрация
витамина очень низкая (в печени быка 1 мг/кг) для того, чтобы
использовать этот источник для промышленных целей. Химический синтез
очень сложен. Синтезировать витамин В12 способны уксуснокислые
бактерии, грибы и пропионовокислые бактерии. Наибольшее
промышленное значение имеют Рrоpionibacterium и Pseudomonas (P.
denitrificans).
Концентрат витамина B12 предназначен для обогащения кормов
животных. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином B12
используют пропионовокислые бактерии, как в чистом виде, так и в виде
концентрата, приготовленного на молочной сыворотке.
Витамин В2 (рибофлавин) можно в небольших количествах выделять
из природного сырья. В наибольшем количестве он содержится в моркови
и печени трески. Наиболее активными продуцентами витамина B2
являются дрожжеподобные грибы рода Eremothecium ashbyii, входящие в
класс аскомицетов, а также бактерии Bacillus subtilis. Витамином В2
обогащают некоторые сорта белого хлеба, его используют для окраски
пищевых продуктов в оранжево-желтый цвет.
Каротиноиды – это предшественники витамина А, среди которых
наиболее активен β-каротин. В организме человека каротиноиды не
синтезируются, поэтому должны поступать извне. В печени каротин
превращается в витамин А. Продуцентами каротиноидов могут быть грибы
и дрожжи. В промышленности β-каротин чаще всего получают с помощью
микроскопического гриба рода Blakeslea trispora.
91
 β-Каротин используют при изготовлении пищевых продуктов как
краситель. Его применяют при изготовлении колбас с целью замены
нитрита натрия и обеспечения высокой интенсивности и устойчивости
цвета. Используют при производстве леденцов, пищевых паст, кексов и
других кондитерских изделий. Во многих странах β-каротин применяют
для подкрашивания сливочного масла. Кроме того, он обладает
антиокислительными свойствами, которые используются для продления
срока хранения продукта.
Витамин D2 промышленно синтезируют с помощью дрожжей
Saccharomyces serevisiae. Витамин используется для лечения и
профилактики рахита человека и животных.
Перспективно микробиологическое получение биотина,
используемого в рационе кур и свиней. В настоящее время на Западе в
большую часть комбикормов для свиней включают биотин, получаемый
путем химического синтеза. В результате химического синтеза образуется
рацемическая смесь, а биологической активностью обладает лишь D-
форма витамина, которую синтезируют микроорганизмы.
В мире существует 40 крупных промышленных производителей
витаминов; 18 из них в США, 8 - в Японии, 14 - в Западной Европе
Ведущее место в производстве витаминов занимает швейцарский концерн
Hoffman La Roche, выпускающий 50-70% всех витаминов.

Методы получения витаминов

- выделение из растительного сырья;
- химический синтез;
- микробиологический синтез (в промышленном масштабе
производят особо сложные по строению витамины В2, В12, β-каротин
(провитамин А), РР и предшественники витамина Д (эргостерина). Синтез
аскорбиновой кислоты через стадию биотрансформации D-сорбита в L-
сорбозу осуществляют с использованием уксуснокислых бактерий.
Большинство витаминов либо выделяют из природных источников,
либо синтезируют химическим путем.
Витамин В12 (цианкобаламин) впервые был выделен в 1948 г. из
печени. Особенность витамина В12 по сравнению с другими витаминами
группы В заключается в том, что, во-первых, в природе он синтезируется
только микроорганизмами, во-вторых, молекула витамина состоит из 2
частей: кобальтосодержащей и нуклеотидной.
В тканях животных концентрация витамина очень низкая (в печени
быка 1 мг/кг) для того, чтобы использовать этот источник для
промышленных целей. Химический синтез очень сложен. Поэтому это
соединение в промышленности получают биосинтетическим путем.
Синтезировать витамин В12 способны уксуснокислые бактерии,
грибы и пропионовокислые бактерии. Наибольшее промышленное

92
значение имеют P r o p i o n i b a c t e r i u m и P s e u d o m o n a s (P .
d e n i t r i f i c a n s).
Образование витамина В12 идет в 2 стадии: анаэробную и аэробную.
При анаэробных условиях микроорганизмы образуют одну половину
молекулы, при аэробных условиях, когда культура достигает максимума
роста, 2 части витамина соединяются, и заканчивается синтез витамина.
Продуценты витамина В12 выращивают в средах, приготовленных на
основе пищевого сырья: соевой, рыбной муки, а также добавляют
кукурузный экстрат, усиливающий рост бактерий.
Ферментация осуществляется глубинным способом, причем
поступление воздуха регулируется в соответствии с потребностями в нем
применяемых штаммов.
Ферментацию заканчивают через 72 часа. Витамин В12 сохраняется в
клетках бактерий и не выделяется в среду. Клетки микроорганизмов
отфильтровывают от культуральной жидкости, высушивают и в сухом
виде применяют как кормовую добавку. Концентрат витамина В12
предназначен для обогащения кормов животных. Он представляет собой
однородный порошок коричневого цвета, кисловатый на вкус, имеет
характерный запах. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином
В12 используют пропионовокислые бактерии, как в чистом виде, так и в
виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке.
Получение витамина В2
Витамин В2 (рибофлавин) можно в небольших количествах выделять
из природного сырья. В наибольшем количестве он содержится в моркови
и печени трески.
Из 1 т моркови получают 1 г витамина, из 1 т печени - 6 г.
Рибофлавин впервые был выделен в кристаллическом виде в 1933 г.
Продуцентами данного витамина являются дрожжи, мицелиальные грибы
и бактерии. Наиболее активными продуцентами витамина В2 являются
дрожжеподобные грибы рода E r e m o t h e c i u m , входящие в класс
аскомицетов.
Недостаток культуры - ее нестабильность. При хранении на твердых
средах при комнатной и даже низкой температуре гриб легко теряет
способность к сверхсинтезу рибофлавина. Для сохранения штамма в
активном состоянии в течение длительного времени рекомендуется
производить систематический рассев на твердые питательные среды и
отбирать наиболее интенсивно окрашенные в оранжевый цвет колонии.
Яркая окраска колоний указывает на высокую способность к синтезу
витамина.
Культивирование проводят глубинным способом при хорошей
аэрации. Максимальное накопление витамина происходит вместе с
максимумом накопления биомассы на вторые сутки, причем синтез
рибофлавина начинается лишь после фазы интенсивной ассимиляции

93
сахара. Через 4 сут клетки стареют, происходит их лизис, и появляются
споры. Эти признаки определяют микроскопированием.
Витамином В2 обогащают некоторые сорта белого хлеба, его
используют для окраски пищевых продуктов в оранжево-желтый цвет.

Получение каротиноидов
Каротиноиды - это предшественники витамина А, среди которых
наиболее активен β-каротин. В организме человека каротиноиды не
синтезируются, поэтому должны поступать извне. В печени каротин
превращается в витамин А.
Продуцентами каротиноидов могут быть грибы и дрожжи. В
промышленности β-каротин чаще всего получают с помощью
микроскопического гриба рода B l a k e s l e a (блакеслеа). Культивирование
проводят и поверхностным, и глубинным способами на питательных
средах сложного состава. Во время ферментации среду интенсивно
аэрируют. Образование каротиноидов в культуре микроорганизмов не идет
параллельно с образованием биомассы. Интенсивный синтез каротиноидов
начинается, когда в среде использован весь азот, а рост культуры
уменьшается. В качестве стимуляторов в питательные среды добавляют
экстракты цитрусовых и дрожжей.
После ферментации мицелий фильтруют и сушат в вакууме. Каротин
извлекают из сухого измельченного мицелия растительными маслами.
β-Каротин используют при изготовлении пищевых продуктов как
краситель. Его применяют при изготовлении колбас с целью замены
нитрита натрия и обеспечения высокой интенсивности и устойчивости
цвета. Используют при производстве леденцов, пищевых паст, кексов и
других кондитерских изделий. Во многих странах β-каротин применяют
для подкрашивания сливочного масла. Нагревают до температуры 30 оС,
добавляют β-каротин, который при такой температуре хорошо
растворяется в масле. В Италии каротиноиды используют в производстве
макаронных изделий.
β-Каротин применяется для стабилизации цвета мяса охлажденного
и замороженного в тушах. С этой целью раствор β-каротина наносят на
поверхность мяса.
Кроме того, β-каротин обладает антиокислительными свойствами,
которые используются для продления срока хранения продукта.

Синтез эргостерина

Эргостерин - исходный продукт производства жирорастворимого

витамина D2. Витамин D2 обладает антирахитичным действием, а также
регулирует усвоение кальция и фосфора из пищи и отложение их в костной
ткани.

94
 Витамин D2 образуется при облучении ультрафиолетовым
излучением эргостерина. В основе структуры эргостерина и витамина D
лежат четыре углеродных цикла (А, В, С, D). В структуре витамина D
кольцо В разомкнуто:

В промышленности эргостерин получают, используя дрожжи

Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, а
также мицелиальные грибы. Засев производят большим количеством
инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной
аэрации в среде, содержащей большой избыток углерода по отношению к
источнику азота.
Дрожжи, а также грибы рода A s p e r g i l l u s и P e n i c i l l i u m
используют для получения кристаллического витамина D2 или
концентрата. В качестве концентрата в животноводстве применяют
облученные сухие дрожжи.
Максимум поглощения эргостерина отмечен при 280 нм. Именно это
излучение возбуждает отдельные связи колец А и В в молекуле
эргостерина и вызывает его превращение в витамин D2. Облучение
производят ультрафиолетовыми лампами с длиной волны 280-300 нм
(сухие дрожжи) или током в слое 5%-й суспензии дрожжей. При более
коротковолновом и длинноволновом излучении повышается выход других
соединений стериновой природы.
На выход витамина D2 (и образование других соединений)
оказывают влияние длительность облучения, температура, наличие
примесей.
Для получения кристаллического витамина D2 дрожжи (или мицелий
грибов) подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при
температуре 110 оС. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при
75-78 оС и после охлаждения до 10-15 оС фильтруют.
Витамин D2 получают из массы, оставшейся после фильтрации.
Массу промывают водой, сушат, размельчают и обрабатывают при
температуре 78 оС трехкратным объемом спирта. Спиртовые экстракты
сгущают, концентрат омыляют раствором NaOH. Стерины остаются в
неомыленной фракции. Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при
0 оС. Полученные кристаллы эргостерина сушат, растворяют в эфире,
облучают, после чего эфир отгоняют, а раствор витамина концентрируют и
кристаллизуют.
Таким образом, из всего вышеизложенного можно сделать вывод,
что витамины, синтезированные микроорганизмами, используют для
95
повышения пищевой ценности продуктов питания, а также в качестве
антиоксидантов, красителей и стабилизаторов цвета.

Контрольные вопросы

1. Какие витамины получают с помощью микроорганизмов?

2. Каково значение витаминов в производстве пищевых
продуктов?
3. Какие микроорганизмы являются продуцентами витамина В12?
4. В чем особенности витамина В12 по сравнению с другими
витаминами группы В?
5. Из какого природного сырья можно выделить рибофлавин?
6. Назовите продуценты витамина В2.
7. Какие витамины являются предшественниками витамина А?
8. Каково применение витамина А в пищевой промышленности?
9. Под действием каких факторов из эргостерина можно получить
витамин D2?

ТЕМА 10
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ: ПРОИЗВОДСТВО
АНТИБИОТИКОВ

Общая характеристика антибиотиков

Принципы получения вторичных метаболитов основаны на

особенностях их образования клетками микроорганизмов. Биосинтез
вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит после завершения
стадии роста, в идиофазе, благодаря чему их и называют идиолитами.
Антибиотики – самый большой класс фармацевтических соединений,
синтез которых осуществляется микробными клетками. К этому же классу
относятся противогрибковые агенты, противоопухолевые лекарства и
алкалоиды. В мире ежегодно производится антибиотиков на 20 млрд.
долларов. Еще более широко, чем в медицине, они используются в
растениеводстве, животноводстве, ветеринарии, пищевой
промышленности.
Термин «антибиотик» был предложен в 1942 г. Зельман Абрахам
Ваксман для обозначения веществ, образуемых микроорганизмами и
обладающих антимикробным действием. Следует отметить, что в 1871 г.
лечебные свойства плесени были описаны русским дерматологом А.Г.
Полотебновым.
Разработка и производство антибиотиков активно началась в конце
XIX века. Первым антибиотиком, выпущенным в промышленное
производство, стал сальварсан (1910 год).
96
 Антибиотики – это группа высокоэффективных биологически
активных веществ, которые синтезируются микроорганизмами и способны
убивать или подавлять рост живых клеток.
В настоящее время под антибиотиками понимают
химиотерапевтические вещества, полученные из микроорганизмов или
иных природных источников, а также их полусинтетические аналоги и
производные, обладающие способностью избирательно подавлять в
организме больного возбудителей заболеваний и (или) задерживать
развитие злокачественных новообразований.
К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы
изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых
клеток. В настоящее время описано 12000 антибиотичных препаратов, из
которых в клинике применяется около 200. Около 97 % известных
антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. В
химическом отношении они представляют собой сборную группу
органических веществ.
По типу действия антибиотики делят на бактерицидные,
вызывающие гибель микроорганизмов и бактериостатические,
нарушающие способность микроорганизмов делиться. По спектру
действия различают антибиотики узкого и широкого действия. К
последним относят тетрациклины, макролиды, амилогликозиды, которые
назначают в случае неидентифицируемых возбудителей болезней, при
длительном применении они вызывают дисбактериоз.
Особенностью антибиотиков является специфичность их действия.
Эти эффекторы подавляют один или несколько процессов лишь у
некоторых микроорганизмов. В зависимости от специфики действия
антибиотиков на молекулярном уровне различают следующие группы
соединений, вызывающие у бактерий:
1) нарушение биосинтеза пептидогликанов клеточной стенки;
2) нарушение отдельных этапов процесса трансляции (трансляция –
реализация генетической информации);
3) повреждение цитоплазматической мембраны;
4) нарушение биосинтеза нуклеиновых кислот;
5) нарушение энергетического обмена.
Антибиотики широко используются для расшифровки механизмов
биосинтеза белка, нуклеиновых кислот и структуры клеточных стенок
бактерий.
Изыскание новых антибиотиков обусловлено и потребностями
практики, и накоплением резистентных форм микроорганизмов по
отношению ко многим антибиотикам. Устойчивость микроорганизмам
придает фермент лактамаза, превращающий пенициллин в
пенициллиновую кислоту. Поэтому новые аналоги антибиотиков получают
при использовании природных ингибиторов β-лактамаз – клавулановой и
оливановой кислот.
97
 Химические методы получения антибиотиков очень сложны и не
могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии.
Существует несколько способов получения как природных, так и
полусинтетических антибиотиков:
1) ферментация микроорганизма-продуцента с подходящим пред-
шественником, что индуцирует синтез антибиотиков в идиофазе;
2) использование для биосинтеза блокированных мутантов. У таких
мутантов блокирован синтез нужного антибиотика. Используя низкую
субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя
аналоги предшественников антибиотика, их переводят в аналоги самого
антибиотика.
В качестве продуцентов антибиотиков используются
микроорганизмы, плесневые грибы, актиномицеты, высшие растения и
ткани животных.
Антибиотики животного происхождения: экмолин, выделенный из
осетровых рыб, эритрин – из эритроцитов, лизоцим и интерферон –
обладающие антимикробным и противовирусным действиями.
Антибиотики, продуцируемые высшими растениями - фитонциды.
Это аллицин из чеснока – Allium sativum, иманин из зверобоя, сальван из
шалфея, рафанин из редиса - Raphanus sativum, фазеолин из фасоли -
Phaseolus vulgaris и другие
Микроорганизмы одного вида могут синтезировать антибиотики
различной природы и, наоборот, один и тот же антибиотик могут
продуцировать микроорганизмы различных таксономических групп.
Из эубактерий наиболее часто продуцентами являются
представители родов Bacillus и Pseudomonas (около 400−600), причем
большинство антибиотиков бактериального происхождения –
полипептиды.
Антибиотики продуцируются плесневыми грибами, актинамицетами,
эубактериями и другими микроорганизмами. Шесть родов филаментозных
грибов производят около 1000 различных антибиотиков, в том числе
пенициллин и цефаллоспорин, а три рода актиномицетов – 3000
антибиотиков. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род
Streptomyces, один из видов которого – S. griseus синтезирует более 50
антибиотиков.
Мицелиальные грибы продуцируют (около 10 %) антибиотиков:
Пенициллины – Penicillium chrysogenum, P. notatum цефалоспорины
Cephalosporium Acremonium chrysogenum являются известными
представителями бета-лактамных антибиотиков, продуцирующимися
мицелиальными грибами. В структуре антибиотика имеется бета-
лактамное кольцо, обладающее способностью ингибирования синтеза
пептидогликанов клеточной стенки. Антибиотики используются в лечении
инфекций, вызванных грам(-) бактериями.

98
 Так, например, актиномицеты продуцируют следующие группы
антибиотиков: (не менее 50 % из всех известных) канамицин - Actinomyces
kanamycetu; неомицин - Actinomyces iracie; окситетрациклин – Аctinomyces
ninesus; линкомицин – Streptomyces linconiensis; природный левомицетин
(хлорамфеникол) продуцируется Streptomyces venezuelae; рифамицин –
Streptomyces mediterranei, на основе рифамицина получен рифампицин.

Методы получения антибиотиков

1. Химический синтез. С помощью этого метода получают основные

синтетические антибиотики.
2. Биосинтез (прямая ферментация микроорганизма – продуцента).
Для получения антибиотиков этим способом используют штаммы
микроорганизмов, образующие наибольшее количество антибиотика.
Большинство антибиотиков получают при глубинной аэробной
ферментации периодического действия в асептических условиях.
3. Мутационный биосинтез (мутасинтез). Биосинтез антибиотиков
с применением блокированных мутантов, у которых отсутствует или
блокировано определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу
антибиотиков. Блокированные мутанты не способны образовывать
нужный антибиотик. Используя низкую субстратную специфичность
ферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников
антибиотиков, последние переводят в аналоги самого антибиотика в ходе
процесса мутасинтеза.
4. рДНК-технологии - создание высокоактивных штаммов
продуцентов антибиотиков. С помощью рДНК можно создавать новые
антибиотики с уникальной структурой, оказывающие мощное воздействие
на определенные микроорганизмы, обладающие минимальными
побочными эффектами.

Схема промышленного биотехнологического производства

антибиотиков

1. получение соответствующего штамма — продуцента

антибиотика, пригодного для промышленного производства;
2. подготовка питательной среды: в технологии получения
антибиотиков применяют твердые питательные среды – агаризованные или
сыпучие субстраты (пшено, ячмень, пшеничные отруби и т.п.) и жидкие
питательные среды.
3. Подготовка посевного материала (продуценты-мутанты колба
на качалке первый инокулятор (10 л) второй инокулятор (100–500 л)
ферментер).
4. Ферментация: для получения антибиотиков используют методы
поверхностного и глубинного культивирования.
99
 В ходе ферментации культура непрерывно аэрируется стерильным
подогретым воздухом. Процесс ферментации осуществляется в строго
стерильной глубинной аэробной периодической культуре, носит
выраженный двухфазный характер. Температура среды, рН и ряд др.
параметров автоматически регулируются в соответствии с регламентом
производства антибиотика. Антибиотики получают при глубинной
аэробной ферментации периодического действия в асептических условиях.
Период ферментации длится 7-10 суток.
5. Выделение антибиотиков. Если антибиотик находится в клетках,
на первом этапе обработки биомассу выделяют из культуральной
жидкости (фильтрацией или центрифугированием); после разрушения
клеток антибиотик экстрагируют и переводят в растворимую фазу. Затем
данный раствор и культуральные среды (если антибиотик выделяется из
клеток в среду) подвергают разным методам экстракции, разделения,
очистки и концентрирования для получения готового продукта.
6. Очистка антибиотиков включает стадии: осаждение, сорбцию,
сушку. Затем препарат фасуют в стерильные флаконы с соблюдением
условий, гарантирующих стерильность.
7. Получение готового продукта: Готовый продукт подвергается
биологическому и фармакологическому контролю. Биологический
контроль определяет степень стерильности препарата. При
фармакологическом контроле проводят всесторонние испытания препарата
на токсичность, пирогенность, токсикогенность и др., оценивают
антимикробный спектр препарата, действие на лейкоциты крови,
устанавливают максимально переносимую дозу антибиотика, дозы,
вызывающие полную и 50 % гибель экспериментальных животных (рис.5).
Готовая форма лекарственного препарата антибиотического
вещества поступает к потребителю с указанием биологической активности
и даты выпуска.
Для каждого продуцента разрабатывается оптимальная среда,
которая должна соответствовать определенным требованиям:
а) обеспечивать максимальный выход антибиотика;
б) состоять из относительно дешевых компонентов;
в) иметь хорошую фильтрующую способность;
г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов для
выделения и очистки антибиотиков.

100
 Рисунок 25 - Схема производства антибиотиков в процессе микробного
биосинтеза

Используются следующие среды:

мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным
экстрактом и пептоном входят хлорид натрия, фосфат калия, иногда
глюкоза или сахароза; используется обычно в лабораторной практике;
картофельные среды с глюкозой и пептоном, часто используемые в
лаборатории для культивирования многих видов актиномицетов и
бактерий;
среды с кукурузным экстрактом, соевой мукой, бардой и другими
веществами, в состав которых входят сульфат аммония, карбонат кальция,
фосфаты, глюкоза, сахароза, лактоза или иные углеводы и ряд других
соединений; среды успешно применяются в промышленности, т. к.
являются дешевыми и обеспечивают хорошее развитие микроорганизмов с
высоким выходом антибиотиков.
Большинство сапрофитных бактерий хорошо развивается на богатых
по составу натуральных средах (мясопептонный агар, картофельный агар,
101
сусло-агар и др.) при рН около 7,0 и температуре 30–37 °С. В этих же
условиях развиваются актиномицеты и некоторые грибы, но для них они
менее благоприятны, чем для бактерий. Значение рН среды после
стерилизации устанавливается в пределах 6,8–7,1.
Мицелиальные грибы предпочтительнее развиваются на средах с
несколько пониженным значением рН (4,5–5,0), на которых плохо растут
многие бактерии и актиномицеты.
Источниками минерального питания служат фосфор, сера и другие
макро- и микроэлементы.
Продуценты антибиотиков по отношению к концентрации фосфора в
среде можно разделить на три группы:
- высокочувствительные продуценты, для которых оптимальная
концентрация фосфора в среде составляет менее 0,01 % (продуценты
нистатина, тетрациклинов, флоримицина, ванкомицина);
- продуценты средней чувствительности, для которых оптимальная
концентрация фосфора составляет 0,010–0,015% (продуценты
стрептомицина, эритромицина, циклосерина, неомицина);
- малочувствительные продуценты, для которых оптимальная
концентрация фосфора составляет 0,018–0,020% (продуценты
новобиоцина, грамицидина, олеандомицина).
Стерилизация питательных сред в промышленных условиях
достигается в результате:
периодического метода для небольших объемов среды, при котором
среда нагревается до 120–130 оС непосредственно в ферментере и
выдерживается в течение определенного времени;
непрерывного метода для значительных объемов, при котором
приготовленная среда подается в стерилизационную колонку, через
которую пропускают острый пар. Нагретая до необходимой температуры
среда поступает в специальный аппарат, где выдерживается определенное
время.
Температура. Для большинства бактериальных организмов
температурный оптимум развития лежит в диапазоне 30–37 °С. Для
продуцента грамицидина С оптимальная температура для развития и
биосинтеза равна 40 °С.
Актиномицеты, как правило, культивируются при температуре 26–
30°С, хотя некоторые виды стрептомицетов могут развиваться как при
пониженных (от 0 до 18 °С), так и при повышенных (55–60 °С)
температурах.
Для большинства мицелиальных грибов оптимальная температура
составляет 25–28 °С.
Аэрация. Большинство изученных продуцентов антибиотиков
являются аэробами. Для биосинтеза многих антибиотиков (пенициллин,
стрептомицин и др.) максимальное их накопление происходит при степени

102
аэрации, равной единице, при которой через определенный объем среды за
1 мин продувается такой же объем воздуха.
В процессе развития продуцента антибиотика в промышленных
условиях потребность организма в кислороде меняется в зависимости от
стадии развития, вязкости культуральной жидкости и других факторов. На
определенных стадиях могут возникнуть ситуации, связанные с
кислородным голоданием продуцента. В этих условиях следует принимать
дополнительные меры, например, повышение концентрации окислителя
добавлением пероксида водорода.

Применение антибиотиков

Антибиотические вещества находят применение в различных

отраслях народного хозяйства, в научных исследованиях. Они широко
используются в медицине, в сельском хозяйстве, в пищевой и консервной
промышленности, как специфические ингибиторы в биологических
исследованиях.
Антибиотики в медицине. Открытие антибиотиков вызвало
переворот в медицине. Многие антибиотические вещества оказались
незаменимыми лечебными препаратами. Они нашли широкое применение
при лечении многих инфекционных заболеваний, которые ранее считались
неизлечимыми или сопровождались высоким летальным исходом. К числу
таких заболеваний необходимо отнести некоторые формы туберкулеза и,
прежде всего туберкулез менингитный, который до применения
антибиотиков вызывал 100%-ный летальный исход, чуму, азиатскую
холеру, брюшной тиф, бруцеллез, пневмонию, различные септические
процессы и др.
Некоторые антибиотики способны подавлять развитие
злокачественных опухолей и проявлять активность в отношении ряда
вирусов.
К настоящему времени в медицинской практике нашло применение
около ста антибиотиков. Поиски новых антибиотических веществ,
получение ценных полусинтетических препаратов антибиотиков
расширяют возможность их практического применения в медицине.
Антибиотики в сельском хозяйстве. Наряду с медицинским
использованием антибиотики находят широкое применение в сельском
хозяйстве. Прежде всего, антибиотики используются в качестве
препаратов в ветеринарии для лечения различных заболеваний
сельскохозяйственных животных. В этом случае они, как и в медицине,
оказались весьма эффективными средствами.
Антибиотические вещества находят все возрастающее применение в
борьбе с фитопатогенными организмами - возбудителями заболеваний
растений, наносящими ощутимый урон сельскохозяйственному
производству.
103
 При выборе антибиотиков, используемых в растениеводстве,
необходимо руководствоваться следующими основными требованиями к
препарату:
1) антибиотик должен обладать специфической биологической
активностью к возбудителю заболевания растений;
2) он должен легко проникать в ткани растений и проявлять внутри
них биологическую активность;
3) лечебные дозы антибиотика должны быть безвредными для
растения;
4) антибиотик, находясь на поверхности и внутри тканей растения,
должен относительно длительное время проявлять биологическую
активность, но должен также легко и быстро инактивироваться, попадая в
почву.
Одним из самых главных требований к антибиотикам, используемым
в сельском хозяйстве, должно быть то, чтобы эти препараты не
применялись в медицинской практике. Это принципиальное условие
обеспечивает снижение уровня появления резистентных форм
микроорганизмов, патогенных для человека.
Для борьбы с фитопатогенными организмами могут применяться
различные антибиотики.
Гризеофульвин - образуется плесневыми грибами из рода Penicillum
(P. urticae, P. nigricans, P. rustrichi).
Гризеофульвин применяют против фитопатогенных грибов и,
прежде всего грибов, относящихся к роду Botrytis. Он активен в
отношении возбудителя ржавчины, мучнистой росы, килы капусты.
Трихотецин - продуцируется плесневым грибом Trichothecium
roseum.
Антибиотик подавляет развитие ряда фитопатогенных грибов, в том
числе Botrytis cinerea, Helmintosporium. Попадая в почву, трихотецин
инактивируется ферментом трихотециназой, образуемой почвенными
грибами из рода Fusarium, Aspergillus, Penicillum.
Касугамицин, продуцируемый Streptomyces kasugaensis, имеет
следующее строение: Активен против грибного заболевания риса
пирикуляриоза, широко распространенного в Японии. Заболевание
вызывается грибом Pericularia oryzae.
Полиоксины - антибиотики, относящиеся к своеобразным
соединениям пептидил-пиримидин-нуклеозидам, обладают
противогрибковой активностью. Образуются культурой Streptomyces
cacaoi и имеют следующее строение:
Антибиотики подавляют рост фитопатогенных грибов из рода
Alternaria, Cochliobalus, Pirularia.
Валидамицин А, образуемый Streptomyces hygroscopicus var.
limoneus, обладает биологической активностью против фитопатогенного
гриба Rizoctonia solani - возбудителя заболевания риса. Известна
104
суммарная формула валидамицина A: C20H35NO13∙H2O. Антибиотик легко
разлагается почвенными микроорганизмами.
Тетранастин - антибиотическое вещество актиномицетного
происхождения. Его продуцентом является Streptomyces aureus. Обладает
специфической активностью против паразитарных паучков и клещей
плодовых деревьев.
Гербицидины А и В, синтезируемые Streptomyces saganoensis,
подавляют развитие возбудителя заболевания риса, вызываемое
Xanthomonas oryzae.
Гербицидин А задерживает прорастание семян риса и китайской
капусты, обладает избирательной гербицидной активностью против
двудольных растений.
Гербицидины А и В по химическому строению и биологической
активности близки к тойокамицину, образуемому культурой Str.
toyocaensis.
Антибиотики в пищевой и консервной промышленности. При
борьбе с микроорганизмами, вызывающими порчу продуктов питания,
наряду с физическими и химическими методами применяются и
антибиотики. Однако для этих целей не могут быть использованы
антибиотики, применяемые в медицине. Это правило введено в нашей
стране и ряде других государств и связано оно с предупреждением
процесса возникновения и распространения устойчивых к антибиотикам
форм микробов.
Среди антибиотиков, применяемых в пищевой и консервной
промышленности, можно назвать субтилин, низин и некоторые другие.
Субтилин образуется культурой Bacillus subtilis и представляет собой
полипептид. Активен в отношении грамположительных и
грамотрицательных микроорганизмов, в том числе и кислотоустойчивых
бацилл.
Применяя субтилин при консервировании овощей, можно
значительно смягчить их термическую обработку, что имеет большое
значение для сохранения витаминов, вкусовых качеств и консистенции
продукта.
Низин - высокомолекулярный пептид, а может быть даже
низкомолекулярный белок, образуемый Streptococcus lactis.
Низин не используется в медицинской практике. Его применяют при
консервировании томатов, зеленого горошка, цветной капусты и других
продуктов. Хорошие результаты получены при сохранении сыров.
Антибиотик подавляет развитие ряда термофильных
спорообразующих бактерий, не токсичен для человека.
Применение антибиотиков в растениеводстве, пищевой и консервной
промышленности должно происходить под постоянным и строгим
контролем специалистов и соответствующих компетентных органов.

105
 Контрольные вопросы
1. Дайте определение термину антибиотики?
2. Принципы классификация антибиотиков.
3. Перечислите основные группы микроорганизмов-продуцентов
антибиотиков.
4. Характеристика метаболических путей биосинтеза антибиотиков
микроорганизмами.
5. Характеристика антибиотиков, продуцируемых актиномицетами.
6. Характеристика антибиотиков, продуцируемых бактериями.
7. Характеристика антибиотиков, продуцируемых мицелиальными
грибами.
8. Опишите их технологию получения пенициллина.
9. Области применение антибиотиков в пищевой промышленности.
10. Какие методы используют при анализе качества антибиотиков.

ТЕМА 11
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ: ПРОИЗВОДСТВО
ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Номенклатура ферментных препаратов микробного

происхождения

Ферменты (от лат. «fermentum» — закваска) или энзимы - белковые

молекулы или молекулы РНК (рибозимы) или их комплексы,
катализирующие химические реакции в живых системах.
Происхождение терминов связано с тем, что первоначально
ферментативные процессы были открыты и изучены в бродильном
производстве.
Термины «фермент» и «энзим» давно используют как синонимы
(первый, в основном, в русской и немецкой научной литературе, второй - в
англоязычной). А более ста лет назад эти термины отражали различные
точки зрения в теоретическом споре Л. Пастера и Ю. Либиха о природе
спиртового брожения.
Ферменты обладают уникальными свойствами (эффективность и
специфичность действия, нетоксичность, способность работать в мягких
условиях, перерабатывать различное сырье растительного и животного
происхождения, в том числе и отходы), в связи с чем их применение в
промышленности выгодно с экономической и экологической точек зрения.
Ф е р м е н т н ы е п р е п а р а т ы могут представлять собой смесь
ферментов или фермент одного вида, иметь различную степень очистки,
могут быть добавлены в сырье или продукт или использоваться
закрепленными на носителе (иммобилизованные ферменты).

106
 Поэтому в технологии ферментов препараты чаще классифицируют
по основному компоненту в смеси ферментов, присутствующих в данном
препарате: амилолитические, протеолитические, липолитические и т. д.
Существует определенная система названия ферментных препаратов,
в которой учитываются основной фермент, источник получения и степень
очистки. Наименование каждого препарата включает сокращенное
название основного фермента, затем добавляется видовое название
продуцента и заканчивается название препарата суффиксом «ин».
Например, амилолитические препараты, получаемые из культур Aspergillus
oryzae и Bacillus subtilis, называются соответственно амил-о-ризин (амило-
ризин) и амил-о-субтилин (амилосубтилин). Далее ставится индекс, в
котором обозначены способ производства и степень очистки фермента от
балластных веществ. При глубинном способе культивирования после
названия ставится буква Г, а при поверхностном - П. Если это
неочищенная культура продуцента, то далее следует буква х. Между
буквами П, Г и х может стоять цифра, обозначающая степень чистоты
препарата. Индекс 2 обозначает жидкий неочищенный концентрат
исходной культуры; 3 - сухой ферментный препарат, полученный
высушиванием распылением неочищенного раствора фермента (экстракт
из поверхностной культуры или культуральной жидкости); 10 - сухие
препараты, полученные осаждением ферментов органическими
растворителями или методом высаливания. Индексы 15, 18, 20 обозначают
препараты, частично освобожденные не только от балластных веществ, но
и от сопутствующих ферментов. Номенклатура препаратов с индексом
выше 20 не используется, так как в этих случаях речь идет о
высокоочищенных и даже гомогенных ферментных препаратах, которые
именуются согласно классической номенклатуре и классификации
ферментов.

Характеристика активности ферментных препаратов

Ферменты являются веществами белковой природы, поэтому в смеси

с другими белками определить их количество невозможно. Наличие
определенного фермента в данном препарате может быть установлено по
результатам той реакции, которую катализирует фермент, т. е. по
количеству образовавшихся продуктов реакции или уменьшению
исходного субстрата. В количественном выражении условно активность
фермента определяется по начальной скорости ферментативной реакции.
Начальная скорость зависит от многих факторов, наиболее важные из них -
температура, концентрация субстрата, рН реакционной смеси и время от
начала реакции. Поэтому по предложению Комиссии по ферментам
Международного биохимического союза были приняты правила
определения активностей препаратов и их выражения в единицах
активности.
107
 Стандартная единица активности. Эта величина для любого
фермента обозначает то количество его, которое катализирует
превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин при заданных
регламентированных условиях. На русском и немецком языках эта
единица обозначается буквой Е, на английском, французском, итальянском
и испанском - U. Часто количество субстрата нельзя выразить числом
микромолей, так как точно не известна масса молекулы, например, при
действии на белок, крахмал, пектин, целлюлозу. В этих случаях
определяют микроэквивалент затронутых реакцией групп. Так, при
гидролизе белка учитывают не число прогидролизованных молекул, а
число образовавшихся свободных карбоксильных или аминных групп, т. е.
число расщепленных пептидных связей; при гидролизе крахмала и
полисахаридов - число прогидролизованных глюкозидных связей и т. д.
Комиссия по ферментам рекомендовала придерживаться
определенных условий при установлении активности фермента: стараться
вести определение при температуре 30°С и определять активность по
начальной скорости реакции, когда концентрация субстрата достаточна
для насыщения фермента и соответствует кинетике реакции нулевого
порядка. Концентрации субстрата, фермента и рН выбирают
оптимальными для данного фермента.
Если количество прореагировавшего субстрата очень мало или
велико, допускается выражение результатов в миллиединицах (мЕ или мU)
и кило-единицах (кЕ и кU).
Активность ферментных препаратов. Содержание фермента в
данном препарате условно выражается в стандартных единицах
активности фермента на 1 мл ферментного раствора или 1 г препарата.
Активность ферментного препарата выражается в микромолях субстрата,
прореагировавшего в присутствии 1 мл ферментного раствора или 1 г
препарата в заданных условиях за 1 мин. Число микромолей и будет равно
числу стандартных единиц. Если фермент гомогенен, то его удельная
активность может быть выражена в стандартных единицах на 1 мг
фермента: если же препарат содержит балласт в виде неактивного белка,
его удельная активность выражается в стандартных единицах на 1 мг белка
в ферментном препарате. Молекулярная активность представляет собой
число миллимолей субстрата или эквивалентов затронутой реакцией
групп, прореагировавших в течение 1 мин с 1 ммоль фермента при
оптимальных концентрациях субстрата, или число стандартных единиц,
содержащихся в 1 ммоль фермента.
Если фермент содержит характерную простетическую группу или
несколько каталитических центров, которые поддаются измерению, его
активность можно выразить в величинах активности каталитического
центра. Такая активность будет соответствовать молекулярной активности,
если молекула фермента имеет один активный центр; если же число

108
каталитических центров n, то активность одного центра будет в n раз
меньше молекулярной.
Активность условного препарата. В технологии ферментов
помимо общепринятых понятий об активности ферментных препаратов
принято пользоваться понятием активности условного ферментного
препарата. Это необходимо для оценки работы предприятия, сравнения его
с другими аналогичными заводами, т. е. для сопоставления показателей по
всем видам выпускаемой продукции. Для осуществления этого пересчета
предполагают, что предприятие выпускает товарную продукцию в виде
стандартного препарата с точно определенной активностью, измеряемой
по основному ферменту в стандартных единицах в препарате на единицу
массы препарата. Активность основного фермента в таком стандартном
условном препарате устанавливается нормативами и называется
активностью условного препарата.
За 1 усл. т ферментного препарата принимается 1 т препарата со
стандартной активностью. Для пересчета выработанной товарной
продукции в условные тонны можно пользоваться формулой
Qусл=QтовАф / Aусл ,
где Qусл - количество условного препарата, т; Qтов - количество
товарного препарата, т; Аф - фактическая активность товарного препарата,
ед./г; Aусл - активность условного препарата, ед./г.

Производство ферментных препаратов является одним из

перспективных направлений развития биотехнологии.
Для крупномасштабного получения ферментов пригодны только
некоторые растительные организмы на определенной фазе их развития
(проросшее зерно различных злаков и бобовых, сок зеленой массы
растений), а также отдельные ткани и органы животных (поджелудочная
железа, сычуг крупного рогатого скота). Практически неограниченный
источник ферментов – микроорганизмы, содержащие набор большинства
известных в настоящее время энзимов, количество которых можно
повысить в десятки и сотни раз методами мутагенеза, селекции и индукции
биосинтеза.
Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов в
промышленности используется около 30. Основная часть ферментов,
поступающих на мировой рынок, приходится на долю гидролаз. По
прогнозам ученых, основным потребителем ферментов в ближайшем
будущем останется пищевая промышленность.
Главное место среди ферментов для пищевой промышленности
занимают глюкоизомераза и глюкоамилаза, применяющиеся для
получения обогащенных фруктозой сиропов и составляющие около 50 %
рынка пищевых энзиматических препаратов.

109
 Получение ферментных препаратов из сырья растительного
происхождения

Для получения ферментных препаратов пригодны только некоторые

растения или отдельные органы растений и животных, способные
накапливать значительное количество ферментов. Источники некоторых
ферментов приведены в табл. 2.
Из ферментов растительного происхождения наиболее широко в
пищевой промышленности используют амилазы и папаин. Источником
ферментов могут быть пророщенные зерна различных злаков. Условно
ферментным препаратом можно считать и ячменный солод, в котором
содержится до 1 % амилаз.

Таблица 2 - Источники ферментов растительного происхождения

Ферменты Источник,
из которого получают
Амилазы Ячмень
Протеазы:
Папаин Дынное дерево
Фицин Фиговое дерево
Бромелаин Ананас
Кислая фосфатаза Картофель
Пероксидаза Хрен
Уреаза Канавалия мечевидная

Растительная протеаза - папаин - содержится в плодах дынного

дерева. Только в США ежегодно расходуют около 1 т папаина для
обработки (размягчения) мяса. Папаин, а также протеазы фицин и
бромелаин при контакте с мясом в течение 2 час при комнатной
температуре расщепляют белки соединительной ткани - коллаген и
эластин.
Из растительного сырья получают также фосфатазы, пероксидазы,
уреазы, гемицеллюлазы и другие ферменты.

Получение ферментных препаратов из сырья животного

происхождения

Органы и ткани животных (поджелудочная железа, слизистые

оболочки желудков и тонких кишок свиней и т.п.), содержащие ферменты,
на мясоперерабатывающих комбинатах консервируют и используют для
получения ферментов. Из слизистой желудка свиней и крупного рогатого
скота получают препарат пепсина. Из поджелудочной железы свиней
110
получают панкреатин, смеси трипсина, химотрипсина, липаз и амилаз.
Пепсин, трипсин и химотрипсин применяют для размягчения мяса, однако
бόльший эффект получен при обработке мяса панкреатином. Из желудка
(сычуга) молодых телят выделяют сычужный фермент (реннин), широко
используемый в сыроделии. Сычужный фермент осуществляет процесс
превращения жидкого молока в гель (сгусток), а кроме того, участвует в
протеолизе, происходящем в сыре при созревании. Некоторые наиболее
известные ферменты животного происхождения, а также органы и ткани
животных, из которых их получают, представлены в табл. 3.

Таблица 3- Источники ферментов животного происхождения

Ферменты Источник,
из которого получают
Сычужный фермент Крупный рогатый скот - сычуг
Щелочная фосфатаза Крупный рогатый скот - кишечник
Лактатдегидрогеназа Крупный рогатый скот - сердце
Гиалуронидаза Крупный рогатый скот - семенники
Каталаза Крупный рогатый скот,
свиньи - печень
Пепсин Свинья - желудок
Трипсин, химотрипсин, Свинья - поджелудочная железа
карбоксинпептидаза,
панкреатин, эластаза
Фумараза и Свинья - сердце
трансаминаза
Аминоацилаза Свинья - почки
Ацетилхолинэстераза Электрический угорь - мышечная
ткань

Технология получения ферментных препаратов микробным

синтезом

Технологический процесс можно разбить на три стадии:

1) получение посевного материала;
2) получение производственной культуры методами поверхностного
или глубинного культивирования;
3) выделение из готовой производственной культуры технических
или очищенных ферментных препаратов.
Производство ферментных препаратов осуществляется и
поверхностным, и глубинным способами.
Поверхностный метод заключается в культивировании
микроорганизмов на поверхности увлажненной стерилизованной сыпучей
111
питательной среды, размещенной в кюветах. Инкубацию микроорганизмов
ведут в специальном термостатируемом цехе при постоянном контроле в
нем температуры, влажности и расхода воздуха.
Основные параметры поверхностного способа получения ферментов
приведены в табл. 4.

Таблица 4 - Основные параметры поверхностного способа

получения ферментов

Параметры стадии Значения параметров

Продуценты Микроскопические грибы
родов Aspergillus, Rhizopus,
Penicillium, Trichoderma, Mucor,
Fusarium
Компоненты питательной Пшеничные отруби,
среды солодовые ростки, свекловичный
жом, пивная дробина, опилки (W
=58-60 %)
Температура культивирования 30-32 → 28-30 °С
Режим аэрации Кондиционированный воздух
W от 98-99 до 92-94 % и
температурой от 30-32 °С
до 28-30 °С, расход 0,1-0,2 м3 /
кг⋅ч
Продолжительность от 36 до 52 ч в зависимости от
культивирования продуцента
Содержание ферментов 0,006-0,007 % от массы сухих
веществ

При поверхностном способе в качестве продуцентов используются

микроскопические грибы. Питательные среды при этом способе имеют
твердую или рыхлую консистенцию. Основой почти всех сред являются
увлажненные пшеничные отруби. Для придания среде рыхлой структуры и
ее обогащения к пшеничным отрубям добавляются древесные опилки или
солодовые ростки. Среду стерилизуют при температуре 105-140оС от 60 до
90 мин. После стерилизации среда охлаждается в этом же аппарате до
температуры 38-40оС, после этого в аппарат вводят посевную культуру
продуцента и тщательно перемешивают среду. Доза посевного материала
составляет 0,5-1%. Засеянная среда поступает из стерилизатора на
специальный стол и раскладывается ровным слоем на простерилизованные
кюветы. Заполненные кюветы устанавливают на этажерки, которые
транспортируют в растильные камеры.
Процесс выращивания поверхностной культуры длится 36-48 час.
Выросшая в неподвижном слое культура представляет собой корж из
112
набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Для
дальнейшего употребления массу приходится размельчать до гранул 5-6
мм, это достигается применением различных типов дробилок. После
дробления культуру, имеющую влажность 40-50 %, необходимо высушить
до 10-12 %, при этом температура сушки не должна превышать 40 оС, а
длительность не более 30 мин.
Дробление и сушка в простейшем случае завершают обработку
препарата марки ПХ.
Для выращивания продуцентов ферментов глубинным методом в
промышленных условиях используют ферментаторы из нержавеющей
стали, снабженные устройствами для перемешивания и подачи в жидкую
питательную среду стерильного воздуха. Основные параметры глубинного
способа получения ферментов приведены в табл. 4. Культивирование
проводят в жидких средах, а продуцентами могут быть и бактерии. Весь
процесс должен проводиться в строго асептических условиях. Малейшее
нарушение асептики может привести к прекращению образования
фермента.
Сначала ферментатор заполняют питательной средой,
стерилизуют ее, затем засевают чистой культурой, подаваемой из
специального генератора. Для предотвращения инфицирования в
ферментере поддерживают повышенное давление наряду с оптимальными
значениями рН, температуры, окислительно-восстановительного
потенциала и другими условиями культивирования. Основные параметры
глубинного способа получения ферментов приведены в табл. 5.

Таблица 5 - Основные параметры глубинного способа

получения ферментов

Параметры стадии Параметры стадии

Продуценты Микроскопические грибы
родов Aspergillus, Rhizopus,
Penicillium, Trichoderma, Mucor,
Fusarium, бактерии родов Baccillus
и Clostridium
Компоненты питательной Кукурузная мука, крахмал,
среды патока, гидролизаты казеина,
дрожжей, древесины, минеральные
соли (содержание СВ от 1,5 до 15,5,
pH от 3,5 до 8,5)
Температура 26-32 °С для грибов
культивирования 32-37 для бактерий
Режим аэрации 50-60 м3 / ч⋅м3
Продолжительность от 24 до 54 ч
культивирования
113
 Глубинный способ выращивания принципиальных отличий от
других производств не имеет. Культивирование проводят в жидких средах,
а продуцентами могут быть и бактерии. Весь процесс должен проводиться
в строго асептических условиях. Малейшее нарушение асептики может
привести к прекращению образования фермента.
Фильтраты культуральной жидкости после глубинного
культивирования содержат не более 3 % сухих веществ. Поэтому
необходимо предварительно концентрировать фильтрат, перед тем как
выделять из него ферменты любым методом.

Выделение и очистка ферментов

Выделение и очистка ферментов – весьма трудоемкая и
дорогостоящая процедура, поэтому если фермент можно использовать в
виде неочищенного препарата, его не очищают.
Например, в пивоваренной промышленности применяются
ферментные препараты, представляющие собой высушенную биомассу
плесневых грибов. В большинстве отраслей пищевой промышленности
используют очищенные ферментные препараты, частично или полностью
освобожденные от балластных веществ.
Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат:
биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из
культуры микроорганизмов.
Неочищенные ферментные препараты получают путем высушивания
в мягком режиме культуры микроорганизмов вместе с остатками
питательной среды. Такие препараты получают и путем упаривания
экстракта из культуры продуцента, выращенного поверхностным
способом, или из фильтрата культуральной жидкости в случае глубинного
выращивания микроорганизмов. Технические препараты ферментов
представляют собой либо высушенные до порошкообразного состояния
продукты, либо жидкие концентраты с содержанием 50 % сухих веществ.
Технические препараты ферментов представляют собой либо
высушенные до порошкообразного состояния продукты, либо жидкие
концентраты с содержанием 50 % сухих веществ.
Схема очистки ферментов включает следующие этапы:
1) освобождение от нерастворимых веществ;
2) освобождение от сопутствующих растворимых веществ;
3) фракционирование белков.
Э к с т р а к ц и я и з п о в е р х н о с т н о й к у л ь т у р ы . Наилучшим
экстрагентом для белков является вода. Вместе с белками в воду переходят
часть сахаров, не потребленных в процессе роста, гемицеллюлозы,
пектиновые вещества, продукты гидролиза целлюлозы и белковых
веществ, содержащихся в отрубях, растворимые пигменты, образуемые
плесневыми грибами. Из-за большой молекулярной массы ферменты
114
диффундируют медленно. Используют 8-секционную батарею, общее
время экстракции около 4 час.
Отделение твердой ф а з ы . Фильтрация жидкостей,
содержащих мелкодисперсный клеточный материал, частично
разрушенные клетки и внутриклеточные биополимеры, осложнена тем, что
такая суспензия склонна к гелеобразованию, осадок сжимается, и
производительность фильтров быстро падает. Улучшению процесса
фильтрации способствует регулирование рН, добавление флокулянтов или
введение 0,1 % хлорида кльция. Однако это может вызвать потерю
ферментативной активности. Поэтому целесообразнее использовать
центрифугирование. Потери ферментов на этой стадии 10-15 %.
К о н ц е н т р и р о в а н и е ф е р м е н т н ы х р а с т в о р о в проводится
выпариванием в проточных выпарных аппаратах пленочного типа, за
которыми установлены холодильники для резкого снижения температуры
и сокращения времени пребывания раствора в нагретом состоянии. Для
ускорения процесса температуру греющего пара поднимают до 100-120 оС,
при этом температуру кипения раствора фермента необходимо снизить до
20 оС, то есть обеспечить высокий вакуум. В производственных условиях
не всегда возможно достичь глубокого вакуума, поэтому потери фермента
из-за тепловой инактивации достигают 20-25 %.
У л ь т р а ф и л ь т р а ц и я позволяет одновременно удалить из
растворов все низкомолекулярные баластные примеси, то есть
одновременно происходит и концентрирование, и очистка ферментов.
Процесс основан на разделении веществ по молекулярной массе с
использованием полупроницаемой мембраны. Не требует изменения
температуры, проводится без добавления химических реагентов и
позволяет получить любую концентрацию и степень очистки ферментов.
О с а ж д е н и е о р г а н и ч е с к и м и р а с т в о р и т е л я м и . В качестве
осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. Используя
различное количество растворителя и проводя процесс при различных
значениях рН, можно осаждать ферменты фракциями с преобладанием
какого-либо одного из них. Например, из 50%-го этанола осаждается до
80% протеазы и лишь 3-5 % амилазы. В то же время до 98 % амилазы
выпадает при использовании 70 % спирта.
Надосадочную жидкость направляют на регенерацию. Потери
фермента достигают 15 % по причине инактивации при длительном
контакте с растворителем.
В ы с а л и в а н и е . Используют сульфат аммония, сульфат натрия,
сульфат магния, фосфат калия. Осадок ферментов различной природы
образуется за разное время - от 0,5 до 12 час. Длительность этого процесса,
а также расход соли сильно зависят от содержания сухих веществ в
растворе. Для выделения 1 кг препарата из культуральной жидкости надо
затратить 45-50 кг соли, а из раствора, упаренного до содержания 30 %
АСВ, - только 1,5 кг.
115
 С о р б ц и о н н а я о ч и с т к а . Для сорбции белков чаще всего
применяют иониты на основе целлюлозы: катионит -
карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) и анионит - диэтиламиноэтилцеллюлозу
(ДЭАЭ).
С у ш к а ф е р м е н т н ы х п р е п а р а т о в . Этот процесс завершает
стадии выделения и очистки ферментов. Высушиванию подвергают
культуральные жидкости и диффузионные вытяжки, концентраты после
упаривания и ультрафильтрации, а также осадки после осаждения
растворителями или солями.
Жидкие полупродукты чаще сушат в распылительных сушилках.
Сушку осадков проводят под вакуумом. Более современны и эффективны
сушилки, которые перемешивают продукт в процессе сушки.
После сушки препарат должен содержать не более 6-8 % влаги, тогда
срок его хранения в герметичной упаковке может составлять до года
практически без потери активности.
С т а н д а р т и з а ц и я ф е р м е н т н ы х п р е п а р а т о в - это
операция по доводке активности препарата до стандартной, определяемой
ГОСТ или техническими условиями. Для этого используют нейтральные
наполнители, например, крахмал, лактозу, пищевую соль. Препарат и
наполнитель тщательно перемешивают в барабанном смесителе в течение
20-30 мин, количество наполнителя расчитывают по формуле:
Аисх · М
m= М,
Аст
где m - масса наполнителя; М - масса исходного препарата; Аисх -
активность исходного препарата; Аст - стандартная активность.

Применение ферментов

Ферменты нашли широкое применение в таких отраслях

промышленности, как хлебопечение, пивоварение, виноделие, чайное,
кожевенное и меховое производства, сыроварение, кулинария (для
обработки мяса).
Так, например кислые протеазы на основе высокоактивного
продуцента Aspergillus oryzae применяют в производстве спирта и для
получения белковых гидролизатов высокого качества в пищевой
промышленности. В сочетании с амилазой эти ферменты также
используют в хлебопекарной промышленности. Они улучшают качество и
аромат хлеба, ускоряют созревание теста, увеличивают пористость и объем
хлеба.
В пищевой промышленности целлюлазы используют для осветления
соков, в пивоварении. Использование протеаз ускоряет созревание сыров
вдвое и снижает их себестоимость на 10%. В кулинарии обработка мяса
пептидгидролазами Streptomyces griseus (протелином и проназой) перед
116
его приготовлением значительно улучшает качество мясных блюд. По
прогнозам ученых, основным потребителем ферментов в ближайшем
будущем остается пищевая промышленность. Главное место среди этих
энзимов занимают глюкоизомераза и глюкоамилаза, применяющиеся для
приготовления обогащенных фруктозой кукурузных сиропов и
составляющие около 50 % рынка пищевых энзиматических препаратов.
В текстильной промышленности процесс расшлихтовки
(выравнивания поверхности) тканей ферментными препаратами класса
протеаз грибного происхождения ускоряется в 7–10 раз; эти же препараты
служат для удаления белка серицина при размотке коконов тутового
шелкопряда при производстве натурального шелка. С конца 1980-х гг.
целлюлазы стали активно применяться для обработки текстильных
изделий и материалов. Первым таким процессом стала ферментативная
обработка джинсовых изделий, приводящая к частичному удалению
красителя с поверхности ткани, в результате которой изделия приобретают
внешний вид «вареных джинсов». В течение нескольких лет ферменты
практически заменили пемзу и химические агенты, применявшиеся для
этой цели ранее. Позднее целлюлазы стали широко использоваться для
биополировки трикотажа и изделий на основе хлопчатобумажных и
смесовых тканей. В результате такой обработки с поверхности материала
удаляются ворсинки и неровности, материал становится более гладким,
приятным на ощупь, и после серии стирок ткань не скатывается, что
повышает потребительские свойства изделий.
В кожевенном и меховом производстве применяют препараты
протеиназ (протелин и протофрадин), являющихся внеклеточными
ферментами стрептомицетов. При этом время, требуемое для
осуществления необходимых процессов, сокращается в несколько раз,
сортность и качество шерсти и кожи повышается.
Щелочные протеазы на основе высокоактивного продуцента Bacillus
licheniformis вместе с целлюлазами являются компонентами стиральных
порошков и моющих средств. Кроме того, протеолитические ферменты
применяют при извлечении серебра из фотографических пленок и бумаги.
Важнейшей областью применения протеолитических ферментов
является медицина. Нейтральные протеазы широко используются в
лечении болезней желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой
системы, в хирургии для обработки гнойных ран, ожоговых и
обмороженных поверхностей. Протеазы способствуют размягчению
омертвевшей ткани, облегчая тем самым дренаж ран и ускоряя их
заживление.
На втором месте по объему промышленного использования, после
протеаз, находятся амилолитические ферменты, которые катализируют
гидролиз различных типов гликозидных связей в крахмале, декстране,
гликогене и родственных полисахаридах. К ферментам, расщепляющим
гликозидную связь внутри полисахарида (эндоамилазам), относятся α-
117
амилаза, пуллуланаза и циклодекстрин-глюкозилтрансфераза. Среди
экзоамилаз выделяют β-амилазу, глюкоамилазу и амилоглюкозидазу.
Из амилолитических ферментов чаще используют α-амилазу (из
Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis) и глюкоамилазу
(продуцируется представителями рода Aspergillus). α-Амилаза – фермент,
осуществляющий эндогидролиз α-1,4- гликозидных связей крахмала,
гликогена и родственных им полисахаридов до мальтозы, декстринов и
глюкозы. α-Амилазы используются в процессе промышленного получения
этанола как частичная замена дорогого солода в пивоварении, для
улучшения качества муки в хлебопечении, а также в целлюлозно-
бумажной промышленности. Кроме того, эти ферменты применяются в
текстильной промышленности при изготовлении тканей и как добавки к
моющим средствам.
Глюкоамилаза – экзофермент, атакующий крахмал с
нередуцирующего конца полисахаридной цепочки, последовательно
отщепляя глюкозные остатки с образованием преимущественно глюкозы.
Препараты глюкоамилазы применяются для ферментативной обработки
крахмалсодержащего сырья в спиртовой, крахмалопаточной,
хлебопекарной и пивоваренной промышленности.
Целлюлолитические ферменты – ферменты класса гидролаз,
катализирующие гидролиз 1,4-гликозидных связей в молекуле целлюлозы
с образованием набора олигосахаридов различной степени полимеризации
вплоть до мономера – глюкозы.
Среди целлюлолитических ферментов микроорганизмов выделяют
экзоглюканазы (целлобиогидролазы, отщепляющие от нередуцирующего
конца целлюлозной цепи как остатки целлобиозы, целлотриозы, глюкозы,
так и более крупные фрагменты), эндоглюканазы (гидролизующие β-1,4-
гликозидные связи между остатками глюкозы в середине цепи), β-
глюкозидазы (катализирующие превращение целлобиозы и целлотриозы в
глюкозу).
Среди промышленных продуцентов микробных целлюлаз ведущую
роль играют различные виды грибов рода Trichoderma (Т. reesei, Т. viride,
Т. longibrachiatum). Это обусловлено высокой секреторной способностью
их клеток, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной
субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным
объектом для получения различного рода биотехнологических продуктов.
Препараты целлюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются во
многих странах ведущими компаниями – производителями промышленных
ферментов, в частности Novozymes (Дания), Genencor International (США),
Iogen (Канада), PrimAlko (Финляндия), Meiji Seika Kaisha Ltd. и Shin Nihon
Chemical Co. (Япония) и др.
Кроме того, целлюлолитические ферменты активно используются в
целлюлозно-бумажной промышленности, в сельском хозяйстве (в процессе

118
приготовления силоса). После полного гидролиза целлюлозу можно
использовать как дешевый источник глюкозы.
В последнее десятилетие целлюлазы также стали активно
использоваться в качестве добавок к детергентам и моющим средствам,
чтобы, воздействуя при стирке на текстильные материалы, содержащие в
своем составе целлюлозные волокна, облегчить удаление грязей за счет
гидролиза части поверхностных волокон.
В последние годы ферменты стали применять в тонкой химической
индустрии для осуществления таких реакций органической химии, как
окисление, восстановление, дезаминирование, декарбоксилирование,
дегидратация, конденсация, а также для разделения и выделения изомеров
аминокислот L-ряда (при химическом синтезе образуются рацемические
смеси L- и D-изомеров), которые используют в промышленности, сельском
хозяйстве, медицине.
Для деградации и модификации антропогенных органических
соединений, поступающих в окружающую среду, используют ферменты
разных классов и в том числе лактазу, лигниназу, тирозиназу,
монооксигеназу, диоксигеназу и др.
Перспективна для очистки сточных вод новая технология,
основанная на использовании реакции пластеинообразования, открытой А.
Я. Данилевским в 1886 г. Сущность работ Данилевского состоит в
экспериментальном доказательстве обращения протеолиза и возможности
синтеза белковоподобных веществ (пластеинов) под действием ряда
протеолитических ферментов. Сточные воды содержат аминокислоты и
пептиды, концентрация которых возрастает в результате гидролиза
белковых компонентов отходов под воздействием пептидогидролаз
микроорганизмов. Данная технология, активно внедряющаяся во Франции,
нацелена на производство в промышленных масштабах кормовых белков
из аминокислот и пептидов сточных вод.
Развитие клеточной и генной инженерии было бы невозможно, если
бы в распоряжении исследователей не было целого набора специфических
ферментов (рестриктаз, лигаз, синтетаз, ферментов избирательно
разрушающих клеточную оболочку и др.). Так, в настоящее время в
продаже имеется более 300 различных рестриктаз.
Ферменты широко используют в медицине, например в
заместительной терапии в составе лечебных препаратов. Пероральное
введение фенилаланин-аммиак-лиазы снижает уровень фенилаланина в
крови при фенилкетонурии. Протеолитические ферменты, амилазу и
липазу применяют при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и
печени.
В последние годы накопились данные об эффективности применения
протеиназ в энзимотерапии злокачественных новообразований. Это
объясняется большей проницаемостью мембран раковых клеток для
гидролитических ферментов в сравнении с нормальными клетками,
119
благодаря чему опухолевые клетки быстро лизируются при введении
смеси протеиназ (препарат «Папайотин»).
Протеолитические ферменты - плазмин и активирующие его
стрептокиназу и урокиназу используют для растворения тромбов в
кровеносных сосудах и разжижении гноя; коллагеназу - для рассасывания
рубцовых образований; эластазу - для задержки развития атеросклероза;
лизоцим - для лечения конъюнктивитов; дезоксирибонуклеазу из
стрептококка (стрептодорназа) - для лечения заболеваний верхних
дыхательных путей и роговицы глаза.
L-аспарагиназу продуцируют Е. coli и Erwinia carotovora. Фермент
используют при химиотерапии некоторых форм лейкемии. L-аспарагиназа
отщепляет одну аминогруппу от аспарагина, превращая его в
аспарагиновую кислоту. Избирательность действия фермента определяется
потребностью некоторых форм опухолевых клеток в аспарагине, тогда как
нормальные клетки в аспарагине не нуждаются.
Нейраминидазу получают при культивировании Vibrio cholera.
Фермент отщепляет остатки N-ацетилнейраминовой кислоты, входящей в
мембрану некоторых опухолевых клеток, повышая, таким образом, их
антигенную активность.
β-лактамазы, инактивирующие пенициллины и цефалоспорины, ис-
пользуются при определении стерильности этих антибиотиков или при
микробиологическом анализе клинического материала от больных, полу-
чающих эти антибиотики. В терапевтических целях их используют в
случае тяжелой аллергической реакции на β-лактамные антибиотики.
Фермент вводят внутримышечно или внутривенно совместно с другими
препаратами (адреналин, антигистаминные средства).

Контрольные вопросы

1. В чем отличие ферментов от ферментных препаратов?

2. Что такое активность ферментного препарата?
3. Перечислите основные источники получения ферментов
растительного происхождения.
4. Какие ткани и органы животных используют для получения
ферментов?
5. Перечислите, какие микроорганизмы применяют для
промышленного производства ферментных препаратов.
6. Какие способы культивирования микроорганизмов используют
при производстве ферментных препаратов?
7. Расскажите, по какому принципу составляется название
ферментного препарата микробного происхождения.
8. Ферментные препараты какого действия наиболее широко
используются в пищевой промышленности?

120
 9. Перечислите области применения амилолитических
ферментов.
10. В каких отраслях пищевой промышленности используются
пектолитические ферменты?
11. Назовите продуценты и область применения целлюлаз.

ТЕМА 12
ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Инженерная энзимология разрабатывает и осуществляет

промышленные методы получения химических веществ и продуктов
(например, пищевых), основанные на использовании в качестве
катализаторов химических реакций ферментов, выделенных обычно из
биолоогических объектов или находящихся внутри клеток, которые
искусственно лишены способности роста.
Инженерная энзимология возникла в конце 60 – начале 70-х годов на
базе технической биохимии.
Инженерная энзимология – это общая система методов получения,
очистки ферментов в различных реакторах, объединяющая подходы ряда
областей естествознания (химический энзимологии, биохимии,
микробиологии и т.д.)., химической технологии и инженерно-
экономических дисциплин.
Области применения инженерной энзимологии: тонкий
органический синтез (фармацевтическое производство), пищевая
промышленность (пищевые добавки, производство продуктов питания,
кормовые добавки), медицина (лекарственные препараты на основе
ферментов, диагностические наборы и устройства, аналитические системы
и устройства, биосенсоры.
Наибольшее распространение получили препараты, в которых
ферменты в активной форме прикреплены к нерастворимой основе. Такие
ферментные препараты называют и м м о б и л и з о в а н н ы м и.
Иммобилизация фермента – метод, при котором молекулу
биокатализатора включают в какую-либо фазу, отделенную от фазы
свободного раствора, но способную обмениваться с ней молекулами
субстрата, эффектора или ингибитора (рис. 26).
В 1916 г. Дж.Нельсон и Е.Гриффин показали, что сахароза,
сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность, но
лишь в 1953 г. Н.Грубхофер и Д.Шлейт впервые осуществили ковалентные
связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с
нерастворимым носителем. В 1959 г. был применен принципиально новый
методический прием - ковалентное связывание. С этого времени и ведется
целенаправленная разработка гетерогенных катализаторов на основе
ферментов.

121
 Рисунок 26 - Схема использования иммобилизованных клеток для получения
продукта

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был

узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие
«иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл,
чем связывание на нерастворимом носителе, а именно - полное или
частичное ограничение свободы движения белковых молекул.
Иммобилизованные ферменты имеют существенные преимущества.
Так, например, они легко отделимы от реакционной среды. Это дает
возможность остановить реакцию в любой момент, получить продукт,
незагрязненный катализатором, и использовать ферментный препарат
многократно. Иммобилизованные ферменты технологичны, что
определяется возможностью вести биотехнологический процесс
непрерывно и регулировать скорость катализируемой реакции и выход
продукта путем изменения скорости протока.
Для иммобилизации используется широкий круг носителей
органической и неорганической природы. Носители могут иметь
зернистую структуру, могут быть выполнены в виде волокон, пленок,
полых трубок, мембран и т.д.
В зависимости от природы носители делятся на органические и
неорганические материалы.
Органические полимерные носители. Существующие
органические полимерные носители можно разделить на два класса:
природные и синтетические полимерные носители. Среди природных
полимеров выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а
среди синтетических - полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.

122
 К преимуществам природных носителей следует отнести их
доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам -
биодеградируемость и достаточно высокую стоимость.
Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют
целлюлозу, декстран, агарозу (агар) и их производные. Для придания
химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана
поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры
довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической
модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид,
глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель - губчатый
крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам.
Из природных аминосахаридов в качестве носителей для
иммобилизации применяют хитин, который в значительных количествах
накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки
крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную
пористую структуру.
Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли
структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт
переработки коллагена - желатина. Эти белки широко распространены в
природе, поэтому доступны в значительных количествах, дешевы и имеют
большое число функциональных групп для связывания фермента. Белки
способны к биодеградации, что очень важно при конструировании
иммобилизованных ферментов для медицинских целей. К недостаткам
белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую
иммуногенность.
Синтетические полимерные носители. К ним относятся полимеры
на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; по-
лиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтетических
полимерных носителей обладают механической прочностью, а при
образовании обеспечивают возможность варьирования в широких
пределах величины пор, введения различных функциональных групп.
Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных
физических формах (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны
для разных способов иммобилизации ферментов.
Носители неорганической природы. В качестве носителей наи-
более часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой
сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно
подвергать химической модификации, для чего носители покрывают
пленкой оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают
органическими полимерами. Основное преимущество неорганических
носителей - легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам
неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с
любой степенью пористости.

123
 Таким образом, к настоящему времени создано огромное число
разнообразных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каж-
дого индивидуального фермента, используемого в конкретном тех-
нологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные варианты,
как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

Методы иммобилизации ферментов

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации

ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и
носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием
ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации)
(рис.27). Каждый из этих методов осуществляется разными способами.

Рисунок 27 - Методы иммобилизации ферментов (ф-молекула фермента)

Физические методы иммобилизации ферментов реализуются

посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, путем
включения энзимов в поры поперечно сшитого геля, в полупроницаемые
структуры или двухфазные системы.
Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При
адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на
поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных,
дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была
первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нельсон, Э.Гриффин,
1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко
распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в
промышленности.
В литературе описано получение адсорбционным способом более 70
иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких
носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа,
различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические
124
полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние
применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка
на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров
сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на
нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается
при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим
способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием
колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком,
например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Актив-
ность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется
практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1
г носителя.
К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую
прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий
иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и
загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность
связывания фермента с носителем может предварительная его
модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными
агентами - полимерами, белками, гидрофобными соединениями,
монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается
молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его
активности.
Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Способ
иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру
полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и
уникальности. Метод применим для иммобилизации не только
индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже
интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя
способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а
затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает
пространственная структура полимерного геля с включенными в его
ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор
уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное
состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поли-
винилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго - гели
крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.
Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное
распределение энзима в объеме носителя. Большинство гелевых матриц
обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической
стойкостью и обеспечивает возможность многократного использования
фермента, включенного в его структуру. Однако метод непригоден для
иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые
субстраты.

125
 Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры.
Сущность этого способа иммобилизации заключается в отделении водного
раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью
полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные
молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы
фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых
интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в
липосомы.
Первый способ предложен Т.Чангом в 1964 г. и состоит в том, что
водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы,
стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из
механизмов возникновения мембраны на поверхности водных
микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной
поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной,
а другое — в органической фазе.
Примером может служить образование на поверхности раздела фаз
микрокапсулы, получаемой путем поликонденсации гексаметилендиамина
-1,6 (водная фаза) и галогенангидрида себациновой кислоты (органическая
фаза):
-HCl
H2N-(CH2)6-NH2 + СlOС-(СН2)8-СОСl → HN-(CH2)6-NH - СО-
(СН2)8-СО-

Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни мик-

рометров, а толщина мембраны - сотые доли микрометра.
Достоинства метода микрокапсулирования - простота, уни-
версальность, возможность многократного использования нативного
фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего
субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования).
Особенно существенно, что методом микрокапсулирования могут быть
иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и
мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток.
К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных
ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.
Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно
считать включение водных растворов ферментов в липосомы,
представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных
липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для
иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г.
Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина)
упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку
липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В
процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных
структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.
126
 Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру
липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях,
ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе
липидного матрикса биологических мембран, поэтому изучение липосом
имеет большое значение для понимания закономерностей процессов
жизнедеятельности в клетке.
Другие приемы иммобилизации ферментов, основанные на
физических методах, менее распространены по сравнению с описанными
выше.
Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация
ферментов путем образования новых ковалентных связей между
ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения
промышленных биокатализаторов.
В отличие от физических методов этот способ иммобилизации
обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто
сопровождается стабилизацией молекулы энзима.
Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка,
спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и
полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид,
глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения
галактозилтрансферазы из микроокружения носителя между ним и
ферментом вставляют последовательность: -СН2-NH-(СН2)5-СО-.
В этом случае структура иммобилизованного фермента включает
носитель, вставку и фермент, соединенные между собой ковалентными
связями (рис. 28).

Рисунок 28 - Схема иммобилизации фермента химическим методом

Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента

участвовали функциональные группы, не существенные для его
каталитической функции. Так, гликопротеины обычно присоединяют к
носителю через углеводную, а не через белковую часть молекулы
фермента.
Число методических приемов, разработанных для осуществления
ковалентной иммобилизации ферментов, исключительно велико. Все
методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от
природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с
молекулой фермента.

127
 Крупномасштабные производства с использованием
иммобилизованных ферментов

Иммобилизованные ферменты применяются в различных сферах –

органический синтез, преобразование энергии, ферментная аналитика,
получение целевых продуктов, конверсия растительного сырья, создание
лекарственных препаратов.
1. Получение глюкозо-фруктозных сиропов из крахмала. Здесь
используется 3 фермента: амилаза – для разжижения крахмала,
глюкоамилаза – для осахаривания крахмала (трансформации в глюкозу) и
глюкозоизомераза – для изомерзации глюкозы в более сладкий сахар
фруктозу. Первая промышленная установка для превращения глюкозы во
фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы была запущена
лишь в 1973 г. (компания «Клинтон Корн», США).
2. Получение оптически активных L-аминокислот из их
рацемических смесей.

Разделение рацемических смесей на составляющие их оптические

изомеры (представляющее труднейшую задачу) явилось первым
промышленным процессом с использованием иммобилизованных
ферментов. Этот процесс был осуществлен в Японии в 1969 г. (компания
«Танабе Сейяку») с помощью аминоацилазы, иммобилизованной на
ДЕАЕ-целлюлозе.
3. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония.
Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой
добавки (подсластитель и подкислитель).
Первая в мире промышленная установка для синтеза L-
аспарагиновой кислоты из фумарата аммония была запущена в 1973 г. в
Японии (фирма «Танабе Сейяку») на основе иммобилизованных клеткок Е.
coli, содержащие аспартат-аммиаклиазу в полиакриламидном геле.
Полиакриламидный гель с иммобилизованными микробными клетками
формуют в виде кубиков размером 2 - 3 мм, которыми заполняют колонку
объемом 1 м3. Через колонку пропускают раствор фумарата аммония. При
подкислении выходящего из колонки элюата до рН 2,8 и охлаждении до
150С из него выкристаллизовывается аспарагиновая кислота в виде
препарата 100 %-ой чистоты. Процесс получения аспартата
осуществляется в непрерывном режиме. Производительность процесса -
1700 кг чистой аспарагиновой кислоты в сутки на реактор.

128
Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраняют активность
фермента на 80 % в течение 120 дней и на 50 % в течение 600 дней работы
реактора, в то время как свободные клетки — всего на протяжении 10 дней
с уровнем активности 25 % от исходной. В Армении был налажен
промышленный процесс получения аспартата особой степени чистоты с
использованием иммобилизованной аспартат-аммиак-лиазы на базе
научных разработок химфака МГУ им. М. В.Ломоносова (1974).
4. Синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты. основной
промышленный способ получения L-аланина – ферментативное
декарбоксилирование L-аспарагиновой кислоты:
Аспартат--де-
карбоксилаза
HOOC CH2 CH COOH H3C CH COOH CO2
NH2 NH2

Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется

аспартат-β-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas
dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), иммобилизованных
в полиакриламидном геле, каррагинане или полиуретане. Биореакторы
японской фирмы «Танабе Сейяку», производит этим способом 10 тонн
аланина в месяц. В качестве сырья используют фумарат аммония.
Процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в
двух последовательно расположенных реакционных колонках. На первом
этапе фумарат аммония превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая
без выделения из реакционной среды на втором этапе претерпевает β-
декарбоксилирование с образованием аланина.
5. Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты.
6. Получение безлактозного молока.
7. Получение сахаров из молочной сыворотки.
8. Получение 6-аминопенициллановой кислоты. Ключевым
полупродуктом для получения полусинтетических антибиотиков
пенициллинового ряда является 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК)

O
H2C C HN S CH3 +H2O , пенициллин-
CH3 ацилаза
N
_
O COOH CH2 COOH

Бензилпенициллин

H2N S CH3

CH3
N
O COOH

6 - Аминопенициллановая кислота (6-АПК)

129
 Со второй половины 70-х годов XX в. вся 6-АПК, выпускаемая в
России, и значительная часть 6-АПК, получаемая в Италии производятся с
помощью иммобилизованных ферментов. На итальянских фирмах
применяют фермент, иммобилизованный путем включения клеток Е. coli в
волокна триацетата целлюлозы, на российских предприятиях используют
бактериальные клетки, им мобилизованные в полиакриламидном геле.
Переход к технологии, в которой применяются иммобилизованные
бактериальные клетки, обеспечивает высокий выход 6-АПК,
составляющий 80-85%.
Внедрение в промышленность биокаталитической технологии
производства 6-АПК привело к существенному увеличению выпуска
полусинтетических пенициллинов и снижению их себестоимости.

Контрольные вопросы:

1. Химическая природа ферментов.

2. Что означают понятия активный и аллостерический центры
ферментов?
3. Перечислите основные свойства ферментов.
4. Объясните смысл основных параметров кинетики ферментативных
реакций.
5. Перечислите классы ферментов и катализируемые ими реакции.
Приведите примеры химических реакций.
6. Приведите примеры использования ферментов в различных
областях биотехнологии.
7. Объясните смысл термина «иммобилизованные ферменты».
8. Укажите преимущества использования ферментов в
иммобилизованном состоянии.
9. Опишите основные методы получения иммобилизованных
ферментов.
10. Приведите примеры крупномасштабных технологических
процессов с использованием ферментных катализаторов.
11. Охарактеризуйте основные направления использования
ферментов в кожевенно-меховом производстве.

ТЕМА 13
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Предмет и методы клеточной инженерии

Клеточная инженерия - это конструирование специальными

методами клеток нового типа.
Клеточная инженерия включает реконструкцию жизнеспособной
клетки из отдельных фрагментов разных клеток, объединение целых
130
клеток, принадлежавших различным видам (и даже относящихся к разным
царствам — растениям и животным), с образованием клетки, несущей
генетический материал обеих клеток и другие операции.
Клеточная инженерия используется для решения теоретических
проблем в биотехнологии, для создания новых форм растений,
обладающих полезными признаками и одновременно устойчивых к
болезням и т. п.
Основным объектом и средством исследования в клеточной
инженерии является клеточная культура. Как и любой другой метод, метод
клеточной культуры обладает рядом преимуществ и недостатков.
Базовым методом клеточной инженерии служит слияние
(гибридизация) клеток микроорганизмов или соматических клеток
животных и растений. Слияние клеток может быть проведено с
использованием факторов слияния различного происхождения:
физического (переменное электрическое или магнитное поле),
химического (катионы, полиэтиленгликоль и др.), биологического
(вирусы).
Этапы метода слияния протопластов:
Протопластирование (сферопластирование для бактерий) – удаление
клеточной стенки;
Фузия протопластов;
Ломка и рекомбинация хромосом с образованием диплоидов;
Образование и отбор гаплоидов – клеток способных к размножению;
Регенерация протопластов и формирование нормальных гибридных
клеток;
Учет фенотипических признаков гибридных клеток;
Создания условий, в которых выживают только гибриды,
объединившие геномы родительских клеток.
Для разрушения клеточной стенки у бактерий и актиномицетов –
используют фермент лизоцим, который разрушает пептидогликан, у
грибов – зимолаза виноградной улитки, растительных клеток – целлюлаза,
пектиназа. Гибриды, полученные в результате слияния протопластов,
отличаются высокой скоростью роста и большим выходом целевого
продукта.
Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей
среды макромолекулы и частицы. Согласно концепции Коккинга,
поглощение имеет место вследствие эндоцитоза, который может быть
усилен внешними воздействиями. Другие авторы акцентируют внимание
на возможности пассивного проникновения через разрывы плазмалеммы,
которые всегда имеют место на поверхности свежеизолированных
протопластов.
Также одним из методов клеточной инженерии является
реконструкция жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных
клеток, объединение целых клеток, принадлежавших различным видам (и
131
даже относящихся к разным царствам — растениям и животным), с
образованием клетки, несущей генетический материал обеих клеток и
другие операции.
Разработано несколько способов индукции поглощения органелл
протопластами, в том числе:
- обработка органелл модификаторами мембран (лизоцим, NaNO3), в
сочетании с центрифугированием;
- агглютинация смеси протопластов и изолированных органелл ПЭГ
с одновременным центрифугированием.
Клеточная инженерия расширяет возможности получения новых
ценных штаммов микроорганизмов, сортов культурных растений и пород
сельскохозяйственных животных, для создания которых ранее
использовались методы классической селекции, требующие десятилетий.
За последнее время создан ряд межвидовых и межродовых гибридов
табака, картофеля, томата и других растений.
Клеточная инженерия используется для решения теоретических
проблем в биотехнологии, для создания новых форм растений,
обладающих полезными признаками и одновременно устойчивых к
болезням и т. п.
Основными направлениями использования клеточной
культуры являются генетика, иммунология, биохимия,
молекулярная биология, биотехнология и генная инженерия,
вирусология и трансформация клеток, фармакология и токсикология,
определение механизмов роста и дифференцировки, и многое-многое
другое.
Культуры животных клеток

В зависимости от поставленных перед исследователем целей и

задач, используется два направления в культивировании животных
клеток: культура клеток и культура органов и тканей. Для ведения
культуры клеток используются различные источники. Таковыми могут
являться взрослые или эмбриональные ткани, а также нормальные и
опухолевые. Каждая такая культура клеток будет характеризоваться
рядом морфологических, биохимических и физиологических
особенностей. Свежевыделенные культуры носят название первичных
культур до начала их субкультивирования или пассивирования. Клетки
первичных культур будут обладать рядом особенностей, таких как низкая
пролиферативная активность и гетерогенность клеточного состава. После
проведения нескольких пассажей (пересевов) таких клеточных культур
удаѐтся получить более однородную популяцию клеток, теряется ряд
специализированных клеток и, в результате, первичная культура
превращается в постоянную клеточную линию. Таким образом,
пассивирование клеточной культуры является важным методом для

132
продления жизни клеток и их конечной трансформации в постоянную
клеточную культуру.
Особенности в биологии культивируемых клеток in vitro заключается
в следующем:
1. Клетки животных и, в особенности, млекопитающих способны
расти в состоянии клеточной культуры лишь прикреплѐнными к какому-
либо субстрату. В качестве субстрата можно использовать другие клетки,
коллаген, желатин (денатурированный коллаген), стекло или пластик. В
случае отделения культуральных клеток от субстрата, происходит
остановка роста и размножения, быстрая дегенерация такой суспензионной
культуры.
2. Клетки растущей клеточной культуры находятся в клеточном
цикле деления и делятся с периодичностью примерно 1 раз в 24 часа.
3. Клетки в своем жизненном цикле проходят ряд этапов (рис.
29):

Рисунок 29 - Клеточный цикл

Клеточные культуры находятся под контролем своего роста, что

связано с постоянным действием лимитирующих факторов. Для
стимуляции первичной культуры, прежде чем клетки возобновят движение
по циклу к фазе деления, следует устранить ограничение роста. В этом
случае клетки возвращаются в фазу G1 клеточного цикла, происходит
синтез ДНК, после чего клетка делится (рис. 30).

Рисунок 30- Цитокинез на завершающей стадии в животной клетке

133
 4. Поддержание постоянной плотности популяции клеточной
культуры в результате согласования скорости деления. В случае
эпителиальных клеток или фибробластов, помещѐнных в культуральный
флакон, будет происходить «приклеивание» к поверхности флакона,
«распластывание» клеток и их деление до образования сплошного
монослоя из клеток, соприкасающихся друг с другом.
5. Клетки, делящиеся в культуре, претерпевают в процессе своего
роста так называемое контактное торможение. При достижении
клетками плотного монослоя, при котором клетки плотно прилегают друг
к другу, происходит остановка деления клеток. Причем даже нормальные
клетки могут оставаться в таком состоянии некоторое время. Явление
контактного размножения тесным образом связано с функционированием
адгезивных контактов. Адгезивные контакты обеспечиваются вследствие
образования комплексов рецепторов на поверхности мембраны клеток. В
мембрану клеток встроены рецепторы адгезии, в основе которых лежит
комплекс гликопротеинов. Главным гликопротеидом клеточной
поверхности является фибронектин. Сig (Cold insoluble globulin-
нерастворимый на холоде глобулин) и SP (Cell surface protein - клеточный
поверхностный белок). Фибронектин характеризуется молекулярной
массой 220 000, но может существовать также в форме связанных
дисульфидными связями димеров и более высоких олигомеров. Молекулы
фибронектина весьма гибки и состоят из нескольких, лабильно связанных
доменов. На клеточной поверхности фибронектин образует относительно
неподвижную фибриллярную сеть, связанную через мембрану клетки с
элементами цитоскелета. Фибронектин отсутствует на поверхности
митотических клеток, и его количество резко увеличивается при
достижении нормальными клетками полного монослоя, или при остановке
клеточной пролиферации при низкой концентрации сыворотки.
При соприкосновении гликопротеиновых комплексов соседних
клеток происходит формирование так называемых бляшек адгезии.
Адгезивные бляшки начинают выделять разнообразные белки, основу
которых составляют белки цитоскелета.
Белки цитоскелета, встраиваясь в мембрану, уменьшают еѐ
«текучесть», клетки не округляются. Таким образом, при контакте клетки с
соседней клеткой происходит прекращение движения в этом направлении,
так называемое контактное ингибирование. При достижении
монослойности, клетки культуры прекращают своѐ движение. Клетки
становятся более скученными и менее распластанными, что приводит к
уменьшению доли клеточной поверхности, обращѐнной к среде. Далее
клетки перестают делиться, происходит торможение пролиферации.
Если монослой клеток поранить иглой до образования свободной зоны от
клеток, то в клетках, примыкающих к краю такой "раны", происходит
стимуляция синтеза ДНК и делений. В результате клетки быстро занимают
поверхность "раны" в монослое (рис. 31).
134
 Рисунок 31 - Пролиферация клеток, после нанесения «раны» клеточному
слою

6. Плотность клеточной популяции регулируется концентрацией

фактора роста. Обычно фактор роста присутствует в среде в очень
низкой концентрации, порядка 10-9 – 10-10 М. Каждая клетка имеет на своей
поверхности примерно 80-150 рецепторов для фактора роста, причём
каждый рецептор обладает очень высоким сродством к нему. После
соединения «фактор роста – рецептор», образовавшийся комплекс
поглощается клеткой путем эндоцитоза и расщепляется. Таким образом,
между соседними клетками существует жёсткая конкуренция за факторы
роста, в результате чего предотвращается рост клеточной популяции выше
некоторого уровня её плотности.

Питательные среды и условия культивирования

Для роста и размножения культуры клеток животных используют
питательные средой строго определённого состава. Основу питательной
среды составляет солевой раствор, минеральные компоненты которого
подобраны таким образом, что поддерживается постоянный
кислотнощелочной баланс, постоянство рН и определённая буферная
ёмкость. К минеральной основе добавляются различные компоненты
биологического и фармакологического происхождения – плазма или
сыворотка крови, тканевые экстракты, антибиотики, ростовые факторы и
др.
Для приготовления питательных сред обычно используются солевые
растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, используются также для орошения
и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных
линий и других манипуляциях с культурами клеток.
Стандартные среды для ведения культур животных клеток – Игла
MEM (minimal essential medium) и BME (basal medium, Eagle) (рис. 32).
Чаще используется МЕМ. Она содержит минеральные вещества,
аминокислоты (13 незаменимых), 6 водорастворимых витаминов,
холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата.
МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют

135
биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы. Основа раствор
Эрла.

Рисунок 32 – Питательные среды для культуры клеток животных

Культуры клеток человека

В настоящее время могут быть культивированы фактически любые
культуры клеток человека. Благодаря культивированию клеток человека
раскрываются широкие перспективы в оценке морфологических и
биохимических особенностей различных нормальных и опухолевых тканей
человека. Становится возможной оценка влияния и эффекта тестируемого
фармакологического продукта. Возможны исследования в области
геномики, протеомики и транскриптомики, с использованием культур
человеческих клеток. Спектр клеток, которые в настоящее время можно
культивировать, достаточно широк: фибробласты (элементы
соединительной ткани), клетки кости и хряща, мышечные клетки,
эпителиальные клетки, нервные клетки - (нейроны, глиальные клетки),
эндокринные клетки, опухолевые клетки.
Наиболее распространены в практической клеточной инженерии
человека культуры фибробластов.
В 1999 году журнал «Science» признал открытие эмбриональных
стволовых клеток (рис. 33) третьим по значимости событием в биологии
после расшифровки двойной спирали ДНК и программы «Геном
человека».
Стволовые клетки - недифференцированные клетки организма,
способные делиться неопределенный период времени, равный жизни
организма и, в подходящих условиях, дифференцироваться в любые
клеточные типы тканей. Стволовые клетки способны асимметрично
делиться, из-за чего при делении образуется клетка, подобная материнской
(самовоспроизведение), а также новая клетка,которая способна
дифференцироваться. В 1908 году термин «стволовая клетка» был введён
136
в научный обиход русским гистологом Александром Максимовым (1874—
1928) на съезде гематологического общества в Берлине. Он постулировал
существование стволовой кроветворной клетки. В 1981 году американский
биолог Мартин Эванс впервые выделил недифференцированные
плюрипотентные линии стволовых клеток — бластоцисты мыши. В 1998
году Д. Томпсон и Д. Герхарт выявили бессмертную линию
эмбриональных стволовых клеток (ЭСК).

Рисунок 33 - Фотографии человеческих эмбриональных стволовых клеток

Корнем иерархии стволовых клеток является тотипотентная

зигота. Первые несколько делений зиготы сохраняют тотипотентность и
при потере целостности зародыша это может приводить к появлению
монозиготных близнецов. К ветвям иерархии относятся плюрипотентные
(омнипотентные) и мультипотентные (бластные) стволовые клетки.
Конечными элементами иерархии являются зрелые
унипотентные клетки тканей организма. Нишами стволовых клеток
называются места в ткани, где постоянно залегают стволовые клетки,
делящиеся по мере надобности для дальнейшей дифференциации.
Стволовые клетки размножаются путём деления, как и все остальные
клетки. Отличие стволовых клеток состоит в том, что они могут делиться
неограниченно, а зрелые клетки обычно имеют ограниченное количество
циклов деления.
В организме имеется ряд популяций стволовых клеток различной
степени зрелости. В нормальном состоянии, чем более зрелой является
клетка, тем меньше вероятность того, что она сможет превратиться в
клетку другого типа. Но, всё же, это возможно благодаря феномену
трансдифференцировки клеток. В различных органах и тканях взрослого
организма существуют частично созревшие стволовые клетки, готовые
быстро дозреть и превратиться в клетки нужного типа. Они называются
бластными клетками. Например, частично созревшие клетки мозга —
это нейробласты, кости — остеобласты и так далее. Дифференцировку
могут запускать как внутренние причины, так и внешние.

137
 Стволовые клетки таят в себе невиданные возможности: от
регенерации поврежденных органов и тканей до лечения заболеваний, не
поддающихся лекарственной терапии.
Наиболее универсальны эмбриональные стволовые (ES - embrionic
stem) клетки (рис. 34) .

Рисунок 34 - Эмбриональные СК. Получение: 1. из бластоцисты отбирают

внутреннюю клеточную массу; 2.помещают ее в чашку Петри с клетками-
кормилицами; 3.культивируют несколько дней в чашке до образования колоний
эмбриональных стволовых клеток.

Они были взяты на самой ранней стадии развития плода из той его
части, которая в норме дает начало трем разным слоям (зародышевым
листкам) более позднего эмбриона и, в конце концов, - всем органам и
тканям. Большинство ES-клеточных линий человека, находящихся
сегодня в распоряжении ученых, получены от необычных эмбрионов - они
были созданы в результате искусственного оплодотворения in vitro.
Однако, не все они идентичны. Для проверки плюрипотентности
предложено два теста, давно апробированных на ES-клетках животных.
138
Первый тест основан на введении предполагаемых ES-клеток в организм
какого-нибудь животного. Если у того образуется тератома (опухоль,
содержащая клетки всех трех зародышевых листков), то
плюрипотентность можно считать доказанной. Второй тест заключается в
маркировке клеток-кандидатов и введении их в развивающийся эмбрион.
Если клетки оказываются во всех тканях родившегося детеныша, то они
скорее всего плюрипотентны. Однако применение подобной методики
может привести к появлению животного-химеры, во всех тканях которого
присутствует человеческая ДНК, что с этической точки зрения
неприемлемо.
Чтобы получить линию ES-клеток, из бластоцисты отбирают
внутреннюю клеточную массу и помещают ее в чашку Петри с клетками-
кормилицами. Через несколько дней в чашке образуется колония клеток,
которые можно отнести к эмбриональным стволовым, если они
соответствуют двум условиям: дают положительный результат на
стандартные тесты и обладают способностью к самоподдержанию.

Характеристика эмбриональных стволовых клеток:

1. Тотипотентность — способность образовывать любую из 350

тканей организма.
2. Хоуминг — способность cтволовых клеток, при введении их в
организм, находить зону повреждения и фиксироваться там, исполняя
утраченную функцию.
3. Теломеразная активность.
4. Наличие в цитоплазме мРНК всех 3 тысяч генов, которые
отвечают за раннее развитие зародыша.
Хранилищем стволовых клеток организма служит костный мозг, где
стволовые клетки находятся с своеобразной нише в окружении
стромальных клеток, которые участвуют в передаче регуляторных
сигналов.

Метод наработки моноклональных антител (МКА) в культуре

клеток вне организма

Процесс получения моноклональных антител был изобретён Жоржем

Кёлером, Сезаром Мильштейном и Ниелсом К. Джерне в 1975 году. Они
разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом, от
слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с
культивируемыми в питательной среде клетками миеломных
штаммов. Слияние лимфоцитов с миеломными клетками осуществляется с
помощью полиэтиленгликоля. Слившиеся гибридомные клетки получают
от лимфоцита способность синтезировать определенное антитело и
выживать в среде с ГАТ. От миеломного партнера они
139
приобретают свойство бесконечно размножаться in vitro.
Накопившийся гибридомный клон может быть размножен.
Синтезируемые им моноклональные антитела можно получить в
неограниченном количестве. По всем параметрам антитела,
вырабатываемые одним клоном, идентичны по классу молекулы, ее типу,
специфичности и авидности. Они взаимодействуют только с одним
антигеном, одной антигенной детерминантой.
Таким образом, полученный в пробирке, флаконе или клеточном
реакторе препарат может служить идеальным по специфичности реагентом
на ту или иную органическую субстанцию и идеальным диагностическим
или лечебным средством. Набор специфических реагентов, который может
быть получен, неограничен. Это могут быть антитела против белков крови
и тканей, против специфических антигенов, органов, раковых и
нормальных клеток, против вирусов, бактерий, паразитов, против, ряда
химических соединений и т. д.
В настоящее время получение МКА является одной из ведущих
клеточной инженерии. Количество созданных гибридом превышает тысячи
и постоянно растет.

Механизм слияния клеток. Получение гибридом

Процедура получения гибридом, продуцирующих антитела

(моноклональные антитела) состоит из следующих основных этапов:
1. Иммунизация животных; 2. Подготовка клеток к слиянию; 3.
Слияние клеток; 4. Отбор продуцирующих специфические антитела
клонов; 5. Клонирование и реклонирование; 5. Выявление антител,
синтезируемых гибридными клетками; 6. Массовая наработка
моноклональных антител. 7. Получение культуральной жидкости или
асцита, содержащих антитела; 8. Выделение и очистка антител.
Ниже представлен рисунок с отображением основных этапов
получения гибридом, продуцирующих антитела (рис. 35).

140
 Рисунок 35 - Схема основных этапов получения гибридом

Области практического использования моноклональных

антител
Благодаря своим уникальным свойствам моноклональные антитела
успешно используются для решения многих актуальных задач биологии и
медицины, например, создание на их основе диагностических средств,
разработка препаратов для лечения злокачественных новообразований,
вирусных и аутоиммунных заболеваний (рис. 36).

Рисунок 36 - Практическое использование моноклональных антител

141
 Моноклональные антитела широко применяются
научных исследованиях, в частности, в высокочувствительном методе
иммуноблоттинга (рис. 37-38).

Рисунок 37 - Иммуноблоттинг с использованием МКА

Рисунок 38 - Фотография SDS-полиакриламидного геля

иммуноблотта с использованием МКА

142
 Моноклональные антитела широко применяются в диагностике
инфекций, определения гормонов и других соединений (рис. 39).

Рисунок 39- Метод иммуноанализа антигенов с использованием МКА

Методы получения клонированных животных

1. Пересадка ядра соматической клетки в яйцеклетку, из которой
удалено собственное ядро.
2. Разделение эмбрионов крупного рогатого скота в возрасте до 7-8
дней, не имеющих дифференцированных клеток, на части (2-4) с
последующей пересадкой реципиенту.
Работа по клонированию ведется по трем направлениям:
1.Пересадка ядер из соматических клеток в энуклеированную
яйцеклетку.
2. Получение гомозиготных диплоидных потомков.
3. Создание партеногенетических животных.
В 1952 году Р. Бриггс и Т. Кинг разработали метод пересадки ядер
соматических клеток зародышей в энуклеированные яйцеклетки лягушек.
Усовершенствовали метод трансплантации ядер.
Дж. Гердон в 1962 году усовершенствовал технику пересадки ядер
(рис. 40). Он использовал в качестве донора ядер специализировавшиеся
клетки эпителия кишечника головастика. Выживало не более 2%
143
клонированного потомства. 1970-е гг. разработал метод серийных
пересадок.

Рисунок 40 - Эксперимент Гердона

Трансплантация ядер является центральной методикой, от которой

зависит успех в проведении клонирования. В 1985 г. Б. В. Конюховым и Е.
С. Платоновым был разработан метод переноса ядер путём
микроманипуляции.
Он состоит из двух этапов: сначала тонкой микропипеткой
прокалывают зоны пеллюцида и плазматической мембраны, извлекают
пронуклеусы, а затем другой пипеткой, большего диаметра (12 мкм), в то
же отверстие вводят диплоидное ядро донора. В этом случае меньше
травмируется цитоплазма зиготы и транспортируемое ядро донора.
Трансплантация ядер может осуществляться и с использованием
цитохалазинов (веществ, синтезируемых грибами).
Цитохалазин В разрушает структуру микрофиламентов и
способствует уникальному расположению ядра. Ядро остается
соединенным с клеткой тоненьким стебельком цитоплазмы. При
центрифугировании этот мостик разрывается, образуются безъядерные
клетки - цитопласты и кариопласты, представляющие собой ядра,
144
окруженные тонким слоем цитоплазмы и цитоплазматической мембраной.
Цитопласты отделяют от интактных клеток в градиенте плотности. Они
сохраняют способность прикрепляться к поверхности культурального
сосуда и могут быть использованы для слияния с кариопластами других
клеток с целью получения жизнеспособной клетки. Методы выделения
кариопластов несколько сложнее и включают в себя ряд операции по
центрифугированию, разделению в градиенте плотности и т.д. В
некоторых случаях к смеси клеток и кариопластов добавляют частицы
тантала диаметром 1 – 3 мкм. Они проникают в клетки и никогда в
кариопласт, поэтому более тяжелые клетки осаждаются быстрее
кариопластов.
Цитопласты содержат все виды органелл, присущие нормальной
клетке, сохраняют способность прикрепляться к субстрату, образовывать
складчатую мембрану, передвигаться, осуществлять пиноцитоз.
Кариопласты окружены тонким слоем цитоплазмы (около 10% от
всей клеточной цитоплазмы), содержат компактный эндоплазматический
ретикулум, несколько митохондрий и рибосом. У некоторых клеточных
линий 1/10 кариопластов способна восстановить весь утраченный объем
цитоплазмы и восстановиться в жизнеспособные клетки.
Для реконструкции клеток суспензию кариопластов в солевом
буфере добавляют к монослою культуры цитопластов из пропорции 100
кариопластов на 1 цитопласт. Цитопласты должны быть уже
покрыты инактивированными вирусными частицами. Инкубируют
о
при температуре 4 С 45 минут, а затем еще 45 минут при температуре
37оС. Отмывают раствором Эрла для удаления не слившихся
кариопластов.
Методы создания химер

Химера – сборное, составное животное, состоящее из генетически

разнородных клеточных популяций, происходящих более чем от одной
оплодотворенной яйцеклетки.
Химеры – гибридные животные, у потомков происходит
расщепление, но отсутствует перекомбинация генов исходных пород или
видов, поэтому химеры сохраняют признаки и свойства исходных форм
лишь в 1 поколении.
С генетической точки зрения химеры – это продукт объединения 2 и
более ранних эмбрионов, вследствие чего они обладают сложным
комбинированным генотипом.
Для создания химерных животных было предложено два метода:
агрегационный и инъекционный.
Агрегационный метод был разработан Тарковским в Варшаве и
Минц в Филадельфии (1961-1962 гг.). Принцип метода заключается в
следующем: из матки беременных самок животного извлекают зародыши,
достигшие стадии 8 бластомеров. Бластомеры, полученные от двух
145
животных с различными генотипами помещают в условия,
способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша.
Такие составные зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты,
после чего их вводят в матку приемной матери, у которой предварительно
вызывают ложную беременность путем введения соответствующих
гормонов. В результате получаются аллофенные животные.
Агрегационные химеры можно получать не только между двумя
эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров
или отдельными частями эмбрионов. Масса химерных эмбрионов не
больше обычной и подвержена действию механизмов эмбриональной
регуляции. Преимущество метода состоит в том, что он не требует
вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко
используется в эмбриогенетике.
Инъекционный метод был разработан Р.Гарднером в 1968 г.
Методика его заключается в следующем: бластоцисту
фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции
клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель
эмбриона - рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только
внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более
дифференцированные клетки. Благодаря этому методу возможно
получение межвидовых химер.
Химерные животные не передают потомкам генетическую
мозаичность. У них происходит расщепление, как у гетерозигот, поэтому
ценные генетические комбинации нарушаются. Но на протяжении первого
поколения хозяйственно ценные признаки поддерживаются.

Биоэтика клеточной инженерии животных

Биоэтика – комплексное понятие, которое в широком смысле
относится к исследованию социальных, экологических, медицинских и
социально-правовых проблем, касающихся не только человека, но и
любых живых организмов, включенных в экосистемы, окружающие
человека. Первоначально биоэтика представляла собой попытку
выработать стандарты поведения медицинских профессионалов и юристов
в спорных вопросах современной медицины. Со временем содержание
нового термина расширилось, и в настоящее время биоэтика – область
междисциплинарных исследований этических, философских и
антропологических проблем, возникающих в связи с прогрессом
биомедицинской науки и внедрением новейших технологий в практику
здравоохранения.
Основными проблемами биоэтики клеточной инженерии являются:
1. Новые репродуктивные технологии, в том числе искусственное
оплодотворение, оплодотворение «в пробирке» с последующей
имплантацией эмбриона в матку, суррогатное материнство.
2. Манипуляции со стволовыми клетками человека.
146
 3. Клонирование, как терапевтическое, так и репродуктивное.
4. Вопросы трансплантологии.

Культура клеток растений

Основным типом культивируемой растительной клетки является
каллусная ткань, которая в обычных условиях возникает при
повреждениях и функционирует непродолжительное время.
Каллус - ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации
клеток органов растений. Каллус получают из паренхимы корнеплодов,
стеблей, листьев, а также из гаплоидных тканей пыльников.
Культура каллусных тканей – выращивание в длительной
пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток
изолированных сегментов разных органов или самих органов растений.
Выделяют два типа культивируемых растительных клеток:
нормальные и опухолевые.
Опухолевые клетки морфологически мало отличаются от каллусных.
Физиологическим отличием является гормононезависимость опухолевых
клеток, поэтому опухолевые клетки делятся и растут на питательных
средах без добавок фитогормонов. Эти клетки не могут дать начало
нормально организованным структурам. Иногда они образуют тератому -
опухоль, состоящую из тканей нескольких типов, производных одного,
двух или трех зародышевых листков, присутствие которых не свойственно
тем органам и анатомическим областям организма, в которых формируется
опухоль.
Нормальные клетки в культуре могут существовать в двух видах: в
виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой
питательной среды в виде каллуса.
Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом
на полужидкой агаризованной среде (концентрация агар-агара 0.6-1%),
среде с добавлением других желирующих полимеров, на дисках из
полиуретана, на мостиках из фильтровальной бумаги, полупогруженных в
жидкую питательную среду (рис. 41).

Рисунок 41 - Каллусная культура

147
 Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом,
представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток,
не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы
может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. В зависимости от
происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают:
1. Рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на
отдельные клетки.
2. Средней плотности, с хорошо выраженными
меристематическими очагами.
3. Плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. Как
правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины,
каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.
В цикле выращивания каллусной ткани клетки после ряда
делений приступают к росту растяжением, дифференцируются как зрелая
каллусная ткань и деградируют. Для того, чтобы не произошло старения,
утраты способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания
каллусных клеток, первичный каллус переносят на свежую питательную
среду через 28 - 30 дней, то есть проводят пассирование или
субкультивирование каллусной ткани.
Неорганизованно растущая каллусная ткань содержит три типа
клеток мелкие, средние и крупные. При пассировании ткани на среду,
содержащую индукторы органогенеза, мелкие клетки приступают к
делению и формируют меристематические очаги. Деление клеток
меристематического очага приводит либо к формированию почек и
последующему развитию из них побегов (геммогенез), либо к ризогенезу.
Неморфогенные каллусы могут быть переведены в суспензионную
культуру для получения вторичных метаболитов.
Суспензионные культуры - отдельные клетки или
небольшие группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в
жидкой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их
аэрацию и перемешивание (рис. 42).
Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу
с жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на
качалке, имеющей скорость перемешивания 100 - 120 об/мин. При первом
переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и
крупные агрегаты, фильтруя через 1 - 2 слоя марли, нейлоновые сита,
шприц с соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной
культуры необходимо 2 - 3 г свежей массы каллусной культуры на 60 – 100
мл жидкой питательной среды. Для каждой линии культуры клеток
существует минимальный объем инокулята, при меньшем размере
которого культура не растет.

148
 Рисунок 42 - Культивирование суспензионной культуры растений в
лабораторных условиях

Суспензионные культуры широко используются в качестве

модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции
ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений,
цитологических исследований и др.
Культура протопластов растений. Протопласт (от греч. «protos»-
первый и «platos» - вылепленный, образованный) - клетка, лишенная
целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной,
способная осуществлять активный метаболизм, выполнять биосинтез и
трансформировать энергию (рис. 43).

Рисунок 43- Протопласты, выделенные из мезофилла листьев

Впервые термин использовал Д. Ханстеин в 1880 г. Впервые

протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал
149
механический способ. При этом способе добиваются плазмолиза
растительных тканей, например, с помощью 0,1% раствора сахарозы с
последующим разрезанием эпидермиса и освобождением протопластов в
окружающую питательную среду.
В 1960 г. Э.Кокинг получил клетки без клеточной стенки
(протопласты) из плодов и корней томата Он обработал кончики корней
томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости
плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил
изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.
Дж.Пауэр (1955) стимулировал слияние протопластов.
Для удаления клеточной стенки используют
ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы.
Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа
клеток.
Этапы выделения протопластов:
1. Обработка ферментами.
2. Выделение протопластов из клеточных стенок.
3. Отделение интактных протопластов от клеточных осколков.
Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных
культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда
клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее
жизнеспособны. Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что
и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из
осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника
углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования:
рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28оС, невысокая освещенность (не
более 2000 лк).

Применение протопластов
Протопласты являются уникальной моделью для изучения
фундаментальных физиологических проблем у растений. Они незаменимы
при изучении состава, структуры и функционирования плазмалеммы в
норме и при воздействии на нее гормонами, ингибиторами,
фитототоксинами, а также при взаимодействии самих протопластов в
популяции. Кроме того, протопласты могут использоваться для
определения состава и архитектоники первичной клеточной стенки и
изучения механизма ее репарации после разрушения.
Области применения изолированных протопластов:
1. Изучение химии и структуры клеточной стенки (и при
разрушении, и при синтезе «de novo»).
2. Изучение свойств плазмалеммы, трансмембранных перемещений.
3. «Мягкое» выделение органелл.

150
 4. Наблюдение за закономерностями дифференцировки клеток при
слиянии протопластов, отслеживание взаимодействия ядра и цитоплазмы в
полученной гибридной клетке, изучение соматических гибридов.
5. Введение чужих органелл.
6. Введение чужеродных генов в растительную клетку (трансгенез).

Слияние протопластов

Соматическая гибридизация - слиние соматических клеток, в

результате чего образуются гетерокарионы, содержащие ядра обоих
родительских типов. Образовавшиеся гетерокарионы дают начало двум
одноядерным гибридным клеткам. Такую искусственную гибридизацию
можно осуществлять между соматическими клетками, принадлежащими
далёким в систематическом отношении организмам.
Гетерокарион (от греч. «heteros» — другой и «karyon» — ядро) —
клетка с двумя или более ядрами, сформированная в результате
экспериментального слияния двух или более генетически различных
клеток.
Сущность соматической гибридизации заключается в том, что в
качестве родительских используют не половые клетки (гаметы), а клетки
тела (сомы) растения, из которых изолируют протопласты, а при
определенном экспериментальном воздействии протопласты заставляют
сливаться друг с другом. Из полученных гибридных клеток в дальнейшем
регенерируют целые растения-гибриды.

Преимущества соматической гибридизации:

Соматическая гибридизация позволяет:
1) скрещивать филогенетически отдаленные виды растений
(организмов), которые невозможно скрестить обычным половым путем;
2) получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор
одного из родителей наряду с несколькими хромосомами (или
несколькими генами, или только органеллами и цитоплазмой) другого;
3) создать систему гибридизации, включающую одновременное
слияние трех и более родительских клеток;
4) получать гибриды, представляющие собой в генетическом смысле
сумму идиотипов родителей;
5) получать растения, гетерозиготные по внеядерным генам;
6) преодолевать ограничения, налагаемые генеративными системами
несовместимости;
7) скрещивать формы, которые невозможно гибридизовать
половым путем из-за аномалий в морфогенезе или гаметогенезе родителей;
8) гибридизовать клетки, несущие различные эпигенетические
программы.

151
 Способы слияния протопластов
(соматическая или парасексуальная гибридизация)

Для индуцированного слияния изолированных протопластов с

целью гибридизации соматических клеток используют методы физические
и химические:
1) слияние с помощью электрического тока;
2) добавление в среду инкубирования протопластов веществ,
стимулирующих их слияние.
Метод электрослияния. Физический способ слияния протопластов
разработан Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 году.
Химический способ слияния протопластов. В качестве стимуляторов
слияния используют нитрат натрия; ПЭГ (полиэтиленгликоль) в среде с
высоким рН и высоким содержанием ионов кальция, эффект улучшается
добавлением 2% диметилсульфоксида (ДМСО).

Типы соматических гибридов

Соматическая гибридизация путем слияния целых клеток растений:

Ядерные геномы. При слиянии двух протопластов истинная гибридная
клетка (ядерный гибрид) образуется, если сливаются ядра.
Примеры: При слиянии протопластов из листьев растения дикого
типа одного вида петунии с альбиносными протопластами,
изолированными из суспензионных культур другого вида привело к
образованию цветущих растений с 28 хромосомами соматического гибрида
Petunia parodii (2n=14)X P. hybrida (2n=14) и Petunia parodii (2n=14)X P.
inflata (2n=14).
Цитоплазматические геномы. Цитоплазматический геном кодирует
ряд признаков - скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам,
абиотическим факторам и т. д. Наличие косегрегации генов (признаки,
контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно)
свидетельствует о физическом сцеплении генов.
Цибридизация, когда возникают гетерозиготы по внеядерным
(цитоплазматическим) генам, определяющим, например, устойчивость к
гербицидам или признак цитоплазматической мужской стерильности.
Образование новой цитоплазмы после слияния протопластов, способствует
получению гетерозигот по внеядерным генам. Гибрид, несущий гены ядра
только одного родителя наряду с цитоплазматическими (внеядерными)
генами от обоих либо от одного из родителей, называется
цитоплазматическим (цибрид). Гибриды, несущие альтернативные
цитоплазматические гены от обоих родителей цитогеты —
цитоплазматические гетерозиготы.

152
 Клеточная реконструкция

Клеточная реконструкция — это создание жизнеспособной клетки из

отдельных фрагментов разных клеток (ядра, цитоплазмы, митохондрий,
хлоропластов, хромосом).
Перенос генетического материала осуществляется с помощью
слияния цитопласта с кариопластом, с помощью микроклеток и целых
хромосом, введением органелл
Перенос генов путем слияния микроклеток растений.
Микроклетки содержат хромосомы, окруженные ядерной мембраной, и
тонкий слой цитоплазмы с плазматической мембраной. Перенос генов с
помощью микроклеток (микрокариопластов) позволяет передавать
клеткам-реципиентам небольшое число хромосом. Образование
микроклеток можно вызвать, обрабатывая клетки в течение нескольких
дней ингибитором митоза (колхицин). Микроклетки можно разделить по
размерам, что позволяет контролировать количество переносимого
генетического материала.
Перенос генов с изолированными хромосомами. Перенос генов с
изолированными хромосомами осуществляют с помощью изолированных
метафазных хромосом, индуцированное ПЭГ, в реципиентные
протопласты пшеницы, петрушки и кукурузы, которые захватывают их
путем фагоцитоза.
Конструирование клеток с использованием органелл.
Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей
среды макромолекулы и частицы. По-видимому, это происходит либо
вследствие естественного эндоцитоза, либо путем пассивного
проникновения через разрывы плазмалеммы, которые всегда имеются на
поверхности свежеизолированных протопластов.
В протопласты трансплантируют, такие органеллы как митохондрии
и хлоропласты. Выбор этих органелл объясняется их полуавтономностью,
то есть наличием собственной ДНК и способность делиться
самостоятельно, независимо от деления самой клетки. Кроме того, эти
органеллы контролируют важнейшие физиологические процессы
растительной клетки, такие как фотосинтез и дыхание. Например, перенос
хлоропластов может использоваться для выведения новых форм
хозяйственно важных сортов растений. Трансплантация
высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации
фотосинтеза и повышению продуктивности растения.

Методы переноса органелл в протопласты

Клеточные органеллы растений можно также переносить:

1. Посредством липосом. Широкий спектр одно- и
многоламелльных частиц, которые сливаются с мембранами протопластов,
153
получен с применением таких веществ, как фосфатидилсерин, холистерол
и т.д.
2. Путем микроинъекций. Успешно используется для переноса
клеточных органелл у растений. Также метод широко используется для
введения в клетку ДНК, РНК.
3. С использованием субпротопластов. Субпротопласты –
фрагменты, полученные из протопластов. Они могут содержать большую
часть цитоплазмы, но без ядра (цитопласты), ядро с небольшим
количеством цитоплазмы (кариопласты), часть хромосом с небольшим
количеством цитоплазматического материала (микропротопласты).

Значение клеточной инженерии

1. Применение клеточных культур позволяет преодолеть многие

проблемы биоэтики (биологической этики), связанные с умерщвлением
животных. Поэтому культуры клеток широко используются в научных
исследованиях.
2. В культуре можно выращивать строго определенные клетки в
неограниченном количестве. Поэтому культуры клеток и тканей,
выделенные из природного материала, широко используются при
промышленном производстве биологически активных веществ. В
частности, на клеточно-тканевом уровне выращиваются женьшень,
родиола розовая и другие лекарственные растения.
3. Решаются проблемы получения отдаленных гибридов растений.
Во-первых, путем соматической гибридизации можно скрещивать
растения, которые не скрещиваются обычным путем. Во-вторых,
полученные отдаленные гибриды можно воспроизводить, минуя семенное
размножение и мейотический фильтр. Стерилизация – как необходимое
условие культивирования клеток in vitro. Питательные среды, их состав.
Культура каллусных клеток, их возможное использование. Суспензионные
культуры и их использование для получения веществ вторичного синтеза.
Культивирование отдельных клеток.
4. На культурах клеток получают вакцины, например, против кори,
полиомиелита. В настоящее время решается вопрос крупномасштабного
производства моноклональных антител на основе гибридомных культур.
5. Сохраняя культуры клеток, можно сохранять генотипы отдельных
организмов и создавать банки генофондов отдельных сортов и даже целых
видов, например, в виде мериклонов (культур меристем).
7. Манипуляции с отдельными клетками и их компонентами
используются для клонирования животных. Например, ядра из клеток
кишечного эпителия головастика внедряются в энуклеированные
яйцеклетки лягушки. В результате из таких яйцеклеток развиваются особи
с генетически идентичными ядрами.

154
 Контрольные вопросы

1. Что представляет собой клеточная инженерия и как она

осуществляется? Общие положения клеточной инженерии
2. Перечислите основные технологии клеточной инженерии
животных.
3. В чем суть метода гибридизации животных клеток.
4. Опишите технологию получение моноклональных антител.
5. Кто впервые выделил изолированный протопласт и из какого
объекта?
6. Расскажите о способах получения, культивирования
протопластов растений.
7. Перечислите способы слияния протопластов.
8. В чем преимущества соматической гибридизации по сравнению с
половой?
9. Какими свойствами обладают разные виды стволовых клеток?
10. Какие проблемы возникают при получении и применении
стволовых клеток?

ТЕМА 14
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Методология генетической инженерии

Генетическая инженерия (метод рекомбинантных ДНК) - это

совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных
РНК и ДНК, выделения генов, осуществления манипуляций с генами и
введения их в организмы. Организмы, в которые переносятся чужеродные
гены, называется трансгенными. В литературе генная инженерия также
называется клонированием гена, ДНК - рекомбинантной технологией,
генным манипулированием и др.
Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально
активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе -
создание искусственных генетических программ (Баев А. А.).
Генетическая инженерия - система экспериментальных приемов,
позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке)
искусственные генетические структуры в виде так называемых
рекомбинантных или гибридных молекул ДНК (Пирузян Э. С.).
Речь идет о направленном, по заранее заданной программе
конструировании молекулярных генетических систем вне организма с
последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные
ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного
организма и сообщают ему новые уникальные генетические,
биохимические, а затем и физиологические свойства.
155
 Цель прикладной генетической инженерии заключается в
конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при
внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства,
полезные для человека.
С появлением методологии генетической инженерии появилась
реальная возможность искусственного конструирования
функционирующих рекомбинантных («химерных») молекул ДНК и в
настоящее время эта методология допускает конструирование in vitro
любых желаемых генов. Разработка методов выделения индивидуальных
генов практически любых организмов посредством их клонирования в
бактериальных клетках явилась одним из крупнейших достижений
молекулярной биологии. Такие клонированные гены (индивидуальные
гены в составе векторных молекул) можно переносить из клеток одних
организмов в клетки других видов, как близко родственных, так и
эволюционно отдалённых.
Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г.,
когда группа П. Берга в США создали первую рекомбинантную молекулу
ДНК (рДНК), объединившую в своем составе генетический материал из
трех источников: полный геном онкогенного вируса обезьян SV40, часть
генома умеренного бактериофага λ и гены лактозного оперона E. сoli.
В настоящее время генная инженерия широко применяется в
медицине для диагностики и установления механизмов развития
наследственных болезней, злокачественных опухолей, судебной медицине
и криминалистике, фармацевтической промышленности для синтеза и
производства лекарственных средств в т.ч. вакцин; микробиологии, для
получения полезных человеку штамов микроорганизмов, сельском
хозяйстве, для получения трансгенных животных и растений с ценными
для человека свойствами, клонирования клеток, органов и целых
организмов.
Основные ферменты генетической инженерии

Ферменты, используемые в генетической мнженерии можно

разделить на несколько групп:
- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК
(рестриктазы);
- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК
(полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы)— синтезирует
копии генов по их мРНК.
- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов
фрагментов ДНК.
Молекулярное клонирование стало возможным только после
выделения из бактерий высокоспецифичных ферментов, которые узнают
определенные последовательности оснований в двухцепочной молекуле
156
ДНК (рис. 44). Эти ферменты называются эндонуклеазы рестрикции типа
II.

Рисунок 44 - Формы разрывов двухцепочечных ДНК, образующихся под

действием рестриктаз: а – 5’-выступающие (1), 3’-выступающие "липкие" (2) и
"тупые" (3) концы ДНК, образующиеся под действием рестриктаз BamHI, KpnI и PvuII
соответственно. Стрелками обозначены места разрывов цепей ДНК, пунктирной
линией – ось симметрии сайтов рестрикции; б – лигирование с потерей сайта
рестрикции

К настоящему времени описано более двух тысяч рестриктаз.

Рестриктазы обозначаются латинской буквой R. Название фермента
складывается из первой буквы рода бактерий и двух первых букв вида,
например Bacillus subtilis – Bsu, Escherichia coli – Eco. Могут
дополнительно добавляться буквы или цифры, обозначающие типовую
характеристику штамма, или тип фермента. Так одна из первых ЭР типа II,
выделенная из бактерии Escherichia coli, была названа EcoRI. Римские
цифры обозначают порядковый номер данной ЭР в ряду прочих
рестриктаз, выделенных из данного микроорганизма.

Этапы создания трансгенных организмов

Сущность генетической инженерии заключается в том, что процесс

рекомбинации производится вне организма, при этом преодолеваются все
препятствия, с которыми сталкиваются ученые при классической
селекции. В результате появились неограниченные возможности
скрещивать гены видов, далеко отстоящих друг от друга на эволюционной
лестнице. Появилась возможность управлять процессом рекомбинации, так
как in vitro он не защищен запрещающими механизмами организма.
157
 Основными этапами создания трансгенных организмов являются
следующие:
1. Получение нужного гена (трансгена), намеченного для переноса
Ген может быть выделен из естественных источников (из
подходящего генома) или геномной библиотеки. Он может быть
синтезирован искусственно: химическим путем (по имеющейся
последовательности нуклеотидов) или ферментативным путем с
использованием механизма обратной транскрипции (синтез кДНК на
матрице мРНК с помощью обратной транскриптазы), получен с помощью
полимеразной цепной реакции (ПЦР).
2. Создание специальных генетических конструкций – векторов
(переносчиков), в составе которых гены (трансгены) будут внедряться в
геном другого вида или клонированы в клетках про- или эукариот.
Клонирование предполагает получением большого числа копий
фрагментов ДНК, идентичных исходному.
3. Генетическая трансформация, т.е. перенос и включение
генетических векторов (рДНК) в клетки-мишени хозяина (реципиента).
4. Молекулярная селекция – отбор клонов, несущих рДНК, что
осуществляется с использованием различных маркерных генов, которые
находятся в векторной молекуле наряду с трансгеном.
5. Выращивание измененных клеток в целые трансгенные
организмы.

Векторная трансформация

Вектором в генной инженерии называют молекулу ДНК, способную

самостоятельно реплицироваться, включать чужеродную ДНК, переносить
ее в реципиентные клетки и стабильно там поддерживать. Векторы
используют для создания in vitro молекул рДНК и для последующего
введения их в клетки, в составе, которых они клонируют (умножают)
число чужеродных генов.
Требования к вектору:
1. Вектор должен длительное время существовать в популяции
клеток- хозяев, т.е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами
клеток.
2. В любом векторе должны быть биохимические или генетические
маркеры, которые позволяли бы обнаруживать его присутствие в клетках.
3. Структура вектора должна допускать встраивание в нее
чужеродной последовательностей нуклеотидов без нарушения ее
функциональной целостности. Это значит, что вектор должен содержать
хотя бы один единичный сайт рестрикции.
В качестве векторных молекул могут быть использованы плазмиды
бактерий или дрожжей (простых эукариотических организмов), ДНК
бактериофагов или вирусов, искусственные хромосомы дрожжей (YAK) и
158
бактерий (BAK). Созданы также гибридные (искусственные) векторы-
космиды, объединяющие преимущества плазмид и фагов.
Для растений используются векторы, сконструированные на основе
Ti- и Ri- плазмид почвенных агробактерий. Эти бактерии поражают до
60% двудольных растений и некоторые однодольные растения, вызывая
формирование опухолей - корончатых галлов (Agrobacterium tumefaciens)
или образование "косматых" корней (A. rhizogenes). В плазмидах можно
клонировать фрагменты ДНК размером не более 10 тпн.
Фаговые векторы, чаще всего, создают на базе умеренного
бактериофага X, содержащего двухцепочечную линейную молекул ДНК.
Линейная двухцепочечная ДНК бактериофага X состоит примерно
из 50 тпн. На концах ДНК имеются cos-участки, отвечающую за упаковку
фаговой ДНК в ее протеиновую капсулу.
Зачастую полноразмерные гены и мультигенные комплексы
(>100тпн) эукариот слишком велики для встраивания в обычные векторы.
Для переноса крупных трансгенов и их клонирования используют
искусственные хромосомы дрожжей (YAK- яки от англ. yeast artificial
chromosomes), вмещающие фрагменты геномной ДНК длиной от 100 тпн
до 1 млн пн. Для их создания к плазмиде дрожжей "пришивают"
центромерные (CEN) последовательности, теломеры (концевые
последовательности), последовательности для автономной репликации
(ARS) в дрожжевой клетке, сайты рестрикции и селективные маркеры
(TRPI и URA3 - независимость от наличия триптофана и урацила
соответственно).
Классификация векторов:
По области использования:
1. Векторы общего назначения (клонирование генов, кДНК или
любых фрагментов ДНК). кДНК (одноцепочные ДНК, полученные с
помощью ревертаз);
2. Векторы для экспрессии клонированных генов (синтез мРНК и
белков).
3. Специализированные векторы (секвенирование и мутирование
генов и т.д.).
По происхождению:
1. Плазмидные
2. Фаговые
3. Гибридные (сочетают свойства плазмид и фагов.
По структуре ДНК:
1. Кольцевые
2. Линейные
По способу поддержания в клетке:
1. Автономные (реплицирующиеся самостоятельно)
2. Интегративные (реплицирующие в составе клеточной хромосомы
По числу молекул в клетке:
159
 1. Малокопийные (несколько копий)
2. Мультикопийные (десятки копий)
По числу репликаторов, имеющихся в векторном геноме:
1. Монорепликонные 2. Бирепликонные, их также называют
челночными, если они могут реплицироваться в клетках различных видов
Плазмиды. Наиболее пригодны на роль векторов – естественные
репликоны небольших размеров: ДНК плазмид и вирусов (в т.ч. фагов), а
также фрагменты хромосом эукариотических клеток, но непосредственно в
этом качестве их используют редко. Обычно их модифицируют или
комбинируют их части для того, чтобы они отвечали определенным
требованиям.
Самые распространенные плазмидные векторы клеток E. coli –
плазмида pBR322 и ее производные. Буквы B и R указывают на авторов Ф.
Боливара и Р. Родригеса. Длина плазмиды 4361 п.н., Этот вектор
полностью секвенирован, содержит репликатор от плазмиды pMB1 и
сохраняет от нее свойство мультикопийности (15-20 копий на клетку) и
способность к амплификации в присутствии хлорамфеникола
левомицетина).
Репликатор – участок ДНК, ответственный за инициацию
репликации.
Репликон – молекула ДНК или ее участок, находящиеся под
контролем репликатора. Из двух других плазмид в pBR322 переданы два
гена устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрациклину, это
позволяет вести отбор трансформантов по их устойчивости к одному
антибиотику, а клоны с рекДНК выявлять после перепечатки
трансформантов на соответствующие чашки по их чувствительности к
другому антибиотику (рис. 45). Гены устойчивости к антибиотикам
содержат несколько единственных сайтов рестрикции. В совокупности
этот вектор обладает большими возможностями для клонирования генов.

Рисунок 45 - Схема строения плазмидного вектора pBR322

160
 Плазмида pFH7 является примером интегративной челночной
плазмиды, полученной путем объединения двух репликонов, один из
которых берет начало от плазмиды pC194 из B. subtilis, а другой - от
плазмиды pBr322 E. coli, что дает возможность вектору существовать и
стабильно реплицироваься как в клетках E. coli, так и B. subtilis. Созданы
челночные векторы, способные реплицироваться в клетках животных и
растений и в низших организмах. Необходимость использования
челночных векторов в ГИ связана с тем, что наработку векторной ДНК
для проведения генно-инженерных манипуляций удобнее проводить в
бактериях, а получение биологически активных продуктов клонированных
генов высших организмов во многих случаях возможно только в клетках
своего или близкого вида, в которых эти гены экспрессируются в
природных условиях.
Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той
же клетке в условиях отсутствия селективного давления, то считается, что
они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды,
относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно
существуют в одной клетке, независимо от числа копий. У некоторых
микроорганизмов обнаружено до 8-10 разных плазмид, при этом каждая из
них выполняла свои функции, была представлена характерным для нее
числом копий и относилась к собственной группе несовместимости. Одни
плазмиды несут специфический сайт инициации репликации и могут
реплицироваться только в клетках одного вида. У других плазмид этот
сайт менее специфичен, и они реплицируются в самых разных
бактериальных клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и с
широким кругом хозяев. Несовместимость плазмид обусловливается
подавлением репликации одной из них или блокированием распределения
дочерних молекул ДНК по клеткам перед их делением. Оба механизма
действуют независимо друг от друга.
Различают плазмиды со строгим и ослабленным контролем
репликации. Минимальный размер плазмид со строгим контролем
репликации 20-30 тпн, а максимальный – на порядок больше. Плазмиды с
ослабленным контролем репликации обычно невелики – не более 15-30
тпн. Строгость контроля репликации плазмид заключается в наличии у них
механизма ограничения числа копий до 1-3 молекул на клетку. При
переходе в стационарную фазу роста плазмиды со строгим контролем
перестают реплицироваться, в то время как плазмиды с ослабленным
контролем продолжают дупликацию, и их масса в клетке может достигать
массы бактериальной ДНК.
Плазмиды со строгим контролем репликации способны к
интеграции в бактериальную хромосому. При этом они подчиняются
репликационному аппарату бактериальной хромосомы и могут
неопределенно долго существовать в ее составе. Такие плазмиды получили
название эписом (Пример - плазмида F)
161
 Контроль числа копий осуществляет базовый репликон плазмиды
(его размер около 2-3 т.п.н.), в который входят сайт начала репликации ori,
сайты контроля за копийностью cop (лат) и несовместимостью inc
(incompatibility), а также гены, чьи продукты функционируют на этих
сайтах.
Фенотипические признаки. Плазмиды передают клеткам
различные признаки: устойчивость к антибиотикам (более 20), тяжелым
металлам: висмуту, кадмию, кобальту, ртути, свинцу; соединениям
мышьяка, УФ-свету и т.д. Клетки с плазмидами способны вызывать
биодеградацию различных углеводородов, синтезировать антибиотики,
пигменты, токсины, конъюгировать с реципиентными штаммами бактерий,
инициировать опухоли у растений, осуществлять рестрикцию и
модификацию ДНК. Плазмиды, которые не выявляются по
фенотипическим признакам, называются криптическими.
В природе плазмиды играют роль посредников, способствуя
межклеточному обмену генами. Такой обмен приводит к быстрой
адаптации клеток к изменяющимся факторам среды. Частота таких
явлений в природе низка. Однако в последнее время она возросла, в
результате чрезмерного использования в медицине антибактериальных
веществ и загрязнения окружающей среды промышленными отходами. В
клиниках вместо естественных чувствительных штаммов стали выделять
их варианты, устойчивые к лекарственным веществам, а в местах
скопления отходов и ядов были выявлены микроорганизмы, активно
утилизирующие эти вещества. Плазмиды также могут вызывать изменения
в составе белков внешней мебраны, что приводит к их антигенной
вариации и способствует повышению устойчивости бактерий против
иммунной системы животных.
Плазмида F (или фактор фертильности) представляет собой
малокопийную конъюгативную эписому клеток E. coli К12, относящуюся к
IncF1-группе несовместимости и обладающую строгим контролем
репликации. Размер ее кольцевой ДНК составляет около 100 тпн, у нее
идентифицированы около 60 генов. Попадая в клетку, эта плазмида
изменяет ее свойства. Клетки приобретают пили и чувствительность к
некоторым фагам (для них пили являются рецепторами), а также
становятся донорами ДНК и блокируют конъюгационный перенос в них
чужой ДНК (явление поверхностного исключения). Эта плазмида может
существовать как автономно в цитоплазме у F+ донора, так и встраиваться
в бактериальную хромосому. Реципиентные штаммы не имеют фактора F и
обозначаются F-(минус). F+ -доноры передают F-плазмиды практически
всем F- клеткам, с которыми они спариваются. Клетка после интеграции в
ее хромосому F-плазмиды приобретает свойства Hfr-клетки, т.е.
способность с высокой частотой ориентированно передавать свои гены в
реципиенты.

162
 F - плазмиды представляют пример генной инженерии in vivo,
осуществляющейся в природе с помощью плазмид. Эти плазмиды широко
используются и в молекулярной генетике и генной инженерии.

Секвенирование ДНК и экспрессия трансгенов

Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход

предполагает использование бактериальных или дрожжевых клеток для
размножения введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ
представляет собой амплификацию ДНК in vitro.
Клонирование ДНК in vivo
Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек
ДНК: геномную и клоновую (кДНК).
Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма
разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку,
то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или
фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков
генома довольно высока.
Такой способ получения геномной библиотеки получил название
«метод дробовика», так как геном в данном случае представлен
отдельными фрагментами.
Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие,
поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из
вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют
большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.
Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой,
получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же
рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом,
получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в
бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с
образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к
антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то
клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.
Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной
клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а
совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК.
Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в
огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем,
поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые
фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные
последовательности.
Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на
матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити
ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на
163
нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют
комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с
тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки
бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной
копии ДНК (кДНК).
Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том,
что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не
прерывается.
Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из
транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего
следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут
осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем
транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют
получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше
использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.
Полимеразная цепная реакция. В 1985 году К. Мюллис с
сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК
in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Из всех последних технических достижений в молекулярной
биологии полимеразная цепная реакция (ПЦР) была гораздо полезнее
других. Принцип действия ПЦР заключается в амплификации
последовательностей ДНК совершенно невероятным способом. Даже если
у вас имеется очень малое количество исходной молекулы ДНК, так мало,
что ее трудно обнаружить, вы можете создать бесчисленное множество
копий с помощью ПЦР.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - искусственная амплификация
последовательности ДНК путем повторных циклов репликации и
разделения нитей.
ПЦР используется в клинической диагностике, генетическом
анализе, генной инженерии и судебно-криминалистическом анализе, а
также в целом ряде практических примеров.
Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать
препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в
миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены
и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном
человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и
выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она
встречается однажды в образце из 105 клеток. Получаемый сегмент ДНК
надежно выявляется в виде дискретной полосы после
электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум
бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то ферментная метка будет
накапливаться при амплифицировании. Продукт амплификации
проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается
изменение окраски. В качестве метки можно использовать стрептавидин.
164
Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В последнем
случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к обычным,
идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим достигается еще
большее усиление сигнала.
Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах,
достаточных для его прямого секвенирования. Поскольку при этом не
требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в
молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным
молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning).
Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции,
состоящая из 30 и более циклов, занимает 3—4 часа, что существенно
быстрее и проще процедуры клонирования определенного фрагмента ДНК
в составе векторных молекул.
Ввести рекомбинантный ген в клетку можно 2 способами:
используя вектора или путем прямого введения.
Требования к векторной ДНК, ее состав
Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов:
векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача
вектора – донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент, встроить ее в
геном, позволить идентификацию трансформированных клеток,
обеспечить стабильную экспрессию введенного гена.
Таким образом, вектор должен быть небольшим, способным
поддерживаться в клетке-хозяине (реплицироваться), многократно
копироваться (ампфлицироваться), экспрессировать соответствующий ген
(содержать соответствующие регуляторные последовательности), должен
иметь маркерный ген, позволяющий различать гибридные клетки для
эффективной селекции их; должен быть способен передаваться в клетку
соответствующего организма.
Можно выделить 2 группы маркерных генов, позволяющие
отличить трансформированные клетки:
1. Селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам
(канамицину, тетрациклину, неомицину и др.), гербицидам (у растений).
Это могут быть гены ауксотрофности по какому-либо субстрату и т.д.
Основной принцип работы такого маркера – способность
трансформированных клеток расти на селективной питательной среде, с
добавкой определенных веществ, ингибирующих рост и деление
нетрансформированных, нормальных клеток.
2. Репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки,
наличие которых в тканях может быть легко тестировано.

Регуляция экспрессии генов у прокариот

Многие бактериальные гены устроены таким образом, что они

способны функционировать с существенно разной эффективностью. У
165
E.coli, например, относительное содержание различных белков варьирует в
очень широких пределах (от менее чем 0,1% до 2%) в зависимости от их
функций; при этом каждый белок в хромосоме E. coli кодируется
единственным геном. Такие вариации обусловлены действием системы
контроля генной экспрессии, которая осуществляется главным образом на
уровне транскрипции ДНК. Таким образом, чаще всего уровень активности
гена связан с количеством синтезируемой на нем мРНК, то есть с
активностью фермента РНК-полимеразы.
Последовательности ДНК, расположенные перед началом
структурного гена и определяющие степень активности РНК-полимеразы,
называются регуляторными последовательностями. Одна из таких
последовательностей представляет собой участок ДНК, с которым
связывается РНК-полимераза. Этот участок называется промотором.
Последовательность оснований промотора определяет частоту
инициации синтеза иРНК, причем замена одного основания в этой
последовательности может привести к уменьшению частоты инициации в
1000 раз.
Промотор может быть сильным и слабым. Сильный промотор
инициирует синтез иРНК часто, слабый - гораздо реже. С другой стороны,
промотор может быть регулируемым и нерегулируемым. Например,
промотор β-лактамазы нерегулируемый, но сильный. Использование таких
промоторов не всегда удобно. Дело в том, что большое количество белка
может блокировать рост бактерий. Кроме того, интенсивная транскрипция
рекомбинантной ДНК может помешать репликации плазмиды, и она будет
утрачена. Поэтому удобнее использовать регулируемые сильные
промоторы (индуцибельные), включение которых, а значит и синтез
чужеродного белка можно осуществить, когда получена большая
бактериальная масса.
Некоторые плазмидные векторы содержат промотор, работа
которого регулируется температурочувствительным белковым продуктом
гена-репрессора. Белок-репрессор активен при определенных
температурах и блокирует действие промотора. Повысив температуру до
42оС, можно "включить" промотор и быстро получить большое количество
требуемого белка.
В качестве индуцибельных промоторов используют также Trp-
промотор триптофанового оперона, который регулируется триптофановым
голоданием, lac-промотор лактазного оперона, который индуцируется
субстратом (лактозой) и другие.
Интенсивность транскрипции определенных структурных генов
может зависеть от эффективности ее терминации, в частности, от того, как
часто РНК-полимераза прекращает синтез РНК, не дойдя до этих генов.
Сравнительно недавно обнаружено, что во многих оперонах Е.coli,
контролирующих биосинтез аминокислот, между промотором и первым
структурным геном имеется терминирующая последовательность. В
166
определенных условиях происходит образование терминирующего
сигнала, ослабляющего интенсивность транскрипции.
Это явление получило название аттенуации, а участок ДНК -
аттенуатор (ослабитель). Как и репрессия, аттенуация зависит от
присутствия в среде соответствующих аминокислот. Например, избыток
триптофана в клетках триптофанзависимых мутантов, дефектных по
репрессору, только 1 из 10 молекул РНК-полимеразы, начавших
транскрипцию, преодолевает аттенуатор и считывает структуру генов.
Удаление триптофана втрое повышает эффективность транскрипции генов.
В отличие от репрессии, антенуация зависит не от самой аминокислоты, а
от триптофанил - тРНК (аминокилоты, присоединенной к
соответствующей тРНК).
«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток в
митозе колцемидом. При продолжительной обработке клеток колцемидом
в них вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана.
Обработка цитохалазином В и центрифугирование приводит к
образованию мини-клеток, представляющих микроядра,
инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану.
Полученные мини-клетки очень чувствительны к разного рода
воздействиям, поэтому для слияния подбирают специальные мягкие
условия. Метод трудный, капризный, эффективность низкая – 10-6 – 10-7.
Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного
генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.
Липосомы - сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов.
Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и
липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов.
Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее
пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Системы
переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.
Метод биологической баллистики (биолистики) является одним
из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации
растений, особенно однодольных.
Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички
вольфрама, диаметром 0,6-1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего
необходимую для трансформирования генную конструкцию.
Вольфрамовые частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую
подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или
суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и
помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10-15 см. В пушке
вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент
сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью
выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки,
входят в цитоплазму и ядро клеток.

167
 Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру,
погибают из-за огромного количества и давления вольфрамовых частиц, в
то время как в зоне 0,6-1 см от центра находятся наиболее удачно
протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на
среду для дальнейшего культивирования и регенерации.
С помощью биолистической пушки были протрансформированы
однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При
этом были получены стабильные растения-трансформанты. Кроме успехов
в получении трансгенных однодольных, биолистическая трансформация
применяется для прямого переноса ДНК в эмбриогенную пыльцу и
дальнейшего быстрого получения трансгенных дигаплоидных растений,
которые являются важным этапом в селекционной работе. В настоящее
время этим методом была проведена трансформация растений табака и
после регенерации гаплоидных растений получены стабильные
трансформанты.

Генная инженерия микроорганизмов

Стратегия получения трансгенных микроорганизмов (рис. 46):

1. Рестрикция — «вырезание» нужных генов. Проводится с помощью
специальных «генетических ножниц», ферментов — рестриктаз.
2. Создание вектора — специальной генетической конструкции, в
составе которой намеченный ген будет внедрен в геном другой клетки.
Основой для создания вектора являются плазмиды. Ген вшивают в
плазмиду с помощью другой группы ферментов — лигаз. Вектор должен
содержать все необходимое для управления работой этого гена —
промотор, терминатор, ген-оператор и ген-регулятор, а также маркерные
гены, которые придают клетке-реципиенту новые свойства, позволяющие
отличить эту клетку от исходных клеток.
3. Трансформация — внедрение вектора в бактерию.
4. Скрининг — отбор тех бактерий, в которых внедренные гены
успешно работают.
5. Клонирование трансформированных бактерий.

168
 Рисунок 46 - Схема основных этапов генетической инженерии
микроорганизмов

Перспективы использования трансгенных микроорганизмов

Первыми организмами, которые по воле ученых содержали

рекомбинантную ДНК, явились бактерии, а именно E. сoli, производящие
генно-инженерный человеческий инсулин. Инсулин – гормон
поджелудочной железы – играет главную роль в углеводном обмене. Если
он не производится в организме (по разным причинам), развивается
тяжелое заболевание – диабет. Для лечения больных диабетом применяли
инъекции свиного инсулина, на который у многих больных развивалась
иммунологическая реакция. Но даже потребности в свином инсулине
удовлетворялись всего на 60%. Поэтому в качестве первой практической
задачи генные инженеры клонировали ген человеческого инсулина и
включили его в плазмиду, которой заразили E.coli (рис. 47). В результате
E.coli. стали нарабатывать человеческий инсулин. За ночь каждая бактерия
дает потомство 107 клеток. Из 1000 л бактериальной культуры получают
200 г инсулина, столько же, сколько получали раньше из 1600 кг
поджелудочной железы свиней. Главное, для этих больных решена
проблема иммунологической реактивности на чужеродный свиной
инсулин.

169
 Рисунок 47 - Получение генноинженерного инсулина

Другой генно-инженерный биопрепарат – это интерферон, который

успешно применяют для лечения вирусных заболеваний и
злокачественных опухолей. В настоящее время на стадии клинического
испытания находится более 1000 генно-инженерных лекарственных
веществ. Около 200 новых диагностических препаратов уже введено в
медицинскую практику. Так начало развиваться одно из главных
направлений в генной инженерии – наработка труднодоступных
лекарственных биопрепаратов – гормонов, факторов роста, нейро- и
иммуномодуляторов, аминокислот, витаминов, антибиотиков. Второе
направление – это получение рекомбинантных вакцин для профилактики
инфекционных заболеваний. Идеалом является комбинированная вакцина,
состоящая из иммунодоминантных эпитопов ряда возбудителей (что в
естественных условиях не встречается), эффективная при использовании в
малой дозе для перорального введения людям и сельскохозяйственным
животным.
В пищевой промышленности используются трансгенные штаммы
организмов в хлебопечении, сыроварении, получении кисломолочных
продуктов, виноделии и т.д.
Для использования в сельском хозяйстве получены штаммы
трансгенных бактерий, которые наиболее эффективно осуществляют
фиксацию азота, улучшают состояние почв, препятствуют образованию
льда на корнях растений и т. д.

170
 Для целей охраны окружающей среды используют трансгенные
бактерии, которые очищают почву и воду от фенолов, от загрязнения
нефтью, ракетным топливом гептилом и другими загрязняющими
веществами.
Ген фермента хитиназы встроили в бакуловирус (вирусы этой
группы поражают только насекомых), последний используют в качестве
биоинсектицида. Попадая в организм насекомых, он поражает их
кишечник. Есть проект, предусматривающий введение гена хитиназы в
растения.
1) производство продуктов биосинтеза трансгенных
микроорганизмов, например, антибиотиков, гормонов, ферментов и
витаминов;
2) использование биомассы микроорганизмов – производство
медицинских вакцин, различных дрожжей, белково-витаминных
концентратов и заквасок для получения кисломолочных продуктов и
силосования кормов;
3) биотехнологии, основанные на уникальных способностях
некоторых бактерий производить органические кислоты, этанол, углеводы
и метан. Сюда же можно отнести и переработку некоторых отходов с
возможностью получения полезных соединений, в первую очередь,
горючих газов.

Генная инженерия животных

Стратегия получения трансгенных животных состоит в следующем:

1. Клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки;
2. Инокулированные оплодотворенные яйцеклетки
имплантируют в реципиентную женскую особь, поскольку успешное
завершение развития эмбриона млекопитающих в иных условиях
невозможно;
3. Отбирают потомков, развившихся из имплантированных
яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках;
4. Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в
клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию
Наиболее часто в ГИ исследованиях на животных используются
мыши. Введение чужеродной ДНК мышам осуществляется следующими
способами:
1. С помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки
эмбриона на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в
самку-реципиента;
2. Микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской
пронуклеус) (рис. 48);

171
 Рисунок 48 - Микроинъекция экзогенной ДНК в пронуклеус
оплодотворенной яйцеклетки млекопитающих: А - под микроскопом; Б- схема
эксперимента)

3. Введением генетически модифицированных эмбриональных

стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях
развития.
Первый способ достаточно эффективен, но размер вставки
небольшой - около 8 тпн., вследствие чего трансген может быть лишен
прилегающих регуляторных участков, необходимых для его экспрессии.
Кроме того, есть вероятность попадания в клетку животного вируса –
помошника, что нежелательно, если эти животные используются в пищу.

Суть метода микроинъекций ДНК.

- Вначале увеличивают число яйцеклеток, в которых будет

инъецирована чужеродная ДНК, путем стимуляции гиперовуляции у самок
доноров. Для этого самкам вводят сыворотку беременной кобылы, а спустя
примерно 48 часов - гонадотропин человека. В результате гиперовуляции
образуется примерно 35 яйцеклеток, вместо обычных 5-10.
- Затем скрещивают этих самок с самцами и самок умерщвляют.
Вымывают из яйцеводов оплодотворенные яйцеклетки и вводят в них ДНК
путем микроинъекции. Это делается под микроскопом с помощью очень
тонких капилляров.
- Далее вводят полученные яйцеклетки в «суррогатную» мать, у
которой вызывают ложную беременность, скрещивая с
вазэктомированным (кастрированным) самцом. У мышей спаривание это
единственный способ подготовки матки к имплантации. Поскольку
вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из
яйцеклеток «суррогатной» матери не оплодотворяется, и эмбрионы
развиваются только из введенных яйцеклеток. Через три недели
рождаются мышата (рис. 49) .
Для идентификации выделяют ДНК из кончика хвоста и теститруют
на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Далее
проводят ряд скрещиваний для получения чистых (гомозиготных)

172
трансгенных линий. В целом эффективность этого способа невелика – на
1000 имплантированых яйцеклеток - 30-50 трансгенных мышат.

Рисунок 49 - Технология создания трансгенных мышей

Лабораторные трансгенные животные используются в основном для

моделирования заболеваний человека. В настоящее время, благодаря
трансгенной технологии, получено более 300 трансгенных линий мышей,
моделирующих воспалительные, аутоиммунные, нейродегенеративные,
онкологические и другие заболевания человека. Трансгенные
сельскохозяйственные животные используются в основном как “фабрики”
для наработки необходимых для человека биопрепаратов.
В последующем техника введения чужеродной ДНК в геном
животных усовершенствовалась так, что стало возможным вводить ДНК
направленно, адресно в конкретную часть генома. Основой этой
технологии послужило использование эмбриональных стволовых ( ES)
клеток. Известно, что ES -клетки сохраняют высокие плюрипотентные
свойства при длительном культивировании in vitro и, будучи вновь
введенными в эмбрион, способны формировать химеры. Эта уникальная
способность ES -клеток открыла широкие возможности для манипуляции с
их генами. Адресное введение гена достигается благодаря возможности
рекомбинации между экзогенной ДНК и ДНК реципиента. В результате
этого происходит адресная инсерция гена в ДНК-мишень ES -клеток.
После этого ES - клетки внедряют в бластоцисту животных на ранних
173
стадиях развития (рис. 50). В результате трансгенные эмбриональные
стволовые клетки принимают участие в формировании тканей
развивающегося плода, который представляет собой химеру. У химерных
животных до 50% клеток составляют клетки – потомки введенных
трансгенных эмбриональных стволовых клеток. Показано, что они
присутствуют во всех тканях, в том числе и зародышевом пути.

Рисунок 50 - Получение трансгенных мышей методом реконструкции

эмбрионов с помощью генетически модифицированных эмбриональных
стволовых клеток (ES-клеток). ES-клетки получают из внутренней клеточной массы
бластоцисты мыши

В эмбриональные стволовые клетки трансгены вводят с помощью

ретровирусов, электропорации, липосом, в виде “голой ” плазмидной ДНК,
в виде искусственных конструкций на основе полисахаридов и др. К
настоящему времени получено более 2000 трансгенных мышей, в геноме
которых находятся различные введенные генетические конструкции.
Получены трансгенные козы, овцы, свиньи, коровы и другие
сельскохозяйственные животные.
Вводимая таким способом ДНК интегрируется в геном случайным
образом и зачастую в виде множественных копий. Вследствие этого
экспрессия трансгена у разных животных может сильно варьировать. Тем

174
не менее этот метод активно используется для практических целей,
например, для получения животных, которые являются поставщиками
человеческих белков – факторов свертывания крови, гормонов и других
необходимых для лечения человека белков. Дело в том, что трансгенные
прокариоты, которых получать проще, не достаточно полно справляются с
аналогичной задачей. Они не могут осуществлять посттрансляционную
модификацию белков так, как это делают эукариотические клетки
(фолдинг, гликозилирование и др.). использование биореакторов, в
которых продуцентами биопрепаратов являются культивируемые клетки
животных, очень дорого. К тому же культивируемые клетки часто
проявляют нестабильность генома. В связи с этим наиболее
перспективной для получения белков человека является биотехнология с
использованием трансгенных животных. Животные адекватным образом
осуществляют посттрансляционные процессы и могут быть настоящими
фабриками по производству любого белка. При этом можно сделать так,
что нужный белок будет выделяться с молоком, что очень удобно в ряде
случаев. Для этого трансген помещают под контроль одного из генов,
контролирующих белки молока. Для промышленного биопроизводства
используют коров, коз, овец и свиней. В настоящее время имеется
реальная возможность производства в молоке трансгенных животных
более 65 биологически активных белков человека. Так получают
антитрипсин для лечения заболевания легких, антитромбин, необходимый
для лечения инфаркта миокарда и инсульта, факторы свертывания крови
для лечения гемофилии, С-реактивный белок для лечения
иммунодефицитов, иммуномодуляторы, биостимуляторы, антитела и др.

Перспективы использования трансгенных животных

Трансгенные млекопитающие являются лучшей моделью для

изучения болезней человека, с другой стороны, их планируют
использовать для производства необходимых человеку биомедицинских
препаратов.
Первое трансгенное животное было получено в 1982 г. Р.Д.
Пальмитером с соавторами. Это была гигантская мышь, которой
пересадили ген гормона роста крысы. Попытки увеличить таким же путем
размеры более крупных млекопитающих оказались неудачными.
Животные с повышенным уровнем индукции гормона роста не
увеличивались в размерах, но у них наблюдались значительные нарушения
в росте и строении костей.
Трансгенные животные — биореакторы ("биологические фабрики").
Трансгенные животные получили широкое распространение как
биореакторы, т.е. продуценты биологически активных лекарственных
белков человека, секретируемых в молоко: гормонов, ферментов, антител,
факторов свертывания крови и роста и др. Традиционно такие белки
175
выделяли из донорской крови, дефицит которой и низкая концентрация
этих белков не позволяли получать необходимого количества препаратов,
покрывающего запросы фармакологического рынка. Биореакторами могут
быть и бактерии, но бактериальные клетки идут в переработку целиком и
поэтому трудно избавиться от посторонних примесей в конечном
продукте. Трансгенные животные позволят решить и эту проблему -
очистки лекарственных белков. Даже если после очистки в препарате
останутся примеси, это будут нетоксичные для человека белки молока.
Кроме того, микроорганизмы неспособны осуществлять
посттрансляционные модификации сложных эукариотических белков
(гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование,
карбоксилирование и др.), необходимые для их нормального
функционирования. Известно, что производимые микроорганизмами белки
нередко вызывают аллергические реакции.
Стратегия работ в этом направлении такова: получить трансгенное
животное, у которого чужой ген экспрессируется в клетках молочной
железы и его продукт выделятся в молоко. Использование молока
целесообразно потому, что оно образуется в организме животного в
большом количестве, является стерильным и его можно надаивать по мере
надобности без вреда для животного. Например, коза в период лактации
может произвести до 800 л молока в год при содержании в нем
рекомбинантного белка около 5г/л, т.е. около 4 кг этого белка в год. Таким
образом, относительно небольшое стадо трансгенных коз может
продуцировать в составе молока сотни килограммов рекомбинантного
белка в год при его низкой стоимости.
В 1988 г. впервые удалось получить трансгенных овец, продуци-
рующих с молоком фактор свертывания крови, необходимый для лечения
людей, больных гемофилией. В последующие годы в мире созданы
трансгенные мыши, кролики, овцы и козы, свиньи, коровы, в молоке
которых секретируются белки человека (ценнейшие фармацевтические
вещества): антитрипсин, антитромбин, белок С, сывороточный альбумин
(используемый при операциях), различные моноклональные антитела,
эритропоэтин, инсулиноподобный фактор роста, интерлейкины и др.
Трансгенные животные с выключенными генами (генный нокаут).
Генный нокаут (от англ. «knock out» - выбить) или генный таргетинг -это
направленное разрушение (выключение) определенного гена с помощью
гомологичной рекомбинации. Большое значение имеют опыты по
созданию животных, продуцирующих молоко, максимально
приближающееся по составу к материнскому молоку человека. Для этого
нужно выключить несколько генов коровы, т.е. получить так называемых
животных-нокаутов, а затем ввести в ее геном несколько генов человека.
На основе изучения трансгенных животных разрабатываются методы
генной терапии (способы лечения различных наследственных
заболеваний). При этом используется соматическая трансфекция - метод,
176
когда генетические конструкции вводятся в определенные клетки и ткани
организма пациента. Как и все другие методы лечения,
генотерапевтические методы разрабатываются и проходят испытания на
модельных трансгенных животных.
Трансгенные животные — источники органов для пересадки
человеку. Значительный интерес представляет создание трансгенных
животных как источников органов для пересадки человеку. Органы
свиньи, например, очень подходят человеку по строению, размерам и
многим биохимическим показателям. Свиньи считаются наиболее
подходящими животными в качестве доноров сердца для пересадки
людям, т.к. сердце свиньи по размерам наиболее соответствует сердцу
человека и сердечные клапаны свиньи уже более десятилетия
используются при кардиологических операциях на людях. Клонирование
трансгенных свиней позволит создать постоянный запас органов для
пересадки людям. Но пересаживать их без генетического изменения
(трансформации) невозможно, т.к. эти органы будут немедленно
отторгнуты иммунной системой пациента. Чтобы этого не произошло,
необходимо создать трансгенную свинью, у которой нокаутированы
соответственные гены гистонесовместимости (тканенесовместимо-сти), а
вместо них введены гены гистосовместимости человека. Эти гены
располагаются компактно в локусах гистосовместимости, и при
проведении генного нокаута можно выключить сразу несколько генов.
Трансгенные животные находят применение для моделирования
заболеваний человека. Введеный трансген обеспечивает экспрессию
рецептора к соответствующему вирусу и, следовательно, возможность
возникновения вирусной инфекции. Такой прием необходим в случае
моделирования на животных вирусных инфекций, поражающих только
человека.
В последние годы внимание исследователей привлечено к
возможности модификации генома животных на уровне индивидуальных
хромосом. Появились способы создания искусственных хромосом и
подходы к переносу их от одного животного к другому. По сути, это новая
биотехнология или генная инженерия. Она основана на модификации
генома эмбриональных стволовых клеток. В Институте цитологии и
генетики СО РАН О. Л. Серовым с сотрудниками используется
оригинальный подход. Получают гибриды между эмбриональными
стволовыми клетками и соматическими клетками. В полученных гибридах,
только в тех из них, которые сохраняют плюрипотентные свой свойства и
способны образовывать при введении в бластоцисту химеры, находятся
единичные хромосомы от соматического партнера. Будучи введенными в
бластоцисту мыши, они способны формировать химеры, а последние –
продуцировать гаметы, идентичные по генотипу гибридным клеткам.
Согласно этой схеме, возможен перенос индивидуальных хромосом от
одного животного к другому. Не менее привлекательным выглядит
177
сочетание метода с клонированием. В этом случае ядра полученных
гибридов переносят в энуклеированную яйцеклетку. Значит, такие
реконструированные ооциты обеспечат развитие особей с генотипом
гибридной клетки.
Есть еще одна интересная модификации трансгенеза, позволяющая
переносить большие количества генетического материала. В основе его –
контролируемая фрагментация клеточного ядра, так что отдельные
фрагменты содержат индивидуальные хромосомы или их фрагменты, их
называют микроклетками. Последние сливают с эмбриональными
стволовыми клетками. Полученные мыши-химеры (способом, описанным
выше) называют транс-хромосомными. Недавно группа английских
ученых получила серию транс-хромосомных мышей, несущих фрагменты
21 хромосомы человека. Важно, что у этих животных наблюдается
тканеспецифическая регуляция экспрессии человеческих генов. Ученые
научились также получать искусственные хромосомы и вводить их в геном
животных. Уже получены такие мыши, которые могут использоваться для
изучения роли отдельных структур в организации хромосом
млекопитающих.
Генная инженерия растений

Для трансформации растений чужеродной ДНК используется

фитопатогенная грамотрицательная почвенная бактерия Agrobacterium
tumefaciens, вызывающая образование опухолей растений (рис.51).

Рисунок 51 - Генетическая колонизация растения A. tumefaciens в природе:

1- агробактерии существуют в ризосфере; 2 - строение A. tumefaciens; 3 – встраивание
Т-ДНК в геном; 4 – образование опухоли

178
 При проникновении этой бактерии в растение она интегрирует в
геном растительной клетки и экспрессирует специфический сегмент
бактериальной плазмидной ДНК – так называемую T-ДНК.
В 1977 г. американские генетики доказали, что опухоли корончатого
галла возникают в результате включения в растения ДНК определенного
фрагмента Ti-плазмид агробактерий, названного Т-ДНК (от англ. trans-
ferred — «перенесенный») или (от английского tumor inducing -
вызывающие опухоли).
Гены, входящие в состав T-ДНК, функционируют лишь после их
переноса в растительную клетку. Будучи интегрированной с хромосомой,
Т-ДНК индуцирует в месте заражения неконтролируемый рост
недифференцированных клеток, вызывая образование опухоли
(корончатых галлов, напоминающих раковые клетки животных),
гиперпродукцию фитогормонов: цитокининов и индолилуксусной кислоты
- ИУК (ауксина), а также синтез ряда производных аминокислот,
объединенных под общим термином опины, которых нет в здоровых
клетках ни у одного растения (рис. 52).

Рисунок 52 - Структура Ti-плазмиды: основные элементы: оri-область, vir-

область, область Т-ДНК

Размер всей Ti-плазмиды составляет 200-250 тпн, размер T-ДНК в

разных плазмидах варьирует от 10 до 30 тпн (что составляет примерно 10%
Ti-плазмиды). На T-области картировано не менее 7 генов, каждый из
которых регулируется собственным промотором (что сходно с генами
эукариот). Эти гены отвечают за синтез опинов (тип которых, например,
нопалин, октопин, агроцинопин, манопин зависит от штамма
агробактерии, вызывающего его образование) и подавление
дифференцировки клеток (онкогены) - подавление образования корней и
побегов. Эти гены функционируют лишь после их переноса в
179
растительную клетку. С концов T-ДНК ограничена правым и левым
прямыми повторами из 25 пн, что придает ей сходство с мобильными
генетическими элементами. Поэтому любая ДНК, вставленная между
этими повторами, будет принята за T-ДНК и перенесена в растительную
клетку. Важно отметить, что все гены (их около 35), ответственные за
перенос и интеграцию T-ДНК, находятся не в T-ДНК, а в области
вирулентности (vir-область).
При культивировании в условиях in vitro клетки опухоли могут расти
в отсутствие специальных гормонов (ауксинов/цитокининов),
необходимых для культивирования нормальных растительных клеток,
поскольку эти гормоны клетки опухоли синтезируют сами. Опухоль
возникает вследствие нарушения баланса фитогормонов, от которого
зависит нормальный морфогенез растения. Т.е. это результат
функционирования онкогенов, продуктами которых являются
фитогормоны (ауксины и цитокинины). Опины, выделяемые клетками
опухоли, бактерия использует в качестве источников углерода и азота для
своего роста и размножения. Сама бактерия в клетку не проникает, а
остается в межклеточном пространстве и использует клетки со встроенной
T-ДНК как фабрику, продуцирующую опины. Ti-плазмида относится к
классу конъюгативных плазмид. Однако практическое использование
природных Ti-плазмид как векторов для переноса генетической
информации в растительные клетки и клонирования генов затруднено из-
за ее больших размеров (до 250 тпн, тогда как для прокариот вектор
pBR322 имеет размеры всего 4,4 тпн).
Учеными были разработаны различные стратегии введения
чужеродных генов в состав T-ДНК, одна из которых, нашедшая широкое
применение, - создание бинарной векторной системы. В этом случае
конструируют два вектора, совместно взаимодействующие друг с другом,
один из которых содержит область T-ДНК, а другой - гены vir-области,
обеспечивающие все функции переноса T-ДНК в геном растительных
клеток. Трансгены, кодирующие хозяйственно ценные признаки,
встраивают в T-ДНК. Эта же область снабжается маркерными генами (для
отбора трансформированных растительных клеток), эукариотическим
промотором (узнаваемым растительными полимеразами, например 35S-
промотор вируса мозаики цветной капусты - CAMV) и уникальными
сайтами рестрикции (в которые встраиваются чужеродные фрагменты
ДНК) (рис. 53).

LB Промотор Селект Терм. посл. Промотор Трансген Терм.посл. RB

селект. . Ген селективного трансгена (Cry, трансгена
Гена (NPTII) гена (NOS, (35S) EPSPS, (NOS)
(35S) OCS) Bar)

Рисунок 53 -Типичная трансгенная вставка

180
 Причем, гены, подавляющие дифференцировку растительных клеток
и вызывающие развитие опухоли (онкогены), инактивируются или
вырезаются, вследствие чего рост трансформированных растений не
нарушается. Таким образом, плазмида и агробактерия начали работать на
получение трансгенных растений (рис. 54).

Рисунок 54 - Технология получения трансгенных растений

В последние годы для создания искусственных векторов

используется Ri-плазмида (от англ. root inducing - индуцирующая корни),
присутствующая в штаммах Agrobacterium rhizogenes. Ri-плазмиды
выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они являются естественными
безвредными векторами, т.е. после встраивания T-ДНК в хромосомную
ДНК растительных клеток в области заражения наблюдается усиленное
образование корешков ("бородатость"), из которых легче регенерировать
здоровые плодовитые растения, чем из недифференцированной ткани
опухоли.
Также применяют векторы, полученные на основе растительных
патогенов (вирусов, вироидов), которые характеризуются естественной
способностью к введению в клетку чужеродной ДНК. ДНК-содержащие
вирусы могут включать одноцепочечную (вирус золотистой мозаики
фасоли (ВЗМФ или вирус полосатости кукурузы); двухцепочечную ДНК
181
(вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном
растения семейства крестоцветные.
Перспективны векторы, полученные на основе мобильных
генетических элементов. Их еще называют подвижные элементы,
транспозируемые элементы, транспозоны. Транспозоны способны менять
свою локализацию в геномах после первичной интеграции в хромосому
растений перемещаться по геному путем встраивания и последующего
вырезания. Наиболее широко для растений используется система Ac/Ds
векторов.

Основные методы трансформации растительных клеток с

помощью Agrobacterium tumefaciens

Необходимым условием для инфекции Ti-плазмиды является

поранение растения. Поэтому агробактерии, содержащие рекомбинантные
плазмиды, наносят на срезанную часть растения (например, побег) или
осуществляют совместное культивирование (кокультивирование)
агробактерий и стерильного растительного материала (например,
сегментов междоузлий, листовых дисков, каллуса, протопластов) на
питательных средах в условиях in vitro (рис.55).

Рисунок 55 -Трансформация табака Niсotiana tabaсum штаммами

Agrobacterium tumefaciens

Однако, несмотря на эффективность агробактериальной

трансформации, круг хозяев агробактерий ограничен. Агробактерии
обладают способностью интегрировать свой генетический материал
преимущественно в клетки двудольных растений. Альтернативными
способами преодоления проблемы ограниченного круга растений,
чувствительных к трасформации, являются методы прямого переноса
чужеродной ДНК - микроинъекция, электропорация, бомбардировка

182
микропулями (один из самых эффективных методов для трансформации
однодольных растений) и др.
Для эффективной трансформации используют такие приемы как
векторы на основе Ti-плазмид и вирусов, бомбардировка микрочастицами,
микроинъекция и электропорация.
При бомбардировке микрочастицами золотые или вольфрамовые
частицы диаметром 0.4-1.2 мкм покрывают ДНК, осажденной хлоридом
кальция или полиэтиленгликолем, и выстреливают ими в клетки из
специального ружья, приводимого в действие порохом или сжатым
воздухом. Частицы пробивают клеточную стенку и мембраны клеток, но
клетки при этом не повреждаются. Попав в клетку, ДНК неизвестным
образом интегрируется в растительную ДНК (рис. 56).

Рисунок 56 - Основные методы трансформации растительных клеток: А-

кокультивирование клеток растений совместно с A. tumefaciens; В - бомбартировка с
помощью генной пушки.

183
 Перспективы использования трансгенных растений в сельском
хозяйстве

Первые трансгенные растения (растения табака со встроенными

генами из микроорганизмов) были получены в 1983 году, что открыло
необозримые перспективы для создания растений с улучшенными
свойствами путем переноса в них соответствующих генов из других видов.
Первые успешные полевые испытания трансгенных растений табака,
устойчивых к вирусной инфекции, были проведены в США уже в 1986
году. После прохождения всех необходимых тестов на токсичность,
аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты
появились в продаже в США в 1994 году. Это были томаты Flavr Savr с
замедленным созреванием, созданные фирмой "Calgen", А также
гербицидустойчивая соя компании "Monsanto". Уже через 1-2 года
биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически
измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса,
кабачков, хлопчатника, свеклы и др. В настоящее время трансгенные
формы получены у 120 видов растений.
Количество используемых в сельском хозяйстве трансгенных (или
генетически модифицированных = ГМ) растений идет по нарастающей.
Сейчас они возделываются в 30 странах мира, из них лидируют
США (63% общей площади), Аргентина (21%), Канада (6%), Бразилия
(4%), Китай (около 4%) и Южная Африка (около 1%). На эти 6 стран
приходится 99% всех посевных площадей трансгенных культур. ГМ -
растения выращивают также в Индии, Австралии, Испании, Румынии,
Болгарии, Германии, Мексике, Франции и др., всего в 18 странах,
заметную долю которых составляют развивающиеся страны. С каждым
годом площади, занятые в мире под ГМ - растениями, увеличиваются
примерно на 10%. В 1996 году трансгенные растения были высажены на
общей площади порядка 1,7 млн. га, в 2000 г. - 44,2 млн. га (что превышает
размеры такой страны как Великобритания), 2003г. - 67,7 млн. га (что
составляет половину посевных площадей России).
В США генетически модифицированные растения составляют сейчас
около 50% посевов кукурузы и сои и более 30-40% посевов хлопчатника.
На российском рынке разрешены для реализации трансгенные сорта
кукурузы, сои, хлопчатника, сахарной свеклы и картофеля.
В настоящее время генная инженерия, позволяющая направленно
получать новые сорта растений с заданными (нужными человеку)
хозяйственно ценными признаками и свойствами, является одним из
наиболее перспективных и нестандартных подходов для решения многих
задач сельского хозяйства. В то же время следует отметить, что их
успешное решение возможно лишь при сочетании метода генной
инженерии с традиционными методами генетики и селекции.

184
 Современные достижения и перспективы развития генной
инженерии

Принцип получения в промышленных условиях и масштабах

биологически активных белков генноинженерным способом сводится к
созданию рекомбинантного штамма бактерий, способного синтезировать
целевой продукт (гормон, антиген и т.д.), выращиванию в
производственных условиях рекомбинантного штамма; выделению из
биомассы рекомбинантного штамма целевого продукта, его очистке,
концентрированию и приданию ему лекарственной формы.
С помощью генной инженерии получены сотни и тысячи
рекомбинантных штаммов бактерий и вирусов, способных синтезировать
продукты (белки) генов, встроенных в их геномы.
Таким образом уже получены штаммы рекомбинантных бактерий и
вирусов (кишечная палочка, псевдомонады, дрожжи, вирусы), способных
синтезировать гормоны человека (инсулин, гормон роста), антигены
вирусов гепатита В, вируса иммунодефицита человека, возбудителей
малярии, коклюша, бешенства, кори, сифилиса и др.; ферменты (липазы,
протеазы), иммуно-модуляторы (интерфероны, интерлейкины, пептиды
тимуса, костного мозга, фактор некроза опухоли), белки крови (альбумин,
комплемент, антикоагулянты, тромболитики), рецепторы клеток,
регуляторные пептиды, управляющие нервной, иммунной и другими
системами.
Для медицины биотехнологическая промышленность производит
антибиотики, витамины, ферменты, аминокислоты, гормоны, вакцины,
антитела, компоненты крови, иммуномодуляторы, адаптогены, диагнос-
тические препараты, алкалоиды, пищевые белки, нуклеиновые кислоты,
липиды, антиметаболиты, антиоксиданты, противоопухолевые, противо-
глистные препараты и др.
В сельском хозяйстве получены трансгенные растения, устойчивые к
действию гербицидов, патогенных грибов, вредных насекомых,
обладающие способностью к ускоренному росту, продолжительному
хранению, характеризирующиеся высокой урожайностью и качеством. В
частности получены трансгенные растения, устойчивые к действию
гербицидов - глифосфату, производным хлорсульфанов и имидазолинов,
фосфинотропину, даламону и др.
Трансгеноз гена бактерии Bacillus thringiensis, продуцирующего
белок, токсичный для многих насекомых, но безвредный для
млекопитающих,вгеном растений, приводит к тому, что насекомые
избегают их.
Таким же способом в США (1993 г.) были получены сорта хлопка,
кукурузы, картофеля, устойчивые к колорадскому жуку.

185
 В 1995 г. в США был выведен и выращивается трансгенный рапс с
измененным составом растительного масла, используемого в том числе для
производства стирального порошка, шампуней, косметики.
В настоящее время проводятся эксперименты по получению
трансгенных растений, накапливающих целлюлозу, крахмал,
фитогормоны, устойчивых к вредителям, засухе, низкой температуре,
синтезирующих вакцины, антитела.
У животных проводятся эксперименты по получению трансгенных
животных, обладающих устойчивостью к болезням, ускоренным ростом,
плодовитостью и т.д.
У человека начаты экспериментальные исследования по
генотерапии. В литературе имеются единичные сообщения об успешном
применении генотерапии.
В США ребенку, страдающему тяжелым комбинированным
иммунодефицитом, связанным с дефектом гена, кодирующего фермент
аденозиндеза-миназу, ввели копии нормального гена в Т-лимфоциты при
помощи ретровирусного вектора.
Эксперименты ведутся по генотерапии болезней накопления
(лизосомные болезни).
В литературе сообщается о возможности лечения генотерапией
около 10 болезней, и синтезе более 200 диагностических препаратов.
Вместе с тем, необходимым учитывать и негативные аспекты генно-
инженерной технологии.
Риски при выращивании генетически модифицированных продуктов
и употреблении их в пищу.
Выращивание и употребление в пищу генетически
модифицированных продуктов (ГМП) сопровождается несколькими
рисками. Экологи опасаются, что генетически измененные формы могут
случайно проникнуть в дикую природу, что приведет к катастрофическим
изменениям в экосистемах.
Например, при перекрестном опылении сорняки могут получить от
ГМП ген устойчивости к вредителям и пестицидам. Тогда размножение
сорняков будет неконтролируемым. Саморегуляция в экосистемах
нарушится. Сорняки вытеснят многие виды, неспособные к конкурентной
борьбе с ними, и займут огромные территории, которые будут постоянно
расширяться. Насекомые, питающиеся или опыляющиеся ГМП, получают
аномальные для данного вида гены, что может привести к самым
непредсказуемым последствиям. Помимо всего этого в природе могут
появиться более патогенные вирусы и штаммы микроорганизмов.
Кроме экологических рисков, связанных с проблемами выращивания
ГМП, существуют пищевые риски. Употребление трансгенного продукта,
полученного пересадкой гена бразильского ореха в ДНК сои, вызвало у
многих людей аллергические реакции на чужеродный белок. Сорта
растений, устойчивые к пестицидам (например, ГМ соя и кукуруза), могут
186
накапливать вредные вещества, а также их метаболиты, и вызывать
отравление при употреблении в пищу.
При употреблении ГМП в пищу может происходить горизонтальный
перенос трансгенных конструкций в геном симбионтных человеку
микроорганизмов. Бактерии микрофлоры кишечника могут получить ген
устойчивости к антибиотикам. В этом случае лечение человека окажется
затруднительным или невозможным.

Контрольные вопросы

1. В чем заключается сущность и задачи генетической инженерии

растений.
2. Ферменты, используемые в генетической инженерии.
3. Какие существуют методы выделения и клонирования генов.
4. Что такое вектор? Что используется в качестве вектора?
5. Какие векторы чаще используются для клонирования генов
животных и способы их введения в клетки животных?
6. Перечислите методы прямого переноса генов.
7. Какова роль генетической инженерии в селекции животных и
растений.
8. Как осуществляется ферментативный синтез ДНК?
9. Для чего используют т-ДНК – Тi-плазмиды?
10. Какие существуют методы трансформации растительных клеток?
11. Как осуществляется скрининг (отбор) трансформированных
клеток растений?
12. Какова разница между традиционными и современными
методами изменения пород животных и сортов растений?

ТЕМА 15
БИОТЕХНОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ

Экологическая биотехнология – это новейший подход к охране и

сохранению окружающей среды при совместном использовании
достижений биохимии, микробиологии, генетической инженерии и
химических технологий.
Экологическая биотехнология базируется на специальном
применении биотехнологии для решения проблем окружающей среды,
куда входят: борьба с загрязнениями, переработка различных отходов,
соединение биологических методов очистки с химическими и физико-
химическими технологиями, а также создание альтернативных,
«дружественных природе» способов получения пищи, энергии,
минерального сырья и пр.

187
 В связи с ростом городов и развитием промышленности возникли
серьезное экологические проблемы: загрязнение водоемов, накопление
ядовитых веществ, в том числе канцерогенных, бытового мусора и
отходов, загрязнение воздуха. Однако многие из созданных человеком
низкомолекулярных соединений (ядохимикаты, детергенты) и
высокомолекулярных полимеров оказались устойчивыми и не разлагаются
микроорганизмы, т.е. требуется разработка более усовершенствованных
технологий.

Биотехнологические методы очистки сточных вод

Развитие промышленности и рост населения обычно

сопровождаются образованием большого количества отходов, многие из
которых вызывают сильное загрязнение окружающей среды при
накоплении их в экосистеме. Очистка сточных вод – это система методов,
вызывающих разрушение или удаление из них присутствующих веществ, а
также патогенных микроорганизмов. В сельской местности утилизация
отходов ведется веками с получением ценных удобрений и биогаза.
Однако необходимо помнить, что отходы могут быть источником болезней
человека и животных из-за содержания в них патогенных
микроорганизмов. В процессах естественного самоочищения водоемов в
большинстве случаев поступающие со стоками вещества подвергаются
разрушению. В ходе этого процесса структура, свойства и концентрации
веществ изменяются во времени и пространстве. В результате вода
приобретает исходные свойства. Таким образом, водоемы играют роль
природного очистного сооружения. Однако к настоящему времени
разработаны эффективные методы сбора и утилизации отходов,
позволяющие избежать попадания их в водоемы и почву. Внедрение этих
методов в практику в прошлом веке позволило значительно улучшить
условия жизни людей в развитых странах.
Источники образования сточных вод:
Сточные воды подразделяются на бытовые, промышленные
(производственные) и атмосферные (дождевые).
Бытовые сточные воды образуются в результате хозяйственно-
бытовой деятельности человека.
Промышленные сточные воды образуются на производственных
предприятиях, их состав разнообразен и зависит от профиля производства
(нефтеперерабатывающей, химической, целлюлозно-бумажной,
металлургической, текстильной и других отраслей промышленности.)
Атмосферные сточные воды – образуются на поверхности проездов,
площадей и крыш зданий при выпадении осадков. К этой категории
относятся дождевые и талые стоки, а также воды от поливки улиц
(поливомоечные). В атмосферных водах наблюдается высокая

188
концентрация кварцевого песка, глинистых частиц, мусора и
нефтепродуктов, смываемых с улиц города.

Основные группы загрязнений сточных вод:

Минеральные загрязнения. К ним относятся: песок, глинистые
частицы, частицы руды, шлака, растворимые неорганические соли,
кислоты щелочи.
Органические загрязнения. Могут быть разделены на загрязнения
растительного происхождения, в которых преобладает химический
элемент углерод (остатки овощей, плодов и т.д.) и животного
происхождения, в которых преобладает азот (физиологические выделения,
остатки живых тканей и т.д.).
В бытовых стоках содержится примерно 60% загрязнений
органического происхождения и 40% минерального. Органические
загрязнения являются благоприятной средой для развития
микроорганизмов, поэтому в стоках содержится еще один, третий вид
загрязнений:
Биологические загрязнения. К этой категории относятся бактерии,
дрожжевые и плесневелые грибки, яйца гельминтов и вирусы.
Тысячелетиями отходы деятельности человека перерабатывались
естественным путем, при участии соответствующих микроорганизмов. В
наиболее широко распространенных установках для очистки сточных вод
выполняются четыре основные операции:
1. механическая очистка сточных вод – первая стадия очистки,
которая удаляет твердые примеси и крупнодисперсные вещества. При
первичной обработке удаляются твердые частицы, которые либо
отбрасываются, либо направляются в биореактор.
2. На втором этапе происходит разрушение растворенных
органических веществ при участии природных аэробных
микроорганизмов. Образующийся ил, состоящий главным образом из
микробных клеток, либо удаляется, либо перекачивается в реактор.
3. На третьем этапе (необязательном) производится химическое
осаждение и разделение фосфора и азота.
4. Для переработки ила, образующегося на первом и втором этапах,
обычно используется процесс анаэробного разложения. При этом
уменьшается объем осадка и количество патогенов, устраняется запах, а
кроме того, образуется ценное органическое топливо – метан.
Сходные процессы применяются при переработке промышленных
сточных вод, особенно в химической, пищевой, целлюлозно-бумажной
промышленности. Поэтому любые биотехнологические
усовершенствования этих процессов находят немедленное применение в
промышленности.
Такие усовершенствования могут быть направлены на увеличение
мощности перерабатывающих установок, повышение выхода полезных
189
побочных продуктов, на замену обычно применяемых синтетических
химических добавок, устранение запаха и удаление металлов, а также не
поддающихся переработке соединений.
Биологическая очистка сточных вод – очищение сточных вод
аэробными и анаэробными микроорганизмами, результатом является
окисление и уменьшение органической составляющей сточных вод.
Аэробная переработка сточных вод – это самая обширная область
контролируемого использования микроорганизмов в биотехнологии.
Отличительной особенностью аэробной биологической системы является
свободный доступ воздуха к аэробным микроорганизмам, участвующим в
превращении различных веществ, содержащихся в отходах, в
относительно стабильные продукты.
Аэробная переработка включает следующие стадии:
1. Адсорбция субстрата на клеточной поверхности;
2. Расщепление адсорбированного субстрата внеклеточными
ферментами;
3. Поглощение растворенных веществ клетками;
4. Рост и эндогенное дыхание;
5. Высвобождение экскретируемых продуктов;
6. «Выедание» первичной популяции организмов вторичными
потребителями.
В идеале это должно приводить к полной минерализации отходов до
простых солей, газов и воды. Эффективность переработки
пропорциональна количеству биомассы и времени контактирования ее с
отходами.
Системы аэробной переработки можно разделить на системы с
перколяционными фильтрами и системы с использованием активного ила.
Перколяционный фильтр был самой первой системой, примененной
для биологической переработки отходов, причем его конструкция
фактически не изменилась со времени создания в 1890 г. Эта система
используется в 70% очистных сооружений Европы и Америки и обладает
рядом преимуществ, которые состоят в простоте, надежности, малых
эксплуатационных расходах, образовании небольших излишков биомассы
и возможности длительного использования установки (в течение 30-50
лет).
Фильтрующими элементами в фильтрах являются гравий или
пластмассы. Использование пластмасс позволяет применять такие системы
для переработки некоторых промышленных стоков высокой концентрации.
Другим важным преимуществом является то, что пластмассы – легкий
материал, и это позволяет строить высокие, не занимающие много места
очистные сооружения. Для создания оптимальной поверхностной
площади, вентиляции и пористости пластмассы размалывают.
Основное изменение в конструкцию очистных сооружений было
внесено в 1973 году (в Англии), когда был создан вращающийся
190
биологический реактор (рис. 57). Сточные воды пропускаются через слой
крупнозернистого материала, покрытого тонкой бактериальной пленкой, в
которой интенсивно протекают процессы биологического окисления
органических веществ.

Рисунок 57 - Вращающийся биофильтр

Основной недостаток перколяционного фильтра – избыточный рост

на нем микроорганизмов; это ухудшает вентиляцию, ограничивает
протекание жидкости и приводит в конечном счете к засорению фильтра и
выходу его из строя.
Активный ил. Переработка отходов с помощью активного ила,
осуществляемая сложной смесью микроорганизмов, была предложена в
1914 г. Этот процесс более эффективен, чем фильтрация, и позволяет
перерабатывать сточные воды в количестве, в десять раз превышающем
объем реактора. Очистка сточных вод происходит в аэротенке с помощью
активного ила, состоящего из бактерий и микроскопических животных
(рис. 58).

Рисунок 58 - Аэротенк
191
 Аэротенки представляют собой достаточно глубокие (от 3 до 6 м)
резервуары, снабженные устройствами для аэрации. Здесь обитают
колонии МО (на хлопьевидных структурах активного ила), расщепляющие
органические вещества.
Однако он обладает рядом недостатков: более высокими
эксплуатационными расходами из-за необходимости перемешивания и
аэрации; большими трудностями в осуществлении и поддержании
процесса; образованием большого избытка биомассы.
Несмотря на все это, процесс, использующий активный ил, остается
наиболее распространенным методом переработки сточных вод в
густонаселенных районах, поскольку требует меньших площадей, чем
эквивалентная фильтрационная система.
Анаэробные методы очистки сточных вод. Все возрастающая
стоимость переработки отходов с помощью аэробного разложения и
энергетический кризис, с одной стороны, и новые достижения
микробиологии и технологии – с другой, возродили интерес к анаэробной
переработке.
Анаэробные способы очистки применяются для сбраживания
высококонцентрированных стоков и осадков, содержащих большое
количество органических веществ. Процессы брожения осуществляются в
специальных аппаратах – метантенках (рис.59).

Рисунок 59 - Метантенк Biomar

Процесс брожения состоит из двух стадий - кислой и метановой.

Каждая из этих стадий осуществляется определенной группой
микроорганизмов: кислая - органотрофами, метановая - литотрофами. Обе
эти группы присутствуют в метантенке одновременно, поэтому кислото- и
газообразование протекает параллельно.

192
 Видовой состав микрофлоры представлен примерно 50 видами
бактерий, которые осуществляют стадию кислотообразования.
Среди них присутствуют представители бацилл (Bacillus cereus, B.
megaterium, B. subtilis), псевдомонад (Pseudomonas aeraginosa). Конечными
продуктами этой стадии брожения являются низшие жирные кислоты,
диоксид углерода, ионы аммония, сероводород. Образовавшиеся на первой
стадии продукты брожения подвергаются дальнейшим превращениям, в
результате которых образуются метан и диоксид углерода. Основная роль
во второй стадии брожения принадлежит метанобразующим бактериям,
которые относятся к строгим анаэробам (Methаnococcus, Methanosarcina,
Methanobacterium). Процесс образования метана необходим этим
бактериям для получения энергии.
В результате жизнедеятельности микрофлоры метантенка
происходит снижение концентрации органических загрязнений в отходах
или сточных водах с одновременным образованием биогаза. В состав
биогаза входит метан (50-85 %) и диоксид углерода (15-50 %). Процентное
соотношение компонентов биогаза во многом определяется исходным
составом сбраживаемой среды.
Существенную роль при проведении метанового брожения играет
температурный режим: различают мезофильный (30-35оС) и
термофильный (50-60оС) режимы сбраживания. При более высоких
температурах скорость распада органических соединений увеличивается,
следовательно, возрастает доза суточной загрузки в метантенк.
Стадии биометаногенеза:
1) Ферментативный гидролиз. Под действием экстрацеллюлярных
ферментов гидролизу подвергаются сложные многоуглеродные
соединения – белки, липиды, полисахариды. Около 76% органических
веществ переходит в высшие жирные кислоты, до 20% - в ацетат и 4% в
водород.
2) Ацидогенез (кислотообразование). На этой стадии участвуют две
группы микроорганизмов: 1-ацетогенные (ферментируют моносахариды,
спирты и органиче-ские кислоты с образованием Н2 и СО2, низших
жирных кислот, в основном аце-тата, спиртов и некоторых других
низкомолекулярных соединений) и 2-гомоацетатные (усваивают Н2 и СО2,
образуют водород ). Образуется 52% ацетата и 24% водорода.
3) Метаногенез. Метаногенные бактерии образуют из ацетата 72%
метана, из Н2 и СО2 - 28% метана.
Активное использование метантенков при сбраживании
органических отходов является одним из перспективных путей
совместного решения экологичеких и энергетических проблем, который
позволяет, например, агропромышленным комплексам практически
полностью перейти на самостоятельное энергоснабжение.
Метанообразующие бактерии и некоторые другие микроорганизмы,
продуцирующие нужные этим бактериям субстраты, формируют в таких
193
условях систему прочных симбиотических отношений, которая может
функционировать неопределенно долгое время, если в нее в подходящем
количестве поступают все новые порции отходов.
Самая распространенная технология анаэробной переработки –
разложение ила сточных вод. Эта хорошо разработанная технология с
успехом используется с 1901 г. Однако здесь существует ряд проблем,
обусловленных малой скоростью роста облигатных анаэробных
метанообразующих бактерий, которые используются в данной системе. К
ним относятся также чувствительность к различным воздействиям и
неприспособленность к изменениям нагрузки. Конверсия субстрата также
происходит довольно медленно и поэтому обходится дорого.
Тем не менее, этот подход представляется перспективным с точки
зрения биотехнологии; например, можно добавить к отходам ферменты
для повышения эффективности процесса или попытаться усилить контроль
за переработкой путем изменения тех или иных биологических
параметров.
Анаэробная ферментация отходов или растительных культур,
специально выращиваемых для получения энергии, очень перспективна
для экономичного получения газообразного топлива при умеренных
температурах (30-350С).
Для получения энергии и полезных побочных продуктов можно
использовать самые разнообразные отходы и сырье. Некоторые страны,
например Бразилия, Австралия и Новая Зеландия используют специально
выращиваемые культуры в качестве источника топлива.
Сходные проекты обсуждаются и в некоторых европейских странах,
например в Финляндии, Швеции и Ирландии.
В Англии работа по биоконверсии энергии проводится в рамках
Программы по использованию солнечной энергии; за счет этой программы
финансируются и проекты ЕЭС по получению энергии биологическими
способами.
Множество подходов используется в США; например, одно очистное
сооружение за счет биологической конверсии бытового мусора позволяет
получать газ в количестве, достаточном для обеспечения им 12 тыс. домов.
Анаэробные ферментеры могут применяться также в целях
получения промежуточных продуктов для химической промышленности
(например, уксусной, молочной и акриловой кислот в качестве
химического сырья, идущего на переработку).

Перспективы биотехнологии в утилизация твердых отходов

Для переработки твердых городских отходов применяется

к о м п о с т и р о в а н и е , при котором под действием микроорганизмов
происходит разложение твердых органических материалов и образуется
стабилизированный продукт - к о м п о с т . Так как в этих отходах могут
194
содержаться патогенные микроорганизмы, компостирование должно
проходить через термофильную стадию. Процессы компостирования
можно проводить периодическим или непрерывным способами в
специальных аппаратах с аэрацией и перемешиванием компостируемой
массы. При непрерывном способе процесс разложения субстрата идет с
большей скоростью. Полученный при биологической переработке твердых
отходов компост может быть использован в качестве удобрения.
Разрабатываются специальные методы утилизации
трудноразлагаемых промышленных отходов. Выведены штаммы бактерий,
которые способны разлагать пластмассу, старые автомобильные шины и
др.
В настоящее время ведутся работы по подбору искусственных
ассоциаций микроорганизмов, способных усваивать нефть. Проблема
загрязнения водоемов и почв нефтью резко возросла из-за аварий, при
очистке емкостей и т.д. Распространение пленок нефти на поверхности
водоемов преграждает доступ кислорода в толщу воды, нарушая энерго-,
влаго- и теплообмен между океаном и атмосферой. Предполагается
вносить микроорганизмы в очаги загрязнений совместно с источниками
питания для этой микрофлоры.
Неприятно пахнущие загрязнения воздуха, образующиеся в
различных производствах, часто являются органическими соединениями и
могут удаляться с помощью биоочистки. Процессы эти могут быть
разделены на мокрые и сухие. В мокром реакторе противотоком движутся
жидкость (сточные воды) и загрязненный воздух. Неприятно пахнущие
компоненты переносятся из воздуха в жидкость, а затем окисляются
микрофлорой биопленки. В сухом реакторе находится биоактивный
сорбирующий материал (торф), и загрязненный воздух продувается через
этот слой.
Одна из перспективных отраслей биотехнологии – биоэнергетика, т.
е. получение энергии с помощью биологических процессов.
Для этой цели используется обычная биотехнологическая схема, но с
необычным конечным продуктом, который представляет собой
трансформированный энергетический эквивалент, аккумулирующий
большую часть энергии химических связей использованных органических
соединений. Основные направления биоэнергетики: биометаногенез и
производства спирта, повышение эффективности процесса фотосинтеза,
создание биотопливных элементов, получение фотоводорода,
биоэлектрокатализ.
В упрощенном виде этот процесс заключается в запасании энергии в
живых системах путем фотосинтеза и превращении биомассы в более
ценное топливо путем ее переработки. Учитывая все снижающееся
количество традиционных энергоносителей (уголь, нефть, газ), запасы,
которых на земле не безграничны, а также низкий коэффициент
эффективности сжигания топлива, при котором большая часть энергии
195
теряется, проблема поиска новых способов получения энергии является
ключевой для выживания земной цивилизации.
Первым этапом биотехнологического получения энергии является
накопление биомассы за счет солнечного света. Ежегодно на Землю
поступает 3·1024 Дж солнечной энергии, в то время как суммарный
энергетический эквивалент всех запасов угля, нефти, газа и урана в земной
коре составляет менее 1% этого количества. Считается, что для
удовлетворения всей мировой потребности в энергии 0,1 % поверхности
земли должны занимать коллекторы солнечного света с коэффициентом
полезного действия 10%. Среди множества проблем реализации этого
способа обеспечения энергией наиболее существенными являются
неравномерность и диффузность солнечной инсоляции. Но эти
ограничения перекрываются возможностями получения возобновляемого
сырья, в котором аккумулирована солнечная энергия в виде химических
связей органических соединений. Это сырье можно складировать и
транспортировать.
Главная трудность и до сих пор до конца не решенная
технологическая задача – это эффективное извлечение энергии,
содержащейся в биологическом сырье. До настоящего времени 60%
древесины используется в качестве топлива. При этом эффективность
использования биомассы в качестве топлива чрезвычайно мала (1–2 %)
вследствие большого содержания воды и высокой температуры сжигания,
что приводит к большим теплопотерям. Биологические процессы
протекают при низких температурах (25–650 С) и для них пригодно сырье с
высокой влажностью. Экономичное преобразование энергии химических
связей органических соединений в тепловую энергию проводится в
биореакторах.
В биореакторах используются сахарный тростник, древесина,
сточные воды, навоз, бытовой мусор, отходы сельского хозяйства (солома
и меласса) и производства бумаги. Вид сырья зависит от конкретных
природно-экономических условий. Для большинства стран мира древесина
– слишком дорогое сырье, особенно для стран Азии и Африки, где
возникает дилемма: куда важнее использовать биомассу – на получение
энергии или на производство пищи. Однако в Бразилии найден способ
высокоэкономичного разведения эвкалиптов и получения из них
относительно дешевого растительного сырья и топлива. Следует отметить,
что древесное сырье из-за большого содержания в нем лигнина
(полифенол) трудно использовать для производства перспективных
жидких энергоносителей – спиртов, так как для этого требуются
относительно чистые растворы углеводов. В ряде стран в качестве
исходного сырья для получения топлива используются водоросли и
микроорганизмы, но чаще всего – лишенные лигнина ткани высших
растений, содержащие полисахариды.

196
 Таким образом, экологическая биотехнология обуславливается
возможностью решения проблемы окружающей среды, благодаря простоте
аппаратурного оформления и относительно невысокими
эксплуатационными расходами.

Контрольные вопросы
1. Какие вещества могут загрязнять почву и водоемы?
2. Перечислите основные этапы очистки сточных вод.
3. Как осуществляется механическая очистка сточных вод?
4. В чем сущность биологических методов очистки сточных вод?
5. Какие аэробные методы очистки сточных вод вам известны?
6. Что такое активный ил?
7. Как происходит очистка сточных вод в аэротенке?
8. Что такое биофильтр?
9. Каким образом проводят анаэробную очистку сточных вод?
10. Из каких микроорганизмов формируется микрофлора
метантенка?
11. Что такое компост?
12. Какие существуют способы очистки воздушных выбросов
промышленных предприятий?
13. Какие способы получения экологически чистой энергии Вы
знаете?

197
 ТЕСТЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ СТУДЕНТОВ

Вариант-1
1. Рост клеточной культуры растений:
А) Качественные изменения в структуре и функциональной
активности растения в процессе онтогенеза;
В) Необратимое увеличение размеров и массы клеток, тканей и
органов растения, связанное с новообразованием элементов их структур;
С) Образование новых структур в процессе необратимого
увеличения линейных размеров клеток, тканей, органов растения;
D) Приобретение клеткой состояния готовности к развитию по
определенному пути, сопровождающееся одновременным ограничением
возможностей развития в двух направлениях;
Е) Увеличение линейных размеров клеток и органов;
F) Количественные изменения линейных параметров клеток и
тканей, связанное с новообразованием элементов их структур.
2. Бактерицидное вещество:
А) Хлорамин;
В) Этилендиаминтетрауксусная кислота;
С) Зеатин;
D) Хлорамфеникол;
Е) Хлоралгидрат;
F) Пиридоксин.
3. Скорость роста каллусной ткани определяют при помощи
следующих показателей:
А) Увеличение объема каллуса;
В) Увеличение массы;
С) Увеличение плотности;
D) Изменение консистенции каллуса;
Е) Увеличение содержания воды;
F) Увеличение числа клеток.
4. Каллусная ткань появляется в результате процесса:
А) Дифференциации;
В) Эмбриогенеза;
С) Дедиффенциации специализированных клеток;
D) Органогенез;
Е) Геммогенез;
F) Деления неспециализированных клеток;
G) Дедифференциации.
5. Цитопласт:
А) Протопласт без ядра;
В) Растительная клетка, лишенная клеточной стенки;
С) Гетерокарион;

198
 D) Гибридная клетка, образовавшаяся после слияния двух и более
субпротопластов;
Е) Клетка, образовавшаяся в результате слияния цитопласта одной
клетки и ядра другой клетки.
6. Наиболее подходящей для получения протопластов фазой
роста клеток в суспензионной культуре является:
А) Логарифмическая фаза;
В) Линейная фаза;
С) Стационарная фаза;
D) log-фаза;
Е) Фаза ускорения роста;
F) Латентная фаза.
7. Фермент рестриктаза:
А) Расщепляет молекулы АТФ;
В) Расщепляет молекулы углеводов;
С) Расщепляет молекулы липидов;
D) Расщепляет молекулы нуклеиновой кислоты с образованием
«липких» и тупых концов;
Е) Распознает определенные сайты и «разрезает» молекулы ДНК;
F) Расщепляет молекулы ДНК.
8. Достижения биотехнологии животных применяются в:
А) Химической отрасли;
В) Космических исследованиях;
С) Экологии;
D) Медицине;
Е) Образовании;
F) Микробиологической промышленности.
9. К субклеточным структурам, применяемым в биотехнологии
растений в качестве биообъектов, относятся:
А) Клетки грибов;
В) Плазмиды;
С) Микромолекулы;
D) Дрожжи;
Е) Клетки животных;
F) Бактерии;
G) Ядерная ДНК.
10. Отметьте название питательных сред, применяемых для
культивирования клеток растений:
А) Питательная среда Игла;
В) Питательная среда Гамборга-Эвелега В5;
С) Питательная среда ВМ;
D) Питательная среда Эрлиха;
Е) Питательная среда Мурасиге-Скуга;
F) Питательная среда Дюльбека;
199
 G) Питательная среда Уайта.
11. Типы дифференециации клеток:
А) Плюропотентность;
В) Мультипотентность;
С) Монопотентность;
D) Гетеропотентность;
Е) Суперпотентность;
F) Гипопотентность.
12. Способы получения спермы при уретральном методе:
А) Влагалищный;
В) С использованием искусственной вагины;
С) Губочный;
D) Метод электроэякуляции;
Е) Метод электропарации.
13. С использованием мышей созданы модели для изучения
следующих генетических болезней:
А) Гемофилия;
В) Шизофрения;
С) Онкологические заболевания;
D) Болезнь Альцгеймера;
Е) Синдром Патау;
F) Синдром Дауна.

14. Цели получения трансгенных животных:

А) Использование в качестве лабораторных животных;
В) Увеличение поголовья скота;
С) Получения БАВ медицинского и технологического назначения;
D) Исследование вторичного метаболизма;
Е) Получение альтернативных источников энергии;
F) Изучение природы ксенобиотиков.
15. Популярные ген-маркеры, используемые при трансформации
животных:
А) Ген устойчивости к канамицицину;
В) Ген ẞ-галактозидаза;
С) Thy-1-антигены;
D) Ген устойчивости к этиловому спирту;
Е) Ген тимидинкиназы.
16. При непрерывном культивировании микроорганизмов
необходимо:
А) культура не должна находится в физиологически активном
состоянии длительное время;
В) организовать вымывание культуры из системы;
С) сохранение культуры в физиологически активном состоянии в
течение краткого времени;
200
 D) создание условий для нарушения постоянной концентрации
клеток;
Е) сохранение культуры в физиологически активном состоянии в
течение длительного времени;
F) обеспечить постоянную концентрацию клеток;
G) предотвратить вымывание культуры из системы.
17. Технологические трудности, возникающие в периодическом
культивировании микроорганизмов:
А) постоянные технологические режимы;
В) затруднения контроля и регулирования процесса;
С) сменные технологические режимы;
D) линейный ход операций;
Е) постоянный контроль и регулирование процесса;
F) полный контроль и регулирование процессов;
G) циклический ход операций.
18. Генноинженерный препарат соматотропин, полученный с
помощью геномодифицированного штамма Е.coli, имеет
преимущества:
А) гетерогенен;
В) гомогенен;
С) не содержит патогенных микроорганизмов;
D) не содержит ферментов;
Е) не содержит токсинов;
F) синтезируется в небольших количествах.

19. Различают несколько модификаций периодических способов

культивирования:
А) культивирование с центрифугированием;
В) турбидостатное культивирование;
С) хемостатное культивирование;
D) периодическое культивирование с добавлением кислоты для
подкисления среды;
Е) культивирование с диализом;
F) отъемно-доливочное культивирование;
G) периодическое культивирование с подпиткой.
20. Прототрофами называются организмы:
А) требующие специальных питательных веществ;
В) питающиеся органическими веществами;
С) питающиеся неорганическими веществами;
D) не требующие специальных питательных веществ;
Е) растущие на простых питательных средах;
F) способные сами синтезировать необходимые для роста и развития
вещества.

201
 21. Генетическая нестабильность культивируемой in vitro
растительной клетки является следствием:
А) следствием нарушения коррелятивных связей при вычленении
экспланта;
В) следствием их чувствительности к кислотности среды;
С) следствием влияния фитогормонов;
D) следствием витрификации;
Е) гетерогенность клеток исходного экспланта.
22. Гетерокарион:
А) соматическая гибридная клетка с ядрами двух видов;
В) клетка, содержащая генетически разнокачественные
митохондрии;
С) гибридная клетка, содержащая ядра двух видов;
D) клетка, содержащая хлоропласты одного биологического вида и
ядро другого вида;
Е) гибридная клетка, в которой не произошло слияния ядер двух
видов.
23. Устойчивые к ионному стрессу клеточные линии в условиях
in vitro получают следующим способом:
А) с помощью серологического анализа;
В) гибридологическим анализом;
С) прямой селекцией устойчивых клеток на средах с токсичными
концентрациями солей;
D) непрямой селекцией устойчивых клеток на средах с токсичными
концентрациями солей;
Е) тотальной селекцией устойчивых клеток.

24. Сомаклональные варианты:

А) растения-регенеранты, являющиеся генетической копией
растения-донора экспланта;
В) растения, полученные методом генетической инженерии;
С) растения, возникающие при традиционном вегетативном
размножении;
D) растения фенотипически различающиеся друг от друга вследствие
проявления генетической изменчивости;
Е) соматические гибриды, полученные в результате длительного
культивирования и отклоняющиеся от родительских форм.
25. Производство антибиотиков осуществляется в несколько
стадий:
А) на постферментационной стадии получают инокулят из музейной
культуры и готовят питательную среду;
В) в ходе ферментационной стадии осуществляется выделение и
очистка антибиотика;

202
 С) в ходе постферментационной стадии осуществляется выделение и
очистка антибиотика;
D) на ферментационной стадии получают инокулят из музейной
культуры и готовят питательную среду;
Е) в процессе предферментации происходит накопление биомассы,
после активный синтез антибиотиков;
F) на предферментационной стадии получают инокулят из музейной
культуры и готовят питательную среду;
G) в ходе предферментационной стадии осуществляется выделение и
очистка антибиотика.
Вариант-2
1. Аппарат для глубинного культивирования микроорганизмов:
А) Миксер
B) Шейкер
C) Метанотенк
D) Барботер
E) Ферментер
F) Биореактор
G) Качалка
2. Вторичные метаболиты – целевые продукты биосинтеза:
А) Биомасса
B) Токсины
C) Нуклеотиды
D) Органические кислоты
E) Антибиотики
F) Ненасыщенные жирные кислоты
G) Гормоны
3. При поверхностной ферментации:
А) Биообъект растет в толще питательной среды
B) Работает барботер
C) Отсутствует массообмен
D) Биообъект растет только на поверхности питательной среды
E) Происходит интенсивный массообмен
F) Работают мешалки
G) Применяют пеногасители
4. Из большого многообразия центрифужных процессов, в
микробиологическом производстве используют:
А) Отстаивание суспензий
B) Отстаивание эмульсий
C) Сепарация культуральной жидкости
D) Отстаивание культуральной жидкости
E) Фильтрование эмульсий
F) Сепарация эмульсий
5. Дедифференцировка растительной ткани ведет к:
203
 А) Вставка вирусного генома
B) Превратится в животные клетки
C) Развитию каллусной клетки, заканчивающийся ее старением и
отмиранием
D) Может произойти оплодотворение
E) Утрате клеткой способности к дифференцировке и регенерации
растения
F) Превратится в бактериальные клетки
6. Растения – регенеранты, полученные способами
микроклонального размножения можно:
А) Размножать на голодном агаре
B) Стерилизовать дезинфицирующими растворами
C) Черенковать в стерильных условиях
D) Пересадить на растение - донор
E) Хранить в холодильнике
F) Увеличивать количество, поливая водой
7. На синтез вторичных метаболитов растений влияют:
А) Вирусы
B) Состав питательной среды и концентрация ее компонентов
C) Посторонний шум
D) Генотип растения - донора
E) Природа и количество углеводов
8. По классификации Р. Г. Бутенко структурная организация
каллусной ткани делится на:
А) С хорошо выраженными меристиматическими очагами
B) Вирусные клетки
C) С зонами редуцирования камбия и проводящей системы
D) Бактериальные клетки
E) Клетки без ядер
F) Мелкие безъядерные ткани

9. Мембранные методы предварительной обработки

культуральной жидкости:
А) Микрофильтрация
B) Обработка протеазами
C) Обработка ПАВами
D) Центрифугирование
E) Обработка ультразвуком
F) Осаждение
10. Специфичные технологии извлечения растворенных
веществ, основанные на химических или физико–химических
свойствах продукта:
А) Экстракция
B) Фильтрация
204
 C) Микрофильтрация
D) Ультрафильтрация
E) Центрифугирование
F) Адсорбция
G) Ионный обмен
11. Методы выделения и концентрирования продуктов
микробиологического синтеза, находящихся в растворе:
А) Адсорбция
B) Ионный обмен
C) Центрифугирование
D) Фильтрование
E) Экстракция
12. В тубулярном биореакторе процесс ферментации
осуществляется в длинной трубе, в которой:
А) Питательные компоненты вносятся только перед ферментацией
B) Сток культуры происходит в конце ферментации
C) Инокулят вносится только перед ферментацией
D) С другого конца непрерывно вытекает культуральная жидкость
E) Культуральная жидкость отбирается после полного окончания
ферментации
13. Ферментер с подводом энергии жидкой фазой:
А) Трубчатый
B) Струйный с затопленной струей
C) Газлифтный
D) Барботажный колонный
E) Барботажно-эрлифтный
F) Барботажный
14. Для сбора образуемого биогаза метановые установки
снабжены:
А) Газовым колпаком
B) Гиотором
C) Устройством переменного объема
D) Эжектором
E) Газожидкостным сепаратором
F) Гиотором
G) Барботером
15. Популярные ген-маркеры, используемые при трансформации
клеток животных:
А) Ген устойчивости к канамицину
B) Ген β-галактозидазы
C) Thy-1-антигены
D) Ген устойчивости к этиловому спирту
E) Ген тимидинканазы

205
 16. В зависимости от температурного режима тепловая
стерилизация подразделяется на:
А) Текучим паром
B) Активным паром
C) Паром под давлением (автоклавированием)
D) Переходящим паром
E) Горячей водой под давлением
F) Парами кислорода под давлением
17. Для получения биогаза применяют:
А) Метантенк
B) Отходы животноводческих комплексов
C) Отходы бумажной промышленности
D) Биофильтр
E) Анаэростат
F) Аэротенк
G) Денитрифицирующих бактерий
18. Промышленный процесс брожения при получении
топливного этилового спирта осуществляется по разным
технологическим схемам:
А) Полунепрерывно
B) Непрерыно с извлечением биомассы
C) Периодически
D) Непрерывно с добавлением биомассы
E) Периодически с возвратом биомассы
F) Трехступенчато
19. Роль Л. Пастера в промышленной микробиологии
заключается в том, что он сделал ряд крупнейших фундаментальных
открытий, которые заложили основы современной технической
микробиологии:
А) Доказал, что хемосинтез вызывается микроорганизмами
B) Разработал научные основы сыроварения, пивоварения,
производства ацетона и уксуса
C) Доказал, что брожение и гниение вызываются микроорганизмами
D) Доказал, что трансформация и гниение вызываются
микроорганизмами
E) Использованием микробных микробных ассоциаций в
биотехнологических производствах
20. Полиферативный комплекс это:
А) Комплекс клеток, который образуется из эмбриоидов
B) Комплекс клеток, из которого образуются протокормы
C) Комплекс клеток, из которого образуются семена
D) Комплекс клеток, из которого в дальнейшем образуются
эмбриоиды
E) Клеточный комплекс, дающий начало биполярному зародышу
206
 F) Комплекс клеток, из которого in vitro образуются зародыши
21. Клеточные линии, устойчивые к засолению отбирают
следующим образом:
А) Культивируя клетки на среде с повышенной концентрацией
карбонатных солей
B) Культивируя клетки на среде с низким содержанием солей
C) Культивируя клетки на среде с высоким содержанием бетаина
D) Культивируя клетки на среде с низким содержанием
криопротекторов
E) Культивируя клетки на бессолевой среде
F) Культивируя клетки на среде с высоким содержанием пролина
22. Цитогета:
А) Субпротопласт, в котором имеется только ядро
B) Клетка, содержащая пластиды одного и митохондрии другого
биологического вида
C) Клетка, в котором не произошло слияние ядер двух видов
D) Клетка, содержащая генетически разнокачественные
митохондрии
E) Клетка, содержащая ядра двух видов
F) Клетка, содержащая генетически разнородные пластиды
G) Цитоплазматическая гомозигота
23. Для имитации in vitro стрессового эффекта засухи
используется питательная среда
А) Среда, содержащая полиэтиленгликоль
B) Среда, содержащая осмотически активные вещества
C) Среда, содержащая целлюлозу
D) Среда, содержащая жирные кислоты
E) Среда, содержащая гликоген
F) Среда, содержащая пектиновые вещества
G) Среда, содержащая бетаин
24. Устойчивые к ионному стрессу растения в условиях in vitro
получают прямой селекцией устойчивых клеток так как:
А) Происходит увеличение интенсивности фотосинтеза
B) Происходит абсорбция ионов клетками флоэмы
C) Происходит подавление фотосинтеза
D) Многие ионы оказывают токсическое влияние на
физиологические процессы
E) Многие ионы оказывают токсическое влияние на биохимические
процессы
F) Происходит обмен между ионами между клетками ксилемы и
флоэмы
G) Происходит абсорбция ионов паренхимными клетками ксилемы
25. Для повышенного синтеза L-глутаминовой кислоты (α-
аминоглутаровая) требуется соблюдение условий:
207
А) Наличие рибофлавина в среде от 1 до 5 мг/л
B) Присутствие детергентов в среде
C) Высокая концентрация фосфора в среде
D) Наличие биотина в среде от 1 до 5 мг/л
E) Присутствие антибиотиков в среде
F) Высокая концентрация серы в среде

208
 ГЛОССАРИЙ

Антибиотики (от греч. anti – против, bios – жизнь) – вещества био-

логического происхождения или их модификации, обладающие высокой
физиологической активностью по отношению к определенным группам
микроорганизмов (бактериям, грибам, водорослям, протистам) либо к
тканям злокачественных опухолей, избирательно задерживая их рост или
полностью подавляя развитие.
Асептика – комплекс мероприятий, направленных на
предупреждение попадания в среду посторонней микрофлоры. А.
достигается стерилизацией питательных сред, оборудования,
инструментов, включает обработку ультрафиолетовым облучением и
химическими веществами, оказывающими бактерицидное или
бактериостатическое действие, инструментов, оборудования и помещений;
подачу стерильного воздуха в ферментеры и др.
Аэрация – процесс естественного или искусственного поступления
кислорода в какую-либо среду (воду, почву и т. д.).
Аэробы – организмы, развивающиеся в присутствии свободного кис-
лорода и использующие его в качестве конечного акцептора электронов в
окислительно-восстановительных реакциях.
Аэротенк – сооружение для биологической очистки сточных вод,
представляющее собой несколько проточных резервуаров, продуваемых
воздухом.
Ауксины – фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие рост
стеблей и корней, стимулирующие образование корней у проростков.
Бактерии (от греч. bakterion, уменьш. от bactron – трость, посох) –
группа микроскопических одноклеточных организмов, не имеющих
обособленного ядра, роль которого чаще всего выполняет единственная
хромосома.
Бактериофаги, фаги – вирусы, репродуцирующиеся в
бактериальных клетках.
Биоремедиация (от греч. bios – жизнь, лат. remedium – лекарство) –
использование биологических объектов для борьбы с загрязнением
окружающей среды. Наибольшее распространение в Б. получили
микроорганизмы, способные к деградации и ассимиляции различных
соединений, в том числе ксенобиотиков. Одним из способов Б. является
фиторемедиация, представляющая собой использование зеленых растений
для очистки вод, почв и атмосферного воздуха.
Биотехнология – технологическое использование биологических
явлений и процессов для получения полезных продуктов, товаров и услуг;
направление научной и практической деятельности человека, основанное
на использовании биологических объектов в промышленных целях.

209
 Биотрансформация – превращение исходных органических
соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью клеток
живых организмов или выделенных из них ферментов.
Биофильтр – устройство, содержащее фильтр из дробленого
пористого камня или шлака, на поверхности которого развивается сложная
по составу неподвижная биопленка из микроорганизмов, в том числе
грибов Penicillium, Aspergillus и Leptomitus, разлагающих растворенное
органическое вещество. Б. применяется для очистки сточных вод и
загрязненного воздуха.
Биогаз – смесь метана и двуокиси углерода, а также следов других
газов, таких как водород, азот, сероводород, и водяных паров, получаемая
из биомассы в анаэробных условиях.
Биогенные элементы – химические элементы, относящиеся к
группе макроэлементов и включающие C, H, N, O, P, S.
Биодеградация – процесс разрушения загрязняющих окружающую
среду веществ, образовавшихся в процессе деятельности людей,
преимущественно посредством микроорганизмов.
Биоконверсия – превращение метаболитов в структурно-
родственные соединения под действием микроорганизмов.
Биологически активные вещества (БАВ) – органические
соединения, оказывающие влияние на метаболизм и другие функции в
организме и обладающие высокой активностью и специфичностью.
Многие БАВ являются целевыми продуктами биотехнологического
производства.
Биомасса - клеточная масса, образующаяся в результате
жизнедеятельности живых организмов.
Биореактор, ферментер - устройство, в котором протекают
биохимические реакции при участии живых микроорганизмов, клеточных
экстрактов или ферментов. Часто этот термин относится к сосуду, в
котором растут микроорганизмы.
Брожение – метаболический процесс, осуществляемый
микроорганизмами, при котором образуется АТФ, а продукты
расщепления органического субстрата могут служить одновременно и
донорами и акцепторами водорода. Типы брожения различаются в
зависимости от того, какие конечные продукты преобладают (например,
спиртовое , уксуснокислое, молочнокислое, маслянокислое и т. д.).
Время генерации культуры, время удвоения культуры (t d) – время,
необходимое для удвоения количества клеток в экспоненциально растущей
популяции одноклеточных организмов.
Вторичный метаболит - вещество, не являющееся обязательным
для роста или функционирования клетки, но синтезирующееся в
стационарной фазе (обычно участвует в защите клеток или
микроорганизмов от тех или иных воздействий).

210
 Время генерации клетки – интервал времени между двумя
последовательными клеточными делениями.
Время удвоения популяции – интервал времени, за который число
клеток в популяциях увеличивается вдвое.
Генетически модифицированный организм (ГМО) – организм, в
геном которого с помощью методов генетической инженерии перенесен
фрагмент чужеродной ДНК.
Глубинное культивирование – выращивание микроорганизмов в
условиях, когда мицелий погружен в жидкую аэрируемую питательную
среду на весь период ферментации. Глубина погружения различна (0-10м)
и зависит от массообмена, вызываемого аэрацией, конструкции мешалки и
других факторов.
Дедифференциация – переход специализированных, неделящихся
клеток к образованию недифференцированных делящихся каллусных
клеток.
Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям
между дочерними клетками, а также между материнскими и дочерними
клетками.
Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее
их от других.
Инокулюм – часть клеточной суспензии, используемая для
переноса на свежую питательную среду.
Иммобилизация – ограничение подвижности молекул или клеток
посредством их связывания с каким-либо веществом. В биотехнологии
широко применяют разнообразные физические и химические методы И.
клеток и ферментов.
Каллус – ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации
клеток органов растений.
Клеточная линия - группа клеток, поддерживаемая в культуре
путем пересевов.
Клеточная инженерия – метод создания клеток нового типа путем
слияния клеток, протопластов, субклеточных структур, а также введения в
клетки чужеродных органелл, включающий культивирование клеток in
vitro. С помощью К. и. удается объединять геномы разных видов (даже
принадлежащих к различным царствам), напр. при образовании
искусственных ассоциаций растительных клеток с цианобактериями.
Клон - популяция клеток или молекул, идентичных одной
родоначальной клетке или молекуле.
Клонирование - совокупность процедур, использующихся для
получения клонов. Клонирование многоклеточных организмов, например,
включает пересадку ядер соматических клеток в оплодотворенное яйцо с
удаленным пронуклеусом.

211
 Клонирование животных – совокупность процедур, включающих
пересадку ядра соматической клетки клонируемого организма в
яйцеклетку другого организма с удаленным пронуклеусом.
Кривая роста бактериальной культуры – зависимость количества
клеток в популяции от времени культивирования.
Культура - популяция клеток или микроорганизмов, выращиваемых
в контролируемых условиях in vitro.
Культура клеток (суспензионная культура) — выращивание
отдельных клеток или небольших групп их во взвешенном состоянии в
жидкой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их
аэрацию и перемешивание.
Культура каллусных тканей – выращивание в длительной
пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток
изолированных сегментов разных органов или самих органов (пыльники,
семяпочки и т. д.) растений.
Культура эксплантов – инкубация в стерильных условиях на
питательных средах, либо вызывающих, либо не вызывающих
пролиферацию сегментов, изолированных из разных органов растений.
Культура тканей in vitro – выращивание в длительной
пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток
изолированных сегментов разных органов или самих органов растений.
Культуральная среда - твердая или жидкая среда, использующаяся
для выращивания микроорганизмов in vitro.
Линия — культура, возникшая из штамма путем селекции или
клонирования, имеющая маркерные признаки.
Метаболизм - совокупность физических и химических процессов,
протекающих в организме и обеспечивающих его существование.
Продукты метаболизма называются метаболитами.
Микроинъекция - введение в изолированную эукариотическую
клетку ДНК или других молекул с помощью тонкой иглы.
Микроорганизмы, микробы (от греч. micros – малый) –
микроскопически малые организмы (до 500 мкм), преимущественно
одноклеточные – бактерии, одноклеточные грибы, водоросли, простейшие,
клетки которых нельзя увидеть невооруженным глазом.
Морфогенез in vitro – процесс формообразования, то есть
заложения, роста и развития клеток (цитогенез), тканей (гистогенез) и
органов (органогенез) в культуре клеток и тканей in vitro.
Мутация – изменения в генетическом материале клеток путем
перестройки ДНК ядер и органелл, изменений в структуре хромосом или
уровне плоидности организма.
Объекты биотехнологии – бактерии, грибы (микро- и
макромицеты), водоросли, клетки (ткани) растений, животных, человека, а
также вирусы и выделенные из клеток ферменты, в том числе
иммобилизованные.
212
 Объекты биотехнологии базовые – микроорганизмы, безопасные
для человека, для которых имеется достаточная физиолого-биохимическая
и генетическая характеристика и опыт применения в биотехнологическом
производстве, поэтому они могут служить основой для разработки нового
биотехнологического процесса (см. GRAS), а также наиболее
используемые в биотехнологическом производстве линии клеток (напр.,
линии СНО, ВНК и др.).
Объекты биотехнологии модельные – микроорганизмы, которые
легко культивировать в лабораторных условиях, о которых накоплено
много научных данных (геном секвенирован, изучены процессы
метаболизма). К ним относятся E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces
cerevisiae.
Объекты биотехнологии промышленные – конкретные штаммы
микроорганизмов и линии клеток, с использованием которых налажено
крупномасштабное биотехнологическое.
Первичная культура - культура клеток или тканей, взятых
непосредственно от организма.
Первичная культура клеток – культура животных клеток,
полученная из ткани и выращиваемая in vitro до начала
субкультивирования, т. е. до первого пересева.
Популяция клеток — совокупность культивируемых клеток.
Прокариоты - организмы, у которых нет ограниченных мембранами
ядра и органелл. К прокариотам относятся все бактерии.
Протопласт - бактериальная, дрожжевая или растительная клетка,
стенка которой разрушена ферментативным или химическим путем.
Пролиферация – новообразование клеток и тканей путем
размножения уже существующих.
Периодическая (закрытая) система культивирования – система
культивирования микроорганизмов, в которой хотя бы один из
компонентов питательной среды или вся она не могут ни поступать в
систему, ни покидать её.
Поверхностное культивирование – выращивание микроорганизмов
на плотных неагаризованных средах (семенах злаковых растений, отрубях
и др.) или на стандартных агаризованных или жидких питательных средах.
При этом рост культуры происходит на поверхности питательной среды,
где и формируются колонии.
Рекомбинантная ДНК – молекула ДНК, созданная in vitro методами
генетической инженерии. Рекомбинантный белок – белок, кодируемый
клонированной рекомбинантной ДНК. На сегодняшний день осуществлено
молекулярное клонирование более 500 генов различных белков человека,
которые могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов.
Для ее получения используются как бактериальные системы экспрессии,
так и клетки эукариот.

213
 Рестриктазы, рестрикционные эндонуклеазы – ферменты,
специфически гидролизующие молекулы двухцепочечных ДНК в
определенных сайтах рестрикции. Первая Р. (EcoK) была выделена в 1968
г. М. Мезельсоном и Р. Юанем из бактерий штамма E. сoli К12. На
основании характера расщепления молекул ДНК и потребности фермента
в кофакторах Р. подразделяют на три класса. Основным инструментом
генетической инженерии являются Р. класса II. Ряд Р. этого класса
расщепляет молекулы ДНК с образованием выступающих
взаимокомплементарных одноцепочечных участков – «липких» концов
(напр., BamHI, PstI, EcoRI и др.). Другие Р. расщепляют молекулы ДНК
строго по оси симметрии узнаваемой последовательности, что приводит к
образованию фрагментов ДНК с «тупыми концами», не имеющими
выступающих одноцепочечных участков (напр., SmaI, HaeIII).
Регенерация – восстановление целостного организма из клетки,
ткани, органа.
Ростовой цикл — рост популяции клеток в цикле периодического
выращивания, характеризуется S-образной кривой. Фазы ростового цикла:
латентная, экспоненциальная, замедления роста, стационарная,
деградации.
Рост микроорганизмов – увеличение числа клеток
микроорганизмов путем бинарного деления или почкования. У некоторых
микроорганизмов увеличение их числа может происходить вследствие
почкования.
Стерилизация (от лат. sterilis – бесплодный) – система мероприятий,
направленных на полное уничтожение как вегетативных клеток, так и спор
микроорганизмов на поверхности и внутри стерилизуемого объекта.
Выделяют термическую С. и холодную С. Стерильность – отсутствие
микроорганизмов или других контаминирующих объектов в среде или
биологическом объекте.
Субкультивирование, пассирование – поддержание клеток в
культуре путем переноса части клеток в свежую питательную среду.
Субкультивирование животных клеток – перенос части монослойной
культуры клеток животных во второй культуральный сосуд после
диссоциации клеток монослоя трипсином, суспендирования в среде и
определения числа клеток; в случае суспензионной культуры – разведение
суспензии клеток свежей средой.
Стволовые клетки - митотически активные стволовые клетки, в
результате деления которых происходит замещение погибших клеток в
многоклеточном организме.
Субстрат - вещество, превращение которого катализируется
специфическим ферментом.
Технология рекомбинантных ДНК – совокупность
экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос
генетического материала из одного организма в другой.
214
 Тотипотентность – свойство клеток растений полностью
реализовать свою наследственную программу онтогенестического
развития при определенных условиях выращивания вплоть до образования
взрослых растений и семян.
Трансплант – часть каллусной ткани, используемая для переноса на
свежую питательную среду.
Трансгенные организмы — организмы, в наследственные
структуры которых искусственно введён хотя бы один активно
функционирующий ген от другого организма.
Ферментер, биореактор – аппарат для осуществления различного
рода ферментных реакций в стерильных условиях и при заданных
параметрах среды (температура, аэрация, состав среды и др.) при участии
микроорганизмов, культур клеток или изолированных ферментов. Ф.
представляет собой закрытый сосуд, изготовленный из термостойкого
боросиликатного стекла или металла, оборудованный устройствами для
измерения и регулирования температуры и рН среды, системой
перемешивания.
Ферменты иммобилизованные (от лат. immobilis – неподвижный)
– ферменты, молекулы которых связаны с матрицей или носителем (как
правило, полимером), сохраняя при этом полностью или частично свои
каталитические свойства. Выделяют физические методы иммобилизации
(без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем) и
химические методы иммобилизации, предполагающие образование таких
связей.
Фитогормоны – (гормоны растений) – биолигически активные
соединения, образующиеся в раститениях в малых количествах,
вызывающие специфический ростовой или формообразовательный
эффект.
Фильтрование – разделение твердой и жидкой фаз суспензии при
пропускании её через пористую перегородку.
Флокулянты – вещества, способствующие разрушению коллоидных
структур и образованию крупных хлопьев.
Целевой продукт – вещество, синтез которого осуществляется в
промышленных масштабах с помощью биотехнологических объектов. В
качестве Ц. п. можно рассматривать очищенные сточные воды с
территорий промышленных предприятий и населенных мест, а также
почву после биоремедиации.
Цикл выращивания – период от помещения инокулюма или
трансплантата в свежую среду до последующего субкультивирования.
Цитокинины – фитогормоны (кинетин, 6-БАП), активизирующие
развитие меристем, стимулирующие образование почек.
Ультрафильтрация – разделение клеток и молекул с
использованием мембран с диаметром пор от 0,001 до 0,1 мкм.

215
 Упаривание – процесс концентрирования жидких растворов путем
частичного удаления растворителя испарением при нагревании жидкости.
Хемостатная (открытая) система культивирования – это система
культивирования микроорганизмов, когда все питательные компоненты
могут поступать в реактор, в котором выращивается тот или иной
организм, и удаляться из реактора в виде продуктов синтеза
микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты и т.д.) или биомассы
самих микроорганизмов.
Центрифугирование – разделение неоднородных систем под
воздействием поля центробежных сил.
Цикл выращивания — период от помещения инокулюма или
трансплантата в свежую среду до последующего субкультивирования.
Штамм — культура, возникшая после первого субкультивирования.
Состоит из многих клеточных линий, возникших из клеток,
присутствующих в первичной культуре.
Эксплант – фрагмент ткани или органа, инкубируемый
самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.
Экстракция – процесс разделения смеси твердых и жидких веществ
с помощью избирательных растворителей (экстрагентов).
Электропорация – создание пор в бислойной липидной мембране
под действием электрического поля.
Энуклеированная яйцеклетка – яйцеклетка с удаленным ядром.
Эукариоты - организмы, у которых: 1) имеется ядро, где
содержатся хромосомы; 2) в цитоплазме присутствуют различные
органеллы — митохондрии, хлоропласты и т.д. К эукариотам относятся
животные, растения, грибы, некоторые водоросли.
In vitro – выращивание живого материала «в стекле», на
искусственных питательных средах, в асептических условиях.
In vivo – выращивание живого материала в естественных условиях.

216
 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Антипова, Л. В. Прикладная биотехнология: учеб. пособие / Л. В.
Антипова. – СПб.: ГИОРД, 2003. – 288 с. – ISBN 5-901065-58-1
2. Воронин, Е. С. Биотехнология: учебник / Е. С. Воронин. – М.:
ГИОРД, 2005. – 792 с. – ISBN: 5-98879-005-4.
3. Евтушенков, А. Н., Фомичев Ю. К. Введение в биотехнологию:
курс лекций.– Минск: БГУ, 2002. – 105 с.
4. Репин, В. С. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная
биология и медицина / В. С. Репин, А. А. Ржанинова, Д. А. Шаменков. –
М.: Реметэкс, 2002. – 176 с. – ISBN: 5-72130-306-9.
5. Инженерная энзимология / Березин И. В., Клесов А. А., Швядас
В. К. и др. – М.: Высшая школа, 1987. – 144 с.
6. Егорова, Т.А. Клунова С. М., Живухина Е. А. Основы
биотехнологии : учебное пособие для вузов. - М.: Академия, 3-е изд..
2006.-208 с.
7. Елинов, Н.П. Химическая микробиология: учебник для
студентов вузов, обучающихся по спец. "Биотехнология". - М. : Высшая
школа, 1989. - 448 с.
8. Виестур У. Э., Шмите И. А., Жилевич А. В. Биотехнология:
биотехнологические агенты, технология, аппаратура. – Рига: «Зинатне»,
1987. – 294 с.
9. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. – СПб: Изд-во СПб.
ун-та, 2003. – 228 с.
10. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. – М.: Мир, 2002. – 589 с. –
ISBN 5-03003-328-9.
11. Щелкунов, С. Н. Генетическая инженерия: учеб. пособие.–
Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, – 2-е изд., испр. и доп. 2004. – 496 с. –
ISBN 5-94087-098-8.
12. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. –
Новосибирск : Изд-во Новосиб. ун-та, 2002. – 458 с.
13. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. – СПб.: Изд-
во СПбГТУ, 1999. – 521с.
14. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология.– М.
:Высш. шк., 2003. – 469 с.
15. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. Биотехнология.
Микробиологическое производство биологически активных веществ и
препаратов.- М.: Высшая школа, 1987.- 142 с.
16. Бирюкова В.В. Основы промышленной биотехнологии:
Учебник для вузов.– М: «Колос» 2004.
17. Беккер М.Е. Введение в биотехнологию. – М.: Пищевая
промышленность 1978.
18. Дебабов В.Г., Ливщиц В.А. Современные методы создания
промышленных штаммов микроорганизмов. Биотехнология Т.2. М., 1987,
стр. 61-90.
217
 19. Кригер О. В., Гореликова Г. А. Основы биотехнологии: учебное
пособие. – Кемерово, 2009. – 116 с.
20. Варфоломеев С. Д., Панцхава Е. С. Биотехнология преобразо-
вания солнечной энергии. Современное состояние, проблемы, перспективы
// Биотехнология. – М.: Наука, 1984. – 282 с.
21. Экобиотехнология фототрофных микроорганизмов: Монография.
– Алматы: «Арыс», 2011. – 380 с.

218
 СОДЕРЖАНИЕ

Список применяемых в тексте сокращений……………………………….. 3

Введение ………………………………………………………………………… 4
Тема 1 Предмет биотехнологии, задачи, методы и перспективы
развития…………………………………………………………………………. 5
История биотехнологии (периоды развития)………………………………… 6
Тема 2 Объекты биотехнологии …………………………………………… 10
Основные методы биотехнологии…………………………………………….. 12
Технология микробиологического синтеза………………………………….. 13
Технология генетической инженерии………………………………………… 14
Технология клеточной инженерии……………………………………………. 16
Технология иммобилизованных ферментов………………………………….. 18
Тема 3 Типовая схема и основные стадии биотехнологических
производств…………………………………………………………………….. 20
Сырье для питательных сред…………………………………………………… 22
Приготовление питательных сред……………………………………………… 24
Получение посевного материала……………………………………………… 25
Способы культивирования микроорганизмов………………………………. 26
Тема 4 Аппараты и методы, используемые при культивировании
микроорганизмов и получении конечного продукта………..………….. 28
Классификация процессов культивирования (ферментации)………………. 28
Процессы культивирования на твердой поверхности………………………. 28
Процессы суспензионного или глубинного культивирования…………….. 30
Тубулярные процессы непрерывного культивирования…………………… 36
Классификация ферментеров…………………………………………………..
37
Стерилизация ферментера и сохранение асептики…………………………. 47
Термостатирование………………………………………………………………
49
Пеногашение……………………………………………………………………...
50
Контроль и управление процессами культивирования…………………….. 50
Тема 5 Аппаратура и методы выделения целевых продуктов
биотехнологии (биосинтеза)………………………………………………….. 53
Методы выделения и очистки целевых продуктов в процессе
культивирования микроорганизмов…………………………………………. 54
Общие принципы фракционирования экстрактов биологического сырья… 61
Концентрирование, обезвоживание, модификация и стабилизация продукта 63
Товарная форма продукта 67
Правила GMP, GLP, GAP 67
Тема 6 Промышленная биотехнология: производство микробного
белка……………………………………………………………………………. 68
Промышленное производство микробного белка…………………………… 69
Возможности использования белковых препаратов в производстве 72

219
пищевых продуктов…………………………………………………………….
Тема 7 Промышленная биотехнология: производство
аминокислот……………………………………………………………………. 73
Способы получения аминокислот……………………………………………… 73
Микробиологический способ производства аминокислот………………….. 75
Микробный синтез глутаминовой кислоты……………………………………. 78
Применение аминокислот………………………………………………………. 80
Тема 8 Промышленная биотехнология: производство органических
кислот ………………………………………………………………………….. 81
Получение лимонной кислоты………………………………………………….. 82
Получение молочной кислоты………………………………………………… 86
Получение уксусной кислоты…………………………………………………. 87
Тема 9 Промышленная биотехнология: производство
витаминов……………………………………………………………………… 89
Методы получения витаминов………………………………………………… 92
Получение витамина В2……………………………………………………....... 93
Получение каротиноидов……………………………………………………… 94
Синтез эргостерина……………………………………………………………. 94
Тема 10 Промышленная биотехнология: производство
антибиотиков………………………………………………………………….. 96
Общая характеристика антибиотиков……………………………………….. 96
Методы получения антибиотиков……………………………………………… 99
Схема промышленного биотехнологического производства антибиотиков 99
Применение антибиотиков……………………………………………………. 103
Тема 11 Промышленная биотехнология: производство ферментных
препаратов ………………………………………………………………….. 106
Номенклатура ферментных препаратов микробного происхождения……. 106
Характеристика активности ферментных препаратов………………………. 107
Получение ферментных препаратов из сырья растительного
происхождения…………………………………………………………………. 110
Получение ферментных препаратов из сырья животного происхождения… 110
Технология получения ферментных препаратов микробным синтезом….. 111
Выделение и очистка ферментов……………………………………………….
114
Применение ферментов ……………………………………………………….. 116
Тема 12 Инженерная энзимология ……………………………………….. 121
Методы иммобилизации ферментов………………………………………….. 124
Крупномасштабные производства с использованием иммобилизованных
ферментов………………………………………………………………………. 128
Тема 13 Клеточная инженерия ………………………………………………. 130
Предмет и методы клеточной инженерии……………………………………. 130
Культуры животных клеток……………………………………..................... 132
Питательные среды и условия культивирования……………………………. 135
220
Культуры клеток человека …………………………………………………… 136
Метод наработки моноклональных антител (МКА) в культуре клеток вне
организма………………………………………………………………………… 139
Области практического использования моноклональных антител…………
141
Методы получения клонированных животных………………………………143
Методы создания химер……………………………………………………….. 145
Биоэтика клеточной инженерии животных…………………………………..
146
Культура клеток растений……………………………………………………… 147
Клеточная реконструкция…………………………………………………….. 153
Значение клеточной инженерии………………………………………………. 154
Тема 14 Генетическая инженерия …………………………………………. 155
Методология генетической инженерии……………………………………… 155
Основные ферменты генетической инженерии………………………………
156
Этапы создания трансгенных организмов……………………………………157
Векторная трансформация……………………………………………………. 158
Секвенирование ДНК и экспрессия трансгенов………………………………
163
Регуляция экспрессии гена у прокариот………………………………………..
165
Генная инженерия микроорганизмов………………………………………….. 168
Перспективы использования трансгенных микроорганизмов……………….
169
Генная инженерия животных………………………………………………….. 171
Перспективы использования трансгенных животных……………………….
175
Генная инженерия растений……………………………………………………. 178
Перспективы использования трансгенных растений в сельском хозяйстве
184
Современные достижения и перспективы развития генной инженерии…….
185
Тема 15 Биотехнология и экология ………………………………………… 187
Биотехнологические методы очистки сточных вод…………………………..
188
Перспективы биотехнологии в утилизация твердых отходов………………..
194
Тесты для контроля знаний студентов ……………………………….. 198
Глоссарий ………………………………………………………………………. 209
Библиографический список …………………………………………………
217

221