МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

КОСТАНАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМНЕИ А.

БАЙТУРСЫНОВА

Г.Д. Чужебаева

ДИАГНОСТИКА ПАСТЕРЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО

СКОТА МЕТОДОМ ПЦР
Монография

Қостанай, 2017
 УДК 619. (035.3)
ББК 48.61
Ч-86

Рецензенты: доктор ветеринарных наук, профессор кафедры

биологической безопасности Киркимбаева Ж.С., доктор
ветеринарных наук, заведующий «Костанайской НИВС» филиала
ТОО «КазНИВИ» Мустафин Б.М.

Чужебаева Г.Д.
ДИАГНОСТИКА ПАСТЕРЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО
СКОТА МЕТОДОМ ПЦР:
Монография Г. Чужебаевой. - Костанай.:Костанайский
государственный университет имени Ахмета Байтурсынова, 2017.- 106 с.

ISBN 978-601-7387-41-9

В монографии описан принцип метода полимеразной цепной

реакции, преимущества этого метода, подробно изложена методика
постановки ПЦР для диагностики инфекционных болезней животных.
Приведены результаты исследований по разработке протокола реакции.
Указанный метод способствует развитию фундаментальных
исследований в области изучения инфекционных заболеваний
животных. Для преподавателей, студентов, магистрантов и докторантов
ветеринарных факультетов сельскохозяйственных ВУЗов.

УДК 619. (035.3)

Монография рассмотрена и рекомендована ученым советом КГУ

им. А. Байтурсынова (протокол № 6-3 от 26.05.17).

ISBN 978-601-7387-41-9 © Чужебаева Г.Д. 2017

1
 СОДЕРЖАНИЕ

Введение……………………………………………………. 4
1 Обзор литературы…………………………………………… 6
1.1 Краткая характеристика, распространенность
пастереллеза…… ............................................................... 6
1.2 Диагностика пастереллеза ………………………………… 14
1.3 Геном бактерии пастереллеза и кодируемые им
белки……………… ………………………………………. 30
2 Экспериментальная часть …………………………………. 39
2.1 Материалы и методы исследований……………………… 39
2.2 Результаты исследований ………………………………… 43
2.2.1 Изучение распространенности пастереллеза в
Костанайской области……………………………………… 43
2.2.2 Выделение эпизоотических штаммов Pasteurella multocida
и изучение их биологических свойств ……………………. 46
2.2.3 Изучение биологических свойств штамма Pm 90………… 48
2.3 Выделение геномной ДНК Pm ………………… … …….. 51
2.3.1 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida из
бактериальных культур…………………………………… 51
2.3.2 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida из 54
органно-тканевых материалов …………………………..
2.4 Реcтрикционный анализ ДНК Pasteurella multocida …… 55
2.5 Разработка и оптимизация метода ПЦР для диагностики
Pasteurella multocida……………………………………… 58
2.5.1 Конструирование и синтез специфических праймеров для
идентификации Pm методом ПЦР……………... ................. 59
2.5.2 Отработка и оптимизация параметров
ПЦР…………………… …................................................. 65
2.5.3 Определение чувствительности ПЦР при диагностике
пастереллеза……… ………….. ………………… ……… 76
2.5.4 Определение специфичности ПЦР при пастереллезе 77
КРС……… … ………………………………………………
2.6 ПЦР тест-система для выявления ДНК………………… 79
2.7 Использование метода ПЦР для обнаружения ДНК Pm у
больных животных из неблагополучных по пастереллезу
хозяйств………………………………………………........ 82
3 Обсуждение полученных результатов…………........... 87
Заключение……………………………………………….. 90
Список использованной литературы …………………… 93

2
 ВВЕДЕНИЕ
Одной из причин, сдерживающих успешное развитие
животноводства, являются факторные болезни, имеющие сложную
этиологию и отрицательно влияющие на технологические процессы. По
мнению многих ученых к ним относится и пастереллёз. В Казахстане
пастереллез является одной из наиболее распространенных инфекций,
наносящей значительный экономический ущерб болезнью домашних
животных и птиц.
Своевременная и точная диагностика инфекции является одним из
основных факторов в недопущении ее распространения, что позволяет
предотвращать и существенно снижать экономические потери. Для
лабораторной диагностики и идентификации пастереллеза на
сегодняшний день разработаны и применяются различные
культуральные, серологические и иммунологические методы. Все они
имеют различную диагностическую ценность – одни требуют
значительных затрат по времени, другие имеют низкую
чувствительность и специфичность. В связи с молниеносным течением
инфекции вопросы прижизненной диагностики пастереллеза до
настоящего времени остаются нерешенными. Поэтому
усовершенствование и разработка более чувствительных и
специфичных, а также экспрессных методов лабораторной диагностики,
остается актуальной проблемой и до настоящего времени. При этом
данная задача совпадает со стратегией Правительства РК, взявшего курс
на разработку инновационных решений, обеспечивающих раннюю
диагностику с применением высокотехнологичных экспресс - методов.
В контексте поставленных задач полимеразная цепная реакция
(ПЦР) является наиболее совершенным диагностическим методом,
позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих
инфекционных заболеваний за счет многократного увеличения
количества копий тестируемых специфических последовательностей
участков ДНК.
К настоящему времени в Российской Федерации для ПЦР налажено
производство высокоспецифичных, стандартизированных тест-систем
(наборов) для обнаружения большинства патогенных микроорганизмов
в биологических средах, однако их доступность и стоимость
сдерживают широкое использование этих методов; тест – системы на
пастереллез на рынке ветеринарных диагностикумов России и
Казахстана - нет.
Тест-системы, предназначенные для постановки ПЦР, основаны на
принципе амплификации ДНК, позволяют обнаруживать фрагменты
ДНК патогенных для человека и животных бактерий и вирусов, даже в
тех случаях, когда другими способами (иммунологическим,

3
бактериологическим, микроскопическим и др.) их выявление
невозможно.
Метод ПЦР имеет ряд преимуществ – прямое определение ДНК
возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность,
универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа,
сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа. В
зарубежных странах метод ПЦР успешно применяют для диагностики
пастереллеза животных [1,2,3,4,5]. Разработка эффективных, быстрых и
надежных методов диагностики пастереллеза крупного рогатого скота
является весьма актуальной проблемой для Казахстана. Необходимо
создать отечественную ПЦР систему для детекции ДНК пастереллеза
крупного рогатого скота. В РК аналогичные работы до настоящего
времени не проводились.
Целью работы являлась разработка лабораторного метода ПЦР для
диагностики пастереллеза крупного рогатого скота, c использованием
компьютерно-моделированных и синтезированных специфических
праймеров.
Были определены основные этапы исследований:
1 Провести мониторинг вспышек пастереллеза крупного рогатого
скота в Костанайской области;
2 Изучить основные биологические свойства эпизоотических
культур Pasteurella multocida, отобрать наиболее консервативные
штаммы с целью создания праймера;
3 Отработать оптимальные методы выделения ДНК Pasteurella
multocida;
4 Провести рестрикционный анализ с целью фрагментации
бактериальной ДНК и определения ее молекулярной массы;
5 Сконструировать, отобрать и синтезировать оптимальные
специфические праймеры для амплификации участка геномной ДНК
возбудителя пастереллеза КРС;
6 Отработать оптимальные условия проведения ПЦР (временной и
температурный режим реакции, концентрации основных компонентов в
реакционной смеси) при выявлении ДНК возбудителя пастереллеза
крупного рогатого скота;
7 Изучить специфичность и чувствительность ПЦР системы при
выявлении ДНК возбудителя пастереллеза крупного рогатого скота.

4
 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Краткая характеристика, распространенность

пастереллеза
Пастереллез – широко распространенная инфекционная болезнь,
поражающая многие виды домашних и диких животных и
проявляющаяся при остром течении симптомами септицемии, с
образованием множественных кровоизлияний на серозных и слизистых
покровах дыхательных путей и пищеварительного тракта.
Вызывают пастереллезы разные биотипы и сероварианты
возбудителей из рода Pasteurella, нередко в ассоциации с другой
условно-патогенной микрофлорой, вирусами и грибами.
Пастереллы играют весьма существенную роль в патологии
сельскохозяйственных животных. Инфекционная природа болезни была
установлена только в середине ХIХ века. Большая работа по
пастереллезу была проведена Пастером (1880), который установил
возбудителя этого заболевания, получил микроорганизм в чистой
культуре и разработал активную специфическую профилактику.
Выделенный микроорганизм назван в честь Луи Пастера – пастереллой,
а вызываемое им заболевание - пастереллезом. От крупного рогатого
скота пастереллы выделены Киттом в 1885 году, от буйволов – Орестом
и Арман в 1887 году, от овец – Линьером в 1896 году, от свиней –
Леффлером и Шютцем в 1885 году [6], от кроликов – Гаффки в 1883
году [7].
По классификации Международного эпизоотического бюро МЭБ
в 1979 году пастереллез крупного рогатого скота был включен в список
В как менее опасное, но достаточно широко распространенное среди
крупного рогатого скота, после лейкоза, туберкулеза, бруцеллеза
инфекционное заболевание 8. Болезни списка В– контагиозные
болезни, которые считаются опасными с социально-экономической и
санитарной точек зрения. Занос возбудителей этих инфекций при
международной торговле животными и продуктами животноводства
может иметь крайне неблагоприятные последствия. Пастереллез
распространен во всех странах мира. К наиболее неблагополучным по
пастереллезу крупного рогатого скота зонам относятся Южная часть
Европы, Африканский континент, Средний Восток, Юг и Юго-
Восточная Азия.
Интенсивные исследования, проведенные во многих направлениях
в течение нескольких десятков лет, коренным образом изменили
существовавшее представление и значительно расширили познания о
пастереллезах сельскохозяйственных животных.
По мнению С.И. Джупины, А.А. Колосова (1992), В.А. Салимова
(2007) пастереллез можно отнести к факторным болезням,
5
являющимися одной из причин, сдерживающих развитие
животноводства, имеющих сложную этиологию и отрицательно
влияющих на технологические процессы [9,10].
Проявляется пастереллез в виде спорадических случаев, но при
условиях, способствующих его распространению, может приобретать
характер эпизоотии.
Экономический ущерб от пастереллеза слагается из потерь от
падежа, вынужденного убоя больных животных, пастереллоносителей и
затрат на проведение профилактических и оздоровительных
мероприятий. Летальность при пастереллезе колеблется от 10 до 100%
[11,12,13].
К пастереллезу восприимчивы крупный рогатый скот, лошади,
мелкий рогатый скот, буйволы, козы, свиньи, грызуны, кошки, собаки,
дикие животные, домашние и дикие птицы. При благоприятных
условиях пастереллез развивается и распространяется среди здоровых
животных [14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24]. Пастереллез распространен
повсеместно, но чаще регистрируются в странах с тропическим и
субтропическим климатом (Индия, Пакистан, Иран, Ирак, Таиланд,
Камерун, Филиппины, Индонезия, Вьетнам, Лаос, Камбоджа, Южная
Корея). Достаточно широко пастереллез распространен на территориях
стран СНГ, в том числе и в Казахстане [8,10,25,26,27,28,29,30,31].
Определенной устойчивостью к пастереллезу обладают лошади и
плотоядные [32,33,34,35,36]. Как самостоятельное заболевание
пастереллез у этих видов животных наблюдается редко, но может
встречаться в качестве секундарной инфекции, например, при гриппе
лошадей, чуме собак. Однако, Керимбаев У.Н., Сансызбаев А.Р.,
Сидоров М.А., Геведзе В.И., считают, что лошади легко заражаются
пастереллезом, при этом болезнь протекает остро и большинство
животных погибает [37, 38].
Наиболее широко распространено носительство среди крупного
рогатого скота (9,52%), буйволов (5,13%), домашних птиц (4,95%), овец
(2,63%), коз (2,56%) и лошадей (1,87%) [39]. В среднем носители
выявлены среди здоровых животных и птиц в 3,9%, среди больных с
поражением органов дыхания – 4,6% случаев [8,15]. Носительство
пастерелл отмечено не только у диких, но и у синантропных грызунов (у
3,1% серых крыс и у 1,9% домовых мышей) [40,41, 42, 43, 44, 45].
Разнообразие пастереллезов по клиническому проявлению и
характеру течения связано с широкой серологической и
иммунологической гетерогенностью пастерелл.
Poberts .Р. на основе результатов сывороточных тестов защиты на
мышах обнаружил иммунологическую гетерогенность культуры
P.multocida и таким образом разделил их на четыре типа 1,2,3,4 46.
Д.Картер установил наличие специфического капсульного антигена
6
пастерелл, которые разделил на четыре серологические группы А, В, Д и
Е 47,48.
Представители всех четырех серологических групп способны
вызывать заболевание у всех видов восприимчивых животных, но в то
же время наблюдается более высокая патогенность для одного или
нескольких видов животных.
Пастереллы типа А чаще всего вызывают болезнь у птиц, реже у
крупного рогатого скота, буйволов и свиней, типы В и Е –
преимущественно у крупного рогатого скота, тип Д встречается у всех
видов животных 49.
По данным Wijewardana T.G. геморрагическая септицемия
характеризуется высокой смертностью и поражает в основном буйволов
и крупный рогатый скот. Заболевание распространено в Южной
Америке, Азии, Африке и не регистрируется в Австралии, Канаде,
Западной Европе и Японии 50.
Этиологическим агентом геморрагической септицемии является
P.multocida серотипов В:2 и Е:2. В Мексике важную роль в
эпизоотологии пастереллезной инфекции играет серотип А P. multocida,
меньшей степени серотипы Д, В, Е. Еще 80-е годы XX века Namioka S.
сообщал о неблагополучии таких стран, как Вьетнам, Бирма, Тайвань
51.
На Африканском континенте преобладающим серотипом являются
серотипы В, Е. Серотип Е встречается в основном Западной,
Центральной Африке, тип В является Азиатским, но встречается также
Восточной Африке 52. De Alwis M.C.L. подтверждает, что в Азиатских
странах единственным серотипом, вызывающий геморрагическую
септицемию является серотип 6:В. 53. В Республике Мали все
выделенные штаммы пастерелл от крупного рогатого скота по
результатам серологической типизации отнесены серотипу Е 54. По
данным Сидем Юсуф в Республике Гвинея в этиологии пастереллеза
ведущим является пастереллы типа Е 55.
По данным De Alwis M.C.L. Шри-Ланка неблагополучна по
пастереллезу животных, в стране имеются зоны, где болезнь носит
энзоотический характер 56.
В Южной Англии Wyld S.G. выделил пастереллы из легких
павших телят 57. В своих работах Nanu N. отмечает, что в Румынии, в
разные годы заболеваемость была от 7 до 38% с отходом молодняка 15-
17%. Большинство исследователей отмечают, что от 70 до 90% изолятов
пастерелл представлены серотипами Д и А 58.
В странах СНГ проблема пастереллеза сельскохозяйственных
животных, также как и за рубежом занимает одно из ведущих мест в
патологии молодняка. При определенных условиях в ряде хозяйств
7
возможны энзоотии смешанных инфекций у телят (пастереллез,
колибактериоз, сальмонеллез) и у поросят (колибактериоз,
сальмонеллез, лептоспироз). Ворнаков Д.И. считает что, для
эффективной профилактики инфекционных болезней телят, поросят
необходима тщательная оценка природно-климатических, социально-
экономических факторов, способствующих развитию инфекционного и
эпизоотологического процессов 59. Исследования, проведенные за
последние годы в Республике Беларусь, показывают, что поражение
органов дыхания среди животных свиноводческих комплексов по
доращиванию и откорму молодняка крупного рогатого скота достигает
55-75%. При этом отмечается резкое увеличение количества
выделенных пастерелл от животных до 78-87% 60.
В хозяйствах Московской области заболевают пастереллезом 45-
65% животных 61,62.
По данным Геведзе В.И. и Соколова С.Г. при энзоотической
пневмонии телят основными возбудителями являются пастереллы
серотипа А и Д 63,64.
По сведению Колосова А.А. все штаммы пастерелл, выделенные
от животных павших от геморрагической септицемии, отнесены, к
серотипу В. Они отличались высокой вирулентностью 65.
По данным Масимова Н.А. при проведении бактериологического
исследования проб от 65 откормочных телят, без проявления
клинических признаков были выделены 48 штаммов пастерелл серотипа
Д и А 66.
Джупина С.И., Колосов А.А. установили, что в отдельных
регионах Сибири и Дальнего Востока довольно часто отмечаются
вспышки пастереллеза, во время которых заболевает значительное
количество крупного рогатого скота. Следует отметить, что иногда
заболевание возникает, среди иммунизированного поголовья и весьма
часто на отгонных пастбищах, где болеют и гибнут в основном коровы и
молодняк на откорме 9.
По данным Шегедевич Э.А. в течение последних 10 –12 лет в
природе значительно шире распространены серологические варианты
пастерелл А и Д, по сравнению с серологическим вариантом В, которые
могут вызывать первичные и вторичные пастереллезы у широкого круга
различных видов животных 19.
В хозяйствах Республики Беларусь пастереллез крупного
рогатого скота является одним из наиболее распространенных
инфекционных заболеваний. С 1995 по 2003г. количество
неблагополучных пунктов по этой болезни возросло на 13,2%,
заболеваемость животных на 6,1%, а число павших увеличилось на
32,4%. При бактериологическом исследовании легочной ткани павших

8
телят, выделен 101 штамм пастерелл, из которых 22,8% изолятов
отнесены P.multocida [тип Д] и 31,7% к P.haemolytica 9.
Андросик Н.Н., Лях Ю.Г. в своей работе отмечают, что в около
50% случаев пастереллы выделяются в чистой культуре без примеси
других микроорганизмов. При определении серологической
принадлежности выделенных изолятов 20,8% были отнесены к серотипу
Д, 36,8% к серотипу А P.multocida и 26,29% к P.haemolitica 67.
В Самарканде, по данным Курбанова Ш.К., в стадии
максимального подъема эпизоотии частота выделения пастерелл
серотипа А и серотипа Д наиболее высокая 68.
В Казахстане исследованиями пастереллеза животных начали
заниматься довольно давно. Во многих областях Казахстана пастереллы
наиболее часто выделялись от крупного рогатого скота, овец, свиней,
лошадей и птиц.
По данным Республиканской ветеринарной лаборатории ареал
пастереллеза среди сельскохозяйственных животных охватывает все
области Казахстана, но степень неблагополучия варьирует в широких
пределах. Наиболее неблагополучными по заболеваемости
пастереллезом лошадей являются Западно-Казахстанская, Алматинская,
Восточно-Казахстанская области; крупного рогатого скота –
Костанайская, Западно-Казахстанская, Актюбинская области; свиней –
Алматинская, Западно-Казахстанская, Карагандинская области; птицы –
Западно-Казахстанская, Алматинская и Северо-Казахстанская области
[69].
Исследования, проведенные Дерновой В.Ф. по изучению
пастерелл на территории Республики Казахстан, свидетельствуют о
распространении пастереллеза среди лошадей, крупного рогатого скота,
мелкого рогатого скота, свиней, птиц и других животных, причем
пастереллез крупного рогатого скота наиболее часто встречаются в
Костанайской, Западно-Казахстанской, Актюбинской, Алматинской
областях 70.
В распространении данной инфекции немаловажная роль
принадлежит синантропным грызунам, так как пастереллезу характерна
стойкая приуроченность к строго определенным территориям. Описаны
случаи пастереллезной инфекций при исследовании массовой гибели
сайгаков на территории Тургайской, Актюбинской и Западно-
Казахстанской областях. Возбудитель был изолирован не только из
органов павших сайгаков, но из органов павших грызунов и хищников
71,72.
По данным Некрасовой Л.Е. зараженность диких грызунов
пастереллезом составляет в среднем от 0,008% до 1,8% 73.
По сведениям Дерновой В.Ф. зараженность диких грызунов
пастереллезом в природе колеблется в среднем от 0,10,0015% до
9
3,70,4% 70. В 2001 г ряд ученых установили первый случай
выделения возбудителя пастереллеза из органов павших Каспийских
тюленей. Культуры пастерелл были выделены прямым посевом и через
биологическую пробу из паренхиматозных органов павших тюленей
74.
Анализ эпидемиологических обследований, проведенных в
больницах разных стран мира, свидетельствует о том, что проблема
пастереллеза актуальна и для медицины [75,76, 77].
Случаи заболевания пастереллезом человека описаны рядом
исследователей, в которых прослежена этиология заболевания и
полученные культуры идентифицированы как Pasteurella multocida
[78,79,80,81].
Заболевания людей пастереллезом отмечены во многих странах
мира, однако регистрировались они сравнительно редко. По видимому,
действительный уровень заболеваемости значительно превосходит
регистрируемый, что было обусловлено состоянием лабораторной
диагностики, при неудовлетворительной организации которой, во
многих случаях пастереллез у людей проходит под другими диагнозами;
этому способствует то обстоятельство, что заболевание нередко
протекает в стертой форме [82].
Исследования, проведенные в Швеции на 146 инфицированных
людях за период с 2009 по 2012 годы, позволили выделить 159 штаммов
пастерелл, из которых 95 были типированы как Pasteurella multocida.
Случаи заболевания людей также были отмечены в Японии, Франции,
Испании. При этом, основным источником инфекции для людей
являются животные – больные или бактерионосители, из них
наибольшее значение имеют собаки и кошки [72,83,84].
В работах Smith J.E. указывается на широкое носительство
Pasteurella multocida среди кошек и собак. По данным французских
исследователей потенциально патогенные для людей виды (Pasteurella
dogmatic, Pasteurella canis, Pasteurella multocida), в основном, были
обнаружены у кошек и собак в соскобах из десен. При этом Pasteurella
multocida у кошек выделяли в 65% случаев и 1,4% - у собак [24,85,
86,87].
Инфицирование обычно связывают с укусами и царапинами.
Впервые клинические проявления пастереллеза, как результат укуса
кошками, описаны и подтверждены бактериологически Rimpau W. [88].
Как иностранные, так и отечественные [7,8,14,15,16] исследователи
связывают пастереллез у людей с содержанием домашних животных
(собак, кошек), укусами диких и сельскохозяйственных животных,
кровососущих насекомых (клещи, слепни) [7,8,14,16,24,25,72,86,89].
Широкое распространение пастереллеза среди домашних, диких
животных и птиц непосредственно влияет на ухудшение
10
эпизоотологической и эпидемиологической обстановки по данной
инфекции, нанося большой экономический ущерб сельскому хозяйству.
Пастереллез – как зооантропонозная болезнь представляет большую
проблему, как для ветеринарии, так и для медицины.
Возбудители пастереллезов относятся к семейству Pasteurellaceae,
роду Pasteurella. Род включает виды multocida, haemolytica,
pneumotropica, ureae, gallinarum, aerogenes. [90].
Пастереллы являются аэробами или факультативными
анаэробами, температура их жизнедеятельности 22-42ºС, оптимальная -
37ºС [32]. Возбудители пастереллезов характеризуются
наличием многих антигенов и имеют сложную антигенную структуру,
по которой некоторые штаммы пастерелл резко отличаются друг от
друга, а в серологических реакциях ведут себя как представители разных
групп бактерий [91,92,93,94,95,96].
В соответствии с общепринятой в настоящее время
классификацией у Pasteurella multocida обнаружено наличие трех
основных факторов патогенности, ответственных за развитие
инфекционного патологического процесса. Среди инвазивных факторов
у Pasteurella multocida установлено наличие, по крайней мере, двух
основных ферментов. Один из них гиалуронидаза [97.98], другой -
нейраминидаза [99]. Работами целого ряда авторов у вирулентных
штаммов Pasteurella multocida обнаружена капсульная субстанция,
обладающая выраженной антифагоцитарной активностью [46, 47, 100,
101, 102, 103]. Факторы патогенности с токсической функцией
включают липополисахаридный комплекс клеточной стенки и
экзотоксин белковой природы, выявленный в настоящее время у
штаммов Д и А серовариантов Pasteurella multocida [104,105]. Однако
факторы патогенности Pasteurella multocida изучены еще недостаточно,
особенно в плане иммуногенной активности.
Многочисленными исследованиями ученых доказано, что среди
поверхностных антигенов капсула является важным фактором
патогенности многих видов бактерий, обуславливающим ряд их
биологических свойств []. Вирулентность культур Pasteurella multocida
прямо коррелирует с количеством микробов, имеющих капсулу [100].
Так при гемосептицемии, тяжелом течении пастереллезной пневмонии и
других формах пастереллезов у животных были выделены
инкапсулированные формы. Штаммы ослабленной вирулентности
характеризовались отсутствием на их поверхности капсулы. При
бактерионосительстве среди кошек и собак выявлено циркулирование в
их организме преимущественно неинкапсулированных клеток Pasteurella
multocida [87,88].
По данным ряда авторов основное биологическое свойство
капсульных полисахаридов пастерелл связано с антифагоцитарной
11
функцией, обеспечивающей протекцию против различных механизмов
клеточной защиты хозяина [102,104,106,107]. Работами целого ряда
авторов продемонстрировано антифагоцитарное действие
инкапсулированных штаммов Pasteurella multocida серотипа А на
нейтрофиллы крупного рогатого скота в тестах in vitro [108,109,110].
Несмотря на эту неоднократно подтвержденную точку зрения, по
мнению Dubrenil J.D. et al. [111], не всегда наличие капсулы коррелирует
с вирулентностью штаммов Pasteurella multocida и определяет их
антифагоцитарную активность.
Тем не менее, замечено, что диссоциативные изменения,
связанные с нарушением синтеза капсулы, в частности капсульных
полисахаридов, сопровождались снижением или полной потерей
вирулентности и иммуногенной активности. Капсулы представляют
собой внеклеточное слизистое образование, более или менее
выраженный наружный слой в составе клеточной оболочки многих
грамотрицательных бактерий. Анализ большого количества штаммов
позволил выявить корреляцию между толщиной капсульного слоя и
серовариантной принадлежностью штамма. Замечено, что сероварианты
А и Д проявляют сильное инкапсулирование. У клеток этого типа при
дополнительной стабилизации наблюдается внеклеточное образование
толщиной 70-90 и 10-30 нм от внешней мембраны соответственно для
указанных выше серовариантов [112,113]. По данным Коломниной Г.Ф.
и др., Pasteurella multocida сероварианта В при определенных условиях
культивирования тоже формирует капсулу или микрокапсулу [101]. Ряд
авторов отмечает зависимость процессов капсулообразования от
условий и сроков культивирования бактерий [108,109,114,115].
Относительно химической природы капсульного материала единого
мнения нет. Большинство авторов указывают, что капсульные экстракты
представляют собой белково-полисахаридный комплекс с примесями
веществ различной биохимической природы. Соотношение основных
компонентов в неочищенных экстрактах различно и варьирует от
штамма, серовариантной принадлежности, условий культивирования
бактерий и метода экстракции. Согласно литературным данным
содержание протеинов составляет от 37,7% до 55,1% углеводов - от
4,71% до 14,8% [106,111,116, 117].
Исследование белковых компонентов капсул Pasteurella multocida
различных серовариантов методом электрофореза продемонстрировало
их неоднородность. В капсульном материале вирулентных штаммов
было выявлено до 12 белковых полос [118,119].
Pirocky P. удалось выделить полисахаридные компоненты из
гладких культур Pasteurella multocida [120]. Из капсульного вещества
Pasteurella multocida серовариантов А и Д, полученных по методу Carter,
были выделены муцинозные полисахариды, содержащие равное
12
количество гексозамина и уроновой кислоты. Качественный анализ
углеводных компонентов Pasteurella multocida сероварианта А,
выделенных от различных видов животных и человека, показал наличие
гиалуроновой кислоты [97,98, 121]. В дополнение к изложенному, в 1993
году появилось сообщение о выделении методом бумажной
хроматографии гиалуроновой кислоты из капсульного материала
штаммов Pasteurella multocida сероварианта Д, изолированных из легких
свиней [122].
Анализ литературных данных показал отсутствие целостного
представления о биохимических и физико-химических свойствах
капсульного материала Pasteurella multocida различных серовариантов,
но указывает на значительную важность ее в иммунологической
реакции, как основного антигенного фактора.
Многими авторами подчеркивается сложность антигенного состава
капсульной субстанции Pasteurella multocida с различной степенью
активности отдельных компонентов. В ряде работ сообщается о
выделении методом гель-фильтрации из капсульных антигенов
высокомолекулярной фракции, обладающей выраженными антигенными
свойствами [123,124]. По мнению ряда авторов, капсульное вещество
Pasteurella multocida является полноценным антигеном и в значительной
мере определяет антигенную специфичность штаммов [101,102,103]. В
ряде серологических тестов (РА, РНГА) была продемонстрирована
специфичность капсульных антигенов, на основании чего штаммы
Pasteurella multocida делятся на серологические варианты [125,126].
Учитывая сложность антигенного строения капсульной субстанции
Pasteurella multocida, исследователи расходятся во мнении относительно
компонентов, детерминирующих антигенную активность. В целом у
Pasteurella multocida установлено 18 растворимых антигенов, два из
которых лежат на поверхности клетки: соматический термостабильный
и капсульный термолабильный специфический антигены. Тем не менее,
точная топографическая локализация антигенов как в капсуле, так и в
клетке в целом не выявлена [91,92,93].
Основными антигенами являются соматический термостабильный
протективный, общий для рода пастерелл, и капсульный
полисахаридный термолабильный специфический, в зависимости от
которых пастереллы делятся на несколько групп. Четыре капсульных
типа Pasteurella multocida обозначены через А, В, С и Е [95,96,127].
Pasteurella multocida состоит более чем из 16 сероваров, некоторые
из них ассоциированы с определенными видами животных и
симптомами болезни. Серовары В:2 и Е:2 являются возбудителями
геморрагической септицемии у крупного рогатого скота и водяных
буйволов, серовары А:1 и А:3 – возбудителями пастереллеза птиц
[128,129,130].
13
 Современные представления об основных компонентах,
ассоциированных с капсульным веществом, можно резюмировать так:
1) β-антиген – типоспецифический полисахарид, адсорбируется на
эритроцитах в реакции непрямой гемагглютинации: встречается в
микроорганизмах, которые дают флюоресцирующие и мукоидные
варианты;
2) d-комплекс – полисахаридно-белковый, тесно
прикрепляющийся к клеточной стенке, иммуногенный, видимо, в
некоторой степени лабильный;
3) γ-антиген – липополисахарид, встречающийся у
микроорганизмов всех вариантов, входящий в состав клеточной стенки;
у каждого одна или более антигенных детерминант, ответственных за
различные О-, или соматические, серовары [131,132].
Многие исследователи указывают на вариабельность
биохимических свойств возбудителя пастереллеза. По данным
некоторых исследователей биохимический тест нельзя использовать для
дифференциации штаммов возбудителя различного зоологического
происхождения, который заключается в сбраживании сахарозы, глюкозы
[133,134]. Khalifa I.A., напротив, установил зависимость биохимических
свойств штаммов от зоологического происхождения. [135]. По данным
Breed R.S. et al. [136], Pasteurella multocida, как правило, не
ферментирует лактозу, но имеются исключения. Так, штаммы
разлагающие лактозу, описаны некоторыми учеными. Эти бактерии
обычно не свертывают молоко, не изменяют его реакцию [137,138].
Pasteurеlla multocida не коагулирует плазму кролика и морской свинки.
Желатину и свернутую сыворотку не разжижает, не вызывает гемолиза,
но образует индол и сероводород. Восстанавливает нитраты до
нитритов, дает отрицательную пробу с метиленовым красным.
Мочевину не разлагает, разрушает перекись водорода. Ферментирует
сахара, спирты и гликозиды с образованием кислоты без газа. Как
указывают Breed R.S. и др., Pasteurella multocida сбраживает глюкозу,
сахарозу, фруктозу, сорбит, галактозу, маннозу и как правило, маннит,
ксилозу и трегалозу; не ферментирует лактозу, дульцит, амигдалин,
рафинозу, рамнозу, адонит, декстрин, инулин, глицерин, эритрит,
салицин, мальтозу и арабинозу. У Pasteurella multocida видовым
признаком следует считать лишь способность ферментировать глюкозу,
сахарозу, маннозу и галактозу с образованием кислоты без газа, не
разжижать желатину, не свертывать и не пептонизировать молоко и, как
правило, не образовывать сероводород [85,112,133,134,139,140].

1.2 Диагностика пастереллеза

Диагноз пастереллеза ставится комплексно, с учетом данных
эпизоотологии, клиники, данных патологоанатомических изменений и
14
бактериологического исследования. Каждый из методов диагностики
имеет ценность лишь в совокупности с другими методами, в
особенности с результатами патологоморфологических и
бактериологических исследований [115,139,141].
Обнаружение у заболевших животных сходной с пастереллезом
клинической картины не дает права ставить диагноз на пастереллез, так
как имеется ряд заболеваний, клиническое течение которых очень
напоминает пастереллез. Патологоанатомические данные достаточно
выражены при остром течении пастереллеза, но не патогномоничны, и
ставить диагноз только на основании их нельзя. Выделение культуры
пастерелл при бактериологическом исследовании без учета результатов,
полученных другими диагностическими методами, также не дает
оснований для постановки диагноза на это заболевание, так как при
пастереллезе наблюдается широкое бактерионосительство как среди
переболевших, так и среди клинически здоровых животных,
контактировавших, а иногда и неконтактировавших с животными
неблагополучных хозяйств. Совокупность сведений по эпизоотологии,
клинической и патологоанатомической картине дает право на
постановку предварительного диагноза, результаты же
бактериологических и биологических и молекулярно-биологических
исследований позволяют поставить диагноз окончательно [139,142].
Клинические признаки не имеют большого диагностического значения.
Исключительно ценные данные для правильной постановки диагноза
при остром и подостром течениях пастереллеза дают
патологоанатомическое исследования. Прижизненная
бактериологическая диагностика пастереллеза также не имеет большого
значения, чаще исследуют материал от павших животных. Результаты
лабораторного исследования этого материала дают возможность
уточнить первоначальный диагноз [6,7,9,17,18,37].
Для бактериологического исследования в лабораторию посылают
отдельные органы (сердце, селезенку, печень и др.). Патологический
материал лучше посылать свежий или замороженный, либо в
консервирующей жидкости – 30%-ный водный раствор глицерина.
Бактериологическая диагностика пастереллеза слагается из
следующих методов:
- микроскопии мазков крови или мазков-отпечатков внутренних
органов (печень, селезенка);
- выделения культур P.multocida из патологического материала
путем высева на искусственные питательные среды или биологическим
методом, заражая лабораторных животных;
- идентификации культуры;
- определения вирулентности выделенных культур на
лабораторных животных.
15
 При острых инфекционных болезнях, к которым относится и
пастереллез, серологический диагноз имеет меньшее значение, чем
такие методы диагностики, как бактериологический и биологический,
так как болезнь протекает быстро. Но с целью своевременного и более
полного выявления и в неблагополучных и в благополучных хозяйствах
скрытых больных и животных-пастереллоносителей применение
серологических реакций имеет большое значение.
Для серологической диагностики используют реакции
агглютинации, связывания комплемента, преципитации,
гемагглютинации, адсорбции агглютининов и другие.
Реакцию агглютинации (РА) пробовали применять для выявления
птиц-пастереллоносителей, но отсутствие стандартных антигенов не
позволяло дать объективную оценку этому методу диагностики, хотя
S.Nomioka и M.Murata довольно успешно с помощью реакции
агглютинации разделили соматические антигены на несколько групп. По
различию в О-антигенном строении изученные 166 штаммов
(выделенных от крупного рогатого скота – 26; свиней – 43; овец – 7;
мышей – 18; кошек – 1; птиц – 69; человека - 2) были распределены на
10 групп. Группируя по соматическому и капсульному антигенам, все
штаммы удалось разделить на 12 серологических типов (групп). В
капсульную группу А входило пять соматических групп (1, 3, 5, 7 и 9), в
группу Д – пять О-групп (1, 2, 3, 4 и 10) и одна из О-групп (6) была в
группе В (G.R.Carter), к 12-му серотипу отнесены все остальные
штаммы. На основании полученных данных авторы предлагают
характеризовать штаммы P.multocida по соматическому и капсульному
антигенам и в связи с этим именовать их 1:А, 3:А, 2:В и т.д. Штаммы
1:А и 3:А имеют общий капсульный антиген А, но различные (1 и 3)
соматические антигены. Почти все культуры от цыплят и уток, больных
пастереллезом, принадлежали к серотипу 5:А, от индеек - К 9:А.
Несколько штаммов типа 2:Д были изолированы от цыплят при
хроническом течении пастереллеза [48,92,70].
Большинство авторов ставили РА по обычно принятой методике,
но антигены готовили по-разному, поэтому результаты, полученные с
испытуемыми сыворотками птиц, были неодинаковыми.
S.Nomioka и M.Murata для постановки РА на стекле была
предложена упрощенная методика. Антиген получали по особой
методике – культуру пастерелл выращивали на УРС-агаре,
предложенном авторами, причем рост был обильным, затем смывали
формализированным буферным раствором. Типовые (эталонные)
антисыворотки готовили по капсульному антигену штаммов А, В, С, Д
по G.R.Carter. S.Nomioka и M.Murata применяли РА также для
типирования пастерелл не только по капсульному антигену, но и по
соматическому [48].
16
 Применяется и реакция диффузионной преципитации (РДП), где
для изготовления антигена К.П.Чепуров обрабатывается взвесь
пастерелл в физиологическом растворе двукратным объемом
хлороформа. А.Н.Борисенкова получала антигены из выращенной на
МПА с 10% аминопептидом 2-суточной культуры пастерелл, смытых
физиологическим раствором и прогретых в водяной бане при 56-58 0С в
течение 30 мин. После 20-минутного центрифугирования при 5000
об/мин супернатант был использован в качестве антигена [143,144].
Гипериммунные сыворотки получают путем иммунизации
кроликов эталонными штаммами. Для этих целей используется та же
методика гипериммунизации кроликов, как и в РА. Сыворотки и
антигены в реакции использовали неразведенными, в эквивалентных
объемах. Чашки Петри с реагентами помещали во влажную камеру при
комнатной температуре, реакцию учитывали при постановке РДП в
макромодификации в чашках Петри через 24-72 часа, а в
микромодификации (на стеклянных пластинках 9 х 12) - через 18-24
часа. В обоих случаях использован агар Дифко [145].
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) в
настоящее время считается наиболее точной серологической реакцией
для выяснения иммунобиологического состояния. G.R.Carter применял
ее для изучения иммунитета у птиц, иммунизированных против
пастереллеза. Чаще она используется для идентификации различных
серотипов пастерелл, имеющих капсулу. Реакцию ставят и учитывают
по общепринятой методике в пробирках или на плексиглазовой
пластинке с углублениями [146].
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) был предложен в начале 70-
х годов тремя группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции,
van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США. К
концу ХХ века этот метод прошел путь от новейшей научной разработки
до рутинного метода в клинической диагностике. На сегодняшний день
ИФА-диагностика является наиболее часто используемым
диагностическим методом. В настоящее время в России и Казахстане
для исследований на пастереллез животных используется набор для
выявления антител к возбудителю пастереллеза (Pasteurella multocida)
иммуноферментным методом фирмы «Synbiotics Europe» (Франция).
Сущность ИФА пастереллеза, так же как и других болезней животных,
заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с
последующим присоединением к полученному комплексу коньюгата
(антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент
вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием
окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо
фотометрически. Регистрацию результатов реакции проводят на
специальных фотометрах с вертикальным лучом при определенной
17
длине волны. Результат выражают в единицах оптической плотности
[147]. Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых
наибольшее практическое значение получил гетерогенный
твердофазный иммуноферментный анализ. Использование твердой фазы
позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет
иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления
субстанций, не участвующих в реакции. Основными требованиями,
предъявляемыми к твердой фазе при проведении ИФА, являются
устойчивость к растворам, используемым в реакции, и высокая
специфическая емкость (т. е. способности сорбировать на своей
поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для
проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической
сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов). Наиболее
распространенным способом иммобилизации антител или антигенов
является адсорбция, процесс, при котором часть молекул за счет ионных
и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных
связей, присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой
фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов
используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или
полистироловые шарики. В то же время метод ИФА в различных его
модификациях мало эффективен в случае необходимости
дифференциации типовой и штаммовой принадлежности
микроорганизмов. ИФА выявляет белки-маркеры, являющиеся
продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь
опосредованное свидетельство наличия инфекции [148].
В последнее время, к традиционным микробиологическим и
иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных
заболеваний животных добавились новые, основанные на использовании
молекулярно-генетических технологий.
К концу 90-х г. в микробиологической практике получило
широкое развитие использование новых методических подходов, как в
прикладном, так и фундаментальном аспекте. Среди них ведущее место
заняли молекулярно-генетические методы - рестрикционный анализ,
молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот, молекулярное
клонирование. Применение этих методов не только в научных целях, но
и в практической лабораторной диагностике стало возможным в
немалой степени благодаря созданию в середине 80-х годов процесса
искусственного многократного копирования ДНК и дальнейшему
стремительному развитию этой технологии, в настоящее время
известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР) [149,150].
Менее чем за 15 лет своего существования ПЦР сделала рутинным
анализ специфических ДНК-последовательностей многих патогенных
микроорганизмов. Универсальность, высокая чувствительность и
18
относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым
для решения различных задач клинической диагностики, таких, как
прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний,
молекулярное типирование и исследование свойств патогенных
микроорганизмов [151,152].
Основное преимущество этих методов, по сравнению с
иммунологическими, состоит в возможности их использования при
латентных и хронических инфекциях для широкого спектра патогенных
микроорганизмов, а также определять генетическое родство
возбудителей [153].
Молекулы ДНК разных микроорганизмов отличаются друг от
друга содержанием пуриновых и пиримидиновых оснований, которые
формируют комплементарные пары в антипараллельных цепях ДНК.
Близкородственные микроорганизмы имеют идентичное или схожее
содержание ГЦ-пар в ДНК, а далеко отстоящие в генетическом
отношении сильно отличаются по относительному содержанию этих
азотистых оснований.
Более тонким методом оценки генетического сходства организмов
является метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, с
помощью которого определяют число и степень сходства гомологичных
участков в геномах сравниваемых видов [154].
В настоящее время наиболее приемлемой филогенетической
системой классификации прокариот является система, основанная на
сопоставлении последовательности нуклеотидов в 16 S РНК. Эта
система положена в основу «Руководства по систематической
бактериологии Берджи» 2001 года. По Берджи пастереллы относятся к
Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Pasteurellales,
Pasteurellaceae, Pasteurella [90].
Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и Escherichia coli
принадлежат к γ подразделу протеобактерий, и включают очень много
патогенных Гр- бактерий. Проведенный сравнительный анализ всего
генома позволяет исследовать сравнительную эволюцию этих
организмов в геномной лестнице. Установлено эволюционное родство
между Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и Escherichia coli
[155].
В 1985 году появилась первая статья, описывающая революциони-
зирующую технологию - полимеразную цепную реакцию - ПЦР.
Множественные (амплифицированные в миллион раз) копии опре-
деленных фрагментов ДНК получают in vitro с помощью ПЦР. В
настоящее время, метод ПЦР или специфической амплификации ДНК
широко используется как для диагностики, так и для дифференциации
различных групп микроорганизмов. ПЦР поднимает лабораторную
диагностику на иной уровень определения ДНК или РНК, что позволяет
19
прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации.
Внедрение метода в лабораторную практику стало одним из наиболее
важных событий в медицине и ветеринарии за последнее время. По
данным журнала Labmedica International с 1995 г. наблюдается
увеличение расходов на ПЦР-диагностику, что является показателем
роста ее использования. В 1996 г. на ДНК-диагностику было потрачено
181.6 млн. долларов, а в 2002 г. затраты возросли до 1400 млн. долларов
[156,157] .
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – искусственный процесс
многократного копирования – амплификации, специфической
последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. Копирование ДНК
при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНК-полимеразой,
как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по
одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей
последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать
синтез цепи ДНК "с нуля", ей необходима короткая "затравочная" цепь
ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды.
Существуют различные подходы к использованию ПЦР для
диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный
вариант ПЦР предусматривает использование праймеров,
комплементарных специфической последовательности ДНК,
характерной для строго определенного вида микроорганизмов (specific
PCR).
Имеется также возможность использования сразу нескольких пар
видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для
одновременной амплификации ДНК различных возбудителей –
множественная ПЦР (multiplex PCR) [158,159]. Множественная ПЦР
может быть использована для выявления этиологической роли
различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного
типа. В ветеринарной практике, точность ПЦР имеет меньшее значение
в виду того, что ветеринарные инфекционисты работают с группами
животных, в отличие от медиков. Поэтому для ветеринарии
мультиплексные ПЦР перспективны не только для типирования культур
микроорганизмов в процессе микробиологических исследований, но и
для работы с патологическим материалом [160].
Альтернативный подход в ПЦР диагностике связан с
использованием универсальных праймеров, которые позволяют
амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех
микроорганизмов определенной таксономической группы: небольших
(рода, семейства) или крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа.
В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются
рибосомные гены (16S и 23S), которые имеют сходную структуру у
различных прокариотических организмов. Полученные в
20
результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем
идентифицированы молекулярными методами (секвенирование), чтобы
сравнить амплифицированную ДНК с соответствующими
последовательностями известных видов. [161,162,163,164,165].
На практике обычно используют менее трудоемкие и
дорогостоящие методы, чем секвенирование которые, тем не менее,
позволяют достоверно выявлять определенные различия в
последовательности ДНК фрагментов. Наиболее распространенными
являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК
участков расщепления ферментами-рестриктазами – метод ПДРФ –
полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. ПЦР с
использованием универсальных праймеров может применяться как для
идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и
для прямой диагностики широкого спектра возбудителей
непосредственно в клинических образцах. Следует, однако, отметить,
что чувствительность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по
сравнению с «видоспецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с
универсальными праймерами обычно не используется для исследования
образцов, в которых может находиться большое количество различных
микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции,
полученных в результате амплификации ДНК разных видов
[166,167,168].
ПЦР широко используется не только для идентификации, но также
и для субвидового типирования и анализа генетического родства
(клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно, при
проведении эпизоотологических исследований. По сравнению с
традиционными фенотипическими методами, генотипирование на
основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем
дифференциации, возможностью использования количественных
методов для оценки идентичности штаммов и высокой
воспроизводимостью. На практике выбор определенного метода
типирования зависит от характера и целей проводимого
эпизоотологического исследования, с учетом видовой принадлежности
штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня
дифференциации и т.д.
Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования, общим для
большинства из них является использование гель-электрофореза для
отдельного штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных
электрофоретических профилей, проводимый визуально или с помощью
компьютера, позволяет оценить степень генетического родства
исследуемых штаммов [169,170,171].
Для визуализации результатов амплификации используют
различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день
21
является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК
по размеру. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от
минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся
быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет
концентрация агарозы, напряженность электрического поля,
температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени,
ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой
скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными
группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза,
продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр
трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне
(254, 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260
нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-
красной области видимого спектра (590 нм). Яркость полос продуктов
амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦР-
лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или
пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя
связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто
уменьшение яркости свечения полос связано со снижением
эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других
факторов [172,173].
Метод вертикального электрофореза. Метод вертикального
электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом.
Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы
используют полиакриламид. Его проводят в специальной камере для
вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле
имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным
электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров
с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного
геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является
токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер
продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко,
то в рутинной работе этот метод не используют . [174,175]
Другой способ детекции продуктов амплификации основан на
гибридизации олигонуклеотидных зондов (искусственно
синтезированных участков ДНК) с продуктами амплификации,
содержащими ту или иную метку, детектируемую специальными
приборами. В этом случае чаще всего используют плашечный формат и
систему детекции, аналогичную используемой в ИФА.
Гибридизационные методы не получили пока широкого
распространения из-за их дороговизны, длительности и трудоемкости
методических манипуляций. Однако они интересны с точки зрения

22
массового скрининга, т.к. при наличии соответствующего оборудования
могут быть легко автоматизированы [176,177,178,179].
Разработка праймеров для ПЦР является самым ответственным
звеном в создании диагностикума. Требуется подобрать такой фрагмент
молекулы ДНК, который бы отличался генетической консервативностью
и присутствовал бы только у интересующего вида микроорганизмов или
в исследуемом гене. При этом длина такого фрагмента должна
составлять 15- 30 нуклеотидов. Проделать эту работу помогают
специальные компьютерные программы, использующие информацию о
нуклеотидной последовательности известных микроорганизмов или
генов человека.
Дизайн праймеров (primer design) дословно с английского можно
перевести как моделирование или конструирование праймеров.
Сочетание из этих слов появилось вместе с тем, как была открыта
полимеразная цепная реакция [180,181].
Дизайн праймеров – это не просто выбор праймеров. Сложность
проводимой предварительной теоретической работы, связанной с
дизайном праймеров, в значительной степени зависит от их дальнейшего
назначения (применения). В ходе протекания полимеразной цепной
реакции образуется продукт, называемый амплификатом. Амплификат
содержит смесь ампликонов – основного, специфического, и побочных,
неспецифических – отдельных продуктов реакции, отличающихся друг
от друга длиной фрагмента (молекулярной массой). В идеале – это
образование одного основного ампликона, который и является
специфическим для выбранной пары праймеров
[182,183,184,185,186,187].
Праймер, используемый в ПЦР, имеет специальное название –
амплимер.
Конструирование праймеров проводится для решения одной из
следующих задач:
1 Получение ПЦР-фрагмента, несущего видоспецифическую
нуклеотидную последовательность, для диагностики какого-либо
заболевания (инфекционного или генетического);
2 Получение ПЦР-фрагмента, содержащего интересуемую
нуклеотидную последовательность (ген, регуляторный элемент и т.п.)
для клонирования в экспрессионный вектор или создания новых
генетических конструкций;
3 Получение ПЦР-фрагмента, содержащего интересуемую
нуклеотидную последовательность (ген, регуляторный элемент и т.п.)
для последующего прямого секвенирования – определения первичной
нуклеотидной последовательности – или для клонирования в вектор с
целью последующего секвенирования;

23
 4 Получение ПЦР-фрагмента, несущего родо- или
видоспецифическую нуклеотидную последовательность, для
дифференциальной диагностики в пределах рода или таксона более
высокого порядка;
5 Получение смеси специфических ПЦР-фрагментов в ходе
проведения мультиплексной ПЦР для одновременной диагностики
одного или нескольких заболеваний (инфекционных и/или
генетических) [188].
Подбор эффективных праймеров – процесс эмпирический,
соблюдение определенных требований увеличивает вероятность
получения хороших праймеров: нужно выбирать праймеры с
содержанием GC пар =50% и случайным распределением оснований.
Следует избегать использования праймеров с протяженными
полипуриновыми, полипиримидиновыми и другими неординарными
последовательностями, а также последовательностей с устойчивыми
вторичными структурами.
Необходимо поверять затравки на комплементарность друг
другу, очевидно, что праймеры отжигающиеся с друг другом не смогут
участвовать в амплификации интересующей нас последовательности.
Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций
делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве
критерия при выборе праймеров специфичности. При попадании на
такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие –
ложноотрицательный результат. Иными словами, если предполагается
разработать видоспецифический праймер на какой либо микроорганизм,
выбирается именно та зона, которая удовлетворяет этим требованиям в
пределах нуклеотидных последовательностей генома данного вида. И,
наоборот, в этих последовательностях должны быть как можно более
существенные отличия среди всех близкородственных видов
[189,190,191,192,193].
Среди множества различных направлений клинической
диагностики ветеринарная микробиология занимает, пожалуй,
лидирующее место по количеству и разнообразию приложений,
использующих технологию ПЦР. Внедрение в практику этого метода
существенно расширило возможности современной практической
микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы
выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных
питательных средах. Hunt ML, Adler B, Townsend KM. в статье «The
molecular biology of Рasteurella multocida» отмечают, что современные
молекулярные методы, такие как ПЦР, анализ ферментной рестрикции,
риботипирование, пульс гель электрофарез, генное клонирование,
характеристика и экспрессия рекомбинантных белков, мутагенез, анализ
плазмид и бактериофагов и геномная картография, очень увеличили
24
наше понимание Pasteurella multocida, и предоставили исследователям
много молекулярных инструментов для изучения патогенеза и
эпизоотологии данного возбудителя на молекулярном уровне [194].
Учеными многих стран проводятся исследования по разработке
различных методов ПЦР для идентификации штаммов Pasteurella
multocida. Biswas A, Shivachandra SB, Saxena MK, Kumar AA, Singh VP,
Srivastava SK. отмечают, что молекулярные методы выявления и
типирования превосходят обычные методы исследований
геморрагической септицемии [195].
Miflin JK, Blackall PJ., с целью разработки быстрого
диагностического теста для идентификации Pasteurella multocida,
разработали ПЦР анализ, используя праймеры полученные на
последовательность гена 23 rRNA Pasteurella multocida. ПЦР
исследование правильно идентифицировало все 144 исследованных
изолята Pasteurella multocida, включая штаммы трех подвидов и
референтные штаммы для типирования по схеме Heddleston и Carter. Из
20 проверенных близкородственных бактерий из семейства
Pasteurellaceae только штаммы типа Pasteurella canis biovar 2 и Pasteurella
avium biovar 2 были положительны. Эти две бактерии, прежде известные
как Bisgaard Таксон 13, являются самыми близкими филогенетическими
родственниками Pasteurella multocida, основанными на 16S
рибосомальной рРНК. Все проверенные филогенетически несвязанные
штаммы других возбудителей, выделенные от птиц и свиней, были
отрицательны. Данный метод на основе ПЦР позволяет быстро
идентифицировать колонии Pasteurella multocida птичьего или свиного
происхождения. Авторы рекомендуют использовать данную
модификацию ПЦР для быстрой и точной диагностики холеры
домашней птицы и пастереллеза свиней [196].
Sellyei B, Varga Z, Ivanics E, Magyar T охарактеризовали и
сравнили биохимическими тестами, методами капсульного типирования
ПЦР и ERIC-ПЦР 61 штамм Pasteurella multocida, выделенные от
различных видов птиц, представляющих различные географические
области Венгрии. По результатам исследований, основанным на анализе
группы штаммов, были выделены четыре большие и четыре
минигруппы, которые показали значительную корреляцию с
географическим происхождением и видом хозяина. Результаты их
исследований показали, что ERIC-ПЦР может быть подходящей
методикой для изучения адаптации Pasteurella multocida к хозяину и
эпизоотологии возбудителя пастереллезов домашней птицы [197].
Saxena MK, Kumar AA, Chaudhari P, Shivachandra SB, Singh VP,
Sharma B. оценивали применимость риботипирования основанного на
16S рРНК и 23S рРНК. Были риботипированы 48 изолятов Pasteurella
multocida изолированных от различных хозяев и географических мест
25
Индии и один референтный изолят. Исследователями выявлено только
четыре риботипа. Все изоляты, включая референтный от диких
плотоядных животных, имели один и тот же риботип, хотя у них были
различные серотипы. Один изолят от тигра имел дополнительную
группу к представленным в главном риботипе группам. Изоляты от
львов представляли два риботипа; из этих риботипов один (r2) имел
дополнительную группу 3.6 kbp, которая отсутствовала во всех других
риботипах. У второго риботипа (r4) от льва отсутствовала одна группа
(6 kbp), которая присутствовала в другом риботипе. Изоляты были
далее типированы, используя методы ERIC-ПЦР и REP –ПЦР, в
результате чего были получены индексы дискриминации (D) 0.83 - 0.89.
Данное исследование показало, что риботипирование не очень
эффективный инструмент молекулярной эпизоотологии для видовой
дифференциации изолятов [198].
Liu D, Lawrence ML, Austin FW. идентифицировали два гена -
Pm0762 и Pm1231 - уникальных для P. multocida. Используя
разработанные для этих генов олигонуклеотидные праймеры
(Pm0762F/R и Pm1231F/R), получили специфичные продукты ДНК
ожидаемых размеров только от геномной ДНК P. multocida. Результаты
их исследований показали, что предполагаемые гены регуляторы
транскрипции - Pm0762 и Pm1231 - являются специфичными для видов
P. multocida и методы ПЦР, предназначающиеся для этих генов,
обеспечивают быструю и точную идентификацию P. multocida от других
бактерий; способствуют объяснению ролей и функций этих генов и их
белковых продуктов, а также являются ценными для понимания
молекулярного механизма вирулентности P. multocida [199].
Nagai S, Someno S, Yagihashi T. разработали ПЦР анализ для
дифференцирования вирулентных штаммов Pasteurella multocida subsp.
multocida от авирулентных штаммов на основе toxA гена. Был
амплифицирован toxA ген, кодирующий 143-kDa дермонекротического
токсина, который, как полагают, является центральным этиологическим
фактором прогрессирующего атрофического ринита свиней.
Полученные результаты ПЦР 187 областей ДНК изолятов P. multocida,
были совместимы с результатами тестов на коже морских свинок и
анализа иммуноблотинга [200].
Fisher MA, Weiser GC, Hunter DL, Ward AC. провели исследования
методом ПЦР для определения леукотоксина lktA - структурного гена
Pasteurella - в изолятах Pasteurella haemolytica и P trehalosi и
коррелляции их бета – гемолитической деятельности с обнаружением
lktA гена. Производство и секреция леукотоксина - главный фактор
вирулентности, когда другие условия благоприятны для развития
болезни. Было исследовано147 изолятов Pasteurella haemolytica от 21
биовариантных групп, и 101изолят Pasteurella trehalosi от 7
26
биовариантных групп. LktA ген был обнаружен в 108 (44 %) изолятах,
включая 15 связанных с болезнями дыхательных путей. Все кроме 2 (98
%) изолятов, у которых был lktA ген, были бета-гемолитиками когда
выращивались на кровяном агаре овец [201].
Boucher DJ, Adler B, Boyce JD. использовали множество методов,
чтобы идентифицировать факторы вирулентности Pasteurella multocida,
включая технологию экспрессии in vivo (IVET). Ими был
сконструирован изогенный штамм P. multocida , который не был
способен редуцировать нитриты при аэробных и анаэробных условиях,
таким образом, демонстрируя, что nrfE ген P. multocida является
существенным для редукции нитритов. Однако, nrfE мутант оставался
вирулентным для мышей. Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени показал,
что nrfE был отрегулирован независимым от nrfABCD покровителем,
который, вероятно, является сорегулятором в естественных условиях
[202].
С целью получения больших данных о молекулярной биологии
Pasteurella multocida Ewers C, Lübke-Becker A, Bethe A, Kiebling S, Filter
M, Wieler LH. исследовали методом ПЦР и ДНК-ДНК гибридизации
гены капсульного биосинтеза (capA, B, D, E, и F) и 14 вирулентно
ассоциативных генов 289 штаммов, изолированных от различных
клинически здоровых и больных животных. Как ожидалось, штаммы
капсульного типа были чрезвычайно адаптированы к крупному рогатому
скоту (92.3 %) и домашней птице (85.7 %), в то время как, capA (34.9 %)
и capD (58.1 %) - позитивные штаммы выделены от свиней. Значимое
количество capD-положительных штаммов выделены от мелкого
рогатого скота (34.9 %) и capF - в штаммах дикого типа от больного
крупного рогатого скота (2.2 %) и кошек (7.4). Гены toxA, tbpA и pfhA
предположительно так же, как гены капсульного биосинтеза, являются
важными эпидемиологическими генами маркерами для того, чтобы
характеризовать штаммы Pasteurella multocida [203].
Orth J.H., Aktories K., Kubatzky K.F. методами ПЦР выяснили, что
токсин Pasteurella multocida (PMT) вызывает активацию STAT белков, и
идентифицировали STAT1, STAT3, и STAT5 белки как новые цели PMT
индуцированных Galpha (q) сигналов. Поскольку конститутивная
активация STAT белков была найдена во многих раковых образованиях,
результаты данных исследований предлагают новый механизм
канцерогенной роли PMT [204].
Tang X, Zhao Z, Hu J, Wu B, Cai X, He Q, Chen H. в 2009 году
исследовали в общей сложности 233 изолята Pasteurella multocida на
чувствительность к 20 антибиотикам и присутствие 19 генов факторов
вирулентности (VFs), полученные от 2 912 случаев клинического
пастереллеза свиней в Китае. Частота антибактериальной
резистентности среди изолятов P. multocida, выделенных от свиней в
27
Китае, была выше чем, среди изолятов P. multocida, выделенных от
свиней в других странах, и 93 % изолятов показали многократную
устойчивость к антибиотикам. Профили резистентности указывают, что
цефалоспорины, флорфеникол, и флуороквинолон (fluoroquinolones)
были лекарствами наиболее активными против Pasteurella multocida.
Использование ПЦР показало, что факторы вирулентности (ptfA, fimA,
и hsf-2), факторы усвоения железа и наружные мембранные белки
распространены в большинстве свиных штаммов. Факторы
вирулентности - pfhA, tadD, toxA, и pmHAS, каждый, были
представлены в около 50 % штаммах. Различные факторы
вирулентности показали отдельные ассоциации с серогруппами:
сконцентрированные в серогруппе A, сконцентрированные в серогруппе
D, или находящиеся совместно в серогруппах A и D [205].
Townsend KM, Frost AJ, Lee CW, Papadimitriou JM, Dawkins HJ.
путем геномной гибридизации близкородственных изолятов Pasteurella
multocida, получили клоны, полезные для идентификации штаммов типа
B от других серотипов P. multocida, вызывающих геморрагический
сепсис. Олигонуклеотидные праймеры, разработанные на
последовательность этих клонов оказались ценными в разработке ПЦР
анализа для быстрой видо- и типоспецифичной идентификации
Pasteurella multocida, и типа B:2, в частности. Это исследование
показало, что пара праймеров сконструированная на
последовательности клона 6b (KTT72, и KTSP61) амплифицировала
специфичный фрагмент ДНК серотипов B:2, B:5, и B:2,5 P. multocida и
что праймеры, KMT1T7 и KMT1SP6 амплифицировали, уникальный для
всех проанализированных изолятов Pasteurella multocida продукт. По
мнению ученых, ПЦР амплификация, выполненная непосредственно на
бактериальных колониях или культурах представляет чрезвычайно
быстрый, чувствительный метод идентификации P. multocida [206].
Индийские ученые разработали метод ПЦР анализа, основанный
на последовательности гена hyaC-hyaD, для идентификации штаммов
Pasteurella multocida серогруппы A. Сконструированные
серогруппоспецифичные праймеры амплифицировали продукт
размером 564 пн геномной ДНК, выделенной из бактериальных клеток
или непосредственно бактериальных колоний. У этого метода,
обнаруживающего 10 нанограммов бактериальной ДНК была 100 %
специфичность для P. multocida серогруппы A. Метод nested ПЦР
привел к единственным 374 bp продуктам. Все пятьдесят изолятов, как
показал также анализ рестрикции полиморфизма длин фрагментов (
ПДРФ -RFLP) с BglII., были идентичны продуктам ПЦР [207].
Они изучили применимость обычных и молекулярных методов
для быстрого выявления и дифференцирования Pasteurella multocida
серогруппы B изолированных от индийских буйволов при вспышке
28
геморрагической септицемии в Индии. Было получено пять изолятов,
которые были подвергнуты фенотипической и генотипической
характеристике. Ни один из этих пяти изолятов, не мог быть
дифференцирован на основе культуральных, биохимических методов,
патогенности и антибактериальной чувствительности. Методы на
основе ПЦР были специфичными и чувствительными для быстрого
выявления и дифференцирования изолятов. Методами REP - ПЦР, ERIC-
ПЦР, ПЦР с одним праймером дифференцировали различные профили
всех пяти изолятов. У всех изолятов, генетический профиль отличался
от стандартного штамма P. multocida - P52. Однако, три изолята, имели
идентичные профили, тогда как, у каждого из оставшихся двух был
различный профиль. Исследование указывает на причастность многих
штаммов P. multocida к одной вспышке геморрагической септицемии
буйволов. Результаты также показывают, что молекулярные методы
выявления и типирования P. multocida превосходят обычные методы для
быстрых эпизоотологических исследований геморрагической
септицемии [208].
Также применимость молекулярных методов изучена для
обнаружения и дифференцирования штаммов Pasteurella multocida,
вовлеченных в две отдельных вспышки пастереллеза домашней птицы
на одной птицеферме. В общей сложности 12 и 18 штаммов P. multocida
выделенные из двух отдельных вспышек были подвергнуты
фенотипической и генотипической характеристике. Фенотипически, все
штаммы были подобны; однако методы ПЦР анализа были очень
специфичными и чувствительными для быстрого выявления и
дифференцирования штаммов. Все 30 штаммов дали ампликоны
приблизительно 460 п.о и 1 044п.о, специфичные для P. multocida и
капсульных серогрупп в мультиплексной капсульной ПЦР типирующей
системе. Молекулярные методы типирования, такие как REP -ПЦР ,
ERIC- ПЦР и ПЦР с одним праймером дифференцировали все 30
штаммов в различные профили. Однако, по результатам анализа
эндонуклеазной рестрикции, с использованием фермента HpaII, сходные
образцы фрагментов генома наблюдались среди всех штаммов.
Исследование показало причастность тех же самых многочисленных
штаммов P. multocida к двум вспышкам [209].
Pasteurella multocida состоит из трех подвидов, которые часто
дифференцируются ферментированием сорбита и дульцита. Hunt
Gerardo S, Citron DM, Claros MC, Fernandez HT, Goldstein EJ. изучили 35
дульцитол-отрицательных изолятов P. multocida, выделенных из
инфицированных укушенных ран собак и кошек, 16 из которых привели
к слабым или противоречивым реакциям сбраживания сорбитола, таким
образом мешая различать два дульцитол - отрицательных подвида P.
multocidа: P. multocida subsp. multocida и P. multocida subsp. septica. Все
29
изоляты, и два контрольных штамма далее были проанализированы,
используя ПЦР метод геномных «отпечатков пальцев» с одним
праймером (ядро M13) и по альфаглюколидазной активности (альфа-
Glu). По результатам данных исследований ПЦР метод геномных
«отпечатков пальцев» и оценка альфа-Glu деятельности являются
надежными методами дифференциации P. multocida subsp. multocida от
P. multocida subsp. septica, особенно в штаммах, которые слабо или
несоответственно ферментируют сорбитол [210].
Капсула штаммов ATCC 11039 серотипа А Pasteurella multocida
состоит из гиалуроновой кислоты и является важным фактором
вирулентности. Повторное субкультивирование определенных штаммов
капсульных серотипов приводит к диссоциации от капсульных до
акапсульных фенотипов с сопутствующей потерей вирулентности. Хотя
акапсульные варианты, как полагали, возникли в результате мутации,
молекулярные механизмы, лежащие в основе этого процесса,
неизвестны. Watt JM, Swiatlo E, Wade MM, Champlin FR.
продемонстрировали, что восстановление капсульного фенотипа
происходит в естественных условиях в результате внутрибрюшинного
заражения мышей BALB/c акапсульным вариантом. Кроме того, анализ
ОТ-ПЦР показал капсульный локус, находящийся под
транскрипционным контролем. Клонирование и секвенирование 290-п.о.
фрагмента в пределах промотора, содержащего интергенный регион
капсульного локуса 11039/iso, показали, что после субкультивирования
не произошло никаких существенных изменений. Эти результаты
демонстрируют, что штамм ATCC 11039 серотипа А P. multocida,
регулирует капсульную экспрессию в ответ на неопознанный фактор
среды, таким образом обеспечивая способность проникновения в суть
молекулярных механизмов, лежащих в основе диссоциации колоний
[211].
Shivachandra SB, Kumar AA, Chaudhuri P. использовали REP-
ПЦР, ERIC - ПЦР, и ПЦР с одним праймером для молекулярной
характеристики 66 птичьих штаммов Pasteurella multocida серогруппы
A:1, изолированных от разных видов птиц, из различных областей
Индии. REP- ПЦР привела к амплификации повторных
последовательностей генома, в диапазоне примерно от 200 до 3000 п.о.,
которые составляли в общей сложности 54 различных профиля
(D=0.99). Анализ ERIC-ПЦР также произвел амплифицированные
продукты в диапазоне приблизительно от 200 до 3200 п.о.,
категоризирующие штаммы в общей сложности 50 различных профилей
(D=0.98). Амплификация повторных областей, используя
микросателлитные праймеры (GTG), привела к четко
дифференцированным группам в пределах приблизительно от 200 до
2400 п.о. Штаммы были разделены на 43 профиля (D=0.96). Генотипные
30
профили птиц-хозяев не коррелировали с географической областью их
происхождения. Птичьи штаммы P. multocida серогруппы A:1, были
очень гетерогенными с разнообразными профилями. Метод REP-ПЦР,
как показали исследования, очень специфичен и прост для
дифференцирования фенотипически подобных штаммов. Данное
исследование также показало, что ПЦР основанный на амплификации
повторных областей P. multocida – быстрый метод с хорошей
дискриминацией, который может использоваться непосредственно для
рутинного типирования изолятов выделенных при вспышках
пастереллезов домашней птицы [212].
Leotta GA, Chinen I, Vigo GB, Gugliada J, Rivas M. провели
исследования для оценки двух методов молекулярного типирования -
ERIC-ПЦР и Apal-PFGE, с целью изучения Pasteurella multocida. Были
определены видовые особенности, воспроизводимость, и отличительные
особенности, для установления генетического родства штаммов P.
multocida. Были изучены сорок девять штаммов из различных
источников, биотипов, капсульной группы, соматических серотипов, и
резистентности к антибактериальным препаратам. В ERIC-PCR был
определен 31 образец 10 - 14 групп в размере 0.2 и 1.2 КБ. В Apal-PFGE
были установлены 37 рестриктированных образцов 7 - 15 групп в
размере 34 - 450 КБ. Типоспецифичность составляла 100 % (T=1) для
ERIC-PCR, и 94 % (T = 0.94) для Apal-PFGE. Воспроизводимость обоих
методов составляла 100 %, разделение на профили составляло 93 % (D =
0.93) для ERIC-ПЦР, и 98 % (D = 0.98) для Apal-PFGE. При
использовании обоих методов, эпизоотологически связанные штаммы
были сгруппированы, несвязанные штаммы были четко
дифференцированы [213].
Бельгийскими учеными был исследован 141 изолят Pasteurella
multocida, и 34 изолята Mannheimia haemolytica sensu lato, выделенных
из верхних дыхательных путей здоровых телят, для сравнения
классического фенотипирования с тДНК – ПЦР генотипированием, и с
другой стороны, попарным сравнением результатов дисковой диффузии
в агаре для семи антибактериальных составов (ампициллин, цефтиофур,
окситетрациклин, гентамицин, флорфеникол, энрофлоксацин и
триметоприм. Фенотипирование и генотипирование хорошо
коррелировали (> 90 %). Попарные сравнения методов чувствительности
к антибиотикам были исследованы традиционно посредством расчета
погрешности обязательных норм специфичности и чувствительности и
особенностей методики. Специально определявшаяся чувствительность
для старых антибактериальных агентов (окситетрациклин, гентамицин,
триметоприм) часто оказывалась ниже 85 %. Почти для всех
антибактериально-бактериальных комбинаций специфичность
превысила 90%. Ученые пришли к заключению, что метод дисковой
31
диффузии надежен в эпизоотологических исследованиях как программа
мониторинга [214.]
Российские ученые Афонюшкин В.Н., Коптев В.Ю., Юшков Ю.Г.,
Шкиль Н.А. разработали мультиплексную ПЦР для детекции геномной
ДНК P. aerugenosa и микроорганизмов рода Pasteurella и синегнойной
палочки в патологическом материале сельскохозяйственной птицы.
Мультиплексная ПЦР позволяет контролировать наличие определенного
спектра микроорганизмов в одной реакции. По мнению ученых к
негативным факторам, ограничивающим применение мультиплексных
ПЦР в системе скрининга и мониторинга различных инфекций относят
более высокий риск неспецифических реакций ввиду наличия в
реакционной смеси нескольких пар праймеров и снижение
чувствительности реакции в связи с конкуренцией за компоненты
реакционной смеси при синтезе нескольких разных ампликонов [215].
Однако в ветеринарной практике, точность ПЦР имеет меньшее
значение ввиду того, что ветеринарные инфекционисты работают с
группами животных, в отличие от медиков. Поэтому для ветеринарии
мультиплексные ПЦР перспективны не только для типирования культур
микроорганизмов в процессе микробиологических исследований, но и
для работы с патологическим материалом.
Пастереллез и псевдомоноз с./х птицы обычно сопровождается
инфицированием одних и тех же органов и тканей (легкие, сердце,
паренхиматозные органы) поэтому использование мультиплексной ПЦР
будет вполне уместно для дифференциальной диагностики, в то же
время биологические особенности пастерелл и псевдомонасов не
создают существенных предпосылок для развития ассоциированных
инфекций. В этой связи, риск конкурентного ингибирования одной из
реакций – минимален.

1.3 Геном бактерии пастереллеза и кодируемые им белки

P. multocida является мультипатогенным возбудителем,
индуцирующим инфекционные патологии у многих видов
млекопитающих и птиц.
Из многочисленных факторов вирулентности P. multocida
наиболее значимыми являются полисахариды капсулы, эндотоксины или
липополисахариды, белки внешней мембраны, фимбрии и адгезины,
экзотоксины, внеклеточные ферменты (липаза, гиалуронидаза) и др. [].
В 2001 году Barbara J. May [216] c сотрудниками из Национального
центра токсикологии и безопасности питания университета штата
Мичиган методом случайного секвенирования и компьютерного
анализа провели исследования 53 000 фрагментов последовательностей
штамма Pm 70, которые были, затем собраны в одинарную циркулярную
последовательность 2 257 487 п.о.
32
 Геном Pasteurella multocida (Pm 70) – одинарная циркулярная
хромосома, состоит из 2 257 487 пар оснований в длину, содержит 2 014
потенциально кодирующих регионов, размером, в среднем, 998 п.о.,
которые составляют 89 % от всей хромосомы. Оставшиеся 11%
последовательностей – 6 полных рРНК оперонов (16S – 23S -5S); 57
тРНК генов представляют все 20 аминокислот и сравнительно
небольшое количество некодирующих элементов.
26% кодирующих последовательностей белков с неизвестными
функциями большей частью идентичны последовательностям белков,
расшифрованным в других полных микробиологических геномах.
Геном Pasteurella multocida кодирует целиком путь метаболизма
ферментов, цикл глюколизиса, глюконеогенезиса и трихлорацетиловой
кислоты. Этот путь также представлен в обоих геномах Haemophilus
influenzae и Escherichia coli. Геном Pasteurella multocida, подобно
геномам Haemophilus influenzae и Escherichia coli кодирует полностью
путь синтеза всех 20 аминокислот, а также пуриновых и
пиримидиновых нуклеотидов. В противоположность к Escherichia coli,
пути катаболизма нескольких аминокислот, включая аспарагин, лейцин,
гистидин, лизин и фенилаланин, отсутствуют у Haemophilus influenzae и
Pasteurella multocida. В этих бактериях представлен сложный путь
усвоения сульфатов, а также метаболизм нитратов и фолиевой кислоты.

Рисунок 1. Комплексное представление о факторах вирулентности

(генах), вовлеченных в патогенность Pasteurella multocida. Группы генов
выделеные отдельным цветом представляют собой разные факторы
вирулентности, их название выделенно жирным шрифтом.
По результатам определения и анализа полной нуклеотидной
последовательности генома P. multocida выявлено 104 гена,
ассоциированных с вероятными факторами вирулентности данного
микроорганиза, что составляет около 7% от всего генома P. midtocida.
Эти гены выполняют различные функции: адгезия и
33
проникновение в клетку хозяина, приобретение железа, порины
наружной мембраны, нейроминидазы, супероксид дисмутазы, выроботка
дерманекротоксина и гиалуронидаза. Образование капсулы является
одним из факторов вирулентности.

Таблица 1 – Гены, ассоциированные с вирулентностью Pasteurella

multocida

Наименование гена Выполняемые функции

ToxA dermanecrotoxin
pfhВ1/pfhB2 Filmentous hemagglutinin
hgbA hemoglobin-binding protein/iron uptake
hgbB hemoglobin-binding protein/iron uptake
exbBD-tonB Iron acquisition
nanH Neurominidase/sialidase
Psl porin
nanB Neurominidase/sialidase
omp H outer membrane protein H
omp87 Outer membrane protein 87
ptfA Type 4 fimbriae
sodА superoxide dismutase
sodC superoxide dismutase
tbpA transferrin binding protein
fimA fimbriae
hsf1 Autotransporter adhesion
hsf2 autotransporter adhesion
tadD putative nonspecific tight adherence protein
Fur ferric uptake regulation protein
pmHAS Hyaluronan synthase
ompA outer membrane protein A
plpB lipoprotein B
Rci recombinase
Dam DNA adenine methylase

Также в ходе данного исследования было установлено, что геном

данного вида пастерелл представлен одиночной циркулярной
хромосомой длиной 2.257.487 пар нуклеотидов и содержит 2.014
кодирующих 4 регионов, средний размер которых 998 п.н. (в сумме 89%
всей хромосомы). Оставшиеся 11% генома представлены шестью
оперонами рибосомальной РНК (16S-23S-5S) и 57 генами тРНК,
представляющими все 20 аминокислот, и относительно небольшим
количеством некодирующих элементов. Сравнительный анализ
первичной структуры микроорганизма показал наличие двухсот
кодирующих регионов (10%), уникальных для P. midtocida, а также 1421
и 1329 кодирующих регионов, гомологичных таковым в геномах
Hemophilus influenzae и Echerichia coli, соответственно [217]. В
34
результате исследований генетической организации биосинтетического
локуса капсулы были выявлены участки генома, обозначенные в
настоящее время как гены hyaD, bcbD, dcbF, ecbJ и fcbD, высоко
специфичные (уникальные) для каждой из 5 серогрупп (А, В, D, Е и F) P.
multocida и ассоциированные с синтезом характерного для каждой
серогруппы капсульного материала, что обеспечивает генетическую
основу для серологической дифференциации штаммов микроорганизма
[35,36].

Рисунок 2 - Циклическое представление генома Pasteurella

multocida, Pm70.

Внешний круг представляет собой масштаб выраженный в

базовых парах нуклеотидов. Внешние стрелки указывают на 57
оперонов tRNA, а внутренние стрелы представляют собой 6 оперонов
rRNA (16S-23S-5S). Цветами изображена гомология Pm с Escherichia coli
(Ec) и Haemophilus influenzae(Hi) во всех кодирующих
последовательностях, общая гомология как с Ec, так и с Hi (зеленый),
только с Ec (фиолетовый), только с Hi (светло-голубой), отличия Pm от
Ec и Hi (красный). Центральный круг представляет собой процентное
соотношение пары ГЦ к паре АТ: самый светлый розовый представляет
собой соотношение ГЦ до 25-30% в то время как самый темный участок
означает 45-50%. Цифра была получена на основе genescene
программного обеспечения (DNAstar).

35
 Суммарное соотношение Г и Ц нуклеотидов в геноме
микроорганизма составило 41%. Кроме того, в ходе исследований
генома были выявлены два новых потенциальных фактора
вирулентности P.multocida: волокнистые гемагглютинины pfhBl и pfhB2
- поверхностные белки, опосредующие тесную связь между бактерией и
клетками макроорганизма и соответствующие им кодирующие
нуклеотидные последовательности, проявляющие существенную
гомологию с геном волокнистого гемагглютинина Bordetella pertussis.
Авторы данной работы высказали предположение, что инактивация этих
двух факторов вирулентности Р. multocida - возможный путь к
усовершенствованию живых аттенуированных вакцин против
пастереллёза. Также было установлено, что более 2,5% генома P.
multocida составляют гены, кодирующие белки, вовлечённые в
транспорт и регуляцию обмена железа в микроорганизме, такие как
yfeABCD, fbpABC, fecBCD, HemBHUL, AfuAB, CcmABCD, ртОЗОО,
ртОЗЗб, pm0741, pm0803, локус генов TadABCDEFG, ген Fur и другие
гены. Исследованию подверглись так же и другие гены P.multocida,
такие как гены, кодирующие белки наружной мембраны, являющиеся
основными антигенными детерминантами P.multocida, гены ,
ассоциированные с устойчивостью микроорганизма к антибиотикам
(МикЕ, MukF, AmpD, TehD, AcrB, LytB, TolQ, TolR, Bcr и др.), гены
вовлечённые в биосинтез аминокислот и ассимиляцию азота (asnG, aspC,
dppA, gdhA, и ilvH гены), гены, кодирующие белки теплового шока
бактерии (DnaK, DnaJ, GroEL, DjlA, GrpE, HslU и др. гены), гены
вовлечённые в процесс хемотаксиса P. multocida, а именно кодирующие
протеины фимбрий (Hsfl и Hsf2), а также множество других генов,
ассоциированных с различными процессами микроорганизма, такими
как трансляция, транскрипция, репликация, рекомбинация, транспорт
аминокислот, нуклеотидов и липидов и другие. Несмотря на это,
функции и продукты многих генов остаются неизвестными до
сегодняшнего дня [218].
Mannheimia haemolytica (прежнее название Pasteurella haemolytica)
— комменсал носоглотки и верхних дыхательных путей жвачных
животных, но также и первостепенный этиологический агент легочного
пастереллёза КРС и важнейший бактериальный патоген комплекса
респираторных заболеваний крупного рогатого скота [219].
M.haemolytica представляет собой грамотрицательную,
неподвижную, ферментирующую, не образующую спор,
оксидазаположительную, факультативную анаэробную биполярную
коккопалочку или палочку.
Микроорганизм входит в состав порядка Pasteurellales, семейства
Pasteurellaceae, рода Mannheimia.

36
 На сегодняшний день геном M. haemolytica расшифрован
практически полностью, его величина составляет 2 569 125 п.н. с
соотношением G+C нуклеотидов 41%. В результате данного
исследования в геноме данного микроорганизма были выявлены
различные нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки,
играющие роль регуляторов транскрипции M.haemolytica. В свою
очередь, регуляцией транскрипции обеспечивается синтез и активация
различных факторов вирулентности микроорганизма, что, возможно,
позволяет объяснить механизм взаимодействия M. haemolytica с
макроорганизмом, а именно переход от комменсализма к паразитизму и
изменение взаимодействия «микроорганизм-клетка» [220].
Наиболее полно изучен ген 16S RNA, один из самых
консервативных генов M. haemolytica, данные о нуклеотидных
последовательностях которого послужили основой при определении
филогенетического родства и разработки современной таксономии и
геносистематики микроорганизмов семейства Pasteurellaceae и рода
Mannheimia. Так же детально изучен оперон генов IktCABD,
кодирующих термолабильный лейкотоксин M. haemolytica.
Установлено, что синтез, активацию и секрецию лейкотоксина кодируют
четыре гена полицистронного оперона: ген IktC кодирует внутреннюю
ацилтрансферазу, необходимую для ацилации, продукции и
последующей активации ЛКТ (вероятно ациклично активирует IktA);
ген IktА кодирует структурный токин (белок 102 kDa); продукты генов
IktB и IktD способствуют секреции токсина.
По результатам некоторых исследований установлено, что из всех
генов оперона IktCABD ген IktD является наиболее консервативным, а
ген IktA наиболее полиморфным. Кроме этого, в исследованиях R. Davies
с соавт. (2001) показано наличие множества мозаичных по структуре
аллелей гена IktA, а проведённый филогенетический анализ штаммов
P.haemolytica от крупного и мелкого рогатого скота позволил установить,
что мозаичность и множество аллелей гена IktА может свидетельствовать
о процессах рекомбинации между генами IktA таких микроорганизмов
как M. haemolytica, M. glycosida и Pasteurella trehalosi [221].
Кроме генов, кодирующих лейкотоксин, на сегодняшний день
определены первичные структуры генов, кодирующих различные по
природе факторы вирулентности M. haemolytica, такие как ген sod А,
кодирующий супероксиддисмутазу - металлофермент, катализирующий
реакцию дисмутации супероксидных радикалов, защищающий клеточные
структуры от повреждающего действия радикалов кислорода.
Нуклеотидные последовательности гена sodA изучены для всех
представителей рода Mannheimia и для некоторых представителей других
родов семейства Pasteurellaceae. Кроме того, изучены ген отрА, ген папН,
гены lpp\-5 (pip А- Е), локус генов cap, гены IpsA и galE, кодирующие
37
белки наружной мембраны, нейраминидазу, липопротеины и
полисахариды [205,207].
Последовательности геномной ДНК кодируют всю наследственную
информацию, ответственны за микробиологическую репликацию,
вирулентность, высокую специфичность, способность противостоять
иммунной системе; знание обширного генома Pasteurella multocida как
патогена, дает всю необходимую информацию, нужную для
эффективных и целевых исследований в лечении, профилактике и
диагностике болезней, вызываемых этим возбудителем.
Thomas S. Whittam, Vivek Kapur [221] провели сравнительный
анализ полных геномов Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и
Escherichia coli. Были выровнены 1197 кодирующих
последовательностей всех 3 организмов, установлен процент
идентичности аминокислот в выравнивании. Установлено эволюционное
родство между Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и
Escherichia coli. Сравнение последовательностей позволило различить
200 кодирующих последовательностей (10%), уникальных для
Pasteurella multocida и 1197 кодирующих последовательностей
ортологичных геномам Haemophilus influenzae и Escherichia coli. Эти
результаты согласуются с тем, что они полностью близкородственны и
подтверждают классификацию этих бактерий в Υ подразделе
протеобактерий.
Состав полного генома Pasteurella multocida
Количество кодирующих последовательностей – 2014
Гомологичные пептидам – 1814
Гомологичные протеинам – 531
Кодирующие последовательности уникальние для Pasteurella multocida -
200
Гомологичные Haemophilus influenzae - 1421
Гомологичные Escherichia coli - 1392
Ортологичные Escherichia coli - 223
Ортологичные Haemophilus influenzae - 195
Содержание GC пар - 41%
Средний молекулярный вес белков - 37,081Кд
Средний размер генов - 997 п. о
тРНК - 57
рРНК опероны -6

Анализ данных литературы показал, что пастереллезная инфекция

имеет широкое распространение во многих странах, в том числе и в
Республике Казахстан. На территории Казахстана, согласно данным

38
ветеринарной отчетности, имеются энзоотические вспышки
пастереллеза среди крупного рогатого скота, лошадей, свиней, птиц.
К пастереллезу восприимчивы крупный рогатый скот, лошади,
мелкий рогатый скот, буйволы, козы, свиньи, грызуны, кошки, собаки,
дикие животные, домашние и дикие птицы.
Пастереллез распространен повсеместно, но чаще регистрируется
в странах с тропическим и субтропическим климатом . Достаточно
широко пастереллез распространен на территориях стран СНГ, в том
числе и в Казахстане. Летальность при пастереллезе колеблется от 10 до
100%.
Диагноз пастереллеза ставится комплексно, с учетом данных
эпизоотологии, клиники, данных патологоанатомических изменений и
бактериологического исследования. Каждый из методов диагностики
имеет ценность лишь в совокупности с другими методами, в
особенности с результатами патологоморфологических и лабораторных
исследований.
Обнаружение у заболевших животных сходной с пастереллезом
клинической картины не дает права ставить диагноз на пастереллез, так
как имеется ряд заболеваний, клиническое течение которых очень
напоминает пастереллез. Патологоанатомические данные достаточно
выражены при остром течении пастереллеза, но не патогномоничны, и
ставить диагноз только на основании их нельзя.
Для бактериологического исследования в лабораторию посылают
отдельные органы. Выделение культуры пастерелл при
бактериологическом исследовании без учета результатов, полученных
другими диагностическими методами, также не дает оснований для
постановки диагноза на это заболевание, так как при пастереллезе
наблюдается широкое бактерионосительство как среди переболевших,
так и среди клинически здоровых животных, контактировавших, а
иногда и неконтактировавших с животными неблагополучных хозяйств.
Совокупность сведений по эпизоотологии, клинической и
патологоанатомической картине дает право на постановку
предварительного диагноза, результаты же бактериологических и
биологических исследований позволяют поставить диагноз
окончательно.
Серологический диагноз при пастереллезе имеет меньшее
значение, чем такие методы диагностики, как бактериологический и
биологический, так как болезнь протекает быстро. Но с целью
своевременного и более полного выявления и в неблагополучных и в
благополучных хозяйствах скрытых больных и животных-
пастереллоносителей применение серологических реакций имеет
немалое значение.

39
 Для серологической диагностики используют реакции
агглютинации, связывания комплемента, преципитации,
гемагглютинации, адсорбции агглютининов и другие.
Реакцию агглютинации (РА) пробовали применять для выявления
птиц-пастереллоносителей, но отсутствие стандартных антигенов не
позволяло дать объективную оценку этому методу диагностики, хотя
S.Nomioka и M.Murata довольно успешно с помощью реакции
агглютинации разделили соматические антигены на несколько групп.
На сегодняшний день наиболее часто используемым
диагностическим методом для диагностики пастереллеза является ИФА-
диагностика. В настоящее время в России и Казахстане для
исследований на пастереллез животных используется набор для
выявления антител к возбудителю пастереллеза (Pasteurella multocida)
иммуноферментным методом фирмы «Synbiotics Europe» (Франция).
Являясь косвенным методом, ИФА определяет лишь белки-маркеры -
продукты жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь
опосредованное свидетельство наличия инфекции.
В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА), ПЦР-
диагностика позволяет определять непосредственно возбудителя
заболевания. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что
в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только
для данного возбудителя фрагмент ДНК. Высокая чувствительность
метода позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или
вирусов. К преимуществам метода можно отнести высокую скорость
получения результата анализа и возможность диагностики острых,
вялотекущих и скрытых инфекций.
Результаты исследований, проведенные учеными разных стран,
также показывают, что молекулярные методы выявления и типирования
Pasteurella multocida превосходят обычные методы в случае
необходимости быстрых эпизоотологических исследований
геморрагической септицемии и могут использоваться в
эпизоотологических исследованиях как программа мониторинга.
Современные молекулярные методы, такие как ПЦР, анализ
ферментной рестрикции, риботипирование, пульс гель электрофарез,
генное клонирование, характеристика и экспрессия рекомбинантных
белков, мутагенез, анализ плазмид и бактериофагов и геномная
картография, очень увеличили понимание Pasteurella multocida, и
предоставили исследователям много молекулярных инструментов для
изучения патогенеза и эпизоотологии данного возбудителя на
молекулярном уровне.
Оценка двух методов молекулярного типирования - ERIC-ПЦР и
Apal-PFGE позволила сгруппировать эпизоотически связанные штаммы
и четко дифференцировать несвязанные штаммы, что дает возможность
40
изучения видовых особенностей, воспроизводимости и отличительных
особенностей, установления генетического родства штаммов Pasteurella
multocida [222].
Метод ERIC-ПЦР может использоваться непосредственно для
рутинного типирования изолятов, выделенных при вспышках
пастереллезов домашней птицы и крупного рогатого скота.
Методами nested ПЦР и ПЦР- ПДРФ (анализ рестрикции
полиморфизма длин фрагментов) проводится серотипирование.
По сравнению с традиционными фенотипическими методами,
генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более
глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования
количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой
воспроизводимостью. На практике выбор определенного метода
типирования зависит от характера и целей проводимого
эпизоотологического исследования, с учетом видовой принадлежности
штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня
дифференциации и т.д.
Несмотря на все преимущества методов ПЦР, классические
методы исследования не утратили своего значения и при постановке
диагноза на пастереллез должны учитываться, по мере необходимости,
результаты бактериологических и серологических методов
исследований.
Из вышеизложенных данных можно заключить, что для
диагностики бактериальных инфекций в зарубежных странах
внедряется метод ПЦР и его различные модификации. Понятно, что
внедрение и владение подобными аналитическими методами
молекулярной диагностики в практике эпизоотологии требует
определенного финансирования и повышения профессиональной
дисциплины и порядка в отрасли, но контроль, надзор и эпизоотический
мониторинг состояния здоровья животных и внешней среды стоит того
и обязывает ветеринарную науку и практику иметь и использовать
современные точные экспресс-методы в своей деятельности [223].
Поэтому разработка, адаптирование и внедрение в ветеринарную
практику в РК тест-системы (праймера) для диагностики пастереллеза
крупного рогатого скота на основе ПЦР – требование сегодняшнего дня.
На основе анализа данных литературы, нами определены
основные направления работы, а именно, изучение распространенности
пастереллеза, определение биологических свойств возбудителя
пастереллеза, разработка метода диагностики пастереллеза крупного
рогатого скота на основе полимеразной цепной реакции.

41
 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы и методы иследований

Исследования проводили в лаборатории «Молекулярной биологии
и генной инженерии вирусов» НИИПББ НЦБ РК, лаборатории
противобактериозной биотехнологи КазНАУ, НИЦ КГУ им. А.
Байтурсынова, хозяйствах Костанайской и Алматинской областей.
Эпизоотическую ситуацию по пастереллезу сельскохозяйственных
животных за 5 лет изучали по данным отдела ветеринарного надзора
областного территориального управления МСХ РК, Костанайского
областного филиала РГКП «Республиканская ветеринарная
лаборатория», по результатам собственных исследований по
диагностике пастереллеза крупного рогатого скота.
Для проведения экспериментальных работ исследовано 64 пробы
патологического материала от 29 голов крупного рогатого скота из
хозяйств в п. Прогресс, с/о Айдарлы, п. Челгаши Карасуского района,
ТОО «Восток», АО «Север» Мендыкаринского района, ТОО
«Викторовское» Тарановского района Костанайской области и СХПК-
П3 «Алматы -2» Алматинской области.
Всего было выделено 8 изолятов пастерелл, отобрано и
подвергнуто всестороннему изучению биологических свойств 3
эпизоотических штамма пастерелл( К1,К2,А1) и 1 эталонный штамм
Pasteurella multocida 90 из музея лаборатории противобактериозной
технологии КазНАУ.
В лабораторных опытах использовано 35 белых мышей живой
массой 16 – 18 г.
Для определения специфичности метода ПЦР при диагностике
пастереллеза крупного рогатого скота использовали штаммы из
коллекции лаборатории противобактериозной биотехнологии КазНАУ:
- штамм Pasteurella multocida 90, 26, 46
- штамм Escherichia coli
- штамм Salmonella dublin
- Salmonella typhimurium
- штамм Listeria monocitogenes
- штамм Brucella abortus
- штамм Mycobacterium bovis
В работе использовали питательные среды: МПА, МПБ, бульон и
агар Хоттингера с добавлением 5% сыворотки крови лошади.
Среды и растворы.
В работе использовали следующие среды и растворы: 5 М NaCl, 3 M
NaOH, 10 % БСА, 3 М ацетат натрия, 10 мМ дНТФ, 7 % уксусная
кислота, 20 %, 30 %, 40 %, 60 % растворы сахарозы, 0,5 M ЭДТА, рН 8,0,

42
10 % ДСН, 10 мг/см3 этидиум бромида, 2 % ФВК, рН 6,8, 1 М KOH, 10
мг/см3 протеиназа К, 1 М Трис-HCl, рН 8,0, 96 % и 70 % этанол.
TВE: 89 мМ Трис-борат, рН 8,0, 2 мМ ЭДТА

ТАЕ : 40 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 2 мМ ЭДТА

ТЕ: 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА

Протеиназный буфер: 0,3 М NaCl, 25 мМ ЭДТА, 2 % ДСН,

0,2 М трис-HCl, рН 7,5

Буфер для проб (2): 100 мМ Трис-HCl, рН 6,8,

20 % (в/о) глицерин,
4 % (в/о) ДСН,
0,001 % (в/о) БФС,
2 % (о/о) 2-меркаптоэтанол,

Электрофорезный буфер 125 мМ Трис-HCl, 0,5 % (в/о) ДСН,

(5): 0,96 М глицин

Буфер для нанесения проб: 80 % (о/о) формамид,

1 мМ ЭДТА, рН 8,0,
0,1% (в/о) бромфеноловый синий,
0,1% (в/о) ксиленцианол

4х Трис-Cl/ДСН, рН 8.8 1,5 M Трис довести рН до 8,8 1n NaCl, 0,4

% ДСН

Буфер для ПЦР 100 мM Трис HCl, pH 8,3, 15 мM MgCl2,

750 мM KCl

Буфер для отжига (×5): 200 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2,

250 мМ NaCl

Оборудование:
- синтезатор олигонуклеотидов Expedite 8909, Applied Biosystems;
- термоциклер с градиентом температур Mastercycler gradient;
- УФ бокс UVS/ T-M, Латвия;
- РНК/ДНК калькулятор GenQuant Pro RNA/DNA Calculator,
Amersham-Pharmacia-Biotech;
- аналитические весы AB 204-5/A, Mettler Toledo;
- рН-метр Delta 320 Mettler Toledo;
43
 - универсальная цифровая система документации Infinity 115;
- термоплаты Thermomixer compact, Eppendorf;
- шейкеры, вортексы Vortex Genie 2 Shaker, МультиСпин MSС -
3000;
- автоматические микропипетки, Eppendorf;
- аппарат для горизонтального электрофореза нуклеиновых кислот
HU 25, Scie - Plas;
- цифровой фотоаппарат для фотографирования гелей, Olympus;
- пакет прикладных программ для анализа последовательностей ДНК
- DNASYS MAX 1.0, Sequencher, Vector NTI, BioEdit, GENEDOC, Staden
package.
- рефрижираторная микроцентрифуга " Centrifuge 5417R", Eppendorf
;
- низкоскоростная центрифуга "Centrifuge 5702", Eppendorf;
- микроцентрифуга "MiniSpin", Eppendorf;
- ультразвуковой дезинтегратор "MSE-150", MSE;
- источник питания "Electrophoresis Power Supply-EPS 3501",
Amersham-Pharmacia-Biotech.
Методы исследований.
Мониторинг эпизоотической ситуации по пастереллезу в
Костанайской области проводили по данным ветеринарной отчетности
Костанайской областной ветеринарной инспекции, Костанайского
филиала РГКП «Республиканская ветеринарная лаборатория»,
результатам собственных исследований.
Выделение эпизоотических штаммов Pasteurella multocida
проводили от больных и павших голов крупного рогатого скота из
хозяйств Костанайской и Алматинской областей. Культурально -
морфологические, биохимические, вирулентные свойства
эпизоотических штаммов пастерелл изучали по общепринятым
методикам.
Для выращивания культур штаммов пастерелл производили
посевы на МПБ и МПА, питательные среды Хоттингера с добавлением
5% сыворотки лошади. Посевы инкубировали в термостате в течение 18
часов. Готовили суспензии из паренхиматозных органов, мазки из
органов и крови сердца мышей, мазки из выращенных суточных
культур. Мазки окрашивали по Граму, синькой Леффлера и по
Романовскому - Гимза.
Биохимические свойства пастерелл изучали на средах Гисcа.
Пастереллы расщепляли глюкозу, сахарозу, сорбит и маннит с
образованием кислоты без газа, не разжижали желатин, образовывали
индол.
Выделение ДНК из бактериальной культуры Pasteurella multocida
проводили обработкой протеолитическим ферментом – протеиназой К.
44
В суточную культуру возбудителя добавляли протеиназу К до конечной
концентрации 100 мкг/см3, ДСН до конечной концентрации 0,5 %.
Полученную смесь инкубировали при 56 0С в течение 1 ч, при этом
происходил лизис и выделение ДНК.
ДНК очищали двукратным экстрагированием равными объемами
фенола и фенол/хлороформа. Каждую экстракцию проводили
медленным переворачиванием пробирки. Фенольную и водную фазы
разделяли центрифугированием при 15600 g, при комнатной
температуре в течение 5 мин на центрифуге "Eppеndorff''. Конечную
водную фазу отбирали и экстрагировали равным объемом смеси
хлороформ/изоамиловый спирт (96:4). Водную фазу отбирали и к ней
добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема охлажденного
96 % этанола. Смесь тщательно перемешивали и выдерживали при
минус 20 0С в течение 1 ч.
Осаждение ДНК проводили центрифугированием при 15600 g в
течение 15 мин при температуре 4 0С. Осадок ДНК дважды
промывали 70 % этанолом, высушивали на воздухе и растворяли в
необходимом объеме ТЕ буфера.
Чистоту полученных препаратов ДНК определяли
спектрофотометрически по отношению оптических плотностей при
длинах волн 260 нм и 280 нм (Е260/Е280). Для чистых препаратов ДНК
это отношение должно быть равно 1,8 и выше. Если это отношение
меньше, значит, препараты загрязнены белками или фенолом. В этом
случае необходимо повторить обработку протеиназой К и экстракцию
фенол/хлороформом.
При выделениеи ДНК Pasteurella multocida из органно-тканевых
материалов образцы исследуемого биологического материала (легкие,
лимфоузлы) мелко нарезали с помощью скальпеля и помещали в ступки
с песком. Материал растирали до образования однородной массы, и
добавляли физиологический раствор для получения 20 % суспензии
(вес/объём). Далее выделение бактериальной ДНК проводили по выше
описанной методике.
Кровь для исследования консервировали 3% раствором трилона Б.
При перхлоратном методе цельную кровь в первый день ставили на
лизис:
- на 200 мкл цельной крови добавили 1 мл ТЕ буфера и
перемешивали в течение 1 минуты на вортексе, затем центрифугировали
при 7500 об/мин в течение 1 минуты. Затем супернатант сливали так
повторяли 2-3 раза, до получения супернатанта розового цвета;
аккуратно сливали верхний слой и добавляли 300 мкл лизирующего
буфера и 8 мкл. протеиназы К; ставили в термостат при +63 0С на 12-14
часов. На следующий день для продолжения процесса выделения ДНК в
каждую пробирку добавляли реагенты: 50 мкл перхлората натрия и
45
мешали на шейкере около 5 минут; 300 мкл CIA, мешали на шейкере
около 5 минут; центрифугировали 15 об/мин в течение 1 минут;
верхнюю фракцию после разделения сред снимали дозатором и
добавляли 600 мкл 96 0С этилового спирта, встряхивали пробирку, в
результате ДНК выпадает в осадок; сливали спирт и добавляли 600 мкл
охлажденного 70 0С спирта и оставляли на 15 минут; спирт сливали и
ставили пробы ДНК сушить. Затем в высохшие пробирки с ДНК
добавляли 60 мкл бидистиллированной воды.
Метод щелочного лизиса осуществлялся по следующей
схеме:1мкл лейкоцитов крови помещали в 0,5 мл пробирку, затем
дабавляли 10 мкл щелочного лизисного буфера ALL. Пробы
инкубировали при +60 С в течение 30-45 минут. Лизат охлаждали и
0

центрифугировали несколько секунд при 15 тыс. об/мин для осаждения

конденсата. Затем добавляли 10 мкл нейтрализационного раствора NL и
тщательно перемешивали. Далее центрифугировали в течение 1 минуты
при 15 тыс. об/мин для осаждения
Для выделения бактериальной ДНК также использовали набор –
DNA Genomic Extraction Kit фирмы "Sigma", в соответствии с
прилагаемой инструкцией к набору.
Рестрикционный анализ препаратов ДНК бактерии Pasteurella
multocida проводили, используя ферменты рестрикции, а именно Apa I,
Ceu I, NotI.
В одной пробирке смешивали 10 мкл ДНК бактерии, 7 мкл H2O, 2
мкл 10х буфера (для каждой рестриктазы использовали
соответствующий ей буфер, который прилагался к набору с
рестриктазами фирмы " Sigma") и 1 мкл рестриктазы (10 ед/см3). Смесь
инкубировали при 37 0С в течение 2 ч и разделяли компоненты
электрофорезом в 0,7 % агарозном геле.
Электрофоретический анализ рестрикционных фрагментов ДНК
провордили на электрофоретическом аппарате HU 25, Scie - Plas;
Электрофорез проводили при напряжении 5 В/см, при температуре
4 С в течение ночи. Для электрофореза использовали 0,7 % раствор
0

агарозы в ТАЕ-буфере с бромистым этидием в концентрации 1 мг/см 3.

В качестве контроля использовали ДНК фага λ, обработанную
рестриктазой HindIII (DNA Molecular Weight marker II (0,12-23,1 kbp).
Документировали полученные результаты через трансгельиллюминатор,
с помощью компьютерной программы "LabWorks 4.0", определяли
молекулярные массы рестриктов, сумму всех фрагментов рестрикции.
Синтез подобранных праймеров осуществляли на синтезаторе
нуклеотидов "Expedite 8909" фирмы "Applied Biosystems" согласно
протоколам, прилагающимся к прибору. Полученные олигонуклеотиды
элюировали с колонок концентрированным раствором аммиака и
выпаривали в вакуумном испарителе CentriVap Concentrator,
46
LABCONCO. Синтезированные праймеры переосаждали этанолом,
ресуспендировали в высокоочищенной воде и хранили при минус 20 0С.
Наработку специфических участков ДНК проводили в
термоциклере с градиентом температур Mastercycler gradient, Eppendorf
.
Электрофорез продуктов амплификации ДНК бактерии Pasteurella
multocida проводили в аппарате для горизонтального электрофореза
"G-100", фирмы "Pharmacia'', при напряжении 8 В/см. Для электрофореза
использовали 2 % раствор агарозы в TBE-буфере. Документирование
полученных результатов проводили через трансгельиллюминатор.
Последующий анализ результатов проводили с использованием
программы Digi-Doc-It.
В качестве маркера молекулярных масс использовали "DNA Wide
Range marker" и "DNA Ladder 1kb" фирмы "Sigma"

2.2 Результаты исследований

2.2.1 Изучение распространенности пастереллеза в
Костанайской области
На территории Казахстана, согласно данным ветеринарной
отчетности, имеются энзоотические вспышки пастереллеза среди
крупного рогатого скота. За период с 2012 по 2015 годы в Костанайской
области были подвергнуты патологоанатомическим и
бактериологическим исследованиям пробы от 4357 голов павшего
крупного рогатого скота, из числа которых выделено 802 культуры
пастерелл (18,4%).

Таблица 2 - Информация о результатах бактериологических

исследований сельскохозяйственных животных и птиц в Костанайской
области за 2013 – 2015 гг.

2013 2014 2015

Вид животного
Иссл Выдел Иссл Выдел Иссл Выдел
Патматериал КРС 289 17 60 5 225 18
Биоматериал КРС 103 2 319 3 612 6
Патматериал МРС 18 - 236 - 18 -
Биоматериал МРС 316 - 101 - 98 -
Патматериал лош. 96 - 28 - - -
Биоматериал лош. 170 - 235 - - -
Патматериал свин 169 54 30 7 372 12
Биоматериал свин 228 4 353 - - -
Патматериал птицы 37 3 40 1 9 -
Биоматериал птицы 2 2 - - - -
Всего 1428 82 1402 16 1334 36

47
 Из таблицы видно, что к пастереллёзу восприимчивы все виды
домашних животных и птицы. В 2012 году из 390 исследованных проб
материала КРС с постановкой бактериологического диагноза получено 2
положительных результата (2,8%), из 360 проб материала от свиней – 46
положительных результатов (12,7%), 65 проб материала от птиц – 6
положительных результатов (5,3%).
В 2013 году исследовано всего 392 пробы материала от КРС,
выделено 19 культур пастерелл (4,8%), 397 проб материала от свиней -
выделено 58 культур (14,6%), 39 проб материала от птицы – выделено 3
культуры (8,1%).
В 2014 году бактериологически исследовано 379 проб материала
от КРС – выделено 8 культур (2,1%), 383 пробы материала от свиней –
выделено 7 культур (1,8%), 40 проб материала от птицы - выделена 1
культура пастерелл (2,5%). В 2015 году исследовано 837 проб материала
от КРС– выделено 24 культуры (2,8%), 372 пробы материала от свиней –
выделено 12 культур (3,2%), 9 проб патматериала от птицы - культуры
не выделены.
Из таблицы видно, что было проведено значительное количество
исследований биоматериала. Положительные результаты, полученные
при исследованиях биоматериала от КРС, говорят о наличии
носительства среди животных.
При исследованиях патологического материала больные животные
выделяются чаще, чем при исследованиях биологического материала.
Так, в 2012 году процент выделения культур при исследованиях
патматериала от КРС составил 8,8%, от свиней -23,5%, от птиц -9,5%. В
2013 году процент выделения культур при исследованиях патматериала
от КРС составил 5,8%, от свиней -31%, от птиц -8,1%. В 2014 году от
КРС - 8,3%, от свиней - 23% и от птиц - 2,5% . В 2015 году – 12,5%, 3,2%
и 0% соответственно (рисунок 3).

48
 35

30

25

20

15

10

0
2012 год 2013 год 2014 год 2015 год
КРС
свиньи
птицы

Рисунок 3 - Положительные результаты бактериологических

исследований патматериала от животных

Как видно из диаграммы, за анализируемый период в области

выделение культур Pasteurella multocida из патматериала от крупного
рогатого скота начиная с 2013 года растет: в 2013г 5,8%, в 2014 г - 8,3%,
в 2015г - 12,5%. Наибольший процент выделения культур за
анализируемый период (2012 – 2015 г) наблюдается у свиней – 15,5%,
крупного рогатого скота – 7,3% и птицы – 6,7% (рисунок 4).

Рисунок 4 - Процент выделения культур при бактериологических

исследованиях материала от животных за 2012 – 2015 годы
Как видно из диаграммы за 3 анализируемых года заболеваемость
крупного рогатого скота пастереллезом превосходит заболеваемость
49
пастереллезом птиц на 0,6%. Возможно, это объясняется тем, что
бактериологических исследований материалов от птиц стало меньше

2.2.2 Выделение эпизоотических штаммов Pasteurella multocida

и изучение их биологических свойств
Нами проведены исследования по выделению эпизоотических
штаммов пастерелл, сравнительному изучению основных биологических
свойств выделенных культур с эталонным штаммом Pasteurella multocidа
90 с целью дальнейшего использования для молекулярно -
биологических исследований.
Нами были изучены морфологические, культуральные,
биохимические, вирулентные свойства выделенных культур.
Пастереллы – короткие овоидные палочки, грамотрицательные,
неподвижные (рисунок 5).

Рисунок 5 - Pasteurella multocidа в мазке из селезенки, окрашенном

по Граму

Отмечается биполярность при окраске по Романовскому-Гимзе, при

окрашивании по Михину обнаруживали капсулу.
Культуральные свойства изучали при посеве на плотные и жидкие
питательные среды при температуре 370, рН 7,2-7,4. При
культивировании на плотных питательных средах (МПА) в обогащенной
5%-ой сывороткой крови лошади пастереллы представляют собой
мелкие, гладкие, округлые ровными краями колонии.
На МПБ пастереллы образуют равномерное помутнение среды,
при встряхивании пробирки отмечаются муаровые волны. Культуры
пастерелл обладают специфическим запахом, не образуют пленку и
пристеночного кольца.
При изучении биохимических свойств эпизоотических штаммов
пастерелл установили, что все они ферментируют без образования газа:
глюкозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, сорбит, маннит, не
ферментируют лактозу, ксилозу, арабинозу, восстанавливают нитраты в
50
нитриты, обладают каталазной активностью, образовывают индол,
сероводород, не вызывают гемолиз эритроцитов, не разжижает желатин,
не свертывает молоко.
Данные биохимических свойств пастерелл отражены в таблице 3.

Таблица 3- Биохимические свойства производственных штаммов

P.multocida

каталазная акт-ть
Подвижность
восст.нитрат
гемол.св-ва
Арабиноза
Галактоза
Мальтоза
Ксилозаа

Сахароза
Глюкоза

Лактоза

Маннит
Сорбит

Индол
Наименование

H2 S
штамма

к к к к к
P.multocida А1
- + + + - + + + - + - - + + -
к к к к к
P.multocida К1
- + + + - + ± + - + - - + + -
к к к к к
P.multocida К2
- + + + - + + + - + - - + + -

При изучении вирулентных свойств эпизоотических штаммов

пастерелл А1, К1,К2 на белых мышах с массой 18-20 г. (таблица 4) с
определением ЛД50 путем внутрибрюшинного введения вирулентной
культуры пастерелл 15 КОЕ, 50 КОЕ и 100 КОЕ.
Таблица 4 - Вирулентные свойства эпизоотических штаммов
пастерелл на белых мышах

Результаты
Наименование Кол - во Доза Метод
%
штамма животных введения введен. Пало Выжило
падежа
10 15 КОЕ в/б 6 4 60
P.multocida А1 10 50 КОЕ в/б 8 2 80
10 100 КОЕ в/б 10 - 100
10 15 КОЕ в/б 7 3 70
P.multocida К1 10 50 КОЕ в/б 9 1 90
10 100 КОЕ в/б 10 - 100
10 15 КОЕ в/б 3 7 70
P.multocida К2 10 50 КОЕ в/б 9 1 90
10 100 КОЕ в/б 10 - 100
51
 Как видно из таблицы 4 вирулентность эпизоотических штаммов
пастерелл для белых мышей составило 15 - 100 КОЕ.

2.2.3 Изучение биологических свойств штамма Pasteurella

multocida 90
Из коллекции музея лаборатории противобактериозной
биотехнологии получаем лиофильно высушенные штамм P.multocida 90.
Ампулу с аморфным веществом растворяем физиологическим раствором
[рН 7,2-7,4] получаем 20 млрд. КОЕ, затем проводим серийное
разведение и из 5, 6 пробирки производим посевы по 0,1 см 3 в чашки
Петри для подсчета количества колоний. Через 24 часа после инкубации
при визуальном просмотре роста колоний в чашки Петри должно быть
не менее 100-200 КОЕ.
На питательных средах культуры P.multocida 90 сохраняют
исходные свойства не более 10 пассажей. Поэтому в период
использования данного штамма пастерелл проводили пассажи культур
на белых мышах, что обеспечивало повышение их вирулентности. Так
как иммуногенные свойства возбудителя обусловлены наличием
капсулы, не менее важным условием является сохранение музейных
штаммов пастерелл в фазе, образования капсулы, а этим условием
является животный организм, из которого выделен данный штамм.
Нами были изучены морфологические, культуральные,
биохимичесике, вирулентные свойства музейного штамма P.multocida
90.
Штаммы P.multocida 90 – короткие овоидные палочки (длиной 0,3-
1,5 мкм и шириной 0,15-0,25 мкм), грамотрицательные, неподвижные
(рисунок 4). Отмечается биполярность при окраске по Романовскому-
Гимзе, при окрашивании по Михину обнаруживали капсулу, ее наличие
связано со степенью вирулентности штаммов.

Рисунок 6 - Штамм Pasteurella multocida 90 в мазках из культуры

52
 Как видно из рисунка, в мазках пастереллы располагаются
изолированно иногда парами, реже в виде цепочек
Культуральные свойства изучали при посеве на плотные и жидкие
питательные среды при температуре 370, рН 7,2-7,4. По характеру роста
на плотных питательных средах (МПА) обогащенной 5%-ой сывороткой
крови лошади выявили три типа колоний: гладкую S-форму, которые
представляют собой мелкие, гладкие, округлые, прозрачные с
голубоватым оттенком ровными краями (рисунок 7).

Рисунок 7 - Колонии Pasteurella multocida 90 на МПА (х10)

На необогащенном МПА пастереллы растут в виде нежных мелких

росинчатых колоний, слегка опалесцирующих в проходящем свете
(рисунок 8). Для выделения чистых культур пастерелл производили
дробный посев исследуемого патологического материала на чашки
Петри с обогащенными средами МПА (по две-три чашки на каждое
исследование).

Рисунок 8 - Рост штамма Pasteurella multocida 90 на МПА

53
 Как видно из рисунка в косопроходящем свете колонии имеют
радужное свечение, что связано с капсулообразованием.
При длительном хранении культур происходила диссоциация, в
результате чего S-форма колоний переходила в R и М - формы. R-форма
представляет собой непрозрачные с шероховатыми краями колонии, а
М-форма (мукоидная) слизистые, с неровными краями колонии.
Также, при изучении культуральных свойств, производили посевы
пастерелл в бульон Хоттингера и МПБ (рисунок 9).

Рисунок 9 - Рост штамма Pasteurella multocida 90 на МПБ

Как видно из рисунка при культивировании пастерелл в бульоне

Хоттингера и МПБ штамм Pasteurella multocida 90 давал типичный рост,
вызывая равномерное помутнение среды с образованием
незначительного осадка на дне культивируемого сосуда, при
встряхивании отмечаются муаровые волны, по мере старения культуры
происходит просветление среды с образованием слизистого осадка на
дне пробирки, поднимающегося при встряхивании в виде косички.
Штамм Pasteurella multocida 90 обладает специфическим запахом, не
образуют пленку и пристеночного кольца
Данные результатов изучения биохимических свойств Pasteurella
multocida 90 отражены в таблице 3.
Таблица 5 – Биохимические свойства штамма Pm 90
каталазная акт.
Подвижность
гемол.св-ва
Арабиноза
Галактоза
Мальтоза

Наименование
Ксилозаа

Сахароза

Желатин
Глюкоза

Лактоза

Маннит
Сорбит

Индол
H2 S

штамма

P.multocida 90 - к к к - к + к - + - - + - -
+ + + + - +

54
 Как видно из данных таблицы 5, штамм ферментирует без
образования газа: глюкозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, сорбит,
показал вариабельность в отношении маннита, не ферментирует лактозу,
ксилозу, арабинозу, восстанавливает нитраты в нитриты, обладает
каталазной активностью, образовывает индол, сероводород, не вызывает
гемолиз эритроцитов. Согласно определителю бактерии Bergey|s (1984)
тесты на индол и гемолиз эритроцитов являются основными
показателями для определения вида у представителей рода Pasterella, то
есть служат для дифференциации P.multocida от P.haemolitica.
P.multocida - 90 также не разжижает желатин, не свертывает молоко.
Далее нами были изучены вирулентные свойства эталонного
штамма P.multocida 90 на белых мышах с массой 18-20 г. (таблица 6) с
определением ЛД50 путем внутрибрюшинного введения вирулентной
культуры пастерелл 50 КОЕ, 100 КОЕ и 150 КОЕ.

Таблица 6 - Вирулентные свойства эталонного штамма P.multocida

90 на белых мышах

Результаты
Наименование Кол-во Доза Метод
%
штамма жив-ых введен. введен. Пало Выжило
падежа
10 50 КОЕ в/б 5 5 50
P.multocida 90 10 100 КОЕ в/б 7 3 70
10 150 КОЕ в/б 8 2 80

Из таблицы видно, что вирулентность эталонного штамма

P.multocida 90 для белых мышей составило 50-150 КОЕ. Таким образом,
для эпизоотических и музейного штаммов пастерелл характерными
являются: полиморфизм, отрицательная окраска по Граму, выраженная
биполярность при окрашивании по Романовскому-Гимзе, наличие
капсулы при окраске по Михину, рост в аэробных условиях на обычных
питательных средах, но лучше с добавлением сыворотки лошади,
образование на плотных питательных средах гладких S-форм колоний с
радужным свечением в косопроходящем свете, рост на МПБ, бульоне
Хоттингера сопровождающиеся помутнением среды с последующим
просветлением с образованием слизистого осадка, при встряхивании
поднимающегося в виде косички, способность образовывать индол и
сероводород, не способность гемолизировать эритроциты,
вариабельность биохимических свойств. Все исследованные штаммы
пастерелл обладают вирулентными свойствами.

55
 2.3 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida
2.3.1 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida из
бактериальных культур
Нами проведены исследования по отработке оптимальных методов
экстрагирования бактериальной ДНК. При диагностике пастереллеза
КРС методом ПЦР основным рабочим материалом, как уже
упоминалось, является ДНК Pasteurella multocida. Основным критерием
в методах выделения ДНК является то, что нуклеиновая кислота должна
быть максимально очищенной от примесей клеточных ДНК и белков.
Выделенная геномная ДНК должна быть
нефрагментированной, так как она служит матрицей для синтеза
специфического продукта.
Как известно, в прокариотической клетке генетический материал
(ДНК) локализован в довольно неупорядоченном, не окруженном
мембраной тельце, называемом нуклеоидом. Для исследования свойств
нуклеиновой кислоты бактерии в растворе необходимо выделить ее из
бактериальной клетки. Для этого используют такие методические
приемы, которые позволяют разрушить различного типа связи между
субъединицами белковой оболочки бактериальной частицы, между
нуклеиновой кислотой и белком. В методическом сборнике «PCR
Protocols» наиболее часто для выделения нативной ДНК прокариотов
рекомендуют детергентно-ферментные методы с последующей
экстракцией фенолом [223]. Детергенты - растворимые в воде
полярные липиды. Обычно они классифицируются по типу
гидрофильной группы: анионные, катионные, амфотерные и неионные.
Ионные детергенты (Nonidet P-40, Тween 80) лучше денатурируют
белки, чем неионные.
Townsend KM, Frost AJ, Lee CW, Papadimitriou JM, Dawkins HJ.
[206] в своих работах описывают метод экстракции ДНК с
использованием детергента Тween 20. Carol A. Lichtensteiger, Susan M.
Steenbergen в статье “Direct PCR Analisis for Toxigenic Pasteurella
multocida” [224] остановились на методе изоляции ДНК Pasteurella
multocida с использованием детергента Nonidet P-40.
В наших исследованиях по подбору оптимальной схемы
выделения ДНК из культур Pasteurella multocida были использованы
следующие методы:
- детергентно-ферментный метод с использованием
додецилсульфата с последующей экстракцией фенол/хлороформом;
- с применением детергента и последующей экстракцией фенолом.
- использование лизирующего буфера, содержащий и с дальнейшей
экстракцией фенол/хлороформом;
- метод кипячения.

56
 Первый способ основан на использовании фермента протеиназы К
для лизиса белковых структур с дальнейшей фенольной
депротеинизацией. Второй способ экстракции ДНК из бактерий
предусматривает использование в качестве детергента Тween - 20. Тween
хорошо лизирует клеточную мембрану, но слабее действует на ядерную
стенку, если учесть, что в бактериальных клетках ядро не имеет
оболочки – это оптимальный вариант.
При применении третьего метода в качестве детергента
использовали Nonidet P-40.
Главными критериями при отработке оптимальных методов были
концентрация и чистота препарата.
После выделения ДНК Pasteurella multocida вышеперечисленными
методами проводили качественный и количественный анализ образца.
Электрофорез проводили в 0,8 % агарозном геле в ТАЕ-буфере.
Спектрофотометрически измеряли отношение между оптическими
плотностями при 260 и 280 нм. Максимум поглощения для нуклеиновых
кислот регистрируется при длине волны 260 нм. Препарат ДНК
считается свободным от примесей при величине отношений Е 260/280
равным 1,8 и выше. Если этот показатель ниже указанного, то образец
загрязнен белками или фенолом.
Образцы ДНК Pasteurella multocida, полученные с использованием
детергентов Nonidet P-40 и Тween - 80, оказались невысокого качества.
Отношения между оптической плотностью при длинах волн 260 и 280
нм в среднем составляли 1,65-1,7, что говорило о загрязненности ДНК
белком и другими примесями. Таким образом, полученные результаты
показали неэффективность этих методов.
Лучшие результаты были получены при обработке
бактериосодержащей суспензии детергентом – 10 % раствором
додецилсульфата натрия в сочетании с протеиназой К и с последующей
экстракцией фенол/хлороформом. Применение додецилсульфата натрия
не только депротеинизирует бактериальную клетку, но также подавляет
активность нуклеаз. Клеточные белки удаляли обработкой
протеолитическим ферментом – протеиназой К. Для удаления белков и
разрыва связей ДНК-белок использовали смесь фенол-хлороформ,
который является более сильным средством депротеинизации.
Результат качественного анализа полученного препарата ДНК
представлен на электрофореграмме (рисунок 10).

57
 Примечание - 1 – геномная ДНК Y.enterocolitica; М – маркер ДНК ".
Рисунок 10 - Электрофореграмма геномной ДНК штамма
Y.enterocolitica,

Как видно из рисунка ДНК Pasteurella multocida представлена

одной четкой линией, что говорит о нативности препарата. Оптимальная
схема выделения ДНК Pasteurella multocida при использовании данного
метода представлена на рисунке 11.

Инкубация суточной культуры

Pasteurella multocida с протеиназой К
(к/к 100 мкг/см3 и 0,5 % SDS).

Двухкратная депротеинизация
фенол/ хлороформом , однократная
хлороформом. Центрифугирование

Осаждение ДНК спиртом, в

присутствии ацетата натрия в течение
1 часа при минус 20 0С.

Центрифугирование при 15600 g в

течение 15 мин при для температуре
4 0С для отделения осадка

Двухкратное промывание осадка

ДНК 70 % спиртом, высушивание и
разведение в ТЕ буфере

Рисунок 11 – Схема выделения ДНК детергентно – ферментным

методом.
58
 Нами был опробован способ выделения ДНК методом горячего
лизиса агаровой культуры пастерелл на водяной бане описанный в
статье W. L. Araujo, D.A. de Angellis, J.L. Azevedo “Direct RAPD
Evalution of Bacteria without Conventional DNA Extraction” [223]. Данный
метод очень прост в исполнении: ДНК выделяется методом горячего
лизиса - 50 мкл культуры инкубируется 10 минут на водяной бане, и
хотя метод не дает высокую степень очистки экстрагированной ДНК
(1,65-1,7), может использоваться при рутинной диагностической работе.
Выход геномной ДНК при данном методе составлял 60-80 %. Таким
образом, результаты качественного и количественного анализа показали,
что наилучшим является метод с использованием додецилсульфата
натрия и протеиназы К.

2.3.2 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida из

органно-тканевых материалов
Выделение ДНК из цельной крови проводили двумя методами:
перхлоратным методом и методом щелочного лизиса. Отношение
оптической плотности (Е260/Е280) полученных препаратов ДНК
Pasteurella multocida в обоих случаях имело средние значение 1,840,04
(рисунок 12).

Примечание - 1 – геномная ДНК Pasteurella multocida ; М – маркер

ДНК "Direct LoadTM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50 п.о.", Sigma.
Рисунок 12 - Электрофореграмма препарата ДНК Pasteurella
multocida перхлоратным методом и методом щелочного лизиса

Из полученных результатов видно, что в образцах на агарозном

геле присутствуют полосы, соответствующие высокомолекулярной
ДНК, а также отсутствуют следы деградации ДНК и низкомолекулярные
фрагменты.
59
 В целях выделения ДНК из органов применяли метод Кавасаки.
Была получена высокомолекулярна ДНК с отличной степенью очистки.
Качество очистки препарата было дополнительно проанализировано по
оптической экстинкции в ультрафиолетовом спектре при длине волны
260нм - 320 нм.
Таким образом, определены оптимальные методы выделения ДНК
для дальнейшего проведения исследований по разработке метода ПЦР
для диагностики пастереллеза крупного рогатого скота.

2.4 Реcтрикционный анализ ДНК Pasteurella multocida

Рестрикционный анализ ДНК широко используется в
молекулярно-биологических исследованиях и прикладных работах и
является одним из наиболее важных инструментов при изучении ДНК.
Большое разнообразие существующих эндонуклеаз рестрикции
позволяет проводить расщепление ДНК по более 150 сайтам узнавания.
Одним из важных элементов рестрикционного анализа является
получение теоретически рассчитанной картины разделения фрагментов
ДНК, определяемой на основе известной первичной структуры данной
ДНК.
В наших экспериментах рестрикционный анализ проводили для
определения молекулярной ДНК Pasteurella multocida. Молекулярный
размер нуклеиновых кислот бактерий достаточно большой – более
2 миллионов пар оснований.
Очень важно, чтобы выделенная ДНК была нефрагментированной,
так как в дальнейших экспериментах она будет служить матрицей для
синтеза специфического продукта.
Целью данного этапа работы являлось подобрать оптимальную
рестриктазу и условия рестрикции, провести анализ и обработку
электрофореграмм. На конечном этапе работы предполагалось
определить молекулярную массу геномной ДНК штамма Pasteurella
multocida 90 и сравнить с данными литературы.
Первоначально были проведены эксперименты по выбору
оптимальных ферментов рестрикции ДНК Pasteurella multocida и
подбору оптимальных условий рестрикции. В экспериментах при
выборе ферментов для расщепления ДНК Pasteurella multocida
использовали рестриктазы Apa I, Ceu I, NotI. Характеристики
рестриктаз представлены в таблице 7.

60
 Таблица 7 - Характеристика использованных в работе
рестрикционных эндонуклеаз

Рестриктазы Ионная Сайты узнавания Образование Т

сила концов инкубации, С
Apa I Средн. CAAGCTT липкие 37-55
Ceu I Высок. (A/G)(A/G)A тупые 37- 50
T(T/C)(T/C)
NotI Низкая CGTACG липкие 37 -55

Реакционная смесь: в одной пробирке смешивали 10 мкл ДНК

Pasteurella multocida, 7 мкл H2O, 2 мкл 10х буфера (для каждой
рестриктазы использовали соответствующий ей буфер, который
прилагался к набору с рестриктазами фирмы "Sigma") и 1 мкл
рестриктазы (10 ед/см3). В ходе опытов было опробовано несколько
температурных режимов инкубации реакционной смеси. В результате
экспериментов для расщепления ДНК оптимальной температурой
инкубирования оказалось 37 0С в течение 2 ч.
На рисунке 12 представлен результат опыта по рестрикции генома
Pasteurella multocida штамм 90 различными эндонуклеазами.

Примечание - Ceul (1), ), Notl /Ceul (2), Notl (3), ApaI/ Ceul (4) и
ApaI (5).справа М – маркер стандартных размеров ДНК в килобазах,
слева М- маркер, ДНК фага , обработанная HindIII
Рисунок 13 - Электрофореграмма гидролизатов ДНК Pasteurella
multocida, полученных с помощью обработки рестриктазами

61
 В результате исследований нами определено среднее значение
молекулярной массы геномной ДНК Pasteurella multocida. Молекулярная
масса ДНК Pasteurella multocida при расщеплении Ceu l составила
2,345кб, Notl - 2,349 кб, а при обработке ApaI – 2,353кб. Среднее
значение размера ДНК Pasteurella multocida составило 2,249 кб.
Как видно из фореграммы, при использовании всех трех
рестриктаз получен хороший электрофоретический профиль.
Молекулярная масса ДНК при расщеплении Apa I составила 2,353, при
обработке Not I – 2,349, при обработке Ceul – 2,345кб. При
расщеплении ДНК комплексом Notl /Ceul молекулярная масса составила
2,359 кб, ApaI / Ceul – 2,360 кб. В 1998 году Meredith L. Hunt, Carmel G.
Ruffolcu Kumar Rajakumar, Ben Abler [226] с целью физического и
генетического картирования хромосомы Pasteurella multocida А:1
методом рестрикционного анализа генома определили молекулярную
массу ДНК Pasteurella multocida равной 2,353кб.
В 2001 году May B. J., Zhang Q., Li L.L., Paustian M.L., Thomas S.
[220] методом случайного секвенирования и компьютерного анализа
определили, что геном штамма Pasteurella multocida Pm 70 - одинарная
циркулярная хромосома - состоит из 2 257 487 пар оснований в длину.
Таким образом, данные наших исследований относительно
молекулярного размера ДНК Pasteurella multocida совпадают с
литературными, особенно с размером ДНК штамма Pasteurella multocida
А:1. Полученные данные в дальнейшем можно использовать для
дифференциации штаммов на основе ПЦР с последующим
рестрикционным анализом.
Обработку полученных в экспериментах электрофореграмм
проводили с помощью компьютерной программы "LabWorks 4.0". Для
определения молекулярной массы геномной ДНК Pasteurella multocida
определяли молекулярные массы рестриктов, их процентное содержание
в пробе и сумму всех фрагментов рестрикции. В таблице 8 представлены
молекулярные размеры фрагментов гидролиза ДНК штамма Pasteurella
multocida 90.

62
 Таблица 8 - Молекулярные размеры (п.о.) фрагментов гидролиза
ДНК Pasteurella multocida

Размеры фрагментов
ДНК Pasteurella multocida штамма 26 (Кб)
Фрагмент ApaI - Notl –
ApaI Notl Ceul Ceul Ceul

1 2 3 4 5 6
A 460,0 850,0 980,0 460,0 630,0
B 450,0 630,0 630,0 330,0 520,0
C 340,0 230,0 450,0 230,0 230,0
D 230,0 230,0 230,0 185,0 180,0
E 228,0 180,0 55,0 180,0 175,0
F 185,0 110,0 175,0 110,0
G 180,0 110,0 125,0 55,0
H 130,0 9 75,0 9
I 95,0 55,0
J 55,0 53,0
K 33,0
L 9
Суммарный размер 2,353 2,349 2,345 2,360 2,359
Число
10 8 5 12 8
фрагментов

Из таблицы видно, что в результате исследований нами

определено среднее значение молекулярной массы геномной ДНК
штамма Pasteurella multocida 90 – 2,353 8 (n=5) п.о
Таким образом, показано, что данные относительно молекулярного
размера ДНК Pasteurella multocida совпадают с литературными,
особенно с размером ДНК Pasteurella multocida А:1. Установлено, что
используемый нами метод экстрагирования ДНК позволяет получать
полноразмерную и нефрагментированную нуклеиновую кислоту.
Полученные данные в дальнейшем можно использовать для
дифференциации штаммов на основе ПЦР с последующим
рестрикционным анализом.

2.5 Разработка и оптимизация метода ПЦР для диагностики

Pasteurella multocida
Полимеразная цепная реакция, ПЦР не сходит с заголовков статей
научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в
1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии.
Появление метода ПЦР было обусловлено определенными
достижениями молекулярной генетики, прежде всего расшифровкой
нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов.
Простота исполнения и непревзойденные показатели
63
чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую
популярность.С быстротой молнии метод распространился по всему
миру. ПЦР используется для проведения научных и практических
исследований. Но прежде всего метод нашел широкое применение в
области микробиологической диагностики. В настоящее время метод
ПЦР автоматизирован, довольно прост в исполнении и доступен любой
молекулярно-биологической лаборатории. [193].
Основной целью настоящей работы являлась разработка метода
ПЦР для идентификации возбудителя пастереллеза КРС, включающая
выбор стратегии конструирования специфических праймеров для
наработки нуклеотидных последовательностей, определение
оптимальных параметров амплификации и адаптацию метода для
рутинных исследований.
В РК аналогичные работы до настоящего времени не проводились.
Впервые в Казахстане с использованием последних достижений
молекулярной биологии и генной инженерии была организована
разработка метода нового поколения диагностики пастереллеза на
основе ПЦР.

2.5.1 Конструирование и синтез специфических праймеров для

идентификации Pasteurella multocida методом ПЦР
Подбор праймеров для детекции геномной ДНК Pasteurella
multocida является одной из основных задач при разработке ПЦР тест
системы. Этот этап представляет из себя аналитическую работу, которая
включает анализ и сравнение нуклеотидных последовательностей, как
полных геномов, так и отдельных генов возбудителей пастереллеза и
родственных к ним микроорганизмов (P. multocida subsp. multocida, P.
multocida subsp. gallicida, P. multocida subsp. septica, P. dagmatis, P. canis
biotype 1, P. canis biotype 2, P. stomatis, P. anatis, P. langaa, Pasteurella sp.
B strain, P. haemolytica, H. influenzae type b, A. pleuropneumoniae,
Actinobacillus sp. Strain, E. coli, P. aeruginosa, S. typhimurium, S. aureus, S.
faecalis, B. cereus). Конструирование праймеров происходит на основе
существующих знаний о геноме Pasteurella multocida. Первоначально
необходимо выбрать ген-мишень, к которому будут подбираться
специфические праймеры.
По данным исследований последних лет, с вирулентностью
Pasteurella multocida ассоциированы множества генов, кодирующих
белки с разными функциями. Таким как, адгезия и проникновение в
клетку хозяина, приобретение железа, порины наружной мембраны,
нейроминидазы, супероксид дисмутазы, выработка дерманекротоксина и
гиалуронидазы. Работа BarbaraJ.M. etal. (2000) показала, что геном
Pasteurella multocida содержит 104 вероятных генов вирулентности. Это
7% всего генома. DaboS.M. et al. (2007) предполагают, что гены pfhB1 и
64
pfhB2 потенциальные носители вирулентности. Оба гена высоко
гомологичный с filamentoushemagglutinin (fbaB) B. pertussis, который
отвечает за проникновение Pasteurella multocida в клетку хозяина.
Центральный регион этих белков содержит интегрин-связывающие
участки, участвующие в адгезии B. Pertussis. Более того, карбоксильная
группа этих белков содержит участки, с 66% гомологичностью с
сыворотко-устойчивым белком р76 Heamafilussomnus. Наличие р76
обуславливает сопротивление опсонизации, тем самым увеличивая
выживаемость патогена в хозяине.
По работам FerreiraT.S.Petal. (2012), среди генов кодирующих
порины наружной мембраны, наиболее ярко выражены гены tadD
(93.4%), ptfA (91.3%), omp87 (84.7%).
Для моделирования праймеров нами взяты нуклеотидные
последовательности генов, кодирующих порины наружной мембраны
Pasteurella multocida из базы данных Genbank , с использованием пакета
компьютерных программ Vector NTI Advance 9, проведено попарное
сравнение последовательности нуклеотидов между собой для
определения наиболее вариабельных и консервативных участков генома.
Характеристики и параметры выбранны праймеров были установлены с
помощью программы Oligo Analizer.
В результате исследований было сгенерировано 3 пары праймеров.
Подобранные пары праймеров с основными характеристиками
представлены на рисунках 14,15 и в таблице 9.

Рисунок 14 - Расположение амплифицируемого участка для гена

tadD (красным цветом показан прямой праймер, зеленым - обратный)

65
Primer 1

Primer: 5ґ-TTCTACCCATTCTCAGCAAGGC-3ґ
Reverse: 3ґ-CGGAACGACTCTTACCCATCTT-5ґ
Length: 22 nt
Tm (basic): 66,0 0C
Tm (salt): 62,1 0C
Tm (NN): 64,9 0C
GC %: 50,0 %
dG: -42,1 kCal/mol
3'-tail GC %: 71,4 %
3'-tail dG: -14,9 kCal/mol
Molecular weight: 6692,3 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 4,57 µM and contains 30,6 µg ssDNA
Primer 1 self annealing:
None!
Primer 1 loops:
None!

Primer 2

Primer: 5ґ-ATCATTTCGGGCATTCACC-3ґ
Reverse: 3ґ-CCACTTACGGGCTTTACTA-5ґ
Length: 19 nt

Tm (basic): 56,0 0C
Tm (salt): 55,2 0C
Tm (NN): 63,0 0C
GC %: 47,4 %
dG: -38,2 kCal/mol
3'-tail GC %: 42,9 %
3'-tail dG: -11,4 kCal/mol
Molecular weight: 5800,8 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 5,28 µM and contains 30,6 µg ssDNA
Primer 2 self annealing:
None!
Primer 2 loops:
None!

Primer 1 - Primer 2 annealing:

5'-TTCTACCCATTCTCAGCAAGGC-3'
: ||| : :
3'-CCACTTACGGGCTTTACTA-5'
dG: -2,93 kcal/mol

66
 Рисунок 15 - Расположение амплифицируемого участка для гена
omp87 (красным цветом показан прямой праймер, зеленым - обратный)

Primer 1
Primer: 5ґ-AGCGAGCAACAGATAACG-3ґ
Reverse: 3ґ-GCAATAGACAACGAGCGA-5ґ
Length: 18 nt
Tm (basic): 54,0 0C
Tm (salt): 53,8 0C
Tm (NN): 57,5 0C
GC %: 50,0 %
dG: -34,4 kCal/mol
3'-tail GC %: 42,9 %
3'-tail dG: -10,9 kCal/mol
Molecular weight: 5612,6 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 4,58 µM and contains 25,7 µg ssDNA

Primer 1 self annealing:

None!
Primer 1 loops:
None!

Primer 2

Primer: 5ґ-AGGCATGACTGTCACAAC-3ґ
Reverse: 3ґ-CAACACTGTCAGTACGGA-5ґ
Length: 18 nt
Tm (basic): 54,0 0C
Tm (salt): 53,8 0C
Tm (NN): 55,0 0C
GC %: 50,0 %
dG: -31,2 kCal/mol
67
 3'-tail GC %: 42,9 %
3'-tail dG: -10,1 kCal/mol
Molecular weight: 5554,6 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 5,01 µM and contains 27,8 µg ssDNA
Primer 2 self annealing:
5'-AGGCATGACTGTCACAAC-3'
: |||| :::: :
3'-CAACACTGTCAGTACGGA-5'
dG: -1,66 kcal/mol

5'-AGGCATGACTGTCACAAC-3'
||| :::
3'-CAACACTGTCAGTACGGA-5'
dG: -0,08 kcal/mol
Primer 2 loops:
5'-AGGCATGAC
: ||| T
3'-CAACACTG
dG: -0,20 kcal/mol

Primer 1 - Primer 2 annealing:

5'-AGCGAGCAACAGATAACG-3'
: |||| :
3'-CAACACTGTCAGTACGGA-5'
dG: -1,68 kcal/mol

Рисунок 16 - Расположение амплифицируемого участка для гена

pfhB1 (красным цветом показан прямой праймер, зеленым - обратный)

68
Primer 1
Primer: 5ґ-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3ґ
Reverse: 3ґ-GTTTAAATTCGTCAAAGTAAAGTAA-5ґ
Length: 25 nt
Tm (basic): 62,0 0C
Tm (salt): 55,9 0C
Tm (NN): 59,8 0C
GC %: 24,0 %
dG: -43,5 kCal/mol
3'-tail GC %: 14,3 %
3'-tail dG: -11,2 kCal/mol
Molecular weight: 7774,1 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 3,37 µM and contains 26,2 µg ssDNA

Primer 1 self annealing:

5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3'
||| : : :::
3'-GTTTAAATTCGTCAAAGTAAAGTAA-5'
dG: -0,68 kcal/mol

5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3'
||| :: : : :: :::
3'-GTTTAAATTCGTCAAAGTAAAGTAA-5'
dG: -0,21 kcal/mol
Primer 1 loops:
5'-AATGAAATGAA
||| :: : A
3'-GTTTAAATTCGTC
dG: -0,09 kcal/mol

Primer 2
Primer: 5ґ-CGATAATAACGCATCGAGAAAATC-3ґ
Reverse: 3ґ-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5ґ
Length: 24 nt
Tm (basic): 66,0 0C
Tm (salt): 60,1 0C
Tm (NN): 63,0 0C
GC %: 37,5 %
dG: -44,4 kCal/mol
3'-tail GC %: 28,6 %
3'-tail dG: -10,5 kCal/mol
Molecular weight: 7424,9 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 3,52 µM and contains 26,1 µg ssDNA
Primer 2 self annealing:
5'-CGATAATAACGCATCGAGAAAATC-3'
||| : :: :: : :::
3'-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5'
dG: 0,16 kcal/mol
Primer 2 loops:
69
 5'-CGATAATAACGC
||| : :: A
3'-CTAAAAGAGCT
dG: 0,28 kcal/mol
Primer 1 - Primer 2 annealing:
5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3'
:: : |||
3'-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5'
dG: -0,21 kcal/mol

Таблица 9 - Подобранные праймеры для исследования

Ген Последовательность Положение Размер

в геноме ампл.уч.
п.н.
tadD F 5`-TTCTACCCATTCTCAGCAAGGC-3` 63-480 417
R 5`- ATCATTTCGGGCATTCACC-3`
omp87 F 5`-AGCGAGCAACAGATAACG-3` 146-261 115
R 5`-AGGCATGACTGTCACAAC-3`
pfhB1 F 5`-TGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3` 4926-5091 165
R 5`-GATAATAACGCATCGAGAAAAT-3`

Для синтезирования праймеров была использована программа

Clonemanager (http://www.scied.com/prcmpro. htm), с установкой на
оптимальные параметры: температуру плавления Tmo= 58 o-62o, длина
18-22 пар оснований (по), получаемый продукт 70-300 п.о. Допустимое
количество праймеров-димеров – не более 4. Так же рассматривалось
образование «шпильки», то есть отжиг с самим собой и повторные
участки.
Помимо сходных температур плавления, по расчетным данным
эти праймеры не должны образовывать стабильных гетеродуплексов
друг с другом.
Фланкирующий праймерами участок ДНК был проверен с
помощью программы BLAST (on-line free).
Результаты проверки показали, что нуклеотидная
последовательность теоретически образуемого ПЦР-продукта
соответствует Pasteurella multocida.
Смоделированные последовательности праймеров в дальнейшем
были синтезированы на синтезаторе олигонуклеотидов Expedite 8909,
Applied Biosystems. Очистку праймеров проводили методом спиртового
переосаждения. Полученные таким образом синтезированные праймеры
разводили до концентрации 20 пмоль и использовали для проведения
ПЦР.

70
 2.5.2 Отработка и оптимизация параметров ПЦР

2.5.2.1 Подбор и отработка температурно-временного режима

Очень важным и сложным этапом при разработке метода ПЦР
является подбор и отработка параметров температуры и времени циклов
амплификации.
Трем последовательным стадиям ПЦР: денатурации матрицы при
нагревании, отжигу праймеров с одноцепочечной матрицей и синтезу
второй цепи с помощью термостабильной ДНК-полимеразы
соответствует определенный температурный профиль. Для каждой
стадии экспериментальным путем подбирается температура и время. В
общем случае температура этапа денатурации обычно выбирается между
90-95 0С, отжига между 40-60 0С, а элонгации между 70-75 0С. Кольцевая
ДНК умеет денатурировать после тепловой денатурации. Поэтому
температура и время денатурации выбираются как компромисс между
двух целей: хорошо денатурировать матрицу, не сильно повредив при
этом матрицу и Taq полимеразу, которые разрушаются при нагреве.
Температура, при которой денатурируется двуспиральная ДНК-
матрица, зависит от содержания в ней GC оснований. При высоком
содержании GC оснований, для полного расхождения цепей в молекуле
ДНК необходима более высокая температура. Так же более длинные
матрицы ДНК требуют большей температуры для полной денатурации.
Очень низкая температура денатурации, или короткая
продолжительность времени денатурации приводят к тому, что участки
ДНК с высоким содержанием GC оснований не расплетутся, а
денатурируют только регионы богатые АТ-основаниями. Однако более
продолжительное время денатурации или более высокая температура
приводят к нежелательному снижению ферментативной активности
полимеразы.
Эксперимент ПЦР проводили в двух температурных режимах.
В первом эксперименте использовали амплификатор Nexus,
используя следующие режимы температур:
пре-денатурация: 5 мин, 95 0С
денатурация: 20 с, 94 0С
отжиг: 20 с, 52 0С 30 циклов
синтез: 20 с, 72 С
0

пост-репликация 5 мин, 72 0С

Использовали реакционную смесь в следующем составе на 25 мкл

на 12 образцов:

Таблица 10- Состав реакционной смеси с праймерами pfhB1 и tadD

71
 Объем на один Объем
Компонент
образец на 12 образцов
KCl 2,5 мкл 30 мкл
dNTP 2,0 мкл 24 мкл
F праймер (pfhB1, tadD) 0,9 мкл 10,8 мкл
R праймер 0,9 мкл 10,8 мкл
Taq полимераза 0,2 мкл 2,4 мкл
MgCl2 1,5 мкл 18 мкл
Деионизированная вода 15,0 мкл 180 мкл
ДНК 2,0 мкл 24 мкл

Во втором эксперименте амплификацию проводили в

амплификаторе «Терцик» (Россия) при следующем режиме:
пре-денатурация: 5 мин, 95 0С
денатурация: 20 с, 95 0С
отжиг: 20 с, 57 0С 30 циклов
синтез: 20 с, 72 С
0

пост-репликация 5 мин, 72 0С

Использовали реакционную смесь в следующем составе на 25 мкл

на 12 образцов:

Таблица 11 – Состав реакционной смеси с праймерами omp87, pfh

Объем на Объем на
Компонент
один образец 12 образцов
KCl 2,5 мкл 30 мкл
dNTP 0.5 мкл 6 мкл
F праймер (omp87, pfh) 0,5 мкл 6 мкл
R праймер 0,5 мкл 6 мкл
Taq полимераза 0,5 мкл 6 мкл
MgCl2 1,0 мкл 12 мкл
Деионизированная вода 14,5 мкл 174 мкл
ДНК 5 мкл 5 мкл

Для амплификации использовали все 3 пары праймеров: omp87, Pfh

B1 b tadD. Результаты амплификации представлены в рисунке 17.

72
 Рисунок 17 - Электрофореграмма продуктов ПЦР с
использованием праймеров omp87, pfhB1, tadD.
А - Программа, где для отжига праймеров использовали
температуру- 520С.
Б - Программа, где для отжига праймеров использовали
температуру - 570С.
М - Маркер молекулярного веса с фрагментами ДНК известных
размеров: 100, 150 и т.д пар нуклеотидов (п.н.).
Из рисунка видно, что при отжиге праймеров при 520С не
получены никакие сигналы амплификации. При температуре 57 0С
произошел слабый отжиг праймеров PfhB1, вследствие чего
нарабатывался незначительное количество ПЦР - продукта.
В следующем эксперименте попробовали увеличить температуры
отжига. При температуре 58 0С выход продукта начинал резко
снижаться, что обусловлено превышением значения критической
температуры для данных пар праймеров. Поэтому, в дальнейших
экспериментах использовали температуру отжига 57 0С.
При проведении следующего эксперимента учитывали важный
момент: если ДНК взята в избытке, то при амплификации могут
появиться неспецифические фрагменты продуктов амплификации.
Поэтому, полученный нашими методами ДНК пастерелл разводили до
1000 раз. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик»
(Россия) при следующем режиме:

пре-денатурация: 5 мин, 95 0С
денатурация: 30 с, 95 0С
отжиг: 30 с, 57 0С 30 циклов
синтез: 30 с, 72 0С
пост-репликация 5 мин, 72 0С

73
 Использовали реакционную смесь следующего состава (300 мкл
на 12 образцов):

Таблица 12- Состав реакционной смеси с праймерами omp 87,

pfhB1, tadD

Объем на Объем на
Компонент
один образец 12 образцов
KCl 2,5 мкл 30 мкл
dNTP 0.5 мкл 6 мкл
F праймер (omp87, pfh) 0,5 мкл 6 мкл
R праймер 0,5 мкл 6 мкл
Taq полимераза 0,5 мкл 6 мкл
MgCl2 1,0 мкл 12 мкл
Деионизированная вода 14,5 мкл 174 мкл
ДНК 5 мкл 5 мкл

Результаты данного эксперимента представлены на рисунке 18.

Рисунок 18 - Электрофореграмма продуктов ПЦР с использованием

праймеров omp 87, pfhB1, tadD
М - Маркер молекулярного веса с фрагментами ДНК известных
размеров: 100, 150 и т.д пар нуклеотидов (п.н.)..

Из рисунка 18 видно, что при использовании праймера pfhB1 на

дорожках 3и 4 образовались полосы, размером 165 п.н.
Для дальнейших исследований использовали праймеры на участок
гена pfhB1: Pm РfhB1 -F - 5`-TGCGAGTATTACGCTACAAG-3` и Pm
РfhB1 – R -5`-TGAACGTCGCTCTGTATAAC-3`
При проведении ПЦР большое значение имеет фермент –
полимераза, которая работает с комплексом элонгации (праймер и
матрица ДНК). Элонгация – этап, на котором происходит основной
синтез ДНК. На данный момент известно, что существует три класса

74
полимераз. Фермент выбирается в зависимости от размера
специфического продукта. В наших исследованиях длина ПЦР-продукта
составляет порядка 165 п.о. Рекомендуемой полимеразой при синтезе
более 1000 п.о. является Taq-полимераза. Для работы Taq-полимеразы, в
основном используют температуру 720С, так как при этой температуре
полимеразная активность максимальна. Однако температура 72 0С
приемлема не для всех случаев. При проведении эксперимента
учитывали важный момент: если матрица взята в избытке, то
полимераза будет "пренебрегать" неудобными участками для синтеза
ДНК. В реальном процессе полимеразе необходимо пройти все
имеющиеся в наличии участки.
Время синтеза определяется скоростью работы Taq-полимеразы и
длиной амплифицируемого фрагмента. При расчётах учитывали, что
для синтеза продукта размером 1000 п.о. необходима 1 минута, чтобы
достроить вновь синтезированные комплементарные цепи ДНК.
Введение же в конце дополнительного времени синтеза (10 мин) при 72
0С обеспечивает завершение синтеза всего имеющегося неполного
амплификата.
В процессе исследований было изучено влияние
продолжительности синтеза на наработку ПЦР продукта. Сокращение
времени синтеза, позволяет сократить время постановки диагноза.
Поэтому, при отработке параметров метода ПЦР большое значение было
уделено экспериментальной оптимизации времени синтеза для
амплификации продукта размером 165 п.о. Первоначально синтез
проводили в течение 1 мин, далее уменьшали время на каждые 10
секунд. Результаты исследований представлены на рисунке 19.

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рисунок 19 - Электрофореграмма продуктов ПЦР с

использованием праймеров pfhB1 при различной продолжительности
синтеза
М – маркер ДНК "50 bp DNA Ladder." BioLabs ", 1 –
отрицательный контроль, 2 – 10 с. синтез, 3 – 15 с., 4 – 20 с., 5 - 25 с., 6 –
30 с., 7 – 40 с, 8 – 50 с, 9 – 60 с.
75
 Из рисунка 19 видно, что при проведении синтеза в течение 10-15
секунд амплификаты отсутствуют. За 20 секунд нарабатывается ПЦР-
продукт c очень низкой специфичностью. При проведении синтеза от 25
до 60 секунд в пробах нарабатывается достаточное количество ПЦР-
продукта размером 165 п.о. Таким образом, полимераза полностью
достраивает вновь синтезированные комплиментарные цепи ДНК за 30
секунд. В дальнейших экспериментах синтез ПЦР-продукта проводили
в течение 30 секунд.
На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных
параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был
составлен следующий режим для проведения ПЦР:
пре-денатурация: 5 мин, 95 0С
денатурация: 30 с, 95 0С
отжиг: 30 с, 57 0С 30 циклов
синтез: 30 с, 72 С
0

пост-репликация 5 мин, 72 0С

2.5.2.2 Подбор оптимальных условий проведения ПЦР

Концентрация MgCl2, KCl и рН буфера в значительной степени
определяют специфичность и чувствительность ПЦР. В случае
изменения параметров буфера для ПЦР происходит качественное или
количественное изменение получаемого амплификата.
Концентрация MgCl2 влияет на отжиг праймеров, денатурацию
образца, кроме того, MgCl2 необходим для поддержания активности
Taq-полимеразы. Однако, избыток хлорида магния может вызывать
получение неспецифического амплификата. Трис-HCl и KСl
обеспечивают необходимую ионную силу и рН смеси. Хлорид калия
является активатором ПЦР и его добавляют для улучшения отжига
праймеров. Предельной концентрацией KСl является 50 мМ, так как
последующие увеличение может привести к ингибированию
полимеразы [223].
Оптимизация концентраций MgCl2 , KСl и рН буфера может
приводить к уменьшению выхода неспецифического продукта и
увеличению выхода амплификата. Рабочие концентрации
перечисленных выше соединений подбираются экспериментальным
путем в процессе оптимизации условий реакции. Данную задачу
значительно облегчают имеющиеся на сегодняшний день наборы для
оптимизации ПЦР.
Для подбора оптимальных условий проведения ПЦР был
использован набор для оптимизации ПЦР – "PCR Optimization Kit II"
фирмы "Sigma".

76
 10 буферных растворов которые, были апробированы в ходе
работы, различались концентрацией хлористого магния и калия, а также
величиной рН.
Состав буферных систем приведен в таблице 13.

Таблица 13 – Состав буферных растворов, используемых при

оптимизации ПЦР

№ Состав ПЦР буфера, х10

буфера
1 100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2, 250 мМ KCl
2 100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl
3 100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 35 мМ MgCl2, 750 мМ KCl
4 100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 15 мМ MgCl2, 250 мМ KCl
5 100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 35 мМ MgCl2, 250 мМ KCl
6 100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 35 мМ MgCl2, 250 мМ KCl
7 100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl
8 100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 35 мМ MgCl2, 750 мМ KCl
9 100 мМ Трис HCl, pH 9,2, 15 мМ MgCl2, 250 мМ KCl
10 100 мМ Трис HCl, pH 9,2, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl

Использовали реакционную смесь для амплификации ДНК объемом

50 мкл следующего состава:
х50 универсальный буфер
(20 мМ ТрисHCl, pH 8.0, 250 нМ ЭДТА - 1 мкл
х10 (один из 10 буферов) ПЦР буфер - 5 мкл
10 мМ dNTP mix - 1 мкл
Праймер Рm 16SRNA- F , (20 пмоль) - 1 мкл
Праймер Рm 16SRNA- R (20 пмоль) - 1 мкл
ДНК Pasteurella multocida - 2 мкл
Taq ДНК полимераза (5 ед) - 0,5 мкл
Деионизированная
стерильная вода - 38,5 мкл
Амплификацию специфического участка проводили на
термоциклере Mastercycler gradient при следующих режимах:
пре-денатурация: 5 мин, 95 0С
денатурация: 30 с, 95 0С
отжиг: 30 с, 57 0С 30 циклов
синтез: 30 с, 72 С
0

пост-репликация 5 мин, 72 0С
По завершению наработки ДНК, полученные пробы детектировали
электрофорезом в 2 % агарозном геле, приготовленном на ТБЕ буфере в
присутствии бромистого этидия.
77
 Полученные результаты представлены на рисунке 20.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

370

370 п.о.

Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000

bp", 1-10 – буферные системы.
Рисунок 20 - Электрофореграмма амплифицированной ДНК
Pasteurella multocida в различных буферных системах и разных режимах

Из полученных результатов видно, что при использовании

буферных систем № 6, 7 и 10 не происходит амплификации фрагмента.
При использовании остальных буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9)
нарабатывается ПЦР-продукт размером 372 п.о., представленный на
рисунке яркими и четкими полосами. Существенных различий при
использовании буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) не наблюдается.
По-видимому, в буферных системах (№ 6, 7 и 10) сочетание более
высокой рН и использование данных концентраций MgCl2 и KCl
приводит к ингибированию реакции.
Ферменту Taq-полимеразе при проведении ПЦР отводится
основная роль. Концентрация фермента в реакции подбирается в
зависимости от индивидуальной ДНК мишени или праймеров. Если
концентрация фермента слишком высокая, то могут образовываться
неспецифические продукты, а если слишком низкая, то образуется не
достаточное количество амплификата. При подборе оптимальной
концентрации брали активности фермента в реакционной смеси от 0,05
ед до 0,5 ед/50 мкл, и детектировали результаты амплификации гель-
электрофорезом в 2 % агарозе, которые представлены на рисунке 21.

78
 М 1 2 3 4 5 6

370п.о
.

Примечание - 1 – 0,05 ед; 2 – 0,1 ед; 3 – 0,2 ед; 4 – 0,3 ед; 5 – 0,4 ед; 6
– 0,5 ед; M –маркер "Direct LoadTM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50
п.о."
Рисунок 21 - Оптимизация концентрации Taq ДНК-полимеразы в
реакционной смеси при обнаружении ДНК Pasteurella multocida методом
ПЦР

Как видно из рисунка 21 концентрация Taq ДНК-полимеразы

влияет на выход конечного продукта: с повышением концентрации
фермента в реакционной смеси интенсивность полос увеличивается,
что свидетельствует о достаточной концентрации ДНК. При активности
фермента всего 0,05 ед нарабатывается ПЦР-продукт, который
достаточно легко визуализировать в 2 % агарозном геле в присутствии
бромистого этидия под УФ-светом. Нужно отметить, что в
разрабатываемой тест-системе полимераза является самым дорогим
компонентом. Поэтому для разрабатываемой нами реакции мы выбрали
наименьший расход фермента – 0,05 ед.
Специфичность и эффективность синтеза копий нуклеиновых
кислот в ходе ПЦР зависят не только от качества и свойств ДНК-
полимеразы. Огромное значение придается и качеству других
компонентов реакционной смеси. Mg2+ необходим для
функционирования Taq - полимеразы. Чтобы определить и создать
оптимальный избыток несвязанного иона в рамках 0,5-2,5 мМ
оптимальную концентрацию магния устанавливали путем титрования.
Диапазон рабочих концентраций: 0.5-5.0mM так как 10mM - ингибирует
полимеразу на 40-50%. Увеличение концентрации Mg2+ оказывает
очень резкое влияние на специфичность и эффективность ПЦР:
увеличивается выход ПЦР продукта, но более высокими темпами
уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей
матрицы и праймеров.
Результаты представлены
420п.н. на рисунке 22.2 3 4 5
пппп.о.мп.о п.о
79
 В наших экспериментах мы изучили влияние концентрации
хлорида магния, начиная с 1,5 мМ постепенно повышая концентрацию
до предельного значения 4,0 мМ.

М 1 2 3 4 5 6
6666

370 п.н.

Примечание – 1- отрицательный контроль; 2 - 1,5 мМ; 3 – 2,0 мМ;

4 – 2,5 мМ; 5 – 3,0 мМ; 6 – 3,5; M- маркер ДНК "Amplisize Molecular
Ruler 50-2000 bp"
Рисунок 22 - Оптимизация концентрации MgCl2 в реакционной
смеси при обнаружении ДНК Pasteurella multocida методом ПЦР

Как видно из рисунка 22, изменение концентрации соли в

пределах 1,5-2,5 мМ существенно не влияло на процесс амплификации.
0
пппп.о.мп.о п.о
Выход специфического ПЦР-продукта был приблизительно одинаков.
Нужно заметить, что и при концентрации MgCl2 2,5 мМ нарабатывалось
достаточно большое количество специфического продукта. На
основании полученных экспериментальных данных в дальнейших
экспериментах при проведении ПЦР, для приготовления реакционных
смесей использовали концентрацию соли 1,5 мМ.
Дальнейшие исследования по оптимизации ПЦР проводили,
используя различные, так называемые активаторы ПЦР. Соли хлорид
калия в концентрации 10-50 мМ или сульфат аммония в концентрации
10-20 мМ добавляют для улучшения отжига праймера. В некоторых
методиках рекомендуют использовать неионные детергенты Triton
X100, Nonidet NP40 и Tween 20, 10 % в концентрации 0,05-0,1 %, буфер
с сахарозой для стабилизации фермента. Однако роль денатурирующих
агентов для нарушения вторичной структуры ДНК двояка: они могут
не только способствовать полной денатурации матрицы, но и вызывать
частичную инактивацию Taq-полимеразы и снижение выхода продукта
80
амплификации. Формамид обычно используется для увеличения
специфичности ГЦ богатых матриц. Глицерин – для стабилизации
полимеразы и понижения температуры необходимой для разделения
нитей, бетаин – оказывает очень заметное стабилизирующее влияние на
реакцию (суппрессируется действие различных ингибиторов,
температуры плавления различных матриц становятся более близкими).
Но нужно иметь в виду, что бетаин заметно снижает критическую
температуру отжига праймеров. Нитевой связующий белок используется
для стабилизации однонитевой ДНК, ускоряет процесс отжига
комплиментарного праймера к ДНК-образцу. В наших экспериментах в
качестве добавочных компонентов использовали сахарозу, тритон Х-
100, глицерин, бетаин и нитевой связующий белок. В качестве контроля
в реакционную смесь вносили деионизированную воду. Результаты
проведенных исследований представлены на рисунке 23.

М 1 2 3 4 5 6 М

370 п.н.

Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000

bp", 1 -бетаин , 2 - нитевой связующий белок , 3 - глицерин, 4 - тритон
Х-100, 5 - сахароза, 6 - деионизированная вода (контроль).
Рисунок 23 - Электрофореграмма амплифицированной ДНК
Pasteurella multocida с различными добавками

На представленной электрофореграмме видно, что внесение

добавочных компонентов (глицерина, тритона Х-100) в основной буфер
приводит к ингибированию реакции. Незначительное положительное
влияние на амплификацию специфического продукта оказало
добавление 5% сахарозы, по видимому, за счёт стабилизации фермента,
что видно при сравнении с контролем. Добавление бетаина и нитевого
связующего белка существенного влияния на процесс амплификации не
оказывает. Основываясь на вышеперечисленных результатах, мы не
стали включать добавочные компоненты в рабочий буферный раствор.
81
 Таким образом, результаты экспериментов по оптимизации
концентрации компонентов реакционной смеси позволили использовать
реакционную смесь следующего состава (50 мкл): х10 ПЦР буфер (100
мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl) 10 мкл, 1 мкл dNTP
(10 мМ), по 1 мкл праймеров (20 пмоль каждый), 0,05 ед Taq-
полимеразы в конечной концентрации.
После того как были отработаны основные этапы метода ПЦР, мы
определили время, которое затрачивается на стадии проведения реакции
и детекцию. Для постановки диагноза достаточно 1ч 25 минут.
В последние время одной из основных тенденций развития метода
ПЦР и его модификаций является сокращение времени проведения
анализа. Данный факт очень важен при проведении исследований во
время возникновения вспышек инфекции и в затруднительных
ситуациях при постановке диагноза традиционными методами. Далее
был проведен сравнительный анализ условий временного режима с
аналогичными работами, представленными в литературе. В работе
Miflin J.K., Blackall P.J. [196] на 1 цикл ПЦР затрачивается 3 минуты,
что в 3 раза увеличивает время проведения исследований при сравнении
температурно-временным режимом настоящей работы. Townsend K..M
и др. [206] синтезировал специфический участок размером 372 п.о. при
72 0С в течение 2 минут. Результаты наших исследований показывают,
что для работы сконструированных нами специфических праймеров и
наработки ПЦР-продукта размером 372 п.о. для отжига и синтеза
достаточно по 20 секунд, соответственно. При сопоставлении с работой
Townsend K..M температурно-временной режим сокращается в 4 раза и
тем самым значительно уменьшается общее время проведения
исследований. При сравнении ПЦР условий, предложенными
Афонюшкиным В.Н., [218], в отработанном нами методе на каждый
цикл реакции требуется на 30 секунд меньше. Это позволяет выявлять
ДНК Pasteurella multocida в более короткий срок.
Полученные нами результаты делают отработанный метод ПЦР
наиболее эффективным, который позволяет увеличить скорость
постановки диагноза.

2.5.3 Определение чувствительности ПЦР при диагностике

пастереллеза
Одним из главных достоинств ПЦР является чрезвычайно высокая
чувствительность.
После определения основных параметров разрабатываемого
метода ПЦР для диагностики пастереллеза КРС, были проведены
эксперименты по определению чувствительности данного метода. При
изучении чувствительности ПЦР использовали разработанные
оптимальные температурные и временные условия реакции. В наших
82
экспериментах для выявления ДНК Pasteurella multocida использовали
различные разведения ДНК штамма 90 Pasteurella multocida. Для
проведения ПЦР делали 10-ти кратные разведения ДНК бактерии от 500
нг до 0,05 пг. Результаты данного эксперимента представлены на
рисунке 20.
В работе Nagai S, чувствительность метода ERIC -ПЦР для
диагностики пастереллеза с использованием праймеров на участок toxA
гена достигала всего 25 пг [166]. Порог чувствительности метода
геномных «отпечатков пальцев» ПЦР в работах индийских ученых
составил 1-10 фг [173,176].Чувствитеьность метода геномных
«отпечатков пальцев» на порядок выше. Метод ПЦР разработанный
Saxena MK, et al.при диагностике пастереллеза позволяет выявлять ДНК
пастерелл в количестве 500 нг-50 фг в пробе [164].
Таким образом, по литературным данным, порог
чувствительности различных модификаций метода ПЦР для выявления
ДНК Pasteurella multocida варьирует в пределах 50 пг-50 фг.

370 п.н.

Примечание - ДНК штамма 90 Pasteurella multocida в

концентрациях: 1 – 500 нг; 2 – 50 нг; 3 – 5 нг; 4 – 500 пг; 5 – 50 пг; 6 – 5
пг; 7 – 0,5 пг; 8 –0,05 пг. М – маркер ДНК “Direct LoadTM Wide Range
DNA Marker, 50 – 10000 bp”.

Рисунок 24 - Определение чувствительности ПЦР при выявлении

ДНК Pasteurella multocida

Как видно из рисунка3724 чувствительность метода ПЦР составила

0,5 пг ДНК Pasteurella 370
multocida
п.н. в пробе. Результаты экспериментов
83
показали, что отработанный метод ПЦР обладает высокой
чувствительностью.
Результаты наших исследований по определению
чувствительности не уступают аналогичным работам зарубежных
ученых. Значение порога чувствительности 0,5 пг в пробе и сокращение
времени проведения диагноза повышают диагностическую ценность
отработанного метода.

2.5.4 Определение специфичности ПЦР при пастереллезе КРС

Чувствительность и специфичность - основные достоинства,
определяющие преимущество метода ПЦР по сравнению с
традиционными методами. Специфичность метода ПЦР основана на
уникальности ДНК, поэтому многократно превосходит другие методы
диагностики, в том числе ИФА.
Дальнейшие исследования проводили по определению
специфичности разработанной нами и оптимизированной ПЦР. В работе
Chang P.C и Lee Y. специфичность ПЦР проверяли, используя ДНК-
образцы, выделенные из Haemophilus influenzae и Escherichia coli, В.
pertussis. Ни в одном из образцов не нарабатывались специфические
продукты, что доказывало высокую специфичность метода. В своей
работе Townsend K.M специфичность метода проверял, используя
бактериальные инфекции, симптомы которых очень похожи между
собой, и другими методами эти инфекции дифференцировать очень
трудно [189]. В экспериментах использовали ДНК штамма Pasteurella
multocida 90.
ПЦР-продукт размером 372 п.о. нарабатывался только в пробах,
содержащих ДНК Pasteurella multocida.
Для определения специфичности ПЦР в наших экспериментах
использовали штаммы Escherichia coli, Salmonella dublin, Salmonella
typhimurium, Listeria monocitogenes, Brucella abortus, Mycobacterium
bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Lysteria monocytogenes
В качестве положительного контроля при постановке ПЦР
использовали ДНК Pasteurella multocida штамм 90, в качестве
отрицательного контроля использовали деионизированную воду.
Результаты исследований представлены на рисунке 25.

84
 370 п.н.

М – маркер «Direct LoadTM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50

п.о.», 1- контроль (Н2О), 2,3 - ДНК штамма 90 Pasteurella multocida, 4 -
ДНК Escherichia coli ; 5 - ДНК Salmonella typhimurium; 6,7 – ДНК
Pasteurella multocida штамм К1 и К2; 8,9 - ДНК Pasteurella multocida из
органо-тканевого материала, 10 - ДНК Salmonella Dublin, 11 - Brucella
abortus, 12 - Mycobacterium bovis, 13 – ДНК Listeria monocitogenes.
Рисунок 25 - Электрофореграмма продуктов амплификации при
использовании праймеров Рm РfhB1- F и Рm РfhB1- R

Как видно из рисунка 25 только в пробах, содержащих ДНК

Pasteurella multocida нарабатываются специфические продукты реакции
размером около 372 п.о. (2-4, 9, 11-14). Отрицательные результаты
были получены при использовании в качестве матриц ДНК Escherichia
coli (4), Salmonella typhimurium (5), Listeria monocitogenes (13),
Mycobacterium bovis (12), а также при использовании в качестве матриц
ДНК Salmonella Dublin, Brucella abortus. Отсутствие каких-либо
продуктов амплификации наблюдается и с деионизированной водой (1).
Полученные результаты демонстрируют специфичность разработанного
нами метода.
Таким образом, результаты проведенных экспериментов
показывают высокую специфичность разработанного метода ПЦР.

2.6 ПЦР тест-система для выявления ДНК

На основании результатов разработанного метода ПЦР был
составлен опытный образец тест-системы для выявления пастереллеза
КРС в биологическом материале, с электрофоретической детекцией
продуктов амплификации в агарозном геле. Состав основных
компонентов набора, необходимых для постановки реакции ПЦР: буфер
для проведения реакции, специфические олигонуклеотиды (праймеры),
85
ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, стерильная
ПЦР-вода и контрольная ДНК.
Термостабильная ДНК полимераза (Taq DNA Polymerase) и смесь
дНТФ являются коммерческими препаратами и приобретаются в
готовом виде.
Объем составных компонентов реакции рассчитывался из расчета
на проведение 100 тестов, т.е. анализа 100 проб, как исследуемых
образцов, так и положительных и отрицательных контролей. В таблице
11 представлены комплект реагентов для проведения ПЦР по
обнаружению ДНК Pasteurella multocida.
Состав10х ПЦР-буфер: 100 мM Трис HCl, pH 8,3, 15 мM MgCl2,
750 мM KCl. Данный рабочий буферный раствор был подобран при
оптимизации метода ПЦР. Для приготовления буфера использовали
стерильную деионизированную воду и химические реагенты высокой
чистоты.
Специфические праймеры, используемые при выявлении ДНК
Pasteurella multocida, были сконструированы после компьютерной
обработки полного генома Pasteurella multocida программой DNASIS
MAX 1.0. Подобранные праймеры синтезировали на синтезаторе
олигонуклеотидов Expedite 8909 фирмы Applied Biosystems.
Раствор синтезированных праймеров предварительно высушивали
на ротационном испарителе и растворяли в деионизированной воде. С
целью очистки праймеры переосаждали спиртом и осадок
олигонуклеотидов перерастворяли в стерильной воде до конечной
концентрации 20 пмоль.
В качестве положительного контроля мы предлагаем использовать
ДНК штамма 90 Pasteurella multocida. Используемую в качестве
положительного контроля ДНК Pasteurella multocida получали по
методике, отработанной в лаборатории и представленной в разделе
материалы и методы. На конечном этапе выделения ДНК растворяли в
ТЕ буфере до конечной концентрации 10 мкг/см 3.

86
 Таблица 14 - Комплект реагентов для постановки ПЦР при
выявлении ДНК Pasteurella multocida

Наименование Объем Тип упаковки Количество

компонентов в наборе компонен пробирок
та (мкл) (шт.)
Комплект реагентов для 500 Пластиковый флакон 1
выделения ДНК объемом 50,0 см3
Раствор смеси
специфических праймеров Пластиковая пробирка
100 1
Рm РfhB1- F и Рm РfhB1- R, объемом 1,5 см3
по 20 пмоль
Раствор смеси Пластиковая пробирка
нуклеозидтрифосфатов 100 объемом 1,5 см3 1
(дНТФ), 10 мМ
Раствор термостабильной Пластиковая пробирка
ДНК полимеразы (Taq- 50 объемом 1,5 см3 1
полимераза), 5 Ед/мкл
Раствор: Пластиковая пробирка
неинфекционная ДНК объемом 1,5 см3
Pasteurella multocida 500 1
(положительный контроль),
10 мкг/мл
10х ПЦР-буфер Пластиковая пробирка
400 2
объемом 1,5 см3
Стерильная ПЦР-вода 800 5

Одним из компонентов, используемых при постановке реакции

ПЦР, является вода, к которой предъявляются очень большие
требования. Воду готовили в системе высокой очистки Milli RO и Milli
Q фирмы Labconco, обеспечивающей качество воды в 16 МОм и
отсутствие микроорганизмов. Деионизированную воду разливали в
пробирки и автоклавировали. Все компоненты хранятся при минус 20
0
С.
Прежде всего, работоспособность созданной ПЦР тест-системы
была протестирована на вакцинных и вирулентных штаммах Pasteurella
multocida, которыми располагает музей микроорганизмов лаборатории
противобактериозной биотехнологии. Результаты одного из опытов по
испытанию тест-системы для выявления ДНК Pasteurella multocida
представлены на рисунке 26.

М 1 2 3

87
 370 п.н.

Примечание - 1 – ДНК Pasteurella multocida штамм 90 , 2 - ДНК

М
Pasteurella multocida эпизоотический 1штамм;
2 3 – 3ДНК Pasteurella
multocida эпизоотический штамм, М – маркер ДНК "Amplisize Molecular
Ruler 50-1000 bp".

Рисунок 26- Электрофоретический профиль разделения ПЦР

продуктов при апробации тест-системы по выявлению ДНК разных
штаммов Pasteurella
370 п.н. multocida методом ПЦР

Результаты испытаний показали, что в пробах 1, 2, и 3

нарабатывается ПЦР-продукт размером 372 п.о., что указывает на
присутствие в исследуемых пробах ДНК Pasteurella multocida. В то
время как в отрицательной контрольной пробе каких-либо продуктов
амплификации обнаружено не было.
Следующим шагом, разработанный опытный вариант ПЦР тест-
системы опробовали на патологическом материале. Образцы проб
органов павших и вынужденно убитых телят с подозрением на
пастереллез были доставлены из Илийского района Алматинской
области. Из полученных органов была приготовлена 20 % суспензия,
затем выделена ДНК Pasteurella multocida с использованием протеиназы
К и ДСН. Проводили ПЦР используя оптимизированные условия.
Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунке 27.

88
 М 1 2 3 4 5 6 7

370 п.о
М 1 2п.о
пппп.о.мп.о
3 3704 п.н. 5
6 7

Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000

bp", 1 – ДНК Pasteurella multocida штамм 90 (положительный контроль) ,
2-8 - 20 % суспензия органов (легкие, сердце) от павших телят из
Илийского района Алматинской области от 26.07.2004 г, 9 –
отрицательный контроль.

Рисунок 27 - Электрофоретический профиль разделения ПЦР

продуктов при апробации тест-системы по выявлению ДНК Pasteurella
multocida из патологических материалов методом ПЦР

Из рисунка 27 видно, что на дорожках 2 - 8 образуются полосы,

лежащие на одном уровне с положительным контролем. Данный факт
позволяет заключить, что во всех исследуемых пробах методом ПЦР с
последующей детекцией электрофорезом выявлено ДНК Pasteurella
multocida.
Таким образом, результаты испытаний показывают, что
разработанный лабораторный образец ПЦР тест-системы позволяет
выявлять ДНК Pasteurella multocida, выделенную из различных
штаммов, также и из патологических материалов.

2.7 Использование метода ПЦР для обнаружения ДНК

Pasteurella multocida у больных животных из неблагополучных по
пастереллезу хозяйств
В июле 2012 года произошла энзоотическая вспышка
пастереллеза среди крупного рогатого скота, принадлежащих АО
«Север» Мендыкаринского района. У нескольких животных в группе
проявились клинические признаки болезни: угнетение, отсутствие

89
аппетита, высокая температура. Из патматериала от 2 голов вынужденно
забитых коров бактериологически был установлен пастереллез.
У всех животных данной группы (22 головы) была взята кровь для
исследования методами ИФА и ПЦР (таблица 15). Для исследования
методом ИФА использовали набор для выявления антител к
пастереллезу животных фирмы «Synbiotics Europe» (Франция).

Таблица 15 – результаты сравнительных исследований крови КРС

№ Идентиф № Бактериол ИФА ПЦР

1 2226 + + +
2 2297 + + +
3 2749
- +
4 2016
5 2309 + +
6 2798 - -
7 2795 - -
8 2738 + +
9 2268 + +
10 1879
+ +
11 336
12 876 - +
13 3100 - -
14 2338 - -
15 3100 + +
16 1314 - +
17 2751
+ -
18 419
19 2726 - +
20 795 - -
21 712 - +
22 17 + +

Как видно из таблицы, бактериологически был исследован

материал только от 2 голов животных. При исследовании методом ИФА
выявлено 9 положительных проб. При исследовании методом ПЦР - 11
положительных проб. Метод ПЦР можно применять для выявления
пастереллоносителей в хозяйствах.

2.8 Разработка способа отбора и доставки патологического

материала при пастереллезе крупного рогатого скота для
исследования методом полимеразно-цепной реакции
Качественное взятие и доставка материала является одним из
стандартизирующих и предопределяющих моментов всего
лабораторного исследования. Особое значение имеет стандартизация

90
процесса транспортировки проб в лабораторию. Общее правило:
доставить материал в лабораторию как можно быстрее. При
транспортировке учитывается стабильность отдельных проб для
исследований в зависимости от времени, температуры, воздействия
прямого света.
Для ПЦР исследования способы доставки биологического
материала разработаны в общих чертах. В методических рекомендациях
«Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-
диагностики» (Москва, 2003), способ доставки носовых и ротовых
истечений для исследования на пастереллез также не описан. Главным
условием предложенных в рекомендации способов является свежесть,
быстрота доставки материала для исследования, что не всегда бывает
возможным. В Республике Казахстан методики по забору,
транспортировке патологического материала для исследования
методом ПЦР не разработаны.
Поэтому в процессе работы перед нами стояла задача разработки
способа доставки истечений из носовой и ротовой полостей для
исследования методом ПЦР, который бы продлевал сроки
транспортировки биоматериала.
Сущность разработанного нами способа доставки носовых и
ротовых истечений заключается в следующем: в слюне и носовой слизи
содержатся ферменты, выполняющие бактериолитические функции:
лизоцим, протеазы, пептидазы, щелочная и кислая фосфатазы, РНКазы.
Вместе с бактерией лизируется и бактериальная ДНК. Для проведения
ПЦР анализа необходимо наличие нефрагментированной геномной
ДНК, так как она служит матрицей для синтеза специфического
продукта.
Истечения для исследования брали стерильными ватными
тампонами и помещаются в стерильную одноразовую пробирку с 0,9%
физиологическим раствором. Пробирки с пробами истечений
выдерживаются в кипящей водяной бане в течение 10 минут, в
результате чего разрушаются ферменты слюны и носовой слизи, тем
самым устраняется их лизирующее действие, также лизируются
бактериальные клетки и выделяется ДНК. Затем в пробирки
добавляется 96% этиловый спирт в соотношении 1 : 4. Выделенная ДНК
консервируется этиловым спиртом, что продлевает срок доставки
истечений для исследования на пастереллез до 24 часов. Преимущество
данного способа заключается в том, что увеличивается срок доставки
материала для исследования до 24 часов при комнатной температуре.
При исследовании крови и носовых и ротовых истечений
доставленных от больных животных п. Прогресс, с/о Айдарлы, п.
Челгаши Карасуского района в года не удавалось выделить

91
качественную ДНК, так как из-за дальности расстояния пробы
материала доставлялись в течение 8 -12 часов.
В КХ «Дастан» с/о Тастинский Амангельдинского района
произошла вспышка пастереллеза среди крупного рогатого скота. В
хозяйстве пали 2 коровы, у 8 голов крупного ргатого скота наблюдались
клинические признаки болезни. В лабораторию через 12 часов было
доставлено для исследования методом ПЦР 10 проб крови,
консервированных 3% раствором ЭДТА, кусочки органов от павших
коров в термочемоданах и 5 проб истечений из ротовой и носовой
полостей, выдержанных на кипящей водяной бане в течение 10 минут и
консервированных 96% этиловым спиртом в соотношении 1:4 (рисунок
28).

Примечание – 1 – 5 дорожки – ДНК носовых истечений,

выдержанных на кипящей водяной бане в течение 10 минут и
консервированных 96% этиловым спиртом в соотношении 1:4; 6 - ДНК
крови, консервированной 3% раствором ЭДТА; 7 – ДНК из органов,
доставленных в термочемоданах.
Рисунок 28 – Электрофореграмма проб материала из КХ
«Дастан» доставленных через 12 часов

Как видно на фореграмме при проведении электорофореза

выделенных ДНК органов, доставленных в неконсервированном виде в
термочемоданах и консервированной крови не удавалось выделить
качественную ДНК, если с момента взятия пробы проходило больше 10
часов. Электрофореграммы показывали лишь шмеры.
В процессе экспериментов нами проводилось выделение ДНК из
проб истечений доставленных из хозяйств «Викторовское»
Тарановского района, ТОО «Восток», АО «Север» Мендыкаринского
92
района, п. Челгаши Карасуского района в разные промежутки времени:
через 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 часов (рисунок 25).
Как видно на рисунке 27, через 3 часа после взятия материала ДНК
выделяется из всех проб истечений: доставленных в стерильных
пробирках с без консервантов, в термочемоданах без консервантов и
подготовленных к доставке по нашей методике. Через 6 часов из проб
истечений, доставленных без консерванта выделяется около 50% ДНК.
Из проб истечений доставленых в термочемоданах без консервантов
через 6 часов выделяется около 70% ДНК. Из проб истечений,
подготовленных к доставке по нашей методике ДНК выделяется в
количествах достаточных для проведения генотипических исследований
до 24 часов.

%
80

70

60

50

40

30

20

10

0
3 6 9 12 15 18 21 24 27 часы
кипячение
в термочемоданах
без консервации

Рисунок 29 - Выход ДНК при различных способах доставки

проб истечений

Таким образом, нами разработан оптимальный способ доставки

носовых и ротовых истечений для исследования методом ПЦР при
пастереллезе крупного рогатого скота, заключающийся в
кратковременном кипячении в течение 10 минут на водяной бане проб
истечений, в результате чего лизируются ферменты слюны и носовой
слизи и выделяется ДНК, которая консервируется добавлением 96%
этилового спирта в соотношении 1 : 4, что продлевает срок доставки
истечений для исследования на пастереллез до 24 часов.

93
 3 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ данных литературы показал, что пастереллезная инфекция

имеет широкое распространение во многих странах, в том числе и в
Республике Казахстан. На территории Казахстана, согласно данным
ветеринарной отчетности, имеются энзоотические вспышки
пастереллеза среди крупного рогатого скота, лошадей, свиней, птиц.
К пастереллезу восприимчивы крупный рогатый скот, лошади,
мелкий рогатый скот, буйволы, козы, свиньи, грызуны, кошки, собаки,
дикие животные, домашние и дикие птицы.
Диагноз пастереллеза ставится комплексно, с учетом данных
эпизоотологии, клиники, данных патологоанатомических изменений и
бактериологического исследования. Каждый из методов диагностики
имеет ценность лишь в совокупности с другими методами, в
особенности с результатами патологоморфологических и лабораторных
исследований.
Совокупность сведений по эпизоотологии, клинической и
патологоанатомической картине дает право на постановку
предварительного диагноза, результаты же бактериологических и
биологических исследований позволяют поставить диагноз
окончательно.
Серологический диагноз при пастереллезе имеет меньшее
значение, чем такие методы диагностики, как бактериологический и
биологический, так как болезнь протекает быстро. Но с целью
своевременного и более полного выявления и в неблагополучных и в
благополучных хозяйствах скрытых больных и животных-
пастереллоносителей применение серологических реакций имеет
немалое значение.
На сегодняшний день наиболее часто используемым
диагностическим методом для диагностики пастереллеза является ИФА-
диагностика. В настоящее время в России и Казахстане для
исследований на пастереллез животных используется набор для
выявления антител к возбудителю пастереллеза (Pasteurella multocida)
иммуноферментным методом фирмы «Synbiotics Europe» (Франция).
Являясь косвенным методом, ИФА определяет лишь белки-маркеры -
продукты жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь
опосредованное свидетельство наличия инфекции.
В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА), ПЦР-
диагностика позволяет определять непосредственно возбудителя
заболевания. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что
в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только
для данного возбудителя фрагмент ДНК. Высокая чувствительность
метода позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или
94
вирусов. К преимуществам метода можно отнести высокую скорость
получения результата анализа и возможность диагностики острых,
вялотекущих и скрытых инфекций.
Результаты исследований, проведенные учеными разных стран,
также показывают, что молекулярные методы выявления и типирования
Pasteurella multocida превосходят обычные методы в случае
необходимости быстрых эпизоотологических исследований
геморрагической септицемии и могут использоваться в
эпизоотологических исследованиях как программа мониторинга.
Современные молекулярные методы, такие как ПЦР, анализ
ферментной рестрикции, риботипирование, пульс гель электрофарез,
генное клонирование, характеристика и экспрессия рекомбинантных
белков, мутагенез, анализ плазмид и бактериофагов и геномная
картография, очень увеличили понимание Pasteurella multocida, и
предоставили исследователям много молекулярных инструментов для
изучения патогенеза и эпизоотологии данного возбудителя на
молекулярном уровне.
Из вышеизложенных данных можно заключить, что для
диагностики бактериальных инфекций в зарубежных странах
внедряется метод ПЦР и его различные модификации. Поэтому
разработка, адаптирование и внедрение в ветеринарную практику в РК
тест-системы (праймера) для диагностики пастереллеза крупного
рогатого скота на основе ПЦР – требование сегодняшнего дня.
В Костанайской области случаются вспышки пастереллеза
животных и птицы. За период с 2012 по 2015 гг. в области выделение
культур Pasteurella multocida из патматериала от крупного рогатого
скота начиная с 2013 года растет: в 2013г 5,8%, в 2014 г - 8,3%, в 2015г -
12,5%. Наибольший процент выделения культур за анализируемый
период наблюдается у свиней – 15,5%, крупного рогатого скота – 7,3%
и птицы – 6,7%.
Были изучены основные биологиеские свойства пастерелл:
полиморфизм, отрицательная окраска по Граму, выраженная
биполярность при окрашивании по Романовскому-Гимзе, наличие
капсулы при окраске по Михину, рост в аэробных условиях на обычных
питательных средах, но лучше с добавлением сыворотки лошади,
образование на плотных питательных средах гладких S-форм колоний с
радужным свечением в косопроходящем свете, рост на МПБ, бульоне
Хоттингера сопровождающиеся помутнением среды с последующим
просветлением с образованием слизистого осадка, при встряхивании
поднимающегося в виде косички, способность образовывать индол и
сероводород, не способность гемолизировать эритроциты,
вариабельность биохимических свойств. Производственные и

95
эпизоотические штаммы пастерелл обладают вирулентными и
антигенными свойствами.
Результаты качественного и количественного анализа препаратов
ДНК показали, что наилучшим является метод с использованием
додецилсульфата натрия и протеиназы К.
По результатам рестрикционного анализа среднее значение
размера ДНК штамма 90 Pasteurella multocida составило 2.353 kb.
Полученные данные в дальнейшем можно использовать для
дифференциации штаммов на основе ПЦР с последующим
рестрикционным анализом.
В наших экспериментах для дизайна праймеров была использована
последовательность гена pfhB1: Pm РfhB1 -F - 5`-
TGCGAGTATTACGCTACAAG-3` и Pm РfhB1 – R -5`-
TGAACGTCGCTCTGTATAAC-3` Pasteurella multocida.
Были сконструированы и синтезированы специфические
праймеры на участки генов pfhB1.
Были определены временные и температурные условия
амплификации, проводили оптимизацию содержания компонентов в
реакционной смеси и отработку ПЦР.
На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных
параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был
составлен следующий режим для проведения ПЦР:
пре-денатурация: 5 мин, 95 0С
денатурация: 30 с, 95 0С
отжиг: 30 с, 57 0С 30 циклов
синтез: 30 с, 72 С
0

пост-репликация 5 мин, 72 0С
Были отработаны оптимальные условия проведения ПЦР по
составу солевого буфера ( концентрация MgCl2 и KCl, рН буфера),
оптимизирована концентрация Taq ДНК-полимеразы, добавочных
компонентов буфера.
Порог чувствительности метода ПЦР с различными
модификациями для выявления ДНК Pasteurella multocida составил 0,5
пг в пробе и сокращение времени постановки диагноза (20 сек.) -
повышают диагностическую ценность отработанного метода.
Полученные нами данные показывают высокую специфичность
разработанного метода ПЦР.
Результаты испытаний показали, что разработанный лабораторный
образец ПЦР тест-системы позволяет выявлять ДНК Pasteurella
multocida, выделенную из различных штаммов, также и из
патологических материалов.

96
 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Своевременная и точная диагностика инфекции является одним из

основных факторов в недопущении ее распространения, что позволяет
предотвращать и существенно снижать экономические потери. Для
лабораторной диагностики и идентификации пастереллеза на
сегодняшний день разработаны и применяются различные
культуральные, серологические и иммунологические методы. Все они
имеют различную диагностическую ценность – одни требуют
значительных затрат по времени, другие имеют низкую
чувствительность и специфичность. В связи с молниеносным течением
инфекции вопросы прижизненной диагностики пастереллеза до
настоящего времени остаются нерешенными. Поэтому
усовершенствование и разработка более чувствительных и
специфичных, а также экспрессных методов лабораторной диагностики,
остается актуальной проблемой и до настоящего времени
В контексте поставленных задач полимеразная цепная реакция
(ПЦР) является наиболее совершенным диагностическим методом,
позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих
инфекционных заболеваний за счет многократного копирования
участков специфических последовательностей ДНК. Прямое
определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая
чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство
проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на
проведение анализа сделали метод ПЦР незамениным. В связи с этим,
нами были проведены исследования по разработке метода ПЦР для
детекции ДНК Pasteurella multocida, а так же изучена эффективность
разработанного метода для диагностики болезни.
1 Для разработки ПЦР необходимо наличие нативных и
высокоочищенных полноразмерных нефрагментированных препаратов
геномной ДНК Pasteurella multocida во избежание получения
недостоверных результатов. Поэтому необходимо было отработать
схему выделения, позволяющую получить высокоочищенные препараты
ДНК. В экспериментах по выделению ДНК Pasteurella multocida
использовали выделенные эпизоотические штаммы и музейные штаммы
Pasteurella multocida. Существует множество методов для выделения
нуклеиновой кислоты бактерий. Нами для выделения бактериальной
ДНК были испытаны методы с использованием додецилсульфата натрия
(ДСН) в комплексе с протеиназой К, а также детергента Nonidet P-40 и
Тween 20 с последующей фенольной депротеинизацией. Лучшие
результаты при выделении ДНК из бактерий Pasteurella multocida
достигались при обработке суспензии детергентом – 10 % ДСН в
сочетании с протеиназой К, с последующей экстракцией
97
фенол/хлороформом. Отношение оптической плотности (Е260/Е280)
полученных препаратов ДНК Pasteurella multocida имело средние
значение 1,940,04 (n=5). Данный метод обеспечивал более высокий
выход нативной нуклеиновой кислоты до 80 %.
2 Проведенный реcтрикционный анализ ДНК Pasteurella multocida
позволил показать, что размер геномной ДНК штамма Pasteurella
multocida 90, составляет 2,353 8 п.о. Результаты наших исследований
согласуются с данными литературы.
3 Основным этапом при разработке ПЦР является разработка
праймеров для детекции, в нашем случае, ДНК Pasteurella multocida.
Правильный подбор пар праймеров является одним из основных
факторов, влияющих на специфичность реакции. Для конструирования
и компьютерного моделирования олигонуклеотидов был проведен поиск
и отбор нуклеотидной последовательности отдельных генов генома
Pasteurella multocida. Поиск проводили на сайте NCBI с базой данных
GenBank, Результаты поиска показали, что в Genbank депонирована одна
полная нуклеотидная последовательность генома Pasteurella multocida
(NC006623) и множество отдельных генов.
С использованием компьютерных программ были определены
наиболее консерватиные и вариабельные участки гена pfhB1, которые
были использованы для подбора праймеров. Для наибольшей
специфичности праймерам учитывали все критерии, предъявляемые к
олигонуклеотидам для ПЦР. В результате компьютерного анализа было
сгенерировано 21 пара праймеров, которые в дальнейшем проходили
апробацию. Была отобрана пара праймеров для проведения ПЦР,
которые были названы Рm pfhB1- F (прямой) и Рm pfhB1- R(обратный),
а продукт амплификации составлял 372 п.о.
4 В результате проведенных экспериментальных работ по подбору
оптимальных температурно-временных параметров амплификации и
определению состава реакционной ПЦР смеси были определены2,353 8
(n=5) п.о условия постановки ПЦР, при которых происходит
специфическая наработка ПЦР продукта размером 372 п.о. и в
достаточном количестве. На основании полученных данных можно
заключить, что для наработки специфического продукта достаточно 0.05
ед. активности фермента в реакционной смеси. Концентрация магния
существено не влияет на процесс амплификации. Так же не оказывают
существенного положительного эффекта на специфичность и
добавочные компоненты. только буферные растворы следующего
состава (6-100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl,7- 100
мМ Трис HCl, pH 8,8, 35 мМ MgCl2, 250 мМ KCl и 9 - 100 мМ Трис HCl,
pH 9,2, 15 мМ MgCl2, 250 мМ KCl) приводят к ингибированию реакции.
Суммируя все вышеизложенные результаты по оптимизации
компонетов, мы использовали реакционную смесь следующего состава:
98
(50 мкл): х10 ПЦР буфер (100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2, 750
мМ KCl) 10 мкл, 1 мкл dNTP (10 мМ), по 1 мкл праймеров (20 пмоль
каждый), 0,05 ед Taq-полимеразы в конечной концентрации.
Результаты по подбору и оптимизации температурно-
временного режима показали, что в пределах температур от 52,5 до 59,5
0
С специфический ПЦР-продукт нарабатывается в достаточных
количествах, отсутствуют шлейфы. Полимеразе для наработки ПЦР-
продукта размером 372 п.о. в нашем случае достаточно 20 с. Обобщая
все температурно-временные характеристики, при проведении ПЦР
использовали следующие условия:
пре-денатурация: 5 мин, 95 0С
денатурация: 30 с, 95 0С
отжиг: 30 с, 57 0С 30 циклов
синтез: 30 с, 72 С
0

пост-репликация 5 мин, 72 0С
Использование данного режима существенно сокращает время
постановки диагноза при сравнении температурно-временных профилей,
приводимых в литературе. Данное обстоятельство повышает
диагностическую ценность разработанного метода по обнаружению
ДНК Pasteurella multocida.
5 Проведенные эксперименты по определению специфичности
метода ПЦР с праймерами Рm 16SRNA- F , Рm 16SRNA- R показали
образование ПЦР продукта, характерного только для Pasteurella
multocida. Разработанный метод позволяет выявлять ДНК бактерий в
концентрации 0,5 пг в исследуемой пробе. Порог чувствительности
метода ПЦР с различными модификациями по обнаружению ДНК
Pasteurella multocida по данным литературы изменяется в пределах 50
пг–50 фг . Результаты наших исследований по чувствительности не
уступают зарубежным аналогичным работам.
6 Разработанный лабораторный вариант тест-системы для
обнаружения ДНК Pasteurella multocida был апробирован на штаммах
Pasteurella multocida, хранящихся в музее микроорганизмов лаборатории
противобактериозной биотехнологии; биологических (кровь, смывы из
ротовой и носовой полостей) патологических материалах от павших
животных, доставленных из хозяйств. Нарабатывался специфический
продукт только в тех пробах, которые содержали ДНК Pasteurella
multocida. Разработанная ПЦР тест-система для обнаружения ДНК
Pasteurella multocida в пробах органов павших и больных животных
может быть использована для диагностики болезни.

99
 Список использованной литературы

1 Watt J.M., Swiatlo E., Wade M.M., Champlin F.R. Regulation of

capsule biosynthesis in serotype A strains of Pasteurella multocida//
Microbiol Lett. -2003.- V. 8. – Р. 9-14.
2 Ewers C., Lübke-Becker A., Bethe A., Kiebling S., Filter M., Wieler
L.H. Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from
different hosts with various disease status//Vet Microbiol. –2006. - v.7. - Р. 3-
4.
3 Шегидевич Э.А., Федотов В.Б., Крючков В.Я. Серотиповой
состав Пастерелла мультоцида // Труды ВИЭВ. – М., 1983. – Т. 38. –
С.15-19.
4 Масимов К.А. Значение пастерелл (Р.multocida) при остром
респираторном синдроме парагриппа-3 у телят в откормочных
хозяйствах промышленного типа: автореф. ...канд.дисс. – М., 1982. – 29
с.
5 Gautam R., Kumar A.A., Singh V.P., Singh V.P., Dutta T.K., Shivachandra
SB. Specific identification of Pasteurella multocida serogroup-A isolates by
PCR assay// Res Vet Sci.- 2004. - v.3. –Р.179-85.
6 Масимов Н.А. Пастереллез животных: Лекция // Моск. Гос. Акад. вет.
медицины и биотехнологии им.К.И.Скрябина. – М., 1995. – 12с.
7 Сосов Р.Ф. Пастереллез // Эпизоотология. - М.:Колос, 1974. -
С.4-5.
8 Rapports. de L| Office Inretnational des Episooties Sessin generale de
mai,1979,С. 12-14.
9 Джупина С.И., Колосов А.А. Особенности эпизоотологии,
клинического проявления и диагностики пастереллеза в Новосибирской
области // Профилактики и лечение болезней крупного рогатого скота. -
1992. - № 24. - С.15-22.
10 Салимов В.А., Жаров А.В. // Ветеринария. - 2007.-№ 6. – С. 14 -
15.
11 Намет А.М. Иммунопрофилактика пастереллеза лошадей:
автореф. докт. вет. наук. –Алматы, 2006. –3 с.
12 Кожаев А.Н. Поливалентная вакцина против пастереллеза
сельскохозяйственных животных: автореф. … канд. вет. наук. –Алматы,
2008. –3 с.
13 Борисенкова А.Н. Рекомендации по диагностике, профилактике
и мерам борьбы с пастереллезом птиц: технологические процессы //
Госагропром СССР. ВНИВИП. - Л., 1986. - 25 с.
14 Пустовит Г.Л., Федотов Н.И., Кучеренко Л.А. Некоторые
особенности эпизоотологии и течения пастереллеза свиней // В кн.:
Инфекционные и инвазионные болезни с.-х. животных и птиц. – Одесса,
1983. – С.15-18.
100
 15 Луницын В.Г. Пастереллоносительство у пантовых оленей,
некоторых видов грызунов и птиц в Горном Алтае // НИИ пушного
звероводства и кролиководства. – 1984. – Т. 30. – С.160-168.
16 Чоенбаев З.Н., Сарымсаков Е.С. О заболеваемости лошадей
пастереллезом // Профилактика и меры борьбы с инфекционными и
незаразными болезнями с.-х. животных в Казахстане. – Алма-Ата, 1984.
– С.137-140.
17 Коломакин Г.А. Пастереллез жеребят // Ветеринария. - 1960. -
№ 7. - 45 с.
18 Зеленский В.П. Пастереллез свиней: автореф. ...докт. дисс. –
Омск, 1965. – 39 с.
19 Шегидевич Э.А. Роль пастерелл в респираторной патологии
овец и крупного рогатого скота: автореф. ...докт.вет.наук. – М., 1993.
20 Велиев Ш.В. Эпизоотология пастереллеза овец // Тез. докл. III
Всесоюзн. конф. по эпизоотологии. – Новосибирск, 1991. – С.322-323.
21 Стаценко Н.И. Случай пастереллеза сайгаков в
Кургальджинском заповеднике // Вестник с.-х. науки Казахстана. – 1980.
- № 5. – С.66-67.
22 Борисенкова А.Н. Профилактика пастереллеза птиц. – Москва,
1979. – 87 с.
23 Цимох П.Ф., Сердюк Н.Г., Бакай А.Ф. Пастереллез птиц //
Ветеринария.- 1967. - № 5. – С. 111.
24 Ganiere J.P., Franccise E. Characterization of Pasteurella multocida
from gingival scraping of dogs and cats // Comp.Imm.Microbiol. & Inf.Dis. –
1992. – V. 16. - № 1. – P. 21-22, 77-85.
25 Aldova E., Frederiksen W. Aerogenic pasteurellas and Pasteurella –
like organisms isolated in Czechoslovakia // Zentralblatt fur Bacteriologie. –
1992. – V. 277. - № 1. – P.139.
26 Лундаа Ц. Эпизоотология пастереллеза крупного рогатого
скота, овец и его специфическая профилактика в МНР: автореф.
...канд.вет.наук. – Улан-Батор,1989. – 22 с.
27 Курченко Ф.П., Гононов Ю.М., Уфимцев К.П. К вопросу об
инфекционной патологии сайгаков // Тез. докл. I Всесоюзн. конфер.
«Проблемы патологии и экологической взаимосвязи болезней диких
теплокровных и с.-х. животных». – М., 1988. – С.45-46.
28 Буткин Е.М. Пастереллез птиц. – М., 1972. – 100 с.
29 Никифорова Н.М., Лукьянченко А.В. Пастереллезы //
Ветеринарные препараты. – М., 1981. – С.236-251.
30 Занина В.М., Занин Л.Ф., Латышева Л.В. К характеристике
пастереллеза у диких грызунов Северного Дагестана // Особо опасные
инфекции на Кавказе. - Ставрополь, 1970 - Вып. 2. - С.147-150.

101
 31 Gupta B.K., Kunar S. Serotypings of Indian isolates of Pasteurella
multocida from poultry // Indian J. of Animal Sci. – 1978. – v.48. № 4. –
Р.301-304.
32 Тулепбаев С.Ж., Керимбаев У.Н., Нурахметов Т.А. Пастереллез
лошадей // Вестник с.-х. науки Казахстана. – 1987. - № 10. – С.63-65.
33 Romalde J.L., Barjia J.L., Toranzo A.E. Evidence of a dormant but
infective state of the horse pathogen Pasteurella multocida // Applied and
Environmental Microbiology. – 1994. – P.180-186.
34 Wadia D.S. Hemorrhagic septiceamia in horses – a case report //
Centaur Mylapore. – 1990. –v.7. – P.23-24.
35 Art D. Portage buccal des Pasteurella chez le chien et le chat.
Antibioresistance et pouvoir pathogene experimental // Ann. Med. Vet. –
1984. – V.128. - № 5. – P.361-368.
36 Borkotaki P., Baxi K.K., Sharma S.N. Respiratory carriers of
Pasteurella multocida in apparently healthy and diseased animals and birds //
Res. Punjab Agr. Univ. – 1984. - V. 21. - № 2. – P.323-325.
37 Керимбаев У.Н., Сансызбаев А.Р. К вопросу изучения
пастереллеза лошадей // Вестник с.-х. науки Казахстана. – 1990. - № 2. –
С.69-70.
38 Сидоров М.А., Геведзе В.И. Пастереллез животных //
Ветеринария. - 1983. - № 10. - С.43-47.
39 Масимов Н.А. Значение пастереллоносительства при
респираторной инфекции телят // Проблемы лейкоза и инфекционных
заболеваний с.-х. животных. Межвуз. сб. нау. трудов. – М., 1988. – С.97-
99.
40 Бакунина Л.И. Случай выделения возбудителя геморрагической
септицемии от больных песчанок // Журнал микробиологии,
эпидемиологии и иммунологии. - 1961. - № 5. - С.122-123.
41 Гордиенко О.Я., Ковтун И.П. Пастереллез больших песчанок в
Муюнкумах // Материалы V науч.конф.противочумных учрежд. Ср.Азии
и Казахстана, посв. 50-летию В.О.С. революции. - Алма-Ата, 1967. -
С.353-354.
42 Стогов В.И., Безрукова Л.С.. Алманиязова К.К. О
проникновении серых крыс в Алма-Ату и выделении от них
возбудителей иерсиниозов, сальмонеллезов и пастереллеза // Тезисы
докладов XI Всесоюзной конф. по природной очаговости болезней. - М.,
1984. - С.163-164.
43 Степанов В.М., Безрукова Л.С., Алманиязова К.К., Стогов В.И.,
Стручкова Э.Н., Байтанаев О.А., Пак И.Г., Мырзабеков Ж.М. О
зараженности домовых мышей патогенными и условно-патогенными
микробами // Здравоохранение Казахстана. - Алма-Ата, 1988. - С.272-
274.

102
 44 Степанов В.М., Безрукова Л.С., Толмачева Л.П., Алманиязова
К.К. О выделении патогенных для человека бактерии от грызунов //
Тезисы докладов XI Всесоюзной конф. по природной очаговости
болезней. - М.,1984. - С.162-163.
45 Цепко И.Н. Сочетанные инфекции грызунов в Волго-
Уральском очаге чумы // Автореф.канд.дисс.мед.наук. - Алматы, 1993. -
24 с.
46 Roberts P. An. Immunological study of Past. multocida//J.Comp.
Path. And Therap, 1947, 57, P. 261- 278.
47 Carter G. The type specific capsular of Pasteurella
multocida//Canada J. Vet. Sci., 1952, V.30, P. 48-53.
48 Carter G. Studies of P. multocida J.A. haemagglutination test for the
identification test of serological types//Amer.J. vet. Res, 1955, v.16 P. 481-
484.
49 Осидзе Д.Ф. Инфекционные болезни животных//Москва, 1987,
188с.
50 Wijewardana T. G. Haemorrhahic sepricaemia//Rev. Med.
Microbiol.,1992, 3, 1, P. 59-63.
51 Namioka S. Serolohical studies on pasteurella especially on O-
antigenic analysis of the organism//Trop. Agr. Res. Ser., 1980, 13, P.55-67.
52 Perreau P. La pasteurella septicemique des boeufs et des
buffles//LEMUT, Avil, 1976, С. 115-117.
53 De Alwis M.C.L. Presistence of the carrier status in haemorragie
septicaemia [P. multocida serotype 6:B] in buffaloes//Gomis Anime. J, 1991,
№3 P.42.
54 Мамаду К. Эпизоотология пастереллеза крупного рогатого
скота в Республике Мали и меры борьбы с ним. Автореф. канд. вет.
наук. Москва, 1982, 18с.
55 Сидем Юсуф. Эпизоотология особенности пастереллеза
крупного рогатого скота в Гвинейской республике. Автореф. канд. вет.
наук. Москва, 1989, 18с.
56 De Alwis M.C.L. Martality among cattle and buffaloes in Sri-Lanka
due to haemorrhagic septicaemia//Trop. Anim. haelth. and prod, 1980, v.13,
№13, P. 195-202.
57 Wyld S.G. Experemental. Pasteurella multocida pneumonia in alves.
Res. In veter. Sc., 1989, 47.2, P. 185-189.
58 Nanu V. Bronhopneumonila viteilor, obserrvatii clinice, nasuri
perofilaktice si terapeutice//Rev. Crestereamm,1982, v. 32. №5, Р.44-47.
59 Варнаков Д.И. Диагностика и лечебно-профилактические
мероприятия при инфекционных и инвазионных заболеваниях с.-х
животных//Сб. научн. трудов, посвященных 80-летию создания в России
кафедры паразитологии им. акад. К.И. Скрябина [Дон. Гос. аграр.ун-т,
Персиановка], 1997, С. 48-52.
103
 60 Андросик Н.Н., Лях Ю.Г. Профилактика пастереллеза с-х
животных на современном этапе//Вестник Академии наук Республики
Беларусь, 2002, №4, С. 15-23.
61 Жилвинский А.Д. Аспекты эпизоотологии и борьбы с
эпизоотической бронхопневмонией телят//Болезни молодняка с-х
животных и их профилактика на комплексах, Таллин, 1984, С.17-19.
62 Данилевский В.М. Бронхопневмония телят: этиология,
патогенез, диагностика, профилактика и лечение // Ветеринария, 1985,
№1, С. 16-19.
63 Геведзе В.И., Соколов С.Г. Биологические свойства пастерелл,
выделенных от свиней и крупного рогатого скота при острых вспышках
пастереллеза, Москва, 1978, 104с.
64 Геведзе В.И., Фарнаков Н.П. и др. Нервная форма пастереллеза
крупного рогатого скота//Ветеринария, Москва, 1987, № 6, С. 39-42.
65 Колосов А.А. Пастереллез молодняка с.-х животных//Сб. научн.
трудов ВАСЗНИЛ. Сибирское отд., Новосибирск, 1990, С. 130-133.
66 Масимов Н.А. Проблемы лейкоза и инфекционных заболеваний
с.-х животных//Ветеринария, Москва, 1990 №8, С.12-16.
67 Лях Ю.Г. Пастереллез крупного рогатого скота [эпизоотология
и специфическая профилактика]. Автореф. канд. вет. наук. Минск, 1994,
19с.
68 Курбанов Ш К. Эпизоотологическое значение различных
серотипов P.multocida при массовых респираторных инфекциях телят в
откормочных хозяйствах. Автореф. канд. вет. наук. Самарканд, 1994,
20с.
69 Султанов А.А. Эпизоотическая ситуация и научное
обеспечение ветеринарных проблем животноводства Казахстана //
Материалы международной научно-практической конференции
«Состояние и перспективы развития ветеринарной науки и практики»,
посвященной государственной программе «Аул». – Алматы, 2003. – 9 с.
70 Дерновая В.Ф. Биологические свойства пастерелл и вопросы
лабораторной диагностики пастереллеза: автореф. ...канд.мед.наук. –
Алматы, 1996. – 22 с.
71 Мартиневский И.Л., Котурга Л.Н., Радионова А.А. Свойства
штаммов пастерелл, выделенных от сайгаков // ЖМЭИ. – 1985. - № 11. –
С.112-113.
72 Мартиневский И.Л., Семиотрочев В.Л., Безрукова Л.С.
Свойства штаммов пастерелл, выделенных от сайгаков // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1989. - № 11 . –
С.112-113.
73 Некрасова Л.Е. Сочетанные инфекции грызунов в Северо-
Приаральском Устюртском автономных очагах чумы. Автореф. канд.
вет. наук, Алматы, 1989, 21с.
104
 74 Мека-Меченко Т.В. и др. Характеристика штамма P.haemolitica
выделенного от Каспийского тюленя//Проблемы особо опасн. инфекций,
2001,№1, С.164-165.
75 Holst J., Rollef F. Characterization and distribution of Pasteurella
species recovered from infected humans // J.Clin.Microbiol. – 1992. – V.30. -
№ 1. – P.10-18.
76 Бакулов И.А., Васильев Д.А., Козлова Д.И. Пастереллез как
зооантропонозная инфекция // Вопросы ветер.микробиол., эпизоотол. и
ветсанэкспертизы. – Ульяновск, 1994. – ч. 2. – С.26-32.
77 Riera Franceasc, Priu Ramon, Sauca M.Goreti, Bassa Josep.
Empiema por Pasteurella multocida resistente a la penicillina //
Enferm.Infecc. y microbial.clin. – 1993. – 11. - № 3. – P.170.
78 Семиотрочев В.Л., Безрукова Л.С. Случай выделения Pasteurella
multocida из сгустка крови лихорадящей больной // Лабораторное дело. –
1989. - № 10. – С.77-78.
79 Fleck D.G., Mair N.S. Pasteurella and Yersinia infections // British
Medical Journal. – 1973. – № 2. – P.430.
80 Kummerlen Ch., Schneider F., Robles J. Pericardite a Pasteurella
multocida // Presse med. – 1989. – V. 18. - № 31. – P.1527.
81 Riera Franceasc, Priu Ramon, Sauca M.Goreti, Bassa Josep.
Empiema por Pasteurella multocida resistente a la penicillina //
Enferm.Infecc. y microbial.clin. – 1993. – 11. - № 3. – P.170.
82 Черкасский Б.Л. Руководство по зоонозам. // Ленинград:
Медицина, 1983. - 191 с.
83 Arashimo Yasutomo, Kumasaka Kazunari, Okuyama Kijoko,
Tsuchiyo Toshio, Kawano Kinya, Sano Kazumitzu, Kaya Hideo, Koizumi
Fumizada. Первое сообщение о хроническом синусите у человека,
вызванном Pasteurella multocida в Японии // Кепсэнсегаку дзаеси.
J.Jap.Assos.Infect.Diseases. – 1992. – V. 66. - № 2. – P.232-235.
84 Arashimo Yasutomo, Kumasaka Kazunari, Okuyama Kijoko,
Kavabata Masato, Tsuchiyo Toshio, Kawano Kinya, Akano Rynri, Hokari
Shigeo. // Клинико бактериологическое изучение Pasteurella multocida,
как зооноза. Условия носительства Pasteurella multocida у собак и кошек
в зависимости от степени носительства у людей от частоты поцелуев
своих любимцев // Кепсэнсегаку дзаеси. J.Jap.Assos.Infect.Diseases. –
1992. – V. 66. - № 2. – P.221-224.
85 Smith J.E. Some culteral and biochemical properties of strains from
different host species // J.Patol.Bact. – 1958. – V. 68. - № 3. – P.315-323.
86 Betermiez P., Denamur E., Lanrans G., Sevestre H., Pedinelli J.L.,
Absec cerebral a Pasteurella multocida. Revue de la literature. A propos
d’ucas // Sem.Hop. – 1988. - № 4. – P.263-266.
87 Rhodes M. Pasteurella multocida meningitis in a dog lover //
J.Roy.Med. -1986. - № 12. – P.747-748.
105
 88 Rimpau W. Pasteurella multocida from gingival scraping of dogs
and cats // Munch.Med.Wschr. – 1937. - № 84. – P.413-414.
89 Korber R., Gerlach H., Bisgaard M., Hafer H.M. Futther
investigation an Pasteurella multocida infections in feral brids injured by cats
// J.Vet.Med. – 1992. – V. 39. - № 1. – P.10-18.
90 Bergey D.H. Manual of systematic bacteriology // The Williams and
Wilkins Company. – Baltimore, 1986. –V.2. - P.1051
91 Лященко В.А., Воробьев Н.А. Антигенная молекула и
антигенная детерминанта // В кн.: Молекулярные основы
иммуногенности антигенов. М., 982. – С.7-49.
92 Namioka S., Murata M. Serological studies on Pasteurella
multocida. V. Some epizootiological findings resulting from O antigenic
analysis // Cornell. Vet. – 1964. – v. 54. – P. 510-521.
93 Никифорова Н.М., Плотникова В.А. Изучение антигенного
состава пастереллезных культур // Сборник научных трудов ГНКИ. –
М., 1953. – Т.3. – С.206-212.
94 Namioka S., Murata M. Serological studies on Pasteurella
multocida. III. O antigenic analysis of cultures isolated from various animals
// Cornell. Vet. – 1961. – v.51. – P. 507-527.
95 Борисенкова А.И. Значение соматического и капсульного
антигена Пастерелла мультоцида в иммунологической специфичности
вакцин // Ветеринария. – 1978. - № 5. – С.40-42.
96 Цимох П.Ф. Типизация пастерелл по О-антигенным свойствам
// Ветеринария. – 1970. - № 11. – С.41-44.
97 Рождественская Т.Н. Гиалуронидаза Pasteurella multocida и ее
ингибирование: автореф. ...канд. дисс. – Татру. 1976.
98 Wessels M.R., Allon E.M., Goldberg J.B., Dilesare T.J. Hyaluronic
acid capsula is a virulence factor of Pasteurella multocida // Proc. Nat. Acad.
Sci. USA.1991. –V. 88. № 19. P.8317-8321.
99 Trola V.I., Kazadzhov J.A. Neuraminidase activity of Pasteurella
multocida// Dok. Bolg. Med. Akad. Nank. - 1969.- T.22. № 5. –P.517.
100 Литвини В.Ю., Пушкарев В.И. Факторы патогенности
бактерий: функция в окружающей среде// Журнал микробиол.,
эпидемиол. и иммунологии. 1994. - № 5. – С. 84-87.
101 Коломнина Г.Ф. Капсула и капсульные антигены Pasteurella
multocida сероварианта В// Научные основы производства ветеринарных
препаратов.-1989.- С. 89-90.
102 Петров О.В. Некоторые антигенные и структурные компоненты
капсулы Pasteurella multocida // Труды ВИЭВ. – 1971. – Т.39. – С.189-
197.
103 Lu O., Rhoades K.R., Rimler R.B., A virulents of capsular strains of
Pasteurella multocida for turkey // Avian Dis. -1998. – V. 193. - № 7. -P.
1021-1024.
106
 МОНОГРАФИЯ

Чужебаева Гульжаган Джамбуловна

ДИАГНОСТИКА ПАСТЕРЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО

СКОТА МЕТОДОМ ПЦР

Заказ№_____Подписано к печати ____________

Тираж 500 эксзепляров Формат 60х84 1/16
Бумага офсетная. Усл.п.л. 8,0.

ТОО «Костанайский печатный двор»

Адрес: Город: Костанайская область
Адрес: Казахстан, 110003 Костанай Темирбаева 39
Телефон: (7142) 53-54-60, (7142) 90-02-45
Факс: (7142) 53-54-92, (7142) 53-54-60
E-mail: kpdvor@mail.kz

107