0034УЭ08В

На правах рукописи

$.<£fQ«$

БОРОННИКОВА СВЕТЛАНА ВИТАЛЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ
ГЕНОФОНДОВ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ
РАСТЕНИЙ ПЕРМСКОГО КРАЯ

Специальность 03.00.15 - генетика

- в онг т
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук

Уфа - 2009
 Работа выполнена в Государственном образовательном
учреждении высшего профессионального образования
Пермском государственном университете

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАСХН, профессор

Драгавцев Виктор Александрович
Агрофизический научно-исследовательский институт РАСХН
доктор биологических наук, профессор
Янбаев Юлай Аглямович
Башкирский государственный аграрный университет

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Путенихин Валерий Петрович
Учреждение Российской академии наук Ботанический сад-институт
Уфимского научного центра РАН

Ведущее учреяздение:
Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится « £ 0 » HAsCcWV, 200 9 г. в «ІЧ » часов

на заседании Диссертационного совета ДМ 002.133.01 по адресу:
г.Уфа, 450054, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского

научного центра РАН и на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН
ibg.anrb.ru/dissov.htmI, e-mail: moIgen@anrb.ru

Автореферат разослан «

Ученый секретарь и-^-щ

Диссертационного совета ^ С - ^ — С. М. Бикбулатова
 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Сохранение биологического разнообразия занимает особое место среди
глобальных проблем современности (Вахрамеева, 1988; Конвенция о
биологическом разнообразии..., 1992; Алтухов, 1995; Динамика популяционных
генофондов..., 2004). Основой биологического разнообразия является его
генетическая компонента. Сокращение видового и генетического разнообразия
представляет реальную угрозу для биосферы, поскольку устойчивость
воспроизводства природных экосистем и агроэкосистем непосредственно связана
с их генетически обусловленным потенциалом к адаптациям к меняющимся
условиям окружающей среды (Мэгарран,1992; Глазко, 1998; Лебедева и др., 1999,
Жученко, 2001, Динамика ..., 2004). К середине текущего столетия прогнозируется
увеличение числа видов растений, находящихся под угрозой исчезновения, с 7 до
60 тысяч (Frankel, 1995; Стратегия сохранения ..., 2004).
Впервые концепция о необходимости контроля и мобилизации мировых
растительных ресурсов была разработана Н.И. Вавиловым, что легло в основу
планомерной работы по созданию банков растительных ресурсов в разных
странах. К настоящему времени в них собраны миллионы образцов, однако до сих
пор нет универсальных принципов их отбора (Жученко, 2001). При изучении
редких видов растений не всегда учитывается необходимость сохранения
внутривидовой изменчивости, как на межпопуляционном, так и на
внутрипопуляционном уровнях (Тихонова, 1985). Популяционный подход
остается наименее разработанным в области сохранения биоразнообразия
растений, поскольку до сих пор отсутствуют общепринятые методы
идентификации не только популяционных, но даже видовых особенностей
генофондов. Анализ молекулярно-генетических маркеров полиморфизма белков и
различных участков геномной ДНК позволил выявлять внутривидовое
генетическое разнообразие, оценить гетерозиготность, реконструировать
филогенетические взаимоотношения между видами и пространственные
взаимосвязи между популяциями (Алтухов, 1975, 1995; Янбаев и др., 2007;
Политов, 2007). В то же время, эффективность использования традиционных
молекулярно-генетических маркеров (структурных генов, мини- и
микросателлитных локусов) для исследований генофондов до сих пор остается
достаточно низкой из-за ограниченности количества локусов, доступных для
одновременного генотипирования особей. Это требует поиска новых подходов

3
одновременного молекулярного маркирования многих геномных участков,
которые могли бы позволить создавать «геномный портрет» каждого отдельного
индивидуума и, таким образом, наиболее объективно оценивать своеобразие
генофондов популяций. Особую важность разработка таких методов имеет для
решения главной проблемы в поддержании биоразнообразия - отбора наиболее
типичных представителей популяций и создания генетически обоснованных
программ по их сохранению. К настоящему времени у редких эндемичных видов
растений Урала изучен ряд характеристик внутривидовой изменчивости (Кучеров,
Щелокова, 1987; Кучеров и др., 1993; Янбаев. и др., 2000; Янбаев и др., 2007), но
практически не исследована генетическая изменчивость травянистых реликтовых
редких видов растений, в том числе и в Пермском крае.
Актуальность диссертационной работы обусловлена:
а) недостаточной теоретической разработанностью молекулярно-
генетических подходов к изучению геномов дикорастущих редких видов растений,
представленных популяциями с низкой численностью;
б) важностью определения молекулярно-генетических основ генетического
разнообразия редких видов растений на популяционном уровне;
в) отсутствием экспериментальных методов молекулярного маркирования
многих участков геномов редких видов растений, пригодных для массового
анализа;
г) недостатком методов для оптимизации сохранения генофондов редких и
исчезающих видов растений.
Цель и задачи исследования
Цель работы - разработать принципы множественного молекулярно-
генетического геномного маркирования и технологию идентификации и
паспортизации генофондов редких реликтовых видов растений Пермского края в
качестве модельной системы оптимизации сохранения генофондов редких и
исчезающих видов растений.
Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:
1. Подобрать наиболее полиморфные стабильные ДНК-маркеры и
разработать методы оценки мультилокусного полиморфизма ДНК с целью
оптимизации исследования генофондов популяций редких и исчезающих видов
растений.
2. Исследовать генетическое разнообразие популяций некоторых редких
реликтовых видов растений, распространенных на территории Пермского края.
4
 3. Определить общую и эффективную численность популяций, способ
размножения и семенную продуктивность некоторых редких реликтовых видов
растений.
4. Установить популяции с типичными и специфическими характеристиками
генофондов.
5. Разработать методику и провести молекулярно-генетическую
паспортизацию (ключевого звена технологии идентификации генофондов редких и
исчезающих видов растений), на модельных редких реликтовых видах растений
Пермского края.
Положения, выносимые на защиту
1. Наиболее эффективным для оценки генетического разнообразия
популяций редких и исчезающих видов растений является использование ДНК-
фингерпринтинга (анализа полилокусных спектров) высоко полиморфных и
стабильных ISSR- и IRAP-маркеров.
2. Оптимизация сохранения генофондов редких и исчезающих видов
растений возможна с учетом показателей генетического разнообразия,
установленных по результатам молекулярного маркирования множественных
геномных участков, а также с обязательным учетом уровней внутри- и
межпопуляционного разнообразия.
3. Для сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений
рекомендуются отбор в природных условиях популяций и их групп как с наиболее
типичными, так и со специфичными характеристиками генофондов.
4. Для оптимизации сохранения генетического разнообразия на
популяционном уровне необходима молекулярно-генетическая идентификация и
паспортизация генофондов редких и исчезающих видов растений, позволяющая на
основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК
составить молекулярно-генетическую формулу, штрих-код популяций и обобщить
данные в виде генетического паспорта.
Научная новизна полученных результатов
Впервые разработана концепция идентификации генофондов редких и
нуждающихся в охране видов растений с использованием оценок геномного
распределения повторов, таких как микросателлиты и ретротранспозоны. Впервые
получены и систематизированы данные о генетическом разнообразии популяций
ряда редких травянистых реликтовых видов растений, произрастающих на
территории Пермского края: адониса весеннего Adonis vemalis L., адониса
5
сибирского Adonis sibirica Patrin ex Ledeb., бубенчика лилиелистного Adenophora
lilifolia (L.) A.DC, пиона уклоняющегося Paeonia anomala L., наперстянки
крупноцветковой Digitalis grandiflora Mill. Впервые оценена эффективность в
исследованиях генофондов редких видов растений IRAP-метода, основанного на
использовании в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве праймеров
терминальных последовательностей ретротранспозонов. С целью анализа геномов
редких реликтовых видов растений были клонированы и секвенированы
последовательности ДНК пяти редких видов растений Пермского края.
Нуклеотидные последовательности LTR-ретротранспозонов некоторых редких
видов растений были включены в мировую базу генетических данных GenBank
NCBI под номерами: EF191000-EF191012 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
С целью изучения взаимосвязи генетического разнообразия с показателями
численности выявлены общая и эффективная численность популяций и изучены
биологические особенности модельных реликтовых редких видов растений, такие
как преимущественный способ опыления, способ и эффективность размножения.
Даны характеристики изученных популяций с определением степени
антропогенного воздействия в соответствии с рекомендациями, разработанными
автором диссертационной работы. С целью оптимизации сохранения генофондов
редких и нуждающихся в охране видов растений разработана методика
молекулярно-генетической паспортизации на популяционном уровне, которая
включает в себя анализ полиморфизма стабильных ISSR- и IRAP-маркеров,
выявление идентификационных мономорфных (родовых и видовых) и
полиморфных фрагментов ДНК, составление молекулярно-генетической формулы,
штрих-кода и генетического паспорта. Анализ генетического разнообразия редких
видов растений на основании оценки полиморфизма ISSR- IRAP-маркеров
предложен в качестве критерия оценки состояния их генофондов. На основании
полученных данных рекомендованы научно обоснованные меры сохранения
генофондов изученных редких реликтовых видов растений и разработаны подходы
оптимизации сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов
растений.
Практическая значимость и реализация результатов исследований
Использование ретротранспозонов для анализа геномов открывает новые
возможности изучения организации и функционирования геномов редких и
исчезающих видов растений, являющихся наиболее уязвимым звеном в
растительных сообществах, выявления механизмов их устойчивости.
6
Поддержание исторически сложившегося уровня генетического разнообразия
популяций как основы сохранения их адаптационного потенциала в естественно
колеблющейся и антропогенно трансформированной среде является необходимым
условием их существования и развития. Изучение генетической изменчивости
природных популяций, оценка их состояния позволяют рекомендовать научно
обоснованные меры сохранения популяций редких видов растений.
Разработанная технология идентификации генофондов и ее ключевое звено
(методика молекулярно-генетической паспортизации) позволяют оптимизировать
сохранение генофондов растений, включая редкие и исчезающие виды растений.
Научные выводы работы и рекомендации непосредственно используются при
проведения мониторинга популяционного разнообразия редких и нуждающихся в
охране видов растений Пермского края, так как автор диссертационной работы
является куратором пяти редких реликтовых видов растений от Управления по
охране окружающей среды Пермского края. На основании анализа динамики
показателей численности и генетического разнообразия бубенчик лилиелистный
(Adenophora lilifolia (L.)A.DC.) внесен в Красную книгу Пермского края (2008).
Результаты и выводы исследований могут быть использованы для сохранения
генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений и оптимизации
сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне и в других
регионах страны.
Теоретические и практические результаты исследований используются при
преподавании учебных дисциплин и специальных курсов студентам
Новосибирского, Уральского, Челябинского и Пермского государственных
университетов, а также Калининградского технического университета, что
подтверждено справкой и актами внедрения результатов исследований в учебный
процесс.
Связь работы с научными программами
Диссертационная работа выполнялась в ходе подготовки и реализации ПГУ
приоритетного инновационного национального проекта «Образование» в части
«Молекулярная генетика». Популяционно-генетические исследования были
частично связаны с последовательным циклом программ Управления по охране
окружающей среды Пермской области (2006 г): гос. контракты № 6/2006 от
03.04.2006, № 90203 от 10.04.2006, № 90202 от 01.06.2006, № 90211 от 01.06.2006;
а также Министерства градостроительства и развития инфраструктуры Пермского

7
края: гос. контракты № 65-0 от 20.06.2007, № 56/1-0 от 13.06.2007, № 11-0 от
18.02.2008, № 43-0 от 17.03.2008.
Часть исследований проводились в связи с тематикой гранта РФФИр_урал_а
№ 07-04-96032 «Динамика генетического разнообразия и структуры
популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных
воздействиях» (2006-2009 гг.), гранта РФФИр_урал_а №07-04-96016 «Влияние
нефтяных загрязнений почв на популяции микроорганизмов и растений Пермского
края» (2006-2009 гг.), гранта РФФИ АНФ_з №08-04-92673 «Участие в российско-
австрийском семинаре «Молекулярно-генетические маркеры, фитогеография и
популяционная генетика для устойчивого лесного хозяйства: Евроазиатская
перспектива» (2008-2009 гг.).
Личный вклад автора
Разработка подходов и программы молекулярно-генетических
исследований; выбор типов молекулярных маркеров и объектов исследований;
планирование, организация и проведение полевых и лабораторных исследований;
обработка, обобщение и интерпретация представленных в диссертационной работе
результатов, их сопоставление с литературными сведениями, разработка
теоретических положений; подготовка практических рекомендаций и публикаций,
написание и оформление текста диссертации проведены лично автором работы.
Идея создания концепции идентификации генофондов, разработка методики
молекулярно-генетической паспортизации, выявление мономорфных и
полиморфных идентификационных фрагментов ДНК, а также составление
молекулярно-генетической формулы и молекулярно-генетического паспорта
единолично принадлежат автору диссертационной работы. Для гетерогенных
природных популяций растений диссертантом предложена запись молекулярно-
генетической формулы в виде штрих-кода. Автор диссертационной работы
является инициатором и одним из соавторов обоснования внесения Adenophora
Ші/оііа (L.) A.DC. в Красную книгу Пермского края (2008) с категорией
угрожаемого состояния 3 (R) - редкий вид. Результаты части исследований,
проведенных совместно с соискателями и аспирантами диссертанта,
опубликованы; ссылки на них приведены в соответствующих разделах работы.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены и доложены на Втором
республиканском совещании семинаре «Содержание и формы экологического
образования в педвузе» (Пермь, 1990), IX Всесоюзном совещании по
8
семеноведению интродуцентов «Репродуктивная биология интродуцированных
растений» (Умань, 1991), межвузовской научной конференции «Охраняемые
природные территории. Проблемы выявления, исследования, организации систем»
(Пермь, 1994), 2-й Международной научно-практической конференции «Экология
и охрана окружающей среды» (Пермь, 1995), симпозиуме «Проблемы
репродуктивной биологии растений» (Пермь, 1996),Ѵ научной конференции
памяти проф. А.А. Уранова «Популяции и сообщества растений: экология,
биоразнообразие, мониторинг» (Кострома, 1996), популяционном семинаре
«Жизнь популяций в гетерогенной» (Йошкар-Ола, 1998), XI съезде Русского
ботанического общества «Ботанические исследования в азиатской России»
(Барнаул, 2003), Proceedings of the IV Balkan Botanical Congress (Sofia, 2006), VII
Международном симпозиуме «Нетрадиционные и редкие растения, природные
соединения и перспективы их использования» (Белгород, 2006), Всероссийской
научной конференции «Ботанические исследования в Поволжье и на Урале»
(Саратов, 2006), Международной конференции «Генетика в России и мире»,
посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
(Москва, 2006), Международной научно-практической конференции
«Антропогенная динамика природной среды» (Пермь, 2006), IV Международной
научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва,
2006), Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология:
состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), Всероссийской конференции
«Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века»
(Петрозаводск, 2008), Международной научно-практической конференции
«Нанобиотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008), Пятом Московском
международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития»
(Москва, 2009), Съезде генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со
дня рождения Чарльза Дарвина, Пятом Съезде Вавиловского общества генетиков и
селекционеров (Москва, 2009).
Публикации
Диссертантом по теме диссертации опубликовано 64 научные работы, в их
числе 12 статей в ведущих рецензируемых журналах из перечня ВАК, 10 статей в
других журналах, 29 статей в материалах конференций, 1 учебно-методическое
пособие и 2 монографии, в одной из которых диссертант является соавтором.

9
 Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, семи глав - обзор проблемы,
объекты и методы исследований, 5 глав результатов и их обсуждения, выводов.
Список литературы включает 306 источников, в том числе 196 отечественных и
110 иностранных. Диссертационная работа изложена на 356 машинописных
страницах, содержит 66 таблиц, 51 рисунок и приложения.
Благодарности
Автор выражает искреннюю признательность за помощь при обучении,
повышении квалификации, освоении современных методов молекулярно-
генетического анализа, подготовке диссертационной работы и консультации с.н.с.
лаборатории гетерозиса растений ИЦиГ СО РАН В.И. Коваленко и зав.
лабораторией академику РАН В.К. Шумному, академику РАЕН, РАСХН
(иностранный член) В.И. Глазко и проф. Т.Т. Глазко; проф. каф. ботаники и
генетики растений ПГУ В.А. Верещагиной, Н.В. Москвиной, зав. кафедрой
ботаники и генетики растений ПГУ проф. С.А. Овеснову; сотрудникам группы
проф. С.А. Гостимского (особенно с.н.с. З.Г. Кокаевой) и всей кафедре генетики
Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; зав.
лабораторией растительной геномики Института биотехнологии университета
Хельсинки (Финляндия) проф. А.Х. Шульману и доц. Р.Н. Календарю; зав.
лабораторией популяционной генетики ИОГен имени Н.И. Вавилова РАН д.б.н.
Д.В. Политову. Выражается искренняя благодарность соавторам по публикациям,
а также всем, кто поддерживал и поддерживает развитие молекулярно-
генетических исследований в ПГУ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований
В качестве основных объектов исследований избраны пять реликтовых
редких видов растений, распространенных в Пермском крае: адонис весенний
Adonis vemalis L. и адонис сибирский Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. из семейства
Ranunculaceae, наперстянка крупноцветковая Digitalis grandiflora Mill, из
семейства Scrophulariaceae, пион уклоняющийся Раеопіа anomala L. из семейства
Paeoniaceae, бубенчик лилиелистный Adenophora lilifolia (L.) A.DC. из семейства
Campanulaceae с категорией угрожаемого состояния 3 (R) (Горчаковский и др.,
1982; Красная книга Среднего Урала, 1996; Красная книга Пермского края, 2008).

10
Эти виды являются реликтами (Белковская и др., 1988; Камелин и др., 1999).
Проведены комплексные исследования 27-ми природных популяций (82 выборки)
редких видов растений. Для изучения генетического разнообразия A. vernalis из
разных частей Кунгурской островной лесостепи избраны 10 популяций, в том
числе самая северная популяция Аѵ2, расположенная на Спасской горе в
Кунгурском районе. На территории Ординского района находятся 4 популяции:
АѵІ, АѵЗ, Аѵ4 и AvlO, в Уинском районе - одна (Аѵ7). Южная группа представлена
популяциями Октябрьского района: Аѵ5, Аѵб, Аѵ8 и Аѵ9. Для анализа
генетического разнообразия A. sibirica избраны 3 популяции из разных частей
Пермского края: As J из центральной (Добрянский район), As2 - из юго-западной
(Кишертский район), a As3 - из северной части (Ильинский район). Первая
популяция Ad liilifolia (Ad.lil.l) приурочена к северному участку островной
Кунгурской лесостепи; вторая (Ad.lil.l) и третья (Ad.lil.3~) популяции находятся в
юго-западной, а четвертая (Ad.lil.4) - в северной части края. Для изучения
динамики численности и генетического разнообразия D. grandijiora бьши избраны
5 популяций в разных районах Пермского края: первая (Dgl) расположена в
Кишертском районе, вторая (Dg2) - на Спасской горе Кунгурского района, 3
популяции (Dg3, Dg4, Dg5) - в Октябрьском районе. Популяции Р. апотаіа
находятся в центральной части Пермского края: Pal в Чусовском, Ра2 в
Добрянском, а РаЗ в Губахинском районах. Для апробации ISSR- и IRAP-методов
анализа полиморфизма ДНК помимо редких видов растений бьши использованы
некоторые широко распространенные травянистые виды растений и один широко
распространенный древесный вид Populus tremula L.
Разработка методики молекулярно-генетической паспортизации редких
видов растений с целью оптимизации сохранения их генофондов проведена на
примере двух видов рода Adonis (A. vernalis, A. sibirica) (Боронникова, 2008), а ее
апробация - на примере как редких, так и широко распространенных видов
растений рода Adenophora (бубенчик лилиелистный Adenophora lilifolia (L.) A.DC,
бубенчик трехлистный Adenophora triphylla A.DC), рода Digitalis (наперстянка
крупноцветковая Digitalis grandijiora Mill., наперстянка пурпуровая Digitalis
purpurea L., наперстянка ресничатая Digitalis ciliata Trautv., наперстянка
шерстистая Digitalis lanata Ehrh., наперстянка желтая Digitalis lutea L.).
Полевые исследования проводились с использованием традиционных
методов, применяемых в ботанике, молекулярной и популяционной генетике. С
1988 по 2005 гг. проведены исследования биологических особенностей редких
11
видов растений, определение их семенной продуктивности (Работнов, 1960;
Вайнагий, 1973), возрастного состава эффективного размера популяций (Хедрик,
2003), а также подсчет общей (N) (Голубев и др., 1978; Денисова и др., 1986) и
эффективной (Ne) численности популяций (Вахрамеева, 1981; Алтухов, 2004); а с
1994 по 2009 гг. - анализ генофондов (Lewontin, 1972; Nevo, 1987; Chalmers, 1992;
Алтухов, 1995, 2003; Хедрик, 2003; Артюкова и др., 2004; Динамика..., 2004).
Определение степени антропогенного воздействия на изученные популяции
редких видов растений проведено по разработанным автором рекомендациям
(Боронникова, 2008).
Для анализа молекулярно-генетического полиморфизма ДНК были собраны
листья с 30-ти случайно выбранных растений в каждой популяции на расстоянии
от 30-ти до 50-ти м друг от друга. Для выделения ДНК использовали методику
A.M. Торрес (Torres et al., 1993) с незначительными модификациями. С целью
молекулярно-генетического анализа ДНК выделена из более 1520 образцов
листьев редких видов растений, а так же с целью молекулярно-генетической
паспортизации дополнительно из 1240 образцов проростков, почек возобновления
и листьев.
Анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК, включая основные
его стадии, проведен в молекулярно-генетической лаборатории кафедры ботаники
и генетики растений ПГУ с использованием ISSR- (Inter Simple Sequence Repeats,
Zietkiewicz et al., 1994) и IRAP- (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism,
Kalendar et al., 1999) методов с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР).
С целью разработки праймеров для IRAP-анализа полиморфизма ДНК в
лаборатории растительной геномики Института биотехнологии университета
Хельсинки (Финляндия) проведены клонирование и секвенирование
последовательностей ДНК пяти редких видов растений. Клонирование
последовательностей ретротранспозонов осуществляли с помощью нового
универсального метода (Kalendar et al, 2008), основанного на использовании ПЦР
с праймерами из консервативного участка связывания tRNA (PBS, Primer Binding
Site), непосредственно прилегающего к левому прямому повтору LTR (Long
Terminal Repeats) в центральной части ретротранспозона.
Продукты амплификации с универсальными PBS-праймерами были
клонированы в pGEM-T («Promega», USA) плазмидный Т-вектор после очистки в
QIAGEN («MinElute PCR Purification Kit»). Цитирование проводили при 16°С в

12
течение 12 часов. Трансформацию плазмидной ДНК со вставками осуществляли с
использованием компетентных клеток Е.соіі штамма JM109 («Promega», USA).
Клетки, несущие плазмиду со вставкой фрагмента чужеродной ДНК, были
выявлены путем бело-синей селекции на среде с ампициллином в конечной
концентрации 100мкг/мл, X-Gal (20мг/мл) и IPTG (200мг/мл). Проверка pGEM
вектора на наличие клонированных ПЦР-продуктов проведена с помощью ПЦР с
универсальными праймерами (М13 universal и reverse).
Секвенирование последовательностей ДНК проведено с использованием
капиллярного секвенатора ABI3700 («Biosystems», USA). В соответствии с
консервативными участками LTR-ретротранспозонов в различных ориентациях
были разработаны праймеры с использованием программы FastPCR (Календарь,
Боронникова, 2007). Для IRAP-анализа пяти редких видов синтезированы 70
праймеров в «MWG Biotech AG» (Germany).
С целью разработки первого варианта IRAP-метода проанализирован
полиморфизм геномных участков пяти редких видов растений с использованием
70 IRAP-праймеров. Эффективность выявления полиморфизма IRAP-праймерами
рассчитана для A. vernalis, A. sibirica, Ad. lilifolia, D. grandiflora, P. anomala в
соответствии с предложенной нами (Календарь, Боронникова, 2007) шкалой (1-5):
от низкой (1) до высокой (5). Амплификация ДНК IRAP- и ISSR-методами была
выполнена в термоциклерах MJ Mini-Cycler («Bio-Rad», USA) и Терцик («ДНК-
Технология», Москва) по типичным для IRAP- и ISSR-методов программам
(Молекулярная генетика, 2007). Для проверки достоверности полученных
спектров ДНК опыт повторяли не менее четырех раз. Амплифицированные
продукты были подвергнуты электрофорезу в 1.7-2% агарозном геле в
присутствии бромистого этидия. Гели были отсканированы в системе гель-
документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA). Для определения длины фрагментов
ДНК использовали маркер молекулярной массы 100 Ьр +1.5 + 3 Kb DNA Ladder
(«ООО-СибЭнзим-М», Москва) и программу Quantity One («Bio-Rad», USA). У
четырех редких реликтовых видов растений проведен анализ полиморфизма 350
ISSR- и 450 IRAP-маркеров, том числе 219 IRAP-маркеров у двух видов рода
Adonis.
Для количественной оценки степени полиморфизма и определения уровня
дивергенции между изученными популяциями, полученные данные были
представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которой наличие или
отсутствие в ISSR- и IRAP-спектрах одинаковых по размеру фрагментов
13
рассматривалось, соответственно, как состояние 1 или 0. При этом учитывали
только воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты, изменчивость
по интенсивности не брали в расчет. Компьютерный анализ молекулярно-
генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью программы POPGENE
1.31 (Yeh et al., 1999) и специализированного макроса GenAlEx6 (Peakall, Smouse,
2006) для MS-Excel с определением: доли полиморфных локусов (Williams et al.,
1990) при Р„, общего числа аллелей (п„), эффективного числа аллелей (nt)
(Kimura et al., 1964), ожидаемой гетерозиготности (Я £ ) (Nei, 1987).
Уровень внутрипоггуляционного разнообразия оценен через показатели
среднее число морф (ц) и доля редких морф (А) (Животовский, 1980). Объемы
использованных выборок в среднем составляли 30 особей. Оценку отклонения
наблюдаемых распределений генотипов от ожидаемых при равновесии Харди-
Вайнберга проводили с использованием теста хг • Оценка генетического
разнообразия внутри и между популяциями редких видов растений проведена с
использованием информационной мера Шеннона (Schennon, 1949; Lewontin, 1972;
Chalmers, 1992), которая не предусматривает существование в популяциях
равновесия Харди-Вайнберга и традиционно применяется (Артюкова и др., 2004)
при молекулярно-генетическом анализе редких видов растений. Индекс
разнообразия Шеннона рассчитывали для каждой популяции (Я ), среднее
значение для популяций (Я ) и для суммарной выборки (Hsp), на основе этих
значений определяли долю внутри- и межпопуляционного разнообразия. Для
описания генетической структуры подразделенной популяции были использованы
следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (Нт) во всей
популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля
гетерозиготных генотипов (Я 5 ) в субпопуляции, как мера ее
внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического
разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенное™ популяций
(GST) (Nei, 1975). Генетическое расстояние между популяциями (£>) определяли
по формулам М. Нея (Nei, 1978; Nei, Li, 1979). На основе матриц бинарных
признаков были рассчитаны матрицы генетических различий (Nei, 1972), на
основании полученной матрицы невзвешенным парно-групповым методом
(UPGMA - unweighed pair-grup method using arithmetic average) были построены
дендрограммы, отражающие степень родства исследуемых популяций по ISSR- и

14
IRAP-спектрам при помощи компьютерных программ Treecon 1.3b и POPGENE
1.31. Молекулярно-генетическая паспортизация проведена по разработанной
автором методике (Боронникова, 2008). Проверка всех выявленных
идентификационных молекулярных маркеров у исследованных видов проведена
не менее 5-ти раз. Статистические анализы выполнены при помощи программ
STATISTICA 6.0 (версия 6.0.) и MS EXCEL. Статистическая обработка данных
молекулярно-генетического анализа проведена с использованием стандартных для
популяционно-генетических исследований методов (Животовский, 1983, 1990;
Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биологические особенности редких реликтовых видов растений и

характеристика избранных для изучения популяций

1.1. Adonis vernalis L.

В Пермском крае отмечено 19 местонахождений A. vernalis. За последние 15
лет общая численность этого вида сократилась на 20-25% (Боронникова, 2008).
Вид в природных условиях размножается только семенным путем. Показано, что
основной вклад в семенное размножение A. vernalis вносят средневозрастные
генеративные особи (g 2 ), составляющие эффективную численность популяций.
Установлено, что к популяциям с низкой общей численностью относятся АѵЗ, Аѵб,
Аѵ7, Аѵ8, AvlO (от 39 в Аѵ7 до 184 особей в AvS), а к популяциям с высокой общей
численностью - Аѵі, Аѵ2, Аѵ4, Аѵ5, Аѵ9 (от 248 в Аѵ2 до 562 особей в Avl).
Показано, что в изученных популяциях A. vernalis с низкой общей численностью
эффективная численность варьировала от 8 ІАѵ7) до 65 особей (Аѵ8), а в
популяциях с высокой общей численностью эффективная численность изменялась
от 67 (Аѵ2) до 194 (Аѵ9) особей. Популяции АѵЗ , Аѵб, Аѵ7 и AvlO находятся под
антропогенным воздействием сильной степени, популяции Аѵ, Аѵ2, Аѵ5 и Аѵ8 -
средней, а Аѵ4 и Аѵ9 - слабой степени.
1.2. Adonis sibirica Patrin ex Ledeb.
В Пермском крае выявлено 16 местонахождений A. sibirica. Размножение
этого вида в естественных условиях происходит только семенным путем.
Установлено, что как и у A. vernalis, так и у A. sibirica принимают участие в
семенном размножении преимущественно средневозрастные генеративные особи
(g 2 ). Общая численность в Asl составила 22 особи, в As2 - 246, в As3 - 257 особей.

15
В Asl к настоящему времени эффективная численность равна 3-м особям, в As2 и
As3 - 89 и 77 особям соответственно. С 1994 по 2008 гг. из-за строительства
горнолыжной трассы общая численность Asl сократилась на 75.00 %, а
эффективная численность - на 85.71% (рис. 1). Исследованные популяции А.
sibirica находятся под антропогенным воздействием Asl сильной, As2 средней и
As3 слабой степени.
1.3. Paeonia anomala L.
В северной части Пермского края P. anomala представлен популяциями с
большой стабильной численностью. В центральной части края из-за
антропогенного воздействия численность популяций сокращается. Общая
численность Pal составила 975 особей, а эффективная - 190 особей. Общая
численность Ра2 в 1988 составляла 562 особи (Боронникова, 2002), а в 2008 году -
377 особей, то есть за 20 лет сократилась на 41.04%. Эффективная численность
популяции за этот же период сократилась с 402 до 224 особей, то есть на 44.28%
(рис. 1). Одной из причин сокращения показателей численности Ра2 является
усиление антропогенного воздействия в связи со строительством новой
автомобильной трассы в 1 км от местонахождения Ра2. В РаЗ общая численность
составила 441 особь, а эффективная - 146 особей. По нашим данным в природе Р.
anomala размножается только семенным путем (Боронникова, 2002). Нами
установлено, что в семенном размножении у P. anomala принимают участие особи
g2 , редко g} • Изученные популяции находятся под антропогенным воздействием
средней степени, кроме Ра2, которая испытывает антропогенное воздействие
сильной степени.
Asl Pa2

100

80

во
40

20

о _п:Э
1994 1997 2001 2005 2008

И Общая численность I Эффективная численность

Рис. 1. Динамика общей и эффективной численности первой популяции (Asl) A.

sibirica и второй популяции (Ра2 ) P. anomala

16
 1.4. Adenophora lilifolia (L.) A.DC.
Общая численность вида в крае сократилась за последние 10 лет в среднем
на 15-20% (Боронникова, 2008). В изученных популяциях Ad. lilifolia этот
показатель варьировал от 59 особей в Ad.lil.4 до 293 особей в Ad.lil.l, a
эффективная численность - от 36 в Ad.lil. 4 до 239 особей в Ad.lil.l. По нашим
данным размножение вида в природе осуществляется и семенным и вегетативным,
то есть комбинированным способом (Боронникова, 1999). Наибольший вклад в
семенную продуктивность вносят особи g2 и g 3 , которые и определяют
эффективную численность популяций. Сильную степень антропогенного
воздействия испытывает популяция Ad.lil.4, среднюю - Ad.lil. 1, а слабую - Ad.lil.2
KAd.lil.3.
1.5. Digitalis grandiflora Mill.
D. grandiflora на территории Пермского края встречается, в основном, в
островной Кунгурской лесостепи, где и отмечено 12 местонахождений этого вида.
Общая численность изученных популяций D. grandiflora варьировала от 56 (Dg3)
до 487 особей (Dgl), а эффективная - от 40 до 304 особей соответственно. Для
вида характерен комбинированный (семенной и вегетативный) способ
размножения. При анализе показателей семенной продуктивности особей D.
grandiflora разных возрастных групп генеративного периода было отмечено, что у
средневозрастных особей показатели выше, чем у особей остальных групп
(Боронникова и др., 20096). Эффективная численность у данного вида
представлена особями #2 и g3 • Изученные популяции D. grandiflora находятся под
антропогенным воздействием сильной (Dg3), средней (Dgl. Dg2, Dg4) и слабой
степени (Dg5).
Таким образом, избранные для изучения пять редких реликтовых видов
представлены в Пермском крае, кроме Р. апотаіа, небольшим числом популяций с
низкой численностью. Три из изученных видов (A. vernalis, A. sibirica, P. anomala)
размножаются только семенным путем. Для Ad. lilifolia и D. grandiflora характерен
комбинированный (и семенной и вегетативный) способ размножения.
Эффективная численность популяций выявлена благодаря изучению участия в
семенном размножении особей разных возрастных групп генеративного периода.
Самые низкие значения данного показателя характерны для видов рода Adonis (три
особи у A. sibirica и восемь особей у A. vernalis), а самые высокие - для P. anomala
(от 146 до 224 особей).

17
 2. Анализ генофондов редких видов растений на основании оценок
полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными
микросателлитными повторами (ISSR-PCR маркеры)

2.1. Анализ генетического разнообразия популяций двух видов рода

Adonis
В изученных популяциях A. vernalis выявлено 109 амшшфицированных
ISSR-фрагментов ДНК, из которых 100 были полиморфными (Боронникова,
Тихомирова, 2008а). Число амшшфицированных фрагментов ДНК в общей
выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 19 (М9) до 29 (М12).
В среднем при ISSR-анализе у A. vernalis один праймер инициировал синтез 22-х
фрагментов ДНК. Число полиморфных ISSR-фрагментов A. vernalis варьировало
от 16 до 29, а их размеры - от 210 до 1900 пн (рис. 2).
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 И 15 16 17 1S 19

1500

1000 М

700
~~ - Г - . - . 2 — тг_ s = ~ ~ ~
500 Л . - - « _ • - • , » « »

Рис. 2. ISSR-спектр популяции A.vernalis (Avl) с праймером Ml: цифрами обозначены

номера проб, М - маркер молекулярного веса, стрелками указаны некоторые
полиморфные фрагменты ДНК; представлена часть спектра

Доля полиморфных локусов в общей выборке в среднем (при Рп) составила

91.74%. В популяциях данный показатель варьировал от 34.86% в Аѵ2 до 62.39% в
Аѵб. Ожидаемая гетерозиготность A. vernalis по локусам (НЕ) равна 0.290. Самое
высокое значение этого показателя в Аѵ9 (Я £ =0.245), а самое низкое - в Аѵ7
(# £ =0.113). Абсолютное число аллелей на локус (в нашем случае на фрагмент
ДНК) на общую выборку (и„) составило 1.973, а эффективное число аллелей на
локус (пе) - 1.499. Число редких аллелей (фрагментов ДНК с частотой <=0.05)
варьировало по популяциям от 0 (Аѵ4, Avl, AvlO) до 8 (Аѵб).
Генетическая структура изученных популяций A. vernalis характеризуется
тем, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции выше
(#,.=0.301), чем в субпопуляциях (Я6. =0.181). Коэффициент подразделенности
популяций (GJJ.) показывает, что на межпопуляционную компоненту
18
генетического разнообразия A. vemalis приходится 39.90% разнообразия, то есть
изученные популяции сильно дифференцированы (Боронникова и др., 2009в).
Наименьшее генетическое расстояние между популяциями A. vemalis отмечено
между Аѵ7 и АѵІО и (D=0.015), а наиболее генетически удаленными являются
популяции Аѵ4 и Аѵ7 (Д =0.441), Аѵ4 и Лѵі(£»=0.430) и Аѵ4 и АѵЮ (£>=0.424). На
дендрограмме (рис. 3) популяции A. vemalis сформировали три кластера: в первом
кластере к трем популяциям примыкает четвертая, второй и третий кластеры
включают по 3 популяции. Узлы ветвления имеют высокую поддержку (индекс
бутстрепа >90%).

0.4 03 0J
—\— -4—
- Аѵ7
10»
95 С - АѵІО
- АѵЗ
Avl
Ml
ІООг- - Av«
Av8
100Г - AvS
- Av4

т Av9

Рис. 3. UPGMA дендрограмма генетического сходства 10 популяций A. vemalis,

построенная на основании полиморфизма ISSR-маркеров. Шкала сверху -
генетические дистанции. На дендрограмме указаны значения бутстрепа (в %)

Среднее значение индексов разнообразия Шеннона ( Я ) в изученных

популяциях A. vemalis, рассчитанные по ISSR-праймерам, составило 0.274.
Высоки эти показатели в Аѵ9 (0.363) и в Аѵ5 (0.361). Индекс разнообразия
Шеннона, рассчитанный на общую популяцию A. vemalis, равен 0.462. На долю
внутрипопуляционного генетического разнообразия A. vemalis приходится
59.58%, а на долю межпопуляционного - 40.42%. Итак, оба подхода к
определению генетического разнообразия, то есть определение показателя
подразделенности популяций (Gsr) и коэффициента разнообразия Шеннона ( # о )
у A. vemalis дали близкие результаты (Боронникова, Тихомирова, 2008а;
Боронникова и др., 2009в). Таким образом, самые высокие показатели
генетического разнообразия отмечены в популяциях Октябрского района (Аѵ4,
Аѵ5, Аѵ9), а самые низкие показатели - в самой северной популяции на Спасской
горе (Аѵ2) и в популяциях с низкой общей и эффективной численностью (Аѵ7,

19
AvlO). Необходимо сохранение как генетически уникальной Аѵ2, в которой
отмечены семь редких аллелей.
Полиморфизм структурных элементов генома A. sibirica был выявлен с
использованием тех же ISSR-праймеров, что и у A. vernalis. В трех изученных
популяциях A. sibirica при помощи ISSR-праймеров были получены 74 ампликона
(существенно меньше, чем у A. vernalis), из которых 66 были полиморфными (P9S
=89.19%). Размеры ампликонов у A. sibirica варьировали от 270 до 1620 пн. В
среднем при ISSR-анализе у A. sibirica один праймер инициировал синтез 14.8
фрагментов ДНК, что значительно меньше, чем у A. vernalis (22 ампликона).
Высокий процент полиморфизма ISSR-маркеров отмечен в As3 (P„=81.08%), a
самый низкий - в Asl (P,s=35.13%). Низкие значения ожидаемой гетерозиготности
отмечены в Asl (Я £ =0.142), а высокие - в As2 (HE =0.243). В общей популяции А.
sibirica ожидаемая гетерозиготность выше и составила 0.356. Абсолютное число
аллелей на локус (л„) на общую выборку A. sibirica составило 1.914. Этот
параметр выше в As2 и ниже в Asl. Эффективное число аллелей на локус на
общую популяцию составило 1.608. Наибольшее значение данного показателя
отмечено в As3 (л„=1.409), а его резкое снижение - в Asl (л,=1.257). Наибольшее
число редких аллелей отмечено в As3 (R =11). Редкие аллели отсутствуют в Asl,
что свидетельствует об обеднение генофонда этой популяции. Генетическая
структура популяций A. sibirica такова: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов
выше в общей популяции ( Я г =0.334), чем в субпопуляциях ( Я s =0.214).
Показатель генетической подразделенности популяций {GST) A. sibirica равен
0.358. Генетически более гетерогенна As3 (/>,5=81.08%; Я£=0.235; ne=1.409), a
наименьшие основные показатели генетической изменчивости отмечены в Asl
(Р95=35.13%; Я£=0.145; л,=1.257). Таким образом, на межпопуляционную
изменчивость у A. sibirica приходится 35.77% генетического разнообразия.
Наибольшее генетическое расстояние отмечено между As2 и As3 (D =0.290), а
наименьшее - между Asl и As2 (D =0.166). Кластерный анализ показал, что As]
генетически ближе к As2. Третья популяция {As3) находится на большем
генетическом расстоянии от первых двух популяций и характеризуется
наименьшей степенью родства с ними. Среднее значение индексов разнообразия
Шеннона (Я о ) в изученных популяциях A. sibirica, рассчитанных по ISSR-
праймерам, составило 0.292. Выше этот показатель в As3. Индекс Шеннона,

20
рассчитанный на общую популяцию A. sibirica, равен 0.504. На долю
внутрипопуляционного генетического разнообразия A. sibirica приходится 59.55%,
а на долю межпопуляционного - 40.45% разнообразия.
Таким образом, молекулярно-генетический анализ двух видов рода Adonis
показал, что полиморфизм ISSR-маркеров высок у обоих видов (91.74% у
A.vermalis и 89.19% у A. sibirica). У A. vernalis большая часть генетической
изменчивости (по данным G -статистики) является внутрипопуляционной
(60.10%), на межпопуляционную изменчивость приходится 39.90% генетического
разнообразия. У A. sibirica сохраняется та же тенденция: внутрипопуляционная
изменчивость составляет большую часть (64.23%), на межпопуляционную
изменчивость данного вида приходится 35.77% генетического разнообразия.
Среди изученных популяций A. vernalis деградация генофонда отмечена в Аѵ7
(Р95=36.70%; НЕ =0.113; и,=1.181;Л =0) и в AvlO (P„ =35.27%; НЕ =0.119;
л,=1.193;Д =0), а тенденция к обеднению генофонда - в Аѵ2 (Р95=34.86%;
Я £ =0.122; ле=1.199;Д =7). Среди изученных популяций A. sibirica деградация
генофонда выявлена у Asl (Р„=35ЛЗ%; Я £ =0.145; ле=1.257;Д =0). Данная
популяция находится в критическом состоянии и требует экстренных мер охраны.

2.2. Анализ генетической изменчивости Adenophora lilifolia (L.) A.DC

У Ad. lilifolia выявлено 56 амплифицированных ISSR-фрагментов ДНК, из
которых 46 были полиморфными. Число амплифицированных фрагментов ДНК в
общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 9 (праймеры
М8, Х10) до 15 (праймер Ml), а их размеры - от 280 до 1370 пн. В среднем один
праймер инициировал синтез 11 фрагментов ДНК. Доля полиморфных локусов в
общей выборке в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 75.00% в Ad.lil.4.
до 90.91% в Ad.lil.l и, в среднем, составила Р„ =82.14 %. Ожидаемая
гетерозиготность Ad. lilifolia составила 0.228. Этот показатель выше в Ad.lil.3
(Я £ =0.275) и значительно ниже в Ad.lil.4 (Я £ =0.159). Абсолютное число аллелей
на локус (па) на общую выборку Ad. lilifolia равно 1.930, а эффективное число
аллелей на локус (л,) - 1.412. Абсолютное число аллелей на локус выше в Ad.lil.l
(п„=1.857), а эффективное число аллелей на локус выше в Ad.lil.3 (л,=1.463).
Наименьшие значения эти показатели имеют в Ad.lil.4 (Я £ =0.159; na=1.518;
л,=1.251). Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на общую популяцию Ad.

21
lilifolia ( Я r ) составила 0.270; а в субпопуляциях этот параметр (Я 5 ) равен 0.228.
Итак, среднее выборочное генетическое разнообразие в субпопуляциях ниже, чем
общее генетическое разнообразие в общей популяции. Коэффициент
подразделенное™ популяций (G ir ) показал, что на межпопуляционную
компоненту Ad. lilifolia приходится 15.51% разнообразия (Боронникова, 2009г).
Таким образом, при молекулярно-генетическом анализе Ad. lilifolia установлено,
что доля полиморфных локусов и абсолютное число аллелей выше в Ad.lil.l, a
эффективное число аллелей и ожидаемая гетерозиготность - в Ad.lil.3. Все выше
перечисленные показатели генетического разнообразия достоверно ниже bAd.lil.4.

2.3. Анализ генетической изменчивости популяций Digitalis grandiflora Mill.

При ISSR-анализе структурных элементов генома D. grandiflora выявлено
111 амплифицированных фрагмента ДНК, из которых 90 были полиморфными
(Р„ =81.08%). Число ампликонов в общей выборке растений варьировало в
зависимости от праймера от 15 (Х10) до 24 (М9), а их размеры - от 200 до 2200 пн.
В среднем, при ISSR-анализе D. grandiflora один праймер инициировал синтез 22.2
фрагментов ДНК. Число полиморфных фрагментов в общей выборке варьировало
от 14 до 22. Доля полиморфных локусов и в Dgl и в Dg2 составила 66.36%, а в Dg3
- 50.45%). Ожидаемая гетерозиготность D. grandiflora равна 0.237. Данный
показатель выше в Dgl (Я £ =0.207). Абсолютное число аллелей на локус (ио) на
общую выборку D. grandiflora равно 1.991, а эффективное число аллелей на локус
(пе)- 1.394. Абсолютное число аллелей на локус ниже в Dgl (л„=1.649), а
эффективное число аллелей на локус ниже в Dgl (п„=1.280). Число редких аллелей
у D. grandiflora выше, чем у других изученных видов и равно 18. Наименьшее их
число отмечено в Dgl (R =3), а наибольшее - в Dg3 (R =17).
Анализ генетической структуры популяций показал, что ожидаемая доля
гетерозиготных генотипов на подразделенную популяцию D. grandiflora (Я г )
равна 0.261, а в субпопуляциях (Я 5 ) - 0.190. Показатель генетической
подразделенности популяций (GCT) D. grandiflora равен 0.272. Таким образом, на
межпопуляционную изменчивость у данного вида приходится 27.22%
генетического разнообразия. Среднее значение индексов разнообразия Шеннона
(Я о ) в изученных популяциях D. grandiflora, рассчитанные по ISSR-праймерам,
составило 0.292. Кластерный анализ показал, что Dg2 генетически ближе к Dgl

22
(£)=0.076). Dgl находится на большем генетическом расстоянии от Dg2
(D =0.269) и Dg3 (D =0.329). Среди изученных популяций D. grandiflora
тенденция к обеднению генофонда отмечена в Dg3 (P9S =50.45%; # £ =0.181;
«,=1.281).
Таким образом, ISSR-маркеры позволяют получить ценные сведения о
генетическом полиморфизме участков генома, фланкированных
микросателлитными повторами, определить основные параметры генетического
разнообразия и дифференциации популяций, на основании которых установить
основные характеристики генофондов редких и исчезающих видов растений.

3. Анализ генетического разнообразия редких видов растений с

использованием оценки полиморфизма инвертированных повторов
ретротранспозонов (IRAP-PCR маркеры)

3.1. Использование ДНК-маркеров на основе ретротранспозонов для

анализа полиморфизма ДНК редких видов растений

Клонирование последовательностей ретротранспозонов осуществляли с

помощью нового универсального метода (Kalendar et al., 2008), основанного на
использовании ПЦР с праймерами из консервативного участка связывания tRNA,
непосредственно прилегающего к левому прямому повтору LTR в центральной
части ретротранспозона (рис. 4).
У і 2 3 I 5 б 7 S 9 1С 11 12 13 Н 15 16 17*3182021 22 23 21 25

5 0 0
"™ _ ' _ ~ — « , ... — ,. т •• т ••• « * •'•"

Рис. 4. IRAP-спектр Аѵі с праймером 2095 (5'-GCTCGGATACCA-3'): цифрами

обозначены номера проб, М - молекулярный маркер; стрелками указаны некоторые
полиморфные фрагменты ДНК, представлена часть спектра

Для секвенирования последовательностей LTR ретротранспозонов были

отобраны 96 клонов. Для подбора IRAP-праймеров секвенированные
последовательности клонов были отсортированы по общей последовательности.
Выявлены уникальные последовательности концевых прямых повторов LTR

23
ретротранспозонов. С помощью выравнивания была определена консенсус
последовательность для каждого кластера LTR.
Для IRAP-анализа 5-ти редких видов растений разработаны 70 праймеров
(Календарь, Боронникова, 2007) и проведена оценка их эффективности.
Установлено, что наиболее эффективно выявляют полиморфизм инвертированных
повторов ретротранспозонов в геномах A. vernalis, A. sibirica, Ad. lilipholia, D.
grandiflora, P. anomala IRAP-праймеры, обозначенные номерами 2155, 2156, 2175,
2197, 2198,2201, 2202, 2204 (табл. 1).
Таблица 1
Эффективность праймеров из LTR- последовательностей ретротранспозонов
Нуклеотидная Adonis
№ Digitalis Paeonia Adenophora
последовательность LTR- vernalis,
grandiflora anomala lilifolia
праймера (5'—»3') A. sibirica

2149 GTAGTTTCGGGTTCGGAATTGCA 2 1
2153 ATCTTTTGAGACCAAGCTTCCGTC 2 1
2155 AGCTTGATATCCCGCCCCGGTCAA 5 1
2156 ACAAGTTGTCCAAGGGCTTTCCTC 2 1 5
2157 AGGTGGGCGCCAAACTGTTTTGG 2 4
2159 AGCGAATCAACAGGGGCTGCCCGA 2 3 3
2175 TTAGACCCGGAACCGCCGTG 4 1 2
2183 TTGCAAATACCAGTGGCGGGTCGT 2 2
2185 AATTCCACAACCGCTAGTGGCG 4 1
2186 CGGTTTAGAACGCCACAAATGG 4
2197 GAAGTACCGATTTACTTCCGTGTA 4
2198 ATCCTTCGCGTAGATCAAGCGCCA 4
2200 ATGTGACAGTCGACTAACCAC 3
2201 CCTAGGTGGTTAGTCGACTGTCAC 5
2202 TGGCGCTTGATCTACGCGAAGGA 5
2203 ATCCCACAACTTGGACGTTTGCTG 3 1
2204 AACTTGATCCAGATCATCTCC 4
2211 GTTGGAGTGTATAGTCCCACATCG 3

Установлена видовая специфичность исследованных IRAP-праймеров

(Календарь, Боронникова, 2007; Боронникова, 2008). С целью апробации IRAP-
метода дана оценка полиморфизма структурных элементов геномов,
фланкированных инвертированными повторами ретротранспозонов, некоторых

24
широко распространенных травянистых видов растений и одного древесного
ресурсного вида растений (Боронникова и др., 2009а).

3.2. Анализ полиморфизма IRAP-маркеров A. vemalis

В шести изученных популяциях A. vemalis выявлено 127
амплифицированных IRAP-методом фрагментов ДНК, из которых 118 были
полиморфными (Р95 =92.91%). Число выявленных IRAP-маркеров в общей
выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 19 (праймер 2202) до
31 (праймер 2197). В среднем при IRAP-анализе один праймер инициировал у А.
vemalis синтез 25 фрагментов ДНК (Боронникова, 2008; Боронникова, 2009а).
Число полиморфных фрагментов A. vemalis варьировало от 17-ти до 30-ти, а
их размеры - от 190 до 2500 пн. Ожидаемая гетерозиготность по локусам ( Я £ )
составила 0.291. Эти показатели наиболее высоки в Аѵ5, а минимальны - в Аѵі.
Абсолютное число аллелей на локус (п„) на общую выборку A. vemalis составило
1.992, эффективное число аллелей на локус (пе) - 1.497. Число редких аллелей
варьировало по популяциям от 2 (Аѵ2) до 13 (Аѵ4), а на общую выборку равнялось
8. Отмечены уникальные фрагменты ДНК, например, в Аѵ2 - AVU1500IR75-
Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на подразделенную популяцию
A. vemalis (HT), определенная на основании полиморфизма IRAP-маркеров, равна
0.305, а в субпопуляциях ( H s ) - 0.225. Коэффициент подразделенности популяций
(Gst) продемонстрировал, что на межпопуляционную компоненту генетического
разнообразия A. vemalis приходится 26.13% разнообразия. Среднее значение
индексов разнообразия Шеннона ( # о ) в изученных популяциях A. vemalis,
рассчитанное по IRAP-праймерам, составило 33.83%. На долю
внутрипопуляционного генетического разнообразия A. vemalis, выявленного
посредством индекса Шеннона, приходится 72.15%, а на долю
межпопуляционного - 27.85%. Итак, оба подхода к определению генетического
разнообразия на популяционном уровне (коэффициент подразделенности
популяций (Gst) и индекс разнообразия Шеннона (Но)) у изученного вида дали
близкие результаты.
Таким образом, самые низкие показатели генетического разнообразия,
определенные на основании полиморфизма IRAP-маркеров, отмечены в первой

25
(АѵІ) популяции A. vernalis (P9S =58.26%; Я£=0.177; «,,=1.281), а самые высокие
показатели - в Av5 (P9S =77.16%; Я£=0.270; w,=1.445).

3.3. Анализ полиморфизма IRAP-маркеров A. sibirica

При анализе фрагментов ДНК, амплифицированных в результате ПЦР с
IRAP-праймерами, у A. sibirica выявлено 92 амплифицированный фрагмент ДНК,
из которых 74 были полиморфными. Доля полиморфных локусов у A. sibirica
составила (приР95) 80.43%. Число амплифицированных фрагментов ДНК
варьировало в зависимости от праймера от 12 (праймер 2202) до 21 (праймер 2175)
до а их размеры - от 270 до 2980 пн. В среднем при IRAP-анализе у A. sibirica
один праймер инициировал синтез 18.4 фрагментов ДНК. Наибольшую долю
полиморфных локусов выявил праймер 2204 (Я95 =93.33%), а наименьшую -
праймер 2202 (Р95 =66.66%). Высокий полиморфизм IRAP-маркеров характерен
для As3 (P„ =61.96%). Резкое снижение данного показателя (Р95 =34.78%)
отмечено в Asl также как и при анализе полиморфизма ISSR-маркеров.
Ожидаемая гетерозиготность в общей выборке равна 0.360, выше данный
показатель в As3 (Я£=0.235). Самое низкое значение этого параметра отмечено в
Asl (Я£=0.143). Абсолютное (л0) и эффективное (пе) число аллелей на локус
выше также в As2 и As3, а самые низкие значения этих параметров отмечены в Asl.
Наибольшее число редких аллелей (R =5) отмечено в As3.
Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на подразделенную популяцию
A. sibirica (Я г ), определенная на основании полиморфизма IRAP-маркеров, равна
0.336, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляциях (Я 5 ) - 0.207.
Как следствие коэффициент подразделенности популяций (Gst) высок и составил
0.385. Изученные популяции сильно дифференцированы, так как 38.47%
разнообразия приходится на межпопуляционную и 61.53% - на
внутрипопуляционную изменчивость. Оценка генетического разнообразия
посредством индекса Шеннона (Я ) дала сходные результаты - на долю
внутрипопуляционного генетического разнообразия A. sibirica приходится
58.30%, а на долю межпопуляционного - 41.70%. Наименьшее генетическое
расстояние между исследуемыми популяциями A. sibirica, рассчитанное на основе
IRAP-анализа, отмечено между Asl и As2 (D =0.165), наиболее генетически
удаленными являются Ля/ nAs3 (D =0.345).
26
 Итак, генетико-популяционные исследования с использованием IRAP-
метода анализа полиморфизма ДНК выявили неоднородность генофондов редкого
реликтового вида A. sibirica. Самые высокие показатели генетического
разнообразия характерны для As3 (Р95=62.50%; Я£=0.350; ле=1,409). Деградация
генофонда при снижении численности популяции и сильном антропогенном
воздействии отмечена у Asl (Р,5=33.65%; #£=0.143; л,=1.253). Необходимо
осуществление экстренных мер охраны данной популяции.
Таким образом, использование ДНК-фингерпринтинга на основе
ретротранспозонов оказалось весьма эффективным для характеристики
генофондов и оценки внутри- и межпопуляционного генетического разнообразия
популяций редких и исчезающих видов растений.

4. Молекулярно-генетическая паспортизация редких видов растений

4.1. Методика молекулярно-генетической паспортизации
Методика молекулярно-генетической паспортизации редких и
нуждающихся в охране видов растений разработана нами на примере природных
популяций двух видов A. vernalis и A. sibirica (Боронникова, 2008, 2009а). Она
включает в себя семь этапов: 1 - выбор эффективных стабильных молекулярных
маркеров, 2 - сбор материала, 3 - подбор эффективных праймеров и проведение
молекулярно-генетического анализа с использованием ПЦР, 4 - анализ
выявленных ISSR- и IRAP-маркеров и определение идентификационных
(мономорфных и полиморфных), а также составление молекулярно-генетической
формулы (5 этап), штрих-кода (6 этап) и генетического паспорта (7 этап).
На первом этапе разработки методики была решена задача выбора
эффективных стабильных молекулярных маркеров, позволяющих выявіпъ
высокий уровень полиморфизма ДНК, анализировать большую часть генома
растений, получить четко воспроизводимые результаты на основании анализа
данных молекулярно-генетических исследований двух видов рода Adonis,
проведенных нами ранее (Боронникова, 2005, 2008; Боронникова и др., 2006;
Боронникова, Тихомирова, 2008а). Всем этим требованиям отвечают ISSR- и
IRAP-маркеры.
На втором этапе паспортизации в природных популяциях двух видов рода
Adonis собраны фрагменты листьев, из которых выделена ДНК.

27
 На третьем этапе были отобраны наиболее информативные четыре ISSR- и
пять IRAP-праймеров, с помощью которых выявлены ISSR- и IRAP-маркеры у
двух видов рода Adonis. Проведен ПЦР анализ выделенных проб ДНК.
На четвертом этапе для двух видов рода Adonis выявлены 10 ISSR- и 17
IRAP- мономорфных фрагментов и 9 ISSR- и 21 IRAP- полиморфных фрагментов
ДНК. Четко воспроизводимые при амплификации у особей одного рода
фрагменты ДНК названы нами «родовыми», а у особей одного вида - «видовыми».
На пятом этапе маркеры ДНК, избранные для паспортизации, представили
в виде молекулярно-генетической формулы. Нами предложена новая оригинальная
запись фрагмента ДНК (Боронникова, 2008; Боронникова, 2009а) с указанием типа
фрагмента (родовой, видовой, полиморфный), длины фрагмента и указания
праймера нижним индексом, например, Asv 1510iR75 (табл. 2).
Таблица 2
Молекулярно-генетическая паспортизация популяций A. vernalis и A. sibirica

Обозначение Тип
популяции фрагментов Молекулярно-генетическая формула
ДНК
rod AD r 550 X ii; AD r 850, R9 g; AD r 480 M3 ; ADr380Mi
Avl vid A V » 8 3 0 M I 2 ; A V V 7 1 0 I R O 4 ; Av v 630 M]; Avv 490 Хц

polimorph Av p 900 ми; Av 0 620 тог; Av p 440 Ж97; Av „ 350 iR75

rod AD, 550 xi 1; AD r 850i R 9 8 ; AD r 480 M 3; A D r 3 8 0 M i
АѵЗ vid Av v 830 м и ; AV V 710IRO4; Av v 630 MI; A V V 490 Xn

polimorph Av p 12001R97; Av „ 760 IR97 ; Av „ 6201R02 Av D 610 iR75

rod AD r 550 X ii; AD r 850| R 9 8 ; AD r 480 M 3; A D r 3 8 0 M i
Аѵб vid Av v 830 M ,2; Av ¥ 710 IR04 ; Av v 630 Mi", Av „ 490 x l l
polimorph Av p 1100 IR98;Av „ 880 rR97; Av „ 7501R02; Av „ 650 |R7S
rod AD r 550 X ii; AD r 850, R 9 8 ; AD,480 M 3; A D r 3 8 0 M i
Asl vid As у 1510 IR75 ; As „930 m97 ; As v 610 X n; As v 430 iR98
polimorph As p 1370 IR75 ; As D 750 M i2
rod AD r 550xn; AD r 850i R 9 8 ; AD r 480 M 3; A D r 3 8 0 M i
As2 vid As v 1510 iR7s", As v 930 iR97; As v 610 xn; As v 430 IR9s
polimorph As „I 170 iR04; A S D 7 5 0 M I 2
rod AD r 550 xn; AD r 850, R 9 8 ; AD r 480 M 3; A D r 3 8 0 M i
As3 vid As v 1510 IR75; As v 930 IR97; As v 610 X n; As v 430 ,R98
polimorph Aspl020i R75 ; As D 320 M i2

Первыми буквами названия рода (AD) мы обозначили. родовые

идентификационные фрагменты ДНК с указателем «п> от «rod» нижним индексом,
например, ADr550xn- Видовые идентификационные фрагменты обозначены как
Аѵ и As с указанием «ѵ» от «vid», например, Аѵѵ830мі2- Полиморфные фрагменты
ДНК предлагается обозначить индексом «р» от «polimorph», например,
28
Avp650iR75-. Как родовые, так и видовые фрагменты ДНК являются мономорфными
и, в основном, установлены с использованием ISSR-метода. Полиморфные
фрагменты ДНК (при их различных сочетаниях) позволили составить уникальную
генетическую формулу популяции. Для паспортизации популяций видов рода
Adonis было отобрано по 4 родовых и видовых фрагментов ДНК, а также от одного
до четырех полиморфных фрагментов ДНК, сочетания которых специфичны для
исследуемых популяций (табл. 2). Это минимальное число фрагментов ДНК, с
помощью которых нам удалось провести паспортизацию. Гетерогенные
природные популяции можно охарактеризовать разными сочетаниями
полиморфных фрагментов ДНК, причем главную роль будут играть полиморфные
фрагменты, амплифицированные IRAP-методом. Сочетания полиморфных
фрагментов ДНК не совпадают ни у одной из изученных популяций.
На шестом этапе паспортизации предложена запись молекулярно-
генетической формулы в виде штрих-кода (рис. 5).

Мол^к. № фрагмента Обозначение

маркер,пн Штрих-код ДНК фрагмента
1 Аѵр900мі2
900
_ _ 2
3 АѴѴ830МІ2
800

4 Аѵѵ710,ши
700 5 Аѵѵ630мі
6 AVP620IRO2
600
7 ADr 550хп
—
500 8 Avv490xn
9 ADr480M3
— 10 Avp440[R97
400 11 ADr380Mi
— 12 AVP350IR75
Рис. 5. Молекулярно-генетический штрих-код популяции A. vernalis (Avl):
AD r - фрагменты ДНК, общие для видов A.vernalis и A. sibirica; A v v - фрагменты
ДНК, характерные для A. vernalis; Av p - полиморфные фрагменты ДНК

Родовые фрагменты предлагается обозначить толстой линией, видовые -

линией средней толщины, а полиморфные фрагменты - тонкой линией. Для
штрих-кода предлагается использовать от 10 до 12 штрихов, из которых четыре

29
характерны для рода, четыре - для вида, а от одного до четырех - для популяции.
Фрагменты ДНК в штрих-коде располагаются в зависимости от их длины от
большего к меньшему. Как молекулярно-генетическая формула (табл. 2), так и
штрих-код (рис. 5), позволят идентифицировать принадлежность как
растительного сырья, так и отдельных особей не только к роду и виду, но и к
определенной популяции изученных видов редких реликтовых растений.
Таким образом, генофонд популяции документируется в виде формул и
штрих-кода, отражающих состав аллелей в отдельных локусах генома.
На седьмом этапе молекулярно-генетической паспортизации рекомендуется
составление генетического паспорта популяции. Нами разработана форма
генетического паспорта популяции редкого вида растений, избраны общепринятые
показатели состояния популяций и генетического разнообразия (Боронникова,
20096).
4.2. Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Digitalis
Проведено проращивание семян пяти видов рода Digitalis; из проростков
выделена ДНК. После проведения ПЦР-анализа с использованием ISSR- и IRAP-
праймеров выявлены четко воспроизводимые 11 мономорфных и 12 полиморфных
фрагментов ДНК (Боронникова, 20096). Мономорфные фрагменты ДНК, общие
для пяти проанализированных видов рода Digitalis, обозначены первыми тремя
буквами латинского названия рода - DIG (например, DIGr460Mi). Мономорфные
фрагменты ДНК, характерные для вида, обозначены как Dgv520xs>, а полиморфные
- Dgp650iR55 (табл. 3).
Таблица 3
Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Digitalis

Вид Тип
фрагментов Молекулярно-генетическая формула
ДНК
rod DIGr 1260x9, DIGr640iR97, DIGr550Xio, DIGr460Mi
D. purpurea
vid Dp, 1010 Mi2, Dpv900x9, Dpv750 M n, Dpv680X9
rod DIGrl 260x9, DIG^OIRQT, DIGr550Xio, DIG,460MI
D. lutea
vid Dlu» 1230 MI Dluvl 160 iRo4, Dluv1020 X9, DluH50 X9
rod DlGr 1260 X9, DlGr 640 ,R97, DlGr 550 Xio, DIG, 460 Mi
D. ciliata
vid Dcv 2600 MI, Dcv 1020 M , Dcv 970 xio, Dcv 610 x<>
rod DIGr 1260 X9, DIGr 640 m , 7 , DIGr 550 xio, DIGr 460 MI
D.grandiflora
vid Dgv1020X9, DgvlOOOiRo,, Dgv950x,o, Dgv 520 X9

Основная характеристика молекулярного маркера - его длина указана

большими буквами после указания типа фрагмента - Dpv750Mi2- В молекулярно-
30
генетической формуле приведены тип и номер праймера нижним индексом.
Например, Dgp810iR58 амплифицирован IRAP-методом посредством праймера под
номером 2158. При ISSR-анализе праймер можно записать в виде короткой
формулы, например, Dgp1210(AGQ6c- Для составления молекулярно-генетическои
формулы популяций видов рода Digitalis в соответствии с методикой отобрано
традиционно по 4 родовых и по 4 видовых идентификационных фрагментов ДНК
(табл. 3); а также от 1-го до 4-х полиморфных фрагментов ДНК, сочетания
которых специфичны для исследуемых популяций.
Для генетической паспортизации популяций использованы от 10-ти до 12-ти
молекулярных маркеров. Проведена молекулярно-генетическая паспортизация
трех природных популяций редкого реликтового вида D. grandijlora. Запись
молекулярно-генетическои формулы популяции Dg2, к примеру, такова:
DIGr1260X9; DIGr640IR97; DIG r 550 xl0 ; DIG r 460 № ; Dgv1020x9; Dgv1000IR01;
Dg v 950 xl0 ; Dgv520X9;Dgp1110M9; Dgp810IR58;Dgp650IR55;Dgp260IR59.
Результаты молекулярно-генетическои паспортизации популяций D.
grandijlora представленные в виде молекулярно-генетическои формулы и штрих-
кода, внесены наряду с общепринятыми показателями состояния популяций и
характеристиками их генофондов в генетические паспорта (Боронникова, 20096).

4.3. Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Adenophora

Геномная ДНК выделена из проростков двух видов рода Adenophora (Ad.
Ulifolia и Ad. triphylla). После проведения ПЦР-анализа выявлены четко
воспроизводимые 11 моіюморфных и 11 полиморфных фрагментов ДНК. В
соответствии с разработанной методикой были отобраны по четыре фрагмента
ДНК, общих и специфических для двух видов этого рода. Составлены
молекулярно-генетические формулы и штрих-коды 4-х изученных популяций Ad.
Ulifolia. Например, запись молекулярно-генетическои формулы первой популяции
(Adlil.l) такова: Adr1610iR59; Adr840XU); Adr400M8; Adr370IR96; Ad.lilv1220IR96;
Ad.lilv1050M8; Ad.lu v 920 xn ; Ad.lilv440IR56; Ad.lilpllOO[R57; Ad.lilp920Mi;
Ad.lilp760iR59; Ad.lilp670[R56. Данные об изученных популяциях Ad. Ulifolia и
характеристики их генофондов внесены в генетические паспорта. С
использованием разработанной методики молекулярно-генетическои
паспортизации составлены молекулярно-генетические формулы и штрих-коды для
22-х популяций 12 видов растений (Боронникова, 2009в, 2009д).

31
 5. Концепция идентификации и оценки состояния генофондов редких
и нуждающихся в охране видов растений

5.1. Характеристика генофондов на основании анализа полиморфизма

ISSR- и IRAP-маркеров
Изучение генофондов редких видов растений с использованием
молекулярных маркеров ДНК опирается на оценки количественных характеристик
генетического разнообразия популяций. Одной из основных количественных
характеристик является процент (или доля) полиморфных локусов. Избранные для
анализа состояния генофондов ISSR- и IRAP-маркеры являются высоко
полиморфными, так как в зависимости от вида выявляют от 56 до 111 ISSR-
маркеров и от 92 до 127 IRAP-маркеров. В среднем 1 праймер выявляет 17.6 при
ISSR-анализе и 22.5 фрагментов ДНК при IRAP-анализе. Общее число
выявленных у четырех редких видов растений ISSR-маркеров составило 350, а
IRAP-маркеров - 450. Для проведения молекулярно-генетического анализа
четырех редких видов растений проанализированы 88 978 ампликонов. Как
следует из приведенных данных, IRAP-метод позволяет выявить большее число
молекулярных маркеров. Стабильность избранных для изучения маркеров
подтверждается их воспроизводимостью при повторных ПЦР. В совокупности
избранные нами для изучения ISSR- и IRAP-маркеры позволяют характеризовать
полиморфизм большей части геномов как широко распространенных, так и
избранных для изучения редких реликтовых видов растений и установить
основные показатели генетического разнообразия популяций, таких как процент
полиморфных локусов (я95), ожидаемая гетерозиготность (Я £ ), абсолютное (ло) и
эффективное (пг) число аллелей, коэффициент внутрипопуляционного
разнообразия (ц), число (R) и долю (А) редких аллелей.
Таким образом, нами для характеристики генофондов редких и исчезающих
видов растений предложены параметры генетического разнообразия популяций,
установленные на основании анализа полиморфизма ISSR- и IRAP-маркеров; на
большом фактическом материале убедительно доказано, что для оценки
генетического разнообразия популяций редких и нуждающихся в охране видов
растений эффективным является использование ДНК-фингерпринтинга
(полилокусных спектров) высоко полиморфных и стабильных ISSR- и IRAP-
маркеров.

32
 5.2. Принципы множественного молекулярно-генетического геномного
маркирования
Изученные редкие реликтовые виды растений послужили моделью для
разработки и создания концепции идентификации генофондов на основании
оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК. Тандемно
организованные повторяющиеся последовательности ДНК различных типов
широко представлены в эукариотических геномах. Они варьируют по длине
кластера и размеру повторяющегося звена. Среди них наиболее полиморфными
являются минисателлитные и микросателлитные ДНК, а также ретротраншозоны.
Основные принципы множественного молекулярно-генетического
маркирования таковы:
- использование высоко полиморфных молекулярных маркеров, основанных
на широко представленных в геномах тандемных повторах;
- использование не менее двух типов молекулярных маркеров ДНК,
основанных на различных структурных повторяющихся элементах генома;
- один из используемых молекулярных маркеров должен быть основан на
вариабельных элементах генома, например, мобильных генетических элементах -
ретротранспозонах;
- оценка полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК;
- выявление общих (идентификационных) для рода и вида мономорфных
фрагментов ДНК и характеристика популяционных генофондов посредством
сочетание полиморфных фрагментов ДНК;
- обобщение характеристик генофондов в виде молекулярно-генетической
формулы, штрих-кода и генетического паспорта.

5.3. Оптимизация сохранения генофондов редких видов растений

посредством молекулярно-генетической паспортизации на основании
молекулярно-генетического анализа

Методика молекулярно-генетической паспортизации на основе ISSR- и

IRAP-маркеров имеет высокую разрешающую способность, дает стабильно
воспроизводимые результаты, характеризуется высоким уровнем стандартизации,
как набора маркеров, так и техники выполнения анализа. Именно использование
IRAP- вместе с ISSR-маркерами позволило нам провести паспортизацию
гетерогенных природных популяций редких реликтовых видов растений.

33
 Разработанная методика молекулярно-генетической паспортизации
популяций редких реликтовых видов растений предлагается в качестве ключевого
звена технологии идентификации генофондов редких и исчезающих видов
растений, которая позволит установить уровень и состав генетического
разнообразия на популяционном уровне, выявить популяции с типичными и
специфическими характеристиками генофондов, рекомендовать научно
обоснованные меры их сохранения, то есть оптимизировать процедуру сохранения
генофондов наиболее уязвимых в растительных сообществах редких и
исчезающих видов растений. Эта технология является одним из подходов
оптимизации сохранения генетической компоненты биоразнообразия
растительных сообществ.

5.4. Показатели генетической дифференциации популяций

Изученные редкие реликтовые виды растений, кроме Р. апотаіа,
представлены небольшим числом популяций и характеризуются низкими
показателями численности. Влияние общей и эффективной численности
популяций на параметры генетического разнообразия изучено на примере
10 популяций A. vernalis, которые распределены по показателю общей
численности в две группы: популяции с низкой (АѵЗ, Аѵб, Аѵ7, Аѵ8, AvlO) и
высокой (Avl, Av2, Av4, Av5, Av9) общей численностью. Нами установлено, что
эффективную численность или эффективный размер популяций A. vernalis
составляют, в основном, средневозрастные генеративные особи {g2).
Высокая линейная корреляция достоверно установлена между долей
средневозрастных генеративных особей (g2) и индексом разнообразия Шеннона
(г=0.6618; /)=0.0371), ожидаемой гетерозиготностью (r=0.6355; p =0.0483) и
числом эффективных аллелей (г =0.6462; р =0.0435). Аналогичная картина
наблюдается, если сравнить данные показатели отдельно в популяциях с низкой и
высокой общей численностью.
При изучении генетической структуры подразделенной популяции
установлено, что в группе популяций с высокой общей численностью
коэффициент подразделеной популяции (G sr ) составил 0.169, а в группе
популяций с низкой общей численностью - 0.371. Нами достоверно (F (1.77) >
FST (1.39)) установлено, что популяции Л. vernalis с низкой общей численностью
дифференцированы в большей степени.

34
 Таким образом, с учетом специфики редких реликтовых видов растений
рекомендуемые нами генетико-статистические параметры позволяют установить
характеристики их генофондов и дают адекватные и стабильные оценки
генетической дифференциации популяций.

5.5. Отбор объектов для сохранения и меры охраны генофондов редких

реликтовых видов растений

Для отбора в качестве объектов сохранения генофондов рекомендуются

локальные группы популяций с наиболее типичными характеристиками
генофондов, такие как популяции A. vernalis, расположенных в центральной части
островной Кунгурской лесостепи: Аѵ4 (Р„ =61.47%; #£.=0.241; л,=1.482; R =0);
Аѵ5(Рп =57.80%; НЕ =0.222; л„=1.403; R =4);
Яѵ9(Р95=60.55%; НЕ =0.245; п = 1.422; R =0).
Кроме этого для сохранения генофондов в качестве генетически более
гетерогенных рекомендуются отдельные популяции:
A. sibirica-As3 Ильинского района (Р95 =81,08%; Я £ =0,235; л,=1,409; R =11),
Ad. ///!/о/г'а-ЛйШ.ЗОрдш1СКОГорайона(^,5=75.00%; НЕ =0,275; п,=1,462; R =0),
D. grWJ/7ora-Z)g2KyHrypcKoro района (Р95 =66.36%; # f =0,182; л,=1,784;Д =14).
К объектам сохранения со специфичными характеристиками генофондов, то
есть со специфическими сочетаниями полиморфных локусов, относятся:
- самая северная популяция A. vernalis на Спасской горе
Аѵ2(Р„ =34.86%; НЕ =0.122; л,=1.199; R =7);
- популяции островной Кунгурской лесостепи
A. vernalis-Аѵі (Р 95 =44.95%; НЕ =0.147; ле=1.236; R =4),
D. grandijlora-Dgi (Я95=50.45%; НЕ =0,181; /7С=1,281; R =17),
Ad. lilifolia-Ad.lil.I(P,5=&036%; HE =0.250; «,=1.402; R =0),
- популяции из центральной части Пермского края
A. sibirica-Asl (Р 95 =35.13%; НЕ =0.141; и„=1,257; R =0).
На основании обобщения данных, представленных в данной
диссертационной работе, рекомендуются следующие меры по сохранению
генофондов изученных редких реликтовых видов растений:
1. Поддержание генетического разнообразия популяций изученных видов
путем сохранения на уровне не ниже исторически сложившегося эффективного
35
размера популяций за счет устранения или снижения антропогенного воздействия:
прекращения изъятия щебня и строительства объектов туризма и зон отдыха на
склонах, где обитают виды; снижения рекреационной нагрузки, предотвращения
пожаров и ряд других мер.
2. Картирование на местности избранных для сохранения генофондов
популяций и строгое их сохранение, учет их уникальности при планировании и
проведении строительных, нефтедобывающих, хозяйственных и иных работ.
3. Мониторинг популяционных характеристик и генетического разнообразия
избранных для сохранения популяций редких реликтовых видов растений.
4. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация на
популяционном уровне и выявление на ее основе объектов для сохранения
генетического разнообразия.
5. Для третьей (АѵЗ), шестой (Аѵб), седьмой (Аѵ7) и десятой (АѵІО)
популяций A. vernalis, первой (Asl) популяции A. sibirica, третьей (Dg3)
популяции D. grandiflora необходимы экстренные меры охраны, а именно
снижение общей антропогенной нагрузки (запрет на разрушение
местонахождений популяций, ограничение выпаса скота и посещения людей
путем создания ОППТ).
6. Для сохранения генофондов D. grandiflora и Ad. lilifolia помимо
сохранения in situ рекомендуется отбор особей из популяций как с наибольшим
типичными (Dgl, Ad.lil.3), так и со специфичными характеристиками генофондов
(Dg2, Ad.lil.l) для введения в культуру в ботанические сады с последующей
реинтродукцией.
7. В связи с ограниченной возможностью разведения в культуре двух
изученных видов рода Adonis необходимо охранять природные популяции этих
видов. Кроме этого рекомендуется консервация в генетических банках
полноценных семян, отобранных в связи с сильной генетической
дифференциацией популяций на основе максимальной представленности
генетического разнообразия каждой из немногочисленных природных популяций
этих видов.
8. При сильной дифференциации популяций рекомендуется создание
промежуточных популяций с целью поддержания генетического разнообразия.

36
 выводы
1. Для оценки генетической изменчивости редких и исчезающих видов
растений рекомендуется метод ДНК-фингерпринтинга с использованием высоко
полиморфных стабильных 1SSR- и IRAP-маркеров, позволяющий эффективно
оценить полиморфизм локусов в геноме и выявить основные показатели
генетического разнообразия популяций.
2. С целью оптимизации сохранения генетической компоненты
биологического разнообразия растительных сообществ разработаны принципы
множественного молекулярно-генетического геномного маркирования и создана
концепция идентификации и оценки состояния генофондов редких и
нуждающихся в охране видов растений на основании оценок полилокусного
сочетания моно- и полиморфных участков ДНК на примере модельных редких
реликтовых видов растений Пермского края рода Adonis, Ad. lilifolia и D.
grandiflora.
3. Показано, что изученные редкие реликтовые виды растений
характеризуются высоким уровнем генетической изменчивости:
на основании полиморфизма ISSR-маркеров установлены доля
полиморфных локусов (Р9!) в пределах от 81.08% до 91.74%, ожидаемая
гетерозиготность (НЕ) - от 0.234 до 0.356, а эффективное число аллелей (пе) - от
1.394 до 1.608;
на основании полиморфизма IRAP-маркеров - доля полиморфных локусов в
пределах от 80.43% до 92.91%, ожидаемая гетерозиготность - от 0.291 до 0.432, а
эффективное число аллелей - от 1.496 до 1,759.
4. Выявлено, что генетическая изменчивость у исследованных редких
реликтовых видов растений варьирует в узких пределах (уровень полиморфизма
ISSR-маркеров - от 81.08 % у D. grandiflora до 91.74 % у A. vernalis; уровень
полиморфизма IRAP-маркеров - от 80.43% у A. sibirica до 92.91% A, vernalis),
несмотря на небольшую эффективную численность популяций, а также их
дифференциацию и изолированность.
5. Установлено, что основные показатели генетического разнообразия
изученных популяций A. vernalis достоверно (г =0.636; р =0.048 для ожидаемой
гетерозиготности; г =0.646; jo =0.044 для числа эффективных аллелей; г =0.662;
^=0.037 для индекса разнообразия Шеннона) и линейно коррелируют с долей

37
средневозрастных генеративных особей (g2), составляющих эффективную
численность изученных популяций.
6. Виды рода Adonis характеризуются высоким уровнем межпопуляционной
дифференциации (Gsr равен 39.90% у A. vemalis и 35.77% у A. sibirica). Величина
параметра ниже у D. grandiflora (27.22 %) и Ad. lilifolia (15.51%).
7. Генофонд исследованных популяций D. grandiflora способен
самовоспроизводиться без вмешательства извне при условии сохранения
существующих популяций, их эффективной численности (как определено в
работе, изменяющийся в популяциях от 40 до 304 особей) и существующего
уровня семенной продуктивности (в среднем около 2350 полноценных семян на
особь в год). Генофонд Ad. lilifolia обеднен из-за отсутствия редких аллелей, но
также способен к самовоспроизводству при сохранении существующей
эффективной численности популяций (от 36 до 239 особей) и при формировании
на каждой особи около 570 полноценных семян в год.
8. Выявлено, что у A. vemalis и A. sibirica часть популяций находится на
пороге деградации генофонда из-за антропогенных факторов, среди которых
преобладает разрушение местонахождений из-за строительства горнолыжной
трассы (Asl), нефтепровода (АѵТ), дорог (АѵЗ, АѵІО), а также из-за вытаптывания
вследствие выпаса скота и посещения людьми.
9. Для отбора в качестве объектов сохранения рекомендуются локальные
группы популяций с наиболее типичными характеристиками генофондов, такие
как популяции A. vemalis, расположенные в центральной части островной
Кунгурской лесостепи (Аѵ4, Аѵ5, Аѵ9), а также отдельные популяции, такие как
третья (As3) популяция A. sibirica из Ильинского района, третья (Ad.lil.3)
популяция Ad. lilifolia из Ординского района и вторая (Dg2) популяция D.
grandiflora из Кунгурского района Пермского края.
10. Установлены специфические характеристики генофондов (уникальные
сочетания аллелей многих локусов) для ряда популяций: самой северной
популяции {Av2) A. vemalis на Спасской горе; (Avl) A. vemalis и (Dg3)
D.grandiflora, расположенных в островной Кунгурской лесостепи; а также
(Ad.lil.l) Ad. lilifolia, расположенной на горе Подкаменной, и (As!) A. sibirica из
центральной части Пермского края.

38
 11. С помощью разработанной нами технологии идентификации генофондов
редких видов растений и ее ключевой части (методики молекулярно-генетической
паспортизации) на основании молекулярно-генетического анализа установлены
уровень и состав генетического разнообразия популяций, выявлены популяции с
типичными и специфическими характеристиками генофондов, даны научно
обоснованные рекомендации по сохранению генофондов с учетом уровней
внутри- и межпопуляционного генетического разнообразия, то есть разработана
модельная система оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих
видов растений.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ
1. Боронникова СВ. Семенная продуктивность некоторых видов сем.
Сатрапиіасеае (Пермская обл.) // Раст. ресурсы. 1999. Вып.2. С.43-48.
2. Боронникова СВ. Семенная продуктивность Lilium martagon L. subsp.
pilosiusculum (Freyn) Miscz. Ex Iljin и Paeonia anomala L. (Пермская обл) // Раст.
ресурсы, 2002. Вып.З. С. 50-53.
3. Боронникова СВ.. Кокаева З.Г., Гостимский С.А., Дрибноходова О.П.,
Тихомирова Н.Н. Анализ ДНК-полиморфизма реликтового вида Урала
наперстянки крупноцветковой (Digitalis grandiflora Mill.) с помощью RAPD- и
ISSR-маркеров // Генетика. 2007. Т.43, №5. С.653-659.
4. Боронникова СВ.. Тихомирова Н.Н. Анализ генетической изменчивости
популяций двух редких лекарственных видов рода Adonis с использованием ISSR-
маркеров // Известия ТСХА. 2008а. №1. С.86-94.
5. Боронникова СВ. Молекулярное маркирование и генетическая
паспортизация ресурсных и редких видов растений с целью оптимизации
сохранения их генофондов // Аграрный вестник Урала. 2009а. №2 (56). С. 57-59.
6. Боронникова СВ. Молекулярно-генетическая паспортизация редких
реликтовых видов растений // Вестник Новосибирского государственного
университета. 20096. Т.7, вып.З. С.3-8.
7. Боронникова СВ. Генетическая паспортизация популяций редких видов
растений рода Adonis с использованием ISSR- и IRAP-маркеров // Известия ТСХА.
2009в.№1.С83-89.
8. Боронникова СВ. Исследование генетической изменчивости популяций
редкого вида Урала Adenophora lilifolia (L.) A.DC на основании анализа
полиморфизма ISSR-маркеров // Генетика. 2009г. Т. 45, №5. С.652-655.

39
 9. Боронникова СВ. Генетическая паспортизация редких видов растений как
основа оптимизации сохранения их генофондов // Вопросы современной науки и
практики. Университет им. В.И.Вернадского. 2009д. №3 (17). С.8-15.
10.Боронникова СВ., Светлакова Т.Н., Бобошина И.В. Изучение генетического
полиморфизма Populus tremula L. с использованием ISSR- и IRAP- маркеров //
Аграрная Россия. 2009а. №2. С.20-22.
11.Боронникова СВ.. Тихомирова Н.Н. Семенная продуктивность редкого
лекарственного вида Digitalis grandiflora Mill, в Пермском крае // Раст. ресурсы.
20096. №2. С. 17-22.
12. Боронникова СВ., Тихомирова Н.Н., Кравченко. О.А. Характеристика
генофондов редкого лекарственного вида Adonis vernalis L. с использованием
ISSR-маркеров // Аграрный вестник Урала. 2009в. № 5 (59). С.67-70.
Монографии
1. Боронникова СВ. Молекулярно-генетическая идентификация и
паспортизация редких и находящихся под угрозой уничтожения видов растений.
Перм. ун-т. Пермь, 2008. 120 с.
2. Красная книга Пермского края / М.А. Бакланов, СВ. Баландин, Т.П.
Белковская, В.Д. Белоногова, СВ. Боронникова и др. Под общ. ред. А.И. Шепеля.
Пермь: Книжный мир, 2008. 256 с.
Учебно-методическое пособие
1. Молекулярная генетика: учебно-методическое пособие / под. ред СВ.
Боронниковой: Перм. ун-т. Пермь, 2007. 150 с.
Публикации в других изданиях
1. Боронникова СВ. Изучение репродуктивной биологии редких видов
растений Урала // Содержание и формы экологического образования в педвузе.
Часть 2. Тезисы второго республиканского совещания-семинара. Пермь, 1990.
С.104-106.
2. Верещагина В.А., Боронникова СВ. Охрана генофонда дикорастущих
декоративных растений Предуралья // Охраняемые природные территории.
Проблемы выявления, исследования, организации систем: Тезисы докладов
межвузовской научной конференции. Часть 2. Пермский университет. Пермь,
1994. С.8-10.
3. Боронникова СВ. Репродуктивная биология колокольчиковых // Вестник
Пермского университета. Биология. 1995. Вып. 1. С. 28-36.
4. Боронникова СВ. Репродуктивная биология декоративных дикорастущих
видов растений Предуралья. Тезисы докладов V научной конференции памяти
проф. А.А.Уранова. // Популяции и сообщества растений: экология,
биоразнообразие, мониторинг. Кострома, 1996. Ч. 2. С. 102-103.

40
 5. Боронникова СВ. Влияние антропогенного фактора на семенную
продуктивность колокольчиковых // Жизнь популяций в гетерогенной среде. 4.2.
Йошкар-Ола: Периодика Марий Эл, 1998. С. 151-152.
6. Боронникова СВ. Репродуктивная биология некоторых охраняемых
растений Предуралья // Флористические и геоботанические исследования в
Европейской России: Материалы Всероссийской научной конференции,
посвященной 100-летию со дня рождения проф. Фурсаева. Саратов, 2000. С.403-
405.
7. Боронникова СВ.. Жуйкова Н.А., Матюшина М.А. Некоторые аспекты
репродуктивной биологии колокольчиковых // Вестник Пермского университета.
Заказник "Предуралье". Вып. 3. Пермь, 2000. С. 164-167.
8. Боронникова СВ., Куницына Е.Г. Оценка состояния двух ценопопуляций
пиона уклоняющегося в Пермской области // Вестник Пермского университета.
Биология. Вып.4. Пермь, 2001. С. 17-21.
9. Боронникова СВ., Бердникова Ю.В., Галиева Т.А Оценка состояния
ценопопуляций некоторых редких видов растений в Пермской области //
Фундаментальные и прикладные проблемы популяционнои биологии. Сборник
тезисов докладов VI Всероссийского популяционного семинара. Нижний Тагил,
2002. С.16-18.
10. Боронникова СВ. Семенная продуктивность редких видов Пермской
области // Ботанические исследования в азиатской России: Материлы XI съезда
Русского ботанического об-ва. Барнаул: Изд-во АзБуки, 2003.Т.З. С.292-293.
11. Боронникова СВ.. Стамикова Е.И. К оценке состояния ценопопуляций
некоторых редких видов растений II Растительный покров Пермской области и его
охрана: межвузовский сборник научных трудов. Пермь, 2003. С.38-44.
12. Боронникова СВ. Гетерогенность ценопопуляций двух видов рода Adonis L.
// Вестник Пермского университета. Биология. Вып. 6. Пермь: ПГУ, 2005. С.22-36.
13. Tihomirova N.N., Boronnikova S.V. Kokaeva Z.G., Gostimsky S.A. Molecular
genetic investigations of medical plants // Proceedings of the IV Balkan Botanical
Congress. (Sofia, 20-26 June 2006). Sofia, 2006. P.35.
14.Кокаева З.Г., Боронникова СВ.. Тихомирова Н.Н., Дрибноходова О.П.
Анализ генетического разнообразия популяционных систем редких и ресурсных
видов растений // IV Международная научная конференция «Биотехнология -
охране окружающей среды». Доклады МОИП. Москва, 2006. С. 75-79.
15. Кокаева З.Г., Гостимский С А., Боронникова СВ. Анализ изменчивости
природных популяций редкого вида растений Предуралья Digitalis grandijlora
Mill, с помощью молекулярных маркеров // Материалы международной научно-
практической конференции и VII Международного симпозиума «Нетрадиционные

41
и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования».
Белгород, 2006. Т.2. С. 12-16.
16. Тихомирова Н.Н., Боронникова СВ. Структура ценопопуляций и семенная
продуктивность Digitalis grandiflora Mill, в Предуралье // Бюллетень
Ботанического сада Саратовского государственного университета. Вып.5.
Материалы Всероссийской научной конференции «Ботанические исследования в
Поволжье и на Урале», посвященные 50-летию Ботанического сада СГУ им.
Чернышевского. Саратов, 2006. С.77-82.
17. Тихомирова Н.Н., Боронникова СВ. ДНК-полиморфизм и демографические
характеристики популяций некоторых редких видов растений Предуралья //
Международная конференции «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию
Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Москва, 2006. С.200.
18. Боронникова СВ., Кокаева З.Г., Тихомирова Н.Н. Генетическое
разнообразие популяций некоторых редких видов растений Пермского края при
антропогенных воздействиях // Международная научно-практическая
конференция «Антропогенная динамика природной среды»: Материалы
международной научно-практической конференции. Пермь, 2006.Т. II. С. 107-112.
19. Календарь Р.Н, Боронникова СВ. Анализ молекулярно-генетического
полиморфизма природных популяций редких видов растений Урала с помощью
ретротранспозонов // Материалы Четвертого Московского международного
конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития». М.: ЗАО «Экспо-
биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007.4.2. С.121.
20. Тихомирова Н.Н.. Боронникова СВ.. Кокаева З.Г., Гостимский С.А. Анализ
генетического разнообразия популяций лекарственных и редких видов растений
Урала // Материалы Четвертого Московского международного конгресса
«Биотехнология: состояние и перспективы развития» М.: ЗАО «Экспо-биохим-
технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007.4. 2. С. 122-123.
21. Боронникова СВ. Популяционно-генетический мониторинг генофондов
редких ресурсных видов растений Пермского края // Флора Урала в пределах
бывшей Пермской губернии и ее охрана: материалы межрегиональной
конференции, посвященной 140-летию со дня рождения П.В.Сюзева / под ред.
Е.И.Демьяновой / СА.Овеснова / Л.Г.Переведенцевой. Пермь, 2007. С37- 43.
22. Боронникова СВ. Анализ генетического разнообразия популяций редких
видов растений как критерий оценки их состояния // Фундаментальные и
прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: Материалы Всероссийской
конф. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008а. Ч.З. С.323-326.
23. Боронникова СВ., Календарь Р.Н. Ретротранспозоны в геномах
лекарственных растений // Нанотехнологии в сельском хозяйстве: Доклады

42
Международной научно-практической конференции. М.: Изд-во РГАУ-МСХА
имени К.А.Тимирязева, 2008. С. 20-21.
24.Боронникова СВ.. Тихомирова Н.Н. Анализ генетической изменчивости
некоторых редких лекарственных видов растений // Научное наследие
Н.И.Вавилова - фундамент для развития отечественного и мирового сельского
хозяйства. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, 20086. С. 222-229.
25. Боронникова СВ.. Дрибноходова О.П., Кокаева З.Г. и др. Динамика
генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных
растений Пермского края при антропогенных воздействиях // Региональный
конкурс РФФИ-Урал. Пермь, Екатеринбург, 2008в. 4.2. С.60-63.
26. Боронникова СВ.. Тихомирова Н.Н., Светлакова Т.Н. и др. Использование
микросателлитов для анализа геномов редких видов растений // Нанотехнологии в
сельском хозяйстве: Доклады Междунар. научно-практической конференции. М.:
Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, 2008г. С. 107-108.
27. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Королева Ю.А. Боронникова СВ.
Использование ДНК-технологий для оценки состояния популяций ресурсных
видов растений // Нанотехнологии в сельском хозяйстве: Доклады Междунар.
научно-практической конференции. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени
КА.Тимирязева, 2008д. С.109-110.
28.Тихомирова Н.Н., Боронникова СВ. Анализ геномов лекарственных
растений с использованием молекулярных маркеров // Материалы Пятого
Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и
перспективы развития». М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им.
Д.И.Менделееева, 2009. 41. С.213.
29. Боронникова СВ. Молекулярно-генетическая паспортизация и
идентификация редких лекарственных растений // Материалы Пятого
Московского междунар. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы
развития». М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И.Менделееева,
2009Ж.Ч. 1.С269-270.
30. Боронникова СВ., Календарь Р.Н.. Использование молекулярных маркеров
на основе ретротранспозонов для анализа и сохранения генофондов редких видов
растений // Материалы Пятого Московского междунар.конгресса «Биотехнология:
состояние и перспективы развития» М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ
им. Д.И. Менделееева, 2009.4.2. С.201.
31. Боронникова СВ. Генетическая паспортизация природных популяций
редких видов растений с использованием ISSR- и IRAP-маркеров // Материалы
Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения
4арльза Дарвина, Пятого Съезда Вавиловского общества генетиков и
селекционеров. М., 2009. 4.II. с. 149.
43
 Список использованных сокращений

оппт- особо охраняемая природная территория

IPTG- isopropyl-p-D-1 -thiogalactopyranoside
IRAP- Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism
ISSR- Inter Simple Sequence Repeats
NCBI National Center for Biotechnology Information
LTR- Long Terminal Repeats
pGEM-T- плазмидный вектор для E.coli (Promega)
X-Gal- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-D-galactopyranoside
UPGMA- unweighed pair-grup method using arithmetic average

44
 БОРОННИКОВА СВЕТЛАНА ВИТАЛЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ
ГЕНОФОНДОВ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ
РАСТЕНИЙ ПЕРМСКОГО КРАЯ

Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук

Лицензия ПД № 11-0002
Подписано в печать 15.09.2009. Формат 60x90/16.
Набор компьютерный. Усл.печ.л. 2.
Тираж 100 экз. Заказ № 597/2009.

Отпечатано в типографии «Пресстайм»

Адрес: 614025, г. Пермь, ул. Героев Хасана, 105