Лекция 5

Генная инженерия
 Вопросы:

• История становления генной

инженерии.
• Цель и методы генной инженерии.
• Рекомбинантные микроорганизмы.
• Методы переноса генов в клетки.
• Получение генетически
модифицированных объектов.
История становления генной
инженерии.
 Краткий экскурс

• На протяжении многих лет главным классом

макромолекул считали белки. Существовало
даже предположение, что гены имеют
белковую природу.
• В 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак
Карти показали, что носителем
наследственной информации является ДНК.
• Начинается интенсивное изучение
нуклеиновых кислот.
• Начинается интенсивное изучение
нуклеиновых кислот.
• На рубеже 50-60-х годов были выяснены
свойства генетического кода, а к концу 60-х
годов его универсальность была
подтверждена экспериментально.
• Интенсивное развитие молекулярной
генетики, объектами которой стали кишечная
палочка (E. Coli), ее вирусы и плазмиды.
• Были разработаны методы выделения
высокоочищенных препаратов
неповрежденных молекул ДНК, плазмид и
вирусов.
• Разработаны методы введения ДНК вирусов
и плазмид в клетки в биологически
активной форме, обеспечивая ее
репликацию и экспрессию соответствующих
генов.
• В 70-х годах был открыт ряд ферментов,
катализирующих реакции превращения
ДНК.
• Особая роль в развитии методов генной
инженерии принадлежит рестриктазам и
ДНК-лигазам.
 Историю развития генетической
инженерии можно условно
разделить на три этапа:
• Доказательство принципиальной
возможности получения рекомбинантных
молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются
получения гибридов между различными
плазмидами. Была доказана возможность
создания рекомбинантных молекул с
использованием исходных молекул ДНК из
различных видов и штаммов бактерий, их
жизнеспособность, стабильность и
функционирование.
• Начаты работы по получению
рекомбинантных молекул ДНК
между хромосомными генами
прокариот и различными
плазмидами, и доказательству их
стабильности и
жизнеспособности.
• Начало работ по включению в
векторные молекулы ДНК (ДНК,
используемые для переноса генов и
способные встраиваться в генетический
аппарат клетки-реципиента) генов
эукариот, главным образом, животных.
• Формально датой рождения
генетической инженерии следует
считать 1972 год, когда в
Стенфордском университете П.
Берг и С. Коэн с сотрудниками
создали первую рекомбинантную
ДНК, содержавшую фрагменты
ДНК вируса SV40, бактериофага и
E. coli.
 2. Цель и методы генной инженерии

• Генная инженерия - это сумма

методов, позволяющих переносить
гены из одного организма в
другой, или - это технология
направленного конструирования
новых биологических объектов.
 Цель прикладной генетической
инженерии заключается в
конструировании таких
рекомбинантных молекул ДНК,
которые при внедрении в
генетический аппарат реципиента
придавали бы организму свойства,
полезные для человека.
В настоящее время кишечная палочка (E.
coli) стала поставщиком таких важных
гормонов как инсулин и соматотропин.
• Инсулин -Для получения 100г кристаллического
инсулина требуется 800-1000кг поджелудочной
железы, а одна железа коровы весит 200-250грамм.
Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для
широкого круга диабетиков.
• E. coli –продуценты инсулина .
Показано, что не содержит белков E.
coli, эндотоксинов и других примесей, не
дает побочных эффектов, как инсулин
животных, а по биологической
активности от него не отличается.
 Соматотропин - гормон роста
человека, секретируемый гипофизом

• Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной

карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10
мг на 1 кг веса три раза в неделю, то за год ребенок,
страдающий от его недостатка, может подрасти на 6
см.
• Ранее его получали из трупного материала, из одного
трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на
конечный фармацевтический препарат. Доступные
количества гормона были ограничены, кроме того,
гормон, получаемый этим способом, был неоднороден
и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.
Технология рекомбинантных ДНК
использует следующие методы:

• специфическое расщепление ДНК

рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее
выделение и манипуляции с отдельными
генами;
• быстрое секвенирование всех нуклеотидов
очищенном фрагменте ДНК, что позволяет
определить границы гена и аминокислотную
последовательность, кодируемую им;
• конструирование рекомбинантной ДНК;
• гибридизация нуклеиновых кислот,
позволяющая выявлять специфические
последовательности РНК или ДНК с большей
точностью и чувствительностью;
• клонирование ДНК: амплификация in vitro с
помощью полимеразной цепной реакции или
введение фрагмента ДНК в бактериальную
клетку, которая после такой трансформации
воспроизводит этот фрагмент в миллионах
копий;
• введение рекомбинантной ДНК в клетки или
организмы.
 3. Рекомбинантные
микроорганизмы
• Основным объектом монипуляций
генной инженерии служат гены, т.е
фрагменты ДНК, являющиеся
функциональной единицей
наследственности, кодирующей,
как правило, отдельный белок.
• С молекулярной точки зрения ген представляет
собой специфическую нуклеотидную
последовательность, транскрибируемую в РНК.
Кодирующая последовательность снабжена
генетическими элементами, необходимыми для
начала правильной транскрипции (промотор) и
для образования правильной 3´- 5´- концевой
регуляторной последовательности.
• Процесс реализации генетической
информации, закодированной в структуре ДНК,
на уровне РНК и белков называют экспрессией
генов.
• Транскрипция – синтез молекул РНК на ДНК-
или РНК- матрице, осуществляемый РНК –
зависимой или ДНК- зависимой РНК-
полимеразой.
• Промотор – Цис –(действующая) активная
последовательность ДНК длиной 80-120 п.о.,
расположенная перед сайтом инициации гена,
с которым может связываться РНК-полимераза
и инициировать транскрипцию.
• Терминатор – специфическая область ДНК
(последовательность в опероне), ответственная
за прекращение (терминацию) синтеза иРНК.
 Перенос плазмид у бактерий
• У бактерий генетическая информация
заключена в одной большой молекуле ДНК –
хромосоме бактерии. Поскольку бактерии
размножаются бесполым путем, эта
генетическая информация на протяжении
многих поколений остается в значительной
степени неизменной. В бактериальной клетке
имеются, помимо главной ее хромосомы, еще и
небольшие кольцевые сегменты ДНК. Эти
молекулы ДНК, - плазмиды, часто несут в себе
гены, ответственные за устойчивость к
антибиотикам.
Плазмида pJET1,2 от Fermentas

• верхнем правом углу - сайты

рестрикции
• . Rep – участок отвечающий
за репликацию
(размножение) плазмиды в
клетке
• а Ap – репортерный ген
устойчивости к антибиотику –
ампициллину.
Культура трансгенных бактерий

• тестируем на содержание bl1

методом ПЦР
• Бактерии растут очень быстро
и теперь плазмиду с геном
можно выделить из них в
любой момент в нужном
количестве.
• Чтобы последовательность
гена работала в клетке, с нее
должна прочитываться мРНК
(а с нее — белок), необходимо
наличие промотора.
• Сигнальная последовательность для
синтеза мРНК называется промотор.
• Промоторы есть у всех генов и они
отвечают за то, в каких условиях
должен синтезироваться ген, однако
определенные промоторы работают
только в определенных организмах.
Так, бактериальные промоторы не
работают у растений и наоборот,
растительные – в бактериях.
Готовая плазмида, содержащая промотор
и имеющая место для вставки гена.
 выделяем плазмиду со вставкой из
культуры бактерий и вырезаем оттуда ген.

• Вырезание производится с помощью ферментов-

рестриктаз (просто к раствору плазмидной ДНК
добавляем фермент и буфер для работы фермента).
По бокам от встроенного нами гена в плазмиде
содержатся участки ДНК (сайты рестрикции),
которые ими узнаются и происходит разрезание.
• Необходимо выбирать те рестриктазы, которые будут
резать только в одном месте, не разрезая сам ген
(определенная рестриктаза всегда узнает
определенный сайт, который состоит обычно из 6
определенных нуклеотидов).
Рестриктаза EcoR1 всегда разрежет ДНК если
обнаружит в ней последовательность G'AATTC,
причем резать будет и одну цепь и вторую.
Разрезаем купленную плазмиду с промотором и
смешиваем ее с вырезанным геном. Добавляем
лигазы – имеем сшитую последовательность,
где у нас имеется промотор 35S и ген bl1.
Плазмида с промотором, геном,
маркёрами и другими
служебными частями называется
“плазмидой для экспрессии”. Ее
уже можно использовать для
получения трансгенных растений
и животных.
Соединение разных плазмид

• Плазмиды можно разрезать, фрагменты

сращивать друг с другом, а затем такие
комбинированные плазмиды вводить в
клетки. Можно соединять фрагменты ДНК
одного и того же вида или же разных видов.
• Плазмиды из штамма E. coli, устойчивого к
тетрациклину, и плазмиды из штамма,
устойчивого к другому антибиотику,
каномицину, можно соединить и получить
штамм E. coli, устойчивый к обоим
антибиотикам.
 Эксперименты с двумя
видами
• Плазмиды другого вида бактерий,
например Staphylococcus aureus
(золотистого стафилококка), сами по
себе не способны размножаться в
клетках E. coli. Однако в них могут
размножаться гибридные плазмиды,
составленные искусственным путем из
куска плазмиды S. aureus и фрагмента
плазмиды E. coli.
• Этот эксперимент, в котором был
осуществлен перенос генетической
информации между неродственными
организмами, позволил предположить,
что в клетки бактерии можно вводить
молекулы ДНК и высших организмов и
что они будут в этих клетках
реплицироваться (копироваться).
 • Плазмиды из штамма E. coli,
устойчивого к тетрациклину, и
плазмиды из штамма, устойчивого
к другому антибиотику,
каномицину, можно соединить и
получить штамм E. coli,
устойчивый к обоим
антибиотикам.
 • вектор - циклическая
дезоксиполинуклеотидная
молекула, содержащая сигналы
репликации и транскрипции.
Сочетание генов и векторов дает
рекомбинантную молекулу ДНК.
Примеры векторов для E.coli
Векторы Количество Размер, т.п.н.
копий
Плазмидные векторы клонирования:
- pBR 322 40-50 4,4
- pACY 184 До 20 4,0
Специализированные емкие векторы
клонирования:
- λCharon 4A 100-200 41,8
- космида pHC 79 До 20 6,4
Плазмидные векторы для экспрес­
сии генов:
- p trp EDS-1 40-50 6,7
Процесс конструирования рекомбинантных ДНК
предпологает существование следующих
представлений и методических приемов:

• четких представлений о молекулярных

структурах и механизмах
функционирования генов, подлежащих
клонированию;
• способов выделения этих генов из
живых объектов или их химического
синтеза;
• методических возможностей сшить
нужные гены нужные гены в определенной
последовательности с выполнением
правил, обеспечивающих эффективную
экспрессию (транскрипцию и трансляцию);
• методов введения рекомбинантных ДНК в
реципиентный организм и создания таких
условий, при которых рекомбинантная
ДНК стабильно сохранялась бы и
функционировала в организме
продолжительное время.
Методы переноса генов в клетки
растений
• Растительные клетки не содержат
плазмид, поэтому для переноса генов в
растения в качестве
трансформирующих векторов в
основном, используют рекомбинантные
векторы на основе TI-плазмиды
почвенной бактерии Аgrobacterium
tumefacience.
 Ti-плазмиды содержат
разнообразные уникальные гены.
Одна часть этих генов
экспрессируется исключительно в
бактериальных клетках, другая в
эукариотических.
• Поврежденные клетки растения с нарушенной
клеточной стенкой выделяют специфические
фенольные соединения, которые служат
индукторами инфекционного процесса у
агробактерий. После прикрепления
агробактерий к растительной клетке и
активации механизма переноса с помощью пока
еще неизвестного механизма, который,
возможно, аналогичен процессу бактериальной
конъюгации, т-ДНК переносит в растительную
клетку и интегрируется в геном растения.
 Существует два типа векторов на
основе Ti-плазмид.

• Бинарный (челночный) вектор

содержит два ori для репликации
плазмиды в клетках агробактерий и
E.coli, однако лишен vir – функций.
Благодаря действию vir – генов в
трансположении, тДНК может быть
перенесена в клетки растений.
• Коинтегрированный вектор может
существовать только в клетках E.coli, но
имеет области гомологии с неонкогенной
Ti-плазмидой. После перенесения
коинтегрированного вектора в
агробактериальный штамм он
практически полностью встраивается в
Ti-плазмиду. В данной конфигурации
чужеродный ген в составе Т-ДНК также
может быть перенесен в растительные
клетки.
Рекомбинантные векторы на основе Ti-
плазмид являются не онкогенными, т.к.
лишены последовательностей,
кодирующих ферменты опухолевой
трансформации. На место этих генов
встраивается чужеродный ген который
нужно перенести в растение, и
селективный маркер для отбора
трансформантов.
• Для прямого переноса генов в растительные
клетки в основном используются
растительные протопласты. Обработка
растительной клетки целлюлозами или
пектиназами приводит к гидролизу жесткой
клеточной стенки и в результате остается
протопласт, окруженный только
плазматической мембраной, проницаемой для
ДНК. После трансформации протопласты
восстанавливают клеточную стенку и затем из
них также возможно регенерировать целые
растения.
Бомбардировка микрочастицами
(биолистика) – второй по
популярности метод
трансформации растений и
основной в случае трансформации
однодольных растений.
• Для проведения трансформации частицы
золота или вольфрама диаметром 0,4-1,2 мкм
покрывают плазмидной ДНК и «выстреливают»
ими в клетки из «пушки», приводимой в
действие пороховым зарядом, сжатым
воздухом или гелием. При этом частицы
разгоняются до скорости 300-600 м/с и
пробивают клеточную стенку и мембраны
клетки. Попав в клетку, генетический
материал, нанесенный на частицы,
интегрируется в растительную ДНК.
 Конструирование векторов для
растений с использованием
фитовирусов
• Вирусные векторы чаще используют для получения в
клетках растений ценных рекомбинантных белков
нерастительного происхождения. Чужеродные гены
встраивают в геном вируса путем слияния с
вирусными генами или замены их части. Вирусная
ДНК не встраивается в геном растительной клетки,
однако, целевой белок нарабатывается в больших
количествах в клетках, инфицированных вирусом.
Такая экспрессия носит название транзитной
(временной).
Создание трансгенных
животный
Трансгенные козлята
Микроинъекция генной
конструкции