Иммуноферментные

анализаторы

Лекция 3

Современные иммуноферментные
анализаторы
Измерение:
• Абсорбции
• Флуоресценции
• Люминесценции
фот
Измерение абсорбции
 Закон Ламберта–Бэра
(Beer –Lambert law)
clk
Io/I = 
Io - интенсивность света, падающего на кювету
I - интенсивность света, прошедшего через
кювету n молекул
с - концентрация
log (I0/I) = clk = A l

c – концентрация
l – толщина кюветы, см
k – молярный коэффициент экстинкции,
dm3mol-1cm-1
A - абсорбция или оптическая плотность (OD),
безразмерная величина
Планшеты для измерения абсорбции
Флуоресценция
 В соответствии с законами квантовой
механики, молекулы поглощают энергию в
виде квантов (фотонов)
 Поглощение фотона приводит к переходу
молекулы из невозбужденного состояния в
возбужденное состояние
 Поглощение энергии обусловлено структурой
молекулы (как правило, флуорофорами
являются молекулы, содержащие
ароматические группы)
Поглощение и освобождение энергии при
флуоресценции
Схематическое изображение физического
механизма люминесценции

Жирными горизонтальными линиями обозначены

энергетические состояния молекулы
люминесцирующего вещества; S0 — основное
(невозбужденное) состояние; S2, S2 и Т1 —
возбужденные состояния; тонкими
горизонтальными линиями обозначены
колебательные уровни. ВК — внутренняя
конверсия (переходы электрона без обращения
спина); ИК — интеркомбинационная конверсия
(переходы электрона с обращением спина). При
поглощении энергии молекула переходит в
возбужденное состояние S1 или S2 (обозначено
синими вертикальными стрелками). Часть
поглощенной энергии преобразуется в тепло
(обозначено волнистыми стрелками), при этом
молекула переходит на нижний колебательный
уровень состояния S1 или трансформируется в
состояние Т1 Возвращение молекулы из
состояния S1 или Т1 на исходный энергетический
уровень может сопровождаться излучением
света — флюоресценцией (обозначена темно-
зелеными стрелками) или фосфоресценцией
(обозначена светло-зелеными стрелками).
 Поглощение энергии, связанное с электронным
переходом ≈ 1 фемтосекунда (10-15 s)
 Время жизни молекулы в возбужденном состоянии
зависит от того, как молекула отдает избыточную
энергию
 Как правило, чем быстрее происходит
преобразование энергии, тем менее точно можно
определить ее значение
 Так, при большей длительности излучения энергии
наблюдается более узкий пик поглощения, и
наоборот, чем меньше время излучения, тем шире
пик поглощения
Между поглощением и испусканием происходят
промежуточные процессы, длительность которых
больше периода световой волны.
По длительности свечения:
• флуоресценция (быстро затухающая)
• фосфоресценция (длительная).
Фосфоресценция — запрещенный по спину
излучательный переход между двумя состояниями
разной мультиплетности. Например, излучательный
переход возбужденного триплетного состояния T 1 в
основное состояние S0. Синглет-триплетные переходы
имеют квантово-механический запрет, поэтому время
жизни возбужденного состояния при фосфоресценции
составляет порядка 10-3 – 10-2 с
Упрощенная диаграмма Jablonski

S’1

S1

hvex hvem
Energy

S0
 Флуоресценция

Чем больше длина волны, тем ниже энергия

Чем меньше длина волны, тем больше энергия

(солнечные ожоги – UV, но не красный свет)
Красное смещение (Stokes Shift)
– обусловлено разницей энергий поглощения и
эмиссии

Stokes Shift is 25 nm
Fluorescein
Fluorescnece Intensity

molecule
495 nm 520 nm

Wavelength
 Fluorescein (FITC)
Excitation Emission
300 nm 400 nm 500 nm
Wavelength
600 nm 700 nm

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

ity
In te n s
R e la tiv e

Protein
Спектры флюоресценции
 Правило Левшина
(Закон зеркальной симметрии)
 Параметры флуоресценции

 Коэффициент экстинкции
–  (применим к определенной длине волны, как правило,
определяют для максимума поглощения)
 Квантовый выход
– Qf - суммарное количество фотонов, испускаемых в
спектральном диапазоне флуорофора

photons emitted
Q=
photons absorbed

 Fluorescence Lifetime (

– Промежуток времени между поглощением и эмиссией
 Закон Вавилова
 Квантовый выход люминесценции не
зависит от длины волны возбуждения
Причина:

Молекула живет
Закон Вавилова дольше всего
на нижнем
подуровне
возбужденног
о состояния и
безизлучател
ьный переход
происходит
из этого
состояния
 Флуоресцентные красители

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Texas Red

Ethidium

PE

FITC

cis-Parinaric acid
 Allophycocyanin (APC)
Protein 632.5 nm

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Excitation Emisson
Схема простого флуориметра
Схема складного флуориметра

http://www.iss.com/image/applicationNotes/K2CH/LifeMeasBODIPYAlexa_fig1.png
 Типичная схема
измерителя флуоресценции

Свет возбуждения направляется в волновод через дихроичный делитель

светового луча. Этот делитель отражает свет возбуждения и пропускает
свет эмиссии. Практически полностью подавляется фоновый сигнал света
возбуждения, так как последний направляется от детектора.
 Флуоресценція

Переваги:
висока чутливість, яка може на 4 порядки
перевищувати чутливість фотометричних
методів. Це відбувається тому, що у фотометричних
методах для визначення невідомої концентрації
аналізованої речовини у зразку вимірюється різниця в
поглинанні між розчином, що містить нульову концентрацію
аналізованої речовини (% Т = 100) і аналізованих зразком.
У випадку сильно розбавлених зразків (для яких,
наприклад,% Т = 98), невеликі відхилення в процесі
вимірювання можуть призвести до великих відносним
помилок у результатах.
У разі флуориметрії, навпаки, здійснюється пряме
вимірювання флуоресценції зразка для визначення в
ньому невідомої концентрації аналізованої речовини.
 Флуоресценція

Недоліки
залежність від середовища:
 температури,
 рН,
 в’язкості
 Планшеты для измерения
флуоресценции и люминесценции
Люминесценция
 Измерение люминесценции

Фермент - люцифераза