Фармацевтическая химия и фармакогнозия
© Коллектив авторов, 2012
ВЭЖХ-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ
В АНАЛИЗЕ ИНДИКАТОРНЫХ
ИРИДОИДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
А.А. Жогова1, К.И. Эллер1, докт. хим. наук, профессор,
И.А. Самылина2, член-корр. РАМН, докт. фарм. наук, профессор
1
НИИ питания РАМН, Москва
2
Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
E-mail: zhogovaaa@yandex.ru
Разработана ВЭЖХ-УФ/МС-методика определения основных
индикаторных иридоидов в лекарственном растительном и пище-
вом сырье и готовых продуктах на их основе.
Ключевые слова: иридоиды, метод ВЭЖХ, масс-
спектрометрическое детектирование, растительное сырье.
И ридоиды – обширный класс циклопента-
пирановых монотерпенов, в основе струк-
туры которых лежит скелет иридана (1-изопропил-
2,3-диметилциклопентана). Иридоиды широко
распространены в природе как вторичные метаболи-
ты растений, синтезируемые ими предположительно
в качестве защиты от травоядных животных, насеко-
мых или поражения микроорганизмами. Все соеди-
нения данного класса имеют горький вкус. С одной
стороны, иридоиды являются компонентами некото-
рых пищевых продуктов и БАД к пище, а с другой,
служат индикаторными компонентами лекарствен-
ных препаратов, характеризующими их подлинность
и качество.
В хемотаксономических исследованиях роль ири-
доидов заключается в их способности быть важными
маркерами для таксонов различных уровней. Данный
класс соединений широко представлен в растениях
семейств Ericaceae, Loganiaceae, Gentianacae, Rubiaceae,
Verbenaceae, Lamiaceae, Oleaceae, Plantaginaceae,
Scrophulariaceae, Valerianaceae и Menyanthaceae.
Растения, содержащие иридоиды, применяют-
ся в официнальной и народной медицине в каче-
стве средств, стимулирующих аппетит и улучшающих
пищеварение, желчегонных, противовоспалитель-
ных, противомикробных, ранозаживляющих и седа-
тивных средств. Исследования фармакологических
свойств иридоидов, выделенных из растений, пока-
зали, что они обладают широким спектром биоло-
гической активности, в частности противовоспали-
тельной, противомикробной, иммуномодуляторной,
14
УДК 615.322.074
антиоксидантной, нейропротекторной, спазмолити-
ческой и др. [3, 7, 8].
В Российской Федерации Едиными санитарно-
эпидемиологическими и гигиеническими тре-
бованиями к товарам, подлежащим санитарно-
эпидемиологическому надзору (контролю),
установлены адекватные и верхние допустимые уров-
ни потребления ряда иридоидов, в частности аукуби-
на, гарпагозида, олеуропеина, асперулозидовой и де-
ацетиласперулозидовой кислоты.
Для характеристики и стандартизации лекар-
ственных препаратов и БАД к пище на основе ири-
доидсодержащего растительного сырья необходимы
специфические достоверные методы определения
индикаторных для каждого вида сырья иридоидов.
Задача настоящего исследования – разработка
методики определения основных индикаторных ири-
доидов (табл. 1) в лекарственном и пищевом расти-
тельном сырье и готовых продуктах на их основе.
Для идентификации и количественного опреде-
ления иридоидов используются методы высокоэф-
фективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ)
с денситометрическим детектированием [2, 4], высо-
коэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
со спектрофотометрическим или масс-спектральным
детектированием [1, 9], метод капиллярного электро-
фореза [5, 6]. Применение ВЭТСХ и капиллярного
электрофореза в количественной оценке иридоидов
ограничено недостаточной по сравнению с ВЭЖХ се-
лективностью и чувствительностью методов.
Отсутствие у иридоидов хромофорных групп де-
лает малоинформативным и неспецифичным спек-
трофотометрическое детектирование. В то же время
содержание индикаторных иридоидов в раститель-
ном сырье и готовой продукции варьирует в широких
пределах, предъявляя серьезные требования к чув-
ствительности и селективности используемых детек-
торов. В этой связи наиболее достоверным является
использование масс-селективного детектора.
Фармация №7, 2012
 Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Экспериментальная часть ского разделения и детектирования для совместно-

Пробоподготовка объектов исследования прово- го определения основных индикаторных иридоидов.
дилась следующим образом: порошок растительно- Параметры удерживания, максимумы поглощения в
го сырья (1,0 г) экстрагировали метиловым спиртом УФ-области и результаты масс-спектрометрического
(100 мл) на кипящей водяной бане в течение 1 ч. По- анализа представлены в табл. 2.
лученные извлечения упаривали под вакуумом досу- В режиме положительной ионизации в качестве
ха, остаток растворяли в воде (2 мл) и очищали ди- основного пика у всех иридоидов детектировался ион
этиловым эфиром (по 2 мл дважды). Водную фазу [M+Na]+, тогда как псевдомолекулярный ион [M+Н]+
выпаривали, остаток растворяли в 5% метаноле (1 мл) отсутствовал. Наблюдались также менее интенсив-
и центрифугировали на скорости 12000 об/мин в те- ные пики [2M+Na]+ и [M+К]+. Образование данных
чение 5 мин. Образцы экстрактов растительного сы- ионов позволяет точно определить молекулярную
рья (10 мг) растворяли в метаноле (100 мл), образцы массу соединений и идентифицировать их. Это осо-
соков разводили водой 1:10. Перед анализом раство- бенно важно в случае анализа сложного раститель-
ры центрифугировали. ного матрикса, когда масс-спектры иридоидов могут
В качестве стандартных об-
разцов были использованы ме- Таблица 1
танольные растворы индивиду- ОСНОВНЫЕ ИНДИКАТОРНЫЕ ИРИДОИДЫ И РАСТЕНИЯ –
альных иридоидов: аукубина, ЛЕКАРСТВЕННЫЕ И ПИЩЕВЫЕ ИСТОЧНИКИ ИРИДОИДОВ
гарпагозида, деацетиалсперуло-
зидовой кислоты, каталпола, ло- Иридоид Структура Растительные источники
ганина. Plantago major L. (подорожник большой),
Анализ проводили на жид- Каталпол
P. lanceolata L. (п. ланцетный),
костном хроматографе Agilent Rehmannia glutinosa Libosch.
(ремания клейкая)
1100 с диодноматричным де-
тектором Agilent 1100 Series Morinda citrifolia L.
Деацетил-
(моринда цитрусолистная, нони),
Diode Array, времяпролетным асперулозидовая
Galium aparine L.
кислота
масс-селективным детекто- (подмаренник цепкий)
ром Agilent G1969A с иониза- Plantago major L. (подорожник большой),
цией электрораспылением, ав- P. lanceolata L. (п. ланцетный),
Аукубин
E ucommia ulmoides Oliv.
тосемплером и программным (эвкоммия вязолистная)
обеспечением обработки хро-
Morinda citrifolia L.
матографических данных Chem (моринда цитрифолистная, нони),
Station. Условия ВЭЖХ: колон- Асперулозидовая Galium aparine L.
ка ProteColC18HPH125 (5 мкм, кислота (подмаренник цепкий)
250х4.6 мм); градиентное элюи-
рование в системе 0,1% водный
Leonurus cardiacа L. (пустырник сердечный),
раствор муравьиной кислоты (А) L. japonicas Houtt. (п. японский),
– метанол (В) (0 – 40 мин – 5 – Scrophularia ningpoensis Hemsl.
Гарпагид
80% В; 40 – 45 мин – 80% В, 45 (норичник нингпонский),
S. buergeriana Miq. (норичник Бюргера),
– 46 мин – 5% В); температура Ajuga spp. (живучка), Stachys spp. (чистец)
колонки – 30°С; расход элюен-
Cornus officinalis Sieb. et Zucc.
та – 0,5 мл/мин; объем вводимой (кизил лекарственный),
пробы – 5 мкл. Общее время ана- Логанин Menyanthes trifoliata L. (вахта трехлистная),
лиза – 46 мин. Аналитические Lonicera japonica Thunb.
(жимолость японская)
длины волн – 210, 235, 278 нм.
Сканирование масс проводили Leonurus cardiaca L.
Гарпагида (пустырник сердечный),
в режиме регистрации положи- ацетат L. japonicas Houtt. (п. японский),
тельных ионов в диапазоне m/z Ajuga spp (живучка), Stachys spp. (чистец)
150–1000. Рабочие параметры Olea europea L.
источника ионизации: напряже- Олеуропеин
(олива европейская)
ние на капилляре – 4,0 кВ, поток
газа-осушителя (азот) – 10 л/мин,
температура – 325°С, давление на Harpagophytum procumbens (Burch.)
DS (мартиния душистая, дьявольский
распылителе – 50 psig. Гарпагозид
коготь), Scrophularia ningpoensis Hemsl.
Были подобраны оптималь- (норичник нингпонский)
ные условия хроматографиче- *Glu– β-D-глюкоза.

Фармация №7, 2012 15

Фармацевтическая химия и фармакогнозия
Таблица 2
РЕЗУЛЬТАТЫ ВЭЖХ-УФ/МС-АНАЛИЗА ОСНОВНЫХ ИРИДОИДОВ

Коэффициент UV λmax,
Иридоид Mr Относительная интенсивность пика, % (ESI-MS+ m/z)
емкости нм
Каталпол 1,20 <210 362,33 385,11 [M+Na]+ (100), 401,08 [M+К]+ (21)
Деацетил-
1,41 235 390,34 413,10 [M+Na]+ (100), 429,08 [M+К]+ (14), 803,23 [2M+Na]+ (45)
асперулозидовая кислота
Аукубин 1,75 <210 346,33 369,11 [M+Na]+ (100), 385,09 [M+К]+ (5), 715,24 [2M+Na]+ (5)
Асперулозидовая кислота 2,87 235 432,37 455,11 [M+Na]+ (100)
Гарпагид 2,37 <210 364,35 387,12 [M+Na]+ (100), 751,26 [2M+Na]+ (43)
Логанин 3,45 235 390,40 413,10 [M+Na]+ (100), 803,23 [2M+Na]+ (13)
Гарпагида ацетат 3,50 <210 406,38 429,13 [M+Na]+ (100), 835,28 [2M+Na]+ (32)
Олеуропеин 4,29 230, 280 540,51 563,17 [M+Na]+ (100)
Гарпагозид 5,17 280 494,49 517,16 [M+Na]+ (100), 1011,35 [2M+Na]+ (13)

маскироваться спектрами коэлюирующихся соедине- стандартных образцов иридоидов и сырья пустырни-

ний. Примеры характеристических разделений смеси ка представлены на рис. 1, 2.

×107 +ESI TIC 4 6 ×105 +ESI EIC 1

1 (385,1149) *12,258
5 2
0,8
1,5
0,6
1
0,4 1 2 3
0,5
0,2
0
6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Время, мин Время, мин
×105 +ESI EIC ×105 +ESI EIC 3
7 (413,1083) 4 (369,11167) *15,683
6 3,5
5 3
2,5
4 2
3 1,5
2 2 1
1 *13,119 0,5
0 0
6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Время, мин Время, мин
×106 +ESI EIC 4 ×105 +ESI EIC 5
(413,1426) *28,249 (563,1754) *34,693
1 8
0,8 6
0,6
4
0,4
0,2 2
0 0
6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Время, мин Время, мин
×105 +ESI EIC 6
8 (517,1697) *41,490
6
4
2
0
6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Время, мин

Рис.1. ВЭЖХ-МС-анализ смеси стандартных образцов иридоидов. TIC – полный ионный ток,
EIC – хроматограммы выделенных ионов [M+Na]+. 1 – каталпол, 2 – деацетиласперулозидовая кислота,
3 – аукубин, 4 – логанин (8,33 мкг/мл), 5 – олеуропеин (7,55 мкг/мл), 6 – гарпагозид (6 мкг/мл)

16 Фармация №7, 2012

 Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Таким образом, определены основные параме- ×107 +ESI TIC

тры удерживания индикаторных иридоидов и ха- 6
рактеристические для каждого соединения методы 5
4
детектирования. УФ-СФМ-детектирование воз- 3 1 2
можно для иридоидов, имеющих специфическое 2
поглощение в УФ-области спектра, в частности для 1
гарпагозида, олеуропеина, логанина, асперулозидо- 6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
вой и деацетиласперулозидовой кислот. Все иридо- Время, мин
иды с высокой чувствительностью могут быть опре- ×106 +ESI EIC 1
*20,232
делены при помощи масс-спектрометрического 1,4 (387,1254)
1,2
детектирования по характеристическим ионам. 1
Предел обнаружения анализируемых иридоидов в 0,8
0,6
растительном сырье при использовании УФ-СФМ- 0,4
0,2
детектора –0,2–1,5 мг/кг, масс-детектора – 0,001–
0,009 мг/кг. 6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
Время, мин
Выводы ×106 +ESI EIC 2
1. Определены основные параметры удерживания (413,1388) *28,077
1
индикаторных иридоидов и характеристические для 0,8
0,6
каждого соединения методы детектирования. 0,4
2. Разработанный метод позволяет идентифици- 0,2
ровать основные иридоиды лекарственного и пище- 0
6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
вого растительного сырья. Методика также пригодна Время, мин
для поиска новых иридоидных соединений.
Рис.2. ВЭЖХ-МС-анализ метанольного извлечения
ЛИТЕРАТУРА сырья пустырника. TIC – полный ионный ток,
1. Aberhama A., Pieri V., Croom Jr. E. M., Ellmererc E., Stuppner H. EIC- хроматограммы выделенных ионов [M+Na]+.
Analysis of iridoids, secoiridoids and xanthones in Centauriumerythraea, 1 – гарпагид, 2 – гарпагида ацетат
Fraseracaroliniensis and Gentianalutea using LC–MS and RP-HPLC //
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. – 2011. – Vol. 54. –
P. 517–525.
2. Biringanine G., Chiarelli M.-T., Faes M., Duez P. A validation protocol Mini-reviews in medicinal chemistry. – 2008. – Vol. 8. – P. 399–420.
for the HPTLC standardization of herbal products: Application to the 8. Villasenor I.M. Bioactivities of iridoids // Anti-inflammatory and anti-
determination of acteoside in leaves of Plantagopalmata Hook. f.s. // allergy agents in medicinal chemistry. – 2007. – Vol. 6. – P. 307–314.
Talanta. – 2006. – Vol. 69. – P. 418–424. 9. Wei Sh., Zhang P., Feng X., Kodama H., Yu Ch., Chen G. Qualitative
3. Dinda B., Debnath S, Haigaya Y. Naturally occurring iridoids. A and quantitative determination of ten iridoids and secoiridoids in
revive, part 1 // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. – 2007. – Vol. 55 Gentianastraminea Maxim. by LC-UV-ESI-MS // Journal of natural medi-
(2). – P. 159–222. cine. – 2012. – Vol. 66. – P. 102–108.
4. Jankovic T., Menkovic N., Zdunic G., Beara I., Balog K., Savikin K.,
Mimica-Dukic N. Quantitative determination of aucubin in seven spe- SUMMARY
cies using HPLC, HPTLC, and LC-ESI-MS methods // Analytical letters. – HPLC-MASS SPECTROMETRY IN THE ANALYSIS OF INDICATOR IRIDOIDS
2010. – Vol. 43. – P. 2487–2495. FROM RAW PLANT MATERIAL
5. Jurisic R., Debeljak Z., Vladimir-Knezevic S., Vukovic J. A.A. Zhogova1; Professor K.I. Eller, PhD1; Corr. Member of the Russian
Determination of aucubin and catalpol in Plantago species by micel- Academy of Medical Sciences Professor I.A. Samylina, PhD2
larelectrokinetic chromatography // Verlag der Zeitschrift fur 1
Research Institute of Nutrition, Russian Academy of Medical
Naturforschung. – 2004. – Vol. 59. – P. 27–31. Sciences, Moscow
6. Suomi J., Siren H., Hartonen K, Riekkola M. Extraction of iridoids gly- 2
I.M. Sechenov First Moscow State Medical University
cosides and their determination by micellarelectrokinetic capillary An HPLC-UV/MS procedure has been developed to determine major
chromatography // Journal of Chromatography A. – 2000 Vol. – 868. – indicator iridoids in the raw medicinal plant and edible raw materials
P. 73–83. and finished products prepared on their basis.
7. Tundis R., Loizzo M.R., Menichini F., Statti G.A., Menichini F. Biological Key words: iridoids, HPLC, mass spectrometric detection, raw plant
and pharmacological activities of iridoids: recent developments // material.

Фармация №7, 2012 17