Вы находитесь на странице: 1из 13

ГЕНЕТИКА, 2019, том 55, № 9, с.

998–1010

ОБЗОРНЫЕ
И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 634.7:577.21

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМА С ПРИМЕНЕНИЕМ


ДНК-МАРКЕРОВ У СМОРОДИНЫ
© 2019 г. А. В. Пикунова1, *, С. Д. Князев1, О. Д. Голяева1, А. Ю. Бахотская1, О. В. Калинина1
1Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур,
Орловская область, п/о Жилина, 302530 Россия
*e-mail: pikuanna84@mail.ru
Поступила в редакцию 28.12.2018 г.
После доработки 19.03.2019 г.
Принята к публикации 02.04.2019 г.

Приводится обзор зарубежных и отечественных работ по изучению генома представителей рода


смородина с применением ДНК-маркеров. Представлен перечень методик для выделения ДНК из
смородины. Собраны работы по применению различных типов ДНК-маркеров (RAPD, AFLP,
ISSR, SSR) в исследованиях по генетическому разнообразию, идентификации сортов представите-
лей рода смородина, молекулярной филогении и систематике. В работах различных научных кол-
лективов показан высокий уровень полиморфизма, выявляемый микросателлитными маркерами, и
перспективы их использования для разработки систем идентификации и паспортизации, уточне-
ния родословных и менеджмента коллекций. Описаны составленные на данный момент генетиче-
ские карты черной смородины c применением AFLP, SSR, SNP ДНК-маркеров. Приведен перечень
QTL (локусов количественных признаков), локализованных на генетических картах. Описываются
опубликованные методики для маркер-вспомогательной селекции: маркеры генов Се и Р устойчи-
вости черной смородины к почковому клещу, зеленой и черной окраски ягод. Приведена усовер-
шенствованная авторами методика детекции гена Се устойчивости к почковому клещу. Наиболее
глубоко изученной с применением ДНК-маркеров культурой рода Ribes L. является смородина чер-
ная. Рассматриваются перспективы развития исследований генома смородины с применением
ДНК-маркеров и возможности, которые эти исследования откроют для дальнейшего направленно-
го человеком совершенствования генома этой хозяйственно важной культуры.

Ключевые слова: смородина, геном, ДНК-маркеры, генетическая карта, маркер-вспомогательная


селекция, Ribes L.
DOI: 10.1134/S001667581909011X

Род смородина Ribes L. включает более 150 ви- Смородина красная на сегодняшний день ши-
дов, произрастающих главным образом в умерен- роко распространена в промышленном ягодовод-
ной зоне Северного полушария. Хозяйственное стве стран Европейского Союза [3]. Сравнитель-
значение имеют смородина черная (Ribes nigrum L.), ная непопулярность крыжовника в промышлен-
смородина красная (Ribes rubrum L.) и крыжовник ном садоводстве, вероятно, связана с отсутствием
(Ribes uva-crispa L.). Декоративное значение име- сортов, пригодных к механизированной уборке, и
ет смородина золотистая (Ribes aureum Pursh), наличием у этой культуры шипов.
кроваво-красная (Ribes sanguineum Pursh). В меди- Дикорастущие виды смородины, на данный
цинских целях используются плоды и другие ча- момент не востребованные в производстве ягод,
сти растений рода смородина. являются или могут стать источниками пополне-
Смородина черная – ведущая ягодная культура ния генетического разнообразия и донорами хо-
в России. Популярность ее объясняется высокой, зяйственно полезных признаков. Несмотря на то,
стабильной урожайностью, неприхотливостью к что межвидовые гибриды естественного проис-
условиям возделывания, высоким уровнем меха- хождения немногочисленны, в селекции наиболее
низации, что позволяет выращивать ее в про- значительные успехи достигнуты при использова-
мышленных масштабах [1]. нии отдаленной гибридизации, в том числе между
Ведущими производителями ягод смородины видами, входящими в разные секции Ribes L. [4]. За-
черной являются Польша, Германия и Россия. В частую отдаленные гибриды оказываются стериль-
США и Канаде смородина черная не так попу- ными, однако в ряде случаев метод искусственной
лярна, как в Западной Европе и России [2]. полиплоидизации успешно использовался для вос-

998
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМА С ПРИМЕНЕНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ 999

становления фертильности, например, в случае с шинства видов рода смородина подошли моди-
искусственно выведенными амфидиплоидными, фицированные и дополненные методики, осно-
32-хромосомными смородинно-крыжовниковыми ванные на СТАВ-методе выделения ДНК,
гибридами, которые отнесены к виду Ribes × nidigro- предложенном Doyle и Doyle [8], а в некоторых
laria [5]. случаях были более действенны дополнительные
В настоящее время с помощью молекулярно- экстракции хлороформом, повышенный процент
биологических методов, в том числе методов мани- поливинилпирролидона и бисульфита натрия,
пуляции с ДНК, пополняются знания об устройстве очень высокое соотношение СТАВ и ткани, до-
генетического аппарата растений, на основании че- полнительный этап CTAB/полиэтиленгликоль
го разрабатываются и внедряются инструменты для осаждения, как описано у Rowland и Nguyen [9]. В
усовершенствования генома посредством ускоре- работах шотландской группы ученых [10–12] ис-
ния селекционного процесса или принципиально пользовали для выделения ДНК методику, опи-
иных методов генетической трансформации и ге- санную Milligan [13]. В более поздних работах ис-
номного редактирования. Современный этап пользовался также набор готовых реактивов
развития селекции рассматривают как этап адап- DNeasy Mini Extraction Kit (Qiagen) [12]. При ра-
тивной селекции с использованием генных тех- боте с гербарным материалом Weigend et al. [14]
нологий [1]. использовал CTAB-метод, описанный у Struwe
Одним из молекулярно-биологических мето- et al. [15]. В исследованиях Palmieri et al. [16] ис-
дов, нашедших применение в селекционных ис- пользовали для выделения набор готовых реакти-
следованиях, является ДНК-маркирование. Мо- вов NucleoSpin® 96 Plant kit (MACHEREY-NA-
лекула ДНК – материальная основа хранения и GEL, Germany). В наших исследованиях выделе-
передачи генетической информации, поэтому ис- ние растительной ДНК проводили из молодых
пользование ее полиморфизма в качестве марке- листьев по методикам, предложенным Puchooa
ров вызвало огромный интерес. [17] и, позднее, Doyle и Doyle [18] с модификаци-
ями (измельчение материала осуществляли без
использования жидкого азота, в СТАВ-буфере
ДНК-МАРКЕРЫ В ИССЛЕДОВАНИЯХ присутствовал 2%-ный поливинилпирролидон,
ПО ГЕНЕТИЧЕСКОМУ РАЗНООБРАЗИЮ, отмывку осажденной ДНК проводили 70%-ным
ИДЕНТИФИКАЦИИ СОРТОВ, этанолом без добавления ацетата аммония). В осно-
МОЛЕКУЛЯРНОЙ ФИЛОГЕНИИ ве обеих методик лежит СТАВ-метод с применени-
И СИСТЕМАТИКЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ем поливинилпирролидона и меркаптоэтанола.
РОДА СМОРОДИНА
Пионерами в использовании ДНК-маркеров
В естественных условиях дикой природы все при работе с генетическими ресурсами смороди-
виды рода смородина – диплоидны (n = 8), что в ны стали ученые из Шотландского института се-
определенной степени облегчает изучение генома
лекции сельскохозяйственных культур (Scottish
по сравнению с геномами полиплоидных видов.
Размер генома Ribes petraeum Wulf., R. rubrum L. и Crop Research Institute, Invergowrie, Dundee, Scot-
R. grossularia составляет 2C = 1.91 пг = 1868 Мпн land, UK), ныне ставшего частью James Hutton
(1 пг = 978 Мпн) [6]. Institute (https://www.hutton.ac.uk/), применившие
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),
Изучение генома с применением ДНК-марке- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism),
ров зачастую начинается с оценки генетического ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat), SNP (Single-
полиморфизма, изучения филогенетических Nucleotide Polymorphism), SSR (Simple Sequence
связей, а затем переходит к созданию генетиче- Repeat) маркеры [10–12, 19–21].
ских и физических карт хромосом конкретных
видов, локализации локусов качественных и ко- Первым типом ДНК-маркеров были RAPD,
личественных признаков, приблизительной ло- использованные на смородине Lanham et al. в
кализации генов на картах, их более точной локали- 1995 г. для фингерпринтинга сортов черной смо-
зации, разработке тесно сцепленных ДНК-марке- родины [19]. RAPD-анализ – один из наиболее
ров, выявлению генов-кандидатов и клонированию распространенных среди методов амплификации
генов. По этому пути, на наш взгляд, идет и изу- с праймерами, случайно выбирающими участки
чение генома смородины. генома. Он характеризует полиморфизм длин
Базовой методикой при работе с ДНК-марке- случайным образом амплифицированных фраг-
рами является выделение ДНК. Листья смороди- ментов [22, 23]. Метод очень производителен, так
ны содержат фенольные компоненты и танины, а как амплифицируется большое количество фраг-
определенные виды также имеют высокое содер- ментов, конкретное число зависит от объекта ис-
жание сложных полисахаридов, которые могут следований, прост в исполнении, не требуются
ингибировать ПЦР (полимеразную цепную реак- дополнительные данные сиквенса генома объек-
цию). Messinger et al. [7] отмечают, что для боль- та и дорогостоящее оборудование.

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


1000 ПИКУНОВА и др.

Однако полученные результаты недостаточно лиза, различия в единичных фрагментах в одном


воспроизводимы в различных лабораториях. пробеге при AFLP и небольшие различия в разме-
Другим недостатком RAPD-анализа является рах полученных фрагментов при SSR [28].
преимущественно доминантное наследование Следует отметить, что низкая воспроизводи-
RAPD-фрагментов, при котором фрагмент либо мость RAPD-анализа является основной прегра-
присутствует (Аа, АА, не различая гомозиготу от дой для широкого использования в области иден-
гетерозиготы), либо отсутствует (аа), и лишь не- тификации организмов, где ему на смену приходят
большое число фрагментов имеют кодоминант- хорошо воспроизводимые типы ДНК-маркеров,
ное наследование, т.е. амплифицируются как два такие как микросателлитные локусы.
аллеля различного размера и помогают отличить
гомозиготу от гетерозиготы [22]. В последние го- SSR (микросателлитные) маркеры – ампли-
ды RAPD-метод все чаще используется только на фицируют тандемные повторы коротких мотивов
предварительной стадии изучения полиморфиз- (от 1 до 10 пн), для амплификации используются
ма ДНК [23]. достаточно длинные пары праймеров (около 18–
20 пн), что повышает специфичность амплифика-
В наших исследованиях смородины мы также ции. В зависимости от методов выявления различа-
начинали с RAPD-анализа и использовали его для ют геномные SSR и EST (expressed sequence tag)–
изучения вариабельности генома и филогенетиче- SSR. EST–SSR находятся в транскрибируемых
ских отношений у представителей рода Ribes L. [24]. регионах генома. SSR используются как в фунда-
В результате каждый образец был охарактеризован ментальных исследованиях для оценки генетиче-
уникальным набором RAPD-фрагментов. При ского полиморфизма, изучения филогенетических
этом были идентифицированы фрагменты, специ- отношений, построения генетических карт для
фичные как для отдельных образцов, так и для групп сцепления, так и в прикладных целях – для
представителей определенных таксонов. При ис- проверки родословных, при разработке систем
следовании полиморфизма крыжовника (12 об- идентификации и паспортизации, поиске марке-
разцов) Lanham и Brennan [10] использовали мар- ров, связанных с хозяйственно полезными при-
керы RAPD, ISSR и AFLP. По средним подсчетам знаками, при маркер-вспомогательном отборе
один RAPD-праймер амплифицировал два поли- интересующих генотипов на ранних стадиях раз-
морфных фрагмента (без учета не полиморфных), вития растений [29].
ISSR-праймер – 18 полиморфных фрагментов, од-
на комбинация праймеров AFLP – 23 полиморф- Для изучения смородины первые микросател-
ных фрагмента. При этом только AFLP-маркеры литные маркеры были разработаны шотландскими
позволили получить уникальные профили для учеными [11, 30]. Более 200 пар праймеров тестиро-
каждого из образцов. ISSR-анализ не различал вали на гибридной популяции при составлении ге-
три генотипа из 12, RAPD-анализ – 2. нетической карты черной смородины, в результате
AFLP-анализ – маркеры полиморфизма длин 49 микросателлитных локусов были локализованы
амплифицированных фрагментов ДНК [25]. на разных хромосомах [12, 31]. SSR-маркеры при-
Включает несколько этапов, в том числе рестрик- менялись также для оценки разнообразия генети-
цию, лигирование адаптеров, две последователь- ческих коллекций Ribes в Италии и Северной Ев-
ные ПЦР. Разделение фрагментов ДНК проводят ропе [32, 33].
в полиакриламидном геле с радиоактивной или с Необходимо отметить значение научных сооб-
флуоресцентной меткой. Сложнее по техниче- ществ в проведении молекулярно-генетических
скому исполнению по сравнению RAPD, но не исследований, требующих, с одной стороны, при-
уступает, а, как правило, превосходит его по про- влечения современного дорогостоящего оборудо-
изводительности, требуется специальное обору- вания, а с другой – наличия разнообразного расти-
дование для детекции. тельного материала и, зачастую, накопления фе-
ISSR – анализ полиморфизма участков, находя- нотипических данных. В настоящее время
щихся между микросателлитными локусами [26]. крупные проекты осуществляются в рамках меж-
Сравнительно быстрый и дешевый метод. Характе- дународных сообществ, объединяющих молеку-
ризуется улучшенной воспроизводимостью по лярных генетиков, селекционеров, производите-
сравнению с RAPD в связи с большей длиной прай- лей. Одним из таких проектов был RIBESCO, на-
мера и более высокой температурой отжига. правленный на углубленное изучение и
сохранение генофонда представителей рода Ribes
RAPD и ISSR использовали для поиска ДНК- L. Северной и Центральной Европы. В рамках
маркеров зеленого и черного цвета ягод. При проекта более 800 сортообразцов были генотипи-
этом из 29 праймеров 9 амплифицировали моно- рованы с помощью микросателлитных маркеров,
морфные паттерны [27]. на основании полученных данных вкупе с фено-
Тестирование маркеров RAPD, AFLP и SSR в типическими были отобраны образцы для даль-
различных лабораториях Европы показало слож- нейшей криоконсервации. Кроме того, прове-
ности в воспроизведении результатов RAPD-ана- денное генотипирование помогло выявить ошиб-

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМА С ПРИМЕНЕНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ 1001

ки в названиях сортов, содержащихся в разных вом поколении (сорта Кипиана, Гамма, Грация).
коллекциях [33]. Однако у сорта Очарование, для которого по ро-
В наших исследованиях впервые в России были дословной сорт Экзотика служил отцовской фор-
использованы микросателлитные маркеры для мой, в трех локусах (e4-D03, g1-E03, g2-B20) не
оценки межсортового полиморфизма, определения было общих аллелей с сортом Экзотика. Такое
генетического сходства и проверки родословных несоответствие, вероятно, связано с тем, что в
между сортообразцами черной смородины [34]. действительности произошло опыление другой
Был проведен анализ 14 микросателлитных локусов пыльцой, нельзя также исключить ошибку при
у 27 сортообразцов смородины. размножении, пересадке или отборе, а также му-
тации в данных локусах. Сорт Бинар (Оджебин ×
Ожидаемая, или теоретическая, гетерозигот- × Нарядная) также не имел с сортом Оджебин об-
ность изученных нами локусов в среднем соста- щих аллелей в двух микросателлитных локусах
вила 0.652, в то время как наблюдаемая гетерози- (g1-M07, g1-E03) [34].
готность – 0.608. Таким образом, значительной
потери гетерозиготности не наблюдается, что, ве- Подобные результаты были получены с ис-
роятно, обусловлено природой изучаемого объ- пользованием 11 микросателлитных локусов при
екта и особенностями селекции. Как известно, уточнении происхождения у сортов яблони, вы-
перекрестноопыляемые растения, к которым от- веденных в Dresden-Pillnitz [36]. В результате в
носится черная смородина, характеризуются ряде случаев выяснили, какой именно сорт участ-
большей гетерозиготностью по сравнению с са- вовал в гибридизации при опылении смесью
моопыляемыми [35]. Генетическое разнообразие пыльцы разных сортов, а для некоторых сортов
сортов черной смородины также объясняется во- установлена недостоверность родословных как
влечением в селекцию генетически отдаленных по материнской, так и по отцовской форме. При
родственников (крыжовника, смородины клейкой генотипировании микросателлитных локусов у
и др). К тому же вегетативное размножение культу- коллекционных сортов черной смородины из Се-
ры позволяет закрепить гетерозиготное состояние верной Европы в ряде случаев не удалось под-
генотипа независимо от того, насколько стабиль- твердить генетическую идентичность одноимен-
ным будет проявление признаков в первом поколе- ных образцов из разных коллекций, например,
нии. Поэтому к отличительным особенностям та- один из 10 сортообразцов сорта Оджебин оказал-
ких культур относится высокая гетерозиготность. ся не идентичен остальным [33].
Однако в некоторых локусах наблюдаемая гетеро- В наших исследованиях минимальный набор из
зиготность значительно отличается от ожидаемой четырех локусов (e4-D03, g1-M07, g1-E03, g2-B20)
(теоретической), что может свидетельствовать о позволил различить 27 сортообразцов, т.е. для
влиянии селекции на эти локусы, наличии пози- каждого образца был получен уникальный муль-
тивного или негативного отбора определенных тилокусный профиль [34]. В работе Palmieri et al.
аллелей, которые связаны с проявлением жиз- [16] 91 образец различных представителей рода
ненно важных или селекционных признаков. смородина был проанализирован на полимор-
Микросателлитные маркеры можно считать физм 10 микросателлитных локусов. Практиче-
одним из типов маркеров, наиболее подходящих ски для всех образцов (87 штук) получены уни-
для разработки системы генетического маркиро- кальные мультилокусные профили. Благодаря
вания в целях идентификации генотипов и уточ- маркерам выявлены случаи неверной маркиров-
нения генетического происхождения. В связи с ки образцов, подтверждающие возможность ис-
этим важен подбор наиболее полиморфных и ин- пользования микросателлитных маркеров для
формативных локусов, способных различать контроля верности маркировки, различения сор-
близкородственные генотипы. тов со схожими названиями, обнаружения иден-
тичных сортов под разными названиями.
На основании полученных данных нами был
проведен анализ потока аллелей через родослов- SSR-анализ использовали для изучения ягод-
ные у родственных сортов, задействованных в ных культур рода Ribes L., возделываемых в рес-
анализе. В большинстве случаев распределение публике Беларусь (всего 83 образца). На основа-
аллелей между родственными сортами не проти- нии полиморфизма восьми микросателлитных
воречило родословным; так, родительский сорт локусов разработаны методы ДНК-идентифика-
Лентяй и его производные в первом поколении ции сортов смородины черной, смородины крас-
(сорта Ажурная, Орловский вальс, Сластена) ной и крыжовника обыкновенного, применимые
имели хотя бы один общий аллель по всем проте- для практического использования и обладающие
стированным микросателлитным локусам. То же достаточной степенью информативности для
происходило с сортом Минай Шмырев и с сорта- определения сортовой принадлежности, а также
ми, полученными от него в первом поколении установления родословных сортов [37].
(Зуша, Лентяй, Орловская серенада), а также с SSR-анализ использовали для практической
сортом Экзотика и потомками этого сорта в пер- цели – проверки идентичности одноименных

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


1002 ПИКУНОВА и др.

сортообразцов сорта Консорт, показавших раз- внешних транскрибируемых спейсеров (ITS и


личную реакцию на искусственную инокуляцию ETS) рибосомного оперона ядерной ДНК [49],
столбчатой ржавчиной (Cronartium ribicola J.). В анализа нуклеотидного полиморфизма внутрен-
одном из шести протестированных микросател- них транскрибируемых спейсеров ядерной ДНК
литных локусов обнаружен полиморфизм и сде- [50], было установлено, что все исследованные
лан вывод, что данные клоны, вероятно, генети- образцы видов смородин и крыжовника объеди-
чески связаны, но различаются [38]. няются вместе, что свидетельствует о спорности
родового статуса Grossularia и возможности вклю-
Остановимся отдельно на филогенетических
чения его в состав рода Ribes в ранге подрода. В
исследованиях смородины, в том числе с примене-
наших исследованиях с применением RAPD-ана-
нием ДНК-маркирования. Молекулярная филоге-
лиза полученные результаты говорят о том, что
нетика как способ установления родственных свя-
таксоны крыжовника, черной смородины и крас-
зей между живыми организмами на основании
ной смородины являются таксонами одного
изучения структуры полимерных макромолекул –
уровня, что свидетельствуют в пользу классифи-
ДНК, РНК и белков представляет дополнитель-
каций, выделяющих их в отдельные подроды [24].
ную информацию как альтернативу морфологи-
ческим данным.
Наиболее разработанными на сегодняшний СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА
день являются таксономические классификации СМОРОДИНЫ. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ
рода Ribes, основанные на его морфологических КАРТИРОВАНИЕ. ЛОКУСЫ
особенностях [39] и скрещиваемости видов [40]. КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ
Ряд систематиков выделяли два рода: Ribes (виды Составление карт генома является важным
смородины) и Grossularia Hill. (виды крыжовни- этапом изучения генома. Различают генетиче-
ка) [41–43]. Однако, по мнению Brennan [44], ские и физические карты. Генетическая карта
Hummer и Barney [2], в настоящее время наиболее (ГК) – схема взаимного расположения структур-
общепринятой является концепция одного рода ных генов, регуляторных элементов и генетиче-
Ribes, сформулированная еще Janczewski [45] и ских маркеров на хромосоме (группе сцепления).
далее развиваемая Sinnott [46], и др. Единство ро- Расстояние на ГК определяется в условных еди-
да косвенно подтверждалось получением сморо- ницах – сантиморганидах (сМ), условно отража-
динно-крыжовниковых гибридов. Тем не менее ющих частоту рекомбинаций. Эта условная еди-
некоторые современные авторы придерживаются ница зависит от ряда факторов, в том числе и от
классификаций, выделяющих два рода [47, 48]. числа индивидов картируемой популяции: чем
Также окончательно не определено таксономиче- больше популяция, тем точнее генетическая карта.
ское положение отдельных видов и групп видов, ГК дают представление, на каком относительном
например, красных смородин. Так, Janczewski расстоянии участки хромосомы (локусы) находят-
[45], разделяя род Ribes на шесть подродов, наря- ся друг от друга, в какой последовательности рас-
ду с подродом Coreosma (Spach) Jansz. – черная положены. Реальными единицами измерения опе-
смородина, Grossularia Rich. – крыжовник, пред- рируют физические карты, на которых расстояние
ложил выделить виды красной смородины в от- между локусами измеряется в парах нуклеотидов.
дельный подрод Ribesia Berl. В то время как Reh- Однако составление физических карт требует
der [39], выделяя четыре подрода, объединяет предварительного частичного или полного секве-
красную и черную смородины в один подрод Ri- нирования генома. Для смородины есть пока
besia. Кеер [40] на основании данных о скрещива- лишь фрагментарные сиквенсы, представленные
емости и возможности получения межвидовых в базах данных, таких как NCBI [51]. Карты могут
гибридов предлагает увеличить число подродов включать не только ДНК-маркеры, но и морфо-
до девяти, также выделяя красную смородину в логические признаки.
отдельный подрод. Weigend [14] выделяет семь
На данный момент генетическое картирова-
подродов и допускает возможность рассматри-
ние применялось лишь к черной смородине – как
вать данные подроды на уровне родов, но считает
наиболее значимой культуре рода. Первая гене-
это излишним в силу общего морфологического
тическая карта для черной смородины была со-
единства рода. Очевидно, что классическая си-
здана шотландскими учеными. 125 гибридов се-
стематика рода смородина имеет ряд спорных во-
мьи 9328 и их родители (SCRI S36/1/100
просов.
(cv. BenAlder × cv. Ben Loyal) × EMRS B1834:
При помощи различных методов молекулярно- (EMRS B1426 × cv. Ben Lomond)) стали основой
го анализа полиморфизма ядерной и хлоропласт- для картирования. ГК была составлена с помо-
ной ДНК, таких как полиморфизм рестрикцион- щью SSR (картировано 43 маркера, в том числе
ных сайтов двух регионов хлоропластной ДНК [7], геномные и EST), AFLP (107 маркеров) и SNP
psbA-trnH спейсера хлоропластной ДНК и анали- (16 шт.) маркеров (рис. 1). В результате так же бы-
за нуклеотидного полиморфизма внутренних и ло установлено местоположение в геноме гена Се

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМА С ПРИМЕНЕНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ 1003

1 1_P1 1_P2

Full leaf (21.6%)


0 E33M55-345 0 E33M55-345
1 E41M60-251 1 E41M60-251
8 E41M60-228 8 E41M60-228

Full flower (21.9%)


26 E40M42-264
29 E41M43-386

AsA (19.7%)
33 E45M40-351 26 E40M42-264
36 g2-P03 E45M40-126 33 E45M40-351 29 E41M43-386
37 g1-K04 36 g2-P03 E45M40-126
39 E40M41-112 g1-O17 39 E40M41-112 g1-O17 36 g2-P03
40 E45M39-250 37 g1-K04
40 E45M39-250 39 g1-O17
41 SNPctig262 41 SNPctig262
Iog HBW (20.5%) E45M61-372 E45M61-326 41 SNPctig262
E45M61-372 E45M61-326 43
43 E41M58-166 E45M40-246 E41M58-166 E45M40-246 47 g1-P17
E40M42-227 E40M42-227 51 g2-D05
45 g1-E03 e1-O20 45 g1-E03 e1-O20
47 gr2-J05_183 g1-P17 47 gr2-J05_183 55 g1-P05
51 g2-D05 51 g2-D05 60 g1-M07
55 g1-P05 55 g1-P05
60 g1-M07 60 g1-M07
70 E45M43-198 70 E45M43-198

2 2_P1 2_P2
0 E45M40-222
2 E41M42-388
4 gmr 0 E45M40-222
8 E40M43-236 E40M41-121 gmr
9 E41M40-222 4
8 E40M43-236 E40M41-121
Iog HBW (21.7%)

g1-G06 E41M41-163 2 E41M42-388


11 E41M43-179 8 E40M41-121 9 E41M40-222
g1-G06 E41M41-163

AsA (14.4%)
gr1-F07a g2-J08_166 11 g1-G06 11
SG (19.3%)

13 E45M39-156 E40M42-226 E40M61-263 SNPctig258 E41M43-179


E40M40-219 E40M61-263 14 g1-P01_213 E45M39-213 13 gr1-F07a g2-J08_166
14 SNPctig258 g1-P01_213 g1-B02 E45M39-156 E40M42-226
E45M39-213 g1-B02 E41M43-370 E45M61-262 E40M40-219 SNPctig258
16 14 g1-B02
16 E40M43-289 E41M43-370 E33M55-177 16 E40M43-289
E45M61-262 E33M55-177 17 E40M55-350
17 E40M55-350 24 E45M50-191 25 SNPctig221
24 E45M50-191 26 E45M58-232 27 E45M41-410
SNPctig221 31 E45M40-270
25 28 E41M41-375 E45M42-228
26 E45M58-232 36 E33M55-201 32
27 E45M41-410 42 E40M41-148
28 E41M41-375
31 E45M40-270 47 E45M39-117
32 E45M42-228
36 E33M55-201
42 E40M41-148
47 E45M39-117

Рис. 1. Фрагмент генетической карты черной смородины [36]. Представлены 1-е и 2-е группы сцепления. Слева на-
право: объединенная генетическая карта, затем ГК каждого из родителей. По вертикали указано положение QTL и
% вариации признака. Расшифровка сокращенных названий признаков: AsA – аскорбиновая кислота, HBW – вес ста
ягод, SG (Specific gravity) – удельный вес выжатого сока, full leaf – полное распускание листьев, full flower – полное
цветение.

устойчивости к почковому клещу и ряда локусов керами, полученными в результате использования


хозяйственно полезных признаков (QTL, Quantita- современных подходов с применением секвениро-
tive trait loci). Ген Се был картирован на второй вания нового поколения (New Generation Sequen-
группе сцепления. Интересно отметить, что ги- sing). Главное отличие секвенирования по саргенту
бриды семьи 9328 по данным ДНК-маркеров раз- (более старая методика) и секвенирования нового
делились на две группы, в одну из них вошли ги- поколения – это бóльшие объемы секвенирова-
бриды, у которых не было специфических аллелей ния, соответственно более высокая воспроизво-
от отца, т.е. они образовались от самоопыления димость и, в конечном счете, дешевизна анализа.
(selfs) [31]. В 2011 г. Russel et al. [12] опубликовали вторую вер-
сию генетической карты черной смородины, увели-
Изначальная генетическая карта для черной чив число гибридов популяции 9328 до 311 штук и
смородины постепенно насыщалась новыми мар- используя для картирования еще одну гибридную

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


1004 ПИКУНОВА и др.

семью МР7 (95 гибридов, Ben Finlay × Hedda). В ния и проверка на конкретном селекционном ма-
данной работе посредством секвенирования тран- териале.
скриптомов родителей гибридной популяции с ис- Помимо указанных в табл. 1 признаков на пер-
пользованием секвенатора 454 (Life Science) были вой ГК по однолетним данным были локализова-
обнаружены новые SNP (около 7 тыс. шт.) и SSR ны QTL следующих фенологических дат: дата пол-
(около 3 тыс. шт.) маркеры. Однако, вероятно в ного раскрытия листа (date of Full leaf), полного
связи с дороговизной анализа, только 384 SNP цветения (Date of Full Flower), начала цвете-
были проанализированы на популяциях (в итоге ния/раскрытия первого цветка (First open Flower).
189 картированы в популяции 9328 и 118 в популя- Для каждого из признаков обнаружено по не-
ции МР7).Всего 10 SSR протестировали на попу- сколько QTL, объясняющие небольшую долю ва-
ляциях, 6 штук картировали, при этом AFLP- риации признака (от 14.6 до 21.9%) [31].
маркеры были исключены из анализа [12]. Общая
При этом важно отметить, что подход к обра-
длина карты составила 605 сМ для популяции
ботке фенотипических данных и данных поли-
9328 и 355 сМ для популяции МР7.
морфизма ДНК-маркеров, в том числе статисти-
Несколько позднее была опубликована третья ческая модель, влияют на локализацию локусов
версия генетической карты черной смородины. В количественных признаков и их значимость [53].
ней метод генотипирования по сиквенсу (geno- Так, изначально на первой генетической карте
typing by sequencing) использовали для выявления черной смородины не было обнаружено QTL, свя-
новых SNP-маркеров в семье 9328 [21]. Авторы от- занных с содержанием антоцианов [31], использо-
мечают преимущества этого метода – возможность вание иного статистического подхода к обработке
одновременного выявления, детекции и проверки тех же данных привело к выявлению нескольких
маркеров. В итоге была получена подробная карта QTL на различных группах сцепления [53].
высокого разрешения (high-resolution linkage map) Интересен тот факт, что на первой генетиче-
общей длиной 771 сМ, включающая SNP (более ской карте черной смородины был локализован
1300 шт.) и SSR (49 шт.) маркеры. При этом кар- целый ряд QTL по девяти параметрам [31], однако
тированы SNP, обнаруженные разными способа- только о двух из них (вес 100 ягод и содержание
ми: 1) путем 454-секвенирования родителей (из растворимых сухих веществ, таких как сахара) го-
работы [12], 2) с помощью программы Tassel (Trait ворится в последней наиболее насыщенной карте
Analysisby Association, Evolution and Linkage), черной смородины [21].
3) посредством сборки, основанной на тран- Локализация QTL – важный этап изучения ге-
скриптоме (reference transcriptome assembly). нома, однако он не всегда является залогом после-
Прием генетического картирования использо- дующей локализации генов кандидатов в этой по-
вали для локализации гена Р устойчивости к поч- зиции. Порою, первоначальная локализация QTL
ковому клещу ученые из Польши. На карте были может быть не точна или даже ошибочна, что мо-
локализованы 43 AFLP и 19 микросателлитных жет быть связано со слишком субъективными ме-
маркеров [52]. тодами фенотипирования, ошибками на этапе де-
текции ДНК-маркеров, статистическими подхода-
Наибольший практический интерес от состав- ми к анализу данных.
ления генетических карт – это локализация хо- Усилиями мирового сообщества селекционе-
зяйственно полезных признаков. Хочется отме- ров идентифицирован ряд генов, контролирую-
тить, что в настоящее время различают локусы щих хозяйственно полезные признаки черной
количественных признаков (quantitative trait loci, смородины, среди них гены устойчивости к бо-
QTL), подразумевая полигенное наследование, и лезням и вредителям (почковому клещу, столбча-
локусы качественных признаков (Mendelian trait той ржавчине, листовой галлице, американской
loci, MTL) в случаях классического менделевско- мучнистой росе, антракнозу, септориозу), мор-
го расщепления признака. фологические признаки (окраска кожицы ягод,
На генетической карте черной смородины ло- форма листовой пластинки), а также фенологи-
кализованы локусы целого ряда количественных ческие даты, летальные гены, цитоплазматиче-
признаков (табл. 1). Важно отметить, что обнару- скую мужскую стерильность, блокировку био-
женные локусы количественных признаков объ- синтеза антоцианов. Однако Огольцова в своей
ясняют лишь определенную долю варьирования работе отмечает, что этих сведений явно недоста-
их морфологического проявления. Можно пред- точно, чтобы дать генетическую модель идеаль-
положить также, что у генетически отдаленных ного сорта [54].
родственников могут быть различные механиз- Несмотря на то, что в селекции крыжовника и
мы, обуслoвливающие схожее проявление при- красной смородины выделены доноры целого ряда
знаков. Поэтому для разработки методов маркер- хозяйственно полезных признаков (таких как
ного отбора для селекционной практики на эти устойчивость к болезным и вредителям, крупно-
признаки требуются дополнительные исследова- плодность, самоплодность, раннеспелость, бес-

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМА С ПРИМЕНЕНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ 1005

Таблица 1. Локусы количественных признаков (QTL), картированные на генетической карте черной смородины
Группа Степень влияния обнаруженного генетического
Признак Ссылка
сцепления полиморфизма на фенотипическое проявление
Средний вес 100 ягод 1 Полиморфизм в этих локусах объясняет от 20 до 34.7%
[21, 31]
(HBW) 5 изменчивости признака в зависимости от года изучения
Содержание растворимых
сухих веществ, таких как 2 Полиморфизм в этих локусах объясняет от 16.7 до 43.9%
[21]
сахара (soluble solids such as 3 изменчивости признака в зависимости от года изучения
sugars)
Содержание аскорбиновой 1 19.7% изменчивости признака [31]
кислоты* (Ascorbic acid) 2 14.1% изменчивости признака
Среднее содержание антоцианов на 0.073 (при стандарт-
6 ной ошибке 0.024) ниже у гибридов с маркером
E40M39-125
Среднее содержание антоцианов на 0.075 (при стандарт-
Содержание антоцианов в
3 ной ошибке 0.027) выше у гибридов с маркером [53]
плодах (anthocyanin)
E45M58-334
Среднее содержание антоцианов выше у гибридов
5 с маркером E40M39-149, при этом разница в содержании
антоцианов варьирует по годам
Даты раскрытия почек 3 В среднем на 3.6 дней (стандартная ошибка 0.93 дня)
(Time of Budbreak) раньше
8 В среднем на 2.1 день (стандартная ошибка 0.84 дня)
[31, 53]
раньше
4 В среднем на 2.1 дней (стандартная ошибка 0.89 дня)
раньше
Титруемая кислотность сока* Полиморфизм в этом локусе объясняет
(Еitratable juice acidity) 3 26.6% изменчивости признака
[31]
6 24.8% изменчивости признака
7 15.7% изменчивости признака
Удельный вес выжатого сока* Полиморфизм в этом локусе объясняет
(Specific gravity of the extracted 2 19.3% изменчивости признака [31]
juice) 3 15.8% изменчивости признака
pH сока* Полиморфизм в этом локусе объясняет
3 28.4% изменчивости признака [31]
7 16.3% изменчивости признака
* Для QTL анализа брали среднее значение данных за три года.

шипость у крыжовника и т.д.) и ведется селекция, на в генетическом и молекулярно-генетическом


генетика большинства из них изучена крайне плане смородина черная.
слабо [4]. У видов G. watsonoana, G. leptantha
идентифицирован ген Sph1, контролирующий
иммунитет к мучнистой росе (Sphaerotheca mors МАРКЕР-ВСПОМОГАТЕЛЬНАЯ СЕЛЕКЦИЯ
uvae Schwein) [55]. Одним из прикладных направлений примене-
Для локализации генов методами построения ния молекулярных маркеров является маркер-
генетических карт необходимы соответствующие вспомогательная селекция (МВС, Marker-assisted
популяции от скрещивания контрастных по selection) [56]. Принцип метода заключается в от-
определенным признакам генотипов. Очевидно, боре генотипов, несущих целевой ген на основа-
что среди видов рода смородина наиболее изуче- нии данных о присутствии ДНК-маркеров, тесно

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


1006 ПИКУНОВА и др.

сцепленных с ним. Рекомендуется использовать сцепление с геном в генетически разнородном


маркеры, расположенные в непосредственной материале, не задействованном в картировании
близости к гену (в пределах 5 сМ). При этом на- (в т.ч. 20 сортов, дикая форма, гибриды), и авторы
дежность маркерного отбора возрастает при ис- резюмируют, что он может быть использован для
пользовании фланкирующих (окружающих ген с ранней диагностики устойчивости к почковому
двух сторон) маркеров или внутригенного маркера, клещу у гибридов. В дальнейшей работе [61] дан-
напрямую идентифицирующего нужный аллель. ный маркер вместе с ДНК-маркером гена Се ис-
Выделяют несколько целей использования мар- пользуют для анализа различных видов и выявле-
кер-опосредованной селекции растений, включая ния межвидовых гибридов, совмещающих два ге-
оценку селекционного материала с помощью мо- на устойчивости.
лекулярных маркеров; ускоренное получение бек- Ген Се устойчивости черной смородины к
кроссов с помощью молекулярных маркеров; сов- почковому клещу, переданный ей от крыжовни-
мещение нескольких интересующих генов в одном ка, был локализован шотландскими учеными на
генотипе; отслеживание интересующих аллелей 2-й группе сцепления вместе с AFLP и SSR
(доминантных или рецессивных) через поколения ДНК-маркерами. На основании лучшего AFLP-
с тем, чтобы накопить желательные аллели; выяв- маркера был разработан доминантный SCAR-
ление наиболее подходящих индивидуумов в рас- маркер, который у устойчивых (проверено на
щепляющейся популяции, основанное на оценке инфекционном участке) генотипов с геном Ce
аллельной композиции части или всего генома; выявлял фрагмент размером 130 пн и ничего не
разрыв возможной связи желательных аллелей и амплифицировал у восприимчивых генотипов.
нежелательных локусов и др. [56, 57]. Разработчики успешно проверили маркер на
На данный момент для черной смородины 155 генотипах (включая сорта, селекционные
опубликовано всего несколько методик, рекомен- формы и гибридные сеянцы) [58].
дованных для маркер-вспомогательной селекции: Интересно отметить, что, амплифицировав
маркеры черной и зеленой окраски ягод [27], мар- ДНК-маркер гена Се на ДНК крыжовника, смо-
керы генов Се и Р устойчивости к почковому кле- родины кроваво-красной (R. sanguineum) и смо-
щу [52, 58]. родины золотистой (R. aureum) и секвенировав
Работая над созданием простой методики точ- ампликоны, ученые из Литвы обнаружили высо-
ного выявления генотипов черной смородины с кий уровень сходства нуклеотидных последова-
зеленым и черным цветом ягод на ранних этапах тельностей. На основании этого авторы приходят
развития растений, польские ученые обнаружили к выводу, что, возможно, устойчивость к почко-
RAPD-маркер размером 700 пн, амплифицируе- вому клещу смородины кроваво-красной и золо-
мый парой праймеров OPA-01 только у растений тистой, так же как и у крыжовника, обусловлена
с доминантным аллелем черного цвета, а также геном Се [61].
ISSR-маркер размером 1200 пн, амплифицируе-
мый праймером 818 только у растений с рецессив- Маркеры, разработанные на одной популя-
ным зеленым аллелем [27]. Следует отметить, что ции, не обязательно будут столь же эффективны
зеленоплодные сорта черной смородины, на- на другой. Поэтому необходима проверка марке-
сколько нам известно, мало интересны для про- ров на различном селекционном материале. В свя-
изводства, так как содержат меньше полезных для зи с чем нашей первоначальной задачей была
здоровья веществ. оценка возможности использования SCAR-мар-
кера гена Се, амплифицируемого парой праймеров
Существенным недостатком смородины чер- GMresa [62], для отбора устойчивых к почковому
ной, как и всех ягодных культур, является высокая клещу генотипов при работе с отечественным се-
восприимчивость к болезням и вредителям. К на- лекционным материалом. Для чего был проведен
стоящему времени идентифицировано два гена скрининг выборки образцов (включая черную
устойчивости к почковому клещу, ген Р у потомков смородину, крыжовник, смородино-крыжовни-
сибирского подвида смородины черной [59] и ген ковые гибриды) из коллекции ВНИИСПК на
Се, который передан смородине от крыжовника и присутствие вышеупомянутого ДНК-маркера.
унаследован производными смородины клейкой, SCAR-маркер во всех случаях верно определил
которые интенсивно использовали в качестве до- наличие или отсутствие гена в соответствии с
норов устойчивости к мучнистой росе [60]. данными родословных и наблюдениями за устой-
В работе литовских исследователей Mazeikiene чивостью. SCAR-маркер амплифицирует только
et al. [52] с помощью AFLP и микросателлитных доминантный аллель и не дает никаких ПЦР-
ДНК-маркеров была построена генетическая продуктов у генотипов без гена Ce. В связи с этим
карта и локализован ген P. Обнаружен ДНК-мар- для исключения ложноотрицательных результа-
кер – AFLP-фрагмент CTA-ACC-107, сцеплен- тов (отсутствия ПЦР-продуктов в связи с неудо-
ный с геном. Несмотря на то, что на карте маркер влетворительным для ПЦР-качеством ДНК)
расположен в 14.2 сМ от гена, он показал хорошее ДНК всех сортообразцов предварительно тести-

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМА С ПРИМЕНЕНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ 1007

пн
400
Сe 300 Сe Сe
e4-D03
200
SCAR
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис. 2. Выявление SCAR-маркера гена Се по усовершенствованной методике одновременной амплификации с микро-


сателлитным локусом e4-D03. Надпись Се указывает присутствие или отсутствие гена Се у образца черной смородины
по данным селекционных наблюдений; стрелка указывает на SCAR-маркер гена Се (фрагмент размером 130 пн). М –
маркер молекулярного веса (110, 200…1000 пн), 1…17 – сорта Рита, Памяти Правика, Чародей, Сластена, Алтаянка, Кипи-
ана, Лана, Tisli, Ажурная, Hildur, Орловская серенада, Заря Галицина, Лентяй, Оазис, Чудное мгновение, Гамма, 4934-5.

ровалась путем амплификации с микросателлит- Се используются для анализа межвидовых гибри-


ными праймерами, чтобы подтвердить удовле- дов и отбора гибридов с двумя генами в Institute of
творительное качество и концентрацию ДНК. Та- Horticulture Lithuanian Research Centre for Agricul-
ким образом, скрининг проходил в два этапа. ture and Forestry, Литва [61]. Внедрение маркер-
На стадии внедрения данного метода в целях вспомогательной селекции в школке сеянцев бы-
маркер-вспомогательной селекции в гибридных ло начато и во ВНИИ селекции плодовых куль-
семьях возникла задача упрощения двуступенча- тур, Орел. Девяносто три гибрида из одиннадцати
той методики при анализе большого объема мате- семей были протестированы на присутствие
риала. В практике нашей лаборатории задача была SCAR-маркера гена Се [63].
решена путем подбора микросателлитного локуса
для проведения одновременной ПЦР вместе с па- ЗАКЛЮЧЕНИЕ
рой праймеров GMresa. Изначальные требования
по микросателлитному локусу: 1) температура от- Для изучения рода смородина Ribes L. исполь-
жига, близкая с парой праймеров GMresa (58°С), зовались различные типы ДНК-маркеров
2) размеры ПЦР-фрагментов более 200 пн, т.е. в (RAPD, AFLP, ISSR, SSR) в исследованиях по ге-
ином диапазоне нежели ПЦР-продукт пары нетическому разнообразию, идентификации сор-
праймеров GMresa – 130 пн. тов, молекулярной филогении и систематике.
Для разработки систем идентификации сортов
Семнадцать сортов и селекционная форма бы- различными научными коллективами успешно
ли использованы для проверки методики (рис. 2). использовались микросателлитные ДНК-марке-
ПЦР-фрагменты микросателлитного локуса e4D03 ры. Наиболее глубоко изучена с применением
не мешают оценке амплификации пары прайме- ДНК-маркеров смородина черная. Для нее со-
ров GMresa и являются внутренним контролем ставлено несколько генетических карт групп
качества ДНК. Данная усовершенствованная ме- сцепления с применением маркеров AFLP, SSR,
тодика также была использована при МВС в ги- SNP, локализован ряд локусов количественных
бридных семьях. признаков. На данный момент нет секвенирован-
Разработанные методики маркер-вспомога- ных и аннотированных геномов представителей
тельной селекции генов устойчивости к почковому рода смородина.
клещу в настоящее время внедряются в селекцион- В настоящее время в рамках маркер-вспомога-
ную практику. SCAR-маркер гена Се, амплифици- тельной селекции для смородины черной опубли-
руемый парой праймеров GMresa, используется в ковано только несколько методик, позволяющих
селекционной программе SCRI для выявления отбирать генотипы с заданными параметрами на
устойчивых генотипов [58], маркеры гена Р и гена ранних стадиях развития – отбор устойчивых к

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


1008 ПИКУНОВА и др.

почковому клещу генотипов с генами Се и Р, от- germplasm using RAPD, ISSR and AFLP markers //
бор растений с черным и зеленым окрасом ягод. J. Hortic. Sci. Biotechnol. 1999. V. 74. P. 361–366.
https://doi.org/10.1080/14620316.1999.11511122
В целом молекулярно-генетические исследо-
вания смородины отстают от уровня культур се- 11. Brennan R., Jorgensen L., Woodhead M. et al. Develop-
мейства Розоцветные (таких как яблоня, земля- ment and characterization of SSR markers in Ribes spe-
ника), однако, учитывая наличие генетической cies // Mol. Ecol. 2002. № 2(3). P. 327–330.
карты черной смородины и локализацию целого https://doi.org/10.1046/j.1471-8286.2002.00233.х
ряда QTL, молекулярно-генетические исследова- 12. Russell J.R., Bayer M., Booth C. et al. Identification,
ния смородины переходят на стадию выявления utilisation and mapping of novel transcriptome-based
генов хозяйственно полезных признаков, что markers from blackcurrant (Ribes nigrum) // BMC
позволит разрабатывать новые методы маркер- Plant Biol. 2011. № 11(1). P. 147.
https://doi.org/10.1186/1471-2229-11-147
вспомогательной селекции, а также даст возмож-
ность для развития других прикладных подходов 13. Milligan B.G. Plant DNA isolation // Molecular Ge-
в усовершенствовании генома, таких как транс- и netics of Populations // Molecular Analysis of Popula-
цисгенез, геномное редактирование. tion: A Practical Approach. Oxford, UK: IRL Press,
1992. P. 59–68.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ
“Изучение генома смородины (Ribes L.) с помо- 14. Weigend M., Flowering plants. Eudiocots // Families
щью ДНК маркеров” № 18-76-0032. and Genera of Vascular Plants. 2007. V. 9. P. 168–176.
Настоящая статья не содержит каких-либо ис- 15. Struwe L.M., Thiv J.W., Kadereit A.S.-R. et al. Saccifo-
следований с использованием в качестве объекта lium an endemic of Sierra de La Neblina on the Brazil-
lian-Venezuelan frontier is related to a temperate alpine
животных. lineage of Gentianaceae // Harvard Papers Bot. 1998.
Настоящая статья не содержит каких-либо ис- V. 3. P. 199–214.
следований с участием в качестве объекта людей. 16. Palmieri L., Grando M.S., Sordo M. et al. Establishment
Авторы заявляют, что у них нет конфликта ин- of molecular markers for germplasm management in a
тересов. worldwide provenance Ribes spp. Collection // Plant
Omics. 2013. V. 6(3). P. 165–174.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 17. Puchooa D. A simple, rapid and efficient method for the
extraction of genomic DNA from lychee (Litchinensis
1. Князев С.Д., Огольцова Т.П. Селекция смородины Sonn.) // African J. Biotechnol. 2004. V. 3. № 4.
черной на современном этапе. Орел: Изд-во Орел- P. 253–255.
ГАУ, 2004. 238 с. https://doi.org/10.5897/AJB2004.000-2046
2. Hummer K.E., Barney D. Currants // HortTechnol. 18. Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh
2002. V. 12. № 3. P. 377–387. tissue // Focus. 1990. V. 12. P. 13–15.
3. Maлинoвcкий Б. 2017 https://propozitsiya.com/krasnaya-
19. Lanham P., Brennan R.M., Hackett C. et al. RAPD fin-
smorodina-priznana-samoy-rentabelnoy-nishevoy-yagodoy.
gerprinting of blackcurrant (Ribes nigrum L.) cultivars //
https://doi.org/10.1051/fruits/2011049 www.fruits-jour-
Theor. Appl. Genetics. 1995. V. 90. P. 166–172.
nal.org
https://doi.org/10.1007/BF00222198
4. Помология. Т. IV. Смородина. Крыжовник / Под
ред. Седова Е.Н. Орел: ВНИИСПК, 2009. С. 468. 20. Lanham P.G., Korycinska A., Brennan M. Genetic di-
versity within a secondary gene pool for Ribes nigrum L.
5. Bauer R. “True breeding” for combined resistance to revealed by RAPD and ISSR markers // J. Horticultur-
leaf, bud and shoot diseases // Jugoslovensko Vocarst- al Sci. Biotechnol. 2000. V. 75(4). P. 371–375.
vo. 1973. V. 7. № 25/26. P. 17–19. https://doi.org/10.1080/14620316.2000.11511253
6. Chiche J., Brown S.C., Leclerc J.-L. et al. Genome size,
heterochromatin organization and ribosomal gene 21. Russell J., Hackett C., Hedley P. et al. The use of geno-
mapping in four species of Ribes // Can. J. Bot. 2003. typing by sequencing in blackcurrant (Ribes nigrum):
V. 81. P. 1049–1057. developing high-resolution linkage maps in species
https://doi.org/10.1139/b03-088 without reference genome sequences // Mol. Breeding.
2014. V. 33(4). P. 835–849.
7. Messinger W., Liston A., Hummer K. Ribes phylogeny as https://doi.org/10.1007/s11032-013-9996-8
indicated by restriction-site polymorphisms of PCR-
amplified chloroplast DNA // Plant Systemat. Evol. 22. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений:
1999. V. 217. P. 185–195. ДНК-технологии создания новых сельскохозяй-
8. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure ственных сортов // C.-x. биол. 2003. № 3. С. 26–41.
for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. 23. Чесноков Ю.В. ДНК-фингерпринтинг и анализ ге-
Bull. 1987. V. 19. P. 11–15. нетического разнообразия у растений // С.-x. био-
9. Rowland L.J., Nguyen B.I.N.H. Use of polyethylene логия. 2005. Т. 40. № 1. С. 20–40.
glycol for purification of DNA from leaf tissue of woody 24. Пикунова А.В. Использование молекулярных марке-
plants // BioTechniques. 1993. V. 14(5). P. 734–736. ров для оценки исходного селекционного материала
10. Lanham P.G., Brennan R.M. Genetic characterization ягодных культур // Вестн. Орлов. гос. аграр. ун-та.
of gooseberry (Ribes grossularia subgenus Grossularia) 2011. № 3(30). С. 29–32.

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМА С ПРИМЕНЕНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ 1009

25. Vos P., Hogers R., Bleeker M. et al. AFLP: a new tech- 40. Keep E. Interspecific hybridization in Ribes // Geneti-
nique for DNA fingerprintin // Nucl. Acids Res. 1995. ca. 1962. V. 33. P. 1–23.
V. 23(21). P. 4407–4414. 41. Coville F.V., Britton N.L. Grossulariaceae // North Amer.
https://doi.org/10.1093/nar/23.21.4407 Flora. 1908. V. 22. P. 193–225.
26. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome finger- 42. Berger A. A taxonomic review of currants and gooseber-
printing by simple sequence repeat (SSR)-anchored ries // N.Y. Agric. Exptl Sta. Techn. Bull. 1924. V. 109.
polymerase chain reaction amplification // Genomics. P. 1–118.
1994. V. 20. P. 176–183.
https://doi.org/10.1006/geno.1994.1151 43. Komarov V.L. Flora of the (former) USSR // Ribesi-
oideae Engl. London: Keter, 1971. V. IX. P. 175–208.
27. Keller-Przybylkowicz S., Korbin M., Gwozdecki J. RAPD
and ISSR markers of black and green colour of black- 44. Brennan R.M. Currants and gooseberries // Temperate
currant (Ribes nigrum) fruits // J. Fruit and Ornamental Fruit Crop Breeding. Dordrecht: Springer, 2008.
Plant Res. 2006. V. 14. P. 45–52. P. 177–196.
28. Jones C.J., Edwards K.J., Castaglione S. et al. Repro- 45. Janczewski E. Monograph of the currants Ribes L. //
ducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in Mem. Soc. Phys. Hist. Nat. Geneve, 1907. V. 35.
plants by a network of European laboratories // Mol. P. 199–517.
Breed. 1997. V. 3. № 5. P. 381–390. 46. Sinnott Q.P. A revision of Ribes L. subg. grossularia
https://doi.org/10.1023/A:1009612517139 (Mill.) per. Sect. Grossularia (Mill.) Nutt. (Grossulari-
29. Kalia R.K., Rai M.K., Kalia S. et al. Microsatellite aceae) in North America // Rhodora. 1985. V. 87.
markers: an overview of the recent progress in plants // P. 189–286.
Euphytica. 2011. № 177(3). P. 309–334. 47. Еремин Г.В., Исачкин А.В, Казаков И.В. и др. Общая
https://doi.org/10.1007/s10681-010-0286-9 селекция и сортоведение плодовых и ягодных
30. http://www.fruitbreeding.co.uk/RibesGenomicsSSRs.asp. культур. М.: Мир, 2004. 422 с.
31. Brennan R., Jorgensen L., Hackett C. et al. The develop- 48. Самигуллина Н.С. Практикум по селекции и сорто-
ment of a genetic linkage map of blackcurrant (Ribes ni- ведению плодовых и ягодных культур: уч. изд. Ми-
grum L.) and the identification of regions associated чуринск: Изд-во Мичурин. гос. ун-та, 2006. С. 197.
with key fruit quality and agronomic traits // Euphyti- 49. Schultheis L.M., Donoghue M.J. Molecular phylogeny
ca. 2008. V. 161. P. 19–34. and biogeography of Ribes (Grossularia) with an em-
https://doi.org/10.1007/s10681-007-9412-8 phasis of gooseberry (subg. grossularia) // Systemat.
32. Cavanna M., Marinoni D.T., Beccaro G.L. et al. Micro- Bot. 2004. V. 29. № 1. P. 77–96.
satellite-based evaluation of Ribes spp. germplasm // https://doi.org/10.1600/036364404772974239
Genome. 2009. V. 52. № 10. P. 839–848. 50. Senters A.E., Soltis D.E. Phylogenetic relationships in
https://doi.org/10.1139/G09-057 Ribes (Grossulariaceae) inferred from ITS sequence
33. Antonius K., Karhu S., Kaldm H. et al. Development of data // TAXON. 2003. V. 52. P. 51–66.
the Northern European Ribes core collection based on 51. NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore).
a microsatellite (SSR) marker diversity analysis // Plant 52. Mazeikiene I., Bendokas V., Stanys V. et al. Molecular
Genet. Resources: Characterization and Utilization. markers linked to resistance to the gall mite in blackcur-
2012. P. 70–73. rant // Plant Breeding. 2012. V. 131(6). P. 762–766.
https://doi.org/10.1017/S1479262111000980 https://doi.org/10.1111/j.1439-0523.2012.01995.x
34. Пикунова А.В., Князев С.Д., Бахотская А.Ю. и др. 53. Hackett C.A., Russell J., Jorgensen L. et al. Multi-envi-
Полиморфизм микросателлитных локусов у сор- ronment QTL mapping in blackcurrant (Ribes nigrum L.)
тов черной смородины (Ribes nigrum L.) из коллек- using mixed models // Theor. Appl. Genet. 2010.
ции ВНИИСПК // С.-x. биол. 2015. Т. 50. № 1. V. 121(8). P. 1483–1488.
С. 46–54. https://doi.org/10.1007/s00122-010-1404-8
https://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.1.46rus
54. Огольцова Т.П. Селекция черной смородины –
35. Гаевский Н.А. Знакомство с эволюционной генети- прошлое, настоящее, будущее. Тула: Приок. кн.
кой. Красноярск. 2002. 52 с. изд-во, 1992. 384 с.
36. Reim S., Flachowsky H., Hanke M.V. et al. Verifying the 55. Keep E. Breeding for resistance to American gooseberry
parents of the Pillnitzer apple cultivars // Acta Horti- mildew, Sphaerotheca mors-uvae, in the gooseberry
culture. 2009. V. 814. P. 319–323. (Ribes grossularia) // Ann. Appl. Biol. 1974. V. 76(1).
https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2009.814.50 P. 131–135.
37. Межнина О.А. Оценка генетического разнообра- https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1974.tb01363.x
зия и разработка методов ДНК-идентификации 56. Collard B.C. Marker-assisted selection: an approach for
сортов и представителей видов ягодных культур precision plant breeding in the twenty-first century //
FRAGARIA L. и RIBES L.: Автореф. дис. … канд. Phil. Transact. R. Soc. L. Ser B. Biol. Sci. 2008. V. 363.
биол. наук. 2017. 25 с. P. 557–572.
38. Burnes T.A., Blanchette R.A., Smith J.A. et al. Black cur- https://doi.org/10.1098/rstb.2007.2170
rant clonal identity and white pine blister rust resistance // 57. Francia E. Marker assisted selection in crop plants //
HortScience. 2008. V. 43(1). P. 200–202. Plant Cell. Tissue and Organ Culture. 2005. V. 82.
39. Rehder A. Manual of Cultivated Trees and Shrubs. To- P. 317–342.
ronto: MacMillan and Co., 1954. 999 p. https://doi.org/10.1007/s11240-005-2387-z

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019


1010 ПИКУНОВА и др.

58. Brennan R., Jorgensen L., Gordon S.L. et al. The devel- 61. Mazeikiene I., Bendokas V., Baniulis D. et al. Genetic
opment of a PCR-based marker linked to resistance to background of resistance to gall mite in Ribes species //
the blackcurrant gall mite (Cecidophyopsis ribis Acari: Agricultur. Food Sci. 2017. V. 26(2). P. 111–117.
Eriophyidae) // Theor. Appl. Genet. 2009. V. 118. https://doi.org/10.23986/afsci.59410
P. 205–211. 62. Пикунова А.В. Оценка генетического разнообразия
https://doi.org/10.1007/s00122-008-0889-x исходного и селекционного материала ягодных
59. Anderson M.M. Resistance to gall mite (Phytoptus ribes культур с помощью молекулярных маркеров.
Nal.) in the Eucorcosma section of Ribes // Euphytica. Дис. … канд. биол. наук. 2011. 148 с.
1971. V. 20. P. 422–426. 63. Шавыркина М.А., Князев С.Д., Пикунова А.В. Моле-
60. Knight R.L. Transference of resistance to black currant кулярно-генетические методы отбора устойчивых
gall mite Cecidophyopsis ribis from gooseberry to black к почковому клещу (Cecidophyopsis ribis) генотипов
currant // Ann. Appl. Biol. 1974. V. 76. P. 123–130. черной смородины // Современное садоводство.
https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1974.tb01362.x 2015. № 4(16). С. 31–35.

Genome Study by Means of DNA-Markers of the Black Currant


A. V. Pikunovaa, *, S. D. Knyazeva, O. D. Golyaevaa, A. U. Bahotskayaa, and O. V. Kalininaa
aRussian Research Institute of Fruit Crop Breeding, Oryol oblast, Zhilina village, 302530 Russia
*e-mail: pikuanna84@mail.ru

The paper provides an overview of foreign and Russian studies of the genus Ribes genome by means of DNA-
markers. A list of techniques for DNA extraction from currants is given. There are researches on the use of
different types of DNA markers (RAPD, AFLP, ISSR, SSR) for genetic diversity, identification of varieties,
molecular phylogeny and systematic are represented. In the works of various research teams, high level of
polymorphism revealed by microsatellite markersare shown. Examples and prospects for their use in devel-
opment of identification tools, pedigrees validations and collection management are represented. Paper de-
scribes genetic maps of blackcurrant developed by means of AFLP, SSR, SNP DNA markers. A list of QTL
(quantitative trait loci) localized on genetic maps is represented. The published techniques for marker-assist-
ed selection are described: DNA-markers of gene Се and gene Р of black currant resistance to gall mite and
DNA-markers of green and black color of berries. Improved by authors method of gene Ce detection is de-
scribed. Black currant is the most widely studied by means of DNA markers currant. The prospects for further
development of currants genome studies and the possibilities that these studies will open for further human-
directed improvement of these economically important cropsare considered.

Keywords: currants, genome, DNA-markers, linkage map, Marker-Assisted Selection, Ribes L.

ГЕНЕТИКА том 55 №9 2019