О книге

Фрида Карловна Черкес, Лина Борисовна Богоявленская, Наталья Александровна

Бельская - Микробиология

Учебник включает теоретические и практические разделы. В теоретических

разделах приведены сведения о развитии микробиологии, свойствах
микроорганизмов, инфекционном процессе, иммунитете и аллергии. В
практических разделах по строго определенной схеме описаны основные методы
микробиологического исследования при отдельных инфекциях.

Учебник соответствует программе, утвержденной Министерством

здравоохранения СССР, и предназначен для учащихся фельдшерско-лаборантских и
санитарно-фельдшерских отделений медицинских училищ.

Учебная литература

Для учащихся медицинских училищ

Ф. К. Черкес, Л. Б. Богоявленская, Н. А. Бельская

Микробиология

Под редакцией Ф. К. Черкес

Допущено Главным управлением учебных заведений Министерства

здравоохранения СССР в качестве учебника для учащихся фельдшерско-
лаборантских и санитарно-фельдшерских отделений медицинских училищ

Москва. "Медицина". 1986

ББК 52.6

Ч48
 УДК 579(075.8)

Рецензенты: А. М. Смирнова, профессор-консультант кафедры микробиологии II

ММИ им. Н. И. Пирогова; И. Л. Заборская, председатель предметной комиссии по
микробиологии и эпидемиологии Ленинградского медицинского училища № 1.

Черкес Ф. К., Богоявленская Л. Б., Бельская Н. А.

Ч48 Микробиология / Под ред. Ф. К. Черкес. - М.: Медицина, 1986. - 512 с., ил.

В пер.: 1 р. 40 к. 150000 экз.

4107000000-241
Ч 94-86
039(01)-87

© Издательство "Медицина", Москва, 1986.

Фрида Карловна Черкес,

Лина Борисовна Богоявленская,

Наталья Александровна Бельская

Микробиология

Редактор А. М. Смирнова. Редактор издательства И. В. Войтехова. Худ. редактор

Т. К. Винокурова. Переплет художника В. С. Сергеевой. Технический редактор С.
П. Танцева. Корректор Л. Г. Воронина.

ИБ № 4275

Сдано в набор 28.10.85. Подписано к печати 14.05.86. Т-01365. Формат бумаги

84×1081/32. Гарн. Таймс. Бумага кн.-журн. Печать высокая. Усл. печ. л. 27,72. Усл.
кр.-отт. 30,24. Уч.-изд. л. 31,82. Тираж 150000 экз. (1-й завод 1 - 75000 экз.).

Заказ 1786. Цена 1 р. 40 к.

Ордена Трудового Красного Знамени издательство "Медицина", 101000, Москва,

Петроверигский пер., 6/8.

Ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени МПО

"Первая Образцовая типография" имени А. А. Жданова Союзполиграфпрома при
Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной
торговли. 113054, Москва, Валовая, 28.

Предисловие
Решения XXVII съезда КПСС и постановления ЦК КПСС и Совета Министров
СССР "О мерах по дальнейшему улучшению народного здравоохранения" (1977) и
"О дополнительных мерах по улучшению охраны здоровья населения" (1982)
предусматривают комплекс мероприятий, направленных на борьбу с
инфекционными заболеваниями. Успех этих мероприятий в значительной мере
зависит от подготовки и квалификации среднего медицинского звена, владеющего
современными методами диагностики инфекционных болезней.

Настоящий учебник является первым, в котором объединены теоретический курс

с подробно описанными методами микробиологических и вирусологических
исследований.

Знание теории необходимо для понимания выбора применения тех или иных
методов лабораторной диагностики и правильного освоения практических навыков,
высокий уровень выполнения диагностических исследовали может быть достигнут
при знании работниками методов взятия материала и хода исследования, поэтому
авторы старались подробно и полно осветить основные методы
микробиологических и вирусологических исследований. В основе описания их
использованы унифицированные методы, получившие всеобщее признание и
доступные для работы в лабораториях широкой сети.

Учебник содержит три части: общую, частную и санитарную микробиологию.

Каждый раздел заканчивается контрольными вопросами, помогающими усвоению и
закреплению пройденного материала. Ряд глав имеет задания для самостоятельной
работы учащихся, что способствует развитию мышления и навыков
микробиологической техники. Идентификация выделенного возбудителя
сопровождается цветными схемами, которые наглядно иллюстрируют описанные
методы. Учебник снабжен таблицами и рисунками. В конце учебника имеется
словарь основных микробиологических терминов, упоминаемых в тексте, что
облегчит работу учащихся.

Авторы надеются, что настоящий учебник поможет среднему медицинскому

звену более квалифицированно участвовать в борьбе с инфекционными болезнями в
нашей стране.

Авторы приносят глубокую благодарность специалистам НИИ эпидемиологии и

микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР, ЦКВИ им. В. Г. Короленко МЗ
СССР, Института молекулярной биологии АН СССР, ГИСК им. Л. А. Тарасевича
МЗ СССР и медицинского училища № 14, оказавшим большую помощь при работе
над учебником.

Все замечания, сделанные по содержанию и оформлению учебника, будут

приняты авторами с благодарностью.

Введение - Л. Б. Богоявленская
С первых дней создания Советского государства охрана здоровья населения
стала одной из главных задач, стоящих перед партией и правительством.
Мероприятия, направленные на снижение заболеваемости, в том числе и
инфекционными болезнями, постоянно декретируются законами и
постановлениями ЦК КПСС, Верховного Совета и Совета Министров СССР.

В постановлении ЦК КПСС и Совета Министров СССР "О мерах по

дальнейшему улучшению народного здравоохранения" (1968) изложены принципы,
в соответствии с которыми медицинские учреждения ведут борьбу за здоровье
человека. В "Основах закон законодательства Союза ССР и союзных республик о
здравоохранении" (1969) это постановление расширено и развито. Специально
предусмотрены законы, охраняющие водные источники и природные богатства
нашей страны: "Основы водного законодательства Союза ССР и союзных
республик" (1970), "Об усилении охраны природы и улучшении использования
природных ресурсов" (1972).

Противоэпидемические и профилактические мероприятия, достижения

медицинской науки и техники, повышение уровня благосостояния и культуры
населения привели к ликвидации ряда тяжелых инфекционных болезней в СССР. В
нашей стране уже давно не зарегистрировано ни одного случая натуральной оспы;
нет чумы и эпидемического возвратного тифа. Снижена заболеваемость дифтерией,
коклюшем, корью и другими инфекциями.

Однако до сих пор эпидемии гриппа, вспышки кишечных заболеваний,

внутрибольничные инфекции наносят Урон народному хозяйству и здоровью
населения, поэтому борьба с инфекционными болезнями является одной из
первоочередных задач здравоохранения.

Пути решения этой задачи намечены XXVI съездом КПСС, на котором было
отмечено, что "познание механизма... иммунологических процессов
жизнедеятельности человека, совершенствование методов профилактики,
диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний" *, является одной
из важнейших задач медицинской науки.
*
(Материалы XXVI съезда КПСС. - М.: Политиздат, 1981, с. 146.)

Чтобы достигнуть успеха в деле снижения и ликвидации инфекционных

болезней, необходимо хорошо знать экологию и биологию их возбудителей,
особенности взаимодействия микроорганизмов с организмом хозяина (человека,
животного) и закономерности распространения инфекций. Такие знания позволяют
создавать систему мероприятий, направленных на предупреждение возникновения
и распространения инфекционных болезней.

Успех этих мероприятий в значительной мере обеспечивается деятельностью

среднего медицинского персонала, а качество работы фельдшеров, лаборантов,
медицинских сестер зависит от их знаний и подготовки в области медицинской
микробиологии.

Предмет и задачи микробиологии. Микробиология - раздел биологии,

изучающий закономерности жизни и развития микроорганизмов в их единстве с
окружающей средой. Эта наука изучает свойства микроорганизмов, а также
процессы, которые они вызывают в макроорганизме (в частности, в организме
человека) и различных объектах окружающей среды. Полезные для человека
свойства микроорганизмов используются в различных отраслях народного
хозяйства.

Микроорганизмы окружают нас повсюду. Они живут в почве, воде, организме

человека и животных. С помощью одних микроорганизмов происходит круговорот
веществ в природе - очищение окружающей среды (гниющие органические отбросы
под влиянием микроорганизмов превращаются в неорганические вещества, которые
усваиваются растениями); другие вызывают заболевания человека и животных.
 Микробиология рассматривает широкий круг вопросов и подразделяется на ряд
дисциплин.

Общая микробиология изучает строение и жизнедеятельность микроорганизмов,

их распространение в природе, наследственность и изменчивость.

Медицинская микробиология изучает микроорганизмы, вызывающие

заболевания человека, и процессы, происходящие в организме при внедрении
болезнетворных микроорганизмов. Задачей медицинской микробиологии является
разработка методов лабораторной диагностики инфекционных болезней, создание
иммунобиологических медицинских препаратов для их предупреждения и лечения.

Курс медицинской микробиологии включает общую и частную части.

Общая медицинская микробиология рассматривает свойства микроорганизмов и

их взаимодействие с организмом хозяина, частная - характеризует возбудителей
отдельных болезней и методы их лабораторной диагностики.

В настоящее время из медицинской микробиологии выделены: вирусология

(наука о вирусах); протозоология (изучает простейшие); микология (изучает
грибы); иммунология (рассматривает защитные процессы, происходящие в
организме); санитарная микробиология (занимается микроорганизмами,
обитающими во внешней среде); космическая микробиология (изучает влияние
космических условий на микроорганизмы и изменение микробной флоры человека
в космосе).

Ветеринарная микробиология изучает микроорганизмы, вызывающие

заболевания животных. Эта отрасль науки тесно связана с медицинской
микробиологией, так как многие микроорганизмы являются возбудителями
болезней и человека, и животных.

Промышленная микробиология изучает микроорганизмы, которые используют в

производстве пищевых продуктов, антибиотиков и других лекарственных веществ,
создает способы защиты пищевых продуктов и различных материалов от вредного
воздействия микроорганизмов.

Агромикробиология изучает микроорганизмы, играющие роль в формировании

почвенных структур, повышении плодородия почв, создании бактериальных
удобрений.

Краткий очерк истории микробиологии - Л. Б.

Богоявленская
Задолго до открытия микроорганизмов человек сталкивался с процессами их
жизнедеятельности. С незапамятных времен люди использовали брожение теста,
сквашивание молока, брожение виноградного сока. Издавна знакомы человечеству
и повальные заболевания, уносившие население целых селений и городов. Уже в
трудах врача Древней Греции Гиппократа появляются предположения о связи
заразных болезней и особых болезнетворных испарений, названных им "миазмами".
Подобная гипотеза высказана итальянским врачом Джироламо Фракасторо (XVI
век). Он создал учение о живом "контагии" - "мельчайших и недоступных нашим
чувствам частиц", которые, проникая в организм человека, вызывают болезнь.
Мнение о том, что причиной заразных болезней являются живые существа,
высказал в начале XVII века Афанасий Кирхер.

Окончательное подтверждение этих предположений было получено голландским

натуралистом Антони ван Левенгуком (1632-1723). Шлифуя стекла, он сумел
изготовить двояковыпуклые линзы, дававшие увеличение в 160 раз и более.
Рассматривая в созданной им оптической системе настои, дождевую воду, зубной
налет и другие объекты, он увидел, зарисовал и описал "живых зверьков", которых
и сегодня можно рассматривать, как основные формы микроорганизмов:
шаровидные, извитые, палочковидные, плесень, дрожжи.

Антони ван Левенгук (1632-1723)

Предположения о причинах заразных болезней не были доказаны, но

практическая деятельность врачей со времен древности подтверждала их.

Законы индусов (1800-800 гг. до н. э.) предусматривали первые

"противоэпидемические" мероприятия - больной чахоткой приравнивался по
степени опасности его для окружающих к прокаженному, а брамину запрещалось
вступать в брак с девушкой, имевшей среди предков чахоточных. Широко известны
предписания об изоляции прокаженных, дезинфекции их вещей и жилищ (1700-500
гг. до н. э.).

В 1771-1772 гг. во время эпидемии чумы в Москве военный врач Данила

Самойлович, считая, что "чума вызывается особливым и совсем отменным
существом", впервые производит дезинфекцию вещей больных чумой, делает
прививку "заразного ослабленного начала чумы" здоровым людям,
соприкасавшимся с больными.
 Одна из наиболее интересных глав в истории медицины - создание метода
оспопрививания, который с давних времен практиковался у турков, персов и
китайцев. Применение прививок было основано на убеждении, что при
искусственном заражении болезнь протекает легче, чем при естественном. Оспа
производила чудовищные опустошения. Только за 1723 г. в Париже умерло от оспы
20 тыс. человек, в Неаполе в 1768 г. - 16 тыс. человек за несколько недель.

Английский врач Эдуард Дженнер заметил, что многие люди, которые не болели
оспой, не заражаются и при контакте с больными. Особенно часто это явление
наблюдали у доярок, заражавшихся при доении животных, больных коровьей
оспой. Это явилось отправным пунктом его исследований, продолжавшихся более
10 лет. В 1796 г. Дженнер привил здоровому мальчику содержимое гнойного
пузырька от коровы, больной оспой. Через полтора месяца он привил этому же
мальчику материал от человека, больного оспой. Мальчик не заболел. С тех пор
прививки против оспы принесли человечеству избавление от этой страшной
болезни, уносившей миллионы человеческих жертв.

Прошло много лет. Открытые Левенгуком микроскопические существа не

связывали с возникновением заразных заболеваний. И только в XIX веке
гениальные работы французского ученого Луи Пастера (1822-1895) дали научные
доказательства значения микроорганизмов в возникновении заразных болезней и
обоснование для развития методов борьбы с ними.

Луи Пастер (1822-1895)

Химик по образованию, Пастер показал, что микроорганизмы способны изменять

среду обитания и вызывать ее химические превращения. Но он не остановился на
химических явлениях, а описал процессы брожения и гниения и показал, что они
вызываются микроорганизмами.
 Им впервые выявлены микроорганизмы, которые могут существовать без
доступа кислорода (анаэробы).

Одной из наиболее важных заслуг Пастера является Доказательство

невозможности самопроизвольного зарождения живых существ. Этот вопрос
волновал умы ученых в течение долгого времени.

Хотя еще в 1775 г. русский исследователь М. М. Тереховский высказал мнение,

что микроскопические существа ("инфузории") не возникают путем
самозарождения, вопрос о возникновении живого из неживого оставался спорным.

Опыты Пастера показали, что микроорганизмы попадают в питательную среду

только из воздуха. Прокипятив бульон в колбе с горлышком, вытянутым в форме
латинской буквы S, он сохранял бульон прозрачным (стерильным), так как
микроорганизмы, проникая в трубку вместе с воздухом, оседали под действием
силы тяжести в его изогнутом колене и не достигали бульона на дне колбы.

Круг исследований Пастера весьма широк. Доказав роль микроорганизмов в

развитии процессов брожения и гниения, он занялся изучением болезней
шелковичных червей, которые наносили в то время большой урон экономике
Франции. И в этой работе он сумел найти причину поражения червей - их
заболевания были также вызваны микроорганизмами, и Пастер нашел средство
борьбы с ними.

Пастером разработаны впервые в истории науки методы уничтожения

микроорганизмов при воздействии на них высокой температуры. Этот метод
обеспложивания среды называют стерилизацией.

Для пищевых продуктов, которые изменяют свои свойства при кипячении, он

предложил более "мягкую" стерилизацию, названную пастеризацией. Продукты
обрабатываются несколько раз при сравнительно невысокой температуре.

Пастер не остановился на изучении процессов в окружающем нас мире. Он

показал роль микроорганизмов в жизни человека, впервые доказав, что заразные
болезни человека также являются результатом жизнедеятельности
микроорганизмов. Это открытие сыграло огромную роль в развитии биологии и
дало начало новой науке - медицинской микробиологии.

Следующим этапом деятельности Пастера было создание вакцин (от лат. vacca -
корова). Этим термином Пастер назвал ослабленные культуры микроорганизмов,
введение которых не вызывает заболевания, но делает людей и животных
невосприимчивыми к нему.

Он приготовил вакцину из ослабленной прогреванием культуры возбудителей

куриной холеры, привил ее курам, вызвав у них не смертельное заболевание, и
после их выздоровления вновь заразил их очень "сильной" культурой возбудителя.
Куры остались живы и здоровы. По тому же принципу была создана вакцина
против сибирской язвы животных - предварительные прививки сделали
нечувствительными к этому заболеванию коров и овец.
 В 1885 г. Пастер предложил прививки против бешенства; поскольку возбудителя
бешенства не удавалось обнаружить ни под микроскопом, ни на искусственной
среде, Пастер использовал для изготовления вакцины мозг бешеной собаки,
который многократно последовательно перевивал от кролика к кролику, уменьшая
период, протекающий от заражения до заболевания и ослабляя силу прививочного
материала. Применение таких вакцин на собаках давало хорошие результаты, и
Пастер решился вакцинировать ребенка, искусанного бешеной собакой, и спас его
от верной смерти. Следующий шаг - вакцинация русских крестьян, пешком
прибывших в Париж после укусов бешеного волка.

Успех вакцинации положил начало доверию врачей и населения к новому

средству борьбы с самыми страшными инфекциями прошлого.

На основании открытий Пастера английский хирург Д. Листер (1867) создал

метод антисептики - промывания ран и перевязочных материалов раствором
карболовой кислоты, чтобы предотвратить развитие в ранах микроорганизмов.

Открытия, сделанные Луи Пастером, коротко изложены на мемориальной доске

на здании его первой лаборатории:

"Здесь была лаборатория Пастера:

1857 - брожение

1860 - самопроизвольное зарождение

1865 - болезни вина и пива

1868 - болезни шелковичных червей

1881 - зараза и вакцины

1885 - предохранение от бешенства".

Научные исследования Пастера показали роль микроорганизмов в

возникновении инфекции. Он научился выращивать их в искусственных
питательных средах, но не знал способа обнаружения возбудителя в каждом
отдельном случае инфекции.

Немецкий ученый Роберт Кох (1843-1910) впервые ввел в практику плотные

питательные среды, позволившие получить отдельные колонии и чистую культуру
микроорганизмов. Кох впервые предложил анилиновые красители для окраски
микроорганизмов, ввел освещение при микроскопировании (конденсор Аббе),
применил иммерсионную систему и микрофотографирование.
 Роберт Кох (1843-1910)

Он открыл возбудителя туберкулеза (1882), названного в честь ученого

"палочкой Коха" и возбудителя холеры (1883).

Методы выращивания и выделения микроорганизмов, которые разработал Кох,

привели к целому ряду открытий. В конце XIX века были описаны возбудители
дифтерии (Э. Клебс и Ф. Леффлер), брюшного тифа (К. Эберт и Г. Гаффки),
столбняка (А. Николайер и С. Китазато), дизентерии (А. В. Григорьев, К. Шига) и
многие другие.

Открытие возбудителей некоторых инфекций связано с драматическими

страницами истории медицины. Так в 1874 г. профессор Казанского университета
Г. Н. Минх заразил себя кровью больного возвратным тифом. Он заболел, доказав
этим, что возбудители возвратного тифа находятся в крови. Минх высказал
предположение, что возбудители передаются через кровососущих насекомых. Через
два года врач О. О. Мочутковский, повторив опыт Минха, заразил себя кровью
больных сыпным и возвратным тифом и подтвердил высказанное Минхом
предположение о том, что возбудитель этого заболевания находится в крови.

Д. И. Ивановский (1864-1920) в эти же годы изучал мозаичную болезнь листьев

табака и пришел к выводу, что ее вызывает мельчайший агент. Он не растет на
питательных средах и проходит через фильтры. К такому выводу Ивановский
пришел, вызывая болезнь здоровых растений соком из пораженных листьев табака,
после фильтрования его через мельчайшие поры (не пропускающие другие
микроорганизмы). Это была первая работа, доказавшая вирусную природу
инфекционных болезней.
 Д. И. Ивановский (1864-1920)

В истории микробиологии можно условно выделить несколько периодов:

морфологический, для которого характерно описание микроорганизмов (А.

Левенгук); физиологический, развитие которого связано с работами Л. Пастера и Р.
Коха, раскрывших сущность жизнедеятельности микроорганизмов и законов их
развития; иммунологический. В этот период жил и работал И. И. Мечников, его
исследования и положили начало учению об иммунитете.

Очерк истории отечественной микробиологии. Большой вклад в развитие

микробиологии внесли отечественные ученые.

Еще в 1698 г. Петр I, находясь в Голландии, познакомился с А. Левенгуком,

который продемонстрировал ему микроскоп и показал ряд микроскопических
объектов.

В период становления микробиологии Л. С. Ценковский (1822-1887)

опубликовал работу "О низших водорослях и инфузориях", в которой впервые
отнес бактерии к растительным организмам. Он же, в соответствии с принципами
Пастера, получил ослабленный вариант бацилл сибирской язвы и использовал его
для прививки животных.

Наряду с Пастером и Кохом, одним из основоположников микробиологии

является великий русский ученый И. И. Мечников (1845-1916). Его классическая,
до сих пор всеобъемлющая теория иммунитета основана на признании роли
клеточной защиты в развитии невосприимчивости к инфекционным болезням. Он
показал, что многие клетки организма (лейкоциты, клетки селезенки, костного
мозга и пр.) способны захватывать и переваривать различные чужеродные
элементы, в том числе и бактерии. Такие клетки он назвал фагоцитами (от греч.
phago - пожираю, cytos - клетка), а открытое явление - фагоцитозом. Учение о
фагоцитозе явилось основой для изучения воспаления, которое, как показал
Мечников, является активной реакцией организма на внедрение болезнетворных
микробов.

И. И. Мечников (1845-1916)

Научная деятельность Мечникова многогранна и широка. Он исследовал

причины старения и искал способы продления жизни человека. Мечников считал,
что ядовитые продукты, образующиеся в результате жизнедеятельности
гнилостных микроорганизмов, обитающих в толстом кишечнике, отравляют
организм человека. Чтобы избежать этого вредного воздействия, он предлагал
заселить кишечник молочно-кислыми бактериями - антагонистами гнилостных.

При таком изменении микрофлоры кишечника, считал Мечников, гнилостные

яды не будут пагубно действовать на организм человека и жизнь его продлится. В
настоящее время доказано, что нельзя полностью менять естественную флору
кишечника, но идея использования одного вида микроорганизмов в борьбе с
другими (болезнетворными), высказанная Мечниковым, сегодня претворена в
жизнь при применении антибиотиков для лечения многих инфекционных болезней,
бактерийных препаратов для лечения кишечных заболеваний.

Мечников изучал холеру, брюшной тиф и туберкулез. Он разработал метод

экспериментального воспроизведения сифилиса (совместно с французским ученым
Э. Ру), исследовал многие другие вопросы биологии и медицины. В 1886 г. он
организовал в Одессе первую в стране бактериологическую станцию и создал
школу микробиологов. Однако его прогрессивная научная и общественная
деятельность вызвала недовольство царского правительства и он был вынужден
покинуть родину. С 1887 г. и до конца жизни он жил в Париже и работал в
институте Пастера. В нашей стране и за рубежом его именем названы многие
научные институты и лаборатории.
 Одним из ближайших помощников и учеников Мечникова был А. М. Безредка
(1868-1940). Его работы, посвященные проблемам иммунитета и анафилаксии,
нашли широкое применение в практике.

Л. А. Тарасевич (1868-1927) также является учеником Мечникова. Он вел

исследования в области изучения механизма иммунитета и анафилаксии, являлся
блестящим организатором борьбы с эпидемиями в России, проводил вакцинацию
против туберкулеза и кишечных инфекций. В 1918 г. он организовал Институт
контроля сывороток и вакцин, который носит его имя (ГИСК им. Л. А. Тарасевича).

К числу выдающихся микробиологов и учеников Мечникова относится П. В.

Циклинская (1859-1923) - первая женщина-профессор бактериологии, руководитель
кафедры бактериологии Московских высших женских курсов. Основные работы
Циклинской посвящены изучению кишечной флоры и ее значения для здоровья
человека. Результаты исследований Циклинской по изучению природы детских
поносов до сих пор имеют теоретическое и практическое значение.

Ближайшим помощником Мечникова во время его работы на

бактериологической станции в Одессе был Н. Ф. Гамалея (1859-1949). Это был
крупный иммунолог, впервые применивший так называемые химические вакцины.
Он изучал бешенство, возбудителей туберкулеза, холеры. В 1898 г. Гамалея
впервые наблюдал бактериофагию - растворение бактерий. Имя Н. Ф. Гамалеи
присвоено нескольким микробиологическим институтам нашей страны.

Имя Г. Н. Габричевского (1860-1907), главы Московской школы микробиологов,

связано с изучением и производством вакцин и сывороток в России. Он показал
значение гемолитического стрептококка как возбудителя скарлатины и предложил
вакцину, снизившую смертность от этого заболевания. Внедрение Габричевским в
практику лечения дифтерии сыворотки также имело несомненный успех.
Габричевский был председателем Пироговского общества русских врачей, автором
первого русского учебника медицинской микробиологии. Его именем назван
Московский институт микробиологии и эпидемиологии.

Д. К. Заболотный (1866-1929) - выдающийся микробиолог и эпидемиолог. Его по

праву можно считать основоположником отечественной эпидемиологии. Труды
Заболотного посвящены борьбе с чумой, холерой, сифилисом. Он заразил себя
взвесью холерных вибрионов, чтобы выяснить возможность вакцинации против
этой болезни через рот убитой вакциной. Такой же опыт проделал над собой И. Г.
Савченко.

Особое место в общей микробиологии занимает микробиология почвы.

Основоположник этой науки С. Н. Виноградский (1856-1953) установил роль
микроорганизмов в круговороте азота, углерода, фосфора, серы и железа. Он
изучил нитрифицирующие и азотфиксирующие бактерии почвы.

Его ученик В. Л. Омелянский (1867-1928) посвятил свои исследования

выяснению роли бактерий в круговороте азота и углерода, анаэробному
разложению клетчатки.

Можно назвать еще много имен отечественных микробиологов, которым

принадлежит честь открытия возбудителей разных инфекционных болезней,
создания лечебных препаратов, разработки вакцин и сывороток для
предупреждения инфекций. Нельзя забыть и тех, кто рисковал своей жизнью при
изучении возбудителей инфекционных болезней или в борьбе с ними: И. А.
Деминского, В. Хавкина, М. А. Лебедевой, А. Л. Берлина и др.

Великая Октябрьская социалистическая революция раскрыла широкие

возможности для плодотворной работы ученых-микробиологов.

Первый период развития советской микробиологии был связан с ликвидацией

эпидемий сыпного и возвратного тифов, холеры; предотвращением заноса чумы и
натуральной оспы. Решение этой задачи требовало организации производства
вакцин и сывороток для проведения профилактических прививок, организации
санитарно-просветительной работы, подготовки высококвалифицированных
кадров. Блестящая плеяда советских ученых-микробиологов помогла решить
поставленные задачи.

Л. А. Зильбер (1894-1966) - микробиолог, иммунолог, эпидемиолог. Его работы

по изучению весенне-летнего энцефалита привели к открытию возбудителя и
переносчиков этого заболевания. В течение длительного времени Зильбер изучал
этиологию и иммунологию злокачественных опухолей и создал
вирусогенетическую теорию их происхождения.

Л. А. Зильбер (1894-1966)

Исследования З. В. Ермольевой (1898-1974) были посвящены изучению холеры и

борьбе с этой инфекцией. Она впервые в СССР получила пенициллин, который в
годы Великой Отечественной войны спас тысячи жизней.
 З. В. Ермольева (1898-1974)

Автор классических трудов по изучению бруцеллеза и риккетсиозов П. Ф.

Здродовский (1890-1976) создал и внедрил в практику ряд профилактических и
лечебных препаратов. Он занимался также вопросами иммунологии малярии и
кишечных заболеваний, вызванных простейшими.

1950-1970 гг. были периодом небывалого расцвета советской микробиологии. В

это время развернули свою работу крупные ученые: М. П. Чумаков, А. А.
Смородинцев, В. М. Жданов, В. Д. Тимаков и др. Их исследования связаны с
разработкой и внедрением вакцин против различных инфекций. Созданы и
используются вакцины из ослабленных возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза.
Разработана и повседневно применяется вакцина против полиомиелита. Введение
этой вакцины почти ликвидировало полиомиелит (детский паралич) в нашей
стране.

Дальнейшее развитие микробиологии, вирусологии и иммунологии тесно связано

с успехами молекулярной биологии и генетики. Эти дисциплины поднимают
микробиологические исследования на новый, более высокий уровень, позволяя
широко проникать в сущность патогенности, структуры клетки, закономерности
иммунного ответа организма и т. д.

В этом очень кратком очерке истории микробиологии освещена лишь малая

часть проблем и вопросов, над разрешением которых непрестанно трудятся
советские микробиологи. Их преданность своему делу, высокая квалификация и
творческое горение - залог будущих успехов отечественной медицины.

Часть I. Общая микробиология

 Глава 1. Микробиологическая лаборатория - Л. Б.
Богоявленская
Микробиологические лаборатории организуются при больницах, поликлиниках и
санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС).

Задача медицинской микробиологической лаборатории - диагностика

инфекционных болезней. Для этого проводят выделение возбудителя и определение
иммунного ответа организма на внедрение микроорганизмов (серологическая
диагностика). Кроме того, проводят выявление носителей патогенных
(болезнетворных) микроорганизмов. Имеются лаборатории, в которых проводят
вирусологические исследования. В специальных санитарно-бактериологических
лабораториях проводят исследования с целью выявления степени микробного
загрязнения внешней среды и различных объектов.

Материалом для микробиологических исследований служат чаще всего

выделения человека (испражнения, моча, рвотные массы, мокрота, отделяемое ран),
а также кровь, желчь, спинномозговая жидкость, промывные воды желудка,
бронхов, трупный (секционный) материал и др.

Работа в микробиологической лаборатории с заразным материалом делает

обязательным размещение ее в изолированном помещении. Для выполнения всех
правил работы с заразным материалом и проведения микробиологических
исследований лаборатория должна иметь несколько помещений:

1. Лабораторные 4. Моечная.
комнаты. 5. Препараторская.
2. Бокс с предбоксником. 6. Стерилизационная.
3. Помещение для приготовления 7. Регистратура.
питательных сред. 8. Виварий.

Лабораторная комната предназначена для проведения микробиологических

исследований. Она должна быть просторной и светлой. Стены красят светлой
масляной краской, пол покрывают линолеумом, лабораторные столы - пластиком
или стеклом, что удобно для влажной уборки и дезинфекции. В лабораторной
комнате оборудуют: рабочие столы для врача и лаборанта, место для окраски
препаратов, термостат, холодильник, центрифугу, микроскоп, шкафы, раковину с
подводкой горячей и холодной воды, газовые горелки (при отсутствии газа
работают со спиртовыми горелками).

Число лабораторных комнат определяется объемом работы лаборатории. В

крупных лабораториях выделяют отдельные комнаты для работы с различными
видами возбудителей.

Рабочий стол устанавливают у окна, чтобы свет падал сбоку или прямо. На столе
размещают горелку, бактериологические петли, банки с дезинфицирующим
раствором и ватой.

Внимание! Перед началом работы на столе размещают все необходимое для

проведения исследования. Горелку устанавливают на расстоянии, равном
предплечью работающего, т. е. в позиции, исключающей лишние движения во
время работы. Размер пламени в горелке и правильное свечение регулируют до
начала работы.

В термостате при проведении обычных исследований температура должна быть

37° С. В больших лабораториях может быть оборудована специальная термальная
комната. Температуру ежедневно региструют.

В холодильнике держат некоторые питательные среды, диагностические

препараты, кровь, желчь и пр.

Центрифугу используют для отделения плотных частиц от жидкости (например,

эритроцитов от сыворотки).

В шкафах держат штативы, посуду, сухие питательные среды, реактивы и т. п.

Около раковины должны находиться сосуд с дезинфицирующим раствором для

обработки рук и аптечка с набором предметов для оказания первой медицинской
помощи.

Бокс - строго изолированное помещение для проведения микробиологической

работы в условиях, требующих особой стерильности. Обеспложивание воздуха
проводят с помощью бактерицидных ламп (БУВ-15, БУВ-30 и др.) или водяной
бани (перед работой бокс обрабатывают паром кипящей воды с дезинфицирующим
раствором). Подача в бокс через приточно-вытяжную вентиляцию обеззараженного
воздуха определенной температуры и влажности является лучшим способом
обеспечения нужных условий для работы. Обычно в боксе работают два человека.
Входят в бокс через предбоксник, в котором переодеваются (халат, тапочки,
шапочка, маска) и переходят в бокс через вторую дверь.

Внимание! В боксе не разговаривают и избегают лишних движений.

Помещение для приготовления питательных сред должно находиться рядом с

моечной и стерилизационной. В этой комнате должна быть раковина с подводкой
горячей и холодной воды, дистиллятор, плита (газовая или электрическая), шкафы
или стеллажи для хранения сухих питательных сред, химических реактивов,
стерильной посуды.

Моечная - комната для мытья и обработки посуды, которая должна иметь

раковину (с холодной и горячей водой) и плиту. Моечную оборудуют столами,
стеллажами, снабжают приспособлениями для мытья посуды: моющими
средствами, ершами, тряпками.

В стерилизационной находятся приборы для стерилизации чистой посуды,

питательных сред и обеззараживания отработанного материала: автоклавы,
сушильный шкаф и др. (см. главу 5).

При наличии отдельной препараторской комнаты ее используют для подготовки,

упаковки посуды и другой подсобной работы.
 В регистратуре, или части помещения ее заменяющей, принимают и
регистрируют материал, поступающий для исследования, и выдают заключения
микробиологического исследования.

Виварий - помещение для содержания экспериментальных животных, имеется

только в больших лабораториях (см. главу 11).

Правила поведения и работы в микробиологической

лаборатории
1. К работе допускают сотрудников только после ознакомления с правилами
поведения и режимом работы.

2. Все работники подвергаются профилактическим прививкам, главным образом

против кишечных инфекций.

3. Каждый сотрудник имеет халат и шапочку; в лаборатории носят сменную

обувь.

4. Каждый сотрудник обязан строго соблюдать личную гигиену, содержать в

чистоте рабочее место.

5. Поступающий в лабораторию материал регистрируют в специальный журнал и

маркируют.

6. Весь поступающий материал для исследования считают инфицированным

(заразным). Его ставят на специальный поднос, а емкость с материалом протирают
дезинфицирующим раствором снаружи.

7. Переливать исследуемый материал из одной емкости в другую следует над

дезинфицирующим раствором. Жидкий материал отсасывают с помощью
резинового баллона, надетого на пипетку.

8. При попадании исследуемого материала на руки, стол или другие предметы их

обрабатывают дезинфицирующим раствором.

9. По окончании работы руки, инструменты, рабочее место обрабатывают

дезинфицирующим раствором. Культуры обезвреживают или, при необходимости,
сохраняют в холодильнике, который опечатывают. Материал, требующий
продолжения исследования, ставят в термостат, который тоже опечатывают. При
хранении патогенных культур в лаборатории их регистрируют в специальном
журнале. Указывают количество культур, даты их поступления, пересева,
уничтожения.

10. В лаборатории категорически запрещается принимать пищу и курить.

11. В лаборатории ежедневно проводят влажную уборку помещений с

применением дезинфицирующих растворов. Еженедельно моют стены, полы,
инвентарь горячей водой с мылом. Бокс убирают в конце рабочего дня, а перед
работой облучают бактерицидными лампами.
 Режим работы в лабораториях зависит от степени опасности заражения для лиц,
работающих с болезнетворными микроорганизмами или материалом, их
содержащим.

Микроорганизмы по степени опасности заражения ими разделены на четыре

группы:

I. Возбудители чумы.

II. Возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний (холера,

бруцеллез, туляремия, сибирская язва, сап, мелиоидоз, лептоспироз).

III. Возбудители эпидемических бактериальных инфекций: кишечных (брюшной

тиф, паратифы А и В, дизентерия), туберкулеза, дифтерии, коклюша, менингита,
гонореи, листериоза, трахомы, лепры; патогенные анаэробы, спирохеты
(возбудители эпидемического возвратного тифа и сифилиса) и др.

IV. Сальмонеллы, протей, эшерихии, клебсиеллы, гемоглобинофильные

бактерии, стафилококки, стрептококки, возбудители газовой гангрены и др.

С материалом, возможно зараженным возбудителями особо опасных инфекций

(ООИ) I и II групп, и с культурами микроорганизмов этих групп работают в
специальных лабораториях с разрешения органов здравоохранения СССР или
союзных республик. С возбудителями, относящимися к III группе, - в лабораториях
СЭС, больниц и др., к IV группе - во всех микробиологических лабораториях.

Большое значение для микробиологического исследования имеет техника взятия

исследуемого материала и способ доставки его в лабораторию. Любой материал
должен быть собран в стерильную посуду с соблюдением условий,
предохраняющих его от загрязнения посторонней микрофлорой.

Испражнения берут специальной ректальной петлей, которую вводят в прямую

кишку на 8-15 см. Петлю помещают в пробирку с консервантом (глицериновая
смесь, фосфатно-буферная смесь и т. п.). Можно также использовать стерильные
картонные тарелки или судно, обработанное дезинфицирующим раствором (10%
хлорная известь) и тщательно промытое горячей водой для удаления следов
хлорной извести.

Мочу берут стерильным катетером в стерильные флаконы или пробирки.

Мокроту собирают в стерильные банки. Кровь из вены берут стерильно во

флакон со специальной питательной средой, для серологических реакций - в сухую
пробирку.

Гнойное отделяемое из раны, мазки из зева и носа берут стерильными ватными

тампонами и помещают в стерильные пробирки. Рвотные массы собирают в
стерильную широкогорлую банку, закрытую вощаной бумагой.

Трупный (секционный) материал следует брать в первые часы после смерти

больного, так как микрофлора кишечника очень быстро распространяется по всему
организму. Кровь из сердца берут стерильным шприцем, стерильными ножницами
вырезают кусочки печени, селезенки и других органов. Все пробы для
микробиологического исследования помещают в стерильные сосуды.

На пробирку, банку, флаконы с материалом для исследования наклеивают

этикетку, на которой указаны фамилия, имя, отчество, возраст больного и дата
взятия материала. В направлении повторяют сведения, приведенные на этикетке, и
дополнительно сообщают: характер материала, учреждение, направившее материал,
клинический диагноз, цель исследования и фамилию врача, направляющего
материал.

Доставку исследуемого материала в лабораторию производят в кратчайший срок

в специальных металлических биксах, контейнерах, пеналах. Материал,
содержащий микроорганизмы, малоустойчивые во внешней среде, переносят в
специальных сосудах, в которых поддерживается температура 37° С, при доставке
вирусного материала используют термосы со льдом для создания низкой
температуры.

Внимание! Правильный сбор и транспортировка исследуемого материала

обеспечивают эффективность микробиологических исследований.

Методы микробиологического исследования

Микроскопический метод используется для изучения окрашенных мазков и
мазков из нативного материала в микроскопе и позволяет характеризовать
морфологию (форму) возбудителя, его отношение к различным красителям,
подвижность. С помощью этого метода можно подтвердить клинический диагноз
гонореи, дифтерии, возвратного тифа, сифилиса и некоторых других болезней.

Микробиологический метод применяют для выделения и изучения чистой

культуры возбудителя, т. е. для установления этиологии заболевания. Лабораторная
диагностика большинства инфекционных болезней (брюшной тиф, дизентерия,
холера, коклюш и др.) основана на применении этого метода.

Серологический метод (от лат. serum - сыворотка) выявляет в сыворотке крови

вещества, образующиеся в ответ на внедрение возбудителя в организм человека
(антитела). С его помощью подтверждают диагноз бруцеллеза, туляремии,
брюшного тифа и др.

Биологический (экспериментальный) метод - введение подопытным

животным чистой культуры микроорганизмов, ядов ими выделяемых (токсинов)
или исследуемого материала с целью получения характерных для данной инфекции
изменений. Этот метод дает возможность воспроизвести инфекционное
заболевание. Его применяют с целью постановки диагноза ботулизма, столбняка,
токсико-инфекций и др.

Контрольные вопросы
1. Каковы задачи микробиологической лаборатории?

2. Какие помещения имеет микробиологическая лаборатория?

 3. Как следует вести себя при работе в микробиологической лаборатории?

4. Как собирают и пересылают в лабораторию материал для

микробиологического исследования?

Глава 2. Микроскоп и микроскопические методы

исследования - М. Я. Корн
Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы.
Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые
имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.), а электронные -
для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы).

Различают простые и сложные световые микроскопы. Оптика простых

микроскопов представлена одной линзой с большим увеличением. В сложных
микроскопах оптическая система состоит из объектива для получения увеличенного
изображения объекта и окуляра для дальнейшего увеличения полученного
изображения и его рассматривания.

Современные световые микроскопы, позволяющие не только увидеть

микроорганизмы, но и изучить их структуру, это сложные оптические приборы,
обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой
аккуратности.

Биологические световые микроскопы, в зависимости от области применения,

сложности устройства и комплектации различной оптикой, подразделяются на
рабочие, лабораторные и исследовательские. Сейчас наша промышленность
выпускает серию микроскопов "Биолам". Микроскопы этой серии имеют
обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (Р - рабочие, Л -
лабораторные, И - исследовательские), комплектация обозначается цифрой,
например рабочие от Р11 до Р17 (рис. 1).
Рис. 1. Микроскопы рабочие серии 'Биолам'. а - 'Биолам P16'; б - 'Биолам Р11'

В микроскопе различают механическую и оптическую части.

 К механической части относится штатив (состоящий из основания и
тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и
смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для
крепления конденсора и светофильтров, встроенные в штатив механизмы для
грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт)
перемещения предметного столика или тубусодержателя.

Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и

осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под
предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую
сторону, а также отдельного или встроенного осветителя с низковольтной лампой
накаливания и трансформатором. Объективы ввинчиваются в револьвер, а
соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с
противоположной стороны тубуса.

Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий

два одинаковых окуляра и дающий возможность наблюдения двумя глазами)
тубусы. Кроме того, тубус микроскоп может быть прямой вертикальный (в
основном для фотографирования) и наклонный.

Основную роль в получении четкого изображения играет объектив. Он строит

увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это
изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр,
который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.

На рис. 2 показана схема хода лучей в микроскопе.

 Увеличение микроскопа можно определить, умножая увеличение объектива на
увеличение окуляра (обычно увеличение объектива и окуляра указано на оправе:
объектива до 100×, окуляра - 4×, 5×, 7×, 10×, 12,5×, 15× и 20×).

Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения,

его четкость определяется разрешающей способностью микроскопа, т. е.
возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Предел
разрешения - минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,
- зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры
объектива. Числовая апертура в свою очередь зависит от угловой апертуры
объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной
линзой объектива и препаратом. Угловая апертура - это максимальный угол, под
которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше
апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между
объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше
разрешающая способность объектива.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно

равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое
окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.

В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом,

различают "сухие" объективы малого и среднего увеличения (до 40×) и
иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90-100×).

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной

линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость,
имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что
обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности
объектива.

В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии

используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии -
кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Недостатком
кедрового масла является его быстрое загустевание. Для объективов, работающих в
ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют
глицерин. Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными
недостатками: сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля
изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в
той или иной мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих
недостатков различают объективы ахроматы и более сложные апохроматы.
Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения,
называются планахроматами и план апохроматам и. Использование этих
объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как
изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой
резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно
выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива
(АПО - апохромат и т. п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и
белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии -
обозначение МИ и черное кольцо.

Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17 мм.
Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с
сильными сухими системами (40×). При работе с иммерсионными объективами
нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина
покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в
этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть
повреждена фронтальная линза объектива.

Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из

которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя
недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
 Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от
осветителя. Он состоит из нескольких линз, превращающих параллельные лучи от
осветителя в сходящиеся. Одной из деталей конденсора является апертурная
диафрагма, которая имеет важное значение для правильного освещения препарата.
Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, накал
которой можно регулировать, коллекторной линзы и полевой диафрагмы (от
раскрытия которой зависит диаметр освещенного поля на препарате). Зеркало
направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить
параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо
использовать только плоскую сторону зеркала. Качество изображения в
значительной мере зависит также от правильного освещения.

Настройка освещения и фокусировка микроскопа. Существует несколько

различных способов освещения препарата при микроскопии. Наиболее
распространенным является способ установки света по Кёлеру, который
заключается в следующем:

1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа;

2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало

микроскопа;

3) помещают препарат на предметный столик микроскопа;

4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем

изображение нити лампы;

5) убирают лист бумаги с зеркала;

6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка

передвигая патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной
диафрагме.

Внимание! Расстояние осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы

изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора.

7) открывают апертурную диафрагму конденсора, прикрывают полевую

диафрагму осветителя и значительно уменьшают накал лампы;

8) при малом увеличении (10×), глядя в окуляр, получают резкое изображение

препарата;

9) слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы,

которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая
конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы
(вокруг них может быть видна цветная каемка);

10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения,

увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной
диафрагмы конденсора;
 11) при смене объектива необходимо проверить настройку света.

Внимание! После окончания настройки света по Кёлеру ни в коем случае нельзя

изменять положение конденсора, раскрытие полевой и апертурной диафрагмы.

Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными

светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата.

Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого

увеличения (до 10×) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.

Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение - с

сильными сухими (40×) и иммерсионными (90×) системами, чтобы не повредить
фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая
сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом,
затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до
появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную
фокусировку микроскопа.

Уход за микроскопом. Микроскоп - точный оптический прибор, требующий

бережного обращения с ним. При работе с микроскопом нельзя применять большие
усилия. Ни в коем случае нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и
светофильтров.

Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы

тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе.

При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой
(беличьей) кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают
поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной
или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или
специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику
объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию.

С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее

резиновой грушей. Протирать их нельзя.

Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы - это

неизбежно приведет к их порче.

По окончании работы на микроскопе необходимо прежде всего тщательно

удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы объектива указанным
выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах
с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.

Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать

его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой
мягкой чистой тряпкой.
 Фазово-контрастная микроскопия
Световые волны характеризуются длиной волны, амплитудой и фазой. Глаз
человека способен различать длину волны (цвет) и амплитуду (интенсивность,
яркость света), но не может обнаружить различия в фазе.

При микроскопии окрашенных объектов наблюдается изменение амплитуды

(уменьшение яркости света) и избирательное поглощение света определенной
длины волны (изменение цвета).

При наблюдении неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от

окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности
не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз
изменений заметить не может и эти объекты выглядят малоконтрастными,
прозрачными.

Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию,

основанную на превращении фазовых изменений, вносимых объектом, в
амплитудные, различимые глазом.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом

биологическом микроскопе и состоит из: 1) набора объективов со специальными
фазовыми пластинками; 2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем
установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в
каждом из объективов; 3) вспомогательного микроскопа.

Настройка фазового контраста в основном заключается в следующем:

1) заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазово-контрастные;

2) устанавливают объектив малого увеличения и отверстие в диске конденсора

без кольцевой диафрагмы (обозначенное цифрой "0");

3) настраивают свет по Кёлеру;

4) выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его

на препарат;

5) поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу

кольцевую диафрагму;

6) вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный

микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в
виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же
диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре точно совмещают
эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых

неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на
светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне
(негативный фазовый контраст). Наша промышленность выпускает устройство КФ-
4 для позитивного фазового контраста.

Фазово-контрастная микроскопия широко применяется также для изучения

клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В
этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным
расположением оптики - так называемые инвертированные микроскопы. У таких
микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху. Иногда они
заключены в термостат для наблюдения за динамикой изменений в клетках
культуры ткани и снабжены кинокамерой.

Морфология некоторых микроорганизмов не может быть изучена с помощью

описанных выше способов микроскопии. К ним относятся различные спирохеты и,
в частности, лептоспиры, некоторые крупные вирусы. Для наблюдения этих
микроорганизмов применяют темнопольную микроскопию.

Темнопольная микроскопия
Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно
рассеивать свет. Для темнопольной микроскопии пользуются обычными
объективами и специальными темнопольными конденсорами. Существует
несколько типов таких конденсоров, различающихся по устройству.

Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что

центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив
микроскопа не попадают. Объект освещается косыми боковыми лучами и в
объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися
в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным
примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их
узким лучом солнечного света.

Чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура его должна

быть меньше, чем апертура конденсора. Для уменьшения апертуры в обычный
объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами,
снабженными ирисовой диафрагмой.

При темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на

черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие
микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности
микроскопа. Однако темнопольная микроскопия позволяет увидеть только контуры
объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру.

Обычно с помощью темнопольной микроскопии изучают препараты типа

"раздавленная капля". При этом очень строгие требования предъявляются к
качеству предметных и покровных стекол и приготовлению препарата. Предметные
стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные - 0,17 мм, без царапин и
загрязнений. При приготовлении препарата следует обращать особое внимание на
отсутствие пузырьков и крупных частиц (все эти дефекты будут видны ярко
святящимися и не позволят наблюдать препарат).
 Для темнопольной микроскопии необходимы яркие источники света, поэтому
следует применять более мощные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:

1) устанавливают свет по Кёлеру; 2) заменяют светлопольный конденсор

темнопольным; 3) на верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или
в крайнем случае дистиллированную воду; 4) поднимают конденсор до
соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла; 5) объектив малого
увеличения фокусируют на препарат; 6) с помощью центрировочных винтов
переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный
центральный участок); 7) поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения
затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого
пятна. Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного
стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых
предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла).

После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения

и исследуют препарат.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на способности
некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым
ультрафиолетовым или синим светом. Примером такого свечения являются
известные всем лампы дневного света, в которых в результате облучения
ультрафиолетовыми лучами светится специальный состав - люминофор,
покрывающий изнутри колбу лампы.

Цвет люминесценции обычно смещен в более длинноволновую часть спектра по

сравнению с возбуждающим ее светом. Так, если люминесценция возбуждается
синим светом, то цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция
возбуждается невидимым ультрафиолетовым излучением, то цвет ее может быть в
любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет,
используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет,
наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.

Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются

от обычного светового микроскопа в основном следующим:

1. Наличие мощного источника света в осветителе, излучающего

преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра
(ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления). В специальных
люминесцентных осветителях, которые устанавливают на обычный микроскоп,
применяют кварцевые галогенные лампы (КГМ).

2. Наличие системы светофильтров: а) возбуждающие светофильтры пропускают

только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию;

б) теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры,

препарат и оптику люминесцентного микроскопа. В отечественных
люминесцентных микроскопах теплозащитную функцию кроме того выполняет
кювета с плоскопараллельными стеклами, заполненная дистиллированной водой.
Эта кювета установлена непосредственно после коллектора.

При работе с люминесцентным микроскопом надо обращать особое внимание на

то, чтобы эта кювета была полностью заполнена водой и чтобы вода была
абсолютно чистой и прозрачной, поскольку при длительной работе микроскопа в
воде могут размножаться микроорганизмы и она мутнеет;

в) "запирающие" светофильтры расположены между препаратом и окуляром. Эти

светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет
люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.

В нашей стране разработан очень эффективный способ освещения препаратов

для возбуждения люминесценции, который используется во всех отечественных
люминесцентных микроскопах. Этот способ заключается в том, что препарат
освещают светом, падающим на него через объектив. Благодаря этому
освещенность увеличивается при использовании объектов, имеющих большую
числовую апертуру, т. е. тех, которые используются для изучения
микроорганизмов. Очень важную роль при этом способе освещения играет
специальная интерференционная светоделительная пластинка, направляющая свет в
объектив и представляющая собой полупрозрачное зеркало, которое избирательно
отражает и направляет в объектив только ту часть спектра, которая возбуждает
люминесценцию, а пропускает в окуляр только свет люминесценции.

Оптика объективов люминесцентного микроскопа изготавливается из

нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным
нелюминесцирующим клеем. На оправе таких объективов выгравирована буква "Л".
При работе с объективами масляной иммерсии при люминесцентной микроскопии
пользуются специальным нелюминесцирующим иммерсионным маслом.

Правила настройки люминесцентного микроскопа подробно изложены в

инструкции к микроскопу.

На рис. 3 показан люминесцентный микроскоп "Люмам", выпускаемый

Ленинградским оптико-механическим объединением (ЛОМО).
 Рис. 3. Микроскоп люминесцентный исследовательский серии 'Люмам ИЗ'

Для изучения микроорганизмов в люминесцентном микроскопе их

предварительно окрашивают (флюорохромируют) сильно разведенными
растворами специальных люминесцирующих красителей (флюорохромов), которые
избирательно связываются с определенными структурами клетки. Флюорохромы
отличаются от обычных красителей тем, что применяются в очень малых
концентрациях (До нескольких мкг/мл); кроме того, ими могут быть окрашены не
только фиксированные, но и живые клетки. Люминесцентная микроскопия также
используется для регистрации результатов реакции иммунофлюоресценции (РИФ)
(см. главу 12).

Электронная микроскопия
Различные способы световой микроскопии позволяют изучать сравнительно
крупные микроорганизмы (бактерии, простейшие), но не дают возможности
наблюдать объекты, величина которых меньше чем 0,2 мкм, так как разрешающая
способность микроскопа зависит от длины волны видимого света. Поэтому в
световом микроскопе не может быть изучено строение вирусов.

Принципиально новые возможности для изучения тонкого строения бактерий и

вирусов появились после изобретения электронного микроскопа.

В электронном микроскопе вместо световых волн для построения изображения

используют поток электронов в глубоком вакууме.
 В качестве "линз", фокусирующих электроны, служит электромагнитное поле,
создаваемое электромагнитными катушками. Изображение в электронном
микроскопе наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. Объекты
при электронной микроскопии находятся также в глубоком вакууме, поэтому
подвергаются фиксации и специальной обработке. Кроме того, они должны быть
очень тонкими, так как поток электронов сильно поглощается. В связи с этим в
качестве объектов используют ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм, что
значительно меньше толщины вирусных частиц. Разрешающая способность
современных электронных микроскопов равна 0,15 нм, что позволяет получить
полезное увеличение в миллионы раз.

Электронный микроскоп по своим размерам и сложности устройства очень

отличается от светового. Колонна микроскопа, в которой находится объект и
разгоняются электроны, превышает рост человека, а для размещения микроскопа
нужна отдельная комната.

Контрольные вопросы
1. Из каких основных частей состоит микроскоп?

2. Как правильно настроить свет в микроскопе?

3. В чем принцип фазово-контрастной микроскопии?

4. На чем основана темнопольная микроскопия и когда ее используют?

5. На чем основана люминесцентная микроскопия?

6. Что такое электронный микроскоп и какова его разрешающая способность

(увеличение)?

Глава 3. Основы классификации и морфология

микроорганизмов - О. Б. Орлеанская
Микроорганизмы (от лат. micros - малый) - организмы, невидимые
невооруженным глазом. К ним относятся простейшие, спирохеты, грибы, бактерии,
вирусы, изучением которых занимается микробиология. Величина
микроорганизмов измеряется в микрометрах (мкм). В микромире существует
большое разнообразие форм, которые делятся на группы с учетом общих
принципов биологической классификации.

Первой общей биологической классификацией была созданная в XVIII веке

система шведского ученого К. Линнея, основанная на морфологических признаках
и включавшая животный и растительный мир. С развитием науки в классификации
стали учитывать не только морфологические, но и физиологические,
биохимические и генетические особенности микроорганизмов. В настоящее время
невозможно говорить об единой классификации всех живых организмов: сохраняя
единые принципы, классификации макро- и микроорганизмов имеют свои
особенности.
 Основными ступенями всех классификаций являются: царство - отдел - класс
(группа) - порядок - семейство - род - вид. Главной классификационной категорией
является вид - совокупность организмов, имеющих общее происхождение, сходные
морфологические и физиологические признаки и обмен веществ.

Микроорганизмы относятся к царству прокариотов, представители которых, в

отличие от эукариотов, не обладают оформленным ядром. Наследственная
информация у прокариотов заключена в молекуле ДНК, располагающейся в
цитоплазме клетки.

Для микроорганизмов принята в 1980 г. единая международная классификация, в

основе которой лежит система, предложенная американским ученым Берги.

Для того чтобы определить, к какому виду относится микроорганизм,

необходимо с помощью различных методов изучить его особенности (форму
клетки, спорообразование, подвижность, ферментативные свойства) и по
определителю найти его систематическое положение - идентифицировать.

Внутри вида существуют варианты: морфоварианты отличаются по морфологии,

биоварианты - по биологическим свойствам, хемоварианты - по ферментативной
активности, сероварианты - по антигенной структуре, фаговарианты - по
чувствительности к фагам.

Для обозначения микроорганизмов принята общебиологическая бинарная или

биноминальная (двойная) номенклатура, введенная К.Линнеем. Первое название
обозначает род и пишется с прописной буквы. Второе название обозначает вид и
пишется со строчной буквы. Например, Staphylococcus aureus - стафилококк
золотистый. В названиях могут быть отражены имена исследователей, открывших
микроорганизмы: бруцеллы - в честь Брюса, эшерихии - в честь Эшериха и т. д. В
ряд наименований включены органы, которые поражает данный микроорганизм:
пневмококки - легкие, менингококки - мозговую оболочку и т. д.

Бактерии
Бактерии - это одноклеточные организмы, лишенные хлорофилла. Средние
размеры бактериальной клетки - 2-6 мкм. Размеры и форма клеток бактерий,
присущие микроорганизмам определенного вида, могут изменяться под влиянием
различных факторов (в зависимости от возраста бактериальной культуры, среды
обитания и пр). Это явление называется полиморфизмом.

По форме клетки бактерии делятся на три группы: шаровидные, палочковидные

и извитые (рис. 4).
Рис. 4. Формы микроорганизмов и методы их окраски. а - шаровидные бактерии: 1 -
стафилококки (окраска по Граму); 2 - стрептококки (окраска по Граму); 3 -
пневмококки (окраска по Бурри - Гинсу); 4 - менингококки и гонококки (окраска по
Граму); б - палочковидные бактерии: 1 - кишечные палочки (окраска по Граму); 2 -
возбудитель дифтерии (окраска метиленовым синим); 3 - возбудитель туберкулеза
(окраска по Цилю - Нильсену); 4 - возбудитель столбняка (окраска по Ожешко); 5 -
холерный вибрион (окраска по Граму); в - спирохета: 1 - бледная трепонема; 2 -
спирохета возвратного тифа; 3 - лептоспиры

Шаровидные бактерии называются кокки (от лат. coccus - ягода) и имеют

диаметр клетки от 0,5 до 1 мкм. Форма кокков разнообразна: сферическая,
ланцетовидная, бобовидная. По взаимному расположению клеток после деления
среди кокков выделяют: микрококки (от лат. micros - малый) - клетки делятся в
разных плоскостях и располагаются поодиночке; диплококки (от лат. diploos -
двойной) - клетки делятся в одной плоскости и затем располагаются попарно; к ним
относятся ланцетовидные пневмококки и бобовидные гонококки и менингококки;
стрептококки (от лат. streptos - цепочка) - клетки делятся в одной плоскости и не
расходятся, образуя цепочку; стафилококки (от лат. staphyle - гроздь) - клетки
делятся в различных плоскостях, образуя скопления в виде грозди винограда;
тетракокки (от лат. tetra - четыре) - клетки делятся в двух взаимно
перпендикулярных плоскостях и располагаются по четыре; сарцины (от лат. sarcio -
соединяю) - клетки делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и
располагаются в виде тюков или пакетов по 8 или 16 клеток в каждом.

Кокки широко распространены во внешней среде, а также в организме человека и

животных. Почти все группы кокков, исключая микрококки, тетракокки и сарцины,
включают возбудителей инфекционных заболеваний.

Палочковидные формы называются бактериями. Средние размеры их от 1 до 6

мкм в длину и от 0,5 до 2 мкм в толщину.

Бактерии различаются по внешнему виду: концы их могут быть закругленными

(кишечная палочка), обрубленными (возбудитель сибирской язвы), заостренными
(возбудитель чумы) или утолщенными (возбудитель дифтерии). После деления
бактерии могут располагаться попарно - диплобактерии (клебсиеллы), цепочкой
(возбудитель сибирской язвы), иногда под углом друг к другу или крест-накрест
(возбудитель дифтерии). Большинство бактерий располагается беспорядочно.

Среди бактерий встречаются изогнутые формы - вибрионы (возбудитель

холеры).

К извитым формам относятся спириллы и спирохеты. Форма их клетки

напоминает спираль. Большинство спирилл неболезнетворны.

Строение бактериальной клетки

Для изучения строения бактериальной клетки наряду со световым микроскопом

применяют электронно-микроскопические и микрохимические исследования,
позволяющие определить ультраструктуру бактериальной клетки.

Бактериальная клетка (рис. 5) состоит из следующих частей: трехслойной

оболочки, цитоплазмы с различными включениями и ядерного вещества
(нуклеоида). Дополнительными структурными образованиями являются капсулы,
споры, жгутики, пили.
Рис. 5. Схематическое изображение строения бактериальной клетки. 1 - оболочка; 2
- слизистый слой; 3 - клеточная стенка; 4 - цитоплазматическая мембрана; 5 -
цитоплазма; 6 - рибосома; 7 - полисома; 8 - включения; 9 - нуклеоид; 10 - жгутик; 11 -
пили

Оболочка клетки состоит из наружного слизистого слоя, клеточной стенки и

цитоплазматической мембраны.

Слизистый капсульный слой находится снаружи клетки и выполняет защитную

функцию.

Клеточная стенка - один из основных структурных элементов клетки,

сохраняющий ее форму и отделяющий клетку от окружающей среды. Важным
свойством клеточной стенки является избирательная проницаемость, которая
обеспечивает проникновение в клетку необходимых питательных веществ
(аминокислот, углеводов и др.) и выведение из клетки продуктов обмена. Клеточная
стенка сохраняет внутри клетки постоянное осмотическое давление. Прочность
стенки обеспечивает муреин, вещество полисахаридной природы. Некоторые
вещества разрушают клеточную стенку, например лизоцим.

Бактерии, полностью лишенные клеточной стенки, называются протопластами.

Они сохраняют способность к дыханию, делению, синтезу ферментов; к
воздействию внешних факторов: механическому повреждению, осмотическому
давлению, аэрации и др. Сохранить протопласты можно только в гипертонических
растворах.

Бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой называются

сферопластами. Если подавить процесс синтеза клеточной стенки с помощью
пенициллина, то образуются L-формы, которые у всех видов бактерий
представляют шаровидные крупные и мелкие клетки с вакуолями.

Цитоплазматическая мембрана плотно прилегает к клеточной стенке с

внутренней стороны. Она очень тонкая (8-10 нм) и состоит из белков и
фосфолипидов. Это пограничный полупроницаемый слой, через который
осуществляется питание клетки. В мембране находятся ферменты пермеазы,
осуществляющие активный перенос веществ, и ферменты дыхания.
Цитоплазматическая мембрана образует мезосомы, принимающие участие в
делении клетки. При помещении клетки в гипертонический раствор мембрана
может отделиться от клеточной стенки.
 Цитоплазма - внутреннее содержимое бактериальной клетки. Она представляет
собой коллоидную систему, состоящую из воды, белков, углеводов, липидов,
различных минеральных солей. Химический состав и консистенция цитоплазмы
изменяются в зависимости от возраста клетки и условий окружающей среды. В
цитоплазме находятся ядерное вещество, рибосомы и различные включения.

Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат. Ядерное

вещество прокариотов в отличие от эукариотов не имеет собственной мембраны.
Нуклеоид зрелой клетки представляет собой двойную нить ДНК, свернутую в
кольцо. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки. По
генетической терминологии ядерное вещество получило название генофор или
геном.

Рибосомы находятся в цитоплазме клетки и выполняют функцию синтеза белка.

В состав рибосомы входит 60% РНК и 40% белка. Количество рибосом в клетке
достигает 10000. Соединяясь вместе, рибосомы образуют полисомы.

Включения - гранулы, содержащие различные запасные питательные вещества:

крахмал, гликоген, жир, волютин. Они расположены в цитоплазме.

Клетки бактерий в процессе жизнедеятельности образуют защитные органеллы -

капсулы и споры.

Капсула - внешний уплотненный слизистый слой, примыкающий к клеточной

стенке. Это защитный орган, который появляется у некоторых бактерий при
попадании их в организм человека и животных. Капсула предохраняет
микроорганизм от защитных факторов организма (возбудители пневмонии и
сибирской язвы). Некоторые микроорганизмы имеют постоянную капсулу
(клебсиеллы).

Споры встречаются только у палочковидных бактерий. Они образуются при

попадании микроорганизма в неблагоприятные условия внешней среды (действие
высоких температур, высыхание, изменение рН, уменьшение количества
питательных веществ в среде и т. д.). Споры находятся внутри бактериальной
клетки и представляют уплотненный участок цитоплазмы с нуклеоидом, одетый
собственной плотной оболочкой. По химическому составу они отличаются от
вегетативных клеток малым количеством воды, увеличенным содержанием липидов
и солей кальция, что способствует высокой устойчивости спор. Спорообразование
происходит в течение 18-20 ч; при попадании микроорганизма в благоприятные
условия спора в течение 4-5 ч прорастает в вегетативную форму. В бактериальной
клетке образуется только одна спора, следовательно, споры не являются органами
размножения, а служат для переживания неблагоприятных условий.

Спорообразующие аэробные бактерии называются бациллами, а анаэробные -

клостридиями.

Споры отличаются по форме, размерам и расположению в клетке. Они могут

располагаться центрально, субтерминально и терминально (рис. 6). У возбудителя
сибирской язвы спора располагается центрально, ее размер не превышает
поперечника клетки. Спора возбудителя ботулизма расположена ближе к концу
клетки - субтерминально и превышает ширину клетки. У возбудителя столбняка
округлая спора располагается на конце клетки - терминально и значительно
превышает ширину клетки.

Жгутики - органы движения, характерны для палочковидных бактерий. Это

тонкие нитевидные фибриллы, состоящие из белка - флагеллина. Длина их
значительно превышает длину бактериальной клетки. Жгутики отходят от
базального тельца, расположенного в цитоплазме, и выходят на поверхность
клетки. Наличие их можно обнаружить по определению подвижности клеток под
микроскопом, в полужидкой питательной среде или при окраске специальными
методами. Ультраструктура жгутиков изучена в электронном микроскопе. По
расположению жгутиков бактерии делят на группы (см. рис. 6): монотрихи - с
одним жгутиком (возбудитель холеры); амфитрихи - с пучками или единичными
жгутиками на обоих концах клетки (спириллы); лофотрихи - с пучком жгутиков на
одном конце клетки (фекальный щелочеобразователь); перитрихи - жгутики
расположены по всей поверхности клетки (кишечные бактерии). Скорость
движения бактерий зависит от количества и расположения жгутиков (наиболее
активны монотрихи), от возраста бактерий и влияния окружающих факторов.

Рис. 6. Варианты расположения спор и жгутиков у бактерий. I - споры: 1 -

центральное; 2 - субтерминальное; 3 - терминальное; II - жгутики: 1 - монотрихи; 2
- амфитрихи; 3 - лофотрихи; 4 - перитрихи

Пили или фимбрии - ворсинки, расположенные на поверхности бактериальных

клеток. Они короче и тоньше жгутиков и также имеют спиральную структуру.
Состоят пили из белка - пилина. Одни пили (их несколько сотен) служат для
прикрепления бактерий к клеткам животных и человека, с другими (единичными)
связана передача генетического материала из клетки в клетку.

Микоплазмы
Микоплазмы - клетки, не имеющие клеточной стенки, но окруженные
трехслойной липопротеидной цитоплазматической мембраной. Микоплазмы могут
быть сферической, овальной формы, в виде нитей и звезд. Микоплазмы по
классификации Берги выделены в отдельную группу. В настоящее время этим
микроорганизмам уделяется все большее внимание как возбудителям заболеваний
воспалительного характера. Размеры их различны: от нескольких микрометров до
125-150 нм. Мелкие микоплазмы проходят через бактериальные фильтры и
называются фильтрующимися формами.
 Спирохеты
Спирохеты (см. рис. 52) (от лат. speira - изгиб, chaite - волосы) - тонкие, извитые,
подвижные одноклеточные организмы, имеющие размеры от 5 до 500 мкм в длину
и 0,3-0,75 мкм в ширину. С простейшими их роднит способ движения путем
сокращения внутренней осевой нити, состоящей из пучка фибрилл. Характер
движения спирохет различен: поступательное, вращательное, сгибательное,
волнообразное. В остальном строение клетки типичное для бактерий. Некоторые
спирохеты слабо окрашиваются анилиновыми красителями. Спирохеты разделяют
на роды по количеству и форме завитков нити и ее окончанию. Кроме сапрофитных
форм, распространенных в природе и организме человека, среди спирохет имеются
болезнетворные - возбудители сифилиса и других заболеваний.

Риккетсии
Риккетсии - микроорганизмы размером от 0,2 до 30 мкм. Они имеют обычное для
бактерий строение клетки: двуслойную оболочку, цитоплазму, нуклеоид. По форме
риккетсии могут быть палочковидными, нитевидными и кокковидными. Все
риккетсии внутриклеточные паразиты, т. е. могут развиваться только в клетках
живого организма. Они вызывают такие инфекционные заболевания, как сыпной
тиф и различные лихорадки. Переносчиками риккетсии являются членистоногие:
клещи, вши и блохи, в организме которых риккетсии размножаются.

Вирусы
Вирусы (см. рис. 53) - мельчайшие организмы неклеточного строения. Вирусная
частица носит название вирион. Размеры вирионов составляют от 15 до 400 нм.
Большинство вирусов можно увидеть только с помощью электронного микроскопа.
Оболочка вириона, капсид, состоит из молекул белка. Внутри находится
нуклеиновая кислота только одного типа - ДНК или РНК. По типу нуклеиновой
кислоты вирусы делятся на две группы - ДНК и РНК вирусы. Все вирусы являются
облигатными (обязательными) паразитами и в лабораториях культивируются в
куриных эмбрионах, организме животных или культуре тканей. Форма вирионов
разнообразна: сферическая, палочковидная, кубоидальная и сперматозоидная.
Размножение вирусов осуществляется путем раздельного синтеза оболочки и
нуклеиновой кислоты в клетке хозяина с последующей сборкой вирионов. Этот
процесс называется репродукцией. В организме хозяина некоторые вирусы
образуют внутриклеточные включения и элементарные тельца, которые видны в
обычном световом микроскопе, так как величины их составляют несколько
микрометров. Эти образования имеют диагностическое значение. Вирусы
вызывают заболевания бактерий, растений, животных. Важнейшими
инфекционными заболеваниями человека вирусной природы являются грипп, корь,
полиомиелит, гепатит и бешенство.

Среди вирусов выделяют группу фагов (от лат. phagos - пожирающий),

вызывающих лизис (разрушение) клеток микроорганизмов. Сохраняя присущие
вирусам свойства и состав, фаги отличаются структурой вириона (см. главу 8). Они
не вызывают заболеваний человека и животных.
 Контрольные вопросы

1. Расскажите о классификации микроорганизмов.

2. Назовите основные свойства представителей царства прокариотов.

3. Перечислите и охарактеризуйте основные формы бактерий.

4. Назовите основные органеллы клетки и их назначение.

5. Дайте краткую характеристику основных групп бактерий и вирусов.

Изучение морфологии микроорганизмов

Для изучения морфологии микроорганизмов применяют микроскопический
метод исследования. Важным условием успешного использования этого метода
является правильное приготовление мазка из исследуемого материала или
бактериальной культуры. Культурой называются микроорганизмы, выращенные на
питательных средах в лабораторных условиях.

Техника приготовления мазка

Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные

стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде,
споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем
тщательно промывают водой.

Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным

маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в
концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно
промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные
стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой
тканью.

Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем

равномерно, не распадаясь на мелкие капли.

Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные

объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают
пинцетом.

Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.

Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей,

иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю
(рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю
закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец
проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.
 Рис. 7. Игла и петли для посева. 1 - игла; бактериальные петли: 2, 3 - петли
приготовлены неправильно; 4 - петля приготовлена правильно

Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и

извлечении оттуда сохраняет водную пленку.

Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки

в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень.
Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.

Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной

среде. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и
охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри,
штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным
пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем
правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки.
Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в
пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и
затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки.
Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят
пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми
движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени
горелки. Мазок оставляют для высыхания.

Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с

двухкопеечную монету).

Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной

среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или
петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно
снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на
стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его
высыхании на предметном стекле остается слабый налет.
 Приготовление мазка из гноя или мокроты. Материал забирают стерильной
пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым
предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть
первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два
больших мазка.

Приготовление мазка из крови. Каплю крови наносят на предметное стекло на

расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного
стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая
отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно
приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.

Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов трупов и

пищевых продуктов твердой консистенции. Поверхность органа или пищевого
продукта прижигают раскаленным скальпелем и из этого участка вырезают кусочек
материала. Пинцетом осторожно захватывают этот кусочек и поверхностью среза
прикасаются к предметному стеклу в двух - трех местах, делая ряд мазков-
отпечатков.

Высушивание мазка

Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае

необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в
горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком
вверх.

Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение структуры

клеток.

Фиксация мазка

Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить

микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы
лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.

Способы фиксации. 1. Физический - в пламени горелки: стекло берут пинцетом

или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю
часть пламени горелки в течение 6 с.

2. Химический - в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и мазках-

отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их
обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом- 5 мин; б)
этиловым спиртом - 10 мин; в) смесью Никифорова - 10-15 мин; г) ацетоном - 5
мин; д) парами кислоты и формалина - несколько секунд.

Окраска препаратов

После фиксации приступают к окраске препарата.

Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом

линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с
дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных
резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты,
цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их
слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.

Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными

свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители.
Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.

Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной,

фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и
толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический);
коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).

Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из

них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы
используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при
окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат
предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят
краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.

Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь

препарат.

Рецепты красителей

1. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):

красителя - 1 г
спирта 96% - 10 мл

Смесь помещают в термостат до полного растворения на несколько дней.

Взбалтывают ежедневно. Хранят в склянках с притертыми пробками.

2. Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов,

спор и капсул):

насыщенного спиртового раствора

основного фуксина - 10 мл
раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл

Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот.

Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют и

сливают во флакон для хранения.

3. Фуксин Пфейффера (для окраски по Граму и для простого метода окраски):

Фуксина Циля - 1 мл
воды дистиллированной - 9 мл

Краситель готовят непосредственно перед применением.

 4. Карболовый генциановый фиолетовый (для окраски по Граму):

насыщенного спиртового раствора

генцианового фиолетового - 10 мл

карболовой кислоты 5% - 100 мл

Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

5. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал):

йодида калия - 2 г
кристаллического йода - 1 г
дистиллированной воды - 10 мл

Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на

сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды.

6. Щелочной раствор метиленового синего Леффлера:

насыщенного спиртового раствора

метиленового синего - 30 мл
раствора гидроксида калия 1% - 1 мл
дистиллированной воды - 100 мл

7. Бумажки по Синеву (для окраски по Граму):

1% спиртовой раствор кристаллического фиолетового

Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.

Методы окраски делят на ориентировочные (простые) и дифференциальные

(сложные), выявляющие химические и структурные особенности бактериальной
клетки.

Простой метод окраски

Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх.

Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени
краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают
фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель.
Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение
3-5 мин, фуксином Пфейффера - 1-2 мин (см. рис. 4).

На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и

микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Сложные методы окраски

Окраска по Граму (универсальный метод). Наиболее распространенным

методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.
 В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы -
грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль

РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем
(генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не
разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как

не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается,
клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином)
в красный цвет.

1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель

воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают
бумагу или сливают краситель.

2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем

краситель сливают.

3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с).

Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Окраска по Цилю - Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий). Этот метод

применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке
клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-,
щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки
первый этап окрашивания проводят при подогревании.

1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят

фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем
горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают
еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.

2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в

раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.

3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5

мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные - в синий

(см. рис. 4).
 Окраска по Ожешко (выявление спор). 1. На высушенный на воздухе мазок
наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и
подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над
пламенем.

2. Окрашивают по способу Циля - Нильсена. Кислотоустойчивые споры

окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка - в голубой цвет (см. рис.
4).

Окраска по Бурри - Гинсу (выявление капсулы). Этот метод назван

негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула
остается неокрашенной.

1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее

вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как
мазок крови, и высушивают.

2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно

промывают водой.

3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и

высушивают на воздухе.

Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить

препарат.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный,

клетки - красные, капсулы - неокрашенные (см. рис. 4).

Прижизненная окраска микроорганизмов

Для изучения живой культуры используют чаще всего метиленовый синий и

другие красители в больших разведениях (1:10000). Каплю исследуемого материала
смешивают на предметном стекле с каплей красителя и накрывают покровным
стеклом. Микроскопируют с помощью объектива 40×.

Изучение подвижности микроорганизмов

Для исследования используют культуру бактерий, выращенных в жидкой

питательной среде, или взвесь бактерий в изотоническом растворе натрия хлорида.

Метод раздавленной капли. На предметное стекло наносят пипеткой каплю

культуры и покрывают ее покровным стеклом. Чтобы не образовывалось пузырьков
воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для
предохранения препарата от высыхания его помещают во влажную камеру.

Влажная камера представляет собой чашку Петри, на дне которой находится

влажная фильтровальная бумага. На бумагу кладут две спички и на них помещают
препарат. Чашку закрывают крышкой.

Микроскопируют при увеличении объектива 40х в темном поле (см. главу 2).
 Метод висячей капли (рис. 8). Для приготовления препарата необходимы
стекло с лункой, покровное стекло и вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем
вазелина.

Рис. 8. Камера с висячей каплей

На покровное стекло наносят каплю культуры. Затем осторожно накрывают

покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре.
Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля
находится в герметической камере и сохраняется долгое время. При микроскопии
сначала при малом увеличении (8×) находят край капли, а затем проводят изучение
препарата при большом увеличении.

Контрольные вопросы
1. Как приготовить бактериальную петлю?

2. Назовите цели и способы фиксации мазков.

3. Назовите основные красители.

4. Какими методами изучают подвижность микроорганизмов?

Задание
1. Возьмите готовые препараты, изучите их и зарисуйте основные формы
микроорганизмов.

2. Приготовьте мазки из различного материала (культуры, гноя, крови, мазки-

отпечатки).

3. Окрасьте препараты сложными методами (по Граму, Цилю - Нильсену,

Ожешко, Бурри - Гинсу).
 Глава 4. Физиология микроорганизмов
Физиология изучает жизненные функции микроорганизмов: питание, дыхание,
рост и размножение. В основе физиологических функций лежит непрерывный
обмен веществ (метаболизм).

Сущность обмена веществ составляют два противоположных и вместе с тем

взаимосвязанных процесса: ассимиляция (анаболизм) и диссимиляция (катаболизм).

В процессе ассимиляции происходит усвоение питательных веществ и

использование их для синтеза клеточных структур. При процессах диссимиляции
питательные вещества разлагаются и окисляются, при этом выделяется энергия,
необходимая для жизни микробной клетки. В результате распада питательных
веществ происходит расщепление сложных органических соединений на более
простые, низкомолекулярные. Часть из них выводится из клетки, а другие снова
используются клеткой для биосинтетических реакций и включаются в процессы
ассимиляции. Все процессы синтеза и распада питательных веществ совершаются с
участием ферментов.

Особенностью микроорганизмов является интенсивный обмен веществ. За сутки

при благоприятных условиях одна микробная клетка может переработать такое
количество питательных веществ, которое в 30-40 раз больше ее массы.

Химический состав бактерий

Для понимания процессов обмена веществ необходимо знать химический состав
микроорганизмов. Микроорганизмы содержат те же химические вещества, что и
клетки всех живых организмов.

Важнейшими элементами являются органогены (углерод, водород, кислород,

азот), которые используются для построения сложных органических веществ:
белков, углеводов и липидов. Микроорганизмы содержат также зольные или
минеральные элементы. Большая часть их химически связана с органическими
веществами, остальные присутствуют в клетке в виде солей.

В количественном отношении самым значительным компонентом клетки

является вода, которая составляет 75-85%; на долю сухого вещества, которое
состоит из органических (белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды) и
минеральных соединений, приходится 15-25%.

Вода. Значение воды в жизнедеятельности клетки велико. Все вещества

поступают в клетку с водой, с ней же удаляются продукты обмена. Вода в
микробной клетке находится в свободном состоянии как самостоятельное
соединение, но большая часть ее связана с различными химическими компонентами
клетки (белками, углеводами, липидами) и входит в состав клеточных структур.

Свободная вода принимает участие в химических реакциях, протекающих в

клетке, является растворителем различных химических соединений, а также служит
дисперсной средой для коллоидов. Содержание свободной воды в клетке может
изменяться в зависимости от условий внешней среды, физиологического состояния
клетки, ее возраста. Так, у споровых форм бактерий значительно меньше воды, чем
у вегетативных клеток. Наибольшее количество воды отмечается у капсульных
бактерий.

Белки (50-80% сухого вещества) определяют важнейшие биологические

свойства микроорганизмов. Это простые белки - протеины и сложные - протеиды.
Большое значение в жизнедеятельности клетки имеют нуклеопротеиды -
соединение белка с нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК). Кроме
нуклеопротеидов, в микробной клетке содержатся в незначительных количествах
липопротеиды, гликопротеиды, хромопротеиды.

Белки распределены в цитоплазме, нуклеоиде, они входят в состав структуры

клеточной стенки. К белкам принадлежат ферменты, многие токсины (яды
микроорганизмов).

Видовая специфичность микроорганизмов зависит от количественного и

качественного состава белковых веществ.

Нуклеиновые кислоты в микробной клетке выполняют те же функции, что и в

клетках животного происхождения. ДНК содержится в ядре (нуклеоиде) и
обусловливает генетические свойства микроорганизмов. РНК принимает участие в
биосинтезе клеточных белков, содержится в ядре и цитоплазме. Общее количество
нуклеиновых кислот колеблется от 10 до 30% сухого вещества микробной клетки и
зависит от ее вида и возраста.

Углеводы (12-18% сухого вещества) используются микробной клеткой в

качестве источника энергии и углерода. Из них состоят многие структурные
компоненты клетки (клеточная оболочка, капсула и другие). Углеводы входят также
в состав тейхоевой кислоты, характерной для грамположительных бактерий.

Клетки микроорганизмов содержат простые (моно- и дисахариды) и

высокомолекулярные (полисахариды) углеводы. У ряда бактерий могут быть
включения, по химическому составу напоминающие гликоген и крахмал, они
играют роль запасных питательных веществ в клетке. Углеводный состав различен
у разных видов микроорганизмов и зависит от их возраста и условий развития.

Липиды (0,2-40% сухого вещества) являются необходимыми компонентами

цитоплазматической мембраны и клеточной стенки, они участвуют в
энергетическом обмене. В некоторых микробных клетках липиды выполняют роль
запасных веществ.

Липиды состоят в основном из нейтральных жиров, жирных кислот,

фосфолипидов. Общее количество их зависит от возраста и вида микроорганизма.
Например, у микобактерий туберкулеза количество липидов достигает 40%, что
обусловливает устойчивость этих бактерий к воздействию факторов внешней
среды.

В клетках микроорганизмов липиды могут быть связаны с углеводами и белками,

составляя сложный комплекс, определяющий токсические свойства
микроорганизмов.
 Минеральные вещества - фосфор, натрий, калий, магний, сера, железо, хлор и
другие - в среднем составляют 2-14% сухого вещества.

Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов, многих ферментов,

а также АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты), которая является аккумулятором
энергии в клетке. Натрий участвует в поддержании осмотического давления в
клетке. Железо содержится в дыхательных ферментах. Магний входит в состав
рибонуклеата магния, который локализован на поверхности грамположительных
бактерий.

Для развития микроорганизмов необходимы микроэлементы, содержащиеся в

клетке в очень малых количествах. К ним относят кобальт, марганец, медь, хром,
цинк, молибден и многие другие. Микроэлементы участвуют в синтезе некоторых
ферментов и активируют их. Соотношение отдельных химических элементов в
микробной клетке может колебаться в зависимости от вида микроорганизма,
состава питательной среды, характера обмена и условий существования во внешней
среде.

Питание бактерий
Всем микроорганизмам для осуществления процессов питания, дыхания,
размножения необходимы питательные вещества.

В качестве питательных веществ и источников энергии микроорганизмы

используют различные органические и неорганические соединения, для нормальной
жизнедеятельности им требуются также микроэлементы и факторы роста.

Процесс питания микроорганизмов имеет ряд особенностей: во-первых,

поступление питательных веществ происходит через всю поверхность клетки; во-
вторых, микробная клетка обладает исключительной быстротой метаболических
реакций; в-третьих, микроорганизмы способны довольно быстро адаптироваться к
изменяющимся условиям среды обитания. Разнообразие условий существования
микроорганизмов обусловливает различные типы питания.

Типы питания определяются по характеру усвоения углерода и азота.

Источником других органогенов - водорода и кислорода служит вода. Вода
необходима микроорганизмам и для растворения питательных веществ, так как они
могут проникать в клетку только в растворенном виде.

По усвоению углерода микроорганизмы делят на два типа: автотрофы и

гетеротрофы.

Автотрофы (от греч. autos - сам, trophe - питание) способны синтезировать

сложные органические вещества из простых неорганических соединений. Они
могут использовать в качестве источника углерода углекислоту и другие
неорганические соединения углерода. Автотрофами являются многие почвенные
бактерии (нитрифицирующие, серобактерии и др.).

Гетеротрофы (от греч. heteros - другой, trophe - питание) для своего роста и
развития нуждаются в готовых органических соединениях. Они могут усваивать
углерод из углеводов (чаще всего глюкозы), многоатомных спиртов, органических
кислот, аминокислот и других органических веществ.

Гетеротрофы представляют обширную группу микроорганизмов, среди которых

различают сапрофитов и паразитов.

Сапрофиты (от греч. sapros - гнилой, phyton - растение) получают готовые

органические соединения от отмерших организмов. Они играют важную роль в
разложении мертвых органических остатков, например бактерии гниения и др.

Паразиты (от греч. parasites - нахлебник) живут и размножаются за счет

органических веществ живой клетки растений, животных или человека. К таким
микроорганизмам относятся риккетсии, вирусы и некоторые простейшие (см. главу
11).

По способности усваивать азот микроорганизмы делятся также на две группы:

аминоавтотрофы и аминогетеротрофы. Аминоавтотрофы для синтеза белка клетки
используют молекулярный азот воздуха (клубеньковые бактерии, азотобактер) или
усваивают его из аммонийных солей. Аминогетеротрофы получают азот из
органических соединений - аминокислот, сложных белков. К ним относят все
патогенные микроорганизмы и большинство сапрофитов.

По источникам энергии среди микроорганизмов различают фототрофы,

использующие для биосинтетических реакций энергию солнечного света
(пурпурные серобактерии) и хемотрофы, которые получают энергию за счет
окисления неорганических веществ (нитрифицирующие бактерии и др.) и
органических соединений (большинство бактерий, в том числе и патогенные для
человека виды).

Однако резкой границы между типами питания микробов провести нельзя, так
как есть такие виды микроорганизмов, которые могут переходить от
гетеротрофного типа питания к автотрофному, и наоборот.

В настоящее время для характеристики типов питания введена новая

терминология: гетеротрофы называют органотрофами, а автотрофы - литотрофами
(от греч. litos - камень), так как подобные микроорганизмы способны расти в чисто
минеральной среде.

Факторы роста. Микроорганизмы для своего роста и размножения нуждаются в

особых веществах, которые сами синтезировать не могут и должны получать их в
готовом виде. Эти вещества называют факторами роста, и нужны они микробным
клеткам в небольших количествах. К ним относят различные витамины, некоторые
аминокислоты (необходимые для синтеза белка), пуриновые и пиримидиновые
основания (идущие на построение нуклеиновых кислот) и др. Многие факторы
роста входят в состав различных ферментов и играют роль катализаторов в
биохимических процессах.

Знание потребностей микроорганизмов в питательных веществах и факторах

роста очень важно, в частности, для создания питательных сред, применяемых для
их выращивания.
 Транспорт питательных веществ. Питательные вещества могут проникать в
цитоплазму микробных клеток только в виде небольших молекул и в растворенном
виде.

Сложные органические вещества (белки, полисахариды и др.) предварительно

подвергаются воздействию ферментов, выделяемых микробной клеткой, и после
этого становятся доступными для использования. Транспорт питательных веществ в
клетку и выход из нее продуктов метаболизма осуществляется в основном через
цитоплазматическую мембрану.

Питательные вещества проникают в клетку несколькими способами:

1. Пассивная диффузия, т. е. перемещение веществ через толщу мембраны, в

результате чего выравниваются концентрация веществ и осмотическое давление по
обе стороны оболочки. Таким путем могут проникать питательные вещества, когда
концентрация в среде значительно превышает концентрацию веществ в клетке.

2. Облегченная диффузия - проникновение питательных веществ в клетку с

помощью активного переноса их особыми молекулами-переносчиками,
называемыми пермеазами. Это вещества ферментной природы, которые
локализованы на цитоплазматической мембране и обладают специфичностью.
Каждая пермеаза адсорбирует соответствующее питательное вещество на наружной
стороне цитоплазматической мембраны, вступает с ним во временную связь и
диффундирует комплексно через мембрану, отдавая на внутренней стороне ее
транспортируемое вещество в цитоплазму. Этот процесс совершается без
использования энергии, так как перемещение веществ происходит от более высокой
концентрации к более низкой.

3. Активный транспорт питательных веществ осуществляется также с помощью

пермеаз, но этот процесс требует затраты энергии. В этом случае питательное
вещество может проникнуть в клетку, если концентрация его в клетке значительно
превышает концентрацию в среде.

4. В ряде случаев транспортируемое вещество может подвергаться химической

модификации, и такой способ переноса веществ получил название переноса
радикалов или транслокации химических групп. По механизму передачи
транспортируемого вещества этот процесс сходен с активным транспортом.

Выход веществ из микробной клетки осуществляется или в виде пассивной

диффузии, или в процессе облегченной диффузии с участием пермеаз.

Ферменты и их роль в обмене веществ

Ферменты - это вещества белковой природы, вырабатываемые живой клеткой.
Они являются биологическими катализаторами и играют важную роль в обмене
веществ микроорганизмов.

По химическому строению, свойствам и механизму действия ферменты

микробов сходны с ферментами, образующимися в клетках и тканях животных и
растений. Ферменты микробной клетки локализуются в основном в цитоплазме,
некоторые содержатся в ядре и клеточной оболочке. Микроорганизмы могут
синтезировать самые разнообразные ферменты, относящиеся к шести известным
классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы.

Характерным свойством ферментов является специфичность действия, т. е.

каждый фермент реагирует с определенным химическим соединением или
катализирует одну или несколько близких химических реакций. Например, фермент
лактаза расщепляет лактозу, мальтаза - мальтозу.

Активность ферментов зависит от температуры среды, рН и других факторов.

Для многих патогенных микроорганизмов оптимальное значение рН 7,2-7,4, а
оптимальная температура находится в пределах 37-50° С.

Ферменты микроорганизмов классифицируются на экзоферменты и

эндоферменты. Экзоферменты, выделяясь во внешнюю среду, расщепляют
макромолекулы питательных веществ до более простых соединений, которые могут
быть усвоены микробной клеткой. Так, к экзоферментам относят гидролазы,
вызывающие гидролиз белков, жиров, углеводов. В результате этих реакций белки
расщепляются на аминокислоты и пептоны, жиры - на жирные кислоты и глицерин,
углеводы (полисахариды)- на дисахариды и моносахариды. Распад белков
вызывают ферменты протеазы, жиров - липазы, углеводов - карбогидразы.
Эндоферменты участвуют в реакциях обмена веществ, происходящих внутри
клетки.

У микроорганизмов различают также конститутивные и индуктивные ферменты.

Конститутивные ферменты постоянно находятся в микробной клетке независимо от
условий существования. Это в основном ферменты клеточного обмена: протеазы,
липазы, карбогидразы и др. Индуктивные (адаптивные) ферменты синтезируются в
клетке только под влиянием соответствующего субстрата, находящегося в
питательной среде, и когда микроорганизм вынужден его усваивать. Например,
если бактерии, не вырабатывающие в обычных условиях фермента амилазы,
расщепляющей крахмал, засеять на питательную среду, где единственным
источником углерода служит крахмал, то они начинают синтезировать этот
фермент. Таким образом, индуктивные ферменты позволяют микробной клетке
приспособиться к изменившимся условиям существования.

Наряду с ферментами обмена многие патогенные бактерии вырабатывают также

ферменты агрессии, которые служат для преодоления естественных защитных
барьеров макроорганизма и являются факторами патогенности. К таким ферментам
относятся гиалуронидаза, дезоксирибонуклеаза, лецитовителлаза и др. Например,
гиалуронидаза расщепляет межклеточное вещество соединительной ткани
(гиалуроновую кислоту) и тем самым способствует распространению возбудителя в
макроорганизме.

Выделение микроорганизмами различных ферментов определяет их

биохимические свойства. Ферментный состав любого микроорганизма является
достаточно постоянным признаком, а различные виды микроорганизмов довольно
четко различаются по набору ферментов. Поэтому изучение ферментативного
состава имеет важное значение для дифференциации и идентификации различных
микроорганизмов.
 Практическое использование микробных ферментов. Издавна человек
использовал ферментативную активность дрожжей в пивоварении и виноделии.
Применение ферментов в пищевой промышленности позволяет значительно
интенсифицировать технологический процесс, повысить выход и улучшить
качество готовой продукции. Ферменты, выделенные из определенных видов
микроскопических грибов, используются в процессе изготовления пшеничного
теста, что позволяет увеличить объем, пористость выпеченного хлеба, улучшить его
свежесть, аромат, вкус. Ферментные препараты некоторых микроорганизмов
применяют для ускорения процессов выделения соков из плодов и ягод.

С целью получения высококачественных кормов для сельскохозяйственных

животных процессы микробного синтеза используются при силосовании зеленых
трав; благодаря ферментативной активности дрожжей, размножающихся на отходах
нефти (парафинах), получают белково-витаминные концентраты, которые являются
ценным питательным веществом - их добавляют к грубым кормам для животных.

Ферменты позволяют некоторым микроорганизмам усваивать метан, и эти виды

бактерий используют для борьбы с метаном в шахтах. Известно, что ферменты
бактерий (в частности, сенной палочки) широко применяются в качестве
биодобавок к стиральному порошку "Ока" и стиральной пасте "Био". Эти
препараты удаляют белковые загрязнения, так как ферменты расщепляют белки до
водорастворимых веществ, легко смываемых при стирке.

В медицинской промышленности с помощью ферментов микроорганизмов

получают витамины, гормоны, алкалоиды.

Дыхание бактерий
Дыхание (или биологическое окисление) микроорганизмов представляет собой
совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается
энергия, необходимая для жизнедеятельности микробных клеток.

Все физиологические процессы, такие как движение, рост и размножение,

образование спор и капсул, выработка токсинов, могут осуществляться при
постоянном притоке энергии. Микроорганизмы добывают энергию за счет
окисления различных химических соединений: углеводов (чаще глюкозы), спиртов,
органических кислот, жиров и т. д. Сущность окисления состоит в том, что
окисляемое вещество отдает электроны, а восстанавливаемое получает их.

По типу дыхания все микроорганизмы разделяются на облигатные (строгие)

аэробы, облигатные анаэробы и факультативные (необязательные) анаэробы.

Облигатные аэробы (микобактерии туберкулеза и др.) живут и развиваются при

свободном доступе кислорода, т. е. реакции окисления осуществляются у них при
участии молекулярного кислорода с высвобождением большого количества
энергии. Примером может служить окисление глюкозы в аэробных условиях:

С6Н12О6 + 6О2 → 6СО2 + 6Н2О + 2882,6 кД (688,5 ккал)

Существуют и микроаэрофилы, которые нуждаются в малых количествах

кислорода (некоторые лептоспиры, бруцеллы).
 Облигатные анаэробы (клостридии столбняка, ботулизма и др.) способны жить и
размножаться только в отсутствие свободного кислорода воздуха. Дыхание у
анаэробов происходит путем ферментации субстрата с образованием небольшого
количества энергии. Так, при анаэробном разложении 1 моль глюкозы энергии
выделяется значительно меньше, чем при аэробном дыхании:

С6Н12О6 → 2С2Н5ОН + 2СО2 + 130,6 кД (31,2 ккал)

Наличие свободного кислорода для облигатных анаэробов является

губительным. Это связано с тем, что в присутствии кислорода конечным продуктом
окисления органических соединений оказывается перекись водорода. А поскольку
анаэробы не обладают способностью продуцировать фермент каталазу,
расщепляющую перекись водорода, то она накапливается и оказывает токсическое
действие на бактерии.

Факультативные анаэробы могут размножаться как при наличии молекулярного

кислорода, так и при отсутствии его. К ним относят большинство патогенных и
сапрофитных бактерий.

Процессы разложения органических веществ в бескислородных условиях,

сопровождающиеся выделением энергии, называют также брожением. В
зависимости от участия определенных микроорганизмов и конечных продуктов
расщепления углеводов различают несколько типов брожения: спиртовое,
осуществляемое дрожжами; молочно-кислое, вызываемое молочно-кислыми
бактериями; масляно-кислое, обусловленное масляно-кислыми бактериями и др.

Выделение тепла при дыхании микроорганизмов можно наблюдать при

выращивании культур в сосудах, защищенных от потери тепла, - температура
питательной среды будет постепенно повышаться. С выделением избыточного
тепла при дыхании некоторых микроорганизмов связаны процессы самовозгорания
торфа, навоза, влажного сена и хлопка.

Биохимические механизмы дыхания более подробно изложены в учебниках

биологической химии.

Пигменты микроорганизмов
Некоторые микроорганизмы (бактерии, грибы) в процессе обмена веществ
образуют красящие вещества - пигменты. По химическому составу и свойствам
пигменты неоднородны. Они подразделяются на растворимые в воде (синий
пигмент - пиоцианин, выделяемый синегнойной палочкой); растворимые в спирте и
нерастворимые в воде (красный пигмент - продигиозан, выделяемый чудесной
палочкой); нерастворимые ни в воде, ни в спирте (черные и бурые пигменты
дрожжей и плесеней).

Нерастворимые в воде пигменты (липохромы) обычно окрашивают колонии

бактерий (например, желтый, золотистый, палевый пигменты стафилококков), а
растворимые - окрашивают питательную среду (синегнойная палочка).

Образование пигментов у микробных клеток происходит на свету при

достаточном доступе кислорода и определенном составе питательной среды.
 Пигментообразование в ряде случаев является стойким признаком
микроорганизмов, что позволяет использовать его в качестве теста для
идентификации некоторых бактерий (например, стафилококки, синегнойная
палочка).

Пигментообразование у микроорганизмов имеет определенное физиологическое

значение. Пигменты защищают микробную клетку от природной ультрафиолетовой
радиации, принимают участие в процессах дыхания, некоторые обладают
антибиотическим действием (продигиозан).

Особый интерес представляет история чудесной палочки Serratia marcescens,

которая образует на хлебе, картофеле и других продуктах, содержащих крахмал,
красные колонии, похожие на капли свежей крови. Древнеримский историк Квинт
Курций Руф в своей книге "История Александра Македонского" описал одну из его
побед при покорении Малой Азии, связанную с этим удивительным микробом. В
332 г. до н. э. при осаде города Тироса в армии Александра Македонского
произошло неприятное событие - в хлебе появились большие красные пятна,
напоминающие пятна крови, и солдат охватил страх. Они посчитали это плохим
предзнаменованием. Однако хитрый придворный мудрец Александра истолковал
это "знамение" так: "Кровавые пятна действительно знак богов, но поскольку они
находятся внутри запеченного хлеба, то это означает гибель войск, находящихся
внутри осажденных стен города. Боги указывают на свою благосклонность войскам
Александра и дают понять, что его победа обеспечена". Толкование мудреца так
подняло дух армии, что солдаты с воодушевлением атаковали стены города и в
скором времени захватили его.

Появление подобных красных пятен на продуктах во времена религиозных

предрассудков и мракобесия средневековья широко использовалось церковниками
для пропаганды "кары божьей" за неверие и служило основанием для жестокой
расправы с вольнодумцами.

Светящиеся и ароматообразующие микроорганизмы

Среди микроорганизмов (бактерий, грибов) встречаются такие, которые
обладают способностью светиться (люминесцировать). Свечение бактерий
возникает в результате интенсивных процессов окисления,^сопровождающихся
выделением энергии. Свечение морской воды, чешуи рыб, тела мелких
ракообразных, сгнившего дерева объясняется присутствием на них светящихся
бактерий или фотобактерий.

Все светящиеся бактерии относятся к аэробам. Большая часть их видов обитает в

морской воде, так как они лучше размножаются при повышенной концентрации
соли (галофильные микробы). Могут светиться пауки, муравьи, термиты, живущие
в симбиозе с фотобактериями. Светящиеся бактерии излучают зеленый или
голубоватый свет, хорошо заметный в темноте. Ночью светятся и грибы, например
осенние опенки.

Светящиеся бактерии не вызывают процессов гниения, для большинства видов

оптимальная температура жизнедеятельности - 15-18° С. Они хорошо растут на
рыбных и мясных субстратах, что и обусловливает свечение мяса, рыбы.
 В начале XX века пытались использовать светящиеся бактерии в практических
целях, их предлагали применять для "безопасных ламп" в пороховых погребах.

Выявлены микроорганизмы, способные вырабатывать ароматические вещества,

например уксусно-этиловый, уксусно-амиловый эфиры. Запахи некоторых
микробов определяют ароматические свойства вин, молока, масла, сливок, сыров и
т. д. Ароматообразующие бактерии широко используют при приготовлении
различных пищевых продуктов.

Некоторые микроорганизмы в процессе жизнедеятельности образуют вещества с

неприятным запахом (индол, скатол, сероводород), что связано с разложением
органических веществ.

Рост и размножение бактерий

Одним из важнейших проявлений жизнедеятельности микроорганизмов
являются рост и размножение их.

Рост определяется как увеличение размеров отдельной особи и упорядочное

воспроизведение всех клеточных компонентов и структур.

Под размножением понимают способность микроорганизмов к

самовоспроизведению, в результате чего увеличивается число особей в популяции.
Основной способ размножения у бактерий поперечное деление. Перед делением у
бактериальных клеток, достигших определенного возраста, происходит удвоение
молекул ДНК. Каждая дочерняя клетка получает копию материнской ДНК. Процесс
деления считается законченным, когда цитоплазма дочерних клеток разделена
перегородкой (рис. 9).

Рис. 9. Ультратонкий срез делящейся клетки Е. coli

В образовании перегородки принимает участие цитоплазматическая мембрана и

клеточная стенка. Если перегородка формируется в середине делящейся клетки, то
появляются дочерние клетки одинаковой величины (изоморфное деление). Иногда
перегородка образуется ближе к одному из концов, тогда дочерние клетки имеют
неодинаковый размер (гетероморфное деление).

Деление бактерий (кокков) может происходить в различных плоскостях с

образованием многообразных сочетаний клеток: цепочки стрептококков, парные
соединения (диплококки), тетрады кокков, тюки (сарцина), гроздья (стафилококки).
Палочковидные и извитые формы делятся поперечно и только в одной плоскости.

У некоторых бактерий размножение происходит путем образования почки

(микобактерии туберкулеза, клубеньковые бактерии), которая по величине меньше
исходной клетки.

Скорость размножения бактерий велика, что обусловлено интенсивностью их

обмена. У большинства бактерий каждая клетка делится в течение 15-30 мин.
Подсчитано, что за 24 ч у бактерий сменяется столько поколении, сколько у
человека за 5000 лет. Есть виды бактерий, которые делятся медленно, 1 раз в сутки,
например микобактерии туберкулеза.

Для каждого вида бактерий скорость размножения может быть различной и

зависит от возраста культуры, питательной среды, температуры, значения рН и
многих других факторов.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде обладает рядом

особенностей и происходит в несколько последовательных фаз (рис. 10).

Рис. 10. Фазы размножения бактерий. аb - исходная стационарная; bd - фаза

логарифмического роста; de - стационарная фаза; eg - стадия отмирания

Фаза 1 - исходная стационарная (латентная): микробные клетки адаптируются к

питательной среде, при этом повышается интенсивность обменных процессов,
увеличивается размер клеток. Бактерии начинают размножаться лишь к концу
первой фазы.

Фаза 2 - логарифмического роста: бактерии энергично размножаются, вследствие

чего количество клеток возрастает в геометрической прогрессии. В этой фазе
бактерии обладают наибольшей биохимической и биологической активностью.

Фаза 3 - стационарная: концентрация бактериальных клеток в среде остается

постоянной. Это обусловлено тем, что число вновь появившихся бактерий почти
равно числу отмирающих клеток. Длительность этой фазы у разных бактерий
различна.
 Фаза 4 - отмирания: жизнеспособных клеток бактерий становится все меньше, и
постепенно они погибают. Причинами гибели клеток могут быть истощение
питательной среды, накопление в ней вредных продуктов обмена. В этой фазе у
бактерий могут изменяться морфологические, биохимические и другие свойства.
Фаза отмирания у различных видов бактерий неодинакова. Полная гибель культуры
может наступить через несколько дней, недель или месяцев.

Увеличение количества размножившихся в жидких питательных средах бактерий

можно наблюдать через 18-24 ч - появляется либо помутнение среды, либо
образование пленки или осадка. При этом характер изменения среды зависит как от
вида и возраста бактериальной культуры, так и от состава самой питательной
среды.

При размножении на плотных питательных средах бактерии образуют на

поверхности среды и внутри нее типичные для каждого микробного вида колонии.
Каждая колония - это популяция микроорганизмов, развившаяся из одной клетки
определенного вида бактерии. Колонии бактерий различаются по размеру, форме,
строению, консистенции и цвету. Внешний вид колоний у некоторых бактерий
настолько характерен, что может служить дифференциальным признаком для
идентификации микроорганизмов. Например, колонии возбудителя сибирской язвы
можно сравнить с локонами или львиной гривой (см. рис. 47).

Спирохеты и риккетсии размножаются также поперечным делением. Процесс

размножения (репродукция) вирусов (см. "Вирусы").

Контрольные вопросы
1. Каков химический состав микробной клетки?

2. Какие типы питания различают у микроорганизмов?

3. Как осуществляется транспорт питательных веществ в микробную клетку?

4. Как различаются микроорганизмы по типу дыхания?

5. Какими способами осуществляется размножение бактерий?

Глава 5. Влияние факторов окружающей среды на

микроорганизмы - Н. А. Бельская
Жизнь микроорганизмов находится в тесной зависимости от условий
окружающей среды. Все факторы окружающей среды, оказывающие влияние на
микроорганизмы, можно разделить на три группы: физические, химические и
биологические, благоприятное или губительное действие которых зависит как от
природы самого фактора, так и от свойств микроорганизма.

Физические факторы
Из физических факторов наибольшее влияние на развитие микроорганизмов
оказывают температура, высушивание, лучистая энергия, ультразвук.
 Температура. Жизнедеятельность каждого микроорганизма ограничена
определенными температурными границами. Эту температурную зависимость
обычно выражают тремя основными точками: минимум - температура, ниже
которой размножение микробных клеток прекращается; оптимум - наилучшая
температура для роста и развития микроорганизмов; максимум - температура, выше
которой жизнедеятельность клеток ослабляется или прекращается. Оптимальная
температура обычно соответствует температурным условиям естественной среды
обитания.

Все микроорганизмы по отношению к температуре подразделяются на

психрофилы, мезофилы и термофилы.

Психрофилы (от греч. psychros - холодный, phileo - люблю), или холодолюбивые

микроорганизмы, растут при относительно низких температурах: минимальная
температура - 0° С, оптимальная - 10-20° С, максимальная - 30° С. Эта группа
включает микроорганизмы, обитающие в северных морях и океанах, почве,
сточных водах. Сюда же относятся светящиеся и железобактерии, а также микробы,
вызывающие порчу продуктов на холоду (ниже 0° С).

Мезофилы (от греч. mesos - средний) - наиболее обширная группа, включающая

большинство сапрофитов и все патогенные микроорганизмы. Оптимальная
температура для них 28-37° С, минимальная - 10° С, максимальная - 45° С.

Термофилы (от греч. termos - тепло, жар), или теплолюбивые микроорганизмы,

развиваются при температуре выше 55° С, температурный минимум для них 30° С,
оптимум - 50-60° С, а максимум - 70-75° С. Они встречаются в горячих
минеральных источниках, поверхностном слое почвы, самонагревающихся
субстратах (навозе, сене, зерне), кишечнике человека и животных. Среди
термофилов много споровых форм.

Высокие и низкие температуры оказывают различное влияние на

микроорганизмы. Одни более чувствительны к высоким температурам. Причем,
чем выше температура за пределами максимума, тем быстрее наступает гибель
микробных клеток, что обусловлено денатурацией (свертыванием) белков клетки.

Вегетативные формы бактерий мезофилов погибают при температуре 60° С в

течение 30-60 мин, а при 80-100° С - через 1-2 мин. Споры бактерий гораздо
устойчивее к высоким температурам. Например, споры бацилл сибирской язвы
выдерживают кипячение в течение 10-20 мин, а споры клостридий ботулизма - 6 ч.
Все микроорганизмы, включая споры, погибают при температуре 165-170° С в
течение часа (в сухожаровом шкафу) или при действии пара под давлением 1 атм (в
автоклаве) в течение 30 мин.

Действие высоких температур на микроорганизмы положено в основу

стерилизации - полного освобождения разнообразных объектов от
микроорганизмов и их спор (см. ниже).

К действию низких температур многие микроорганизмы чрезвычайно устойчивы.

Сальмонеллы тифа и холерный вибрион длительно выживают во льду. Некоторые
микроорганизмы остаются жизнеспособными при температуре жидкого воздуха (-
190° С), а споры бактерий выдерживают температуру до -250° С.
 Только отдельные виды патогенных бактерий чувствительны к низким
температурам (например, бордетеллы коклюша и паракоклюша, нейссерии
менингококка и др.). Эти свойства микроорганизмов учитывают в лабораторной
диагностике и при транспортировке исследуемого материала - его доставляют в
лабораторию защищенным от охлаждения.

Действие низких температур приостанавливает гнилостные и бродильные

процессы, Что широко применяется для сохранения пищевых продуктов в
холодильных установках, погребах, ледниках. При температуре ниже 0° С микробы
впадают в состояние анабиоза - наступает замедление процессов обмена веществ и
прекращается размножение. Однако при наличии соответствующих температурных
условий и питательной среды жизненные функции микробных клеток
восстанавливаются. Это свойство микроорганизмов используется в лабораторной
практике для сохранения культур микробов при низких температурах. Губительное
действие на микроорганизмы оказывает также быстрая смена высоких и низких
температур (замораживание и оттаивание) - это приводит к разрыву клеточных
оболочек.

Высушивание. Для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов

необходима вода. Высушивание приводит к обезвоживанию цитоплазмы,
нарушению целостности цитоплазматической мембраны, вследствие чего
нарушается питание микробных клеток и наступает их гибель.

Сроки отмирания разных видов микроорганизмов под влиянием высушивания

значительно отличаются. Так, например, патогенные нейссерии (менингококки,
гонококки), лептоспиры, бледная трепонема и другие погибают при высушивании
через несколько минут. Холерный вибрион выдерживает высушивание 2 сут,
сальмонеллы тифа - 70 сут, а микобактерии туберкулеза - 90 сут. Но высохшая
мокрота больных туберкулезом, в которой возбудители защищены сухим белковым
чехлом, остается заразной 10 мес.

Особой устойчивостью к высушиванию, как и к другим воздействиям

окружающей среды, обладают споры. Споры бацилл сибирской язвы сохраняют
способность к прорастанию в течение 10 лет, а споры плесневых грибов - до 20 лет.

Неблагоприятное действие высушивания на микроорганизмы издавна

используется для консервирования овощей, фруктов, мяса, рыбы и лекарственных
трав. В то же время, попав в условия повышенной влажности, такие продукты
быстро портятся из-за восстановления жизнедеятельности микробов.

Для хранения культур микроорганизмов, вакцин и других биологических

препаратов широко применяют метод лиофильной сушки. Сущность метода
состоит в том, что предварительно микроорганизмы или препараты подвергают
замораживанию, а затем их высушивают в условиях вакуума. При этом микробные
клетки переходят в состояние анабиоза и сохраняют свои биологические свойства в
течение нескольких месяцев или лет.

Лучистая энергия. В природе микроорганизмы постоянно подвергаются

воздействию солнечной радиации. Прямые солнечные лучи вызывают гибель
многих микроорганизмов в течение нескольких часов, за исключением
фотосинтезирующих бактерий (зеленых и пурпурных серобактерий). Губительное
действие солнечного света обусловлено активностью ультрафиолетовых лучей
(УФ-лучи). Они инактивируют ферменты клетки и повреждают ДНК. Патогенные
бактерии более чувствительны к действию УФ-лучей, чем сапрофиты. Поэтому
хранить микробные культуры в лаборатории лучше в темноте. В этом отношении
демонстративен опыт Бухнера.

В чашку Петри с тонким слоем агара производят обильный посев какой-либо

культуры бактерий. На наружную поверхность засеянной чашки наклеивают
вырезанные из черной бумаги буквы, образующие, например, слово "typhus".
Чашку, обращенную дном вверх, подвергают облучению прямыми солнечными
лучами в течение 1 ч. Затем бумажки снимают, и чашку ставят на сутки в термостат
при 37° С. Рост бактерий наблюдается лишь в тех местах агара, которые были
защищены от действия УФ-лучей наклеенными буквами. Остальная часть агара
остается прозрачной, т. е. рост микроорганизмов отсутствует (рис. 11).

Рис. 11. Действие света на бактерии

Велико значение солнечного света как естественного фактора оздоровления

внешней среды. Он освобождает от патогенных бактерий воздух, воду
"естественных водоемов, верхние слои почвы.

Бактерицидное (уничтожающее бактерий) действие УФ-лучей используется для

стерилизации воздуха закрытых помещений (операционных, перевязочных, боксов
и т. д.), а также воды и молока. Источником этих лучей являются лампы
ультрафиолетового излучения, бактерицидные лампы.

Другие виды лучистой энергии - рентгеновские лучи, α-, β-, γ-лучи оказывают
губительное действие на микроорганизмы только в больших дозах, порядка 440-280
Дж/кг. Гибель микробов обусловлена разрушением ядерных структур и клеточной
ДНК. Малые дозы излучений стимулируют рост микробных клеток.
Микроорганизмы значительно устойчивее к радиоактивным излучениям, чем
высшие организмы. Известны тионовые бактерии, обитающие в залежах урановых
руд. Бактерии обнаруживали в воде атомных реакторов при концентрации
ионизирующей радиации 20-30 кДж/кг.
 Бактерицидное действие ионизирующего излучения используется для
консервирования некоторых пищевых продуктов, стерилизации биологических
препаратов (сывороток, вакцин и др.), при этом свойства стерилизуемого материала
не изменяются.

В последние годы радиационным методом стерилизуют изделия для

одноразового использования - полистироловые пипетки, чашки Петри, лунки для
серологических реакций, шприцы, а также шовный материал - кетгут и др.

Ультразвук вызывает значительное поражение микробной клетки. Под

действием ультразвука газы, находящиеся в жидкой среде цитоплазмы,
активируются, и внутри клетки возникает высокое давление (до 10000. атм). Это
приводит к разрыву клеточной оболочки и гибели клетки. Ультразвук используют
для стерилизации пищевых продуктов (молока, фруктовых соков), питьевой воды.

Высокое давление. К механическому давлению бактерии и особенно их споры

устойчивы. В природе встречаются бактерии, живущие в морях и океанах на
глубине 1000-10000 м под давлением от 100 до 900 атм. Некоторые виды бактерий
выдерживают давление до 3000-5000 атм, а бактериальные споры - даже 20000 атм.

Химические факторы
Влияние химических веществ на микроорганизмы различно в зависимости от
природы химического соединения, его концентрации, продолжительности
воздействия на микробные клетки. В зависимости от концентрации химическое
вещество может быть источником питания или оказывать угнетающее действие на
жизнедеятельность микроорганизмов. Например, 0,5-2% раствор глюкозы
стимулирует рост микробов, а 20-40% растворы глюкозы задерживают
размножение микробных клеток.

Многие химические соединения, оказывающие губительное действие на

микроорганизмы, используются в медицинской практике в качестве
дезинфицирующих веществ и антисептиков.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, называют

дезинфицирующими. Под дезинфекцией понимают мероприятия, направленные на
уничтожение патогенных микроорганизмов в различных объектах окружающей
среды. К дезинфицирующим веществам относят галлоидные соединения, фенолы и
их производные, соли тяжелых металлов, некоторые кислоты, щелочи, спирты и др.
Они вызывают гибель микробных клеток, действуя в оптимальных концентрациях,
в течение определенного времени. Многие дезинфицирующие вещества оказывают
вредное воздействие на ткани макроорганизма.

Антисептиками называют химические вещества, которые могут вызывать гибель

микроорганизмов или задерживать их рост и размножение. Их используют с
лечебной целью (химиотерапия), а также для обеззараживания ран, кожи,
слизистых оболочек человека. Антисептическими свойствами обладают перекись
водорода, спиртовые растворы йода, бриллиантового зеленого, растворы
перманганата калия и др. Некоторые антисептические вещества (уксусная,
сернистая, бензойная кислоты и др.) в дозах, безвредных для человека, применяют
для консервирования пищевых продуктов.
 По механизму действия химические вещества, обладающие противомикробной
активностью, можно подразделить на несколько групп.

1. Поверхностно-активные вещества (жирные кислоты, мыла и прочие

детергенты) вызывают снижение поверхностного натяжения, что приводит к
нарушению функционирования клеточной стенки и цитоплазматической мембраны
микроорганизмов.

2. Фенол, крезол и их производные вызывают коагуляцию микробных белков.

Они используются для дезинфекции заразного материала в микробиологической
практике и инфекционных больницах.

3. Окислители, взаимодействуя с микробными белками, нарушают деятельность

ферментов, вызывают денатурацию белков. Активными окислителями являются
хлор, озон, которые используют для обеззараживания питьевой воды.
Хлорпроизводные вещества (хлорная известь, хлорамин) широко употребляют в
целях дезинфекции. Окисляющими свойствами обладают перекись водорода,
перманганат калия, йод и др.

4. Формальдегид применяют в виде 40% раствора (формалин) для дезинфекции.

Он убивает вегетативные и споровые формы микроорганизмов. Формалин
блокирует аминогруппы белков микробной клетки и вызывает их денатурацию.

5. Соли тяжелых металлов (ртуть, свинец, цинк, золото и др.) коагулируют белки
микробной клетки, вызывая этим их гибель. Ряд металлов (серебро, золото, ртуть и
др.) оказывают бактерицидное действие на микроорганизмы в ничтожно малых
концентрациях. Это свойство получило название олигодинамического действия (от
лат. oligos - малый, dinamys - сила). Доказано, что вода, находящаяся в сосудах из
серебра, не загнивает, благодаря бактерицидному действию ионов серебра. Для
профилактики бленнореи*новорожденных долгое время применяли 1% раствор
нитрата серебра. Коллоидные растворы органических соединений серебра
(протаргол, колларгол) используют также в виде местных антисептических средств.
*
(Бленнорея - воспаление конъюнктивы глаза, вызванное гонококками.)

Сильным антимикробным действием обладают препараты ртути. Издавна для

дезинфекции применяли бихлорид ртути, или сулему (в разведении 1:1000). Однако
она оказывает токсическое действие на ткани макроорганизма и использование ее
ограничено.

6. Красители (бриллиантовый зеленый, риванол и др.) обладают свойством

задерживать рост бактерий. Растворы ряда красителей применяют в качестве
антисептических средств, а также вводят в состав некоторых питательных сред для
угнетения роста сопутствующей микрофлоры.

Губительное действие ряда физических и химических факторов на

микроорганизмы составляет основу асептического и антисептического методов,
широко используемых в медицинской и санитарной практике.
 Асептика - система профилактических мероприятий, препятствующих
микробному загрязнению объекта (раны, операционного поля, культур
микроорганизмов и т. д.), основанная на физических методах.

Антисептика - комплекс мер, направленных на уничтожение микроорганизмов в

ране, целом организме или на объектах внешней среды, с применением различных
обеззараживающих химических веществ.

Биологические факторы
В естественных условиях обитания микроорганизмы существуют не
изолированно, а находятся в сложных взаимоотношениях, которые сводятся в
основном к симбиозу, метабиозу и антагонизму.

Симбиоз - это сожительство организмов различных видов, приносящих им

взаимную пользу. При этом совместно они развиваются лучше, чем каждый из них
в отдельности.

Симбиотические взаимоотношения существуют между клубеньковыми

бактериями и бобовыми растениями, между мицелиальными грибами и сине-
зелеными водорослями (лишайниками): Симбиоз молочно-кислых бактерий и
спиртовых дрожжей используют для приготовления некоторых молочно-кислых
продуктов (кефир, кумыс).

Метабиоз - такой вид взаимоотношений, при котором продукты обмена одного

вида микроорганизмов создают необходимые условия для развития других.
Например, гнилостные микроорганизмы, расщепляющие белковые вещества,
способствуют накоплению в среде аммонийных соединений и создают
благоприятные условия для роста и развития нитрифицирующих бактерий. А
развитие анаэробов в хорошо аэрируемой почве было бы невозможно без аэробов,
поглощающих свободный кислород.

Метабиотические взаимоотношения широко распространены среди почвенных

микроорганизмов и лежат в основе круговорота веществ в природе.

Антагонизм - форма взаимоотношений, при которой один микроорганизм

угнетает развитие другого или может вызвать его полную гибель.
Антагонистические взаимоотношения выработались у микроорганизмов в борьбе за
существование. Повсюду, где они обитают, между ними идет непрерывная борьба
за источники питания, кислород воздуха, среду обитания. Так, большинство
патогенных бактерий, попав с выделениями больных во внешнюю среду (почву,
воду), не выдерживают здесь длительной конкуренции с многочисленными
сапрофитами и сравнительно быстро погибают.

Антагонизм может быть обусловлен прямым воздействием микроорганизмов

друг на друга или действием продуктов их обмена. Например, простейшие
пожирают бактерий, а фаги лизируют их. Кишечник новорожденных заселяют
молочно-кислые бактерии Bifidobacterium bifidum. Выделяя молочную кислоту, они
подавляют рост гнилостных бактерий и этим защищают от кишечных Расстройств
еще малоустойчивый организм грудных детей. Некоторые микроорганизмы в
процессе жизнедеятельности вырабатывают различные вещества, оказывающие
губительное действие на бактерии и другие микробы. К таким веществам относят
антибиотики (см. "Антибиотики").

Контрольные вопросы
1. Какие физические факторы оказывают влияние на жизнедеятельность
микроорганизмов?

2. Какие вещества относит к дезинфицирующим и как они различаются по

механизму воздействия на микроорганизмы?

3. Перечислите, какие взаимоотношения существуют между микроорганизмами?

Стерилизация
Стерилизация - это обеспложивание, т. е. полное освобождение объектов
окружающей среды от микроорганизмов и их спор.

Стерилизацию производят различными способами:

1) физическими (воздействие высокой температуры, УФ-лучей, использование

бактериальных фильтров);

2) химическими (использование различных дезинфектантов, антисептиков);

3) биологическим (применение антибиотиков).

В лабораторной практике обычно применяют физические способы стерилизации.

Возможность и целесообразность использования того или иного способа

стерилизации обусловлена особенностями материала, подлежащего стерилизации,
его физическими и химическими свойствами.

Физические способы

Прокаливание в пламени горелки или фламбирование - способ стерилизации, при

котором происходит полное обеспложивание объекта, так как погибают и
вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Обычно прокаливают
бактериологические петли, шпатели, пипетки, предметные и покровные стекла,
мелкие инструменты. Не следует стерилизовать прокаливанием ножницы,
скальпели, так как под действием огня режущая поверхность становится тупой.

Сухожаровая стерилизация

Стерилизацию сухим жаром или горячим воздухом осуществляют в печах

Пастера (сушильных сухожаровых шкафах). Печь Пастера - шкаф с двойными
стенками, изготовленный из термостойких материалов - металла и асбеста.
Нагревают шкаф с помощью газовых горелок или электронагревательных
приборов. Шкафы с электрическим нагревом снабжены регуляторами,
обеспечивающими необходимую температуру. Для контроля температуры имеется
термометр, вставленный в отверстие верхней стенки шкафа.
 Сухим жаром стерилизуют в основном лабораторную Посуду. Подготовленную
для стерилизации посуду неплотно загружают в печь, чтобы обеспечить
равномерный и надежный прогрев стерилизуемого материала. Дверь шкафа плотно
закрывают, включают обогревательный прибор, доводят температуру до 160-165° С
и при этой температуре стерилизуют 1 ч. По окончании стерилизации выключают
обогрев, но дверцу шкафа не открывают до тех пор, пока печь не остынет; в
противном случае холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать
образование трещин на горячей посуде.

Стерилизацию в печи Пастера можно проводить при различном температурном

режиме и экспозиции (время стерилизации) (табл. 1).

Таблица 1. Режим стерилизации

Жидкости (питательные среды, изотонический раствор хлорида натрия и др.),

предметы из резины и синтетических материалов стерилизовать сухим жаром
нельзя, так как жидкости вскипают и выливаются, а резина и синтетические
материалы плавятся.

Для контроля стерилизации в печи Пастера шелковые нити смачивают в культуре

спорообразующих бактерий, подсушивают, помещают в стерильную чашку Петри и
ставят в печь Пастера. Стерилизацию проводят при температуре 165° С 1 ч (для
контроля часть нитей оставляют при комнатной температуре). Затем
простерилизованные и контрольные нити кладут на поверхность агара в чашку
Петри или помещают в пробирки с бульоном и инкубируют в термостате при
температуре 37° С в течение 2 сут. При правильной работе печи Пастера в
пробирках или чашках с питательными средами, куда были помещены
простерилизованные нити, роста не будет, так как споры бактерий погибнут, в то
время как споры бактерий на нитях, не подвергавшихся стерилизации
(контрольные), прорастут и на питательных средах будет отмечен рост.

Для определения температуры внутри печи Пастера можно использовать

сахарозу или пищевой сахарный песок, карамелизующиеся при температуре 165-
170° С.

Подготовка лабораторной посуды к стерилизации в печи Пастера.

Лабораторную посуду (чашки Петри, пипетки градуированные и пастеровские,
флаконы, колбы, пробирки) перед стерилизацией необходимо тщательно вымыть,
высушить и завернуть в бумагу, иначе после стерилизации она может снова
загрязниться бактериями воздуха.

Чашки Петри завертывают в бумагу по одной или несколько штук либо

укладывают в специальные металлические пеналы.

В верхние концы пипеток вставляют ватные тампоны, предупреждающие

попадание исследуемого материала в рот. Градуированные пипетки заворачивают в
длинные полоски бумаги шириной 4-5 см. На бумаге отмечают объем завернутой
пипетки. В пеналах градуированные пипетки стерилизуют без дополнительного
завертывания в бумагу.

Примечание. Если градуировка на пипетках плохо заметна, ее восстанавливают

перед стерилизацией. На пипетку наносят масляную краску и, не дав краске
высохнуть, в нее втирают с помощью тряпочки порошок бария сульфата. После
этого тряпкой снимают избыток краски, которая остается только в насечках
градуировки. Обработанные таким образом пипетки следует сполоснуть.

Острые концы пастеровских пипеток запаивают в пламени горелки и

заворачивают в бумагу по 3-5 штук. Заворачивать пастеровские пипетки нужно
осторожно, чтобы не обломать запаянные концы капилляров.

Флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробка

должна входить в горлышко сосуда на 2/3 своей длины, не слишком туго, но и не
свободно. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный
колпачок. Пробирки связывают по 5-50 штук и обертывают поверх бумагой.

Примечание. При высоких температурах бумага, в которую завертывают чашки и

пипетки, и вата желтеют и даже могут обугливаться, поэтому каждый новый сорт
бумаги, получаемый лабораторией, следует испытывать при принятом
температурном режиме.

Контрольные вопросы

1. Что понимают под термином стерилизация?

2. Какими способами проводят стерилизацию?

3. Что стерилизуют прокаливанием на огне?

4. Опишите устройство и режим работы печи Пастера.

5. Что стерилизуют в печи Пастера?

6. Как подготавливают стеклянную посуду к стерилизации?

7. Почему в печи Пастера нельзя стерилизовать питательные среды и предметы

из резины?

Задание

Подготовьте к стерилизации чашки Петри, градуированные пипетки,

пастеровские пипетки, пробирки, колбы и флаконы.

Стерилизация кипячением

Кипячение - способ стерилизации, гарантирующий обеспложивание при условии

отсутствия в стерилизуемом материале спор. Применяют для обработки шприцев
инструментов, стеклянной и металлической посуды резиновых трубок и т. п.
 Стерилизацию кипячением обычно проводят в стерилизаторе - металлической
коробке прямоугольной формы с плотно закрывающейся крышкой. Стерилизуемый
материал помещают на имеющуюся в стерилизаторе сетку и заливают водой. Для
повышения точки кипения и устранения жесткости воды добавляют 1-2%
гидрокарбонат натрия (лучше пользоваться дистиллированной водой).
Стерилизатор закрывают крышкой и подогревают Началом стерилизации считают
момент закипания воды, время кипячения 15-30 мин. По окончании стерилизации
сетку с инструментами извлекают за боковые ручки специальными крючками, а
находящиеся в ней инструменты берут стерильным пинцетом или корнцангом,
который кипятят вместе с остальными инструментами.

Стерилизацию паром производят двумя способами: 1) паром под давлением; 2)

текучим паром.

Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Этот способ

стерилизации основан на воздействии на стерилизуемые материалы насыщенного
водяного пара при давлении выше атмосферного. В результате такой стерилизации
при однократной обработке погибают как вегетативные, так и споровые формы
микроорганизмов.

Автоклав (рис. 12) - массивный котел, снаружи покрытый металлическим

кожухом, герметически закрыт крышкой, которая плотно привинчивается к котлу
откидывающимися болтами. В наружный котел вставлен другой, меньшего
диаметра, который называют стерилизационной камерой. В эту камеру помещают
предметы, подлежащие стерилизации. Между обоими котлами имеется свободное
пространство, называемое водопаровой камерой. В эту камеру через воронку,
укрепленную снаружи, наливают воду до определенного уровня, отмеченного на
специальной водомерной трубке. При кипячении воды в водопаровой камере
образуется пар. Стерилизационная камера снабжена выпускным краном с
предохранительным клапаном для выхода пара при повышении давления сверх
необходимого. Для определения давления, создающегося в стерилизационной
камере, служит манометр.
 Рис. 12. Схема автоклава. М - манометр; ПК - предохранительный клапан; В -
воронка для воды; К2 - кран для выпуска воды; К3 - кран для выпуска пара

Нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимают за нуль. Между

показаниями манометра и температурой имеется определенная зависимость (табл.
2).

Таблица 2. Режим работы автоклава

В настоящее время имеются автоклавы с автоматическим регулированием

режима работы. Кроме обычного манометра, они снабжены электроконтактным
манометром, который препятствует увеличению давления выше заданной величины
и тем самым обеспечивает постоянство нужной температуры в автоклаве.

Паром под давлением стерилизуют различные питательные среды (кроме

содержащих нативные белки), жидкости (изотонический раствор хлорида натрия,
воду и т. д.); приборы, особенно имеющие резиновые части.

Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяется

их составом, указанным в рецепте приготовления питательной среды. Например,
простые среды (мясопептонный агар, мясопептонный бульон) стерилизуют 20 мин
при 120° С (1 атм). Однако при этой температуре нельзя стерилизовать среды,
содержащие нативные белки, углеводы и другие легко изменяющиеся от нагревания
вещества. Среды с углеводами стерилизуют дробно при 100° С или в автоклаве при
112° С (0,5 атм) 10-15 мин. Различные жидкости, приборы, имеющие резиновые
шланги, пробки, бактериальные свечи и фильтры стерилизуют 20 мин при 120° С (1
атм).

Внимание! В автоклавах производят также обезвреживание инфицированного

материала. Чашки и пробирки, содержащие культуры микроорганизмов, помещают
в специальные металлические ведра или баки с отверстиями в крышке для
проникновения пара и стерилизуют в автоклаве при 126° С (1,5 атм) в течение 1 ч.
Таким же образом стерилизуют инструменты после работы с бактериями,
образующими споры.

К работе с автоклавом допускаются только специально подготовленные лица,

которые должны строго и точно выполнять правила, указанные в инструкции,
прилагаемой к аппарату.

Техника автоклавирования. 1. Перед работой проверяют исправность всех

частей и притертость кранов.

2. Через воронку, укрепленную снаружи котла, до верхней метки водомерного

стекла заливают воду (дистиллированную или кипяченую, чтобы не образовалась
накипь). Кран под воронкой закрывают.

3. В стерилизационную камеру на специальную сетку помещают стерилизуемый

материал. Предметы следует загружать не слишком плотно, так как пар должен
свободно проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной
температуры и могут остаться нестерильными.

4. Резиновую прокладку на крышке натирают мелом для лучшей герметизации.

5. Крышку закрывают и болтами привинчивают к корпусу автоклава, причем

болты закручивают попарно крест-накрест.

6. Открывают до отказа выпускной кран, соединяющий стерилизационную

камеру с наружным воздухом, и начинают нагревать автоклав. Нагревание
автоклава обычно производят с помощью газа или электричества.

При нагревании автоклава вода закипает, образующийся пар поднимается между

стенками котлов и сквозь специальные отверстия, имеющиеся в стенке внутреннего
котла (см. рис. 12), попадает в стерилизационную камеру и выходит через открытый
выпускной кран. Сначала пар выходит вместе с воздухом, находившимся в
автоклаве. Необходимо, чтобы весь воздух был вытеснен из автоклава, так как в
противном случае показания манометра не будут соответствовать температуре в
автоклаве.

Появление непрерывной сильной струи пара указывает на полное удаление

воздуха из автоклава; после этого выпускной кран закрывают и давление, внутри
автоклава начинает постепенно повышаться.
 7. Началом стерилизации считают момент, когда показания манометра достигают
заданной величины. Нагрев регулируют так, чтобы давление в автоклаве в течение
определенного времени не изменялось.

8. По истечении времени стерилизации нагрев автоклава прекращают, пар

выпускают через выпускной кран. Когда стрелка манометра опускается до нуля,
открывают крышку. Чтобы избежать ожогов паром, оставшимся в автоклаве,
крышку следует открывать на себя.

Уровень температуры в автоклаве, т. е. правильность показаний манометра,

можно проверить. Для этого используют различные вещества, имеющие
определенную точку плавления: антипирин (113° С), резорцин и серу (119° С),
бензойную кислоту (120° С). Одно из этих веществ смешивают с ничтожно малым
количеством красителя (фуксина или метиленового синего) и насыпают в
стеклянную трубочку, которую запаивают и помещают в вертикальном положении
между стерилизуемым материалом. Если температура достаточна, вещество
расплавится и окрасится в цвет соответствующего красителя.

Для проверки эффективности стерилизации в автоклав помещают пробирку с

заведомо споровой культурой. После автоклавирования пробирку переносят в
термостат на 24-48 ч, отмечают отсутствие или наличие роста. Отсутствие роста
свидетельствует о правильной работе прибора.

Стерилизацию текучим паром производят в аппарате Коха. Этот способ

применяют в тех случаях, когда стерилизуемый объект изменяется при температуре
выше 100° С. Текучим паром стерилизуют питательные среды, содержащие
мочевину, углеводы, молоко, картофель, желатин и др.

Аппарат (кипятильник) Коха представляет собой металлический цилиндр,

обшитый снаружи (для уменьшения теплоотдачи) войлоком или асбестом. Цилиндр
закрывают конической крышкой с отверстием для выхода пара. Внутри цилиндра
находится подставка, до уровня которой наливают воду. На подставку ставят ведро
с отверстием, в которое помещают стерилизуемый материал. Нагревают аппарат
Коха при помощи газа или электричества. Отсчет времени стерилизации ведут с
момента энергичного выделения пара у краев крышки и из отверстия для выхода
пара. Стерилизуют в течение 30-60 мин. По окончании стерилизации нагрев
прекращают. Вынимают из аппарата ведро с материалом и оставляют при
комнатной температуре до следующего дня. Прогревание проводят 3 дня подряд
при температуре 100° С по 30-60 мин. Такой метод носит название дробной
стерилизации. При первом прогревании гибнут вегетативные формы микробов, а
споровые сохраняются. За сутки споры успевают прорасти и превратиться в
вегетативные формы, которые погибают на второй день стерилизации. Так как
возможно, что некоторая часть спор не успела прорасти, материал выдерживают
еще 24 ч, а затем проводят третью стерилизацию. Стерилизация текучим паром в
аппарате Коха не требует специального контроля, так как показателем правильной
работы прибора служит стерильность приготовленных питательных сред.
Стерилизовать текучим паром можно также в автоклаве при незавинченной крышке
и открытом выпускном кране.

Контрольные вопросы
 1. Какие питательные среды стерилизуют паром?

2. Что такое стерилизатор и как он устроен?

3. Почему при стерилизации кипячением следует применять дистиллированную

воду?

4. Опишите устройство и режим работы автоклава.

5. Что стерилизуют в автоклаве?

6. Что служит контролем правильной стерилизации при автоклавировании?

7. Что такое стерилизация текучим паром?

8. Опишите устройство аппарата Коха.

9. С какой целью проводят дробную стерилизацию?

Задание

Заполните форму.

Дробную стерилизацию можно проводить также в свертывателе Коха.

Свертыватель Коха используют для свертывания сывороточных и яичных

питательных сред, причем одновременно с уплотнением среды происходит ее
стерилизация.

Свертыватель Коха представляет собой плоский металлический ящик с

двойными стенками, покрытый снаружи теплоизоляционным материалом. В
пространство между стенками через специальное отверстие, находящееся в верхней
части наружной стенки, наливают воду. Отверстие закрывают пробкой, в которую
вставлен термометр. Закрывают аппарат двумя крышками: стеклянной и
металлической. Через стеклянную крышку можно наблюдать за процессом
свертывания. Пробирки со средами укладывают на дно свертывателя в наклонном
положении.

Нагревание свертывателя осуществляют с помощью газа или электричества.

Среды стерилизуют однократно при температуре 90° С в течение 1 ч или дробно - 3
дня подряд при 80° С в течение 1 ч.
 Тиндализацию* - дробную стерилизацию при низких температурах - применяют
для веществ, которые легко разрушаются и денатурируются при температуре 60° С
(например, белковые жидкости). Прогревание стерилизуемого материала
производят на водяной бане или в специальных приборах с терморегуляторами при
температуре 56-58° С в течение часа 5 дней подряд.
*
(Способ стерилизации, назван по имени Тиндаля, предложившего его.)

Пастеризация - стерилизация при 65-70° С в течение 1 ч, предложена Пастером

для уничтожения бесспоровых форм микробов. Пастеризуют молоко, вино, пиво,
плодовые соки и другие продукты. Молоко пастеризуют с целью освобождения от
молочно-кислых и патогенных бактерий (бруцеллы, микобактерии туберкулеза,
шигеллы, сальмонеллы, стафилококки и др.). При пастеризации пива, плодовых
соков, вина погибают микроорганизмы, вызывающие различные виды брожения.
Пастеризованные продукты лучше сохранять на холоду.

Контрольные вопросы

1. Каково назначение и устройство свертывателя Коха?

2. Какие существуют способы стерилизации в свертывателе?

3. Что такое тиндализация?

4. Что такое пастеризация?

Стерилизация ультрафиолетовым облучением

Стерилизацию УФ-лучами производят при помощи специальных установок -

бактерицидных ламп. УФ-лучи обладают высокой антимикробной активностью и
могут вызвать гибель не только вегетативных клеток, но и спор. УФ-облучение
применяют для стерилизации воздуха в больницах, операционных, детских
учреждениях и т. д. В микробиологической лаборатории УФ-лучами обрабатывают
бокс перед работой.

Контрольные вопросы

1. Какими свойствами обладают ультрафиолетовые лучи?

2. В каких случаях прибегают к стерилизации методом ультрафиолетового

излучения?

Механическая стерилизация при помощи бактериальных

фильтров

Стерилизацию фильтрованием применяют в тех случаях, когда стерилизуемые

предметы изменяются при нагревании. Фильтрование проводят с помощью
бактериальных фильтров, изготовленных из различных мелкопористых материалов.
Поры фильтров должны быть достаточно мелкими (до 1 мкм), чтобы обеспечить
механическую задержку бактерий, поэтому некоторые авторы относят
фильтрование к механическим способам стерилизации.
 Методом фильтрования стерилизуют питательные среды, содержащие белок,
сыворотки, некоторые антибиотики, а также отделяют бактерии от вирусов, фагов и
экзотоксинов.

В микробиологической практике используют асбестовые фильтры Зейтца,

мембранные фильтры и фильтры (свечи) Шамберлана и Беркефельда.

Фильтры Зейтца представляют собой диски, изготовленные из смеси асбеста с

целлюлозой. Толщина их 3-5 мм, диаметр 35-140 мм. Отечественная
промышленность изготовляет фильтры двух марок: "Ф" (фильтрующие)-
задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие бактерии; "СФ"
(стерилизующие) - с меньшими порами, задерживающие бактерии, но
пропускающие вирусы. Мятые асбестовые пластинки, а также пластинки с
надломами и трещинами для работы непригодны.

Мембранные фильтры готовят из нитроцеллюлозы. Они представляют собой

диски белого цвета толщиной 0,1 мм и диаметром 35 мм. В зависимости от размера
пор их обозначают № 1, 2, 3, 4 и 5 (табл. 3).

Таблица 3. Характеристика мембранных фильтров

Для стерилизации наиболее пригоден фильтр № 1. Кроме перечисленных,

выпускают еще так называемый предварительный фильтр, предназначенный для
освобождения фильтруемой жидкости от содержащихся в ней крупных частиц.

Фильтры (свечи) Шамберлана и Беркефельда представляют собой полые

цилиндры, закрытые с одного конца. Свечи Шамберлана изготовляют из каолина с
примесью песка и кварца. Стандартизуют их по размерам пор и обозначают L 1, L2,
L3 ... L13. Фильтры (свечи) Беркефельда готовят из инфузорной земли, по величине
пор их обозначают V, N, W, что соответствует диаметру пор 3-4, 4-7, 8-12 мк.

Работу с бактериальными фильтрами осуществляют следующим образом.

Фильтр должен быть закреплен в специальном держателе, который вставляют в
приемник фильтра. Приемником обычно является колба Бунзена. Держатели, в
большинстве случаев сделанные из нержавеющей стали, состоят из двух частей:
верхней, имеющей форму цилиндра без дна, и нижней - опорной части,
заканчивающейся трубкой. Фильтры Зейтца шероховатой поверхностью вверх
помещают на металлическую сетку и крепко зажимают винтами между верхней и
нижней частью держателя. Смонтированный фильтр укрепляют в резиновой
пробке, вставленной в горлышко колбы Бунзена. В отводную трубку колбы,
которую присоединяют к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон.
Подготовленную установку обертывают бумагой и стерилизуют в автоклаве под
давлением 1 атм в течение 20-30 мин. Весь прибор в собранном виде называют
также фильтром Зейтца (рис. 13).

Рис. 13. Фильтр Зейтца

Непосредственно перед фильтрованием отводной конец колбы Бунзена

соединяют резиновой трубкой с масляным или водоструйным насосом. Места
соединения различных частей заливают парафином для создания герметичности. В
цилиндр аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают в действие насос,
создающий вакуум в приемнике. В результате образующейся разности давлений
фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник, а микробы
остаются на поверхности фильтра.

Мембранные фильтры перед употреблением стерилизуют кипячением в

дистиллированной воде. Чтобы предупредить скручивание фильтров, их сначала
помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50-60° С, и
кипятят на слабом огне 30 мин, 2-3 раза меняя воду. Держатель и приемник фильтра
стерилизуют заранее, прибор монтируют в асептических условиях. Чтобы не
порвать мембранный фильтр о металлическую сетку, под него кладут кружки
стерильной фильтровальной бумаги. Затем стерильным пинцетом с гладкими
кончиками берут мембранный фильтр из стерилизатора и помещают на опорную
сетку блестящей поверхностью вниз.

Простерилизованные в автоклаве свечи (Шамберлана) соединяют посредством

резиновой трубки с приёмником и опускают в сосуд (чаще цилиндр) с фильтруемой
жидкостью. Фильтрация происходит при помощи вакуумного насоса. В приемник
поступает стерильный фильтрат, а бактерии задерживаются порами свечи.

Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны на одноразовое использование.

Свечи после употребления кипятят в водопроводной воде, затем прокаливают в
муфельной печи.
 Перед последующим употреблением свечи проверяют на целостность. Свечу
опускают в сосуд с водой и пропускают воздух. Если на поверхности свечи
выступают пузырьки воздуха, значит в свече образовались трещины и она
непригодна.

Контрольные вопросы

1. В чем заключается метод стерилизации фильтрованием? Что стерилизуют этим

методом?

2. Какие бактериальные фильтры Вы знаете? Как монтируют прибор для

фильтрования, какие условия необходимо соблюдать?

Химические способы

Этот вид стерилизации применяют ограниченно, и он служит в основном для

предупреждения бактериального загрязнения питательных сред и
иммунобиологических препаратов (вакцин и сывороток).

К питательным средам чаще всего прибавляют такие вещества, как хлороформ,

толуол, эфир. При необходимости освободить среду от этих консервантов ее
нагревают на водяной бане при 56° С (консерванты испаряются).

Для консервирования вакцин, сывороток пользуются мертиолатом, борной

кислотой, формалином и т. д.

Биологическая стерилизация

Биологическая стерилизация основана на применении антибиотиков. Этот метод

используют при культивировании вирусов.

Контрольные вопросы

1. Что такое химическая стерилизация и когда ее используют?

2. Что такое биологическая стерилизация?

Основные способы стерилизации представлены в табл. 4.

Таблица 4. Основные способы стерилизации

 1
(Стерилизация неполная: в стерилизуемом материале сохраняются споры.)
2
(Стерилизация неполная: в стерилизуемом материале сохраняются вирусы.)

Дезинфекция
В микробиологической практике применяют различные дезинфицирующие
вещества: 3-5% растворы фенола, 5-10% растворы лизола, 1-5% растворы
хлорамина, 3-6% растворы перекиси водорода, 1-5% растворы формалина, растворы
сулемы в разведении 1:1000 (0,1%), 70° спирт и др.

Дезинфекции подвергают отработанный патологический материал (гной, кал,

моча, мокрота, кровь, спинномозговая жидкость) перед сливом его в канализацию.
Обеззараживание проводят сухой хлорной известью или 3-5% раствором
хлорамина.

Загрязненные патологическим материалом или культурами микроорганизмов

пипетки (градуированные и пастеровские), стеклянные шпатели, предметные и
покровные стекла опускают на сутки в стеклянные банки с 3% раствором фенола
или перекиси водорода.

По окончании работы с заразным материалом лаборант должен обработать

дезинфицирующим раствором рабочее место и руки. Поверхность рабочего стола
протирают кусочком ваты, смоченным 3% раствором фенола. Руки дезинфицируют
1% раствором хлорамина. Для этого ватный шарик или марлевую салфетку
смачивают дезинфицирующим раствором и протирают левую кисть, потом правую,
а затем моют руки теплой водой с мылом.

Выбор дезинфицирующего вещества, его концентрация и длительность

воздействия (экспозиция) зависят от биологических свойств микроба и от той
среды, в которой будет происходить контакт дезинфицирующего вещества с
патогенными микроорганизмами. Например, сулема, фенол, спирты непригодны
для обеззараживания белковых субстратов (гной, кровь, мокрота), так как под их
влиянием происходит свертывание белков, а свернувшийся белок предохраняет
микроорганизмы от воздействия дезинфицирующих веществ.

При дезинфекции материала, инфицированного споровыми формами

микроорганизмов, применяют 5% раствор хлорамина, 1-2,5% растворы
активированного хлорамина, 5-10% растворы формалина и другие вещества.

Дезинфекцию, которую проводят на протяжении всего дня по ходу работы,

называют текущей, а по окончании работы - заключительной.

Дезинфицирующие вещества и прописи приготовления из них рабочих

растворов. Хлорная известь - белый комковатый порошок с резким запахом хлора,
в воде растворяется не полностью. Бактерицидный эффект зависит от содержания
активного хлора, количество которого колеблется от 28 до 36%. Хлорная известь,
содержащая менее 25% активного хлора, для дезинфекции непригодна.
 При неправильном хранении хлорная известь разлагается и теряет часть
активного хлора. Разложению способствуют тепло, влага, солнечный свет, поэтому
хранить хлорную известь следует в сухом, темном месте, в плотно закрытой таре.

Сухую хлорную известь применяют для обеззараживания выделений человека и

животных (из расчета 200 г на 1 л испражнений и 10 г на 1 л мочи).

Приготовление исходного 10% осветленного раствора хлорной извести. Берут 1

кг сухой хлорной извести, помещают в эмалированное ведро и измельчают. Затем
заливают холодной водой до объема 10 л, хорошо перемешивают, закрывают
крышкой и оставляют на сутки в прохладном месте. После этого образовавшийся
10% осветленный раствор осторожно сливают и отфильтровывают через несколько
слоев марли или процеживают через плотную ткань. Хранят в бутылях из темного
стекла, закрытых деревянной пробкой, в прохладном месте, не более 10 сут.
Рабочие растворы необходимой концентрации готовят из основного раствора
непосредственного перед их употреблением. Количество основного раствора,
необходимое для приготовления 0,2-10% осветленных растворов хлорной извести,
приведено в табл. 5.

Таблица 5. Схема приготовления растворов хлорной извести

Концентрацию осветленных растворов хлорной извести от 0,2 до 10% выбирают

в зависимости от характера обеззараживаемого объекта и устойчивости
возбудителя.

Хлорамин - кристаллическое вещество белого или желтоватого цвета, содержит

24-28% активного хлора. Хорошо растворяется в воде при комнатной температуре,
поэтому растворы его готовят непосредственно перед дезинфекцией. Пользуются
0,2-10% растворами хлорамина. Соотношение между процентной концентрацией
раствора и количеством хлорамина в граммах на 1 и 10 л приведено в табл. 6.
 Таблица 6. Схема приготовления различных растворов хлорамина

Растворяют хлорамин в стеклянной или эмалированной посуде. При хранении

растворов хлорамина в посуде из темного стекла с притертой пробкой их
активность сохраняется до 15 сут.

Активированный хлорамин. Дезинфицирующие свойства хлорамина

усиливаются при добавлении к нему активатора в соотношении 1:1 или 1:2. В
качестве активатора используют аммонийные соединения - хлорид, сульфат, нитрат
аммония. Применяется активированный хлорамин в концентрации 0,5, 1 и 2,5%.
Готовят их непосредственно перед употреблением. Раздельно отвешивают
хлорамин и соль аммония. Сначала растворяют в воде хлорамин, а затем
прибавляют активатор.

Преимущество активированных растворов хлорамина перед обычными

заключается в том, что при добавлении активатора ускоряется выделение активного
хлора. Поэтому препарат губительно действует не только на вегетативные формы
микроорганизмов, но и на их споры. Активированный хлорамин применяют в более
низких концентрациях и при меньшей экспозиции.

Фенол (карболовая кислота) представляет собой бесцветные кристаллы

игольчатой формы с резким характерным запахом. Под действием света, воздуха и
влаги кристаллы приобретают малиново-красный цвет. Хранят в закрытых банках
из темного стекла и в защищенном от света месте.

Фенол растворим в воде, спирте, эфире, жирных маслах. Обладая большой

гигроскопичностью, поглощает из окружающей среды влагу и становится жидким.
Жидкая карболовая кислота содержит 90% кристаллического фенола и 10% воды.

Применяют 3-5% водные растворы карболовой кислоты, приготовленные из

кристаллического фенола и жидкой карболовой кислоты по схеме, приведенной в
табл. 7. Активность фенола повышается при растворении его в горячей воде (40-50°
С).
 Таблица 7. Схема приготовления различных растворов карболовой кислоты

Внимание! Кристаллический фенол или жидкая карболовая кислота, попадая на

кожу, могут вызвать ее раздражение, а в больших концентрациях - тяжелые ожоги.
Поэтому обращаться с карболовой кислотой нужно с большой осторожностью. При
изготовлении растворов следует надевать резиновые перчатки или в крайнем случае
смазать руки вазелином.

В случае попадания карболовой кислоты на кожу необходимо немедленно смыть

ее теплой водой с мылом или 40° этиловым спиртом.

Примечание. Для приготовления дезинфицирующих растворов фенола удобнее и

безопаснее использовать жидкую карболовую кислоту.

Контрольные вопросы

1. Какие дезинфицирующие вещества применяют в микробиологической

практике?

2. Опишите внешний вид и основные свойства хлорной извести, хлорамина,

фенола.

3. Какие растворы дезинфицирующих веществ используют для обеззараживания

материала, инфицированного споровыми формами микроорганизмов?

Задание

Приготовьте 2 л 5% рабочего раствора осветленной хлорной извести; 500 мл 3%

раствора хлорамина, 300 мл 1% раствора активированного хлорамина.

Внимание! Прежде чем приступить к приготовлению растворов, сделайте

расчеты.

Глава 7. Питательные среды и микробиологическое

исследование - Г. И. Кац
Микробиологическое исследование - это выделение чистых культур
микроорганизмов, культивирование и изучение их свойств. Чистыми называют
культуры, состоящие из микроорганизмов одного вида. Они нужны при
диагностике инфекционных болезней, для определения видовой и типовой
принадлежности микробов, в исследовательской работе, для получения продуктов
жизнедеятельности микробов (токсинов, антибиотиков, вакцин и т. п.).

Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях

in vitro) необходимы особые субстраты - питательные среды. На средах
микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат,
размножаются и т. д.), поэтому их еще называют средами для культивирования.

Питательные среды
Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их
качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны
создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов.

Требования, предъявляемые к средам

Среды должны соответствовать следующим требованиям:

1) быть питательными, т. е. содержать в легко усвояемом виде все вещества,

необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими
являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ,
включая микроэлементы. Минеральные вещества не только входят в структуру
клетки и активизируют ферменты, но и определяют физико-химические свойства
сред (осмотическое давление, рН и др.). При культивировании ряда
микроорганизмов в среды вносят факторы роста - витамины, некоторые
аминокислоты, которые клетка не может синтезировать;

Внимание! Микроорганизмы, как все живые существа, нуждаются в большом

количестве воды.

2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - рН, так как только при
оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки,
микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН

7,2-7,4). Исключение составляют холерный вибрион - его оптимум находится в
щелочной зоне (рН 8,5-9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в
слабокислой реакции (рН 6,2-6,8).

Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их

жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т. е.
содержать вещества, нейтрализующие продукты; обмена;

3) быть изотоничными для микробной клетки; т. е. осмотическое давление в

среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства
микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0,5% раствору натрия
хлорида;

4) быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту

изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды (состав,
рН и др.);
 5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для
микроорганизмов консистенцию;

6) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т. е.

соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым
индексом RH2. Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом. Для
одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, для других - низкий. Например,
анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы - при RH 2 не ниже 10.
Окислительно-восстановительный потенциал большинства сред удовлетворяет
требованиям к нему аэробов и факультативных анаэробов;

7) быть по возможности унифицированным, т. е. содержать постоянные

количества отдельных ингредиентов. Так, среды для культивирования большинства
патогенных бактерий должны содержать 0,8-1,2 г/л аминного азота NH 2, т. е.
суммарного азота аминогрупп аминокислот и низших полипептидов; 2,5-3,0 г/л
общего азота N; 0,5% хлоридов в пересчете на натрия хлорид; 1% пептона.

Желательно, чтобы среды были прозрачными - удобнее следить за ростом

культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

Классификация сред

Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов

микроорганизмов неодинакова. Это исключает возможность создания
универсальной среды. Кроме того, на выбор той или иной среды влияют цели
исследования.

В настоящее время предложено огромное количество сред* в основу

классификации которых положены следующие признаки.

1. Исходные компоненты. По исходным компонентам различают натуральные и

синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и
растительного происхождения. В настоящее; время разработаны среды, в которых
ценные пищевые продукты (мясо и др.) заменены непищевыми: костной и рыбной
мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Несмотря на то что состав
питательных сред из натуральных продуктов очень сложен и меняется в
зависимости от исходного сырья, эти среды нашли широкое применение.
Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и
неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и
растворенных в дважды дистиллированной воде. Важное преимущество этих сред в
том, что состав их постоянен (известно, сколько и какие вещества в них входят),
поэтому эти среды легко воспроизводимы.

2. Консистенция (степень плотности). Среды бывают жидкие, плотные и

полужидкие. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым для
получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин.

Агар-агар - полисахарид, получаемый из определенных сортов морских

водорослей. Он не является для микроорганизмов питательным веществом и
служит только для уплотнения среды. В воде агар плавится при 80-100° С,
застывает при 40-45° С.
 Желатин - белок животного происхождения. При 25-30° С желатиновые среды
плавятся, поэтому культуры на них обычно выращивают при комнатной
температуре. Плотность этих сред при рН ниже 6,0 и выше 7,0 уменьшается, и они
плохо застывают. Некоторые микроорганизмы используют желатин как
питательное вещество - при их росте среда разжижается.

Кроме того, в качестве плотных сред применяют свернутую сыворотку крови,

свернутые яйца, картофель, среды с селикагелем.

3. Состав. Среды делят на простые и сложные. К первым относят

мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар
Хоттингера, питательный желатин и пептонную воду. Сложные среды готовят,
прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества,
необходимые для размножения того или иного микроорганизма.

4. Назначение: а) основные (общеупотребительные) среды служат для

культивирования большинства патогенных микробов. Это вышеупомянутые МПА,
МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода;

б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов,

не растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к
средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков - сыворотку крови, для
возбудителя коклюша - кровь;

в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида

микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост
сопутствующих микроорганизмов. Так, соли желчных кислот, подавляя рост
кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа.
Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков,
солей, изменении рН.

Жидкие элективные среды называют средами накопления. Примером такой

среды служит пептонная вода с рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается
холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут;

г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить

(дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности,
например среды Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов,
расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды;

д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и

транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание
патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой
среды - глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при
исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий.

Рецепты приготовления некоторых сред приведены в конце следующего раздела

и во второй части учебника.
 Контрольные вопросы

1. Каким требованиям должны удовлетворять питательные среды?

2. Как классифицируют среды по исходным компонентам?

3. Какие вещества служат для уплотнения сред?

4. Какие среды являются простыми или общеупотребительными и для чего их

применяют?

5. Какие среды называют сложными, что служит их основой?

6. Какие среды позволяют получить преимущественный рост одних микробов

при одновременном подавлении других?

7. На каких средах изучают ферментативную активность микробов?

Задание

Заполните форму, указав на какие группы подразделяют среды.

Приготовление сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ,

например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа,
которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего
пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие
количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах
или реакторах (рис. 14). Перед употреблением посуду необходимо тщательно
вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно
кипятят 30 мин в 1-2% растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот
раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.
 Рис. 14. Общий вид реактора

Внимание! Посудой, предназначенной для приготовления сред, нельзя

пользоваться в других целях, например для хранения химических реактивов или
дезинфицирующих растворов - даже следы этих веществ могут помешать росту
микроорганизмов.

Исходным сырьем для приготовления большинства сред служат продукты

животного или растительного происхождения: мясо и его заменители, молоко, яйца,
картофель, соя, кукуруза, дрожжи и др.

Основные питательные бульоны готовят на мясной воде или на различных

переварах, полученных при кислотном или ферментативном гидролизе исходного
сырья. Бульоны из переваров в 5-10 раз экономичнее, чем из мясной воды. Среды
на переварах богаче аминокислотами, следовательно, питательнее; обладают
большей буферностью, т. е. имеют более стабильную величину рН. Кроме того,
перевары можно готовить из заменителей мяса (сгустков крови, плаценты, казеина
и т. д.).

В настоящее время снабжение лабораторий мясной водой и переварами

централизованно. Чаще пользуются панкреатическим переваром Хоттингера,
гидролизатами казеина или кормовых дрожжей. Из этих полуфабрикатов по
определенным рецептам готовят необходимые среды.
 Этапы приготовления сред: 1) варка; 2) установление оптимальной величины
рН; 3) осветление; 4) фильтрация; 5) разлив; 6) стерилизация; 7) контроль.

Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах,
подогреваемых паром.

Установление рН сред ориентировочно производят с помощью индикаторных

бумажек. Для точного определения рН пользуются потенциометром, применяя
стеклянные электроды в соответствии с инструкцией или компаратором (аппарат
Михаэлиса), состоящим из штатива с гнездами для пробирок (рис. 15) и набора
стандартов определенного рН. При приготовлении сред пользуются обычно
индикатором метанитрофенолом, изменяющим свой цвет в диапазоне 6,8-8,4.

Рис. 15. Компаратор (аппарат макро-Михаэлиса). 1 - вид спереди; 2 - вид сзади; 3 -

схема расположения пробирок в штативе

Для определения рН среды 4 пробирки, диаметр и цвет стекла которых не

отличается от пробирок со стандартами, помещают в гнезда 1, 2, 3 и 5 (см. рис. 15).
В 1-ю и 3-ю пробирки наливают по 5 мл дистиллированной воды; в 5-ю - 7 мл; во 2-
ю - 4 мл воды и 1 мл индикатора. В гнезда 4 и 6 ставят стандарты нужного рН. В 1-
ю, 2-ю и 3-ю пробирки наливают 2 мл охлажденной среды. Содержимое пробирок
смешивают.

Цвет жидкостей в пробирках сравнивают в проходящем свете, закрыв заднюю

прорезь прибора фильтром (матовым или синим, если жидкости интенсивно
желтые). рН испытуемого раствора соответствует рН стандарта, с цветом которого
совпадает его цвет.

Готовя среды с заданным рН, в гнезде 4 и 6 ставят стандарты, рН которых близок

к требуемому, а во 2-ю пробирку с испытуемой средой и индикатором добавляют из
бюретки определенное количество раствора щелочи, если жидкость во 2-й пробирке
светлее стандартов, или раствора кислоты - если светлее стандарты. Щелочь (или
кислоту) приливают до тех пор, пока цвет жидкости во 2-й пробирке не совпадает с
цветом стандартов. Количество щелочи (или кислоты), прибавленное к 2 мл среды
во 2-й пробирке, пересчитывают на весь объем приготовленной среды. Например,
если для получения нужного рН на 2 мл среды пошло 2 капли (0,1 мл) 0,05 н.
раствора щелочи, то для подщелачивания 1 л нужно в 500 раз больше, т. е. 50 мл
0,05 н. или 2,5 мл 1 н. раствора щелочи.

При стерилизации рН сред снижается на 0,2, поэтому для получения среды с рН

7,2-7,4 ее сначала готовят с рН 7,4-7,6.

Осветление сред производят, если при варке они мутнеют или темнеют. Для
осветления в среду, подогретую до 50° С, вливают белок куриного яйца, взбитый с
двойным количеством воды, перемешивают и кипятят. Свертываясь, белок увлекает
в осадок взвешенные в среде частицы. Таким же способом можно вместо яичного
белка использовать сыворотку крови (20-30 мл на 1 л среды).

Фильтрацию жидких и расплавленных желатиновых сред производят через

влажный бумажный или через матерчатые фильтры. Фильтрация агаровых сред
затруднена, - они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый
фильтр (в воронку помещают марлевую салфетку и на нее пышный комок ваты).
Можно пользоваться бумажными или матерчатыми фильтрами, если проводить
фильтрацию в горячем автоклаве или в воронках с подогревом.

Фильтрацию агаровых сред можно заменить отстаиванием. Среду наливают в

высокий цилиндрический сосуд и расплавляют в автоклаве. При медленном
остывании среды в выключенном приборе взвешенные в ней частицы оседают на
дно. На следующий день агаровый сгусток извлекают из сосуда (для этого сосуд
ненадолго помещают в горячую воду) и отрезают ножом нижнюю часть со
скопившимся осадком. Верхнюю часть растапливают и разливают в
соответствующие емкости.

Разливают среды в пробирки (по 3-5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрацы
и бутылки не более чем на 2/3 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть
пробки и среды утратят стерильность.

Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100° С, разливают в чистую

сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре, обязательно
разливают в стерильную посуду.

Разливают среды с помощью воронки, на конец которой надета резиновая трубка

с зажимом Мора. Для мерного разлива применяют мензурки, бюретки, дозаторы,
шприцы-пипетки и т. п. (рис. 16).
 Рис. 16. Приспособления для мерного разлива сред. а - лабораторный монтаж; б -
автоматический шприц-пипетка; в - дозатор; г - полуавтомат; д - автоматический
дозатор

Посуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх

которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не
смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду
обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и датой ее приготовления.

Стерилизация. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в ее

рецепте. Примерная схема режима стерилизации сред приведена в табл. 8.

Таблица 8. Режим стерилизации сред

1
(Жидкие среды с углеводами, белками или витаминами лучше стерилизовать с помощью бактериальных
фильтров.)

Контроль готовых сред: а) для контроля стерильности среды ставят в термостат

на 2 сут, после чего просматривают. Если на средах не появятся признаки роста, их
считают стерильными и передают для химического контроля по нескольку образцов
каждой серии; б) химический контроль: окончательно устанавливают рН,
содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (их количество должно
соответствовать указанному в рецепте).

Химический контроль сред производят в химической лаборатории; в) для

биологического контроля несколько образцов среды засевают специально
подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных
(ростовых) свойствах среды. К готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в
котором указывают название и состав среды, результаты контроля и др.

Хранят среды при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для

них предназначенных. Некоторые среды, например, среды с кровью и витаминами,
хранят в холодильнике.

Рецепты приготовления простых (основных) сред и

изотонического раствора натрия хлорида
 Изотонический раствор натрия хлорида. К 1 л дистиллированной воды
добавляют 9 г натрия хлорида. Раствор фильтруют, устанавливают заданный рН и,
если нужно, стерилизуют при 120° С в течение 30 мин.

Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5%

х. ч. натрия хлорида, кипятят на слабом огне 10-15 мин для растворения веществ,
устанавливают нужный рН и снова кипятят 30-40 мин до выпадения осадка.
Фильтруют, доливают до первоначального объема водой и стерилизуют 20 мин при
120° С.

Бульон Хоттинтера. Перевар Хоттингера разводят водой в 5-6 раз в

зависимости от того, какое количество аминного азота он содержит и какое его
количество должно быть в бульоне (указано в паспорте перевара и рецепте среды).
Например, для приготовления среды с 1,2 г/л аминного азота перевар, содержащий
9,0. г/л, надо развести в 7 5 раз (9,0:1,2). К разведенному перевару прибавляют 0,5%
натрия хлорида и кипятят на слабом огне до растворения соли, В остывшей среде
устанавливают рН, фильтруют, разливают и стерилизуют 20 мин при

Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону (до стерилизации или после

нее) добавляют 2-3% измельченного агар-агара и кипятят, помешивая, на слабом
огне до полного расплавления агара. МПА можно варить в автоклаве или аппарате
Коха. Готовую среду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при
120° С.

Полужидкий агар содержит 0,4-0,5% агар-агара.

Питательный желатин. К готовому бульону прибавляют 10-15% желатина,

подогревают ДО его расплавления (не кипятят!), разливают в стерильную посуду и
стерилизуют текучим паром.

Рецепты приготовления сложных сред

Среды с углеводами. К основному бульону или расплавленному агару

прибавляют нужное количество (0,1-2%) определенного углевода (например,
глюкозы). После его растворения разливают в стерильную посуду и стерилизуют
текучим паром. Поскольку углеводы частично разрушаются даже при таком режиме
стерилизации, предпочтительнее 25-30% раствор углеводов, простерилизованный
через бактериальный фильтр, добавлять в нужном объеме с соблюдением асептики
к стерильным основным средам - после контроля стерильности среда готова к
употреблению.

Среды с кровью готовят из стерильных простых сред, добавляя в асептических

условиях (лучше в боксе) от в до 30% (обычно 5%) стерильной дефибринированной
крови. Агаровые среды перед этим растапливают и остужают до 45° С. Определяют
температуру среды, поднося сосуд к шее у угла нижней челюсти. При нужной
температуре должно быть терпимое ощущение горячего, но не ожога. После
добавления крови, пока среда не застыла, содержимое сосуда тщательно
перемешивают и разливают в чашки или пробирки.

Внимание! Среды с кровью растапливать нельзя - кровь изменит свои свойства.

 Среды с сывороткой крови готовят так же, как среды с кровью. К основным
средам добавляют 10-20% сыворотки, не содержащей консерванта и
предварительно инактивированной при 56° С в течение 30 мин на водяной бане или
в инактиваторе. При инактивации разрушается вещество (комплемент), губительно
действующее на микробы.

Среды с желчью. К простым средам добавляют желчь в количестве 10-40%

объема среды, устанавливают нужный рН и стерилизуют 20 мин при 120° С. Можно
стерильную желчь добавить к стерильной среде в асептических условиях.

Разлив агаровых сред в чашки Петри. Среды перед разливом расплавляют на

водяной бане и остужают до 45-50° С. Обычно для чашки диаметром 9 см
достаточно 15-20 мл среды (высота слоя 0,25-0,3 см). Если слой выше, на нем менее
контрастно выглядят колонии. При очень тонком слое резко ограничено количество
питательных веществ и влаги (среда быстро высыхает) - ухудшаются условия
культивирования.

Разливают среды в стерильные чашки в асептических условиях. Чашки ставят

крышкой вверх. Сосуд со средой берут в правую руку, держа его у огня. Левой
рукой вынимают пробку, зажав ее мизинцем и ладонью. Обжигают горлышко
сосуда и двумя пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку. Вводят под нее
горлышко флакона, не прикасаясь им к краю чашки. Наливая среду, следят чтобы
она равномерно распределилась по дну чашки. Если при разливе на поверхности
среды образуются пузырьки воздуха, к ним до того, как среда застынет, подносят
пламя спички или горелки - пузырьки лопнут. Затем чашку закрывают и дают среде
застыть. Если посев производят в день разлива, среду необходимо подсушить. Для
этого чашки в термостате осторожно открывают и устанавливают крышки и чашки
открытой стороной вниз на 20-30 мин. Если посев производят на следующий день
после разлива, чашки, не подсушивая, завертывают в ту же бумагу, в которой их
стерилизовали, и помещают в холодильник.

Приготовление скошенного агара. Пробирки с 4-5 мл стерильной

расплавленной агаровой среды укладывают в наклонном положении (примерно под
углом 20 °) с таким расчетом, чтобы среда не заходила за 2/3 пробирки, иначе она
может смочить пробку. После того как среда застынет, пробирки ставят
вертикально - дают стечь конденсату. Лучше употреблять свежескошенный агар.

Внимание! Пользоваться средой, в которой нет конденсата, нельзя. Ее следует

снова растопить на водяной бане и скосить.

Сухие среды

Отечественная промышленность выпускает сухие среды разного назначения:

простые, элективные, дифференциально-диагностические, специальные. Это
порошки во флаконах с завинчивающимися крышками. Хранят сухие среды в
темном месте плотно закрытыми - они гигроскопичны. В лаборатории из порошков
готовят среды по прописи на этикетке.

Преимущество сухих сред по сравнению со средами, изготовленными в

лаборатории, - стандартность (их выпускают большими партиями), простота
приготовления, делающая их доступными в любых (даже походных) условиях,
стабильность, экономичность. Важно, что их можно готовить из заменителей мяса:
гидролизата казеина, фибрина, кильки и даже белковых фракций микробных клеток
(сарцин).

Контрольные вопросы

1. Каким должен быть рН сред для культивирования большинства патогенных

микробов перед стерилизацией и почему?

2. При какой температуре плавятся и застывают агаровые среды?

3. Как должна быть подготовлена посуда, в которую разливают среды с

углеводами и белками?

Задание

1. Приготовьте МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера с рН 7,2-7,4, разлейте во

флаконы и пробирки; простерилизуйте.

2. Приготовьте из сухих порошков среды Гисса, разлейте в пробирки по 4-5 мл и

простерилизуйте.

3. Приготовьте агар с кровью и разлейте его в чашки Петри.

4. Приготовьте из сухих порошков среды Эндо, ЭМС, Плоскирева и разлейте их в

чашки Петри.

5. Приготовьте скошенный агар.

Методы посевов
Важным этапом бактериологического исследования является посев. В
зависимости от цели исследования, характера посевного материала и среды
используют разные методы посева. Все они включают обязательную Цель: оградить
посев от посторонних микробов. Поэтому работать следует быстро, но без резких
движений, усиливающих колебания воздуха. Во время посевов нельзя
разговаривать. Посевы лучше делать в боксе.

Внимание! Не забывайте выполнять правила личной безопасности при работе с

заразным материалом.

Посев из пробирки в пробирку. Пробирку с посевным материалом и пробирку

со средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным
пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне, а их основания
находились поверх кисти. Обычно пробирку с посевным материалом держат ближе
к себе. В правой руке, как писчее перо, держат бактериальную петлю, и
стерилизуют ее, держа вертикально в пламени горелки. Мизинцем и краем ладони
правой руки вынимают обе пробки одновременно. Извлекают пробки не рывком, а
плавно - легкими винтовыми движениями. Вынув пробки, края пробирок обжигают
в пламени горелки. Прокаленную петлю вводят через пламя горелки в пробирку с
посевным материалом, охлаждают и, набрав немного материала, осторожно
переносят в пробирку со средой.

При посеве в жидкую среду посевной материал растирают на стенке пробирки

над жидкостью и смывают средой.

При посеве на жидкие среды тампоном его погружают в среду и 3-5 с

ополаскивают в ней. При посеве на плотную среду материал втирают в ее
поверхность, вращая тампон, после чего тампон обеззараживают (помещают в
пробирку, в которой он был доставлен в лабораторию, и автоклавируют).

Внимание! Следите, чтобы среда не вылилась и не смочила пробку.

При посеве на скошенный агар материал обычно растирают на поверхности

среды зигзагообразными движениями снизу вверх, начиная от границы конденсата.

При посеве на плотные среды, разлитые в пробирки столбиком, петлей с

посевным материалом прокалывают столбик, производя так называемый посев
"уколом".

После посева петлю извлекают из пробирки, края пробирок обжигают и, проведя

пробки через пламя горелки, закрывают пробирки, после чего прокаливают петлю.

Посев жидкого материала можно производить стерильными пипетками

(пастеровскими или градуированными). После посева пипетки погружают в
дезинфицирующую жидкость.

Посевы во флаконы, матрацы и бутыли производят примерно так, как в

пробирки, только сначала набирают материал (петлей или в пипетку), а потом
открывают сосуд со средой.

Сосуды с засеянной культурой надписывают и ставят в термостат.

Посев на пробирки с чашки Петри. Изучив характер роста культуры на чашке,

со стороны дна отмечают восковым карандашом нужный для посева участок.
Чашку с посевным материалом ставят перед собой крышкой вверх. Левой рукой
приоткрывают крышку и вводят под нее обожженную петлю. Остудив петлю,
набирают посевной, материал с отмеченного участка. Вынимают петлю, закрывают
чашку и в левую руку берут пробирку со средой. Посев производят так же, как с
пробирки в пробирку. После посева чашку поворачивают вверх дном.

Посев на агар в чашки Петри. Посев шпателем. Шпатель - это стеклянная или
металлическая трубочка, конец которой загнут в виде треугольника. Шпатель
можно сделать из пастеровской пипетки, согнув под углом ее тонкий конец,
предварительно разогретый в пламени горелки.

Левой рукой слегка приоткрывают крышку, держа ее большим и указательным

пальцем. Петлей, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность среды
посевной материал, после чего тщательно втирают его круговыми движениями
шпателя до тех пор, пока шпатель не перестанет свободно скользить по
поверхности среды, левой рукой при этом придерживают крышку и одновременно
вращают чашку. По окончании посева шпатель вынимают из чашки и закрывают
крышку. Стеклянный шпатель помещают в дезинфицирующий раствор, а
металлический прокаливают в пламени горелки.

Посев петлей. Небольшое количество посевного материала (иногда его

предварительно эмульгируют в стерильном изотоническом растворе или бульоне)
втирают петлей в поверхность среды у края чашки, несколько раз проводя петлей из
стороны в сторону. Затем у того места, где закончились штрихи, агар прокалывают
петлей, снимая избыток посевного материала. Оставшийся на петле посевной
материал зигзагообразными движениями распределяют по всей поверхности среды.
По окончании посева закрывают чашку и прожигают петлю.

Посев петлей на секторы. Чашку со стороны дна расчерчивают на секторы. Посев

производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру. Необходимо
следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор.

Посев тампоном. Тампон с посевным материалом вносят в слегка приоткрытую

чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды,
вращая при этом тампон и чашку.

Посев газоном. Примерно 1 мл (20 капель) жидкой культуры (если культура с

плотной среды, ее эмульгируют в стерильном изотоническом растворе или бульоне)
наносят на поверхность агара и тщательно распределяют жидкость по поверхности
среды. Чашку слегка наклоняют и пипеткой отсасывают избыток культуры,
выливая ее в дезинфицирующий раствор. Туда же помещают пипетку.

Посев в толщу агара. Культуру, выращенную на жидкой среде, или

эмульгированный материал вносят в сосуд с расплавленным и остуженным до 45° С
агаром, перемешивают и выливают в стерильную чашку Петри. Можно внести
посевной материал в пустую чашку и залить 15-20 мл остуженного до 45° С агара.
Для перемешивания содержимого чашки ее слегка покачивают и вращают. Чашки
оставляют на столе до застывания среды.

Засеянные чашки подписывают со стороны дна и помещают в термостат дном

вверх.

Контрольные вопросы

1. Нужны ли асептические условия во время посева? Обоснуйте ответ.

2. Как нужно обработать рабочее место по окончании посевов?

Методы культивирования
Для успешного культивирования, помимо правильно подобранных сред и
правильно произведенного посева, необходимы оптимальные условия: температура,
влажность, аэрация (снабжение воздухом). Как правило, подходящие условия
удается создать, тщательно воспроизведя условия природной обстановки.

Температура. Оптимальную температуру для культивирования большинства

патогенных микроорганизмов (37° С) создают в термостате (рис. 17). Это прибор с
двойными стенками, между которыми находится воздух или вода, подогреваемые
электричеством. Он снабжен терморегулятором, автоматически поддерживающим
нужную температуру, и термометром для контроля за температурой.

Рис. 17. Термостат

Пробирки с посевами в штативах, проволочных сетках или банках

устанавливают на полках термостата. Чашки в термостате должны стоять вверх
дном. Чтобы воздух в термостате свободно циркулировал и нагрев был
равномерным, полки в термостате делают с прорезями и плотно не загружают.
Чтобы не охладить культуры, термостат не оставляют надолго открытым.

Лаборант обязан ежедневно регистрировать температуру в термостате и

поддерживать чистоту в приборе, а при неисправности вызвать мастера.

Свет подавляющему большинству микробов (к ним относятся все патогенные)

не нужен - их культивируют в темноте. Однако для изучения пигментообразования,
которое происходит активнее на рассеянном свету, культуры после термостата
выдерживают 2-3 дня при комнатном освещении.

Внимание! Следует избегать попадания прямых солнечных лучей, действующих

на культуры губительно.

Влажность. Жизнь микробов невозможна без влаги - питательные вещества

проникают в клетку только в растворенном виде. Это необходимо учитывать при
культивировании на плотных средах: разливать их в чашки и скашивать в
пробирках лучше в день посева. При культивировании микробов, особенно
чувствительных к отсутствию влаги, например гонококков, в термостат ставят
открытый сосуд с водой.

Сроки культивирования. Большинство патогенных микробов культивируют

18-24 ч, но есть виды, растущие медленно (до 4-6 нед). Чтобы сохранить в них
влагу, ватные пробки после посева заменяют стерильными резиновыми или
надевают на них резиновые колпачки.
 Внимание! Резиновые пробки стерилизуют в автоклаве завернутыми в бумагу.

Аэрация. По потребности микробов в свободном кислороде их делят на аэробы и

анаэробы. Обе группы требуют различных условий культивирования.

Поступление кислорода, необходимого для культивирования аэробов и

факультативных анаэробов, осуществляется при пассивной и активной аэрации.

Пассивная аэрация - это культивирование на плотных и жидких средах в сосудах,

закрытых ватными или ватно-марлевыми пробками, или в чашках Петри. При таком
культивировании микробы потребляют кислород, растворенный в среде,
находящийся в сосуде над средой и поступающий через пробку. Пассивно
аэрируемые культуры можно выращивать на поверхности или в тонком слое среды,
куда проникает кислород воздуха.

Активную аэрацию применяют при глубинном культивировании микробов, когда

их выращивают в больших объемах среды. Чтобы достаточно снабдить кислородом
такие культуры, их помещают в специальные качалки - постоянное перемешивание
культуры обеспечивает соприкосновение ее с воздухом. При культивировании в
объемах жидкости, достигающих десятков и сотен литров, проводимом в приборах,
называемых реакторами или ферментерами, воздух продувают через культуру при
помощи специальных устройств.

Культивирование анаэробов сложнее, чем аэробов, так как их необходимо

лишить доступа свободного кислорода воздуха. Для этого удаляют воздух из
питательной среды различными способами.

Культивирование актиномицетов, грибов, микоплазм, L-форм, спирохет и

простейших. Культивирование этих микроорганизмов принципиально сходно с
культивированием бактерий. Для них разработаны специальные среды и подобраны
режимы, соответствующие их потребностям.

Культивирование риккетсий и вирусов. Риккетсии и вирусы являются

облигатными паразитами, т. е. могут развиваться только в живых клетках. Их
культивируют в культурах тканей, организме экспериментальных животных,
развивающихся куриных эмбрионах.

Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют скопление микробов одного вида на плотной или в
жидкой питательной среде.

Существует ряд методов выделения чистой культуры в зависимости от свойств

изучаемого материала и цели исследования. Обычно чистые культуры получают из
изолированных колоний - обособленных скоплений микробов на плотной среде.
Считают, что чаще всего колония развивается из одной микробной клетки, т. е.
является чистой культурой этого микроорганизма.

Этапы выделения чистой культуры:

 1-й день - получение изолированных колоний. Каплю исследуемого материала
петлей, пипеткой или стеклянной палочной наносят на поверхность агара в чашке
Петри. Шпателем втирают материал в поверхность среды; не прожигая и не
перевертывая шпателя, производят посев на 2-й, а затем на 3-й чашке. При таком
посеве на 1-ю чашку приходится много материала и соответственно много
микробов, на 2-ю меньше и на 3-ю еще меньше.

Можно получить изолированные колонии при посеве петлей. Для этого

исследуемый материал эмульгируют в бульоне или изотоническом растворе натрия
хлорида.

2-й день - изучают рост микробов на чашках. В 1-й чашке обычно бывает
сплошной рост - выделить изолированную колонию не удается. На поверхности
агара во 2-й и 3-й чашке вырастают изолированные колонии. Их изучают
невооруженным глазом, с помощью лупы, при малом увеличении микроскопа и
иногда в стереоскопическом микроскопе (см. главу 31). Нужную колонию отмечают
со стороны дна чашки и пересевают на скошенный агар. Посевы ставят в термостат.

Внимание! Пересевать можно только изолированные колонии.

3-й день - изучают характер роста на скошенном агаре. Делают мазок,

окрашивают его и, убедившись в том, что культура чистая, приступают к ее
изучению. На этом выделение чистой культуры заканчивается. Выделенная из
определенного источника и изученная культура, называется штаммом.

При выделении чистой культуры из крови (гемокультуры) ее предварительно

"подращивают" в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-
150 мл жидкой среды. Так поступают потому, что в крови обычно мало микробов.
Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1:10 не случайно - так
достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на
микроорганизмы). Колбы с посевом ставят в термостат. Через сутки (иногда через
большее время в зависимости от выделяемой культуры) из содержимого колб
делают высевы на чашки для получения изолированных колоний. При
необходимости повторяют высевы с интервалами 2-3 дня.

При выделении чистой культуры из мочи, промывных вод желудка и других

жидкостей их предварительно центрифугируют в асептических условиях и засевают
осадок. Дальнейшее выделение чистой культуры производят обычным способом.

Для выделения чистой культуры широко применяют элективные среды.

В ряде методов для получения чистых культур используют биологические

особенности выделяемого микроба. Например, при выделении спорообразующих
бактерий посевы прогревают при 80° С 10 мин, убивая этим вегетативные формы;
при выделении возбудителя туберкулеза, устойчивого к кислотам и щелочам, с
помощью этих веществ посевной материал освобождают от сопутствующей флоры;
для выделения пневмококка и палочки чумы исследуемый материал вводят белым
мышам - в их организме, высокочувствительном к данным возбудителям, эти
микробы размножаются быстрее других.
 В научно-исследовательской работе, особенно при генетических исследованиях,
необходимо получать культуры заведомо из одной клетки. Такая культура
называется клон. Для ее получения чаще всего пользуются микроманипулятором -
прибором, снабженным инструментами (иглами, пипетками) микроскопических
размеров. С помощью держателя под контролем микроскопа их вводят в препарат
"висячая капля", извлекают нужную клетку (одну) и переносят ее в питательную
среду.

Изучение выделенных культур

Изучение морфологии, подвижности, тинкториальных свойств (см. главу 3),
характера роста на средах (культуральные свойства), ферментативной активности и
ряда других особенностей выделенного микроба позволяет установить его
таксономическое положение, т. е. классифицировать микроорганизм: определить
его род, вид, тип, подтип, разновидность. Это называется идентификацией.
Идентификация микроорганизмов очень важна при диагностике инфекций,
установлении источников и путей ее передачи и в ряде других научно-практических
исследований.

Культуральные свойства

Разные виды микроорганизмов по-разному растут на средах. Эти различия

служат для их дифференциации. Одни хорошо растут на простых средах, другие -
требовательны и растут только на специальных. Микроорганизмы могут давать
обильный (пышный) рост, умеренный или скудный. Культуры могут быть
бесцветными, сероватыми, серо-голубыми. Культуры микроорганизмов,
образующих пигмент, имеют разнообразную окраску: белую, желтую или
золотистую у стафилококка, красную - у чудесной палочки, сине-зеленую - у сине-
зеленой палочки, пигмент которой, растворимый в воде, окрашивает не только
колонии, но и среду.

На плотных средах микроорганизмы в зависимости от количества посевного

материала образуют или сплошной налет ("газон"), или изолированные колонии.
Культуры бывают грубые и нежные, прозрачные и непрозрачные, с поверхностью
матовой, блестящей, гладкой, шероховатой, сухой, бугристой.

Колонии могут быть крупные (4-5 мм в диаметре и больше), средние (2-4 мм),
мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм). Они различаются по форме,
расположению на поверхности среды (выпуклые, плоские, куполообразные,
вдавленные, круглые, розеткообразные), форме краев (ровные, волнистые,
изрезанные).

В жидких средах микроорганизмы могут образовывать равномерную муть,

давать осадок (зернистый, пылевидный, хлопьевидный) или пленку (нежную,
грубую, морщинистую).

На полужидких средах при посеве уколом подвижные микробы вызывают

помутнение толщи среды, неподвижные - растут только по "уколу", оставляя
остальную среду прозрачной.
 Культуральные свойства определяют, изучая характер роста культуры простым
глазом, с помощью лупы, под малым увеличением микроскопа или пользуясь
стереоскопическим микроскопом. Величину и форму колоний, форму краев и
прозрачность изучают в проходящем свете, рассматривая чашки со стороны дна. В
отраженном свете (со стороны крышки) определяют характер поверхности, окраску.
Консистенцию определяют прикосновением петли.

Морфологические свойства
Изучение морфологии микробов тоже служит для их дифференциации.
Морфологию изучают в окрашенных препаратах. Устанавливают форму и величину
клеток, их расположение в препарате, наличие спор, капсул, жгутиков. В
окрашенных препаратах определяют отношение микробов к краскам
(тинкториальные свойства) - хорошо или плохо воспринимают краски, как
относится к дифференциальным окраскам (в какой цвет окрашивается по Граму,
Цилю - Нильсену и др.). Витальная (прижизненная) окраска позволяет установить
подвижность, отдифференцировать живые и мертвые клетки, следить за их
делением. Деление и подвижность можно изучать в нативных (неокрашенных)
препаратах (см. главу 3).

Ферментативная активность
Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. По ней
можно установить не только видовую и типовую принадлежность микроба, но и
определить его варианты (так называемые биовары). Рассмотрим основные
ферментативные свойства и их качественное определение.

Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т. е. способность

расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и
газа, изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор.
Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор
изменяет окраску среды. Поэтому эти среды названы "пестрый ряд". Микробы, не
ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа
устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его
в "поплавке" на жидких средах. "Поплавок" - узкая стеклянная трубочка с
запаянным концом, обращенным вверх, которую до стерилизации помещают в
пробирку со средой (рис. 18).
 Рис. 18. Изучение сахаролитической активности микроорганизмов. I - 'пестрый ряд':
а - жидкая среда с углеводами и индикатором Андреде; б - полужидкая среда с
индикатором ВР: 1 - микроорганизмы не ферментируют углевод; 2 - микроорганизмы
ферментируют углевод с образованием кислоты; 3 - микроорганизмы ферментируют
углевод с образованием кислоты и газа; II - колонии микроорганизмов, не разлагающих
(бесцветные) и разлагающих лактозу (фиолетовые на среде ЭМС - слева, красные на
среде Эндо - справа)
 Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, ЭМС,
Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этих средах
молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - кислота изменяет цвет
имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу,
бесцветны (см. рис. 18).

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым

крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре
несколько капель раствора Люголя - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный
крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Протеолитические свойства (т. е. способность расщеплять белки, полипептиды

и т. п.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте
на желатиновой среде микробов, ферментирующих желатин, среда разжижается.
Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен (рис. 19).
Микробы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию
молока - оно приобретает вид молочной сыворотки. При расщеплении пептонов
могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с
помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают
определенными растворами, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной
5-6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и
стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак
вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на
бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната,
происходит образование свинца сульфата - бумажка чернеет; индол вызывает
покраснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты (см. рис. 19).

Рис. 19. Протеолитические свойства микроорганизмов. 1 - формы разжижения

 желатина; II - определение сероводорода; III - определение индола: 1 -
отрицательный результат; 2 - положительный результат

Помимо указанных сред, способность микроорганизмов расщеплять различные

питательные субстраты определяют с помощью бумажных дисков, пропитанных
определенными реактивами (системы индикаторные бумажные "СИБ"). Эти диски
опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 ч инкубации в
термостате при 37° С по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов,
аминокислот, белков и т. д.

Гемолитические свойства (способность разрушать эритроциты) изучают на

средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных
средах вокруг колонии появляется прозрачная зона (рис. 20). При образовании
метгемоглобина среда зеленеет.

Рис. 20. Гемолиз вокруг колоний, растущих на агаре с кровью

Сохранение культур
Выделенные и изученные культуры (штаммы), представляющие ценность для
науки или производства, хранят в музеях живых культур. Общесоюзный музей
находится в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских
биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГИСК).

Задача хранения - поддержать жизнеспособность микроорганизмов и

предупредить их изменчивость. Для этого надо ослабить или прекратить обмен в
микробной клетке.

Один из самых совершенных методов длительного сохранения культур -

лиофилизация - высушивание в вакууме из замороженного состояния позволяет
создать состояние анабиоза. Высушивание проводят в специальных аппаратах.
Хранят культуры в запаянных ампулах при температуре 4° С, лучше при -30-70° С.

Восстановление высушенных культур. Сильно нагревают кончик ампулы в

пламени горелки и прикасаются к нему ватным тампоном, слегка * смоченным
холодной водой, чтобы на стекле образовались микротрещины, через которые
воздух медленно просочится внутрь ампулы. При этом, проходя через разогретые
края трещин, воздух стерилизуется.
*
(При избытке воды на тампоне она может попасть в ампулу и нарушить стерильность культуры: ее
засосет через образовавшиеся микротрещины, так как в ампуле вакуум.)

Внимание! Не забывайте, что в запаянной ампуле вакуум. Если воздух в нее

попадает сразу через большое отверстие, может распылиться находящаяся в ампуле
культура и произойти ее выброс.

Дав войти воздуху, быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку ампулы.

Слегка обжигают отверстие и стерильной пастеровской пипеткой или шприцем
вносят в ампулу растворитель (бульон или изотонический раствор). Перемешивают
содержимое ампулы и засевают на среды. Рост восстановленных культур в первых
посевах может быть замедлен.

Длительно сохранять культуры можно также в жидком азоте (-196° С) в

специальных приборах.

Методы непродолжительного сохранения культур следующие: 1)

субкультивирование (периодические пересевы на свежие среды) с интервалами,
зависящими от свойств микроорганизма, среды и условий культивирования. Между
пересевами культуры хранят при 4° С; 2) сохранение под слоем масла. Культуру
выращивают в агаре столбиком высотой 5-6 см, заливают стерильным вазелиновым
маслом (слой масла примерно 2 см) и хранят вертикально в холодильнике. Сроки
хранения у разных микроорганизмов разные, поэтому из пробирок периодически
высевают культуру, чтобы проверить ее жизнеспособность; 3) хранение при -20-70°
С; 4) хранение в запаянных пробирках. По мере надобности сохраняемый материал
высевают на свежую среду.

Контрольные вопросы
1. Что входит в понятие "бактериологическое исследование"?

2. Какой должна быть культура для такого исследования?

3. Что такое колония микробов, культура, штамм, клон?

4. Что входит в понятие "культуральные свойства микробов"?

Задание
1. Изучите и опишите несколько колоний. Пересейте их на скошенный агар и на
сектор.
 2. Изучите и опишите характер роста - культуры на скошенном агаре.
Определите чистоту и морфологию культуры в окрашенном препарате.

3. Пересейте культуру со скошенного агара на бульон и на дифференциально-

диагностические среды. Изучите и запишите в протокол характер роста культуры
на этих средах и ее ферментативные свойства.

Глава 8. Фаги - Г. И. Кац

Фаги - вирусы бактерий и ряда других микроорганизмов. В определенных
условиях они вызывают лизис (растворение) своих хозяев. Действие фагов
проявляется в природе и используется в практике.

История открытия и изучения фага. В 1898 г. Н. Ф. Гамалея показал, что

фильтрат сибиреязвенных бацилл вызывает лизис свежих культур этих
микроорганизмов. В 1915 г. Ф. Ту орт обнаружил, что белые непрозрачные колонии
стафилококков становились прозрачными и исчезали и что агент, лизирующий
стафилококки, проходит через бактериальные фильтры, сохраняя способность
растворять свежие культуры этих микроорганизмов. Явление лизиса
микроорганизмов было описано, но природа его не изучена. Вот почему честь
открытия бактериофага принадлежит канадскому ученому д'Эреллю.

Д'Эрелль (1917) изучал фильтраты испражнений, которые брал ежедневно у

больного дизентерией и вносил в пробирки со свежезасеянной культурой
возбудителя этой болезни. После инкубации в термостате культура вырастала. Но
однажды она не выросла, а растворилась. Это совпало с началом выздоровления
больного.

Д'Эрелль показал, что лизирующая способность фильтратов испражнений

усиливалась при последовательных пассажах на свежих культурах бактерий. Из
этого ученый сделал вывод, что растворяет их живой агент, проходящий через
бактериальные фильтры, т. е. вирус. В настоящее время его точка зрения принята
большинством ученых.

Открытый вирус д'Эрелль назвал бактериофагом * - пожирателем бактерий (от

греч. фагос - пожирающий), а явление - бактериофагией.
*
(В настоящее время чаще употребляют термин "фаг", так как подобные "пожиратели" встречаются
также у грибов и водорослей.)

С открытием электронного микроскопа была подтверждена корпускулярная

природа фага и изучена его морфология.

Открытие д'Эрелля привлекло внимание врачей, применивших фаг для лечения и

профилактики ряда инфекционных болезней. В настоящее время фаги широко
используют в медицинской практике и при различных биологических
исследованиях. Фагами занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики,
генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи,
специалисты по генной инженерии и биотехнологии и т. д. Изучение фага
продолжается, как одна из интереснейших глав биологии.
 Свойства фагов
Природа фагов. Фаги, как считает большинство исследователей, - это
организмы, которые подобно всем живым организмам способны размножаться,
передавать потомству свои свойства и изменяться под воздействием различных
факторов. Они могут инфицировать и разрушать только молодые развивающиеся
клетки, являясь их паразитами.

Морфология фагов. Большинство фагов состоит из головки и хвостового

отростка, поэтому их сравнивают с головастиками или сперматозоидами. Наиболее
изучены Т-фаги кишечной палочки (рис. 21). Их отросток представляет собой
полый цилиндр (стержень), покрытый чехлом и заканчивающийся базальной
пластинкой с шипами и фибриллами. Размеры фагов, форма и величина головки,
длина и строение отростка различны у разных фагов. Например, встречаются фаги с
длинным отростком, чехол которого не сокращается, фаги с коротким отростком,
без отростка и нитевидные (рис. 22).

Рис. 21. Строение фага Т-2. 1 - головка; 2 - ДНК; 3 - стержень; 4 - чехол; 5 -

базальная пластинка; 6 - шипы; 7 - хвостовые фибриллы
 Рис. 22. Морфология фагов. 1 - фаги с головкой, отростком и сокращающимся
чехлом; 2 - головка и отросток, без сократительной способности; 3 - головка и
короткий отросток; 4 - бесхвостые фаги; 5 - нитевидные фаги

Химический состав фагов. Как и все вирусы, фаги состоят из нуклеиновой

кислоты одного типа (чаще встречаются ДНК-фаги) и белка. Молекула
нуклеиновой кислоты, скрученная в спираль, находится в головке фага. Оболочка
фага (капсид) и отросток имеют белковую природу. На свободном конце отростка
содержится литический фермент, обычно лизоцим или гиалуронидаза.

Специфичность фагов. Фаги обладают строгой специфичностью. Различают

видовую специфичность, т. е. способность паразитировать только в определенном
виде микроорганизмов. Именуют фаги обычно по названию микроба-хозяина
(стрептококковый, стафилококковый, холерный, дизентерийный и т. д.). Фаги с
более строгой специфичностью паразитируют только на определенных
представителях данного вида - это типовые фаги. Фаги, лизирующие
микроорганизмы близких видов, например видов, входящих в род возбудителей
дизентерии (шигелл), называются поливалентными.

Взаимодействие фага с чувствительной клеткой проходит через

последовательные стадии. Весь цикл занимает в разных системах фаг - бактерия от
нескольких минут до 1-2 ч, Разберем последовательность этого процесса на
примере Т-четного фага кишечной палочки.

Стадия I - адсорбция частиц фага на поверхностных рецепторах клетки

осуществляется с помощью нитей хвостового отростка. На одной клетке могут
адсорбироваться сотни фагов для лизиса клетки достаточно одного). Адсорбция
фагов специфична.

Стадия II - проникновение (инъекция) нуклеиновой кислоты фага в клетки у

разных фагов происходит по-разному. У Т-фагов кишечной палочки шипы
базальной пластинки соприкасаются с клеточной стенкой. Стержень "прокалывает"
клеточную стенку. Фермент, находящийся в отростке, чаще всего лизоцим,
разрушает цитоплазматическую мембрану. При этом чехол отростка сокращается, и
через канал стержня нуклеиновая кислота фага "впрыскивается" в клетку. Пустая
белковая оболочка фага ("тень") остается снаружи.

Стадия III - репродукция белка и нуклеиновой кислоты фага внутри клетки.

Стадия IV - сборка и формирование зрелых частиц фага.

 Стадия V - лизис клетки и выход зрелых частиц фага из нее. Обычно происходит
разрыв клеточной стенки и в окружающую среду выходит несколько сот новых
фагов, способных поражать свежие клетки. Такой лизис называется лизисом
изнутри (рис. 23).

Рис. 23. Схема основных этапов взаимодействия фага с бактериальной клеткой. 1 -

внедрение нуклеиновой кислоты фага в клетку; 2 - молодые, размножающиеся фаги; 3
- зрелые фаги; 4 - выделение фагов

В отличие от лизиса изнутри лизис извне происходит тогда, когда на клетке

адсорбируется сразу очень большое количество фагов. Они проделывают в
клеточной стенке многочисленные отверстия, через которые вытекает содержимое
клетки. Таким образом при лизисе извне фаг не размножается, и количество его
частиц не увеличивается.

По характеру действия на микроорганизмы различают вирулентные и умеренные

фаги.

Вирулентные фаги вызывают лизис зараженной клетки с выходом в

окружающую среду большого количества фаговых частиц, способных поражать
новые клетки. При этом культура микроорганизмов лизируется. Жидкая среда
становится прозрачной - происходит образование фаголизата * - среды, в которой
находится большое количество фагов. При развитии вирулентного фага в
бактериях, растущих на плотной среде, образуются или прозрачные участки
сплошного лизиса, или вырастают отдельные прозрачные образования - колонии
фага. Их называют негативными колониями (бляшками). Колонии разных фагов
отличаются по величине и структуре (рис. 24).
 *
(При дальнейшей инкубации фаголизата в термостате может наступить вторичное помутнение среды -
размножаются оставшиеся живыми, устойчивые к фагу клетки Популяций.)

Рис. 24. Колонии фагов кишечной палочки. 1 - крупные; 2 - мелкие

Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции. С частью из них фаги

вступают в симбиоз: нуклеиновая кислота фага (его геном) встраивается в
хромосому клетки и получает название про фаг. Происходит образование единой
хромосомы. Бактериальная клетка при этом не погибает. Профагу ставший частью
генома клетки, при ее размножений может передаваться неограниченному числу
потомков, т. е. новым клеткам. Явление симбиоза микробной клетки с умеренным
фагом (профагом) носит название лизогения, а культура, в которой имеется профаг,
называется лизогенной. Это название отражает способность профага спонтанно
покидать хромосому клетки и, переходя в цитоплазму, превращаться в вирулентный
фаг. Те клетки культуры, в которых образовался вирулентный фаг, погибают
(лизируются), остальные сохраняют лизогенность.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных,

но они устойчивы к повторному заражению одноименным фагом. При действии на
лизогенную культуру проникающего излучения (определенных доз и экспозиции
рентгеновских, космических лучей), некоторых химических веществ и ряда других
факторов продукция вирулентного фага и лизис им клеток культуры значительно
увеличиваются.

Умеренные фаги могут принести вред микробиологическому производству.

Например, если штаммы-продуценты вакцин, антибиотиков и других
биологических веществ оказываются лизогенными, существует опасность перехода
умеренного фага в вирулентный, что повлечет за собой лизис производственного
штамма.

Умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов.

Профаг может изменить некоторые свойства микробной культуры, например
сделать ее способной к токсинообразованию, что наблюдается среди дифтерийных
палочек, возбудителя скарлатины и др. Кроме того, переходя в вирулентную форму
и лизируя клетку, фаг может захватить часть хромосомы клетки-хозяина и
перенести эту часть хромосомы в другую клетку, где фаг снова перейдет в профаг, а
клетка получит новые свойства (см. главу 10).
 Распространение фагов в природе повсеместное. Фаги встречаются там, где
находятся чувствительные к ним микроорганизмы: в воде, почве, сточных водах,
выделениях человека и животных и т. д. Почти все известные бактерии являются
хозяевами специфических для них фагов.

Устойчивость фагов к физическим и химическим факторам выше, чем у

вегетативных форм их хозяев. Фаги выдерживают нагревание до 75° С, длительное
высушивание, рН от 2,0 до 8,5. Они не чувствительны к антибиотикам, тимолу,
хлороформу и ряду других веществ, уничтожающих сопутствующую микрофлору.
Поэтому эти вещества используют при выделении и сохранении фагов. Кислоты и
дезинфицирующие вещества губительны для фагов.

Контрольные вопросы
1. Дайте определение понятию фаг.

2. Кто впервые наблюдал действие фага? Кто открыл фаг и изучил его природу?

3. Какова природа, химический состав и строение фагов?

4. В чем выражается специфичность действия фага?

5. Чем отличается действие вирулентного и умеренного фагов?

Методы изучения вирулентных фагов

Подготовка материала

Материалом, из которого выделяют фаг, обычно являются фильтраты,

полученные с помощью бактериальных фильтров из объектов внешней среды,
органов и выделений человека и животных, культур микроорганизмов и т. д.

Перед фильтрацией исследуемый материал подготавливают следующим образом:

Жидкости (кровь, мочу, воду, смывы с предметов и т. п.) освобождают от

крупных частиц с помощью бумажного фильтра или центрифугированием, чтобы
они не забили поры бактериального фильтра.

Вязкий материал (гной, кал) эмульгируют в изотоническом растворе натрия

хлорида или бульоне, после чего освобождают от крупных частиц, как описано
выше.

Плотный материал (кусочки органов, пищи и т. п.) предварительно измельчают

- обычно растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Вместо песка
можно использовать стерильные кончики пастеровских пипеток или битые
покровные стекла. Растертый материал тщательно эмульгируют в изотоническом
растворе натрия хлорида или бульоне и освобождают от крупной взвеси.

Подготовленный материал пропускают через бактериальный фильтр, освобождая

от посторонней микрофлоры.
 Культуры микроорганизмов (известные или изучаемые). В работе с фагом
применяют 20-24-часовые культуры, выращенные на агаре, или 2-6-часовые
культуры в жидких средах. Чистоту культуры устанавливают в мазках, окрашенных
фуксином Пфейффера или по Граму. Из культур, выращенных на скошенном агаре,
готовят взвесь. В пробирку с культурой наливают 3-5 мл изотонического раствора
натрия хлорида. Вращая пробирку между ладонями, осторожно смывают культуру с
поверхности среды так, чтобы не намочить пробку. Взвесь переносят в стерильную
пробирку и разводят изотоническим раствором натрия хлорида 1:10 (0,5 мл взвеси в
4,5 мл раствора).

При работе с фагом необходима стерильная посуда (градуированные и

пастеровские пипетки, чашки Петри, пробирки, колбы, ступки), термостат,
фильтровальное устройство, центрифуга, штативы, прибор для счета колоний.

Внимание! Вся работа с фагом требует соблюдения асептики.

Качественные методы

О наличии фага в том или ином субстрате узнают по лизису чувствительной к

нему микробной культуры (тест-культура).

Обнаружение фага на плотных средах. Тест-культуру засевают "газоном" (см.

главу 7) на поверхность агара в чашке Петри. Посев подсушивают в термостате 30-
40 мин при открытой крышке, после чего на него наносят каплю изучаемого
материала. Через несколько минут, когда жидкость впитается, чашки помещают в
термостат на 18-20 ч. Если в изучаемом материале есть фаг, произойдет лизис
культуры и на месте, куда была нанесена капля, культура или совсем не вырастет
(сплошной лизис) или образуются отдельные колонии фага.

Обнаружение фага в жидких средах. В две пробирки с одинаковым

количеством бульона вносят по одной капле культуры, микроба, в отношении
которого изучают фаг. В одну из них добавляют исследуемый фаг или фильтрат
материала, в котором его определяют. Вторая пробирка служит контролем роста
культуры. Пробирки помещают в термостат на 12-20 ч. Учет результатов
производят только при наличии роста культуры в контроле (помутнение среды).
Отсутствие видимого роста или последующее просветление среды в пробирке с
исследуемым материалом свидетельствует о присутствии фага. Если содержимое
этой пробирки мутное, исследование необходимо дополнить посевом на плотную
среду: помутнение могло произойти от роста устойчивой к фагу культуры. Только в
том случае, если в посеве на агар фаг не будет обнаружен, можно сделать вывод,
что его нет в изучаемом материале.

Количественные методы

Количественные методы имеют большое значение при проведении многих

исследований, в том числе и фага. Врачу нужно знать активность фага, чтобы
правильно установить его дозу при лечебно-профилактическом применении,
исследователю - чтобы выяснить, как изменяется активность фага в эксперименте.

Активность фага выражают понятием титр, различая титр фага в жидкой и на

плотной среде.
 При исследовании в жидкой среде (по Аппельману) титр фага - это наибольшее
его разведение (или наименьшее количество), которое подавляет рост тест-
культуры в условиях данного опыта.

На плотной среде (титрование по Грациа) титр фага - количество частиц

(корпускул) фага в 1 мл исходного материала.

Титрование фага по Аппельману (в жидкой среде). При титровании фага

объем и состав среды, температура, аэрация, количество микробов, пробирки, в
которых проводят титрование (диаметр, конфигурация дна, толщина стекла),
должны быть одинаковыми. Изменяется только количество фага.

Все компоненты, участвующие в биологических опытах, подлежат

обязательному контролю на правильность их работы.

При титровании фага ставят контроль фага и бульона на стерильность, контроль

культуры - на ее жизнеспособность.

Постановка опыта. 1. В 12 стерильных пробирок наливают по 4,5 мл стерильного

бульона. Уровень жидкости во всех пробирках должен быть одинаковым. Если это
не так, значит допущена ошибка. В этом случае нестандартную пробирку заменяют
новой и заново наполняют бульоном. При разливе бульона пользуются пипетками
вместимостью 5-10 мл.

2. Пробирки ставят в штатив и нумеруют от 1 до 10, на одной из оставшихся

пробирок пишут "КК" (контроль культуры), на другой - "КФ" (контроль фага). Все
пробирки, в которых проводят опыт, должны быть надписаны.

3. В десяти пробирках готовят последовательные десятикратные разведения фага

от 10-1 до 10-10 (табл. 9). В 1-ю пробирку вносят 0,5 мл фага. Такое же количество
вносят в пробирку контроля фага. Сменив пипетку, новой пипеткой тщательно
перемешивают содержимое 1-й пробирки и переносят 0,5 мл его во 2-ю пробирку;
0,5 мл содержимого 2-й пробирки переносят в 3-ю и так далее до 10-й пробирки,
меняя каждый раз пипетки. Перемешав содержимое 10-й пробирки, 0,5 мл
жидкости из нее выливают в дезинфицирующий раствор. Также поступают с
содержимым пробирки контроля фага. Для разведения фага пользуются пипетками
вместимостью 1-2 мл. Проверяют уровень жидкости в пробирках. Он должен быть
одинаковым.
 Таблица 9. Схема титрования фага по Аппельману

Условные обозначения: + рост культуры, - отсутствие роста культуры.

Примечание. Стрелки указывают перенос фага из пробирки в пробирку. Из

пробирки 10 и из пробирки контроля фага 0,5 мл выливают в дезинфецирующий
раствор.

4. Во все пробирки, кроме пробирки контроля фага, вносят по 1 капле (0,05 мл)
взвеси тест-культуры. Пробирки встряхивают. Во всех пробирках, кроме пробирки
контроля фага, должна появиться слегка заметная муть. Если этого не происходит,
все операции с нестандартной пробиркой повторяют вновь.

5. Пробирки помещают в термостат на 18-20 ч, после чего учитывают результат

титрования. Учет результатов обязательно начинают с контролей.

При правильной постановке опыта в контроле культуры должно быть

размножение бактерий - содержимое пробирки становится мутным. Этот контроль
позволяет сделать вывод, что взятая в опыт культура жизнеспособна и что
питательная среда обеспечивает ее развитие в данных условиях опыта. Значит, если
в пробирках с фагом культура не выросла, на нее подействовал фаг.

Жидкость в пробирке с контролем фага должна остаться прозрачной. Этот

контроль позволяет сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны.

При правильных результатах в контролях регистрируют характер изменений в

первых десяти пробирках. Рост культуры в пробирках "опытного" ряда говорит об
отсутствии или недостаточном количестве в них фага. Устанавливают титр фага, т.
е. его наибольшее разведение, в котором произошел лизис культуры (содержимое
пробирки прозрачно). Обозначают титр степенью разведения фага с обратным
знаком, что соответствует порядковому номеру пробирки. Например, если культура
не растет в первых семи пробирках, титр фага равен 10 -7 (см. табл. 9).
 Титрование фага по Грация (на плотной среде) методом агаровых
слоев позволяет определить количество частиц фага в титруемом материале. Метод
основан на том, что каждая частица фага дает зону просветления (лизиса) на чашке
с газоном чувствительного к нему микроба, т. е. образует отдельную колонию.

Постановка опыта. Чашки с 20-25 мл МПА покрывают стерильной

фильтровальной бумагой и подсушивают в термостате или под бактерицидной
лампой (расстояние от лампы не более 2 м). Титруемый фаг разводят от 10 -1 до 10-
10
(как в предыдущем опыте) и по 1 мл переносят в другие пронумерованные
пробирки (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й), в которые заранее
наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45° С. В каждую
из этих пробирок добавляют по 0,1 мл тест-культуры. Содержимое пробирок
быстро перемешивают (не дать застыть агару) и выливают на поверхность среды в
чашки Петри с номерами, соответствующими номерам пробирок. Через 30 мин
чашки ставят в термостат.

Учет результатов проводят через 18-20 ч. При большой концентрации фага (в

первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях фага, в
которых находилось небольшое количество частиц фага, появятся изолированные
колонии, которые подсчитывают. Чтобы не ошибиться в счете, каждую учтенную
колонию помечают со стороны дна чашки. Аппарат для счета колоний намного
облегчает работу (см. рис. 54). Чтобы установить количество частиц фага в 1 мл
фаголизата, пользуются формулой: n = y×x, где n - искомое число; y - количество
выросших на чашке колоний фага; x - разведение фага в чашке, в которой
подсчитаны колонии.

Например, если в чашке с разведением фага 10 -8 (1:108) выросло 25 колоний, то в

1 мл исходной жидкости содержится 25×108 или 2,5×109частиц фага.

Более точные результаты получают, если определяют количество частиц фага в

исходной жидкости по нескольким разведениям и вычисляют среднее
арифметическое. Например, при разведении фага 10 -6 выросло 320 колоний,
следовательно, в 1 мл исходной жидкости было 320×10 или 3,2×10 8 частиц фага.
При разведении фага 10-7 выросло 42 колонии, следовательно, в исходной жидкости
было 4,2×108/мл частиц фага. При разведении фага 10 -8 выросло 5 колоний,
следовательно, в исходной жидкости было 5×10 8/мл частиц фага. Сложив величины,
полученные при этих подсчетах и разделив сумму на 3 (количество проведенных
подсчетов), устанавливают число частиц фага в 1 мл титруемого препарата. В
нашем примере оно равно 4,1×108.

Подсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и не

больше 50 колоний. В противном случае страдает точность подсчёта. Если на чашке
много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии
на одном из них и полученную цифру умножить на количество секторов.

Как правило, все биологические исследования проводят в трех параллельных

опытах. В данном примере каждое разведение фага одновременно титруют трижды.
 Методы выделения фагов
Прямой метод. Фаг получают и изучают непосредственно в фильтратах
исследуемого материала. О наличии и активности фага узнают по лизису
чувствительной к нему культуры.

Как правило, прямой метод не дает убедительных результатов из-за малого

количества содержащегося в фильтрате фага. Для повышения его количества
используют методы обогащения.

Метод обогащения. Подготовленный фильтрат вносят в 2-3-часовую бульонную

культуру соответствующих микроорганизмов. Посев инкубируют в термостате. Фаг
размножается в клетках культуры и титр его значительно увеличивается. После
этого бульон фильтруют и в фильтрате определяют свойства и активность фага.

Практическое применение фагов

Применение фагов основано на их строгой специфичности и способности
разрушать микробные клетки или вступать с ними в симбиоз.

Фагопрофилактика и фаготерапия - предупреждение и лечение инфекций с

помощью фагов основаны на том, что, встречая в организме больного возбудителя
болезни, фаг уничтожает его. В настоящее время фаги широко применяют при
лечении и профилактике стафилококковых и стрептококковых поражений, даже
таких, которые не поддаются действию антибиотиков, а также холеры, чумы и ряда
других инфекций, например инфекций, вызванных кишечной палочкой и протеем.

Фагодиагностика включает: а) идентификацию выделенных культур с помощью

известных (диагностических) фагов. Культура соответствует тому фагу, который ее
лизировал. Например, если лизис вызвал холерный фаг, то это культура холерного
вибриона. Строгая специфичность типовых фагов дает возможность типировать
варианты внутри вида (фаговары). Фаготипирование имеет большое значение в
эпидемиологии, так как позволяет установить источник инфекции и решить ряд
других вопросов (см. с. 243, 292); б) определение неизвестного фага по тест-
культуре микробов. Если фаг лизирует культуру возбудителя дизентерии, то это
дизентерийный фаг; в) ускоренный метод диагностики с помощью реакции
нарастания титра фага РНТФ не требует выделения чистой культуры возбудителя.
Исследуемый материал (от больного или из объектов внешней среды) и
индикаторный фаг, титр которого строго установлен, вносят в бульон. После
инкубации в термостате определяют титр фага по Грациа. Увеличение титра (числа
корпускул фага) в 5 раз и более говорит о том, что в исследуемом материале есть
соответствующие возбудители, в которых фаг размножился.

Умеренные фаги широко применяют при решении кардинальных вопросов

биологии. С их помощью изучен генетический код, достигнуты большие успехи в
генной инженерии, их используют для изучения опухолевого роста, как фактор
изменчивости микроорганизмов и в других исследованиях. Так как лизогенные
культуры в отличие от "здоровых" чувствительны к радиации, они служат для
определения надежности защиты космических кораблей от космических лучей: при
ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру.
 Препараты фагов
При производственном получении препаратов фага пользуются хорошо
изученными штаммами микроорганизмов и фагов, которые обычно выращивают в
реакторах, что позволяет получать большие количества фаголизата.

Фаги выпускают в жидком виде (ампулы и флаконы), в таблетках и свечах.

Таблетки фагов, предназначенные для применения через рот, покрыты
кислотоустойчивой оболочкой, защищающей фаги от действия соляной кислоты
желудочного сока.

Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие

посторонней флоры, безвредность и активность (титр), который осуществляется на
выпускающем их производстве. Выборочный контроль производят в
Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических
препаратов им. Л. А. Тарасевича. Выпускаемый фаг снабжен этикеткой, на которой
указано: учреждение, его выпускающее, название фага, серия, номер контроля и
срок годности. Каждая упаковка снабжена наставлением по применению и
хранению фага.

Контрольные вопросы
1. Какие свойства фага лежат в основе его получения и использования?

2. Почему титровать фаг необходимо в стерильных условиях?

3. С каких пробирок начинают учет опыта титрования фага по Аппельману?

Задание
1. Изучите и опишите характер действия фага на культуры микроорганизмов,
выращенные на жидкой и плотной среде (культуры получите у преподавателя).

2. Проведите титрование фага по Аппельману и запишите его результаты.

3. Подсчитайте колонии фага на чашке (метод Грациа). Зная разведение фага,

определите количество корпускул фага в 1 мл исходного препарата.

4. Изучите различные препараты фага.

Глава 9. Антибиотики. Химиопрофилактика и

химиотерапия
Общая характеристика - Н. А. Бельская
Антибиотики (от греч. anti - против, bios - жизнь) - продукты жизнедеятельности
живых организмов, способные избирательно убивать микроорганизмы или
подавлять их рост.

Выработка антибиотиков микроорганизмами является одним из важнейших

проявлений микробного антагонизма (от греч. antagonizomai - борюсь, соперничаю).
Наибольшее число микроорганизмов, обладающих антагонистическими
свойствами, встречается в почве, особенно среди грибов, актиномицетов,
спороносных бактерий. Антагонисты выявляются и в водоемах (реки, озера), а
также среди представителей нормальной микрофлоры человека и животных.
Например, кишечная палочка, бифидум-бактерии, лактобациллы в кишечнике
людей (см. главу 6). Первые попытки практического использования микробного
антагонизма принадлежат Л. Пастеру и И. И. Мечникову.

Л. Пастер в 1877 г. установил, что гнилостные бактерии подавляют рост

сибиреязвенных бацилл при совместном выращивании их на питательной среде. В
результате своих наблюдений Пастер высказал предположение о возможности
использовать явление антагонизма бактерий для лечения инфекционных
заболеваний.

И. И. Мечников (1894), изучая роль гнилостных бактерий кишечника, установил,

что они систематически отравляют организм продуктами своей жизнедеятельности
и это способствует преждевременному старению людей. Он обнаружил также, что
молочно-кислые бактерии (болгарская палочка), находящиеся в простокваше,
подавляют развитие гнилостных бактерий кишечника и предложил использовать
антагонистические отношения микроорганизмов как один из методов борьбы со
старостью.

Русские ученые В. А. Манассейн и А. Г. Полотебнов (1871-1872) за много лет до

открытия антибиотиков применяли зеленую плесень пенициллиум для лечения
гнойных ран и других поражений кожи.

Идея использовать один вид микроорганизмов в борьбе против другого

(антагонизм) принесла существенные плоды. Из синегнойной палочки был получен
первый антибиотик - пиоционаза (Р. Эммерих, О. Лев), но он не нашел широкого
применения.

Начало учения об антибиотиках положено в 1929 г., когда английский ученый А.

Флеминг обнаружил на чашках с посевами золотистого стафилококка лизис
колоний вблизи случайно выросшей плесени Penicillium notatum. Флеминг
установил, что фильтрат бульонной культуры плесени убивает не только
стафилококки, но и другие микроорганизмы. В течение 10 лет Флеминг пытался
получить пенициллин в химически чистом виде. Однако это ему не удалось.
Очищенный препарат пенициллина, пригодный для клинического использования,
получили английские исследователи Э. Чейн и Г. Флори в 1940 г.

Советский микробиолог З. В. Ермольева применила для получения пенициллина

другой вид плесени - Penicillium crustosum (1942) и явилась одним из организаторов
производства пенициллина во время Великой Отечественной войны.

Открытие пенициллина и успешное применение его для лечения гнойно-

воспалительных процессов и ряда других инфекционных болезней побудило
ученых к поиску новых антибиотиков, оказывающих губительное действие на
различные микроорганизмы. В настоящее время получено свыше 2000 различных
антибиотиков. Однако в клинической практике используются далеко не все, так как
одни оказались токсичными, другие - неактивными в условиях организма человека.
 Источником получения антибиотиков служат разнообразные микроорганизмы,
обладающие антимикробной активностью. Антибиотики выделяют из плесневых
грибов (пенициллин и др.), актиномицетов (стрептомицин, тетрациклин и др.),
бактерий (грамицидин, полимиксины); вещества, обладающие антибиотическим
действием, получают также из высших растений (фитонциды лука, чеснока) и
тканей животных (лизоцим, экмолин, интерферон).

Антибиотики могут оказывать на микроорганизмы бактериостатическое и

бактерицидное действие. Бактерицидное действие антибиотиков вызывает гибель
микроорганизмов, а бактериостатическое - подавляет или задерживает их
размножение. Характер действия зависит как от антибиотика, так и от его
концентрации.

Классификация антибиотиков может быть основана на различных принципах: по

источнику получения, химическому строению, механизму и спектру
антимикробного действия, способу получения. Чаще всего классифицируют
антибиотики по спектру антимикробного действия и источникам получения.

Механизм антимикробного действия антибиотиков разнообразен: одни

нарушают синтез клеточной стенки бактерий (пенициллин, цефалоспорины), другие
тормозят процессы синтеза белка в клетке (стрептомицин, тетрациклин,
левомицетин), третьи угнетают синтез нуклеиновых кислот в бактериальных
клетках (рифампицин и др.).

Для каждого антибиотика характерен спектр действия, т. е. препарат может

оказывать губительное действие на определенные виды микроорганизмов.
Антибиотики широкого спектра активны в отношении различных групп
микроорганизмов (тетрациклины) или угнетают размножение многих
грамположительных и грамотрицательных бактерий (стрептомицин и др.). Ряд
антибиотиков действует в отношении более узкого круга микроорганизмов,
например к полимиксину чувствительны преимущественно грамотрицательные
бактерии.

По спектру действия антибиотики разделяют на антибактериальные,

противогрибковые и противоопухолевые.

Антибактериальные антибиотики угнетают развитие бактерий и составляют

наиболее обширную группу препаратов, различных по химическому составу. Для
лечения инфекционных болезней, вызываемых бактериями, чаще используют
антибиотики широкого спектра действия: тетрациклины, левомицетин,
стрептомицин, гентамицин, канамицин, полусинтетические пенициллины и
цефалоспорины и другие препараты.

Противогрибковые антибиотики (нистатин, леворин, амфотерицин В,

гризеофульвин) оказывают угнетающее действие на рост микроскопических грибов,
так как нарушают целостность цитоплазматической мембраны микробных клеток.
Применяются для лечения грибковых заболеваний.

Противоопухолевые антибиотики (рубомицин, брунеомицин, оливомицин)

угнетают синтез нуклеиновых кислот в животных клетках и используются для
лечения различных форм злокачественных новообразований.
 Биологическую активность антибиотиков измеряют в международных
единицах действия (ЕД). За единицу активности антибиотика принимают
наименьшее количество препарата, которое оказывает антимикробное действие на
чувствительные к нему тест-бактерии (например, для пенициллина - золотистый
стафилококк, стрептомицина - кишечная палочка и т. п.). В настоящее время
единицы активности антибиотиков выражают в микрограммах * чистого препарата.
Так, за единицу активности пенициллина принимают 0,6 мкг, а для большей части
антибиотиков 1 ЕД соответствует 1 мкг (стрептомицин и др.).
*
(1 мкг - 10-6 г.)

В нашей стране создана мощная промышленность по производству

антибиотиков. Природные антибиотики получают биосинтетическим путем:
штаммы-продуценты грибов, актиномицетов, бактерий выращивают в жидкой
питательной среде соответствующего состава, при определенном значении рН,
оптимальной температуре и аэрации. Антибиотические вещества являются
конечными продуктами метаболизма микроорганизмов и продуцируются клетками
в питательную среду, откуда их извлекают химическими методами.

Изучение химической структуры антибиотиков позволило получать

синтетические препараты методом химического синтеза (левомицетин).

Большим достижением является разработка методов получения

полусинтетических антибиотиков, основанных на изменении химической
структуры природного препарата. В результате этого удалось расширить спектр
антимикробного действия, устранить некоторые недостатки природных
антибиотиков. В последние годы в клинической практике широко применяют
полусинтетические пенициллины, цефалоспорины, тетрациклины, рифампицин и
другие препараты.

Антибиотикотерапия иногда может сопровождаться осложнениями со стороны

макроорганизма, а также вызывать изменения различных свойств микроорганизмов.

Возможные осложнения при антибиотикотерапии. Некоторые антибиотики

(пенициллин, стрептомицин и др.), введенные в организм больного, вызывают
состояние повышенной чувствительности (аллергия), нарастающее по мере
применения препарата. Аллергические реакции развиваются в виде сыпи-
крапивницы, отеков век, губ, носа, дерматитов. Наиболее грозным осложнением
является анафилактический шок (см. главу 13), от которого может наступить смерть
больного*.
*
(Чем лучше очищен антибиотик от балластных веществ, тем он реже и в меньшей степени вызывает
выраженные аллергические акции.)

Внимание! Прежде чем применять антибиотик парентерально, необходимо

выявить отсутствие повышенной чувствительности к нему организма больного. Это
определяют с помощью внутрикожной пробы с данным препаратом: в кожу
внутренней стороны предплечья вводят 0,1 мл антибиотика и наблюдают в течение
20-30 мин. Если реакция положительная (диаметр папулы более 1 см и большая
зона красноты), то антибиотик вводить нельзя.
 Введение в организм больших доз антибиотиков широкого спектра действия, как
правило, сопровождается и гибелью представителей нормальной микрофлоры
дыхательных путей, кишечника и других органов. Это приводит к изменению
обычных антагонистических отношений между микроорганизмами в естественных
условиях. В результате этого условно-патогенные бактерии (стафилококки, протей)
и грибы рода Candida, устойчивые к этим антибиотиком, могут активизироваться и
вызывать вторичные инфекции. Так возникают грибковые поражения - кандидозы
кожи, слизистых оболочек, внутренних органов; дисбактериозы (нарушения
нормального состава микрофлоры).

Для предотвращения развития кандидамикозов антибиотики вводят с

противогрибковыми препаратами, например нистатином и др. Применение
препаратов, приготовленных из представителей нормальной микрофлоры
(колибактерин, бифидумбактерин, бификол) после приема антибиотиков,
предупреждает развитие дисбактериоза.

Длительное лечение и применение антибиотиков может оказывать токсическое

действие на организм больного: тетрациклины могут вызвать поражение печени,
левомицетин - органов кроветворения, стрептомицин в ряде случаев поражает
вестибулярный и слуховой анализаторы, цефалоспорины способны нарушать
функции почек (нефротоксичность). Многие антибиотики часто вызывают
гиповитаминоз и раздражение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Антибиотики могут оказывать вредное действие на развитие плода, особенно у

женщин, употреблявших антибиотики в первый период беременности. Прямое
влияние на организм плода оказывают антибиотики группы тетрациклина.

Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам. Часто при лечении

антибиотиками происходит превращение чувствительных к антибиотику
микроорганизмов в устойчивые (резистентные) формы. Приобретенная
устойчивость бактерий к антибиотику передается по наследству новым популяциям
бактериальных клеток.

Механизм образования устойчивости разнообразен (см. главу 10). В большинстве

случаев резистентность связана со способностью бактерий синтезировать
ферменты, разрушающие определенные антибиотические вещества. Например,
устойчивость стафилококков к пенициллину объясняется их способностью
вырабатывать фермент пенициллиназу, разрушающий антибиотик. В то же время
для кишечной палочки, протея и других бактерий семейства кишечных
пенициллиназа является конститутивным (постоянным) ферментом и определяет их
естественную резистентность к пенициллину.

У некоторых бактерий обнаружена множественная лекарственная устойчивость,

т. е. бактериальная клетка может обладать резистентностью к нескольким
антибиотикам. Особенно выражена резистентность к пенициллину и
стрептомицину, которые первыми стали использовать в клинической практике.

Эффективность антибиотикотерапии определяется главным образом степенью

чувствительности бактерий к применяемому препарату. Поэтому проверяют
чувствительность культур микроорганизмов, выделенных от больных, к различным
антибиотикам, которые используют для лечения.
 В процессе действия антибиотиков возможно изменение морфологических,
культуральных, биологических свойств бактерий; могут образовываться L-формы
(см. главу 3).

Антибиотики, выделенные из грибов. Из некоторых штаммов грибов рода

Penicillium (Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum) получен пенициллин.

Пенициллин - высокоактивен в отношении патогенных кокков:

грамположительных стафилококков, стрептококков, пневмококков;
грамотрицательных - менинго- и гонококков. Его используют для лечения
сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены, сифилиса и других заболеваний.
Вводится пенициллин парентерально. Препарат нельзя применять перорально, так
как он теряет свою активность в кислой и щелочной средах и разрушается в
желудочно-кишечном тракте.

Уже в самом начале применения пенициллина было замечено, что он быстро

выводится из организма, и для поддержания необходимой для терапевтического
эффекта концентрации пенициллина в крови его вводят каждые 3-4 ч.

В дальнейшем были созданы препараты пенициллина, обладающие

пролонгированным (продленным) действием. К ним относят экмоновоциллин,
бициллин-1, бициллин-3, бициллин-5. Бициллин-1, 3, 5 - антибиотики, которые с
успехом используются для лечения ревматизма и сифилиса.

В настоящее время получены полусинтетические пенициллины: метициллин,

оксациллин, клоксациллин, которые не разрушаются пенициллиназой и
применяются для лечения инфекций, вызванных устойчивыми к пенициллину
стафилококками; ампициллин активен не только в отношении грамположительных,
но и грамотрицательных бактерий (возбудителей брюшного тифа, дизентерии и
др.). Оксациллин и ампициллин устойчивы к кислой среде желудка, что позволяет
применять их перорально.

Грибами рода Cephalosporium продуцируется антибиотик цефалоспорин. Его

полусинтетические производные, из которых наибольшее применение нашли
цепорин (цефалоридин) и цефомезин, малотоксичны, обладают широким спектром
действия, не разрушаются пенициллиназой, не дают аллергических реакций у лиц,
чувствительных к пенициллину, и широко используются для лечения многих
инфекционных болезней.

Антибиотики, образуемые актиномицетами. Впервые антагонистическое

действие лучистых грибов (актиномицетов) установил Н. А. Красильников (1939).
Из Actinomyces globisporus американским ученым А. Ваксманом (1943) был
выделен стрептомицин. Открытие стрептомицина ознаменовало новую эпоху в
борьбе с туберкулезом, так как к препарату оказались чувствительны микобактерии
туберкулеза. Стрептомицин оказывает губительное действие на многие
грамположительные и грамотрицательные бактерии и применяется для лечения
чумы, туляремии, бруцеллеза и др. Вводится антибиотик парентерально.

Бактерии быстро приобретают устойчивость к стрептомицину. Некоторые

микроорганизмы образуют стрептомицинозависимые формы, которые могут
размножаться на питательных средах лишь при добавлении антибиотика.
 Актиномицеты являются продуцентами природных антибиотиков группы
тетрациклина (тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин). Все препараты
обладают широким спектром действия, подавляют размножение многих видов
грамположительных и грамотрицательных бактерий, риккетсий, некоторых
простейших (дизентерийная амеба). Тетрациклин быстро всасывается из
желудочно-кишечного тракта, его назначают с нистатином для профилактики
кандидозов.

За последние годы широкое применение нашли полусинтетические производные

окситетрациклина (метациклин, доксициклин и др.), которые оказались более
эффективными по сравнению с природными препаратами.

Левомицетин - синтетический препарат, идентичный природному

хлорамфениколу, выделенному из культуральной жидкости Streptomyces
venezuelae. Антимикробный спектр левомицетина включает многие
грамположительные и грамотрицательные бактерии, риккетсий, спирохеты.
Наиболее часто левомицетин используется для лечения кишечных инфекций -
брюшного тифа, паратифов, дизентерии, а также различных риккетсиозов - сыпного
тифа и других заболеваний.

Из актиномицетов получены антибиотики: эритромицин, олеандомицин,

канамицин, рифампицин, линкомицин и др. Эти препараты относят к антибиотикам
"резерва" и применяют их для лечения заболеваний, вызванных бактериями,
резистентными к другим антибиотикам.

Антибиотики, продуцируемые бактериями. Наибольшее практическое

значение имеют полимиксины и грамицидин С.

Полимиксины объединяют группу родственных антибиотиков, продуцируемых

спорообразующими почвенными бациллами - В. polimixa. Полимиксины В, М и Е
активны в основном в отношении грамотрицательных бактерий (энтеробактерии,
синегнойная палочка и др.).

Грамицидин С выделен советскими учеными Г. М. Гаузе и М. Г. Бражниковой

(1942) из различных штаммов почвенных бацилл - B. brevis. К нему чувствительны
грамполбжительные бактерии. Грамицидин С может вызывать гемолиз
эритроцитов, поэтому применяется только местно для лечения нагноительных
процессов.

Антибиотические вещества, полученные из высших растений. Советский

исследователь Т. П. Токин (1928) обнаружил, что многие высшие растения
образуют летучие вещества, обладающие антимикробным действием (фитонциды).
Они защищают растения от болезнетворных микроорганизмов. Фитонциды -
летучие эфирные масла, которые чрезвычайно нестойки, вследствие чего получать
препараты фитонцидов в чистом виде очень сложно.

Фитонциды выделены из сока лука, чеснока, листьев эвкалипта и лишайника,

травы зверобоя. Обнаружены они также в соке хрена, редиса, алоэ и других
растений. Применение фитонцидов в медицинской практике ограничено, так как не
удается получить хорошо очищенные, стойкие и малотоксичные препараты.
 Антимикробные вещества, выделенные из тканей животных. Лизоцим был
впервые обнаружен русским ученым Н. П. Лащенковым (1909) в белке куриного
яйца. Позднее лизоцим выявили в молоке, слезной жидкости, слюне и тканях
различных органов (почках, селезенке, печени); установили, что он как
естественный защитный фактор организма оказывает бактериолитическое
(растворяющее бактерий) действие на многие патогенные и сапрофитные
микроорганизмы. Его используют для лечения глазных и кожных болезней.

Экмолин был выделен З. В. Ермольевой из тканей рыб. Применяется он в

сочетании с пенициллином (экмоновоциллин), так как усиливает и продлевает его
действие в организме.

Особый интерес представляет интерферон, образующийся в клетках организма

под действием вирусов и являющийся фактором естественной защиты клетки от
размножения вирусов. Интерферон, открытый Айзексом и Линдеманом (1957),
обладает широким антивирусным спектром. Изучение механизма действия
интерферона показало, что он препятствует синтезу нуклеиновых кислот многих
вирусов и вызывает их гибель. Интерферону присуща видовая специфичность:
человеческий интерферон не влияет на вирусы в организме животных.

Выделяют интерферон из лейкоцитов человека и обозначают его Иф-α.

Применяют для профилактики и лечения гриппа и других вирусных респираторных
заболеваний. В последние годы появились сообщения об эффективном действии
интерферона при некоторых злокачественных новообразованиях.

Контрольные вопросы
1. Что представляют собой антибиотики?

2. Какое явление лежит в основе действия антибиотиков?

3. Каковы источники получения антибиотиков?

4. Как различаются антибиотики по механизму антимикробного действия?

5. Каков характер действия антибиотиков?

6. Что называют антимикробным спектром антибиотиков?

7. Какие возможны осложнения со стороны макроорганизма при

антибиотикотерапии?

8. Какие свойства могут изменяться у микроорганизмов под влиянием

антибиотиков?

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам -

Н. А. Бельская
(Согласно Приказу Министерства здравоохранения СССР № 250 от 13.03.75 г. "Об унификации методов
определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам".)
 В клинической практике чувствительными к антибиотикам считают те
микроорганизмы, на которые антибиотики оказывают бактериостатическое или
бактерицидное действие.

При любом лабораторном исследовании критерием чувствительности

микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация
антибиотика, ингибирующая (задерживающая) рост возбудителя заболевания при
стандартных условиях постановки опыта.

Для определения лекарственной чувствительности оптимальным является

использование чистой культуры возбудителя. Выделять культуры микробов из
организма для исследования на чувствительность следует до начала лечения
антибиотиками, так как под их воздействием рост возбудителя заболевания может
быть полностью угнетен. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам
определяют методом диффузии в агар с применением стандартных дисков или
методом серийных разведений в жидких и плотных питательных средах.

Методы определения

Метод дисков. Взвесь изучаемой культуры засевают "газоном" (см. главу 7). В
качестве посевного материала можно использовать суточную бульонную культуру
или 1 миллиардную микробную взвесь, приготовленную по оптическому стандарту
мутности № 10 (см. ниже). Засеянные чашки подсушивают 30-40 мин при
комнатной температуре. Затем на поверхность засеянного агара пинцетом
накладывают бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков.
Каждый диск слегка прижимают браншами пинцета, чтобы он плотно прилегал к
поверхности агара. Диски накладывают на равном расстоянии друг от друга и на
расстоянии 2 см от края чашки. Одну чашку можно использовать для изучения
чувствительности одного штамма к 4-5 антибиотикам.

Засеянные чашки с нанесенными на них дисками помещают в термостат при 37°

С на 18-24 ч. Чашки ставят вверх дном, чтобы избежать попадания
конденсационной воды на поверхность посевов.

Учет результатов. Действие антибиотиков оценивают по феномену задержки

роста вокруг диска (рис. 25). Диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков
определяют с помощью линейки, включая диаметр самого диска. Между степенью
чувствительности микроба к антибиотикам и величиной зоны отсутствия роста
имеются следующие соотношения (табл. 10).
Рис. 25. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам (метод дисков)

Таблица 10. Определение степени чувствительности микроорганизмов к

антибиотикам по величине зоны отсутствия роста

В ответе указывают, какой чувствительностью обладает исследуемый штамм, а

не размер зоны задержки роста.

В ряде случаев определяют чувствительность микроорганизмов к антибиотикам в

нативном материале (гной, раневое отделяемое и др.). При этом материал наносят
на поверхность питательного агара и равномерно растирают по поверхности
стерильным стеклянным шпателем*, а потом накладывают диски. Метод дисков для
определения чувствительности микроорганизмов вследствие простоты и
доступности широко применяют в практических лабораториях и расценивают как
качественный метод.
*
(Для тех видов микроорганизмов, которые не растут на мясопептонном агаре, как, например,
стрептококки, пневмококки и другие, применяют агар с кровью или сывороткой.)

Метод серийных разведений в жидкой питательной среде. Этот метод

является точным количественным методом, его применяют в научной работе и в
особо важных случаях в лабораториях больниц и профилактических учреждений.

Для постановки опыта необходимо иметь чистую культуру испытуемого

микроорганизма, основной раствор антибиотика, мясопептонный бульон на
переваре Хоттингера, содержащий 1,2-1,4 г/л аминного азота.

Активность антибиотиков выражают в ЕД/мл или мкг/мл. Для приготовления

основного раствора антибиотика используют антибиотики, имеющиеся в продаже с
указанием количества их во флаконе.
 Если на этикетке вместо количества единиц во флаконе дозировка указана в
единицах массы, то следует иметь в виду, что 1 г активности для большей части
антибиотиков соответствует 1 млн. ЕД. Из этого раствора и должны быть
приготовлены требуемые разведения антибиотиков. Указания для приготовления
основного раствора антибиотиков на примере пенициллина приведены в табл. 11.

Таблица 11. Получение основного раствора пенициллина

Готовят взвесь культуры микроорганизмов, выросшей на плотной питательной

среде. Полученную взвесь сравнивают с оптическим стандартом мутности № 10
(см. ниже), а затем разводят стерильным изотоническим раствором натрия хлорида
до 106микробных тел в 1 мл. Для получения соответствующего разведения
микробной взвеси готовят ряд последовательных десятикратных разведений (см.
ниже).

Постановка опыта. В 12 стерильных пробирок разливают по 1 мл жидкой

питательной среды. В 1-ю пробирку вносят 1 мл основного раствора антибиотика,
содержащего, например, 32 ЕД в 1 мл. Содержимое 1-й пробирки перемешивают и
1 мл переносят во 2-ю пробирку, из 2-й - в 3-ю, из 3-й - в 4-ю и так до 10-й, из
которой 1 мл удаляют. Таким образом, 1-я пробирка будет содержать 16 ЕД, 2-я - 8
ЕД, 3-я - 4 ЕД и т. д. Для приготовления каждого разведения используют отдельную
пипетку. Содержимое 11-й пробирки служит контролем роста бактерий, а 12-й -
контролем стерильности питательной среды. Во все пробирки, кроме 12-й, вносят
0,1 мл испытуемой культуры определенной густоты. Посев инкубируют в
термостате в течение 18-24 ч и регистрируют результаты опыта.

Учет результатов проводят при наличии роста в контроле культуры и отсутствии

роста в контроле среды. Затем отмечают последнюю пробирку с полной видимой
задержкой роста микробов. Количество антибиотика в этой пробирке является
минимальной ингибирующей концентрацией для испытуемого штамма и
определяет степень его чувствительности к данному антибиотику. В ответе,
выдаваемом лабораторией, указывают минимальную ингибирующую
концентрацию.

Метод серийных разведений на плотной питательной среде. Готовят

двукратные разведения антибиотика, как и при методе серийных разведений в
жидкой питательной среде. Затем берут 1 часть каждого разведения антибиотика и
9 частей питательного агара, расплавленного и охлажденного до 42° С (из расчета 1
мл антибиотика + 9 мл МПА), хорошо перемешивают и наливают в чашки Петри.
 Густоту (концентрацию) культуры определяют по оптическому стандарту
мутности № 10 и разводят стерильным изотоническим раствором до 10 7 микробных
тел в 1 мл. Бактериальной петлей наносят испытуемые культуры на поверхность
питательного агара с антибиотиком. На одну чашку делают посев 20-25 штаммов.
Засеянные чашки ставят в термостат при 37° С на 16-20 ч для большинства видов
микроорганизмов. Чашка с питательным агаром без антибиотика, на которую
наносят испытуемые культуры, является контрольной.

Учет результатов проводят при наличии роста в контрольной чашке, а

минимальную ингибирующую концентрацию антибиотика определяют по
последней чашке Петри, где отмечают полную задержку роста бактерий.

Метод дорожки по Флемингу. Метод применяют для определения спектра

действия антибиотика. В чашке Петри с МПА стерильным скальпелем вырезают
дорожку шириной 1 см и удаляют ее. Затем в пробирку с растопленным и
охлажденным до 42-45° С мясопептонным агаром вносят определенную
концентрацию раствора антибиотика. Содержимое пробирки перемешивают и
выливают в дорожку так, чтобы жидкость не выходила за ее пределы. После
застывания агара перпендикулярно к дорожке засевают петлей культуры
нескольких исследуемых микроорганизмов. Посевы помещают в термостат на 18-24
ч.

Учет результатов. Чувствительные к препарату культуры начинают расти лишь

на некотором расстоянии от дорожки, нечувствительные растут до самого края.

Методика работы с оптическим стандартом мутности

Для определения количества микробных тел в 1 мл используют оптические

стандарты мутности. Их изготовляет Государственный НИИ стандартизации и
контроля медицинских биологических препаратов МЗ СССР им. Л. А. Тарасевича
(ГИСК). Существуют следующие стандарты мутности:

0,5 млрд. микробов в 1 мл - № 5 (5 ед. мутности)

0,9 " " " 1 " - № 9 (9 " " )
1 " " " 1 " - № 10 (10 " " )
1,1 " " " 1 " - № 11 (11 " " )

Перед определением количества микробных тел в 1 мл сначала получают

микробную взвесь. Для этого в пробирку с выросшей на скошенном агаре
культурой наливают 5-6 мл изотонического раствора натрия хлорида и, вращая
пробирку между ладонями, смывают культуру с поверхности среды. Часть
полученной взвеси переносят стерильной пипеткой в стерильную пробирку,
толщина стенки и диаметр которой соответствует пробирке оптического стандарта.
Затем сравнивают густоту полученной микробной взвеси с одним из оптических
стандартов мутности. В случае необходимости микробную взвесь разводят,
прибавляя изотонический раствор натрия хлорида до нужной мутности. Если
мутность полученной микробной взвеси совпадает с мутностью оптического
стандарта, то количество микробных тел в ней соответствует номеру стандарта.
 Контрольные вопросы
1. Что является критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
при лабораторном исследовании?

2. Когда следует выделять культуры микроорганизмов из организма больных для

определения чувствительности к антибиотикам?

3. Какие существуют методы определения чувствительности микроорганизмов к

антибиотикам?

Задание
1. Возьмите у преподавателя флакон с пенициллином, содержащий в 1 мл 300000
ЕД, и приготовьте основной раствор антибиотика в 32 ЕД/мл.

2. Определите чувствительность микроорганизмов к антибиотикам методом

бумажных дисков, учтите результаты и дайте ответ.

3. Определите чувствительность выделенной культуры стафилококков к

пенициллину методом серийных разведений в жидкой питательной среде, учтите
результаты и дайте ответ.

Химиопрофилактика и химиотерапия
В медицинской практике для предупреждения и лечения инфекционных болезней
давно применяли химические вещества. Индейцы для борьбы с малярией
употребляли кору хинного дерева, а в Европе уже в XVI веке применяли ртуть для
лечения сифилиса. Химиотерапия - это применение для лечения заболевания
химических веществ, обладающих специфическим действием на клетки
возбудителя заболевания и не повреждающих клетки и ткани человека. Основы
научной химиотерапии были сформулированы П. Эрлихом. Он получил первые
химиотерапевтические препараты - сальварсан и неосальварсан, содержащие
мышьяк. В течение нескольких десятилетий их использовали при лечении
сифилиса.

Химиопрофилактика - применение химических препаратов для предупреждения

инфекционных заболеваний.

В основе действия химиотерапевтических препаратов на клетки возбудителей

заболеваний лежит сходство их молекул с рядом веществ, необходимых для
метаболизма микроорганизмов: аминокислот, витаминов, ферментов и т. д.
Препарат всасывается бактериальной клеткой вместо необходимого ей компонента
и начинает свое разрушительное действие. В результате нарушения важнейших
систем клетки она погибает (бактерицидное действие), а если нарушения слабые, то
отмечается бактериостатическое действие.

Важным этапом в развитии химиотерапии явилось создание сульфаниламидных

препаратов (стрептоцид, норсульфазол, сульфадимезин и др.). Они дают хороший
лечебный эффект при ангине, гнойно-воспалительных инфекциях, кишечных
заболеваниях. В борьбе с туберкулезом помогли синтетические
химиотерапевтические препараты ПАСК (парааминосалициловая кислота), тибон,
фтивазид и др. В настоящее время разрабатывают и применяют химические
противовирусные и противоопухолевые препараты. Большое значение имеют
антибиотики - химиотерапевтические препараты биологического происхождения.

Однако химиотерапевтические препараты обладают рядом отрицательных

свойств. Воздействуя на определенную цепь обмена веществ, они могут наряду с
клеткой возбудителя поражать и клетки человека. В результате лечения
химиопрепаратами в организме человека накапливается большое количество
промежуточных продуктов, обладающих побочным действием. Описаны случаи
изменения состава крови, мутации клеток и другие функциональные нарушения
организма человека в результате применения химиотерапевтических препаратов.

Глава 10. Генетика микроорганизмов - Ф. К. Черкес

Способность живых организмов сохранять определенные признаки на
протяжении многих поколений называется наследственностью.

В процессе изучения наследственности оказалось, что каждое последующее

поколение под влиянием различных факторов может приобретать признаки,
отличающие их от предыдущих поколений. Это свойство называется
изменчивостью. Таким образом наследственность и изменчивость тесно связаны
между собой.

Наука, изучающая наследственность и изменчивость живых организмов,

называется генетикой (от греч. genos - рождение).

Еще в XIX веке Ч. Дарвин доказал, что все существующие виды живых
организмов произошли путем изменчивости от немногих форм, а возникшие
изменения, передаваемые по наследству, являются основой эволюционного
процесса. Теория Дарвина получила высшую оценку у классиков марксизма-
ленинизма. Ф. Энгельс рассматривал ее как одно из величайших открытий XIX
века.

Изучение наследственности и изменчивости у высших организмов связано с

большими трудностями из-за большой продолжительности их жизни и
немногочисленности потомства.

Удобным объектом для этого изучения являются микроорганизмы, для которых

характерен короткий жизненный цикл, быстрое размножение и способность давать
многочисленное потомство. Кроме того, они обладают выраженной морфологией,
которую можно изучать визуально при помощи светового микроскопа.
Микроорганизмы биохимически активны, что легко учитывать при использовании
специальных питательных сред.

Способность микроорганизмов изменять свои свойства при воздействии

различных факторов (температура, ультрафиолетовое и рентгеновское излучение и
др.) позволяет широко использовать их в качестве модели при изучении
наследственности и изменчивости.
 Первым объектом генетических исследований была кишечная палочка, которая
хорошо культивируется в лабораторных условиях. Важное значение имело также
то, что морфологические, культуральные и биохимические свойства этой бактерии
хорошо изучены. В дальнейшем объектом генетических исследований стали и
другие бактерии, а также вирусы.

Исследования генетики микроорганизмов показали, что у них роль носителя

генетической информации играет ДНК (у некоторых вирусов РНК).

Молекула ДНК в бактериях состоит из двух нитей, каждая из которых спирально

закручена относительно другой. При делении клетки нитчатая спираль удваивается-
каждая из нитей служит как бы шаблоном или матрицей, на которой строится новая
нить. При этом каждая нить, возникшая в процессе деления клеток, содержит вновь
образовавшуюся двунитчатую молекулу ДНК.

В состав ДНК входят четыре азотистых основания - аденин, гуанин, цитозин и

тимин, порядок расположения в цепи у разных организмов определяет их
наследственную информацию, закодированную в ДНК.

Функциональной единицей наследственности является ген, который

представляет собой участок нити ДНК. В генах записана вся информация,
касающаяся свойств клетки.

Полный набор генов, которым обладает клетка, называется генотипом. Гены

подразделяются на структурные, несущие информацию о конкретных белках,
вырабатываемых клеткой, и гены-регуляторы, регулирующие работу структурных
генов. Например, клетка вырабатывает те белки, которые необходимы ей в данных
условиях, однако при изменении условий гены-регуляторы изменяют свойства
клетки, приспосабливая их к новым условиям.

Изменения морфологических, культуральных, биохимических и других свойств

микроорганизмов, возникающие под действием внешних факторов, взаимосвязаны.
Например, изменения морфологических свойств сопровождаются обычно
изменениями физиологических особенностей клетки.

В процессе изучения изменчивости микроорганизмов была обнаружена особая

форма изменчивости - диссоциация. Этот вид изменчивости был описан П. де Крюи
и Дж. Аркрайтом и выражается в том, что при посеве некоторых культур на
плотные питательные среды происходит разделение колоний на два типа: гладкие,
круглые, блестящие колонии с ровными краями - S-форма (от англ. smooth -
гладкий), и плоские, непрозрачные колонии неправильной формы, с неровными
краями - R-форма (от англ. rough - шероховатый). Существуют также переходные
формы: М-формы (слизистые) и g-формы (карликовые).

Колонии, относящиеся к гладкой S-форме, могут при определенных условиях

переходить в R-форму и обратно, однако переход R-формы в S-форму происходит
труднее.

Диссоциация наблюдается у ряда бактерий, в частности у возбудителей

сибирской язвы, чумы и др.
 Характеристика S- и R-форм колоний
S-форма R-форма
Колонии гладкие, блестящие, Колонии неправильной
формы,
правильной выпуклой формы мутные, шероховатые
При росте в бульоне - Растут в бульоне в виде
осадка
равномерная муть У подвижных бактерий
жгутики
У подвижных бактерий имеются могут отсутствовать
жгутики Капсулы отсутствуют
У капсульных бактерий имеется Биохимические свойства
выражены
капсула слабо
Биохимически активны Большинство бактерий менее
Болезнетворны болезнетворны
Выделяются чаще в остром Выделяются обычно при
хронической
периоде заболевания форме заболевания

Болезнетворные бактерии чаще бывают в S-форме. Исключением являются

возбудители туберкулеза, чумы, сибирской язвы, у которых болезнетворной
является R-форма (рис. 26).

Рис. 26. Рост возбудителей туберкулеза на плотной среде (R-форма)

Изменения, возникающие в бактериальных клетках могут быть ненаследуемые -

фенотипическая изменчивость и наследуемые - генотипическая изменчивость.
 Фенотипическая изменчивость (модификация)
Модификация микроорганизмов возникает как ответ клетки на неблагоприятные
условия ее существования. Это адаптивная реакция на внешние раздражители.
Модификация не сопровождается изменением генотипа, в связи с чем возникшие в
клетке изменения по наследству не передаются. При восстановлении оптимальных
условий возникшие изменения утрачиваются. Модификация может касаться разных
свойств микроорганизмов - морфологических, культуральных, биохимических и др.

Морфологическая модификация выражается в изменениях формы и величины

бактерий. Например, при добавлении пенициллина к питательной среде клетки
некоторых бактерий удлиняются. Недостаток в среде солей кальция вызывает у
палочки сибирской язвы повышенное спорообразование. При повышенной
концентрации солей кальция способность образовывать споры утрачивается и т. д.
При длительном росте бактерий в одной и той же среде возникает полиморфизм,
обусловленный влиянием накопившихся в ней продуктов их жизнедеятельности.

Культуральная модификация состоит в изменении культуральных свойств

бактерий при изменении состава питательной среды. Например, при недостатке
кислорода у стафилококка утрачивается способность образовывать пигмент.
Чудесная палочка при комнатной температуре образует ярко-красный пигмент, но
при 37° С способность образовывать этот пигмент утрачивается и т. д.

Биохимическая (ферментативная) модификация. Каждый вид бактерий имеет

определенный набор ферментов, благодаря которым они усваивают питательные
вещества. Эти ферменты вырабатываются на определенных питательных
субстратах и предопределены генотипом.

В процессе жизнедеятельности бактерий обычно функционируют не все гены,

ответственные за синтез соответствующих ферментов. В геноме бактерий всегда
имеются запасные возможности, т. е. гены, определяющие выработку адаптивных
ферментов. Например, кишечная палочка, растущая на среде, не содержащей
углевод лактозу, не вырабатывает фермент лактазу, но если пересеять ее на среду с
лактозой, то она начинает вырабатывать этот фермент. Адаптивные ферменты
позволяют приспособляться к определенным условиям существования.

Таким образом, модификация - это способ приспособления микроорганизма к

условиям внешней среды, обеспечивающий им возможность расти и размножаться
в измененных условиях. Приобретенные свойства не передаются по наследству,
поэтому они не играют роли в эволюции, а способствуют в основном выживанию
микробных популяций.

Генотипическая (наследуемая) изменчивость

Генотипическая изменчивость может возникать в результате мутаций и
генетических рекомбинаций.

Мутации (от лат. mutatio - изменять) - это передаваемые по наследству

структурные изменения генов.
 Крупные мутации (геномные перестройки) сопровождаются выпадением или
изменением относительно крупных участков генома - такие мутации, как правило,
необратимы.

Мелкие (точковые) мутации связаны с выпадением или добавлением отдельных

оснований ДНК. При этом изменяется лишь небольшое число признаков. Такие
измененные бактерии могут полностью возвращаться в исходное состояние
(ревертировать).

Бактерии с измененными признаками называются мутантами. Факторы,

вызывающие образование мутантов, носят название мутагенов.

Бактериальные мутации делят на спонтанные и индуцированные. Спонтанные

(самопроизвольные) мутации возникают под влиянием неконтролируемых
факторов, т. е. без вмешательства экспериментатора. Индуцированные
(направленные) мутации появляются в результате обработки микроорганизмов
специальными мутагенами (химическими веществами, излучением, температурой и
др.).

В результате бактериальных мутаций могут отмечаться: а) изменение

морфологических свойств; б) изменение культуральных свойств; в) возникновение
у микроорганизмов устойчивости к лекарственным препаратам; г) потеря
способности синтезировать аминокислоты, утилизировать углеводы и другие
питательные вещества; д) ослабление болезнетворных свойств и т. д.

Если мутация приводит к тому, что мутагенные клетки обретают по сравнению с

остальными клетками популяций преимущества, то формируется популяция из
мутантных клеток и все приобретенные свойства передаются по наследству. Если
же мутация не дает клетке преимуществ, то мутантные клетки, как правило,
погибают.

Генетические рекомбинации. Трансформация. Клетки, которые способны

воспринять ДНК другой клетки в процессе трансформации, называются
компетентными. Состояние компетентности часто совпадает с логарифмической
фазой роста.

Трансдукция - это перенос генетической информации (ДНК) от бактерии донора

к бактерии реципиенту при участии бактериофага. Трансдуцирующими свойствами
обладают в основном умеренные фаги. Размножаясь в бактериальной клетке, фаги
включают в состав своей ДНК часть бактериальной ДНК и передают ее реципиенту.
Различают три типа трансдукции: общую, специфическую и абортивную.

1. Общая трансдукция - это передача различных генов, локализованных на

разных участках бактериальной хромосомы. При этом бактерии доноры могут
передать реципиенту разнообразные признаки и свойства - способность
образовывать новые ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам и т. д.

2. Специфическая трансдукция - это передача фагом только некоторых

специфических генов, локализованных на специальных участках бактериальной
хромосомы. В этом случае передаются только определенные признаки и свойства.
 3. Абортивная трансдукция - перенос фагом какого-то одного фрагмента
хромосомы донора. Обычно этот фрагмент не включается в хромосому клетки
реципиента, а циркулирует в цитоплазме. При делении клетки реципиента этот
фрагмент передается только одной из двух дочерних клеток, а второй клетке
достается неизмененная хромосома реципиента.

С помощью трансдуцирующих фагов можно передать от одной клетки другой

целый ряд свойств, таких как способность образовывать токсин, споры, жгутики,
продуцировать дополнительные ферменты, устойчивость к лекарственным
препаратам и т. д.

Конъюгация - это передача генетического материала от одной бактерии к другой

при непосредственном контакте клеток. Клетки, передающие генетический
материал, называются донорами, воспринимающие его - реципиентами. Этот
процесс носит односторонний характер - от клетки донора к клетке реципиента.

Бактерии донора обозначаются F+ (мужской тип), а бактерии реципиента - F-

(женский тип). При тесном сближении клеток F+ и F- между ними возникает
цитоплазматический мостик. Образование мостика контролируется фактором F (от
англ. fertility - плодовитость). Этот фактор содержит гены, ответственные за
образование половых ворсинок (sex-pili). Функцию донора могут выполнять только
те клетки, которые содержат фактор F. Клетки реципиента лишены этого фактора.
При скрещивании фактор F передается клеткой донора реципиенту. Получив
фактор F, женская клетка сама становится донором (F+).

Процесс конъюгации можно прервать механическим способом, например

встряхиванием. В этом случае реципиент получает неполную информацию,
заключенную в ДНК.

Перенос генетической информации путем конъюгации лучше всего изучен у

энтеробактерий.

Конъюгация, как и другие виды рекомбинации, может осуществляться не только

между бактериями одного и того же вида, но и между бактериями разных видов. В
этих случаях рекомбинация называется межвидовой.
 Плазмиды
Плазмиды - это сравнительно небольшие внехромосомные молекулы ДНК
бактериальной клетки. Они расположены в цитоплазме и имеют кольцевую
структуру. В плазмидах содержится несколько генов, функционирующих
независимо от генов, содержащихся в хромосомной ДНК.

Типичным признаком плазмид служит их способность к самостоятельному

воспроизведению (репликации).

Они могут также переходить из одной клетки в другую и включать в себя новые
гены из окружающей среды. К числу плазмид относятся:

Профаги, вызывающие у лизогенной клетки ряд изменений, передающихся по

наследству, например способность образовывать токсин (см. трансдукцию).

F-фактор, находящийся в автономном состоянии и принимающий участие в

процессе конъюгации (см. конъюгацию).

R-фактор, придающий клетке устойчивость к лекарственным препаратам

(впервые R-фактор был выделен из кишечной палочки, затем из шигелл).
Исследования показали, что R-фактор может быть удален из клетки, что вообще
характерно для плазмид.

R-фактор обладает внутривидовой, межвидовой и даже межродовой

трансмиссивностью, что может явиться причиной формирования трудно
диагностируемых атипичных штаммов.

Бактериоциногенные факторы (col-факторы), которые впервые были

обнаружены в культуре кишечной палочки (Е. coli), в связи с чем названы
колицинами. В дальнейшем они были выявлены и у других бактерий: холерного
вибриона - вибриоцины, стафилококков - стафилоцины и др.

Col-фактор - это маленькая автономная плазмида, которая детерминирует синтез

белковых веществ, способных вызывать гибель бактерий собственного вида или
близкородственного. Бактериоцины адсорбируются на поверхности чувствительных
клеток и вызывают нарушения метаболизма, что приводит клетку к гибели.

В естественных условиях только единичные клетки в популяции (1 на 1000)

спонтанно продуцируют колицин. Однако при некоторых воздействиях на культуру
(обработка бактерий УФ-лучами) количество колицинпродуцирующих клеток
увеличивается.

Практическое значение изменчивости

Еще Пастер искусственным путем получил необратимые изменения у
возбудителей бешенства, сибирской язвы и приготовил вакцины, предохраняющие
от этих заболеваний. В дальнейшем исследования в области генетики и
изменчивости микроорганизмов позволили получить большое число бактериальных
и вирусных штаммов, используемых для получения вакцин.
 Результаты исследования генетики микроорганизмов с успехом были
использованы для выяснения закономерностей наследственности высших
организмов.

Большое научное и практическое значение имеет также новый раздел генетики -

генная инженерия.

Методы генной инженерии позволяют изменять структуру генов и включать в

хромосому бактерий гены других организмов, ответственных за синтез важных и
нужных веществ. В результате микроорганизмы становятся продуцентами таких
веществ, получение которых химическим путем представляет очень сложную, а
иногда даже невозможную задачу. Этим путем в настоящее время получают такие
медицинские препараты, как инсулин, интерферон и др. При использовании
мутагенных факторов и селекции были получены мутанты-продуценты
антибиотиков, которые в 100-1000 раз активнее исходных.

Контрольные вопросы
1. Что является функциональной единицей наследственности?

2. Какова роль генов-регуляторов?

3. Что такое диссоциация и какие Вы знаете формы диссоциации?

4. Что значит фенотипическая изменчивость и какими свойствами она может

быть выражена?

5. Что значит генотипическая изменчивость и какими формами она может быть

выражена?

6. Что такое плазмиды?

7. Какое практическое значение имеет изменчивость?

Глава 11. Учение об инфекции - Ф. К. Черкес

Инфекция или инфекционный процесс (от лат. infectio - заражать, загрязнять) -
это совокупность явлений, возникающих и развивающихся в макроорганизме при
внедрении и размножении в нем болезнетворных микроорганизмов.

Проявления инфекции разнообразны, что зависит от свойств микроорганизма,

состояния макроорганизма и условий окружающей среды.

Крайней степенью выраженности инфекционного процесса является

инфекционная болезнь.

Инфекционные болезни были известны давно. Народы глубокой древности не

могли иметь правильного представления о причинах возникновения этих
заболеваний и считали их "карой божьей". Однако еще Гиппократ, а в XVI веке Д.
Фракаеторо и другие уже высказали предположение о том, что заразные болезни
связаны с какими-то существами, передающимися от больных здоровым.
 В середине XIX века Л. Пастер, Р. Кох, И. И. Мечников, Д. И. Ивановский и
другие ученые установили, что возбудителями инфекционных болезней являются
микроорганизмы.

Взаимоотношения между микроорганизмами и макроорганизмом представляют

собой симбиоз, который характеризуется следующими формами: мутуализмом,
комменсализмом и паразитизмом.

Мутуализм (от лат. mutuus - взаимный) - это сожительство, выгодное для обоих
сожителей. Например, молочно-кислые бактерии живут за счет макроорганизма и
являются - антагонистами гнилостной микрофлоры кишечника человека.

Комменсализм (от франц. commensal - сожитель, сотрапезник) - это форма

сожительства, при которой один сожитель (микроорганизм) живет за счет хозяина
(макроорганизм), не принося ему вреда. К микробам-комменсалам относятся
представители нормальной микрофлоры организма, например неболезнетворные
стафилококки, кишечные палочки и др. Однако, когда макроорганизм попадает в
наблагоприятные условия либо когда эти микроорганизмы из места своего
естественного обитания попадают в другие органы, они могут вызывать
заболевания.

Паразитизм (от греч. parasitos - нахлебник) характеризует взаимоотношения,

когда один организм (паразит) живет за счет другого (хозяина) и наносит ему вред.

Переход микроорганизмов от сапрофитизма к паразитизму сопровождался

изменением ряда их свойств. Основой таких изменений явилась постоянная
изменчивость микроорганизмов с последующим естественным отбором тех форм,
которые более приспособлены к новым условиям жизни. Вначале развились
паразиты, которые не полностью утратили способность к самостоятельному
существованию в окружающей среде (факультативные). Затем появились
обязательные (облигатные) паразиты, размножающиеся только в организме своего
хозяина.

Эволюционный характер формирования паразитизма у микроорганизмов

проявляется и в том, что некоторые их виды приобрели способность жить и
размножаться только в организме определенного вида. Например, возбудители
брюшного тифа, гонореи паразитируют только в организме человека.

В дальнейшем, дифференцируясь, микроорганизмы приспособились к

определенным органам и тканям. Например, пневмококки в основном поражают
слизистые оболочки дыхательных путей, гонококки - слизистую оболочку половых
органов, возбудители брюшного тифа и дизентерии - слизистую оболочку
кишечника и т. д.

Патогенность и вирулентность микроорганизмов

Способность микроорганизмов вызывать патологические процессы в
макроорганизме, т. е. заболевания, называется патогенностью (от лат. pathos -
страдание, genos - рождение). Микроорганизмы, обладающие этой способностью,
называются патогенными. Патогенность это генетически обусловленный видовой
признак. Для большинства патогенных микроорганизмов характерна
специфичность - способность данного вида микробов вызывать определенное
заболевание. Например, холеру вызывает холерный вибрион, гонорею - гонококк и
т. д.

Разные штаммы одного и того же вида могут обладать различным по

патогенности действием. Степень или мера патогенности называется
вирулентностью.

Вирулентность, как и всякое свойство микроорганизма, может изменяться. Эти

изменения носят либо фенотипический характер, либо являются результатом
нарушений в геноме клетки - тогда они передаются по наследству. Фенотипические
изменения, ведущие к ослаблению вирулентности, возникают тогда, когда
микроорганизмы попадают в неблагоприятные условия, например при воздействии
на них различных физических и химических факторов. Эти изменения
восстанавливаются, вирулентность снова повышается при попадании микробов в
благоприятные условия существования. Стабильное снижение вирулентности
можно получить при длительном действии различных веществ. Так, Кальметт и
Герен получили БЦЖ - живую вакцину из туберкулезных бактерий. Ученые 13 лет
пересевали культуру на среды, содержащие бычью желчь. При этом имела место
селекция (отбор) авирулентных бактериальных клеток, обладающих высокой
устойчивостью к желчи. Количество их в исходной культуре было невелико (их
свойства в популяции не проявлялись).

Вирулентность можно усиливать при пассировании микроорганизмов через

чувствительных к ним животных. При этом имеет место селекция вирулентных
особей популяции.

Вирулентность микроорганизмов обусловлена их способностью к адгезии

(прилипанию), колонизации (размножению), инвазии (проникновению в ткани,
клетки макроорганизма) и подавлению фагоцитоза.

Адгезия - способность адсорбироваться на определенных, чувствительных к

данному микробу клетках организма хозяина. Она обусловлена, с одной стороны,
поверхностными структурами микробной клетки (пили и пр.), с другой - наличием
рецепторов клетки макроорганизма, способных вступать в соединение с микробной
клеткой.

Колонизация может быть на поверхности клеток, к которым прилипли микробы

(например, холерные вибрионы размножаются на энтероцитах), или внутри клеток,
в которые проникают прилипшие микробы (например, дизентерийные палочки
размножаются в клетках толстого отдела кишки).

Инвазивность связана со способностью микробов продуцировать ферменты,

нарушающие (повышающие) проницаемость соединительной и других тканей. К
таким ферментам относятся: а) гиалуронидаза (фактор распространения), которая
разрушает гиалуроновую кислоту соединительной ткани и тем самым способствует
проникновению микробов в ткани; б) нейраминидаза, отщепляющая нейраминовую
кислоту от гликопротеидов, гликолипидов, полисахаридов, входящих в состав
разных тканей, и таким образом повышающая их проницаемость.
 Подавление фагоцитоза осуществляют капсулы бактерий. Вещества, входящие
в состав капсул различных микроорганизмов, неодинаковы, и их функции тоже
различны. Так, полипептид капсул возбудителя сибирской язвы предохраняет его от
захвата фагоцитами; полисахарид синегнойной палочки угнетает и захват, и
внутриклеточное переваривание бактерий.

Кроме перечисленных факторов, микробы защищаются от фагоцитоза

некоторыми ферментами. Например, коагулаза стафилококков способствует
свертыванию плазмы, что приводит к образованию защитного "чехла" вокруг
микробной клетки; фибринолизин растворяет фибрин, способствуя этим
распространению микробов.

Особое значение в вирулентности имеет способность микроорганизмов

синтезировать токсины (яды). Токсины, образуемые микроорганизмами, делят на
две группы - экзотоксины и эндотоксины.

Экзотоксины являются продуктами метаболизма микробов, секретируемыми в

окружающую среду. Они имеют белковое происхождение, что обусловливает их
малую устойчивость к внешним воздействиям. Исключение составляют
нейротоксин палочки ботулизма, энтеротоксины стафилококка, холерного
вибриона, которые выдерживают кратковременное кипячение.

Микроорганизмы, образующие экзотоксин, обычно локализуются в месте

проникновения (во влодных воротах), а продуцируемый ими экзотоксин
циркулирует в макроорганизме, например столбнячный, дифтерийный и др.

Экзотоксины характеризуются высокой токсичностью и выраженной

специфичностью - органотропностью. Каждый вид токсина поражает определенные
органы или ткани. Например, столбнячный токсин поражает нервную систему, а
дифтерийный токсин - мышцы сердца и т. д.

По своей биологической активности токсины неодинаковы: некоторые из них

полностью определяют клиническую картину заболевания, например столбнячный,
дифтерийный, ботулинический токсины. Другие принимают более ограниченное
участие в инфекционном процессе, вызывают нетипичные по клиническим
проявлениям реакции, например гемолитические токсины стафилококков,
кишечной палочки и др.

Экзотоксины диффундируют в окружающую среду. Их получают, засевая

токсигенную культуру в жидкую питательную среду и выращивая ее в условиях
максимального накопления токсина. После фильтрации через бактериальные
фильтры получают фильтрат, содержащий экзотоксин.

В настоящее время ряд экзотоксинов получены в чистом виде и хорошо изучены.

Очищенные токсины обладают более высокой токсичностью.

Токсическое действие экзотоксинов снимается, если блокировать активный

центр яда, воздействуя на него химическими и физическими факторами. При
действии 0,4% формалина, выдерживании в условиях 39-40° С температуры в
течение 3-4 нед экзотоксины утрачивают токсические свойства, но сохраняют
антигенные. Такие препараты готовят как вакцинные и называют анатоксинами.
 Эндотоксины - липополисахаридопротеиновый комплекс, тесно связанный с
клеткой микроорганизма. Они не специфичны. Клиническая картина, вызываемая
эндотоксинами разных микроорганизмов, однотипна: реакция организма
сопровождается обычно общими явлениями интоксикации - лихорадкой, головной
болью и т. д.

Тесная связь эндотоксина с клетками микроорганизма обусловливает его

устойчивость к температурному и другим внешним факторам. Для получения
эндотоксина необходимо разрушить клетку микроорганизма.

Свойства экзо- и эндотоксинов

Экзотоксины Эндотоксины
Белковой природы
Липополисахаридопротеиновый комплекс
Диффундируют из клетки в Связаны с телом микробной
окружающую среду клетки
Высокотоксичны Малотоксичны
Избирательно действуют на Вызывают общие явления
органы и ткани (специфичны) интоксикации
Термолабильны Термостабильны
Под действием формалина Под действием формалина
переходят в анатоксин частично обезвреживаются
Образуются в основном Образуются в основном
грамположительными бактериями грамотрицательными
бактериями

Действие токсина определяют на чувствительных к данному токсину животных.

Например, дифтерийный токсин испытывают на морских свинках, ботулинический
- на белых мышах и т. д.

Для определения вирулентности и силы токсина (токсичности) микробов

пользуются условными обозначениями: DLM, DCL, LD 50.

DLM (Dosis letalis minima) - наименьшая доза микробов или токсина, которая
убивает большинство подопытных животных. DCL (Dosis certe letalis) - наименьшая
доза микробов или токсина, которая убивает всех животных, взятых в опыт.
LD50 (Dosis letalis) - доза микробов или токсина, которая приводит к гибели 50%
подопытных животных.

Дозы, определяющие вирулентность или силу токсина, зависят от вида и штамма

микроба, вида токсина, а также от способа введения. Для определения силы токсина
из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений, каждое из
них испытывают на группе животных, чувствительных к данному виду токсина.
Для получения сравнительных результатов при определении доз (DLM, DO, LD 50)
исследование проводят на животных одного вида и пола, имеющих одинаковую
массу тела.

Роль макроорганизма в инфекционном процессе

Возникновение инфекционного заболевания в значительной степени зависит от
реактивности макроорганизма, готовности обезвредить болезнетворные микробы,
яды, попавшие в его внутреннюю среду. При этом большую роль играют
следующие факторы.

Возраст. Значение возраста определяется физиологическими особенностями

организма, в частности характером обмена веществ. Известно, что к возбудителям
некоторых инфекций дети более чувствительны. Существуют так называемые
"детские инфекции" - скарлатина, коклюш, корь, ветряная оспа, паротит
эпидемический и др. Лица преклонного возраста тяжело переносят пневмонию.
Наряду с этим имеются инфекционные агенты, одинаково поражающие людей
любого возраста, например вирус гриппа.

Состояние нервной системы. Установлено, что угнетение нервной системы

способствует возникновению и более тяжелому течению инфекционных болезней,
так как при этом в макроорганизме снижена активность защитных механизмов.

Состояние эндокринной системы. У людей, страдающих эндокринными

заболеваниями (диабет, нарушение функции щитовидной железы и др.), часто
возникают гнойно-воспалительные процессы, что также является результатом
снижения защитных сил организма.

Питание. При неполноценном питании у человека часто возникают

инфекционные болезни. Результатом недоедания является повышенная
заболеваемость и смертность от туберкулеза, холеры, дизентерии и других
инфекций в ряде капиталистических стран, где часть неимущего населения
систематически голодает.

Существенное значение в пище имеют белки и витамины. Так, голодание, а

порою просто недостаточное количество белков, приводит к нарушению белкового
обмена. Это влечет за собой уменьшение синтеза иммуноглобулинов, снижение
активности фагоцитов. Потеря фагоцитарной активности клеток возникает и при
недостатке витамина А, что нередко приводит к возникновению воспалительных
процессов на коже и слизистых. Недостаток витаминов группы В и С повышает
восприимчивость к туберкулезу, дифтерии, стрептококковым, стафилококковым и
другим заболеваниям.

В устойчивости организма к возбудителям многих инфекций большая роль

принадлежит микроэлементам, недостаток которых в пище приводит к нарушению
обмена веществ, повышению восприимчивости к инфекционным заболеваниям.

"Нормальная микрофлора" играет немалую роль в осуществлении защитных

функций организма. Представители этой микрофлоры часто являются
выраженными антагонистами патогенных микробов. Например, кишечная палочка -
постоянный обитатель толстого отдела кишечника - подавляет развитие
брюшнотифозной и других кишечных патогенных микроорганизмов.

Влияние окружающей среды на возникновение и

развитие инфекционного процесса
Охлаждение понижает устойчивость ко многим патогенным и условно-
патогенным микроорганизмам. Например, действие холодного и одновременно
влажного воздуха снижает устойчивость слизистой оболочки дыхательных путей,
что приводит к заболеванию.

Развитию инфекционных заболеваний могут способствовать перегревание,

длительное и интенсивное действие солнечных лучей, ионизирующая радиация в
повышенных дозах, профессиональные вредности (высокая температура в горячих
цехах, облучение, отравление химическими веществами, недостаток кислорода,
физическое и умственное переутомление и др.). Плохие санитарно-гигиенические
условия снижают общую сопротивляемость организма

Таким образом, соотношение вирулентности микроорганизмов, состояния

макроорганизма и условий окружающей среды определяют возможность
возникновения и характер течения инфекционного процесса.

Механизм передачи инфекции

Источником возбудителей инфекций являются человек и животные. Наибольшее
значение имеют больные люди и животные, однако источником могут быть
выздоравливающие (реконвалесценты), больные со скрытой формой заболевания,
микробоносители.

Все инфекционные болезни человека по характеру источников подразделяются

на две группы: антропонозы, при которых источником возбудителей является
человек, и зоонозы - заболевания, присущие животным, но к которым восприимчив
и человек.

Механизмы передачи возбудителей инфекций различны, но определенны для

каждого вида микроорганизмов и обусловлены локализацией в организме больного
(или носителя), а также путем выделения. В соответствии с первичной
локализацией возбудителей в организме различают 4 типа механизмов передачи:

1) фекально-оральный - возбудители локализуются в кишечнике (брюшной тиф,

дизентерия, холера), передаются алиментарным путем - с пищей, водой;

2) воздушно-капельный - возбудители локализуются в дыхательных путях

(грипп, коклюш и др.), передаются воздушно-капельным, воздушно-пылевым
путем;

3) трансмиссивный - возбудители локализуются в кровеносной системе (малярия,

сыпной тиф, возвратный тиф и др.), передаются кровососущими насекомыми;

4) контактный: а) прямой - передача возбудителей происходит при

непосредственном соприкосновении (венерические болезни); б) непрямой - через
зараженные предметы окружающей обстановки (игрушки, на которых могут
находиться возбудители, например, дизентерии). Возбудители локализуются на
коже, слизистых оболочках, поверхности ран.

Большое значение для возникновения инфекционного заболевания имеет место

проникновения возбудителя - входные ворота, а также инфицирующая доза.
 Входные ворота - это те органы и ткани организма хозяина, через которые
проникают патогенные микроорганизмы. Например, возбудитель брюшного тифа
вызывает заболевание только при проникновении через рот, а гонококк - при
попадании его на слизистую оболочку половых путей, или конъюнктиву глаза. Если
эти возбудители попадают в организм иным путем, не через свои входные ворота,
то заболевание не развивается, и микроорганизмы погибают.

Однако некоторые микроорганизмы (например, возбудители чумы, туляремии,

сибирской язвы) могут вызвать заболевание, попадая в организм хозяина
различными путями. В этих случаях входные ворота определяют только форму
клинического течения (кожная форма, легочная, кишечная и т. д.).

Для возникновения инфекционного заболевания возбудители должны

проникнуть в организм в определенной "критической дозе". Величина ее
неодинакова для различных возбудителей. Например, для возникновения
заболевания дизентерией инфицирующая доза составляет в среднем
102 вирулентных возбудителей, брюшным тифом - 105, холерой - 107 и т. д.

Формы инфекционного процесса

В зависимости от пути проникновения возбудителя в организм хозяина
различают экзогенные и эндогенные инфекции.

Экзогенные инфекции возникают в результате поступления возбудителей из

окружающей среды.

При эндогенной (аутоинфекции) инфекции возбудители находятся в организме в

составе облигатной или транзиторной флоры. При ослаблении защитных свойств
организма они могут быть причиной возникновения заболевания.

По продолжительности течения различают острые и хронические инфекции.

Острые характеризуются сравнительно кратковременным (от 1 нед до 1 мес)
течением (например, грипп, корь, холера, брюшной тиф и др.), хронические -
затяжным течением (в течение месяцев - лет) (например, малярия, сифилис,
туберкулез, бруцеллез, лепра).

Если инфекция вызвана одним видом возбудителя, такую инфекцию называют

моноинфекцией. При заражении организма одновременно 2-3 различными
возбудителями (например, дифтерийной палочкой и стрептококком) говорят о
смешанной инфекции.

От смешанных инфекций отличают вторичную инфекцию, когда к основному

заболеванию (например, гриппу) присоединяется инфекция, вызванная другим
возбудителем (например, стафилококком или стрептококком).

Реинфекцией называют такое состояние, когда возникло повторное заболевание в

результате нового заражения тем же видом возбудителя. Если заболевание
возобновилось до выздоровления в результате инфицирования тем же
возбудителем, говорят о суперинфекции. Такие инфекции наблюдаются при
сифилисе, гонорее.
 Рецидив - возврат симптомов заболевания (возвратный тиф, малярия), которые
возникают без повторного заражения за счет оставшихся в организме возбудителей.

Некоторые инфекционные болезни могут протекать скрыто, без клинических

проявлений. Такие формы инфекции называют латентными (например,
бессимптомно может протекать туберкулез).

Одной из форм инфекции, протекающей без признаков болезни, является

микробоносительство. Оно формируется чаще после перенесенного заболевания,
когда наступает клиническое выздоровление, но возбудители продолжают
оставаться в организме переболевшего и выделяться в окружающую среду
(например, носительство брюшнотифозных, дизентерийных палочек). В некоторых
случаях микробоносительство развивается у здоровых лиц, контактировавших с
больными или даже носителями патогенных микроорганизмов.

В зависимости от локализации возбудителей в организме больного различают

очаговую инфекцию, при которой микробы находятся в местном очаге, не
распространяются за его пределы (например, ангина, фурункулез), и
генерализованную, когда силы агрессии микроорганизмов превышают силу
защитных механизмов организма хозяина и возбудители из местного очага
распространяются по организму. Состояние, когда возбудители инфекции
циркулируют в течение определенного времени в крови, но не размножаются в ней
(например, брюшной тиф), называют бактериемией.

В том случае, когда возбудитель длительно находится в крови, накапливается там

и даже размножается, возникает сепсис или септицемия (от лат. sepsis -
гноекровие). Такое наводнение микроорганизмами бывает при чуме, сибирской
язве. Сепсис вызывают также гноеродные кокки. Особой чертой сепсиса является
то, что клиническая картина не зависит от вида возбудителя.

Образование в результате сепсиса гнойных очагов в различных органах

называется септикопиемией. Циркуляция в крови токсина называется токсинемией,
циркуляция вирусов - вирусемией.

Динамика развития инфекционного заболевания

Динамика развития инфекционного заболевания складывается из нескольких
периодов.

Инкубационный период - время от момента внедрения патогенного микроба до

появления первых признаков заболевания. В этом периоде происходит
размножение и накопление возбудителей и их токсинов. Длительность его
неодинакова при разных заболеваниях, но она определенна для отдельных
инфекционных болезней. Например, средняя продолжительность инкубационного
периода для брюшного тифа - 14 дней, скарлатины и дифтерии - 5-7 дней, коклюша
- 9 дней, кори - 10-11 дней, токсикоинфекции возникают через несколько часов
после заражения, грипп - через 2-3 дня.

Клинические проявления болезни ряда инфекций возникают после очень

продолжительного инкубационного периода (например, лепра развивается через
несколько лет - до 30 лет! - после заражения).
 Продромальный период - период предвестников наступает после
инкубационного периода и проявляется общими для разных заболеваний
симптомами (головная боль, слабость, недомогание, повышение температуры).
Продолжительность этого периода невелика - от нескольких часов до 3 дней.

Период развития основных клинических явлений характеризуется проявлением

разнообразных, но специфичных для каждого заболевания симптомов, что зависит
от вида возбудителя. Период этот часто сопровождается: лихорадкой, нарушением
функций органов дыхания, пищеварения, появлением сосудистых явлений (иногда
появлением сыпи), изменением картины крови и т. п. Длительность этого периода
зависит от вида инфекции.

Смена периодов заболевания имеет большое значение для лабораторной

диагностики, так как каждый из них характеризуется определенной локализацией
возбудителя и путями его выделения из организма, что определяет вид забираемого
материала и тактику лабораторных исследований.

Период выздоровления (реконвалесценция) характеризуется угасанием

болезненных явлений, постепенным восстановлением физиологических функций
организма.

Распространение инфекционных заболеваний. Инфекционные заболевания

характеризуются заразностью и могут протекать в виде эпидемий - массовых
заболеваний, связанных друг с другом. Массовые заболевания,
распространяющиеся на несколько стран и континентов, называют пандемией.
Инфекционные заболевания, встречающиеся в единичных случаях, называются
спорадическими. Заболевания, распространенные только в определенной
местности, называются эндемией. Они обусловлены обычно наличием переносчика
и других резервуаров возбудителя инфекции.

В СССР за последние десятилетия инфекционные болезни редко протекают в

виде эпидемических вспышек.

Целый ряд заболеваний, таких как натуральная оспа, чума, ликвидированы. Резко
снижена заболеваемость дифтерией, коклюшем и др. Все это является результатом
профилактических мероприятий, постоянно проводимых советским
здравоохранением.

Контрольные вопросы
1. Что такое инфекционный процесс?

2. Что такое патогенность и вирулентность?

3. Как дифференцируются экзо- и эндотоксины?

4. Каковы механизмы передачи возбудителей инфекций?

5. Какова роль макроорганизма и факторов внешней среды в возникновении и

течении инфекционного процесса?
 6. Какова динамика развития инфекционного заболевания?

Биологические методы исследования

Биологическими называют методы исследования, проводимые на лабораторных
животных. Цель этих исследований: выделение микроорганизмов из исследуемого
материала, особенно в тех случаях, когда возбудитель не может быть обнаружен
методом посева, например при вирусных заболеваниях, риккетсиозах и т. д.;
выделение чистой культуры из материала, загрязненного другими
микроорганизмами, не позволяющими искомому возбудителю размножаться на
искусственной питательной среде; определение некоторых свойств выделенных
микроорганизмов (вирулентность и др.).

Экспериментальное заражение позволяет воспроизвести некоторые

инфекционные болезни и решить ряд вопросов, касающихся инфекции и
иммунитета, эффективности иммунобиологических препаратов, определения их
реактивности и превентивных (предупредительных) свойств.

При выборе лабораторного животного необходимо учитывать степень его

восприимчивости к изучаемой инфекции и установить, не вызывает ли у него
данный возбудитель заболевания в естественных условиях.

Виды лабораторных животных

Для экспериментального заражения чаще всего используют белых мышей, крыс,

морских свинок и кроликов. Для некоторых специальных исследований
лабораторными животными служат обезьяны, кошки, собаки, лошади, мелкий и
крупный рогатый скот, дикие животные (хомяки, суслики, дикие крысы, полевки), а
также птицы (куры, голуби и т. д.).

В настоящее время часто пользуются чистолинейными (инбредными)

животными, полученными при близкородственном скрещивании (братья, сестры) в
течение 20-40 поколений с отбором животных по определенному признаку.
Генетическая однородность мышей обеспечивает однообразие ответных реакций,
поэтому в опыт можно брать меньшее количество животных.

Имеются специальные лаборатории, в которых ведутся исследования на

безмикробных животных (их содержат в асептических условиях). Наука,
изучающая безмикробную жизнь макроорганизмов, называется гнотобиологией.
Одна из целей исследования - выявить роль нормальной и измененной микрофлоры
в физиологических и патологических процессах макроорганизма.

Содержание лабораторных животных

Животные, используемые для биологического эксперимента, содержатся в

специальных условиях. Для этого существуют особые помещения - виварии. В
виварии лабораторных животных содержат в клетках или банках, установленных на
стеллажах. Каждый вид лабораторных животных содержат отдельно. Помещение
вивария должно быть теплым, светлым и сухим. Разводят животных в специальных
питомниках в условиях, приближенных к естественным. Поступающих из
питомника животных предварительно помещают в карантинное отделение.
 Виварий должен иметь ряд специальных и подсобных отделений: карантинное,
для содержания здоровых животных, помещение, предназначенное для вскрытий, и
кухню (помещение для приготовления пищи).

В хорошо устроенном виварии должны быть два выхода - для изоляции части
помещения в случае возникновения спонтанной, т. е. возникающей без
искусственного заражения, инфекции.

Наблюдение за общим состоянием животных производится ежедневно. Все

изменения состояния животных (вялость, отсутствие аппетита, наличие
инфильтратов) или их гибель отмечают в специальном регистрационном журнале.

Уход за лабораторными животными и уборка помещения вивария. Для

уборки вивария необходима специальная одежда: халат, фартук, резиновые
перчатки, косынка и тапочки. При работе с животными, предназначенными для
эксперимента с возбудителями опасных инфекций, дополнительно надевают
клеенчатый фартук, резиновые сапоги, нарукавники, маску, очки.

Уборку начинают с осмотра клеток и банок для выявления всех заболевших и

погибших животных. Затем вынимают поилки и кормушки, очищают их от
остатков пищи, тщательно моют, а стеклянные кипятят. После этого специальными
металлическими скребками очищают клетку от мусора и устанавливают поилки и
кормушки на место. Раз в неделю клетки и банки нужно промывать горячей водой,
дезинфицировать или автоклавировать. После очистки клеток приступают к уборке
помещения.

По окончании уборки весь собранный мусор сжигают в печи. Павших животных

вскрывают и тоже сжигают под контролем ответственного за это лица (врач или
лаборант). Работники вивария тщательно дезинфицируют и моют руки.

Кормление животных. Правильное и полноценное кормление животных имеет

очень большое значение. Разработаны нормы рационального питания для каждого
вида животных, которые утверждены Министерством здравоохранения СССР. В
эти нормы входят зерновые смеси, корнеплоды, сено, отруби, овощи, продукты
животного происхождения и т. д.

Количество и характер продуктов зависит от вида животных и цели опыта.

Плохое содержание и неправильное питание животных приводят к снижению их

устойчивости к инфекции, что сказывается на результатах опытов.

Отбор животных и подготовка их к опыту

Каждый вид животных лучше получать из одного питомника. Для опыта

отбирают животных определенной породы, одинаковой массы, что приблизительно
соответствует одному и тому же возрасту, и одного пола.

Отобранных животных рассаживают в чистые клетки или банки. На дно клетки

кладут сено или опилки. Мелких животных, например белых мышей, можно сажать
по 5-8 штук. Переносят животных в лабораторию в клетках или банках.
 Перед опытом животных взвешивают. Для взвешивания удобнее пользоваться
десятичными (без гирь) или тарированными весами.

Для проведения некоторых опытов животных ежедневно термометрируют.

Измерение температуры производят специальным ртутным термометром, который
перед употреблением дезинфицируют, насухо вытирают и смазывают вазелином.
После употребления термометр вновь дезинфицируют. Термометр вставляют в
просвет прямой кишки, причем глубина введения для каждого вида животных
должна быть всегда одинакова, например для морской свинки - 3,5 см. С этой
целью на стеклянный столбик выше резервуара надевают ограничитель - колечко.
Измерение температуры производят в течение 5 мин. Результаты регистрируют в
специальном журнале.

Маркировка животных. Каждое животное, взятое в опыт, маркируется. Вид

маркировки зависит от вида животного. Например, белых крыс и мышей метят
красками: насыщенным спиртовым раствором фуксина, пикриновой кислоты,
генциановым фиолетовым, перманганатом калия, хризоидином и др. Окрашивают
разные части тела: голову, спину, переднюю правую лапку, заднюю левую лапку и
т. д. Места окраски означают условные номера животных, например окраска
передней правой лапки - № 3. Используя сочетание цвета и места окраски, можно
пометить несколько сот животных.

Для маркировки кроликов и морских свинок используют металлические

пластинки, на которых выгравирован номер. Эти пластинки имеют расширенную
центральную часть и два отходящих, в стороны шипа. Перед употреблением
пластинки погружают на 2-3 ч в спирт. Ухо подопытного животного протирают
спиртом, эфиром и только после этого шипы продевают в уши животного, выводят
на внутреннюю поверхность уха и загибают (рис. 27). Птицам (курам и голубям)
обычно на правую лапку надевают алюминиевое кольцо, на котором проставлен
номер.

Рис. 27. Пластинка с номером для метки лабораторных животных

Экспериментальное заражение животных

Иммобилизация животных. Перед опытом животное нужно вынуть из клетки.

Чтобы животное не укусило и не поцарапало экспериментатора, существуют
различные приемы: мышей и крыс берут за конец хвоста, кроликов и морских
свинок - за кожу спины.

Затем животное фиксируют, т. е. ограничивают его подвижность, и создают

наиболее удобное положение для проведения манипуляции.

Для фиксирования животных существуют разные приспособления: доски

различного типа, ящики-боксы, пластинки, станки и т. д.

Вид фиксации зависит от характера манипуляции. Например, при введении

материала в вену уха кролика можно использовать деревянный ящик-бокс,
передняя стенка которого имеет отверстие для головы и состоит из двух половинок,
одна из которых выдвигается. Животное помещают в ящик, голову просовывают в
отверстие и фиксируют выдвижной половиной стенки (рис. 28). Чтобы фиксировать
животное в лежачем положении, используют доску, которая должна
соответствовать размеру тела животного. Сбоку доски на уровне лапок укрепляют
четыре кольца или крючка. Животное кладут животом вверх или вниз в
зависимости от характера манипуляции, на лапки надевают петли, сделанные из
марлевого бинта или веревки, другой конец которой закрепляют на крючке или в
кольце.

Рис. 28. Бокс для фиксации головы кролика

Применяют и более простые формы иммобилизации: животное можно плотно

запеленать в полотенце или халат либо держать в положении, ограничивающем
движения. Например, помощник берет морскую свинку правой рукой за задние
лапки, левой - за грудь. Белую мышь можно взять за кончик хвоста, поместить на
стол и, когда хвост при движении животного натягивается, левой рукой захватить
кожу головы или затылка между ушами. Крыс фиксируют так же, но при этом
обычно применяя корнцанги.

Работать с мелкими животными, например с мышами, можно и одному, без

помощника: для этого надо захватить указательным и большим пальцами левой
руки кожу затылка мыши между ушами и, повернув руку ладонью вверх, зажать
левую лапку и хвост между мизинцем и мягкой частью ладони. Свободной рукой
производят нужные манипуляции (рис. 29).

Рис. 29. Фиксация мыши без помощника

 Подготовка инструментов для проведения эксперимента. Шприцы, иглы,
пинцеты, скальпели, предназначенные для заражения животных, стерилизуют
кипячением. Шприцы предварительно разбирают, закладывают в сетку
стерилизатора, кипятят 30 мин, затем стерильно собирают при помощи пинцета.

Животное можно заражать нативным материалом: гноем, мокротой, кровью,

эмульсией из органов и т. д. и взвесью микробов, густоту которой определяют с
помощью оптического стандарта.

Материал, предназначенный для инъекции, помещают в стерильную посуду.

Чтобы избежать разбрызгивания исследуемого материала, наполнение шприца
производят крайне осторожно. Для этого отверстие иглы опускают ниже
поверхности материала и осторожно, медленно набирают в цилиндр шприца
количество материала несколько больше, чем требуется. Затем поворачивают
шприц вертикально (иглой вверх) и, покрывая кончик иглы стерильной ватой,
выталкивают из шприца пузырьки воздуха и избыток материала. Грязную вату
сбрасывают пинцетом в дезинфицирующий раствор.

Контрольные вопросы
1. Что означает понятие "биологический метод"?

2. Что необходимо учитывать при выборе лабораторного животного?

3. Каких животных обычно используют для эксперимента?

4. Каким требованиям должно отвечать помещение вивария? Из каких отделений

состоит виварий?

5. Как маркируют лабораторных животных?

6. Для чего фиксируют животных? Какие приспособления для этого существуют?

7. Как следует наполнять шприц, чтобы избежать разбрызгивания материала?

Задание
Простерилизуйте шприц. Соберите его. Наполните изотоническим раствором
натрия хлорида, накройте кончик иглы ватой и вытолкните из шприца пузырьки
воздуха и избыток материала (изотонический раствор натрия хлорида).

Способы заражения

Существуют следующие способы введения материала: подкожный,

внутрикожный, накожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный,
пероральный (через рот), интраназальный (через нос в дыхательный тракт);
введение в глаз, введение в центральную нервную систему и т. д.

Участок, где должна быть сделана инъекция, разрез или пункция, называют
операционным полем. Чаще применяют подкожное введение материала. Для
введения животным материала внутрикожно, подкожно или накожно необходимо
освободить операционное поле от шерсти. Шерсть можно выстричь (для этого
применяют ножницы с загруженными краями, чтобы избежать порезов), выщипать
или удалить при помощи бритвы, растягивая для этого кожу большим и
указательным пальцами левой руки (чтобы не поранить кожу).

В некоторых случаях для полного удаления шерсти применяют депиляторий *,

однако им можно пользоваться только за 2-3 дня до опыта, так как он иногда
вызывает раздражение кожи. После применения депилятория кожу очищают от
шерсти, промывают теплой водой и смазывают вазелином.
*
(Состав депилятория: 7 частей талька, 7 частей белой муки, 1 часть мыльного порошка и 3 части
сернистонатриевого сплава.)

При любом способе удаления шерсти перед инъекцией операционное поле

дезинфицируют спиртом или спиртовым раствором йода.

Подкожное введение. Место введения выбирают в зависимости от вида

животного. Кроликам материал обычно вводят под кожу спины, морским свинкам -
под кожу живота или бока, мышам и крысам - под кожу спины или затылка.

Для подкожного введения кожу животного захватывают в складку, иглу

вкалывают у основания образовавшейся складки, медленно вводят ее до половины,
чуть отклоняя в сторону, чтобы не вылился вводимый материал, затем опускают
складку, накладывают на иглу вату, смоченную спиртом или спиртовым раствором
йода, и быстро извлекают иглу.

Внутрикожное введение. Этот способ наиболее часто применяют при

алергических пробах и введении токсина (например, дифтерийного). Необходимо
иметь тонкие, острые иглы (№ 18-20) с короткой бородкой. Удобно использовать
туберкулиновый шприц. Кожу, освобожденную от шерсти, растягивают большим и
указательным пальцами; иглу вводят под острым углом срезом вверх. Правильно
введенная игла просвечивает сквозь эпидермис. Исследуемый материал вводят
медленно; на месте введения образуется пузырек, который быстро рассасывается.

Накожный способ. Поверхность кожи после удаления шерсти скарифицируют *.

Исследуемый материал наносят а скарифицированный участок и втирают шпателем
или стерильной палочкой. Животное должно быть зафиксировано до тех пор, пока
нанесенный материал не просохнет.
*
(Скарификацией называют повреждение поверхности кожи, которое производят любым остроконечным
инструментом: скальпелем, иглой или специальным скарификатором.)

Внутримышечное введение. Материал вводят в толщу мышцы, чаще в мышцу

бедр. Для этого удобно захватить мышцу указательным и большим пальцами левой
руки; правой рукой под прямым углом вводят иглу.

Внутрибрюшинное введение. При этом способе введения животное следует

держать вертикально головой вниз (для перемещения внутренних органов к
диафрагме). Иглу вводят в нижнюю часть живота, чуть отступя от средней линии -
такое положение уменьшает возможность ранения кишечника. Кроликам и морским
свинкам предварительно делают небольшую надсечку верхнего слоя кожи.
Применяют иглы с короткой бородкой, которые вводят под острым углом. После
прокола кожи шприц переводят в горизонтальное положение и уже под прямым
углом к брюшной стенке проталкивают иглу до ощущения "провала", затем ее
вновь переводят в вертикальное положение и вводят исследуемый материал.

Внутривенное введение. При этом методе выбор вены зависит от вида

животного: кроликам материал вводят в краевую вену уха, мышам и крысам - в
вену хвоста, морским свинкам - непосредственно в сердце, так как их вены
малодоступны для инъекций.

Для внутривенных инъекций используют иглы с длинной бородкой. Животные

должны быть иммобилизованы. После фиксации животного для лучшего выявления
вены кожу протирают ватой, смоченной ксилолом или теплой водой. Можно также
пощелкать участок кожи, где расположена вена, кончиками пальцев и прижать вену
у корня хвоста или уха - эти манипуляции способствуют набуханию вены. Затем
экспериментатор левой рукой фиксирует место введения, шприцем, находящимся в
правой руке, прокалывает кожу и под очень острым углом, почти параллельно вене,
вводит иглу срезом вверх. Если игла не попала в вену, то при надавливании поршня
ощущается затруднение и в месте введения появляется белый пузырек,
образованный жидкостью, попавшей в ткань. В этом случае иглу извлекают и
производят новый укол ближе к корню хвоста (если вводят в вену хвоста) или к
основанию уха (если вводят в вену уха). При попадании иглы в вену жидкость
свободно проходит в нее. После того как материал введен, иглу прижимают
немного ниже места укола, накладывают на это место кусок стерильной ваты, после
чего иглу извлекают. Место инъекции протирают спиртом или спиртовым
раствором йода.

Морским свинкам исследуемый материал вводят в сердце. Для этого двумя

пальцами левой руки прощупывают сердечный толчок и через межреберный
промежуток вкалывают иглу в место толчка. При попадании иглы в сердце в
шприце показывается кровь, и тогда вводят весь материал.

При инъекциях, особенно в ток крови (в вену, в сердце), вводимая жидкость

должна быть свободна от пузырьков воздуха, которые могут вызвать газовую
эмболию.

Введение через пищеварительный тракт. Существует несколько способов

перорального (через рот) заряжения. Самый простой из них - это примешивание
исследуемого материала к пище животного. Этот способ хорош тем, что близок к
естественному, однако в этом случае трудно учесть количество вводимого
материала. Второй способ - введение материала в желудок с помощью зонда,
диаметр и длина которого зависят от вида животного. Вводить зонд следует после
того, как в рот животного вставлен роторасширитель. Предварительно зонд
смазывают вазелином. Когда введенный зонд достигает носоглотки, в рот вливают
несколько капель воды и в момент глотания продвигают зонд. Правильно
вставленный зонд должен продвигаться легко и свободно. После того как трубка
достигнет желудка, через наружный ее конец шприцем без иглы вводят нужное
количество исследуемого материала. Третий способ - закапывание шприцем с
иглой. Для этого животное фиксируют в вертикальном положении, открывают рот
пинцетом или надавливая двумя пальцами на щеки, и вводят исследуемый материал
по каплям, причем каждую каплю вводят только после того, как животное
проглотило предыдущую. Такое медленное введение необходимо для устранения
возможности попадания жидкости в дыхательные пути. Наконец, исследуемый
материал можно вводить в пищевод при помощи шприца с иглой, имеющей на
конце оливу. Диаметр иглы должен быть 1 мм, длина зависит от вида животного:
30-40 мм для мышей, 70-80 мм для крыс и т. д.

При таком способе введения животное фиксируют также в вертикальном

положении, открывают ему рот пинцетом и вводят иглу, ведя ее по задней стенке
зева, затем переводят иглу в вертикальное положение и очень медленно вливают
жидкость.

Введение через дыхательные пути. Интраназально (через нос) заражение

проводят двумя различными способами. Наиболее простым способом является
закапывание исследуемого материала через нос шприцем (чтобы не поранить
слизистую оболочку, пользуются тупой иглой). Заражение осуществляют под
легким эфирным наркозом; к носу прикладывают вату, смоченную эфиром, под
действием которого животное начинает глубоко дышать, втягивая при этом
вводимый материал.

Второй способ - закапывание исследуемого материала в ноздри пипеткой (по

каплям); при этом способе животное фиксируют брюшком вверх.

Введение в глаз. Вводить материал можно несколькими способами. Производят

заражение через конъюнктиву. Для этого, придерживая веко, пипеткой закапывают
в глаз исследуемый материал (1-2 капли). Второй способ - субконъюнктивальный.
Материал вводят тонкой иглой под конъюнктиву. Этим путем можно ввести 0,1-0,2
мл. Третий способ - введение материала в скарифицированную роговую оболочку;
при этом способе животное необходимо фиксировать. Глаз прижимают пинцетом,
роговую оболочку скарифицируют концом скальпеля или обычной иглой; в
скарифицированную роговую оболочку тонким стеклянным шпателем или ватным
тампоном втирают исследуемый материал. Этот способ применяют большей частью
при опытах на кроликах и собаках, реже на морских свинках и других животных.

Контрольные вопросы
1. Что такое операционное поле и как его обрабатывают?

2. Какие способы заражения животных Вы знаете?

3. От чего зависит количество вводимого животному материала?

Задание
Нарисуйте схему маркировок белой мыши. Нанесите краску на схему так, чтобы
номер животного соответствовал 3.

В табл. 12 приведены величины максимального количества вводимой жидкости в

зависимости от вида животных и способа введения.
 Таблица 12. Схема введения инфицированного материала животным

Вскрытие и микробиологическое исследование погибших

животных

При экспериментальном заражении вскрытие животного после его гибели,

характер изменений и результат бактериологического исследования внутренних
органов позволяют выяснить причину смерти животного, пути распространения
возбудителей в организме и место их локализации. В некоторых случаях животных
приходится умерщвлять на определенных этапах эксперимента. Существует
несколько способов умерщвления. Наиболее часто применяют следующий:
животное помещают в банку или плотно закрывающийся сосуд, в который
опускают кусок ваты, смоченный эфиром или хлороформом. Гибель животного
наступает через несколько минут. Одним из способов умерщвления мелких
животных, например мышей, является декапитация (мышам срезают голову). Для
умерщвления кроликов используют воздушную эмболию: вводят иглу в вену,
соединяют ее со шприцем без жидкости и, нажимая на поршень, вводят воздух в
вену; животное погибает мгновенно.

Вскрытие следует производить непосредственно после гибели животного, чтобы

избежать проникновения микроорганизмов из кишечника в кровь и другие органы.
При отсутствии такой возможности трупы сохраняют на холоду.

Вскрытие производят на специальном столе, в отдельной комнате, если такая

имеется.

На столе должно находиться все необходимое для вскрытия,

бактериологического исследования патолого-анатомического материала: доска или
кювета, залитая парафином, для фиксации животного; газовая горелка или
спиртовка; сосуд со спиртом и ватой на дне, в котором находятся
простерилизованные инструменты (ножницы, скальпель, хирургический и
анатомический пинцеты и др.); стерильные ватные тампоны, бактериальная петля,
стерильные пастеровские пипетки, предметные стекла, чашки Петри, пробирки с
питательными средами. Выбор сред зависит от вида микроорганизмов, которых
считают причиной гибели животного.
 Все наблюдения, сделанные во время вскрытия, протоколируют. Отмечают вид
животного, номер, время и место заражения, материал, примененный для
заражения, время гибели, обнаруженные изменения и т. д.

Во время вскрытия надо следить за тем, чтобы жидкость и кусочки тканей и

органов не попали на стол. После каждой манипуляции инструменты промывают
водой или спиртом и прожигают. Сделанные посевы надписывают. Мазки
фиксируют в пламени горелки или в специальной фиксирующей жидкости
(например, в смеси Никифорова).

Вскрытие состоит из следующих этапов: 1) фиксация животного; 2) осмотр

наружных покровов; 3) вскрытие и исследование грудной полости; 4) вскрытие и
исследование брюшной полости.

Фиксация. Животных укладывают брюшком вверх. Кроликов и морских свинок

привязывают за лапки к находящимся в углах доски крючкам или кольцам. Мышам
и крысам лапки можно приколоть кнопками или иглами. Лапки при этом широко
раздвигают.

Осмотр наружных покровов. Ватой, смоченной дезинфицирующим раствором,

протирают всю поверхность тела. Осматривают наружные покровы и делают разрез
кожи по средней линии, начиная от лобка до нижней челюсти, стараясь не
повредить при этом боковые надрезы. Инструменты, использованные для вскрытия
кожи, протирают, обжигают или меняют и только тогда продолжают вскрытие.
Пинцетом захватывают край кожного лоскута и скальпелем отсепаровывают его от
подкожной клетчатки. Отмечают состояние паховых и подмышечных
лимфатических узлов, подкожной клетчатки, расширение сосудов, кровоизлияние,
нагноения и т. д.

При обнаружении изменения лимфатических узлов (припухания, отека,

нагноения) делают мазки и посев их содержимого на специальные среды.

Для вскрытия грудной полости захватывают пинцетом мечевидный отросток, под

ним делают разрез, в который вставляют ножницы, и перерезают с обеих сторон
ребра в месте соединения их с хрящами грудной кости. Грудину отбрасывают вверх
и осматривают грудную полость. При осмотре легких и сердца отмечают их цвет,
величину, консистенцию. При наличии изменений производят посев и делают
мазки из измененной части легкого. Далее срезают кусочек легкого и опускают его
в баночку или пробирку с водой. Здоровое легкое всплывает на поверхность,
больное тонет. Обязательно делают посев крови из сердца. Для этого
придерживают сердце пинцетом у его основания, прижигают раскаленным
скальпелем верхушку сердца и стерильной пастеровской пипеткой прокалывают
прожженный участок, кровь при этом поднимается в капилляр. Набранную кровь
выдувают по каплям в питательные среды и делают из нее мазки.

При вскрытии брюшной полости пинцетом приподнимают кожу брюшной

стенки, ножницами делают разрез от лобка до диафрагмы, затем делают два
боковых надреза - у лобка и диафрагмы, широко открывая этим брюшную полость.
Осматривают все органы брюшной полости, из измененных органов делают посев
на питательные среды, мазки и мазки-отпечатки. При отсутствии внешних
изменений обязательно производят посев и делают мазки из селезенки, печени и
мезентериальных узлов. Для посева прижженную поверхность органа надрезают
стерильным скальпелем, из глубины органа вырезают кусочек, часть его опускают в
питательную среду, из другой части делают мазки-отпечатки, прикладывая
срезанную часть к стеклу, и мазки. Отпечатки всех органов можно сделать на одном
стекле, соблюдая определенную последовательность в их расположении. Этот
метод принят при эксперименте на животных, зараженных возбудителями особо
опасных инфекций. Зная последовательность расположения отпечатков различных
органов, можно не надписывать каждый отпечаток (рис. 30).

Рис. 30. Приготовление мазков-отпечатков органов и мазка крови на одном стекле. 1

- лимфатические узлы; 2 - легкое; 3 - селезенка; 4 - печень; 5 - мазок крови

После окончания вскрытия производят тщательную уборку рабочего места. Труп

животного укладывают в банку или специальный сосуд (например, ведро) и под
контролем ответственного лица сжигают или автоклавируют. Если нельзя
уничтожить труп сразу после вскрытия, его заливают дезинфицирующим раствором
(5% карболовая кислота или 5% лизол). Доску или кювету протирают спиртом и
прожигают или заливают на сутки дезинфицирующим раствором. Инструменты
осторожно с помощью чистого пинцета укладывают в стерилизатор и кипятят 30-40
мин. После работы с патогенными спорообразующими бактериями инструменты
автоклавируют. Посевы помещают в термостат.

Зафиксированные мазки окрашивают и изучают.

Контрольные вопросы
1. С какой целью проводят вскрытие лабораторных животных?

2. Из каких этапов состоит вскрытие лабораторных животных?

3. Как готовят мазки и мазки-отпечатки из органов и тканей? Какие правила надо

соблюдать при приготовлении отпечатков на одном предметном стекле?

4. Как дезинфицируют оборудование и инструменты в ходе и по окончании

вскрытия?

В микробиологической практике животных используют также в качестве

доноров. Кровь животных применяют как в цельном виде, так и для получения ее
отдельных составных частей (сыворотка, плазма, эритроциты и т. д.). Кровь и
сыворотка крови могут быть использованы как ингредиенты сред, а также для
изучения иммунных свойств после вакцинации.
 Чаще используют кровь кролика, морских свинок, реже - крыс и мышей, из
крупных животных - кровь лошадей, баранов, быков.

Способ получения крови зависит от вида животного и цели исследования.

Техника взятия крови у животных

У кролика небольшое количество крови берут обычно из краевой вены уха, у

крыс и мышей - из вены хвоста, у морских свинок ввиду плохо развитых
поверхностных вен - непосредственно из сердца. Кровь из сердца можно брать и у
других лабораторных животных.

В случае, когда донорами являются крупные животные (лошади, бараны), кровь

берут из яремной вены.

Для взятия небольшого количества крови у кролика выщипывают шерсть с

наружной поверхности уха, дезинфицируют кожу и вызывают гиперемию,
пощелкивая по вене пальцами или протирая ухо ватой, смоченной теплой водой
(применять ксилол не следует, так как он может вызвать лизис - растворение
эритроцитов).

Кроме того, можно прижать вену у корня уха, что также способствует гиперемии.
Затем экспериментатор большим и указательным пальцами захватывает кончик уха
(фиксируя его) и вводит иглу без шприца по ходу вены. Капающую из иглы кровь
собирают в стерильную пробирку, после чего иглу извлекают, место укола
дезинфицируют спиртом или спиртовым раствором йода.

При взятии крови из вены хвоста у мышей и крыс ампутируют кончик хвоста.
Вытекающую из культи кровь собирают в стерильную пробирку или насасывают
пипеткой. Для остановки кровотечения культю прижигают перекисью водорода или
в пламени горелки.

При взятии крови из сердца животное фиксируют в горизонтальном положении

брюшком вверх, удаляют шерсть, дезинфицируют место укола, затем кончиками
пальцев левой руки прощупывают сердечный толчок и в этом месте вводят иглу.
Если игла попала в сердце, кровь сама поступает в шприц, подымая поршень.
Количество взятой крови зависит от вида животного и его массы (табл. 13).

Таблица 13. Максимальное количество крови, получаемой от лабораторных

животных

После одномоментного кровопускания животному следует ввести под кожу

изотонический раствор натрия хлорида, подогретый до температуры тела, в объеме,
равном объему взятой крови.
 При необходимости получить максимальное количество крови производят
тотальное кровопускание (полное обескровливание). При тотальном кровопускании
кровь чаще всего берут из сонной артерии. Животное фиксируют в горизонтальном
положении брюшком вверх, наркотизируют, поднося к носу смоченную эфиром
вату, и после обработки операционного поля делают разрез кожи на шее. Обнажают
сонную артерию, отсепаровывают ее, накладывают две шелковые лигатуры и
перерезают между ними артерию. Периферический конец артерии быстро
пережимают, а центральный захватывают пинцетом и опускают в стерильный
сосуд. Когда струя крови иссякнет, можно дополнительно собрать кровь, массируя
область сердца, печень и другие органы. Недостатком тотального кровопускания
является гибель животного.

Обработка и выделение составных частей крови

Получение дефибринированной крови. Кровь помещают в стерильную колбу

или баночку со стеклянными бусами и энергично встряхивают в течение 15-20 мин;
при этом фибрин оседает на бусах в виде сгустка. Свободную от фибрина кровь
переливают в стерильную посуду.

Получение цитратной крови. К крови добавляют вещество, предотвращающее

ее свертывание, - 5% раствор натрия цитрата в соотношении 1:10 (на 10 мл крови 1
мл 5% раствора натрия цитрата).

Получение плазмы. Жидкую часть крови получают из цитратной крови,

которую центрифугируют или ставят в холодильник на 18-20 ч. В результате над
осадком образуется слой жидкости желтоватого цвета - плазма.

Получение сыворотки крови (см. главу 12).

Получение взвеси эритроцитов. Взвесь эритроцитов получают из цельной и

дефибринированной крови.

Кровь центрифугируют в течение 15-20 мин при 2000-3000 об/мин. Эритроциты

оседают на дно, образовавшуюся над ними желтовато-красную жидкость сливают, а
в пробирки добавляют стерильный изотонический раствор натрия хлорида до
первоначального объема и вновь центрифугируют. Такое промывание эритроцитов
производят 2-3 раза, пока надосадочная жидкость не станет совершенно
бесцветной. Последнюю порцию надосадочной жидкости удаляют, а в пробирке
остается взвесь эритроцитов, которую можно использовать в течение 2-3 дней. Для
сохранения эритроцитов в течение более длительного срока их подвергают
обработке формалином. Для получения 50% взвеси к одному объему эритроцитов
добавляют два объема буферного раствора, имеющего рН 7,2, и при постоянном
помешивании такое же количество 3% раствора формалина. Полученную смесь
выдерживают на водяной бане при 37° С 2-3 ч, помешивая ее каждые 15-20 мин, а
затем в термостате (всего 20 ч при 37° С). На следующий день смесь
центрифугируют в том же растворе, сливают надосадочную жидкость, а осадок
доводят до первоначального объема буферным раствором, разливают по флаконам,
плотно закрывают и хранят при 4° С.
 Контрольные вопросы
1. Какова техника взятия крови у кроликов, морских свинок, крыс, мышей и
какие из них чаще служат донорами?

2. Что такое тотальное кровопускание?

3. Какие максимальные количества крови можно получить от лабораторных

животных при одномоментном и тотальном кровопускании?

4. Как получить нитратную и дефибринированную кровь и составные части

крови: плазму, сыворотку, взвесь эритроцитов?

Задание
Возьмите пробирку с кровью и получите из нее сыворотку.

Глава 12. Учение об иммунитете. Реакции

иммунитета. Иммунопрофилактика и
иммунотерапия инфекционных болезней - Л. Б.
Богоявленская, Г. И. Кац
Понятие иммунитет обозначает невосприимчивость организма ко всяким
генетически чужеродным агентам, в том числе и болезнетворным микроорганизмам
и их ядам (от лат. immunitas - освобождение от чего-либо).

При попадании в организм генетически чужеродных структур (антигенов)

приходит в действие целый ряд механизмов и факторов, которые распознают и
обезвреживают эти чуждые для организма субстанции.

Система органов и тканей, осуществляющая защитные реакции организма против

нарушения постоянства его внутренней среды (гомеостаза), называется иммунной
системой.

Наука об иммунитете - иммунология изучает реакции организма на чужеродные

вещества, в том числе и микроорганизмы; реакции организма на чужеродные ткани
(совместимость) и на злокачественные опухоли; определяет иммунологические
группы крови и т. д. Основы иммунологии были заложены стихийными
наблюдениями древних о возможности искусственного предохранения человека от
заразной болезни. Наблюдения за людьми, находившимися в очаге эпидемии,
привели к заключению, что заболевают не все. Так, не болеют чумой
выздоровевшие от этой болезни; корью обычно болеют один раз в детстве;
перенесшие коровью оспу, не болеют натуральной и т. п.

Известны способы древних народов предохранять от укуса змеи, втирая в

насечки на коже растения, растертые со змеиным ядом; защищать стада от
перипневмонии скота, делая также насечки на коже кинжалом, предварительно
погруженном в легкие быка, погибшего от этого заболевания.
 Впервые искусственную прививку с целью предупреждения инфекции произвел
Э. Дженнер (1876). Однако только Л. Пастер сумел научно обосновать принципы
искусственной защиты от инфекционных болезней. Он доказал, что заражение
ослабленными возбудителями ведет к невосприимчивости организма при
повторных встречах с этими микроорганизмами.

Пастер разработал препараты, предохраняющие от заболевания сибирской язвой

и бешенством.

Дальнейшее развитие иммунология получила в работах И. И. Мечникова о

значении клеточного иммунитета (фагоцитоза) и П. Эрлиха о роли гуморальных
факторов (жидкостей организма) для развития невосприимчивости.

В настоящее время иммунология - это наука, в которой защита от инфекционных

болезней является лишь одним из звеньев. Она объясняет причины совместимости и
отторжения тканей при пересадке органов, гибель плода при резус-конфликтной
ситуации, осложнения при переливании крови, решает задачи судебной медицины и
т. п.

Основные виды иммунитета представлены на схеме.

Виды иммунитета

Наследственный (видовой) иммунитет

Наследственный (видовой) иммунитет - это наиболее прочная и совершенная
форма невосприимчивости, которая обусловлена передающимися по наследству
факторами резистентности (устойчивости).

Известно, что человек невосприимчив к чуме собак и рогатого скота, а животные

не болеют холерой и дифтерией. Однако наследственный иммунитет не абсолютен:
создавая особые, неблагоприятные условия для макроорганизма, можно изменить
его невосприимчивость. Например, перегрев, охлаждение, авитаминоз, действие
гормонов приводят к развитию заболевания, которое обычно человеку или
животному несвойственно. Так, Пастер, охлаждая кур, вызывал у них при
искусственном заражении заболевание сибирской язвой, которой они в обычных
условиях не болеют.

Приобретенный иммунитет
Приобретенный иммунитет у человека формируется в течение жизни, по
наследству он не передается.
 Естественный иммунитет. Активный иммунитет формируется после
перенесенного заболевания (его называют постинфекционным). В большинстве
случаев он длительно сохраняется: после кори, ветряной оспы, чумы и др. Однако
после некоторых заболеваний длительность иммунитета невелика и не превышает
одного года (грипп, дизентерия и др.). Иногда естественный активный иммунитет
развивается без видимого заболевания. Он формируется в результате скрытой
(латентной) инфекции или многократного инфицирования небольшими дозами
возбудителя, не вызывающими явно выраженного заболевания (дробная, бытовая
иммунизация).

Пассивный иммунитет - это иммунитет новорожденных (плацентарный),

приобретенный ими через плаценту в период внутриутробного развития.
Новорожденные могут также получить иммунитет с молоком матери. Этот вид
иммунитета непродолжителен и к 6-8 мес, как правило, исчезает. Однако значение
естественного пассивного иммунитета велико - он обеспечивает
невосприимчивость грудных детей к инфекционным заболеваниям.

Искусственный иммунитет. Активный иммунитет человек приобретает в

результате иммунизации (прививок). Этот вид иммунитета развивается после
введения в организм бактерий, их ядов, вирусов, ослабленных или убитых разными
способами (прививки против коклюша, дифтерии, оспы).

При этом в организме происходит активная перестройка, направленная на

образование веществ, губительно действующих на возбудителя и его токсины
(антитела). Происходит также изменение свойств клеток, уничтожающих
микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности. Развитие активного
иммунитета происходит постепенно в течение 3-4 нед и сохраняется он
сравнительно длительное время - от 1 года до 3-5 лет.

Пассивный иммунитет создают введением в организм готовых антител. Этот вид

иммунитета возникает сразу после введения антител (сывороток и
иммуноглобулинов), но сохраняется всего 15-20 дней, после чего антитела
разрушаются и выводятся из организма.

Понятие "местный иммунитет" было введено А. М. Безредкой. Он считал, что

отдельные клетки и ткани организма обладают определенной восприимчивостью.
Иммунизируя их, создают как бы барьер для проникновения возбудителей
инфекции. В настоящее время доказано единство местного и общего иммунитета.
Но значение невосприимчивости отдельных тканей и органов к микроорганизмам
несомненно.

Помимо указанного выше разделения иммунитета по происхождению, различают

формы иммунитета, направленные на разные антигены.

Антимикробный иммунитет развивается при заболеваниях, обусловленных

различными микроорганизмами или при введении корпускулярных вакцин (из
живых ослабленных или убитых микроорганизмов).

Антитоксический иммунитет вырабатывается по отношению к бактериальным

ядам - токсинам.
 Антивирусный иммунитет формируется после вирусных заболеваний. Этот вид
иммунитета большей частью длительный и стойкий (корь, ветряная оспа и др.).
Антивирусный иммунитет развивается также при иммунизации вирусными
вакцинами.

Кроме того, иммунитет можно разделить в зависимости от периода

освобождения организма от возбудителя.

Стерильный иммунитет. Большинство возбудителей исчезает из организма при

выздоровлении человека. Этот вид иммунитета называют стерильным (корь, оспа и
др.).

Нестерильный иммунитет. Восприимчивость к возбудителю инфекции

сохраняется только в период пребывания его в организме хозяина. Такой
иммунитет называют нестерильным или инфекционным. Этот вид иммунитета
наблюдают при туберкулезе, сифилисе и некоторых других инфекциях.

Контрольные вопросы

1. Что такое иммунитет?

2. Какие Вы знаете формы иммунитета?

Невосприимчивость человека к инфекционным заболеваниям обусловлена

совместным действием неспецифических и специфических факторов защиты.

Неспецифическими называют врожденные свойства организма, которые

способствуют уничтожению самых различных микроорганизмов на поверхности
тела человека и в полостях его организма.

Развитие специфических факторов защиты происходит после соприкосновения

организма с возбудителями или токсинами; действие этих факторов направлено
только против этих возбудителей или их токсинов.

Неспецифические факторы защиты организма

Существуют механические, химические и биологические факторы,
предохраняющие организм от вредных воздействий различных микроорганизмов.

Кожа. Неповрежденная кожа является барьером для проникновения

микроорганизмов. При этом имеют значение механические факторы: отторжение
эпителия и выделения сальных и потовых желез, которые способствуют удалению
микроорганизмов с кожи.

Роль химических факторов защиты также выполняют выделения желез кожи

(сальных и потовых). Они содержат жирные и молочные кислоты, обладающие
бактерицидным (убивающим бактерии) действием.

Биологические факторы защиты обусловлены губительным воздействием

нормальной микрофлоры кожи на патогенные микроорганизмы.
 Слизистые оболочки разных органов являются одним из барьеров на пути
проникновения микроорганизмов. В дыхательных путях механическая защита
осуществляется с помощью мерцательного эпителия. Движение ресничек эпителия
верхних дыхательных путей постоянно передвигает пленку слизи вместе с
различными микроорганизмами по направлению к естественным отверстиям:
ротовой полости и носовым ходам. Такое же воздействие на бактерий оказывают
волоски носовых ходов. Кашель и чиханье способствуют удалению
микроорганизмов, предотвращают их аспирацию (вдыхание).

В слезах, слюне, материнском молоке и других жидкостях организма содержится

лизоцим. Он оказывает губительное (химическое) действие на микроорганизмы.
Также влияет на микроорганизмы кислая среда желудочного содержимого.

Нормальная микрофлора слизистых оболочек, как фактор биологической

защиты, является антагонистом патогенных микроорганизмов.

Контрольные вопросы

1. Что такое неспецифические факторы защиты?

2. Какие факторы препятствуют проникновению патогенных микроорганизмов

через кожу и слизистые оболочки?

Воспаление - реакция макроорганизма на чужеродные частицы, проникающие в

его внутреннюю среду. Одной из причин воспаления является внедрение в организм
возбудителей инфекции. Развитие воспаления приводит к уничтожению
микроорганизмов или освобождению от них.

Воспаление характеризуется нарушением циркуляции крови и лимфы в очаге

поражения. Оно сопровождается повышением температуры, отеком, краснотой и
болевыми ощущениями.

Клеточные факторы неспецифической защиты

Фагоцитоз

Одним из основных механизмов воспаления является фагоцитоз - процесс

поглощения бактерий.

Явление фагоцитоза впервые описано И. И. Мечниковым. Он начал изучение

фагоцитоза от одноклеточной амебы, для которой фагоцитоз является способом
усвоения пищи. Проследив этот процесс на разных ступенях развития животного
мира, И. И. Мечников завершил его открытием специализированных клеток
человека, с помощью которых происходит уничтожение бактерий, рассасывание
мертвых клеток, очагов кровоизлияний и т. д. Так было создано учение о
фагоцитозе, которое и сегодня имеет огромное значение.

Фагоцитарной активностью обладают различные клетки организма (лейкоциты

крови, эндотелиальные клетки кровеносных сосудов). Наиболее выражена эта
активность у подвижных полиморфноядерных лейкоцитов, моноцитов крови и
тканевых макрофагов, в меньшей степени - у клеток костного мозга. Все
одноядерные фагоцитирующие клетки (и их костномозговые предшественники)
объединены в систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ).

Фагоцитирующие клетки имеют лизосомы, в которых находится более 25

различных гидролитических ферментов и белков, обладающих
антибактериальными свойствами.

Стадии фагоцитоза. Этап 1 - приближение фагоцита к объекту за счет

химического влияния последнего. Это движение называют положительным
хемотаксисом (в сторону объекта).

Этап 2 - прилипание микроорганизмов к фагоцитам.

Этап 3 - поглощение микроорганизмов клеткой, образование фагосомы.

Этап 4 - образование фаголизосомы, куда поступают ферменты и бактерицидные

белки, гибель и переваривание возбудителя.

Процесс, который заканчивается гибелью фагоцитированных микробов,

называется завершенным фагоцитозом.

Однако некоторые микроорганизмы, находясь внутри фагоцитов, не погибают, а

иногда даже размножаются в них. Это - гонококки, микобактерии туберкулеза,
бруцеллы. Такое явление называют незавершенным фагоцитозом; при этом
погибают фагоциты.

Как и другие физиологические функции, фагоцитоз зависит от состояния

организма - регулирующей роли центральной нервной системы, питания, возраста.

Фагоцитарная деятельность лейкоцитов изменяется при многих и часто

неинфекционных заболеваниях. Определяя ряд показателей фагоцитоза, можно
установить течение болезни - выздоровление или ухудшение состояния больного,
эффективность проводимого лечения и пр.

Для оценки функционального состояния фагоцитов чаще всего определяют

поглотительную активность по двум тестам: 1) фагоцитарный показатель - процент
фагоцитирующих клеток (число лейкоцитов с поглощенными микробами из 100
наблюдаемых); 2) фагоцитарное число - среднее количество поглощенных одним
лейкоцитом микробов или других объектов фагоцитоза.

Бактерицидные возможности фагоцитов определяют по числу лизосом,

активности внутриклеточных ферментов и другими методами.

Активность фагоцитоза связана с наличием в сыворотке крови антител -

опсонинов. Эти антитела усиливают фагоцитоз, готовят поверхность клетки к
поглощению ее фагоцитом.

Активность фагоцитоза в значительной степени определяет невосприимчивость

организма к тому или иному возбудителю. При одних заболеваниях фагоцитоз
является основным фактором защиты, при других - вспомогательным. Однако во
всех случаях отсутствие фагоцитарной способности клеток резко ухудшает течение
и прогноз заболевания.

Клеточная реактивность

Развитие инфекционного процесса и формирование иммунитета полностью

зависят от первичной чувствительности клеток к возбудителю. Наследственный
видовой иммунитет - пример отсутствия чувствительности клеток одного вида
животных к микроорганизмам, патогенным для других. Механизм этого явления
изучен недостаточно. Известно, что реактивность клеток меняется с возрастом и
под влиянием различных факторов (физических, химических, биологических).

Контрольные вопросы

1. Что такое фагоцитоз?

2. Какие стадии фагоцитоза Вы знаете?

3. Что такое завершенный и незавершенный фагоцитоз?

Гуморальные факторы неспецифической защиты

Помимо фагоцитов, в крови находятся растворимые неспецифические вещества,

губительно действующие на микроорганизмы. К ним относятся комплемент,
пропердин, β-лизины, х-лизины, эритрин, лейкины, плакины, лизоцим и др.

Комплемент (от лат. complementum - дополнение) представляет собой сложную

систему белковых фракций крови, обладающую способностью лизировать
микроорганизмы и другие чужеродные клетки, например эритроциты. Различают
несколько компонентов комплемента: С1, С2, С3 и т. д. Комплемент разрушается при
температуре 55° С в течение 30 мин. Это свойство называется термолабильностью.
Он разрушается также при встряхивании, под влиянием УФ-лучей и т. п. Помимо
сыворотки крови, комплемент обнаружен в различных жидкостях организма и в
воспалительном экссудате, но отсутствует в передней камере глаза и
спинномозговой жидкости.

Пропердин (от лат. properde - подготовлять) - группа компонентов нормальной

сыворотки крови, активирующая комплемент в присутствии ионов магния. Он
сходен с ферментами и играет важную роль в устойчивости организма к инфекции.
Снижение уровня пропердина в сыворотке крови свидетельствует о недостаточной
активности иммунных процессов.

β-лизины - термостабильные (устойчивые к действию температуры) вещества

сыворотки крови человека, обладающие антимикробным действием, в основном по
отношению к грамположительным бактериям. Разрушаются при 63° С и под
действием УФ-лучей.

Х-лизин - термостабильное вещество, выделенное из крови больных с высокой

температурой. Обладает способностью без участия комплемента лизировать
бактерии, главным образом грамотрицательные. Выдерживает нагревание до 70-
100° С.
 Эритрин выделен из эритроцитов животных. Оказывает бактериостатическое
действие на возбудителей дифтерии и некоторые другие микроорганизмы.

Лейкины - бактерицидные вещества, выделенные из лейкоцитов.

Термостабильны, разрушаются при 75-80° С. Обнаруживаются в крови в очень
небольших количествах.

Плакины - сходные с лейкинами вещества, выделенные из тромбоцитов.

Лизоцим - фермент, разрушающий оболочку микробных клеток. Он содержится в

слезах, слюне, жидкостях крови. Быстрое заживление ран конъюнктивы глаза,
слизистых оболочек полости рта, носа объясняется в значительной степени
наличием лизоцима.

Бактерицидными свойствами обладают также составные компоненты мочи,

простатическая жидкость, экстракты различных тканей. В нормальной сыворотке
содержится в небольшом количестве интерферон.

Контрольные вопросы

1. Что такое гуморальные факторы неспецифической защиты?

2. Какие гуморальные факторы неспецифической защиты Вы знаете?

Специфические факторы защиты организма

(иммунитет)
Перечисленные выше компоненты не исчерпывают всего арсенала факторов
гуморальной защиты. Главными среди них являются специфические антитела -
иммуноглобулины, образующиеся при введении в организм чужеродных агентов -
антигенов.

Антигены

Антигены - генетически чужеродные для организма вещества (белки,

нуклеопротеиды, полисахариды и др.), на введение которых организм отвечает
развитием специфических иммунологических реакций. Одна из таких реакций -
образование антител.

Антигены обладают двумя основными свойствами: 1) иммуногенностью, т. е.

способностью вызывать образование антител и иммунных лимфоцитов; 2)
способностью вступать с антителами и иммунными (сенсибилизированными)
лифоцитами в специфическое взаимодействие, которое проявляется в виде
иммунологических реакций (нейтрализации, агглютинации, лизиса и др.).
Антигены, обладающие обоими признаками, называются полноценными. К ним
относятся чужеродные белки, сыворотки, клеточные элементы, токсины, бактерии,
вирусы.

Вещества, не вызывающие иммунологических реакций, в частности выработку

антител, но вступающие в специфическое взаимодействие с готовыми антителами,
получили название гаптенов - неполноценных антигенов. Гаптены приобретают
свойства полноценных антигенов после соединения с крупномолекулярными
веществами - белками, полисахаридами.

Условиями, определяющими антигенные свойства различных веществ, являются:

чужеродность, макромолекулярность, коллоидное состояние, растворимость.
Проявляется антигенность при попадании вещества во внутреннюю среду
организма, где происходит встреча его с клетками иммунной системы.

Специфичность антигенов, способность их соединяться только с

соответствующим антителом - уникальное биологическое явление. Оно лежит в
основе механизма сохранения постоянства внутренней среды организма. Это
постоянство обеспечивает иммунная система, распознающая и уничтожающая
генетически чужеродные вещества (в том числе и микроорганизмы, их яды),
находящиеся в его внутренней среде. Иммунная система человека несет
постоянный иммунологический надзор. Она способна распознавать чужеродность
при отличии клетки всего по одному гену (раковые).

Специфичность - особенность строения веществ, по которой антигены

отличаются друг от друга. Она определяется антигенной детерминантой, т. е.
небольшим участком молекулы антигена, который и соединяется с антителом.
Число таких участков (группировок) у разных антигенов различно и определяет
число молекул антител, с которыми может соединяться антиген (валентность).

Способность антигенов соединяться только с теми антителами, которые

возникли в ответ на активацию иммунной системы данным антигеном
(специфичность), используется в практике: 1) диагностика инфекционных болезней
(определение специфических антигенов возбудителя или специфических антител в
сыворотке крови больного); 2) профилактика и лечение больных инфекционными
болезнями (создание невосприимчивости к определенным микробам или токсинам,
специфическая нейтрализация ядов возбудителей ряда болезней при
иммунотерапии).

Иммунная система четко дифференцирует "свои" и "чужие" антигены, реагируя

только на последние. Однако возможны реакции на собственные антигены
организма - аутоантигены и возникновение против них антител - аутоантител.
Аутоантигенами становятся "забарьерные" антигены - клетки, вещества, которые в
течение жизни идивидуума не контактируют с иммунной системой (хрусталик
глаза, сперматозоиды, щитовидная железа и др.), а приходят в соприкосновение с
ней при различных повреждениях, всасываясь обычно в кровь. А поскольку при
развитии организма эти антигены не распознавались как "свои", то не
сформировалась естественная толерантность (специфическая иммунологическая
безответность), т. е. в организме остались клетки иммунной системы, способные к
иммунному ответу на эти собственные антигены.

В результате появления аутоантител могут развиться аутоиммунные заболевания

как следствие: 1) прямого цитотоксического действия аутоантител на клетки
соответствующих органов (например, зоб Хасимото - повреждение щитовидной
железы); 2) опосредованного действия комплексов аутоантиген - аутоантитело,
которые откладываются в поражаемом органе и вызывают его повреждение
(например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит).
 Антигены микроорганизмов. Микробная клетка содержит большое число
антигенов, имеющих разное расположение в клетке и разное значение для развития
инфекционного процесса. У разных групп микроорганизмов антигены имеют
различный состав. У кишечных бактерий хорошо изучены О-, К-, Н-антигены.

О-антиген связан с клеточной стенкой микробной клетки. Его обычно называли

"соматическим", так как считали, что этот антиген заключен в теле (соме) клетки.
О-антиген грамотрицательных бактерий - сложный липополисахаридно-
протеиновый комплекс (эндотоксин). Он термостабилен, не разрушается при
обработке спиртом и формалином. Состоит из основного ядра (core) и боковых
полисахаридных цепей. Специфичность О-антигенов зависит от строения и состава
этих цепей.

К-антигены (капсульные) связаны с капсулой и клеточной стенкой микробной

клетки. Их называют также оболочечными. К-антигены расположены более
поверхностно, чем О-антигены. Они являются главным образом кислыми
полисахаридами. Имеется несколько видов К-антигенов: А, В, L и др. Эти антигены
отличаются друг от друга по устойчивости к температурным воздействиям. А-
антиген наиболее устойчив, L - наименее. К поверхностным антигенам относят и
Vi-антиген, который имеется у возбудителей брюшного тифа и некоторых других
кишечных бактерий. Он разрушается при 60° С. Наличие Vi-антигена связывали с
вирулентностью микроорганизмов.

Н-антигены (жгутиковые) локализуются в жгутиках бактерий. Они представляют

собой особый белок - флагеллин. Разрушаются при нагревании. При обработке
формалином сохраняют свои свойства (см. рис. 70).

Протективный антиген (защитный) (от лат. protectio - покровительство, защита)

образуется возбудителями в организме больного. Возбудители сибирской язвы,
чумы, бруцеллеза способны образовывать протективный антиген. Его
обнаруживают в экссудатах пораженных тканей.

Выявление антигенов в патологическом материале является одним из способов

лабораторной диагностики инфекционных болезней. Для выявления антигена
применяют различные иммунные реакции (см. ниже).

При развитии, росте и размножении микроорганизмов их антигены могут

меняться. Происходит утрата некоторых антигенных компонентов, более
поверхностно расположенных. Это явление носит название диссоциации. Примером
ее может служить "S" - "R"-диссоциация.

Контрольные вопросы

1. Что такое антигены?

2. Каковы основные свойства антигенов?

3. Какие антигены микробной клетки Вы знаете?

 Антитела

Антитела - это специфические белки крови - иммуноглобулины, образующиеся в

ответ на введение антигена и способные специфически реагировать с ним.

В сыворотке человека имеется два вида белков: альбумины и глобулины.

Антитела связаны в основном с глобулинами, измененными под воздействием
антигена и названными иммуноглобулинами (Ig). Глобулины неоднородны. По
скорости движения в геле при пропускании через него электрического тока их делят
на три фракции: α, β, γ. Антитела принадлежат главным образом к γ-глобулинам.
Эта фракция глобулинов имеет наибольшую скорость движения в электрическом
поле.

Иммуноглобулины характеризуют по молекулярной массе, скорости осаждения

при ультрацентрифугировании (центрифугировании с очень большой скоростью) и
т. п. Различия этих свойств позволили разделить иммуноглобулины на 5 классов:
IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Все они играют роль в развитии иммунитета против
инфекционных заболеваний.

Иммуноглобулины G (IgG) составляют около 75% всех иммуноглобулинов

человека. Они наиболее активны в развитии иммунитета. Единственные из
иммуноглобулинов проникают через плаценту, обеспечивая пассивный иммунитет
плода. Имеют небольшую молекулярную массу и скорость осаждения при
ультрацентрифугировании.

Иммуноглобулины М (IgM) образуются в организме плода и первыми

появляются после заражения или иммунизации. К этому классу принадлежат
"нормальные" антитела человека, которые образуются в течение его жизни, без
видимого проявления инфекции или при бытовом многократном инфицировании.
Имеют большую молекулярную массу и скорость осаждения при
ультрацентрифугировании.

Иммуноглобулины A (IgA) обладают способностью проникать в секреты

слизистых (молозиво, слюна, содержимое бронхов и др.). Они играют роль в защите
слизистых оболочек дыхательного и пищеварительного трактов от
микроорганизмов. По величине молекулярной массы и скорости осаждения при
ультрацентрифугировании близки к IgG.

Иммуноглобулины Е (IgE) или реагины несут ответственность за аллергические

реакции (см. главу 13). Играют роль в развитии местного иммунитета.

Иммуноглобулины D (IgD). Обнаружены в небольшом количестве в сыворотке

крови. Изучены недостаточно.

Структура иммуноглобулинов. Молекулы иммуноглобулинов всех классов

построены одинаково. Наиболее простая структура у молекул IgG: две пары
полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью (рис. 31). Каждая пара
состоит из легкой и тяжелой цепи, различающихся по молекулярной массе. Каждая
цепь имеет постоянные участки, которые предопределены генетически, и
переменные, образующиеся под воздействием антигена. Это специфические
участки антитела называют активными центрами. Они вступают во взаимодействие
с антигеном, который вызвал образование антител. Количество активных центров в
молекуле антитела определяет валентность - число молекул антигена, с которым
может связаться антитело. IgG и IgA - двухвалентны, IgM - пятивалентны.

Рис. 31. Схематическое изображение иммуноглобулинов

Иммуногенез - антителообразование зависит от дозы, кратности и способа

введения антигена. Различают две фазы первичного иммунного ответа на антиген:
индуктивную - от момента введения антигена до появления антителообразующих
клеток (до 20 ч) и продуктивную, которая начинается к концу первых суток после
введения антигена и характеризуется появлением антител в сыворотке крови.
Количество антител постепенно увеличивается (к 4-му дню), достигая максимума
на 7-10-й день и уменьшается к концу первого месяца.

Вторичный иммунный ответ развивается при повторном введении антигена. При

этом индуктивная фаза значительно короче - антитела вырабатываются быстрее и
интенсивнее.

Контрольные вопросы

1. Что такое антитела?

2. Какие Вы знаете классы иммуноглобулинов?

Клеточные механизмы иммунного ответа

Лимфоидные клетки организма выполняют основную функцию в развитии

иммунитета - невосприимчивости, не только по отношению к микроорганизмам, но
и ко всем генетически чужеродным клеткам, например при пересадке тканей.
Лимфоидные клетки обладают способностью отличать "свое" от "чужого" и
устранять "чужое" (элиминировать).

Родоначальницей всех клеток иммунной системы является кроветворная

стволовая клетка. В дальнейшем происходит развитие двух типов лимфоцитов: Т и
В (тимусзависимых и бурсазависимых). Эти названия клетки получили в связи с их
происхождением. Т-клетки развиваются в тимусе (зобной, или вилочковой железе)
и под влиянием веществ, выделяемых тимусом, в периферической лимфоидной
ткани.

Название В-лимфоциты (бурсазависимые) произошло от слова "бурса" - сумка. В

сумке Фабрициуса у птиц развиваются клетки, сходные с В-лимфоцитами человека.
Хотя у человека не найдено органа, аналогичного сумке Фабрициуса, название
связано с этой сумкой.

При развитии В-лимфоцитов из стволовой клетки они проходят несколько стадий

и преобразуются в лимфоциты, способные образовывать плазматические клетки.
Плазматические клетки в свою очередь образуют антитела и на их поверхности
имеются иммуноглобулины трех классов: IgG, IgM и IgA (рис. 32).

Рис. 32. Сокращенная схема развития иммуноцитов

Иммунный ответе виде продукции специфических антител происходит

следующим образом: чужеродный антиген, проникнув в организм, прежде всего
фагоцитируется макрофагами. Макрофаги, перерабатывая и концентрируя антиген
на своей поверхности, передают информацию о нем Т-клеткам, которые начинают
делиться, "созревают" и выделяют гуморальный фактор, включающий в
антителопродукцию В-лимфоциты. Последние также "созревают", развиваются в
плазматические клетки, которые и синтезируют антитела заданной специфичности.

Так, соединенными усилиями макрофаги, Т- и В-лимфоциты осуществляют

иммунные функции организма - защиту от всего генетически чужеродного, в том
числе и от возбудителей инфекционных болезней. Защита с помощью антител
осуществляется таким образом, что синтезированные к данному антигену
иммуноглобулины, соединяясь с ним (антигеном), подготавливают его, делают
чувствительным к разрушению, обезвреживанию различными естественными
механизмами: фагоцитами, комплементом и пр.

Контрольные вопросы
 1. Какова роль макрофагов в иммунном ответе?

2. Какова роль Т-лимфоцитов в иммунном ответе?

3. Какова роль В-лимфоцитов в иммунном ответе?

Теории иммунитета. Значение антител в развитии иммунитета неоспоримо.

Каков же механизм их образования? Этот вопрос в течение длительного времени
является предметом споров и обсуждений.

Создано несколько теорий антителообразования, которые можно разделить на

две группы: селективные (селекция - отбор) и инструктивные (инструктировать -
наставлять, направлять).

Селективные теории предполагают существование в организме уже готовых

антител к каждому антигену или клеток, способных синтезировать эти антитела.

Так, Эрлих (1898) предполагал, что клетка имеет готовые "рецепторы"

(антитела), которые соединяются с антигеном. После соединения с антигеном,
антитела образуются еще в большем количестве.

Такого же мнения придерживались создатели других селективных теорий: Н.

Ерне (1955) и Ф. Бернет (1957). Они утверждали, что уже в организме плода, а
затем и во взрослом организме имеются клетки, способные к взаимодействию с
любым антигеном, но под влиянием определенных антигенов определенные клетки
вырабатывают "нужные" антитела.

Инструктивные теории [Гауровитц Ф., Полинг Л., Ландштейнер К., 1937-1940]

рассматривают антиген, как "матрицу", штамп, на котором формируются
специфические группировки молекулы антител.

Однако эти теории не объясняли всех явлений иммунитета и в настоящее время

наиболее принятой является клонально-селекционная теория Ф. Бернета (1964).
Согласно этой теории в эмбриональном периоде в организме плода имеется
множество лимфоцитов - клеток-предшественников, которые при встрече с
собственными антигенами разрушаются. Поэтому во взрослом организме уже нет
клеток для выработки антител к собственным антигенам. Однако, когда взрослый
организм встречается с чужеродным антигеном, происходит селекция (отбор) клона
иммунологически активных клеток и они вырабатывают специфические антитела,
направленные против данного "чужого" антигена. При повторной встрече с этим
антигеном клеток "отобранного" клона уже больше и они быстрее образуют
большее количество антител. Эта теория наиболее полно объясняет основные
явления иммунитета.

Механизм взаимодействия антигена и антител имеет различные объяснения.

Так, Эрлих уподоблял их соединение реакции между сильной кислотой и сильным
основанием с образованием нового вещества типа соли.

Бордэ считал, что антиген и антитела взаимно адсорбируют друг друга подобно
краске и фильтровальной бумаге или йоду и крахмалу. Однако эти теории не
объясняли главного - специфичности иммунных реакций.
 Наиболее полно механизм соединения антигена и антитела объяснен гипотезой
Маррека (теория "решетки") и Полинга (теория "фермы") (рис. 33). Маррек
рассматривает соединение антигена и антител в виде решетки, в которой антиген
чередуется с антителом, образуя решетчатые конгломераты. Согласно гипотизе
Полинга (см. рис. 33) антитела имеют две валентности (две специфические
детерминанты), а антиген несколько валентностей - он поливалентен. При
соединении антигена и антител образуются агломераты, напоминающие "фермы"
построек.

Рис. 33. Схематическое изображение взаимодействия антител и антигена. А - по

схеме Маррска: Б - по схеме Полинга. Структура комплекса: а - при оптимальных
соотношениях; б - при избытке антигена; в - при избытке антител

При оптимальном соотношении антигена и антител образуются большие

прочные комплексы, видимые простым глазом. При избытке антигена каждый
активный центр антител заполнен молекулой антигена, не хватает антител для
соединения с другими молекулами антигена и образуются мелкие, невидимые
глазом комплексы. При избытке антител, для образования решетки не хватает
антигена, детерминанты антител отсутствуют и видимого проявления реакции нет.

На основании изложенных теорий специфичность реакции антиген - антитело

сегодня представляют как взаимодействие детерминантной группы антигена и
активных центров антитела. Так как антитела формируются под воздействием
антигена, их структура соответствует детерминантным группам антигена.
Детерминантная группа антигена и фрагменты активных центров антитела имеют
противоположные электрические заряды и, соединяясь, образуют комплекс,
прочность которого зависит от соотношения компонентов и среды, в которой они
взаимодействуют.

Учение об иммунитете - иммунология - достигло за последние десятилетия

больших успехов. Раскрытие закономерностей иммунного процесса позволило
решить различные задачи во многих областях медицины. Разработаны и
совершенствуются методы предупреждения многих инфекционных заболеваний;
лечения инфекционных и ряда других (аутоиммунных, иммунодефицитных)
болезней; предупреждения гибели плода при резус-конфликтных ситуациях;
трансплантации тканей и органов; борьбы со злокачественными
новообразованиями; иммунодиагностики - использования реакций иммунитета в
диагностических целях.

Реакции иммунитета - это реакции между антигеном и антителом или между

антигеном и сенсибилизированными* лимфоцитами, которые происходят в живом
организме и могут быть воспроизведены в лабораторных условиях.
*
(Сенсибилизированные - повышенно чувствительные.)

Реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в

конце XIX - начале XX века. В силу высокой чувствительности (улавливают
антигены в очень больших разведениях) и, главное, строгой специфичности
(позволяют отличить близкие по составу антигены) они нашли широкое
применение в решении теоретических и практических вопросов медицины и
биологии. Этими реакциями пользуются иммунологи, микробиологи,
инфекционисты, биохимики, генетики, молекулярные биологи, экспериментальные
онкологи и врачи других специальностей.

Реакции антигена с антителом называются серологическими (от лат. serum -

сыворотка) или гуморальными (от лат. humor - жидкость), потому что участвующие
в них антитела (иммуноглобулины) всегда находятся в сыворотке крови.

Реакции антигена с сенсибилизированными лимфоцитами называются

клеточными.

Контрольные вопросы

1. Как образуются антитела?

2. Какие Вы знаете теории образования антител?

3. Каков механизм взаимодействия антигена с антителом?

Серологические реакции
Серологические реакции - реакции взаимодействия между антигеном и
антителом протекают в две фазы: 1-я фаза - специфическая - образование комплекса
антигена и соответствующего ему антитела (см. рис. 33). Видимого изменения в
этой фазе не происходит, но образовавшийся комплекс становится чувствительным
к неспецифическим факторам, находящимся в среде (электролиты, комплемент,
фагоцит); 2-я фаза - неспецифическая. В этой фазе специфический комплекс
антиген - антитело взаимодействует с неспецифическими факторами среды, в
которой происходит реакция. Результат их взаимодействия может быть видим
невооруженным глазом (склеивание, растворение и т. п.). Иногда эти видимые
изменения отсутствуют.

Характер видимой фазы серологических реакций зависит от состояния антигена

и условий среды, в которой происходит его взаимодействие с антителом. Различают
реакции агглютинации, преципитации, иммунного лизиса, связывания комплемента
и др. (табл. 14).
 Таблица 14. Серологические реакции в зависимости от участвующих в них
компонентов и условий среды

Применение серологических реакций. Одно из основных применений

серологических реакций - лабораторная диагностика инфекций. Их используют: 1)
для выявления антител в сыворотке больного, т. е. для серодиагностики; 2) для
определения вида или типа антигена, например выделенного от больного
микроорганизма, т. е. для его идентификации.

При этом неизвестный компонент определяют по известному. Например, для

обнаружения антител в сыворотке больного берут известную лабораторную
культуру микроорганизма (антиген). Если сыворотка реагирует с ним, значит она
содержит соответствующие антитела и можно думать, что данный микроб является
возбудителем болезни у обследуемого больного.

Если нужно определить, какой микроорганизм выделен, его испытывают в

реакции с известной диагностической (иммунной) сывороткой. Положительный
результат реакции говорит о том, что данный микроорганизм идентичен тому,
которым иммунизировали животное для получения сыворотки (табл. 15).
 Таблица 15. Применение серологических реакций

Серологические реакции применяют также для определения активности (титра)

сывороток и в научных исследованиях.

Проведение серологических реакций требует особой подготовки.

Посуда для серологических реакций должна быть чистой и сухой. Применяют

пробирки (бактериологические, агглютинационные, преципитационные и
центрифужные), пипетки градуированные разного размера и пастеровские *, колбы,
цилиндры, предметные и покровные стекла, чашки Петри, пластины из пластмассы
с лунками.
*
(Каждый ингредиент реакции разливают отдельной пипеткой. Пипетки следует сохранять до конца
постановки опыта. Для этого удобно помещать их в стерильные пробирки с пометками, где какая пипетка. )

Инструменты и оборудование: петля, штативы, лупа, агглютиноскоп, термостат,

холодильник, центрифуга, весы химические с разновесом.

Материалы: антитела (иммунные и исследуемые сыворотки), антигены (культуры

микроорганизмов, диагностикумы, экстракты, лизаты, гаптены, эритроциты,
токсины), комплемент, изотонический раствор натрия хлорида.

Внимание! В серологических реакциях применяют только химически чистый

натрия хлорид.

Сыворотки. Сыворотка больного. Сыворотку обычно получают на второй

неделе болезни, когда можно ожидать наличие в ней антител, иногда пользуются
сыворотками реконвалесцентов (выздоравливающих) и переболевших.

Чаще всего для получения сыворотки кровь берут из вены в количестве 3-5 мл в
стерильную пробирку и направляют в лабораторию, сопровождая этикеткой, с
указанием фамилии и инициалов больного, предполагаемого диагноза и даты.

Кровь следует брать натощак или не раньше чем через 6 ч после еды. В
сыворотке крови после еды могут содержаться капельки жира, которые делают ее
мутной и непригодной для исследования (такая сыворотка называется хилезной).

Внимание! При взятии крови необходимо соблюдать правила асептики.

 Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 ч при комнатной температуре
или ставят в термостат при 37° С на 30 мин для образования сгустка.

Внимание! Не следует держать сыворотку в термостате больше 30 мин - может

произойти гемолиз, что помешает проведению исследований.

Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки пастеровской пипеткой

или петлей ("обводят"). Пробирку помещают в холодильник на некоторое время
(обычно 1 ч, но не более 48 ч) для лучшего отделения сыворотки из сжавшегося на
холоде сгустка. Затем сыворотку отсасывают стерильной пастеровской пипеткой,
снабженной резиновым баллоном или шлангом.

Отсасывать сыворотку следует очень осторожно, чтобы не захватить форменные

элементы. Сыворотка должна быть совершенно прозрачной без примеси клеток.
Мутные сыворотки еще раз отсасывают после того, как клетки осядут. Сыворотку
можно освободить от форменных элементов центрифугированием.

Внимание! На сгустке сыворотка может оставаться не более 48 ч при + 4° С.

Для получения сыворотки кровь можно брать из прокола мякоти пальца или
мочки уха пастеровской пипеткой. У грудных детей кровь берут из У-образного
разреза на пятке.

При использовании пастеровской пипетки кровь насасывают в пипетку из

прокола. Острый конец пипетки запаивают. Пипетку помещают в пробирку острым
концом вниз. Чтобы он не сломался, на дно пробирки кладут кусочек ваты.
Пробирку с соответствующей этикеткой направляют в лабораторию. Скопившуюся
в широком конце пипетки сыворотку отсасывают.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и

лошадей), иммунизированных по определенной схеме соответствующим антигеном
(вакциной). В полученной сыворотке определяют ее активность (титр), т. е.
наибольшее разведение, в котором она реагирует с соответствующим антигеном в
определенных условиях опыта.

Готовят сыворотки обычно на производстве. Их разливают в ампулы, на которых

указывают название и титр. В большинстве случаев сыворотки высушивают. Сухую
сыворотку перед употреблением растворяют в дистиллированной воде до
первоначального объема (тоже указан на этикетке). Хранят все сухие
(лиофилизированные) диагностические" препараты при 4-10° С.

Для серологических исследований применяют иммунные сыворотки нативные

(не адсорбированные) и адсорбированные. Недостаток нативных сывороток -
наличие в них групповых антител, т. е. антител к микроорганизмам, имеющим
общие антигены. Обычно такие антигены встречаются у микробов, принадлежащих
к одной группе, роду, семейству. Адсорбированные сыворотки отличаются строгой
специфичностью: реагируют только с гомологичным антигеном. Антитела к другим
(гетерогенным) антигенам удалены адсорбцией. Титр антител адсорбированных
сывороток низкий (1:40, 1:320), поэтому их не разводят*.
 *
(В настоящее время методом биотехнологии получены особые клетки (гибридомы), вырабатывающие in
vitro моноклональные антитела, т. е. антитела, реагирующие строго специфично (с одним антигеном). )

Реакция агглютинации
Реакция агглютинация (РА) - это склеивание и выпадение в осадок микробов или
других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического
раствора натрия хлорида). Образовавшийся осадок называют агглютинатом. Для
реакции необходимы:

1. Антитела (агглютинины) - находятся в сыворотке больного или в иммунной

сыворотке.

2. Антиген - взвесь живых или убитых микроорганизмов, эритроцитов или

других клеток.

3. Изотонический раствор.

Реакцию агглютинации для серодиагностики широко применяют при брюшном

тифе, паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта) и др. Антителом при
этом является сыворотка больного, а антигеном - известный микроб.

При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а

антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют при
диагностике кишечных инфекций, коклюша и др.

Подготовка ингредиентов: 1) получение сыворотки см. с. 200; 2) приготовление

антигена. Взвесь живых микробов должна быть гомогенной и соответствовать (в 1
мл) примерно 30 ед. мутности по оптическому стандарту ГИСК. Для ее
приготовления обычно используют 24-часовую культуру, выращенную на
скошенном агаре. Культуру смывают 3-4 мл изотонического раствора, переносят в
стерильную пробирку, определяют ее густоту и, если нужно, разводят.

Применение взвеси убитых микробов - диагностикумов - облегчает работу и

делает ее безопасной. Обычно пользуются диагностикумами, приготовленными на
производстве.

Постановка реакции. Существует два метода проведения этой реакции: реакция

агглютинации на стекле (иногда ее называют ориентировочной) и развернутая
реакция агглютинации (в пробирках).

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят

2 капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического
раствора. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении
1:5 - 1:25. Капли на стекло наносят так, чтобы между ними было расстояние.
Восковым карандашом на стекле помечают, где какая капля. Культуру петлей или
пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического
раствора и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования
гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является
контролем сыворотки.
 Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического
раствора, которая является контролем антигена.

Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Контроль

сыворотки должен оставаться прозрачным, а в контроле антигена должна
наблюдаться равномерная муть. Если в капле, где культура смешана с сывороткой,
появятся хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции
считают положительным. При отрицательном результате реакции в капле будет
равномерная муть, как в контроле антигена.

Реакция отчетливее видна, если ее рассматривать на темном фоне в проходящем

свете. При ее изучении можно пользоваться лупой.

Развернутая реакция агглютинации. Готовят последовательные, чаще всего

двукратные разведения сыворотки. Сыворотку больного обычно разводят от 1:50 до
1:1600, иммунную - до титра или до половины титра. Титр агглютинирующей
сыворотки - ее максимальное разведение, в котором она агглютинирует
гомологичные клетки.

Разведение сыворотки: 1) ставят в штатив нужное количество пробирок

одинакового диаметра, высоты и конфигурации дна;

2) на каждой пробирке указывают степень разведения сыворотки, кроме того, на

1-й пробирке пишут номер опыта или название антигена. На пробирках контролей
пишут "КС" - контроль сыворотки и "КА" - контроль антигена;

3) во все пробирки наливают по 1 мл изотонического раствора;

4) в отдельной пробирке готовят исходное (рабочее) разведение сыворотки.

Например, для приготовления рабочего разведения 1:50, в пробирку наливают 4,9
мл изотонического раствора и 0,1 мл сыворотки. На пробирке обязательно
указывают степень ее разведения. Исходное разведение сыворотки вносят в первые
две пробирки и в пробирку контроля сыворотки;

5) готовят последовательные двукратные разведения сыворотки.

Примерная схема ее разведения приведена в табл. 16.

Таблица 16. Схема разведения сыворотки для развернутой РА

 Примечание. Стрелки указывают перенос жидкости из пробирки в пробирку; из
5-й пробирки и пробирки контроля сыворотки 1,0 мл выливают в
дезинфицирующий раствор.

Внимание! Во всех пробирках должен быть одинаковый объем жидкости.

После того как сделаны разведения сыворотки, во все пробирки, кроме контроля
сыворотки, вносят по 1-2 капли антигена (диагностикума или свежеприготовленной
взвеси бактерий). В пробирках при этом должна появиться небольшая равномерная
муть. Контроль сыворотки остается прозрачным.

Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат (37° С).

Предварительный учет результатов реакции производят через 2 ч, а окончательный
- спустя 18-20 ч (выдерживая при комнатной температуре).

Учет результатов как всегда начинают с контролей. Контроль сыворотки должен

оставаться прозрачным, контроль антигена - равномерно мутным. Просматривают
пробирки в проходящем свете (очень удобно на темном фоне) невооруженным
глазом, с помощью лупы или агглютиноскопа.

Агглютиноскоп - прибор, состоящий из полой металлической трубки,

укрепленной на подставке. Сверху на ней расположен окуляр с регулирующим
винтом. Под трубкой прикреплено вращающееся зеркало. Пробирку с изучаемой
жидкостью вставляют сбоку в отверстие трубки на такое расстояние, чтобы
находящаяся в ней жидкость была под окуляром. Установив с помощью зеркала
освещение и сфокусировав окуляр, определяют наличие и характер агглютината.

При положительном результате реакции в пробирках видны зерна или хлопья

агглютината. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде "зонтика", а жидкость
над осадком просветляется (сравните с равномерно мутным контролем антигена).

Для изучения величины и характера осадка содержимое пробирок слегка

встряхивают. Различают мелкозернистую и хлопьевидную агглютинацию.
Мелкозернистая (О-агглютинация) получается при работе с О-сыворотками *.
Хлопьевидная (Н) - при взаимодействии подвижных микроорганизмов со
жгутиковыми Н-сыворотками.
*
(О-сыворотки содержат антитела к О (соматическому)-антигену, Н-сыворотки - к жгутиковому.)

Хлопьевидная агглютинация наступает быстрее, образующийся при этом осадок

очень рыхлый и легко разбивается.

Интенсивность реакции выражают следующим образом:

++++ все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат

реакции резко положительный.

+++ осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции

положительный.
 ++ осадок еще меньше, жидкость мутная. Результат реакции слабо
положительный.

+ незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции.

- осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена.

Отрицательный результат реакции.

Возможные ошибки при постановке реакции агглютинации. 1. Спонтанная

(самопроизвольная) агглютинация. Некоторые клетки, особенно микробы в R-
форме, не дают однородной (гомогенной) взвеси, быстро выпадают в осадок. Во
избежание этого следует пользоваться культурой в S-форме, которая не дает
спонтанной агглютинации.

2. В сыворотке здоровых людей имеются антитела к некоторым

микроорганизмам (так называемые "нормальные антитела"). Титр их невысок.
Поэтому положительный результат реакции в разведении 1:100 и выше говорит о ее
специфичности.

3. Групповая реакция с близкими по антигенному строению микробами.

Например, сыворотка больного брюшным тифом может также агглютинировать
бактерии паратифа А и Б. В отличие от специфической групповая реакция идет в
более низких титрах. Адсорбированные сыворотки не дают групповой реакции.

4. Следует учесть, что специфические антитела после перенесенной болезни и

даже после прививок могут сохраняться длительное время. Они называются
"анамнестическими". Чтобы отличить их от "инфекционных" антител,
образующихся в течение текущей болезни, реакцию ставят в динамике, т. е.
исследуют сыворотку больного, взятую повторно через 5-7 дней. Повышение титра
антител говорит о наличии болезни - титр "анамнестических" антител не
повышается, а может даже снизиться.

Контрольные вопросы

1. Что такое реакции иммунитета, каковы их основные свойства?

2. Какие компоненты участвуют в серологических реакциях? Почему реакции

называют серологическими, из скольких фаз они состоят?

3. Что такое реакция агглютинации? Ее использование и методы проведения. Что

такое диагностикум?

4. Каким антигеном пользуются при исследовании сыворотки больного? Какой

сывороткой определяют вид неизвестного микроба?

5. Что такое О- и Н-агглютинация? В каких случаях образуется хлопьевидный

осадок и когда мелкозернистый?
 Задание

1. Поставьте развернутую реакцию агглютинации для определения титра антител

в сыворотке больного и учтите ее результат.

2. Поставьте реакцию агглютинации на стекле для определения вида

выделенного микроорганизма.

Реакция гемагглютинации
В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия
реакциями гемагглютинации (РГА).

Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты

агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами
(гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.

Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов

вызывают не антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус
гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита -
эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса
в исследуемом материале.

Постановка реакции. Реакцию ставят в пробирках или на специальных пластинах

с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим
раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным
объемом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5
мл изотонического раствора. Пробирки ставят в термостат на 30 мин, а пластины
оставляют при комнатной температуре на 45 мин.

Учет результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или

лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями ("зонтик"),
покрывающий все дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют
плотный осадок с ровными краями ("пуговку"). Такой же осадок должен быть в
контроле. Интенсивность реакции выражают знаками "плюс". Титром вируса
является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.

Реакция торможения гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные

антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают
способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию
гемагглютинации. Высокая специфичность реакции торможения гемагглютинации
(РТГА) позволяет с ее помощью определить вид и даже тип вирусов, обнаруженных
при постановке РГА.

Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки в последовательных

двукратных разведениях от 1:10 до 1:2560 смешивают с равным объемом
материала, содержащего вирус, разведенного в 4 раза меньше титра,
установленного в РГА. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 мин,
после чего добавляют по 0,5 мл 1-2% взвеси эритроцитов.
 Реакцию сопровождают тремя контролями (табл. 17).

Таблица 17. Контроли реакции торможения гемагглютинации

Учет результатов производят после повторной инкубации в термостате в течение

30 или 45 мин при комнатной температуре. При правильной постановке опыта в
контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться "пуговка" - нет
агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется "зонтик" -
вирус вызвал агглютинацию эритроцитов.

В опыте, если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется "пуговка" -

сыворотка нейтрализовала вирус. Титр сыворотки - это ее максимальное
разведение, в котором происходит задержка гемагглютинации.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что

эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген,
приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к
адсорбированному антигену. Схема РНГА представлена на рис. 34. РНГА широко
применяют при диагностике ряда инфекций.

Рис. 34. Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). А - получение

эритроцитарного диагностикума: Б - РПГА: 1 - эритроцит: 2 - изучаемый антиген; 3
 - эритроцитарный диагностикум; 4 - антитело к изучаемому антигену: 5 -
агглютинат

Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56° С,

разводят последовательно в соотношении 1:10 - 1:1280 и разливают по 0,25 мл в
пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного
диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).

Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммунной

сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных
эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти
агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.

При помощи РИГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты

адсорбировать заведомо известные антитела.

Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод),

пользуясь микротитратором Такачи.

Контрольные вопросы

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и

исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли агглютинация эритроцитов, если к ним добавить вирус и

соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот
феномен?

Задание

Учтите и зарегистрируйте результат РИГА.

Реакция преципитации
В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического
иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта,
гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют

преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается
размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при

диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине
- для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-
гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее
помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для
реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не

ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по
наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку
обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной

природы (полные антигены и гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция

кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны

быть совершенно прозрачными.

Реакция кольцепреципитации. В преципитационную пробирку с помощью

пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не
должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают
антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке
пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном
наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница.
Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При
положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется
мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна

последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать
сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как
относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и
граница между жидкостями не выявится.

Таблица 18. Схема постановки реакции кольцепреципитации

Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".

Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как
всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о
способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с
соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет
соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке -
положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген
соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только
во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат
реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле). Особенность реакции в том, что

взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле.
Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы
свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко
применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении
токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Контрольные вопросы

1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?

2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?

Задание

1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.

2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции

преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).

Реакция лизиса (иммунный цитолиз)

Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при
обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного.

Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе
бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для
лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.

3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту

сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве
комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при
нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше
двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2%
борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4°
С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его
растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на
этикетке).

4. Изотонический раствор.

Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:

 1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка
эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.

2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана;

обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.

Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором

происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента.
Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза
меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят
1:400 (0,1 мл сыворотки* и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина
необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.
*
(Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения.)

3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического

раствора).

4. Изотонический раствор.

Таблица 19. Схема реакции гемолиза

Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке

произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость
остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает
комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в
5-й - антиген не соответствует антителу,

В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме

(табл. 20).
 Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл
сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые
разведения, например:

Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования,

как показано в табл. 20.

Таблица 20. Схема титрования гемолитической сыворотки (гемолизина)

В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен

1:1200.

При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо

инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее
прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с
терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева
сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для
опыта.

Реакция бактериолиза. В этой реакции комплемент лизирует бактерии в

присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции
принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что
после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со
средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать,
лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок
(контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве
из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они
гомологичны антителу.

Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических

условиях.

Контрольные вопросы

1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия

хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?

2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной

иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?

Задание

Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на том, что специфический
комплекс антиген - антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в

серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами
(реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две

системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - основная состоит из антигена и антитела (один известный,

другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При
соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут
комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы

гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и
соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т. е. готовый иммунный
комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в
присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при
соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет -
так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки
мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный
результат РСК (рис. 35).
 Рис. 35. Схема реакции связывания комплемента (РСК). I - положительный
результат (нет гемолиза); II - отрицательный результат (гемолиз)

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный

комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся
свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, - результат
РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента:

1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен;
взвесь микроорганизмов Основная
2. Антитело - сыворотка больного система
3. Комплемент - сыворотка морских свинок
4. Антиген - эритроциты барана Гемолити-
5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана ческая
6. Изотонический раствор система

Ввиду того что в РСК участвует большое количество сложных компонентов, они
должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных
количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25, реже по 0,2 мл. Соответственно
весь опыт проводят в объемах 2,5, 1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более
точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в
каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.

Подготовка ингредиентов

1. Гемолитическая сыворотка (гемолизин). Сыворотку разводят в 3 раза

меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта; объем
которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5
мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте *.
*
(Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на
стенках пробирок, колб, пипеток.)

2. Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все

количество пробирок в опыте.

Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт

смешивают равные объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов,
приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30
мин при 37° С (сенсибилизируют).

3. Комплемент обычно разводят 1:10. Перед каждым опытом его обязательно

титруют. Титр комплемента - это его наименьшее количество, при добавлении
которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при
37° С. Схема титрования комплемента представлена в табл. 21.

Таблица 21. Схема титрования комплемента

Примечание. Общий объем жидкости в пробирках 2,5 мл.

 Внимание! Титруют комплемент в таком же объеме, в каком ставят основной
опыт, заменяя изотоническим раствором недостающие ингредиенты.

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в
одном из них нет комплемента, в другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют
об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно
лизировать эритроциты).

В приведенном в табл. 21 примере титр комплемента в разведении 1:10 равен

0,15 мл. В опыте активность комплемента может снизиться за счет
неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для
опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу.
Это - рабочая доза. В приведенном примере она равна 0,2 мл комплемента в
разведении 1:10. Так как все компоненты, участвующие в РСК, должны быть взяты
в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе
комплемента (0,2 мл 1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора. Для всего
опыта объем каждого из них (комплемента и изотонического раствора) умножают
на число пробирок, участвующих в РСК. Например, для проведения опыта в 50
пробирках нужно взять 10 мл комплемента 1:10 (0,2 мл × 50) и 15 мл
изотонического раствора (0,3 мл × 50).

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т. е. того

количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл.
Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт
берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза.
Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число
пробирок в опыте.

5. Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом

инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее
прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с
терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает
возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные
сыворотки не пригодны для опыта. Сыворотку больного обычно применяют в
разведении от 1:10 до 1:160.

Иммунные сыворотки чаще всего готовят в производственных условиях и

выпускают инактивированными. Их разводят 1:50 и выше.

Внимание! Все компоненты готовят с небольшим избытком.

Проведение основного опыта

При постановке опыта крайне важна последовательность добавления

компонентов. Опыт проводят в две фазы (табл. 22).
 Таблица 22. Схема основного опыта РСК
1
(В опыте сыворотку можно изучать в последовательных двукратных разведениях.)

Фаза I. В пробирки наливают требуемое количество изотонического раствора

натрия хлорида, затем - требуемый объем разведенной сыворотки и в таком же
объеме рабочие дозы антигена и комплемента. Опыт обязательно сопровождают
контролем всех участвующих в нем ингредиентов: сыворотки, антигена,
гемолитической системы и комплемента.

Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37° С 45 мин - 1 ч или при

4° С ("РСК на холоде") 18 ч. За это время при наличии специфического комплекса
происходит связывание комплемента. Проведение реакции "на холоде" значительно
повышает ее чувствительность и специфичность.
 Фаза II. По окончании инкубации во все пробирки добавляют по 1 мл
гемолитической системы, которую предварительно выдерживают в термостате 30
мин (сенсибилизируют). Пробирки встряхивают и снова ставят в термостат.

Учет результатов. Пробирки оставляют в термостате до полного гемолиза в 2, 3,

6 и 7-й пробирках (контроль сыворотки, антигена и комплемента на одну и две
дозы). Раньше всего гемолиз наступит в 7-й пробирке, в которой находится двойное
количество комплемента. После того как в этой пробирке произойдет гемолиз и
содержимое ее станет совершенно прозрачным, нужно особенно внимательно
следить за остальными контролями. Как только жидкость в 2, 3 и 6-й пробирках
станет прозрачной, следует немедленно вынуть штатив с пробирками из
термостата. О том, что опыт не задержали в термостате дольше, чем нужно, говорит
наличие легкой мути (неполного гемолиза) в 5-й пробирке - в ней находится только
половина рабочей дозы комплемента и полного гемолиза при правильной
постановке опыта быть не может.

Гемолиз в контроле сыворотки и антигена (пробирки 2 и 3) указывает на то, что

дозы их были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген
комплемент не связывают.

В контроле гемолитической системы (пробирка 4) при ее правильной работе не

должно быть даже следов гемолиза - в ней отсутствует комплемент.

Убедившись в том, что контроли прошли правильно, можно учитывать опыт.

Отсутствие гемолиза в пробирках опыта расценивают как положительный результат
реакции. Он свидетельствует о том, что в сыворотке есть антитела, специфичные в
отношении взятого антигена. Образованный ими комплекс связал комплемент и
воспрепятствовал его участию в реакции гемолиза. Если в опытных пробирках
наступит гемолиз, результат реакции оценивают как отрицательный. В данном
случае нет соответствия между антигеном и антителом, комплемент не связан и
участвует в реакции гемолиза.

Параллельно с сывороткой больного ставят такой же опыт с заведомо

положительной сывороткой (т. е. с сывороткой, в которой есть антитела к данному
антигену) и заведомо отрицательной, в которой нет специфических антител. При
правильной постановке опыта в первом случае должна быть задержка гемолиза, а
во втором случае будет гемолиз.

Интенсивность реакции выражают следующим образом:

++++ полная задержка гемолиза. Эритроциты образуют равномерную муть или

оседают на дно. В этом случае жидкость в пробирке становится бесцветной;

+++ лизировано примерно 25% эритроцитов. Осадок меньше, жидкость над ним
слегка розовая. Результат РСК также оценивают как резко положительный;

++ лизировано примерно 50% эритроцитов. Осадок небольшой, жидкость

розовая. Положительный результат РСК;

+ лизировано примерно 75% эритроцитов. Незначительный осадок, над ним

интенсивно окрашенная жидкость. Сомнительный результат РСК;
 - лизированы все эритроциты. Жидкость интенсивно окрашена и совершенно
прозрачна. Отрицательный результат РСК.

Контрольные вопросы

1. В чем состоит принцип РСК?

2. Какие системы участвуют в РСК? Из чего состоит и какую роль в реакции

выполняет гемолитическая система?

3. В чем состоит подготовка к основному опыту РСК? В какой

последовательности его проводят? Сколько фаз в РСК?

4. О чем говорит отсутствие гемолиза в РСК?

Задание

1. Проведите титрование комплемента и установите его рабочую дозу.

2. Произведите расчет всех ингредиентов для постановки основного опыта,

проведите опыт, учтите и зарисуйте результат.

Peaкция иммунофлюоресценции
В реакции иммунофлюоресценции (РИФ) используют люминесцентную
микроскопию (см. главу 2) для серологических исследований. Реакция основана на
том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены
флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами образуют
специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе.
Такие сыворотки называются люминесцирующими *. Метод высокочувствителен,
прост, не требует выделения чистой культуры (можно обнаружить микроорганизмы
непосредственно в материале от больного: кале при холере, мокроте при коклюше,
мозговой ткани при бешенстве). Результат можно получить через полчаса после
нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки. Поэтому РИФ широко
применяют при экспресс (ускоренной)-диагностике ряда инфекций.
*
(Флюрохромы: флюоресцеин дает зеленое свечение, родамин - красное.)

Для приготовления препаратов предметное стекло с фиксированным мазком

(отпечатком, срезом) помещают во влажную камеру. Камеру готовят следующим
образом. На дно чашки Петри кладут влажную фильтровальную бумагу. На нее
параллельно укладывают две стеклянные палочки (можно использовать широкую
часть пастеровских пипеток). На них мазком вверх помещают предметное стекло.

Внимание! Не забудьте мазок с обратной стороны обвести восковым

карандашом.

На мазок наносят каплю люминесцирующей сыворотки. Закрывают чашку и

помещают в термостат или оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин.
После инкубации промывают забуференным изотоническим раствором (рН 7,4),
ополаскивают дистиллированной водой, высушивают, наносят каплю
забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом (не толще 0,17 мм!) и
рассматривают в люминесцентном микроскопе. Если в препарате есть микробы,
гомологичные антителам люминесцирующей сыворотки, они ярко светятся на
темном фоне. Этот метод называется прямой (рис. 36). Неудобство прямого метода
РИФ состоит в том, что для его постановки необходимы люминесцирующие
сыворотки к каждому определяемому антигену, готовить которые сложно, а
полного набора готовых люминесцирующих сывороток к любому антигену нет.
Поэтому пользуются часто непрямым методом. Он заключается в том, что на
первом этапе препарат обрабатывают нелюминесцирующей иммунной
специфической сывороткой к искомому антигену. В случае, если в препарате
имеются искомые антигены (микробы), то образуется комплекс антиген - антитело,
который увидеть нельзя. После высушивания, на втором этапе препарат
обрабатывают люминесцирующей сывороткой, содержащей антитела не к
искомому антигену, а к глобулинам того вида животного, от которого получена
специфическая сыворотка. Например, если первая сыворотка получена при
иммунизации кролика, то вторая должна содержать антитела к кроличьим
глобулинам (см. рис. 36). Эти антитела соединяются с глобулинами специфической
сыворотки, которые адсорбировались на искомом антигене, и комплекс светится
при рассматривании препарата в люминесцентный микроскоп.

Рис. 36. Схема реакции иммунофлюоресценции (РИФ). I - прямой метод: II - непрямой

метод: а - 1-й этап постановки реакции; б - 2-й этап постановки реакции: 1 -
изучаемый антиген: 2 - люминесцирующее антитело к изучаемому антигену; 3 -
нелюминесцирующее антитело к изучаемому антигену 4 - люмннесцирующее
антитело к глобулинам животного, от которого получены антитела к изучаемому
антигену; 5 - светящийся иммунный комплекс: 6 - несветящийся иммунный комплекс

Опсонофагоцитарная реакция
Опсонофагоцитарная реакция (ОФР) является одним из методов оценки
активности иммунного фагоцитоза. Чем эта активность выше, тем выше
устойчивость организма к инфекции. В иммунном организме под влиянием антител
(опсонинов) фагоцитоз протекает активнее (поглощается большее количество
микробов в более короткий срок). Поэтому показатели фагоцитарной активности
имеют не только диагностическое значение (например, при бруцеллезе), но и
позволяют прогнозировать исход инфекционного процесса, оценивать результаты
лечения и вакцинации. Для реакции необходимы:

1. Антиген - взвесь живых или убитых микроорганизмов.

2. Антитело (опсонины) - исследуемая сыворотка.

3. Фагоциты - обычно нейтрофилы исследуемой крови.

Постановка реакции. С помощью микропипетки в небольшие пробирки наливают

0,05 мл 2% раствора натрия цитрата; 0,1 мл исследуемой крови и 0,05 мл взвеси
микроорганизмов, густота которой соответствует в 1 мл 10 ед. мутности по
оптическому стандарту ГИСК.

Внимание! Для каждого ингредиента должна быть использована отдельная

пипетка.

Содержимое пробирок перемешивают. Пробирки ставят в термостат на 30 мин,

после чего вновь перемешивают их содержимое и готовят тонкие мазки (как мазки
крови). Окрашивают по Романовскому - Гимзе.

Учет результатов. В разных местах мазка подсчитывают 25 нейтрофилов,

учитывая в каждом из них количество захваченных микроорганизмов. Показатель
опсонофагоцитарной реакции (ПОФР) вычисляют по формуле:

ПОФР = 3а + 2б + 1с + 0,

где а - число нейтрофилов, содержащих свыше 41 бактерии; б - число

нейтрофилов, содержащих от 21 до 40 бактерий; с - число нейтрофилов,
содержащих от 1 до 20 бактерий; 0 - число нейтрофилов, не содержащих бактерии.

Максимальный показатель опсонофагоцитарной реакции при такой системе

учета составляет 75.

Результат реакции оценивают по следующей схеме:

при ПОФР от 1 до 24 - слабоположительный;

при ПОФР от 25 до 49 - ясновыраженный;

при ПОФР от 50 до 75 - резкоположительный.

У здоровых людей ПОФР составляет 0-1, редко 4-5. Ясновыраженный и

резкоположительный результаты реакции говорят о высоком опсонизирующем
действии сыворотки обследуемого лица с выраженной активностью фагоцитов
крови.

Определение только активности антител - опсонинов проводится опытом

установления опсоиического индекса - отношения фагоцитарного показателя в
присутствии иммунной (исследуемой) сыворотки к фагоцитарному показателю в
сыворотке, заведомо не содержащей антител к данному микробу. Опыт ставят так:
берут 2 пробирки, в одну из которых (опытную) вносят в равных количествах
(обычно по 0,2 мл): 1) сыворотку обследуемого лица; 2) взвесь микробов, в котором
определяют наличие опсонинов; 3) лейкоциты (можно из брюшной полости мыши).
В контрольную пробирку вносят: 1) сыворотку без опсонинов (контрольную); 2) те
же микробы, что и в опытную; 3) лейкоциты (те же, что и в опытную пробирку).

Обе пробирки выдерживают в термостате в течение 30 мин, а затем из той и

другой готовят мазки, фиксируют и окрашивают по Романовскому - Гимзе.
Микроскопируют мазки и определяют фагоцитарный показатель в опытной и
контрольной пробирках.

При наличии опсонинов в исследуемой сыворотке опсонический индекс будет

больше единицы. Чем больше число, полученное от деления показателя фагоцитоза
исследуемой на фагоцитарный показатель контрольной сыворотки, тем более
выражено действие антител - опсонинов.

Контрольные вопросы

1. На каком свойстве антител основана ОФР? Специфична ли эта реакция?

2. О чем свидетельствует показатель ОФР, равный 75?

Задание

Исследуйте ОФР крови, взятой из пальца. Зарисуйте фагоциты. Вычислите

ПОРФ.

Реакции иммунитета in vivo (кожаные пробы)

При нанесении антигена на скарифицированную кожу или введении
внутрикожно можно выявить как иммунное состояние, так и состояние
повышенной чувствительности к данному препарату.

Кожная проба с токсином. Внутрикожно вводят оттитрованное количество

токсина. Если организм иммунен, т. е. обладает определенным уровнем
антитоксина, действие токсина не проявится - произойдет нейтрализация токсина
антитоксином. В неиммунном организме на месте введения токсина разовьется
воспалительный инфильтрат (краснота, уплотнение и т. д.).

Кожные пробы с аллергеном (кожно-аллергические пробы) для изучения

реакций повышенного типа (см. главу 13). При повышенной чувствительности
немедленного типа введенный аллерген (антиген) вступает в реакцию с антителами,
адсорбированными на клетках различных органов. Повышенная чувствительность
замедленного типа обусловлена реакцией на аллерген сенсибилизированных Т-
лимфоцитов. Такая сенсибилизация бывает при ряде инфекций у больных,
переболевших и привитых (туберкулез, бруцеллез и др.). Поэтому кожно-
аллергические пробы при этих инфекциях имеют диагностическое значение.

Препараты для кожных проб готовят специальные производства, снабжая

инструкцией по их применению.
 Контрольные вопросы

1. Что является антителом в кожной пробе с токсином? О чем свидетельствует

отрицательный результат этой пробы?

2. Какая реакция позволяет выявить состояние повышенной чувствительности

организма к инфекционному агенту?

Иммунопрофилактика и иммунотерапия
инфекционных болезней
Попытки предупредить тяжелое течение смертельно опасной болезни, вызвав
легкую форму заболевания, делались на протяжении столетий в разных странах
мира.

Научное обоснование и практическое внедрение иммунопрофилактики впервые

дал Л. Пастер, который создал принципы применения ослабленных
(аттенуированных) микроорганизмов и приготовил препараты (вакцины) для
предупреждения некоторых инфекционных заболеваний человека и животных.

Прошло более ста лет и в настоящее время искусственное создание иммунитета -

основа борьбы с инфекционными заболеваниями.

Иммунизация - введение препаратов для создания искусственного активного

иммунитета - проводится в определенные годы на протяжении всей жизни
человека. В первые же дни после рождения ребенок получает вакцину БЦЖ против
туберкулеза. На 1-м году жизни ему делают прививки, чтобы предупредить
заболевания дифтерией, коклюшем и столбняком, вакцинируют против
полиомиелита, кори и пр. Таким образом проводят специфическую профилактику
инфекционных болезней, для которой используют вакцины.

Вакцины - препараты для активной иммунизации могут быть:

1. Корпускулярные (из микробных клеток) - живые и убитые.

2. Химические (антигены и антигенные фракции).

3. Анатоксины.

Живые аттенуированные вакцины готовят из живых микроорганизмов,

вирулентность которых ослаблена (от лат. attenuer - ослаблять, смягчать), а
иммуногенные свойства (способность вызывать невосприимчивость) сохранены.

Для получения таких микроорганизмов существуют разные способы:

1) выращивание на питательных средах, неблагоприятных для роста и

размножения возбудителя; при действии физических и химических факторов (так
была получена вакцина БЦЖ для профилактики туберкулеза); 2) пассирование
возбудителя через организм животного, мало восприимчивого к воспроизводимой
инфекции (так Л. Пастер получил вакцину против бешенства); 3) отбор
естественных культур микроорганизмов, маловирулентных для человека (так
получена вакцина против чумы) и др.

Живые вакцины создают напряженный иммунитет, так как вызывают процесс,

сходный с естественным инфекционным, только слабо выраженный, почти без
клинических проявлений. При этом приводится в действие весь механизм
иммуногенеза - создается невосприимчивость.

Убитые вакцины - культуры микроорганизмов, инактивированные действием

высокой температуры, химических веществ (фенол, формалин, спирт, ацетон), УФ-
лучей и др. При этом подбирают такие факторы воздействия, которые полностью
сохраняют иммуногенные свойства микробных клеток.

Химические вакцины - отдельные компоненты микробной клетки (антигены),

полученные путем специальной обработки микробной взвеси.

Химические вакцины обычно быстро всасываются после введения в организм,

что не позволяет достичь нужного иммуногенного раздражения, поэтому к
вакцинам добавляют вещества, удлиняющие время всасывания: гидроксид
алюминия, алюминиево-калиевые квасцы, минеральные масла и др. Это называют
созданием "депо".

Химические вакцины применяют для профилактики брюшного тифа, менингита

и др.

Анатоксины (от лат. ana - обратно) - это экзотоксины бактерий, обезвреженные

воздействием формалина (0,3-0,4%) и выдерживанием при температуре 37° С в
течение 3-4 нед. При этом происходит потеря токсических свойств, но сохранение
иммуногенных.

В настоящее время получены и применяются анатоксины из токсинов

возбудителей дифтерии, столбняка и др.

Анатоксины очищают от примесей питательных сред (балластные белки) и

сорбируют на веществах, которые всасываются медленно из места введения.

По количеству антигенов, входящих в состав вакцины, различают: моновакцины

(из одного вида антигенов), дивакцины (из двух антигенов), три вакцины (из трех
антигенов) и т. д.

Ассоциированные вакцины готовят из антигенов различных бактерий и

анатоксинов. Например, ассоциированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная
вакцина (АКДС) содержит убитые коклюшные микробы и анатоксины:
дифтерийный и столбнячный.

Вакцины вводят внутримышечно, подкожно, накожно, внутрикожно, через рот.

Иммунизируют либо однократно, либо двукратно и трехкратно с интервалами в 1-2
нед и больше. Кратность введения, интервалы между вакцинациями зависят от
характера вакцины - для каждой разработаны схемы введения.
 После введения вакцины могут возникнуть общие и местные реакции. К общим
относятся повышение температуры (до 39° С), головная боль, недомогание. Эти
явления обычно проходят через 2-3 дня. Местные реакции - краснота и инфильтрат
на месте введения вакцины могут появиться через 1-2 дня после прививки. При
накожном введении вакцины (против туляремии, БЦЖ и др.) появление местной
реакции свидетельствует об эффективности прививки.

Существуют противопоказания для вакцинации: лихорадочное состояние, острые

инфекционные заболевания, аллергия и др. Не прививают также женщин во второй
половине беременности.

Вакцины и анатоксины готовят на предприятиях по производству бактерийных

препаратов. Для их изготовления необходимы большие количества микробной
взвеси (биомасса) или материала, содержащего вирусы.

Готовые препараты разливают в ампулы или флаконы и большей частью

высушивают. Сухие препараты дольше сохраняют активность и другие свойства.

Некоторые вакцины, например полиомиелита, выпускают в виде таблеток или

драже.

На каждую ампулу, флакон и коробку с препаратами наклеивают этикетки с

указанием названия препарата, его объема, срока годности, номера серии и
контрольного номера.

В каждую коробку кладут наставление по применению.

Хранят препараты в основном при температуре 4° С. Нельзя подвергать

препараты замораживанию и оттаиванию, действию высокой температуры. При
транспортировке соблюдают особые условия. Нельзя применять препараты,
которые имеют трещины на ампулах и измененный внешний вид.

В СССР существует система Государственного контроля за качеством

медицинских иммунобиологических препаратов, которая обеспечивает их
эффективность и стандартность.

Особый вид вакцин - а у то вакцины. Их готовят в бактериологических

лабораториях из микробов, выделенных от больного. Применяют аутовакцину для
лечения только данного больного. Чаще всего используют аутовакцины для лечения
хронически протекающих инфекций (стафилококковых и др.). Вводят аутовакцину
многократно, малыми дозами по разработанной для каждой вакцины схеме.
Аутовакцины стимулируют защитные силы организма, чем способствуют
выздоровлению.

Сывороточные препараты применяют для создания искусственного пассивного

иммунитета. К ним относят специфические иммунные сыворотки и
иммуноглобулины.

Эти препараты содержат готовые антитела. Их получают из крови доноров -

специально проиммунизированных людей или животных (против кори, гриппа,
столбняка). Кроме того, используют сыворотку переболевших и даже здоровых
людей, если в ней содержится достаточное количество антител. В качестве сырья
для приготовления иммунных препаратов используют также плацентарную и
абортную кровь.

Имеются антибактериальные и антитоксические сыворотки. Первые имеют более

ограниченное применение. Антитоксические сыворотки применяют для лечения
дифтерии, столбняка, ботулизма и др. Эти сыворотки выпускают с определенным
содержанием антитоксина, которое измеряют в международных единицах (ME).

Иммунные сывороточные препараты получают из крови животных, главным

образом лошадей, многократно иммунизированных. По окончании иммунизации
определяют уровень антител в крови и делают кровопускание. Полученную
сыворотку консервируют, контролируют ее стерильность, активность и физические
свойства.

Препараты, полученные из крови лошадей, содержат чужеродные для человека

белки, которые при повторном введении могут вызвать аллергические реакции:
сывороточную болезнь и анафилактический шок. Для предупреждения осложнений
сывороточные препараты следует вводить с предосторожностями (по Безредке) (см.
главу 13). Для освобождения сывороток животных от балластных белков и
концентрации антител применяют различные методы, основным из которых
является метод "Диаферм-3", разработанный в нашей стране и включающий
ферментативный гидролиз балластных белков.

Кроме того, для концентрации антител в меньшем объеме препарата разработаны

методы выделения из сыворотки крови гамма-глобулинов, содержащих антитела.
Такие препараты называют иммуноглобулинами. Их готовят из сыворотки человека
(гомологичные) и животных (гетерологичные).

Эффективность иммуноглобулинов гораздо выше эффективности иммунных

сывороток, а осложнений наблюдается несоизмеримо меньше. В настоящее время
иммуноглобулины применяют гораздо более широко, чем сыворотки.

В нашей стране иммуноглобулины используют для профилактики кори, гепатита,

краснухи и др. Профилактическое введение иммуноглобулинов проводят при
подозрении на заражение или при заражении. Целесообразно вводить эти
препараты в первые дни после заражения (начало инкубационного периода), пока
патологический процесс еще не развился.

При лечебном применении препарата раннее его введение дает больший эффект.

Сыворотки и иммуноглобулины вводят внутримышечно и внутривенно.

Своевременное и правильное использование сывороточных препаратов

позволяет снизить заболеваемость многими инфекциями.

Контрольные вопросы

1. Какие виды вакцин Вы знаете?

2. Какими препаратами создают пассивный иммунитет?

 3. Что такое аутовакцина?

Глава 13. Аллергия - Л. Б. Богоявленская

Аллергия (от лат. alios - иной, ergon - действие) - это состояние измененной,
повышенной чувствительности организма к различным чужеродным веществам
(антигенам).

Вещества, вызывающие состояние повышенной чувствительности

(гиперчувствительности) организма, называют аллергенами. Аллергенами могут
быть: микроорганизмы (бактерии, вирусы, грибы), продукты распада микробных
клеток; белки животного происхождения (яйца, молоко и др.); белки растительного
происхождения (земляника, грибы и пр.); лечебные гетерологичные сыворотки и
пр.

Все эти вещества являются полноценными антигенами. Кроме того, аллергию

могут вызвать гаптены - вещества, которые становятся аллергенами после
соединения с белками организма: производственные аллергены (красители, лаки,
мыла и пр.); бытовые аллергены (пыль, шерсть собак и кошек, пух подушек и пр.);
растительные аллергены (пыльца растений во время цветения и пр.); лекарственные
вещества (антибиотики, аспирин и пр.).

Аллергия - специфическая гиперчувствительность организма к различным

агентам. В ее основе лежит реакция антиген - антитело. Впервые попадая в
организм, одни аллергены образуют антитела, другие аллергены сенсибилизируют
Т-лимфоциты. В том и другом случае организм приобретает повышенную
чувствительность к повторной встрече с антигеном, который вызвал эти изменения.
Эта повторная встреча может проявиться по-разному в зависимости от аллергена,
характера иммунной перестройки организма.

Все аллергические реакции делятся на две группы: реакции

гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) и реакции гиперчувствительности
замедленного типа (ГЗТ). В зависимости от формы аллергии проявляется реакция
гиперчувствительности того или иного типа.

Реакции гиперчувствительности
Немедленного типа (ГНТ) Замедленного
типа (ГЗТ)
1. Анафилаксия 1.
Инфекционная аллергия
2. Феномен Артюса - Сахарова 2. Контактные
дерматиты
3. Сывороточная болезнь 3.
Лекарственная аллергия
4.Атопии (поллиноз, бронхиальная астма,
крапивница)
 Реакции гиперчувствительности немедленного типа
Анафилаксия (от лат. ana - против, phylaxis - защита) - это
гиперчувствительность, проявляющаяся немедленно после повторного введения
чужеродного антигена в виде шока или близких к нему состояний.

Вещества, вызывающие анафилаксию, называют анафилактогенами. К ним

относят чужеродные белки, бактериальные токсины, полисахариды микробной
клетки, различные лекарственные вещества, т. е. и полноценные антигены и
гаптены.

Механизм анафилаксии. Первое введение анафилактогена (например, сыворотки

лошади в организм морской свинки) вызывает специфическую сенсибилизацию.
Возникают антитела (IgE), которые накапливаются в максимальном титре через 10-
12 дней. Циркулируя в крови, эти антитела частично адсорбируются на клетках
тела.

Первая доза чужеродного белка, вызывающая сенсибилизацию, называется

сенсибилизирующей. Обычно это очень небольшая доза (0,01-0,0001 мл лошадиной
сыворотки для морской свинки). Сенсибилизация происходит при парентеральном
введении антигена. Однако она может наступить и при прохождении антигенов
через слизистую оболочку кишечника или легких. Развившееся состояние аллергии
может сохраняться долго - несколько месяцев и даже лет.

Повторное введение того же анафилактогена вызывает реакцию немедленного

типа - анафилактический шок, от которого животное погибает. Условиями развития
анафилактического шока являются: 1) повторная доза (разрешающая) должна
превышать сенсибилизирующую в 10-100 раз; 2) разрешающая доза должна быть
введена непосредственно в кровь.

В патогенезе анафилаксии основную роль играют антитела, образовавшиеся в

ответ на введение чужеродного белка или других анафилактогенов. Эти антитела
частично адсорбируются на клетках, которые называют клетки-мишени (тучные,
базофилы) и др. При повторном введении разрешающей дозы аллергена он вступает
в реакцию с антителами на поверхности этих клеток, нарушается целостность
клеточных мембран. Это приводит к массивному выбросу из клеток веществ типа
гистамина, которые обусловливают развитие анафилактического шока. Соединение
антигена с антителами, циркулирующими в крови, приводит к образованию
преципитатов, которые также вызывают активацию медиаторов.

Если сыворотку сенсибилизированного животного ввести здоровому животному

того же вида, то спустя 1-2 дня (это время необходимо для фиксации введенных
антител на клетках-мишенях) оно становится сенсибилизированным. Разрешающая
доза анафилактогена вызовет шок у животного, получившего готовые антитела. Это
- пассивная анафилаксия.

Клиническая картина анафилактического шока различна у разных животных.

У морской свинки реакция после внутривенного введения второй дозы

анафилактогена наступает немедленно: животное становится беспокойным, чешет
лапками нос, чихает, появляются одышка, затем судороги, непроизвольное
выделение мочи и кала - животное погибает. При вскрытии отмечают спазм
бронхов, раздутые легкие, гиперемию и кровоизлияния в пищеварительном тракте.

У собак анафилактический шок сопровождается спазмом сосудов и застоем

крови в печени. Смерть животного наступает при выраженном падении кровяного
давления.

Кролики при анафилаксии погибают от остановки дыхания и падения кровяного

давления. Эти явления вызваны спазмом артерий малого круга кровообращения.

У человека анафилактический шок развивается чаще всего при нарушении

правил инъекций сывороточных препаратов или при введении пенициллина и
других лекарственных веществ. Реакция сопровождается спазмом гладкой
мускулатуры, нарушением деятельности сердечнососудистой системы.
Температура тела падает на 1-2° С, появляются одышка, частый пульс, отмечаются
падение артериального давления, судороги, боли в суставах и т. д. Иногда
анафилактический шок заканчивается смертью.

Для предупреждения анафилактического шока следует провести

десенсибилизацию, т. е. снять повышенную чувствительность. С этой целью до
введения всего количества анафилактогенного вещества вводят небольшую дозу
его, которая не вызывает шока, но связывает антитела к вводимому
анафилактогену. Например, при необходимости введения человеку чужеродной
лошадиной сыворотки (иммунной противостолбнячной, противодифтерийной)
сначала вводят 0,5-1,0 мл, а через 2 ч - остальную дозу. Это - способ введения
сыворотки по Безредке.

Сывороточные препараты всегда вводят дробно. Сначала определяют

чувствительность человека к вводимому препарату. С этой целью в сгибательную
поверхность предплечья внутрикожно вводят 0,1 мл испытуемой сыворотки,
разведенной 1:100. Если реакция отрицательная (небольшая краснота и
припухлость меньше 1 см), через 20-30 мин вводят подкожно 0,1-0,5 мл
неразведенной сыворотки. При отрицательной реакции через 30-60 мин вводят всю
дозу.

Местная анафилаксия - феномен Артюса - Сахарова. Реакция проявляется в

виде местной на повторное введение аллергена не в кровь, а внутрикожно или
подкожно. В опытах на кроликах было установлено, что 3-4 введения лошадиной
сыворотки под кожу проходят бесследно, а на 5-7-й инъекции на коже появляются
воспалительная реакция и некроз. Это явление используют в практике для
выявления состояния сенсибилизации у людей к различным веществам.
Внутрикожно вводят небольшое количество испытуемого вещества (сыворотка,
различные лекарственные вещества, белки). Появление красноты и припухлости
(отек более 1 см) свидетельствует о повышенной чувствительности.

Сывороточная болезнь развивается при введении человеку чужеродной

сыворотки (например, лошадиной). Она может возникнуть сразу после введения
препарата и протекает тяжело, по типу анафилактического шока. Это чаще всего
происходит при повторном введении сыворотки, когда в организме уже имеются
антитела к ней. Но сывороточная болезнь может развиться и при однократном
введении большой дозы сыворотки. В этом случае она проявляется через 8-12 дней
после введения, так как за этот период в организме синтезируются антитела к
сыворотке. Появляются сыпь (крапивница), зуд, боли в суставах, припухлость
лимфатических узлов, повышается температура. Постепенно все эти симптомы
исчезают.

Для предупреждения сывороточной болезни сыворотку следует вводить по

Безредке.

Применение иммуноглобулинов позволяет избежать сывороточной болезни.

Атонические реакции (атопии) (от лат. atopos - необычность, странность)

возникают в ответ на попадание в организм аллергенов у лиц с повышенной к ним
чувствительностью. Предрасположение повышенной чувствительности передается
по наследству.

Механизм этих реакций состоит также во взаимодействии между аллергеном и

антителами, которые образовались при первой встрече организма с данным
аллергеном. При этом, так же как и при анафилаксии, выделяются гистамин и
сходные с ним вещества, которые вызывают спазм гладкой мускулатуры,
повышение проницаемости сосудов и т. д.

В зависимости от органа и ткани, на клетках которых происходит фиксация

(прикрепление) антител, возникают различные состояния: поражение дыхательных
путей - аллергический насморк и бронхиальная астма; поражение слизистой
оболочки глаз - конъюнктивит; кожи - крапивница и т. п.

Кроме того, атопии проявляются в виде непереносимости определенных

веществ: пищевых, лекарственных, растительных. В отличие от анафилаксии
атопические состояния не поддаются десенсибилизации и наблюдаются только у
человека.

Бронхиальная астма. Заболевание протекает в виде приступов удушья с тяжелым

спастическим кашлем. Он развивается в результате спазма мышц и набухания
слизистой оболочки бронхиол. Причиной астмы часто является воздействие
различных аллергенов - пыльцы растений, шерсти животных, лекарственных
препаратов и др.

Поллиноз (сенная лихорадка). Развивается обычно весной и летом, в период

цветения растений. При вдыхании и соприкосновении с пыльцой растений или
спорами грибов возникают конъюнктивиты, насморк, головная боль, иногда
приступы удушья. Развитие заболевания связано с предыдущей сенсибилизацией
организма. В крови можно обнаружить антитела к пыльце растений. При этом
изменение чувствительности может относиться к одному виду растений (рожь,
клевер, георгины и др.) или сразу ко многим.

Крапивница проявляется сыпью в виде крупных красных "лепешек" и зудом.

Возникает при употреблении пищевых продуктов (земляника, грибы, яйца и др.)
или при контакте с химическими веществами (например, фенолфталеин).
 Реакции гиперчувствительности замедленного типа
Реакции гиперчувствительности замедленного типа - это формы аллергии, при
которых сенсибилизация организма связана с активацией и накоплением Т-
лимфоцитов (сенсибилизированных Т-лимфоцитов). В отличие от ГНТ реакции
ГЗТ, во-первых, не связаны с циркулирующими в крови антителами и,
следовательно, пассивная передача ГЗТ другому животному введением сыворотки
сенсибилизированного животного не может быть осуществлена. Во-вторых, они
развиваются не сразу, а через 24-28 ч после контакта с аллергеном.

Механизм реакции гиперчувствительности замедленного типа. Первая встреча

аллергена с Т-лимфоцитом (имеющим соответствующий данному аллергену
рецептор) приводит к активации и пролиферации (размножению) Т-клетки. В
результате в организме накапливается клон сенсибилизированных к данному
аллергену Т-лимфоцитов. При повторной встрече с этим же аллергеном Т-
лимфоциты снова активируются и вовлекают макрофаги в процесс разрушения
клеток-мишеней, несущих антиген. При этом погибают и Т-лимфоциты.
Выделяются токсические для окружающих клеток вещества. Развивается
клиническая картина аллергии.

Инфекционная аллергия - это состояние повышенной чувствительности к

повторному контакту с микроорганизмами или продуктами их жизнедеятельности.
Развивается при многих инфекционных болезнях; играет большую роль в их
патогенезе и сохраняется длительное время после выздоровления. Инфекционная
аллергия наблюдается при туберкулезе, бруцеллезе, сифилисе и др. Специфичность
реакций при инфекционной аллергии используют для диагностики многих
инфекционных болезней (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.) - применяют
кожно-аллергические пробы. Внутрикожно или накожно вводят очень небольшие
количества аллергенов - фильтраты или лизаты культур, взвеси бактерий, убитых
нагреванием или химическими веществами и т. п.

При повышенной чувствительности в месте введения аллергена возникает

реакция: покраснение, припухлость, болезненность. Иногда развиваются и общие
реакции: слабость, недомогание, обострение общего процесса (например, после
введения туберкулина при туберкулезе).

Контактные дерматиты - аллергические заболевания кожи. Они развиваются

при длительном соприкосновении с различными химическими веществами.
Аллергенами могут быть: мыла, клей, красители, резина, лекарства, косметические
и другие обычно безвредные вещества. Они являются гаптенами, но, соединяясь с
белками организма, становятся антигенами (аллергенами). Проявления заболевания
многообразны - от покраснения кожи до некроза к контактным дерматитам относят
экзему (экзематозный дерматит).

У некоторых людей развивается непереносимость к различным пищевым

веществам (земляника, творог яйца и пр.), лекарствам (ацетилсалициловая кислота,
амидопирин и др.). Являясь гаптенами, эти вещества при соединении с белками
организма становятся антигенами и вызывают аллергию

Многие аллергические реакции можно предотвратить только предупреждением

повторного контакта с аллергеном. Однако порою выявить агент, вызвавший
состояние гиперчувствительности, бывает сложно. Для этого ставят внутрикожные
пробы с предполагаемым аллергеном.

За последние годы в нашей стране получено множество аллергенов как

инфекционных (из различных микроорганизмов, вызывающих инфекционную
аллергию), так и неинфекционных (из разного вида пыли, пищевых продуктов,
химических веществ и др.). Но следует помнить, что введение даже малых доз
антигенов в организм вызывает его дополнительную аллергизацию. Поэтому в
последнее время все чаще применяют лабораторные методы аллерго-диагностики.

Иммуносерологические и иммуноцитологические тесты.

Иммуносерологические тесты основаны на выявлении аллергических антител в
сыворотке крови или повышенной концентрации IgE при В-зависимых аллергиях (в
основном атониях). Самым точным является радиоаллергосорбентный тест (PACT),
основанный на принципе антиглобулиновой реакции с использованием меченой
антисыворотки к IgE.

Иммуноцитологические методы основаны на визуальной регистрации

специфического аллергического повреждения клеток. Для диагностики В-
зависимых аллергий применяют базофильный тест Шелли, тест дегрануляции
тучных клеток и др. При Т-зависимых аллергиях информативны другие тесты:
определение показателя повреждения нейтрофилов (по Фрадкину), реакции
бласттрансформации лимфоцитов, торможения миграции макрофагов. Простым и
информативным является тест определения показателя повреждения нейтрофилов
(ППН). Аллергены для его постановки производят в нашей стране. Методика ППН
заключается в регистрации амебоидной активности нейтрофилов при контакте с
аллергеном. Появление амебоидных выпячиваний при контакте с аллергеном
является начальной фазой повреждения нейтрофила и указывает на повышенную
чувствительность организма к данному аллергену.

Для регистрации этого явления кровь обследуемого смешивают с аллергеном

(например, бруцеллином) и антикоагулянтом. Смесь инкубируют В качестве
контроля кровь, соединенную только с антикоагулянтом, тоже инкубируют. Затем
из обоих образцов крови делают мазки и просматривают их под микроскопом. В
каждом мазке считают по 100 нейтрофилов. Показатель повреждения высчитывают
по формуле:

где НО - число поврежденных нейтрофилов в опытном мазке, Нк - число

поврежденных нейтрофилов в контрольном препарате. У здоровых людей ППН не
превышает индекса 0,1.

Контрольные вопросы

1. Какие виды аллергических реакций Вы знаете?

2. Как развивается и проявляется анафилаксия?

 3. Как предупредить анафилактическую реакцию организма при введении
сывороточных препаратов'7

Часть II. Частная микробиология

Патогенные кокки - Ф. К. Черкес
Кокки - это обширная группа микроорганизмов, включающая патогенных,
условно-патогенных и непатогенных представителей.

В данной главе будут рассмотрены патогенные и условно-патогенные кокки.

По классификации Берги патогенные кокки относятся к трем семействам:

1. Micrococcaceae - род Staphylococcus (стафилококки).

2. Streptococcaceae - род Streptococcus (стрептококки и пневмококки).

3. Neisseriaceae - род Neisseria (менингококки и гонококки).

Общим признаком для всех патогенных кокков является их способность

вызывать гнойные процессы, поэтому они называются гноеродными (пиогенными).

Степень органотропности у кокков неодинакова, она наиболее выражена у

пневмококков, менингококков и гонококков.

Все патогенные кокки неподвижны, не образуют спор, пневмококки образуют

капсулу.

По тинкториальным свойствам они делятся на грамположительные

(стафилококки, стрептококки) и грамотрицательные (менингококки, гонококки).

Патогенные представители гноеродной группы отличаются друг от друга по

потребности в питательных веществах и биохимической активности. Наименее
требовательны к средам, а биохимически более активны стафилококки, наиболее
требовательны к средам и наименее биохимически активны - гонококки.

Глава 14. Стафилококки

Впервые стафилококки были обнаружены Л. Пастером в 1897 г. Подробно они
были изучены А. Огстоном (1882) и Ф. Розенбахом (1884).

Морфология. Стафилококки (от греч. staphyle - виноградная гроздь) имеют вид

круглых шаров диаметром 0,5-1,5 мкм. Размножаясь, образуют скопления в виде
грозди винограда. Такая форма является результатом деления микробов в
различных плоскостях. Однако в гное встречаются единичные и парные кокки.
Стафилококки неподвижны, не имеют спор, при специальных условиях
культивирования образуют микрокапсулу, грамположительны.
 Культивирование. Стафилококки - факультативные анаэробы, однако лучше
растут в присутствии кислорода. Растут и размножаются на обычных питательных
средах, хорошо растут на средах с кровью, оптимальные условия - температура 37°
С, рН 7,2-7,4.

Элективными средами являются желточно-солевой агар и солевой агар. На МПА

колонии стафилококка выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие, размером 2-4
мм с ровными краями. При росте стафилококки образуют пигмент: золотистый,
лимонно-желтый или белый. Лучше всего пигмент образуется на молочной среде
при комнатной температуре и рассеянном свете. Стафилококковый пигмент не
растворяется в воде, растворяется в ацетоне, эфире, спирте и т. д. При росте
некоторых штаммов стафилококка на агаре с кровью вокруг колонии образуется
зона гемолиза. Рост на бульоне характеризуется равномерным помутнением и
осадком на дне.

Ферментативные свойства. Стафилококки вырабатывают сахаролитические и

протеолитические ферменты. Сахаролитические ферменты расщепляют ряд
сахаров: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, глицерин и другие с образованием
кислоты.

Протеолитические свойства стафилококка выражаются в способности растворять

казеин, разжижать желатин (медленно), расщеплять другие белковые субстраты.

Стафилококки продуцируют ферменты патогенности: 1) коагулазу (сворачивает

плазму крови); 2) гиалуронидазу (фактор распространения); 3) лецитиназу
(растворяет лецитин оболочки клеток); 4) фибринолизин (лизирует фибрин); 5)
ДНКазу (деполимеризует ДНК); 6) фосфатазу и др.

Наличие плазмокоагулазы позволяет дифференцировать золотистый стафилококк

от стафилококков других видов. Многие стафилококки вырабатывают
пенициллиназу, разрушающую пенициллин.

Токсинообразование. Стафилококки вырабатывают экзотоксины. К их числу

относятся гемолизины четырех типов, из которых наибольшее значение имеет α-
токсин. Он обладает следующими свойствами: гемолитическим - вызывает гемолиз
эритроцитов, дермонекротическим - при внутрикожном введении вызывает некроз,
летальным - при внутривенном введении приводит к гибели чувствительных к нему
животных.

Кроме гемолизинов стафилококки образуют лейкоцидин, убивающий лейкоциты,

энтеротоксины шести типов, вызывающие пищевые отравления, эксфолиатины
двух типов, приводящие к отслаиванию эпидермиса у новорожденных детей.

Антигенная структура. Стафилококки имеют протеиновый антиген А, общий

для всех золотистых стафилококков, и полисахаридные антигены: А, Б, С.

Стафилококки выделяют бактериоцины (стафилоцины), которые обладают

антагонистическим действием по отношению к микроорганизмам данного рода.

Среди золотистых (реже эпидермальных) стафилокков различают около 40

фаговаров. Определение чувствительности выделенных из различных объектов
стафилококковых культур к типовым фагам имеет важное эпидемиологическое
значение (при установлении источника и путей передачи возбудителя).

Классификация. В настоящее время стафилококки, выделенные от человека,

делят на 3 вида (табл. 23): S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus.

Таблица 23. Дифференциация видов стафилококков, выделенных от человека

Примечание. + наличие ферментации, устойчивости, - отсутствие ферментации,

устойчивости.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стафилококки довольно

устойчивы, поэтому они обнаруживаются в воздухе, почве, воде, на предметах
обихода. При температуре 100° С они погибают моментально, при температуре 70°
С - через 10-15 мин. Они хорошо переносят низкие температуры. При
замораживании сохраняют жизнеспособность в течение нескольких лет. Хорошо
переносят высушивание. Прямой солнечный свет убивает их только через
несколько часов. Обычные растворы дезинфицирующих веществ (например, сулема
в разведении 1:1000) убивают их через 15-20 мин. При обезвреживании выделений,
содержащих гной, белок, мокроту, не следует применять фенол. Это
дезинфицирующее вещество вызывает коагуляцию белков, что предохраняет
микроорганизмы от гибели. Стафилококки чувствительны к бриллиантовому
зеленому.

Восприимчивость животных. К стафилококку чувствительны крупный и

мелкий рогатый скот, лошади, свиньи, куры. Из экспериментальных животных -
кролики, белые мыши и котята.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-капельный, воздушно-пылевой,

пищевой.

Заболевания у человека. Пиодермия, фурункулы, карбункулы, панариции,

абсцессы; воспалительные процессы различных органов и тканей; ангины, циститы,
остеомиелиты, холециститы, маститы; сепсис и септикопиемия; пищевые
токсикоинфекции и многие другие. Описано около 120 нозологических форм
стафилококковой этиологии.
 Патогенез. Стафилококки проникают через кожу и слизистые оболочки.

Преимущественное значение при стафилококковых заболеваниях имеет

золотистый стафилококк (S. aureus). Менее выражена роль в патологии человека S.
epidermidis и S. saprophyticus. Патогенез обусловливается свойствами возбудителя -
ферментами, экзотоксинами, веществами бактериальной клетки и состоянием
иммунной системы макроорганизма.

Чаще поражается кожа и подкожная клетчатка - возникают пиодермиты,

фурункулы, панариции. Нередко стафилококки обусловливают вторичные
заболевания, например пневмонию при гриппе. Они также вызывают раневые
инфекции. Особенно велика роль стафилококков в акушерской практике, так как
новорожденные очень чувствительны к ним. В течении стафилококковых
заболеваний имеет значение развитие аллергии, поэтому заболевание
характеризуется рецидивами.

Особое место среди стафилококковых заболеваний занимают пищевые

интоксикации. Клинически они протекают как токсикозы, сопровождаются рвотой,
поносом, головной болью и другими явлениями.

Иммунитет. У человека имеется естественная резистентность, связанная с

механическими факторами, фагоцитозом и наличием антител. Воспалительный
процесс, возникающий в месте внедрения возбудителя, обусловливает задержку
стафилококков и затрудняет их распространение по организму. В образовавшемся
очаге стафилококки подвергаются фагоцитозу.

Образующийся в процессе заболевания антитоксин является важным фактором в

общем комплексе иммунитета. Однако приобретенный иммунитет нестойкий,
поэтому наблюдаются рецидивы.

Профилактика. Сводится к улучшению санитарно-гигиенических условий,

активному выявлению больных и бактерионосителей, правильному режиму работы
больничных учреждений.

Специфическая профилактика. Стафилококковый анатоксин и

антистафилококковый иммуноглобулин.

Лечение. Антибактериальные препараты, поливалентный стафилококковый

бактериофаг, антистафилококковая плазма и иммуноглобулин. В некоторых
случаях при хроническом течении стафилококковых инфекций применяют
аутовакцину.

Контрольные вопросы
1. По какому признаку кокки объединены в одну группу?

2. Какие ферменты и факторы патогенности продуцируют стафилококки?

3. Какие заболевания вызывают стафилококки?

4. Какие виды стафилококков Вы знаете?

 Микробиологическое исследование
Цель исследования: выделение и идентификация стафилококков.

Материал для исследования

1. Гной (фурункулы, карбункулы, абсцессы).

2. Слизь из зева (ангина).

3. Мокрота (пневмония).

4. Моча (пиелиты и циститы).

5. Дуоденальное содержимое (холецистит).

6. Кровь (подозрение на сепсис).

7. Рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты (пищевые

отравления).

8. Слизь из носа (обследование на бактерионосительство).

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Микробиологический.

3. Биологический.

Ход исследования
Первый день исследования
 Первый день исследования

Все посевы ставят в термостат на сутки.

Обнаружение стафилококков при микроскопии гноя из закрытого абсцесса и

осадка мочи, взятой катетером, позволяет дать предварительный положительный
ответ: обнаружен стафилококк.

Второй день исследования

Посевы на плотных и жидких питательных средах вынимают из термостата и

изучают. Подозрительные в отношении стафилококка колонии, выросшие на
желточно-солевом агаре, отсевают на скошенный агар для получения и
дальнейшего изучения чистой культуры. При этом учитывают наличие лецитиназы,
которое проявляется в образовании радужного венчика вокруг колонии. Чашки с
оставшимися колониями оставляют на 2-3 дня при комнатной температуре для
выявления пигмента. Просматривают посевы на чашках с агаром, содержащим
кровь. Колонии с четкой зоной гемолиза (просветление) вокруг них выделяют на
скошенный агар. Посев крови в сахарном бульоне инкубируют 10 сут, производя
через 2-3 дня высевы на агар с кровью и желточно-солевую среду.

При отсутствии роста на плотных питательных средах делают высев из бульона с

глюкозой на агар с кровью. Посевы ставят в термостат на сутки.

Третий день исследования

Вынимают посевы из термостата. Из выделенных на скошенный агар культур

делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии
грамположительных стафилококков проводят дальнейшее изучение выделенной
культуры:
 а) ставят реакцию плазмокоагуляции;

б) изучают гемолитические свойства;

в) определяют продукцию ДНКазы;

г) определяют ферментацию маннита в анаэробных условиях;

д) определяют устойчивость к новобиоцину.

Реакция плазмокоагуляции. Цитратную плазму, полученную из крови кролика,

разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:4 и наливают в
две преципитационные пробирки по 0,3-0,5 мл. В одну пробирку вносят петлю
исследуемой культуры, другая пробирка служит контролем. Обе пробирки ставят в
термостат при температуре 37° С. Учет реакции производят через 2-3 ч. При
отсутствии свертывания плазмы посевы оставляют при комнатной температуре на
24 ч, после чего учитывают реакцию. При наличии фермента коагулазы плазма
свертывается (не выливается из перевернутой пробирки). В контрольной пробирке
консистенция плазмы не изменяется.

Ускоренный метод определения коагулазы. В стерильной капле воды на

предметном стекле суспендируют выделенную культуру, к ней прибавляют одну
каплю неразведенной плазмы. При положительной реакции из микробных клеток в
течение 20-60 с образуются крупные хлопья. Этот метод используют при массовых
обследованиях.

Определение гемолитических свойств. Производят посев на агар с 5% крови

(штаммы, продуцирующие α-гемолизин, дают зоны просветления среды и на
кроличьей и на бараньей крови, продуцирующие β-гемолизин лизируют только
эритроциты барана).

Определение ДНКазы. Исследуемую культуру засевают на среду, содержащую

ДНК. Посевы инкубируют. Через 18-20 ч на чашку с выросшими колониями
стафилококка добавляют 5-7 мл раствора хлороводородной кислоты. ДНК
реагирует с кислотой и среда становится мутной. Если выделенная культура
продуцирует фермент ДНКазу, он деполимеризует ДНК и помутнение не
образуется.

Расщепление маннита в анаэробных условиях. Исследуемую культуру

засевают уколом на полужидкий агар с маннитом. Поверхность среды заливают
вазелиновым маслом. Инкубируют 18-24 ч при 37° С. Положительная реакция
характеризуется изменением цвета среды (в среде имеется индикатор).

Четвертый день исследования

Производят учет результатов (табл. 24).

 Таблица 24. Свойства золотистого стафилококка

Примечание. + положительная реакция.

Наличие перечисленных признаков позволяет отдифференцировать золотистые

стафилококки от стафилококков других видов и дать окончательный ответ: выделен
S. aureus (рис. 37).
 Рис. 37. Схема выделения и идентификации стафилококка

Для установления эпидемиологической цепочки выделенную культуру

фаготипируют. Фаготипирование может подтвердить идентичность стафилококков,
выделенных от разных больных и из объектов внешней среды.

Для фаготипирования используют критические тест-разведения фагов.

Критическим тест-разведением называют то максимальное разведение фагов, при
котором происходит полусливной лизис соответствующего штамма стафилококка.
 Методика фаготипирования. В чашку Петри наливают 20 мл 1,5% МПА, дают
ему застыть и подсушивают в термостате в течение 30-40 мин. На поверхность
агара наносят 1 мл 4-6-часовой культуры выделенного стафилококка, распределяют
по поверхности всей чашки, избыток жидкости отсасывают или дают ей испариться
в термостате в открытой чашке. Предварительно дно чашки делят на секторы или
квадраты. Число квадратов или секторов должно соответствовать количеству
используемых фагов. Затем на каждый квадрат или сектор наносят один фаг.

Чашки ставят в термостат при температуре 37° С. Результаты определяют через

6-7 ч. Если чашки оставляют при комнатной температуре, то учет фаголизиса
производят через 18-24 ч.

Биологические пробы. Проба на определение летальных свойств культуры. Для

выявления летального действия токсина кролику вводят внутривенно (или
внутрибрюшинно) фильтрат бульонной культуры стафилококка из расчета 0,1-0,2
мл фильтрата на 1 кг массы кролика. Гибель кролика через 3-4 дня свидетельствует
о наличии летального действия токсина.

Дермонекротическая проба. Пробу ставят на кролике (наиболее чувствительному

к этому токсину животному). Предварительно на боку или на спине животного
выщипывают шерсть и вводят внутрикожно 0,2 мл двухмиллиардной взвеси
стафилококковой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида. При наличии
в выделенной культуре некротических свойств в месте введения образуется
инфильтрат, сопровождающийся некрозом.

Реакцию учитывают через 24-18 ч.

Полученную культуру стафилококка проверяют на чувствительность к

антибиотикам методом бумажных дисков (см. главу 9).

Контрольные вопросы
1. Какой материал исследуют при заболеваниях, вызываемых стафилококками?

2. Каковы основные методы лабораторного исследования для выявления

стафилококков?

3. Какова методика постановки реакции плазмокоагуляции?

4. На какой среде выявляют гемолитические свойства стафилококков?

5. С какой целью проводят фаготипирование?

Задание
Проверьте, к какому антибиотику чувствительна выделенная культура
стафилококка.

Питательные среды
 Желточно-солевой агар Чистовича. Готовят желточную смесь (1 желток
куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). К
мясопептонному солевому агару (8-10% натрия хлорида), растопленному и
остуженному до 45° С, добавляют 20% желточной взвеси (соблюдают
стерильность) и разливают в чашки.

Агар с кровью. См. главу 7.

Солевой бульон, солевой агар. Готовят как обычные среды - МПБ и МПА,
только натрия хлорид вносят в большем количестве (8-10%). Бульон разливают в
колбы, пробирки, агар - в чашки.

Глава 15. Стрептококки

К роду Streptococcus относятся: Streptococcus pyogenes (гемолитический) и
Streptococcus pneumoniae (пневмококк). Впервые стрептококки были обнаружены
Бильротом (1874), Л. Пастером (1879). Изучены они были Э. Розенбахом (1884).

Streptococcus pyogenes (гемолитический)

Морфология. Стрептококки - это кокки, имеющие шаровидную форму. Диаметр
каждого кокка в среднем 0,6-1 мкм, однако для них характерен полиморфизм:
встречаются мелкие и крупные кокки, строго шаровидные и овальные.
Стрептококки располагаются цепочкой, что является результатом деления их в
одной плоскости. Длина цепочек разная. На плотной питательной среде цепочки
обычно короткие, на жидких - длинные. Стрептококки неподвижны, не имеют спор
(см. рис. 4) Свежевыделенные культуры иногда образуют капсулу. На ультратонких
срезах видна микрокапсула, под ней расположена трехслойная клеточная стенка и
трехслойная цитоплазматическая мембрана. Грамположительны.

Культивирование. Стрептококки - факультативные анаэробы. Растут при

температуре 37° С и рН среды 7,6-7,8. Оптимальными средами для их выращивания
являются среды, содержащие кровь или сыворотку крови. На плотных питательных
средах колонии стрептококков мелкие, плоские, мутные, сероватого цвета. На агаре
с кровью некоторые разновидности стрептококков образуют гемолиз. β-
Гемолитические стрептококки образуют четкую зону гемолиза, α-гемолитические
стрептококки образуют небольшую зеленоватую зону (результат перехода
гемоглобина в метгемоглобин). Встречаются стрептококки, не дающие гемолиза.

На сахарном бульоне стрептококки растут с образованием пристеночного и

придонного мелкозернистого осадка, бульон при этом остается прозрачным.

Ферментативные свойства. Стрептококки обладают сахаролитическими

свойствами. Они расщепляют глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит (не всегда) и
мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у них слабо
выражены. Они свертывают молоко, желатин не разжижают.

Токсинообразование. Стрептококки образуют ряд экзотоксинов: 1)

стрептолизины - разрушают эритроциты (О-стрептолизин обладает
кардиотоксическим действием); 2) лейкоцидин - разрушает лейкоциты (образуется
высоковирулентными штаммами); 3) эритрогенный (скарлатинозный) токсин -
обусловливает клиническую картину скарлатины - интоксикацию, сосудистые
реакции, сыпь и пр. Синтез эритрогенного токсина детерминирован профагом; 4)
цитотоксины - обладают способностью вызывать гломерулонефрит.

Антигенная структура и классификация. У стрептококков обнаружены

различные антигены. В цитоплазме клетки содержится видовой нуклеопротеидной
природы антиген - единый для всех стрептококков. На поверхности клеточной
стенки расположены протеиновые типовые антигены. В клеточной стенке
стрептококков обнаружен полисахаридный групповой антиген.

По составу полисахаридной группоспецифической фракции антигена все

стрептококки делятся на группы, обозначаемые большими латинскими буквами А,
В, С, D и т. д. до S. Кроме групп, стрептококки разделены на серологические типы,
которые обозначаются арабскими цифрами.

Группа А включает 70 типов. В эту группу входит большинство стрептококков,

вызывающих различные заболевания у человека. Группа В включает в основном
условно-патогенные для человека стрептококки. Группа С включает патогенные
для человека и животных стрептококки. Группа D состоит из непатогенных для
человека стрептококков, однако в эту группу входят энтерококки, которые
являются обитателями кишечного тракта человека и животных. Попадая в другие
органы, они обусловливают воспалительные процессы: холециститы, пиелиты и др.
Таким образом, их можно отнести к условно-патогенным микробам.

Принадлежность выделенных культур к одной из серологических групп

определяют с помощью реакции преципитации с групповыми сыворотками. Для
определения серологических типов используют реакцию агглютинации с
типоспецифическими сыворотками.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стрептококки довольно

устойчивы в окружающей среде. При температуре 60° С погибают через 30 мин.

В высушенном гное и мокроте они сохраняются месяцами. Обычные

концентрации дезинфицирующих веществ губят их через 15-20 мин. Энтерококки
значительно устойчивее, дезинфицирующие растворы убивают их только через 50-
60 мин.

Восприимчивость животных. К патогенным стрептококкам чувствителен

рогатый скот, лошади, собаки, птицы. Из лабораторных животных чувствительны
кролики и белые мыши. Однако стрептококки, патогенные для человека, не всегда
патогенны для экспериментальных животных.

Источники инфекции. Люди (больные и носители), реже животные или

инфицированные продукты.

Пути передачи. Воздушно-капельный и воздушно-пылевой, иногда пищевой,

возможен контактно-бытовой.

Заболевания могут возникать в результате экзогенного заражения, а также

эндогенно - при активации условно-патогенных стрептококков, обитающих на
слизистых оболочках зева, носоглотки, влагалища. Снижение сопротивляемости
организма (охлаждение, голодание, переутомление и пр.) может привести к
возникновению аутоинфекций.

Большое значение в патогенезе стрептококковых инфекций имеет

предварительная сенсибилизация - как следствие ранее перенесенного заболевания
стрептококковой этиологии.

При проникновении в кровяное русло стрептококки обусловливают тяжело

протекающий септический процесс.

Заболевания у человека чаще вызывают β-гемолитические стрептококки

серологической группы А. Они продуцируют ферменты патогенности:
гиалуронидазу, фибринолизин (стрептокиназу), дезоксирибонуклеазу и др. Кроме
того, у стрептококков обнаруживают капсулу, М-протеин, обладающие
антифагоцитарными свойствами.

Стрептококки вызывают у человека различные острые и хронически

протекающие инфекции, как с образованием гноя, так и не нагноительные,
различающиеся по клинической картине и патогенезу. Нагноительные - флегмоны,
абсцессы, раневые инфекции, ненагноительные - острые инфекции верхних
дыхательных путей, рожистое воспаление, скарлатина, ревматизм и др.

Стрептококки часто вызывают вторичные инфекции при гриппе, кори, коклюше

и других заболеваниях и нередко осложняют раневые инфекции.

Иммунитет. По характеру иммунитет - антитоксический и антибактериальный.

Постинфекционный антимикробный иммунитет малонапряженный. Это
объясняется слабой иммуногенностью стрептококков и большим количеством
сероваров, не дающих перекрестного иммунитета. Кроме этого, при
стрептококковых заболеваниях наблюдается аллергизация организма, чем
объясняют склонность к рецидивам.

Профилактика. Сводится к санитарно-гигиеническим мероприятиям,

укреплению общей резистентности организма. Специфическая профилактика не
разработана.

Лечение. Применяют антибиотики. Чаще используют пенициллин, к которому

стрептококки не приобрели устойчивости, а также эритромицин и тетрациклин.

Значение стрептококка в этиологии ревмокардита. Патогенез ревмокардитов

изучен недостаточно. Но в пользу роли стрептококка в развитии этого заболевания
говорит ряд фактов:

1. У больных ревмокардитом из зева высевают В-гемолитический стрептококк.

2. Ревматизм часто возникает после перенесенной ангины, тонзиллитов,

фарингитов, сенсибилизирующих организм.

3. В сыворотке крови больных обнаруживают антистрептолизин,

антистрептогиалуронидазу - антитела к стрептококковым ферментам, токсинам.
 4. Косвенным подтверждением роли стрептококка является успешное лечение
пенициллином.

В последнее время в возникновении хронических форм ревмокардита придают

значение L-формам стрептококка.

Профилактика обострений ревмокардита сводится к предупреждению

стрептококковых заболеваний (например, весной и осенью проводят
профилактический курс введения пенициллина). Лечение сводится к применению
антибактериальных препаратов - пенициллина.

Значение стрептококка в этиологии скарлатины. Г. Н. Габричевский (1902)

впервые высказал предположение о том, что гемолитический стрептококк является
возбудителем скарлатины. Но так как стрептококки, выделяемые при других
заболеваниях, не отличались от возбудителей скарлатины, то это мнение не всеми
разделялось. В настоящее время установлено, что скарлатину вызывают
стрептококки группы А, вырабатывающие эритрогенный токсин.

У переболевших возникает иммунитет - стойкий, антитоксический. Его

напряженность определяют постановкой реакции Дика - внутрикожным введением
эритрогенного токсина. У не болевших вокруг места введения возникают гиперемия
и отек, что характеризуется как положительная реакция (отсутствие антитоксина в
сыворотке крови). У переболевших такая реакция отсутствует, так как
образовавшийся у них антитоксин нейтрализует эритрогенный токсин.

Профилактика. Изоляция, госпитализация. Контактным, ослабленным детям

вводят гамма-глобулин. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Используют пенициллин, тетрациклин. В тяжелых случаях вводят

антитоксическую сыворотку.

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выявление стрептококка и определение его серовара.

Материал для исследования

1. Слизь из зева (ангина, скарлатина).

2. Соскоб с пораженного участка кожи (рожа, стрептодермия).

3. Гной (абсцесс).

4. Моча (нефрит).

5. Кровь (подозрение на сепсис; эндокардит).

Способы сбора материала

 Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Бактериологический.

2. Микроскопический.

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Вынимают чашки из термостата и просматривают. При наличии подозрительных

колоний из части их делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При
обнаружении в мазке стрептококков часть оставшейся колонии пересевают в
пробирки на агар с сывороткой для выделения чистой культуры и на бульон с
кровью в пробирках. К концу дня 5-6-часовую культуру из бульона или агара
пересевают на бульон Мартена с 0,25% глюкозы для определения серологической
группы в реакции преципитации по Ленсфильд. Пробирки и флаконы помещают в
термостат и оставляют до следующего дня.

Третий день исследования

Вынимают посевы из термостата, проверяют чистоту культуры на скошенном

агаре, делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии
чистой культуры стрептококка производят посев на среды Гисса (лактозу, глюкозу,
мальтозу, сахарозу и маннит), молоко, желатин, 40% желчь и ставят в термостат.

Просматривают бульон Мартена. При наличии специфического роста ставят

реакцию преципитации по Ленсфильд для определения серологической группы.

Постановка реакции преципитации по Ленсфильд. Суточную культуру,

выросшую на бульоне Мартена, разливают в несколько центрифужных пробирок,
центрифугируют в течение 10-15 мин (3000 об/мин).

Надосадочную жидкость сливают в банку с дезинфицирующим раствором, а

осадок заливают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида и вновь
центрифугируют. К осадку, собранному из всех центрифужных пробирок,
прибавляют 0,4 мл 0,2% хлороводородной кислоты. Затем пробирку помещают в
водяную баню и кипятят 15 мин, периодически встряхивая. После кипячения
полученную взвесь вновь центрифугируют. Антиген при этом экстрагируется в
надосадочную жидкость, которую сливают в чистую пробирку и нейтрализуют
0,2% раствором гидроксида натрия до рН 7,0-7,2. В качестве индикатора
прибавляют бромтимоловый голубой (0,01 мл 0,04% раствора). При указанной
реакции цвет меняется от соломенно-желтого до голубого.

Затем в 5 преципитационных пробирок разливают по 0,5 мл

антистрептококковых групповых сывороток, которые готовят иммунизацией
кроликов (см. главу 19). В 1-ю пробирку вносят сыворотку А, во 2-ю - сыворотку В,
в 3-ю - сыворотку С, в 4-ю - сыворотку D, в 5-ю - изотонический раствор натрия
хлорида (контроль). После этого пастеровской пипеткой во все пробирки по стенке
осторожно наслаивают полученный экстракт (антиген).

При положительной реакции в пробирке с гомологичной сывороткой на границе

экстракта с сывороткой образуется тонкое молочно-белое кольцо (рис. 38).
 Рис. 38. Схема выделения и идентификации стрептококка

Четвертый день исследования

Производят учет результатов (табл. 25).

 Таблица 25. Ферментативные свойства стрептококка

Примечание. к - расщепление углеводов с образованием кислоты.

В настоящее время определяют дезоксирибонуклеазу, а также

антистрептогиалуронидазу, антистрептолизин-О.

Контрольные вопросы

1. Какие основные методы лабораторного исследования для выявления

стрептококков Вы знаете?

2. Для чего ставят реакцию преципитации по Ленсфильд?

3. Почему антиген при постановке этой реакции должен быть прозрачным?

Опишите технику постановки этой реакции.

Задание

Получите у преподавателя антистрептококковыс сыворотки А, В, С, D и

изотонический раствор натрия хлорида. Поставьте реакцию преципитации,
результаты покажите преподавателю и зарисуйте.

Питательные среды

Агар с кровью (см. главу 7).

Агар с сывороткой (см. главу 7).

Среды Гисса (сухие).

Мясопептонный желатин (МПЖ). К 100 мл МПБ прибавляют 10-15 г мелко

нарезанного желатина. Желатин должен набухать при медленном нагревании в
водяной бане (при температуре 40-50° С). К расплавленному желатину прибавляют
10% раствор натрия карбоната (питьевая сода) и устанавливают рН 7,0. Затем сразу
фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрование идет медленно. Для ускорения
процесса фильтрацию можно производить в горячем автоклаве. Профильтрованную
среду разливают в пробирки по 6-8 мл и стерилизуют. Стерилизацию производят
либо дробно при температуре 100° С 3 дня подряд, либо одномоментно при 110° С
20 мин в автоклаве. Охлаждение среды производят в пробирках, поставленных
вертикально.

Приготовление молока. Свежее молоко доводят до кипения, ставят в

прохладное место на сутки, освобождают от сливок, вновь кипятят. Оставляют на
сутки и снимают верхний слой. Обезжиренное молоко фильтруют через слой ваты,
затем подщелачивают 10% раствором натрия карбоната до рН 7,2 и разливают в
пробирки по 5-6 мл.

Бульон Мартена. К мясной воде прибавляют равное количество пептона

Мартена (фарш из свиных желудков, подвергшихся воздействию хлороводородной
кислоты). Полученную смесь кипятят 10 мин, подщелачивают 10% раствором
гидроксида натрия до рН 8,0, добавляют 0,5 натрия ацетата, вновь кипятят и
разливают в стерильную посуду. К бульону Мартена прибавляют 0,25% глюкозы.

Среда Китта - Тароцци (см. главу 34).

Streptococcus pneumoniae (пневмококк)

Пневмококки впервые описаны Р. Кохом (1871).

Морфология. Пневмококки - это диплококки, у которых стороны клеток,

обращенные друг к другу, уплощены, а противоположные стороны вытянуты,
поэтому они имеют ланцетовидную форму, напоминающую пламя свечи (см. рис.
4). Размер пневмококков 0,75-0,5 × 0,5-1 мкм, располагаются они парами. В жидких
питательных средах часто образуют короткие цепочки, приобретая сходство со
стрептококками. Превмококки неподвижны, не имеют спор, в организме образуют
капсулу, окружающую оба кокка. В капсуле содержится термоустойчивое вещество
антифагин (защищающий пневмококк от фагоцитоза и действия антител). При
росте на искусственных питательных средах пневмококки утрачивают капсулу.
Пневмококки грамположительны. В старых культурах встречаются
грамотрицательные бактерии.

Культивирование. Пневмококки - факультативные анаэробы. Растут при

температуре 36-37° С и рН среды 7,2-7,4. Они требовательны к средам, так как не
могут синтезировать многие аминокислоты, поэтому растут только на средах с
добавлением нативного белка (крови или сыворотки). На агаре с сывороткой
образуют мелкие, нежные, довольно прозрачные колонии. На агаре с кровью
вырастают влажные колонии зеленовато-серого цвета, окруженные зеленой зоной,
что является результатом перехода гемоглобина в метгемоглобин. Пневмококки
хорошо растут в бульоне с добавлением 0,2% глюкозы и в бульоне с сывороткой.
Рост в жидких средах характеризуется диффузным помутнением и пылевидным
осадком на дне.

Ферментативные свойства. Пневмококки обладают довольно выраженной

сахаролитической активностью. Они расщепляют: лактозу, глюкозу, сахарозу,
мальтозу, инулин с образованием кислоты. Не ферментируют маннит.
Протеолитические свойства у них выражены слабо: молоко они свертывают,
желатин не разжижают, индол не образуют. Пневмококки растворяются в желчи.
Расщепление инулина и растворение в желчи является важным диагностическим
признаком, отличающим Streptococcus pneumoniae от Streptococcus pyogenes.

Факторы патогенности. Пневмококки продуцируют гиалуронидазу,

фибринолизин и др.
 Токсинообразование. Пневмококки образуют эндотоксин, гемолизин,
лейкоцидин. Вирулентность пневмококков связана также с наличием в капсуле
антифагина.

Антигенная структура и классификация. В цитоплазме пневмококков имеется

общий для всей группы протеиновый антиген, а в капсуле - полисахаридный
антиген. По полисахаридному антигену все пневмококки разделяют на 84 серовара.
Среди патогенных для человека наиболее часто встречаются I, II, III серовары.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Пневмококки относятся к

группе нестойких микроорганизмов. Температура 60° С губит их через 3-5 мин. К
низким температурам и высушиванию они довольно устойчивы. В высушенной
мокроте сохраняют жизнеспособность до 2 мес. На питательной среде они
сохраняются не более 5-6 дней. Поэтому при культивировании необходимо делать
пересевы через каждые 2-3 дня. Обычные растворы дезинфицирующих веществ: 3%
фенол, сулема в разведении 1:1000 губят их через несколько минут.

Особенно чувствительны пневмококки к оптохину, который убивает их в

разведении 1:100000.

Восприимчивость животных. Естественным хозяином пневмококков является

человек. Однако пневмококки могут вызвать заболевания у телят, ягнят, поросят,
собак и обезьян. Из экспериментальных животных к пневмококку
высокочувствительны белые мыши.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Воздушно-капельный путь, может быть воздушно-пылевой.

Входные ворота. Слизистая оболочка верхних дыхательных путей, глаз и уха.

Заболевания у человека. Пневмококки могут вызвать гнойно-воспалительные

заболевания разной локализации. Специфическими для пневмококков являются:

1) крупозная пневмония;

2) ползучая язва роговицы;

3) отит.

Наиболее частым заболеванием является крупозная пневмония, захватывающая

одну, реже две или три доли легкого. Заболевание протекает остро, сопровождается
высокой температурой, кашлем. Заканчивается обычно критически.

Иммунитет. После перенесенного заболевания остается нестойкий иммунитет,

так как пневмония характеризуется рецидивами.

Профилактика. Сводится к санитарно-профилактическим мероприятиям.

Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Используют антибиотики - пенициллин, тетрациклин и др.

 Контрольные вопросы

1. Морфология пневмококков. Культивирование и ферментативные свойства.

2. Какие факторы обусловливают патогенность пневмококков и что защищает

пневмококки от фагоцитоза?

3. Что является основными воротами пневмококковой инфекции. Какие

заболевания вызывают пневмококки?

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выявление пневмококка.

Материал для исследования

1. Мокрота (пневмония).

2. Слизь из зева (ангина).

3. Отделяемое из язвы (ползучая язва роговицы).

4. Выделение из уха (отит).

5. Гной (абсцесс).

6. Плевральный пунктат (плеврит).

7. Кровь (подозрение на сепсис).

Способы сбора материала

Способы сбора материала

1
(Лучше брать утреннюю мокроту (при специфической пневмонии мокрота имеет ржавый цвет).)

Основные методы исследования

1. Микроскопический.
 2. Микробиологический.

3. Биологический.

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Биологическая проба. Немного (3-5 мл мокроты) эмульгируют в стерильном

бульоне, 0,5 мл этой смеси вводят внутрибрюшинно белой мыши. Через 6-8 ч у
мыши отмечаются признаки заболевания. В это время пневмококк уже можно
обнаружить в экссудате брюшной полости. Экссудат берут стерильным шприцем.
Из него делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения
чистой культуры экссудат засевают на агар с сывороткой. Если мышь погибает или
заболевает, делают посев крови из сердца на агар с сывороткой крови для
выделения чистой культуры. Посевы ставят в термостат.

Ускоренный метод определения типа пневмококка (реакция

микроагглютинации). 4 капли экссудата из брюшной полости зараженной мыши
наносят на предметное стекло. К первой капле прибавляют агглютинирующую
сыворотку I типа, ко второй - сыворотку II типа, к третьей - III типа, к четвертой -
изотонический раствор натрия хлорида (контроль).

Сыворотки I и II типа предварительно разводят в соотношении 1:10, а сыворотку

III типа - 1:5. Все капли размешивают, высушивают, фиксируют и окрашивают
разведенным фуксином. При положительном результате в одной из капель
отмечается скучивание микробов (агглютинация).
 Второй день исследования

Посевы вынимают из термостата, просматривают и из подозрительных колоний

делают мазки. При наличии в мазках грамположительных ланцетовидных
диплококков 2-3 колонии выделяют на скошенный агар с сывороткой для
получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат. Из бульона делают
мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Третий день исследования

Посевы вынимают из термостата. Проверяют чистоту культуры - делают мазки,

окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в выделенной культуре
грамположительных ланцетовидных диплококков проводят идентификацию
выделенной культуры путем посева:

1) на среды Гисса (лактоза, глюкоза, сахароза, мальтоза) проводят посев

обычным способом - уколом в среду;

2) на среду с инулином;

3) на среду с оптохином;

4) ставят пробу с желчью.

Проба на инулин. Исследуемую культуру засевают на питательную среду,

содержащую инулин и лакмусовую настойку, и ставят в термостат. Через 18-24 ч
посевы вынимают из термостата. При наличии пневмококков среда окрашивается в
красный цвет (стрептококки консистенцию и цвет среды не меняют).

Определение чувствительности к оптохину. Выделенную культуру засевают

на 10% агар с кровью, содержащий оптохин 1:50000. Пневмококки, в отличие от
стрептококков, не растут на средах, содержащих оптохин.

Проба с желчью. В агглютинационные пробирки наливают по 1 мл исследуемой

бульонной культуры. В одну из них добавляют каплю кроличьей желчи, вторая
пробирка служит контролем. Обе пробирки помещают в термостат. Через 18-24 ч
наступает лизис пневмококков, который выражается в просветлении мутного
бульона. В контроле взвесь остается мутной.
 Пробу с желчью можно поставить на плотной питательной среде. Для этого на
колонию пневмококков, выросших в чашках с агаром и сывороткой, наносят
крупинку сухой желчи - колония растворяется - исчезает.

Четвертый день исследования

Производят учет результатов (табл. 26).

Таблица 26. Дифференциация пневмококка от зеленящего стрептококка

Примечание. к - расщепление углеводов с образованием кислоты.

В настоящее время широко используются серологические методы исследования

(РСК и РИГА) для определения стрептококковых антител. Определение группы и
серовара выделенной культуры производят с помощью флюоресцирующих антител.

Определение вирулентности пневмококка. Суточную бульонную культуру

пневмококка разводят 1% пептонной водой от 10-2до 10-8, 0,5 мл каждого разведения
вводят двум белым мышам. Культуру, вызвавшую гибель мышей в разведении 10 -7,
оценивают как вирулентную, в разведении 10 -4-10-6 считают средневирулентной.
Культура, не вызвавшая гибель мышей, авирулентна.

Контрольные вопросы

1. Какие методы выделения чистой культуры пневмококков Вы знаете?

2. Какое животное наиболее чувствительно к пневмококку?

3. Какие реакции ставят с экссудатом зараженной мыши и с какой целью?

4. От каких представителей гноеродных кокков следует дифференцировать

пневмококк и с помощью какой пробы?

5. Как определить вирулентность пневмококков?

Задание

Составьте схему исследования мокроты, указав его этапы по дням.

Питательные среды

Агар с сывороткой (см. главу 7).

 Бульон с сывороткой (см. главу 7).

Агар с кровью (см. главу 7).

Среды Гисса (сухие).

Среда для пробы с инулином. К 200 мл дистиллированной воды прибавляют 10

мл инактивированной бычьей сыворотки, 18 мл лакмусовой настойки и 3 г инулина.
Стерилизуют текучим паром при 100° С 3 дня подряд. Желчный бульон (см. главу
7).

Глава 16. Менингококки

Род Neisseria включает два вида микробов, патогенных для человека: N.
meningitidis и N. gonorrhoeae. Neisseria meningitidis были выделены из
цереброспинальной жидкости больного Вексельбаумом (1887).

Морфология. Менингококки - это парные кокки, состоящие из двух бобовидных

кокков, лежащих вогнутыми сторонами друг к другу, наружные стенки у них
выпуклые (см. рис.4). Размер каждого кокка 0,6-0,8 × 1,2-1,5 мкм. Они
полиморфны. Менингококки неподвижны, не имеют спор, образуют капсулу.
Грамотрицательны. В чистых культурах располагаются тетрадами и в виде
отдельных кокков без определенного порядка, а в мазках, приготовленных из
спинномозговой жидкости, чаще располагаются попарно. В гнойном материале
находятся внутри лейкоцита.

Культивирование. Менингококки - аэробы. Они требовательны к питательным

средам, размножаются только на средах, содержащих нативный белок (сыворотку,
кровь). Растут при температуре 36-37° С (при 25° С рост прекращается), рН среды
7,4-7,6. Для их размножения необходима влажная среда и повышенное количество
углекислоты (фактор, стимулирующий их рост). Посев следует производить на
свежеприготовленную среду.

На плотных питательных средах менингококки образуют небольшие 2-3 мм в

диаметре, нежные, полупрозрачные, голубоватые, вязкие колонии. В бульоне с
сывороткой менингококки дают легкую муть и небольшой осадок.
Свежевыделенные штаммы в S-форме. Старые культуры могут диссоциировать,
образовывать шероховатые R-формы колоний.

Ферментативные свойства. Биохимически менингококки мало активны. Они

расщепляют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические
свойства у них не выражены (не створаживают молоко, желатин не разжижают).

Патогенность менингококков обусловливается наличием капсулы, которая

препятствует фагоцитозу, пи лей, способствующих прикреплению микроба к
поверхности эпителиальных клеток, и образованием ферментов: гиалуронидазы и
нейраминидазы.

Токсинообразование. При разрушении бактериальных клеток высвобождается

сильный термоустойчивый эндотоксин, который является липополисахаридом
клеточной стенки. При заболевании он обнаруживается в крови и в спинномозговой
жидкости больных. Тяжесть заболевания часто зависит от количества
накопившегося токсина.

Антигенная структура. По полисахаридному (капсульному) антигену

менингококки разделяют на серогруппы: А, В, С, D, X, Y U-135 29E (всего девять
серогрупп).

Согласно международной классификации основными группами являются А, В и

С. Менингококки группы А часто вызывают генерализованные процессы и имеют
наибольшее эпидемиологическое значение. Менингококки групп В и С вызывают
спорадические заболевания. Остальные серогруппы мало изучены.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Менингококки

малоустойчивы. Температура 70° С губит их через 2-3 мин, 55° С - через 5 мин. В
отличие от других кокков этой группы они плохо переносят низкую температуру,
особенно чувствительны к температурным колебаниям.

Обычные концентрации дезинфицирующих растворов губят их быстро.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные не

чувствительны к менингококкам. Но при субдуральном введении менингококков
обезьянам можно вызвать у них заболевание.

Внутрибрюшинное заражение морских свинок и белых мышей вызывает их

гибель за счет действия эндотоксина.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Основной путь воздушно-капельный.

Заболевания у человека:

1) назофарингит;

2) менингококкцемия;

3) цереброспинальный эпидемический менингит.

Патогенез. Попав на слизистую оболочку носоглотки, менингококки могут там

локализоваться, обусловив носительство или вызвать острый назофарингит. Если
они проникают в лимфатические сосуды, кровь и генерализуются, то вызывают
глубокие изменения в паренхиматозных органах за счет действия эндотоксина.
Развивается менингококкцемия. При проникновении менингококков в мозговые
оболочки возникает гнойное воспаление - менингит. При менингококковом
менингите спинномозговая жидкость мутная (в отличие от туберкулезного
менингита). При спинномозговой пункции жидкость вытекает струей вследствие
повышенного внутричерепного давления. Менингеальные явления характеризуются
головной болью, ригидностью затылка, рвотой и т. д. Менингитом чаще болеют
дети. У взрослых чаще заражение ограничивается носительством или
назофарингитом.
 Иммунитет. Постинфекционный иммунитет напряженный, он обусловливается
опсонинами, комплементсвязывающими и бактериоцидными антителами. От
интенсивности образования антител к полисахаридным и белковым антигенам
зависит течение заболевания.

Профилактика. Сводится к раннему выявлению носителей, изоляции

заболевших назофарингитом. Больные подлежат госпитализации.

Специфическая профилактика. Разработана химическая вакцина, состоящая из

полисахаридов серогрупп А и С. Для экстренной профилактики используется
иммуноглобулин.

Лечение. Антибактериальные препараты - пенициллин, левомицетин,

ампициллин.

Контрольные вопросы
1. Каковы морфологические свойства менингококков?

2. На каких средах выращивают менингококки и какие условия необходимы для

их размножения?

3. Какова биохимическая активность менингококков и их устойчивость во

внешней среде?

4. Какие заболевания вызывают менингококки?

5. По какому антигену делят менингококки на серогруппы?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление менингококка и определение его серогруппы.

Материал для исследования

1. Спинномозговая жидкость.

2. Отделяемое слизистой оболочки носоглотки.

3. Кровь.

Способы сбора материала

Способы сбора материала
Рис. 39. Взятие слизи из носоглотки для исследования на менингококки. 1 - шпатель; 2
- тампон для взятия материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Микробиологический.

3. Серологический.

Ход исследования
 Ход исследования

Четвертый день исследования

Производят учет результатов (табл. 27)

Таблица 27. Дифференциация менингококков от непатогенных нейссерий

Примечание. + рост (положительная проба); - отсутствие роста; к - кислота.

Определение группы менингококка. После получения чистой культуры

менингококка проводят серологическое определение группы. Для этого используют
коммерческие агглютинирующие и преципитирующие сыворотки.

На предметное стекло наносят по одной капле неразведенных агглютинирующих

сывороток групп А, В, С и др., каплю изотонического раствора натрия хлорида
(контроль). К каждой капле прибавляют одну петлю выделенной культуры.
Наличие агглютинации в одной из капель определяет группу выделенной культуры.

Для выявления серогрупп можно ставить реакцию преципитации в геле (см.

главу 32).

В настоящее время с диагностической целью используют серологические методы

диагностики: сыворотку обследуемых лиц исследуют в РНГА с менингококковым
эритроцитарным диагностикумом А, С и других серогрупп.

Контрольные вопросы

1. Какой материал служит для выявления менингококков при заболевании

менингитом?

2. Как транспортируют исследуемый материал?

3. Что прибавляют к собранному материалу для подавления роста

грамположительных кокков?
 4. От каких микроорганизмов необходимо дифференцировать менингококки,
какие методы исследования проводят для дифференциации?

5. Какую реакцию ставят для определения серогруппы менингококков?

Задание

1. Подготовьте тампон, изогните его под углом 135° и возьмите друг у друга
слизь из носоглотки. Посейте ее на агар с сывороткой.

2. Изучите под микроскопом мазок из культуры менингококка и зарисуйте его.

Питательные среды

Агар с сывороткой (см. главу 7).

Среда с линкомицином. К 80 мл расплавленного и остуженного до температуры

50° С 2% агара добавляют 20 мл лошадиной или бычьей сыворотки, 0,5-0,7 мл
раствора линкомицина в рабочем разведении (рабочее разведение 0,001 мг на 1 мл
среды). После перемешивания среду разливают в чашки Петри. Раствор
линкомицина готовят на стерильной воде и сохраняют в холодильнике.

Глава 17. Гонококки

Neisseria gonorrhoeae входят в семейство Neisseriaceae, род Neisseria. Гонококки
обнаружены Нейссером в 1879 г. и в честь его названо все семейство.

Морфология. Гонококки - это диплококки, состоящие из двух бобовидных

кокков, лежащих вогнутыми сторонами друг к другу (напоминают кофейные зерна).
Размер гонококков 1,2-1,3 × 0,7-0,8 мкм. Они полиморфны, наряду с крупными
встречаются очень мелкие, неправильной формы L-формы бактерий. Гонококки
неподвижны, спор не имеют. В патологическом материале (гное) обнаруживают
капсулообразное вещество. Грамотрицательны. Под влиянием лекарственных и
других веществ быстро изменяются: появляются грамположительные формы. В
патологическом материале располагаются внутриклеточно (в лейкоците), но могут
быть вне клетки. Могут находиться в виде отдельных кокков (см. рис. 4).

Культивирование. Гонококки - аэробы. Очень требовательны к питательным

средам. Растут на средах, содержащих нативный белок (человеческий) - кровь,
сыворотку, при температуре 37° С и рН среды 7,2-7,4. Среды должны быть
свежеприготовленными и влажными. Посев следует производить сразу после взятия
материала. На сывороточной среде гонококки образуют мелкие колонии 1-2 мм,
прозрачные, блестящие с ровными краями, напоминающие капельки росы. На
кровяной среде гемолиза не дают. В сывороточном бульоне они дают слабое
помутнение и пленку, которая оседает на дно пробирки. При скудном росте через
24 ч посевы оставляют в термостате на вторые сутки.
 Ферментативные свойства. Сахаролитические свойства слабо выражены.
Гонококки расщепляют только один сахар - глюкозу с образованием кислоты.
Протеолитическими свойствами не обладают.

Токсинообразование. В клеточной стенке гонококков имеется токсическая

субстанция - липополисахарид (мало изучен).

Антигенная структура. Антигенная структура неоднородна и легко изменяется

под влиянием факторов внешней среды. Общепринятого деления гонококков на
серовары и серотипы пока нет.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Во внешней среде гонококки

мало устойчивы. При температуре 56-60° С они погибают. При температуре 40° С
их жизнеспособность резко снижается. Низкие температуры и высушивание их
быстро губят. Но в гное они сохраняются до 24 ч. Дезинфицирующие растворы -
1% раствор фенола, сулема 1:1000 убивают гонококки в течение нескольких минут.
Особенно гонококки чувствительны к солям серебра - 1% раствор серебра нитрата
губит их сразу. УФ-лучи убивают их в течение нескольких минут.

Восприимчивость животных. Животные не чувствительны к гонококку.

Однако внутрибрюшинное введение белым мышам гонококкового токсина
вызывает их гибель.

Источники инфекции. Больной гонореей человек.

Пути передачи. Контактно-бытовой (половой), реже через зараженные предметы

(полотенце, губки и др.).

Заболевания у человека. Гонорея и бленнорея.

Патогенез. Естественным хозяином гонококков является больной человек.

Гонококки проникают через слизистые оболочки уретры (у женщин - уретры и
шейки матки). Фактором патогенности гонококков является наличие у них пилей,
которые, соединяясь с микроворсинками цилиндрического эпителия, способствуют
проникновению гонококка внутрь клетки эпителия, обусловливая в слизистой
оболочке острый воспалительный процесс.

Клинически гонорея проявляется болями при мочеиспускании, выделениями

гноя из уретры и влагалища. Заболевание протекает остро, но иногда переходит в
хроническую форму. Гонококки могут вызвать гонорейный конъюнктивит -
бленнорею (гнойное воспаление слизистой оболочки глаз у новорожденных).
Гонококки редко проникают из уретры в другие органы, но иногда они могут быть
причиной артритов, эндокардитов и т. д.

Иммунитет. Естественной резистентности к гонококкам нет. Перенесенное

заболевание также не создает иммунитета. Наблюдающийся фагоцитоз носит
незавершенный характер.

Профилактика. Санитарное просвещение. Повышение культурно-

гигиенического уровня. Специфической профилактики нет. Для профилактики
бленнореи детям сразу после рождения обязательно вводят в конъюнктивальный
мешок 1-2 капли 30% раствора альбуцида.

Лечение. Антибиотики (пенициллин, бициллин, стрептомицин и др.).

Применяют также сульфаниламидные препараты. При хронической форме
используют гонококковую вакцину.

Контрольные вопросы
1. Опишите морфологические свойства гонококков.

2. Каковы ферментативная активность и токсинообразование гонококков?

3. Какова устойчивость гонококков. К какому препарату гонококки особенно

чувствительны?

4. Какие заболевания вызывают гонококки и их патогенез.

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление гонококков и противогонококковых антител.

Материал для исследования

1. Отделяемое слизистой оболочки уретры у мужчин.

2. Отделяемое слизистой оболочки уретры и шейки матки у женщин.

3. Гнойные выделения из глаз.

4. Кровь для получения сыворотки.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Примечание. Для бактериоскопического и бактериологического исследования

материал берут: 1) до начала лечения антибиотиками: 2) не ранее чем через 10 дней
после окончания лечения антибиотиками; 3) не ранее чем через 2 ч после
последнего мочеиспускания; 4) не ранее чем через 2 ч после спринцевания.

Основные методы исследования

 1. Микроскопический (главным образом используется при острых формах).

2. Микробиологический.

3. Серологический.

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Вынимают посевы из термостата и просматривают их. Изучают колонии. Делают

мазки. При наличии подозрительных грамотрицательных диплококков колонии
пересевают на скошенную среду в пробирках (среда должна быть
свежеприготовленной и содержать достаточное количество конденсата) и ставят
пробу на оксидазу. Для этого пипеткой на колонию наносят каплю 1% раствора
диметилпарафенилендиамина, колонии изменяют цвет от темно-коричневого до
черного.

Третий день исследования

 Вынимают посевы из термостата, делают мазки со скошенного агара,
окрашивают по Граму и микроскопируют. Засевают на среды Гисса (лактозу,
глюкозу, маннит и мальтозу). Эти углеводы должны содержать 30% сыворотки
крови. Засеянные пробирки ставят в термостат.

Четвертый день исследования

Вынимают пробирки из термостата, при отсутствии роста оставляют их в

термостате еще на 1-2 дня. При наличии роста учитывают результаты (табл. 28).

Таблица 28. Дифференциация гонококков от других нейссерий

Серологическая диагностика

Третья неделя заболевания. При хроническом течении заболевания и в

сомнительных случаях ставят РСК с сывороткой больного (см. главу 12). В качестве
антигена используют убитую культуру гонококков, которую готовят в
производственных условиях. Можно применить реакцию непрямой
гемагглютинации (см. главу 12).

Контрольные вопросы

1. Какой материал служит для выявления гонококков и каким способом его

получают?

2. Через сколько времени после мочеиспускания (или спринцевания у женщин)

можно брать материал для исследования?

3. Какой метод исследования является основным при острой форме и какой - при
хронической форме гонореи?

4. Когда и какую серологическую реакцию ставят при подозрении на гонорею?

5. От каких микроорганизмов необходимо дифференцировать гонококки?

Задание

Получите у преподавателя препарат. Изучите его и зарисуйте гонококки,

расположенные внутри лейкоцита и вне его при окраске по Граму.

Питательные среды
 Желточная среда. К 100 мл МПА из кроличьего мяса добавляют 15 мл желтка
(свежего куриного яйца), 6 мл индикатора фенолового красного, 1,5 мл сахара,
растворенного в 1 мл стерильной дистиллированной воды.

Питательная среда асцит-агар. К фильтрату бульона, приготовленного из

кроличьего мяса, добавляют 2% агар, 1% пептон и 0,5% хлорид натрия. Нагревают
до растворения агара, устанавливают рН 7,4-7,5, подщелачивают 20% гидроксидом
натрия. Среду доводят до кипения, фильтруют, разливают в стерильные флаконы и
стерилизуют в автоклаве 15 мин при 115° С.

Рецепты безасцитных питательных сред (МПА рН 7,4-7,5).

1) мясной воды из кроличьего мяса или бычьих сердец - 100 мл

гидролизата казеина - 2 мл

дрожжевого аутолизата - 2 мл

сыворотки крови крупного рогатого скота - 20 мл

2) мясной воды из кроличьего мяса или бычьих сердец - 100 мл

5% раствор гемогидролизата - 2 мл

дрожжевого аутолизата - 2 мл

сыворотки рогатого скота - 20 мл

3) мясной воды из кроличьего мяса или бычьих сердец - 100 мл

желтка куриного яйца - 10 мл

сыворотки крови рогатого скота - 20 мл

Рост гонококков на этих средах обильный. Колонии гонококка могут быть

выявлены с помощью пробы на оксидазу, при которой они окрашиваются в
красный цвет, переходящий в черный.

Семейство кишечных бактерий

К семейству энтеробактерий Enterobacteriaceae относят многочисленные
микроорганизмы, сходные по морфологии, тинкториальным и культуральным
свойствам. Они обитают в кишечнике человека и животных и могут быть
обнаружены во внешней среде.

В настоящее время все кишечные бактерии делят на 12 родов, из которых будут

рассмотрены следующие: Escherichia, Shigella, Salmonella, Proteus, Klebsiella,
Yersinia.

Роды эти, в свою очередь, разделены на виды, биологические и серологические

варианты (биовары и серовары).
 Считают, что родоначальником всей этой группы микроорганизмов является
кишечная палочка. В процессе эволюции разновидности кишечной палочки
приспособились к паразитическому способу существования, приобрели патогенные
свойства и являются в настоящее время возбудителями многих болезней человека и
животных.

К патогенным представителям семейства кишечных бактерий относятся

возбудители брюшного тифа, паратифов А и В, токсикоинфекций, дизентерии.
Многие кишечные бактерии постоянно обитают в кишечнике. При изменении
условий существования (например, ослабление организма хозяина) они становятся
возбудителями заболеваний. Это так называемые условно-патогенные бактерии.

Все кишечные бактерии грамотрицательные палочки. Они являются

факультативными анаэробами. Хорошо растут на простых питательных средах.

Энтеробактерий отличаются ферментативной активностью, которая наиболее

выражена у сапрофитов и уменьшается по мере усиления патогенности. Эту
закономерность можно объяснить тем, что микроорганизмы, приспособляясь к
паразитическому образу жизни, утратили ставшие ненужными ферменты.

Глава 18. Эшерихии - Л. Б. Богоявленская, Ф. К.

Черкес
Этот род представлен только одним видом бактерий - Е. coli, но объединяет
множество вариантов. Разновидности кишечной палочки отличаются по
биологическим свойствам, у них могут быть разные наборы ферментов (биовары) и
разная антигенная структура (серовары).

Кишечная палочка впервые выделена в 1888 г. Эшерихом из испражнений

человека и названа по его имени.

Естественным местом обитания E. coli является кишечник человека. Кишечная

палочка - представитель нормальной микрофлоры кишечника.

В процессе жизнедеятельности E. coli вырабатывает ферменты, способствующие

пищеварению (например, расщепляющие клетчатку), синтезирует некоторые
витамины (например, витамины группы В). Кроме того, эти бактерии проявляют
антагонистическое действие в отношении патогенных микроорганизмов, таких как
возбудители Дизентерии, брюшного тифа, токсикоинфекций. Отсутствие кишечной
палочки в толстом кишечнике ведет к тяжелому заболеванию - дисбактериозу. При
этом нарушается нормальный состав микрофлоры кишечника, развиваются протей,
кокковая флора, грибы и т. п.

При снижении устойчивости организма (голодании, переутомлении и т. п.)

эшерихии могут проникнуть в Другие органы и ткани и стать причиной тяжелых
патологических процессов. Таким образом, можно считать, что эшерихии -
типичные условно-патогенные микроорганизмы: в обычных условиях они являются
сапрофитами, а ПРИ изменении условий вызывают заболевания.

Выделяясь с фекалиями, кишечная палочка попадает во внешнюю среду.

Обнаружение E. coli в почве, воде и на других объектах свидетельствует об их
фекальном загрязнении, а определение количества E. coli (коли-титр, коли-индекс)
характеризует санитарное состояние объекта (см. "Санитарная микробиология").

Морфология. E. coli - короткие, в среднем 0,5-3,0 × 0,5-0,8 мкм палочки.

Грамотрицательны. В большинстве случаев они подвижны, перитрихи. Однако
некоторые варианты кишечной палочки неподвижны. Многие штаммы образуют
капсулу. Спор не образуют.

Культивирование. Кишечная палочка - факультативный анаэроб. Хорошо

растет на простых питательных средах при 37° С и рН среды 7,2-7,8. Штаммы E.
coli, выделенные из кишечника человека и животных, развиваются и при 43-45° С, а
кишечные палочки холоднокровных при этих условиях не размножаются. Это
различие в свойствах E. coli разного происхождения используют для определения
санитарного состояния объекта, так как только обнаружение E. coli теплокровных
свидетельствует о санитарном неблагополучии.

На МПА кишечная палочка образует мутноватые, слегка выпуклые влажные

колонии с ровным краем. На МПБ дает равномерное помутнение. Культуры,
имеющие капсулу, растут в виде слизистых колоний.

Для идентификации эшерихий используют дифференциально-диагностические

среды: Эндо и агар с эозинметиленовым синим (ЭМС). На среде Эндо кишечная
палочка растет в виде малиново-красных колоний с металлическим блеском или без
него. На среде ЭМС - в виде темно-фиолетовых колоний.

Ферментативные свойства. E. coli обладают значительной ферментативной

активностью. Расщепляют лактозу, глюкозу, маннит, мальтозу, сахарозу и другие
углеводы и спирты с образованием кислоты и газа. Лротеолитические свойства:
образуют индол. Желатин не расщепляют. Отдельные биовары не ферментируют
лактозу и сахарозу (табл. 29).

Таблица 29. Ферментативные свойства эшерихий

Примечание, кг - образование кислоты и газа; + наличие признака; - отсутствие

признака.

Токсигенность. Эшерихий обладают эндотоксином (лиггополисахарид).

Антигенная структура. Эшерихий различаются по антигенной структуре

микробной клетки, что положено в основу классификации бактерий этого рода.
Различают три типа антигенов эшерихий: О-антиген (соматический), К-антиген
(капсульный) и Н-антиген (жгутиковый). Термостабильный О-антиген является
липополисахариднопротеиновым комплексом и расположен в клеточной стенке
бактерий. О-антиген определяет принадлежность культуры к серологической
группе. Описано более 170 таких групп. Некоторые компоненты О-антигена
являются общими для разных О-групп эшерихий, а иногда и других энтеробактерий
(шигелл, сальмонелл и др.). К-антигены эшерихий различны: А, В, L и М. Антигены
А и М - термостабильны, В и L - термолабильны. К-антиген расположен в
микробной клетке более поверхностно, чем О-антиген, и поэтому в его присутствии
реакция агглютинации живой культуры с О-сывороткой не происходит. Для
выявления О-антигена культуру прогревают в течение часа при 100° С: К-антиген
при прогревании разрушается, а О-антиген становится способным вступать во
взаимодействие с сывороткой. Установлено, что у эшерихий имеется около 100
типов К-антигенов, в основном типа В-антигенов (термолабильных). Н-антиген
имеется только у подвижных штаммов, так как он связан с жгутиками. У эшерихий
известно более 50 типов Н-антигена. Определение Н-антигена позволяет установить
серовариант выделенной культуры (рис. 40).

Рис. 40. Антигенная структура энтеропатогенной кишечной палочки. 1 -

цитоплазма; 2 - клеточная стенка; 3 - жгутики

Характеристику антигенного состава выделенной культуры эшерихий дают на

основании результатов реакции агглютинации с сыворотками, содержащими О-, К-
и Н-антитела. При этом определяют, какие антигены имеются в культуре, а их
сочетание характеризует антигенную формулу выделенной культуры, т. е. ее
серовариант. В табл.30 представлены примеры антигенной структуры некоторых
серовариантов E. coli, у которых К-антигены являются В-антигенами.

Таблица 30. Антигенная структура эшерихий

Если культура агглютинируется ОК-сывороткой ОП1:К58 (В4) и Н-сывороткой

"6", то значит выделен серовариант E. coli О111:В4:Н6; если отмечена реакция
агглютинации с ОК-сывороткой О26:К60 (В6) и с Н-сывороткой "11" - выделена
культура E. coli 026:В6:Н11 и т. п.

Кроме определения сероварианта E. coli, можно определить и фаговар

выделенной культуры. Имеются наборы бактериофагов, которые лизируют
эшерихии отдельных серогрупп. По лизису культуры одним из фагов
устанавливают ее фаговар. Определение фаговаров имеет эпидемиологическое
значение.
 Антагонистическое действие E. coli, их способность подавлять рост гнилостных
и патогенных бактерий используют для создания бактерийных препаратов для
лечения дисбактериоза и различных заболеваний кишечника (колибактерин,
бификол).

Устойчивость к факторам окружающей среды. E. coli довольно устойчивы.

При 55° С они погибают в течение часа, при 60° С - за 15 мин. В почве и воде
сохраняются до 2-3 мес, в молоке не только сохраняются, но и размножаются.
Растворы дезинфицирующих веществ (3% хлорамин, раствор сулемы 1:1000 и др.)
убивают их за 20-30 мин. Особенно чувствительны E. coli к действию
бриллиантового зеленого.

Восприимчивость животных. Эшерихии отдельных серогрупп патогенны для

различных животных и вызывают у них заболевания желудочно-кишечного тракта.
Из лабораторных животных наиболее чувствительны к E. coli морские свинки,
кролики, белые мыши. В зависимости от способа введения культура кишечной
палочки вызывает различные патологические процессы: воспаление и абсцесс при
подкожных инъекциях, перитонит и сепсис - при внутрибрюшинном и
внутривенном введении.

Источники инфекции. Больной человек. При этом бактерии проникают в

организм из внешней среды (экзогенная инфекция). Кишечная палочка может также
вызвать развитие патологического процесса "изнутри" (эндогенная инфекция).

Пути передачи. Основной путь передачи при экзогенной форме инфекции -

контактно-бытовой (непрямой контакт). Возбудители могут быть перенесены на
грязных руках, через посуду, игрушки, белье, пищу, мух.

Патогенез. Заболевания, вызываемые эшерихиями, называют эшерихиозами.

Развитие эшерихиозов зависит от пути внедрения возбудителя в организм и от
серогруппы, к которой принадлежит возбудитель. При проникновении бактерий
через рот могут возникнуть кишечные заболевания детей и взрослых. Некоторые О-
группы эшерихии (серовары) наиболее часто являются возбудителями заболеваний
человека. Такие бактерии называют энтеропатогенными кишечными палочками
(ЭПКП). В настоящее время известно много вариантов ЭПКП, обусловливающих
разное течение эшерихиозов. Различают несколько групп ЭКПК:

группа I - возбудители колиэнтерита у детей раннего возраста (серогруппы О111,

О26, О55, О86 и др.);

группа II - возбудители дизентериеподобных заболеваний у детей и взрослых

(О25, О124, О143, О144 и др.);

группа III - возбудители холероподобных заболеваний (О1, О5, О6, О78 и др.).

Попадая в пищевые продукты, кишечная палочка может в них размножаться.

Употребление в пищу таких продуктов ведет к развитию пищевой
токсикоинфекции.
 Развитие эндогенной инфекции приводит к поражению различных органов:
воспалению желчного пузыря (холецистит), мочевого пузыря (цистит), заражению
крови (сепсис) и др.

Иммунитет. Иммунитет вырабатывается только в отношении одного

сероварианта эшерихии - возбудителя данного заболевания. Многообразие
эшерихии делает практически этот иммунитет недейственным. В развитии
иммунного состояния при заболевании детей большое значение имеет образование
IgM-антител, которые не проходят через плаценту, а значит не передаются от
матери. IgA-антитела к эшерихиям передаются ребенку от матери с грудным
молоком.

Профилактика. Соблюдение личной гигиены и санитарно-гигиенического

режима. Специфическая профилактика отсутствует.

Лечение. Антибиотики: ампициллин, тетрациклин и др. В настоящее время

выпускают колипротейный фаг, использование которого дает хорошие результаты.

Контрольные вопросы
1. Каковы основные признаки бактерий семейства кишечных?

2. Какие антигены имеются у эшерихии?

3. Какие лечебные препараты готовят из кишечных палочек?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выделение и идентификация ЭПКП.

Материал для исследования

1. Испражнения.

2. Рвотные массы.

При необходимости исследует отделяемое из носа и зева, гной из уха, кровь,

мочу, кусочки органов трупа.

При возникновении очага заболеваний коли-энтеритом исследуют (по

эпидемиологическим показаниям) пищевые продукты, смывы с рук
обслуживающего персонала, игрушек и других предметов.

Способы сбора материала

 Способы сбора материала

Примечание. Чем раньше от начала заболевания исследуют испражнения, тем

вероятнее возможность выделения возбудителя.

Основной метод исследования

Бактериологический

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Вынимают из термостата засеянные накануне чашки и просматривают их в

падающем или проходящем свете. При наличии малиново-красных колоний на
среде Эндо (с металлическим блеском или без него) или фиолетовых на среде ЭМС
ставят пробную реакцию агглютинации на стекле для дифференциации ЭПКП от
других разновидностей эшерихий.

Для постановки пробной реакции агглютинации отбирают не менее 10

изолированных колоний, отмечая или нумеруя их на обратной стороне чашки; часть
каждой намеченной колонии снимают петлей и агглютинируют в капле
поливалентной сыворотки или иммуноглобулина. Испытывают только часть
колонии, чтобы в случае положительной реакции агглютинации можно было из
оставшейся части колонии выделить чистую культуру.

Типовые или поливалентные эшерихиозные сыворотки (или иммуноглобулины)

изготовляют в производственных условиях. Поливалентные эшерихиозные ОК-
сыворотки (или ОК-иммуноглобулины) содержат антитела к нескольким О- и К-
антигенам эшерихий. С их помощью ориентировочно определяют принадлежность
выделенной культуры к ЭПКП. Например, поливалентная сыворотка О26, О55,
О111 позволяет выявить одноименные культуры эшерихий. Сыворотки разводят
согласно указанию на этикетке.

В лаборатории можно приготовить смесь отдельных ОК-сывороток, соединяя не

более 5 сывороток, чтобы разведение каждой было не выше 1:10.

Постановка пробной реакции агглютинации. На одно или два хорошо

обезжиренных предметных стекла наносят 10 капель поливалентной сыворотки
(или иммуноглобулина). В каждую каплю вносят часть намеченной колонии и
растирают ее. Колонии, давшие реакцию агглютинации, отсевают в пробирки со
скошенным агаром и ставят в термостат на 18-20 ч. Если ни одна из 10 колоний не
дала реакции агглютинации, дают отрицательный ответ.

Третий день исследования

Вынимают из термостата посевы и просматривают их. На МПА

энтеропатогенные кишечные палочки образуют обычно влажный, блестящий,
сероватый налет, реже он бывает мутным. Выросшую на скошенном агаре культуру
проверяют повторно в реакции агглютинации на стекле с поливалентными
эшерихиозными сыворотками (или иммуноглобулинами). Если выделенная
культура дает реакцию агглютинации с поливалентной сывороткой
(иммуноглобулином), то ее агглютинируют с каждой типовой сывороткой
(иммуноглобулином) раздельно в разведении 1:5 - 1:10. Агглютинация с живой
культурой имеет ориентировочное значение.

Далее необходимо подтвердить принадлежность выделенной культуры к роду

Эшерихия биологическими тестами. Для этого производят посев культуры на
полужидкие среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, мальтозой и
другими сахарами, а также на бульон или пептонную воду для определения
образования индола и сероводорода. Для этого в пробирки под пробку опускают
две индикаторные бумажки, смоченные реактивами, выявляющими образование
этих веществ. Одна бумажка при наличии индола краснеет, другая при наличии
сероводорода чернеет.

При ферментации Сахаров реакция среды становится кислой и цвет индикатора

изменяется. Если, помимо кислоты, образуется газ, в среде появляются пузырьки.
Одновременно определяют подвижность бактерий: делают посев в полужидкий
(0,2%) агар уколом. Подвижные бактерии дают помутнение всей среды,
неподвижные - растут только по уколу.

Для окончательной идентификации выделенной культуры ставят развернутую

реакцию агглютинации с живой и гретой культурами: с живой - для определения К-
антигена, с гретой - для определения О-антигена. Для постановки развернутой
реакции агглютинации антиген готовят следующим образом: 3-5 мл изотонического
раствора натрия хлорида смывают культуру со скошенного агара. Полученную
суспензию разливают в две пробирки. Одну из них прогревают на водяной бане при
100° С в течение часа.

Развернутую реакцию агглютинации ставят в двух рядах пробирок. Сыворотку в

обоих рядах разводят в соотношении 1:50 - 1:100 (в 1-й пробирке) до титра,
указанного на этикетке ампулы с сывороткой. В первый ряд добавляют по 2 капли
живой культуры, во второй - по 2 капли гретой культуры.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 18-24 ч.

Четвертый день исследования

Производят учет изменений сред Гисса, регистрируют образование индола и

сероводорода.

Большинство представителей эшерихий ферментирует углеводы с образованием

кислоты и газа, расщепляет белковый питательный субстрат до образования индола.

Учет пробирочной реакции агглютинации проводят при помощи лупы или

агглютиноскопа. Агглютинация с живой культурой крупнохлопчатая, с убитой -
мелкозернистая. Реакцию считают положительной, если агглютинация с гретой
культурой отмечается в разведении сыворотки не ниже половины титра сыворотки,
а живая культура агглютинируется сывороткой, разведенной не менее чем 1:200.
Играет роль и соотношение антител к гретой и живой культуре. Разведение
сыворотки, в котором отмечается агглютинация с гретой культурой, должно
превышать разведение сыворотки, в котором агглютинируется живая культура, не
менее чем в 2 раза. В табл. 31 приведены различные варианты результата реакции
агглютинации.

Таблица 31. Результаты реакции агглютинации с культурами эшерихий

Примечание. Возможны три варианта реакции: 1) гретая культура

агглютинируется сывороткой в больших разведениях, чем живая, реакция -
положительная; 2) живая и гретая культура дают агглютинацию в одинаковых
разведениях сыворотки. Такой результат может свидетельствовать об отсутствии в
культуре К-антигена; агглютинация живой и гретой культур вызвана О-антигеном.
В этих случаях необходима повторная постановка реакции агглютинации; 3)
агглютинация живой культуры при отсутствии агглютинации гретой позволяет дать
отрицательный ответ. Очевидно, в культуре нет О-антигена, соответствующего O-
антителам в сыворотке (рис. 41).
Рис. 41. Схема выделения и идентификации энтеропатогенных кишечных палочек

Контрольные вопросы

1. Какой материал исследуют для выделения эшерихий?

2. С помощью каких сывороток можно дифференцировать ЭПКП?

3. Для чего ставят развернутую реакцию агглютинации с живой и гретой

культурами эшерихий?
 Задание

1. Получите у преподавателя чашки Петри с засеянной на среде Эндо культурой

и произведите пересев на пробирку со скошенным агаром.

2. Возьмите у преподавателя культуру ЭПКП на скошенном агаре, смойте

изотоническим раствором натрия хлорида. Часть смыва прогрейте на водяной бане
при 100° С. Разведите сыворотку в двух рядах пробирок и поставьте реакцию
агглютинации описанным выше способом.

Питательные среды

Дифференциальные среды Эндо и ЭМС служат для выращивания кишечных

бактерий. Выпускаются в виде сухого порошка. Согласно указаниям на этикетке
отвешивают определенное количество сухой среды, растворяют в соответствующем
количестве воды, кипятят, помешивая, и разливают в стерильные чашки Петри.

Глава 18. Эшерихии - Л. Б. Богоявленская, Ф. К.

Черкес
Этот род представлен только одним видом бактерий - Е. coli, но объединяет
множество вариантов. Разновидности кишечной палочки отличаются по
биологическим свойствам, у них могут быть разные наборы ферментов (биовары) и
разная антигенная структура (серовары).

Кишечная палочка впервые выделена в 1888 г. Эшерихом из испражнений

человека и названа по его имени.

Естественным местом обитания E. coli является кишечник человека. Кишечная

палочка - представитель нормальной микрофлоры кишечника.

В процессе жизнедеятельности E. coli вырабатывает ферменты, способствующие

пищеварению (например, расщепляющие клетчатку), синтезирует некоторые
витамины (например, витамины группы В). Кроме того, эти бактерии проявляют
антагонистическое действие в отношении патогенных микроорганизмов, таких как
возбудители Дизентерии, брюшного тифа, токсикоинфекций. Отсутствие кишечной
палочки в толстом кишечнике ведет к тяжелому заболеванию - дисбактериозу. При
этом нарушается нормальный состав микрофлоры кишечника, развиваются протей,
кокковая флора, грибы и т. п.

При снижении устойчивости организма (голодании, переутомлении и т. п.)

эшерихии могут проникнуть в Другие органы и ткани и стать причиной тяжелых
патологических процессов. Таким образом, можно считать, что эшерихии -
типичные условно-патогенные микроорганизмы: в обычных условиях они являются
сапрофитами, а ПРИ изменении условий вызывают заболевания.

Выделяясь с фекалиями, кишечная палочка попадает во внешнюю среду.

Обнаружение E. coli в почве, воде и на других объектах свидетельствует об их
фекальном загрязнении, а определение количества E. coli (коли-титр, коли-индекс)
характеризует санитарное состояние объекта (см. "Санитарная микробиология").
 Морфология. E. coli - короткие, в среднем 0,5-3,0 × 0,5-0,8 мкм палочки.
Грамотрицательны. В большинстве случаев они подвижны, перитрихи. Однако
некоторые варианты кишечной палочки неподвижны. Многие штаммы образуют
капсулу. Спор не образуют.

Культивирование. Кишечная палочка - факультативный анаэроб. Хорошо

растет на простых питательных средах при 37° С и рН среды 7,2-7,8. Штаммы E.
coli, выделенные из кишечника человека и животных, развиваются и при 43-45° С, а
кишечные палочки холоднокровных при этих условиях не размножаются. Это
различие в свойствах E. coli разного происхождения используют для определения
санитарного состояния объекта, так как только обнаружение E. coli теплокровных
свидетельствует о санитарном неблагополучии.

На МПА кишечная палочка образует мутноватые, слегка выпуклые влажные

колонии с ровным краем. На МПБ дает равномерное помутнение. Культуры,
имеющие капсулу, растут в виде слизистых колоний.

Для идентификации эшерихий используют дифференциально-диагностические

среды: Эндо и агар с эозинметиленовым синим (ЭМС). На среде Эндо кишечная
палочка растет в виде малиново-красных колоний с металлическим блеском или без
него. На среде ЭМС - в виде темно-фиолетовых колоний.

Ферментативные свойства. E. coli обладают значительной ферментативной

активностью. Расщепляют лактозу, глюкозу, маннит, мальтозу, сахарозу и другие
углеводы и спирты с образованием кислоты и газа. Лротеолитические свойства:
образуют индол. Желатин не расщепляют. Отдельные биовары не ферментируют
лактозу и сахарозу (табл. 29).

Таблица 29. Ферментативные свойства эшерихий

Примечание, кг - образование кислоты и газа; + наличие признака; - отсутствие

признака.

Токсигенность. Эшерихий обладают эндотоксином (лиггополисахарид).

Антигенная структура. Эшерихий различаются по антигенной структуре

микробной клетки, что положено в основу классификации бактерий этого рода.
Различают три типа антигенов эшерихий: О-антиген (соматический), К-антиген
(капсульный) и Н-антиген (жгутиковый). Термостабильный О-антиген является
липополисахариднопротеиновым комплексом и расположен в клеточной стенке
бактерий. О-антиген определяет принадлежность культуры к серологической
группе. Описано более 170 таких групп. Некоторые компоненты О-антигена
являются общими для разных О-групп эшерихий, а иногда и других энтеробактерий
(шигелл, сальмонелл и др.). К-антигены эшерихий различны: А, В, L и М. Антигены
А и М - термостабильны, В и L - термолабильны. К-антиген расположен в
микробной клетке более поверхностно, чем О-антиген, и поэтому в его присутствии
реакция агглютинации живой культуры с О-сывороткой не происходит. Для
выявления О-антигена культуру прогревают в течение часа при 100° С: К-антиген
при прогревании разрушается, а О-антиген становится способным вступать во
взаимодействие с сывороткой. Установлено, что у эшерихий имеется около 100
типов К-антигенов, в основном типа В-антигенов (термолабильных). Н-антиген
имеется только у подвижных штаммов, так как он связан с жгутиками. У эшерихий
известно более 50 типов Н-антигена. Определение Н-антигена позволяет установить
серовариант выделенной культуры (рис. 40).

Рис. 40. Антигенная структура энтеропатогенной кишечной палочки. 1 -

цитоплазма; 2 - клеточная стенка; 3 - жгутики

Характеристику антигенного состава выделенной культуры эшерихий дают на

основании результатов реакции агглютинации с сыворотками, содержащими О-, К-
и Н-антитела. При этом определяют, какие антигены имеются в культуре, а их
сочетание характеризует антигенную формулу выделенной культуры, т. е. ее
серовариант. В табл.30 представлены примеры антигенной структуры некоторых
серовариантов E. coli, у которых К-антигены являются В-антигенами.

Таблица 30. Антигенная структура эшерихий

Если культура агглютинируется ОК-сывороткой ОП1:К58 (В4) и Н-сывороткой

"6", то значит выделен серовариант E. coli О111:В4:Н6; если отмечена реакция
агглютинации с ОК-сывороткой О26:К60 (В6) и с Н-сывороткой "11" - выделена
культура E. coli 026:В6:Н11 и т. п.

Кроме определения сероварианта E. coli, можно определить и фаговар

выделенной культуры. Имеются наборы бактериофагов, которые лизируют
эшерихии отдельных серогрупп. По лизису культуры одним из фагов
устанавливают ее фаговар. Определение фаговаров имеет эпидемиологическое
значение.

Антагонистическое действие E. coli, их способность подавлять рост гнилостных

и патогенных бактерий используют для создания бактерийных препаратов для
лечения дисбактериоза и различных заболеваний кишечника (колибактерин,
бификол).

Устойчивость к факторам окружающей среды. E. coli довольно устойчивы.

При 55° С они погибают в течение часа, при 60° С - за 15 мин. В почве и воде
сохраняются до 2-3 мес, в молоке не только сохраняются, но и размножаются.
Растворы дезинфицирующих веществ (3% хлорамин, раствор сулемы 1:1000 и др.)
убивают их за 20-30 мин. Особенно чувствительны E. coli к действию
бриллиантового зеленого.

Восприимчивость животных. Эшерихии отдельных серогрупп патогенны для

различных животных и вызывают у них заболевания желудочно-кишечного тракта.
Из лабораторных животных наиболее чувствительны к E. coli морские свинки,
кролики, белые мыши. В зависимости от способа введения культура кишечной
палочки вызывает различные патологические процессы: воспаление и абсцесс при
подкожных инъекциях, перитонит и сепсис - при внутрибрюшинном и
внутривенном введении.

Источники инфекции. Больной человек. При этом бактерии проникают в

организм из внешней среды (экзогенная инфекция). Кишечная палочка может также
вызвать развитие патологического процесса "изнутри" (эндогенная инфекция).

Пути передачи. Основной путь передачи при экзогенной форме инфекции -

контактно-бытовой (непрямой контакт). Возбудители могут быть перенесены на
грязных руках, через посуду, игрушки, белье, пищу, мух.

Патогенез. Заболевания, вызываемые эшерихиями, называют эшерихиозами.

Развитие эшерихиозов зависит от пути внедрения возбудителя в организм и от
серогруппы, к которой принадлежит возбудитель. При проникновении бактерий
через рот могут возникнуть кишечные заболевания детей и взрослых. Некоторые О-
группы эшерихии (серовары) наиболее часто являются возбудителями заболеваний
человека. Такие бактерии называют энтеропатогенными кишечными палочками
(ЭПКП). В настоящее время известно много вариантов ЭПКП, обусловливающих
разное течение эшерихиозов. Различают несколько групп ЭКПК:

группа I - возбудители колиэнтерита у детей раннего возраста (серогруппы О111,

О26, О55, О86 и др.);

группа II - возбудители дизентериеподобных заболеваний у детей и взрослых

(О25, О124, О143, О144 и др.);

группа III - возбудители холероподобных заболеваний (О1, О5, О6, О78 и др.).

Попадая в пищевые продукты, кишечная палочка может в них размножаться.

Употребление в пищу таких продуктов ведет к развитию пищевой
токсикоинфекции.

Развитие эндогенной инфекции приводит к поражению различных органов:

воспалению желчного пузыря (холецистит), мочевого пузыря (цистит), заражению
крови (сепсис) и др.
 Иммунитет. Иммунитет вырабатывается только в отношении одного
сероварианта эшерихии - возбудителя данного заболевания. Многообразие
эшерихии делает практически этот иммунитет недейственным. В развитии
иммунного состояния при заболевании детей большое значение имеет образование
IgM-антител, которые не проходят через плаценту, а значит не передаются от
матери. IgA-антитела к эшерихиям передаются ребенку от матери с грудным
молоком.

Профилактика. Соблюдение личной гигиены и санитарно-гигиенического

режима. Специфическая профилактика отсутствует.

Лечение. Антибиотики: ампициллин, тетрациклин и др. В настоящее время

выпускают колипротейный фаг, использование которого дает хорошие результаты.

Контрольные вопросы
1. Каковы основные признаки бактерий семейства кишечных?

2. Какие антигены имеются у эшерихии?

3. Какие лечебные препараты готовят из кишечных палочек?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выделение и идентификация ЭПКП.

Материал для исследования

1. Испражнения.

2. Рвотные массы.

При необходимости исследует отделяемое из носа и зева, гной из уха, кровь,

мочу, кусочки органов трупа.

При возникновении очага заболеваний коли-энтеритом исследуют (по

эпидемиологическим показаниям) пищевые продукты, смывы с рук
обслуживающего персонала, игрушек и других предметов.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

 Примечание. Чем раньше от начала заболевания исследуют испражнения, тем
вероятнее возможность выделения возбудителя.

Основной метод исследования

Бактериологический

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Вынимают из термостата засеянные накануне чашки и просматривают их в

падающем или проходящем свете. При наличии малиново-красных колоний на
среде Эндо (с металлическим блеском или без него) или фиолетовых на среде ЭМС
ставят пробную реакцию агглютинации на стекле для дифференциации ЭПКП от
других разновидностей эшерихий.

Для постановки пробной реакции агглютинации отбирают не менее 10

изолированных колоний, отмечая или нумеруя их на обратной стороне чашки; часть
каждой намеченной колонии снимают петлей и агглютинируют в капле
поливалентной сыворотки или иммуноглобулина. Испытывают только часть
колонии, чтобы в случае положительной реакции агглютинации можно было из
оставшейся части колонии выделить чистую культуру.

Типовые или поливалентные эшерихиозные сыворотки (или иммуноглобулины)

изготовляют в производственных условиях. Поливалентные эшерихиозные ОК-
сыворотки (или ОК-иммуноглобулины) содержат антитела к нескольким О- и К-
антигенам эшерихий. С их помощью ориентировочно определяют принадлежность
выделенной культуры к ЭПКП. Например, поливалентная сыворотка О26, О55,
О111 позволяет выявить одноименные культуры эшерихий. Сыворотки разводят
согласно указанию на этикетке.

В лаборатории можно приготовить смесь отдельных ОК-сывороток, соединяя не

более 5 сывороток, чтобы разведение каждой было не выше 1:10.
 Постановка пробной реакции агглютинации. На одно или два хорошо
обезжиренных предметных стекла наносят 10 капель поливалентной сыворотки
(или иммуноглобулина). В каждую каплю вносят часть намеченной колонии и
растирают ее. Колонии, давшие реакцию агглютинации, отсевают в пробирки со
скошенным агаром и ставят в термостат на 18-20 ч. Если ни одна из 10 колоний не
дала реакции агглютинации, дают отрицательный ответ.

Третий день исследования

Вынимают из термостата посевы и просматривают их. На МПА

энтеропатогенные кишечные палочки образуют обычно влажный, блестящий,
сероватый налет, реже он бывает мутным. Выросшую на скошенном агаре культуру
проверяют повторно в реакции агглютинации на стекле с поливалентными
эшерихиозными сыворотками (или иммуноглобулинами). Если выделенная
культура дает реакцию агглютинации с поливалентной сывороткой
(иммуноглобулином), то ее агглютинируют с каждой типовой сывороткой
(иммуноглобулином) раздельно в разведении 1:5 - 1:10. Агглютинация с живой
культурой имеет ориентировочное значение.

Далее необходимо подтвердить принадлежность выделенной культуры к роду

Эшерихия биологическими тестами. Для этого производят посев культуры на
полужидкие среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, мальтозой и
другими сахарами, а также на бульон или пептонную воду для определения
образования индола и сероводорода. Для этого в пробирки под пробку опускают
две индикаторные бумажки, смоченные реактивами, выявляющими образование
этих веществ. Одна бумажка при наличии индола краснеет, другая при наличии
сероводорода чернеет.

При ферментации Сахаров реакция среды становится кислой и цвет индикатора

изменяется. Если, помимо кислоты, образуется газ, в среде появляются пузырьки.
Одновременно определяют подвижность бактерий: делают посев в полужидкий
(0,2%) агар уколом. Подвижные бактерии дают помутнение всей среды,
неподвижные - растут только по уколу.

Для окончательной идентификации выделенной культуры ставят развернутую

реакцию агглютинации с живой и гретой культурами: с живой - для определения К-
антигена, с гретой - для определения О-антигена. Для постановки развернутой
реакции агглютинации антиген готовят следующим образом: 3-5 мл изотонического
раствора натрия хлорида смывают культуру со скошенного агара. Полученную
суспензию разливают в две пробирки. Одну из них прогревают на водяной бане при
100° С в течение часа.

Развернутую реакцию агглютинации ставят в двух рядах пробирок. Сыворотку в

обоих рядах разводят в соотношении 1:50 - 1:100 (в 1-й пробирке) до титра,
указанного на этикетке ампулы с сывороткой. В первый ряд добавляют по 2 капли
живой культуры, во второй - по 2 капли гретой культуры.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 18-24 ч.

Четвертый день исследования

 Производят учет изменений сред Гисса, регистрируют образование индола и
сероводорода.

Большинство представителей эшерихий ферментирует углеводы с образованием

кислоты и газа, расщепляет белковый питательный субстрат до образования индола.

Учет пробирочной реакции агглютинации проводят при помощи лупы или

агглютиноскопа. Агглютинация с живой культурой крупнохлопчатая, с убитой -
мелкозернистая. Реакцию считают положительной, если агглютинация с гретой
культурой отмечается в разведении сыворотки не ниже половины титра сыворотки,
а живая культура агглютинируется сывороткой, разведенной не менее чем 1:200.
Играет роль и соотношение антител к гретой и живой культуре. Разведение
сыворотки, в котором отмечается агглютинация с гретой культурой, должно
превышать разведение сыворотки, в котором агглютинируется живая культура, не
менее чем в 2 раза. В табл. 31 приведены различные варианты результата реакции
агглютинации.

Таблица 31. Результаты реакции агглютинации с культурами эшерихий

Примечание. Возможны три варианта реакции: 1) гретая культура

агглютинируется сывороткой в больших разведениях, чем живая, реакция -
положительная; 2) живая и гретая культура дают агглютинацию в одинаковых
разведениях сыворотки. Такой результат может свидетельствовать об отсутствии в
культуре К-антигена; агглютинация живой и гретой культур вызвана О-антигеном.
В этих случаях необходима повторная постановка реакции агглютинации; 3)
агглютинация живой культуры при отсутствии агглютинации гретой позволяет дать
отрицательный ответ. Очевидно, в культуре нет О-антигена, соответствующего O-
антителам в сыворотке (рис. 41).
Рис. 41. Схема выделения и идентификации энтеропатогенных кишечных палочек

Контрольные вопросы

1. Какой материал исследуют для выделения эшерихий?

2. С помощью каких сывороток можно дифференцировать ЭПКП?

3. Для чего ставят развернутую реакцию агглютинации с живой и гретой

культурами эшерихий?
 Задание

1. Получите у преподавателя чашки Петри с засеянной на среде Эндо культурой

и произведите пересев на пробирку со скошенным агаром.

2. Возьмите у преподавателя культуру ЭПКП на скошенном агаре, смойте

изотоническим раствором натрия хлорида. Часть смыва прогрейте на водяной бане
при 100° С. Разведите сыворотку в двух рядах пробирок и поставьте реакцию
агглютинации описанным выше способом.

Питательные среды

Дифференциальные среды Эндо и ЭМС служат для выращивания кишечных

бактерий. Выпускаются в виде сухого порошка. Согласно указаниям на этикетке
отвешивают определенное количество сухой среды, растворяют в соответствующем
количестве воды, кипятят, помешивая, и разливают в стерильные чашки Петри.

Глава 19. Сальмонеллы - Л. Б. Богоявленская, Ф. К.

Черкес
К этому роду семейства энтеробактерий относится более 2000 различных
бактерий, вызывающих заболевания человека и животных. Эти заболевания
называют сальмонеллезами. Сальмонеллы сходны по морфологическим,
культуральным и ферментативным свойствам, но отличаются по антигенной
структуре.

Сальмонеллы делят на монопатогенные и полипатогенные. К первым относятся

возбудители брюшного тифа, паратифа А и паратифа В. Этими заболеваниями
болеет только человек. Ко второй группе относятся возбудители заболеваний,
поражающие человека и животных.

S. typhi впервые были обнаружены Эбертом (1880) в органах человека,

погибшего от брюшного тифа. Ашар и Бансод (1886) при заболеваниях, сходных с
брюшным тифом, выделили из гноя и мочи больных бактерии, отличающиеся по
биохимическим и серологическим свойствам от возбудителей брюшного тифа. Их
назвали S. paratyphi А и S. paratyphi В. Почти одновременно американский ученый
Д. Сальмон (1885) впервые описал возбудителей холеры свиней (S.choleraesuis). В
дальнейшем было описано множество сходных бактерий, объединенных в род
Сальмонелла, названного по имени ученого, их описавшего.

Морфология. Все сальмонеллы мелкие, 1,0-3,0 × 0,6-0,8 мкм палочки с

закругленными концами. Грамотрицательны. Подвижны, перитрихи. Спор и капсул
не образуют.

Культивирование. Сальмонеллы - факультативные анаэробы. Они не

требовательны к питательным средам. Хорошо растут на МПА и МПБ при 37° С (от
20 до 40° С) и рН среды 7,2-7,4 (от 5,0 до 8,0). На МПА образуют нежные,
полупрозрачные, слегка выпуклые, блестящие колонии, в МПБ - равномерное
помутнение.
 При первичном посеве материала от больных (кал, моча, рвотные массы, кровь,
желчь) часто отмечают медленный рост сальмонелл. Для их накопления производят
посев на среды обогащения: селенитовый бульон, среду Мюллера, среду Кауфмана.
Используют также элективные (избирательные) среды: желчь (10-20%) и среду
Раппопорт.

На дифференциально-диагностических средах Эндо, ЭМС, Плоскирева

сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний, так как не расщепляют лактозу,
входящую в состав среды. На висмут-сульфитном агаре через 48 ч они образуют
колонии черного цвета, оставляющие след после того, как их снимают петлей
(кроме сальмонелл паратифа А).

У свежевыделенных культур S. paratyphi В после инкубации в термостате в

течение 18-20 ч и выдерживания при комнатной температуре в течение 1-2 сут на
периферии колонии образуется слизистый вал.

Ферментативные свойства. Сальмонеллы расщепляют глюкозу, маннит,

мальтозу с образованием кислоты и газа. Исключением являются возбудители
брюшного тифа (S. typhi), которые расщепляют эти сахара только до кислоты.
Сальмонеллы не ферментируют лактозу и сахарозу. Протеолитические свойства:
большинство сальмонелл расщепляет белковые среды с образованием сероводорода
(возбудители паратифа А отличаются отсутствием этого свойства). Индол не
образуют. Желатин не разжижают.

Токсигенность. Сальмонеллы содержат эндотоксин -

липополисахариднопротеиновый комплекс.

Антигенная структура и классификация. Еще в начале XX века ученые

заметили различную природу антигенов сальмонелл. Кауфман (1934) на основании
результатов реакции агглютинации разных сальмонелл с набором сывороток
разделил все сальмонеллы на группы и типы и предложил диагностическую схему
их антигенной структуры. В соответствии с этой схемой в настоящее время
производят идентификацию сальмонелл.

Сальмонеллы содержат два антигенных комплекса: О и Н,О-антиген -

липополисахариднопротеиновый комплекс; он термостабилен, инактивируется под
действием формалина. Н-антиген связан со жгутиками, имеет белковую природу;
он термолабилен, инактивируется под действием спирта и фенола, но устойчив к
воздействию формалина.

Все сальмонеллы разделены на О-группы, каждая из которых характеризуется

наличием определенных О-антигенов: основного, обозначенного арабской цифрой
(2, 4, 7, 8, 9 и т. д.), и дополнительных, общих для нескольких О-групп (1, 12). В
настоящее время известно более 60 О-групп, обозначаемых прописными буквами
латинского алфавита (А, В, С, D, Е и т. д.).

S. typhi содержит, кроме того, Vi-антиген, который расположен в микробной

клетке более поверхностно, чем О-антиген, и препятствует агглютинации культуры
с О-сывороткой. Этот антиген термолабилен. Его присутствие связывали с
вирулентностью возбудителя. Vi-антиген содержится также в клетках S. paratyphi С.
 Н-антигены сальмонелл имеют две фазы. Сальмонеллы различных серовариантов
одной О-группы имеют различную первую фазу Н-антигена, которую обозначают
строчными буквами латинского алфавита: а, b, с, d, eh ... u, z и т. д. Вторую фазу Н-
антигена обычно обозначают арабскими цифрами: 1, 2, 5, 6, 7 и строчными
латинскими буквами. Сочетание различных О- и Н-антигенов определяет
антигенную структуру культур и их название.

В практической работе для определения антигенной структуры сальмонелл

используют адсорбированные монорецепторные агглютинирующие сыворотки,
которые содержат антитела к одному антигену. Ставят реакцию агглютинации на
стекле и по наличию агглютинации с определенными сыворотками характеризуют
антигенную структуру выделенной культуры. Например, культура агглютинируется
О-сыворотками "9" и "12" и Н-сывороткой "d"; находят в схеме серовар с таким
антигенным составом (S. typhi), ставят дополнительно реакцию с Vi-сывороткой

Имеются наборы специфических сальмонеллезных фагов, которые лизируют

только сальмонеллы соответствующего фаговара. Для определения фаговара
культур S. typhi, содержащих Vi-антиген, в нашей стране выпускают 45 фагов; для
S. paratyphi В-11 фагов; S. paratyphi А - 6 и т. д. Эти исследования проводят для
определения источника и путей передачи инфекции.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Сальмонеллы довольно

устойчивы. При температуре 100° С погибают мгновенно, при 60-70° С - за 10-15
мин. Они хорошо переносят низкую температуру, могут сохраняться в чистой воде
и льду в течение нескольких месяцев; в копченом и соленом мясе - до 2 мес.
Устойчивы к высыханию, длительно сохраняются в пыли.

Под действием дезинфицирующих веществ погибают в течение нескольких

минут (2-5% раствор фенола, 1:1000 раствор сулемы, 3-10% раствор хлорамина).

Восприимчивость животных. Большинство сальмонелл вызывает заболевания

человека и многих видов животных и птиц (полипатогенные).

Брюшной тиф, паратифы А и В

Источник инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Возбудители инфекции передаются через предметы,

загрязненные выделениями человека, через руки, воду, пищу. Часто возбудителей
переносят мухи. В зависимости от путей передачи различают бытовые, водные,
пищевые вспышки брюшного тифа и паратифов.

Патогенез. Заражение происходит через рот. Из ротовой полости

микроорганизмы попадают в желудок, где частично разрушаются под воздействием
желудочного сока и ферментов. Оставшиеся сальмонеллы поступают в тонкий
кишечник, проникают в лимфоидную ткань тонкого кишечника (групповые
лимфатические и солитарные фолликулы), в которой размножаются в течение
инкубационного периода (10-14 дней). К концу этого срока возбудители поступают
в лимфу и кровь (бактериемия) и разносятся по всему организму. В этот период они
локализуются в лимфоидной ткани внутренних органов, системе макрофагов,
печени, селезенке, костном мозге. Сальмонеллы накапливаются в желчном пузыре,
где находят благоприятные условия для размножения, так как желчь - хорошая
питательная среда для этих бактерий. При этом они вторично попадают в тонкий
кишечник и, поражая уже сенсибилизированную лимфоидную ткань (групповые
лимфатические и солитарные фолликулы), вызывают образование специфических
брюшнотифозных язв (рис. 42).

Рис. 42. Циркуляция сальмонелл в организме человека. 1 - тонкий кишечник; 2 -

групповые лимфатические фолликулы; 3 - кровеносные сосуды; 4 - желчный пузырь

В период бактериемии часть микроорганизмов разрушается, при этом

освобождается эндотоксин и возникают явления интоксикации: повышается
температура, появляется общее недомогание, слабость, головная боль и т. д. С
конца 2-й и начала 3-й недели сальмонеллы начинают выделяться из организма с
калом, мочой, слюной и т. п.

Период реконвалесценции (выздоровления) характеризуется очищением

организма от возбудителя, усилением фагоцитарной активности клеток,
накоплением антител в крови.
 Однако при брюшном тифе и паратифах бактериовыделение часто не
заканчивается с выздоровлением больного - формируется бактерионосительство.
Хронические воспалительные явления в желчном пузыре способствуют
переживанию сальмонелл в желчи и их длительному выделению из организма
(иногда до нескольких лет).

Иммунитет. Постинфекционный иммунитет достаточно напряженный и

длительный. Повторные заболевания наблюдаются редко. В течение болезни
вырабатываются антитела: в концу 1-й недели появляются агглютинины,
преципитины и другие виды антител. Количество их нарастает, достигая максимума
на 14-15-й день болезни. Антитела сохраняются в сыворотке крови переболевшего
Длительное время.

Активность фагоцитов и другие клеточные факторы защиты также имеют

значение при формировании иммунного состояния организма.

Профилактика. Соблюдение личной гигиены и проведение всех санитарно-

гигиенических мероприятий: надзор за источниками водоснабжения, контроль
продуктов питания и за предприятиями общественного питания.

Специфическая профилактика. Химическая вакцина, содержащая полные

антигены возбудителей брюшного тифа, паратифов А и В и столбнячный анатоксин
(TAB'te). Имеется также брюшнотифозная спиртовая вакцина, обогащенная Vi-
антигеном, введение которой с профилактической целью дает хороший эффект. В
очаге заболевания лицам, контактировавшим с больным, дают брюшнотифозный
бактериофаг.

Лечение. Антибиотики: левомицетин, тетрациклин и др.

Пищевые токсикоинфекции
При употреблении продуктов, зараженных сальмонеллами различных сероваров
(кроме S. typhi, S. paratyphi A и В), возникают пищевые токсикоинфекции.

Источники инфекции. Животные и птицы, больные сальмонеллезами, или

здоровые, в организме которых, не причиняя им вреда, находятся сальмонеллы.

Пути передачи. Заражение происходит при употреблении мяса, мясных

продуктов, яиц, молока, молочных продуктов, инфицированных сальмонеллами.
Наиболее опасным является употребление пищи, в которой происходит
размножение и гибель сальмонелл и накопление эндотоксина.

Патогенез. Попав в организм через рот, сальмонеллы проникают в

пищеварительный тракт. При этом значительная часть бактерий погибает и
освобождается эндотоксин, который может проникнуть в кровь. Появляются
симптомы поражения желудочно-кишечного тракта и общего токсикоза.
Заболевание длится не более 4-5 дней; иногда переболевшие становятся носителями
сальмонелл.

Иммунитет непродолжительный. В крови больных и реконвалесцентов

накапливаются различные антитела: агглютинины, преципитины и т. п. Сероваров
сальмонелл очень много, а иммунитет специфичен, т. е. направлен только против
одного возбудителя, поэтому человек может повторно болеть сальмонеллезом.

Профилактика. Постоянный строгий ветеринарно-санитарный контроль за

скотом, убоем и разделкой туш, хранением и обработкой мяса и мясных продуктов.
Необходимо строгое соблюдение санитарно-гигиенического режима и личной
гигиены на предприятиях общественного питания.

Специфическая профилактика. Людям, находящимся в очагах пищевой

токсикоинфекции, следует давать сальмонеллезный поливалентный бактериофаг.

Лечение. Основным терапевтическим средством является дезинтоксикация

организма - введение большого количества жидкости, промывание желудка.
Применяют также антибиотики.

Внутрибольничная сальмонеллезная инфекция

Возбудителем внутрибольничной сальмонеллезной инфекции чаще всего
является S. typhimurim. Отмечаются также "госпитальные" вспышки, вызванные S.
heidelberg, S. derby и др. Хотя морфологические и культуральные свойства этих
возбудителей не отличаются от свойств других сальмонелл, имеются некоторые
биологические особенности, характерные для них. Так, например, возбудители
внутрибольничных инфекций относятся к определенным биоварам, они более
патогенны для белых мышей и т. п.

Источники инфекции. Чаще бактерионоситель, реже больной.

Пути передачи. Преобладает непрямой контакт (игрушки, белье, предметы

ухода за больным). Реже имеют место воздушно-пылевой и пищевой пути
передачи.

Патогенез. Заболевание развивается на фоне ослабления организма и снижения

его иммунной активности. Возбудитель попадает в организм перорально или через
дыхательные пути, что и определяет развитие патологического процесса:
расстройство функции желудочно-кишечного тракта с обезвоживанием или
поражение органов дыхания, бактериемия, септические осложнения. Заболевают в
первую очередь дети раннего возраста.

Иммунитет. Вырабатывается только по отношению к одному серовару

сальмонелл.

Профилактика. Строгое соблюдение санитарно-гигиенического режима в

лечебных учреждениях.

Специфическая профилактика. При возникновении внутрибольничной

сальмонеллезной инфекции детям, контактировавшим с больным, следует давать
сальмонеллезный поливалентный бактериофаг.

Лечение. Симптоматическое.
 Контрольные вопросы
1. Каковы морфологические, культуральные и ферментативные свойства
сальмонелл?

2. На чем основана классификация сальмонелл?

3. Какие заболевания вызывают сальмонеллы?

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выделение возбудителей заболевания и определение

серовара сальмонелл.

Материал для исследования

1. Кровь.

2. Испражнения.

3. Моча.

4. Дуоденальное содержимое.

В зависимости от стадии болезни исследуют разный материал.

Исследованию могут быть также подвергнуты содержимое розеол, костный мозг,

мокрота и материал, полученный на вскрытии - кусочки органов.

При токсикоинфекциях материалом для исследования могут служить промывные

воды желудка, рвотные массы, остатки пищевых продуктов.

Способы сбора материала

 Способы сбора материала

Независимо от характера взятого для исследования материала с момента

выделения чистой культуры исследование ведут по общей схеме.

Основные методы исследования

1. Бактериологический (рис. 43).

2. Серологический.
Рис. 43. Схема микробиологического исследования при брюшном тифе и паратифах в
 разные периоды заболевания. I - 1-й период исследования (гемокультура); II - 2-й
период исследования (реакция Видаля); III - 3-й период исследования (копрокультура)

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Вынимают чашки из термостата (инкубация 18-24 ч) и просматривают выросшие

колонии невооруженным глазом и при помощи лупы. Несколько (5-6)
подозрительных колоний выделяют на среду Олькеницкого или Рассела. Посев
производят следующим образом: снятую колонию осторожно, не задевая края
пробирки, вносят в конденсационную жидкость, затем штрихами засевают всю
скошенную поверхность среды и делают укол в глубину столбика для выявления
газообразования. Укол следует производить в центр агарового столбика.

Пробирки с посевами ставят в термостат. Если исследуемый материал был

посеян на среду обогащения, то через 18-24 ч производят высев со среды
обогащения на чашки с дифференциальными средами. Дальнейшее исследование
ведут по общей схеме.

Таблица 32. Рост сальмонелл на дифференциально-диагностических средах

1
(На месте снятых колоний остается черный след (изменяется цвет среды).)

Третий день исследования

Вынимают пробирки с посевами из термостата и просматривают характер роста.

В состав комбинированных сред входят лактоза, глюкоза, иногда мочевина и

индикатор. Расщепление глюкозы происходит только в условиях анаэробиоза.
Поэтому скошенная поверхность среды при расщеплении глюкозы не изменяется, а
столбик окрашивается в цвет, соответствующий индикатору. Бактерии,
расщепляющие лактозу и мочевину, изменяют цвет всей среды.

Если выделенные культуры сбраживают лактозу или расщепляют мочевину,

меняя цвет всей среды, то они не являются сальмонеллами и можно дать
отрицательный ответ.

Культуру, расщепляющую только глюкозу, подвергают дальнейшему изучению:

делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. При наличии в мазках
грамотрицательных палочек изучают их подвижность и ферментативные свойства.

Подвижность можно определить в висячей капле или в раздавленной капле, а

также по характеру роста в полужидкой среде Гисса или в 0,2% агаре. При наличии
подвижности при посеве уколом рост на среде диффузный, среда мутнеет.

Для выявления ферментативной активности производят посев на среды Гисса,

МПБ, пептонную воду. В пробирки с последними средами опускают (под пробку)
индикаторные бумажки для определения индола и сероводорода. Делают также
посев на лакмусовое молоко.

Четвертый день исследования

Учитывают биохимическую активность по результату ферментации углеводных

и других сред (см. табл. 33).

Таблица 33. Ферментативные свойства сальмонелл

Примечание. к - образование кислоты; кг - образование кислоты и газа; щ -

щелочение; + наличие свойства; - отсутствие свойства.

Определив морфологические, культуральные и ферментативные свойства

выделенной культуры, необходимо провести анализ антигенной структуры (табл.
34).
Таблица 34. Сокращенная схема антигенной структуры сальмонелл (по Кауфману -
Уайту)

Серологическую идентификацию сальмонелл начинают с реакции агглютинации

на стекле с поливалентной О-сывороткой А, В, С, D, Е. При отсутствии
агглютинации выделенную культуру испытывают с поливалентной О-сывороткой к
редким группам сальмонелл. При положительной реакции с одной из сывороток
культуру испытывают с каждой О-сывороткой, входящей в состав поливалентной,
для определения О-серогруппы. Установив принадлежность культуры к О-группе,
определяют ее Н-антигены с сыворотками первой, а затем второй фазы (табл. 35).

Таблица 35. Антигенная структура возбудителей брюшного тифа и паратифов

Культуру сальмонелл тифа испытывают также с Vi-сывороткой. Возбудители

брюшного тифа, содержащие Vi-антиген, испытывают Vi-фагами (их 86).
Определение фаготипа имеет большое эпидемиологическое значение (см. рис. 43).

Методика фаготипирования. 1-й метод. В чашки Петри наливают 20-25 мл

агара и подсушивают с открытыми крышками в термостате. Дно чашки делят на
секторы. На каждом секторе пишут название фага. Изучают 4-6-часовую
бульонную культуру, так как она содержит больше Vi-антигена. На поверхность
агара наносят 8-10 капель бульонной культуры и стеклянным шпателем растирают
ее по поверхности агара. Чашки с посевами подсушивают с открытыми крышками в
термостате. На каждый сектор наносят каплю соответствующего типового фага.
После подсыхания капель чашки ставят в термостат на 18-24 ч. Результат
учитывают невооруженным глазом или с помощью лупы через дно чашки.

Наличие лизиса культуры одним или несколькими типовыми фагами позволяет

определить принадлежность выделенного штамма к определенному фаготипу.

2-й метод. На питательную среду культуру наносят каплями. На каждую каплю

после высыхания культуры в термостате наносят каплю типового фага. Ставят в
термостат.

Степень лизиса выражают по четырехкрестной системе.

Контрольные вопросы

1. Какой материал исследуют при брюшном тифе, паратифах и

токсикоинфекциях?

2. В каком периоде заболевания используют метод выделения гемокультуры?

3. В каком периоде заболевания брюшным тифом и паратифами исследуют

испражнения и мочу?

4. На какие дифференциально-диагностические среды производят посев

исследуемого материала?

5. Какие среды используют для накопления сальмонелл?

6. Что определяют монорецепторными О-сыворотками и что монорецепторными

Н-сыворотками?

Задание

1. Изучите по табл. 32 характер роста сальмонелл на дифференциальных средах.

Посмотрите у преподавателя чашки с посевом сальмонелл тифа на средах Эндо,
Плоскирева, висмут-сульфитном агаре. Зарисуйте колонии цветными карандашами
и покажите преподавателю.

2. Возьмите у преподавателя культуры сальмонелл, О- и Н-монорепторные

сыворотки. Поставьте реакцию агглютинации на стекле. Учтите реакцию и
покажите преподавателю.

Задача

Выделенная культура дала положительную реакцию агглютинации с О-

сывороткой 4. С какими Н-сыворотками надо поставить реакцию агглютинации,
если Вы думаете, что это культура сальмонелл паратифа В?

Серологическая диагностика брюшного тифа и паратифов

 Реакция Видаля. Со второй недели заболевания в крови больных накапливаются
антитела против возбудителя инфекции. Для их выявления исследуют сыворотку
крови больного в реакции агглютинации. В качестве антигена используют убитые
культуры сальмонелл - диагностикумы.

Для постановки реакции Видаля используют сыворотку больного, набор

диагностикумов, изотонический раствор натрия хлорида.

Кровь (2-3 мл) из мякоти пальца или локтевой вены собирают в стерильную
пробирку и доставляют в лабораторию. В лаборатории пробирку ставят в термостат
на 20-30 мин для образования сгустка, затем пастеровской пипеткой обводят
сгусток, чтобы отделить от стенки пробирки, и ставят на 30-40 мин на холод.
Отделившуюся сыворотку отсасывают и используют для постановки реакции
агглютинации с диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифов. Для получения
сыворотки кровь можно отцентрифугировать.

При возникновении инфекционного процесса - брюшного тифа или паратифов - в

организме вырабатываются О- и Н-антитела к одноименным антигенам
возбудителя.

О-антитела появляются первыми и исчезают довольно быстро. Н-антитела

сохраняются долго. То же самое происходит и при вакцинации, поэтому
положительная реакция Видаля с О- и Н-антигенами свидетельствует о наличии
заболевания, а реакция только с Н-антигенами может быть и у переболевших
(анамнестическая реакция), и у привитых (прививочная). Исходя из этого, реакцию
Видаля ставят раздельно с О- и Н-антигенами (диагностикумы).

Так как клинически брюшной тиф и паратифы А и В сходны, то для выявления

природы заболевания сыворотку больного испытывают одновременно с
диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифа А и В.

Реакцию Видаля широко используют, так как она проста и не требует

специальных условий.

Поставить реакцию можно двумя способами: капельным и объемным (см. главу

12). В практике чаще используют объемный метод. При постановке линейной
реакции агглютинации количество рядов должно соответствовать количеству
антигенов (диагностикумы). Возбудителем заболевания считают микроорганизм,
диагностикум из которого агглютинировался сывороткой больного. Иногда
отмечают групповую агглютинацию, так как возбудители тифа и паратифов
обладают общими групповыми антигенами. В этом случае положительным считают
результат реакции в ряду, в котором агглютинацию отмечают в большем
разведении сыворотки (табл. 36).
 Таблица 36. Возможный результат реакции агглютинации

Примечание. В практике реакцию Видаля ставят с четырьмя диагностикумами:

брюшного тифа "О" и "Н", а паратифов А и В - с диагностикумами "ОН".

Если агглютинация возникает только в небольших разведениях сыворотки -

1:100, 1:200, то для отличия реакции при заболевании от прививочной или
анамнестической прибегают к повторной постановке реакции агглютинации через
5-7 дней. У больного титр антител повышается, а у привитого или переболевшего
не изменяется. Таким образом, нарастание титра антител в сыворотке крови служит
показателем заболевания.

В ответ на внедрение в организм возбудителей брюшного тифа, обладающих Vi-

антигеном, в крови больного появляются Vi-агглютинины. Их определяют со 2-й
недели болезни, но титр их обычно не превышает 1:10. Обнаружение Vi-антител
связывают с наличием в организме возбудителей брюшного тифа, поэтому
определение этих антител имеет большое эпидемиологическое значение, так как
позволяет выявить бактерионосителей.

Реакция Vi-гемагглютинации. Это наиболее чувствительная реакция для

выявления антител.

Принцип реакции заключается в том, что эритроциты человека (I группы) или

барана после специальной обработки могут адсорбировать на своей поверхности
Vi-антиген и приобретают при этом способность агглютиниповаться
соответствующими Vi-антителами.

Эритроциты с адсорбированными на поверхности антигенами называют

эритроцитарными диагностикумами.

Для постановки реакции Vi-гемагглютинации берут:

1) сыворотку крови больного (1-2 мл); 2) эритроцитарный сальмонеллезный Vi-

диагностикум; З) Vi-сыворотку; 4) О-сыворотку; 5) изотонический раствор натрия
хлорида.

Реакцию ставят в агглютинационных пробирках или в пластмассовых пластинах

с лунками.

Кровь у больного берут так же, как для реакции Видаля. Получают сыворотку. Из
сыворотки готовят двукратные серийные разведения, начиная с 1:10 до 1:160.
 По 0,5 мл каждого разведения вносят в лунку и прибавляют по 0,25 мл
эритроцитарного диагностикума. Реакцию ставят в объеме 0,75 мл.

Контролем служат: 1) стандартная агглютинирующая монорецепторная

сыворотка + диагностикум - реакция должна быть положительной до титра
сыворотки; 2) диагностикум в изотоническом растворе натрия хлорида (контроль) -
реакция должна быть отрицательной.

Содержимое лунок тщательно перемешивают, ставят в термостат на 2 ч и

оставляют при комнатной температуре до следующего дня (на 18-24 ч).

Учет начинают с контроля. Реакцию оценивают в зависимости от степени

агглютинации диагностикума.

Результаты учитывают по четырехкрестной системе:

++++ эритроциты полностью агглютинированы - осадок на дне лунки в виде

"зонтика";

+++ "зонтик" меньше, не все эритроциты агглютинировались;

++ "зонтик" маленький, на дне лунки имеется осадок из неагглютинированных

эритроцитов;

- реакция отрицательная; эритроциты не агглютинировались и осели на дно

лунки в виде пуговки.

Контрольные вопросы

1. В какой период заболевания ставят реакцию Видаля?

2. Какие ингредиенты необходимы для постановки реакции Видаля?

3. С какими диагностикумами ставят реакцию Видаля?

4. Какая из серологических реакций является самой чувствительной при

диагностике тифопаратифозных инфекций?

5. Каким диагностикумом пользуются при постановке реакции Vi-

гемагглютинации?

6. Какой сывороткой определяют наличие Vi-антигена у исследуемой культуры?

7. Какое значение имеет определение Vi-фаготипа?

Задание

Возьмите у преподавателя О- и Н-диагностикумы из сальмонелл тифа, паратифа

А и паратифа В и сыворотку больного. Поставьте реакцию Видаля.

Питательные среды
 Среды ЭМС, Плоскирева, висмут-сульфитный агар выпускаются медицинской
промышленностью в виде сухого порошка. Их готовят согласно указаниям на
этикетке: отвешивают определенное количество порошка, наливают
соответствующее количество воды, кипятят и разливают в стерильные чашки
Петри.

Среда Рассела. В 950 мл дистиллированной воды добавляют 40 г сухой

питательной среды и прибавляют 5 г питательного агара. Нагревают до кипения и
растворения порошков. В 50 мл дистиллированной воды растворяют 1 г х. ч.
глюкозы и добавляют к приготовленной смеси. Среду разливают в стерильные
пробирки по 5-7 мл, стерилизуют текучим паром (2 дня по 2 мин) и скашивают так,
чтобы оставался столбик. Среду Рассела с маннитом и сахарозой готовят так же.

Среда Олькеницкого из сухого агара. 2,5 г сухого питательного агара

расплавляют в 100 мл дистиллированной воды. В остуженный до 50° С агар
прибавляют все ингредиенты, указанные в рецептуре (этикетке). Среду, разлитую в
пробирки, стерилизуют текучим паром (3 дня по 20 мин) и затем скашивают.
Готовая среда должна быть бледно-розового цвета.

Глава 20. Шигеллы - Ф. К. Черкес

Первый возбудитель дизентерии был открыт А. В. Григорьевым (1891), а в 1898
г. японский ученый Шига изучил и описал его. В последующие годы были
выделены и описаны другие представители этого рода: Флекснер (1900), Зонне
(1915), Штутцер - Шмитц (1917), Лардж - Сакс (1934).

Согласно Международной классификации все бактерии, вызывающие

дизентерию, в честь Шига объединены в один род - шигеллы.

Морфология. Шигеллы - это небольшие (2-3 × 0,4-0,6 мкм) палочки с

закругленными концами. Отличаются от остальных представителей семейства
Enterobacteriaceae отсутствием жгутиков. Они не имеют спор и капсул.
Грамотрицательны.

Культивирование. Шигеллы - факультативные анаэробы. Неприхотливы к

питательным средам. Размножаются на МПА и МПБ при температуре 37° С и рН
7,2-7,4. Элективными и дифференциально-диагностическими средами для них
являются среды Плоскирева, Эндо, ЭМС. Растут в виде небольших,
полупрозрачных, сероватых, круглых колоний, размером 15-2 мм в S-форме.
Исключением являются шигеллы Зонне, которые часто диссоциируют, образуя
крупные, плоские, мутные, с изрезанными краями колонии R-формы (рис. 44). В
жидких питательных средах шигеллы дают равномерную муть, R-формы образуют
осадок.
 Рис. 44. Схема бактериологического исследования при дизентерии

Ферментативные свойства. Ферментативные свойства шигелл менее

выражены, чем у других представителей Enterobacteriaceae: они расщепляют
углеводы без газообразования, не расщепляют лактозу и сахарозу. Исключением
являются шигеллы Зонне, которые на 2-3-й сутки расщепляют эти углеводы.

Протеолитические свойства у шигелл мало выражены - образование индола и

сероводорода непостоянно, молоко они свертывают, желатин не разжижают.

По отношению к манниту все шигеллы делятся на расщепляющие и

нерасщепляющие маннит (табл. 37).
 Таблица 37. Ферментативные свойства шигелл

Примечание. к - расщепление с образованием кислоты.

В настоящее время шигеллы Зонне делят на четыре ферментативные типа.

Различаются они по способности расщеплять рамнозу и ксилозу (табл. 38).

Таблица 38. Биоварианты шигелл Зонне

Примечание. + расщепление; (+) расщепление через 3-5 дней; - не изменяется.

Токсинообразование. Шигеллы обладают эндотоксином. Исключением

являются шигеллы Шиги, которые помимо эндотоксина выделяют экзотоксин,
оказывающий нейротоксическое действие.

Антигенная структура и классификация. Шигеллы содержат соматические

антигены, к которым относятся групповые и типовые антигены. По Международной
классификации шигеллы подразделяют на четыре группы, обозначаемые
латинскими большими буквами А, В, С, D.

Группа A S. dysenteriae: 1 - Григорьева - Шиги; 2 - Штутцера - Шмитца; 3-7 -

Лардж - Сакса и 8-10 - провизорные. Представители этой группы имеют только
типовые антигены, обозначаемые арабскими цифрами.

Группа В S. flexneri. Микробы этой группы имеют более сложную антигенную

структуру - они содержат типовые антигены, обозначаемые римскими цифрами, и
групповые антигены, обозначаемые арабскими цифрами. Шигеллы Флекснера
имеют 6 серовариантов. Шигеллы Флекснер 6 раньше обозначали как подвид S.
newcastle.
 Группа С S. boydii. Имеет только типовые антигены. В этой группе 15
серологических типов.

Группа D S. sonnei имеет свой видовой антиген (табл. 39).

 Таблица 39. Классификация бактерий рода Shigella

При микробиологическом исследовании в ответах указывают серовариант и

подсеровариант выделенной культуры. Например, выделена культура шигелл
Флекснер 1а.
 Устойчивость к факторам окружающей среды. Температура 100° С убивает
шигеллы мгновенно. Температура 60° С убивает их через 20-30 мин. К низким
температурам шигеллы устойчивы - в речной воде они сохраняются до 3 мес, на
овощах и фруктах - до 10-15 мес. Солнечный свет убивает их через 2-3 ч, а шигеллы
Шиги - через 20 мин. Общеупотребительные концентрации дезинфицирующих
растворов губят их через 20-30 мин. Наименее устойчивы к влиянию внешних
факторов шигеллы группы А, а наиболее устойчивы шигеллы Зонне.

Восприимчивость животных. Животные не чувствительны к возбудителям

дизентерии, исключением являются обезьяны. Экспериментальное заражение
кроликов и белых мышей вызывает у них интоксикацию и гибель.

Источники инфекции. Человек, болеющий острой и хронической формой

дизентерии, и бактерионоситель.

Пути передачи. Пищевой. Большое значение имеет водный путь, овощи,

фрукты, различные предметы, обсемененные шигеллами, и мухи.

Патогенез. Попав с пищей в кишечник, шигеллы проникают в клетки эпителия

слизистой оболочки толстого кишечника, где размножаются. Частично они
погибают. Образующийся при разрушении бактерий эндотоксин сенсибилизирует
слизистую оболочку, повышается проницаемость кровеносных сосудов, и
эндотоксин всасывается в кровь, вызывая интоксикацию. Поражение слизистой
оболочки сопровождается отечностью, некрозами, геморрагией. Кроме того, токсин
влияет на центральную нервную систему, что приводит к трофическим
расстройствам. Особенно тяжело протекает заболевание, вызванное шигеллами
Шиги, которые глубоко проникают в слизистую оболочку толстой кишки, вызывая
резкую гиперемию, отек и кровавый понос. Образуемый ими экзотоксин вызывает
тяжелую интоксикацию.

Для возникновения заболевания имеет значение величина инфицирующей дозы.

Иммунитет. У человека имеется естественная резистентность к дизентерийной

инфекции. После перенесенного заболевания иммунитет нестойкий, а после
дизентерии Зонне практически отсутствует. При заболевании, вызванном
шигеллами дизентерии 1 (Григорьева - Шиги) вырабатывается более стойкий
антитоксический иммунитет.

Профилактика. Общие санитарно-противоэпидемические мероприятия:

изоляция, ранняя диагностика, дезинфекция.

Специфическая профилактика не нашла широкого применения. Лицам,

бывшим в контакте с больными, дают поливалентный дизентерийный бактериофаг.

Лечение. Комплексное, сульфаниламиды с антибиотиками. Специфического

лечения нет.

Контрольные вопросы
1. Назовите представителей рода шигелл - возбудителей дизентерии.
 2. Отношение к какому углеводу положено в основу разделения шигелл на две
группы? Какие виды шигелл входят в каждую из этих групп?

3. Каковы пути проникновения шигелл и какую часть кишечника они поражают?

4. Какой вид шигелл часто растет в R-форме?

5. Какие шигеллы имеют типовые и групповые антигены?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление и идентификация шигелл для постановки
диагноза; выявление бактерионосителей; обнаружение шигелл в пищевых
продуктах.

Материал для исследования

1. Испражнения.

2. Секционный материал.

3. Пищевые продукты.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микробиологический.

2. Серологический.

Ход исследования
Первый день исследования
 Первый день исследования

Второй день исследования

Засеянные чашки вынимают из термостата, просматривают невооруженным

глазом или через лупу. Подозрительные колонии (бесцветные) в количестве 4-6
отсевают на среду Рассела и маннит. Посев производят штрихами по скошенной
поверхности и уколом в агаровый столбик. Засеянную среду Рассела помещают в
термостат на 18-24 ч (параллельно делают пересев из селенитовой среды на
дифференциальные среды).

Третий день исследования

Вынимают посевы, сделанные на среду Рассела, из термостата. Культуры, не

расщепившие лактозу, подвергают дальнейшему изучению: делают мазки,
окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамотрицательных
палочек производят посев на среды Гисса, бульон с индикаторными бумажками
(для выявления индола и сероводорода) и на лакмусовое молоко. Засеянные среды
ставят в термостат на 18-24 ч.

Четвертый день исследования

 Вынимают посевы из термостата и учитывают результат. Культуры,
подозрительные по своим ферментативным и культуральным свойствам в
отношении шигелл (см. табл. 37), подвергают серологической идентификации. При
отсутствии таких культур дают отрицательный ответ.

Серологическая идентификация

Вид, серовар, подсеровар выделенной культуры устанавливают при помощи

адсорбированных сывороток. Анализ антигенной структуры начинают с реакции
агглютинации на стекле со смесью № 1. В эту смесь входят сыворотки с антителами
к шигеллам Зонне, Ньюкасл и поливалентная сыворотка к шигеллам Флекснера.
При положительной реакции агглютинации со смесью выделенную культуру
агглютинируют отдельно с каждой сывороткой, входящей в смесь.

Положительная реакция агглютинации с адсорбированной сывороткой к

шигеллам Зонне и Ньюкасл дает право дать ответ. Для установления серовара и
подсеровара шигелл Флекснера необходимо дополнительно поставить реакции
агглютинации с типовыми (I, II, III, IV, V) и групповыми (1-3, 4-6-7, 8)
сыворотками. Например, выделенная культура дала положительную реакцию с
типовой сывороткой II и групповой сывороткой 3, 4. Как видно из таблицы,
выделена культура шигелл Флекснера, серовар 2, подсеровар 1а. Ответ: выделены
шигеллы Флекснера 2а.

При отсутствии агглютинации со смесью № 1 ставят реакцию агглютинации с

другими поливалентными сыворотками.

При постановке реакции агглютинации следует учитывать отношение изучаемой

культуры к манниту и в зависимости от этого использовать ту или иную сыворотку.
Так культуры, не расщепляющие маннит, испытывают с поливалентными
сыворотками к шигеллам дизентерии Григорьева - Шиги и Штутцера - Шмитца (1,
2), Лардж - Сакса (3-7), провизорным типам (8-10).

Культуры, расщепляющие маннит, испытывают со смесью № 1 и

поливалентными сыворотками к шигеллам Бойда.

При наличии агглютинации выделенной культуры одной из этих сывороток

проводят испытание культуры с каждой из сывороток, входящих в поливалентную.
Положительный результат с одной из сывороток определяет серовариант
выделенной культуры.

При использовании сыворотки к шигеллам Бойда агглютинацию начинают с

сывороткой того серовара, который наиболее часто встречается в данной
местности. В нашей стране чаще выделяют шигеллы Бойда серовариантов 4, 5, 7, 9
и 12 (см. рис. 44).

В качестве ускоренных методов микробиологического исследования при

дизентерии применяют люминесцентную микроскопию и биологическую пробу на
морских свинках. При введении вирулентных штаммов шигелл в
конъюнктивальный мешок (под нижнее веко) к концу 1-х суток у животных
развивается конъюнктивит.
 Контрольные вопросы

1. Какой материал служит для бактериологического исследования при

диагностике дизентерии и как его собирают?

2. Расщепление какого углевода дает право давать отрицательный ответ?

3. При помощи каких сывороток можно установить вид, подвид, серовар и

подсеровар шигелл Флекснера?

4. Какие сыворотки входят в смесь № 1?

Задание

Изучите схему исследования дизентерии по дням.

Питательные среды

Среды Плоскирева, Эндо, ЭМС (см. главу 19).

Условно-патогенные бактерии - Л. Б.
Богоявленская
Развитие микробиологии и учения об инфекционных болезнях привело к
представлению о том, что определенные патогенные микроорганизмы являются
возбудителями инфекционных заболеваний с характерной для них клинической
картиной, путями передачи и особенностями распространения (эпидемиологией).
Однако со второй половины XX века получили распространение заболевания,
вызываемые микроорганизмами, обычно сопутствующими человеку и безвредными
для него: кишечной палочкой, постоянно обитающей в кишечнике, стафилококком -
сапрофитом кожных покровов, гемофильной микрофлорой верхних дыхательных
путей и др. Эти микроорганизмы были названы условно-патогенными, так как их
болезнетворное действие проявляется только при определенных условиях:
ослаблении организма хозяина или приобретении особых свойств возбудителем
(устойчивости к антибиотикам, способности к выработке токсических веществ и т.
п.).

Во всем мире отмечают резкое увеличение частоты гнойно-воспалительных

заболеваний, осложняющих течение послеоперационного периода, заживление
ожогов, послеродовой период. Такие заболевания называют клиническими,
поскольку они возникают, как правило, в лечебных учреждениях разного профиля.

К причинам развития таких заболеваний можно отнести изменение иммунной

реактивности человека из-за получения им в течение жизни различных
лекарственных средств, в том числе антибиотиков, гормонов, вакцинных
препаратов. Играют роль также аллергизация организма и развитие дисбактериоза -
нарушения обычного соотношения различной микрофлоры организма. Не случайно
заболевания, обусловленные условно-патогенными бактериями, часто поражают
новорожденных, особенно недоношенных, организм которых еще не имеет
достаточного уровня иммунной защиты.
 Распространение клинических инфекций зависит также от расширения
резервуаров инфекции: современные методы обследования и лечения часто связаны
с инструментальным вмешательством (введение катетеров, эндо- и бронхоскопов,
ингаляторов), при котором требуется особенно тщательное соблюдение асептики и
антисептики.

И, наконец, одна из главных причин проявления патогенного воздействия

комменсалов - изменение их свойств: возникновение устойчивости к
лекарственным препаратам, повышение устойчивости во внешней среде,
приобретение токсических свойств.

В настоящее время круг условно-патогенных микроорганизмов очень широк. К

ним относятся многие представители семейства кишечных (клебсиеллы, протей,
провиденсия, серрация), кокковых (стафилококки, стрептококки группы В,
энтерококки), синегнойная палочка, неспорообразующие анаэробы и др.

Возникновение клинических инфекций связано обычно с нарушением

внутрибольничного режима. Источником инфекции может быть медперсонал,
больные, посетители. Передача инфекции осуществляется через белье,
инструменты, предметы обихода, воздух. Это - экзогенная инфекция, так как
микробы проникают в организм из окружающей среды. В некоторых случаях
возникновение инфекции происходит из-за приобретения патогенных свойств
микрофлорой самого организма. Так, например, после операции микроорганизмы,
находящиеся в дыхательных путях, вследствие застойных явлений и
недостаточного доступа кислорода вызывают пневмонию.

Проявления клинических инфекций, несмотря на множественность возбудителей,

сходны, что затрудняет их распознавание и лечение. Поэтому особое значение
приобретает микробиологическая диагностика, позволяющая определить
возбудителя, назначить рациональное лечение и эффективные мероприятия, чтобы
ограничить распространение инфекции.

Глава 21. Клебсиеллы

Род Klebsiella, относящийся к семейству энтеробактерий, объединяет капсульные
бактерии, вызывающие различные заболевания: пневмонию и гнойно-
воспалительные процессы - К. pneumoniae, риносклерому - К. rinoscleromatis, озену
(зловонный насморк) - К. ozaenae.

Морфология. Клебсиеллы - короткие толстые палочки, размером 0,6-6,0 × 0,3-

1,5 мкм с закругленными концами. Неподвижны. Образуют капсулу. В мазках
располагаются одиночно, попарно или короткими цепочками.

Культивирование. Клебсиеллы - факультативные анаэробы. Хорошо растут на

простых питательных средах при 35-37° С. На плотных средах образуют
куполообразные слизистые колонии, на бульоне - интенсивное помутнение.

Ферментативные свойства. Ферментируют лактозу, расщепляют глюкозу и

маннит с образованием кислоты и газа, разлагают мочевину, не образуют индола и
сероводорода.
 Токсинообразование. Обладают эндотоксином. Вирулентность их зависит от
наличия капсулы - бескапсульные формы менее вирулентны.

Антигенная структура. Клебсиеллы содержат капсульые К- и соматические О-

антигены. Сочетание этих нтигенов обусловливает принадлежность культур к
определенным сероварам. В настоящее время известно 80 К- и 11 О-антигенов.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Благодаря наличию капсулы

клебсиеллы устойчивы и длительно сохраняются в почве, воде, на предметах
обихода. При 65° С погибают в течение часа. Чувствительны к действию растворов
дезинфицирующих веществ (хлорамина, фенола и др.). Отмечается высокая
резистентность к антибиотикам.

Восприимчивость животных. В естественных условиях вызывают заболевания

различных животных: коров, свиней, лошадей (мастит, пневмонию, септицемию).

Источники инфекции. При экзогенной инфекции источником инфекции

являются больной человек и здоровый носитель.

Пути передачи. Контактно-бытовой (грязные руки, предметы обихода). В

детских учреждениях и больницах инфекция часто передается через белье,
инструментарий, игрушки.

Патогенез. Клебсиеллезы развиваются большей частью как вторичная инфекция

у лиц с пониженной сопротивляемостью и у новорожденных (недоношенных).
Бактерии из верхних дыхательных путей и кишечника проникают в различные
органы и кровь и вызывают гнойно-воспалительные процессы, сепсис, менингит.

Иммунитет. Послеинфекционный иммунитет непродолжителен и развивается

только в отношении одного определенного возбудителя (серовара).

Профилактика. Соблюдение санитарно-гигиенического режима в родильных

домах, больницах, детских учреждениях.Специфическая
профилактика отсутствует.

Лечение затруднено в связи с высокой устойчивостью клебсиелл к

антибиотикам. Наиболее эффективно применение гентамицина, канамицина, иногда
ампициллина.

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выделение и идентификация клебсиелл из патологического
материала и объектов внешней среды.

Материал для исследования

1. Мокрота.

2. Слизь из зева, гной из уха, отделяемое раны.

3. Испражнения.
 4. Смывы с предметов окружающей среды.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микробиологический.

2. Серологический.

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Делают мазки, окрашивают по Граму. При наличии амотрицательных палочек

отбирают слизистые колонии (4-5) и пересевают их на скошенный агар и среду
Ворфель - Фергюсона (для выделения чистой культуры) и на комбинированную
среду Рассела (или среду с мочевиной) для определения ферментативных свойств и
подвижности. В пробирку под пробку опускают полоски бумаги, пропитанные
реактивами для определения индолообразования и сероводорода.

Делают высев из глюкозного агара на плотные питательные среды для

проведения (если понадобится) дополнительного исследования.

Третий день исследования

При росте неподвижной культуры, ферментирующей лактозу, глюкозу,

мочевину, не образующей индола и сероводорода, делают посев на среды с
цитратом и малонатом и мазки для определения наличия капсулы. При наличии
капсулы ставят реакцию агглютинации на стекле с агглютинирующими К-
сыворотками. Просматривают дополнительный посев на плотные питательные
среды. Можно выдать ориентировочный ответ: "Выделены клебсиеллы".

Четвертый день исследования

Производят учет результатов посева на среду с цитратом, малонатом (рост) и

другими углеводами (типа Рассела или Олькеницкого). Выдают окончательный
ответ: "Выделены клебсиеллы (К11)".

Серологическая диагностика

На 7-8-й день болезни при подозрении на заболевание риносклеромой ставят

РСК с сывороткой больного в разведении 1:100 - 1:1600 и склеромным
диагностикумом из убитых клебсиелл склеромы. Нарастание титра антител в
динамике заболевания является подтверждением диагноза.

Контрольные вопросы
1. Каковы особенности условно-патогенных бактерий?

2. Чем отличаются клебсиеллы от других энтеробактерий?

Глава 22. Протей

Род Proteus семейства энтеробактерий объединяет несколько видов,
отличающихся способностью ферментировать многие питательные субстраты.

Морфология. Бактерии всех видов этого рода мелкие, полиморфные

грамотрицательные палочки. Средний размер 0,4-0,6 × 1,0-3,0 мкм. Подвижны,
перитрихи. Спор и капсул не образуют.

Культивирование. Протеи - факультативные анаэробы, хорошо растут на

простых питательных средах при 20-37° С. Некоторые виды дают ползучий рост на
плотной питательной среде, а при посеве в конденсационную воду скошенного
агара - рост по всей поверхности среды (способ выделения чистой культуры по
Шукевичу).

Ферментативные свойства. Обладают сахаролитическими и

протеолитическими ферментами.

Токсинообразование. Содержат эндотоксин.

Антигенная структура. Протеи содержат О- и Н-антигены. В настоящее время

известно более 150 О-антигенов и около 80 Н-антигенов. Сочетание О- и Н-
антигенов в микробной клетке определяет принадлежность возбудителей к той или
иной О-серогруппе или серовару.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Сравнительно устойчивы во

внешней среде. Переносят нагревание до 60° С в течение часа и воздействие слабых
растворов дезинфицирующих веществ. Обладают устойчивостью ко многим
антибиотикам.
 Восприимчивость животных. Заболевания животных, вызванные протеем, не
описаны.

Источники инфекции. Протеи обычно попадают во внешнюю среду с

испражнениями человека. Таким образом, человек - источник инфекции.

Пути передачи. Пищевой, контактно-бытовой (грязные руки, белье, предметы

обихода, хирургические инструменты).

Патогенез. Протей вызывает различные формы инфекции. При попадании в

организм через рот, особенно с пищевыми продуктами, в которых произошло
размножение возбудителя, протей вызывает пищевые токсикоинфекции. При
внедрении в организм через раневую и ожоговую поверхность развиваются гнойно-
воспалительные процессы в различных органах.

Профилактика. Соблюдение санитарно-гигиенического режима на пищевых

предприятиях, в больницах и детских учреждениях. Специфическая профилактика
отсутствует.

Лечение. Гентамицин, карбенициллин, канамицин и др. При поражении

мочеполовой области применяют препараты нитрофуранового ряда: фурагин, 5-
НОК и др. Имеется протейный фаг, применение которого дает хороший эффект.

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выделение и идентификация протея из патологического
материала и объектов внешней среды.

Материал для исследования

1. Испражнения.

2. Рвотные массы.

3. Моча.

3. Слизь из зева, гной из уха, отделяемое раны.

5. Секционный материал.

6. Смывы с предметов окружающей среды.

Способы сбора материала

 Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микробиологический.

2. Серологический.

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Отмечают характер роста на питательных средах (роение - вуалеобразный налет).

Выделяют отдельные колонии или часть сплошного роста на комбинированную

среду Рассела (с мочевиной) или среду Олькеницкого, делают посев в
конденсационную воду пробирки со скошенным агаром (по Шукевичу).

Третий день исследования

Делают мазок и окрашивают его по Граму. При наличии грамотрицательных

мелких палочек учитывают характер роста на среде Рассела или Олькеницкого и
наличие роста в пробирке с посевом по Шукевичу. Протей не ферментирует
лактозу, сбраживает глюкозу с образованием газа, большей частью гидролизует
мочевину.
 В пробе по Шукевичу - рост по всей поверхности скошенного агара.

Производят посев на дополнительные среды "пестрого ряда": маннит, бульон

(для определения индолообразования и образования сероводорода вкладывают в
пробирку бумажки, смоченные соответствующими реактивами), полужидкий агар,
желатин. Делают посев на среду с аминокислотой фенилаланином.

Четвертый день исследования

Учитывают результаты посева: протей не ферментирует маннит (большинство

штаммов), образует индол и сероводород, подвижен, разжижает желатин и образует
фермент фенилаланиндезаминазу, изменяющую цвет в пробирке с аминокислотой
фенилаланином. При указанных результатах можно отнести выделенную культуру
к роду Proteus.

Заключительным этапом исследования является постановка реакции

агглютинации на стекле с агглютинирующими сыворотками к бактериям рода
Proteus. Сначала ставят реакцию агглютинации с поливалентными О-сыворотками.
При положительной реакции с одной из них повторяют реакцию агглютинации с
каждой из типовых О-сывороток, входящих в поливалентную. После определения
О-группы проводят реакцию с Н-сыворотками и определяют серовар. Выдают
ответ: "Выделены Proteus 09:H 1,2".

Контрольные вопросы
1. Какие заболевания вызывает протей?

Глава 23. Иерсинии энтероколитика

Род Yersinia относится к семейству энтеробактерий, включает несколько видов:
Yersinia pestis - возбудитель чумы; Yersinia pseudotuberculosis - возбудитель
псевдотуберкулеза, Yersinia enterocolitica и др.

Yersinia enterocolitica широко распространены в природе. Обычно они обитают в

организме грызунов, часто встречаются у домашних животных.

Морфология. Мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами.

Средний размер 0,8-1,2 × 0,3-0,7 мкм, но в старых культурах могут быть длиннее и
иметь вид нитей. Подвижны. Спор не образуют.

Культивирование. Факультативные анаэробы. Хорошо растут на простых

питательных средах. Наиболее благоприятна для роста температура 22-28° С.

На МПА образуют мелкие блестящие бесцветные колонии (росинки),

увеличивающиеся при удлинении сроков выращивания (при 22-25° С). При
культивировании при 37° С колонии непрозрачны, имеют неровный фестончатый
край и выпуклый центр.

Могут расти при высоком содержании натрия хлорида в среде (до 4%).
 Ферментативные свойства. Расщепляют глюкозу без образования газа, не
ферментируют сахарозу. Сероводород не образуют, образование индола
непостоянно.

Токсинообразование. Содержат эндотоксин. Некоторые штаммы продуцируют

экзотоксин.

Антигенная структура. Y. enterocolitica имеют О-, К- и Н-антигены. О-

соматический антиген является липополисахаридом. Возбудители заболеваний
человека чаще всего принадлежат к сероварам О9, О3, О5.

Устойчивость к факторам окружающей среды. К воздействию высокой

температуры неустойчивы. При 100° С погибают мгновенно, при нагревании до 60-
80° С - через 15-20 мин. Хорошо сохраняются при низкой температуре (-15 -20° С),
при 4-14° С не только сохраняются, но и размножаются. Прямой солнечный свет
убивает их в течение 30 мин, рассеянный - через 6-8 ч. Быстро погибают при
высыхании. В пищевых продуктах могут длительно сохраняться и даже
размножаться.

Растворы дезинфицирующих веществ (сулема, хлорамин, фенол) убивают

иерсинии за несколько минут.

Восприимчивость животных. Лабораторные животные практически не

чувствительны к Y. enterocolitica. В естественных условиях они могут вызвать
тяжелые заболевания грызунов, свиней, кошек, собак, часто со смертельным
исходом.

Источники инфекции. Чаще больные животные, реже человек.

Пути передачи. Пищевой.

Патогенез. Попадая через рот в желудочно-кишечный тракт, иерсинии

размножаются. Иногда они проникают в эпителиальные клетки кишечника и
размножаются внутри них. Эндотоксин и токсические вещества, вырабатываемые
иерсиниями, вызывают явления острого гастроэнтероколита. При проникновении
возбудителей в кровь развиваются бактериемия и генерализованный процесс, при
котором поражаются разные органы: печень, селезенка и др.

Профилактика. Санитарный контроль за хранением и обработкой пищевых

продуктов. Соблюдение санитарно-гигиенического режима на предприятиях
общественного питания и правил личной гигиены.

Специфическая профилактика отсутствует.

Лечение. Антибиотики и симптоматическое лечение.

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выделение и идентификация иерсинии из патологического
материала.
 Материал для исследования

1. Испражнения.

2. Рвотные массы и промывные воды желудка.

3. Кровь.

4. Моча.

5. Слизь из зева и носа, отделяемое раны.

6. Секционный материал.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основной метод исследования

Микробиологический

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Просматривают посевы на среде Эндо, ЭМС. Выбирают мелкие круглые

блестящие колонии. Выделяют на комбинированную среду Рассела или
Олькеницкого. Чашки оставляют при 20-28° С. Делают высев со среды обогащения
на среды Эндо или ЭМС.

Третий день исследования

 Повторно просматривают чашки с посевами. Выбирают более крупные колонии
(0,1-0,2 мм), круглые с ровным краем, блестящие с розоватым оттенком. Выделяют
на среду Рассела или Олькеницкого. Просматривают чашки с посевами со среды
обогащения, выбирают вышеописанные колонии и выделяют их на среду Рассела
или Олькеницкого.

Просматривают посевы на среде Рассела и Олькеницкого. Делают мазки и

окрашивают их по Граму. При наличии мелких грамотрицательных палочек (иногда
полиморфных), не ферментирующих лактозу, ферментирующих глюкозу и
мочевину, не образующих сероводород, делают пересев для определения
подвижности (при 18-20° С и 37° С) и в среды Гисса (маннит, мальтоза, сахароза,
рамноза, желатин, цитрат).

Четвертый день исследования

Повторяют просмотр чашек и комбинированных сред. Учитывают результаты

роста на средах Гисса, агаре для определения подвижности, желатине.

При выделении грамотрицательных палочек, не расщепляющих лактозу,

рамнозу, не образующих сероводорода, ферментирующих глюкозу, маннит,
сахарозу, подвижных при 22° С и неподвижных при 37° С, дают ответ: "Выделены
иерсинии энтероколитика".

Контрольные вопросы
1. Каковы особенности иерсинии энтероколитика?

Глава 24. Синегнойная палочка

Синегнойная палочка - Pseudomonas aeruginosa относится к семейству
Pseudomonadoceae, роду Pseudomonas.

Эти бактерии типичные условно-патогенные микроорганизмы. Они широко

распространены во внешней среде, постоянно обитают в организме человека и
животных.

Морфология. Мелкие грамотрицательные палочки. Средний размер 1,5-3,0 ×

0,5-0,8 мкм. Подвижны, лофотрихи. Спор не образуют. Иногда образуют
капсулоподобную внеклеточную слизь.

Культивирование. Строгие аэробы. Хорошо растут на простых питательных

средах. Оптимальная температура роста 37° С, но могут расти и при 5-42° С. На
МПА образуют колонии размером 2-5 мм, круглые, полупрозрачные, голубовато-
серые с перламутровым оттенком; на МПБ дают помутнение и образуют пленку.

Характерным признаком P. aeruginosa является пигменто- и ароматообразование.

Большинство штаммов образует сине-зеленый пигмент - пиоцианин,
окрашивающий питательную среду. Пиоцианин растворим в воде. Он обладает
антагонистическими свойствами в отношении многих бактерий, но токсичен и
поэтому не используется с лечебной целью. Почти все штаммы P. aeruginosa имеют
характерный запах жасмина.
 Ферментативные свойства. Ферментирует только один углевод - глюкозу.
Протеолитическая активность хорошо выражена: разжижает желатин и свернутую
сыворотку, свертывает молоко. Дает положительную реакцию на
цитохромоксидазу.

Токсинообразование. Образует токсины, обладающие гемолитическим и

цитотоксическим действием и лейкоцидин, лизирующий лейкоциты человека.
Имеет эндотоксин.

Антигенная структура. P. aeruginosa обладает О- и Н-антигенами.

Принадлежность выделенной культуры к определенной О-серогруппе
устанавливают в реакции агглютинации с помощью О-сывороток, выпускаемых в
нашей стране.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При 60° С погибает в течение

15 мин. Выдерживает УФ-облучение. 2% раствор фенола губит синегнойную
палочку. Длительно сохраняется в ожоговых корочках и пыли помещений (до 2
нед). Устойчив к большинству антибиотиков.

Восприимчивость животных. Кролики, белые мыши и морские свинки

чувствительны к P. aeruginosa.

Источники инфекции. Человек (больной и носитель).

Пути передачи. В основном непрямой контакт. Имеет значение и воздушно-

пылевой путь.

Патогенез. Синегнойная палочка вызывает гнойно-воспалительные процессы,

локализация которых зависит от входных ворот инфекции: ожог, рана, дыхательные
пути и т. д.

Заболевания обычно развиваются у лиц с пониженной сопротивляемостью,

большей частью в результате внутрибольничного заражения: холециститы,
циститы, пиелонефриты, гнойно-воспалительные осложнения после оперативного
вмешательства и ожогов, сепсис и пр.

Иммунитет. Малонапряженный.

Профилактика. Соблюдение санитарно-гигиенического режима в стационарах.

Лечение. Антибиотики (карбенициллин, полимиксин, гентамицин и др.).

Хороший эффект дает введение плазмы доноров, вакцинированных против P.
aeruginosa и применение бактериофага (пиофаг).

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление и идентификация синегнойной палочки из
патологического материала и объектов внешней среды.

Материал для исследования

 1. Слизь из зева и носа, отделяемое раны.

2. Кровь.

3. Моча.

4. Секционный материал.

5. Смывы с предметов окружающей среды и рук персонала.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основной метод исследования

Микробиологический.

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Просматривают чашки и пробирки с посевами. Отбирают чашки, в которых

среда окрашена в синевато-зеленоватый цвет и имеет запах жасмина (земляничного
мыла). Дают ориентировочный ответ: "Выделена культура P. aeruginosa".

Выделяют колонии на пробирки с лактозой и на пробирки со скошенным агаром.

Заливают вазелиновым маслом (создают анаэробные условия).
 Если на чашках нет роста или сомнительный результат, отбирают пробирки с
бульоном с признаками роста и высевают на чашки с питательным агаром.
Просматривают флаконы, при наличии признаков роста делают высев на чашки с
питательным агаром.

Третий день исследования

Отбирают пробирки, в которых лактоза не расщеплена. Из культуры в пробирке

со скошенным агаром делают мазок, окрашивают по Граму - наличие
грамотрицательных палочек подтверждает выделение P. aeruginosa. Ставят пробу на
цитохромоксидазу. Проба должна быть положительной.

По совокупности всех признаков: наличие сине-зеленого пигмента, запах

жасмина, грамотрицательные палочки, отсутствие расщепления лактозы в
анаэробных условиях, положительная проба на цитохромоксидазу выдают ответ:
"Выделена культура P. aeruginosa".

Если исследование не закончено, продолжают по той же схеме.

Контрольные вопросы

1. В чемВозбудители особо опасных инфекций - Ф. К.

Черкес
К особо опасным инфекциям относят холеру и ряд зоонозных заболеваний: чуму,
туляремию, бруцеллез и сибирскую язву. Работа с особо опасными инфекциями
регламентируется специальной инструкцией Министерства здравоохранения СССР.
Работу проводят в специальных лабораториях.

Забор материала и лабораторные исследования выполняют в специальных

защитных костюмах. Костюм состоит из комбинезона, халата, резиновых сапог,
очков-консервов, резиновых перчаток, полотенца, смоченного в дезинфицирующем
растворе, косынки и ватно-марлевой маски, закрывающей рот, нос и подбородок
(рис. 45).
 Рис. 45. Противочумный костюм I типа

Надевание и снятие элементов противочумного костюма проводят в

определенном порядке. При раздевании костюма все снятые вещи погружают в 5%
раствор лизола, а очки - в емкость с 70% этиловым спиртом, после чего одежду
автоклавируют.

Посуда, предназначенная для забора материала, должна быть предварительно

проверена на целостность и этикетирована до внесения в нее материала (в этикетке
отмечают все данные о больном, время забора и подпись медицинского работника,
сделавшего забор). После внесения материала посуду закрывают пробками и
парафинируют.

Предметное стекло надписывают до нанесения мазка.

Посуду с собранным материалом следует обернуть салфеткой, смоченной

дезинфицирующим раствором (5% раствор лизола или карболовой кислоты).
Пробирки с засеянным материалом укладывают в металлические пеналы, а чашки
Петри - в металлические банки. На пеналах и банках отмечают "верх".

Пересылают собранный материал специальным транспортом или со

специальным нарочным.

особенности синегнойной палочки?

 Глава 25. Возбудители холеры
Вид Vibrio cholerae относится к семейству Vibrionaceae, роду Vibrio.

Возбудители холеры представлены двумя биоварами. Биовар V. cholerae выделен

и изучен Р. Кохом (1883) и биовар eltor выделен Ф. Готшлихтом (1906). В течение
длительного времени биовар Эль-Тор не считали возбудителем холеры. В 1962 г. по
решению ВОЗ он был признан биоваром вибриона холеры.

В последнее время из воды и других объектов внешней среды выделены НАГ-

вибрионы, которые еще не получили окончательного наименования, но их роль в
острых кишечных заболеваниях установлена. Природа НАГ-вибрионов изучается.
По морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам они не
отличаются от холерных вибрионов, имеют с ними общий Н-антиген. О-антигены у
них разные. По О-антигену установлен 60 О-групп НАГ-вибрионов.

Морфология. Холерные вибрионы - небольшие (1-3 × 0,2-0,4 мкм) слегка

изогнутые палочки, имеют вид запятой, очень полиморфны. На искусственных
питательных средах, особенно в старых культурах, они могут иметь вид шаров,
зерен, нитей, спиралей. Холерные вибрионы очень подвижны. Монотрихи - жгутик
в несколько раз превышает длину клетки. Спор и капсул не образуют.
Грамотрицательны. В окрашенных мазках располагаются в виде стаи рыб (см. рис.
51). При электронной микроскопии установлено, что между стенкой и цитоплазмой
находятся вакуоли. Считают, что в этих вакуолях синтезируется экзотоксин.

Культивирование. Холерные вибрионы - факультативные анаэробы. К

питательным средам неприхотливы. Щелочелюбивы. Размножаются при
температуре 37-39° С и рН 8-9. Хорошо растут на МПА и МПБ. Элективной средой
является щелочная 1% пептонная вода. На поверхности этой среды они образуют
нежную голубоватую пленку. На плотной среде TBRS
(тиосульфатцитратсахарозный агар с добавлением солей желчи) образуются
колонии желтого цвета на фоне голубоватой среды. Размножаются быстро: в
жидких питательных средах 6-8 ч, на плотных - 12-14 ч (на щелочных средах рост
холерных вибрионов опережает рост других бактерий). Холерные вибрионы
диссоциируют из S- в R-форму. Этот процесс сопровождается изменением
антигенной структуры.

Ферментативные свойства. Холерные вибрионы биохимически активны. Они

обладают сахаролитическими, протеолитическими и диастатическими свойствами.
Сахаролитические свойства выражаются в расщеплении Сахаров до образования
кислоты. Ферментация глюкозы, сахарозы, маннита, маннозы и отсутствие
ферментации арабинозы являются важным диагностическим признаком.
Протеолитические свойства: холерные вибрионы разжижают желатин, разлагают
триптофан до образования индола, продуцируют оксидазу, восстанавливают
нитраты в нитриты, свертывают молоко. Сероводород не образуют. Диастатические
свойства выражаются в расщеплении растворимого крахмала.

Холерный вибрион продуцирует ферменты патогенности: фибринолизин,

плазмокоагулазу, гиалуронидазу, лецитиназу, коллагеназу и др.
 Токсинообразование. Холерные вибрионы продуцируют токсины трех типов.
Токсин I типа - эндотоксин, выделяется при разрушении микробной клетки,
термостабилен (липополисахарид). Считают, что он способствует развитию
антибактериального иммунитета. Токсин И типа - экзотоксин (холероген)
термолабилен, обладает энтеротоксическим действием и играет важную роль в
патогенезе холеры (усиливает функцию секреторных клеток тонкого кишечника,
что приводит к обезвоживанию организма). Токсин III типа термостабилен,
считают, что он подавляет активный транспорт натрия через эпителий кишечника.

Антигенная структура. Холерные вибрионы имеют термостабильный

соматический О-антиген и термолабильный Н-антиген. Н-антиген не
специфический и является общим для всего рода Vibrio. О-антиген обладает
видовой и типовой специфичностью. По О-антигену холерные вибрионы делят на
54 группы. Vibrio cholerae и Vibrio eltor относятся к О1 группе. Внутри О1 группы
различают три компонента - А, В, С, по сочетанию которых выделяют три серовара.
Сочетание АВ - серовар Огава, сочетание АС - серовар Инаба, сочетание ABC -
серовар Гикокшима.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При температуре 60° С

холерные вибрионы погибают в течение 5 мин, при кипячении - мгновенно. Низкие
температуры они переносят хорошо. Во льду сохраняются несколько месяцев, в
морской и речной воде - несколько недель, в кишечнике мух - 4-5 дней. К
высушиванию и солнечному свету холерные вибрионы очень чувствительны.
Общепринятые концентрации дезинфицирующих веществ убивают их быстро.
Однако при работе с возбудителем холеры пользуются дезинфицирующими
растворами большей концентрации. Холерные вибрионы чувствительны к кислотам
(хлороводородной кислоте и др.). Вибрион холеры Эль-Тор более устойчив.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные не болеют

холерой. В экспериментальных условиях внутрибрюшинное введение холерных
вибрионов кроликам и морским свинкам сопровождается выраженным токсикозом,
который приводит их к гибели.

Источники инфекции и пути передачи. Единственным источником холеры

является человек, который выделяет вибрион холеры во внешнюю среду в период
заболевания либо носительства. При холере, вызванной вибрионом Эль-Тор,
отмечается длительное носительство. Заражение человека происходит через
продукты (овощи, фрукты), воду и другие объекты внешней среды.

Холера - это давно известная инфекция, которая периодически распространялась

на многие страны и континенты и вызывала гибель миллионов людей. Известны
несколько пандемий холеры. В 1917-1926 гг. было зарегистрировано 6 пандемий
холеры. Эти пандемии вызывались классическим вибрионом Коха. В 60-х годах XX
века начал распространяться возбудитель холеры вибрион Эль-Тор. В 70-х годах
зарегистрированы случаи холеры, вызванные вибрионом Эль-Тор в некоторых
городах Советского Союза.

Патогенез. Заражение происходит через рот. Попав в желудок, часть холерных

бактерий гибнет в кислой среде желудка, а часть проникает в кишечник, где
щелочная среда и обилие продуктов распада белков (в частности, пептон)
способствуют их размножению.
 На слизистой оболочке тонкой кишки накапливается большое количество
холерных вибрионов и токсина, образующегося при их разрушении. Токсин
нарушает функцию Слизистой оболочки, она гиперемируется, увеличивается
проницаемость эпителия кишечника, нарушается секреторная и всасывающая
функция его. Появляются профузные поносы, повторные рвоты, которые выводят
из организма большое количество воды и солей (калия и натрия). Потеря большого
количества жидкости и солей приводит к высушиванию ткани, сгущению крови,
нарушению минерального обмена, поражению центральной и вегетативной
нервных систем и других явлений интоксикации. От степени интоксикации зависит
форма холеры, которая протекает в виде холерного энтерита, гастроэнтерита,
альгидной и сухой формы (см. учебник инфекционных болезней).

Иммунитет. Стойкий, носит антимикробный и антитоксический характер,

связанный с наличием агглютининов, вибриолизинов, антитоксинов и других
антител. Кроме того, в иммунитете большое значение придают факторам местной
защиты.

Профилактика. Проведение общих противоэпидемических мероприятий: раннее

выявление больных, изоляция и госпитализация, дезинфекция, обсервация; охрана
водоисточников, надзор за пищевыми продуктами, охрана границ при
эпидемических вспышках и т. п. Для специфической профилактики используют
убитую холерную вакцину (холероген-анатоксин в сочетании с О-антигеном
холерного вибриона).

Лечение. Антибиотики тетрациклинового ряда, а также введение жидкости и

электролитов (солей калия и натрия).

Контрольные вопросы
1. Какова морфологическая характеристика холерного вибриона? Какие Вы
знаете биовары холерного вибриона?

2. Какая среда является элективной и средой накопления?

3. Каковы условия выращивания и культуральные свойства холерных вибрионов?

4. Каковы ферментативные свойства холерных вибрионов?

5. Какие токсины образуют холерные вибрионы?

Микробиологическое исследование
Холерные вибрионы очень чувствительны к дезинфицирующим веществам,
поэтому в посуде, куда помещают исследуемый материал, не должно содержаться
даже следов дезинфицирующих веществ. Время от взятия материала до проведения
посевов не должно превышать 3 ч. Лучше материал сразу брать в 1% пептонную
воду, являющуюся средой накопления (можно использовать другие среды
накопления - щелочную консервированную жидкость с морской солью и др.).

Цель исследования: выявление холерного вибриона и определение его серовара.

 Материал для исследования

1. Испражнения.

2. Рвотные массы.

3. Секционный материал.

Кроме того, обязательно исследуют воду, пищевые продукты и смывы с объектов

внешней среды.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

При массовых обследованиях по эпидпоказаниям для выявления носительства

можно делать групповые посевы. Материал от 4-5 обследуемых засевают в одну
колбу с 100 мл 1% пептонной воды (исследование ведут как один анализ). При
положительном ответе материал снова берут и засевают индивидуально.

При пересылке исследуемого материала банки с материалом плотно укладывают

в металлическую посуду (бюкс, кастрюлю), прилагают сопроводительный документ
с перечислением отправляемых материалов, указанием предполагаемого диагноза,
времени и места взятия материала и фамилией собиравшего материал.

Основные методы исследования

1. Бактериологический.
 2. Микроскопический.

3. Серологический.

Исследование проводят поэтапно. Интервалы между этапами должны быть

максимально короткими. Пересевы на жидкие среды проводят через 6-8 ч, а на
плотные - через 12-18 ч (поэтапное исследование требует круглосуточной работы).

Ход исследования
Этап I

Этап I

Этап II

Через 6-8 ч посевы на 1% пептонной воде вынимают из термостата. Пленку или

материал с поверхности среды засевают на вторую пептонную воду и делают мазок,
фиксируют, окрашивают карболовым фуксином и по Граму. Микроскопируют.
Если в мазках обнаруживают сходные с холерным вибрионом подвижные бактерии,
то ставят ориентировочную реакцию агглютинации с сывороткой. Для этого на
обезжиренное предметное стекло наносят одну каплю О-сыворотки, разведенной в
100 раз. Контролем служит капля изотонического раствора натрия хлорида. В обе
капли вносят материал из пленки и тщательно эмульгируют. При наличии в капле
сыворотки агглютинации и отсутствии ее в контроле пленку засевают на щелочной
агар и инкубируют в термостате.

Этап III

Через 12-14 ч вынимают посевы из термостата. Изучают рост посевов на плотной

питательной среде. При наличии подозрительных колоний отбирают не менее пяти
и ставят реакцию агглютинации с О-сывороткой, разведенной 1:100, при наличии
положительной реакции агглютинации можно поставить ориентировочную
реакцию агглютинации с типовыми сыворотками Огава и Инаба (в разведении
1:50). Наличие положительной агглютинации при типичной морфологии и
культуральных свойствах дает право дать предварительный положительный ответ.
 Кроме этого материал из типичных колоний (давших положительную реакцию
агглютинации) высевают на полиуглеводную среду (содержит 2-3 сахара) для
выделения чистой культуры, а также в бульон.

Бульон инкубируют 3-4 ч при 37° С. С молодой бульонной культурой ставят

развернутую реакцию агглютинации.

Этап IV

Через 12-14 ч вынимают посевы из термостата. На полиуглеводной среде

изменяется цвет столбика (расщепление сахарозы). Скошенная часть не изменяется.
Полученную культуру идентифицируют.

Идентификация культуры

Идентификация культуры производится по следующим тестам.

1. Изучение морфологических свойств, подвижности висячей и раздавленной

капле).

2. Изучение культуральных свойств.

3. Изучение антигенных свойств (в реакции агглютинации).

4. Изучение сахаролитических свойств.

5. Определение протеолитических свойств.

6. Определение гемолитических свойств.

7. Определение уреазной активности.

8. Изучение восстановительных свойств (реакция холера-рот).

9. Изучение диастатической активности.

10. Постановка реакции Фогеса - Проскауэра.

11. Проба на оксидазу.

12. Определение чувствительности к фагам.

13. Определение чувствительности к полимиксину.

Изучение морфологических свойств, подвижности и культуральных

свойств проводят с первых этапов исследования.

Определение антигенных свойств. Ставят развернутую реакцию агглютинации

с видоспецифической холерной О-сывороткой и типоспецифическими сыворотками
Огава и Инаба.
 Реакцию ставят в объеме 1 мл. Сыворотки разводят начиная с 1:50 до титра. К
каждому разведению добавляют по 2 капли выделенной культуры, реакцию
сопровождают контролем сыворотки и контролем культуры. Учитывают реакцию
через 18-20 ч. Положительная реакция должна быть не менее половины титра
сыворотки.

Ферментацию углеводов определяют на средах Гисса. Результаты учитывают

через 6-14 ч. Расщепление глюкозы, сахарозы, маннита, мальтозы и манозы при
отсутствии ферментации арабинозы является диагностическим показателем.

Протеолитические свойства определяют путем посева выделенной культуры в

столбик желатина; инкубируют при 22° С 2-3 дня. Положительная реакция
выражается в воронкообразном разжижении желатина.

Гемолитические свойства определяют путем добавления к 1 мл 24-часовой

бульонной культуры 1 мл 1% взвеси эритроцитов барана. Контролем служит 1 мл
бульона + 1 мл 1% взвеси эритроцитов. Обе пробирки инкубируют 2 ч при 37° С.
Затем переносят на холод.

Учет производят через 16 ч. При положительном результате в опытной пробирке

(V. eltor) эритроциты гемолизируются (лаковая кровь), в контрольной -
неизмененная взвесь эритроцитов. V. cholerae гемолиза не вызывает.

Уреазную активность определяют посевом выделенной культуры на среду с

мочевиной. Положительный результат характеризуется изменением желтого цвета
среды в красный.

Изучение восстановительных свойств (реакция холера-рот). Холерные

вибрионы восстанавливают нитраты в нитриты. При добавлении к 24-часовой
культуре концентрированной серной кислоты из расчета 2-3 капли на 1 мл
культуры освобождается азотистая кислота, которая, связываясь к индолом,
образует новое соединение (нитрозоиндол). Среда окрашивается в рубиново-
красный цвет.

Диастатическую активность определяют на среде Кодама, содержащей

растворимый крахмал. Индикатором служит раствор Люголя. Холерные вибрионы
расщепляют крахмал, поэтому цвет среды после прибавления раствора Люголя не
изменяется.

Реакция Фогеса - Проскауэра. Исследуемую культуру засевают в среду Кларка.

Посев ставят в термостат. После 2-3 дней инкубации посевы вынимают из
термостата и к 1 мл выросшей культуры добавляют 0,6 мл α-нафтола и 0,2 мл 40%
раствора гидроксида натрия. Положительная реакция характеризуется появлением
красного окрашивания (за счет ацетилметилкарбинола).

Проба на оксидазу. На поверхность 18-часовой агаровой культуры наносят

каплю 1% водного раствора параамино-диметиланилина (гидрохлорида или
оксалата), добавляют каплю 1% спиртового раствора α-нафтола. При
положительной реакции на оксидазу через 2-3 мин культура окрашивается в ярко-
синий цвет.
 Определение чувствительности к фагам. Исследуемую культуру засевают на
щелочной агар и наносят бактериофаг С Мукерджи IV типа и бактериофаг Эль-Тор.
Реакцию учитывают через 14-16 ч (см. главу 8; табл. 40).

Таблица 40. Чувствительность к холерным фагам

Примечание. + лизируется; - не лизируется.

Определение чувствительности к полимиксину. В расплавленный и

остуженный агар добавляют полимиксин (из расчета 50 ед. в 1 мл среды). Среду
размешивают и разливают в чашки Петри. На застывшую среду петлей засевают
выделенную культуру и инкубируют в термостате. Через 8-10 ч вынимают посевы
из термостата. Холерные вибрионы не растут в присутствии полимиксина.
Вибрионы Эль-Тор вырастают (табл. 41).

Таблица 41. Дифференциальные свойства V. cholerae, V. eltor и нехолерных вибрионов

Ускоренные методы исследования

Реакция иммобилизации. На предметное стекло наносят 2 капли испражнений

или материала с поверхности пептонной воды. К 1-й капле добавляют одну каплю
О-сыворотки (1:100), ко 2-й - каплю изотонического раствора натрия хлорида.
Каждую каплю эмульгируют пастеровской пипеткой или петлей, накрывают
покровным стеклом и просматривают под микроскопом. При положительном
результате в первой капле прекращается движение вибрионов (действие
специфической сыворотки), во второй наблюдается движение.

Люминесцентно-серологический метод. См. главу 2.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные методы идентификации холерных вибрионов?

 2. Результаты каких исследований дают право дать предварительный ответ?

3. Какие методы служат для дифференциации классического холерного вибриона

от вибриона Эль-Тор?

4. На чем основан ускоренный метод иммобилизации холерных вибрионов?

Питательные среды

1% пептонная вода. На 1 л дистиллированной воды берут 10 г пептона, 5 г

хлорида натрия, 0,1 г нитрата калия и карбоната натрия до установления рН 9,0.
Полученную среду разливают во флаконы и пробирки. Стерилизуют в автоклаве 20
мин при 120° С.

Щелочной агар. К 1л МП А добавляют 30 мл 10% раствора карбоната натрия,

кипятят 45 мин, устанавливают рН 8,0-9,0. Разливают во флаконы и пробирки.
Стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120° С.

Среда Кларка. 5 г двузамещенного фосфата калия, 5 г пептона, 5 г глюкозы

растворяют в 1 л дистиллированной воды. Среду доводят до кипения, фильтруют,
разливают в пробирки. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин.

Среда ТСВ. Сухая среда (рН 8,6) выпускается фирмой Дифко (США).

Глава 26. Возбудитель чумы

Бактерии чумы открыты были Иерсеном в Гонконге в 1894 г. и в честь него весь
род был назван иерсиниями. Большой вклад в изучение чумы внесли русские
ученые Д. К. Заболотный, Н. К. Клодницкий, И. А. Лебединский, Н. Ф. Гамалея и
индийские ученые, предложившие для лечения чумы стрептомицин.

К роду иерсиний относятся три вида бактерий:

1. Yersiniae pestis - возбудители чумы.

2. Yersiniae pseudotuberculosis - возбудители псевдотуберкулеза.

3. Yersiniae enterocolitica - возбудители кишечных инфекций.

Все представители этого рода грамотрицательные палочки, имеющие чаще

овоидную форму и величину 0,4-0,7 × 1-2 мкм. Спор не образуют. У возбудителей
псевдотуберкулеза и иерсиний энтероколитика имеются жгутики. Все иерсиний
неприхотливы к питательным средам. Ферментативно они активны: расщепляют
ряд углеводов с образованием кислоты.

Морфология. Возбудитель чумы - бвоидная палочка, средний размер 0,3-0,6 × 1-

2 мкм. Они очень полиморфны. В мазках с плотной питательной среды палочки
бывают удлиненными, нитевидными, описаны также фильтрующиеся формы.
Бактерии чумы не имеют спор, жгутиков, образуют нежную капсулу.
Грамотрицательны. Ввиду неравномерного распределения цитоплазмы концы
палочек окрашиваются интенсивнее. Такая биполярность хорошо видна при
окраске их метиленовым синим (рис. 46).

Рис. 46. Морфологические и культуральные свойства возбудителя чумы (Jersinia

pestis). а - бактерии чумы (окраска синим Леффлера); б - рост на МПА: 1 - через 24 ч
в виде битого стекла; 2 - через 48 ч в виде кружевного платочка; в - рост на МПБ -
'сталактитовый'

Культивирование. Возбудители чумы - факультативные анаэробы. Не

прихотливы, растут на обычных питательных средах при температуре 28-30° С, рН
среды 7,0-7,2. Рост появляется через 12-14 ч. Для ускорения роста применяют
стимуляторы (экстракты некоторых бактерий, например сарцин,
свежегемолизированную кровь, сульфит натрия и др.). Элективными средами для
выращивания возбудителей чумы являются казеиновые среды и гидролизаты
кровяных сгустков. Выросшие колонии через 18-24 ч инкубации имеют вид мелких
глыбок с неровными краями, через 48 ч края колоний приобретают фестончатый
вид и напоминают "кружевной платочек" (см. рис. 46).

На скошенном агаре культура растет в виде вязкого налета; на НПБ - в виде

рыхлых хлопьев, взвешенных в прозрачной жидкости. При более длительном росте
с поверхности среды спускаются рыхлые нити: "сталактитовый рост". Бактерии
чумы растут в R-форме, которая является вирулентной. Однако они легко
диссоциируют под влиянием ряда факторов, например бактериофага и через О-
форму переходят в S-авирулентную форму.

Ферментативные свойства. У чумных бактерий выражена сахаролитическая

активность - они расщепляют сахарозу, мальтозу, арабинозу, рамнозу, глюкозу (не
всегда) и маннит с образованием кислоты. Различают два варианта бактерий чумы -
разлагающие и не разлагающие глицерин. Протеолитические свойства выражены
слабо: они не разжижают желатин, не свертывают молоко, образуют сероводород.

Бактерии чумы продуцируют фибринолизин, гемолизин, гиалуронидазу,

коагулазу.

Токсинообразование. Токсин чумной палочки представляет собой особый

белок, сочетающий свойства экзо- и эндотоксина, он состоит из двух белковых
фракций (А и В), различающихся по аминокислотному составу и антигенным
свойствам. Он очень токсичен для человека. Чумный токсин называют мышиный
яд, так как мыши высоко чувствительны к его действию.
 Антигенная структура бактерий чумы сложна. Микробы чумы содержат около
десяти различных антигенов: фракции F, V, W и др. Фракция F - основной
компонент, связанный с капсулой; V и W компоненты препятствуют
фагоцитированию клетки. У бактерий чумы имеются общие антигены с
возбудителем псевдотуберкулеза, эшерихиями, шигеллами и эритроцитами
человека О-группы.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Высокие температуры (100° С)

губят чумные бактерии мгновенно, 80° С - через 5 мин. Низкие температуры
чумные бактерии переносят хорошо: при 0° С сохраняются 6 мес, в замороженных
трупах - год и больше. Прямые солнечные лучи убивают их через 2-3 ч. Чумные
бактерии очень чувствительны к высыханию. В пищевых продуктах они
сохраняются от 2 до 6 мес. В блохах - до года.

Обычные концентрации дезинфицирующих растворов убивают их через 5-10

мин. Особенно они чувствительны к сулеме и карболовой кислоте.

Восприимчивость животных. Основными носителями чумы являются грызуны:

сурки, суслики, тарабаганы; они обусловливают природную очаговость чумы.
Очень чувствительны к чуме серые и черные крысы, мыши; восприимчивы также
верблюды, лисицы, кошки. К экспериментальному заражению чувствительны
мыши, крысы, морские свинки и др.

Источники заражения. Больные животные, в основном грызуны. Эпидемии у

людей часто предшествуют эпизоотии у грызунов.

Пути передачи и переносчики. 1. Основной путь передачи - трансмиссивный.

Переносчики - блохи (грызуны → блохи → человек).

2. Воздушно-капельный путь (заражение человека от человека при легочной

форме чумы).

3. Пищевой - при употреблении в пищу плохо проваренного зараженного мяса

(этот путь бывает редко).

Патогенез и формы заболевания. Входными воротами являются кожа и

слизистые оболочки дыхательных путей и пищеварительного тракта. Возбудители
чумы обладают большой инвазивной способностью. На месте проникновения
возбудителя образуются папулы, переходящие в пустулу с кровянисто-гнойным
содержимым. В патологический процесс вовлекаются регионарные лимфатические
узлы, через которые микробы проникают в кровь, вызывая бактерифмию. С кровью
они попадают во внутренние органы.

В зависимости от места локализации у человека могут возникнуть разные формы

заболевания: кожная, кожно-бубонная, кишечная, легочная, первично-септическая;
каждая форма может закончиться сепсисом (вторичная септицемия). Наиболее
часто возникает бубонная форма. Бубон болезнен. При попадании большой дозы
возбудителя и малой разистентности организма может возникнуть первично-
септическая форма. Заболевание начинается остро и протекает с явлениями
интоксикации - высокой температурой, головной болью и т. д.
 Иммунитет. Напряженный и продолжительный (в прошлые века в период
больших эпидемий переболевших использовали для ухода за больными).
Иммунитет обусловливается системой макрофагов. Большое значение имеет
фагоцитарный фактор.

Профилактика. Общие мероприятия заключаются в ранней диагностике,

изоляции больных. Установление карантина для людей, находившихся в контакте с
больными. Проведение в очагах дезинсекции и дератизации. Защита медицинского
персонала, находящегося в очагах, проводится введением стрептомицина и
противочумной вакцины. Выполнение международных конвенций по профилактике
чумы (дератизация и дезинфекция кораблей в портах). Охрана государственных
границ.

Специфическая профилактика. В СССР применяют живую вакцину EV. Этот

штамм был получен из вирулентной культуры путем последовательных пересевов
возбудителя на питательные среды в течение 5 лет. Штамм потерял вирулентность,
сохранив при этом иммуногенные свойства. Иммунитет длится около года.
Вакцинируют только людей, которым угрожает опасность заражения.

Лечение. Стрептомицин, тетрациклин, специфический фаг и противочумный

иммуноглобулин.

Большой вклад в изучение профилактики и лечения чумы внесли советские

ученые М. П. Покровская и Н. Н. Жуков-Вережников.

Контрольные вопросы
1. К какой группе инфекций относится чума?

2. Как растет возбудитель чумы на плотных и жидких питательных средах? Какая

форма является вирулентной - R или S?

3. Какой токсин образует возбудитель чумы и какие Вы знаете ферменты

патогенности?

4. Кто является источником и переносчиком чумы?

5. Какие формы заболевания вызывает палочка чумы?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление возбудителя чумы.

Материал для исследования

1. Отделяемое язвы или пунктат из карбункула - кожная форма.

2. Содержимое бубона - бубонная форма.

3. Мокрота - легочная форма.

4. Испражнения - кишечная форма.

 5. Кровь - при всех формах.

6. На вскрытии берут кусочки органов трупа, кровь, костный мозг.

7. Блохи - содержимое кишечника.

8. Крысы, мыши и другие погибшие грызуны (и болеющие) - вскрывают,

исследуют органы и кровь.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Бактериологический.

3. Биологический.

4. Люминесцентно-серологический метод (см. главу 2).

Методы серодиагностики не нашли широкого применения.

Ход исследования
Первый день исследования
 Первый день исследования

Посев. Незагрязненный посторонней флорой материал засевают на плотные и

жидкие питательные среды (МПА и МПБ) с прибавлением к ним стимуляторов:
кровь, сульфит натрия и др. Стимуляция роста необходима, так как посевная доза
может быть недостаточной. Материал, содержащий постороннюю флору (мокрота,
содержимое открытых язв), засевают на среду Туманского или среду Коробковой.
Эти среды содержат генциановый фиолетовый (1:50000), подавляющий рост
посторонней флоры. Посевы инкубируют в термостате при 28° С.

Биологическая проба. Биопробу ставят на морских свинках и белых мышах.

Метод введения исследуемого материала зависит от характера материала. Мокроту,
гной из открытого абсцесса вводят путем втирания в кожу брюшной стенки
(предварительно кожу эпилируют, обрабатывают стерильным изотоническим
раствором натрия хлорида и скарифицируют). На скарифицированный участок
наносят исследуемый материал, втирая его плоской частью скальпеля, под
прикрытием специальной воронки или стеклянной крышки от чашки Петри.
Незагрязненный материал (кровь, содержимое закрытого бубона) вводят животным
подкожно или внутрибрюшинно. В зависимости от метода введения животное
погибает на 3-9-й день.

Второй день исследования

Посевы вынимают из термостата. Изучают рост на плотной и жидкой

питательной среде.

Из бульонной культуры при типичном росте делают мазки, окрашивают по

Граму и метиленовым синим. Микроскопируют. Из плотной питательной среды при
наличии типичных колоний выделяют чистую культуру и помещают в термостат.
На 2-3 подозрительные в отношении возбудителя чумы колонии наносят чумный
бактериофаг. Инкубируют в термостате. Через 10-12 ч колонии изменяются -
лизируются. Лизис колоний под действием чумного бактериофага имеет
диагностическое значение.

Третий день исследования

Вынимают из термостата пробирки с культурой на скошенном агаре. На

поверхности агара чумная палочка образует вязкий серовато-белый налет.
Выделенную культуру проверяют микроскопически. При наличии типичных
палочек проверяют сахаролитические свойства посевом на сахара: глюкозу,
мальтозу, сахарозу, рамнозу, маннит. Ставят пробу с бактериофагом.
 Четвертый день исследования

Производят учет результатов: 1. Ферментативные свойства (табл. 42).

Таблица 42. Ферментативные свойства возбудителей чумы

Примечание. к - кислота; - отсутствие расщепления; ± не всегда расщепляет; +

расщепление.

Проба с бактериофагом - лизис колоний.

Ускоренный метод пробы с бактериофагом. Исследуемый материал наносят на

3 чашки со средой Туманского.

1-я чашка - засевают вместе с чумным бактериофагом.

2-я чашка - засевают равномерным распределением материала по поверхности

среды (шпателем), после чего делают дорожку из чумного бактериофага.

3-я чашка (контрольная) - засевают только исследуемым материалом. Посевы

инкубируют при 28° С. Через 12-14 ч чашки вынимают из термостата.

При наличии в исследуемом материале возбудителя чумы отмечают:

в 1-й чашке - негативные колонии (лизис колоний чумы), во 2-й чашке -

стерильную дорожку, в 3-й чашке - типичные колонии чумных бактерий.

Проводят дифференциацию чумных бактерий от бактерий псевдотуберкулеза

(табл. 43).
 Таблица 43. Дифференциация возбудителей чумы и бактерий псевдотуберкулеза

Продолжают наблюдение за животными, зараженными в первый день

исследования. Павших или убитых животных вскрывают. Изучают изменения в
органах. Обычно у животных, павших от чумы, увеличены регионарные узлы, в
органах - геморрагические и некротические участки. Печень и селезенка увеличены.
При вскрытии из органов и крови делают мазки-отпечатки на специальные среды.
Дальнейшее исследование ведут описанным выше способом.

Контрольные вопросы
1. Какой режим работы необходимо соблюдать при работе с возбудителями
чумы?

2. Какие методы являются ведущими? В каких случаях следует прибавить в

среду генциановый фиолетовый?

3. На каких животных ставят биопробу? Какие изменения обнаруживают у

павших животных?

4. Глава 27. Возбудитель псевдотуберкулеза

Возбудители псевдотуберкулеза по морфологическим, культуральным и

ферментативным свойствам схожи с возбудителями чумы. Однако имеются
различия. Бактерии псевдотуберкулеза подвижны, перитрихи. Биохимически более
активны (см. табл. 43).

Антигенные свойства. Бактерии псевдотуберкулеза имеют жгутиковый Н-

антиген и два соматических антигена: гладкий - типовой и шероховатый -
групповой, общий с антигеном возбудителя чумы.

К возбудителю псевдотуберкулеза в основном чувствительны животные:

грызуны, домашние и хищные. Человек заражается пищевым путем.
 Патогенез. Возбудители псевдотуберкулеза проникают в желудочно-кишечный
тракт, поражают лимфоидную ткань, размножаются и по лимфатическим сосудам
проникают в кровь, вызывая бактериемию и токсикоз.

Микробиологическое исследование

Как дифференцируют возбудителей чумы от бактерий псевдотуберкулеза?

Глава 28. Возбудитель туляремии

Возбудитель туляремии впервые был выделен в 1911 г. Мак-Коем и Чепином при
изучении заболевания сусликов в США (штат Калифорния, округ Туляре). В 1921 г.
американский исследователь Э. Френсис выяснил, что эта болезнь свойственна
также людям и описал ее. Поэтому возбудитель получил название Francisella
tularensis.

Морфология. Возбудители туляремии мелкие коккобактерии. Средняя величина

их 0,3-0,6 × 0,1-0,2 мкм. Они очень полиморфны: в мазках обнаруживают
шарообразные, нитевидные и другие формы. Встречаются культуры, которые
проходят через бактериальные фильтры. Бактерии туляремии неподвижны, спор не
образуют. Обладают нежной капсулой, грамотрицательны. В мазках-отпечатках,
сделанных из органов и окрашенных по Романовскому, бактерии имеют нежно-
фиолетовую окраску.

Культивирование. Возбудители туляремии - факультативные анаэробы. Растут

они на средах, богатых питательными веществами: свернутой желточной среде, на
агаровых мясных или рыбных средах с добавлением цистина, глюкозы и крови.
Размножаются лучше на плотных питательных средах, но рост может быть и на
жидких и полужидких средах. На плотных питательных средах бактерии туляремии
растут медленно, 4-14 дней при температуре 36-37° С и рН 6,8-7,2. Они образуют
мелкие, беловатого цвета, выпуклые, блестящие с ровными краями колонии
диаметром в 1-3 мм. Вирулентные штаммы в S-форме. Вакцинные штаммы в SR-
форме. R-форма бактерий - авирулентна (при длительном культивировании в
лабораторных условиях они переходят в R-форму).

Ферментативные свойства. У бактерий туляремии ферментативные свойства

мало выражены и выявляются только на специальных средах. Они могут
ферментировать глюкозу, мальтозу, маннозу, левулезу с образованием кислоты без
газа. Некоторые штаммы расщепляют глицерин, иногда образуют сероводород.
 Токсинообразование. Экзотоксин у бактерий туляремии не обнаружен.
Болезнетворное действие микробов связано, по-видимому, с эндотоксином.

Антигенная структура. S-форма туляремийных бактерий содержит два

антигенных комплекса: О- и Vi-антигены. С Vi-антигеном связаны вирулентность и
иммуногенность. R-формы теряют Vi-антиген. О-антиген имеет общий антиген С
бруцеллезными бактериями.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При температуре 100° С

бактерии туляремии гибнут мгновенно, при температуре 60° С - сохраняются 20
мин. При низких температурах и во влажной почве возбудители сохраняются до 4-5
мес. При 1° С в воде они сохраняются до 9 мес, зерне и соломе при 0° С - до 150
дней, хлебе - до 14 дней, мясе - до 30 дней и т. д. Обычные растворы
дезинфицирующих веществ убивают их в течение 10-15 мин. Бактерии туляремии
чувствительны ко многим антибиотикам.

Восприимчивость животных. Возбудители туляремии патогенны для многих

видов животных. Естественная зараженность туляремией известна у 145 видов
позвоночных и более 100 видов беспозвоночных животных. Наиболее
восприимчивыми к туляремии являются многие виды грызунов и некоторые
насекомоядные.

Из экспериментальных животных чувствительны морские свинки и белые мыши.

Источники инфекции - грызуны, преимущественно водяные крысы, полевки,

домовые мыши, ондатры, хомяки и зайцы. Источником заражения может быть вода,
пищевые продукты, солома и другие субстраты, загрязненные выделениями
больных животных.

Пути передачи. Трансмиссивный, воздушно-пылевой, пищевой, контактно-

бытовой.

Патогенез. Бактерии туляремии обладают высокой инвазивной способностью.

Они проникают через поврежденную и неповрежденную кожу и слизистые
оболочки.

В зависимости от пути проникновения в организм возбудители могут

локализоваться в коже, слизистых оболочках кишечного тракта, дыхательных
путей, глаз и других органах. Из входных ворот по лимфатическим путям они
попадают в ближайшие лимфатические узлы, где размножаются и поступают в
кровь. В очагах скопления возбудителей туляремии образуются специфические
туляремийные гранулемы - первичные бубоны. При дальнейшем распространении
микробов могут возникнуть вторичные бубоны. Размеры бубонов колеблются от
лесного ореха до куриного яйца.

Различают следующие клинические формы заболевания: бубонную, ангинозно-

бубонную, глазобубонную, легочную, абдоминальную и генерализованную. По
тяжести течения - легкую и тяжелую формы. По длительности течения - острую и
затяжную формы.
 Иммунитет. Напряженный и длительный. Определяется гуморальными и
клеточными факторами. Характерным для туляремии является аллергическое
состояние, возникающее с первых дней заболевания.

Профилактика. Борьба с грызунами и насекомыми. Общесанитарные

мероприятия.

Специфическая профилактика. Иммунизируют людей, проживающих в зоне

природных очагов. Иммунизацию проводят живой вакциной Гайского - Эльберта.
Вакцинируют однократно, накожно. Продолжительность иммунитета 3-6 лет.

Лечение. Бактерии туляремии чувствительны ко многим антибиотикам:

стрептомицину, биомицину, тетрациклину, мономицину, канамицину. К
пенициллину и сульфамидам они не чувствительны.

Контрольные вопросы
1. Каковы морфологические и культуральные особенности возбудителей
туляремии?

2. Антигенная структура. С каким антигеном связана вирулентность и какая

форма S или R является более вирулентной?

3. Какова устойчивость бактерий туляремии во внешней среде?

4. Какие животные восприимчивы к туляремии? Основные источники заражения.

5. Входные ворота инфекции. Патогенез. Основные формы заболевания.

6. Специфическая профилактика.

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление возбудителя туляремии.

Сбор материала и исследование проводят в строго режимных условиях!

Материал для исследования

1. Содержимое бубона (бубонная, язвенно-бубонная и ангинозно-бубонная

формы).

2. Отделяемое слизистой глаз (глазобубонная форма).

3. Мокрота (легочная форма).

4. Испражнения (абдоминальная форма).

5. Кровь (генерализованная форма).

В специальных лабораториях исследуются грызуны и их выделения,

членистоногие (клещи, блохи, комары, слепни), вода, пищевые продукты и т. д.
 Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Аллергический.

2. Серологический.

3. Биологический.

4. Люминесцентно-микроскопический.

5. Бактериологический (не нашел широкого применения, так как

непосредственный посев исследуемого материала на искусственные питательные
среды роста бактерий не дает).

Ход исследования
 Ход исследования

Контрольные вопросы

1. Перечислите, какой материал для исследования используют при разных

клинических формах заболеваний туляремией.

2. Перечислите основные методы исследования.

3. Какие серологические методы применяют для диагностики туляремии?

4. На каких животных ставят биологическую пробу?

5. Почему бактериологический метод не нашел широкого применения?

Задание

Составьте таблицу морфологических, культуральных и ферментативных свойств

бактерий туляремии.

Питательные среды

Желточная среда. Желтки свежих яиц смешивают с изотоническим раствором

натрия хлорида в соотношении 3:2. Смесь разливают по 4-5 мл в пробирки и в
скошенном положении стерилизуют при температуре 80° С в течение часа.
Проверяют среду на стерильность (в термостате при 37° С) и сохраняют на холоде
до 1 мес.

Глава 29. Возбудители бруцеллеза

В 1886 г. Д. Брюс в селезенке больного, погибшего от мальтийской лихорадки,
обнаружил маленькую коккобактерию, которую выделил в чистой культуре и
назвал Micrococcus.

В 1896 г. Б. Банг из околоплодной жидкости при аборте коров также выделил

коккобактерии. В 1914 г. Ж. Траум выделил подобную палочку от больных свиней.
А в 1916 г. Ивенс, изучив все выделенные микроорганизмы, определила их
схожесть и в честь Брюса они были названы бруцеллами. В дальнейшем (1953,
1957, 1966) были открыты и другие виды бруцелл. Все они объединены в род
Brucella.

В настоящее время бруцеллы подразделяют на виды по признаку их основного

хозяина: В. melitensis - болеет мелкий рогатый скот (овцы, козы); В. abortus - болеет
крупный рогатый скот; В. suis - болеют свиньи и т. д.

Каждый вид бруцелл подразделяют на биовары: В. melitensis включает 3 биовара;

В. abortus - 9 биоваров; В. suis - 5 биоваров. Наиболее патогенным для человека
является В. melitensis. B. abortus редко вызывают клиническое проявление
заболевания у человека.
 Морфология. Возбудители бруцеллеза мелкие 0,6-0,8 × 0,3-0,5 мкм бактерии
палочковидной или овоидной формы. Неподвижны. Спор не имеют. Образуют
нежную капсулу. Грамотрицательны. В мазке располагаются беспорядочно.

Культивирование. Бруцеллы - аэробы. Прихотливы к питательным средам.

Характеризуются замедленным ростом (2-3 нед). Выращивают их на специальных
питательных средах: сывороточно-декстрозном агаре, на агаре из картофельного
настоя с сывороткой и кровяным агаром (5% овечьей крови), среде "Д", печеночном
агаре МПА и МПБ. Растут они при температуре 37° С и рН 6,8-7,2. Некоторые
штаммы требуют для роста 5-10% СО 2, особенно при первоначальном выделении.
На плотных питательных средах вырастают нежные, мелкие, бесцветные, выпуклые
с перламутровым блеском колонии в S-форме. Под влиянием некоторых факторов
они могут диссоциировать в R-форму. Под действием антибиотиков у них
возникают L-формы. В жидких питательных средах бруцеллы дают равномерную
муть. Бруцеллы можно культивировать в желточном мешке куриного эмбриона.

Дифференцируют виды бруцелл на основании их способности образовывать

сероводород и расти на средах с красителями - основным фуксином и тионином
(табл. 44).

Таблица 44. Биологические свойства бруцелл

Ферментативные свойства. Бруцеллы расщепляют D-рибозу, D-галактозу,

аланин, аспарагин. Некоторые штаммы гидролизуют аминокислоты с образованием
аммиака.

Бруцеллы образуют гиалуронидазу, каталазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и

др. Бруцеллы обладают выраженными инвазивными и агрессивными свойствами.

Токсинообразование. Патогенное действие бруцелл определяется, по-видимому,

наличием эндотоксина. Кроме того, они обладают аллергенными свойствами.

Антигенная структура. Бруцеллы содержат два соматических антигена А и М.

Эти антигены являются видоспецифичными. Они всегда входят в состав микробной
клетки, но в разных соотношениях. У В. melitensis преобладает антиген М, у В.
abortus и В. suis - антиген А. Кроме того, у них выявлен термолабильный Vi-
антиген.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При 100° С бруцеллы

погибают мгновенно. При температуре 80-85° С - через 5 мин, при 60° С - через 30
мин. К низким температурам они очень устойчивы. Прямые солнечные лучи
действуют на них губительно. Во влажной среде бруцеллы сохраняются длительно -
3-4 мес. В молочных продуктах - до 40-45 дней, замороженном мясе - до 5 мес,
почве и воде - до 3-5 мес.

Восприимчивость животных. Бруцеллезом болеют в основном

сельскохозяйственные животные: мелкий и крупный рогатый скот, свиньи, олени и
др. Каждый вид бруцелл поражает определенный вид животного. Но бруцеллы
могут мигрировать, т. е. переходить от одного вида животного другому. Например,
В. abortus могут поражать мелкий рогатый скот.

Основными признаками заболевания являются: у самок - аборты, у самцов -

орхиты. Кроме того, у них бывает поражение суставов, похудание, выпадение
шерсти и т. д. Но бруцеллез у животных может протекать в скрытой форме, что
способствует распространению инфекции.

Из экспериментальных животных к бруцеллам чувствительны белые мыши и

морские свинки. После заражения они абортируют, резко худеют, у них выпадает
шерсть. У мышей иногда развивается септицемия.

Источники инфекции. Основным источником заболевания бруцеллезом людей

являются мелкий и крупный рогатый скот. Роль человека в передаче бруцеллезной
инфекции эпидемиологического значения не имеет.

Пути передачи. Пищевой, контактно-бытовой, воздушно-капельный.

Контактный путь - при работе с животными: в процессе ухода за животными, на

предприятиях, перерабатывающих сырье и продукты животного происхождения;
при соприкосновении с выделениями больных животных, плодом, в процессе убоя,
разделки туши и т. д.

Аэрогенным путем бруцеллы проникают в кожу и неповрежденные слизистые

оболочки.

Пищевой путь - употребление зараженных пищевых продуктов. Наиболее

опасны молочные продукты - молоко, брынза и т. д.

Патогенез. Попав в организм, бруцеллы по лимфатическим путям проникают в

лимфатические узлы, кровь, костный мозг, паренхиматозные органы и
локализуются внутри клеток. При обострении процесса бруцеллы из клеток вновь
попадают в кровь и возникает рецидив. Заболевание характеризуется воспалением
суставов, невралгией и естественными абортами.

Иммунитет - обусловливается клеточными (фагоцитоз) и гуморальными

факторами - агглютининами, комплементсвязывающими антителами и др.
Иммунитет сочетается с состоянием аллергии. В опытах на морских свинках было
показано, что устойчивость к повторному заражению у них сочеталась с
положительной реакцией к бруцеллину.

Профилактика. Плановые обследования в животноводческих хозяйствах, на

пастбищах, в убойных пунктах, на мясных и молочных комбинатах.
 Специфическая профилактика. Вакцинация живой вакциной В. abortus (штамм
19-ВА). Прививки проводят накожным методом однократно, ревакцинируют через
8-12 мес.

Лечение. Антибиотики: левомицетин, эритромицин. Для предупреждения

рецидивов используют также бруцеллезный иммуноглобулин.

Контрольные вопросы
1. Какие Вы знаете виды бруцелл и какой из них патогенен для человека?

2. На каких средах культивируют бруцеллы и чем характеризуется их рост на

средах?

3. С чем связано патогенное действие бруцелл?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление возбудителя бруцеллеза.

Работу с бруцеллами проводят в строго режимных условиях.

Материал для исследования

1. Кровь.

2. Спинномозговая жидкость.

3. Костный мозг.

4. Моча.

5. Грудное молоко.

6. Секционный материал.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Серологический
2. Аллергический.

3. Биологический.

4. Бактериологический.

Ход исследования
 Ход исследования

Ход исследования

Контрольные вопросы

1. В каких условиях проводят работу с материалом, полученным от больного

бруцеллезом?

2. Какой материал служит для диагностического исследования?

3. Перечислите основные методы исследования.

 4. На каких животных ставят биологическую пробу?

Питательные среды

МПБ (см. главу 7).

МПА (см. главу 7).

Сывороточно-декстрозный агар. Основой этой среды является питательный

агар, который готовят следующим образом: к 835 мл дистиллированной воды
добавляют 15 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г х. ч. хлорида натрия и 165 мл мясной
воды. Все ингредиенты вводят в сосуд и подвергают обработке текучим паром в
течение часа. Устанавливают рН 7,8. Затем сосуд ставят в автоклав, при 2 атм,
температуре 120° С выпадают фосфаты. Среду фильтрют через бумажные фильтры,
устанавливают рН 7,4, разливают в мерную посуду и стерилизуют при температуре
116° С в течение 15 мин. Заготовленный таким образом агар по мере надобности
расплавляют на водяной бане и охлаждают до 50° С. Затем к нему добавляют
нормальную инактивированную (при 56° С 30 мин) лошадиную или бычью
сыворотку и раствор декстрозы, простерилизованный путем фильтрации через
фильтр Зейтца. Окончательная концентрация сыворотки должна быть 5% и
декстразы - 1%.

Кровяной агар. См. главу 7.

Среда "Д": а) бульон "Д" - к 100 мл холодной дистиллированной воды

добавляют 2,5 г порошка стандартного бульона "Д", прогревают и тщательно
размешивают до полного его растворения; затем бульон фильтруют, разливают в
необходимую посуду и стерилизуют при 120° С в течение 20 мин (рН среды 7,1-
7,2); б) агар "Д" - к 100 мл холодной дистиллированной воды добавляют 20 г
порошка стандартного агара "Д", прогревают при помешивании до полного
растворения порошка, не допуская его подгорания, затем фильтруют, разливают в
необходимую посуду и стерилизуют при 120° С в течение 20 мин (рН среды 7,2).
Среды готовит Институт эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалея
АМН СССР.

Глава 30. Возбудитель сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis включен в семейство Bacillaceae,
род Bacillus. Название болезни - "углевик" дано русским врачом Андриевским,
который в конце XVIII века изучал это заболевание в Сибири во время большой
эпизоотии среди коров.

Возбудитель сибирской язвы был открыт Паллендером в 1849 г. Большой вклад в

изучение этого заболевания внесли Р. Кох, Л. Пастер и Л. С. Ценковский.

Морфология. Возбудители сибирской язвы - крупные палочки 6-8 × 1-1,5 мкм с

обрубленными или несколько вогнутыми концами. Грамположительны. В
организме они располагаются попарно или в виде коротких цепочек. На
питательных средах встречаются длинные цепочки. Бациллы сибирской язвы
неподвижны. В организме образуют капсулу, окружающую одну, две особи или
всю цепочку. Бациллы сибирской язвы образуют споры овальной формы,
 расположенные в центре и не превышающие поперечника микробной клетки.
Спорообразование лучше всего происходит при доступе кислорода и температуре
30-40° С. При температуре выше 43° С и ниже 15° С спорообразование
прекращается. В период образования спор цитоплазма клетки почти полностью
лизируется, клеточная стенка разрывается и спора выходит наружу (рис. 47).

Рис. 47. Морфологические и культуральные свойства возбудителя сибирской язвы

(Bacillus anthracis). а - В. anthracis (в крови мыши); б - образование капсул; в - споры; г
- рост колонии; д - рост культуры на МПБ; е - рост культуры на желатине

Культивирование. Возбудители сибирской язвы - факультативные анаэробы.

Неприхотливы. Растут при температуре 35-38° С и рН среды 7,2-7,6. На МПА
образуют крупные колонии с неровными бахромчатыми краями (R-форма). От края
колонии отходят пучки нитей. Вид колоний напоминает голову медузы или
львиную гриву. R-форма является характерной для вирулентных штаммов
сибиреязвенных бацилл. В старых культурах появляются гладкие S-формы колоний
- не вирулентные.

В бульоне рост сибиреязвенных бацилл характеризуется придонным ростом. На

дне пробирки образуется осадок в виде комка ваты, при этом среда остается
прозрачной.

При посеве на 10-12% желатин после 2-3-дневной инкубации появляется рост по

ходу укола в виде белых тяжей, уменьшающихся книзу (вид опрокинутой елочки).

При посеве возбудителей на МПА с пенициллином (на пластинчатом агаре)

наблюдается распад бацилл на шары, цепь из которых напоминает жемчужное
ожерелье. Характер роста на средах имеет диагностическое значение (см. рис. 47).

Ферментативные свойства. Сибиреязвенные бациллы обладают выраженной

ферментативной активностью. Сахаролитические свойства: расщепляют глюкозу,
лактозу, мальтозу, левулезу и другие сахара до образования кислоты.
 Протеолитические свойства выражаются в пептонизации молока, разжижении
желатина, свертывании молока (медленно). Они образуют сероводород и аммиак,
переводят нитраты в нитриты, гидролизируют крахмал и т. д. Не гемолизируют
эритроциты, чем отличаются от Вантракоида. Лизируются противосибиреязвенным
фагом. Сибиреязвенные бациллы образуют ферменты: диастазу, пероксидазу,
липазу.

Токсинообразование. В. anthracis образует токсин - протеиновый комплекс,

содержащий отечный и летальные факторы. Этот токсин называют "мышиный
токсин" (ввиду высокой чувствительности мышей). Большая роль в вирулентности
сибиреязвенных бацилл принадлежит капсуле, которая связана с токсическим
веществом.

Антигенная структура. Бациллы сибирской язвы содержат два антигена: 1)

соматический (полисахаридный), который находится в клеточной стенке микроба.
Термоустойчив. Против этого антигена антитела не продуцируются. Этот антиген
длительно сохраняется в культурах и трупном материале. На его обнаружении
основана реакция преципитации Асколи; 2) капсульный (протеиновый) антиген,
обусловливающий антифагоцитарное действие.

Находясь в организме или на средах, содержащих экстракты тканей, бациллы

сибирской язвы вырабатывают протективный термолабильный антиген, который
является атоксичным, но обладает иммунизирующей способностью.

У сибиреязвенных бацилл имеется общий антиген с антракоидом и другими

спорообразующими сапрофитами (В subtilis, B. cereus и др.).

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы

возбудителей сибирской язвы малоустойчивы. При 100° С они погибают
мгновенно, температура 55-60° С губит их через 30-40 мин. Обычные концентрации
дезинфицирующих растворов убивают их через несколько минут. Капсулы
сибиреязвенных бацилл обладают большой устойчивостью. При исследовании
трупов животных, подвергнутых действию гнилостной микрофлоры, можно
обнаружить пустые капсулы (тени). Споры устойчивы: они выдерживают
кипячение на протяжении 15-20 мин. Автоклавирование (120° С) убивает их через
20 мин. К низким температурам не чувствительны. В сухом состоянии сохраняются
до 30 лет, в почве - десятилетия.

Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их через 2-3 сут (табл. 46).
 Таблица 46. Свойства возбудителей сибирской язвы

Примечание. B. anthracoides обладают слабой подвижностью, вызывают гемолиз

эритроцитов, непатогенны для морских свинок.

Восприимчивость животных. К сибиреязвенным бациллам чувствительны

коровы, овцы, лошади, олени, свиньи. Заражаются они друг от друга пищевым
путем, поглощая с кормом споры возбудителя.

Из лабораторных животных наиболее восприимчивы белые мыши, морские

свинки, кролики. Эти животные после заражения погибают через 2-4 сут от
септицемии. На месте введения наблюдаются отек и гиперемия. Кровь у погибших
животных густая и темно-красного цвета, так как сибиреязвенные бациллы
обладают антикоагулирующим действием.

Источники заболевания. Больные животные.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-пыльевой, пищевой (при

использовании продуктов, зараженных бациллами сибирской язвы).

Человек от человека обычно не заражается, тем не менее при заболевании

человека сибирской язвой принимаются все необходимые меры предосторожности.

Патогенез. Входными воротами являются кожа и слизистые оболочки

дыхательных путей и пищеварительного тракта. В зависимости от локализации
различают кожную, легочную и кишечную формы. Каждая форма может
генерализоваться.

Кожная форма - в месте проникновения появляется покраснение, переходящее в

папулу (зудящую). Папула медно-красного цвета переходит в везикулу с серозно-
геморрагическим содержимым, после подсыхания образуется черный струп
(углевик).

Легочная форма - развивается специфическая пневмония, протекающая по типу

отека легких. Обычно заканчивается летально.

Кишечная форма - все вышеописанные явления развиваются в слизистой

кишечника. Обычно заканчивается летально.
 Иммунитет. Довольно стойкий, антимикробный и антитоксический. Зависит от
образования протективных антител. Большая роль принадлежит фагоцитарной
реакции. В сыворотке переболевших сибирской язвой обнаруживаются антитела,
разрушающие капсульную субстанцию бацилл.

При сибирской язве развивается гиперчувствительность, регистрируемая в

аллергической пробе с антраксином.

Профилактика. Все мероприятия по предупреждению сибирской язвы проводят

совместно с ветеринарной службой Они предусматривают своевременное
выявление, изоляцию больных животных, тщательную дезинфекцию территории.

Специфическая профилактика. В настоящее время используют вакцину СТИ,

которая была изготовлена в 1942 г. Н. Н. Гинсбургом из бескапсульной культуры.
Вакцинируют обычно людей, которые по характеру своей работы связаны с
сельскохозяйственными животными. Для экстренной профилактики (людям,
контактировавшим с больными) вводят противосибиреязвенный иммуноглобулин и
антибиотики.

Лечение. Противосибиреязвенный иммуноглобулин, антибиотики: пенициллин,

стрептомицин, тетрациклин.

Контрольные вопросы
1. Опишите морфологию возбудителя сибирской язвы.

2. Опишите культуральные свойства и какая форма: S или R является

вирулентной?

3. Какими свойствами обладает сибиреязвенный токсин?

4. Пути передачи и формы заболевания сибирской язвой.

5. Какие факторы обусловливают иммунитет при сибирской язве.

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление возбудителей сибирской язвы и дифференциация
его от антракоида, выявление антигенов возбудителя.

Работа с возбудителем сибирской язвы проводится в строго режимных

условиях!

Материал для исследования

1. Содержимое везикул, карбункула, отторгнутый струп (кожная форма).

2. Мокрота (легочная форма).

3. Испражнения (кишечная форма).

4. Кровь (септическая форма).

5. Почва, шерсть животных (для постановки реакции Асколи).

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Бактериологический.

3. Биологический.

4. Аллергический.

5. Реакция преципитации Асколи.

Ход исследования
Первый день исследования
 Первый день исследования

Второй день исследования

1. Посевы вынимают из термостата. Изучают рост на плотной и жидкой

питательной среде. Колонии на плотной питательной среде изучают под
микроскопом при малом увеличении. При наличии подозрительных колоний
выделяют чистую культуру на скошенный МПА. Посевы инкубируют в термостате.

2. Из бульонной культуры (рост в виде комка ваты на дне, бульон прозрачный)

делают висячую каплю (для установления неподвижности - дифференциации от
антракойда).

3. Ставят тест "жемчужного ожерелья" (ускоренный метод исследования). С этой

целью к бульону Хоттингера добавляют 30% инактивированной лошадиной
сыворотки и пенициллин из расчета 0,5 ЕД на 1 мл бульона. Приготовленную среду
разливают в пробирки по 2-3 мл и в каждую вносят 2 капли исследуемой бульонной
культуры. Посевы инкубируют в термостате 3 ч при температуре 37° С. Затем
вынимают их из термостата. Из каждой пробирки делают 2-3 мазка, высушивают на
воздухе и фиксируют в жидкости Карнуа (6 частей этилового спирта + 3 части
хлороформа + 1 часть ледяной уксусной кислоты). Фиксацию проводят до полного
испарения жидкости. Полученные мазки окрашивают метиленовым синим и
микроскопируют.

В мазках сибиоеязвенные бациллы обнаруживаются в виде цепи шаров,

напоминающих жемчужное ожерелье - результат действия пенициллина.
 4. Осматривают зараженных животных. Павших животных вскрывают, делают
мазки и мазки-отпечатки, которые фиксируют, окрашивают и изучают под
микроскопом. При наличии подозрительных палочек производят посевы на МПА и
МПБ.

Третий день исследования

Вынимают посевы из термостата, делают мазки, микроскопируют. На МПА и

МПБ бациллы сибирской язвы растут в виде бескапсульных особей. Производят
посев на сахара, лакмусовое молоко, желатин, на чашки с 2% кровью и ставят пробу
с сибиреязвенным бактериофагом. Посевы инкубируют в термостате.

Четвертый день исследования

Вынимают посевы из термостата и учитывают полученные результаты (см. табл.

46).

Исследование мокроты, испражнений и крови после специальной обработки

ведут так же.

Аллергическая проба

Для диагностики сибирской язвы используют аллергическую пробу с

сибиреязвенным антигеном (антраксин). Для этого внутрикожно на внутренней
поверхности предплечья вводят антраксин. Реакцию учитывают через 24-48 ч.
Положительная реакция проявляется с первых дней заболевания.

Реакция Асколи

Реакцию ставят для обнаружения специфического антигена бацилл сибирской

язвы в шерсти животных, коже, трупах, почве и т. д.

Приготовление антигена: исследуемый материал измельчают в ступке, заливают

25-50-кратным объемом изотонического раствора натрия хлорида и кипятят
(антиген термоустойчив). Полученный экстракт фильтруют через смоченную тем
же раствором фильтровальную бумагу. Фильтрат-термоэкстракт - прозрачная
жидкость. Для реакции используют преципитирующую сибиреязвенную сыворотку
и для контроля сибиреязвенный антиген (рис. 48).

Рис. 48. Реакция Асколи. 1 - преципитирующая сыворотка + исследуемый

термоэкстракт; 2 - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный
 антиген (контроль); 3 - преципитирующая сыворотка + антиген из шерсти
здорового животного (чужеродный антиген); 4 - преципитирующая сыворотка +
изотонический раствор хлорида натрия; 5 - нормальная сыворотка + испытуемый
антиген

Постановка реакции: 1-я пробирка - преципитирующая сыворотка + исследуемый

термоэкстракт;

2-я пробирка - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный

антиген (контроль).

3-я пробирка - преципитирующая сыворотка + термоэкстракт из шерсти

здорового животного (контроль).

При положительной реакции в первых двух пробирках образуется

преципитационное кольцо, в третьей - кольцо отсутствует.

Реакция эта очень чувствительна (см. рис. 48).

Питательные среды

МПА, МПБ, желатиновая среда (см. главу 7).

Контрольные вопросы
1. Какой материал используют для бактериологического исследования?

2. Основные методы микробиологического исследования.

3. Какие имеются ускоренные методы исследования? Как получить тест

"жемчужного ожерелья?"

4. Каким методом можно выявить сибиреязвенные бациллы во внешней среде?

Задание
Нарисуйте схему лабораторного исследования сибирской язвы но дням.

Бордетелла - Ф. К. Черкес
Глава 31. Возбудители коклюша и паракоклюша
Возбудители этих заболеваний относятся к роду Bordetella.

1. Bordetella pertussis - возбудитель коклюша, описан Борде и Жангу в 1906 г.

2. Bordetella parapertussis - возбудитель паракоклюша, описан Элдеринг и

Кондрик в 1937 г.
 3. Bordetella bronchiseptica - вызывает заболевание у животных. У человека эти
бактерии вызывают бронхопневмонию с коклюшеподобным кашлем. Впервые у
человека это заболевание описано Брауном в 1926 г. (встречается редко).

Морфология. Бактерии коклюша - мелкие палочки овоидной формы, 0,3-0,5 × 1-

1,5 мкм. Возбудитель пара-коклюша несколько большей величины. Оба микроба не
имеют спор, неподвижны. При специальной окраске видна капсула.
Грамотрицательны. Более интенсивно окрашиваются по полюсам.

На ультрасрезах видны капсулоподобная оболочка, зерна валютина, в нуклеиде -

вакуоли.

Культивирование. Возбудители коклюша и паракоклюша - аэробы. Прихотливы

к питательным средам. Для их выращивания применяют среду Борде - Жангу
(глицериново-картофельный агар с кровью). В настоящее время пользуются средой
КУА (казеиново-угольный агар) - это полусинтетическая среда без крови.
Источником аминокислот здесь является гидролизат казеина. Среда КУА
отличается от среды Борде - Жангу более простым и доступным методом
изготовления.

Для угнетения роста посторонней флоры к среде добавляют пенициллин по 0,25 -

0,5 ME на 1 мл среды или метициллин - 2,5-4 мкг на 1 мл. Пенициллин можно
наносить на поверхность среды в чашках.

Засеянные среды инкубируют в термостате при температуре 35-36° С, рН среды

6,8-7,4. Посевы необходимо предохранять от высыхания, для этого в термостат
ставят сосуд с водой.

Колонии В. pertussis появляются через 48-72 ч, а В. parapertussis - через 24-48 ч.

На среде КУА колонии В. pertussis мелкие 1-2 мм в диаметре, В. parapertussis

несколько крупнее. Колонии обоих микробов блестящие, серовато-кремового цвета
(на казеиново-угольном агаре они напоминают капельки ртути). При снятии
колоний остается вязкий, сметанообразный след. При изучении колоний в
стереоскопическом микроскопе виден световой конус (колонии отбрасывают тень).
Когда меняется положение светового источника (электролампочки) тень меняет
положением Наличие светового конуса (хвостика) имеет диагностическое значение.

В. parapertussis образует фермент тирозиназу, поэтому в средах, содержащих

тирозин, происходит его расщепление и среда окрашивается в коричневый цвет.
Изменение цвета среды является дифференциально-диагностическим признаком.

В жидкой среде бактерии коклюша и паракоклюша образуют равномерную муть

и придонный осадок. На агаре с кровью они дают зону гемолиза.

Свежевыделенные культуры чаще всего имеют гладкую S-форму (I фаза). При

культивировании в неблагоприятных условиях или в материале, взятом в поздние
сроки заболевания, могут появиться диссоциированные формы (II-IV фазы).
 Ферментативные свойства. Возбудители коклюша не расщепляют углеводы и
не ферментируют белки. Бактерии паракоклюша образуют ферменты уреазу и
тирозиназу.

Бактерии коклюша и паракоклюша продуцируют ферменты патогенности:

гиалуронидазу, плазмокоагулазу и лецитиназу.

Токсинообразование. В опытах на животных у коклюшной палочки были

выявлены четыре типа токсина белковой природы: 1) термолабильный
дермонекротический токсин; 2) термостабильный эндотоксин; 3)
лейкоцитозостимулирующий фактор (стимулирующий лейкоцитоз);
парентеральное введение его вызывало гибель экспериментальных животных; 4)
гистаминсенсибилизирующий фактор - при введении его мышам у них повышалась
чувствительность к гистамину.

Первые два типа токсина свойственны и возбудителю паракоклюша.

Таблица 47. Дифференциальные признаки бактерий рода Bordetella

Антигенная структура. У бактерий рода Bordetella сложная антиренная

структура. Наиболее важными антигенами для лабораторной диагностики являются
агглютиногены. Родовым агглютиногеном является 7. Видоспецифическим
агглютиногеном для бордетелл коклюша является 1, для бордетелл паракоклюша -
14, для бордетелл бронхосептика - 12.

Моноспецифические сыворотки 1, 14, 12 используются для дифференциации

видов (сыворотки выпускает Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф.
Гамалеи).

Кроме видоспецифических антигенов, у представителей Bordetella имеются и

другие агглютиногены, разное сочетание которых определяет серовар (табл. 48.).
 Таблица 48. Схема состава агглютиногенного рода бордетелл

По сочетанию трех главных агглютиногенов 1,2,3, определяемых в реакции

агглютинации с моноспецифическими сыворотками, В. pertussis различают три
серовара: 1,2,3; 1,2,0; 1,0,3.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Возбудители коклюша и

паракоклюша мало устойчивы. При температуре 56° С они погибают через 20-30
мин. Низкие температуры также губительно на них действуют. Прямой солнечный
свет убивает их через 1-2 ч; УФ-лучи - через несколько минут. В сухой мокроте эти
бактерии сохраняются в течение нескольких часов. Обычные растворы
дезинфицирующих веществ губят их быстро.

Оба вида микробов мало чувствительны к антибиотикам, не чувствительны к

пенициллину.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные не

восприимчивы к возбудителям этого рода. В экспериментальных условиях удается
воспроизвести коклюш у обезьян и молодых собак, вызвать гибель мышей.

Источники инфекции. Больной человек. Особенно заразны больные в

катаральном периоде.

Пути передачи. Воздушно-капельный путь. Роль различных предметов мало

вероятна ввиду неустойчивости коклюшных бактерий во внешней среде.

Патогенез. Возбудители коклюша и паракоклюша вызывают острое заболевание,

сопровождающееся конвульсивным кашлем. Попав на слизистую оболочку верхних
дыхательных путей, бактерии размножаются там и частично разрушаются.
Выделившийся токсин действует на центральную нервную систему, раздражает
нервные рецепторы слизистой оболочки верхних дыхательных путей, что приводит
в действие кашлевой рефлекс. В результате возникают приступы судорожного
кашля. В процессе заболевания наблюдается несколько периодов: катаральный,
спазматического кашля и разрешения процесса.

Иммунитет. После перенесенного заболевания вырабатывается стойкий

иммунитет, который обусловливается гуморальными и клеточными факторами.

Профилактика. Выявление и изоляция больных. Ослабленным детям,

находившимся в контакте с больным коклюшем, вводят иммуноглобулин.
Основные меры специфической профилактики - иммунизация детей АКДС
(коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной). Вакцину вводят троекратно в
возрасте до 6 мес с последующей ревакцинацией.
 Лечение. В ранних стадиях заболевания применяют противококлюшный
иммуноглобулин. Для лечения используют эритромицин и ампициллин.

Контрольные вопросы
1. Опишите морфологические свойства возбудителя коклюша и паракоклюша.

2. На каких средах и каков характер роста коклюшных и паракоклюшных

микробов?

3. Устойчивость возбудителей коклюша и паракоклюша во внешней среде.

4. Дифференциальные признаки возбудителей коклюша и паракоклюша.

5. Источники заражения, пути передачи, патогенез коклюша.

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление возбудителя и дифференциация возбудителей
коклюша от паракоклюша.

Материал для исследования

Отделяемое слизистой оболочки носоглотки.

Способы сбора материала

 Способы сбора материала

Основной метод исследования

Микробиологический

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй - третий дни исследования

Посевы вынимают из термостата и просматривают, пользуясь лупой или

стереоскопическим бинокулярным микроскопом. При наличии подозрительных
колоний их выделяют на КУА: в чашках Петри, разделенных на сектора, или в
пробирках. Посевы ставят в термостат. Если колоний много, из части их можно
сделать мазки, покрасить и посмотреть под микроскопом. При наличии мелких
грамотрицательных палочек ставят пробную реакцию агглютинации с
моноспецифической родовой сывороткой 7. Положительная реакция агглютинации
свидетельствует о принадлежности выделенной культуры к роду Bordetella. Для
определения вида бордетелл ставят реакцию агглютинации с моноспецифическими
видовыми сыворотками 1 и 14. Реакции ставят на предметном стекле.
Положительный результат реакции агглютинации позволяет дать предварительный
ответ.

Четвертый день исследования

Посевы вынимают из термостата и просматривают: сначала невооруженным

глазом, обращая внимание на Цвет среды (нет ли коричневого окрашивания), затем
изучают рост при помощи стереоскопического микроскопа.

При наличии подозрительных колоний из выделенной культуры делают мазки,

окрашивают по Граму и изучают под микроскопом. Затем повторно (из чистой
культуры) ставят реакцию агглютинации на стекле с моноспецифическими
сыворотками 1,2,3 и 14. Результаты агглютинации дают возможность
отдифференцировать В. pertussis от В. parapertussis, и если это - В. pertussis, то
определить серовар: 1-й серовар - (1,2,3), 2-й серовар - (1,2,0), 3-й серовар - (1,0,3).
Определение серовара имеет эпидемиологическое значение.
 Для окончательной идентификации выделенной культуры (при положительной
агглютинации с моноспецифическими сыворотками) ставят пробу на наличие
уреазы и производят посев на скошенный агар, содержащий 0,1% тирозина (см. рис.
49).

Рис. 49. Схема выделения и идентификации возбудителей коклюша и паракоклюша

(Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis)

Проба на уреазу. В маленькую пробирку наливают 0,3-0,4 мл 2% раствора

мочевины, вносят петлю культуры и добавляют 2-3 капли фенолфталеина.
Пробирку встряхивают и ставят в термостат. Учитывают реакцию через 2 и 24 ч.
Бактерии коклюша не изменяют цвет среды. Бактерии паракоклюша обладают
ферментом уреазой, который расщепляют мочевину с образованием аммиака.
Аммиак изменяет индикатор и среда окрашивается в красный цвет.

Проба с тирозином. На скошенный МПА в пробирках с 0,1% тирозином

засевают выделенную культуру и ставят в термостат. На следующий день
вынимают пробирку из термостата и просматривают ее. Наличие роста в пробирке
и окрашивание среды в коричневый цвет свидетельствуют о росте возбудителей
паракоклюша. Возбудители коклюша на этой среде не растут.

Пятый день исследования

При отсутствии подозрительных колоний дают отрицательный ответ.

Ускоренная диагностика

При бактериологическом методе исследования ответ можно получить через 3-4

дня.

1. Применение иммунно-люминесцентного метода позволяет дать ответ через

несколько часов после взятия материала путем непосредственного выявления
микробов в мазках, сделанных с тампонов.

2. Из посевов на среде КУА при отсутствии видимого роста можно сделать

мазок-отпечаток: для этого стерильной резиновой пробкой дотрагиваются до места
посева и переносят отпечаток на предметное стекло. Мазок-отпечаток изучают
методом иммунофлюоресценции. В мазках обнаруживаются бактерии В. pertussis
или В. parapertussis.

Контрольные вопросы

1. Что служит материалом для исследования при подозрении на коклюш?

2. Какие методы сбора материала применяют для выявления возбудителя при

подозрении на коклюш?

3. Что прибавляют к среде для подавления роста посторонней микрофлоры?

Задание

1. Возьмите 10 чашек со средой КУА, флакон пенициллина, содержащий 300000

ЕД. Сделайте разведение пенициллина таким образом, чтобы в 0,1 мл содержалось
7,5 ЕД. Сделайте расчет на общее количество среды.

2. Соберите отделяемое носоглотки друг у друга и сделайте посев на среду КУА.

3. Возьмите у преподавателя чашку с культурой бактерий коклюша или

паракоклюша, изучите характер колоний с помощью стереоскопического
микроскопа. Подозрительные колонии посейте на сектор среды КУА (выделение
чистой культуры).
 4. Возьмите у преподавателя чистую культуру возбудителей коклюша или
паракоклюша, выросшую на секторе среды КУА, и поставьте реакцию
агглютинации с диагностической коклюшной сывороткой.

При наличии положительной реакции агглютинации поставьте пробу на уреазу и

сделайте посев на среду с тирозином (0,1%).

Питательные среды

КУА. Среду готовит Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф.

Гамалея. Готовая среда КУА черного цвета, конденсационная вода не должна
содержать частиц угля. В готовом виде среду можно сохранять продолжительное
время (до месяца и более), предохраняя ее от высыхания.

Патогенные коринебактерии - Ф. К. Черкес

Глава 32. Возбудитель дифтерии
Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium (от лат. coryna - булава,
diphthera - пленка). Бактерии имеют булавовидные утолщения на концах. К этому
роду относятся патогенные для человека дифтерийные палочки и непатогенные
виды - ложнодифтерийные палочки и дифтероиды, обнаруживаемые на слизистых
оболочках и кожных покровах.

Возбудители дифтерии - Corynebacterium diphtheriae - были обнаружены Т.

Клебсом (1883) и выделены в чистом виде Ф. Леффлером (1884).

Морфология. Возбудители дифтерии слегка изогнутые, тонкие палочки,

размером 3-6 × 0,3-0,5 мкм, на концах которых имеются утолщения. В этих
утолщениях имеются зерна волютина (зерна Бабеша - Эрнста). Бактерии дифтерии
неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамположительны. Они хорошо
окрашиваются основными анилиновыми красителями, при этом волютиновые зерна
окрашиваются интенсивнее. Для окраски обычно применяют щелочной
метиленовый синий или кристаллический фиолетовый. Особенностью
коринебактерий дифтерии является их полиморфность; в одной кулатуре
встречаются различные по форме и размерам палочки: изогнутые, прямые,
длинные, короткие, толстые, иногда коккобактерии. Характерно расположение
бактерий в мазках - они обычно располагаются попарно под острым или тупым
углом, в виде растопыренных пальцев и т. д. Расположение в мазках и наличие
зерен волютина является дифференциально-диагностическим признаком при
микроскопическом исследовании. Непатогенные представители рода
коринебактерий - ложнодифтерийные палочки и дифтериоды чаще располагаются в
виде частокола, зерна волютина у них могут отсутствовать либо быть на одном
конце (см. рис. 4).

Культивирование. Коринебактерий дифтерии - факультативные анаэробы.

Растут при температуре 35-37° С, рН среды 7,4-7,8. Они не размножаются на
обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или
сыворотку.
 В конце XIX века французский ученый Э. Ру для культивирования бактерий
дифтерии предложил использовать свернутую бычью или лошадиную сыворотку, а
Ф. Леффлер рекомендовал добавлять к ней бульон (25%) и 1% глюкозу. На этих
средах коринебактерий растут быстро, в течение 14-18 ч образуют несливающиеся
выпуклые колонии кремового цвета (рост на скошенной среде напоминает
шагреневую кожу). Однако отдифференцировать на этих средах дифтерийные
палочки от ложнодифтерийных невозможно.

В настоящее время основными средами для выращивания являются среда

Клауберга (содержащая сыворотку крови и теллурит калия), хинозольная среда
Бунина, среда Тинсдаля и др. На основании культуральных и ферментативных
свойств коринебактерий дифтерии делят на три биовара: гравис (gravis), ми тис
(mitis), интермедиус (intermedins). Биовар гравис обычно находится в R-форме. На
среде Клауберга бактерии этого биовара растут в виде крупных колоний 2-3 мм,
серовато-черного цвета (так как восстанавливают теллурит в теллур), имеют
изрезанные края, что придает им вид розетки. При прикосновении к колонии петлей
она как бы рассыпается. На бульоне бактерии этого биовара образуют крошащуюся
пленку и зернистый осадок.

Коринебактерии биовара митис (mitis) на среде Клауберга растут в виде

небольших, гладких колоний (S-форма) черного цвета. На бульоне они дают
равномерное помутнение.

Коринебактерии биовара интермедиус (intermedins) являются промежуточными.

На среде Клауберга бактерии этого биовара чаще растут в виде блестящих, мелких,
черных колоний (этот биовар встречается редко).

Ферментативные свойства. Все три биовара дифтерийных бактерий обладают

ферментом цистиназой, расщепляющим цистин с образованием сероводорода. Эти
свойства используются для дифференциации возбудителей дифтерии от
непатогенных представителей этого рода (табл. 49).

Таблица 49. Свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий

Примечание. + положительная реакция (расщепляет); - отрицательная реакция

(не расщепляет).

Возбудители всех трех биоваров расщепляют глюкозу и мальтозу до образования

кислоты. С. gravis расщепляют крахмал. Это свойство отличает его от двух других
биоваров. Коринебактерий дифтерии восстанавливают нитраты в нитриты, не
образуют индол, не разлагают мочевину.
 Коринебактерии дифтерии образуют нейраминидазу, гиалуронидазу и другие
ферменты патогенности.

Токсинообразование. Вирулентные штаммы возбудителей дифтерии

продуцируют экзотоксин. Химически он представляет собой термолабильный
белок, состоящий из Двух фракций. Фракция В фиксирует токсин на
чувствительных к нему тканях организма. Фракция А ответственна за токсическое
действие. Силу токсина дифтерийных культур можно устанавливать "in vivo" на
чувствительных к этому токсину морских свинках. Dim дифтерийного экзотоксина
- минимальная смертельная доза, это минимальное количество яда, убивающее
морскую свинку массой 250 г на 4-й день.

Наличие экзотоксина можно обнаружить также "in vitro" - на плотной

питательной среде. Этот метод широко используется в практической работе.
Дифтерийный экзотоксин малоустойчив. Он быстро разрушается под влиянием
температуры, света и кислорода воздуха. После добавления к токсину формалина
(0,3-0,4%) и выдерживания его при температуре 37-38° С в течение нескольких
недель он переходит в анатоксин, который теряет ядовитость, но сохраняет
антигенные свойства токсина. Токсины, образуемые различными штаммами, не
различаются между собой и могут быть нейтрализованы дифтерийным
антитоксином*.
*
(В настоящее время установлено, что все биовары коринебактерий могут быть токсигенными и
нетоксигенными.)

Антигенная структура. У бактерий дифтерии имеется поверхностный

термолабильный белковый антиген и типоспецифический полисахаридный О-
антиген. Кроме этого, среди коринебактерий различают 19 фаговаров, которые
учитываются при идентификации культур. С помощью фаговаров выявляют
источник заболевания.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Возбудители дифтериии

сравнительно устойчивы. Температура 60° С убивает их через 10-15 мин, 100° С -
через минуту. В пленке они выдерживают нагревание до 90° С. На свернутой
сыворотке при комнатной температуре сохраняются до 2 мес, на детских игрушках
- несколько суток. Низкие температуры коринебактерий переносят хорошо. К
высушиванию возбудители дифтерии довольно устойчивы. Дезинфицирующие
вещества (3% раствор фенола, 1% раствор сулемы, 10% раствор перекиси водорода)
убивают эти бактерии в течение нескольких минут.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные дифтерией

не болеют. Из экспериментальных животных наиболее восприимчивы морские
свинки и кролики. При внутрикожном или подкожном заражении у них развивается
картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека,
некроза. В надпочечниках наблюдаются кровоизлияния.

Источники заболевания. Больные люди и бактерионосители.

Пути передачи. Воздушно-капельный путь, контактно-бытовой (через посуду,

игрушки, книги, полотенца и т. д.).
 Заболевание у человека: 1) дифтерия зева; 2) дифтерия носа.

Реже возникает дифтерия трахеи, бронхов, глаз, уха, влагалища и дифтерия

поврежденной кожи.

Патогенез. Входными воротами являются слизистые оболочки дыхательных

путей и поврежденная кожа. Попав на слизистую оболочку, возбудители дифтерии
размножаются в месте внедрения и вызывают некроз ткани. Образуется пленка,
тесно связанная с подлежащими тканями. На поверхности слизистой появляются
грязно-серые или желтоватые налеты, состоящие из разрушенного эпителия,
фибрина, лейкоцитов и коринебактерий дифтерии. При снятии пленки ватным
тампоном или шпателем поверхность слизистой может кровоточить.

В процессе размножения коринебактерий дифтерии в некротических участках

накапливается экзотоксин, который может привести к отеку слизистой оболочки и
клетчатки. Со слизистой оболочки отек может распространяться на гортань, бронхи
и вызвать явления асфиксии. Токсин, циркулирующий в крови, избирательно
поражает сердечную мышцу, надпочечники и клетки нервной ткани.

Дифтерия - это токсикоинфекция. Тяжесть процесса зависит от степени

токсигенности штамма и от защитных сил организма.

Иммунитет. Невосприимчивость обусловливается антитоксическим и

антибактериальным иммунитетом. Грудные дети не болеют, так как у них имеется
пассивный иммунитет, переданный от матери.

О наличии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика. Для

постановки реакции 1/40 Dlm (летальной дозы токсина для морской свинки),
содержащегося в 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида, вводят
внутрикожно в области предплечья. При отсутствии в крови антитоксина в месте
введения через 24-48 ч появляется краснота и припухлость (до 2 см в диаметре).
При наличии антитоксина припухлости и красноты нет (имеющийся в крови
антитоксин нейтрализовал введенный токсин).

Перенесенное заболевание оставляет иммунитет. Однако в 6-7% случаев

наблюдаются повторные заболевания.

Профилактика. Ранняя диагностика. Изоляция. Дезинфекция. Выявление

носителей токсигенной дифтерийной палочки.

Специфическая профилактика осуществляется введением анатоксина. В СССР

проводят обязательную вакцинацию детей вакциной АКДС - это комплексная
вакцина, в которую входят дифтерийный и столбнячный анатоксин и взвесь убитых
коклюшных палочек. Вакцинируют детей с 5-6 месяцев с последующей
ревакцинацией. Для ревакцинации вводят вакцину без коклюшных палочек.

Специфическое лечение. Применяют противодифтерийную антитоксическую

сыворотку. Доза и кратность определяется лечащим врачом, вводят также
антимикробные препараты.
 Контрольные вопросы
1. Какова морфология коринебактерий дифтерии и какие имеются биовары?

2. На каких средах выращивают бактерии дифтерии и каков характер роста?

3. Отношение к какому углеводу позволяет отличить биовар gravis от других

биоваров дифтерии?

4. Каков путь передачи и где чаще локализуется возбудитель дифтерии у

больного?

5. Каковы специфическая профилактика и специфическое лечение дифтерии?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выделение возбудителя для постановки диагноза. Выявление
бактерионосителей дифтерии по эпидемиологическим показаниям. Выявление
экзотоксина у выделенной культуры.

Материал для исследования

1. Отделяемое слизистой оболочки зева.

2. Отделяемое слизистой оболочки носа.

3. Отделяемое слизистой оболочки глаза.

4. Гной из уха.

5. Отделяемое слизистой оболочки влагалища.

6. Отделяемое раны.

Материал для исследования зависит от локализации процесса.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

При любой локализации процесса обязательно исследует слизистую зева и носа.

Материал собирают ватным тампоном, для чего используют металлическую
проволоку, желательно алюминиевую, на один конец которой плотно накручивают
вату, затем тампон монтируют в корковую пробку, помещают в пробирку и
стерилизуют в печи Пастера при температуре 160° С 1 тампон течение часа или в
автоклаве при температуре 112° С.

Примечания. 1. Материал собирают натощак либо не раньше чем через 2 ч после

еды и не ранее чем через 4 дня после лечения антибиотиками или другими
антибактериальными средствами. 2. Если материал берут из зева и носа, то
пробирки с обоими тампонами надписывают и связывают вместе. Посевы делают
раздельно и исследование материала из каждого тампона ведут как
самостоятельную работу. 3 Материал, собранный сухим тампоном, должен быть
посеян не позднее чем через 2-3 ч после забора. При необходимости
транспортировки собранного материала тампон предварительно смачивают 5%
раствором глицерина в изотоническом растворе натрия хлорида.

Основные методы исследования

1. Микробиологический.

2. Бактериоскопический.

3. Биологический.

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Чашки вынимают из термостата и просматривают. Рост бактерий на среде

Клауберга может быть замедлен из-за наличия ингибиторов в среде. В этом случае
чашки ставят в термостат еще на 24 ч.
 Третий день исследования

Чашки вынимают из термостата, просматривают их с помощью лупы или

стереоскопического микроскопа. При наличии подозрительных колоний часть их
под контролем стереоскопического микроскопа выделяют на агар с 25%
сывороткой и на столбик со средой Пизу для определения фермента цистиназы. Из
другой части колоний ставят пробу на токсигенность.

При микроскопическом исследовании колоний, снятых со среды Клауберга,

коринебактерии дифтерии теряют свою специфичность: отсутствует зернистость,
изменяется величина, расположение сохраняется. При посеве их на среды с
сывороткой морфологическая специфичность возбудителей дифтерии
восстанавливается.

Проба на наличие фермента цистиназы и определение токсигенности являются

обязательными при идентификации возбудителей дифтерии. Если результат этих
опытов, проведенных с частью колоний со среды Клауберга, недостаточно четкий
или отрицательный, то опыт повторяют, используя выделенную чистую культуру.

Проба на цистиназу. Проводят посев исследуемой культуры уколом в центр

столбика среды Пизу. При положительной реакции через 18-24 ч по ходу укола
наблюдается почернение, а вокруг черного стержня образуется темное облачко;
почернение происходит в результате того, что фермент цистиназа расщепляет
цистин, входящий в состав среды Пизу, и освободившаяся сера вступает в реакцию
с ацетатом свинца - образуется сульфит свинца черного цвета. Дифтероиды и
ложнодифтерийные палочки не содержат фермент цистиназу, поэтому при росте их
на среде Пизу цвет среды не изменяется.

Определение экзотоксина. Проводят методом диффузной преципитации в геле.

Метод основан на взаимодействии токсина с антитоксином. В тех участках агара,
где эти компоненты взаимодействуют, образуется преципитат в виде закругленных
линий.

Методика определения: в чашки Петри разливают растопленный и охлажденный

до 50° С агар Мартена рН 7,8 (на агаре Мартена лучше продуцируется экзотоксин).
Количество агара в чашке должно быть не более 12-15 мл, чтобы сохранить
прозрачность, - в толстом слое линии преципитации плохо видны. После
застывания агара накладывают полоску стерильной фильтровальной бумаги,
смоченной противодифтерийной антитоксической сывороткой.

Испытуемую культуру засевают "бляшками". Посев производят петлей. Диаметр

бляшек 0,8-1,0 см. Расстояние бляшек от края полосок бумаги 0,5-0,7 см, между
двумя бляшками испытуемой культуры засевают бляшки заведомо токсигенного
штамма. Испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации
четки и сливаются с линиями преципитации контрольного (токсигенного) штамма.
Если линии преципитации перекрещиваются с линиями контрольного штамма или
отсутствуют, выделенную культуру считают нетоксигенной (рис. 50).
 Рис. 50. Выявление экзотоксина C.Diphtheriae методом диффузной преципитации в
агаре. 1 - бляшки нетоксигенного штамма (линии преципитации перекрещиваются); 2
- бляшки токсигенного штамма (линии преципитации соединяются)

Приготовление полосок бумаги. Из фильтровальной бумаги нарезают полоски

размером 1,5×8 см, заворачивают по несколько штук в бумагу и стерилизуют в
автоклаве при температуре 120° С в течение 30 мин. Перед постановкой опыта
стерильным пинцетом вынимают одну полоску, укладывают ее в стерильную чашку
Петри и смачивают противодифтерийной антитоксической сывороткой.
Предварительно сыворотку разводят так, чтобы в 1 мл содержалось 500 АЕ
(антитоксических единиц). Бумажку смачивают 0,25 мл сыворотки (125 АЕ) и
помещают на поверхность среды. Затем делают посевы указанным выше способом.
Все посевы ставят в термостат. Учет результатов производят через 18-24 и 48 ч.

Четвертый день исследования

Вынимают посевы из термостата, учитывают результат. Делают мазки из

культуры, выросшей на среде с сывороткой, и окрашивают их синим Леффлера.

Наличие в мазках характерных по морфологии палочек, черного с облачком

стержня в среде Пизу и линий преципитации в агаре позволяет дать
предварительный ответ: "Обнаружены коринебактерии дифтерии". Исследование
продолжают. При отсутствии линий преципитации в агаре или их недостаточной
четкости исследование на токсигенность обязательно повторяют с выделенной
чистой культурой.

Для окончательной идентификации выделенной культуры и определения биовара

возбудителя производят посев на глюкозу, сахарозу, крахмал и бульон с мочевиной
(для выявления фермента уреазы). Посев на среды делают обычным способом.

Проба на уреазу. Выделенную культуру засевают на бульон с мочевиной и

индикатором (крезоловый красный) и ставят в термостат. Уже через 30-40 мин
можно учитывать результат: при посеве истинных возбудителей дифтерии цвет
среды не изменяется, так как они не содержат уреазу. Псевдодифтерийные палочки
расщепляют мочевину и изменяют индикатор - среда приобретает малиново-
красный цвет.

Пятый день исследования

Производят учет результатов (табл. 50).

Таблица 50. Ферментативные свойства выделенных возбудителей

Контрольные вопросы

1. Какой материал исследуют для выявления возбудителя дифтерии?

2. Как собирают материал для исследования на дифтерию из зева и носа?

3. Что нужно сделать с тампоном, если собранный материал необходимо

транспортировать?

4. При помощи какого прибора изучают колонии на среде Клауберга?

5. Какие исследования проводят для окончательной идентификации выделенной

культуры?

6. Какими методами определяют токсигенность коринебактерий дифтерии?

Задание

1. Возьмите у преподавателя проволоку и вату и приготовьте 10 тампонов,

вмонтируйте их в корковую пробку, вставьте в пробирку и простерилизуйте.

Внимание! Перед стерилизацией проверьте, достаточно ли плотно накручен

тампон.

2. Возьмите у преподавателя стерильные тампоны и произведите забор материала

друг у друга из зева и носа (разными тампонами).

3. Изучите по табл. 49 свойства возбудителей дифтерии и близких к ним

коринебактерий.

4. Поставьте пробу на токсигенность. Бляшки сделайте петлей без культуры.

5. Зарисуйте ход исследования и положительный и отрицательный результат

пробы на токсигенность.
 Питательные среды

Теллуровая среда Клауберга: первая смесь - предварительно за 1,5 мес готовят

смесь из 20 мл бараньей или лошадиной крови и 10 мл глицерина. В день
приготовления среды готовят две другие смеси; вторая смесь - 50 мл МПА рН 7,5
растапливают и охлаждают до температуры 50° С, после чего прибавляют 2,5 мл
первой смеси; третья смесь - смешивают 17 мл бараньей крови и 33 мл
дистиллированной воды (смесь приготавливают стерильно), подогревают на
водяной бане до температуры 50° С. Соединяют вторую и третью смеси,
прибавляют 4 мл 1% раствора теллурита калия К 2ТеО3, быстро все перемешивают и
разливают в чашки. Среда прозрачная, имеет цвет красного вина.

Среда Пизу. К 90 мл расплавленного 2% МПА (рН 7,6) добавляют 2 мл раствора

цистина (1% раствор цистина в 0,1 н. растворе гидроксида натрия), тщательно
перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 н. раствора серной кислоты. Среду
стерилизуют 30 мин при температуре 112° С. К расплавленной и охлажденной до
50° С среде добавляют 1 мл 10% раствора ацетата свинца, стерилизованного
двукратно текучим паром, перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной
сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев
производят уколом.

Среда Бунина. Сухую хинозольную среду добавляют к 100 мл холодной воды

(рН 7,6-7,8), размешивают и нагревают на слабом огне до расплавления агара (по
прописи на этикетке). Затем среду кипятят 2-3 мин до образования пены, после чего
среду остужают до 50° С и добавляют 5-10 мл стерильной дефибринированной
крови. Среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовую среду можно
сохранять 3-4 дня при температуре 4-10°.

Среда Тинсдаля. К 100 мл 2% питательного агара, расплавленного и

охлажденного до 50° С, добавляют: 1) 12 мл 1% раствора цистина на 0,1 н. растворе
серной кислоты; 2) 12 мл 1% раствора гидроксида натрия; 3) 1,8 мл 2% раствора
теллурита калия; 4) 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия, 20 мл нормальной
лошадиной или бычьей сыворотки. После добавления каждого ингредиента среду
тщательно перемешивают. Чашки со средой хранят 3-4 дня при 10° С.

Патогенные микобактерии - Ф. К. Черкес

Глава 33. Возбудители туберкулеза
Представители семейства микобактерий Mycobacteriaceae имеют вид тонких,
иногда ветвистых палочек, чем напоминают гриб. Медленный рост на питательных
средах также сближает их с грибами. Эти особенности объясняют название
семейства, рода - Mycobacterium.

Микобактерий кислото-щелоче- и спиртоустойчивы, что обусловливается

наличием в оболочках их клеток жировосковых веществ.

Род микобактерий включает патогенных и непатогенных представителей.

Патогенными для человека являются возбудители туберкулеза и возбудитель
лепры.
 Туберкулез широко распространен среди животных, птиц, грызунов.

Существуют несколько видов туберкулезных палочек:

1. Человеческий - Mycobacterium tuberculosis

2. Бычий - Mycobacterium bovis

3. Птичий - Mycobacterium avium

4. Мышиный - Mycobacterium murium

5. Встречаются микобактерий, вызывающие заболевания у холоднокровных. К

ним относится особая группа атипичных микобактерий.

В настоящее время атипичные микобактерий приобретают особое значение. Их

делят по ряду признаков на 4 группы: I, II, III, IV (по Раньону). Они отличаются от
микобактерий туберкулеза меньшей требовательностью к питательным средам.
Между собой они различаются по отношению к питательным средам, скорости
роста, по способности образовывать пигмент, а также по каталазной и
пероксидазной активности. Вызывают заболевания у человека представители групп
I и III.

Морфология. Возбудители туберкулеза были открыты р. Кохом в 1882 г. Это

тонкие палочки величиной 1,5-4 × 0,3-0,5 мкм. Они очень полиморфны:
встречаются прямые, изогнутые, колбовидные. Как результат изменчивости
бактерий, имеются кислотоподатливые формы и очень мелкие, так называемые
зерна Муха. Разнообразие форм нередко зависит от состава среды, воздействия на
них антибиотиков и химиотерапевтических средств. Бактерии туберкулеза
неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамоположительны, однако они плохо
воспринимают анилиновые краски. Хорошо окрашиваются в красный цвет по
методу Циля- Нильсена (см. рис. 4), где используются концентрированные краски и
протравливание.

Культивирование. Возбудители туберкулеза - аэробы. Растут при температуре

37-38° С и рН среды 5,8-7,0, Отличительными культуральными особенностями
туберкулезной палочки являются медленный рост и требовательность к
питательным средам. Первично они растут только на специальных средах: среде
Петраньяни, Петрова, Левенштейна - Йенсена. Их можно выращивать на
глицериновом бульоне, глицериновом агаре, глицериновом картофеле. Глицерин
стимулирует рост микобактерий. М. bovis не нуждаются в глицерине. Наибольшее
распространение получила среда Левенштейна - Йенсена, которая рекомендована
ВОЗ в качестве стандартной среды для выращивания туберкулезных палочек. В
настоящее время пользуются также средой Финна II, которая отличается от среды
Левенштейна - Йенсена тем, что вместо аспарагина в ней используется глутамин
натрия. На этой среде микобактерий туберкулезарастут несколько быстрее, чем на
среде Левенштейна - Йенсена, и процент выделения культур выше. Туберкулезные
палочки можно культивировать и на синтетических средах, например среде Сотона.

Микобактерий туберкулеза встречаются в R- и S-форме. Более вирулентной

является R-форма (М. bovis чаще встречается в R-форме). На плотных питательных
средах возбудители туберкулеза образуют сухие морщинистые колонии кремового
цвета с чуть приподнятым Центром и изрезанными краями (см. рис. 26). В жидких
питательных средах микобактерий туберкулеза вырастают на 10-15-й день в виде
пленки, которая постепенно утолщается, становится грубой, морщинистой, ломкой
и в силу тяжести иногда падает на дно. Бульон под пленкой остается прозрачным.

Ферментативные свойства. Возбудители туберкулеза биохимически мало

активны. У них обнаружен протеолитический фермент, который в определенных
условиях (кислая и щелочная среда) расщепляет белок. Они расщепляют также
некоторые углеводы, образуют уреазу. Но свойства эти непостоянны. Поэтому
изучение ферментов не имеет диагностического значения.

Токсинообразование. Возбудители туберкулеза образуют эндотоксин - это

белковое вещество впервые выделил Р. Кох (1890) и назвал его туберкулином.
"Старый" туберкулин - это культуральная жидкость, полученная при росте
культуры в глицериновом бульоне и выпаренная при 70° С до 1/10 своего
первоначального объема. "Новый" туберкулин - очищенный белковый дериват
туберкулина.

Туберкулин обладает свойствами аллергена. Он не оказывает токсического

действия на здоровый организм. Его действие проявляется только в зараженном
организме. Поэтому введение туберкулина используют с диагностической целью, в
постановках аллергических проб (Пирке или Манту). Для этой цели туберкулин
готовят из бычьего типа микобактерий туберкулеза.

Вирулентные штаммы возбудителей туберкулеза содержат особый липид корд-

фактор, который способствует склеиванию микобактерий и росту их в виде кос и
тяжей.

Антигенная структура. Микобактерий туберкулеза содержат антиген, в

который входят белковые, липоидные и полисахаридные факторы. Этот антиген
вызывает в организме выработку антител (агглютининов, преципитинов,
комплементсвязывающих веществ и др.). Однако эти антитела обнаруживаются в
малых концентрациях, поэтому практически с целью диагностики мало
используются.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Микобактерий туберкулеза

самые устойчивые из неспороносных форм бактерий (устойчивость
обусловливается наличием в их оболочке липидов). Температуру 100° С они
переносят в течение 5 мин. УФ-лучи вызывают их гибель только через несколько
часов.

В высохшей мокроте они живут до 10 мес. При низких температурах

микобактерий туберкулеза длительно сохраняются.

Дезинфицирующие растворы: сулема (1:1000), карболовая кислота (5%) губят их

только через сутки. Наиболее чувствительны они к хлорамину и хлорной извести.

Восприимчивость животных. К М. tuberculosis человек очень чувствителен,

животные и птицы малочувствительны. Из экспериментальных животных к нему
высокочувствительны морские свинки, у которых инфекция протекает
генерализованно и заканчивается обычно гибелью животного.

К M. bovis чувствительны крупный и мелкий домашний скот и домашние

животные (человек малочувствителен, но дети могут заражаться при использовании
молока больных животных).

Из экспериментальных животных наиболее чувствительны кролики, у которых

инфекция протекает генерализованно. М. avium вызывает заболевание у птиц: кур,
голубей, фазанов и т. д. Однако могут болеть и некоторые животные (человек редко
заражается).

Из экспериментальных животных чувствительны кролики. Инфекция протекает у

них остро.

Мышиный вид патогенен главным образом для полевок. У кроликов и морских

свинок заболевание протекает в хронической форме.

Источники инфекции. Человек. Реже животные.

Пути передачи. Наиболее частые пути передачи - воздушно-капельный и

воздушно-пылевой; реже пищевой. Возможно внутриутробное инфицирование
через плаценту.

Заболевания у человека и патогенез. Заболевание туберкулезом

характеризуется многообразием клинических форм. Различают легочную (наиболее
часто встречающуюся) и внелегочные формы: туберкулез желудка и кишечника,
почек, мозговых оболочек, костей и других органов.

Каждая из этих форм может закончиться генерализацией процесса. При

воздушно-капельном и воздушно-пылевом заражении первичный очаг возникает в
легком. В пораженном органе образуется бугорок - tubercul. Бугорок представляет
собой скопление лейкоцитов и гигантских клеток, внутри которых находятся
микобактерий туберкулеза. При хорошей сопротивляемости организма
соединительная ткань окружает бугорок, он обызвествляется и бактерии, оставаясь
жизнеспособными, не выходят за пределы бугорка. Таков "очаг Гона" -
обызвествленный, небольшой очаг на месте первичного внедрения туберкулезной
палочки (закрытый процесс).

При закрытом процессе палочки туберкулеза не выделяются с мокротой, мочой и

др.

Таким образом, даже при доброкачественном течении процесса организм не

освобождается от возбудителей туберкулеза. Считают, что 80% людей
инфицированы туберкулезными бактериями. Однако клинически они здоровы.
Когда организм попадает в неблагоприятные условия, защитные функции его
снижаются, бугорок подвергается некрозу, бактерии высвобождаются и вовлекают
в процесс новые участки, наступает обострение, образуются каверны - открытый
процесс. Иногда может быть генерализация процесса, которая приводит организм к
гибели. Чаще туберкулез протекает в хронической форме (закрытый процесс).
Большое значение при обострении имеют условия труда и быта.
 Иммунитет. Человек обладает определенной резистентностью, т. е. при
заражении не всегда возникает заболевание, а образуется инфекционный
(нестерильный) иммунитет, который обусловливается комплексом защитных
факторов: гуморальных, клеточных, а также резистентностью органов и тканей.

Профилактика. Ранняя диагностика, изоляция и т. д. Для специфической

профилактики используется живая вакцина БЦЖ (BCG), полученная французскими
учеными Кальметтом и Гереном. Эту вакцину вводят новорожденным однократно,
внутрикожно в наружную поверхность плеча. Ревакцинацию проводят через 7-12
лет, а затем через каждые 5-6 лет до 30 лет.

Лечение. Антибактериальные препараты: стрептомицин, рифампицин, ПАСК,

фтивазид и др.

Контрольные вопросы
1. Кем и когда был открыт возбудитель туберкулеза?

2. На какие типы делится туберкулезная палочка? Какой тип патогенен для

человека?

3. Что обусловливает устойчивость микобактерий туберкулеза?

4. Каким методом окрашивают мазки для обнаружения туберкулезных

микобактерий?

5. На какие формы диссоциируют микобактерий туберкулеза и какая форма

является патогенной?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление возбудителя.

Материал для исследования

1. Мокрота (туберкулез легких и бронхов).

2. Экссудат из плевральной полости (туберкулез легких, плевры).

3. Асцитическая жидкость и кал (кишечная форма туберкулеза).

4. Моча (туберкулез почек).

5. Спинномозговая жидкость (туберкулезный менингит).

6. Кровь (генерализация процесса).

Способы сбора материала

 Способы сбора материала

Примечание. Баночки для сбора материала должны быть с завинчивающимися

пробками. Посуду для сбора материала стерилизуют в автоклаве при 120° С в
течение 20 мин или кипячением в течение 1 ч.

Основные методы исследования

1. Бактериоскопический.

2. Люминесцентный.

3. Бактериологический

4. Биологический.

5. Аллергический.

Ход исследования

Ход исследования

Контрольные вопросы

1. На каких питательных средах выращивают микобактерии туберкулеза и какова

длительность их роста?

2. Чем и для чего обрабатывают мокроту до посева ее на питательные среды?

3. Опишите рост туберкулезной палочки на плотной и жидкой питательных

средах.

4. Какое животное является наиболее чувствительным к человеческому типу

туберкулезной палочки?

Питательные среды
 Среда Левенштейна - Йенсена: солевой раствор; однозамещенный фосфат калия -
2,4 г; магния сульфат - 0,24 г; магния цитрат 10,6 г; аспарагин - 3,6 г; глицерин - 12
мл; картофельная мука - 5 г; вода дистиллированная - 600 мл.

Реактивы растворяют в указанной последовательности при слабом подогреве и

стерилизуют 2 ч текучим паром. Солевая основа может быть приготовлена с
запасом на 3-4 нед.

Яичная масса. 24-27 (в зависимости от величины) свежих диетических яиц моют

проточной теплой водой, щеткой с мылом, погружают на 30 мин в 70% спирт, затем
над спиртовкой в боксе разбивают стерильным пинцетом в колбу с бусами, хорошо
размешивают и к 1 л яичной массы добавляют 600 мл солевого раствора. Смесь
фильтруют через марлевый фильтр, добавляют 20 мл стерильного 2% раствора
малахитового зеленого и разливают в пробирки по 5 мл. Свертывание производят
при 85° С в течение 45 мин.

Среда Финна II. Солевая основа: магния сульфат - 0,5 г; натрия цитрат - 1 г;
квасцы железоаммиачные - 0,05 г; калия фосфат однозамещенный - 20 г; аммония
цитрат однозамещенный - 20 г; натрия глутамат однозамещенный - 5 г; глицерин -
20 мл; вода дистиллированная - до 1 л.

Ингредиенты растворяют в указанном порядке в теплой дистиллированной воде.

Устанавливают рН 6,3-6,5. Стерилизуют при 1 атм 20 мин.

Яичная среда. 12 яиц моют щеткой с мылом, обрабатывают спиртом. Разбивают

стерильным пинцетом и выливают в стерильную колбу с бусами, которую после
добавления каждого яйца встряхивают до образования однородной массы.
Добавляют 10 мл 20% водного раствора малахитового зеленого и 300 мл солевого
раствора. Фильтруют через марлевый фильтр и свертывают при температуре 85° С
в течение 30 мин.

Синтетическая среда Сотона. К 200 мл дистиллированной воды добавляют 4 г

аспарагина, 0,5 г цитрата железа, 2 г лимонной кислоты, 0,5 г сульфата магния, 0,5 г
основного фосфата калия, 60 г глицерина, 800 мл дистиллированной воды.

Патогенные анаэробы - Ф. К. Черкес

Патогенные анаэробы относятся к семейству Bacillaceae, роду Clostridium.
Анаэробы - обширная группа микроорганизмов, среди которых патогенны для
человека: 1) клостридии столбняка; 2) клостридии газовой гангрены
(полимикробная инфекция); 3) клостридии ботулизма.

Патогенные анаэробы являются постоянными обитателями кишечника животных

и человека, с испражнениями которых выделяются во внешнюю среду. В виде спор
они длительно сохраняются в почве, морской и пресной воде.

Патогенные клостридии - крупные палочки размером 4-9 × 0,6-1,2 мк, Молодые

культуры грамположительны, старые теряют способность окрашиваться по Граму.
Все клостридии образуют споры овальной или круглой формы, располагающиеся
терминально, субтерминально или центрально. Большинство анаэробов подвижны.
Жгутики располагаются перитрихиально. Клостридии продуцируют экзотоксины
высокой биологической активности.

Методы культивирования

Культивируют анаэробы в безкислородных условиях. Существует несколько

способов удаления кислорода при их культивировании: физические и
биологические.

Физические методы. Удаление кислорода механическим путем. Удаление

воздуха осуществляется в анаэростате - герметически закрывающемся приборе с
устройством для откачивания воздуха. Портативный (переносной) анаэростат -
небольшой цилиндр с герметически закрывающейся крышкой и краном для
откачивания воздуха. Посевы устанавливают в анаэростат, создают вакуум в
аппарате и ставят в термостат. Этот аппарат может быть заменен эксикатором.

Культивирование в атмосфере инертного газа. Воздух в анаэростате замещается

азотом, смесью азота с углекислым газом или водородом.

Культивирование в высоком столбике агара с глюкозой. Микроорганизмы растут

на дне, защищенные от воздуха высоким слоем среды.

Метод Виньяля - Вейона. Посев производят в пробирку с расплавленным и

остуженным до 45° С агаром. Содержимое пробирки перемешивают и насасывают в
пастеровскую пипетку, заполняя ее до верха. Надо следить, чтобы в пипетку не
попали пузырьки воздуха. Тонкий конец пипетки запаивают, опускают в пробирку с
ватой на дне и переносят в термостат. В толще агара вырастают изолированные
колонии. Распилив капилляр пипетки, их извлекают.

Биологические методы. Совместное выращивание анаэробов и аэробов. В

чашку Петри наливают толстым слоем агар с 5% крови. По диаметру чашки делают
в агаре желобок, чтобы культуры не смешивались. На одну половину засевают
культуру аэроба, на другую - анаэроба. Края чашки заливают парафином. Посевы
помещают в термостат. Сначала вырастают аэробы, после того как они поглощают
весь кислород, находящийся в чашке, начинают расти анаэробы.

Добавление в среду редуцирующих (окисляющих) веществ. Используют среду

Китта - Тароцци, содержащую в качестве редуцирующих веществ 0,5% раствор
глюкозы и кусочки мяса. Перед посевом среду кипятят 20 мин на водяной бане -
удаляют растворенный в ней кислород. Быстро остужают до 45° С и засевают, не
дав среде вновь насытиться кислородом. Сразу после посева в пробирку на
поверхность среды наливают стерильное масло слоем 1-1,5 см, чтобы защитить
посев от воздуха. Посевы выращивают в термостате.

Питательные среды

Среда Китта - Тароцци. Бычью печень или мясо нарезают мелкими кусочками,
заливают троекратным количеством питательного бульона рН 7,4-7,6, кипятят 30
мин. Бульон фильтруют. Печень промывают на сите водой, распределяют в
пробирки по 3-4 кусочка в каждую, заливают 7-8 мл бульона. Стерилизуют под
давлением 1 атм 30 мин.
 Кровяной агар. 3% МТТА с 1-2% глюкозы рН 7,2-7,4 смешивают с 15-20%
свежей дефибринированной крови барана или лошади. Разливают в чашки Петри.
Подсушивают в термостате 20-30 мин. Можно пользоваться кровью кролика или
морской свинки, взятой из сердца стерильно, в количестве 5-1% среды.

Среда Вильсона - Блера. 100 мл 3% МПА с 1% глюкозы расплавляют на

водяной бане, добавляют 10 мл 20% натрия сульфита и 1 мл 8% раствора железа
хлорида. Оба раствора готовят на стерильной дистиллированной воде и кипятят.
Приготовленную среду разливают в пробирки по 7-8 мл.

Среда Виллиса - Хоббса. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара,

4,8 г лактозы, 1,8 мл 1% раствора нейтрального красного. Автоклавируют,
охлаждают до 50-55° С, добавляют 15 мл суспензии куриного желтка с
изотоническим раствором натрия хлорида и 60 мл стерильного обезжиренного
молока.

Существуют элективные среды для отдельных видов, типов бацилл и среды для
лучшего токсинообразования.

В настоящее время широко применяются казеиново-дрожжевые, казенново-

грибные, рыбокукурузные и другие среды.

Устойчивость к факторам окружающей среды

Вегетативные формы анаэробов мало устойчивы. Споры очень устойчивы к

физическим и химическим факторам: они переносят кипячение от 15-20 мин до
нескольких часов в зависимости от вида, типа и штамма бацилл. Устойчивы также к
низким температурам и высушиванию.

Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их только после

длительной экспозиции (12-14 ч). Особенно устойчивы споры возбудителей
ботулизма.

Токсины анаэробов, как и большинство экзотоксинов, чувствительны к высоким

температурам, действию прямых солнечных лучей и дезинфицирующих веществ.
Экзотоксин С. botulinum обладает высокой устойчивостью - разрушается только
при 15-20-минутном кипячении.

Контрольные вопросы
1. Каковы условия культивирования анаэробов?

2. В чем основное отличие условий культивирования аэробов от анаэробов?

3. Что такое анаэростат?

4. Какие существуют методы культивирования анаэробов?

5. Благодаря чему создаются анаэробные условия для культивирования на среде

Китта - Тароцци?
 Глава 34. Возбудитель столбняка
Возбудитель столбняка Clostridium tetani описал Николайер в 1884 г. В чистой
культуре получил Китазато в 1889 г.

Морфология. С. tetani - палочки размером 4-8 × 0,4-1 мкм с закругленными

краями. Подвижны. Жгутики располагаются перитрихиально. Капсул не образуют.
Образуют споры шаровидной формы, расположенные терминально, что придает
бацилле вид барабанной палочки. Грамположительны. Старые культуры иногда
теряют способность окрашиваться по Траму. Споры при окраске по Траму или
метиленовым синим имеют вид колечек (см. рис. 4).

Культивирование. Возбудитель столбняка - строгий анаэроб.

Высокочувствителен к кислороду. Поэтому палочки хорошо размножаются в
глубине высокого столбика агара. Специальными средами для их выращивания
служат: среда Вейнберга в модификации ЦИЭМ, среда Виллиса и Хоббса, среда
Китта - Тароцци и др. Жидкие среды заливают слоем вазелинового масла для
создания анаэробных условий. Перед посевом из среды удаляют кислород путем
кипячения в водяной бане и быстрого охлаждения до температуры 40-50° С.
Возбудители столбняка растут при температуре 35-37° С и рН среды 6,8-7,4. На
плотных питательных средах рост появляется на 3-4-й день. Выросшие колонии
сероватого цвета, иногда прозрачные с неровной зернистой поверхностью и
вытянутыми краями - R-форма. В высоком столбике агара С. tetani образуют
колонии в виде пушинок, иногда колонии бывают темные и напоминают
чечевичные зерна. На кровяных средах вокруг колоний отмечается зона гемолиза.
При посеве возбудителей столбняка на среду Китта - Тароцци среда мутнеет. Рост
на среде Вильсона-Блера характеризуется почернением среды. Посевы на чашках
ставят в анаэростат.

Ферментативные свойства. С. tetani обладают слабой ферментативной

активностью. Углеводы не расщепляют (встречаются штаммы, расщепляющие
глюкозу). Протеолитические свойства выражаются в восстановлении нитратов в
нитриты, медленном свертывании молока и медленном разжижении желатина.

С. tetani образует фибрилизин.

Токсинообразование. С. tetani вырабатывают сильный экзотоксин, состоящий из

двух компонентов: тетаноспазмина и тетанолизина. Тетаноспазмин (нейротоксин)
поражает двигательные клетки нервной ткани, что приводит к спазматическому
сокращению мышц. Тетанолизин гемолизирует эритроциты. Токсин, полученный из
бульонной культуры в дозе 0,0000005, убивает белую мышь массой 20 г.

Антигенная структура. Клостридии столбняка делят на 10 сероваров.

Разделение на серовары производят по Н-антигену, а на серогруппы - по О-
антигену, Возбудители всех сероваров продуцируют токсин, который
нейтрализуется антитоксической сывороткой любого типа.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы С. tetani

при температуре 60-70° С погибают через 20-30 мин. Споры обладают большой
устойчивостью, они выдерживают кипячение в течение 1-1,5 ч. В почве и на других
предметах споры длительно сохраняются. Прямой солнечный свет убивает их через
несколько часов.

Дезинфицирующие растворы: 5% раствор фенола, 1% раствор формалина губит

их через 5-6 ч.

Восприимчивость животных. В естественных условиях столбняком болеют

лошади и мелкий рогатый скот. Из экспериментальных животных к столбнячному
токсину высоко чувствительны белые мыши, кролики, крысы. Заболевание у них
протекает по типу восходящего столбняка. Начинается оно с сокращений
поперечнополосатых мышц задних конечностей, затем вовлекаются мышцы
туловища и т. д. Гибель наступает от паралича сердечной мышцы.

Источники инфекции. Возбудители столбняка широко распространены в

природе. Многие животные являются носителями этих микроорганизмов, поэтому
С. tetani обнаруживают в почве, куда они попадают из кишечника животных и
человека. Заболевания столбняком чаще наблюдаются в сельской местности,
особенно в районах с развитым животноводством. Споры могут разноситься с
пылью, попадая на одежду и другие предметы.

Пути передачи и входные ворота. Входными воротами является поврежденная

кожа и слизистые оболочки. Столбняк является раневой инфекцией и
заболеваемость связана с травматизмом (особенно в военное время). Опасны
ранения с глубокой травматизацией тканей, в которые заносится земля, инородные
тела и т. д. Однако для возникновения заболевания иногда достаточно
проникновения небольшой занозы.

Патогенез. Проникнув в глубину ткани, споры на месте внедрения начинают

прорастать в вегетативные формы. Размножаясь, столбнячная палочка выделяет
экзотоксин. Столбнячный токсин избирательно действует на клетки центральной
нервной системы и обусловливает спазм двигательных мышц. У человека
наблюдается нисходящий столбняк. Наиболее ранними признаками являются
судороги жевательных мышц (тризм), затем начинается спазм лицевой и
затылочной мускулатуры. Появляется "сардоническая улыбка". Затем сокращаются
мышцы живота и нижних конечностей. Смерть наступает от асфиксии вследствие
спазма дыхательной мускулатуры.

Иммунитет. Постинфекционного иммунитета нет, так как исход этого

заболевания часто смертельный.

Искусственный иммунитет достигается путем введения анатоксина. Иммунитет

антитоксический.

Специфическая профилактика. Основана на иммунизации анатоксином,

являющимся компонентом АКДС. Прививки вакциной АКДС проводят всем детям
в возрасте от 5-6 месяцев до 12 лет с последующей ревакцинацией, а также
работникам сельского хозяйства, строителям и др. Специфическое лечение. Вводят
внутримышечно противостолбнячную сыворотку. Хороший результат дает
иммуноглобулин, полученный из крови доноров, иммунизированных против
столбняка. Кроме этого, вводят антибиотики тетрациклиного ряда и пенициллин.
 Микробиологическое исследование
Цель исследования: обнаружение возбудителя столбняка и столбнячного токсина
(практически проводят редко).

Материал для исследования

1. Содержимое раны.

2. Кусочки ткани с пораженного участка.

3. Инородные тела, попавшие в рану.

4. С профилактической целью исследуют на стерильность перевязочный

материал, кетгут, шелк и препараты для подкожного введения (см. "Санитарная
микробиология").

5. Почва (см. "Санитарная микробиология").

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Биологический.

3. Бактериологический (выделение возбудителя столбняка).

Ход исследования
Первый день исследования
 Первый день исследования

Второй - третий дни исследования

1. Если животные не погибли, продолжают за ними наблюдение. Признаки

столбняка у мышей: взъерошенная шерсть, ригидность конечностей и хвоста
("хвост трубой"), паралич лапки, в которую введен токсин. Животные погибают в
характерной позе: поджав передние лапки и вытянув задние. После гибели
животного производят микроскопическое и бактериологическое исследование
тканей из органов.

У контрольных мышей, получивших токсин одновременно с антитоксином,

заболевание столбняком не возникает.
 2. При отрицательном результате биологической пробы изучают посевы.
Подозрительные колонии пересевают для выделения чистой культуры на среду
Китта - Тароцци.

Четвертый - пятый дни исследования

Изучают культуральные свойства выделенных микроорганизмов. Делают мазки и

микроскопируют их. Полученную культуру испытывают на наличие столбнячного
токсина в биологической пробе (по той же схеме, табл. 51).
Таблица 51. Морфологические, культуральные и ферментативные свойства основных
 видов патогенных анаэробов

Контрольные вопросы
1. Опишите морфологические свойства возбудителя столбняка.

2. Каковы ферментативные свойства бацилл столбняка?

3. Токсинообразование и антигенная структура бацилл столбняка.

4. Патогенез столбняка.

5. Специфическая профилактика и лечение столбняка.

6. На каких животных и как ставят биологическую пробу?

Глава 35. Возбудители газовой гангрены

Газовая гангрена - это полимикробная инфекция, т. е. вызывается группой
микроорганизмов. Они относятся к семейству Bacillaceae, роду Clostridium.

Основные представители: C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum, C.

sordellii. Обычно заболевание возникает в результате попадания в рану одного или
нескольких представителей рода Clostridium и часто в сочетании с аэробами -
стафилококками и стрептококками.

Clostridium perfringens
C. perfringens открыт в 1892 г. Уэлчем и Неттолмом.

Морфология. C. perfringens - крупные полиморфные палочки в среднем 3-9 ×

0,9-1,2 мкм. Неподвижны. Свежевыделенные из организма культуры имеют
капсулу. При попадании в неблагоприятные условия образуют споры овальной
формы, располагающиеся центрально или субтерминально. Грамположительны.
Старые культуры утрачивают способность окрашиваться по Граму.

Культивирование. C. perfringens - анаэробы, но не очень чувствительны к

кислороду воздуха. Они хорошо и быстро растут на питательных средах,
приготовленных из гидролизатов мяса или казеина: 3-8 ч при температуре 37-42° С
и рН среды 7,2-7,4. Рост сопровождается бурным газообразованием и снижением
рН в кислую сторону. На плотных питательных средах C. perfringens образуют
шероховатые R, гладкие S и слизистые М колонии. В некоторых условиях
появляются колонии смешанного О-варианта. В глубине агара столбиком колонии
имеют вид чечевичных зерен. В жидких средах рост характеризуется равномерным
помутнением и газообразованием. На кровяных средах C. perfringens образуют зону
гемолиза.

Ферментативные свойства - C. perfringens сбраживают лактозу, глюкозу,

сахарозу, мальтозу с образованием кислоты и газа. Протеолитические свойства -
свертывают молоко, медленно (2-7 дней) разжижают желатин. Свертывают
лакмусовое молоко с образованием сгустка кирпичного цвета и полного
просветления молочной сыворотки. Восстанавливают нитраты в нитриты, индол не
образуют.

C. perfringens продуцируют лецитиназу, гиалуронидазу, желатиназу, коллагеназу

и другие ферменты патогенности.

Токсинообразование. C. perfringens выделяют сложный токсический комплекс,

состоящий из нескольких токсинов, которые обозначаются греческими буквами α,
θ, β и др. Кроме того, они образуют энтеротоксин. Основным токсическим
комплексом является α-токсин, обладающий большой и всесторонней
биологической активностью.

Антигенная структура. C. perfringens разделяют на пять сероваров, которые

обозначаются большими латинскими буквами А, В, С, D и Е. Эти серовары
отличаются друг от друга по антигенным и биохимическим свойствам своих
токсинов.

Серовар А является обитателем кишечника в естественных условиях, но может

вызвать пищевые токсикоинфекции у людей. Серовар В вызывает кишечные
явления у ягнят. Серовар С вызывает некротический энтерит у людей и заболевания
у крупного рогатого скота. Серовар D вызывает энтеротоксемию у животных.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы C.

perfringens не очень устойчивы: на них губительно действуют дезинфицирующие
вещества в обычных, применяемых в лабораториях концентрациях.

Споры некоторых штаммов выдерживают кипячение в течение нескольких

минут. Наиболее устойчивы микробы серовара А.

Восприимчивость животных. В естественных условиях C. perfringens вызывают

заболевания у домашних животных. Из экспериментальных животных к ним
чувствительны морские свинки, кролики, голуби, мыши. У зараженных животных
на месте введения токсина возникает некроз ткани. В крови могут находиться
клостридии.

Clostridium novyi
C. novyi обнаружен Нови в 1884 г.

Морфология. C. novyi - крупные, прямые или слегка изогнутые палочки 4-22 ×

1,4-1,6 мкм. Часто располагаются цепочками. Подвижны - перитрихи. Во внешней
среде образуют овальные споры, располагающиеся субтерминально (ширина спор
может быть несколько шире клетки). Капсул не имеют. Грамположительны. Старые
культуры могут быть грамотрицательными.

Культивирование. C. novyi - строгие анаэробы. Высокочувствительны к

кислороду воздуха. Растут на казеиновых, углеводных и мясопептонных средах при
температуре 37-43° С и рН среды 7,4-7,6. На плотных питательных средах через 48
ч вырастают круглые, полупрозрачные колонии с зернистой поверхностью и
бахромчатыми краями. В агаровом столбике они образуют хлопьевидные, в виде
комка колонии с компактным центром. На жидких питательных средах растут с
накоплением газа и выпадением пленок в осадок. На кровяном агаре вокруг
колоний наблюдается зона гемолиза.

Ферментативные свойства. C. novyi менее активны, чем C. perfringens. Они

сбраживают только глюкозу и мальтозу с образованием кислоты и газа.
Протеолитические свойства: молоко медленно свертывают, желатин медленно
разжижают. Индол и сероводород не образуют.

Из ферментов патогенности обнаружена фосфолипаза.

Антигенная структура. C. novyi подразделяют на четыре серовара: А, В, С, D,

различающихся по антигенным свойствам и синтезируемых ими токсинам.

Токсинообразование. C. novyi синтезируют несколько токсинов, обозначаемых

греческими буквами α, β, γ и др.

Экзотоксины обладают некротическим, гемолитическим и летальным

действиями. Кроме того, они нарушают проницаемость стенок кровеносных
сосудов, что приводит к образованию желеобразного отека.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы C. novyi

малоустойчивы. Споры сохраняются во внешней среде в течение многих (25-30)
лет. Кипячение убивает их через 40-60 мин, прямые солнечные лучи - через сутки.
Обычные концентрации дезинфицирующих растворов губят их через 15-20 мин.

Восприимчивость животных. К C. novyi чувствительны млекопитающие и

птицы (голуби). Из экспериментальных животных: морские свинки, кролики,
мыши. При подкожном введении культуры C. novyi у них возникает студенистый
желеобразный отек, иногда с газообразованием. Животное погибает через 24 ч.

Clostridium septicum
Clostridium septicum обнаружены Л. Пастером в 1877 г.

Морфология. С. septicum - полиморфная палочка величиной 3-4 × 1,1-1,6 мкм

(встречаются нитевидные формы до 50 мкм в длину). Палочки подвижны -
перитрихи. Споры располагаются субтерминально, иногда центрально. Капсулу не
образуют. Грамположительны. Старые культуры могут окрашиваться
грамотрицательно.

Культивирование. C. septicum - строгие анаэробы. Хорошо растут на мясных и

казеиновых средах с добавлением 0,5% глюкозы при температуре 37-43° С и рН
среды 7,4-7,6. На глюкозокровяном агаре образуют колонии в виде
переплетающихся нитей, вокруг которых имеется небольшая зона гемолиза. В
глубине столбика сахарного агара - колонии с уплотненным центром и отходящими
от краев нитями. В МПБ образуют равномерное помутнение с последующим
выпадением рыхлого осадка и газообразования.

Ферментативные свойства. C. septicum обладают сахаролитическими

свойствами: расщепляют глюкозу, лактозу, мальтозу с образованием кислоты и
газа. Не ферментируют маннит и глицерин. Протеолитические свойства:
разжижают желатин, молоко свертывают медленно. Переводят нитраты в нитриты,
расщепляют белки с выделением сероводорода и аммиака. Не образуют индол (см.
табл. 51).

Антигенная структура. C. septicum имеют О- и Н-антигены. По Н-антигенам

при помощи реакции агглютинации у них установлено 6 сероваров.

Токсинообразование. Экзотоксин C. septicum состоит из нескольких

субстанций: β, θ, γ и др. Основная субстанция - α-токсин обладает летальным,
некротическим и гемолитическим свойством. Кроме того, в фильтратах культур C.
septicum обнаружен фибринолизин и коллагеназа. Все эти факторы играют
большую роль в патогенезе.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы быстро

погибают в присутствии кислорода воздуха. Споры менее устойчивы, чем споры
других клостридий.

Восприимчивость животных. В естественных условиях болеют домашние

животные: крупный и мелкий рогатый скот.

Из экспериментальных животных болеют морские свинки. После

внутримышечного введения в лапку культуры C. septicum на месте инъекции
развивается интенсивный отек, который распространяется по всей передней стенке
живота и животное через 24-48 ч погибает. Из пораженной ткани при надавливании
выделяется кровянисто-пенистая жидкость.

Clostridium histolyticum
C. histolyticum выделен Вейнбергом в 1916 г.

Морфология. Небольшие палочки 1,6-3,1 × 0,6-1 мкм. Подвижны - перитрихи.

Образуют споры, расположенные субтерминально. Грамположительны.

Культивирование. С. histolyticum - факультативные анаэробы. Растут на мясных

и казеиновых средах. На кровяном агаре они образуют небольшие блестящие
колонии с ровными краями. Вокруг колоний небольшая зона гемолиза.

Ферментативные свойства. C. histolyticum не обладают сахаролитическими

свойствами. Протеолитические свойства выражены: разжижают желатин, лизируют
кусочки мяса, помещенные в жидкую питательную среду, при этом образуется
сероводород (см. табл. 51).

Токсинообразование. В фильтратах C. histolyticum обнаруживают α-токсин,

обладающий летальным и некротическим свойствами. Кроме того, в фильтратах
обнаружен β-фактор, разрушающий коллаген (коллагеназа). Этот токсин
избирательно действует на клетки поджелудочной железы. Значение C. histolyticum
в патологии человека окончательно не выяснено.

Clostridium sordellii
C. sordellii впервые выделены и изучены Сорделли в 1922 г.
 Морфология. C. sordellii - палочки 3-4 × 1,1-1,5 мкм. Подвижны - перитрихи.
Споры - овальные, располагаются субтерминально или овально.
Грамположительны.

Культивирование. C. sordellii - факультативные анаэробы. На поверхности

плотных питательных сред образуют серовато-белые, несколько выпуклые колонии.
На кровяном агаре дают узкую зону гемолиза. В глубине агара колонии имеют
форму чечевиц. В жидких мясных и казеиновых питательных средах быстро растут,
образуя слизь.

Ферментативные свойства. C. sordellii обладают сахаролитическими

свойствами: расщепляют глюкозу, мальтозу, фруктозу, не расщепляют лактозу и
сахарозу. Протеолитические свойства выражаются в медленном разжижении
желатина и свернутой сыворотки, они образуют индол, сероводород и уреазу (см.
табл. 51).

C. sordellii образуют лецитиназу, гиалуронидазу, гемолизин, фибринолизин.

Токсинообразование. C. sordellii выделяют высокоактивный токсин,

обладающий летальными свойствами, похожими по действию на α-токсин C. novyi.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы не

обладают устойчивостью. Споры устойчивы и длительно сохраняются в почве.

Восприимчивость животных. У экспериментальных животных C. sordellii

вызывает заболевание, похожее на газовую гангрену.

Источники инфекции.* В окружающую среду клостридии газовой гангрены

попадают из кишечника животных, чаще травоядных (при плохих санитарно-
гигиенических условиях их можно обнаружить на коже человека).
*
(Нижеизложенный материал относится ко всем рассмотренным представителям рода Clostridium.)

Пути передачи и входные ворота. При повреждении тканей, особенно при

обширных рваных ранах, и попадании в рану комков земли, обрывков одежды,
осколков снарядов может развиться заболевание. В мирное время газовая гангрена
может возникнуть после операции, инъекций лекарств, внебольничных абортов и т.
д.

Патогенез. Попавшие в рану споры или вегетативные формы клеток

размножаются и выделяют экзотоксин. В процессе размножения клостридии
некротизируют здоровую ткань. Особенно интенсивно процесс развивается в
мышечной ткани, так как там находится большое количество гликогена, который
является хорошей средой для развития анаэробов. Наиболее часто инфекция
возникает при глубоких ранах, когда образуются "слепые карманы", которые плохо
снабжаются кислородом и создаются благоприятные условия для развития
клостридии. Выделяющиеся экзотоксины вызывают явления интоксикации.

Клостридии часто бывают в ассоциации: совместное действие токсинов C.

perfringens и C. novyi вызывает более тяжелую реакцию, чем действие раздельных
токсинов. В патогенезе анаэробной инфекции большое значение имеет
сопутствующая флора (стафилококки, стрептококки и др.), а также реактивность
макроорганизма.

Иммунитет. Антитоксический и антибактериальный, однако ведущая роль

принадлежит антитоксину. У человека имеется естественный иммунитет, который
возникает в результате наличия в кишечнике клостридии. После перенесенного
заболевания остается непрочный иммунитет. Более стойкий иммунитет создается
при иммунизации анатоксином.

Профилактика осуществляется хирургической обработкой раны (иссечение,

разрезы). Для специфической профилактики используют адсорбированный
полианатоксин, содержащий анатоксины всех представителей газовой гангрены.
Для серопрофилактики при ранениях (чаще в военное время) вводят
противогангренозную сыворотку: по 10000 ME C. perfringens, C. novyi, C. septicum,
т. е. всего 30000 ME. Используют также смесь анаэробных фагов.

Лечение. Для специфического лечения применяют антитоксическую сыворотку

по 50000 ME каждого из клостридии, т. е. всего 150000 ME. Сыворотку вводят
внутривенно. Используют также антибиотики: пенициллин и сульфамидные
препараты и оксигенотерапию.

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление анаэробных возбудителей, их токсина.

Материал для исследования

1. Экссудат из раны.

2. Кусочки измененной ткани из раны.

3. Инородные тела, попавшие в рану.

4. Кровь (генерализация процесса).

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Бактериологический.
 3. Биологический.

Ход исследования
Первый день исследования

Первый день исследования

Второй - четвертый дни исследования

Вынимают посевы из термостата. При наличии роста - почернение на среде

Вильсона - Блера, зоны гемолиза вокруг колоний на кровяном агаре - выделяют
чистую культуру. Изучают морфологию, подвижность и ферментативную
активность (см. табл. 51).

При обнаружении возбудителей газовой гангрены ставят биологическую пробу

на мышах для определения вида возбудителя. Для этого исследуемый материал
разливают по 0,9 мл в 5 пробирок и в каждую прибавляют по 0,6 мл
соответствующих антитоксических сывороток: С. perfringens, С. novyi, C. septicum,
C. histolyticum, C. sordellii. В последнюю, 6-ю пробирку вносят изотонический
раствор натрия хлорида - контроль.

Смесь токсина с антитоксической сывороткой оставляют при комнатной

температуре на 40 мин для нейтрализации токсина. По 0,5 мл из каждой пробирки
вводят внутривенно двум мышам. За животными ведут наблюдение.

Гибель животных может наступить в сроки от 5-6 ч до 3-4 дней. Мыши,

получившие токсин с гомологичной антисывороткой, остаются живыми. При
отрицательном результате биологической пробы опыт повторяют с выделенной
чистой культурой по той же схеме.

Учитывая быстрое развитие клинических симптомов газовой гангрены,

необходимо быстро дать ориентировочное заключение о виде возбудителя (с целью
применения срочной серотерапии). Для этого из исследуемого материала делают
мазок-отпечаток, обрабатывают иммунофлюоресцирующей видоспецифической
сывороткой и изучают иммунофлуоресцентным методом (см. главу 2).

Контрольные вопросы
1. Каковы морфологические и культуральные особенности и свойства
возбудителей газовой гангрены?

2. Какой из возбудителей газовой гангрены имеет капсулу и неподвижен?

3. Какой из возбудителей газовой гангрены обладает наиболее выраженными

биохимическими свойствами?

4. Какие методы используют для лабораторной диагностики газовой гангрены?

5. Каким методом определяют наличие токсина?

Глава 36. Возбудитель ботулизма

Clostridium botulinum (от лат. botulus - колбаса) были открыты Ван-Эрменгеном в
1896 г. Выделены они были из ветчины, послужившей причиной массового
отравления.

Морфология. Возбудители ботулизма - палочки размером 4-9 × 0,6-1 мкм с

закругленными концами. Палочки полиморфны: встречаются короткие формы и
длинные нити. Возбудители ботулизма образуют споры, располагающиеся
субтерминально. Споры шире палочки и поэтому палочка со спорой имеют вид
теннисной ракетки. С. botulinum не имеют капсул. Подвижны - перитрихи.
Молодые культуры окрашиваются грамположительно.

Культивирование. С. botulinum - строгие анаэробы. Растут при температуре 25-

37° С и рН среды 7,3-7,6. Культивируют их на казеиновых, мясных и других средах.
На глюкозокровяном агаре микробы дают неправильной формы колонии с
нитевидными отростками. В агаре столбиком колонии напоминают комочки ваты,
иногда колонии имеют вид чечевичных зерен. На кровяном агаре в чашках Петри
вырастают колонии в виде росинок с блестящей поверхностью и ровными или
изрезанными краями (R-форма). На печеночном бульоне клостридии растут с
образованием мути и последующим выпадением осадка, при этом бульон
просветляется.

Ферментативные свойства (см. табл. 51). Сахаролитические свойства:

расщепляют лактозу, глюкозу, мальтозу и глицерин с образованием кислоты и газа.
Протеолитические свойства: расплавляют кусочки печени, расщепляют яичный
белок, разжижают желатин, пептонизируют молоко, образуют сероводород и
аммиак.

Токсинообразование. С. Botulinum продуцируют яд, самый сильный из всех

биологических токсинов (в 1 мкг ботулинического токсина содержится 100000000
смертельных доз для белой мыши). Токсин состоит из двух компонентов:
нейротоксина и гемагглютинина.
 Антигенная структура. По антигенным свойствам нейротоксина все штаммы
делят на семь сероваров: А, В, С, D, E, F и G. Каждый серовар характеризуется
специфической иммуногенностью. Наиболее частой причиной заболевания
ботулизмом являются токсины сероваров А, В и E, реже встречаются заболевания,
вызываемые сероварами С, D и F. Токсины серовара G мало изучены.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы C.

botulinum погибают при 80° С через 30 мин. Споры устойчивы. Они выдерживают
кипячение в течение нескольких часов (до 5 ч). В больших кусках мяса, консервных
банках большой емкости споры сохраняются даже после автоклавирования. В 5%
растворе фенола споры сохраняются сутки. Ботулинический экзотоксин
выдерживает кипячение в течение 10 мин. Он устойчив к действию солнечного
света, низким температурам и к дезинфицирующим веществам.

Восприимчивость животных. К возбудителям ботулизма чувствительны

мелкий и крупный рогатый скот, лошади, грызуны и птицы. Из экспериментальных
животных чувствительны белые мыши, морские свинки, кролики, кошки.

Источники инфекции. Возбудители ботулизма широко распространены в

природе: почве, воде, куда они попадают с фекалиями животных и рыб. В почве C.
botulinum живут и размножаются. Человек заражается при употреблении продуктов,
содержащих возбудителей и экзотоксин.

Пути передачи. Пищевой (при употреблении в пищу зараженных мясных,

овощных и рыбных консервов, грибов, осетровых рыб и т. д.). Особенно опасны
консервированные продукты, приготовленные в домашних условиях.

Патогенез. Входные ворота - слизистая оболочка кишечного тракта.

Нейротоксин, образующийся при размножении вегетативных форм возбудителей
ботулизма, не чувствителен к протеолитическим ферментам желудочно-кишечного
тракта. Патологический процесс обусловливается нейротоксином, который через
кишечник всасывается в кровь, разносится по всему организму, поражая
центральную нервную систему. В основном поражаются: клетки (ядра)
продолговатого мозга, сердечно-сосудистая система. У больных отмечают
изменения со стороны органов зрения, расстройство дыхательных и глотательных
функций.

Иммунитет. Естественной резистентности нет. Человек высокочувствителен к

токсину C. botulinum. Перенесенное заболевание не оставляет иммунитета.

Профилактика. Предупреждение возможности загрязнения пищевых продуктов,

правильная технология производства изготовления консервов и других продуктов.
Профилактика ботулизма в быту: продукты домашнего консервирования перед
употреблением следует кипятить в водяной бане (или кастрюле) в течение 15-20
мин.

Специфическая профилактика и лечение. Людям, употреблявшим продукты,

где возможно содержится возбудитель ботулизма или ботулинический токсин,
вводят противоботулиническую поливалентную антитоксическую сыворотку типов
А, В, Е. После установления типа токсина вводят противоботулиническую
сыворотку того типа, который соответствует типу выделенного штамма.
 Микробиологическое исследование
Цель исследования: обнаружение C. botulinum, ботулинического токсина,
определение серовара.

Материал для исследования

1. Рвотные массы.

2. Промывные воды желудка.

3. Кал.

4. Кровь.

5. Остатки пищевых продуктов.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Биологический.

2. Бактериологический.

3. Бактериоскопический метод практически не применяют, потому что по

морфологии различить клостридин невозможно.

Ход исследования
Первый день исследования
Первый день исследования
 Рис. 51. Схема реакции нейтрализации ботулинического токсина на мышах. 1 -
смесью антиботулинических сывороток; 2 - антиботулиническими сыворотками A,
B, C, E (белые мыши живы; черные мыши - погибли)

Второй - четвертый дни исследования

1. Осматривают животных. Заболевание и гибель животных могут наступить в

течение 1-4 дней. Заболевание характеризуется появлением учащенного дыхания,
расслаблением и западением мышц брюшной стенки (осиная талия), судорогами,
параличом, после чего наступает гибель животного. Мыши, которым был введен
центрифугат с противоботулинической сывороткой, остаются живыми.

В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина ставят реакцию

нейтрализации с типоспецифическими диагностическими сыворотками А, В, С, Е,
F, G (см. рис. 51) (сыворотку D в СССР не выпускают). Для каждой сыворотки
берут отдельный шприц. Мыши, получившие сыворотку, гомологичную токсину
(типу), остаются живыми.

2. Вынимают посевы из термостата. При наличии подозрительных колоний их

выделяют на среду Китта - Тароцци для получения чистой культуры возбудителя и
снова ставят реакцию нейтрализации, как указано выше.

Пятый - шестой дни исследования

Изучают биологические свойства выделенной культуры: морфологию,

подвижность, ферментативные свойства. При отрицательном результате
биологической пробы с нативным материалом ее ставят повторно с выделенной
культурой по той же схеме - для определения наличия и типа ботулинического
токсина.

Контрольные вопросы
1. Каковы морфология и культуральные свойства возбудителей ботулизма?

2. Каковы их ферментативные свойства?

3. Какой материал нужно исследовать при подозрении на ботулизм?

4. Каковы основные лабораторные методы исследования при ботулизме?

5. Как поставить биологическую пробу и реакцию нейтрализации с

противоботулиническими сыворотками?

Патогенные спирохеты - Ф. К. Черкес

Спирохеты относятся к семейству Spirochaetaceae. Представляют собой тонкие,
извитые микроорганизмы, тело которых состоит из осевой нити и окружающей ее
спиралевидной цитоплазмы, что придает им штопорообразную форму.

В ультрасрезах обнаружена трехслойная наружная мембрана. У некоторых

спирохет в электронном микроскопе видны на концах нитевидные образования.
Жгутиков, капсул, спор они не образуют. Очень подвижны. Обладают четырьмя
видами движения: поступательным, сгибательным, волнообразным и вращательным
(см. главу 5). Размеры спирохет колеблются от 5 до 500 мкм в длину и 0,3-0,75 мкм
в ширину.

К патогенным для человека спирохетам относятся представители следующих

родов:

1. Treponema - возбудители сифилиса и фрамбезии

2. Borrelia - возбудители возвратного тифа эпидемического, эндемического и

ангины Венсана

3. Leptospira - возбудители лептоспирозов.

Морфологически спирохеты отличаются друг от друга количеством и глубиной

завитков спирали и отношением к окраске. Основной метод окраски по
Романовскому - Гимзе. Этим способом лучше всех окрашиваются боррелии - в
сине-фиолетовый цвет, хуже - трепонемы - в бледно-розовый цвет. Спирохеты
изучают в живом состоянии (см. рис. 4).

Заболевания, вызываемые спирохетами, называются спирохетозами.

Характерным для клиники спирохетозов является цикличность течения.
 Глава 37. Возбудитель сифилиса
Treponema pallidum - возбудитель сифилиса включен в род Treponema (от лат.
trepo - поворачивать, nemo - нить).

Т. pallidum открыта Ф. Шаудином в 1905 г. Большой вклад в изучение сифилиса

внесли И. И. Мечников, П. Эрлих, Д. К. Заболотный и др.

Морфология. Т. pallidum - спиралевидная нить размером 8-18 × 0,08-0,2 мкм с

мелкими, равномерными завитками. Число завитков 12-14. Концы трепонемы
заострены или закруглены. Трепонемы подвижны. Обладают четырьмя видами
движения. По Романовскому - Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет,
поэтому они называются Т. pallidum - бледная трепонема. Плохое окрашивание
объясняется малым содержанием нуклеопротеидов. Спирохеты можно выявлять в
препаратах, окрашенных по Бурри, серебрением. Кроме того, их изучают в живом
состоянии - в темном поле.

Возбудители сифилиса спор и капсул не имеют (см. рис. 4).

Культивирование. Бледные трепонемы очень требовательны к питательным

средам. На искусственных питательных средах они растут только в присутствии
кусочков мозга или почек кролика и асцитической жидкости. Растут медленно, 5-12
дней при температуре 35-36° С в анаэробных условиях. Бледные трепонемы хорошо
размножаются в курином эмбрионе (поперечным делением). При выращивании на
искусственных питательных средах трепонемы теряют вирулентность. Такие
культуры называются культуральными. Культуры, выращенные в курином
эмбрионе, называют тканевыми. Они обычно сохраняют вирулентность.

Ферментативными свойствами трепонемы не обладают. Однако

культуральные штаммы различаются между собой по способности образовывать
индол и сероводород.

Токсинообразование. Не установлено.

Антигенная структура. Бледная трепонема содержит несколько антигенных

комплексов: полисахаридный, липидный и протеиновый. Серогруппы и серовары
не установлены.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Бледные трепонемы

малоустойчивы. Температура 45-55° С губит их через 15 мин. К низким
температурам они устойчивы. При замораживании сохраняются до года. Спирохеты
чувствительны к солям тяжелых металлов (ртути, висмута, мышьяка и др.).
Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их в течение нескольких
минут. Они чувствительны к бензилпенициллину, бициллину и др. Под влиянием
некоторых факторов внешней среды и антибактериальных препаратов трепонемы
могут образовывать цисты. В такой форме они длительно находятся в организме в
латентном состоянии.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные сифилисом

не болеют. Однако на обезьянах, как показали И. И. Мечников и Э. Ру, можно
воспроизвести клиническую картину сифилиса: на месте введения образуется
твердый шанкр. В настоящее время показано, что при заражении кроликов, морских
свинок на месте введения или в другом месте на коже образуются язвы. На
кроликах путем пассажей можно длительное время сохранять выделенный штамм
трепонем.

Источники инфекции. Больной человек.

Пути передачи. Контакт бытовой (прямой контакт), преимущественно половой

путь. Иногда сифилис может передаваться через предметы (посуду, белье). От
больной сифилисом матери заболевание передается через плаценту ребенку
(врожденный сифилис).

Патогенез. Входными воротами являются слизистые оболочки половых путей и

ротовой полости.

Первичный период - спирохеты попадают на слизистую оболочку, и после

инкубационного периода (в среднем 3 нед) на месте внедрения образуется язва,
которая характеризуется плотными краями и дном - твердый шанкр. Образованию
твердого шанкра сопутствует увеличение лимфатических узлов. Первичный период
продолжается 6-7 нед.

Вторичный период - возбудители сифилиса по лимфатическим и кровеносным

путям распространяются по всему организму. При этом на коже и слизистых
оболочках образуются розеолы, папулы, везикулы. Продолжительность этого
периода - 3-4 года.

Третий период - развивается при нелеченом сифилисе. В этот период в органах,

тканях, костях, сосудах образуются грануляционные разрастания - гуммы или
гуммозные инфильтраты, склонные к распаду. Этот период может продолжаться
несколько лет (в скрытой форме). Больной в этот период незаразен. При нелеченом
сифилисе (в некоторых случаях), спустя много лет, может наступить поражение
центральной нервной системы: при поражении головного мозга - прогрессивный
паралич, при поражении спинного мозга - спинная сухотка. Эти заболевания
возникают при локализации трепонем в мозговой ткани, что приводит к тяжелым
органическим и функциональным изменениям в организме.

Иммунитет. Естественного иммунитета нет. При заболевании сифилисом

развивается "нестерильный" инфекционный иммунитет. Его называют шанкерный,
так как при повторном заражении твердый шанкр не образуется, но все
последующие периоды развиваются. При сифилисе обнаруживают IgC и IgM, а
также реагины IgE, которые в присутствии кардиолипидного антигена связывают
комплемент.

Профилактика. Санитарно-просветительная работа, раннее выявление больных

сифилисом. Специфическая профилактика. Не разработана.

Лечение. Пенициллин, бициллин, биохинол и др.

Контрольные вопросы
1. Опишите морфологию спирохет и методы окраски.
 2. Что такое твердый шанкр?

3. Какой материал для исследования Вы будете брать в разные периоды

заболевания сифилисом?

4. Каков иммунитет при сифилисе?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление бледной трепонемы и серодиагностика.

Материал для исследования

1. Содержимое твердого шанкра (первичный период).

2. Содержимое розеол, папул, везикул (вторичный период).

3. Кровь (вторичный, третий и четвертый периоды).

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

3. Серологический: 1) реакция Вассермана (РСК);

2) осадочные реакции.

4. Реакция иммобилизации трепонем (РИТ).

Ход исследования
 Ход исследования

Серологическая диагностика

Реакция Вассермана. Реакцию ставят по принципу реакции связывания

комплемента (табл. 52). Отличается она тем, что при реакции Вассермана может
быть использован неспецифический антиген. Например, липоидный экстракт из
бычьего сердца - кардиоантиген. Ввиду неспецифичности антител, реагирующих с
этим антигеном, их называют реагинами. Реакция с неспецифическим антигеном
объясняется тем, что в сыворотке крови больного повышается содержание
глобулинов и изменяется степень их дисперсности. Глобулины, вступая в
соединение с липидными экстрактами, образуют комплекс, который связывает
комплемент, и поэтому гемолиз не происходит (в гемолитической системе).
Отсутствие гемолиза - положительная реакция - серологически подтверждает
диагноз "сифилис". При постановке серологических реакций нужно использовать
также специфические антигены из тканевых трепонем и культуральные.
 Таблица 52. Постановка реакции Вассермана

Примечание. 1) ++++ полная задержка гемолиза; - гемолиз; 2) антиген № 1

неспецифический (липоидная фракция бычьего сердца); 3) антигены № 2 и 3
специфические, приготовленные из культур трепонем.

Осадочные реакции. 1. Реакция Кана. Сыворотку больного инактивируют при

56° С 30 мин. К антигену (экстракт липидов бычьего сердца) прибавляют 0,6%
холестерина для повышения чувствительности реакции (табл. 53).

Таблица 53. Схема постановки реакции Кана

Учет результата: появление преципитации отмечается как положительная

реакция.
 2. Реакция Закса - Витебского (цитохолевая осадочная реакция) является
модификацией реакции Кана. Авторы применили более концентрированный
антиген, к которому прибавлен холестерин, что способствует более быстрому
образованию преципитата.

Реакция иммобилизации трепонем (РИТ). Это наиболее специфичная реакция

в диагностике сифилиса.

В настоящее время разработана методика этой реакции: взвесь трепонем

получают из измельченного яичка кролика, зараженного Т. pallidum, и сохраняют в
специальной среде, не угнетающей подвижность трепонем. В пробирку вносят 1,7
мл взвеси тканевых трепонем, добавляют 0,2 мл испытуемой сыворотки, 0,1 мл
свежего комплемента.

Контроли: в 1-ю пробирку вместо испытуемой сыворотки вносят сыворотку

здорового лица; во 2-ю - наливают инактивированную сыворотку морской свинки.
Все пробирки помещают в эксикатор или анаэростат, заполняют их смесью газов (1
объем углекислоты и 19 объемов азота) и ставят в термостат при 35° С. Затем
исследуемый материал наносят на стекло и изучают подвижность трепонем в
темном поле. Принцип реакции заключается в том, что сыворотка больного
сифилисом в присутствии комплемента угнетает движение бледной трепонемы.
Определяют процент иммобилизованных трепонем.

Результат считают положительным, если иммобилизованных трепонем выше

50%; слабоположительным - от 30-50%; отрицательным - ниже 20%.

Контрольные вопросы

1. Какой материал используют для лабораторной диагностики сифилиса в разные

периоды заболевания?

2. Каковы методы лабораторного исследования при диагностике сифилиса?

3. Какими антигенами нужно пользоваться при постановке реакции Вассермана?

4. Какие ингредиенты необходимы для постановки реакции иммобилизации

трепонем (РИТ)? Какой материал берут у обследуемого, что в нем определяют?

Глава 38. Возбудители возвратного тифа

Возбудители возвратного тифа относятся к семейству Spirochaetaceae, роду
Borrelia.

По характеру переносчика возвратный тиф подразделяют на эпидемический,

передающийся вшами, и эндемический, переносчиками которого являются клещи.

Боррелии возвратных тифов отличаются от других спирохет тем, что имеют

крупные, неравномерные завитки и хорошо окрашиваются анилиновыми красками,
в том числе по Романовскому - Гимзе в фиолетовый цвет (см. рис. 4).
 Эпидемический возвратный тиф
Возбудители эпидемического (вшивого) возвратного тифа описаны были О.
Обермайером в 1868 г.

Морфология. Боррелии Обермайера представляют собой спиралевидную нить с

5-8 неодинаковыми завитками и заостренными концами. Размеры их 10-18 × 0,3-0,5
мкм. Они обладают всеми четырьмя видами движения, присущими спирохетам.

Культивирование. На искусственных питательных средах растут только в

присутствии сыворотки или асцитической жидкости, тканей или органов животных.
Растут они медленно, 7-12 дней, в анаэробных условиях при температуре 30-35° С и
рН среды 7,2-7,4. В жидких средах, даже при обильном размножении, видимого
роста нет. В последние годы боррелии культивируют в курином эмбрионе.

Ферментативными свойствами боррелии не обладают.

Токсинообразование. Образуют эндотоксин (малоизучен).

Антигенная структура. Малоизучена.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Боррелии очень чувствительны

к высоким температурам: 45-50° С инактивируют их через 30 мин, при 0° С
сохраняются в течение нескольких суток. К низким температурам они более
устойчивы. При замораживании сохраняются несколько месяцев. При высушивании
погибают быстро. Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их
через несколько минут.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные не болеют

возвратным тифом. В экспериментальных условиях с трудом удается заразить
боррелиями Обермайера обезьян, белых мышей, хомяков.

Источники инфекции. Больной человек.

Переносчики. Вши, которые остаются заразными в течение всей жизни (30-40

дней); трансовариально потомству боррелии не передаются.

Механизм заражения. Вошь, насосавшись крови больного, становится заразной

через 5-7 дней. За это время спирохеты из кишечника вши проникают в гемолимфу,
где накапливаются. При расчесе человек повреждает тело вши и втирает гемолимфу
в место расчеса.

Патогенез. В 1874 г. Г. Минх, а в 1881 г. И. И. Мечников в опытах на себе

доказали, что возбудители возвратного тифа циркулируют в крови (заражали себя
кровью больного).

Попав с зараженной лимфой в организм человека, боррелии размножаются в

клетках системы макрофагов, затем попадают в кровь. Возникает первый
лихорадочный приступ болезни. В крови больного накапливаются антитела -
спирохетолизины, которые лизируют боррелии. Образовавшийся при этом
эндотоксин вызывает явления интоксикации - температуру и другие
функциональные расстройства. Но часть боррелии, находящихся в глубине тканей,
сохраняются, размножаются и дают новое поколение боррелии, не чувствительных
к имеющимся лизинам. При выходе их в кровь начинается второй приступ
заболевания. В организме образуются лизины, растворяющие вторую генерацию
боррелии. Таких приступов бывает несколько (3-5). Обычно каждый последующий
приступ короче предыдущего, а интервалы между ними (апирексия) длиннее.
Выздоровление наступает после полного лизиса всех появившихся разновидностей
боррелии.

У больных возвратным тифом еще наблюдается феномен тромбоцитобарии - в

капиллярах внутренних органов тромбоциты адсорбируются на поверхности
спирохет, образуется агрегат "спирохет и тромбоцитов". Этот агрегат нарушает
местное кровообращение, а боррелии теряют подвижность.

Иммунитет. Характеризуется наличием антител: спирохетолизинов,

агглютининов, тромбоцитобаринов. Однако он нестойкий.

Профилактика. Борьба с педикулезом, улучшение санитарно-гигиенических

условий. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Тетрациклин, пенициллин, левомицетин и мышьяковистые препараты.

Контрольные вопросы

1. Опишите морфологию боррелии возвратного тифа и методы культивирования.

2. Кто впервые показал, что возбудители возвратного тифа циркулируют в крови

больного?

3. Каков механизм заражения и патогенез возвратного тифа?

4. Чем обусловлен иммунитет и что такое "феномен тромбоцитобарии"?

Эндемический возвратный тиф

Возбудителями эндемического возвратного тифа являются несколько видов
боррелии: В. persica, B. duttonii и др. В. duttonii были обнаружены в крови больного
Ф. Россом в 1904 г.

Морфология. Боррелии клещевого возратного тифа сходны с возбудителями

эпидемического возвратного тифа.

Культивирование. В. duttonii можно культивировать на специальных средах.

Выращивают их при температуре 30-35° С и рН среды 7,2-7,4 в анаэробных
условиях.

Ферментативные свойства. Не обнаружены.

Антигенная структура. Существуют несколько вариантов боррелии, которые

можно отдифференцировать, используя биологический метод.
 Устойчивость к факторам окружающей среды. Такая же, как у возбудителей
эпидемического возвратного тифа.

Восприимчивость животных. Болеют грызуны: мыши, хомяки, песчанки. Из

экспериментальных животных чувствительны морские свинки, крысы и белые
мыши.

Источники инфекции. Источником и природным очагом являются грызуны:

мыши, хомяки, песчанки и клещи рода Ornithodoros. В теле клещей боррелии
сохраняются пожизненно и передаются трансовариально.

Пути передачи. Трансмиссивный. Человек заражается при укусе клеща, в слюне

которого находятся боррелии. На месте укуса образуется папула.

Патогенез. Сходен с патогенезом эпидемического возвратного тифа, но

количество приступов больше. Клинически заболевание протекает легче.

Иммунитет. В эндемических очагах иммунитет приобретается в раннем детстве

и обусловливается наличием спирохетолизинов и других антител. Болеют в
основном приезжие. После перенесенного заболевания иммунитет нестойкий.
Перекрестного иммунитета с эпидемическим возвратным тифом нет.

Профилактика. Уничтожение грызунов и насекомых. Для каждого природного

очага характерен свой вид возбудителя. Специфическая профилактика не
разработана.

Лечение. Антибиотики: тетрациклин, пенициллин, левомицетин и др.

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление возбудителя и дифференциация возбудителей
эпидемического возвратного тифа от эндемического.

Материал для исследования

Кровь больного

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.
 2. Иммобилизация боррелий.

3. Реакция "нагрузки" боррелий тромбоцитами (используется редко).

4. Люминесцентная микроскопия (см. главу 3).

Ход исследования

Ход исследования

Контрольные вопросы
1. Какой материал используется для диагностики эпидемического и
эндемического возвратного тифа?

2. Перечислите методы исследования и какой из них является основным.

3. Как отдифференцировать эпидемический возвратный тиф от эндемического?

Задание
Нарисуйте возбудителей возвратного тифа, окрашенных по методу Романовского
- Гимзы.
 Глава 39. Спирохеты Венсана
Borrelia vincentii (боррелии Венсана) вызывают язвенную ангину, язвенный
стоматит и другие язвенно-некротические процессы. В мазках из язв, окрашенных
по Граму или разведенным фуксином Пфейффера, обнаруживают спирохету в
сочетании с грамотрицательной веретенообразной палочкой В. fusiformis (поэтому
язвенную ангину называют фузоспирохетоз).

По морфологии спирохеты Венсана неотличимы от сапрофитов полости рта.

Для В. fusiformis характерным является неравномерное окрашивание

цитоплазмы. В центре окраска бледнее, поэтому при микроскопии создается
впечатление двойной палочки.

Считают, что заражение язвенной ангиной происходит через грязную посуду или
другие предметы, на которые попадает слюна больного.

Диагностика. Микроскопия окрашенных препаратов, сделанных из отделяемого

язвы. Наличие боррелии с сочетании с бактерией фузиформис является
диагностическим признаком.

Глава 40. Возбудители лептоспирозов

Патогенные лептоспиры включены в семейство Spirochaetaceae, род Leptospira.
Открыты в 1915 г. японскими исследователями Инадо и Идо.

К роду Leptospira относится группа микроорганизмов, вызывающих заболевания

у животных и человека.

Морфология. Лептоспиры - спиралевидные нити, длиной 6-20 × 0,1-0,25 мкм.

Имеют многочисленные (12-18) мелкие, тесно прилегающие друг к другу завитки.
Концы спиралей загнуты в виде крючков. Существуют и безкрючковые штаммы.
Лептоспиры очень подвижны. Имеют все формы движения.

Они плохо окрашиваются анилиновыми красителями, поэтому с целью

обнаружения их в патологическом материале и в культурах используют метод
микроскопии живых лептоспир в темном поле или метод серебрения - при этом
способе они окрашиваются в коричневый цвет.

Культивирование. Лептоспиры строгие аэробы. Размножаются с жидких и

полужидких питательных средах, содержащих сыворотку кролика, при температуре
28-30° С и рН среды 7,2-7,4. Растут медленно (7-10 дней). Среды при размножении
лептоспир остаются прозрачными. Рост определяют по опалесценции или при
микроскопии препаратов в раздавленной капле (в темном поле). Лептоспиры можно
выращивать и на плотных питательных средах, содержащих кроличью сыворотку.
Рост появляется на 5-7-й день. При выращивании лептоспир на искусственных
питательных средах они теряют вирулентность.

Ферментативные свойства. У лептоспир обнаружены ферменты: каталаза,

оксидаза, липаза и др.
 Токсинообразование. Наличие эндотоксина у лептоспир не доказано.

Антигенная структура. Антигенную структуру лептоспир изучают в реакции

микроагглютинации с монорецепторными сыворотками. На основании этой
реакции лептоспиры делят на 19 серо групп и 169 сероваров. Каждая серогруппа и
серовар имеют название.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Лептоспиры чувствительны к

высоким температурам: 56° С губит их через 30 мин. При низких температурах (-
70-80° С) они длительно сохраняются. Лептоспиры очень чувствительны к
высыханию. Они чувствительны к действию кислот, желчи. Обычные
концентрации дезинфицирующих веществ губят их через несколько минут.

В воде лептоспиры выживают до двух месяцев, в молочных продуктах, хлебе -

несколько часов.

Восприимчивость животных. Наиболее восприимчивы к лептоспирам грызуны,

но болеют парнокопытные, крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, собаки и даже
хищные животные. У животных заболевание протекает обычно в хронической
форме.

Из экспериментальных животных наиболее чувствительны к лептоспирам

морские свинки, золотистые хомяки. Однако вызвать у них заболевание могут
только некоторые серовары лептоспир. У грызунов заболевание протекает тоже в
хронической форме и лептоспиры выделяются с мочой.

Источники инфекции. Источниками заражения являются больные животные -

сельскохозяйственные и грызуны (в основном крысы). Они инфицируют мочой
окружающую почву, открытые водоемы (речки, пруды, колодцы). Кроме того, они
заражают пищевые продукты.

Пути передачи. Контактно-бытовой (при купании и выполнении различных

работ в воде, зараженной лептоспирами больных животных; при уходе за больными
животными), пищевой (через воду и пищевые продукты).

Патогенез. Входными воротами являются поврежденная кожа и

неповрежденные слизистые оболочки рта, глаз и желудочно-кишечного тракта.
Первичный аффект на коже и слизистых оболочках не образуется. Лептоспирозы
протекают в желтушной и безжелтушной форме. Проникнув в организм,
лептоспиры через лимфатические пути проникают в кровь, где циркулируют. С
током крови они проникают в паренхиматозные органы и локализуются в печени и
почках. К этому времени образуются антитела, разрушающие лептоспиры.

В процессе распада лептоспир выделяется токсическое вещество, которое

приводит к явлениям интоксикации и кровоизлияниям в паренхиматозных органах.
В тяжелых случаях развивается желтуха и острая почечная недостаточность
(нефрит) у человека и у чувствительных к лептоспирам животных.

При легких формах течения поражения паренхиматозных органов выявляются

только при специальных методах исследования.
 Иммунитет. Связан с образованием агглютининов и спирохетолизинов,
максимальная концентрация которых достигается на 3-4 нед (антитела бывают в
высоких титрах 1:1000 и выше). Иммунитет сохраняется длительно.

Профилактика. Борьба с грызунами, осушение болот и другие мелиоративные

мероприятия, а также защита пищевых продуктов от крыс и мышей.
Сельскохозяйственных животных вакцинируют.

Специфическая профилактика. Вакцинация людей, работающих в очаге.

Лептоспирозная вакцина представляет собой взвесь убитых нагреванием лептоспир
нескольких сероваров.

Лечение. Пенициллин, тетрациклин, противолептоспирозный иммуноглобулин

(приготовленный из наиболее распространенных серогрупп лептоспир).

Контрольные вопросы
1. Расскажите о морфологических и культуральных свойствах лептоспир.

2. Какова устойчивость лептоспир во внешней среде?

3. Патогенность для животных, источники заражения и пути передачи.

4. Назовите входные ворота. Каков патогенез лептоспирозов?

5. Иммунитет. За счет каких антител он образуется?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление лептоспир у больных и обнаружение их во
внешней среде. Определение серовара.

Материал для исследования

1. Кровь.

2. Моча.

3. Спинномозговая жидкость.

4. Водные источники и пищевые продукты.

5. Секционный материал.

Способы сбора материала

 Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Бактериологический (с микроскопией).

3. Серологический.

4. Биологический.

Ход исследования
 Ход исследования

Контрольные вопросы

1. Что служит материалом для исследования при подозрении на лептоспироз?

2. Перечислите основные методы исследования.

 3. Расскажите как ставят биологическую пробу.

Питательные среды

Среда Терских. Готовят фосфатную смесь: 1) фосфат натрия двузамещенный -

11876 г; 2) дистиллированная вода - 1 л; 3) фосфат калия однозамещенный - 9078 г
(приготовленные растворы хранят в темном месте). Смесь стерилизуют и
добавляют 10% прогретой сыворотки кролика. После посева среду покрывают
слоем жидкого парафина или вазелинового масла.

Среда Ферворта - Вольфа. На 1 л среды: 1) пептон - 1 г; 2) натрия

хлорид - 0,5 г; буферная смесь Зермсена - 100 мл; 4)
дистиллированная вода - 900 мл; 5) 10% инактивиРиккетсии - Ф.
К. Черкес
Риккетсии - это особая группа полиморфных бактерий, которые являются
внутриклеточными паразитами. Они включены в семейство Rickettsiaceae.

Первого представителя этой группы выявил в 1909 г. американский ученый

Риккетс при изучении этиологии лихорадки Скалистых гор. От этого заболевания
он погиб.

В 1913 г. чешский ученый Провацек в крови больных сыпным тифом также

обнаружил подобные микроорганизмы. Заразившись сыпным тифом, ученый тоже
погиб.

А в 1916 г. португальский ученый Роша-Лима на основании длительных

наблюдений установил, что возбудителями мексиканского тифа, европейского
сыпного тифа и других подобных заболеваний являются разновидности
микроорганизмов, обнаруженных Риккетсом, и в честь первооткрывателя назвал их
риккетсиями. А в память Провацека возбудителя сыпного тифа назвал риккетсиями
Провацека.

Большой вклад в изучение сыпного тифа внесли А. А. Кронтовский, М. А.

Кронтовская, П. Ф. Здродовский, Е. С. Галиневич и др.

Среди риккетсии имеются разновидности, патогенные для человека, животных и

членистоногих.

У человека риккетсии обусловливают различные лихорадочные заболевания,%

называемые риккетсиозами.

По П. Ф. Здродовскому, риккетсиозы человека делятся на 5 групп: группа

сыпного тифа, группа клещевых пятнистых лихорадок, группа цуцугамуши, группа
Ку-лихорадки, группа пароксизмальных риккетсиозов.

Классификация риккетсиозов основана на ряде признаков: свойств возбудителя,

эпидемиологии и клиники заболевания.
 На территории СССР встречаются некоторые из риккетсиозов: эпидемический
сыпной тиф (европейский), болезнь Брилла, эндемический сыпной тиф, Ку-
лихорадка.

Морфология. Риккетсии это мелкие (0,2-1 мкм), полиморфные микроорганизмы,

среди которых встречаются палочковидные, кокковидные и нитевидные (длиной
10-30 мкм) представители.

Риккетсии не имеют спор, капсул, неподвижны. Грамотрицательны. По

Романовскому - Гимзе и по способу Здродовского окрашиваются в красный цвет.
Строение клеточной стенки сходно со строением стенки грамотрицательных
бактерий.

Культивирование. Риккетсии размножаются внутри клетки хозяина. Аэробы.

Обладают собственным метаболизмом, ведут себя в клетке самостоятельно. Однако
являются энергетически зависимыми от клетки паразитами.

В клетке хозяина каждый вид риккетсии размножается только в определенных

местах: в цитоплазме, ядре или вакуолях клеток. Они хорошо размножаются в
тканях чувствительных к ним животных и членистоногих. В лабораторной практике
наиболее часто используется метод заражения куриных эмбрионов и культуры
тканей.

Ферментативные свойства. Не выражены.

Токсинообразование. Риккетсии образуют термолабильный эндотоксин.

Антигенная структура. Риккетсии имеют два антигена: групповой

термостабильный и специфический термолабильный.

Устойчивость к факторам окружающей среды. К высоким температурам

риккетсии мало устойчивы. Исключением являются возбудители Ку-лихорадки. К
низким температурам и к высушиванию все риккетсии устойчивы. Они
чувствительны к антибиотикам. Сульфамиды не ингибируют их роста.

рованная сыворотка кролика.

Глава 41. Возбудители сыпного тифа

Сыпной тиф
Возбудителем сыпного тифа является Rickettsia provazekii.

Еще задолго до открытия возбудителя сыпного тифа русский врач О. О.

Мочутковский в опытах на себе показал, что возбудитель этого заболевания
циркулирует у больного в крови.

Морфология. Возбудители эпидемического сыпного тифа - риккетсии

Провацека - полиморфны. Чаще они имеют форму кокков или гантелей,
встречаются нитевидные формы. Средние размеры от 0,8-2,0 × 0,3-0,6 мкм. При
окраске по методу Здродовского они приобретают красный цвет.

Культивирование. Размножаются в цитоплазме клеток хозяина, эпителии

кишечника вши, эндотелии сосудов. Чаще их культивируют в желточном мешке
куриного эмбриона. В месте размножения на 8-13-й день образуется мутная бляшка.
Оптимальная температура для их развития 35° С.

Токсинообразование. Риккетсии Провацека образуют эндотоксин. В чистом

виде он не получен. Однако его чувствительность к температуре (при нагревании он
быстро разрушается) дает право предположить, что он белкового происхождения.
Токсин, при проникновении риккетсии в организм, поражает клетки эндотелия
сосудов, что приводит к увеличению проницаемости капилляров.

Антигенная структура. Риккетсии Провацека содержат два антигена. Один из

них поверхностный, термолабильный. По химическому составу он представляет
собой липидополисахаридобелковый комплекс. Этот антиген невидоспецифичен и
является общим с антигенами возбудителей эндемического сыпного тифа, а также с
антигенами протея OX19, OX2. Второй - белковополисахаридный комплекс является
видоспецифичным и находится в глубине клетки.

Э. Вейлем и А. Феликсом была обнаружена способность Proteus ОХ 19 давать

положительную реакцию агглютинации с сывороткой больных сыпным тифом. Эта
реакция, названная именем ученых, широко использовалась с диагностической
целью. Авторы полагали, что и возбудителем сыпного тифа является Proteus ОХ 19.
Однако по мере накопления материала и доказательства этиологической роли
риккетсии при сыпном тифе было установлено: 1) Proteus OX 19 не является
возбудителем сыпного тифа; 2) Proteus OX 19 дает положительные реакции
агглютинации, с сыворотками больных сыпным тифом потому, что имеет общий с
риккетсиями Провацека антиген; 3) реакция Вейля - Феликса не всегда специфична,
и при диагностике сыпного тифа ее перестали использовать, заменив в реакции
агглютинации антиген диагностикумом из риккетсии Провацека.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При высокой температуре,

особенно во влажной среде, риккетсии Провацека погибают быстро.

В высушенных фекалиях вшей риккетсии сохраняются длительно. Обычные

растворы дезинфицирующих веществ губят их быстро.

Восприимчивость животных. В экспериментальных условиях можно заразить

белых мышей, морских свинок и обезьян. На обезьянах воспроизводят клиническую
картину сыпного тифа. У зараженных белых мышей возникает специфическая
пневмония.

Источники инфекции. Больной человек.

Пути передачи. Трансмиссивный. В 1909 г. французский ученый Николь в

опытах на обезьянах установил, что риккетсии Провацека передаются платяными
вшами. В дальнейшем было показано, что головные вши также могут быть
переносчиками.
 Механизм заражения. Насосавшись крови больного, вошь становится заразной
на 4-5-й день. За это время риккетсии размножаются в клетках эпителия кишечника
вши. Накопившись там, они разрушают эпителиальные клетки, попадают в просвет
кишки и в большом количестве выделяются с фекалиями вши. Попав на кожу
здорового человека, вошь кусает его и тут же выделяет риккетсии с фекалиями.
Человек расчесывает место укуса и втирает в ранку риккетсии. Так возбудители
оказываются во внутренней среде организма человека.

Патогенез. Попавшие в организм человека риккетсии внедряются в клетки

эндотелия сосудов. Размножаются, губят клетки, попадают в большом количестве в
кровь - возникает риккетсиемия. Процесс в сосудах характеризуется воспалением и
образованием тромбов, что приводит к закупорке мелких кровеносных сосудов.
Вокруг затромбированных сосудов головного мозга происходит образование
гранулем - воспаления типа менингоэнцефалита.

Сыпной тиф начинается остро, отмечается высокая температура, общие явления

интоксикации, сильная головная боль и появляется розеолезно-петехиальная сыпь.

Иммунитет. Антимикробный и антитоксический. После перенесенного

заболевания - пожизненный. В крови обнаруживают антитела, нейтрализующие
токсин, агглютинины, комплементсвязывающие антитела, и др.

Заболевания сыпным тифом часто были связаны с народными бедствиями

(война, голод и т. д.) и завшивленностью.

Болезнь Брилла
В последние годы накопился ряд данных о длительном сохранении риккетсий
Провацека в организме человека, переболевшего сыпным тифом. При снижении
резистентности организма они могут вызвать повторное заболевание много лет
спустя (10-30 лет), т. е. это эндогенный рецидив эпидемического сыпного тифа.
Впервые болезнь эту описал Н. Брилль, а Н. Цинссер доказал, что возбудителем ее
являются риккетсий Провацека. Болезнь Брилла характеризуется легким,
доброкачественным течением. Особенностью диагностики при этом заболевании
является отрицательная реакция агглютинации с протеем ОХ 19 (Вейля - Феликса)
и положительная агглютинация с риккетсиями Провацека. Существует и другое
мнение, что болезнь Брилла - это реинфекция, т. е. повторное заражение, а легкое
течение обусловлено наличием иммунитета, приобретенного в результате ранее
перенесенного заболевания.

Профилактика. Изоляция больных и уничтожение вшей. Специфическая

профилактика. В настоящее время разработана химическая вакцина,
приготовленная из концентрированного поверхностного антигена риккетсий
Провацека.

Контрольные вопросы
1. Дайте характеристику риккетсий и способы их культивирования.

2. Перечислите возбудителей основных риккетсиозов.

 3. Расскажите об источнике заболевания, путях передачи и механизме заражения
эпидемического сыпного тифа.

4. Что такое болезнь Брилла?

Эндемический блошиный тиф

Возбудители эндемического сыпного тифа были открыты X. Музером в 1928 г. и
в его честь были названы риккетсиями Музера. Сейчас их называют R. typhi

Морфология. Мелкие кокковидные (в пределах 1 мкм в диаметре) или

палочковидные (0,3-0,6 × 1,5 мкм) микроорганизмы. Они менее полиморфны, чем
риккетсий Провацека. По способу Здродовского окрашиваются в красный цвет.
Грамотрицательны.

Культивирование. Риккетсий Музера хорошо размножаются в желточном

мешке куриного эмбриона при температуре 35° С. Рост характеризуется
образованием бляшек. У членистоногих они размножаются в ядре и цитоплазме
клеток эпителия кишечника.

Токсинообразование. Риккетсий Музера образуют эндотоксин, который

отличается от токсина риккетсий Провацека, что можно выявить реакцией
нейтрализации.

Антигенная структура. Риккетсий Музера имеют два антигенных комплекса.

Один - термостабильный - общий с антигеном риккетсий Провацека и антигенами
против ОХ19 и ОХ2. Второй - термолабильный, видоспецифический, который
позволяет отдифференцировать риккетсий Музера от риккетсий Провацека.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Риккетсий Музера мало

устойчивы во внешней среде, но в высушенном состоянии и при низких
температурах они длительно сохраняются. Обычные концентрации
дезинфицирующих растворов губят их быстро.

Восприимчивость животных. Эндемическим сыпным тифом болеют грызуны, в

основном мыши и крысы. Из экспериментальных животных чувствительны морские
свинки, при внутрибрюшиыном заражении у них развивается периорхит
(скротальный феномен).

Источники инфекции. Эндемический сыпной тиф - зоонозная инфекция.

Основными источниками в природе являются крысы и мыши.

Пути передачи. Трансмиссивный, пищевой, контактно-бытовой,

Переносчиками, могут быть крысиные блохи и клещи (клещи передают риккетсий
трансовариально).

Патогенез. Эндемический сыпной тиф представляет собой кровяную инфекцию.

Патогенез сходен с патогенезом сыпного тифа. Клинически протекает легче.
Болезнь характеризуется лихорадкой и появлением сыпи. Заболевание носит
эндемический характер.
 Иммунитет. После болезни развивается стойкий иммунитет за счет
антимикробных и антитоксических защитных факторов.

Профилактика. Уничтожение насекомых, грызунов и улучшение санитарно-

гигиенических условий. Специфическая профилактика осуществляется
иммунизацией вакциной, содержащей убитые риккетсии Музера. Вакцинируют
людей, живущих в эндемических очагах и подвергшихся опасности заражения.

Лечение. Антибиотики тетрациклинового ряда.

Контрольные вопросы

1. Какие Вы знаете источники инфекции и пути передачи эндемического сыпного

тифа?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление антител к возбудителю и дифференциация
сыпного тифа от эндемического (и других риккетсиозов).

Материал для исследования

Кровь

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Серологические методы:

а) реакция связывания комплемента (РСК);

б) реакция агглютинации;

в) реакция непрямой гемагглютинации (РНГА);

г) реакция нейтрализации токсина;

д) иммунолюминесцентный метод.

2. Биологическая проба.

Ход исследования
 Ход исследования

Контрольные вопросы

1. Какие серологические методы используют для дифференциации

эпидемического сыпного тифа от эндемического?
 2. Какие серологические реакции ставят для дифференциации эпидемического
сыпного тифа от болезни Брилла?

Глава 42. Возбудитель Ку-лихорадки

Ку-лихорадка - это острое инфекционное заболевание, Впервые описано в 30-х
годах XIX века в Австралии (от англ. query - неясный).

В 1939 Г. возбудитель этой лихорадки был выделен из крови больного,

идентифицирован Ф. Бернетом и в его честь назван риккетсиями Бернета. В СССР
Ку-лихорадка регистрируется с 1948 г.

Возбудитель Ку-лихорадки относится к роду Coxiella.

Морфология. С. burnetti представляют собой мелкие, полиморфные

микроорганизмы, ланцетовидной, палочковидной формы, длиной 0,3-0,8 мкм,
сферической формы, 0,3-0,5 мкм в диаметре. Грамотрицательны. По методу
Здродовского красятся в красный цвет.

Культивирование. Риккетсии Бернета хорошо размножаются в желточном

мешке куриного эмбриона. Оптимальная температура для их размножения 35° С.
Внутри клеток хозяина риккетсии размножаются преимущественно в вакуолях.
Рост обнаруживается появлением бляшек.

Ферментативные свойства. Не выражены.

Токсинообразование. Токсин не выявлен, но риккетсии содержат аллерген,

способный сенсибилизировать организм с образованием гранулем.

Антигенная структура. Риккетсии Бернета имеют два антигена: фазы I и II.

Антиген фазы I - поверхностный и представляет собой полисахарид. Антиген фазы
II расположен внутри клетки. Химическая природа его не выяснена. При
длительном культивировании в курином эмбрионе Coxiella burnetti теряет
способность образовывать I антиген. Эта способность восстанавливается после
пассажей через организм морской свинки.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Риккетсии Бернета довольно

устойчивы. Они выдерживают температуру 80-90° С в течение 30 мин.
Пастеризация молока не уничтожает их. Они длительно сохраняются в молочных
продуктах: твороге, масле, кефире и выдерживают действие УФ-лучей в течение 1,5
ч. При низких температурах, особенно в условиях льда, они сохраняются несколько
месяцев. В стерильной воде 3-4 мес. Риккетсии Бернета устойчивы к действию
желудочного сока, 5% раствору формалина и 1% раствору фенола.

Восприимчивость животных. В естественных условиях риккетсии Бернета

обнаруживают у коров, овец, мулов, собак, лошадей, грызунов, птиц и клещей. У
животных болезнь характеризуется лихорадкой. Протекает заболевание у них чаще
в хронической форме. Выделяются риккетсии с молоком, мочой, испражнениями.

Из экспериментальных животных чувствительны: белые мыши, морские свинки,

кролики.
 Источники инфекции. Часто бывают домашние животные.

Пути передачи Coxiella burnetii разнообразны: 1. Воздушно-пылевой (обработка

шерсти зараженных животных вызывает специфическую пневмонию).

2. Пищевой (использование пищевых продуктов, зараженных выделениями

больных животных или фекалиями зараженных насекомых).

3. Трансмиссивный (укус клещей, зараженных риккетсиями Бернета. Клещи

передают риккетсии потомству трансовариально).

Патогенез. Попав в организм, риккетсии проникают в кровь и лимфу - возникает

риккетсиемия, далее - в клетки органов и тканей. В организме человека риккетсии
подвергаются фагоцитозу, однако они не лизируются в фагоците (незавершенный
фагоцитоз). Клиническая картина зависит от механизма заражения. Различают
следующие формы: пневмоническую, гриппозную и менингоэнцефалитическую.
Каждая из них проявляется рядом особенностей.

Иммунитет. Прочный и длительный за счет наличия комплементсвязывающих

антител, агглютининов и др.

Профилактика. Уничтожение грызунов, насекомых. Надзор за домашними

животными. Молоко кипятят. Выделения животных обезвреживают. Больных
госпитализируют. Специфическая профилактика. В местах с повышенной
заболеваемостью людей иммунизируют вакциной, приготовленной из живых
реккетсий Бернета штамм М-44 (вакцина эффективна, но реактивна).

Лечение. Антибиотики тетрациклинового ряда.

Контрольные вопросы
1. Какова морфология и культуральные свойства риккетсии Бернета?

2. Какова устойчивость риккетсии Бернета во внешней среде?

3. Каковы источники и пути передачи риккетсии Бернета?

Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление антител к возбудителю, выделение и
идентификация возбудителя.

Материал для исследования

Кровь

Способы сбора материала

Способы сбора материала

 Основные методы исследования

1. Серологический.

2. Биологический.

Ход исследования

Ход исследования

Контрольные вопросы

1. Перечислите методы диагностики при подозрении на Ку-лихорадку.

2. С какой целью повторно ставят РСК?

Вирусы
Вирусные заболевания возникли в глубокой древности, однако вирусология как
наука начала развиваться в конце XIX века.

В 1892 г. русский ученый-ботаник Д. И. Ивановский, изучая мозаичную болезнь

листьев табака, установил, что заболевание это вызывается мельчайшими
микроорганизмами, которые проходят через мелкопористые бактериальные
фильтры. Эти микроорганизмы получили название фильтрующихся вирусов (от лат.
virus - яд). В дальнейшем было показано, что имеются и другие микроорганизмы,
проходящие через бактериальные фильтры, поэтому фильтрующиеся вирусы стали
называть просто вирусами.

Вопрос о происхождении вирусов является предметом многих исследований и

дискуссий. Одни ученые предполагают, что вирусы являются потомками
неклеточных форм живых паразитических микроорганизмов. Другие считают, что
вирусы возникли в результате регрессивной эволюции одноклеточных
микроорганизмов. Третьи думают, что вирусы произошли из клеточных элементов,
ставших автономными системами.

Большой вклад в изучение вирусов внесли советские вирусологи: М. А. Морозов,

Н. Ф. Гамалея, Л. А. Зильбер, М. П. Чумаков, А. А. Смородинцев, В. М. Жданов и
др.

Вирусы - это неклеточная форма существования живой материи. Они очень

малы. По образному выражению В. М. Жданова "величину их по отношению к
величине средних бактерий можно сравнить с величиной мыши по отношению к
слону". Увидеть вирусы стало возможным только после изобретения электронного
микроскопа.

В настоящее время для изучения вирусов используют много методов:

химические, физические, молекулярно-биологические, иммунобиологические и
генетические.

Все вирусы подразделяются на поражающие человека, животных, насекомых,

бактерии и растения.

У вирусов наблюдается большое разнообразие форм и биологических свойств,

однако все они имеют общие черты строения. Зрелые частицы вирусов называют
вирионами.

В отличие от других микроорганизмов, содержащих одновременно ДНК и РНК,

вирион содержит только одну из нуклеиновых кислот - либо ДНК, либо РНК.

Нуклеиновая кислота вирусов может быть однонитчатой и двунитчатой. Почти

все вирусы, содержащие РНК, имеют в своем геноме однонитчатую РНК, а
содержащие ДНК - двунитчатую ДНК. В соответствии с двумя типами
генетического вещества вирусы подразделяют на РНК- и ДНК-содержащие. К ДНК-
содержащим относятся 5 семейств, РНК-содержащим - 10 семейств.

Классификация вирусов*
*
(Здесь приведены данные, касающиеся только некоторых из патогенных для человека вирусов.)
 Классификация вирусов

Структура вириона. В центре вириона находится нуклеиновая кислота, которая

окружена капсидом (от греч. kanca - ящик). Капсид состоит из белковых
субъединиц, называемых капсомерами. Зрелый вирус по химической структуре
является нуклеокапсидом. Количество капсомер и способ их укладки (рис. 52)
строго постоянны для каждого вида вируса. Например, вирус полиомиелита
содержит 32 капсомера, а аденовирус - 252 капсомера. Капсомеры могут быть
уложены в виде многогранника с равномерными симметричными гранями -
кубоидальная форма (например, аденовирус). Укладка в виде спиралей
(сферическая) характерна для вирусов гриппа. Может быть тип симметрии, при
котором нуклеиновая кислота имеет вид пружины, вокруг которой уложены
капсомеры, в этом случае вирус имеет палочковидную форму - вирус, вызывающий
болезнь листьев табака.
Рис. 52. Схематическое изображение расположения капсомеров в капсиде вирусов. а -
вирус гриппа; б - аденовирус; в - вирус герпеса; г - вирус полиомиелита

Сложный тип симметрии имеет фаг: головка - кубоидальной, а отросток -

палочковидной формы (сперматозоидная форма) (см. рис. 21, 22).

Таким образом, в зависимости от способа укладки вирусы подразделяют на

кубоидальную, сферическую, палочковидную и сперматозоидную формы.

Некоторые вирусы, обладающие более сложной структурой, имеют оболочку,

которая называется пеплос. Она образуется при выходе вируса из клетки хозяина.
Вирусный капсид при этом обволакивается внутренней поверхностью
цитоплазматической мембраны клетки хозяина и образуется один или несколько
слоев оболочки суперкапсид. Такую оболочку имеют только некоторые вирусы,
например вирусы бешенства, герпеса, энцефалита. Эта оболочка содержит
фосфолипиды, разрушающиеся под воздействием эфира. Таким образом,
воздействуя эфиром, можно отличить вирус, имеющий пеплос, от вируса с "голым
капсидом".

У некоторых вирусов из внешнего липидного слоя оболочки выступают

капсомеры в виде шипов (эти шипы тупые). Такие вирусы называются пепломерами
(например, вирус гриппа, см. рис. 52).

Нуклеиновая кислота вируса является носителем наследственных свойств, а

капсид и внешняя оболочка несут защитные функции, как бы оберегая
нуклеиновую кислоту. Кроме того, они способствуют проникновению вируса в
клетку.

Размеры вирусов. Измеряются вирусы в нанометрах. Величина их колеблется в

широком диапазоне от 15-20 до 350-400 нм.

Методы измерения вирусов: 1) фильтрование через бактериальные фильтры с

известной величиной пор; 2) ультрацентрифугирование - крупные вирусы
осаждаются быстрее; 3) фотографирование вирусов в электронном микроскопе.

Химический состав вирусов. Количество и содержание ДНК и РНК вирусов

неодинаковы. У ДНК молекулярная масса колеблется от 1·10 6 до 1,6·108, а у РНК -
от 2·106 до 9,0·106.

Белки у вирионов обнаружены в незначительном числе, они состоят из 16-20

аминокислот. Кроме капсидных белков, имеются еще внутренние белки, связанные
с нуклеиновой кислотой. Белки обусловливают антигенные свойства вирусов, а
также в силу плотной укладки полипептидных цепей ограждают вирус от действия
ферментов клетки хозяина.

Липиды и углеводы обнаружены во внешней оболочке сложных вирионов.

Источником липидов и углеводов является оболочка клетки хозяина.
Полисахариды, входящие в состав некоторых вирусов, обусловливают способность
их вызывать агглютинацию эритроцитов.

Ферменты вирусов. Вирусы не имеют собственного метаболизма, поэтому они

не нуждаются в ферментах обмена веществ. Однако у некоторых вирусов выявлено
наличие ферментов, способствующих проникновению их в клетку хозяина.
Например, у вируса гриппа А обнаружена нейраминидаза, отщепляющая
нейраминовую кислоту, содержащуюся в оболочках животных клеток (эритроцитов
и др.). У фагов - лизоцим, разрушающий клеточную оболочку, фосфатаза и др.

Выявление вирусных антигенов. Вирусные антигены в инфицированных

клетках хозяина можно обнаружить с помощью метода иммунофлюоресценции.
Препараты, содержащие клетки, инфицированные вирусами, обрабатывают
специфическими иммунными люминесцирующими сыворотками. При просмотре в
люминесцентном микроскопе в местах скопления вирусных частиц наблюдается
характерное свечение. Вид вируса определяют по соответствию специфической
люминесцирующей сыворотки, вызвавшей свечение.

Внедрение вируса в клетку, взаимодействие его с клеткой хозяина и

репродукция (размножение) слагаются из ряда последовательных стадий.

Стадия 1. Начинается с процесса адсорбции за счет рецепторов вириона и клетки.

У сложных вирионов рецепторы располагаются на поверхности оболочки в виде
шиловидных выростов (вирус гриппа), у простых вирионов - на поверхности
капсида.

Стадия 2. Проникновение вируса в клетку хозяина протекает по-разному у

разных вирусов. Например, некоторые фаги протыкают оболочку своим отростком
и впрыскивают нуклеиновую кислоту в клетку хозяина (см. главу 8). Другие вирусы
попадают в клетку путем втягивания вирусной частицы с помощью вакуоли, т. е. на
месте внедрения в оболочке клетки образуется углубление, затем края ее
смыкаются и вирус оказывается в клетке. Такое втягивание называется виропексис.

Стадия 3. "Раздевание вируса" (дезинтеграция). Для своего воспроизведения

вирусная нуклеиновая кислота освобождается от защищающих ее белковых
покровов (оболочки и капсида). Процесс раздевания может начаться во время
адсорбции, а может произойти тогда, когда вирус находится уже внутри клетки.

Стадия 4. На этой стадии происходит репликация (воспроизведение)

нуклеиновых кислот и синтез вирусных белков. Эта стадия происходит при участии
ДНК или РНК клетки хозяина.

Стадия 5. Сборка вириона. Этот процесс обеспечивается самосборкой белковых

частиц вокруг вирусной нуклеиновой кислоты. Синтез белка может начаться
непосредственно после синтеза вирусной нуклеиновой кислоты либо после
интервала в несколько минут или несколько часов. У одних вирусов самосборка
происходит в цитоплазме. У других в ядре клетки хозяина. Образование внешней
оболочки (пеплоса) всегда происходит в цитоплазме.

Стадия 6. Выход вириона из клетки хозяина происходит путем просачивания

вируса через оболочку клетки либо через отверстие, образовавшееся в клетке
хозяина (в этом случае клетка хозяина погибает).

Типы взаимодействия вируса и клетки. Первый тип - продуктивная инфекция

- характеризуется образованием новых вирионов в клетке хозяина.

Второй тип - абортивная инфекция заключается в том, что обрывается

репликация нуклеиновой кислоты.

Третий тип - характеризуется встраиванием вирусной нуклеиновой кислоты в

ДНК клетки хозяина; возникает форма сосуществования вируса и клетки хозяина
(вирогения). В этом случае обеспечивается синхронность репликации вирусной и
клеточной ДНК. У фагов это называется лизогения.

Микроскопическое исследование. При отдельных вирусных инфекциях в

цитоплазме или ядрах клеток организма хозяина наблюдаются специфические
внутриклеточные тельца - включения, имеющие диагностическое значение (тельца
Бабеша - Негри при бешенстве, тельца Гварниери при оспе и др.). Размеры
вирусных частиц и телец-включений удается искусственно увеличить
специальными методами обработки препаратов с протравой и импрегнацией
(например, метод серебрения по Морозову) и наблюдать при иммерсионной
микроскопии. Более мелкие вирионы, лежащие за пределами видимости
оптического микроскопа, обнаруживаются только при электронной микроскопии.
Существуют разные точки зрения в отношении внутриклеточных включений. Одни
авторы считают, что они представляют собой скопление вирусов. Другие считают,
что они возникают в результате реакции клетки на внедрение вирусов.

Генетика вирусов. Модификация (ненаследуемые изменения) у вирусов

обусловливается особенностями клетки хозяина, в которой происходит
репродукция вируса. Модифицированные вирусы приобретают способность
заражать клетки, аналогичные тем, в которых они модифицировались. У разных
вирусов модификация по-разному проявляется. Например, у фагов изменяется
форма "негативных пятен" (фаговых колоний).

Мутация - у вирусов возникает под влиянием тех же мутагенов, которые

вызывают мутацию у бактерий (физические и химические факторы). Возникает
мутация во время репликации нуклеиновых кислот. Мутации затрагивают
различные свойства вирусов, например чувствительность к температуре и др.

Генетическая рекомбинация у вирусов может возникнуть в результате

одновременного заражения клетки хозяина двумя вирусами, при этом может
произойти обмен отдельными генами между двумя вирусами и образуются
рекомбинанты, содержащие гены двух родителей.

Генетическая реактивация генов иногда происходит при скрещивании

инактивированного вируса с полноценным, что приводит к спасению
инактивированного вируса.

Спонтанная и направленная генетика вирусов имеет большое значение в

развитии инфекционного процесса.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Большинство вирусов

инактивируется при действии высоких температур. Однако имеются исключения,
например вирус гепатита термоустойчив.

К низким температурам вирусы не чувствительны, ультрафиолетовые солнечные

лучи оказывают инактивирующее действие на вирусы. Рассеянный солнечный свет
действует на них менее активно. Вирусы устойчивы к глицерину, что дает
возможность длительно сохранять их в глицерине. Они устойчивы к антибиотикам
(при культивировании вирусов исследуемый материал обрабатывают
антибиотиками для подавления бактериальной флоры).

Кислоты, щелочи, дезинфицирующие вещества инактивируют вирусы. Однако

некоторые вирусы, инактивированные формалином, сохраняют иммуногенные
свойства, что позволяет использовать формалин для получения вакцин (вакцина
против бешенства).

Восприимчивость животных. Круг восприимчивых животных для некоторых

вирусов очень широк, например к вирусам бешенства чувствительны многие
животные. Некоторые вирусы поражают только один вид животного, например
вирус чумы собак поражает только собак. Имеются вирусы, к которым животные не
чувствительны - например, вирус кори и т. д.

Органотропность вирусов. Вирусы обладают способностью поражать

определенные органы, ткани и системы. Например, вирус бешенства поражает
нервную систему. Вирус оспы обладает дермотропностью и т. д.

Выделение вирусов в окружающую среду. Из больного организма вирусы

могут выделяться с калом, например вирус полиомиелита и другие энтеровирусы.
Вирус бешенства выделяется со слюной, вирус гриппа - с отделяемым слизистой
носоглотки и т. д.
 Основные пути передачи вирусов. Воздушно-капельный (грипп, оспа),
пищевой (полиомиелит, гепатит А), контактно-бытовой (бешенство),
трансмиссивный (энцефалит).

Противовирусный иммунитет. Организм человека обладает врожденной

устойчивостью к некоторым вирусам. Например, человек не чувствителен к вирусу
чумы собак. Животные не чувствительны к вирусу кори. В этих случаях
противовирусный иммунитет основан на отсутствии клеток, способных
поддерживать репродукцию вирусов.

Противовирусный иммунитет обусловливается как клеточными, так и

гуморальными факторами защиты, неспецифическими и специфическими.
Неспецифические факторы. Мощным ингибитором репродукции вирусов является
белковое вещество - интерферон. В здоровом организме он содержится в
незначительном количестве, а вирусы способствуют продукции интерферона и
количество его значительно увеличивается. Он неспецифичен, так как блокирует
репродукцию разных вирусов. Однако он обладает тканевой специфичностью, т. е.
клетки разных тканей образуют неодинаковый интерферон. Считают, что механизм
действия его заключается в том, что он препятствует синтезу белка в клетке хозяина
и этим прекращает репродукцию вируса.

К специфическим факторам противовирусного иммунитета относятся

вируснейтрализующие антитела, гемагглютинирующие и преципитирующие.

Методы культивирования вирусов. Вирусы размножаются только в

жизнеспособных клетках. Их культивируют: в куриных эмбрионах (рис. 53),
культурах ткани человека и различных животных, в организме чувствительных
животных, восприимчивых членистоногих.

Рис. 53, Куриный эмбрион. 1 - хорион-аллантоис: 2 - аллантоисная полость; 3 -

амниотическая полость; 4 - желточный мешок; 5 - воздушный мешок; 6 -
подскорлупная оболочка

В первый период развития вирусологии основным методом изучения вирусов

являлось искусственное заражение животных, но этот метод сложный, и кроме
этого животные ко многим вирусам оказались невосприимчивы.
 Большое значение в развитии вирусологии имело введение методов
культивирования вирусов в куриных эмбрионах и в культуре клеток тканей
человека и животных.

Заражение куриных эмбрионов. Для репродукции вирусов используют

куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста, инкубированные в термостате при 37°
С. Необходимым условием для правильного развития зародыша является
соблюдение определенной влажности воздуха, которую можно создать, поместив в
термостат сосуд с водой.

Пригодность куриного эмбриона для заражения определяется по наличию

движений эмбриона и развитой сети кровеносных сосудов на хорион-аллантоисной
оболочке при просвечивании с помощью овоскопа.

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах

эмбриона, который заражают (см. рис. 53):

1) на хорион-аллантоисную оболочку,

2) в аллантоисную полость;

3) в амниотическую полость;

4) в желточный мешок.

Заражение куриных эмбрионов проводят в боксе с использованием стерильных

инструментов. Перед заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным
тампоном, смоченным спиртом.

Заражение на хорион-аллантоисную оболочку. После дезинфекции яйца

осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого конца, снимают подскорлупную
оболочку - при этом обнаруживается хорион-аллантоисная оболочка.
Инфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или
пастеровской пипетки наносят на хорион-аллантоисную оболочку. После заражения
отверстие закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом
заливают парафином.

На другой стороне яйца простым карандашом пишут название инфекционного

материала и дату заражения.

Заражение в амниотическую полость. Яйцо овоскопируют и на боковой стороне

выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов.
Этот участок отмечают карандашом. Яйца укладывают на подставку в
горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем
прокалывают отверстие в скорлупе на глубину 213 мм, через которое вводят на это
же расстояние иглу с инфекционным материалом непосредственно в
амниотическую полость. Для того чтобы вводимая жидкость не вытекала обратно,
предварительно делают прокол над воздушным мешком, после чего оба отверстия
заливают парафином.
 Заражение в аллантоисную полость. Заражение проводят в затемненном боксе.
Отмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством
дезинфицируют и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону
иглу шприца с материалом. Если игла попала в аллантоисную полость, то
наблюдается смещение тени эмбриона. После заражения отверстие заливают
парафином.

Заражение в желточный мешок. Скорлупу дезинфицируют. Яйцо помещают на

подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный мешок был обращен вверх.
Над воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. Через отверстие в
скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм вводят иглу шприца,
которая попадает в желточный мешок. Материал вводят в объеме 0,2-0,3 мл. После
введения материала отверстие парафинируют.

Температурный режим и длительность инкубации зависят от биологических

свойств введенного вируса.

Инфицированные яйца ежедневно проверяют - овоскопируют для проверки

жизнеспособности эмбриона. Если эмбрионы погибают в первые сутки, то
причиной этого обычно бывает травма при заражении. Такие яйца выводят из
опыта.

При необходимости раздельно исследовать каждую составную часть эмбриона

материал собирают в определенном порядке: отсасывают аллантоисную жидкость,
затем амниотическую жидкость, разрезают хорион-аллантоисную оболочку,
отделяют амниотическую оболочку, эмбрион, желточный мешок и только после
этого извлекают хорион-аллантоисную оболочку, отделив ее от внутренней
поверхности скорлупы. Наличие вируса в зараженном эмбрионе определяют по
характерным изменениям хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного
эмбриона.

Вирусы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, выявляют с

помощью РСК.

Для выявления вируса в аллантоисной или амниотических жидкостях

зараженных эмбрионов ставят РГА (гемагглютинация вызывается аллантоисной
или амниотическими жидкостями или взвесью, приготовленной из хорион-
аллантоисной оболочки).

Культивирование вирусов в культуре клеток. Для накопления вирусов в

чувстсительных клеточных культурах используются ткани человека и различных
животных. Наибольшее практическое применение получили однослойные культуры
первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.

Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоских сосудах-

матрацах. Клеточная суспензия в жидкой питательной среде при температуре 37° С
позволяет получить "in vitro" слой клеток с определенной гистологической
структурой. Присутствие вирусов в культурах тканей обнаруживают по изменению
(дегенерации) клеток. Тип вирусов определяют путем нейтрализации действия
вирусов при добавлении к вируссодержащему материалу соответствующих
типоспецифических сывороток.
 Эти методы позволяют быстрее учитывать результаты исследования и являются
более экономичными. В тех случаях, когда вирусы не вызывают цитопатического
действия (дегенерации) и не развиваются в куриных эмбрионах, пользуются
методами заражения животных (см. главу 11).

Для культивирования вирусов используют перевиваемые клетки, которые чаще

получают из клеток злокачественных опухолей.

Однослойные культуры получают из эмбрионов человека, курицы, животных.

Преимущество однослойных культур клеток - простота методики и легкость

учета.

Способность клеток к размножению вне организма связана со степенью

дифференциации ткани. Менее дифференцированные ткани обладают большей
способностью к пролиферации (соединительная, эпителиальная ткань).

Сущность методов при приготовлении первичных культур ткани заключается в

разрушении межклеточной ткани и разобщении клеток для последующего
получения монослоя.

Разобщение клеток проводится путем воздействия на ткань протеолитических

ферментов, чаще всего трипсина. Раствор трипсина способствует разъединению
клеток при сохранении у них способности к размножению. Для выращивания
культуры клеток необходима питательная среда. Состав среды сложный, он
включает целый ряд ингредиентов: аминокислоты, глюкозу, витамины,
минеральные соли, коферменты и т. д. Получение культуры ткани проводят в
строго асептических условиях. В среду добавляются антибиотики (500 ЕД
пенициллина и 250 ЕД стрептомицина в 1 мл) для подавления роста бактериальной
флоры.

Подготовленную ткань заливают 0,25% раствором подогретого трипсина и

инкубируют в термостате при 37° С. Во время инкубации ткань периодически
помешивают путем вращения колбы. Трипсинизированные клетки центрифугируют
при 800-1000 об/мин в течение 5 мин.

Трипсинизацию и центрифугирование проводят очень осторожно, чтобы не

травмировать клетки. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют,
а осадок клеток помещают в небольшой объем питательной среды. Для получения
однородной массы взвесь клеток фильтруют через один слой марли в воронке
(стерильной). Взвесь клеток проверяют на стерильность путем посева по 0,1 мл , в 2
пробирки с сахарным бульоном.

Успех культивирования клеток зависит от посевной Дозы, поэтому после

трипсинизации производят подсчет клеток в камере Горяева. После подсчета взвесь
клеток разводят питательной средой из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалось
500000-1000000 клеток и разливают по пробиркам и матрацам. Пробирки с
культурой ткани инкубируют в термостате в наклонном положении.

Посеянные культуры ежедневно просматривают под малым увеличением

микроскопа для определения характера их роста. Нормальные пролиферирующие
клетки светлые и растут однослойным пластом. Если клетки темные, зернистые и
не пролиферируют, что может быть результатом загрязнения (плохая обработка
посуды или загрязнение ингредиентов), то такие культуры изымают из опыта.

Смена питательной среды через 2-3 дня после посева улучшает интенсивность
пролиферации.

Нормальные, хорошо пролиферирующие клетки заражают исследуемым

материалом.

Перевиваемые культуры преимущественно получают из злокачественных

опухолей. Штамм Hela - культура клеток рака шейки матки женщины по имени
Helena (получен в 1950 г.); штамм Нер-2 выделен от больного раком гортани. Рост
этих клеток поддерживается в лабораториях путем последовательных пассажей.
Особенность их заключается в том, что они размножаются в течение длительного
срока. В настоящее время эти клетки прошли уже тысячи генераций. В процессе
пассажей они теряют некоторые морфологические и биохимические свойства -
подвергаются мутации. Однако остаются вполне пригодными для культивирования
в них вирусов. Культурой этих клеток пользуются лаборатории всего мира.

Размножение вируса в культуре клеток происходит в различные сроки в

зависимости от свойств вируса и вида клеток.

О наличии вируса судят по цитопатическому действию. В микроскопе

наблюдается дегенерация клеток. Время цитопатического действия и его характер
зависят от дозы и свойств вируса.

У некоторых вирусов цитопатическое действие обнаруживается через несколько

дней (вирус оспы), у других - через 1-2 нед (вирус гепатита и др.).

В настоящее время известны уже сотни вирусов, поражающих человека. Борьба с

вирусными инфекциями осуществляется разными методами. Наиболее эффективна
иммунизация. Таким способом ликвидирована оспа, сокращена заболеваемость
полиомиелитом. Важное значение в борьбе с вирусными инфекциями имеют
общественная профилактика - уничтожение бродячих собак (борьба с бешенством),
личная профилактика и т. д.

Однако эти меры не могут обеспечить ликвидацию всех вирусных заболеваний.

Ученые настойчиво ищут пути, при помощи которых можно было бы поразить
вирус, не повредив клетку, в которой он находится.

Поэтому закономерно, что в программе КПСС вирусология названа одной из

ведущих отраслей естественнонаучных знаний, которая должна получить
преимущественное развитие в ближайшие годы.

Основные методы исследования вирусов. 1. Реакция гемагглютинации,

реакция задержки гемагглютинации, реакция непрямой гемагглютинации. Реакция
связывания комплемента.

2. Реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей.

 3. Метод иммунофлюоресценции.

4. Гистологический метод - выявление включений (телец Бабеша - Негри - при

бешенстве; телец Пашена - при оспе и др.).

5. Биологический метод.

РНК-содержащие вирусы
Глава 43. Возбудители гриппа
Грипп - распространенное острое инфекционное заболевание дыхательных
путей, имеющее эпидемический характер и поражающее большие массы людей.
Пандемия гриппа (1918-1920), получившая название "испанка", охватила почти 1,5
млрд. человек и унесла 20 млн. человеческих жизней.

Еще в начале XX века (1904) М. И. Афанасьев и П. Б. Вакс высказали

предположение о вирусной природе инфекции. Однако установить это удалось
только в 1933 г., когда Ч. Смитс, К. Эндрюс и П. Лейдлоу выделили от больных и
изучили разновидности вирусов гриппа, названные вирусами гриппа типа А, в 1940
г. Т. Френсис и Т. Меджилл изучили вирусы гриппа В, а в 1947 г. Р. Тейлер открыл
вирус гриппа С.

Возбудители гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae (от лат.

myxomatosis - слизистый). Они обладают выраженным тропизмом к слизистым
оболочкам верхних дыхательных путей.

Это семейство включает вирусы, вызывающие заболевания у человека, животных

и птиц.

Морфологическая структура. Структура вирионов гриппа сложна. В ее составе

имеются однонитчатая РНК, нуклеокапсид спиральной формы и защитная
липидоуглеводопротеиновая оболочка. Количество капсомеров точно не
установлено. Вирионы имеют в основном сферическую форму, но встречаются и
вирионы нитевидной формы. Оболочка имеет выступы (шипы) - пепломеры (см.
рис. 53). РНК синтезируется в ядре клетки хозяина. Вирусные белки синтезируются
в цитоплазме. Формирование вирионов происходит вблизи оболочки клетки.

Культивирование. Вирус гриппа хорошо размножается в курином эмбрионе (в

клетках амниотической или аллантоисной полостей). Культивировать его можно
также в культуре клеток почек обезьян, эмбриона человека и др.

Антигенная структура. Вирусы гриппа имеют S-антиген, по которому в

реакции связывания комплемента они подразделяются на типы А, В, С.

У вируса А обнаружены еще два антигена: гемагглютинин и нейраминидаза (см.

рис. 53).

Гемагглютинин имеет четыре подтипа (Н 0, Н1, Н2, Н3), а нейраминидаза - два

(N1 и N2). По сочетанию этих антигенов определяют подтип вируса, который
меняется при разных эпидемиях. Так, эпидемию гриппа в 1933 г. вызвал вирус
гриппа типа А, имевший формулу AH0N1. AH1N1 выделен при эпидемии 1947 г.,
AH2N2 - в 1957 г. (штамм Сингапур), AH 3N2 - в 1968 г. (штамм Гонконг), в 1977 г.
снова вернулся вирус типа AH1N1.

Вариабельность сочетания этих антигенов определяет изменчивость вируса А.

Вирус типа В более устойчив. Самый устойчивый тип С. Типы и подтипы вирусов
не дают перекрестного иммунитета.

Вирусы гриппа обладают общим антигеном с изоантигенами эритроцитов

человека.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Температура 65° С губит

вирусы гриппа через 5-10 мин. При 50° С он утрачивает свои инфекционные
свойства через несколько минут. При комнатной температуре вирус инактивируется
через несколько часов. В кислой, щелочной среде, под влиянием эфира и
дезинфицирующих растворов он погибает очень быстро. Вирус очень чувствителен
к действию УФ-лучей и ультразвуку. Он устойчив к действию глицерина, в котором
может сохраняться несколько месяцев.

Восприимчивость животных. Во время эпидемических вспышек к вирусу

гриппа могут адаптироваться домашние животные. Это выявлено увеличением у
них титра антител. Но эпидемическая роль животных неизвестна. Может быть они
являются хранителями вируса в природе и играют роль в его циркуляции.

Из экспериментальных животных можно заразить хорьков через дыхательные

пути, интраназально - белых мышей. Заболевание у них характеризуется
поражением легких, часто приводящим их к гибели.

Источники инфекции. Больной человек. Пути передачи. Воздушно-капельный

(при разговоре, кашле, чиханье).

Патогенез. Вирус попадает на слизистую оболочку верхних дыхательных путей.

Проникнув в организм человека, он внедряется в эпителиальные клетки верхних
дыхательных путей, откуда проходит в кровь и вызывает явления интоксикации. В
слизистой оболочке вирус вызывает гибель клеток. Это создает условия для
проникновения других микроорганизмов, вызывающих вторичную инфекцию -
пневмонию, бронхит и др. Активируются бактерии, локализующиеся в верхних
дыхательных путях, - возникает аутоинфекция. Кроме того, вирус гриппа
активирует хронические заболевания, такие как туберкулез и др.

Иммунитет. Формируется главным образом за счет антигемагглютининов,

которые обладают вируснейтрализующими свойствами - препятствуют адсорбции
вирусов на чувствительной клетке. Большую роль играют антинейраминидазные
антитела. Защита организма обусловливается также интерфероном и другими
ингибиторами, находящимися в сыворотке крови человека.

Обычно иммунитет носит типо- и штаммоспецифический характер. Смена

подтипов вируса А исключает надежную защиту организма от этой инфекции, так
как перекрестного иммунитета нет, а прогнозировать направление изменчивости
пока не удается.
 Профилактика. Изоляция больного, проветривание помещения, влажная уборка
и т. д. Важно также предупреждение охлаждения, которое снижает выработку
такого защитного фактора как интерферон.

Специфическая профилактика. В СССР используют живую вакцину,

содержащую ослабленные вирусы типа А и В. Вводится вакцина интраназально.
Получена живая вакцина для детей, которая вводится перорально. Ведутся
исследования по созданию вакцины из гемагглютининов, нейраминидазы.

Для индивидуальной защиты пользуются интерфероном и оксалиновой мазью

(смазывают слизистую носа).

Однако противогриппозные мероприятия не могут считаться достаточно

эффективными. В СССР гриппом болеют 40-50 млн. человек в год, что наносит
ущерб здоровью людей и экономике страны. Поэтому в настоящее время
разрабатывается комплексная программа по борьбе с гриппом, в котором
принимают участие многие (более 20) научно-исследовательские институты.

Лечение. При гриппе, вызванном вирусом А, нашел применение ремантадин.

Для предупреждения вторичных инфекций используют различные
антибактериальные препараты.

Вирусологическая диагностика
Цель исследования: выявление вируса и определение его типа; определение в
сыворотке крови антител.

Материал для исследования

1. Отпечатки слизистой оболочки носовой полости (в острой стадии

заболевания).

2. Носоглоточное отделяемое.

3. Кровь.

Способы сбора материала

 Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Культивирование смывов из носоглотки в куриных эмбрионах.

2. Риноцитоскопическое исследование.

3. Иммунофлюоресценция (см. главу 12).

4. Серологическое исследование парных сывороток в РСК и РТГА.

Ход исследования
 Ход исследования

Контрольные вопросы
1. Опишите морфологическую структуру вируса гриппа.

2. Какие Вы знаете методы культивирования вирусов гриппа?

 3. Какова антигенная структура вируса гриппа и какие Вы знаете типы его?

4. Какой тип вируса гриппа наиболее подвержен изменчивости и как называются

выделенные штаммы (обозначения)?

5. Какова устойчивость вируса гриппа во внешней среде?

6. Почему при заболевании гриппом часто возникают вторичные инфекции?

7. Как и какой материал собирают для выявления вируса гриппа?

8. Чем обусловливается нестойкость иммунитета при гриппе?

9. Назовите основные методы исследования при лабораторной диагностике

гриппа.

Глава 44. Возбудитель бешенства

Возбудитель бешенства относится к семейству Rhabdoviridae (рабдовирусы).

Семейство это включает вирусы бешенства, везикулярного стоматита и другие

вирусы, вызывающие заболевания у животных и насекомых.

На протяжении тысячелетий все человечество страдало от этой страшной

болезни - бешенства. Упоминание об этом заболевании встречается в "Илиаде"
Гомера, трудах Аристотеля и Авиценны. В I веке до н. э. римский ученый Цельсий
предложил выжигать укушенные места каленым железом. Это болезненное
мероприятие спасало только в том случае, если рана была невелика и прижигание
производилось немедленно после укуса. Можно рассказывать еще о многих
средствах, но все они оказывались малоэффективными.

Впервые бешенство изучил Л. Пастер в 1880 г.

В 1886 г. группа одесских врачей на свои средства командировала Н. Ф. Гамалея

к Пастеру в Париж для ознакомления с методом приготовления вакцины против
бешенства. После его возвращения в Одессе была открыта лаборатория, где
изготовлялась антирабическая вакцина.

Морфологическая структура. Возбудитель бешенства имеет палочковидную

(пулевидную) форму, один конец которой плоский, другой - вытянутый. Размер 80-
180 нм. Вирион содержит однонитчатую РНК, окруженную капсидом. Снаружи
капсид покрыт оболочкой, в состав которой входят гликопретеиды и гликолипиды.
В оболочке имеются шиловидные образования (пепломеры).

В цитоплазме пораженных вирусом клеток образуются специфические

включения, описанные Бабешем (1892) и Негри (1903). Поэтому их называют
тельцами Бабеша - Негри. Величина этих телец от 3-4 до 20 мкм. Они разной
формы, чаще сферической, но бывают овальной и многоугольной. Кислые
красители окрашивают их в рубиново-красный цвет.
 Тельца Бабеша - Негри располагаются в цитоплазме нервных клеток головного
мозга. Обнаружение телец Бабеша - Негри имеет диагностическое значение.

Культивирование. Вирус бешенства культивируется в мозговой ткани мышей,

цыплят, кроликов, в куриных эмбрионах, эмбрионах телят, овец и культурах клеток
разного вида животных.

Антигенная структура. Вирусы бешенства не имеют антигенных

разновидностей. Существуют два вируса бешенства: дикий, циркулирующий среди
животных, вирулентный и для человека, названный уличным вирусом. Другой
вирус бешенства получил Л. Пастер в лабораторных условиях путем
последовательных, длительных пассажей (133 раза) уличного вируса через мозг
кролика. При этом сократилась продолжительность инкубационного периода при
заражении кролика с 21 до 7 дней. Дальнейшие пассажи уже не меняли время
инкубации, оно зафиксировалось на 7 днях, и вирус был назван фиксированным
(virus fixe). В процессе пассажей вирус адаптировался к мозгу кролика и потерял
способность вызывать заболевания у человека, собак и других животных. Однако
свои антигенные свойства он полностью сохранил, поэтому его используют для
приготовления антирабической (против бешенства) вакцины.

Восприимчивость животных. Бешенством болеют многие животные, домашние

и дикие, даже птицы. Однако чаще заболевают собаки, волки, лисицы, летучие
мыши. Летучие мыши болеют без выраженных признаков заболевания и, возможно,
являются хранителями вируса бешенства в природе.

Источники инфекции. Больные животные.

Пути передачи. Вирус бешенства передается прямым контактным путем от

больных животных (укусы) либо при попадании слюны больного животного на
поврежденную поверхность кожи или слизистых оболочек.

Патогенез. От момента укуса или ослюнения до заболевания человека проходит

от 15-45 дней до 3-6 мес (описаны случаи инкубации свыше года).

Длительность инкубации зависит от ворот инфекции, характера повреждения

ткани.

Наиболее короткий период инкубации при укусах в лицо и голову.

Из места внедрения вирусы распространяются по нервным стволам и попадают в

клетки центральной нервной системы. Наибольшее количество вируса
концентрируется в гиппокампе, продолговатом мозге, ядрах черепных нервов и в
поясничной части спинного мозга. В нервных клетках вирус репродуцируется
(размножается). В результате поражения нервной системы появляется повышенная
рефлекторная возбудимость: судороги, особенно дыхательных и глотательных
мышц. Возникает одышка и водобоязнь (гидрофобия). Одно представление о питье
вызывает у больных сильные болезненные судороги. Смерть наступает через 4-5
дней. Летальность 100%.

Клиническая картина бешенства у собак: животное становится угрюмым,

появляется слюнотечение. Собака начинает пожирать несъедобные вещи - камни,
щепки и пр. Затем наступает период возбуждения. Собака бежит по прямой линии,
низко наклонив голову. Нападает на встречающихся людей, животных без лая и
кусает их. Период возбуждения сменяется параличами и гибелью животного.

Иммунитет. Постинфекционный иммунитет не достаточно изучен. Механизм

иммунитета, возникающего после прививки, связан с вируснейтрализующини
антителами, которые появляются через 2 нед после вакцинации, а также с
интерференцией вакцинного и уличного вирусов. Феномен интерференции состоит
в том, что фиксированный вирус значительно быстрее достигает клеток нервной
системы, размножается в них и препятствует внедрению уличного вируса.
Иммунитет сохраняется в течение 6 мес.

Профилактика. Уничтожение бешеных животных, бродячих собак. Регистрация

собак и обязательная их вакцинация. В случае укуса немедленная обработка ран.

Специфическая профилактика. Введение антирабической вакцины,

предложенной Пастером. Вакцина представляет собой взвесь мозговой ткани
животного (кролика, мыши и др.), зараженного фиксированным вирусом
бешенства. Имеются 2 типа вакцин: Ферми и Филлипса. Они отличаются между
собой количеством и качеством консерванта. Вакцина Ферми содержит 1% фенол,
Филлипса - глицерин.

В последнее время пользуются вакциной Флори. Это живая антирабическая

вакцина, приготовленная из вирусов, культивированных в эмбрионах птиц.
Принцип действия тот же (интерференция вирусов).

Вакцинации подлежат все укушенные или ослюненные больными или

подозрительными в отношении бешенства животными. Противопоказаний нет,
однако прививки не делают людям без достаточных показаний, так как даже
фиксированный вирус может привести к осложнениям. Прививки делают как
можно раньше, проводят их многократно. Вакцину вводят подкожно в область
живота. Количество прививок назначает врач.

При укусах опасной локализации и для повышения эффективности вакцин

применяют еще антирабический иммуноглобулин, который получают из сыворотки
гипериммунизированных фиксированным вирусом лошадей. Иммуноглобулин
обладает способностью нейтрализовать действие вируса. Кроме того, он
предупреждает поствакцинальные осложнения (аллергический энцефаломиелит и
др.).

В СССР и других странах мира проводят исследования, направленные на

получение антирабической вакцины, не вызывающей осложнений.

Лечение. Не разработано.

Вирусологическая диагностика

Посмертная диагностика основана на: 1) обнаружении телец Бабеша - Негри в

клетках мозга; 2) выявлении специфического антигена методом флюоресцирующих
антител; 3) выделении вируса методом биопробы на лабораторных животных.
 1. Тельца Бабеша - Негри могут быть обнаружены в окрашенных мазках и
отпечатках из нефиксированной мозговой ткани и в гистологических срезах (даже в
том случае, если мозг подвергается гниению). Для их обнаружения делают
несколько препаратов (так как телец может быть мало). При окраске по Муромцеву
цитоплазма нервных клеток голубого цвета, а тельца Бабеша - Негри - фиолетового
с розовым оттенком и выраженной темно-фиолетовой зернистостью.

В клетках мозга больных бешенством животных тельца Бабеша - Негри

обнаруживают чаще, чем в срезах, сделанных из слюнных желез.

2. Метод флюоресцирующих сывороток широкого практического применения

пока не получил.

3. Метод биопробы на лабораторных животных проводится только в

специальных лабораториях.

Работу, хранение и пересылку нефиксированного материала осуществляют по

правилам, предусмотренным для работы с особо опасным инфекционным
материалом (см. "Особо опасные инфекции").

Контрольные вопросы
1. Какова форма и величина вируса бешенства?

2. Что такое тельца Бабеша - Негри?

3. Что такое вирус fixe?

4. Какова восприимчивость животных к вирусу бешенства?

5. Как передается вирус бешенства?

6. Какой вирус бешенства используется для приготовления вакцины (уличный

или вирус fixe?)

7. На чем основана вирусологическая диагностика при подозрении на бешенство?

Глава 45. Возбудители полиомиелита

Заболевание полиомиелитом было известно очень давно. В египетском храме
был обнаружен барельеф с изображением египетского жреца, у которого одна нога
тоньше другой (сухая нога), а стопа другой находилась в положении "конской
стопы" - теперь известно, что это результат заболевания полиомиелитом.

Вирусы полиомиелита
Возбудители полиомиелита входят в семейство Picornaviridae (от лат. pico -
маленький, rna - РНК-содержащий).
 Это семейство включает три рода, из которых в патологии человека наибольшее
значение имеют энтеровирусы: возбудители полиомиелита, Коксаки и ECHO
(Enteric cytopathogenic human orphan viruses) (orphan - сирота).

Вирусная этиология полиомиелита была установлена К. Ландштейнером и Э.

Папером в 1909 г. в опытах на обезьянах.

Морфологическая структура (см. рис. 52) Полиовирус относится к малым

вирусам (15-30 нм). Вирус состоит из однонитчатой РНК и белкового капсида,
состоящего из 32 капсомеров. Форма вируса кубоидальная. Внешней оболочки нет.
Углеводы и липиды не обнаружены. Инфекционные свойства связаны с РНК.

Культивирование. Вирус полиомиелита хорошо размножается в культуре

клеток почек обезьян, фибробластов, эмбриона человека и перевиваемых культурах
клеток. Размножение вируса сопровождается цитопатическим действием
(дегенерацией клеток).

Антигенная структура. Известны три серологических типа вируса

полиомиелита, которые обозначаются римскими цифрами (I, II, III). Наибольшее
эпидемиологическое значение имеет вирус I типа (вызывает заболевания в 65-90%
случаев). Вирус II типа обнаруживается в 10-12%, вирус III типа вызывает
отдельные спорадические заболевания.

Серотипы полиовируса различаются в реакции нейтрализации. Они не вызывают

перекрестного иммунитета.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Кипячение убивает вирус

быстро. Температура 50° С губит его через 30 мин. При комнатной температуре
вирус может сохраняться до 3 мес. Низкие температуры он переносит хорошо. В
испражнениях на холоде полиовирус сохраняется до 6 мес. В молоке - до 3 мес.
Полиовирусы длительно сохраняются в почве, открытых водоемах, что имеет
эпидемиологическое значение. Вирусы устойчивы к воздействию желудочного сока
и к 1% фенолу. Чувствительны к формалину, хлорамину, перекиси водорода,
перманганату калия и др.

Восприимчивость животных. К вирусу полиомиелита I и III типа

чувствительны обезьяны (шимпанзе, макаки). К вирусу II типа чувствительны
грызуны (хлопковые крысы, хомяки, мыши). Экспериментальное заражение
вызывает у них заболевание, сопровождающееся параличами.

Источники инфекции. Больные люди и вирусоносители.

Пути передачи. Пищевой (вирус выделяется с фекалиями до 40 дней).

Заболевание может передаваться мухами (мухи переносят вирус на лапках,
брюшке) и через объекты окружающей среды; воздушно-капельный (в первые дни
болезни вирус выделяется из носоглотки).

Патогенез. Входными воротами является слизистая оболочка верхних

дыхательных путей и пищеварительного тракта. Попав в организм на слизистую
носоглотки, вирус проникает в лимфатические узлы глоточного кольца и тонкого
кишечника, где происходит его репродукция (размножение). В крови
накапливаются вируснейтрализующие антитела, блокирующие проникновение
вируса в ЦНС. В том случае, когда вирус все-таки проникает в ЦНС, он
локализуется с двигательных клетках передних рогов спинного мозга и в сером
веществе подкорки, где вызывает воспалительно-дегенеративный процесс. В
результате возникают вялые параличи, чаще нижних конечностей.

Клинически полиомиелит протекает в трех формах: абортивной,

непаралитической (менингеальной) и паралитической (в 1% случаев).

Полиомиелитом чаще болеют дети в возрасте от 5 мес до 5-6 лет. Выделяется

вирус полиомиелита с испражнениями и слизью носоглотки.

Иммунитет. После перенесенного заболевания остается пожизненный

иммунитет, обусловленный образовавшимися вируснейтрализующими антителами
к гомологичным типам вируса.

Профилактика. Ранняя диагностика и изоляция больных.

Специфическая профилактика осуществляется активной иммунизацией.

Первая вакцина была предложена Солком в 40-х годах XX века. Эта вакцина
состояла из инактивированных формалином полиовирусов I, II и III типа. Однако
она не вызывала образования стойкого иммунитета и была очень болезненна при
внутримышечном введении.

Вторая вакцина была предложена Сэбином. Она состояла из живых

аттенуированных (ослабленных) штаммов-мутантов трех типов полиомиелита. Эти
штаммы были лишены инфекционных свойств, но сохранили иммуногенность.

В 60-х годах М. П. Чумаков и А. А. Смородинцев, использовав ослабленный

штамм, полученный Сэбином, разработали метод приготовления вакцины в виде
конфет-драже, что значительно облегчило ее применение. Массовая вакцинация
детей привела к почти полной ликвидации полиомиелита в СССР, за, что авторы
получили Ленинскую премию.

Механизм действия вакцины состоит в интерференции вирусов, т. е. вакцинный

штамм вируса, заселяя клетки кишечника, блокирует репродукцию дикого штамма,
а также в образовании вируснейтрализующих антител.

Лечение. Симптоматическое. Применяют иммуноглобулин.

Вирусологическая диагностика

Цель исследования: выявление вируса и определение его типа; серодиагностика.

Материал для исследования

1. Кал больных (взятые на 1-й и 2-й неделе заболевания).

2. Носоглоточное отделяемое (взятое в первые дни заболевания).

3. Кусочки головного и спинного мозга, содержимое тонкого и толстого

кишечника, лимфоузлы (секционный материал).
 Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Выделение вирусов путем заражения различных культур клеток.

2. Серологическое исследование (реакция нейтрализации) и РСК.

Ход исследования

Выделение вирусов проводят путем заражения исследуемым материалом двух

видов культур - первичных и перевиваемых клеток.

Ход исследования
 О наличии вируса судят по цитопатическому действию на клетки.

При отсутствии дегенерации клеток в течение 7-10 дней после заражения

проводят следующий пассаж. Для второго посева используют культуральную
жидкость, взятую из первого пассажа, и заражают новую культуру клеток.

При отсутствии дегенерации клеток во втором пассаже результат считают

отрицательным.

При положительном результате проводят типирование выделенного вируса с

коммерческими сыворотками против вируса полиомиелита трех типов методом
нейтрализации в культуре клеток и РСК.

Серологическая диагностика

Методы ретроспективной диагностики. Для подтверждения диагноза

полиомиелита ставят реакцию нейтрализации с парными сыворотками больного.
Одну сыворотку берут в начале заболевания, вторую - через месяц после начала
заболевания. Обе сыворотки исследуют одновременно в реакции нейтрализации.
Для этого сыворотки прогревают в течение 30 мин при 56° С и разводят раствором
Хенкса. Разведения делают от 1:4 до 1:1024. Каждое разведение смешивают со
стандартной дозой вируса I, II и III типа. После часового контакта (при комнатной
температуре) каждой смесью заражают по 2 пробирки со взвесью культуры клеток
и помещают в термостат на 4-9 дней. О результатах реакции судят по изменению
цвета среды (от малинового до желтого). Изменение цвета свидетельствует о
наличии антител. Изменение цвета происходит потому, что клетки остаются
жизнеспособными, образуют продукты обмена, изменяющие реакцию рН и
соответственно цвет среды. Жизнеспособность клеток обеспечивает нейтрализация
вируса соответствующей сывороткой.

Положительной реакцию считают только при четырехкратном увеличении титра

вируснейтрализующих антител, т. е. если, например, титр первой сыворотки был
1:8, а во второй, взятой через 1-2 мес, титр не менее чем 1:32.

Вирусы Коксаки
Вирус Коксаки впервые выделили в 1948 г. Г. Долдорф и И. Сиклс в городе
Коксаки в США из испражнений детей при полиомиелитоподобных заболеваниях.

Морфологическая структура. Вирусы Коксаки относятся к мелким вирусам

(20-30 нм). В их состав входит РНК и белок, форма кубоидальная.

Культивирование. Культивируются они так же как и полиовирус.

Антигенная структура. По антигенной структуре и патогенным свойствам

вирусы Коксаки разделяют на 2 группы: А и В.

В группу А входят 24 серологических типа, которые различаются в реакции

нейтрализации.

В группу В входят 6 серотипов, различающихся также в реакции нейтрализации.

 Устойчивость к факторам окружающей среды. Кипячение губит вирусы
Коксаки быстро, 50-55° С - через 30 мин. Низкие температуры вирусы переносят
хорошо. При температуре -70° С они сохраняются около 3 мес. Вирусы устойчивы к
различным концентрациям водородных ионов, действию эфира, 5% лизолу, но
проявляют чувствительность к хлороводородной кислоте, формальдегиду и т. д.

Восприимчивость животных. Вирус типа А вызывает у новорожденных мышей

параличи, а серотип 7 - полиомиелитоподобные заболевания у обезьян и хлопковых
крыс. Вирус типа В у новорожденных мышей вызывает спастические параличи.

Источники инфекции. Вирусы Коксаки в природе широко распространены. Они

выделяются с испражнениями и из носоглотки от больных и вирусоносителей.

Пути передачи. Пищевой (при использовании зараженной воды, пищи и при

контакте с объектами внешней среды, инфицированными вирусом; вирусы могут
переноситься мухами), воздушно-капельный (больной выделяет вирусы при
чиханье, кашле в первые дни болезни).

Патогенез. Входными воротами является слизистая оболочка носоглотки и

пищеварительного такта. Вирусы Коксаки характеризуются нейро- и
миотропностью. Вирусы Коксаки А могут вызвать паралитические заболевания,
схожие с полиомиелитом. Вирусы Коксаки группы В вызывают асептический
серозный менингит, асептический миокардит и другие энтеровирусные
заболевания.

Иммунитет. После перенесенного заболевания остается стойкий

типоспецифический иммунитет.

Профилактика. Санитарные мероприятия: изоляция больных, карантин.

Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Симптоматическое.

Вирусологическая диагностика

Цель исследования: выделение вируса и определение его типа.

Материал для исследования, способы его сбора и основные методы исследования

такие же, как и при полиомиелите.

Методы диагностики. Выделение вирусов проводят так же, как и при

полиомиелите: посев исследуемого материла на первичные и перевиваемые
культуры клеток. Некоторые серотипы Коксаки А с трудом адаптируются в
культуре клеток.

Выделенные вирусы идентифицируют в РСК и реакции нейтрализации.

Для дифференциации вируса Коксаки типа А от типа В ставят биологическую

пробу: заражают новорожденных белых мышей (сосунков).
 Вирус типа А вызывает у них вялые параличи без энцефалита, а вирус типа В
вызывает судороги и параличи, кроме того, наблюдается поражение внутренних
органов - печени, поджелудочной железы и др. При заболевании, вызванном
вирусами Коксаки, используют также ретроспективный метод серодиагностики,
ставят реакции нейтрализации с парными сыворотками (см. главу 45).

Вирусы ECHO
В 1941 г. Д. Эндерс при изучении полиомиелита выделил из кишечника больного
вирус, который по серологическим свойствам отличался от вируса полиомиелита и
других кишечных вирусов, и назвал его orphan - сирота. Дальнейшие работы
показали, что имеется большое количество схожих с ним вирусов, а всю группу
назвали ECHO - Enteric cytopathogenic human orphan viruses.

Морфологическая структура. Величина вируса ECHO 10-15 нм. По своей

структуре и репродуктивной способности он мало отличается от полиовирусов и
вирусов Коксаки.

Культивирование. Вирусы ECHO, так же как вирусы полиомиелита и Коксаки,

культивируют на первичных и перевиваемых линиях клеток.

Антигенные свойства. Вирусы ECHO включают 32 серологических типа, не

создающих перекрестного иммунитета.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Такая же, как и у вирусов

Коксаки.

Восприимчивость животных. Животные не чувствительны к вирусам ECHO.

Источники инфекции, пути передачи и входные ворота. Такие же, как у

вирусов полиомиелита и Коксаки.

Патогенез. Вирусы ECHO являются причиной разнообразных заболеваний -

вызывают асептический серозный менингит, энтеровирусную лихорадку,
эпидемические экзантемы, миокардит и другие лихорадочные заболевания.

Иммунитет. Вирусы ECHO создают стойкий иммунитет за счет

вируснейтрализующих антител.

Профилактика. Общесанитарные мероприятия как и при других кишечных

инфекциях, но следует помнить, что переохлаждение и перегревание способствуют
распространению энтеровирусных заболеваний. Специфическая
профилактика не разработана.

Лечение. Симптоматическое.

Вирусологическая диагностика

Материал для исследования, способы его сбора, основные методы исследования

и диагностики такие же, как и для других энтеровирусных заболеваний. Однако в
качестве культуры клеток ткани лучше использовать первично-
трипсинизированные.

Контрольные вопросы
1. Какие вирусы включены в семейство Picornaviridae?

2. Каковы величина и морфологическая структура вирусов полиомиелита,

Коксаки и ECHO?

3. Какие Вы знаете методы культивирования полиовирусов? Чем сопровождается

размножение вирусов в культурах клеток?

4. Какие Вы знаете типы полиовирусов? Какой из них имеет наибольшее

эпидемиологическое значение?

5. Источники заболевания, ворота инфекции и патогенез при заболевании

полиомиелитом.

6. Расскажите о специфической профилактике полиомиелита.

7. Какой материал следует взять для исследования и какие основные методы

используются для диагностики при подозрении на полиомиелит?

8. Расскажите о вирусах Коксаки.

9. Расскажите о вирусах ECHO.

ДНК-содержащие вирусы
Глава 46. Возбудитель натуральной оспы
Семейство Poxviridae включает несколько родов, имеющих разнообразных
хозяев. Патогенным для человека является вирус натуральной оспы.

Заболевание оспой известно с незапамятных времен (около 3000 лет до н. э.) и

распространено оно было во всех странах мира.

Один из древних историков писал: "Никакой народ, никакая раса, ни звание, ни

возраст, ни пол не щадились оспой. Все трепетало перед ней". Оспа страшна своей
контагиозностью. В Германии в XVIII веке от оспы погибло 80 тыс. человек. От
оспы умерли русский царь Петр II, австрийский император Иосиф, французский
король Людовик XIV, английская королева Анна, знаменитая русская актриса
Комиссаржевская и др.

Нам сейчас трудно представить себе ту сокрушительную силу, с которой

орудовал вирус оспы. Но этот бич человечества был сломлен наукой. Прекратились
эпидемии оспы.

И за последние несколько лет не было зарегистрировано ни одного случая оспы

во всем мире.
 Этиология оспы была установлена к концу XIX века. В 1892 г. Гварниери в
гистологических срезах, сделанных и роговицы глаз кролика, зараженного
оспенным материалом, обнаружил шаровидные и серповидные включения
величиной от 3-4 до 10 мкм, окрашивающиеся по Романовскому - Гимзе в красный
цвет. Эти включения были названы тельцами Гварниери. А в 1906 г. в содержимом
оспенных пустул Пашен обнаружил оспенные корпускулы, в препаратах,
обработанных методом серебрения по Морозову. Эти корпускулы были названы
тельцами Пашена - Морозова.

Морфологическая структура. Вирус оспы крупный, размером 300-350 нм,

кубоидальной формы. На ультрасрезах оспенных вирионов обнаружена
липопротеидная оболочка, под ней вироплазма, в которой содержится
нуклеокапсид. ДНК у вируса оспы - двунитчатая. Из нуклеокапсида вириона
выделены некоторые ферменты.

Культивирование. Вирус натуральной оспы хорошо развивается в куриных

эмбрионах на хорион-аллантоисной оболочке. Репродукция его характеризуется
образованием на оболочке белых, плотных точечных бляшек с блестящей
поверхностью, величиной около 1 мм.

Вирус можно также культивировать на первичных и перевиваемых клеточных

культурах человека и животных. Здесь рост характеризуется цитопатическим
действием (дегенерацией клеток через 48-72 ч).

Антигенная структура. У вируса оспы обнаружено несколько антигенов:

растворимые (L-термолабильный и S-термостабильный), нуклеопротеидный NP-
антиген. Вирусы оспы имеют общие антигены с вирусом оспенной вакцины и
эритроцитами человека группы А и АВ.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При температуре 100° С

вирусы погибают моментально. Температура 60° С губит их через час. Низкие
температуры и высушивание вирусы натуральной оспы переносят хорошо - в
оспенных корочках сохраняются длительно. Дезинфицирующие растворы (30%
хлорамин, лизол) инактивируют вирусы оспы через 30 мин. К фенолу и эфиру они
более устойчивы, а в 50% глицерине вирусы оспы сохраняются месяцами.

Восприимчивость животных. К вирусу оспы чувствителен мелкий и крупный

рогатый скот. В экспериментальных условиях легко заражаются обезьяны, морские
свинки, кролики и др. Однако воспроизвести заболевание, сходное по клинике с
болезнью человека, можно только у обезьян.

У новорожденных белых мышей вирус вызывает оспенный энцефалит.

Источники инфекции. Больные люди.

Пути передачи. Воздушно-капельный и воздушно-пылевой (вирус передается

при кашле, разговоре, через посуду, а также через пылевые частицы, находящиеся
на одежде).

Патогенез. Вирус оспы проникает через слизистую оболочку дыхательных путей

и через кожные покровы. Проникнув в организм, вирусы локализуются в
регионарных лимфатических узлах. Размножившись там, они попадают в кровь,
обусловливая вирусемию. Вторичная репродукция (размножение) происходит в
лимфоидной ткани и сопровождается клиническими проявлениями заболевания:
высокой температурой, головной болью, потерей сознания и т. д. Обладая
дермотропными свойствами, вирусы попадают в эпидермис. На коже и слизистых
оболочках образуются папулы, везикулы и пустулы. Оспенные папулы
характеризуются прозрачным содержимым и имеют вид жемчужин с
перламутровым блеском. На месте появления пустул образуется некроз, после
заживления которого остаются рубцы. Образование рубцов на слизистой глаз
приводит к слепоте (в 25% случаев). Процент смертности при оспе велик, при
геморрагической форме - 100%. При этой форме пустулы наполняются кровью -
черная оспа.

Встречаются легкие формы оспы, когда заболевание протекает без температуры

и сыпи.

Иммунитет. У переболевших людей иммунитет пожизненный. Обусловливается

он вируснейтрализующими, гемагглютинирующимися и комплементсвязывающими
антителами. Искусственная иммунизация с последующей ревакцинацией дает
стойкий иммунитет. Считают, что интерферон также является фактором защиты.

Профилактика. Ранняя диагностика, изоляция, дезинфекция, предупреждение

завоза оспы из других стран, карантин и т. д.

Специфическая профилактика. В борьбе с натуральной оспой большое

значение имеет специфическая профилактика. За много лет до нашей эры на
востоке существовали разные методы борьбы с оспой. В Индии, Иране - растертые
корочки из пустул больных легкой формой втирали в кожу здоровых, а в Китае
наносили на слизистые оболочки носа.

В 1796 г. английский врач Э. Дженнер после длительных наблюдений

использовал содержимое пустул коровьей оспы для вакцинации людей. Отсюда
название - вакцина (от лат. vacca - корова).

Вакциной, приготовленной таким методом, пользовались длительное время.

Затем был разработан метод получения ововакцины (вирус накапливали в курином
эмбрионе). Этот метод удобнее для изготовления и экономнее.

В настоящее время вакцину готовят из вируса, выращенного в культуре клеток.

В марте 1919 г. В. И. Лениным был подписан декрет об обязательном

оспопрививании. После проведения массовой иммунизации оспа в СССР была
ликвидирована.

В 1958 г. по инициативе СССР на XI Ассамблее ВОЗ было принято решение о

ликвидации оспы во всем мире путем массовой вакцинации. В результате за
последние годы не было зарегистрировано ни одного случая заболевания оспой в
мире и в 1981 г. по рекомендации ВОЗ обязательная прививка против оспы была
отменена.
 Вирусологическая диагностика

Цель исследования: выявление возбудителя оспы. Работа с вирусом оспы

проводится в строго режимных условиях (см. "Особо опасные инфекции").

Материал для исследования

1. Содержимое папул, везикул, пустул.

2. Отделяемое слизистой оболочки носоглотки.

3. Кровь (с 5-го дня болезни) берут для выявления специфических антител.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Метод иммунофлюоресценции (экспресс-диагностика) (см. главу 12).

2. Реакция РСК, РТГА и РНГА (см. главу 12).

3. Выделение вируса в куриных эмбрионах и культуре клеток Hela, Нер-2.

4. Обнаружение телец Гварниери в зараженных клетках.

5. Обнаружение телец Пашена в содержимом везикул (окраска по Морозову).

Контрольные вопросы
1. Какова величина и структура вириона оспы?

2. Каковы основные методы культивирования вируса оспы?

3. Патогенез натуральной оспы.

4. Иммунитет и специфическая профилактика? Кем и когда был подписан

первый декрет об обязательной прививке против оспы?

5. Каковы основные методы диагностики оспы?

 Неклассифицируемые вирусы
Глава 47. Возбудители гепатита
Инфекционный гепатит известен давно. Еще Гиппократ описал заразную форму
желтухи. Но только в 1883 г. русский врач С. П. Боткин после длительных
наблюдений и исследований пришел к выводу о том, что это заболевание
инфекционной природы. В честь Боткина инфекционный гепатит был назван его
именем "болезнь Боткина".

Предположение о вирусной этиологии гепатита было высказано в 1937 г. при

изучении вспышки желтухи после массовой иммунизации солдат.

В настоящее время известно, что вирусный гепатит объединяет два

самостоятельных заболевания: гепатит А - инфекционный, гепатит В -
сывороточный, Возбудители этих заболеваний относятся к разным
квалификационным группам.

Вирус гепатита А
Выявлен Фейстоном и другими в 1973 г. в фекалиях больного при помощи
электронной микроскопии.

Морфологическая структура. Это мелкий вирус (20-25 нм). Тип нуклеиновой

кислоты окончательно не установлен. Предполагают, что он содержит РНК. Форма
вируса кубоидальная. Он состоит из нуклеоида и внешней оболочки.

Вирус типа А называют HAV (hepatitis A virus).

Культивирование. Вирусы не репродуцируются в клеточных культурах, но их

удается культивировать в организме южноамериканских обезьян.

Антигенная структура. У вируса гепатита А не обнаружены серотипы. Он

взаимодействует только с антителами HAV.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вирусы типа А довольно

устойчивы. Полная их инактивация происходит только при кипячении в течение 30-
40 мин. Они хорошо переносят низкие температуры, высушивание, воздействие
кислот, эфира, не разрушаются под действием УФ-лучей. Обычные концентрации
дезинфицирующих растворов губят их через 40-60 мин.

Восприимчивость животных. К вирусу гепатита типа А чувствительны

обезьяны (шимпанзе).

Источники инфекции. Больные люди с клинически выраженной желтушной и

безжелтушной формой заболевания.

Пути передачи. HAV передается преимущественно пищевым путем. Мухи могут

быть механическими переносчиками. Вирус чаще передается в первые дни болезни.
 Патогенез. Основной путь проникновения вируса - через слизистую оболочку
желудочно-кишечного тракта. Попав в желудочно-кишечный тракт, HAV проникает
в эпителиальные клетки слизистой оболочки кишечника, а оттуда в кровь.
Возникает вирусемия. С кровью вирусы разносятся по всему организму и поражают
паренхиматозные органы. Наибольшим тропизмом HAV обладает к гепатоцитам
(клеткам печени), в цитоплазме которых вирус репродуцируется. При этом
нарушается белковый и углеводный обмен. В крови появляются желчные кислоты,
кал обесцвечивается, а моча темнеет. Нарушение углеводного обмена приводит к
увеличению в сыворотке крови ферментов: альдолазы и трансфераз. Вирусом
гепатита А чаще заражаются дети в возрасте от 1 года до 15 лет.

Иммунитет. Постинфекционный иммунитет стойкий. Антитела относятся к IgM

и IgG (см. главу 12).

Профилактика. Изоляция больных, обеззараживание испражнений, мокроты

больных, общесанитарные мероприятия.

Специфическая профилактика. Детям в возрасте от 3 до 15 лет,

контактировавшим с больным гепатитом, вводят иммуноглобулин, что снижает
заболеваемость, а в случае заболевания облегчает тяжесть течения.

Лечение. Симптоматическое.

Вирус гепатита В
Парентеральный сывороточный гепатит вызывается вирусом типа В. Он
называется HBV (hepatitis В virus).

В 1961 г. Блумберг с соавторами в сыворотке крови больных обнаружила

антиген, который был назван австралийским. А в 1970 г. Дейн также в сыворотке
крови больных гепатитом обнаружил более крупные частицы, которые назвали
частицами Дейна.

Морфологическая структура. Вирус HBV встречается в трех морфологических

формах.

1. Мелкие сферические частицы - 22 нм в диаметре.

2. Трубчатые частицы разной длины. Полагают, что эти две формы представляют
собой свободные белковые частицы - капсиды.

3. Вирусоподобные частицы - 40 нм (описаны Дейном и называются частицами

Дейна). Они имеют двунитчатую ДНК. У них обнаружены липиды, полипептиды,
углеводы и двойная оболочка. В настоящее время их считают полноценным
вирионом - собственно HBV.

Культивирование. Вирус гепатита типа В репродуцируется в культуре

гепатоцитов эмбриона человека, в диплоидных клетках печени человека, а также в
органах и тканях обезьян шимпанзе. Культивировать вирус сложно, что затрудняет
диагностику.
 Антигенная структура. У частиц Дейна обнаружен HBV-антиген. Это сложный
антиген, в состав которого входят: полипептиды, углеводы, липиды. Антитела,
образующиеся к нему, называются анти-HB S. В сердцевине частицы Дейна имеется
cor-антиген, - антитела к нему называются анти-НВс.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При температуре 60° С вирус

сохраняется 3-4 ч. Низкие температуры на него не действуют. В замороженных
препаратах крови он остается жизнеспособным до 20 лет. HBV устойчивы к эфиру.
5% раствор формалина инактивирует их через 12 ч, 3% раствор хлорамина - через 2
ч.

Источники инфекции. Кровь больных и носителей антигена.

Пути передачи. Гепатит типа В передается парентерально при инъекциях

вакцин, сывороток, лекарств, нестерильными зараженными вирусом гепатита
иглами, шприцами, скарификаторами.

Патогенез. Инкубационный период при гепатите типа В - 2-6 мес (при гепатите
А - 3-6 нед.) Проникнув гематогенно, лимфогенным путем, HBV попадает в печень,
в дальнейшем заболевание развивается так же, как при гепатите, вызванном HAV.
Дифференциальная диагностика гепатитов А и В по клиническим данным
затруднена.

Профилактика. Наибольшее значение для профилактики гепатита типа В имеет

правильная стерилизация инструментов и отбор доноров при использовании их
крови. Донорскую кровь проверяют на наличие HB S-антигена.

Профилактические мероприятия в отношении медицинского персонала,

работающего с материалом, инфицированным HBV, основаны на соблюдении
особой осторожности при работе с кровью (обработке рук, загрязненных кровью,
2% раствором перекиси водорода и т. д.).

Специфическая профилактика. Лицам, подвергшимся опасности заражения,

вводят иммуноглобулин.

В настоящее время разрабатывается вакцина, приготовленная из НВ S-антигена.

Лечение. Симптоматическое.

Вирусологическая диагностика

Для диагностики гепатитов А и В широко используются биохимические

показатели сыворотки крови больных, которые отражают функциональное
состояние печени. О нарушении пигментного обмена функции печени судят по
количеству свободного и связанного билирубина в сыворотке. Для выявления
нарушения белково-синтетической функции ставят тимоловую пробу. Все эти
исследования проводят в клинических лабораториях.

Вирусологические тесты диагностики HAV. Вирусологическая диагностика

проводится путем определения антигенов и антител в крови. Для этой цели
применяют наиболее чувствительные серологические методы: РПГ (реакция
преципитации в геле), встречный иммуноэлектрофорез и др. Разработаны
серологические методы для ранней и ретроспективной диагностики вирусного
гепатита: в острой форме диагноз сводится к выявлению вируса в фекалиях
больных методом иммуноэлектронной микроскопии с сывороткой
реконвалесцентов.

Ретроспективная диагностика гепатита А осуществляется методом исследования

парных сывороток крови больного в РСК и РПГ (см. главу 12).

Вирусологические тесты диагностики HBV. 1. В острой стадии диагностика

осуществляется путем выявления HBS-антигена в сыворотке крови больного.

2. Выявление анти-НВS в РСК. Анти-HBS появляются только через 2-4 нед после
начала заболевания и длительно циркулируют в крови.

3. Ретроспективная диагностика гепатита В осуществляется путем определения

анти-HBS в парных сыворотках крови больного в реакции преципитации в геле (см.
главу 12).

Контрольные вопросы
1. Какие заболевания вызывают вирусы гепатита и каковы пути передачи?

2. Какова устойчивость вирусов гепатита?

3. Какие иммуноглобулины обусловливают иммунитет после инфекционного

гепатита А?

4. Что такое частицы Дейна?

5. Какие показатели используют для лабораторной диагностики гепатита А и В?

6. Какие исследования проводятся для ретроспективной

диагностики при гепатитах А и В? Онкогенные вирусы

Мысль о том, что опухоли имеют инфекционное происхождение и вызываются

вирусами, была высказана давно.

В начале XX века ряд ученых (В. Эллерман, О. Банг, П. Раус) экспериментально

доказали, что некоторые вирусы способны вызывать опухолевые заболевания
(лейкозы и саркомы кур и др.). За последние десятилетия экспериментально
доказана вирусная этиология ряда опухолей: рака молочной железы у мышей,
фибромы кроликов, папилломы кожи человека и др.

Сейчас уже известно более 150 онкогенных вирусов. Некоторые из них хорошо
изучены.

Основным отличием онкогенных вирусов от других вирусов является то, что они
не оказывают цитопатического действия на клетки, а изменяют (трансформируют)
их в сторону беспрепятственного размножения, приводя к образованию опухоли.
 Онкогенные вирусы, как и все другие вирусы, подразделяются на ДНК- и РНК-
содержащие. К ДНК-содержащим онковирусам относят: паповавирусы,
аденовирусы, герпес вирусы и др. РНК-содержащие вирусы имеют несколько
типов: А, В, С, D (все эти типы близки по своим физико-химическим свойствам). К
РНК-содержащим вирусам относят возбудителей саркомы Рауса, лейкоза птиц и др.

Существуют разные теории, объясняющие механизм действия ДНК-содержащих

онкогенных вирусов. Широкое признание получила вирусогенетическая теория Л.
А. Зильбера (1961). Сущность этой теории заключается в том, что вирусная ДНК
встраивается в геном клетки хозяина и может сохраняться там в латентном
состоянии, как это было экспериментально показано в опытах с умеренными
фагами (см. главу 8). В определенных условиях, например при воздействии ряда
физических и химических факторов, вирусный геном изменяется, расстраивает
клеточную регуляцию, что приводит клетку к неконтролируемому делению и
образованию опухоли. Однако в зрелой опухоли обнаружить вирус не удается.
Считают, что вирус в данном случае играет роль пускового механизма.

Способность трансформировать клетку у различных вирусов варьирует.

Например, некоторые вирусы трансформируют только одну из 1000 клеток, другие
- одну из 100000 клеток. А вирус саркомы Рауса трансформирует каждую из
зараженных им клеток.

Несмотря на то что некоторые онкогенные вирусы выделены, изучены и даже

опухоли, вызываемые ими, экспериментально воспроизведены на животных,
достоверных доказательств вирусной природы всех опухолей пока нет.

Часть III. Санитарная микробиология

Одним из основных принципов советского здравоохранения является
профилактика, так как лучше не допустить возникновения заболевания, чем лечить
уже развившиеся.

Поэтому в Советском Союзе организована широкая сеть санитарно-

профилактических учреждений, институтов, занимающихся вопросами санитарии и
гигиены, и около пяти тысяч санитарно-эпидемиологических станций.

Санитарная микробиология занимается изучением микроорганизмов и

процессов, ими вызываемых в окружающей среде (воде, почве, воздухе, пищевых
продуктах и т. д.).

Основной задачей санитарной микробиологии является предупреждение

возникновения инфекционных заболеваний, что достигается изучением экологии
микроорганизмов, разработкой практических мероприятий по борьбе с
инфекционными болезнями.

Непосредственное выявление патогенных микроорганизмов во внешней среде

представляет значительные трудности, так как они встречаются в ней непостоянно
и в малых количествах. Поэтому пользуются косвенными показателями
зараженности окружающей среды - выявлением санитарно-показательных
микроорганизмов.
 Санитарно-показательными микроорганизмами являются постоянные обитатели
поверхностей и полостей тела человека и животных, выделяющиеся из организма
теми же путями, что и патогенные микроорганизмы. Поэтому, чем больше
выявлено санитарно-показательных микроорганизмов, тем большая вероятность
попадания в объекты внешней среды патогенных микроорганизмов.

Для каждого объекта внешней среды имеются определенные санитарно-

показательные микроорганизмы - критерии оценки по бактериологическим
показателям. Например, в отношении кишечных инфекций роль таких индикаторов
принадлежит кишечным палочкам - постоянным обитателям кишечника человека и
животных.

Для проведения санитарно-микробиологических исследований существуют

специальные государственные общесоюзные стандарты - ГОСТы или методические
указания, которые позволяют дать оценку соответствия выявленной в окружающей
среде микрофлоры гигиеническим требованиям.

ГОСТы или методические указания предусматривают:

1. Правила отбора проб.

2. Количество взятого материала.

3. Условия транспортировки.

4. Методы исследования.

5. Цель исследования.

6. Критерии оценки полученных результатов.

К каждой отобранной пробе прилагают сопроводительный документ с

указанием:

1. Название пробы (вода, почва, пищевые продукты и т. д.).

2. Место взятия пробы и номер.

3. Дата (год, месяц, число, час).

4. Цель исследования.

5. Куда направляется проба для исследования.

6. Подпись лица, взявшего пробу.

Примечание. В некоторых случаях, например при исследовании водных

источников, почвы, отмечают метеорологические условия в момент взятия пробы.

Транспортировка отобранных проб всегда производится при температуре не

выше 6-8° С, чтобы не было размножения и гибели микроорганизмов. Такую
температуру поддерживают с помощью резиновых мешков, зимой наполненных
теплой водой, летом - льдом. Для перевозки и хранения взятых проб лучше
пользоваться сумками-холодильниками или контейнерами со льдом.

В лаборатории полученные пробы регистрируют в журналах.

Бактериологическое исследование должно проводиться не позднее 3-6 ч от момента
взятия материала.

Санитарно-бактериологическое исследование воды

- Ф. К. Черкес
Исследованию подлежит вода:

1) централизованного водоснабжения;

2) из колодцев различного типа;

3) открытых водоемов (рек, озер, морей);

4) плавательных бассейнов;

5) сточных вод.

Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором

(гипосульфитом).

Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных

бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать
на глубине 10-15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию
атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега
может быть загрязнена микрофлорой почвы).

Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы

вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые
бумажными колпачками.

Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду

спускают в течение 10-15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы
закрывают стерильными пробками.

Примечание. Исследуют 333 мл воды (табл. 54).

 Таблица 54. Эмпирическая таблица ГОСТ 16963-73

В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в

зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.

Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального

водоснабжения (ГОСТ 18963-73) и предусматривают:

1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды

должно быть не более 100).

2. Определение коли-индекса и коли-титра (коли-индекс 3, коли-титр 333 и

выше; для Москвы и Ленинграда коли-индекс не более 2, а коли-титр более 500).

3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору

(патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).

Определение общего числа бактерий

Согласно ГОСТу 18963-73 общее число бактерий - это то количество
микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в
течение суток при температуре 37° С образовывать колонии, видимые
невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).
 Первый день исследования

При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят

1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз (т. е. 0,1 мл
исходной пробы).

При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в

100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл .воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т.
д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные
разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем
(12-15 мл) растопленного и остуженного до 45° С питательного агара. Для
равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки
перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в
термостат и инкубируют при температуре 37° С 24 ч.

Второй день исследования

Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших

колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30-
300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при
помощи лупы.

Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора

для счета микробных колоний (рис. 54).

Рис. 54. Прибор для счета колоний микроорганизмов. 1 - столик для чашки Петри; 2 -
игла с пружинным устройством; 3 - показатель счетчика; 4 - тумблер для включения
импульсного счетчика; 5 - тумблер для включения лампы освещения счетчика

Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число

микробов в 1 мл исследуемой воды.
 Определение БГКП
Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем
фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:

Коли-индекс - количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.

Коли-титр - наименьшее количество воды, в котором обнаруживают

присутствие кишечной палочки*.
*
(Коли-титр и коли-индекс - это один показатель, различно выраженный.)

Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами:

титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.

Титрационный метод

Для исследования воды используют среду накопления глюкозопептонную (ГПС)

среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится
концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации - для посева 1 мл воды.

Первый день исследования

Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с

концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной
концентрации) - всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Второй день исследования

Вынимают посевы из термостата и просматривают их.

При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев

петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате
при 37° С.

Третий день исследования

Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При

наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность.
Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.

Проба на оксидазу. 1-й способ: со среды Эндо снимают петлей 2-3 колонии
каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной
диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется
посинением штрихов, сделанных из колоний.

2-й способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо

(красная колония - синеет) (рис. 55).
 Рис. 55. Определение коли-индекса воды титрационным методом

Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В

этом случае вычисляют коли-индекс и коли-титр с помощью стандартных
(эмпирических) таблиц ГОСТа 16963-73 (см. табл. 54).

Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посева,

из которых выделена кишечная палочка.

Метод мембранных фильтров

 Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью
700-800 мл.

Первый день исследования

В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора

Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают
вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По
окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают
фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с
осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать
3-4 мембранных фильтра).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37° С 18-24 ч.

Второй день исследования

Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие

подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.

Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или

без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму (рис. 56).
 Рис. 56. Определение коли-индекса воды методом мембранных фильтров

При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу.

Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При
отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с
глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками - для
выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа
вычисляют коли-индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо,
выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.

Расчет. 300 мл - 3 колонии

1000 мл - х
х = 10; коли-индекс 10

Примечание. Титрационный метод более точный и может быть использован при

наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает
возможность дать ответ на 2-й день.
 Выявление свежего фекального загрязнения
Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек
производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной
кислотой. Инкубируют при 43° С 24 ч. Наличие кислоты и газа свидетельствует о
свежем фекальном загрязнении.

По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы,

энтеровирусы.

Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального

загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении
бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя
санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки,
обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.

Контрольные вопросы

1. Какова основная задача санитарной микробиологии?

2. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

3. Что такое коли-индекс и коли-титр?

4. Какие Вы знаете методы определения БГКП?

Задание

Определите общее число микробов в исследуемой пробе воды. Среда ГПС

(Эйкмана).

Питательные среды

ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г

хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г
глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью
250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со
средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации
доводят стерильной водой).

Примечание. При исследовании особенно загрязненных вод делают большие

разведения (например, 10-6, 10-7 и т. д.).

Санитарно-бактериологическое исследование
почвы - Н. А. Бельская
Почва является основным местом обитания многих микроорганизмов (см. главу
6). Из почвы микробы поступают в воду и обсеменяют воздух.
 Микробиологическое исследование почвы имеет важное значение. Оно
проводится при выборе участка для строительства детских учреждений,
спортивных площадок, больниц, госпиталей, военных лагерей, водопроводных
сооружений и других объектов.

Санитарно-микробиологический анализ почвы включает определение:

1) общего количества бактерий в 1 г почвы;

2) титра санитарно-показательных микроорганизмов БГКП и С. perfringens;

3) термофильных бактерий в 1 г почвы;

4) по эпидемиологическим показаниям проводится исследование на наличие

патогенных микроорганизмов (сальмонелл, шигелл, клостридий столбняка,
ботулизма, некоторых вирусов и др.).

Отбор проб почвы. Выбор места для отбора проб почвы определяется
санитарным врачом и бактериологом в зависимости от цели и задачи исследования.
На обследуемой территории до 1000 м2 выделяют два участка площадью 25 м 2.
Один должен быть расположен близ источников загрязнения (свалки, мусорные
ящики, выгребные ямы и т. д.), другой - в отдалении от них (контроль). На каждом
участке в 25 м2 намечают для отбора проб пять точек: четыре по углам и одна в
центре или пять точек по диагонали участка.

Для исследования поверхностного слоя почвы пробы отбирают стерильной

лопаткой или совком на глубине до 20 см. Из отдельных точек участка лопаткой
выкапывают цельный кусок почвы. Стерильным ножом снимают верхний слой
толщиной 1,5-2,0 см и из середины куска набирают стерильной ложкой 200-300 г
почвы. Смешанный образец, составленный из пяти отдельно взятых проб почвы,
должен весить не менее 1 кг.

При исследовании образцов из глубинных слоев почвы (от 0,75 до 2 м)

пользуются специальным буром с полостью. На заданной глубине полость бура
открывается, наполняется почвой, затем механически закрывается, и бур извлекают
на поверхность.

Пробы почвы, взятые для анализа, переносят в стерильные банки с ватно-

марлевыми пробками и покрывают стерильной пергаментной бумагой. К каждой
банке приклеивают этикетку с указанием даты и номера пробы. В
сопроводительном документе отмечают характер почвы, расположение источников
загрязнения, площадь обследуемой территории, данные, характеризующие климат
местности и т. п.

Все пробы помещают в деревянный ящик с гнездами и немедленно

транспортируют в лабораторию. Если нет возможности приступить к исследованию
почвы в тот же день, то допускается хранение проб в холодильнике при 1-2° С в
течение суток.

Подготовка проб почвы к исследованию. Образцы почвы, отобранные на

одном участке из нескольких точек, хорошо перемешивают, освобождают от
крупных включений (щебня, камней, корней, стекол). От среднего образца
отделяют 200-300 г и вносят в стерильную посуду. Затем почву дробят в стерильной
ступке, просеивают через стерильное сито на стерильную бумагу и берут для
исследования навеску в 30 г. Навеску почвы высыпают в стерильную колбу
вместимостью 500 мл и доливают 270 мл стерильной водопроводной воды,
получают разведение почвы 1:10. Взбалтывают почвенную взвесь 10-15 мин и из
приготовленного разведения 1:10 без отстаивания готовят ряд последовательных
десятикратных разведений по общепринятой методике. При анализе чистых почв
ограничиваются 3-4 разведениями (до 1:1000, 1:10000), при исследовании
загрязненных почв используют разведения - до 1:100000, 1:1000000.

Определение общего количества бактерий в почве проводят аналогично

исследованию воды. Показатели общего количества бактерий для различных видов
почв представлены в табл. 55.

Определение БГКП

Определение БГКП как показателя фекального загрязнения проводят двумя

методами: титрационным и методом мембранных фильтров.

Титрационный метод
Первый день исследования

Из первоначального разведения почвенной взвеси 1:10 стерильной пипеткой

берут 10 мл, что соответствует 1 г почвы, и засевают во флаконы с 50 мл среды
Кесслер. Затем из каждого разведения почвы засевают по 1 мл в пробирки с
поплавками, содержащими 9 мл той же среды. Посевы выращивают в термостате 24
ч при 37° С.

Второй день исследования

Просматривают посевы (при задержке роста посевы оставляют на третьи сутки).

Отсутствие газообразования и помутнения в бродильных сосудах со средой Кесслер
через 48 ч позволяет дать отрицательный ответ.

При наличии в средах газообразования и помутнения или только помутнения из

этих сосудов производят высев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри.
Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Третий день исследования

Просматривают посевы. Отсутствие роста на среде Эндо дает право на

отрицательный ответ.

Если на среде Эндо вырастают типичные для кишечной палочки колонии, то из

них делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При выявлении в
мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба на
оксидазу отрицательная, то проверяют ферментативные свойства выделенной
культуры путем посева на полужидкую среду с глюкозой. Посевы помещают в
термостат на 24 ч при 37° С.
 Четвертый день исследования

Просматривают посевы. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие

кишечной палочки в исследуемом разведении почвы.

Коли-титр почвы определяют по наименьшему объему, в котором обнаруживают

БГКП (показатели коли-титра для различных видов почв представлены в табл. 55).

Таблица 55. Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим

показателям

Метод мембранных фильтров

Метод мембранных фильтров применяют при исследовании малозагрязненных

почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 пропускают по 10 мл почвенной
взвеси из разведений 1:10, 1:100, 1:1000. Дальнейший ход исследования аналогичен
определению кишечных палочек в воде. Метод мембранных фильтров позволяет
сократить срок исследования до двух суток. Результаты анализа выражают коли-
индексом. Коли-индекс почвы - это количество кишечных палочек в 1 г почвы.

Примечание. Среда Кесслер содержит лактозу, которую сбраживают БГКП, и

генциановый фиолетовый, задерживающий рост грамположительной микрофлоры.

Определение титра C. perfrinrens

Из всех приготовленных почвенных разведений (от 1:10 до 1:1000000) по 1 мл

вносят в два параллельных ряда стерильных пробирок. Один ряд пробирок
прогревают при 80° С 15 мин для освобождения от неспороносной микрофлоры.
Затем во все пробирки наливают по 9 мл расплавленной и остуженной до 45° С
среды Вильсона - Блера, приготовленной ex tempore. Пробирки вращают между
ладонями, чтобы посевной материал равномерно распределился в питательной
среде, и быстро опускают их в холодную воду для удаления кислорода и
охлаждения среды. Посевы выращивают при 43° С 24 ч.

C. perfringens дает рост в глубине среды в виде черных колоний. Газообразование

регистрируется по разрыву питательной среды. В мазках, приготовленных из
колоний, обнаруживают грамположительные крупные палочки со спорами
овальной формы, расположенные центрально или субтерминально.

Предельное разведение почвенной взвеси, которое дает на среде Вильсона -

Блера рост C. perfringens, означает титр этого микроба в почве (см. табл. 55).
Наличие в почве C. perfringens является косвенным показателем присутствия в ней
и других клостридий - возбудителя столбняка (C. tetani), возбудителя ботулизма (C.
botulinum).

В почве определяют также количество термофильных бактерий в 1 г. Почва, в

которой много кишечных палочек и мало термофилов, может рассматриваться как
загрязненная фекалиями.

Питательные среды

Среда Кесслер. К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 50 мл

бычьей желчи. Смесь кипятят 20-30 мин, фильтруют через вату, прибавляют 10 г
лактозы и доводят объем до 1 л. Устанавливают рН 7,4-7,6. Добавляют 4 мл 1%
водного раствора генцианового фиолетового. Среду разливают в колбы и пробирки
с поплавками. Стерилизуют 15 мин при давлении 0,5 атм (112° С). Среда имеет
фиолетовый цвет.

Контрольные вопросы
1. В каких случаях проводят санитарно-бактериологическое исследование
почвы?

2. Какие определения включают санитарно-бактериологический анализ почвы?

3. Как проводят отбор проб почвы?

4. Какими методами определяют наличие БГКП в почве?

Задания
1. Приготовьте из почвенной взвеси в разведении 1:10 ряд последовательных
разведений 1:100, 1:1000,1:10000 и проведите определение микробного числа в
данной пробе почвы.

2. Возьмите у преподавателя готовые посевы разведений почвы на среде

Вильсона - Блера, определите титр C. perfringens. Сделайте мазки из колоний,
окрасьте по Граму. Найдите под микроскопом в мазках C. perfringens и покажите
преподавателю. Результаты микроскопии зарисуйте в тетрадь.

Санитарно-бактериологическое исследование
воздуха - Ф. К. Черкес
Среди факторов окружающей среды, влияющих на жизнь человека, воздух
занимает ведущее место. Наука, изучающая микрофлору воздуха, называется
аэромикробиологией.

Воздух не является благоприятной средой для развития микроорганизмов, так

как не содержит питательных веществ и находится в постоянном движении.
Поэтому большинство микроорганизмов быстро исчезают из воздуха. Однако
некоторые из них более устойчивые, например туберкулезная палочка, споры
клостридий, грибов и другие, могут длительно сохраняться в воздухе.
 В воздухе городов микроорганизмов больше, чем в воздухе лесов и полей.

Количество микроорганизмов в воздухе с высотой уменьшается. Например, на

высоте 500 м над Москвой в 1 м3 воздуха обнаруживают 2-3 бактерии, а на высоте
1000 м - вдвое меньше.

Количество микроорганизмов в помещениях обычно больше, чем в воздухе

открытых мест.

ГОСТ не нормирует методы проведения исследования воздуха. Раньше большое

внимание уделялось определению гемолитических стрептококков как показателей
загрязнения воздуха закрытых помещений микрофлорой, находящейся в носоглотке
человека. В настоящее время больше внимания уделяют непосредственному
обнаружению в воздухе патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха проводят в плановом

порядке: в больницах, операционных, детских учреждениях и др.

При санитарно-бактериологическом исследовании определяют:

1. Общее количество бактерий в 1 м3 воздуха.

2. Наличие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в 1 м 3 воздуха.

Выявление микроорганизмов в воздухе проводится при помощи специальных

приборов и специальных сред (диагностических и дифференциально-
диагностических).

Методы отбора проб воздуха

Существуют два основных способа отбора проб воздуха для исследования: 1)
седиментационный - основан на механическом оседании микроорганизмов; 2)
аспирационный - основан на активном просасывании воздуха (этот метод дает
возможность определить не только качественное, но и количественное содержание
бактерий).

Седиментационный метод

Чашки Петри с питательной средой (МПА) устанавливают в открытом виде

горизонтально, на разном уровне от пола. Метод основан на механическом
оседании бактерий на поверхность агара в чашках Петри. Чашки со средой
экспонируют от 10 до 20 мин, в зависимости от предполагаемого загрязнения
воздуха. Для выявления патогенной флоры используют элективные среды.
Экспозиция в этих случаях удлиняется до 2-3 ч. После экспозиции чашки
закрывают, доставляют в лабораторию и ставят в термостат на 24 ч при
температуре 37° С. На следующий день изучают выросшие колонии. Метод этот
используют в основном в закрытых помещениях.

(Аспирационный метод)
 Бактериоуловитель Речменского. Перед работой прибор заполняют стерильной
содой. Действие прибора основано на протягивании через него воздуха с помощью
аспиратора. При этом происходит распыление находящейся в приборе жидкости.
После окончания просасывания жидкость, через которую был пропущен воздух,
засевают по 0,1-0,2 мл на МПА в чашках Петри. При необходимости использовать
элективные среды посевную дозу увеличивают (0,3-0,5 мл). Полученная в
приемнике жидкость может быть использована для заражения животных (например,
при исследованиях, проводимых для выявления вирусов, риккетсий и т. д.).

Прибор Дьяконова также основан на улавливании бактерий в жидкости, через

которую пропущен воздух.

Прибор ПАБ-1 предназначен для бактериологического исследования больших

объемов воздуха в течение короткого промежутка времени. Получение проб
воздуха производят со скоростью 125-150 л/мин. Принцип работы прибора основан
на улавливании микроорганизмов на электрод противоположного заряда. Большая
скорость отбора проб воздуха в этом приборе и возможность посева его на
различные питательные среды имеет значение для обнаружения патогенных и
условно-патогенных бактерий (например, синегнойной палочки в хирургических
отделениях и др.).

Аппарат Кротова. Действие основано на принципе удара струи воздуха на среду

в чашках Петри. Аппарат состоит из трех частей: узла для отбора проб воздуха,
ротаметра, электрической части питающего механизма.

Исследуемый воздух при помощи центробежного вентилятора, вращающегося со

скоростью 4000-5000 об/мин, засасывается в щель прибора и ударяется о
поверхность открытой чашки Петри со средой. Содержащиеся в воздухе
микроорганизмы оседают на питательный агар. Для равномерного распределения
микроорганизмов по всей поверхности столик с находящейся на нем чашкой
вращается. Из прибора воздух выводится через воздухопроводную трубку, которая
соединена с ротаметром, показывающим скорость протягивания воздуха через
прибор.

Недостатком прибора Кротова является то, что он нуждается в электроэнергии,

поэтому не во всех условиях может быть использован.

Первый день исследования

Отобранные пробы помещают в термостат при 37° С на 18-24 ч.

Второй день исследования

Чашку вынимают из термостата и производят подсчет колоний. Бактериальное

загрязнение воздуха выражается общим числом микробов в 1 м 3 его.

Расчет. Например, за 10 мин пропущено 125 л воздуха, на поверхности выросло 100

колоний.

100×1000
Число микробов в 1 м воздуха = = 800
125
 Для определения золотистого стафилококка забор производят на желточно-
солевой агар. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37° С в течение 24 ч
и 24 ч выдерживают при комнатной температуре для выявления пигмента. Колонии,
подозрительные на S. aureus, подлежат дальнейшей идентификации (см. главу 14).

В детских учреждениях воздух проверяют на наличие сальмонелл. Для этого

воздух засевают в чашку со средой висмут-сульфитный агар.

Выявление патогенных бактерий и вирусов в воздухе закрытых помещений

проводят по эпидемиологическим показаниям. Для выявления возбудителей
туберкулеза пользуются прибором ПОВ, в качестве улавливающей используется
среда Школьниковой.

Контрольные вопросы
1. Является ли воздух благоприятной средой для развития микроорганизмов?

2. В каких учреждениях проводят плановое исследование микрофлоры воздуха?

3. Расскажите устройство аппарата Кротова.

Задача
За 10 мин было пропущено 250 л воздуха. Выросло 150 колоний. Рассчитайте
количество колоний в 1 м воздуха.

Задание
Возьмите 4 чашки Петри со средой МПА, откройте их и установите на разном
уровне от пола. Через 20 мин закройте чашки и поставьте в термостат. На
следующий день подсчитайте количество выросших колоний, определите степень
загрязнения воздуха.

Санитарно-бактериологическое исследование
молока и молочных продуктов Ф. К. Черкес, Н. А.
Бельская
Молоко и молочные продукты являются благоприятной средой для размножения
микроорганизмов.

При изготовлении некоторых молочных продуктов: творога, кефира,

простокваши, ряженки и других используют специальную микрофлору, например
молочнокислые стрептококки, молочно-кислые ацидофильные палочки и др.
Микрофлора, используемая для приготовления этих продуктов, является для них
специфичной и не учитывается.

Неспецифической микрофлорой, встречающейся в молоке и молочных

продуктах, являются аэробные бактерии: БГКП, стафилококки и др.
 С молоком могут передаваться возбудители туберкулеза, бруцеллеза,
сальмонеллеза, сибирской язвы, вирус полиомиелита, анаэробные бациллы и т. д.

Обсеменение молока и молочных изделий неспецифической микрофлорой может

произойти в момент удоя, транспортировки, хранения и т. д.

Исследование молока и молочных продуктов проводят согласно ГОСТу 9225-68.

Отбор проб. Пробы жидких и полужидких продуктов после тщательного их

перемешивания отбирают в количестве 50-100 мл в стерильные колбы. Пробы
сливочного масла, сыра, творога отбирают с помощью стерильного щупа из
глубины продукта. Перед взятием пробы масла, творога верхний слой продукта
тщательно зачищают, а поверхность сыра в месте отбора пробы прижигают
раскаленным ножом. Из расфасованных продуктов берут по 2 образца в
оригинальной упаковке. Взятые образцы сопровождают документом, в котором
указывают:

1. Номер образца.

2. Наименование и сорт продукта.

3. Дату изготовления.

4. Дату и час отбора пробы.

5. Объем необходимых исследований.

6. Должность и подпись лица, отобравшего пробу.

Микробиологическое исследование продукта должно производиться не позднее

чем через 4 ч с момента отбора пробы. При транспортировке температура не
должна превышать 6° С.

ГОСТ для молока и молочных изделий предусматривает определение общего

числа бактерий в 1 г (мл) и определение титра цитратотрицательных
(цитратнегативных) разновидностей БГКП (коли-титр).

Определение общего числа бактерий

Подготовка образцов для исследования. Из молока и других молочных
продуктов готовят десятикратные разведения (по общепринятой методике).
Количество разведений для каждого вида продукта готовят с учетом наиболее
вероятного микробного обсеменения (табл. 56).
 Таблица 56. Разведение молока и молочных продуктов

Примечание. Для определения общего количества бактерий следует выбирать те

разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 50 и не более 300
колоний.

Посев. По 1 мл каждого разведения вносят в 2-3 стерильные чашки Петри и

заливают 12-15 мл растопленного и остуженного до 45° С питательного агара.
Предварительно чашки маркируют. Сразу после заливки содержимое чашки
перемешивают (путем легкого вращательного покачивания) для равномерного
распределения посеянного материала. Посевы ставят в термостат при 37° С на 48 ч.

По истечении срока инкубации чашки вынимают и подсчитывают число колоний

при помощи счетчика. Число колоний, выросших на каждой чашке, умножают на
соответствующее разведение. Полученные результаты по отдельным чашкам
складывают, делят на количество чашек и получают среднее арифметическое,
которое является показателем общего числа бактерий в 1 г (мл).

Соответствующие ГОСТы регламентируют качество продуктов, что

устанавливают по допустимым показателям: общему числу микробов и коли-титру.
Пример для двух видов продуктов представлен в табл. 57.

Таблица 57. Показатели общего числа бактерий и коли-титра в молоке

Примечание. Для других молочных продуктов также имеется ГОСТ

обусловливающий допустимое количество микробов в 1 мл (г) продукта. Буквы А и
Б обозначают категорию продукта.

В кисломолочных продуктах (кефир, простокваша, творог, сметана и др.),

содержащих обильную специфическую микрофлору, общее количество бактерий не
определяют, а контролируют состав микрофлоры. Для этого из кисломолочных
продуктов готовят препараты и красят метиленовым синим. В поле зрения
препарата должны находиться только специфические для данного продукта
микроорганизмы. Например, для простокваши - молочно-кислые стрептококки и
палочки; для кефира - молочно-кислые стрептококки и палочки, единичные
дрожжи. Микроскопия позволяет выявить микроорганизмы порчи (плесени и
большое количество дрожжей).

Определение БГКП
Обсемененность молока и молочных продуктов бактериями группы кишечной
палочки определяют бродильным методом. Бродильный титр - это то наименьшее
количество продуктов, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором
присутствует кишечная палочка. Согласно ГОСТу 9225-68 учитываются только
цитратнегативные разновидности кишечной палочки (рис. 57).
 Рис. 57. Определение коли-титра молока

Бродильный метод
Первый день исследования

Посев молока и молочно-кислых продуктов производят в 6 пробирок с 5 мл

среды Кесслер. В 3 пробирки засевают по 1 мл цельного продукта, в другие 3
пробирки по 1 мл из разведения 1:10 (0,1 мл). Посевы инкубируют в термостате при
43° С 18-24 ч.

Второй день исследования

 Из каждой забродившей пробирки производят посев на сектор среды Эндо и
инкубируют при 37° С 18-24 ч.

Третий день исследования

При отсутствии типичных для БГКП колоний продукт считают незагрязненным

кишечной палочкой.

При наличии типичных для БГКП колоний делают мазки, окрашивают по Граму
и микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных палочек ставят пробу на
оксидазу и производят посев на среду с глюкозой и среду Козера.

Четвертый день исследования

Производят учет результатов. Наличие кислоты и газа на среде с глюкозой и

отсутствие роста на среде Козера свидетельствует о наличии цитратнегативных
разновидностей кишечной палочки. Коли-титр вычисляют по табл. 58.

Таблица 58. Вычисление коли-титра в пастеризованном молоке, сливках, кефире,

простокваше, ацидофильном молоке

Примечание. Вычисление коли-титра для масла, сыра, творожных изделий,

мороженого и молочных консервов проводят по другим таблицам, указанным в
ГОСТе.

Присутствие патогенных микроорганизмов в молоке и молочных продуктах

недопустимо.

Контрольные вопросы

1. Как определяют в молоке и молочных продуктах общее число микробов?

2. Как определяют коли-титр?

3. Какие микроорганизмы могут встречаться в молоке и молочных продуктах?

Питательные среды

Среда Кесслер. См. с. 484.

Среда Козера. К 1 л дистиллированной воды добавляют 1,0 г фосфата

однозамещенного калия, 0,2 г сульфата магния, 2,5-3,0 г цитрата натрия. Раствор
стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 15 мин, добавляют 10 мл 0,5%
спиртового раствора бромтимолового синего и разливают в стерильные пробирки.

Среда глюкозой. См. главу 7.

Желточно-солевая среда. См. главу 14.

Санитарно-бактериологическое исследование
крема и изделий из крема - Ф. К. Черкес
Санитарно-бактериологическое исследование крема проводят соответственно
методическим указаниям № 1351-75, утвержденным Министерством
здравоохранения СССР, которые предусматривают:

1. Определение титра кишечной палочки.

2. Определение плазмокоагулирующих стафилококков в 1 г изделий.

Отбор проб. Пробы крема берут с поверхности и из прослойки. Пробу снимают

стерильной ложкой в количестве 50 г и помещают в стерильную стеклянную
посуду.

Определение титра кишечной палочки

Первый день исследования

Собранный материал ставят в термостат или водяную баню при температуре не

выше 43-45° С. Для исследования используют нижнюю часть растопленного крема.

Из исследуемого материала делают 3 десятикратных разведения: 1:10, 1:100,

1:1000.

10 мл разведения 1:10 засевают в колбу с 50 мл среды Кесслер. Остальные

разведения (1:100 и 1:1000) засевают по 1 мл в 5 мл среды Кесслер в пробирках.
Посевы ставят в термостат при температуре 43° С на 24 ч.

Второй день исследования

Из всех посевов со средой Кесслер производят высев на сектора чашки Петри со

средой Эндо и ставят в термостат при температуре 37° С на 24 ч.

Третий день исследования

При отсутствии подозрительных колоний дают отрицательный ответ.

Из колоний, подозрительных в отношении кишечной палочки, делают мазки,

окрашивают по Граму. При наличии грамотрицательных палочек вычисляют коли-
титр. Титр БГКП должен быть не ниже 0,3 г.

Выявление коагулазоположительных стафилококков

Первый день исследования
 0,1 г растопленного крема засевают на молочно-солевой агар и ставят в
термостат при температуре 37° С на 24 ч. Параллельно по 0,5 мл засевают в 2
пробирки с 5 мл 6,5-10% солевого бульона (среда накопления) с последующим
пересевом на желточно-солевой агар.

Второй день исследования

Просматривают посевы. При наличии роста чашки с посевами оставляют при

комнатной температуре на 24 ч для выявления пигмента. Со среды накопления
производят посев на желточно-солевой агар. Инкубируют при 37° С 18-24 ч.

Третий день исследования

Изучают выросшие на чашках колонии. Подозрительные в отношении

стафилококков колонии изучают: определяют фермент коагулазу (см. главу 14).

Коагулазоположительных стафилококков не должно быть более 500 в 1 г/мл.

Контрольные вопросы
1. Что определяют в креме и кремовых изделиях?

2. Как определяют титр плазмокоагулирующего стафилококка?

Санитарно-бактериологическое исследование
колбасных и мясных продуктов промышленного
производства - Ф. К. Черкес
Мясо и мясные продукты могут быть обсеменены различными
микроорганизмами. Пути инфицирования мяса:

1) обсеменение мяса бывает первичным (прижизненно) в результате ослабления

организма животного (голод, травма), т. е. при состоянии, когда нарушаются
барьерные функции кишечника, и микробы из него попадают в органы и кровь;

2) микробы могут обсеменять мясо, распространяясь по организму, при

заболеваниях животных, например сальмонеллезом;

3) микроорганизмы могут попасть в мясо при забое животных и разделке туш

(наиболее частый случай).

Мясные продукты инфицируются при недостаточно строгом соблюдении

технологического режима изготовления, нарушения режима хранения и пр.

Колбасные изделия и продукты из мяса промышленного производства исследуют

в соответствии с ГОСТом 9958-74, который регламентирует определение:

1) общего числа бактерий в 1 г продукта;

 2) присутствия бактерий группы кишечной палочки в 1 г;

3) сальмонелл в 5 г продукта, а также протеев и клостридий.

Отбор проб. От каждой партии колбасных изделий отбирают не менее двух проб
из разных мест. Из них составляют общую пробу, которую исследуют. Из сосисок,
сарделек составляют общую пробу из нескольких экземпляров. Из таких продуктов
как холодец, паштет и других продуктов без оболочки пробы берут из 2-3 мест в
количестве 200-250 г каждая.

Общие пробы каждого продукта упаковывают отдельно в стерильный пергамент.

Все взятые пробы пломбируют, этикетируют. В этикетке пишут:

1. Название продукта.

2. Время взятия (дата, час).

3. Место взятия.

4. Цель исследования.

5. Куда направлен материал.

6. Подпись лица, взявшего пробу.

Внимание! Транспортировать продукты следует при температуре не выше 6-8° С,

а исследование производить не позднее чем через 4 ч с момента отбора пробы.

Подготовка проб к исследованию. Поверхность твердых продуктов (батона)

протирают тампоном, смоченным спиртом, и обжигают. Батон разрезают и
стерильным ножом отбирают пробу из разных мест. Из копченостей и других
мясных изделий вырезают участки предпочтительно ближе к кости.

Из изделий без оболочки сначала берут смывы с поверхности увлажненным

тампоном и засевают их на среду "ХБ", Хейфеца или Кесслер. Затем обжигают
смоченную спиртом поверхность, срезают ее и вырезают щупом кусочки массой 20
г. Навеску помещают в стерильную фарфоровую ступку и растирают со
стерильным кварцевым песком, добавляя небольшими дозами изотонический
раствор натрия хлорида (в общей сложности добавляют 80 мл).

Определение количества микробов в 1 г продукта

Первый день исследования

Из каждого исследуемого образца производят 2 посева по 0,1 и 0,01 г. Для этого

делают 2 десятикратных разведения и по 1 мл каждого вносят в 2-3 стерильные
чашки Петри. Засеянные чашки заливают 12-15 мл расплавленного и остуженного
до 45° С агара. После застывания агара на него наливают 4-5 мл голодного агара -
для предотвращения роста протея. Посевы инкубируют при 37° С 48 ч.

Второй день исследования

 Чашки вынимают из термостата, подсчитывают количество выросших колоний и
умножают на сделанные разведения. Определив число бактерий в 1 г продукта,
сопоставляют с ГОСТом.

Определение БГКП в 1 г продукта

Определение основано на способности бактерий кишечной группы
ферментировать маннит с образованием кислых продуктов, изменяющих цвет
индикатора в среде "ХБ" и Хейфеца (двойной концентрации), и расщеплять
глюкозу с образованием кислоты и газа (в среде Кесслер с поплавками).

Первый день исследования

В каждую из вышеуказанных сред вносят по 5 мл первого и второго разведения.

Посевы инкубируют при 43° С в течение 18-20 ч.

Второй день исследования

Вынимают посевы из термостата. При наличии роста кишечных палочек среда

"ХБ" и Хейфеца приобретает желтый цвет (из голубого), а на среде Кесслер
образуются пузыри газа. Идентификацию выросших бактерий проводят по способу,
описанному выше (см. главу 18).

Выявление сальмонелл
Первый день исследования

25 мл полученной взвеси засевают во флакон, содержащий 100 мл среды

накопления (Мюллера, Кауфмана или селенитового бульона). Посевы инкубируют в
термостате при температуре 37° С.

Второй день исследования

Из среды накопления производят посев на среды Эндо и висмут-сульфитный агар

в чашках Петри, а дальше исследование ведут по общепринятой схеме (см. главу
19).

Определение протея
Первый день исследования

0,5 мл взвеси вносят в конденсат свежескошенного агара (метод Щукевича).

Второй день исследования

Присутствие протея определяют по наличию ползучего вуалеобразного налета

(его микроскопируют и определяют подвижность).

Контрольные вопросы

1. Когда может произойти бактериальное загрязнение мяса и мясных изделий?

2. Как отбирают пробы мясных изделий?

 3. Какие бактериологические исследования проводят в мясных изделиях?

4. Каким методом определяют наличие протея?

Питательные среды

"ХБ" (хинозолбромкрезолпурпурная среда). В 1 л водопроводной воды

растворяют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5 г маннита. Приготовленную смесь
кипятят 15-20 мин, устанавливают рН 7,4-7,6, фильтруют через бумажный фильтр,
кипятят фильтрат 10 мин, охлаждают до 60° С, после чего прибавляют 30 мл
дрожжевого диализата, 15 мл желчи, 10 мл раствора хинозола и 10 мл 1,6%
спиртового раствора бромкрезола пурпурного. Среду разливают в стерильные
пробирки по 7-8 мл.

Среда Хейфеца. В 1 л водопроводной воды (для двойной концентрации берут

500 мл) растворяют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5 г маннита. После
установления рН 7,4-7,6 среду нагревают до кипения, фильтруют, прибавляют 1 мл
5% спиртового раствора розоловой кислоты и 2,5 мл 0,1% раствора метилового
голубого. Среду стерилизуют кипячением в течение 5 мин. Разливают в пробирки
по 8-10 мл. Цвет среды - красно-фиолетовый.

Санитарно-бактериологическое исследование
баночных консервов - Ф. К. Черкес
Микрофлора консервов может быть представлена аэробными и анаэробными
микроорганизмами, которые могут попасть в консервы при инфицировании
исходного продукта либо в результате неправильной стерилизации.

Отбор проб. Производят по ГОСТу 8756-070. От каждой партии консервов берут

исходные образцы, из которых готовят среднюю пробу. Из консервов,
расфасованных в стеклянную, жестяную или полимерную тару вместимостью до 1
л, пробу берут из трех единиц расфасовки. При фасовке вместимостью 1-3 л
исследуют 1 единицу фасовки. Из продуктов, находящихся в бочках и ящиках,
берут 500 г.

Подготовка к исследованию. Банки, подлежащие исследованию, осматривают:

нет ли деформации коробки, подтеков, ржавчины. Затем определяют их
герметичность и проверяют на бомбаж.

Герметичность проверяют методом погружения банок в кастрюлю с водой,

нагретой до кипения. Количество воды должно в 4 раза превосходить вместимость
банки, а слой воды над банками должен быть не менее 5 см. В воде банки
выдерживают несколько минут. Появляющиеся пузырьки воздуха в водечговорят
об отсутствии герметичности.

Проверка на бомбаж. Банки вносят в термостат и выдерживают их при

температуре 37° С 5-6 дней. О наличии бомбажа судят по вздутию крышки или дна
банки.

Банки с отсутствием герметичности и наличием бомбажа исследованию не

подлежат (их бракуют).
 Подготовка банок для бактериологического исследования. Исследование
производят в боксе в асептических условиях.

В боксе должны находиться пробойники, стеклянные трубки (стерильные),

питательные среды: бульон с 1% глюкозой, среда Тароцци.

Банки освобождают от этикеток, регистрируют имеющиеся на них данные и

моют горячей водой с мылом, ополаскивают и насухо вытирают. Поверхность
банки обжигают ватой, смоченной спиртом. Под горящую вату подводят острие
профламбированного пробойника под углом 30-40° С. Пробивают отверстие и
вводят в него стеклянную трубочку 8-9 мм в диаметре, закрытую с одной стороны
ватой, и набирают в нее исследуемый материал. После взятия материала сделанное
отверстие закрывается крышкой стерильной чашки Петри.

Посев. Для выявления мезофильных аэробов (ГОСТ 10.444.3.75) проводят посев

2 см3 взятых проб в 2 пробирки с 5-6 мл бульона с 1% глюкозой. Посевы
инкубируют при 37° С в течение 5 дней, ежедневно наблюдая за появлением роста.
При наличии роста делают мазки, окрашивают по Граму. Консервы не должны
содержать аэробной флоры.

Для выявления мезофильных анаэробов (ГОСТ 10.444.4.75) по 2

см исследуемого продукта засевают в 2 пробирки с 10-13 см 3среды Тароцци,
3

предварительно прогретой на водяной бане в течение 20 мин, и быстро

охлажденной до 40° С. Посевы помещают в термостат при 37° С на 5 сут. При
наличии роста со дна пробирки берут материал, делают мазки и ставят пробу на
каталазу. Если в мазках обнаружены грамположительные микробы, а каталазная
проба отрицательная, то 2 мл полученной культуры переносят в стерильную чашку
Петри и заливают агаром с 1% глюкозы. На застывшую поверхность агара
накладывают стерильное предметное стекло так, чтобы под ним не было пузырьков
воздуха. Чашку в перевернутом виде инкубируют при 37° С 48 ч. При появлении
под стеклом роста бактерий или разрывов в агаре, отступающих на 3-4 мм от края
стекла, считают, что в посеве присутствуют анаэробы.

По санитарно-эпидемиологическим показаниям, независимо от вида консервов,

проводят исследования на наличие: возбудителей коагулазоположительных
стафилококков (см. главу 14), возбудителей и токсинов ботулизма (см. главу 36),
клостридий перфрингенс, бактерий цереус, термофильных аэробов и анаэробов,
дрожжей и плесеней.

Консервы не должны содержать патогенных микроорганизмов. Допускается

наличие непатогенных спорообразующих микробов при нормальных
органолептических качествах продукта.

Питательные среды

МПБ с 1% глюкозой. См. главу 7.

Среда Тароцци. См. главу 34.

 Контрольные вопросы
1. Как обрабатывают консервы перед взятием материала для исследования?

2. Как проверяют консервные банки на отсутствие герметичности и наличие

бомбажа?

3. Как проводят исследование для выявления анаэробов?

Санитарно-бактериологическое исследование
смывов - Ф. К. Черкес
Для оценки санитарно-гигиенического состояния предприятий общественного
питания, предприятий пищевой промышленности, лечебно-профилактических и
детских учреждений проводят исследование смывов с рук персонала и предметов
окружающей обстановки.

В зависимости от цели исследования определяют:

1. Наличие БГКП.

2. Наличие S. aureus.

3. Общее количество бактерий.

Исследования на патогенную микрофлору проводят только по эпидпоказаниям.

На предприятиях общественного питания и в детских учреждениях исследования

обычно ограничивают выявлением БГКП (как показатель фекального загрязнения)
и S. aureus.

В отделениях хирургического профиля (операционных, отделениях реанимации,

интенсивной терапии и т. д.), кроме вышеуказанных показателей, определяют
количественную обсемененность микроорганизмами, наличие синегнойной палочки
и протея.

Отбор проб. Взятие проб осуществляют методом смывов. Используют ватные

тампоны (палочка с намотанной на нее ватой вставлена в пробирку) или салфетки
5×5 см, которые захватывают стерильным пинцетом. Тампоны и салфетки
увлажняют, помещая их в пробирки с 2 мл изотонического раствора натрия
хлорида.

Примечание. Марлевые салфетки, предварительно завернутые по одной в

бумажные пакетики, и ватные тампоны, помещенные в пробирки, стерилизуют в
стерилизационном шкафу 1 ч при 160° С.

Смывы с рук делают в следующей последовательности: начинают с левой руки, с

участков меньшей загрязненности - протирают тыльную сторону руки от кисти к
пальцам, затем ладонную сторону, между пальцами и под ногтевым ложем. Этим
же тампоном в такой же последовательности производят смывы с правой руки.
 Смывы с предметов обихода при контроле больших поверхностей делают из
нескольких мест. Исследуемые участки ограничивают рамкой трафарета площадью
50×50 или 100×100 см2. Трафарет изготовляют из проволоки и перед употреблением
прожигают над пламенем горелки.

Примечание. Смывы, как правило, берут с чистых, подготовленных к работе

предметов, а с бывших в употреблении - только по эпидпоказаниям.

Исследование на БГКП
Первый день исследования

Взятые смывы засевают на среду Кода. При росте кишечной палочки среда
изменяет цвет. При изменении цвета среды исследуемый материал пересевают на
среду Эндо.

Второй день исследования

Изучают колонии на среде Эндо. Из подозрительных колоний делают мазки и

микроскопируют. Дальше исследование ведут по обычной схеме.

Выявление S. aureus
Полученные смывы засевают на желточно-солевой агар в чашке Петри и
параллельно на 6,5% солевой бульон (среда накопления). На желточно-солевой агар
можно сделать посев тампоном. Бульон предварительно разливают в пробирки по 5
мл и в каждую засевают 0,2-0,3 мл смыва. Посевы инкубируют при 37° С в течение
24 ч. Дальше исследование ведут по общепринятой методике.

Определение общего числа бактерий

Первый день исследования

К 2 мл взятых смывов прибавляют 8 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Получается разведение 1:5. Тампоны тщательно отмывают встряхиванием. 1 мл
засевают в чашку Петри и заливают 12 мл расплавленного и остуженного до 45° С
агара. Чашки инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Второй день исследования

Посевы вынимают из термостата, подсчитывают количество выросших колоний

и делают пересчет на 1 см2 исследуемой поверхности.

Выявление синегнойной палочки (см. главу 24).

Выявление протея (см. главу 32).

Внимание! Выявление в смывах патогенной флоры производят только по

эпидпоказаниям.

Контрольные вопросы
1. С какой целью проводят исследование смывов с рук и предметов обихода?
 2. Какие основные исследования проводят?

3. Как определяют общее количество бактерий?

4. На какую среду засевают смывы для:

а) выделения БГКП?

б) выделения S. aureus?

Задания
1. Приготовьте тампоны.

2. Сделайте смывы с рук друг у друга и посейте на среду Эндо (смывы

произвести до мытья рук и после мытья).

3. На второй день учтите результаты посевов.

Санитарно-бактериологическое исследование
перевязочного и хирургического материала на
стерильность - Ф. К. Черкес
Посевы исследуемого материала производят в боксе, соблюдая правила асептики.
Выявляют аэробную и анаэробную микрофлору.

Для проведения посевов необходимы:

1) набор стерильных инструментов (ножницы, корнцанги, анатомические

пинцеты);

2) стерильный 10% раствор гипосульфита;

3) стерильная дистиллированная вода;

4) питательные среды: сахарный бульон Хоттингера, среда Сабуро и

тиогликолевая среда.

Материал для исследования направляют в день его стерилизации в закрытых и

опечатанных биксах.

Исследованию подлежат: бинты, тампоны, ватные шарики, марлевые салфетки и

шовный материал (кетгут и шелк).

Материал, подлежащий исследованию, достают из бикса стерильным пинцетом,

над пламенем горелки вырезают из разных участков кусочки, помещают их в
стерильные чашки Петри и производят посев каждого образца в 2 пробирки
сахарного бульона и среду Сабуро.

Шовный материал. Кетгут сохраняют в спиртовом растворе йода. Для

нейтрализации йода кетгут помещают на 24 ч в баночку с 10% раствором
гипосульфита и на 24 ч в стерильную дистиллированную воду. Шелк сохраняют в
спирте, а перед посевом моток шелка выдерживают 24 ч в стерильной
дистиллированной воде.

Подготовленный таким образом шовный материал стерильным пинцетом

извлекают из дистиллированной воды, кладут в чашку Петри, стерильными
ножницами разрезают на куски длиной 2-5 см. Отдельные кусочки засевают на 2
пробирки каждой из вышеуказанных сред.

Посевы ставят в термостат при температуре 37° С, инкубируют 12-14 дней,

просматривая их каждый день (посевы на среде Сабуро инкубируют при 20-22° С).
При наличии роста в пробирках материал признается нестерильным.

Контрольные вопросы
1. Какой материал проверяют на стерильность?

2. Какие используют среды?

3. В каких условиях и как производят посев?

Санитарно-бактериологическое исследование
безалкогольных напитков - Ф. К. Черкес
Методы исследования безалкогольных напитков регламентирует ГОСТ 13273-75.

Для исследования напитки доставляют в лабораторию в фабричной упаковке,

запечатанные пробками.

Перед исследованием горлышко и пробку протирают стерильным тампоном,

обжигают, вынимают пробку и закрывают бутылку стерильной ватно-марлевой
пробкой.

Для удаления газа бутылку выдерживают при 43° С 1 ч.

Напитки с кислой реакцией перед посевом нейтрализуют стерильным 10%

раствором бикарбоната натрия.

Исследование и оценку напитков проводят так же, как исследование и оценку

питьевой воды. Напитки, получаемые путем брожения, не проверяют на общую
бактериальную обсемененность, поскольку в них содержится большое количество
дрожжей и специфической микрофлоры.

Для определения коли-титра напитки засевают на среду Кесслер или ГПС в 2

объемах по 100 мл и 10 объемов по 10 мл. Сиропы предварительно разводят в 10
раз. Квас и пиво как более загрязненные для определения коли-титра засевают в
объемах по 10; 1; 0,1 и 0 01 мл Посев производят на среду Кесслер. Дальнейший
ход исследования аналогичен исследованию воды.

Титр кишечной палочки газированных безалкогольных напитков должен быть не

менее 300, негазированных - не менее 100, хлебного кваса - не менее 10.
 Для выявления ослизняющих бактерий (лейконостока), вызывающих порчу
продуктов, засевают 1 мл сахаросодержащего напитка в дрожжевую воду с 10%
сахарозы и мелом. Посевы выращивают при 22-30° С 48 ч. Наличие ослизняющих
бактерий определяют морфологически (грамположительные кокки, часто
располагающиеся попарно). На среде с сахарозой они образуют большие слизистые
капсулы. На питательных средах вырастают слизистые колонии.

Краткий словарь микробиологических терминов

- Г. И. Кац
Агрессины - вещества, вырабатываемые патогенными микроорганиз мами,
обеспечивающие их внедрение и размножение в макроорганизме.

Адгезия - прилипание.

Аллерген - вещество антигенной или гаптенной природы, сенсибилизирующее

организм и вызывающее аллергию.

Аллергия - состояние измененной реактивности организма в виде повышения

чувствительности к чужеродным веществам или компонентам собственных тканей
(аллергенов). Анафилаксия - вид аллергии, состояние повышенной
чувствительности организма к повторному введению чужеродного белка. Атопия -
общее название заболеваний, развивающихся у людей с повышенной
чувствительностью к определенным веществам (бронхиальная астма, сенная
лихорадка и др.). Идиосинкразия - вид атопии, характеризуется непереносимостью
определенных пищевых веществ у лиц с измененной чувствительностью.
Инфекционная аллергия - состояние повышенной чувствительности организма к
повторному контакту с микроорганизмами или продуктами их жизнедеятельности.

Анабиоз - временная обратимая почти полная приостановка жизненных

процессов при отсутствии видимых внешних проявлений жизни.

Анатоксин - бактериальный экзотоксин, потерявший токсичность, но

сохранивший иммуногенные свойства. Препарат для активной иммунизации.

Анафилаксия - см. аллергия.

Анафилактический шок - см. шок анафилактический.

Анаэробы - микроорганизмы, способные существовать и размножаться при

отсутствии в окружающей среде свободного кислорода. Облигатные анаэробы -
погибают при наличии свободного кислорода в окружающей среде.
Факультативные анаэробы - способны жить и размножаться как в отсутствие, так и
при наличии свободного кислорода в окружающей среде.

Антибиотики - вещества, вырабатываемые микроорганизмами, высшими

растениями и животными, обладающие способностью избирательно подавлять
развитие и вызывать гибель микроорганизмов и опухолевых клеток.

Антигенная детерминанта - см. детерминанта антигенная.

 Антигены микроорганизмов - антигены, находящиеся в микробной клетке. Н
(жгутиковый) - термолабильный антиген, связанный со жгутиками. К (капсульный)
- связан с капсулой и оболочкой микробной клетки. О (соматический) - антиген
липополисахаридного слоя клеточной стенки микробной клетки. Vi
(поверхностный) - полисахаридный антиген некоторых грамотрицательных
микроорганизмов.

Антигены неполноценные - см. гаптены.

Антигены полноценные - генетически чужеродные для организма вещества,

вызывающие иммунную перестройку организма и вступающие в специфическую
реакцию с образующимися при этом антителами.

Антигены протективные - антигены, образуемые возбудителями в организме

хозяина.

Антисептика - комплекс мер, направленных на уничтожение микроорганизмов с

целью предупреждения заболеваний (в ране, на объектах окружающей среды и пр.).

Антитела - иммуноглобулины, вырабатывающиеся иммунной системой под

воздействием антигена и вступающие с ним в специфическую реакцию.
Нормальные - антитела, имеющиеся в сыворотке людей и животных, ранее не
перенесших явного инфекционного заболевания и не иммунизированных
соответствующим антигеном.

Антитоксины - антитела образующиеся под воздействием токсина или

анатоксина и нейтрализующие токсин.

Антропонозы - инфекционные болезни, вызываемые микробами, которые в

природных условиях паразитируют только в организме человека.

Асептика - система мероприятий, Препятствующих микробному загрязнению

объекта (операционного поля, культур микроорганизмов и др.).

Атопия - см. аллергия.

Аэробы - микроорганизмы, живущие и размножающиеся только в присутствии

свободного кислорода.

Бактериемия (микробемия) - присутствие жизнеспособных микроорганизмов в

крови. Общая (генерализованная) форма инфекции (например, при брюшном тифе).
Виремия - циркуляция вирусов в крови. Сепсис (септицемия) - одна из форм
бактериемии, при которой микроорганизмы в большом количестве накапливаются,
длительно находятся и даже размножаются в крови. Септикопиемия (пиемия) -
сепсис, сопровождающийся образованием гнойных очагов (метастазов) в
различных органах.

Бактериостаз (бактериостатическое действие) - временное прекращение

размножения бактерий.

Бактерицидность - способность уничтожать бактерии.

 Бляшка фагов - см. колония фага негативная.

Вакцина - препарат для создания искусственного активного иммунитета.

Вакцинация - метод создания активного иммунитета.

Виремия - см. бактериемия.

Вирогения - см. симбиоз.

Вирулентность - степень патогенности микроорганизма в отношении

определенного хозяина при определенном способе заражения.

Гаптены - вещества, обладающие специфичностью и способные вступать в

серологические реакции с готовыми антителами той же специфичности, но не
способные индуцировать синтез антител в организме. При соединении с белком
гаптен приобретает свойства полноценного антигена.

Генерализованная инфекция - распространение возбудителей по всему

организму.

Гипосенсибилизация - комплекс мер, предупреждающих или ослабляющих

аллергические реакции.

Гомеостаз - относительное динамическое постоянство внутренней среды

организма (крови, лимфы, тканевой жидкости) и устойчивость основных
физиологических функций (кровообращения, дыхания, температуры и т. д.).

Гомология - сходство в строении органов различных видов организмов,

обусловленное их происхождением из одинаковых зачатков.

Гуморальный - относящийся к жидким внутренним средам организма.

Дезинфекция - уничтожение патогенных микроорганизмов в окружающей среде.

Десенсибилизация - см. гипосенсибилизация.

Детерминанта антигенная - участок молекулы антигена, определяющий его

специфичность и взаимодействующий с антителом.

Диссоциация бактерий - возникновение в популяции бактерий, отличающихся от

исходных некоторыми морфологическими, культуральными, антигенными,
вирулентными свойствами.

Доза смертельная. Минимальная (DLM) - минимальная доза возбудителя или

токсина, вызывающая гибель большинства подопытных животных одного вида,
массы и пола при определенном пути введения. Абсолютная (DCL) - минимальная
доза, убивающая всех, взятых в опыт животных. Средняя DL 50 - доза, вызывающая
гибель 50% подопытных животных за фиксированное время.
 Идентификация микроорганизмов - система исследований (микроскопических,
микробиологических, серологических и т. д.), направленных на установление
признаков, определяющих вид, тип, род микроорганизма.

Идиосинкразия - см. аллергия.

Иммунизация - создание искусственного иммунитета. Активного - при введении

вакцин; пассивного - при введении сывороток или иммуноглобулина.

Иммунитет - невосприимчивость организма к генетически чужеродным

антигенам, в том числе к микроорганизмам и их токсинам. Естественный -
возникает после перенесенной инфекции или при получении готовых антител от
матери. Искусственный - развивается при иммунизации. Активный - возникает в
результате иммунного ответа организма на введение антигена. Антибактериальный
- в отношении бактерий. Антитоксический - в отношении токсина. Гуморальный -
обусловлен наличием защитных веществ в крови, лимфе и других жидкостях
организма. Наследственный (видовая, врожденная конституциональная
резистентность) - невосприимчивость, присущая представителям данного вида и
передающаяся по наследству. Приобретенный - развивающийся при иммунизации
или после перенесенного заболевания. Клеточный - обусловлен активностью клеток
(фагоциты и др.). Нестерильный (инфекционный) - обусловлен наличием в
организме живого инфекционного агента и утрачивается при освобождении
организма от возбудителя. Пассивный - обусловлен введением иммунных
сывороток или поступлением от матери (через плаценту или с молоком) готовых
антител. Поствакцинальный - возникает в результате активной иммунизации.
Стерильный - иммунитет, сохраняющийся после освобождения организма от
возбудителя.

Иммунная система - клетки, ткани и органы, осуществляющие защитные

специфические реакции организма, сохраняющие постоянство внутренней среды
(лимфоидная система организма).

Иммуноглобулины - глобулины, преимущественно гамма-глобулины, несущие

функцию антител. Препараты для пассивной иммунизации, полученные при
очистке и концентрации иммунных сывороток.

Импрегнация (в микробиологии) - пропитывание объектов микроскопии

растворами солей металлов.

Инвазивность - способность микроорганизмов преодолевать защитные барьеры

хозяина, проникать в его организм и распространяться в нем.

Ингибиторы - вещества, замедляющие или полностью подавляющие

биологические процессы.

Ингредиент - составная часть какого-либо соединения или смеси.

Инкубационный период - скрытый период инфекционной болезни от момента
заражения до появления первых клинических симптомов.

Интерферон - низкомолекулярный видоспецифический белок, синтезируемый в

организме и культурах клеток, подавляющий репродукцию вирусов.
 Инфекционная аллергия - см. аллергия.

Инфекционная болезнь - клинически выраженный инфекционный процесс.

Инфекционный процесс - см. инфекция.

Инфекция (инфекционный процесс) - совокупность процессов, развивающихся в

восприимчивом организме при его взаимодействии с патогенным
микроорганизмом, происходящих в определенных условиях окружающей среды.

Капсид - белковая оболочка вириона.

Капсомер - белковая макромолекула, составляющая капсид.

Капсульный антиген - см. антигены микроорганизмов.

Клетка плазматическая (антителоообразующая) - клетки лимфоидной ткани,

продуцирующие антитела.

Клон - см. чистая культура микроорганизмов.

Колония - см. чистая культура микроорганизмов.

Колония фага негативная - очаги лизиса, образующиеся вокруг отдельных частиц

фага на плотных средах с бактериальным газоном.

Комменсализм - см. симбиоз.

Комплемент - сложный белок сыворотки крови, лимфы и тканевой жидкости -

фактор неспецифической защиты организма.

Консистенция - степень плотности вещества.

Культивирование - выращивание микроорганизмов, животных и растительных

клеток, тканей и органов в искусственных условиях.

Культура микроорганизмов - микроорганизмы, выращенные на питательной

среде. Популяция - совокупность микроорганизмов одного вида, выросших в
данном объеме среды за определенное время. Культура чистая - см. чистая культура
микроорганизмов.

Лизогения - сосуществование генома бактерий и умеренного фага в виде единой

хромосомы, при котором фаг репродуцируется вместе с бактерией, но сохраняет
способность высвобождения фагового генома и лизиса клетки.

Лизоцим - фермент, разрушающий клеточную стенку бактерий. Фактор

неспецифической защиты организма.

Лимфоцит - клетка, принимающая участие в иммунологических реакциях. В-

лимфоцит - дифференцируется из В-предшественника в неустановленном месте.
Обусловливает реакции гуморального иммунитета. Т-лимфоцит (тимусзависимый) -
дифференцируется в вилочковой железе. Обусловливает реакции клеточного и
гуморального иммунитета.

Линза фронтальная - наружная линза объектива микроскопа.

Линия животных чистая - животные с максимально однородной

наследственностью, полученные путем длительного (не менее 20 поколений)
близкородственного скрещивания.

Лиофилизация - метод обезвоживания путем замораживания с последующей

сушкой в вакууме.

Люминесценция - способность некоторых веществ излучать свет после

поглощения энергии (света более короткой длины волны, рентгеновского излучения
и др.). Флюоресценция - вид люминесценции, отличающийся затуханием в течение
10-9 - 10-8 с после прекращения возбуждения.

Метабиоз - см. симбиоз.

Минимальная смертельная доза (DLM) - см. доза смертельная.

Мутуализм - см. симбиоз.

Нормальные антитела - см. антитела нормальные.

Опсонический индекс - отношение фагоцитарного показателя испытуемой

сыворотки к фагоцитарному показателю нормальной (не иммунной) сыворотки.

Облигатные анаэробы - см. анаэробы.

Очаговая инфекция - инфекционный процесс, локализованный в одном месте.

Паразитизм - см. симбиоз.

Пастеризация - см. стерилизация.

Патогенность - способность микробов определенного вида вызывать заболевание

у определенных видов макроорганизмов.

Пеплос - вторая, наружная оболочка некоторых вирусов, состоящая из отдельных

белковых молекул (пепломеров).

Пигментообразование (у микроорганизмов) - способность вырабатывать

красящие вещества (пигменты).

Пиемия (септикопиемия) - см. бактериемия.

Плазматические клетки - см. клетки плазматические.

Полиморфизм - существование внутри одного вида разных морфологических

форм.
 Популяция микробная - см. культура микроорганизма.

Препарат - биологический объект, подготовленный для макро- или

микроскопического исследования, нативный (не фиксированный), фиксированный
и окрашенный.

Прокариоты - одноклеточные организмы, обладающие одной (обычно

кольцеобразной) нитью ДНК, не имеющие ограниченного ядра и митохондрий.

Протективные антигены - см. антигены протективные.

Протеолитические свойства микроорганизмов - способность ферментативно

расщеплять белки, пептоны и полипептиды.

Рекомбинация - образование смешанного потомства за счет обмена генетическим

материалом.

Сапрофиты - микроорганизмы, питающиеся мертвыми органическими

веществами. Некоторые патогенны для человека.

Сахаролитические свойства - способность расщеплять углеводы.

Сенсибилизация - повышение чувствительности организма к действию какого-

либо фактора.

Симбиоз - тип взаимодействия двух биологических видов. Вирогения - симбиоз

вируса и клетки. Комменсализм - один организм живет за счет другого, не принося
ему вреда. Метабиоз - продукты жизнедеятельности одного вида служат
источником питания другого вида. Мутуализм - приносит взаимные выгоды обоим
участникам. Паразитизм - один организм (паразит) живет за счет другого (хозяина),
принося ему вред. Синергизм - усиление функций у членов ассоциации.

Соматический антиген - см. антигены микроорганизмов.

Стерилизация - полное освобождение веществ и предметов от микроорганизмов

(обеспложивание). Пастеризация - уничтожение бесспоровых форм
микроорганизмов нагреванием до температуры ниже 100° С. Тиндализация -
дробная стерилизация при температуре 56-60° С в течение 30 мин 3 дня подряд.

Стерильные пятна - см. колония фага негативная. Тиндализация - см.

стерилизация.

Тинкториальные свойства - способность микроорганизмов окрашиваться

различными красками.

Токсигенность - способность продуцировать экзотоксин.

Токсин микробный - ядовитое вещество, образующееся в результате

жизнедеятельности микроорганизмов и вызывающее заболевание или гибель
человека или животного. Экзотоксин - выделяется во внешнюю среду. Эндотоксин -
компонент микробной клетки, тесно связанный с нею.
 Токсемия (токсинемия) - наличие токсина в крови.

Токсичность - способность вызывать гибель или отравление организма.

Трансдукция - перенос умеренным фагом участка ДНК от одной бактерии

(донора) к другой (реципиенту).

Трансформация бактерий - включение в хромосому или плазмиду бактерии

(реципиента) фрагмента ДНК другой бактерии (донора) в результате переноса ее
изолированной ДНК.

Фаг (бактериофаг) - вирус, способный инфицировать микробную клетку,

репродуцироваться в ней и вызывать ее гибель или переход в лизогенное состояние.
Вегетативный - находится внутри бактериальной клетки. Вирулентный - вызывает
лизис микробной клетки с выходом в окружающую среду многочисленных частиц
фага. Умеренный - способен существовать в микробной клетке в виде профага и в
определенных условиях может превращаться в вирулентный фаг.

Фагоцитарный показатель - среднее число микроорганизмов, поглощенных

одной фагоцитирующей клеткой.

Фагоцитоз - активный захват и поглощение микроорганизмов, различных клеток

и чужеродных частиц особыми клетками макроорганизма (фагоцитами).

Факультативные анаэробы - см. анаэробы.

Фитонциды - биологически активные вещества, выделяемые некоторыми

растениями (лук, чеснок, черемуха, сосна), задерживающие развитие и вызывающие
гибель микроорганизмов.

Флюоресценция - см. люминесценция.

Флюорохромы - органические вещества, обладающие способностью к

флюоресценции.

Фронтальная линза - см. линза фронтальная.

Химиотерапия - лечение химическими веществами, оказывающими

специфическое антимикробное или противоопухолевое действие.

Чистая культура микроорганизмов - культура, содержащая микроорганизмы

одного вида. Клон - генетически однородная популяция микроорганизмов,
полученная из одной микробной клетки при прямой ее изоляции. Колония -
обособленное скопление микроорганизмов на плотной среде. Штамм - чистая
культура микроорганизмов, выделенная из определенного источника в
определенное время.

Шок анафилактический - генерализованная реакция сенсибилизированного

организма на повторное введение чужеродного белка.

Штамм - см. чистая культура микроорганизмов.

Экзотоксин - см. токсин микробный.

Эксперимент - опыт, поставленный в точно учитываемых условиях

Экстракт - вытяжка из тканей животных или растений.

Эндотоксин - см. токсин микробный.

Эукариоты - организмы, имеющие оформленное ядро и хромосомы.