СЛАЙД 1 НАКОПЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

При ПЦР на первом цикле с одной молекулы ДНК двуцепочечной

образовалось две двуцепочечной молекулы, на втором цикле из двух
двуцепочечных получается 4 двуцепочечных и т д, т. е в каждом цикле
количество молекул ДНК у нас удваивается в результате количеттво
ампликонов полученных за Н цикл можно врразить такой формулой
Например после 30 циклов мы получаем с одной молекулы ДНК млрд
новых молекул ДНК, т.е посути вот так вот работает наш чудесный ксерокс.
Слайд 2
В идеале это могло бы выглядеть вот так т. е каждый цикл все удваивается
удваивается к сожалению так не работает после определённого момента
реакция начинает тормозиться то есть уже происходит не удваивание а
увеличение в полтора раза сначала потом в один и два, в одини один раз
увеличивать и в какой-то момент реакция выходит на плато т.е сколько бы
мы дальше эту реакцию не держали 50, 60,80, 100 ничего больше в
пробирке не происходит реакции остановилась т. е больше ампликонов
мы не получим.
Слайд 3
Почему это проиходит? Ну причин очень много скорее всего нельзя
выделить какую-то одну ведущую, каждая из причин вносит свой вклад.
Слайд 4 Неспецефичекие продукты ПЦР
Первый тип неспецефичекких продуктов это праймер – димеры праймеры
гибридизуются друг на друга, то полимераза так же может их достроить и
у нас в результате образуются короткие молекулы они нам не сильно
страшны, но праймеры на них раходуются.
Следуюший тип неспец продуктов это шмеры это когда праймер
гибридизуется на какую то одну цепь но он не полнотью комплиментарен
при этом полимеризация идет только в одном направлении продукты
накапления при этом не удваиваются каждый цикл, а они накапливаются
как бы линейно т.е каждый цыкл у нас накапливается одна молекула это
так же отвликает праймеры идет расход и трифосфатов и накопление тех
же самых пирофосфатов это все мешает нашей основной реакции.
Ну и самый печальный случай это образование не спецефических
ампликонов, когда праймеры гибридизовались друг на против друга на
одну цепь на на другую цепь полимераза их достраивает и образуются
продукты не которые нас интересуют, а какие то другие, чем это ослжняет
реакцию это сильно снижает чувствительность и таким образом мешает
нам получить точный диагноз если нуклеиновых кислот в пробе мало,
кроме того наличие всяких таких неспецефических продуктов может
затруднять интерпритацию результатов т.е мы не можем чётко понять это
нужный нам продукт или это продукт какой-то неправильный.
Вероятность образования таких продуктов наиболее высока при низких
температурах.
Слайд 4 Протоколы ПЦР
СЛАЙД 5 Детекция продуктов ПЦР
И так мы в пробирке что-то наработали у нас там либо много ампликонов
либо мало нужны не нужны, мы не можем в пробирку просто глазами
посмотреть и увидеть нам нужно выявить эти ампликоны. Для этого также
существует очень много методов: электрофорез, секвенирование
определение последовательности, гибридизационный ИФА, анализ
кривых плавления, анализ по конечной точке или Flash и ПЦР в реальном
времени не будем останавливаться на всех этих методов их много,
рассмотрим основной который нас интересует это метод ПЦР в реальном
времени.
Слайд 6 Способы детекции продуктов ПЦР
По моменту выявления продукта ПЦР можно разделить на детекцию
после проведения реакции ПЦР или по конечной точке и одновременно с
ПЦР то есть в реальном времени.
Слайд 7 Способы детекиии продуктов ПЦР
Кроме того по способу выявления ампликонов методы детекции так же
делятся на спецефические, то есть когда мы выявляем конкретно только
интересующие нас ампликоны, все остальные, которые наработались в
реакции нас совершенно не интересуют мы их выявлять не хотим нам это
не нужно и все методы направленны на выявление только нужного нам
продукта.
И неспецифические это когда в принципе выявляется вся ДНК, которая
наработалась в пробирке.
СЛАЙД 8
ПЦР с детекцией в реальном времени проводится в спец приборах реал
тайм амплификаторах, по сути это тот же термоциклер к которому сверху
присоединен флюориметр, на каждом цикле считывает информацию с
пробирок и фикиирует.
Слайд 9 Флюоресценция
Принцип реал тайм ПЦР основан на явлении флюоресценции .
Флюоресценция это способность некоторых веществ в ответ на свет
определённой длины волны выделять свет другой длины волны такие
вещества называются Флюорафоры или красители.
Слайд 10 Детекцция флюоресценции
Как это работает в приборе?
Источник света, который находится в приборе светит в пробирку и
проходит через фильтр поглощения и таким образом этот фильтр отсекает
все лишние длины волн и светит только тот длины волны которая нас
интересует, а потом флюорофоры в пробирке в ответ на этот свет
излучают свет другой длинный волне, этот свет проходит уже через
фильтр иппуккания или эмисионный фильтр попадает на систему
усиление сигнала, далее на детектор и далее ПО уже все данные
анализирует. При ПЦР анализе мы каждый раз задаем канал детекции
Фам, рокс, хекс каналы называютяся по названию используемого
флюорофора.
Слайд 11 Красители
Для неспецифических методов используются неспецефические то есть
которые связывают с любой ДНК, для спецефических- спецефические.
Для спецефических методов используются так называемые зонды это
короткие фрагменты ДНК к которым Флюорафор прикреплен
химическими методами, такие зонды:
. Гидролизуемые Таг ман зонды
. Молекулярной маяки или биконы
.скорпионы и так далее
Слайд 12 Использование неспецефических красителей
Сначало рссмотрим неспеццефические красители ну например Сибр грин.
Когда у нас в пробирке есть только одноцепочечные молекулы ДНК
краситель присутствует в свободном состоянии и сколько бы мы не
светили на него светом ничего не происходит, то есть в свободном
состоянии краситель на свет никак не реагирует,
Слайд 13
но по мере появления двуцепочечных участков, молекулы красителя
встраиваются в двуцепочечные участки ,внедряются туда и теперь уже
если мы посветим светом они будут излучать в ответ, чем больше
двуцепочечной ДНК у нас в пробирке тем больше красителей
встраиваются в двойную цепь , тем больше будет в ответ излучаемого
света, т. е мало у нас двуцепочечных молекул мало красителя светится,
много двуцепочечных молекул-много светится. Так мы можем определять
количество флюоресценции.
Слайд 14 Использование спецефических зондов
Использование спец красителей рассмотрим на примере Так ман зондов
Зонд также как и праймер химически синтезируемая молекула ДНК т.е
точно также на спец синтезаторе задаем последовательность строго
интересующую нас, но помимо самой последовательности, на один ее
конец пришиваем флюорофор или краситель, а на другой гаситель,
гаситель способен поглощать тот свет который излучает краситель, если
они находится в непосредственной близости друг к другу, например
соеденены зондом, если краситель светится, то Гаситель весь этот свет
поглощает и мы ничего не видим, если мы вот эту связь разрушим и
краситель от гасителя отделится, тогда гаситель уже не способен
поглащать свет от флюорофора и он будет светиться, мы будем его
наблюдать.
Слайд 15 Использование спецефических флуоресцентных зондов
Как это работает в ПЦР?
Одноцепочечная ДНК, полимераза, праймер, зонд все это кладем в одну
пробирку, точно также денатурация, прайер гибридизуется, зонд также
гибридизуется по принципу комплиментарности на то место которое
подобрал производитель, полимераза узнает праймер и начинает
достраивать новую цепь ДНК.
Слайд 16
У таг полимеразы етть еще одно замечательное свойство помимо того, что
она термостабильна, так называемая 5*-3* нуклеазная активность, что это
означает, когда полимераза доходит до препятствия на своем пути тут мы
имеем зонд, т.е зонд это припятствие, она начинает его гидролизовать, т.
е по одному- два нуклеотида от него как бы отщеплять, откусывать,
продолжая при этом строить новую цепь.
Слайд 17
В результате на том месте где полимераза прошла зонд разрушился и
краситель отошел от гасителя и теперь уже свет от него мы можем
фиксировать. С каждой новой построенной цепью полимераза
расщепляет один зонд т. е если полимераза достроила две цепи,она
расщипила два зонда, если она построила 100 цепей-100 зондов и так
далее. Когда она достроила за 30 циклов рассмотреных уже нами млрд
новых цепей нуклеиновой киллоты, она расщпила млрд зондов и
соответственно с каждым расщепленным зондом, интенсивность свечения
у нас увеличивается.
Слайд 18
Если же праймер вдруг гибридизоваляся в неправильное место и
полимераза его достроила, но зонд же мы подбирали так, чтобы он
гибридизовался недалеко от праймера, а он в данном случае не
гибридизоваляся, поскольку праймер гибридизовался неправильно.
Полимераза доттроила этот праймер, но зонд она не расщипила и таким
образом несмотря на то что молекулы неправильные образовались
никакого сигнала от зонда мы не видим, это нам позволяет увеличить
специфичность реакции, т. е мы выявляем только те продукты которые
хотим, а все остальные продукты которые образуются в пробирке нас
совершенно не интересует и мы их не выявляем.
Слайд 19 ПЦР с детекцией в ральном времени
Какие результаты мы при этом получаем, что нам показывает прибор?
Прибор каждый цикл (денатурация, отжиг, элонгация) считывает вот эту
вот флюоресценцию и сначала на первых циклах зондов расщепляется
мало и поэтому изменения флюоресценции очень маленькие, как бы идет
фоновое знаяение, которое прибор выявить не в состоянии, но когда
количество вновь образованных ампликонов достигает определенного
уровня, как правило 1 пмоль, тут уже флюоресценция достигает
порогового уровня, как в случае неспецефических красителей, так и в
случае спецефических, после образования вот такого количества
ампликонов флюоресценция достигла порогового уровня и начинает
расти. Она росла и раньше, но мы этого не видели, после достижения
порогового уровня мы уже видим, как она увеличивается,прибор нам это
регистрирует и строит вот такую кривую и вот то количество циклов на
котором флюоресценция привысила фоновые значения называется Ст.
Именно это значение Ст мы анализируем в режиме реального времени,
более того с помощью анализов вот этих Ст циклов мы можем
количественно сравнивать сколько ДНК было исходно на старте.
Представим ,что у нас есть ведро оно не прозрачное, в нем налито
сколько то воды и каждый цикл количество воды в ведре удваивается,
если изначально воды в ведре было много, то через 2-3 цыкла вода
пойлётся через край, вот этот вот случай.
У нас было изначально много ДНК поэтому очень быстро через там 10- 15
циклов т.е мы удваивали всего 15 циклов у нас стало очень много
ампликонов мы видим, а если воды в ведре было очень мало, да она
удваивалась каждый раз, удваивалась и т. д, но через край полилась уже
после 35 цикла, тогда мы видим кривую, которая выходит позже. Таким
образом если параметр Ст у нас маленький т.е кривая вышла рано это
означает, что ДНК у нас было много, а если кривая вышла поздно т.е
показатель Ст у нас большой это значит, что ДНК у нас было мало.
Слайд 20 ПЦР с детекцией в реальном времени использование
неспецефических красителей.
Достоинства и недостатки метода
Слайд 21 ПЦР с детекцией в реальном времени спецефические
флуоресцентные зонды.
Почему мультиплексность является очень важным моментом. Дело в том,
что большинство современных тестов уже по требованиям различных
регуляторных органов должно быть мультиплексным.
Что это значит ? Это когда в одной пробирке амплифицируется не один
какой то объект, а два очень желательно, чтобы в пробирке помимо
искомого продукта амплифицировался ещё и так называемый внутренний
контрольный образец. Это другая матрица, которая позволяет нам
выявлять качество работы самого теста и посути мультиплексность это
значит что в одной пробирке мы проводим одновременно две реакции и
выявляем одновременно два типа продуктов.
Слайд 22
За счёт чего возможен мультиплексный анализ с использованием
специфических красителей. Дело в том, что мы можем использовать
совершенно разные красители. На данной картинке представлены только
три мы видим, что длины волн поглощения и изучения у них совершенно
разные. Вот эти вот графики излучения и поглощения не перекрывается и
за счёт этого мы можем все три красителя положить в одну пробирку и
регистрировать сигналы от них независимо .
Слайд 23
На самом деле красителей намного больше, если сильно постараться
можно сделать четырёх пяти даже шести красочный тест, тут уже зависит
от усердия производителя и от возможности прибора. Большинство
современных приборов как минимум четырёх канальные, это означает ,
что они могут четыре независимых канала выявлять, но есть уже пяти
шести канальные приборы на рынке, т. е. 5-6 разных ампликонов мы
можем выявлять в одной пробирке.
Как это работает?
Вот мы кладём в пробирку три разных системы т.е два праймера на один
участок и к ним зонд меченный например флурофором FАМ, два
праймера на другую ДНК и к ним зонд меченый флурофором ROX и ещё
два праймера на третью ДНК и к ним соответствующий зонд меченный
например красителем CY5, проводим реакцию.
Слайд 25
 Например мы хотим выявлять три разных патогена Trich vaginalis, neseria
gonorea и Clam trachomatis. Мы все три системы положили в одну
пробирку и можем теперь в , эту пробирку налить один образец от одного
пациента т.е не в три пробирки их наливать , а налить в одну.
Проходит ПЦР, если НК одного из патогенов или двух, или трех
присутствует в пробирке, она будет амплифицироваться и мы будем
наблюдать сигнал, по FAM т.е присутствует Trich vaginalis ,по ROX- Clam
trachomatis, по CY5 neseria gonorea.
Тут совсем печальный случай все три сигнала присутствует.
Мультиплексность набора очень экономит время, экономит ресурсы , для
современных тестов это очень полезно, именно потому специфические
красители так важны.