Вы находитесь на странице: 1из 17

ISSN 0868–5886 НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1, c.

11–25

ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ

УДК 543 + 544.173 + 504.064

 Е. Н. Чернова, Я. В. Русских, Е. П. Подольская, З. А. Жаковская

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОЦИСТИНОВ И АНАТОКСИНА-А МЕТОДОМ


ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
НИЗКОГО РАЗРЕШЕНИЯ
Предложен вариант метода детектирования микроцистинов и анатоксина-а, основанный на их специфиче-
ской фрагментации при тандемном масс-спектрометрическом анализе, с применением масс-спектрометрии
низкого разрешения. Приведены значения m/z, структура диагностических ион-продуктов и тандемные
спектры для 9 вариантов наиболее распространенных микроцистинов. На основании полученных фрагмент-
ных масс-спектров и систематизированных литературных данных предложена новая классификация ион-
продуктов микроцистинов, значительно облегчающая процедуру их идентификации и позволяющая по на-
бору диагностических фрагментов установить структуру разных вариантов микроцистинов без использова-
ния стандартных соединений. Представленный метод исследования микроцистинов и анатоксина-а с помо-
щью масс-спектрометрии низкого разрешения может быть рекомендован как для качественного, так и ко-
личественного определения указанных цианобактериальных метаболитов в биомассе цианобактерий, в при-
родной и питьевой воде в отсутствие полного набора стандартных соединений.

Кл. сл.: микроцистины, анатоксин-а, жидкостная хроматография, тандемная масс-спектрометрия низкого


разрешения, диагностические ион-продукты, идентификация

ВВЕДЕНИЕ цианобактерий — цианотоксинов, опасных для


здоровья и жизни людей и животных. В пресно-
С каждым годом проблема цианобактериаль- водных водоемах европейской части России наи-
ных "цветений" становится все более значимой, более распространены цианобактериальные ней-
особенно для водохранилищ, лагун и водоемов ротоксины (анатоксины) и гепатотоксины (микро-
рекреационного использования европейской тер- цистины) [1−7]. К микроцистинам (МС) относятся
ритории России. Активная вегетация сине- более 80 циклических гептапептидов (рис. 1) с мо-
зеленых водорослей (цианобактерий) часто приво- лекулярными массами в интервале 900−1150 Да.
дит к появлению в воде токсичных метаболитов

Рис. 1. Общая структура микроцистинов и установленные варианты аминокислотных последовательностей


для каждой позиции пептидного кольца микроцистинов.
Вариабельные L-аминокислоты в положениях 2 и 4 на рисунке обозначены Х и Z соответственно [8, 9]

11
12 Е. Н. ЧЕРНОВА, Я. В. РУССКИХ, Е. П. ПОДОЛЬСКАЯ, З. А. ЖАКОВСКАЯ

Наиболее токсичным на сегодняшний день при- ров низкого разрешения в режиме МЗР-переходов
знан микроцистин МС-LR; рекомендуемая вели- анализируемое соединение (аналит) считается
чина предельно допустимого его содержания идентифицированным при соблюдении трех кри-
в питьевой воде — 1 мкг/л; для рекреационных териев:
вод — 20 мкг/л [10]. Однако нормирование и оп- – его время удерживания на колонке совпадает
ределение содержания только одного представи- с таковым для стандартного соединения;
теля микроцистинов является не совсем правиль- – присутствует не менее двух диагностических
ным, т. к. другие микроцистины могут присутст- (характеристичных) ион-продуктов (для количест-
вовать в значительно большем количестве и об- венного и подтверждающего переходов);
ладать сравнимой суммарной токсичностью. Ус- – величина соотношения интенсивностей вы-
тановлено, что токсичность различных представи- бранных сигналов совпадает с установленным для
телей микроцистинов варьируется в диапазоне стандартного соединения для используемого при-
LD50 (мыши, i. p.) от 50 мкг/кг (МС-LR) до более бора в выбранных условиях анализа [22].
1 мг/кг (для линейных структур МС) [11], причем Поскольку молекулы микроцистинов представ-
смесь микроцистинов может обладать более ток- ляют собой циклические пептидные структуры, то
сичным действием, чем отдельные представители в тандемном масс-спектре присутствует достаточ-
[12]. В связи с этим наряду с МС-LR целесообраз- но большое количество ион-продуктов с различ-
но проводить детектирование и других представи- ной интенсивностью сигналов, зависящей от при-
телей микроцистинов. Кроме того, среди нейро- меняемого оборудования и его настроек. При оп-
токсичных метаболитов наиболее часто встречает- тимизации метода детектирования с помощью
ся низкомолекулярный алкалоид анатоксин-а, ко- масс-спектрометров низкого разрешения осущест-
торый относят к соединениям, называемым "фак- вляется выбор диагностических ион-продуктов
тором быстрой смерти" [13], и при детектировании в применяемых условиях проведения анализа.
которого зачастую возникают затруднения [14]. В связи с этим была бы полезна максимально пол-
В настоящее время опубликован ряд статей, ная информация о наборе диагностических ион-
описывающих различные подходы масс-спектро- продуктов и систематизация приведенных в лите-
метрической идентификации и детектирования ратуре данных для разработки схемы идентифика-
микроцистинов. Для количественного определе- ции различных вариантов микроцистинов.
ния рассматриваемых токсичных соединений наи- Таким образом, целью нашей работы было
более часто используют масс-спектрометрические предложить вариант метода определения МС
методы [15, 16]. Метод определения микроцисти- в объектах окружающей среды, основанный на их
нов и анатоксина-а с использованием масс- специфической фрагментации с учетом структур-
спектрометрии высокого разрешения (30 000 ных различий индивидуальных представителей
и выше) хорошо подходит для исследовательских микроцистинов, при использовании более доступ-
целей [17, 18]. Однако стоимость приборов высо- ных масс-спектрометров низкого разрешения.
кого разрешения достаточно высока, поэтому для Также предполагалась разработка классификации
рутинного анализа чаще используют более дос- ион-продуктов по структурным фрагментам для
тупные приборы низкого разрешения с возможно- идентификации вариантов микроцистинов в от-
стью регистрации тандемных масс-спектров [8, 19, сутствие стандартных соединений.
20]. В этом случае идентификацию обычно прово- Данное исследование выполнено на примере
дят с использованием режима мониторинга задан- анатоксина-а и смеси наиболее распространенных
ных реакций (MЗР-переходов, MRM), обеспечи- в водоемах умеренных широт (MC-LR, MC-RR,
вающего высокую чувствительность и хорошую MC-YR, [D-Asp3]MC-LR и [D-Asp3]MC -RR, MC-
воспроизводимость анализа. Для проведения ис- LY, MC-LA, MC-LW, MC-LF) микроцистинов.
следования с помощью масс-спектрометров низ-
кого разрешения необходимы стандартные соеди-
нения. На настоящий момент коммерчески дос- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
тупны стандарты только 10 микроцистинов, что
значительно ограничивает возможности примене- Используемые реактивы: ацетонитрил сорта "0"
ния таких приборов для широкого скрининга мик- (Криохром); метанол марки LC-MS
роцистинов. CHROMASOLV (Fluka); вода, очищенная с по-
В последнее время много внимания уделяется мощью системы Direct-Q (Millipore, элек-
проблеме интерпретации масс-спектрометри- тропроводность 0.056 мкСм/см при 250 °С);
ческих данных и получения надежных результатов муравьиная кислота (Merck, 98−100 % для
[21, 22]. С учетом современных требований к про- анализа). Стандарты: анатоксина-aфумарат фирм
ведению идентификации с использованием прибо- A. G. Scientific, Inc. CA и TOCRIS bioscience UK,

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОЦИСТИНОВ И АНАТОКСИНА-А... 13

смесь микроцистинов -LR, -RR, -YR (фирмы во втором — 510−550 и 970−1100. Температура
SigmaAldrich), а также стандартные соединения ионного источника 320 °С, поток газа-носителя
микроцистинов -LY, -LA, -LW, -LF, [D-Asp3]MC- (азот) 25 arb un., напряжение ISpray 3.2 кВ. В ре-
LR и [D-Asp3]MC-RR (фирмы EnzoLifesciences жиме эмулирования низкого разрешения масс-
Inc., New York, USA). спектрометрический анализ проводили с исполь-
Работа выполнена с использованием линейной зованием линейной ионной ловушки. Фрагмента-
ионной ловушки хромато-масс-спектрометра цию проводили с использованием ДИС-режима
LTQXLOrbitrap (ThermoFinnigan) для эмулирова- ("диссоциация, индуцируемая соударениями").
ния режима низкого разрешения. Данный прибор Величина энергии фрагментации (в %) и напряже-
является комбинацией высокоэффективного жид- ние на линзах составляли 35 % и 20 В — для ана-
костного хроматографа и тандемного масс- токсина-а, 25 % и 35 В — для аргинин-содер-
спектрометра, состоящего из двух видов ионных жащих микроцистинов, 35 % и 45 В — для лей-
ловушек. Конфигурация прибора позволяет про- цин-содержащих. Масс-спектры записывали в
водить разделение ионов как в линейной ионной двух режимах: сканирование ионного тока в вы-
(низкое разрешение, полный МСn-спектр), так и в бранных диапазонах m/z и регистрация полных
орбитальной ловушке с Фурье-преобразователем тандемных масс-спектров.
(высокое разрешение, полный МСn-спектр с высо-
кой точностью определения масс). Кроме того,
линейная ионная ловушка может работать как от- РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
дельный прибор с низким разрешением, и с ее по-
мощью можно получать информацию о фрагмен- Структура микроцистинов
тации соединений [23, 24]. Общая структура микроцистинов содержит
Подбор условий хроматографического разделе- цикл из семи аминокислот, пять из которых посто-
ния и оптимизацию параметров масс-спектро- янны в составе соединений этого класса, вклю-
метрического детектирования проводили с ис- чая характеристическую Adda-кислоту (3-амино-9-
пользованием растворов стандартных соединений метокси-2,6,8-триметил-10-фенилдека-4,6-диено-
(100 нг/мл в метаноле). Для оптимального хрома- евая кислота), а две L-аминокислоты в положени-
тографического разделения смеси микроцистинов ях 2 и 4 вариабельны (рис. 1). Общепринятые аб-
на обращенно-фазовой колонке лучше всего под-
бревиатуры вариабельных аминокислот указыва-
ходит модифицирующая добавка трифторуксус-
ются в качестве суффикса в названии микроцис-
ной кислоты (ТФУ). Однако ТФУ может вызывать
подавление ионизации при масс-спектрометри- тина. Так, в структуре наиболее известного и ток-
ческом анализе [25, 26], поэтому в данной работе сичного представителя микроцистинов МС-LR
применяли в качестве подвижной фазы смесь воды (молекулярная масса 994) присутствуют лейцин
и ацетонитрила с добавкой 0.05 об.% муравьиной (Leu → L) во втором положении и аргинин (Arg →
кислоты, которая не оказывает влияния на иониза- R) в четвертом.
цию [27]. Так как микроцистины представляют В структуре других представителей микроцис-
собой группу соединений, отличающихся по сво- тинов могут содержаться следующие L-амино-
им физико-химическим свойствам, их разделение кислоты: тирозин (Tyr, Y), гомотирозин (Hty), фе-
проводили в градиентном режиме в широком ин- нилаланин (Phe, F), метионин (Met, М), триптофан
тервале органического компонента подвижной (Trp, W), аланин (Ala, А) или гомоаргинин (Har)
фазы на хроматографической колонке Thermo (рис. 1) [8, 9]. В десяти из установленных структур
Hypersil Gold 100 × 3 мм, 3 мкм. Первые десять встречаются модификации в Adda-кислоте в пятом
минут хроматографирования применяли изократи- положении: либо деметилирование по метокси-
ческий режим при 5 % органической фазы для группе (DMAdda), либо ее замена на ацетокси-
элюирования анатоксина-а с дальнейшим нараста- группу (ADMAdda). Другие модификации в струк-
нием органического компонента до 75 % за 18 мин, туре микроцистинов могут быть вызваны демети-
затем для очистки колонки от гидрофобных мат- лированием метилдегидробутирина (methyl-
ричных соединений содержание ацетонитрила по- dehydrobutyrine, Mdha) в 7 положении, с образова-
вышали до 95 %. Уравновешивание колонки про- нием дегидробутирина (dehydrobutyrine, Dhb),
водили при начальных условиях анализа в течение замена на N-метилсерин (methylserine, MeSer); де-
7 мин. Скорость потока составляла 0.2 мл/мин. метилированием в третьем положении метиласпа-
Масс-спектрометрический анализ проводили рагининовой кислоты (MeAsp). Модификации в
в условиях электрораспылительной ионизации положениях 1, 3, 5, 6 и 7 отражаются в названии
в режиме регистрации положительных ионов. микроцистинов введением стандартной аббревиа-
Масс-хроматограмма была разделена на 2 сегмен- туры замещающей аминокислоты с указанием но-
та. Сканируемый диапазон масс (полный ионный мера ее положения в кольце. Например, [D-
ток) (m/z) в первом сегменте составлял 160–200, Asp3]МС-LR [28].

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


14 Е. Н. ЧЕРНОВА, Я. В. РУССКИХ, Е. П. ПОДОЛЬСКАЯ, З. А. ЖАКОВСКАЯ

Табл. 1. Возможные варианты детектируемых наиболее интенсивных моле-


кулярных ионов микроцистинов при электрораспылительной ионизации [29]

Регистрируемые
Микроцистин Детектируемый ион
значения m/z
MC-LR 995.56 [M+H]+

[D-Asp3]MC-LR 981.54 [M+H]+

MC-RR 519.78 / 1038.57 [M+2H]2+, [M+H]+

[D-Asp3]MC-RR 512.78 / 1024.56 [M+2H]2+, [M+H]+

MC-YR 1045.54 [M+H]+

MC-LF 986.52 / 1008.51 [M+H]+, [M+Na]+

MC-LY 1002.52 / 1024.50 [M+H]+, [M+Na]+

MC-LW 1025.53 / 1047.52 [M+H]+, [M+Na]+

Условно микроцистины разделяют на две груп- тенсивный сигнал c m/z, соответствующий ионно-
пы — по содержанию в них аргинина в четвертом му аддукту молекулы с натрием ([M+Na]+)
положении, поскольку это оказывает значительное (табл. 1) [29].
влияние на их физико-химические свойства. Так, С целью установления наиболее интенсивных
содержащие аргинин проявляют гидрофильные сигналов, соответствующих молекулярному иону,
свойства, а не содержащие — гидрофобные. анализировали раствор стандартов с концентраци-
К гидрофобным, например, относят микроцистин ей каждого соединения 100 нг/мл (ввод 10 мкл)
МС-LF (m/z 986) и МС-LW (m/z 1025), в структуре при сканировании полного ионного тока в вероят-
которых аргинин в положении 4 заменен соответ- ном диапазоне масс для изучаемых соединений
ственно на фенилаланин Phe (F) и триптофан Trp (m/z 510−550 для двузарядных молекулярных ио-
(W). нов микроцистинов и m/z 970−1100 — для одноза-
рядных ионов и возможных ионных аддуктов
Масс-спектрометрическое детектирование с натрием). Наиболее интенсивные сигналы двуза-
микроцистинов рядных молекулярных ионов были отмечены для
МС-RR и [D-Asp3]МС-RR. Для остальных изучае-
Вследствие различий в структурах микроцис- мых соединений наблюдали максимальные сигна-
тинов ионизация их молекул может протекать по- лы однократно протонированных молекул. Интен-
разному. В масс-спектрах большинства микроцис- сивных сигналов, соответствующих ионным ад-
тинов регистрируется преимущественно достаточ- дуктам с натрием, детектировано не было.
но интенсивный сигнал, соответствующий прото- При анализе растворов стандартных веществ
нированной молекуле ([M+H]+). В масс-спектре были установлены времена удерживания анали-
микроцистинов, содержащих в своей структуре тов. Пример разделения смеси микроцистинов
два аргинина (микроцистин-RR и его метилиро- и полученные значения площадей пиков аналитов
ванные и деметилированные формы), чаще на- представлены на рис. 2. Как видно из приведенной
блюдается наиболее интенсивный сигнал, соответ- масс-хроматограммы с обращенно-фазовой хрома-
ствующий двузарядному молекулярному иону тографической колонки, в примененном градиент-
([M+2H]2+). ном режиме сначала элюируются "гидрофильные",
При выполнении масс-спектрометрического а затем "гидрофобные" микроцистины. Установ-
анализа возможно образование различных заря- ленный порядок удерживания будет соблюдаться
женных аддуктов, например с натрием, поэтому при использовании обращенно-фазовой колонки
необходимо учитывать, что при ионизации моле- и выбранной подвижной фазы. Следует отметить,
кулы аналита не всегда наибольшую интенсив- что при равных концентрациях в растворе стан-
ность имеет сигнал протонированного молекуляр- дартов регистрируемая площадь сигналов анали-
ного иона. Так, для ряда "гидрофобных" микро- тов в режиме сканирования полного ионного тока
цистинов некоторые исследователи отмечают ин- отличалась, что подтверждает необходимость

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОЦИСТИНОВ И АНАТОКСИНА-А... 15

применения стандартных растворов для проведе- нейной ловушки низкого разрешения LTQOrbitrap
ния количественного анализа. Максимальная пло- в режиме сканирования полного масс-спектра ион-
щадь сигнала отмечалась для дважды протониро- продуктов. Примеры полученных спектров пред-
ванных молекул MC-RR и [D-Asp3]МС-RR. В то ставлены на рис. 3, 4. Рассмотрим фрагментацию
же время масс-спектрометрические сигналы моле- микроцистина-LR, признанного наиболее токсич-
кулярных ионов гидрофобных микроцистинов об- ным [8] (рис. 3, а). Некоторые ион-продукты, рас-
ладали сравнительно меньшей интенсивностью положенные в области масс-спектра до m/z 450,
по сравнению с сигналом молекулярного иона характерны для всех микроцистинов с не-
МС-LR. модифицированной Adda-кислотой. Например,
Фрагментация микроцистинов m/z 135, соответствующий отщеплению
PhCH2CH(OCH3)-фрагмента Adda-кислоты
В настоящей работе обсуждается фрагментация
микроцистинов, полученная с использованием ли- [C9H11O]+; m/z 155 [Mdha-Ala+H]+; m/z 163
[C11H15O]+; m/z 213 [Glu-Mdha+H]+; m/z 284 [Ala-
Mdha-Glu+H]+; m/z 375 [C11H15O-Glu-Mdha]+,
m/z 446 [C11H15O-Glu-Mdha-Ala]+ [20, 23]. Однако
не все они обладают достаточной интенсивностью
сигнала для использования в качестве ион-
продукта для количественного перехода. Поэтому
некоторые исследователи проводят количественный
расчет по сигналу, соответствующему заряженной
молекуле, а диагностические ион-продукты, полу-
чаемые в МЗР, используют только для подтвер-
ждения [19]. Однако такой подход применим
только в том случае, когда в матрице не присутст-
вуют близкие к аналитам по молекулярной массе
Время, мин а соединения.
Другими диагностическими ион-продуктами
MC-LR (структура фрагмента включает и Leu,
и Arg) являются m/z 682 [Glu-Mdha-Ala-Leu-
MeAsp-Arg+H]+, m/z 553 [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-
Arg+H]+, m/z 525 [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-
Arg+H−CO]+ и m/z 470 [Ala-Leu-MeAsp-Arg+H]+
или [Arg-Adda+H]+. Поскольку аминокислота ар-
гинин присутствует в структуре MC-LR, его масс-
спектр фрагментации также содержит диагности-
ческие ионы аргинин-содержащих "гидрофиль-
ных" микроцистинов при m/z 866 [Arg-Adda-Glu-
Время, мин б Mdha-Ala-Leu+H]+ или [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-Arg-
Adda+H]+, m/z 728 [MeAsp-Arg-Adda-Glu+H]+,
Рис. 2. Хроматограммы раствора смеси стандартов m/z 710 [MeAsp-Arg-Adda-Glu+H-H2O]+, m/z 599
микроцистинов (МС-LR, MC-RR, MC-YR, [D- [Arg-Adda-Glu+H]+, m/z 571 [Arg-Adda-Glu+H-
Asp3]MC-LR, [D-Asp3]MC-RR, МС-LY, MC-LA, MC- CO]+, m/z 286 [MeAsp-Arg+H]+ и m/z 174 [Arg-
LW, MC-LF).
Масс-хроматограммы зарегистрированы по соответ- NH3+H]+.
ствующим выделенным протонированным молеку- Характеристические ион-продукты, образую-
лам. Разделение проводили в градиентном режиме щиеся в результате отщепления малых молекул
на колонке ThermoHypersilGold 100×3 мм, 3 мкм, при от МС-LR с m/z 978 [M+H−NH3]+, m/z 977
скорости потока 0.2 мл/мин. Подвижные фазы —
вода и ацетонитрил, обе с добавкой муравьиной ки-
[M+H−H2O]+, m/z 967 [M+H−CO]+ и m/z 951
слоты. [M+H−CO2]+, отличаются наиболее интенсивными
Масс-спектрометрический анализ: электрораспыли- сигналами в фрагментарном cпектре МС-LR. Од-
тельная ионизация в режиме регистрации положи- нако такая фрагментация может протекать для
тельных ионов при сканировании полного ионного любой органической молекулы такой же массы
тока и имеющей в своем составе гидрокси-, амино-
и карбонильные функциональные группы (что

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


16 Е. Н. ЧЕРНОВА, Я. В. РУССКИХ, Е. П. ПОДОЛЬСКАЯ, З. А. ЖАКОВСКАЯ

вполне вероятно для органической молекулы), по- (фрагмент содержит аминокислоты, не являющие-
этому подобные ион-продукты не рекомендуется ся вариабельными, т. е. все кроме аминокислот
выбирать в качестве диагностических. в положениях 2 и 4), исключая метилированные
Аналогичным образом был проведен анализ и деметилированные формы;
полученных тандемных масс-спектров для ос-  фрагменты, содержащие аминокислоты либо
тальных исследуемых микроцистинов. Так как в положении 2 лейцин ("гидрофобные"), либо
закономерности фрагментации "гидрофильных" в положении 4 аргинин ("гидрофильные");
(рис. 3) и "гидрофобных" (рис. 4) представителей  диагностические фрагменты, характери-
микроцистинов значительно отличаются, полу- зующие индивидуального представителя.
чаемые фрагментарные ионы условно можно раз- То есть, исходя из структуры возможных диаг-
делить на несколько групп: ностических ион-продуктов и значений их m/z, все
 принадлежащие большинству микроцистинов

а г

б д

Рис. 3. Полные тандемные масс-спектры изученных


микроцистинов МС-LR (а), [D-Asp3]MC-LR (б), MC-
RR (в), [D-Asp3]MC-RR (г), MC-YR (д).
Фрагментацию проводили с использованием ДИС-
режима в линейной ионной ловушке. Энергия соуда-
рений 35 %. На спектрах отмечены значения диагно-
стических ионов соответствующих микроцистинов

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОЦИСТИНОВ И АНАТОКСИНА-А... 17

диагностические ион-продукты можно разделить роцистинов. Модификации в рассматриваемой


по группам, представленным в табл. 2, 3. При ин- аминокислотной последовательности (например,
терпретации фрагментных масс-спектров следует деметилирование аспарагининовой кислоты в по-
учитывать, что вследствие различной интенсивно- ложении 3) будут изменять набор значений m/z
сти сигналов, представленных в таблицах ионов, диагностических фрагментов (вследствие измене-
не все перечисленные сигналы могут присутство- ния модифицированного участка фрагмента).
вать в спектрах соответствующей им группы мик-

в
а

г
б

Рис. 4. Полные тандемные масс-спектры изученных микроцистинов MC-LA (а), MC-LF (б), MC-LW (в),
МС-LY (г).
Фрагментацию проводили с использованием ДИС-режима в линейной ионной ловушке. Энергия соударений
35 %. На спектрах отмечены значения диагностических ионов соответствующих микроцистинов

Табл. 2. Диагностические ион-продукты с рассчитанной величиной m/z для идентификации МС

Для всех МС с немодифицированной Adda-кислотой

m/z Фрагментный ион m/z Фрагментный ион

580 [Adda-Glu-Mdha-Ala+H]+ 509 [Adda-Glu-Mdha+H]+

446 [C11H15O-Glu-Mdha-Ala]+ 375 [C11H15O-Glu-Mdha]+

284* [Ala-Mdha-Glu+H]+ 213* [Glu-Mdha+H]+

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


18 Е. Н. ЧЕРНОВА, Я. В. РУССКИХ, Е. П. ПОДОЛЬСКАЯ, З. А. ЖАКОВСКАЯ

Табл. 2. Продолжение

Для всех МС с немодифицированной Adda-кислотой

m/z Фрагментный ион m/z Фрагментный ион

163* [C11H15O]+ 155* [Mdha-Ala+H]+

135* [C9H11O] + – –

Для лейцинсодержащих МС

693 [Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu+H] + 559 [C11H15O-Glu-Mdha-Ala-Leu] +

Для аргининсодержащих MC

728 [MeAsp-Arg-Adda-Glu+H]+ 710 [MeAsp-Arg-Adda-Glu-H2O+H]+

682 [Arg-Adda-Glu-Mdha+H] + 599 [Arg-Adda-Glu+H] +

470 [Arg-Adda+H] + 453 [Arg-Adda+H−NH3]+

Примечание. * — значения m/z описаны в литературных данных [8, 23, 28], но не были детектированы
в тандемных масс-спектрах, полученных в условиях нашего исследования

Табл. 3. Диагностические ион-продукты с вариабельной величиной m/z для идентификации МС


Для индивидуального представителя аргининсодержащего микроцистина (значение m/z зависит
от массы заместителя в R2-положении)
[Arg-Adda-Glu-Mdha-Ala-R2+H] + [Mdha-Ala-R2-MeAsp-Arg−NH2+H] +

[Mdha-Ala-R2-MeAsp-Arg+H] + [Mdha-Ala-R2-MeAsp-Arg-Adda+H] +

[Ala-R2-MeAsp-Arg+H] + –
Для индивидуального представителя, включая лейцинсодержащие микроцистины (значение m/z
зависит от массы заместителя в R4-положении)
[R4-Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu+H]+ [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-R4-Adda+H]+

[R4-Adda-Glu-Mdha+H]+ [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-R4+H] +

[R4-Adda-Glu+H] + [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-R4+H−NH2] +

[R4-Adda+H]+ [C11H15O-Glu-Mdha-Ala-Leu-MeAsp-R4]+

[MeAsp-R4-Adda-Glu+H]+ [C11H15O-Glu- Mdha-Ala-Leu-MeAsp-R4−NH3]+

[MeAsp-R4-Adda-Glu+H−H2O]+ [MeAsp-R4-C11H15O-Glu-Mdha-Ala]+

[Ala-Leu-MeAsp-R4+H−NH2]+ [Ala-Leu-MeAsp-R4+H]+

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОЦИСТИНОВ И АНАТОКСИНА-А... 19

На основе предложенной классификации ион- ментации в ловушке не удерживаются массы


продуктов и интенсивности сигналов этих ионов фрагментов менее 28 % от массы ион-прекурсора
в примененных условиях детектирования были (так называемое "правило 1/3"). В то же время
выбраны диагностические ионы для изучаемых фрагментные масс-спектры этого микроцистина,
представителей микроцистинов. В связи с тем, что полученные при помощи тандемного квадруполь-
интенсивность получаемых откликов ион-про- ного масс-спектрометра (тройного квадрупольно-
дуктов зависит от типа используемого масс- го масс-спектрометра), содержат достаточно ин-
спектрометра и приборных настроек, выбранные тенсивный сигнал указанного характеристичного
диагностические ион-продукты и соотношение иона [8, 19, 20].
интенсивностей их сигналов могут отличаться. В настоящей работе для идентификации МС
Например, при использовании режима фрагмента- были предложены ион-продукты с большими ве-
ции "диссоциация, индуцируемая соударениями" личинами m/z (табл. 4). Для "гидрофильных" мик-
(ДИС-фрагментация) в линейной ловушке Orbitrаp роцистинов одним из диагностических ион-
в полном фрагментном масс-спектре однозарядно- продуктов является фрагментный ион с m/z 599
го иона MC-LR ион-продукт с m/z 135 не регист- [Arg-Adda-Glu+H]+. Он присутствовал в каждом
рируется, поскольку при данном механизме фраг-

Табл. 4. Диагностические ион-продукты для детектирования индивидуальных представителей микроцистинов


МС Ион-прекурсор Ион-продукт для количествен- Диагностические ион-продукты для под-
ного расчета тверждения идентификации
m/z Ион m/z Детектируемый ион m/z Детектируемый ион
MC-LR 995 [M+Н]+ 599 [Arg-Adda-Glu+H]+ 375 [C11H15O-Glu-Mdha]+
553 [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-Arg+H]+
861 [M+H−134]+
[D-Asp3]- 981 [M+Н]+ 599 [Arg-Adda-Glu+H]+ 375 [C11H15O-Glu-Mdha]+
MC-LR 539 [Mdha-Ala-Leu-D-Asp-Arg+H]+
847 [M+H−134]+
MC-RR 519 [M+2Н]2+ 599 [Arg-Adda-Glu+H]+ 453 [Arg-Adda+H−NH3]+
596 [Mdha-Ala-Arg-MeAsp-Arg+H]+
904 [M+H−134]+
[D-Asp3] 512 [M+2Н]2+ 599 [Arg-Adda-Glu+H]+ 582 [Mdha-Ala-Arg-D-Asp-Arg+H]+
MC-RR 499 [Ala-Arg-D-Asp-Arg+H]+
890 [M+H−134]+
MC-YR 1045 [M+Н]+ 599 [Arg-Adda-Glu+H]+ 375 [C11H15O-Glu-Mdha]+
603 [Mdha-Ala-Tyr-MeAsp-Arg+H]+
911 [M+H−134]+
MC-LA 910 [M+Н]+ 375 [C11H15O-Glu-Mdha]+ 559 [C11H15O -Glu-Mdha-Ala-Leu]+
693 [Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu+H]+
776 [M+H−134]+
MC-LF 986 [M+Н]+ 375 [C11H15O-Glu-Mdha]+ 544 [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-Phe+H]+
693 [Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu+H]+
852 [M+H−134]+
MC-LY 1002 [M+Н]+ 375 [C11H15O-Glu-Mdha]+ 560 [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-Tyr+H]+
689 [Tyr-Adda-Glu-Mdha +H]+
868 [M+H−134]+
MC-LW 1025 [M+Н]+ 375 [C11H15O-Glu-Mdha]+ 583 [Mdha-Ala-Leu-MeAsp-Trp+H]+
693 [Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu+H]+
891 [M+H−134]+

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


20 Е. Н. ЧЕРНОВА, Я. В. РУССКИХ, Е. П. ПОДОЛЬСКАЯ, З. А. ЖАКОВСКАЯ

тандемном масс-спектре данной группы микро- По литературным данным для анатоксина-а ха-
цистинов, но его относительная интенсивность рактеристичными являются ион-продукты с m/z
была значительно ниже для микроцистина MC-RR 149 [M+H−NH3]+, m/z 131 [M+H−NH3−Н2О]+ [30],
и его метилированных и деметилированных форм m/z 107 [M+H−NH3−COCH3]+ и m/z 91 [C7H7]+ [31].
по сравнению с MC-LR. Вторым диагностическим При фрагментации в линейной ловушке Orbitrap
ионом для идентификации может быть выбран в масс-спектре надежно детектировались ион-
ион-продукт, характеризующий индивидуального продукты с m/z 149 и m/z 131, которые были вы-
представителя гидрофильных микроцистинов. Так, браны в качестве диагностических (рис. 5, е).
например, для идентификации [D-Asp3]MC-RR При этом соотношение интенсивностей приведен-
были выбраны следующие ион-продукты: диагно- ных ионов в выбранных условиях проведения ана-
стический фрагмент с m/z 599 и ион-продукт с m/z лиза для стандартного вещества составляло при-
499 [Ala-Arg-D-Asp-Arg+H]+, сигнал которого об- мерно 3/1. Cигналы ион-продуктов с меньшими
ладал наибольшей интенсивностью в тандемном величинами m/z в тандемных спектрах при фраг-
спектре и указывал на отсутствие метильной ментации в линейной ловушке Orbitrap были мало-
группы в положении 3 в аспарагининовой кислоте. интенсивны.
В фрагментных масс-спектрах "гидрофобных" В то же время для фенилаланина диагностиче-
микроцистинов (MC-LA, MC-LF, MC-LY, MC- ской является пара сигналов: высокоинтенсивный
LW) в примененных условиях детектирования с m/z 120 [M+H−HCO2H]+ и менее интенсивный —
(линейная ловушка Orbitrap) наиболее интенсив- с m/z 131 [M+H−NH3−H2O]+ [30] (рис. 5, д). Таким
ным сигналом обладали диагностические ион- образом, для надежной идентификации недоста-
продукты [M−134+H]+, образовавшиеся в резуль- точно совпадения одного характеристического
тате отщепления фрагмента Adda-кислоты фрагментного иона, что подтверждается и данны-
[C9H11O]+ от молекулярного иона и характери- ми масс-хроматограммы по выделенному ионному
зующие индивидуального представителя микро- току для m/z 166 (рис. 5, а), где регистрируется
цистинов. Все фрагментные спектры "гидрофоб- присутствие двух соединений с временами удер-
ных" микроцистинов содержали сигнал ион- живания 3.65 и 4.57. По данным тандемного ана-
продукта с m/z 375 примерно одинаковой интен- лиза (рис. 5, б, в, г) при фрагментации иона-
сивности. Как пример можно привести идентифи- прекурсора с m/z 166 детектируются ион-продукты
кацию гидрофильного МС-LA c m/z 910 [M+H]+, с m/z 131, m/z 120 и m/z 149. Причем, масс-
для которого были выбраны ион-продукты с m/z хроматографические пики ион-продукта с m/z 131
375 [C11H15O+Glu+Mdha]+, являющийся диагности- детектируются при двух указанных временах
ческим для микроцистинов как подтверждающий удерживания, т. е. присутствуют в тандемных
принадлежность к исследуемому классу соединений, спектрах обоих соединений. Ион-продукт с m/z
и c m/z 852 ([M−134+H]+), избирательно характери- 149 принадлежит соединению со временем удер-
зующий данного представителя микроцистинов. живания на колонке 3.65 мин, а фрагмент
Таким образом, при отсутствии стандартных с m/z 120 — соединению со временем удержива-
соединений микроцистинов их идентификация ния 4.57 мин.
может быть проведена по набору диагностических Стоит отметить, что даже при несовпадении
ионов, соответствующих определенным фрагмен- хотя бы одного из трех критериев в используемой
там структур (таблицы 2, 3 и 4). схеме идентификации вероятность получения
ложноположительного результата значительно
Идентификация анатоксина-а в присутствии увеличивается. Так, например, при проведении
матричных соединений анализа в режиме низкого разрешения с использо-
При идентификации аналитов с низкими моле- ванием линейной ловушки Orbitrap образца при-
кулярными массами, фрагментные масс-спектры родной воды из Куршского залива было детекти-
которых зачастую не содержат достаточного ко- ровано соединение, для которого наблюдалось
личества интенсивных характеристических фраг- совпадение со стандартным соединением анаток-
ментов и являются непредставительными, могут сина-а времен удерживания и отмечалось присут-
возникать затруднения. Так, например, при анали- ствие в тандемных масс-спектрах обоих диагно-
зе анатоксина-а вероятен ложно-положительный стических ионов с m/z 131 и m/z 149. Однако со-
результат из-за наличия в объектах окружающей отношение интенсивностей пиков диагностиче-
среды биогенной аминокислоты — фенилаланина ских ионов в фрагментном масс-спектре значи-
[14], имеющей близкую массу с анатоксином-а тельно отличалось от установленной величины
(Δ 0.05 Да). для стандартного соединения. С целью проверки
Пример хроматографического разделения ана- полученных результатов был проведен масс-
токсина-а и фенилаланина и фрагментные масс- спектрометрический анализ этого же образца
спектры приведены на рис. 5. с использованием орбитальной ловушки высокого

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОЦИСТИНОВ И АНАТОКСИНА-А... 21

Рис. 5. Масс-хроматограммы
и тандемные масс-спектры
анатоксина-а и фенилаланина,
полученные из экстракта про-
бы природной воды.
а — масс-хроматограмма по
выделенному ионному току
д для m/z 166 из полного ионно-
го тока; б, в, г — экстрагиро-
ванные масс-хроматограммы
для соответственно m/z 131,
m/z 120 и m/z 149 из полного
тандемного масс-спектра для
иона-предшественника с m/z
166; д, е — тандемные масс-
спектры для фенилаланина и
анатоксина-а соответственно.
Фрагментацию проводили с
е использованием ДИС-режима
в линейной ионной ловушке.
Энергия соударений 25 %

разрешения при узком интервале выделения роди- Установленная чувствительность к детекти-


тельского иона (0.4 Да) в режиме детектирования руемому в пробе соединению составила 20 ррm,
полного спектра фрагментных ионов. Это позво- что превышает установленную погрешность точ-
лило исключить фрагментарные ионы соединений, ности определения масс при идентификации со-
имеющих молекулярные массы, близкие к анали- единений методом масс-спектрометрии высокого
ту. В полученных спектрах были установлены разрешения (5 ppm). Кроме того, значения m/z
точные массы для ион-прекурсоров и ион- фрагментарных ионов в тандемном масс-спектре
продуктов и сопоставлены их значения с m/z также отличались более чем на 20 ррm. Следова-
ионов для стандартного соединения. тельно, полученные данные указывали на отсутст-

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


22 Е. Н. ЧЕРНОВА, Я. В. РУССКИХ, Е. П. ПОДОЛЬСКАЯ, З. А. ЖАКОВСКАЯ

вие анатоксина-а в исследуемой пробе воды и на- изводных МС-RR (деметилированные и метилиро-
личие маскирующего матричного соединения ванные формы) проводят, по возможности, по гра-
с близкой массой и совпадающим временем удер- дуировочной зависимости для ион-продукта m/z
живания. 599, регистрируемого в фрагментном масс-спектре
Таким образом, для получения достоверных ре- MC-RR. Градуировочные зависимости были ли-
зультатов в случае масс-спектрометрического ана- нейными (R2 = 0.981−0.989) в диапазоне концен-
лиза низкомолекулярных соединений требуется траций от 10 до 500 нг/мл.
наличие стандартов и соблюдение трех критериев Для оценки изменения чувствительности при-
надежной идентификации (время удерживания, не бора в течение дня и между разными днями изме-
менее двух диагностических ион-продуктов и со- рений к каждому раствору или экстракту добавля-
отношение интенсивностей их сигналов). ли одинаковое количество аналитического стан-
дарта. В качестве такого аналитического стандарта
Оценка содержания микроцистинов выбирают соединение, которое заведомо отсутст-
и анатоксина-а в объектах окружающей среды вует в пробе, хорошо ионизуется в применяемых
условиях анализа и имеет время удерживания
Стоит отметить, что использование режима на колонке, близкое к анализируемым соединени-
низкого разрешения позволяет не только иденти- ям. В нашей работе в качестве внешнего стандарта
фицировать микроцистины при отсутствии полно- использовали 13С6-диклофенак.
го набора стандартных соединений, но и прово- В то же время при оптимизации метода масс-
дить полуколичественную оценку их содержания, спектрометрического количественного определе-
основанную на градуировочных зависимостях как ния искомых соединений в объектах окружающей
минимум двух основных представителей класса. среды необходимо учитывать возможное влияние
Для метода масс-спектрометрического детек- матричных компонентов [32], которое может про-
тирования микроцистинов и анатоксина-а в усло- являться не только в изменении интенсивности
виях низкого разрешения и выбранных в данной получаемого сигнала молекулярного иона, но и в
работе условиях проведения анализа были опреде- полном перекрывании сигналов аналита маски-
лены пределы обнаружения масс-спектрометри- рующими соединениями. В этом случае тандем-
ческого метода (LOD), которые составили ный масс-спектр может содержать сигналы фраг-
0.15−0.22 нг на ввод для растворов стандартов ментных ионов различной интенсивности матрич-
аналитов. В случае наличия всего набора стандар- ных соединений с близкими к определяемым ве-
тов микроцистинов градуировочные зависимости ществам молекулярными массами. В таком случае
строятся по диагностическому иону, имеющему для корректного определения следовых количеств
максимальную интенсивность в тандемном спек- микроцистинов в образце выбирают характери-
тре. Построенные градуировочные зависимости стичные ион-продукты с сигналами подходящей
для стандартных растворов анатоксина-а и 9 мик- интенсивности из области масс-спектра с мини-
роцистинов были линейными (R2 = 0.985−0.998) мальным химическим шумом в соответствии
в диапазоне концентраций от 5 до 500 нг/мл. Ве- с табл. 4. В связи с этим для оценки матричных
личина относительного стандартного отклонения эффектов рекомендуется оптимизация метода ана-
(RSD) < 12 % (N = 10) показывает хорошую точ- лиза на модельных системах (например, введение
ность данного метода. смеси имеющихся стандартных веществ в объем
В случае, когда полный набор стандартов не- природной воды из изучаемого водоема, не со-
доступен, проводить полуколичественное опреде- держащей исследуемых соединений [25, 26, 32]).
ление содержания микроцистинов возможно при В данной работе влияние матричных эффектов
наличии хотя бы двух стандартных соединений учитывали путем построения градуировочных за-
МС-LR и MC-RR. Необходимость применения висимостей, полученных с использованием алик-
двух стандартов обусловлена значительным раз- вот экстракта матрицы, заведомо не содержащей
личием в интенсивностях получаемых сигналов аналита, в которые вводят стандарты микроцисти-
ион-продуктов для количественного перехода для нов и анатоксина-а различных концентраций. Экс-
двузарядных и однозарядных молекулярных ионов тракты матрицы природной воды для модельной
микроцистинов. В этом случае градуировочные системы готовили в соответствии с процедурой
зависимости получают для стандартных растворов пробоподготовки для анализа микроцистинов
MC-LR, используя величины площадей пиков вы- и анатоксина-а, описанной ранее [33]. Установ-
бранных ион-продуктов для количественных МЗР- ленное влияние матричных эффектов проявилось
переходов, m/z 599 — для расчета гидрофильных в снижении интенсивности регистрируемого сиг-
и m/z 375 — для гидрофобных микроцистинов нала аналитов по сравнению с раствором стандар-
(предпосылки выбора ион-продуктов для количе- тов, при этом величины LOD для различных водо-
ственных переходов подробно обсуждены в разде- емов составили 0.25−0.63 нг на ввод. Пределы ко-
ле "Фрагментация микроцистинов"). Расчет про- личественного определения (LOQ) составили

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОЦИСТИНОВ И АНАТОКСИНА-А... 23

0.5−1.2 нг на ввод для анатоксина-а и смеси мик- СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


роцистинов в экстрактах модельных систем. По-
строенные градуировочные зависимости были ли- 1. Матишов Г.Г., Ковалева Г.В. Цветение воды в водо-
нейны в диапазоне концентраций 25−500 нг/мл емах юга России и сбои в водоснабжении (на примере
микроцистинов в экстракте матрицы. При данном г. Волгодонска) // Вестник Южного научного центра
уровне чувствительности метода обеспечивается РАН. 2010. Т. 6, № 1. С. 71–79.
определение микроцистинов и анатоксина-а в воде 2. Матишов Г.Г., Матишов Д.Г., Фуштей Т.В., Руд-
в концентрациях, составляющих не более 5 % нев М.И., Сойер В.Г., Зимаков Д.В. Обнаружение ток-
от величины ориентировочно безопасного уровня синов цианопрокариот в планктоне нижнего Дона ме-
тодом масс-спектрометрии // Вестник Южного науч-
содержания анатоксина-а [13] и микроцистинов
ного центра РАН. 2006. Т. 2, № 2. С. 75–78.
по рекомендации ВОЗ [10].
3. Ezhova E., Lange E., Russkikh Y., Chernova E., Zhakovs-
kaya Z. Dynamics of toxic HABs in the Curonian Lagoon,
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Baltic Sea during 2010–2013 // Book of abstracts. ICES
Annual Science Conference (ASC) 15–19 September
Таким образом, в результате проведенной ра- 2014, La Coruna, Spain. H26.
боты нами предложен вариант метода анализа 4. Корнева Л.Г., Соловьева В.В., Русских Я.В., Черно-
микроцистинов и анатоксина-а, основанный на их ва Е.Н. Состояние фитопланктона и содержание циа-
специфической фрагментации с применением тан- нотоксинов в Рыбинском, Горьковском и Чебоксар-
демной хромато-масс-спектрометрии низкого раз- ском водохранилищах в период аномально жаркого
решения. лета 2010 г. // Вода: химия и экология. 2014. № 8.
Представленный вариант анализа микроцисти- С. 24–29.
нов методом жидкостной хроматографии / тан- 5. Сиделев С.И., Зубишина А.А., Бабаназарова О.В., Ку-
демной масс-спектрометрии низкого разрешения тузова В.Ю., Мартьянов О.В. Мониторинг содержа-
позволяет проводить идентификацию микроцис- ния цианотоксинов микроцистинов в водоемах Верх-
тинов без использования стандартов изучаемых ней Волги: молекулярно-генетический и аналитиче-
соединений в режиме записи полного фрагментно- ский подходы // Вода: химия и экология. 2014. № 8.
го масс-спектра и сопоставления диагностических С. 88–94.
ионов, отнесенных к характерному фрагменту 6. Сиделев С.И., Голоколенова Т.Б., Чернова Е.Н., Рус-
структуры изучаемого класса соединений. Для на- ских Я.В. Анализ фитопланктона Цимлянского водо-
дежной идентификации аналитов с малой массой, хранилища (Россия) на наличие генов синтеза циано-
например анатоксина-а, желательно наличие стан- бактериальных гепато- и нейротоксинов // Микробио-
дартного соединения. логия. 2015. Т. 84, № 6. С. 1–11.
На основании полученных фрагментных масс- 7. Чернова Е.Н., Русских Я.В., Воякина Е.Ю., Жаков-
ская З.А. Исследования природных экотоксикантов —
спектров и систематизированных литературных
метаболитов сине-зеленых водорослей в разнотипных
данных предложена новая классификация ион-
водоемах Cеверо-запада России // Региональная эко-
продуктов микроцистинов, значительно облег- логия. 2014. Т. 35, № 1-2. С. 88–95.
чающая процедуру их идентификации и позво- 8. Mazur-Marzec H., Spoof L., Kobos J., Pliński M., Merilu-
ляющая по набору диагностических фрагментов oto J. Cyanobacterial hepatotoxins, microcystins and no-
установить структуру разных вариантов МС. dularins, in fresh and brackish waters of the Pomeranian
Показано, что в отсутствие полного комплекта Province, northern Poland // Oceanological and Hydrobio-
стандартов микроцистинов можно проводить по- logical Studies International Journal of Oceanography and
луколичественную оценку содержания микроцис- Hydrobiology. 2008. Vol. 37, no. 46. P. 3–21. Doi:
тинов при наличии хотя бы двух стандартов: MC- 10.2478/v10009-008-0014-0.
LR, считающегося наиболее токсичным и норми- 9. Seafood and Freshwater Toxins. Pharmacology, Physiolo-
руемого согласно WHO [10], и MC-RR, интенсив- gy and Detection. Ed. L.M. Botana. Second Edition. Boca
ность сигналов диагностических ион-продуктов Raton: CRC Press Taylor & Francis Group, 2008. 941 p.
которого значительно отличается от интенсивно- 10. WHO. Guidelines for Drinking Water Quality. 4th ed:
сти сигналов ион-продуктов МC-LR. World Health Organization. 2011. URL:
Соответственно представленный метод иссле- http://www.who.int/water_sanitation_health/publications/
дования микроцистинов и анатоксина-а с помо- 2011/dwq_guidelines/en (дата обращения: 15.11.2015).
щью хромато-масс-спектрометрии низкого разре- 11. Sivonen K., Jones G. Cyanobacterial toxins // Toxic cya-
шения обладает уровнем чувствительности, доста- nobacteria in water: A guide to their Public health Conse-
точным для достоверного анализа цианобактери- quences, Monitoring and Management. Eds. I. Chorus,
альных метаболитов, и может быть рекомендован J. Bartram. London: E & FN Spon, 1999. P. 41–111.
для их качественного определения и количествен- 12. Pflugmacher S., Jung K., Lundvall L., Neumann S., Peu-
ной оценки в природных объектах и питьевой воде thert A. Effects of cyanobacterial toxins and cyanobacteri-
даже в отсутствие полного набора стандартов. al cell-free crude extract on germination of Alfalfa (Medi-
cago sativa) and induction of oxidative stress // Environ-

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


24 Е. Н. ЧЕРНОВА, Я. В. РУССКИХ, Е. П. ПОДОЛЬСКАЯ, З. А. ЖАКОВСКАЯ

mental Toxicology and Chemistry. 2006. Vol. 25. 24. Zweigenbaum J.A., Henion J.D., Beattie K.A., Codd G.A.,
P. 2381–2387. Doi: 10.1897/05-615R.1. Poon G.K. Direct analysis of microcystins by microbore
13. Fawell J.K., Mitchell R.E., Hill R.E., Everett D.J. The tox- liquid chromatography electrospray ionization ion-trap
icity of cyanobacterial toxins in the mouse: II Anatoxin-a // tandem mass spectrometry // J. Pharm. Biomed. Anal.
Hum. Exp. Toxicol. 1999. Vol. 18. P. 168–173. Doi: 2000. Vol. 23, no. 4. P. 723–733. Doi: 10.1016/S0731-
10.1191/096032799678839833. 7085(00)00354-X.
14. Dimitrakopoulos I.K., Kaloudis T.S., Hiskia A.E., Tho- 25. Gosetti F., Mazzucco E., Zampieri D., Gennaro M.C. Sig-
maidis N.S., Koupparis M.A. Development of a fast and nal suppression/enhancement in high-performance liquid
selective method for the sensitive determination of ana- chromatography tandem mass spectrometry. Review // J.
toxin-a in lake waters using liquid chromatography– Chromatogr. A. 2010. Vol. 1217. P. 3929–3937. Doi:
tandem mass spectrometry and phenylalanine-d5 as inter- 10.1016/j.chroma.2009.11.060.
nal standard // Anal. Bioanal. Chem. 2010. Vol. 397. 26. King R., Bonfiglio R., Fernandez-Metzler C., Miller-
P. 2245–2252. Doi: 10.1007/s00216-010-3727-3. Stein C., Olah T. Mechanistic investigation of ionization
15. Kaya K., Sano T., Inoue H., Takagi H. Selective determi- suppression in electrospray ionization // J. Am. Soc. Mass.
nationof total normal microcystin by colorimetry, LC/UV Spectrom. 2000. Vol. 11, no. 11. P. 942–950. Doi:
detection and/or LC/MS // Anal. Chim. Acta. 2001. 10.1016/S1044-0305(00)00163-X.
Vol. 450. P. 73–80. Doi: 10.1016/S0003-2670(01)01391-5. 27. Neffling M.-R., Spoof L., Meriuoto J. Rapid LC-MS detec-
16. Brittain S.M., Wang J., Babcock-Jackson L., Carmi- tion of cyanobacterial hepatotoxins microcystins and no-
chael W.W., Rinehart K.L., Culver D.A. Isolation and cha- dularins - comparison of columns // Anal. Chim. Acta.
racterization of microcystins, cyclic heptapeptidehepato- 2009. Vol. 653, no. 2. P. 234–241.
toxins from a Lake Erie Strain of Microcystis aerugino- Doi: 10.1016/j.aca.2009.09.015.
sa // J. Great Lakes Res. 2000. Vol. 26. P. 241–249. Doi: 28. Diehnelt C.W., Dugan N.R., Peterman S.M., Budde W.L.
10.1016/S0380-1330(00)70690-3. Identification of microcystin toxins from a strain of Mi-
17. Чернова Е.Н., Русских Я.В., Подольская Е.П., Жаков- crocystis aeruginosa by liquid chromatography introduc-
ская З.А. Оптимизация параметров масс-спектро- tion into a hybrid linear ion trap-Fourier transform ion
метрического анализа цианотоксинов на гибридном cyclotron resonance mass spectrometer // Anal. Chem.
хромато-масс-спектрометре LTQ Orbitrap XL 2006. Vol. 78. P. 501–512. Doi: 10.1021/ac051556d.
(ThermoFinnigan) // Научное приборостроение. 2013. 29. TOXIC: Cyanobacterial Monitoring and Cyanotoxin
Т. 23, № 1. С. 20–29. URL: http://213.170.69.26/ Analysis. Eds. J. Meriluoto, G.A. Codd. ÅboAkademi
mag/2013/full1/Art2.pdf. University Press (Turku), 2005. 149 p.
18. Мильман Б.Л., Русских Я.В., Некрасова Л.В., Жаков- 30. Furey A., Crowley J., Hamilton B., Lehane M., James K.J.
ская З.А. Подход к масс-спектрометрической иденти- Strategies to avoid the mis-identification of anatoxin-a us-
фикации цианобактериальных пептидов. Пример де- ing mass spectrometry in the forensic investigation of
метилмикроцистина-LR // Масс-спектрометрия. 2011. acute neurotoxic poisoning // J. Chromatogr. A. 2005.
Т. 8, № 1. С. 51–60. Vol. 1082. P. 91–97. Doi: 10.1016/j.chroma.2005.05.040.
19. Neffling M.-R., Spoof L., Quilliam M., Meriluoto J. LC- 31. Sanchez J.A., Otero P., Alfonso A. et al. Detection of Ana-
ESI-Q-TOF-MS for faster and accurate determination of toxin-a and Three Analogs in Anabaena spp. Cultures:
microcystins andnodularins in serum // J. Chromatogr. B. New Fluorescence Polarization Assay and Toxin Profile
2010. Vol. 878, № 26. P. 2433–2441. Doi: by LC-MS/MS // Toxins. 2014. No. 6. P. 402–415. Doi:
10.1016/j.jchromb.2010.07.018. 10.3390/toxins6020402.
20. Spoof L., Vesterkvist P., Lindholm T., Meriluoto J. Screen- 32. Urban J., Hrouzek P., Štys D., Martens H. Estimation of
ing for hepatotoxins, microcystins and nodularin in envi- ion competition via correlated responsivity offset in linear
ronmental water samples by reversed-phase liquid chro- ion trap mass spectrometry analysis: Theory and practical
matography—electrospray ionization mass spectrometry // use in the analysis of cyanobacterial hepatotoxin micro-
J. Chromatogr. A. 2003. Vol. 1020. P. 105–119. Doi: cystin-LR in extracts of food additives // BioMed Re-
10.1016/S0021-9673(03)00428-X. search International. 2013. Vol. 2013. Article ID 414631.
21. Duncan M.W. Good mass spectrometry and its place in 14 pages. Doi: 10.1155/2013/414631.
good science // J. Mass Spectrom. 2012. Vol. 47, no. 6. 33. Русских Я.В., Чернова Е.Н., Воякина Е.Ю.,
P. 795–809. Doi: 10.1002/jms.3038. Никифоров В.А., Жаковская З.А. Определение циано-
22. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия для анализа объек- токсинов в водной матрице методом высокоэффек-
тов окружающей среды. М.: Техносфера, 2013. 632 с. тивной жидкостной хроматографии—масс-спектроме-
23. Mayumi T., Kato H., Imanishi S., Kawasaki Y., Hasega- трии высокого разрешения // Известия Санкт-
wa M., Harada K. Structural Characterization of Micro- Петербургского государственного технологического
cystins by LC/MS/MS under Ion Trap Conditions // J. An- института (технического университета). 2012. T. 17,
tibiot. 2006. Vol. 59, no. 11. P. 710–719. Doi: № 43. C. 61–66.
10.1038/ja.2006.95.

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 1


ISSN 0868–5886 NAUCHNOE PRIBOROSTROENIE, 2016, Vol. 26, No. 1, pp. 11–25

Санкт-Петербургский научно-исследовательский Контакты: Чернова Екатерина Николаевна,


центр экологической безопасности РАН, Санкт- s3561389@yandex.ru
Петербург (Чернова Е.Н., Русских Я.В., Подоль-
ская Е.П., Жаковская З.А.) Материал поступил в редакцию: 16.12.2015

Институт аналитического приборостроения РАН,


г. Санкт-Петербург (Подольская Е.П.)

DETERMINATION OF MICROCYSTINS AND ANATOXIN-A


USING LIQUID CHROMATO-MASS-SPECTROMETRY
OF UNIT RESOLUTION
E. N. Chernova1, Y. V. Russkikh1, E. P. Podolskaya1,2, Z. A. Zhakovskaya1
1
Saint-Petersburg Scientific-Research Centre for Ecological Safety RAS (SRCES RAS), Saint-Petersburg, Russia
2
Institute for Analytical Instrumentation of RAS, Saint-Petersburg, Russia

We proposed the method for microcystins and anatoxin-a detection using tandem mass spectrometry of unit
resolution. The method involves a unique fragment approach.
Diagnostic ions are suggested, and tandem spectra and fragmentation pattern of 9 most widespread microcys-
tins and anatoxin-a obtained using LC/MS/MS under ion trap conditions were described. The approach used in
this work is capable to carry out very reliable identification of known microcystins and to state the structural
variants when standards are not available. Based on the fragment mass spectra and systematic literature data
suggested a new classification of ion products microcystins, greatly facilitates the process of identifying them,
and allows for a set of diagnostic fragments to determine the structure of different variants of MS without using
standard compounds. The method of the determination of microcystins and anatoxin-a in the environmental
samples and drinking water using tandem mass-spectrometry using the ion trap of unit resolution was described.

Keywords: microcystins, anatoxin-a, LC/MS/MS of unit resolution, diagnostic ion-products, identification

REFERENСES reservoirs in abnormally hot summer of 2010]. Voda:


chimiya i ekologiya [Water: chemistry and ecology],
1. Matishov G.G., Kovaleva G.V. [Blossoming of water in 2014, no. 8, pp. 24–29. (In Russ.).
reservoirs of the South of Russia and failures in water 5. Sidelev S.I., Zubishina A.A., Babanazarova O.V., Kutu-
supply (on the example of Volgodonsk)]. Vestnik Yuzh- zova V.Yu., Mart'yanov O.V. [Monitoring of the mainten-
nogo nauchnogo zentra RAN [Bulletin of the Southern ance of tsianotoksin of microcystines in reservoirs of the
Russian Academy of Sciences scientific center], 2010, Top Volga: molecular and genetic and analytical ap-
vol. 6, no. 1, pp. 71–79. (In Russ.). proaches]. Voda: chimiya i ekologiya [Water: chemistry
2. Matishov G.G., Matishov D.G., Fushtey T.V., Rudnev and ecology], 2014, no. 8. pp. 88–94. (In Russ.).
M.I., Soyer V.G., Zimakov D.V. [Detection of toxins 6. Sidelev S.I., Golokolenova T.B., Chernova E.N., Rus-
цианопрокариот in a plankton of the lower Don by a skich Ya.V. [The analysis of a phytoplankton of the
mass spectrometry method]. Vestnik Yuzhnogo nauchno- Tsimlyansk reservoir (Russia) on existence of genes of
go zentra RAN [Bulletin of the Southern Russian Acade- synthesis the tsianobakterialnykh gepato-and neurotox-
my of Sciences scientific center], 2006, vol. 2, no. 2, ins]. Mikrobiologiya [Microbiologi], 2015, vol. 84, no. 6,
pp. 75–78. (In Russ.). pp. 1–11. (In Russ.).
3. Ezhova E., Lange E., Russkikh Y., Chernova E., Zha- 7. Chernova E.N., Russkich Ya.V., Voyakina E.Yu., Zha-
kovskaya Z. Dynamics of toxic HABs in the Curonian kovskaya Z.A. [Researches of natural ekotoksikant — me-
Lagoon, Baltic Sea during 2010–2013. Book of abstracts. tabolites of blue-green seaweed in polytypic reservoirs of
ICES Annual Science Conference (ASC) 15–19 Septem- Severo West of Russia]. Regional'naya ekologiya [Re-
ber 2014, La Coruna, Spain. H26. gional ecology], 2014, vol. 35, no. 1-2, pp. 88–95. (In
4. Korneva L.G., Solov'eva V.V., Russkich Y.V., Cherno- Russ.).
va E.N. [Condition of a phytoplankton and the mainten- 8. Mazur-Marzec H., Spoof L., Kobos J., Pliński M., Meri-
ance of tsianotoksin in Rybinsk, Gorky and Cheboksary luoto J. Cyanobacterial hepatotoxins, microcystins and

25
nodularins, in fresh and brackish waters of the Pomera- 2010, vol. 878, no. 26, pp. 2433–2441. Doi:
nian Province, northern Poland. Oceanological and Hy- 10.1016/j.jchromb.2010.07.018.
drobiological Studies International Journal of Oceano- 20. Spoof L., Vesterkvist P., Lindholm T., Meriluoto J.
graphy and Hydrobiology, 2008, vol. 37, no. 46, pp. 3–21. Screening for hepatotoxins, microcystins and nodularin in
Doi: 10.2478/v10009-008-0014-0. environmental water samples by reversed-phase liquid
9. Seafood and Freshwater Toxins. Pharmacology, Physiol- chromatography—electrospray ionization mass spectro-
ogy and Detection. Ed. L.M. Botana. Second Edition. Bo- metry. J. Chromatogr. A, 2003, vol. 1020, pp. 105–119.
ca Raton: CRC Press Taylor & Francis Group, 2008. Doi: 10.1016/S0021-9673(03)00428-X.
941 p. 21. Duncan M.W. Good mass spectrometry and its place in
10. WHO. Guidelines for Drinking Water Quality. 4th ed: good science. J. Mass Spectrom., 2012, vol. 47, no. 6,
World Health Organization. 2011. URL: pp. 795–809. Doi: 10.1002/jms.3038.
http://www.who.int/water_sanitation_health/publications/ 22. Lebedev A.T. Mass-spektrometriya dlya analiza ob’ektov
2011/dwq_guidelines/en. okruzhayushchej sredy [Mass spectrometry for the analy-
11. Sivonen K., Jones G. Cyanobacterial toxins. Toxic cyano- sis of objects of environment]. Moscow, Tekhnosfera
bacteria in water: A guide to their Public health Conse- Publ., 2013. 632 p. (In Russ.).
quences, Monitoring and Management. Eds. I. Chorus, 23. Mayumi T., Kato H., Imanishi S., Kawasaki Y., Hasega-
J. Bartram. London: E & FN Spon, 1999, pp. 41–111. wa M., Harada K. Structural characterization of microcys-
12. Pflugmacher S., Jung K., Lundvall L., Neumann S., Peu- tins by LC/MS/MS under ion trap conditions. J. Antibiot.,
thert A. Effects of cyanobacterial toxins and cyanobacteri- 2006, vol. 59, no. 11, pp. 710–719.
al cyanobacterial cell-free crude extract on germination of Doi: 10.1038/ja.2006.95.
Alfalfa (Medicago sativa) and induction of oxidative 24. Zweigenbaum J.A., Henion J.D., Beattie K.A.,
stress. Environmental Toxicology and Chemistry, 2006, Codd G.A., Poon G.K. Direct analysis of microcystins by
vol. 25, pp. 2381–2387. Doi: 10.1897/05-615R.1. microbore liquid chromatography electrospray ionization
13. Fawell J.K., Mitchell R.E., Hill R.E., Everett D.J. The tox- ion-trap tandem mass spectrometry. J. Pharm. Biomed.
icity of cyanobacterial toxins in the mouse: II Anatoxin-a. Anal., 2000, vol. 23, no. 4, pp. 723–733.
Hum. Exp. Toxicol., 1999, vol. 18, pp. 168–173. Doi: 10.1016/S0731-7085(00)00354-X.
Doi: 10.1191/096032799678839833. 25. Gosetti F., Mazzucco E., Zampieri D., Gennaro M.C. Sig-
14. Dimitrakopoulos I.K., Kaloudis T.S., Hiskia A.E., Tho- nal suppression/enhancement in high-performance liquid
maidis N.S., Koupparis M.A. Development of a fast and chromatography tandem mass spectrometry. Review. J.
selective method for the sensitive determination of ana- Chromatogr. A, 2010, vol. 1217, pp. 3929–3937.
toxin-a in lake waters using liquid chromatography– Doi: 10.1016/j.chroma.2009.11.060.
tandem mass spectrometry and phenylalanine-d5 as inter- 26. King R., Bonfiglio R., Fernandez-Metzler C., Miller-
nal standard. Anal. Bioanal. Chem., 2010, vol. 397, Stein C., Olah T. Mechanistic investigation of ionization
pp. 2245–2252. Doi: 10.1007/s00216-010-3727-3. suppression in electrospray ionization. J. Am. Soc. Mass.
15. Kaya K., Sano T., Inoue H., Takagi H. Selective determi- Spectrom., 2000, vol. 11, no. 11, pp. 942–950.
nationof total normal microcystin by colorimetry, LC/UV Doi: 10.1016/S1044-0305(00)00163-X.
detection and/or LC/MS. Anal. Chim. Acta., 2001, 27. Neffling M.-R., Spoof L., Meriuoto J. Rapid LC-MS de-
vol. 450, pp. 73–80. Doi: 10.1016/S0003-2670(01)01391-5. tection of cyanobacterial hepatotoxins microcystins and
16. Brittain S.M., Wang J., Babcock-Jackson L., Carmi- nodularins - comparison of columns. Anal. Chim. Acta.,
chael W.W., Rinehart K.L., Culver D.A. Isolation and 2009, vol. 653, no. 2, pp. 234–241.
characterization of microcystins, cyclic heptapeptidehepa-
Doi: 10.1016/j.aca.2009.09.015.
totoxins from a Lake Erie Strain of Microcystis aerugi-
28. Diehnelt C.W., Dugan N.R., Peterman S.M., Budde W.L.
nosa. J. Great Lakes Res., 2000, vol. 26, pp. 241–249.
Identification of microcystin toxins from a strain of Mi-
Doi: 10.1016/S0380-1330(00)70690-3.
crocystis aeruginosa by liquid chromatography introduc-
17. Chernova E.N., Russkikh Y.V., Podolskaya E.P., Zha-
tion into a hybrid linear ion trap-Fourier transform ion
kovskaya Z.A. et al. [Analysis of cyanotoxines using an
cyclotron resonance mass spectrometer. Anal. Chem.,
LTQ ORBITRAP (Thermo Finnigan): the optimization of
mass-spectrometry method]. Nauchnoe priborostroenie 2006, vol. 78, pp. 501–512. Doi: 10.1021/ac051556d.
[Science Instrumentation], 2013, vol. 23, no. 1. pp. 20–29. 29. TOXIC: Cyanobacterial Monitoring and Cyanotoxin
(In Russ.). URL: http://213.170.69.26/mag/2013/full1/ Analysis. Eds. J. Meriluoto, G.A. Codd. ÅboAkademi
Art2.pdf (In. Russ.). University Press (Turku), 2005. 149 p.
18. Mil’man B.L., Russkikh Y.V., Nekrasova L.V., Zhakov- 30. Furey A., Crowley J., Hamilton B., Lehane M., James K.J.
skaya Z.A. [Approach to mass-spectrometry identification Strategies to avoid the mis-identification of anatoxin-a us-
cianobakterial peptides. Demetil-microcystine-LR exam- ing mass spectrometry in the forensic investigation of
ple]. Mass-spektrometriya [Mass-spectrometry], 2011, acute neurotoxic poisoning. J. Chromatogr. A, 2005,
vol. 8, no. 1, pp. 51–60. (In Russ.). vol. 1082, pp. 91–97. Doi: 10.1016/j.chroma.2005.05.040.
19. Neffling M.-R., Spoof L., Quilliam M., Meriluoto J. LC- 31. Sanchez J.A., Otero P., Alfonso A. et al. Detection of ana-
ESI-Q-TOF-MS for faster and accurate determination of toxin-a and three analogs in anabaena spp. cultures: new
microcystins andnodularins in serum. J. Chromatogr. B, fluorescence polarization assay and toxin profile by LC-
MS/MS. Toxins, 2014, no. 6, pp. 402–415.
Doi: 10.3390/toxins6020402. 33. Russkikh Y.V., Chernova E.N., Voyakina E.Y., Nikifo-
32. Urban J., Hrouzek P., Štys D., Martens H. Estimation of rov V.A., Zhakovskaya Z.A. [Definition of cianotoxin in
ion competition via correlated responsivity offset in linear a water matrix by method of a highly effective liquid
ion trap mass spectrometry analysis: Theory and practical chromatography—mass spectrometry of high resolution].
use in the analysis of cyanobacterial hepatotoxin micro- Izvestiya Sankt-Peterburgskogo gosudarstvennogo tekh-
cystin-LR in extracts of food additives. BioMed Research nologicheskogo instituta (tekhnicheskogo universiteta)
International, 2013, vol. 2013. Article ID 414631. [News of the St. Petersburg state institute of technology
14 pages. Doi: 10.1155/2013/414631. (technical university)], 2012, vol. 17, no 43. pp. 61–66.

Contacts: Chernova Ekaterina Nikolaevna, Article received in edition: 16.12.2015


s3561389@yandex.ru