/II c ü 5 0 9 1 3

АНАЛИТИЧНИ ПРИНЦИПИ И ПРОЦЕАУРИ В

КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ
апарати за измерване
анализатори под редакцията на
Т. Цветкова и Cm. Аанез
ПОД РЕДАКЦИЯТА НА

Т о д о р к а Здр. ЦВеткоВа, д м н
Професор по клинична лаборатория
Ръководител на Катедра по клинична лаборатория
ВМИ - Пловдив

С т о я н Ив. Данев, д м н
Професор по клинична лаборатория
Катедра по клинична лаборатория и имунология
Медицински университет, София

С КОАЕКТИВ ОТ 22 АВТОРИ
А н а л и т и ч н и п р и н ц и п и и процедури
6 клиничната лаборатория
Уреди з а измерване
Анализатори
Щ11096

© Николай Асенов А т а н а с о в , С т о я н Ивайлов Данев, Благовеста С т о я н о в а Дишлянова,

П о л е т Борисова Дукова-Пенева, Владимир К о с т а д и н о в Иванов, А т а н а с К и р я к о в К и р я к о в ,
Иво Ма ринов Кременски, Невена Борисова Койчева, З л а т к а Василева Кривошиева,
Лиляна Генова Аамбрева, Е к а т е р и н а Кирилова Накова, Русин Руев Николов,
Връбка Цекова Орбецова, Р у м я н а Иванова П а т е в а , М а р и н Николаев Пенев,
П е т к о Делчев Рашков, Добрин Аврамов Свинаров, К а м е н Николаев Цачев,
Елена Михайлова Ц в е т а н о в а , Тодорка Здравкова Ц в е т к о в а , Ана Василева Цончева,
Тодор Кънчев Ш и п к о в .

© Медицинско и з д а т е л с т в о Е Т "Васил П е т р о в " - Б А Н

гр. Пловдив, т е л . : 032/43 82 68

Всички права запазени. Н и т о една ч а с т о т т о в а издание не м о ж е да бъде репродуцирана

(по е л е к т р о н е н или механичен п ъ т ) и р а з п р о с т р а н я в а н а под к а к в а т о и да е форма
без и з р и ч н о т о писмено разрешение н а и з д а т е л с т в о "БАН" - гр. Пловдив.

ЦЕНТРАЛНА МЕДИЦИИС
БИБЛИОТЕКА
ISBN 954-9806-25-1
Ипп. No<•'^0/О/. 1
ПРЕДГОВОР
Тази к н и г а е п р е д н а з н а ч е н а з а лекари - спе­
ц и а л и з а н т и и с п е ц и а л и с т и по клинична ла­
б о р а т о р и я , к а к т о и з а химици, биолози, би-
охимици и ф а р м а ц е в т и , специализиращи
клинична химия. През п о с л е д н и т е 10-15 го­
дини к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я п р е т ъ р п я в а
особено бързо р а з в и т и е по о т н о ш е н и е р а з ­
р а б о т в а н е т о н а нови т е х н о л о г и и , к о и т о
з н а ч и т е л н о р а з ш и р я в а т с п е к т ъ р а н а кли-
н и ч н о - л а б о р а т о р н и т е п о к а з а т е л и . В резул­
т а т о т в н е д р я в а н е т о н а в исо ко еф ектив н и ­
т е и надеждни м е т о д и , н а м о л е к у л я р н а т а
биология, и м у н о т е с т у в а н е т о , к а п и л я р н а т а
електрофореза, " т а н д е м н и т е " хроматог-
рафски м е т о д и к и , ЕТ-ААС и др., б р о я т н а
п о к а з а т е л и т е , изследвани в с ъ в р е м е н н и т е
клинични л а б о р а т о р и и н а р а с т в а експонен­
циално. В р у т и н н и т е л а б о р а т о р и и до 8 0 - т е
години н а миналия век т о й е възлизал н а око­
ло 50, а днес вече надхвърли 100 п о к а з а т е л и ,
к а т о във в и с о к о с п е ц и а л и з и р а н и т е и ц е н т ­
рализирани л а б о р а т о р и и т о з и брой д о с т и ­
г а 200, респ. 800 п о к а з а т е л и . Този своебра­
зен "бум" в м е д и ц и н а т а п о с т а в я особено ви­
соки изисквания к ъ м с п е ц и а л и с т а по клинич­
н а л а б о р а т о р и я и най-вече к ъ м всички рабо­
т е щ и н е п о с р е д с т в е н о със с ъ в р е м е н н а кли-
нично-лабораторна а п а р а т у р а .
О т п е ч а т в а н е т о н а р ъ к о в о д с т в о т о съв­
п а д а с наМършКане п а 5 0 г. о т с ъ з д а В а -
н е т о п а с п е ц и а л н о с т т а к л и н и ч н а ла­
б о р а т о р и я 6 Б ъ л г а р и я п р е з 1951 г. През
т о з и период б я х а издадени редица книги, о т
к о и т о особено в а ж н а роля и м а х а т е з и н а
Й.Тодоров, Х.Пандов и А.Каракашов, Д.Дочев
и др., к а к т о и специализирани монографии -
С т . Д а н е в , Д.Дочев и Т.Шипков, Е л . Ц в е т а н о ­
ва, Т.Шипков и Н . А т а н а с о в , Т . Ц в е т к о в а и
М.Огнянов и др. През п о с л е д н а т а година из­
лезе и б ъ л г а р с к и я т превод н а превъзходна­
т а книга н а Келер - клинично-химична лабо­
раторна диагностика за п р а к т и к а т а .
В н а с т о я щ а т а книга н а м и р а т м я с т о
въпроси, к о и т о с а п о - т я с н о с в ъ р з а н и с ъ с
спецификата на клиничната лаборато­
р и я и к л и н и ч н а т а х и м и я у нас, напр. особе­
н о с т и във връзка с о р г а н и з а ц и я т а н а кли­
ничните лаборатории и т я х н а т а центра­
лизация и д е ц е н т р а л и з а ц и я н а фона н а т р у д ­
н о т о , но неизбежно начало н а з д р а в н а т а ре­
форма, е ш а л о н и р а н е т о н а няколко взаимно
свързани нива с определени изисквания по
отношение на щ а т , апаратура и техника.
Тези въпроси се р а з г л е ж д а т в п ъ р в а ч а с т
н а к н и г а т а . Тази ч а с т к а к т о и с л е д в а щ и т е
- в т о р а и т р е т а , без д а п р е т е н д и р а т з а
изчерпателност, представляват първи п о
р о д а с и о п и т у п а с за охарактеризиране
с ъ щ н о с т т а и п р и н ц и п и т е н а анализ в съв­
р е м е н н а т а лаборатория, н а а в т о м а т и з а ц и ­
я т а и к о м п ю т ъ р и з а ц и я т а н а клинично-лаб-
р а т о р н а т а дейност. В последната, ч е т ­
в ъ р т а ч а с т , след к р а т ъ к к о м е н т а р с а
п р е д с т а в е н и т а б л и ч н и приложения с анали­
т и ч н и т е принципи при изследване н а основ­
н и т е клинично-лабораторни п о к а з а т е л и . И
ч е т и р и т е ч а с т и с а базирани н а данни о т
с в е т о в н а т а л и т е р а т у р а , пречупени през
п р и з м а т а на проблемите, п о т р е б н о с т и т е
и организацията на клиничните лаборато­
рии в България с о т ч и т а н е н а с е г а ш н о т о
с ъ с т о я н и е и бъдещи п е р с п е к т и в и .
З а с ъ с т а в я н е н а р ъ к о в о д с т в о т о е прив­
лечен к о л е к т и в о т висококвалифицирани
с п е ц и а л и с т и , о т к о и т о п о в е ч е т о и м а т ин­
т е н з и в н а преподавателска дейност в рам­
к и т е н а у н и в е р с и т е т с к о т о обучение и след­
д и п л о м н а т а квалификация по клинична ла­
б о р а т о р и я и клинична химия. Г о л е м и я т
брой а в т о р и н а о т д е л н и т е глави в н а с я т из­
в е с т н а п ъ с т р о т а и разнородност в т е к с ­
т а . О т друга с т р а н а о г р а н и ч е н и я т обем,
наложен о т икономически съображения не
позволява д е т а й л н о т о разглеждане н а н я ­
кои въпроси, з а к о и т о в ч у ж д а т а л и т е р а ­
т у р а се заделя д о с т а т ъ ч н о м я с т о . Значи­
т е л н о м я с т о в к н и г а т а е о т д е л е н о з а осо­
бено в а ж н и п р а к т и ч е с к и въпроси в ежеднев­
н а т а р а б о т а н а лабораториите, за к о и т о
у нас н я м а с и с т е м а т и з и р а н и помагала. В
т е к с т а някои т е р м и н и , съкращения и сим­
воли с а запазени к а т о международно възп-
V
puema терминология без да се з а м е н я т със
с ъ о т в е т н и я е к в и в а л е н т н а български език
по две причини: 1. да се улесни ч и т а т е л я при
ползване на чужди оригинални и з т о ч н и ц и и
2. за с ъ о т в е т с т в и е с наименованието на по­
к а з а т е л и т е , получавани в р а з п е ч а т к и т е н а
клиничнолабораторните а н а л и з а т о р и .
Вярваме, че н а с т о я щ а т а книга ще бъде
пълноценно помагало и за лекаря-клиницист,
и за с т у д е н т и т е - не само по медицина, но
и по биология и фармация, изучаващи спе­
БЛАГОДАРНОСТ
Изказваме н а ш а т а благодарност и уваже­
ние към всички, к о и т о о т д е л и х а о т с в о е т о
време, вложиха т р у д , т а л а н т , знания, и доп­
ринесоха да бъде написана т а з и книга, и спе­
циално н а т е з и , к о и т о приеха допълнител­
но ч а с т и и ги завършиха в къс срок.
Благодарим н а инж. Св. Наков и А. Мари­
нов, к а к т о и н а т е х н и ч е с к и я с е к р е т а р В.
Щърбева з а о к а з а н о т о съдействие при из­
р а б о т в а н е н а к о м п ю т ъ р н и т е фигури и гра­
фики, и за ц я л о с т н о т о оформление н а т о з и
труд.
Благодарим н а фирмите-спонсори, подпо­
могнали и з д а в а н е т о н а к н и г а т а : Abbot, Со­
фия; Аджаров - А в т о м а т и ч н и к о н т р о л н и
VI
ц и а л н о с т т а клинична химия, к а к т о и з а
с т у д е н т и о т колежите.
С г о т о в н о с т ще приемем к р и т и ч н и бе­
лежки и препоръки о т н а ш и т е ч и т а т е л и ,
к о и т о биха допринесли за подобряване н а ръ­
к о в о д с т в о т о в едно следващо издание.
Т.Цветкова
Ст.Данев
с и с т е м и , София; Антонимекс ЕООД, София;
АСМ2 ООД, София; ИМЕССА-99 ЕООД, София;
Инфомед ЕООД, София; МВСС Медикус, Плов­
див; Medica 67 Ltd; Мейком ООД, София;
Мегк-Аквахим, София; П е р ф е к т М е д и к а
ООД, Cm. Загора; Омнимед ООД, София; ХЕЛ-
ЛИ лаб ЕООД, София.
Благодарим н а с ъ т р у д н и ц и т е о т изда­
т е л с к а къща ВАП гр. Пловдив за т ъ р п е н и е ­
т о , д е й с т в е н а т а помощ и в ъ з м о ж н о с т т а
да бъде издадена к н и г а т а .
Т.Цветкова
Ст.Данев
АВТОРСКИ КОЛЕКТИВ

АТАНАСОВ, НИКОААЙ НИКОЛОВ, РУСИН

АСЕНОВ, д.м.н., РУЕВ, г л . а с и с т е н т , инженер,
професор, К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я , Е к с п е р и м е н т а л н а база,
ВМИ - Пловдив ВМИ - Пловдив

ДАНЕВ, СТОЯН ОРБЕЦОВА, ВРЪБКА

IlBAllAOB. д.м.н., ЦЕКОВА, д.м.н.,
професор, К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и професор. К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и
клинична имунология. клинична липидология,
Медицински у н и в е р с и т е т - София ДУБ "Царица Йоанна" - София

ДИШЛЯНОВА, БЛАГОВЕСТА ПАТЕВА, РУМЯНА

СТОЯНОВА, к.м.н., ИВАНОВА, к.м.н.,
д о ц е н т , К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и д о ц е н т . Ц е н т р а л н а клинична л а б о р а т о р и я ,
клинична имунология. ВМИ - Варна
Медицински у н и в е р с и т е т - София
НЕНЕВ, МАРИН
ДУКОВА ПЕНЕВА, ПОЛЕТ НИКОЛАЕВ, д м н.,
БОРИСОВА, к.м.н., професор. К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и
д о ц е н т , К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и клинична имунология,
клинична имунология, Медицински у н и в е р с и т е т - София
Медицински у н и в е р с и т е т - София
РАШКОВ, ПЕТКО
ИВАНОВ, ВЛАДИМИР ДЕЛЧЕВ, д.м.н.,
КОСТАДИНОВ, к.м.н., професор. Е к с п е р и м е н т а л н а база,
д о ц е н т , Ц е н т р а л н а клинична л а б о р а т о р и я , ВМИ - Пловдив
ВМИ - Плевен
СВИНАРОВ, ДОБРИН
КИРЯКОВ, АТАНАС АВРАМОВ, д м н.,
КИРЯКОВ, д.м.н., професор. К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и
професор. Ц е н т р а л н а клинична л а б о р а т о р и я и клинична имунология,
клинична липидология, Медицински у н и в е р с и т е т - София
ДУЕ "Царица Йоанна" - София
НАЧЕВ, КАМЕН
КРЕМЕНСКИ, ИВО НИКОЛАЕВ, д.м н.,
МАРИНОВ, к.м.н., професор. К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и
д о ц е н т , Л а б о р а т о р и я по молекулярна клинична имунология,
п а т о л о г и я , ДУЕ "Майчин дом" - София Медицински у н и в е р с и т е т - София

КОЙЧЕВА, НЕВЕНА ЦВЕТАНОВА, ЕЛЕНА

БОРИСОВА, к.м.н., МИХАЙЛОВА, д.м.н.,
д о ц е н т , К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и професор. Секция по клинична л а б о р а т о р и я ,
клинична имунология, ликворология и клинична невробиохимия.
Медицински у н и в е р с и т е т - София К а т е д р а по неврология,
Медицински у н и в е р с и т е т - София
КРИВОШИЕВА, ЗЛАТКА
ВАСИЛЕВА, k х.н , ЦВЕТКОВА, ТОДОРКА
К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и клинична ЗДРАВКОВА, д м н.,
имунология, професор. К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я ,
Медицински у н и в е р с и т е т - София ВМИ - Пловдив

ЛАМБРЕВА, ЛИЛЯНА ЦОНЧЕВА, АНА

ГЕНОВА, к.м.н., ВАСИЛЕВА, к.м.н.,
д о ц е н т , К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и д о ц е н т . К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и
клинична имунология. клинична имунология,
Медицински у н и в е р с и т е т - София Медицински у н и в е р с и т е т - София

НАКОВА, ЕКАТЕРИНА ШИПКОВ, ТОДОР

КИРИЛОВА, к м н.. КЪНЧЕВ, д.м.н.,
д о ц е н т . К а т е д р а клинична л а б о р а т о р и я и професор, Д и а г н о с т и ч н а л а б о р а т о р н а секция,
клинична липидология, Национален онкологичен ц е н т ъ р - София
ДУБ "Царица Йоанна" - София
VII
СЪДЪРЖАНИЕ

ЧАСТ 1 5 Акредитация на клиничните

лаборатории 121
Въведение в к л и н и ч н а т а Акредитация на клиничните
лаборатории, 121
лаборатория Т. Шипков
Д. Свинаров
1 Организация и управление Т. Ц в е т к о в а
на клиничната лаборатория 3 Cm. Данев
Съвременната клинична лаборатория - Добра лабораторна практика, 126
организационни и управленски проблеми, 3 Т. Шипков
Т. Шипков Т. Ц в е т к о в а
Основни принципи на финансите
на клиничната лаборатория, 9 6 Основни х и м и ч е с к и п р о ц е д у р и
В. Иванов в клиничната лаборатория 140
Бюджетът в клиничните лаборатории, 17 Единици и системи за измерване
В. Иванов на физични величини в клиничната
Остойностяване на лабораторните лаборатория, 140
услуги, 22 Т. Ц в е т к о в а
В. Иванов Водата в клиничната лаборатория.
Изисквания и критерии, 142
2 Осигуряване н а б е з о п а с н и у с л о в и я Т. Ц в е т к о в а
за р а б о т а в к л и н и ч н а т а Контрол на температурата
лаборатория 34 в клиничната лаборатория, 148
Т. Ц в е т к о в а Зл. Кривошиева
Лабораторни съдове, 150
3 Осигуряване к а ч е с т в о т о Т. Ц в е т к о в а
на биологичния м а т е р и а л Зл. Кривошиева
за клинично-лабораторен анализ 44 Химически субстанции.
Т. Ц в е т к о в а Степени на чистота, 162
4 Осигуряване к а ч е с т в о т о н а Е. Накова
лабораторните резултатите 69
Измерване на тегло. Везни, 164
Е. Накова
Качественият контрол в клиничната
лаборатория, 69 Разтвори, 167
Т. Шипков
Л. Ламбрева
Основни разделителни техники
Статистически методи в клиничната
при подготовка на пробите и/или
лаборатория, 88
Л. Ламбрева
някои анализи, 174
Външна оценка на качеството И. Койчева
на лабораторните резултати, 96
К. Цачев ЧАСТ 2
Други области за контрол и оценка
на качеството на резултатите, 101 Клинично-лабораторни
Т. Ц в е т к о в а процедури и техники.
Оценка на количествените аналитични
методи, 104 Уреди и а п а р а т и з а измерване.
Л. Ламбрева Същност и принципи
Диагностична надеждност
на лабораторните показатели, 115 н а анализа
К. Цачев
Референтни стойности и граници на референ- 7 Спектрофотометрия.
тната област, 117 Нефелометрия и турбидиметрия 185
К. Цачев Спектрофотометрия, 185
Н. А т а н а с о в
Нефелометрия и турбидиметрия, 193
И. Койчева

IX
8 Аналитична а т о м н а ЧАСТ 3
спектроскопия 201
К. Цачев
А в т о м а т и з а ц и я н а клинично-
9 Молекулна е м и с и о н н а лабораторната дейност
спектроскопия.
Луминесцентен анализ 219
19 А в т о м а т и з а ц и я в к л и н и ч н а т а
А. Цончева
лаборатория 369
10 Е л е к т р о х и м и ч н и м е т о д и . Основни концепции, подходи,
Биосензори 229 тенденции, 369
Д. С в и н а р о в Т. Ц в е т к о в а
Cm. Д а н е в
11 О с м о м е т р и я 245 Техническите кадри и поддържането
Т. Шипков на съвременната клинично-лабораторна
техника, 385
12 Е л е к т р о ф о р е з а 250
П. Рашков
Е. Ц в е т а н о в а
Р. Пиколов
13 И м у н о л о г и ч е н а н а л и з 270 Тенденции и перспективи в развитието
Директен имунохимичен анализ, 270 на клинично-лабораторните
Н. Койчева анализатори, 387
Индиректен белязан с нерадиоизотопни Т. Ц в е т к о в а
маркери имунохимичен анализ, 282 Cm. Д а н е в
А. Цончева
20 А в т о м а т и з а ц и я
Индиректен белязан с радиоизотопни
в клиничната химия 389
маркери имунологичен анализ, 292
Автоматични анализатори, 389
Т. Ц в е т к о в а
Cm. Данев
14 Х р о м а т о г р а ф и я 296 Т. Ц в е т к о в а
Д. Свинаров Изчисление на резултата
при клинично-химични анализатори, 401
15 М и к р о с к о п и я 302 П. А т а н а с о в
М. Пенев, П. Дукова-Пенева
21 А в т о м а т и з а ц и я н а б е л я з а н и т е
16 Д и а г н о с т и ч е н ДНК а н а л и з 320 с нерадиоизотопни маркери
И. К р е м е н с к и имунохимични м е т о д и 407
А. Цончева
17 Ц и т о х и м и ч е н а н а л и з 337
Цитохимия и хистохимия. 22 А в т о м а т и з а ц и я в г а з о в и я а н а л и з 418
Същност на анализа, 337 К. Цачев
М. Пенев
Цитохимични методи за доказване 23 А в т о м а т и з а ц и я
на пероксидаза, фосфатази и естерази, 339 в хематологичната лаборатория 424
М. Пенев, П. Дукова-Пенева Автоматичен хематологичен анализ, 424
Уеднаквена техника за определяне М. Пенев
активността на неспецифични естерази. Нови възможности на мултипараметровия
Оптимизиран метод за доказване анализ в хематологията, 437
на нафтол-Л8-0-хлорацетат естераза, 344 Т. Ц в е т к о в а
Т. Ц в е т к о в а Аазерна проточна цитомерия, 440
Цитохимични методи за доказване Т. Ц в е т к о в а
на гликоген, липиди,
24 А в т о м а т и з а ц и я
кисела фосфатаза и феритин, 346
в хемостазеологията 455
М. Пенев
В. Иванов
Цитохимично доказване на клетъчни
нуклеопротеини и някои катионни 25 Уринен а н а л и з - а в т о м а т и з а ц и я 462
протеини, 351 В. Орбецова
Т. Ц в е т к о в а
26 К о м п ю т р и
18 Ц и т о к и н и и ц и т о к и н о в и и клинична л а б о р а т о р и я 467
р е ц е п т о р и - д и а г н о с т и ч е н анализ 357 П. А т а н а с о в
Cm. Д а н е в

X
Члст 4 32 А н а л и т и ч н и п р и н ц и п и
п р и изследване н а е л е к т р о л и т и
Аналитични принципи при в биологични т е ч н о с т и 578
Електролити - референтни граници,
и з с л е д в а н е н а клинично- интерференция и възможни
лабораторни показатели източници на грешки, 578
Т. Ц в е т к о в а
27 М е т о д и т е в к л и н и ч н а т а Аналитични методи за определяне
лаборатория- основни видове на натрий, калий, хлорид, калций,
и класификаиия 477 неорганичен фосфат и магнезий, 581
Л. Л а м б р е в а Е. Н а к о в а

28 К а л и б р а и и я н а а н а л и т и ч н и т е 33 А н а л и т и ч н и п р и н ц и п и п р и
методи в клиничната определяне н а олигоелементи 589
лаборатория 481 Олигоелементи - референтни граници,
Стандарти и калибратори интерференция и възможни източници
в Ц и н и ч н а т а яабораторя, 481 на грешки, 589
Т. Ш и п к о в Т. Ц в е т к о в а
Калибраиионни криви, 483 Аналитични методи за определяне
Л. Л а м б р е в а на желязо, ЖСК и мед, 593
Е. Н а к о в а
29 А н а л и т и ч н и п р ш щ и п и п р и Аналитични методи за определяне
определяне н а хематологични на цинк, 593
показатели 491 К. Ц а ч е в
Т. Ц в е т к о в а
34 Е к с п р е с н и м е т о д и ( с у х а х и м и я )
30 А н а л и т и ч н и п р и н и и п и п р и в клинично-химичния анализ
определяне на с у б с т р а т и на серум 598
и м е т а б о л и т и в биологичните Б. Д и ш л я н о в а
течности 523
Методи за определяне на небелгпъчни 35 А н а л и т и ч н и п р и н ц и п и
азотсъдърАащи вещества, 523 при определяне на хормони 604
Т. Ц в е т к о в а А. Ц о н ч е в а
А н а л и т и ч н и методи за определяне 36 А н а л и т и ч н и п р и н ц и п и
на глюкоза, 529 при определяне п о к а з а т е л и т е ,
Т. Ц в е т к о в а характеризиращи съединителната
Плазмени л и п и д и и липопротеини. тъкан 610
А н а л и т и ч н и методи, 532 П. Д у к о в а - Н е н е в а
А. К и р я к о в
А н а л и т и ч н и методи за определяне 37 А н а л и т и ч н и п р и н ц и п и
на общ белтък и албумин, 551 при изследване н а урина 615
Е. Ц в е т а н о в а Експресни методи в анализа на урина, 615
А н а л и т и ч н и методи за определяне В. О р б е ц о в а
на билирубин, 556 Хьимични методи за изследване на урина,625
И. А т а н а с о в Р. П а ш е в а

31 А н а л и т и ч н и п р и н ц и п и 38
при изследване на е н з и м и 561
39 Н е и н в а з и в н и к л и н и ч н о - л а б о р а т о р н и
Ензимна активност - механизъм, методи,
фактори, измерване, 561
Cm. Д а н е в
Ь. Д и ш л я н о в а
А н а л и т и ч н и методи за определяне
на ензилги с диагностично значение, 568
Н. А т а н а с о в

XI
ЧАСТ

ВЪВЕДЕНИЕ В КЛИНИЧНАТА
ЛАБОРАТОРИЯ
 Организация и управление
на клиничната лаборатория
СЪВРЕМЕННАТА
КЛИНИЧНА ЛАБОРАТОРИЯ
ОРГАНИЗАЦИОННИ И
УПРАВЛЕНСКИ ПРОБЛЕМИ
Т. Ш и п к о в
О р г а н и з а ц и я т а и управлението н а клинич­
н а т а л а б о р а т о р и я се о п р е д е л я т о т голям
брой ф актори. П р е д с т а в а з а с л о ж н о т о въз­
действие на различни ф а к т о р и върху с т р у к ­
т у р а т а н а к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я дава
фиг. 1.1.
В н а ш а т а страна с т а р т и р а здравната
реформа. Основно се променя н а ч и н ъ т на
финансиране н а медицинските услуги как­
т о в доболничнита, т а к а и в болничната по­
мощ. Несъмнено т о з и сложен проблем зася­
га и к л и н и ч н и т е л а б о р а т о р и и и п о с т а в я
сложни изисквания към т я х н а т а организа­
ция и управление. Успешно бъдеше ше и м а т
клинични лаборатории, к о и т о са в с ъ с т о я ­
ние да п р е д о с т а в я т висококачествени ус­
луги с най-ниска с т о й н о с т . Независимо да­
ли се касае за държавни, обидински, ведомс­
т в е н и или ч а с т н и клинични л а б о р а т о р и и
т е х н и я т успех ше се решава о т правилно­
Наличните човешки ресурси и
тяхната квалификация
Материални Организация и структура иа
W
ресурси клииичпата лаборатории
Изисквания на з а в е ж д а т
отделенията/клиниките
Фиг. 1.1. Ф а к т о р и , к о и т о о к а з в а т влияние върху с т р у к т у р а т а на к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я
(no Vonderschmitt 1991, в модификация)
т о управление, а д е к в а т н а т а н а н у ж д и т е
с т р у к т у р а и п р а в и л н а т а организация.
Същевременно п р о т и ч а т промени в дей­
н о с т т а на здравеопазването в целия с в я т .
R.C.Tilton и M.Martincich справедливо посоч­
в а т с ъ щ е с т в е н и т е проблеми, пред к о и т о е
изправена клиничната лаборатория:
> Намаляващ брой на лекуваните в болнич­
ни заведения,
>- С ъ к р а т е н а продължителност н а болнич­
ния п р есто й .
>• Н а р а с т в а н е д е л ъ т на критично болните
всред „болничната популация".
> Изискване за все п о - к р а т ъ к период за из­
р а б о т в а н е на л а б о р а т о р н и т е изследва­
ния и предаване на р е з у л т а т и т е .
> Н а р а с т в а н е на д е л ъ т на изследванията
до леглото на болния.
> Разширяване о б х в а т а на а м б у л а т о р н о т о
лечение.
> Създаване на групови амбулаторни прак­
т и к и , к о и т о и з и с к в а т разнообразни из­
следвания.
>- Н а р а с т в а щ и изисквания на п а ц и е н т и т е
за повишено качество и по-ниска цена на
медицинските услуги.
Подходите за а д е к в а т н о посрещане на
Държавното
законодателство
Система на обучение
п
в страната
Сграда на болницата и
инфраструктура
в ъ з никващ ите проблеми предполагат;
• а к т и в е н м а р к е т и н г н а н у ж д а т а о т лабо­
р а т о р н и изследвания за к о н к р е т н а т а по­
пулация с оглед п о с т и г а н е н а максимална
ефективност;
• изграждане н а с а т е л и т н и лаборатории в
еднодневни клиники, о т д е л е н и я з а и н т е н ­
зивни грижи, хосписи и пр.;
• изграждане н а електронна комуникация за
предаване н а информация с оглед съкра­
щаване в р е м е т о н а предаване н а р е з у л т а ­
тите;
• п о - н а т а т ъ ш н а механизация и а в т о м а т и ­
зация з а намаляване н е о б х о д и м о с т т а о т
допълнителна р а б о т н а ръка;
• коопериране с други лаборатории за на­
маляване д е л ъ т н а редки, оскъпяващи из­
следването анализи.
Клиничните лаборатории т р я б в а да т ъ р ­
с я т по-добро м я с т о в пазара н а медицинс­
ки услуги. Това предполага п р е у с т р о й с т в о
н а р ъ к о в о д с т в о т о н а л а б о р а т о р и и т е съоб­
разено с у с л о в и я т а на локалния пазар. Опор­
н и т о ч к и н а у с п е ш н о т о ръкоНос^стВо
са:
- изгрсикдале п а а д е к в а т н а база д а н ­
н и относно извършената анали­
тична дейност и естествено з а
с в ъ р з а н и т е с т о в а р а з х о д и - за апа­
ратура, реактиви и консумативи;
- подготвяне п а висококвалифициран
персонал.
ДОКУМЕНТАЦИЯ В КЛИНИЧНАТА
ЛАБОРАТОРИЯ - АКТУАЛНА И АРХИВНА
На Курса н а М е ж д у н а р о д н а т а федерация по
клинична химия по л а б о р а т о р е н менидж­
м ъ н т в София през 1992 P. Broughton мно­
г о к р а т н о п о д ч е р т а , че р е ш а в а щ о з н а ч е ­
н и е з а п р а в и л н о т о у п р а в л е н и е н а вся­
к а к л и н и ч н а л а б о р а т о р и я и м а пре­
цизното, п е д а н т и ч н о д о к у м е н т и р а н е
к а к т о н а изработените изследвания,
т а к а и н а изразходваните реактиви,
х и л г и к а л и и к о н с у л г а т и в и . За д а може
да бъде изградена а д е к в а т н а с т р у к т у р а и
правилна организация основно значение има
т о ч н а т а информация (база данни) за вида и
броя н а и з р а б о т е н и т е изследвания. Ръково­
4
д и т е л я т н а л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да знае
т о ч н о какво са изисквали о т лаборатория­
т а к л и н и ц и с т и т е през предходната годи­
на, какви са п р е т е н ц и и т е им за въвеждане
н а нови анализи, к а к т о и да може да преце­
ни изследването н а кои п а р а м е т р и е изгод­
но з а л а б о р а т о р и я т а и з а кои е по-добре да
осигури коопериране с други лаборатории
поради нисък брой н а т я х н о т о искане, кое­
т о предполага н е с ъ о т в е т н о висока себес­
тойност.
За реално о т ч и т а н е к а ч е с т в о т о н а лабо­
р а т о р н а т а д е й н о с т при р е г и с т р а ц и я т а на
з а я в к и т е за изследване и при валидирането
н а г о т о в и т е р е з у л т а т и следва да се о т б е ­
лежи точно часът на постъпване на биоло­
гичните материали в лабораторията и то­
зи на валидиране на резултатите. Нама­
ляването на продължителността на
изработване к а к т о на спешните, т а ­
к а и н а н е о т л о ж н и т е и р у т и н н и т е из­
с л е д в а н и я е в а ж е н ф а к т о р з а повиша­
ване к а ч е с т в о т о н а л а б о р а т о р н а т а
д е й н о с т . Колкото в п о - к р ъ т ъ к срок клини-
ц и с т ъ т получи р е з у л т а т и т е о т необходи­
м и т е му изследвания, т о л к о в а се съкръща-
ва срока н а диагностичния процес или по-
бързо се създава в ъ з м о ж н о с т з а о п т и м и р а -
не н а лечебния процес. Бързо и з р а б о т е н и т е
л а б о р а т о р н и изследвания с п о с о б с т в а т за
съкращаване п р о д ъ л ж и т е л н о с т т а н а лег-
л о п р есто я .
Друг а с п е к т н а д о к у м е н т и р а н е т о н а ла­
б о р а т о р н а т а д е й н о с т е съх р ан я ван ето н а
л а б о р а т о р н а т а информация. С ъ щ е с т в у в а т
законови разпоредби за сроковете на съхра­
нение н а л а б о р а т о р н а т а документация. В
с ъ о т в е т с т в и е с ДВ бр. 54/1974, ДВ бр. 55/
1987 и ДВ бр. 12/1993 Д ъ р ж а в н и я т архив за­
сега предполага съхранение в лаборатории­
т е н а з а я в к и т е за изследвания (фишовете)
за срок о т една година и н а л а б о р а т о р н и т е
журнали с р е з у л т а т и т е з а т р и календарни
години, к а т о след п ъ р в а т а година т е се пре­
д а в а т срещу подпис н а упълномощеното ли­
це в архива на з д р а в н о т о заведение. Здрав­
но-осигурителната каса в договора си за ме­
дико-диагностични изследвания, о б е к т н а
специализирана извънболнична помощ (чл.
22) изисква по-продължително съхранение на
медицинските направления в лаборатории­
т е - в продължение н а 5 години.
Рано или късно и з а българските клинич-
U p i u i o j k e m i e I . Препоръки н а Експертиния с ъ в е т по клинична лаборатория

I. Клинична л а б о р а т о р и я към „Районно" лечебно заведение за болнична помощ, към „Амбулатория

за първична м е д и ц и н с к а помощ" и към „друго" лечебно заведение (по ЗЛЗ)
З а д ъ л ж и т е л е н ( м и н и м а л е н ) о б е м лаборатории показатели:
>• Изследване н а урина. pH, специфично тегло, полуколичествено изследване н а белтък, глюкоза, кетонни
тела, уробилиноген, билирубин, кръв, седимент и тест за бременност.
>• Кръвна к а р т и н а , определяне на хемоглобин, хематокрит, изброяване н а еритроцити, левкоцити и тром-
боцити, СУЕ, ДКК, морфология н а кръвни клетки.
> Хемостазни показатели; време н а кървене, РТ, аРТТ и фибриноген.
^ Клинично-химични изследвания; глюкоза, креатинин, урея, общ белтък, албумин, общ билирубин, кон юг и-
ран билирубин, АсАТ, АлЛТ, КК, Аф, 114', амилаза, пикочна киселина, холестерол, триглицериди, холесте-
рол в HDL, холестерол в LDL, а з а здравните заведения със с т а ц и о н а р и калций, калий и натрий.
Задължителна апаратура:
>• Микроскоп/и
>• Брояч на кръвни к л е т к и с 3, 5, 7 или 8 показателя
>• Х е м а т о к р и т н а центрифуга, ако б р о я ч ъ т е 3-параметров
>• Т е р м о с т а т и р а н ф о т о м е т ъ р с UV 340 п т
>• Т е р м о с т а т и р а н а вана з а х е м о с т а з а или полуавтоматичен коагулометър
>• Пламъков ф о т о м е т ъ р или йонселективен анализатор за здравните заведения със стационар

II. Клинична л а б о р а т о р и я к ъ м „Областно" лечебно з а в е д е н и е з а болнична помощ, към ДКЦ или

С а м о с т о я т е л н а м е д и к о д и а г н о с т и ч н а л а б о р а т о р и я (по ЗЛЗ)
З а д ъ л ж и т е л е н ( м и н и м а л е н ) обем лабораторни показатели - към обема за предходната група се добавят;
>• Изследване на урина и т е ч н и п у н к т а т и ; количествено изброяване на клетки, количествено определяне на
белтък.
>• Кръвна к а р т и н а ; изброяване на ретикулоцити, морфология на костен мозък.
>• Хемостазни показатели: тромбиново време, фибрин-деградационни продукти (само за здравните заведе­
ния със стационар).
>- Клинично-химични изследвания; неорганичен фосфат, желязо, ЖСК, магнезий, ЛДХ, ХБДХ, КК-МВ, TSH и/Г4.
>• Ликвор; определяне н а общ белтък, албумин, глюкоза, хлор, АсАТ, ЛДХ и КК, диференциране на левкоцитите
след оцветяване по Папенхайм.

З а д ъ л ж и т е л н а а п а р а т у р а - към обема за предходната група се добавят;

>• Пламъков ф о т о м е т ъ р или йонселективен ан ал и за т ор
> Т е р м о с т а т и р а н селективен клинично-химичен а н а л и з а т о р
> Коагулометър или т е р м о с т а т и р а н а вана за хемостаза
> ELISA-reader
III. Клинична л а б о р а т о р и я к ъ м „ М е ж д у о б л а с т н о " лечебно з а в е д е н и е з а болнична помощ, към ДКЦ
или С а м о с т о я т е л н а м е д и к о - д и а г н о с т и ч н а л а б о р а т о р и я (по ЗЛЗ)

З а д ъ л ж и т е л е н ( м и н и м а л е н ) обем лабораторни показатели - към обема за предходната група се добавят.

>• Изследване на урина: селективност н а протеинурия, тест за пара протеин и.
>• Кръвна к а р ти н а : цитохимични показатели.
>• Хемостазни показатели: индивидуални фактори на кръв(Х , ъсирването.
>• Клинично-химични изследвания; цинк, холинестераза, амоняк, имуноглобулини и други индивидуални бел
тъци, анализ н а p H u газове в кръвта.
>• Ликвор; спектрофотометрия, определяне н а л а к т ат , имуноглобулини, очарова електрофореза.

З а д ъ л ж и т е л н а а п а р а т у р а - към обема за предходната група се добавя;

>• Кръвно-газов а н а л и з а т о р
IV. Клинични л а б о р а т о р и и к ъ м „Национално" лечебно з а в е д е н и е (по ЗЛ J)
О б е м ъ т л а б о р а т о р н и изследвания и а п а р а т у р а т а се о п р е д е л я т о т неговото ръководство в зависи
м о с т о т д е й н о с т и т е на с ъ о т в е т н о т о здравно заведение - лечебно-диагностична, консултативна, уче на и
научна. Тук м о г а т да б ъ д а т включени показатели и оборудване за в и с о к о с п е ц и а л и з и р а н анализ.

5
ни лаборатории н а с т ъ п в а в р е м е т о к о г а т о
р ъ к о в о д и т е л я т ( з а в е ж д а щ и я т , мениджъ­
р ъ т ) ще ръководи и б ю д ж е т а н а л а б о р а т о ­
р и я т а . При наличие н а добра информацион­
н а база в н е г о в и т е ръце ще б ъ д а т основни­
т е механизми з а управление н а л а б о р а т о ­
р и я т а , к о и т о с а п р е д п о с т а в к а з а разумен
м а р к е т и н г ( т . е . с ъ с т а в я н е н а набора о т из­
следвания, к о и т о се и з р а б о т в а т , съобразен
с н у ж д и т е н а л о к а л н и т е медицински звена).
Препоръките н а Е к с п е р т н и я с ъ в е т по кли­
нична лаборатория (приложение 1) м о г а т да
подпомогнат т о з и процес.
Р ъ к о в о д и т е л я т (забе^кдащият, ме­
н и д ж ъ р ъ т ) следВа д а и м а р е ш а в а щ а ду­
м а при избор и закупуване на а п а р а т у ­
р а (и п р е с м я т а н е н а с ъ о т в е т н и а м о р ­
тизационни отчисления), консумати­
ви и р е а к т и в и и п р и н е п о - м а л к о съ­
щ е с т в е н о т о определяне н а р а б о т н о
възнаграждение, с ъ о т в е т н о н а прино­
с а в д е й н о с т т а н а к л и н и ч н а т а лабо­
ратория.
ПЕРСОНАЛЪТ В КЛИНИЧНАТА
ЛАБОРАТОРИЯ
ОБУЧЕНИЕ И ПОВИШАВАНЕ
НА КВАЛИФИКАЦИЯТА
С ъ в р е м е н н а т а клинична л а б о р а т о р и я полз­
ва в п р о и з в о д с т в е н а т а си д е й н о с т сложна
а в т о м а т и ч н а апаратура, а обработката на
п о с т ъ п и л и т е заявки и н а биологичните м а ­
териали, к а к т о и изчисляването и предава­
н е т о н а р е з у л т а т и т е о т а н а л и з и т е пред­
полага з н а ч и т е л н а компютъризация. Всич­
ко т о в а изисква не само умения, с р ъ ч н о с т и
знания, но и к о м п ю т ъ р н а г р а м о т н о с т . В ня­
кои с т р а н и , напр. САЩ се препоръчва всич­
ки к а н д и д а т с т в а щ и з а р а б о т а в клинични
лаборатории да п р и т е ж а в а т официални сер­
т и ф и к а т и за н и в о т о н а с в о я т а подготов­
ка. Например според L. Crolla се с ч и т а , че
бакалавърска диплома е минимално изисква­
не з а получаване д л ъ ж н о с т клиничен лабо­
р а н т . За съжаление поне в н а ш а т а с т р а н а
м ла д и т е, завършващи обучението си специ­
а л и с т и - к а к т о медицински лаборанти, т а ­
ка и лекари не п р и т е ж а в а т с ъ о т в е т н а под­
готовка, за да р а б о т я т с а м о с т о я т е л н о пъл­
ноценно в клинична лаборатория. Това на­
лага изграждане н а с и с т е м а за обучение и
6
с и с т е м н о повишаване н а квалификацията
н а персонала.
Всяка лаборатория п о д г о т в я своя персо­
нал в зависимост о т набора изследвания и
н а л и ч н а т а а п а р а т у р а и оборудване. Ключо­
во м я с т о в обучението н а персонала има
п о д г о т о в к а т а н а к л и н и чн и те л а б о р а н т и .
Несъмнено п р о г р а м а т а за обучение н а но­
вопостъпващите и т я х н а т а по-нататъш­
н а квалификация зависи в голяма с т е п е н о т
н и в о т о на л а б о р а т о р и я т а . В приложение 2
п р е д с т а в я м е к а т о пример п р о г р а м а т а за
обучение н а медицински л а б о р а н т и в Лабо­
р а т о р н а т а диагностична секция н а Нацио­
налния онкологичен ц е н т ъ р , к о я т о би мог­
ла да подпомогне всеки завеждащ лаборато­
рия (независимо о т н е й н о т о ниво) при из­
готвяне на т а к а в а .
В Р. България задължително условие за за­
емане д л ъ ж н о с т т а „завеждащ клинична ла­
боратория" е държавно п р и з н а т а специал­
н о с т по клинична лаборатория. Програма­
т а за специализация по клинична лаборато­
рия в Р. България, и з г о т в я н а и периодично
обновявана о т К а т е д р а т а по клинична ла­
б о р а т о р и я н а Медицинския ф а к у л т е т - Со­
фия е у т в ъ р д е н в полувековен о п и т добър
подход за подготовка н а п о т е н ц и а л н и т е за­
веждащ клинични лаборатории в з д р а в н а т а
мрежа. Тази програма предвижда солидна
п р а к т и ч е с к а п о д г о т о в к а в изградена кли­
нична л а б о р а т о р и я в продължение н а пери­
од о т 4-5 години, полагане н а колоквиуми по
основните раздели н а с п е ц и а л н о с т т а , кое­
т о предполага и с и с т е м н о н а т р у п в а н е н а
задълбочени т е о р е т и ч н и познания.
Успешното полагане н а и з п и т а за специ­
а л н о с т означава наличие н а необходимия ми­
нимум о т знания за ръководене н а клинична
лаборатория в н а ш а т а с т р а н а . Интересно
е да се п о с о ч а т ж е л а н и т е ръководни умения
и личностни х а р а к т е р и с т и к и н а добрия ла­
б о р ато р ен мениджър според L. Crolla et al,
за да б ъ д а т разбрани г о л еми те изисквания
към т а з и длъжност: а н а л и т и ч е н ; заслу­
ж а в а щ доверие; изслушващ; и н ф о р м и ­
ран; к о м п е т е н т е н ; к о м у н и к а т и в е н ;
обективен; организиран; осигуряващ
р ъ к о в о д с т в о ; о т г о в о р е н ; п о д а в а щ ин-
формция; политичен; п о ч т и т е л е н ;
п р е ц и з е н ; р а з б и р а щ ; р а ц и о н а л е н ; с въ­
о б р а ж е н и е ; с д а р слово; с п о з н а н и я о т ­
носно лабораторни информационни
11ри^юЖсиис 2. Програма за обучение на медицински лаборанти*
1. Всеки новоназначен л а б о р а н т се обучава в продължение на един месец на начина на р а б о т а в Диагностич­
н а т а лабораторна секция на НОЦ:
• Поведение при болния и отношение към него;
• Основни сръчности при вземане на биологичен м а т е р и а л (специално вземане на венозна кръв);
е Методология з а изпълнение на анализите, включени в с п е ш н а т а панела на с е кция т а ;
• Запознаване с у к а з а н и я т а з а предпазване на медицинския персонал о т инфекции, предавани по кръвен
п ъ т , на С т о л и ч н а т а хигиенно-епидемиологична инспекция, к а к т о и с правилата за безопасност при ра­
б о т а с електро-медицински уреди и противопожарните правила, прилагани в ПОЦ.
О т г о в о р н и к з а п р о в е ж д а н е о б у ч е н и е т о : Cm. м е д . л а б о р а н т I cm.
Срок 1 м е с е ц .
2. През следваидите два месеца се обучава за усвояване производствените сръчности за р а б о т а на всяко
р а б о т н о м я с т о в с ъ о т в е т н и я с е к т о р на Секцията, в к о й т о работи, к а к т о и на компютърна г р а м о т ­
н о с т , за да може да р а б о т и с а н а л и з а т о р и т е и да нанася информация за извършената аналитична дей­
н о с т и изразходвани реактиви, химикали и консумативи.
О т г о в о р н и к за п р о в е ж д а н е о б у ч е н и е т о : Cm. м е д . л а б о р а н т II cm.
Срок 2 .месеца.
3. По време на р а б о т а се обучава с и с т е м н о да разбира а н а л и т и ч н и т е принципи, ползвани при извършване на
изследванията; д а разбира клиничното значение на извършваните изследвания.
О т г о в о р н и к з а п р о в е ж д а н е о б у ч е н и е т о : Лекар, з а в е ж д а щ с е к т о р а .
Срок постоянен.
4. Всеки р а б о т е н ден, по време на почивката след приключване събирането на биологичен материал се обсъж­
д а т равноправно възникнали в с е к ц и я т а производствени проблеми. Поне веднъж месечно се провежда
производствено съвещание за възможности за подобряване на р а б о т а т а в с е кция т а .
Отговорник за провеждане обучението: Ръководител секцията.
Срок постоянен.
5. На всеки л а б о р а н т в с е к щ ш т а се указва съдействие за продължаване на образованието му.
* Програмата е на Диагностичната лабораторна секция към Национален онкологичен център

с и с т е м и ; с ф и н а н с о В у с е т ; с п о с о б е н (ja СТРУКТУРА НЛ КЛИНИЧНАТА

Възлага з адач и; с ъ о б р а з и т е л е н ; съчуВ-
стВащ; т о ч е н ; ч е с т е н .
Едва ли са много х о р а т а , к о и т о са надаре­
ни с толкова и т о различни качества, но до­
колкото поне ч а с т о т т я х се и з р а б о т в а т с
н а т р у п в а н е на професионален и ръководен
о п и т т о з и списък може да стимулира израс­
т в а н е т о на бъдещите завеждащ лаборато­
рии. Те т р я б в а да се с п р а в я т с много предиз­
в и к а т е л с т в а пред д н е ш н и т е клинични лабо­
ратории. С ъ щ е с т в у в а т проблеми в предложе­
н и т е панели за „есенииални" лабораторни из­
следвания и явно подобни панели т р я б в а да
б ъ д а т професионално променени. Вместо за
преразход на средства за лабораторни изслед­
вания Вече започва (ja с е мисли з а сери­
о з н и т е п о с л е д с т В и я о т пропускане наз­
н а ч а в а н е т о н а д о с т а т ъ ч н и изследВа-
ния и л а б о р а т о р н и т е лекари т р я б В а д а
и м а т ясни и мотиВирани предложения
з а решаВане н а проблема.
ЛАБОРАТОРИЯ
СХКМА НЛ КЛИНИЧНО ЛАБОРАТОРНАТА
ОРГАНИЗАЦИЯ И ЩАТ
С т р у к т у р а т а на клиничната лаборатория
т р я б в а да показва ясно начина на ръководс­
т в о ( о т г о в о р н о с т т а за вземане решение),
к а к т о и взаимозаменяемоста в звеното. Р.
Broughton в проведения о т него курс посочи,
че с х е м а т а (графичното представяне) на
с т р у к т у р а т а на л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да
дава ясен отговор к а к т о на п а ц и е н т и т е , т а ­
ка и на ръководството на с ъ о т в е т н о т о
здравно заведение кой е отговорен за дадена
дейност в лабораторията, и ако някой о т ­
съства, кой го замества. К а т о пример се пред­
с т а в я с х е м а т а на Лабораторната диагнос­
т и ч н а секция на НОЦ (фиг. 1.2).
Така представена с х е м а т а сочи, че:
1. За проблеми, к о и т о се о т н а с я т за ц я л а т а
секция следва да бъде т ъ р с е н завеждащ сек­
ц и я т а , а при проблеми в о т д е л н и т е лабо­
ратории - т е х н и т е завеждащи или отго-
в а р я щ и т е за т я х .
2. При о т с ъ с т в и е на зав. секцията, т о й се
7
 з а м е с т в а о т завеждащ лаборатория кли­
нична химия и т у м о р н и маркери, послед­
н и я т се з а м е с т в а о т завеждащ лаборато­
рия хематология, урини, кръвосъсирване и
амбулаторни звена. Респективно при о т ­
съствие н а с т а р ш и медицински л а б о р а н т
о т ръководството н а секцията, т о й се за­
м е с т в а о т с т а р ш и медицински л а б о р а н т
на лаборатория клинична химия и т у м о р ­
ни маркери и т . н .
3. Подобна схема е много важна при изготвя­
не плана за годишните отпуски, з а щ о т о
показва кои служители н е л ю г а т еднов-
релгсппо q a о т с ъ с т в а т о т р а б о т н и ­
т е с и лгеста.
Безспорно с х е м и т е на различни по щ а т , зада­
чи и обем н а д е й н о с т т а лаборатории се различа­
в а т . В с т р у к т у р н и т е схеми на големи съвремен­
ни лаборатории фигурират и собствено с ч е т о ­
водство и отдели по м а р к е т и н г и реклама и на­
учни лаборатории. Независимо о т разликите как­
т о при с х е м а т а н а малка лаборатория без сек­
т о р и , т а к а и при с л о ж н а т а схема н а голяма уни­
в е р с и т е т с к а клинична лаборатория следва да бъ­
де ясно означено взаимоотношението на звена­
т а , п о д ч и н е н о с т т а и начина н а з а м е с т в а н е при
отсъствие.
СТРУКТУРА НА КЛИНИЧНО
ЛАБОРАТОРНАТА ДЕЙНОСТ
В БЪЛГАРИЯ
ОРГАНИ ЗА КОНТРОЛ
И МЕТОДИЧНА ПОМОЩ
За клиничните лаборатории е валидна обща­
т а с т р у к т у р а на медицинската дейност в
Р.България. Л а б о р а т о р и и т е към обединени
п р а к т и к и и диагностични центрове т ъ р с я т
помощ в районни здравни заведения, при из­
черпване на т е х н и т е възможности, лабора­
т о р и и т е в районните здравни заведения изп­
р а щ а т п а ц и е н т и т е към лабораториите в об­
л а с т н и т е болници. При изчерпване възмож­
н о с т и т е н а последните се прибягва до услу­
г и т е на междуобластните болници, а кога­
т о и т о в а не е д о с т ъ т и ч н о - към болници с
национално значение.
С ъ о т в е т н о на т а з и верижна зависимост
по отношение на лабораторните диагностич­
ни възможности е и в ъ з м о ж н о с т т а за т ъ р ­
сене н а методична помощ. Е с т е с т в е н о коле­
гиална помощ може да се т ъ р с и и пряко. За
сега т о з и подход не е регламентиран офици­
ално, всяка лаборатория има възможност да
потърси методична помощ чрез районните

РЪКОВОДСТВО
Завеждащ ДДС
Ст. мед. Лаборант

ЛАБОРАТОРНА ДИАГНОСТИЧНА СЕКЦИЯ

Лаборатории Лаборатории Лаборатории

КЛИНИЧНА Х И М И Я и ХЕМАТОЛОГИЯ, УРИНИ, КЛИНИЧНИ ИЗПИТВАНИЯ И
Т УМ О Р Н И МАРКЕРИ КРЪВОСЪСИРВАНЕ И Л Е КА РС Т В Е НО
АМБУЛАТОРНИ З В Е Н А МОНИТОРИРАНЕ

Завеждащ лаборатория
Завеждащ лаборатория
Ст. мед. лаборант Отговорник лаборатория
Ст. мед. лаборант
Лаборанти Кл. ординатор
Лаборанти
Санитар Лаборанти
Санитар

Фиг. 1.2. Схема н а с т р у к т у р а т а н а клинична лаборатория в НОЦ

центрове no здравеопазване. Специалистите
на центровете или МЗ могат да се обърнат
към Републиканския референт, с негова по­
мощ към Експертния съвет по клинична ла­
боратория към МЗ или към Председателя на
научното дружество по клинична лаборато­
ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА
ФИНАНСИТЕ НА КЛИНИЧНАТА
ЛАБОРАТОРИЯ
В. И в а н о в
В миналото, а все още и понастоящем кли­
ничните лаборатории осъществяваха и осъ­
ществяват своята дейност като се финан­
сират о т държавата. В редки случаи т е са
„подпомагани" финансово о т ведомства или
организации извън с и с т е м а т а на здравео­
пазването. Това „подпомагане" най-често се
свежда до закупуване на апаратура и/или
спомагателни лабораторни съоръжения. Не
бяха редки случаите, при които „целево" се
отпускаха финансови средства с цел изг­
раждане на т ъ й нар. „лабораторни модели".
На практика финансовите ресурси, заделя­
ни за клиничната лаборатория много чес­
т о зависят о т „благоразположението" на
ръководителя на здравното заведение, към
което е лабораторията и/или о т актив­
н о с т т а на нейния ръководител. Не са ред­
ки случаите, при които поради липса на ме-
ниджърски познания и прозорливост, за ла­
бораторна диагностика се о т д е л я т съвсем
оскъдни средства, което не само затрудня­
ва изключително много р у т и н н а т а дей­
ност, но и не позволява въвеждането на нови
технологии и а п а р а т и в с ъ о т в е т н а т а
клинична лаборатория.
Настъпилите промени в общественото
и икономическо развитие на с т р а н а т а ни и
извършващата се радикална реформа в здра­
веопазването изискват лабораторните спе­
циалисти да познават основните принци­
пи за правилното и ефективно управление
на финансовите средства на клиничната ла­
боратория, да познават и осъществяват
в ъ з м о ж н о с т т а за възвръщаемост на
вложените за дейността и средтва.
рия, към Ръководителите на Катедрите по
клинична лаборатория или пряко към всеки
уважаван специалист. Във всеки случаи на по­
искана методична помощ работещите в кли­
нични лаборатории могат да разчитат на
професионална подкрепа.
СТРАТЕГИЯ ЗА УПРАВЛЕНИЕ
ПА ЛАБОРАТОРНИТЕ ФИНАНСОВИ
СРЕДСТВА
ЛАБОРАТОРЕН УПРАВЛЕНЧЕСКИ
ЕКИП И НЕГОВАТА РОЛЯ
Създаването на стратегия за управление на
финансовите средства на клиничната ла­
боратория задължително изисква да се нап­
рави оценка на два важни фактора, о т
които зависи този процес:
• оценка на средата извън
лабораторията и
• оценка на вътрелабораторната среда.
Оценката на тези два фактора е реално
възможна, само ако добре се познават осно­
вите на финансовия лабораторен менидж­
мънт. Такава оценка дава възможност на
ръководството на клиничната лаборато­
рия да прогнозира влиянието на т е з и
фактори върху р а б о т а т а на лаборатория­
т а . То трябва да прецени: какво е пазарно­
то място на лабораторията като източ­
ник на медицински услуги в тази среда, как­
ва е нейната локална роля. Същевременно
с това т о трябва добре да познава нейни­
т е възможности за отговор на изисквания­
т а на средата. В контекста на тази оцен­
ка ръководството е длъжно да прецени соб­
с т в е н а т а си административна отговор­
ност и задължения за осигуряване на лабо­
раторията с финансови средства, както и
източниците за тяхното набиране - болнич­
ното заведение, здравноосигурителна каса,
здравноосигурителни фондове и др. То
трябва да умее на базата на обективни
данни да прогнозира необходимия размер на
финансовите средства, да познава и наблю­
дава факторите, които оказват огранича­
ваща роля върху техния размер.
При оценка на вътрелабораторната сре­
да ръководството на лабораторията тряб­
ва да оцени състоянието на лабораторно-
9
mo оборудване, щ а т н а т а а д е к в а т н о с т u
размера н а т р у д о в о т о възнаграждение н а
персонала, начина н а възвръщане н а израз­
ходваните о т л а б о р а т о р и я т а средства, на­
т о в а р е н о с т т а н а л а б о р а т о р и я т а и др.
Извършването н а задълбочена и преииз-
н а оценка за н е о б х о д и м о с т т а о т финансо­
ви с р е д с т в а и т я х н о т о правилно изразход­
ване се превръща в много т р у д е н процес, ако
в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я не се създаде
добър управленчески екип и н е г о в а т а дей­
н о с т не се обедини и синхронизира с т а з и
на екипа на болничното управление. По прин­
цип о т г о в о р н о с т т а за управление на финан­
с о в и т е с р е д с т в а н а л а б о р а т о р и я т а пада
върху нейния ръководител. Той т р у д н о би
изпълнил с в о и т е задължения и отговорнос­
т и , ако не обедини в д е й н о с т т а си у с и л и я т а
НиВа п а р е ш е н и е
Фиг. 1.3. Примерна схема з а финансови и управленчески решения в клиничнита
л а б о р а т о р и я и р о л я т а н а лабораторния специалист в т о з и процес
10
и у м е н и я т а н а в и с ш и т е и средни
медицински кадри, к а к т о и на техническия
персонал н а л а б о р а т о р и я т а . В т о з и екип
р о л я т а н а лабораторния лекар е особенно
важна. Той следва да поеме о т г о в о р н о с т т а
за доброто и правилно планиране, прецизния
к о н т р о л върху л а б о р а т о р н а т а н а т о в а р е ­
н о с т , за познаване с п е ц и ф и к а т а на управ­
ление н а о т д е л н и т е лабораторни с е к т о р и
и секции. Той е д и р е к т н о отговорен з а въ­
в е ж д а н е т о н а нови лабораторни техноло­
гии, за у л а в я н е т о н а п р о м е н и т е и т е н д е н ­
ц и и т е за промени в обема н а лабораторна­
т а дейност, размера н а о ч а к в а н и т е разхо­
ди, разпределението н а разходите съобраз­
но внезапно възникнали промени и др. (фиг.
1.3). Членовете н а управленческия екип са
л и ц а т а , к о и т о т р я б в а да д о л а в я т к а к т о
Решава с е о т :
фините, т а к а и грубите проблеми, к о и т о
с т о я т пред лабораторията. В най-общ сми­
съл т е се с в е ж д а т до следното:
• проблеми, които са свързани с непрекъс­
н а т о увеличаващия се обем на р а б о т а в
лабораторията;
• проблеми, които са свързани с изисквани­
я т а за качество на лабораторните услу­
ги;
• проблеми, свързани с въвеждане на ефек­
тивна финансова и информацонна систе­
ма, която да обхваща голям обем о т дан­
ни и да облекчава административния пер­
сонал на лабораторията. Този проблем е
с различна с т е п е н на изразеност в отдел­
н и т е типове лаборатории. В т я х се из­
ползват различни информационни систе­
ми, а съществуващите различия не д а в а т
възможност за сравняване на финансови­
т е данни между т я х .
Важен проблем е и липсата на д о с т а т ъ ч ­
но ефективен контрол върху лабораторни­
т е разходи. В т о з и а с п е к т м о г а т да се из­
ползват освен и з в е с т н и т е конвенционални
контролни механизми, и спомагателни мер­
ки. Към допълнителните мерки се о т н а с я т :
• контрол върху с т е п е н т а на а в т о м а т и ­
зация на лабораторията с цел избягване
на ненужни и/или немотивирани разходи,
свързани с придобиване на ненужна авто­
матична апаратура;
• избягване на допълнителни разходи за ре­
активи и консумативи, свързани с излиш­
ни а в т о м а т и или пък с ненужно натовар­
ване на вече закупени такива;
• осигуряване на по-голяма ефективност на
работа в отделението по клинична химия,
където се извършва по голяма ч а с т (50-
70%) о т обема на р а б о т а на лаборатори­
ята;
• с т р и к т е н контрол по изпълнение на ла­
бораторния б ю д ж е т и по специално на
разходите за т р у д , реактиви и консума­
тиви чрез консолидиране на лабораторни­
т е изследвания в специфични групи и на­
маляване обема на р у т и н н и т е лаборатор­
ни анализи и др.
ЛАБОРАТОРНА ФИНАНСОВА
СИСТЕМА
Една о т важните и основни предпоставки
за правилно управление на лабораторните
финанси е създаването на ефективна лабо­
раторна финансова система.
Всяка организация независимо о т нейна­
т а големина и комплексност, и без оглед на
това, дали има печалба или загуби в своята
дейност, трябва да има система за събира­
не на финансови данни, както и система за
регистриране и анализ на необходимата ин­
формация. Важно условие за реализиране на
т а з и задача е изграждането на стройна и
ясна система за о т ч е т . Един о т елементи­
т е на т а з и система е т ъ й нар. о т ч е т н а
к а р т а . К а р т а т а е един о т основните еле­
м е н т и , които се използват в процеса на
о т ч и т а н е и бюджетиране. Тя осигурява
о т ч и т а н е т о и контрола на разходите, де­
тайлизира разходите, които не са включе­
ни в общите разходи и др. По принцип т я е
един о т основните елементи на финансово­
т о управление в клиничната лаборатория.
В нея се нанася информация за минали
финансови данни, но т я включва и актуал­
на финансова информация, необходима за
процесите на планиране и контрол в лабо­
раторията. К а р т а т а (фиг 1.4) включва два
основни раздела:
• Балансов лист и
• Раздел за о п е р а т и в н о т о състояние на
лабораторията. В т о з и раздел се отразя­
в а т р а з х о д и т е и т я х н а т а възвръща
емост.
Балансовият л и с т е съставен о т т р и
секции - секция отразяваща пасивите; сек­
ция отразяваща активите и секция за урав­
нение. В т е з и т р и секции се о п р е д е л я т
а к т и в и т е и п а с и в и т е н а лаборатори­
я т а и ee представя баланса м е Л д у
приходите и разходите.
Целта на балансовия лист е да се опише
и представи финансовото състояние на ла­
бораторията за определен период о т вре­
ме, което дава възможност да се оценят
нейните финансови ресурси. Балансовият
л и с т осигурява и информация за всички
сключени сделки, включващи в себе си акти­
ви, пасиви и уравнение. Основната форму­
ла, която се използва при т а з и оценка е след-
11
ната:
Akmußu = ITacuBu + УраВпение
Главният м о м е н т е п о с т и г а н е т о на ба­
ланс в т о в а уравнение. Най-често срещана­
т а ситуаиия е, к о г а т о с увеличаване на пе­
чалбата се н а м а л я в а т пасивите на лабора­
т о р и я т а , т . е . уравнението се постига чрез
минимизиране на пасивите и максимализи-
ране на а к т и в и т е . При липса на промяна в
приходите много внимателно т р я б в а да се
борави с минимизиране на пасивите.
Друг важен м о м е н т при о т ч и т а н е на
финансовото състояние на л а б о р а т о р и я т а
е преиенката на о п е р а т и в н о т о ü състоя­
ние. В о т ч е т н и т е к а р т и т р я б в а да има сек-
иия, о т ч и и т о данни да се добие представа
за в ъ з в р ъ щ а е м о с т т а на направените
финансови разходи, к а к т о и да се направи
оиенка за п е ч а л б а т а на л а б о р а т о р и я т а .
Възвръщаемостта на изразходваните сред­
с т в а може да се осигури к а к т о о т опера­
тивни, т а к а и о т неоперативни финансови
източниии. О п е р а т и в н а т а възвръщае­
м о с т се определя от т и п а на споразуме­
нията, т и п а на плащанията и от вида на
гаранциите по тези плащания. Неопера-
т и б н а т а б ъ з в р ъ щ а е м о с т зависи о т
такива категории, като технически опера­
ции за обучение, заеми, инвестиции и др.
дейности, генериращи възвръщаемост на
средствата.
Приходите на л а б о р а т о р и я т а се опреде­
л я т к а т о относително ефективна дейност
на управление на финансовите средства,
включваща в себе си разходите, които мо­
г а т да б ъ д а т избегнати в р е з у л т а т на ефек­
т и в н о управление на персонала и оператив­
н и т е ресурси. Тези и с п е с т е н и р е с у р с и '
обикновенно се з а п и с в а т к а т о спечелени
финансови средства и се разпределят о т
болничния директор през финансовата го­
дина, през к о я т о т е са „спестени".
Във всички болнични заведения клинична­
т а лаборатория е звено с големи финансови
разходи, но т я е и ц е н т ъ р на значителна
възвръщаемост на изразходваните средст­
ва. Посредством извършваните о т нея ла­
бораторни услуги и финансовите постъпле­
ния о т т я х , т я компенсира в немалка
с т е п е н направените о т нея разходи. Този
въпрос е о т особенно голяма в а ж н о с т за
болничното заведение, з а щ о т о в неговите

ОТЧЕТНА КАРТА

Балансов л и с т Оперативно състояние

Активи Пасиви Уравнение Приходи Разходи

(капитал)

Постоянни Текущи
L О т оперативни
действия
Вложени Запазени Оперативни
капитали приходи разходи
Отбив о т Неоперативни
Първоначални Натрупани приходи разходи
Инвентар в
номинална
Петни Индиректни
стойност оперативни
Плащания приходи Директни

Настоящи Дълготрайни Първи Временни приходи Труд Материали

(в н а с т о я щ а т а (преди н а с т о я щ а т а години ( т е к у щ а финансова
финансова година) финансова година) година)

Фиг 1.4. П р и н ц и п н а с х е м а з а и з г о т в я н е н а о т ч е т н а к а р т а {по Е. Travers- 1989, в м о д и ф и к а ц и я )

12
с т р у к т у р и има и звена, к о и т о частично въс-
т а н о в я в а т н а п р а в е н и т е о т т я х разходи, но
има и т а к и в а , к о и т о не о с ъ щ е с т в я в а т въз­
в р ъ щ а е м о с т , а дори т ъ р п я т и загуби. В
общоболничен а с п е к т едно правилно
разпределение н а в ъ з в ъ р н а т и т е с р е д с т в а
дава в ъ з м о ж н о с т н а болничния д и р е к т о р да
покрие т е з и загуби.
Оценката на оперативното състояние
н а л а б о р а т о р и я т а дава в ъ з м о ж н о с т да се
добие п р е д с т а в а за п р и х о д и т е на ла б орат о ­
р и я т а за определен период о т време ( т р и ­
месечие, полугодие или година). В т о з и ас­
п е к т е важно да се знае каква е и п е ч а л б а т а
н а л а б о р а т о р и я т а за т о з и период. Това е
р а з л и к а т а л ю Ж д у в ъ з в ъ р н а т и т е и из­
р а з х о д в а н и т е с р е д с т в а . Някои звена в
б о л н и ц а т а н я м а т печалба, т . е . т е са ц е н т ­
рове непродуциращи печалба. За да м о г а т
да с ъ щ е с т в у в а т т е з и звена т е т р я б в а да
у ч а с т в а т в разпределението на п е ч а л б а т а
и в т о з и а с п е к т „ с ъ т р у д н и ч е с т в о т о " им със
з в е н а т а , продуциращи печалба е особенно
важен а с п е к т о т в ъ т р е б о л н и ч н и т е взаимо­
отношения.
П р е с м я т а н е т о на п е ч а л б а т а е един о т
ф у н д а м е н т а л н и т е принципи в о т ч е т н о с т ­
т а . Тя може да се оцени по с л е д н а т а форму­
ла:
В ъ з в р ъ щ а е м о с т - Р а з х о д и = Печалба
В ъ з в р ъ щ а е м о с т т а н а н а п р а в е н и т е раз­
ходи се осигурява о т п р о д а ж б а т а н а произ­
ведения лабораторен п р о д у к т - лаборатор­
ните анализи. В р а з х о д и т е се в к л ю ч в а т :
средствата, които са изразходвани за из­
пълнение на лабораторните дслуги, пазар­
ните и търговски разходи, административ­
ните разходи и др.
В п р а к т и к а т а с ъ щ е с т в у в а т много под­
ходи за п р е с м я т а н е н а п е ч а л б а т а или загу­
б а т а . Най-известен е т ъ й нар. маргинален
анализ. Маргиналният анализ е преглед н а
с ъ с т о я н и е т о на разходите и приходите,
к о г а т о п р о и з в о д с т в о т о (или обема н а про­
д а ж б и т е ) се променя с единица. В т о з и ас­
п е к т м а р г и н а л н и л т р а з х о д е този, к о й ­
т о се извършва з а произвеждането н а
единица повече о т продукта, а лшрги-
налния приход е пралитата в общил
приход, к о г а т о с е п р о д а в а е д н а д о п ъл­
н и т е л н а е д и н и ц а о т п р о и з в e j k g а / 1 им
п р о д у к т . В и н д у с т р и я т а т о й се използва
з а осигуряване информация з а определени
п 0
Р 9Уктови линии и за установяване цена­
т а н а индивидуалния п р о д у к т с оглед раз­
в и т и е т о н а п а з а р н а т а с т р а т е г и я . Този
м е т о д е особено ценен, з а щ о т о позволява да
се п р о у ч а т в з а и м о о т н о ш е н и я т а м е ж д у
цени, променливи разходи, постоянни раз­
ходи и обем на р а б о т а . У с т а н о в я в а н е т о н а
т е з и взаимоотношения улеснява вземането
н а правилни решения. Особенно важно и клю­
чово значение в л а б о р а т о р и я т а има взаимо­
о т н о ш е н и е т о между ц е н а т а на лаборатор­
н о т о изследване и променливите разходи.
Гореизложените данни са с особенна важ­
н о с т за познаването и извършването на ос­
новния за л а б о р а т о р н и т е финанси п р о ц е с
н а бюдЖетиране.
РАЗХОДИ, ПРИХОДИ, ОБЕМ НА
РАБОТА НА ЛАБОРАТОРИЯТА И
ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МЕЖДУ ТЯХ
П р о л г е н л и в и и п о с т о я н н и р а з х о д и . Опе­
р а т и в н и т е разходи в л а б о р а т о р и я т а м о г а т
да б ъ д а т разделени на две категории - про­
менливи и постоянни разходи. Д в е т е к а т е ­
гории разходи са свързани с обема на рабо­
т а , к о й т о се извършва в л а б о р а т о р и я т а .
Ако о б е м ъ т н а р а б о т а се променя, т о се
п р о м е н я т и разходите по нейното извърш­
ване и в т о з и случай разходите се н а р и ч а т
променливи. Р азх о д и те по реализиране на
л а б о р а т о р н и т е изследвания, к о и т о о с т а ­
в а т непроменени за по-продължителен пе­
риод о т време въпреки колебанията в обе­
м а на р а б о т а , се н а р и ч а т постоянни разхо-
ди.
ф и н а н с о в и т е с р е д с т в а за заплащане на
т р у д а са пример за постоянни разходи. Те
м о г а т да о с т а н а т „дълго" време непроме­
нени въпреки и з м е н е н и я т а в обема на рабо­
т а на л а б о р а т о р и я т а . Типичен пример за
променливи разходи са с р е д с т в а т а , к о и т о
се изразходват за реактиви, химикали, кон­
с у м а т и в и и др. На фиг. 1.5 и 1.6 в графичен
вид е представено поведението на промен­
л и в и т е и п о с т о я н н и т е разходи. О т първа­
т а фигура се вижда, че п р о м я н а т а в броя
н а л а б о р а т о р н и т е изследвания води до про­
порционално изменение н а променливите
разходи. Например, ако б р о я т на изследва­
н и я т а се увеличи о т Xj go Х2, т о и промени-
13
 в и т е разходи се и з м е н я т пропорционално н а
т о в а увеличение - т е н а р а с т в а т о т Yx до
Yg 900
Y2:
Х2 100 = 2 600 = 2
Х1 " 5 0 Yi 300
Y2 600

П о с т о я н н и т е разходи н а й - ч е с т о о с т а ­
в а т непроменени при р е л е в а н т н и т е грани­
Y, 300 ци н а л а б о р а т о р н а а к т и в н о с т . О т фиг. 1.6
е видно, че о б щ и т е п о с т о я н н и разходи при
т а з и с и т у а ц и я о с т а в а т непроменени 500
DEM (Y2) и при т р и т е н и в а обем н а р а б о т а
50 100 150 X 50, 100 и 150 л а б о р а т о р н и изследвания в ъ т ­
X, X2 X3 ре в р е л е в а н т н и т е граници. Ако о б е м ъ т н а
Ф и г . 1.5. Зависимост между променливите раз­ р а б о т а е по-малък о т Х1 или се увеличава
ходи в DEM (Y) и броя на изследванията (X) (по над Хз, п о с т о я н н и т е разходи м о г а т д а на­
II. Вегпгап и L. Wecks - 1982, в модификация)
м а л е я т под Y l или д а се у в е л и ч а т над Yß. Този
Релевантни граници с т ъ п а л о в и д е н феномен се обуславя о т фак­
т а , че р а з х о д и т е о с т а в а т непроменени око­
ло долния и горния обем н а р а б о т а , но т о в а
н е и з к л ю ч в а в ъ з м о ж н о с т а до о п р е д е л е н а
с т е п е н н а обем н а р а б о т а п о с т о я н н и т е
разходи д а се п р е в ъ р н а т в променливи. Н а
фиг. 1.5 графично е п о к а з а н начина, по кой­
т о п о с т о я н н и т е и п р о м е н л и в и т е разходи
ф о р м и р а т о б щ и т е л а б о р а т о р н и разходи.
Върху о б щ и т е разходи в ъ з д е й с т в и е м о г а т
д а о к а ж а т редица ф а к т о р и . Например, ако
ц е н и т е н а р е а к т и в и т е и к о н с у м а т и в и т е се
п р о м е н я т ( н а р а с т в а т или н а м а л я в а т ) щ е
50 100 150 се п р о м е н я т и о б щ и т е л а б о р а т о р н и разхо­
X, Х2 Хз ди. Ако с ъ с т а в ъ т н а п а ц и е н т и т е се проме­
Ф и г . 1.6. Общите постоянни разходи в DEM (У) ня, щ е се п р о м е н я т и р а з х о д и т е з а лабора­
о с т а в а т еднакви при всички нива на обем на ра­
т о р н и услуги, т . е . т е м о г а т д а н а м а л е я т
б о т а т а (X) (no II. Вегпгап и L. Weeks -1982, в мо­
дификация) или д а се у в е л и ч а т . С е з о н и т е също м о г а т
д а п о в л и я я т върху р а з м е р а н а р а з х о д и т е з а
л а б о р а т о р н и услуги. Н а п р и м е р през дадени
Общи разходи сезони б р о я т н а н а с е л е н и е т о в определен
район м о ж е д а се увеличи, респ. д а намалее.
Логично е д а се приеме, че щ е се промени и
обемът на работа на лабораторията. В
Променливи разходи
п р е д с т а в е н а т а н а фиг. 1.7 к о н с т р у к ц и я н а
к р и в а т а се допуска, че о б щ и т е п о с т о я н н и
разходи (Y0 = 500 DEM) о с т а в а т непромене­
Yo 500
ни при всички н и в а н а л а б о р а т о р н а а к т и в ­
П о с т о я н н и разходи
н о с т . В р е з у л т а т н а т о в а , з а д а се форми­
р а т о б щ и т е разходи к ъ м р а з м е р а н а п о с т о ­
я н н и т е т р я б в а д а се добави р а з м е р а н а про­
м е н л и в и т е разходи. Т а к а з а обем н а р а б о т а ­
т а 50 изследвания о б щ и т е разходи с а 800
Фиг. 1.7. Крива на общите разходи: X - брой на DEM (500 DEM п о с т о я н н и разходи + 300
изследванията, Y - разходи в DEM (по Н. Bennau DEM променливи разходи), а при 100 изслед­
и L. Weeks - 1982, в модификация) вания, о б щ и т е разходи с а 1100 DEM (500 DEM
14
постоянни разходи + 600 DEM променливи лабораторна активност. По т а к ъ в начин за
разходи). Ако о б е м ъ т на р а б о т а се увеличи Xj, Х2, Хз...Х п , У1 е променлив разход за еди­
о т Х1 до Х2 о б щит е разходи ще се увеличат ница лабораторен продукт (фиг 1.8 - А). Ако
о т Ух до Уз: обемът на р а б о т а се увеличава о т X! go Х3
100 = 2 1100
п о с т о я н н и т е разходи за единица продукт
= 1,375 ще се н а м а л я т о т Ух до УдСфиг. 1.8 - Б). Тъй
Xi ~5Ö" Yj 800
к а т о променливите разходи за единица про­
Следователно при двойно увеличаване д у к т о с т а в а т постоянни при всички нива
броя на изследванията общите разходи се на а к т и в н о с т , а п о с т о я н н и т е разходи за
увеличават в по-малка с т е п е н - т е н а р а с т ­ единица продукт намаляват с увеличаване
в а т 1,375 п ъ т и , т . е . с увеличаване обема на обема на работа, т о общите разходи за еди-
р а б о т а н а м а л я в а т о б щ и т е разходи за едно
изследване.

Д и р е к т н и и и н д и р е к т н и р а з х о д и . Ди­ Y1 6
р е к т н и т е и и н д и р е к т н и т е разходи са дру­
га категория на о б щ и т е разходи. Всички
разходи, к о и т о са направени за реализиране
50 100 150
на лабораторните изследвания и м о г а т да X, Х2 Хз
б ъ д а т проследени пряко се н а р и ч а т дирек­
т н и разходи. Разходи по л а б о р а т о р н и т е Y
изследвания, к о и т о не м о г а т да б ъ д а т прос­ Крива на п о с т о я н н и т е
Y, 10
ледени пряко се н а р и ч а т индиректни раз­ ^разходи за едно изследване
ходи. Д и р е к т н и са разходите за заплати I
I
на персонала, участващ непосредственно в I
реализирането на изследванията, разходи­ Y2 5 •г
I I
те по заплащане на извънредно отработе­ УзЗ.З _i L

ното работно време, разходите за реакти­ j: : ; »

ви и химикали и др. Към и н д и р е к т н и т е 50 100 150 X
р а з х о д и се причисляват разходите по обез- Б X, Х2 Х3
ценка и амортизация на сградния фонд и ла­
бораторната апаратура, разходи за здрав­
ни осигуровки, комунално битови услуги и
Крива на о б щ и т е разходи
др. О т особенна в а ж н о с т са разходите на
за едно изследване
финансови средства, к о и т о л а б о р а т о р и я т а
прави за едно лабораторно изследване. Ана­
л и з ъ т на т о з и т и п разходи дава възмож­
н о с т да се у с т а н о в я т колебанията в разхо­
д и т е за едно изследване, а о т т у к - да се
определи и производителността на лабора­
торията. Първата стъпка, която трябва
да се направи преди да се п р е с м е т н а т раз­
ходите за едно лабораторно изследване е да В
се определи е д и н и ц а т а лабораторен про­
дукт. Общоприето е единицата лаборато­ Ф и г . 1.8. Графично п р е д с т я в я н е н а з а в и с и м о с т ­
рен продукт да е едно лабораторно изслед­ т а м е ж д у р а з х о д и т е з а едно изследване в DEM
ване. Разходите по реализирането на еди­ (У) и брой изследвания (X) (no II. Всгпгап и L.
ница лабораторен продукт м о г а т също да Weeks - 1982, в модификация)
A. Променливите разходи за едно изследване - Y, са еднакви
б ъ д а т променливи, постоянни и общи. За­ при всички обеми на р а б о т а .
в и с и м о с т т а на т е з и разходи о т обема на Ь.С увеличаване обема на р а б о т а п о с т о я н н и т е разходи за
едно изследване намаляват.
работа в лабораторията са представени на B . О б щ и т е разходи (сума о т променливите и п о с т о я н н и т е
фиг. 1.8 (А - И). 11роменливите разходи за еди­ разходи) за едно изследване намаляват с увеличаване обе­
ница продукт са еднакви за всички нива на ма на р а б о т а .
15
ница л а б о р а т о р е н п р о д у к т , к о и т о предс­
т а в л я в а т сума о т т е з и два разхода, също
н а м а л я в а т с увеличаване броя н а изследва­
н и я т а (фиг. 1.8 - В). Е т о защо в и с о к а т а про­
д у к т и в н о с т н а л а б о р а т о р и я т а води до ико­
номия.
Повече о т ясно е, че о б щ и т е променливи
разходи и п о с т о я н н и т е т а к и в а си взаимо­
д е й с т в а т при формиране р а з х о д и т е з а еди­
ница лабораторен п р о д у к т . Такова взаимо­
де й с тв ие се наблюдава и между д и р е к т н и ­
т е и и н д и р е к т н и разходи о т една с т р а н а ,
и променливите и п о с т о я н н и т е разходи - о т
друга с т р а н а . Тези взаимодействия м о г а т
да б ъ д а т изразени до с т е п е н , че д и р е к т н и ­
т е разходи д а с а променливи, к а к т о и
и н д и р е к т н и т е д а с т а н а т п о с т о я н н и или
променливи. В о с н о в а т а си д и р е к т н и т е раз­
ходи с ъ в п а д а т с променливите, а индирек­
т н и т е с п о с т о я н н и т е . Най ч е с т о промен­
л и в и т е и д и р е к т н и т е разходи се контроли­
р а т о т ръководителя н а л а б о р а т о р и я т а ,
д о к а т о п о с т о я н н и т е и и н д и р е к т н и разхо­
ди са о б е к т н а к о н т р о л о т и н с т и т у ц и о н а л ­
н о т о ръководство.
Натрупване н а д и р е к т н и т е и инди­
р е к т н и т е р а з х о д и . В п р а к т и к а т а същес­
т в у в а т два основни м е т о д а за н а т р у п в а н е
н а д и р е к т н и т е и и н д и р е к т н и разходи.
При първия м е т о д , най-напред се пресмя­
т а т д и р е к т н и т е разходи н а лаборатория­
т а . След т о в а т е се класифицират н а в ъ т -
р е л а б о р а т о р н о ниво. Тази „ е с т е с т в е н а "
в ъ т р е л а б о р а т о р н а класификация може да
бъде д о с т а детайлизирана. В нея най-зна­
чими пера са р а з х о д и т е за т р у д , р е а к т и в и ,
химикали и др. След т а з и процедура към т я х
се п р и б а в я т и н д и р е к т н и т е разходи.
При втория м е т о д най-напред се и д е н т и ­
ф и ц и р а т и н д и р е к т н и т е разходи н а лабора­
т о р и я т а . След к а т о се у с т а н о в и д е л ъ т н а
л а б о р а т о р и я т а в т е з и разходи, т е се разп­
р е д е л я т по о т д е л н и т е лабораторни секции,
а в общо лабораторен а с п е к т се п р и б а в я т
към д и р е к т н и т е разходи н а лаборатория­
т а . Разпределянето н а р а з х о д и т е по звена
има з а цел да подпомогне определянето н а
ц е н о в а т а е ф е к т и в н о с т н а всяко звено. Мно­
го о т болничните заведения не м о г а т да
п о с т и г н а т подобрение в управлението н а
т е з и разходи, т ъ й к а т о използват несъвър-
шенни с и с т е м и за и д е н т и ф и ц и р а н е т о им.
16
Т о ч к а н а у с т о й ч и в о с т . Това е т о ч к а т а ,
в к о я т о при определен обем о т р а б о т а при­
х о д и т е о т извършените лабораторни услу­
ги са равни н а о б щ и т е разходи по т я х н о т о
реализиране. Тази т о ч к а може да бъде изпол­
звана за оценка н а п р о м я н а т а в приходите,
разходите и обема на р а б о т а н а лаборато­
р и я т а . В ъ з с т а н о в я в а н е т о н а изразходвани­
т е с р е д с т в а н а й - ч е с т о се и з в ъ р ш в а н а
б а з а т а н а намаляване разходите, намаля­
ване размера н а п л а щ а н и я т а и посредством
използването н а други финансови „лостове".
З а оценка н а ч и с т и я доход се използва
с л е д н а т а формула:
Ч и с т д о х о д = Приходи - Променливи
разходи - П о с т о я н н и разходи
О т г о р н а т а формула се извежда ф о м у л а т а
за оценка н а приходите:
Приходи = Променливи разходи + Постоян­
ни разходи + Ч и с т доход
Ако ч и с т и я т доход е равен н а нула (няма
печалба или загуба) т о т о г а в а е постигна­
т о р а в е н с т в о между приходите и разходи­
т е и л а б о р а т о р и я т а се намира в точката
на устойчивост.
Тази т о ч к а може да бъде п р е с м е т н а т а
по с л е д н а т а формула:
f+r
rX=VX+f+C или Х=1-ТГ
r-V
X - точка на устойчивост за броя
на изследванията
г - приходи о т единица лабораторно изследване
V - променливи разходи за едно изследване
f - общи постоянни разходи
С - сума на чистия доход
Точката на устойчивост е пресечната
т о ч к а н а л и н и я т а н а о б щ и т е разходи с ли­
н и я т а н а о б щ и т е приходи. О б л а с т т а под
т а з и т о ч к а е о б л а с т т а н а загубите, а об­
л а с т т а над нея е о б л а с т т а н а п е ч а л б а т а .
Например, ако променливите разходи (V)
за едно изследване с а 6 DEM, о б щ и т е п о с т о ­
я н н и (f) - 500 DEM, а п р и х о д ъ т о т едно
изследване (г) е 10 DEM и искаме с у м а т а н а
ч и с т и я доход да е 0, т о г а в а б р о я т н а изс­
л е д в а н и я т а в т о ч к а т а н а у с т о й ч и в о с т е:
500+0 500 ^
v
Х = - — 1 2 5 изследвания
10 6 40 ^
 Графично т о ч к а т а н а у с т о й ч и в о с т е
п р е д с т а в е н а н а фиг. 1.9. Тази т о ч к а (Б) е
локализирана т а м , к ъ д е т о се и з п ъ л н я в а т
125 броя изследвания. При брой на изследва­
н и я т а по-малък о т 125 (защрихованата зона
А) ч и с т и я т доход е о т р и ц а т е л е н (налице е
загуба), а при брой н а изследванията по-го­
лям о т 125 ( з а щ р и х о в а н а т а зона В) ч и с т и ­
я т доход е положителен (налице е печалба).
З а к л ю ч е н и е . П р е д с т а в е н и са само ня­
кои о т о с н о в н и т е принципи н а лаб ора т ор­
н и т е финанси. Понастоящем, к о г а т о в здра­
в е о п а з в а н е т о ни се и з в ъ р ш в а т радикални
с т р у к т у р н и промени и промени в начини­
т е н а финансиране, з а всеки л а б о р а т о р е н
специалист е особенно важно да се запознае
с т е з и основни принципи.
к /
Общи приходи при / В
10 DEM за едно ур|||^ Общи разходи
1500
1250
Общи променливи
разходи при 6 DEM
1000 / j 1 за едно изследване
1
/ J
750
"Кои са основните п р и н ц и п и на бюджети-
рането?", "Как се изготвя лабораторен бю­
джет?'^ др. О т г о в о р и т е н а т е з и въпроси,
а и н а още много други о т подобно е с т е с т ­
во са свързани не само с правилното и ефек­
т и в н о управление н а финансовите средст­
ва н а л а б о р а т о р и я т а , но и с възможност­
т а за възвръщаемост на вложените за ла­
б о р а т о р н а д е й н о с т пари.
Б ю д ж е т ъ т н а клиничната лаборатория
най-общо може да се определи к а т о изчер­
п а т е л е н план за определен период о т вре­
ме. О б щ о п р и е т о е т о з и план да обхваща
едногодишен период, но в определени случаи
т о й може да бъде тримесечен или едноме­
сечен. По-прецизното определение за лабо­
р а т о р е н б ю д ж е т е - и з ч е р п а т е л е н и об­
ш и р е н ф и н а н с о в n^iati н а л а б о р а т о р и ­
я т а , б а з и р а щ с е н а о ч а к в а н и я обелг
лабораторна дейност, предвиждани­
т е л а б о р а т о р н и а п а р а т у р н и лющнос-
ти, к а к т о и н а п р е д в а р и т е л н о набе­
л я з а н и т е з а д а ч и и цялостна полити­
к а н а л а б о р а т о р и я т а . Вписвайки се в
целите, з а д а ч и т е и п о л и т и к а т а на здрав­
н о т о заведение, на к о е т о е базирана лабо­
р а т о р и я т а , най-правилно е финансовия план
н а клиничната лаборатория да бъде изра­
зен във финансови с р е д с т в а - в пари.

/
Във всички видове бизнес п о д г о т о в к а т а
МГК и с ъ с т а в я н е т о на б ю д ж е т а , т ъ й нар. бю-
500
джетиране, е сложен и реалистичен процес.
Общи постоянни Той е основен и з а управлението на всяка
250 ml | разходи здравна организация. Чрез него се з а м и с л я т
и п л а н и р а т за по-кратко време или за по-
' 1 1 1 1 1 i 1 1 1 1 1 » дълъг период приходите и разходите за оп­
50 100 1 2 150 200 250
ределена дейност. В т о з и а с п е к т бюдже­
Брой изследвания т ъ т може сполучливо да бъде оприличен на
у к а з а т е л е н с т ъ л б , к о й т о показва какво е
Фиг. 1.9. Точка на устойчивост (пи И. Herman -
1989, в модификация) а к т у а л н о т о използване н а ф и н а н с о в и т е
Точката иа устойчивост е Б - при извършване на 125 изслед­ средства. Процесът н а бюджетиране пре­
вания. минава през две важни фази:
• превръщане н а л а б о р а т о р н а т а с т р а т е ­
гия за даден период в оперативен план на
БЮДЖЕТЪТ В КЛИНИЧНИТЕ лабораторията,
ЛАБОРАТОРИИ • изразяване н а о п е р а т и в н и я план к а т о
бюджет на лабораторията.
В. Иванов
В п ъ р в а т а фаза се включват: определяне
И з в ъ р ш в а щ а т а се реформа в здравеопазва­ обема на работа за даден период, проекти­
н е т о п о с т а в я ред въпроси пред специалис­ р а н е на о п е р а т и в н и т е действия, които
т и т е в к л и н и ч н а т а лаборатория: „Защо е трябва да бъдат предприети, за да се тран­
необходимо да и м а лабораторен бюджет?", сформира лабораторната стратегия в pe­
ll
ЦЕНТРАЛ ИА МЕД ИЦИ1ICKA
БИБЛИОТЕКА
Иhb. № З х6 !
алност и др. В т о р а т а фаза е фокусирана
върху изработването н а оперативен п л а н ,
във финансов смисъл - разход и възвръщае­
мост на финансовите средства, средства з а
к а п и т а л н о оборудване и др.
Ь Ю Д Ж Е Т Н Л ПРОГНОЗА И ОПИСАНИЕ
При к о н с т р у и р а н е т о н а б ю д ж е т а се преми­
нава през един особено важен, но т р у д е н
технически п о д г о т в и т е л е н е т а п . Този е т а п
включва:
• п р о е к т и р а н е обема н а р а б о т а н а лабора­
торията,
• пресмятане размера на финансовите
средства, необходими за предвидения обем
о т лабораторни д е й н о с т и ,
• п р е с м я т а н е н а д и р е к т н и т е разходи,
• п р е с м я т а н е н а и н д и р е к т н и т е разходи,
• п р е с м я т а н е н а о б щ и т е разходи и с т е п е н ­
т а на възвръщаемост н а с р е д с т в а т а с ог­
лед п о с т и г а н е н а баланс и др.
Р а з р а б о т в а н е т о на „добър", "силен" бю­
д ж е т зависи о т ц е л и т е и н а м е р е н и я т а н а
л а б о р а т о р и я т а , к а к т о и о т ц е л и т е и поли­
т и к а т а н а з д р а в н о т о заведение, н а ч и я т о
т е р и т о р и я т а е базирана л а б о р а т о р и я т а .
Б ю д ж е т ъ т н а л а б о р а т о р и я т а зависи и о т
д а н н и т е за п р е д и ш н и т е б ю д ж е т и , к а к т о и
о т с т е п е н т а н а т я х н о т о изпълнение. Ръ­
к о в о д с т в о т о н а л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да
познава добре т е з и данни. Анализирайки ги
за изминал период о т време и п р е д с т а в я й ­
ки ги графично, т о може да добие визуална
п р е д с т а в а за п р о м е н и т е в обема н а рабо­
т а , к а к т о и да направи оценка за скорос т­
т а н а промяна н а т о з и обем. Освен т е з и
данни са необходими и данни за: бюджетния
проект на здравното заведение; демографс­
ката характеристика н а района/региона,
който обслужва лабораторията и тенден­
цията за промени в тези данни; промените
в здравната п о л и т и к а н а заведението,
които биха довели до увеличение и л и нама­
л е н и е в обема на работа на лабораторията
з а следващ период. К ъ м ц я л а т а т а з и
информация трябва да се добавят и д а н н и
за намеренията н а лабораторията за въ­
веждане на нови лабораторни технологии и
съвременна апаратура. Едва т о г а в а ръко­
18
в о д с т в о т о на лабораторията е в състоя­
ние да п р о е к т и р а реалистичен лабораторен
бюджет.
ВИДОВЕ ЛАБОРАТОРЕН Б Ю Д Ж Е Т
Определен ( п р и с п о с о б я е м ) бюджет. Този
т и п б ю д ж е т е обикновенно „лек" за управ­
ление. Типичното з а него е, че и н с т и т у ц и я ­
т а , в к о я т о е включена л а б о р а т о р и я т а
к а т о с т р у к т у р н а единица „отпуска" фик­
сирани суми о т парични с р е д с т в а за всяко
звено, в т о в а число и н а к л и н и ч н а т а лабора­
т о р и я . Б ю д ж е т ъ т е „приспособяем11, защо­
т о към о т п у с н а т и т е финансови с р е д с т в а
се а д а п т и р а обема н а р а б о т а на лаборато­
р и я т а . П р и с п о с о б я е м и я т бюдЖет с е
х а р а к т е р и з и р а с н е д о с т а т ъ ч н а въз-
люЖност з а г ъ в к а в о с т п о о т н о ш е н и е
обелш н а р а б о т а и л и п с а н а с т и м у л и
з а ефективна дейност о т страна н а
ръководствотои персонала н а лабора­
т о р и я т а . При т а к ъ в вид б ю д ж е т , лабора­
т о р и я т а п о ч т и не се с т р е м и да осигури
възвр ъщаемо ст на изразходваните с р е д с т ­
ва. Това позволява н а и н с т и т у ц и о н а л н о т о
ръководство да определя п о - н а т а т ъ к нис­
ки б ю д ж е т и н а л а б о р а т о р и я т а .
Ф и к с и р а н - п р о г н о з е н бюджет. Това е най-
о п р о с т е н а т а форма н а лабораторен бюдж­
е т . И н с т и т у ц и о н а л н о т о ръководство при­
ема прогнозните р а з ч е т и н а з в е н а т а и ги
у т в ъ р ж д а в а . Това не изключва преговори по
прогнозните р а з ч е т и н а лабораторното
звено и коригиране н а п р о е к т а при наличие
на обективни предпоставки за т о в а .
П р о м е н л и в (гъвкъв) бюджет. Този вид бю­
д ж е т в сравнение с д р у г и т е видове е твор­
чески вариант на бюджет. За изразходване­
т о му се и з и с к в а т сигурни и т о ч н и данни
за о п е р а т и в н и т е разходи н а лаборатория­
т а . Тези разходи са о т н о с и т е л н о фиксира­
ни към г р а н и ц и т е н а л а б о р а т о р н а а к т и в ­
н о с т , д о к а т о д р у г и т е разходи се п р о м е н я т
д и р е к т н о с н и в о т о н а обем н а р а б о т а . Ус­
т а н о в я в а н е т о на ц е н о в и т е елементи, свър­
зани с всяка с ъ с т а в к а н а б ю д ж е т а е т р у ­
ден процес и изисква голям обем о т инфор­
мация, к а к т о и з н а ч и т е л н а и н т е л е г е н т -
н о с т о т с т р а н а н а л а б о р а т о р н и т е специа-
листи и лабораторните ръководители. Вед­
нъж създаден и представен за фино акорди­
ране о т с ъ о т в е т н и т е институции, лабора­
торния б ю д ж е т може по един превъзходен
начин да се доближи до реално очакваните
разходи на лабораторията. Това предотв­
р а т я в а н е о б х о д и м о с т т а о т ч е с т о т о му
преработване през бюджетния период. Лко
променливите и п о с т о я н н и т е съставки на
лабораторния б ю д ж е т са добре известни,
т е м о г а т д а б ъ д а т обвързани и със
с ъ о т в е т н и срокове. В някои случаи лимити­
раният - обвързаният със срокове б ю д ж е т
и п р е с м е т н а т най-често за една финансова
година може да се замени с т ъ й нар. после­
дователен т и п бюджет. При т о з и подход
б ю д ж е т ъ т т р я б в а н е п р е к ъ с н а т о да с е
актуализира, к а т о завършилия период (най-
ч е с т о месец) се замени с нов, т а к а че пери­
о д и т е да са винаги 12 (12 календарни месе­
ца). Реализирането на такъв подход е въз­
можно при наличие на компютъризирана
финансово-съобщителна с и с т е м а в лабора­
т о р и я т а и в здравното заведение.
Най-често б ю д ж е т ъ т е сегментиран и
т о особенно в разходната му част. Тя съ­
държа две основни части:
• регулярни разходи и
• оперативни разходи.
Към регулярните разходи с п а д а т разхо­
д и т е за заплати на персонала на лаборато­
рията, с р е д с т в а т а необходими за изплаща­
не на извънредно о т р а б о т е н о т о време,
здравни осигуровки, здравни застраховки и
др.
В о п е р а т и в н и т е разходи се включват
с р е д с т в а т а необходими за пощенски разхо­
ди, за отопление, осветление и електроенер­
гия, разходи за наеми, разходи за поддържа­
не на сградния фонд, разходи за поддържане
на лабораторната апаратура и спомага­
т е л н о т о лабораторно оборудване и др.
ПЕРСОНАЛНО НАСОЧЕН Б Ю Д Ж Е Т
Процесът на персонално бюджетиране е
финансов план за личните разходи и прихо­
ди на всеки работещ в лабораторията. Про­
цесът на неговото изготвяне е т я с н о свър­
зан с целите и задачите на лабораторията,
както и с изискванията за броя на щатния
персонал. Пряката отговорност за т о з и
процес се носи о т ръководството на лабо­
р а то р ията , т ъ й к а т о т о е субектът, кой­
т о превръща бюджетния план в реалност.
По своята същност процесът на изготвя­
не на персоналния б ю д ж е т е комплексен. В
него се включват формирането на работ­
н а т а заплата, възможностите за нейното
увеличаване или намаляване в зависимост
о т промяната на служебния с т а т у с на ра­
ботещия и др. В процеса се включва отчи­
т а н е т о на положения т р у д извън официал­
н о т о работно време и пресмятането раз­
мера на заплащане на т о з и труд. Наличие­
т о на много добра о т ч е т н о с т и допълни­
телна информация може да осигури на ръ­
ководството данни за реално отработени­
т е часове о т всеки работещ в лаборатори­
я т а . В т е з и часове трябва да се включат и
часовете за осигуряване на 24 часова непре­
късната работа на лабораторията.
ОЦЕНКА НА РЕААТИВНОТО
ИЗПЪЛНЕНИЕ НА БЮДЖЕТА
Както бе упоменато, б ю д ж е т ъ т на лабора­
т о р и я т а подсигурява к а к т о плановите,
т а к а и извънплановите разходи. За да се
контролират т е з и разходи е необходимо да
има изградена финансово-информационна
система. Тя дава възможност да се добие
информация за разходите и за т я х н о т о ак­
туализиране, както и за начина, по който
т е з и разходи са направени. Икономически­
я т управител на здравното заведение е длъ­
жен да представя т е з и разходи на лабора­
т о р и я т а за определен период о т време,
напр. за всеки календарен месец и т о з и про­
цес се нарича затваряне на оперативния
период. Ежегодните разходи могат да бъдат
разделени по такъв начин, че 1/12 о т т я х
да се п а д а т на всеки календарен месец. Това
дава възможност по-лесно да се о т ч и т а
р а б о т н а т а а к т и в н о с т и да се маркират
различията о т месец до месец. В т о в а съоб­
щение трябва да се включи и о т ч и т а н е т о
на р а б о т н а т а натовареност.
19
ПРИХОДНА ЧАСТ НА
ЛАБОРАТОРНИЯ БЮДЖЕТ
РАЗМЕР НА ПОСТЪПЛЕНИЯТА
Между обема на р а б о т а , н а п р а в е н и т е раз­
ходи за извършените лабораторни изследва­
ния и т я х н а т а в ъ з в р ъ щ а е м о с т с ъ щ е с т в у ­
в а т к р и т и ч н и в з а и м о о т н о ш е н и я . Досега
предимно се обсъждаше р а з х о д н а т а ч а с т на
л а б о р а т о р н и я б ю д ж е т и се наблягаше н а
о п е р а т и в н и т е планови разходи. При пазар­
ни условия б ю д ж е т ъ т н а л а б о р а т о р и я т а щ е
има не само разходна, но и приходна ч а с т .
Такъв б ю д ж е т дава в ъ з м о ж н о с т а к т у а л н и ­
т е приходи о т и з в ъ р ш е н и т е лабораторни
услуги да б ъ д а т с ъ п о с т а в е н и с а к т у а л н и ­
т е разходи по т я х н о т о извършване. Съпос­
т а в я н е т о н а т е з и две ч а с т и н а б ю д ж е т а
позволява да се добие п р е д с т а в а каква е пе­
ч а л б а т а , респ. з а г у б а т а н а л а б о р а т о р и я т а .
К а к т о при много други видове бизнес осигу­
р е н а т а печалба дава в ъ з м о ж н о с т да се из­
в ъ р ш в а т к а п и т а л н и подобрения в лаборато­
р и я т а . Н а л и ч и е т о н а печалба или пък н а
загуба е начин да се оцени д е й н о с т т а н а
ръководния екип н а л а б о р а т о р и я т а . Кога­
т о между приходите и р а з х о д и т е н я м а ба­
ланс, т о в а е алармиращ сигнал по о т н о ш е ­
ние е ф е к т и в н о с т т а н а управление н а лабо­
р а т о р и я т а . В т а к и в а случаи ръководство­
т о е длъжно да п о т ъ р с и о т г о в о р н о с т з а
дисбаланса н а д в е т е с ъ с т а в к и на б ю д ж е т а .
На п р а к т и к а най- ч ес т о се т ъ р с и отговор­
н о с т само з а прекалено г о л е м и т е разходи и
се пренебрегват п р и ч и н и т е за л и п с в а щ а т а
или намалена печалба. Ясно е, че т р я б в а да
се о т к р и е и приложи някакъв механизъм з а
прогнозиране в ъ з в р ъ щ а е м о с т т а н а изразхо­
д е н и т е с р е д с т в а с цел осигуряване н а ин­
вестиционна жизнеспособност н а лаборато­
р и я т а . В т о з и а с п е к т приходната ч а с т на
б ю д ж е т а е ч а с т т а , к о я т о осигурява и ре­
гулира в ъ з в р ъ щ а е м о с т т а под ф о р м а т а н а
финансови приходи. П р о г н о з а т а н а прихо­
д и т е налага да се разполага с някои данни
о т и н с т и т у ц и о н а л е н х а р а к т е р . В п ове че т о
институции разходната ч а с т на бюджета
се с ъ с т а в я преди п р и х о д н а т а м у ч а с т и
много ч е с т о се и с к а т и изразходват повече
средства, о т к о л к о т о са в ъ з м о ж н о с т и т е н а
л а б о р а т о р и я т а за реализиране н а приходи.
Много по-логично е да б ъ д а т п р о г н о з и р а ­
н и и планирани първо приходите, а
20
след т о в а разхоодите. С оглед да бъде пос­
т и г н а т баланс в д в е т е ч а с т и н а процеса е
редно да б ъ д а т направени прогнози и план и
за приходите, а не само з а р а з х о д и т е к а к т о
с т а в а н а п р а к т и к а . Ако р а з х о д н а т а ч а с т
н а б ю д ж е т а е голяма, не е много редно да се
с т р е м и м чрез прекомерно увеличаване н а
п р и х о д н а т а му ч а с т да п о с т и г н е м баланс
м е ж д у т е з и негови с ъ с т а в к и . Б а л а н с ъ т
т р я б в а да се п о с т и г а не само чрез увелича­
ване размера н а приходите, но и чрез огра­
ничаване на разходите. Много ч е с т о се прак­
тикува даването на предварителна
прогноза з а възвръщане н а изразходваните
средства. Това изисква подробни анализи и
прогнози за р а з х о д и т е и в ъ з в р ъ щ а е м о с т т а ,
к о и т о да б ъ д а т с голяма с т е п е н на т о ч ­
н о с т . П р а к т и к у в а се п р и л аг ан ето н а фик­
сирани с т о й н о с т и н а възвръщаемост, кое­
т о н а п р а к т и к а означава, че лабораторни­
т е услуги т р я б в а да се и з в ъ р ш в а т в предва­
р и т е л н о уговорен финансов л и м и т . Бюдже­
т ъ т н а л а б о р а т о р и я т а т р я б в а т а к а да
бъде изготвен, че д в е т е му ч а с т и да се „със­
т е з а в а т " з а реализиране н а ч и с т и доходи.
Лко р а з х о д н а т а ч а с т н а б ю д ж е т а е толко­
ва голяма, че не може д а бъде компенсирана
чрез о ч а к в а н а т а възвръщаемост, а о т своя
с т р а н а и в ъ з в р ъ щ а е м о с т т а не може да бъде
увеличавана, т о н а м а л е н и е т о т р а б в а д а
обхване предимно р а з х о д н а т а ч а с т н а бю­
д ж е т а . Това би могло да се п о с т и г н е с два
или повече последователни цикъла н а съгла­
суване м е ж д у р а з х о д н а т а и п р и х о д н а т а
ч а с т на бюджета.
КАПИТАЛЕН БЮДЖЕТ
К а п и т а л н и я т б ю д ж е т може да бъде разде­
лен н а две категории. Към п ъ р в а т а се о т ­
н а с я т пера с ниска цена. Тази к а т е г о р и я
изисква минимална с т е п е н н а анализ. Пера­
т а в т о з и списък се п р е д с т а в я т в п р о с т
пореден п р и о р и т е т или класификация. Тези
пера и з и с к в а т извънсписъчно описание н а
ф и н а н с о в а т а си изразеност, посочване из­
р а б о т в а н е т о н а в ъ з м о ж н и т е им з а м е с т и ­
т е л и и др. Този списък следва да бъде обно­
вяван или подобряван. П е р а т а в него м о г а т
да б ъ д а т групирани по следния начин;
• к а п и т а л н и разходи за извършване на не­
п р е к ъ с н а т и услуги или пък за ново оборуд-
 ване, к о е т о да осигури по-голям обем н а
работа в лабораторията,
• к а п и т а л н и пера, к о и т о се ф о р м и р а т о т
„спестяване" н а с р е д с т в а или пък са фор­
мирани о т печалба, или и о т д в е т е ,
• к а п и т а л н и пера, свързани с въвеждане н а
нови програми,
• к а п и т а л н и пера, свръзани с подобряване
к а ч е с т в о т о и е ф е к т и в н о с т т а на клинич-
н о - л а б о р а т о р н и т е услуги.
Д р у г а т а група о т к а п и т а л н и я б ю д ж е т
са п е р а т а с висока йена. С р е д с т в а т а о т
т а з и к а т е г о р и я се о ц е н я в а т и а н а л и з и р а т
ежегодно и се п о л з в а т з а покупки и изпла­
щане н а а п а р а т у р а или оборудване за пери­
од о т 3-5 години. З а всяко о т т е з и пера е
необходимо да се знае следното:
• ясно оформени цели и намерения, за кои­
т о ще се изразходва п е р о т о ,
• с т е п е н н а в а ж н о с т на т е з и цели и наме­
рения,
• ясни и т о ч н и данни з а използване на т е з и
пера в динамика,
• информация за подобни пера в други инс­
титуции,
• очаквани размери на всяко перо,
• оценка н а о ч а к в а н и т е приходи о т т о в а
перо и др.
Основния и най-важен въпрос, на к о й т о
т р я б в а да се отговори при о ц е н к а т а на т е з и
пера е: „Какво е количеството н а парите,
к о и т о ще се п о л у ч а т чрез в ъ н ш н и и
вътрешни приходи, к а т о пряк р е з у л т а т о т
реализиране на този капитално-бюджетен
проект сега, в близкото и далечно бъдеще?".
Закупуването на а п а р а т у р а , лаборатор­
ни съоръжения или извършване н а инвести­
ции в с т р о и т е л с т в о т о са процеси, к о и т о
и з и с к в а т грижливо и прецизно б ю д ж е т и р а -
не. Този процес зависи о т в з а и м н а т а връз­
ка между о п е р а т и в н и я и к а п и т а л н и я бюдж­
е т , а е ф е к т и в н о с т т а на д е й с т в и я т а - о т
м ъ д р о с т т а на р е ш е н и я т а на ръководство­
т о на л а б о р а т о р и я т а . Р е ш е н и я т а о т н о с ­
но к а п и т а л н и я б ю д ж е т са важни и о т дру­
га гледна т о ч к а - п е р с п е к т и в и т е за разви­
т и е на к л и н и ч н а т а лаборатория. По т о з и
повод H . J . B c r m a n отбелязва; „Ако лабора­
торното ръководстводопусне грешки в м и с ­
ленето и вземането н а решения, резулта­
т и т е от тези грешни решения ще се оценя­
в а т и видят след продължителен период о т
време11. Това е една о т м н о г о т о причини
преди вземане на решение за закупуване н а
а п а р а т у р а или оборудване, л а б о р а т о р н и т е
специалисти да б ъ д а т з а п о з н а т и с нейно­
т о използване, с разходите по н е й н а т а под­
дръжка, с размера н а е в е н т у а л н и т е прихо­
ди, к о и т о би донесло т о в а оборудване и др.
Не т р я б в а да се з а б р а в я т д в а т а важни прин­
ципа:
• с р е д с т в а т а за закупуване на а п а р а т у р а
или оборудване се т р е т и р а т к а т о капи­
т а л н и вложения,
• с р е д с т в а т а по поддръжка и възстановя­
ване на оборудването се изразходват о т
о п е р а т и в н а т а ч а с т на б ю д ж е т а .
Ако клиничната лаборатория н я м а въз­
м о ж н о с т за закупуване н а а п а р а т у р а , т о
т я би могла да вземе т а к а в а под наем. Ва­
жен въпрос при т а к а в а с и т у а ц и я е: „Разхо­
д и т е по наема към кое перо да бъдат отне­
сени - към оперативните разходи и л и към
к а п и т а л н и т е разходи?'. Ако оборудването
е под ф о р м а т а на а п а р а т у р а , най-правилно
е разходите да б ъ д а т включени към капи­
т а л н и т е разходи. Ако т о е под друга фор­
ма, по-правилно би било разходите да б ъ д а т
включени към о п е р а т и в н и т е такива. В т о з и
смисъл, к а п и т а л н и т е разходи предварител­
но т р я б в а да б ъ д а т добре обмислени. Преди
да се вземе решение за к а п и т а л н и инвести­
ции, първо би т р я б в а л о да се определи пери­
ода на т е з и инвестиции. Пай-често се из­
п о л з в а т два вида периоди о т време: крат­
косрочни периоди - 1 година и дългосрочни
периоди от 3 до 5 години. Друг много важен
ф а к т о р за вземане на решения за к ап и тал ­
ни вложения е определянето на приоритети­
т е и на к о н к у р е н т н и т е търсения. В ъ т р е в
л а б о р а т о р и я т а п р и о р и т е т и т е в отделни
нейни о т д е л е н и я и секции з а в и с я т о т
н а м е р е н и я т а и п о л и т и к а т а им, но т а к а
също и о т п о л и т и к а т а на ц я л а т а лабора­
т о р и я . Пр о г р ами те и и с к а н и я т а н а отдел­
н и т е л а б о р а т о р н и с е к т о р и и/или секции
т р я б в а да се о ц е н я т внимателно и приори­
т е т и т е да се определят о т ръководство­
т о на л а б о р а т о р и я т а . С и т у а ц и я т а би била
идеална, ако ц е л и т е и н а м е р е н и я т а на о т - /
д е л и и т е лабораторни звена се н а м и р а т в
конкурентна с и т у а ц и я с цел включването
21
им във фондовете н а л а б о р а т о р и я т а . В т о з и
а с п е к т з а м и с л и т е н а „ в л и я т е л н и т е " лабо­
р а т о р н и секции м о г а т да и з г л е ж д а т к а т о
„ м ъ р т в и проекти". В никакъв случай не бива
да се с ч и т а , че т е х н и т е замисли са проява
н а професионален каприз или пък, че п о с т а ­
в е н и т е о т т я х искания т р я б в а да се прие­
м а т у л т и м а т и в н о . Най-често в з е м а н е т о на
решения з а к а п и т а л н и вложения има комп­
лексен х а р а к т е р и най-удачно е да се и м а т в
предвид м н е н и я т а и с т а н о в и щ а т а н а пове­
че специалисти.
СТЕПЕН НЛ ГОТОВНОСТ
ЗА РАЗРАБОТВАНЕ ЗА БЮДЖЕТ
С т е п е н т а н а г о т о в н о с т з а започване н а
б ю д ж е т и р а н е т о е о б е к т н а много проучва­
ния. Това е процес, к о й т о т ъ р п и динамични
промени и р а з в и т и е . Подходите з а опреде­
ляне с т е п е н т а н а г о т о в н о с т з а б ю д ж е т и -
ране са ограничени, но най-често се използ­
в а т т р и основни принципа:
Философията залегнала в първия п р и н ц и п
е р а в н о п о с т а в е н о с т т а н а всички п а ц и е н т и
- т е з и , к о и т о се и з с л е д в а т в с т а ц и о н а р н и
условия и т е з и , к о и т о са о б е к т н а изследва­
не извън с т а ц и о н а р а . При т о з и подход це­
н и т е н а л а б о р а т о р н и т е услуги т р я б в а да
са приемливи и благоразумни.
Според втория принцип, с ъ б р а н и т е сред­
с т в а т р я б в а да п о к р и в а т всички разходи,
направени по реализиране н а лабораторни­
т е изследвания. С р е д с т в а т а т р я б в а да бъ­
д а т с т р у к т у р и р а н и т а к а , че да задоволя­
в а т напълно ф и н а н с о в и т е изисквания н а
лабораторията.
Третият п р и н ц и п е, че с п е ч а л б а т а , коя­
т о се получава о т ц е н т р о в е т е продуцира-
щи т а к а в а , т р я б в а да се п о д д ъ р ж а т и т е з и
лабораторни секции, к о и т о не п р о д у ц и р а т
печалба о т и з в ъ р ш в а н и т е о т т я х услуги.
Р а з м е р ъ т н а п о м о щ т а , к о я т о им се оказва
може да варира о т 10-90% о т размера на ди­
р е к т н и т е им и индиректни разходи.
З а к л ю ч е н и е . Н а с т о я щ о т о к р а т к о изло­
жение дава в ъ з м о ж н о с т н а л а б о р а т о р н и т е
специалисти да се з а п о з н а я т с основните
принципи н а процеса н а бюджетиране, кои­
т о ще са им о т полза в т я х н а т а п р а к т и ­
ческа дейност.
22
ОСТОЙНОСТЯВАНЕ НА
ЛАБОРАТОРНИТЕ УСЛУГИ
Н. И в а н о в
К л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я т р я б в а сама да
направи о с т о й н о с т я в а н е т о , а не да възла­
га извършването му н а а д м и н и с т р а ц и я т а
н а з д р а в н о т о заведение. То изисква: предва­
р и т е л н а информация, у п о р с т в о , п р о с т и
а р и т м е т и ч н и д е й с т в и я и спазване на опре­
делени правила. О с т о й н о с т я в а н е т о не може
да се избегне, т о не е заплаха за лаборато­
р и я т а , не е пълния о т г о в о р и не бива да се
приема, че в научен смисъл не е т о ч н о .
О с т о й н о с т я в а н е т о в к л и н и ч н а т а лабо­
р а т о р и я о с ъ щ е с т в я в а в р ъ з к а т а между из­
разходваните с р е д с т в а (изхарчени за реак­
т и в и и други консумативи, т р у д и к а п и т а л ­
но оборудване) с р е з у л т а т а о т лаборатор­
н а т а д е й н о с т (изпълнени изследвания з а
анализиране н а биологични и др. м а т е р и а ­
ли). Н а п р а в е н и т е разходи и начина на пред­
с т а в я н е н а изразходваните с р е д с т в а зависи
о т оползотворяването н а с ъ б р а н а т а инфор­
мация.
ЦЕНОВА СТРАТЕГИЯ
С ъ щ е с т в у в а т различни начини за у с т а н о ­
вяване ц е н а т а н а л а б о р а т о р н и т е изследва­
ния. Един о т т я х , сравнително широко раз­
пространен, е ц е н и т е им да б ъ д а т взаимс-
т в а н и о т други лаборатории. При т о з и на­
чин обаче, не ноже да бъде даден отговор н а
въпроса "Каква е възвръщаемостта на сред­
ствата, които се о т п у с к а т за лаборатор­
н и услуги? 1 . В ж е л а н и е т о си да подсигури
възвр ъщаемо ст на изразходваните с р е д с т ­
ва, р ъ к о в о д с т в о т о н а л а б о р а т о р и я т а може
да вземе решение да увеличи ц е н а т а на ла­
б о р а т о р н и т е изследвания и т я да с т а н е по-
висока о т т а з и н а к о н к у р е н т н и т е лабора­
т о р и и . Такъв подход едва ли е най-правилен.
Цени те не бива д а се определят емпирично
и л и пък да се взаимстват, а да бъдат прес­
м я т а н и н а базата на д и р е к т н и т е и инди­
р е к т н и разходи, направени при реализира­
не на изследванията. Изчисляването на це­
н и т е не т р я б в а да бъде само механичен сбор
н а и з р а з х о д в а н и т е с р е д с т в а , а к ъ м него
следва да се добави и обема н а ж е л а н а т а
крайна печалба.
По принцип о с т о й н о с т я в а н е т о е д о с т а
трудна област в бизнеса. То изисква сериоз­
ни познания за процеса и механизмите на
възвръщаемост на изразходваните средст­
ва, маркетинга, взаимоотношението меж­
ду управлението на лабораторията и свър­
заните с т о з и процес юридически постанов­
ки, познаване законите за конкуренцията и
пр. Всъщност има и лаборатории, к о и т о
н я м а т проблеми с ц е н и т е на изследвания­
т а . Най-често т о в а са ч а с т н и т е лаборато­
рии. Ако са налице „истински" пазарни усло­
вия, пациентите няма да заплащат по-вече,
отколкото е ц е н а т а на лабораторното из­
следване. Това е и една о т причините поня­
кога т о да бъде продадено на по-ниска цена.
Такъв подход обикновено се прилага в мал­
к и т е лаборатории, които т р у д н о м о г а т да
се конкурират с лабораториите, заемащи
водещо м я с т о на пазара за лабораторни
услуги. В т е з и случаи л а б о р а т о р и я т а не
пресмята цените на лабораторните услу­
ги, а променя пазарните такива. Не т р я б ­
ва да се забравя, че при такива ситуации
е т и к а т а и морала трябва да са водещи! Лко
ръководството на лабораторията реши да
намали пазарната цена на изследванията,
т о трябва да знае, че с т о в а си действие
може да се лиши о т значителни приходи.
При вземане на решение за повишаване це­
н а т а на изследванията, т о трябва да може
ясно да обясни, че се запазва и/или подобря­
ва т я х н о т о качество.
ИКОНОМИЧЕСКИ ОСНОВИ
ИЛ О С Т О Й Н О С Т Я В А Н Е Т О
НА ЛАБОРАТОРНИТЕ УСЛУГИ
Ценообразуването в с т а н д а р т н а т а иконо­
мическа литерутура се основава на „Закона
Т а б л и ц а 1.1. Пример за пресмятаме на продажната цена (в DEM) на единица лабораторен
продукт { п о A n t h o n y - 1977, в модификация)
Продажна цена
Обем н а Общи
за единица лаб.
продажбите приходи
продукт
25 4500 12500
20 1000 20000
15 1500 22500
12,5 2000 25000
за т ъ р с е н е т о и предлагането", т . е . предла­
гането на лабораторни услуги ще зависи о т
т о в а колко клиенти и м а т нуждата да ги
»купуват". В т о з и смисъл може да се прие­
ме, че ниските цени на лабораторните ус­
луги ще б ъ д а т приемливи и „атрактивни"
за повечето пациенти, т . е . т е з и услуги ще
б ъ д а т търсени. Кривата на разходите за
лабораторни услуги ще показва намаляване
на изразходваните средства за единица ла­
бораторен продукт, когато обемът на из­
следванията се увеличава. Това се дължи на
факта, че постоянните разходи на лабора­
т о р и я т а ще се разпределят на повече из­
следвания, когато тяхния обем се увелича­
ва. На табл. 1.1 е показан най-използвания
начин за уточняване и формиране на добра
продажна цена - чрез оценка възвръщаемост­
т а на вложените за реализиране на лабо­
р а т о р н и т е изследвания средства. В т о з и
случай се формират т ъ й нар. п р о д с и к н и
цени.
Естествен е въпросът; "Що е това цена?1
Простичко казано т о в а са парите, които
се изразходват за придобиване на собствен-
н о с т или услуга. О т гледна точка на консу­
матора т о в а са парите, които т о й е израз­
ходвал за придобиване на качествен продукт
или услуга.
Продажните цени са адекватно високи
при спазване на следните условия:
• наличие на възвръщаемост на директни­
т е разходи,
• възвръщане на индиректните разходи и
т я х н о т о безпристрастно разпределение,
• получаване на задоволителна печалба.
Тези т р и елемента трябва да са водещи
при формиране на продажната цена на ла­
бораторните изследвания за всяко лабора­
торно звено. Съществуват обаче и ситуа­
ции, при които вече п р е с м е т н а т и т е про­
дажни цени трябва да бъдат променени, за
Променлив разход Общи
Постоянни (10 DEM за единица Печалба
разходи
разходи лаб. продукт)
5000 55000 10000 2500
5000 10000 15000 5000
5000 15000 20000 2500
5000 20000 25000 0
23
да може л а б о р а т о р и я т а да посрещне проб­
л е м и т е , създадени ü о т к о н к у р е н т н и т е ла­
боратории. Един т а к ъ в проблем е: „Какви
с р е д с т в а т р я б в а к а т о ияло д а получи лабо­
р а т о р и я т а , з а д а се ф о р м и р а т продажни
йени, осигуряващи задоволителна печалба?".
П р е с м я т а н е т о н а необходимите на ла­
б о р а т о р и я т а финансови с р е д с т в а осигуря­
ва информаиия н а н е й н о т о ръководство за
вземане н а правилни и а д е к в а т н и финансо­
ви решения. Формално п р о и е с ъ т се с ъ с т о и
о т две фази: ф и н а н с о в о прсслштпанс и
„ у п р а в л е н ч е с к о п р с с л г я т а н е " . Финансо­
в о т о изчисляване н а й - ч е с т о се прави с иел
някакъв доклад до висшестоящи и н с т а н щ ш .
Ц е л т а н а управленческото п р е с м я т а н е е
в ъ т р е л а б о р а т о р н а информаиия, обхващаща
анализа и и з ч и с л е н и я т а н а ф и н а н с о в и т е
с р е д с тв а, необходими н а л а б о р а т о р и я т а .
В миналото п р е с м я т а н е т о на средства­
т а , необходими н а л а б о р а т о р и я т а , е с т а ­
вало най-често чрез посочване н а с р е д с т в а ­
т а - на й - често з а едно лабораторно изслед­
Таблица 1.2. Примерна схема за пресмятане разходите за изследванията,
направени с анализатора "X"
I. AI1APAT
1. Наименование
2. Фабричен No
3. Модел
4. Цена на закупуване
Начална д а т а
II. ДИРЕКТНИ РАЗХОДИ ЗА МАТЕРИААИ
Наименование на
Общ брой изследвания
изследването
1.
2.
3. и т . н .
Общо
III. ТРУД
Е т а п на изследването Общо минути за процедура
1. Преданалитичен е т а п
2. Аналитичен е т а п
3. Ностаналитичен е т а п
Общо
24
ване, без да се о т ч и т а в ъ з м о ж н о с т т а за
получаване н а и з в е с т е н п р о и е н т печалба.
Понастоящем, финансовото п р е с м я т а н е
не се различава значимо о т управленческо­
т о п р е с м я т а н е поради ф а к т а , че и м а т поч­
т и еднакво предназначение.
Определянето с е б е с т о й н о с т т а на едини-
и а лабораторен п р о д у к т включва т р и основ­
ни е л е м е н т а :
• сродства з а труд,
• средства з а реактивии консулшти-
ви,
• с р е д с т в а з а а п а р а т у р а и съоръЖепия.
През 1989 година M.E.Travers разработва ме­
т о д за пресмятане на необходимите средства
за една лаборатория .Този м е т о д може да се из­
ползва за определяне размера на с р е д с т в а т а ,
необходими за определена лабораторна секция,
за определен лабораторен а в т о м а т , за опреде­
лен лабораторен м е т о д , дори за определено ла­
бораторно изследване. За реализиране на т о з и
м е т о д следва да б ъ д а т установени актуалните
общи средства за т р у д , реактиви и консумат-
ви, както и за използваната апаратура при ре-
5. Очакван живот в години
6. Средни годишни разходи
за поддръжка
7. Средства за м о н т а ж
8. Оценяван период в дни ...
Крайна д а т а
Разход за едно изследване за оценявания период
Предполагаем
Реактиви Консумативи
разход за
в лева в лева
оборудването
Годишна заплата + Осигуровки
ализиране н а л а б о р а т о р н и т е изследвания.
На т а б л . 1.2 е п р е д с т а в е н а примерна схе­
м а за п р е с м я т а н е р а з х о д и т е за изследвани­
я т а , направени с а н а л и з а т о р а „X".
Попълването н а I раздел ( А п а р а т ) включва
внасяне н а необходимите данни за а п а р а т а , след
к о е т о съобразно срока н а оценявания период се
изчислява средния разход по обезценка н а апа­
р а т а , з а м о н т а ж и поддръжка з а едно
изследване. А л г о р и т ъ м ъ т при попълване н а II
раздел (Директни разходи за материали) включва
внасяне н а поименен списък н а изследванията,
к о и т о се а н а л и з и р а т с а н а л и з а т о р а ,Д", общия
им брой за оценявания период, разходите за едно
изследване з а р е а к т и в и , к о н с у м а т и в и и
оборудване. П о п ъ л в а н е т о н а раздел III (Труд)
изисква предварителна информация за дейнос­
т и т е свързани с всяко едно изследване, к а к т о и
за з а п л а т и т е , вкл. и осигуровките на л и ц а т а
реализиращи и з с л е д в а н и я т а . В п и с в а т се
м и н у т и т е за всеки вид изследване за о т д е л н и т е
т р и е т а п а и годишните з а п л а т и за всяка
к а т е г о р и я персонал, у ч а с т в а щ в реализиране н а
т е з и анализи. Н а к р а я се изчислява разхода н а
т р у д за всеки п о к а з а т е л .
Лицето, к о е т о избира, предлага и прила­
га м е т о д и т е за п р е с м я т а н е на продажни­
т е цени е р ъ к о в о д и т е л я т н а лаборатория­
т а . Тези м е т о д и в а р и р а т з н а ч и т е л н о по
с в о я т а сложност. Най-правилно би било да
се избере т о з и м е т о д , к о й т о включва всич­
ки ресурси, необходими з а реализиране на из­
в ъ р ш в а н и т е анализи.
Разходи Разходи
1. Р а з х о д и з а за р е а к т и в и за консумативи
материали
Брой на изследванията
М о г а т да б ъ д а т обособени седем м е т о ­
да за изчисляване н а п р о д а ж н а т а цена на
л а б о р а т о р н и т е анализи:
1. П р е с м я т а н е н а п р о д а ж н а т а цена при
включване н а максимална печалба.
2. П р е с м я т а н е н а п р о д а ж н а т а цена при
включване само на възвръщаемост на нап­
р а в е н и т е д и р е к т н и финансови разходи.
3. П р е с м я т а н е н а п р о д а ж н а т а ц е н а при
включване н а възвръщаемост и на инди­
р е к т н и т е разходи, направени за изслед­
ванията.
4. П р е с м я т а н е н а п р о д а ж н а т а цена при
включване на финансовите средства, ко­
и т о с ъ о т в е т с т в а т н а нормалния капа­
ц и т е т на л а б о р а т о р и я т а .
5. П р е с м я т а н е н а п р о д а ж н а т а цена при
включване на известен п р о ц е н т о т дирек­
т н и т е разходи.
6. П р е с м я т а н е н а п р о д а ж н а т а цена при
включване на всички финансови ресурси,
изразходвани за реализиране на лабора­
т о р н и т е изследвания.
7. П р е с м я т а н е н а п р о д а ж н а т а цена при из­
ползване на о т н о с и т е л н а т а с т о й н о с т на
л а б о р а т о р н и т е изследвания, к а т о ф а к т о ­
р ъ т р а б о т н а н а т о в а р е н о с т се взема под
внимание за всяко едно изследване.
Най-често се използват следните форму­
ли за п р е с м я т а н е на разходите за лабора­
т о р н и изследвания:
Разходи
за оборудване

2. Р а з х о д и Разходи за з а п л а т и 1 година 1 час М и н у т и за едно

за т р у д изследване
Години 2080 h бОмин.

Ц е н а т а , на к о я т о е Брой дни на
3. Р а з х о д и п о закупен а п а р а т а 1 година оценявания период
обезценка х
на а п а р а т а Предвиден ж и в о т на 365 дни Брой на изследванията
а п а р а т а в години за оценявания период

Общи разходи за поддръжка, Брой дни на

4. Р а з х о д и з а сервиз и възстановяване 1 година оценявания период
поддръжка — х
на а п а р а т а Предполагаем технически 365 дни Брой на изследванията
ж и в о т на а п а р а т а в години за оценявания период

Брой дни на
5. Р а з х о д и Разходи по м о н т а ж а 1 година оценявания период
по м о н т а ж 1 х —
на а п а р а т а Предполагаем технически 365 дни Брой на изследванията
ж и в о т на а п а р а т а в години за оценявания период
25
РЕШЕНИЕ " П Р О И З В Е Д И ИЛИ КУПИ!"
На ръководството на л а б о р а т о р и я т а се
пада о т г о в о р н о с т т а да реши, кога е целе­
съобразно определен т и п лабораторно изс­
ледване да бъде произвеждано в лаборато­
р и я т а или пък да бъде купувано о т друга
лаборатория. Обикновено т а к ъ в проблем
възниква, к о г а т о л а б о р а т о р и я т а има обо­
рудване, но няма к а п а ц и т е т а да го използ­
ва пълноценно или пък няма д о с т а т ъ ч н о
р а б о т н а ръка. Такава с и т у а ц и я може да
възникне, и ако няма необходимото оборуд­
ване, а клиничната п р а к т и к а налага необ­
х о д и м о с т т а о т подобно изследване. За взе­
мане на т а к о в а решение р ъ к о в о д с т в о т о
трябва;
• да сравни с р е д с т в а т а за извършване на
анализа с тези, които би изразходвало, ако
го купува;
• да оцени медицинската необходимост о т
т о в а изследване за клиничните звена, ко­
и т о ще го използват;
• да оцени и н ф о р м а т и в н а т а с т о й н о с т на
т о в а изследване;
• да прецени к а ч е с т в о т о на т о з и т и п изс­
ледвания, предлагани о т лабораториите,
които ги извършват;
• да обмисли т р а н с п о р т и р а н е т о и съхра­
няването на биологичния материал, как­
т о и получаването на р е з у л т а т и т е о т
изследването му.
Преди да се вземе решението т р я б в а да
се прецени дали с р е д с т в а т а , които са о т ­
пуснати на л а б о р а т о р и я т а позволяват ку­
пуването на т о з и вид анализи. Това изисква
преоценка на бюджета на лабораторията.
Ако нуждите н а л а г а т т о да бъде закупува­
но, т р я б в а да се изиска корекция в лабора­
торния бюджет.
Особенно важен момент при остойностя­
ване н а л а б о р а т о р н и т е изследвания е
оценката на р а б о т н а т а н а т о в а р е н о с т на
лабораторията.
ОТЧИТАНЕ НА РАБОТНАТА
НАТОВАРЕНОСТ
ЦЕЛИ И НАМЕРЕНИЯ
Ръководството на лабораторията т р я б в а
да разполага със способи, които да му поз­
воляват да взема ефективни решения о т -
26
носно с ъ щ е с т в у в а н е т о и р а з в и т и е т о на
клиничната лаборатория. Ценен помощник
за ц е л т а би бил един малък с т а т и с т и ч е с к и
„център" сформиран в л а б о р а т о р и я т а , в
който да работи с т а т и с т и к , но може да
работи и лаборант с познания по медицин­
ска с т а т и с т и к а . Такъв подход дава възмож­
н о с т на ръководството да използва получе­
н и т е данни о т центъра, вкл. данните за ка­
чествения контрол и р а б о т н а т а натоваре­
ност, за да прецени б ю д ж е т н и т е нужди на
клиничната лаборатория. Най-добре би било,
ако в с т а т и с т и ч е с к и я център wa лаборато­
р и я т а се и з п о л з в а т специализирани
компютърни програми за регистриране и
о т ч и т а н е на р а б о т н а т а натовареност. С
оглед на по-лесното събиране и регистрира­
не на д а н н и т е може да се ползват основни­
т е лабораторни отделения и сектори, на
които е структури ра н а лабораторията по
щ а т н о разписание - клинична химия, лабо­
р а т о р н а хематология и др. Лабораторната
н а т о в а р е н о с т може да бъде оценена за о т ­
делните с т р у к т у р и , но т о в а не изключва и
събиране на данните за ц я л а т а лаборато­
рия. Процесът на събиране на данни за ра­
б о т н а т а н а т о в а р е н о с т включва:
• изготвяне на поименен списък на подле­
ж а щ и т е за остойностяване лабораторни
процедури, подредени по азбучен ред в
списъка;
• определяне на е д и н и ц а т а лабораторна
процедура, к о я т о се получава о т време­
т о , необходимо за извършване на отдел­
н и т е е т а п и в лабораторното изследване.
Тези е т а п и са к а к т о следва:
Начин на обработка на пробата. Към т о з и
е т а п се включва събирането и получаване­
т о на биологичен материал, времето необ­
ходимо за с о р т и р а н е т о му, времето за не­
говото е ти кети ра н е, надписване и поста­
вяне на лабораторния номер, поставяне на
пробите в центрофугата и т я х н о т о изваж­
дане о т нея. Тук се включва времето за из­
работване на т ъ й нар. работен л и с т и дос­
т а в я н е т о на пробите до р а б о т н о т о мяс­
т о и т я х н о т о а п а р а т н о кодиране. Време­
т о за центрофугиране и т е р м о с т а т и р а н е
на пробите не се включва в единицата.
Време за изследване на биологичния мате­
риал. Това е времето за изследване на про­
б а т а , което включва нейното разреждане и
поставяне в а п а р а т а за о т ч и т а н е , отчи­
т а н е т о на п р о б а т а и н е й н о т о изваждане
о т апарата.
Време за записване и съобщаване на лабора­
торния резултат. Включва се в р е м е т о за
изчисляване н а р е з у л т а т а и записването му
върху специализирана л а б о р а т о р н а у ч е т н а
форма ( л а б о р а т о р е н журнал, е л е к т р о н е н
н о с и т е л и т . н . ) , п р о в е р к а т а з а достовер­
н о с т н а лабораторния р е з у л т а т , нанасяне­
т о н а р е з у л т а т а върху бланка, к о я т о се
предава на лекуващия лекар или на пациен­
т а . Към т о з и период се включва и в р е м е т о
за съобщаване н а с п е ш н и т е р е з у л т а т и по
телефона, к а к т о и в р е м е т о за телефонно
приемане н а з а я в к и т е з а лабораторни изс­
ледвания.
Време за подготовка н а изследването. В
т о з и е т а п се в к л ю ч в а т онези дейности, ко­
и т о се и з в ъ р ш в а т в р у т и н н а т а р а б о т а -
в р е м е т о необходимо з а възстановяване на
лиофилизираните с т а н д а р т и и контролни
материали, в р е м е т о за разреждане на с т а н ­
д а р т и т е , ако се и з п о л з в а т т а к и в а . Не се
включва в р е м е т о з а п о в т о р н о извършване
ч а изследванията. Ако л а б о р а т о р н и т е изс­
ледвания се и з в ъ р ш в а т о т а н а л и з а т о р се
включва в р е м е т о за т е м п е р и р а н е , калибри­
ране и почистване н а а н а л и з а т о р а .
Време за поддръжка и възстановяване н а
апарата. В т о з и и н т е р в а л се включва вре­
м е т о за планово поддържане на а п а р а т а ,
к а к т о и в р е м е т о з а по-малки, но предвари­
т е л н о планувани дейности по н е г о в а т а про­
филактика, извършвани о т ла б орат орн и я
персонал. Времето, к о е т о е необходимо за
по-големи р е м о н т и и профилактика, извър­
швани о т лица с инженерно-технически ценз
не се включва в т о з и е т а п .
Време за приготвяне н а реактиви и х и м и ­
кали. Включва се в р е м е т о за п ри г от вян е на
р е а к т и в и и р а з т в о р и в с а м а т а лаборато­
рия, к о и т о се използват за л а б о р а т о р н и т е
анализи.
В р е м е з а обработка н а л а б о р а т о р н а т а
стъклария. Включва се в р е м е т о за обработ­
ка, измиване, изсушаване и стерилизиране
на л а б о р а т о р н а т а с т ъ к л а р и я .
Време за качествен контрол. Към т о з и е т а п
се о т н а с я в р е м е т о за оценка на д а н н и т е о т
провеждания с и с т е м е н вътрелабораторен
качествен контрол, к а к т о и в р е м е т о за из­
работване на пробите о т к о н т р о л н и т е
м а т е р и а л и и с т а н д а р т и т е . Тези проби се
и з р а б о т в а т отделно и също им се дава еди­
ница с т о й н о с т , подобно н а изследваните
м а т е р и а л и о т пациенти. Серумните/реак­
т и в н и „празни" проби също се включват в
предварителния проучвателен период, но не
се т р е т и р а т к а т о о т д е л н а процедура.
Време за повторно и л и двойно изпълнение
на пробите. Тези т е р м и н и т р я б в а да б ъ д а т
правилно обяснени на персонала, с оглед пра­
вилното о т ч и т а н е на с ъ о т в е т н и т е дейнос­
т и , т ъ й к а т о т я х н о т о реализиране е също
е л е м е н т на р а б о т н а т а н а т о в а р е н о с т . Ла­
б о р а т о р н и я т персонал т р я б в а да знае, че
к о г а т о вследствие на възникнал проблем е
необходимо п р о б а т а да бъде изпълнена в т о ­
ри п ъ т е налице повторно изследване. Пов­
т о р е н и е т о на п р о б а т а в случая се записва
при о т ч и т а н е на р а б о т н а т а н а т о в а р е н о с т
в к о л о н а т а за к а ч е с т в е н и я контрол. При
някои т и п о в е изследвания се изисква двойно
изпълнение н а определен аналитичен е т а п
о т изследването. К о г а т о изпълнението
изисква множество анализи за всяка проба,
т о в а се нарича репродуктивен а н а л и з и
представлява ч а с т о т с а м о т о изследване.
В р емето за т о з и репродуктивен анализ се
включва в единицата обем време, к о й т о под­
лежи на проучване.
СЪБИРАНЕ НА НЕОБХОДИМИТЕ ДАННИ
ЗА ПРОЦЕСА НА ОСТОЙНОСТЯВАНЕ
НА ЛАБОРАТОРНИТЕ ИЗСЛЕДВАНИЯ
П р о ц е с ъ т по о с т о й н о с т я в а н е на лабора­
т о р н и т е изследвания може да бъде разде­
лен на ч е т и р и с т а д и я .
ИърМи с т а д и й - разделяне на клиничната
лаборатория на лабораторни секции. Цели
се по-подробно запознаване с д е й н о с т т а н а
о т д е л н и т е звена (секции), с к о е т о се улес­
нява о ц е н к а т а н а т я х н а т а производител­
н о с т и/или п р о и з в о д и т е л н о с т т а на всеки
работещ.
В т о р и с т а д и й - изготвяне списък на про­
цедурите, подлежащи на о с т о й н о с т я в а н е
във всяка о т предварително определените
27
секции.
Т р е т и с т а д и й - избор н а м е т о д з а о с т о й ­
н о с т я в а н е . П р о ц е д у р а т а по избор н а м е т о д
за о с т о й н о с т я в а н е зн ач и т е лн о се улеснява,
ако л а б о р а т о р и я т а е к о м п ю т е р и з и р а н а .
Въпреки к о п ю т е р и з а ц и я т а н а лаборатори­
я т а и н а л и ч и е т о н а с и с т е м а за о т ч и т а н е
са необходими и допълнителни д е й с т в и я за
процеса н а о с т о й н о с т я в а н е , з а щ о т о каква­
т о и да е с и с т е м а т а , т я р е г и с т р и р а преди
всичко общия брой анализи. Такова допълни­
т е л н о д е й с т в и е е изработването на работ­
н и листове. В р а б о т н и т е листове, изслед­
в а н и я т а м о г а т грубо да б ъ д а т разделени на
две к а т е г о р и и - изследвания, постъпили о т
с т а ц и о н а р а и о т извънстационарни паци­
е н т и . Към т я х следва д а се прибави изслед­
ването на с т а н д а р т и т е и контролните
м а т е р и а л и , п о в т о р е н и е т о н а някои изслед­
вания, с п е ш н и т е и р е ф е р е н т н и т е анализи,
изследвания о т други здравни заведения и
други "категории" изследвания, к о и т о мо­
г а т д а п о д п о м о г н а т о т ч и т а н е т о н а обема
н а р а б о т а н а к л и н и ч н а т а лаборатория. Ра­
б о т н и т е л и с т о в е м о г а т д а се п о п ъ л в а т
ръчно и след т о в а д а н н и т е да б ъ д а т обра­
б о т в а н и с к о м п ю т ъ р . Такива р а б о т н и лис­
т о в е следва да се п о п ъ л в а т във всяка лабо­
р а т о р н а секция о т определено з а ц е л т а
лице.
Ч е т в ъ р т и с т а д и й - п р е с м я т а н е и суми­
ране н а с ъ б р а н и т е данни. Д а н н и т е обикно-
венно се с у м и р а т за едномесечен и н т е р в а л .
Ако е необходима п о - ч е с т а информация з а
р а б о т н а т а натовареност на отделните
секции, д а н н и т е м о г а т да се с ъ б и р а т еже­
седмично, н а две или т р и седмици и т . н . След
к а т о се с ъ б е р а т д а н н и т е о т всички секции
се и з г о т в я и н ф о р м а ц и я т а з а ц я л а т а лабо­
р а т о р и я . О т т е з и данни р ъ к о в о д с т в о т о н а
л а б о р а т о р и я т а може д а оцени производи­
т е л н о с т т а н а всяка секция, к а к т о и произ­
в о д и т е л н о с т т а н а всеки р а б о т е щ в лабора­
т о р н а т а секция.
Ц е л т а н а о с т о й н о с т я в а н е т о н а лаборатор­
н и т е услуги е да б ъ д а т определени финансови­
т е средства, к о и т о се изразходват за реалзира-
не н а извършените изследвания. Тази информа­
ция е крайно необходима за процеса на оценка,
планиране и к о н т р о л н а финансовите ресурси с
оглед н а т я х н о т о ефективно използване. Друго
важно значение н а о с т о й н о с т я в а н е т о е осигу­
ряване на информация с оглед възстановяване
28
н а с р е д с т в а т а , к о и т о с а изразходвани за лабо­
р а т о р н и услуги. Най-често се приема, че основ­
н и я т п р о д у к т н а л а б о р а т о р и я т а е лабо­
раторното изследване. С р е д с т в а т а за
закупуването н а т о з и п р о д у к т би т р я б в а л о да
покриват както директните, т а к а и
и н д и р е к т н и т е разходи за произвеждането му.
Поради промени в ц е н и т е н а л а б о р а т о р н и т е
реактиви и консумативи, т о и цените на
лабораторния продукт ще в а р и р а т във времето.
Сравнително справедлив и безпристрас­
т е н м е т о д за остойностяване на лабора­
торния продукт е определянето на релатив-
н а т а единица стойност. Това е п а р и ч н а т а
стойност разпределена на базата на средс­
твата, които са свързани с подсигуряване­
т о на е д н а е д и н и ц а р е л а т и в е н л а б о р а -
т о р н п р о д у к т . В случая т я представля­
ва стандарт з а определяне н а необходими­
т е финансови средства. Ако допуснем, че
с р е д с т в а т а за т р у д за една м и н у т а са рав­
ни н а 0.1 лв, а в р е м е т о необходимо за изра­
б о т в а н е т о н а даден лабораторен п р о д у к т
е 20 м и н у т и , т о т е з и 20 м и н у т и ще с т р у ­
в а т 2.0 лева. Не т р я б в а да забравя, че цени­
т е н а л а б о р а т о р н и т е услуги включват не
само с р е д с т в а т а з а т р у д , но също т а к а и
други разходи.
МЕТОДИ ЗА ОСТОЙНОСТЯВАНЕ
НА ЛАБОРАТОРНИТЕ УСЛУГИ
А. С т ъ п а л о Н и д е н м е т о д з а о с т о й н о с ­
т я в а н е н а л а б о р а т о р н и т е услуги. Този
м е т о д е особенно удобен за о с т о й н о с т я в а ­
не н а л а б о р а т о р н и т е изследвания в болнич­
н и т е лаборатории. З а неговото прилагане
са неоходими данни и информация, к о и т о
ръководството на лабораторията трябва
да получи о т болничния мениджър. М е т о ­
д ъ т включва седем с т ъ п к и :
1. У с т а н о в я в а н е н а л а б о р а т о р н и т е
р а з х о д и - д и р е к т н и и и н д и р е к т н и . Ръ­
к о в о д с т в о т о т р я б в а да има информация з а
о б щ и т е разходи н а л а б о р а т о р и я т а . Необхо­
дима е информация и за н е й н и т е приходи. В
т а з и информация т р я б в а да има данни за
т о в а , не салю колко „спестява „ лаборато­
рията, но и за размера н а н е й н а т а печал­
ба. Д о голяма степен о т т о з и т и п инфор-
лгацип зависи ефективността н а у п ­
равление н а клиничната лаборато­
р и я . В т о з и а с п е к т пред р ъ к о в о д с т в о т о
с т о я т за решаване задачи с висока финан­
сова з н а ч и м о с т .
2. О п р е д е л я н е н а ц е н о в и т е ц е н т р о в е в
л а б о р а т о р и я т а . Принципно в лаборато­
р и я т а има два т и п а „центрове" :
• ц е н т р о в е , к о и т о п р о д у ц и р а т приходи,
напр. секция по клинична химия, лабора­
т о р н а х е м а т о л о г и я и др.,
• центрове, к о и т о не п р о д у ц и р а т приходи,
напр. а д м и н и с т р а ц и я на л а б о р а т о р и я т а ,
обслужващ персонал и др.
3. П р е с м я т а н е н а т р у д о в о т о в ъ з н а г ­
раждениен а работещитев лаборато­
р и я т а ( в с е к ц и я т а ! . Най-често с р е д с т ­
в а т а за т р у д о в о възнаграждение в лабора­
т о р и я т а (при пазарни условия) са около 50-
60% о т о б щ и т е разходи н а л а б о р а т о р и я т а .
За да се у с т а н о в я т р е а л н и т е разходи за
т р у д т р я б в а да бъде у т о ч н е н броя на пер­
сонала, к о й т о р а б о т и в л а б о р а т о р и я т а .
Освен т о в а р ъ к о в о д с т в о т о на лаборатори­
я т а т р я б в а добре да познава м е т о д и т е за
формиране н а т р у д о в о т о възнаграждение,
компенсационните му механизми, к а к т о и
управлението н а финансовите с р е д с т в а за
заплащане н а положения т р у д . Екипът, кой­
т о извършва о с т о й н о с т я в а н е т о т р я б в а да
знае, че з а п л а щ а н е т о н а т р у д а в лаборато­
р и я т а се с ъ с т о и о т две с ъ с т а в к и - неком-
пенсационна и компенсационна.
З а п л а т а т а на р а б о т е щ и я е само една ч а с т
о т т р у д о в о т о му възнаграждения и се о т н а с я
към некомпенсаиионната с ъ с т а в к а на трудо­
в о т о възнаграждение. Иекомпенсационната със­
тавка е ф а к т о р , к о й т о о т р а з я в а р а б о т н а т а
с и т у а ц и я . I.R.Henderson с ч и т а , че о с н о в н и т е
елементи определящи некомпенсационната със­
т а в к а на р а з п л а щ а т е л н а т а с и с т е м а са: задо­
в о л с т в о о т и з в ъ р ш е н а т а р а б о т а ; физическо
здраве; психологична и емоционална з р я л о с т ;
к о н с т р у к т и в и з ъ м ; добри в з а и м о о т н о ш е н и я
между р а б о т е щ и т е ; наличие н а д о с т а т ъ ч н о
ресурси за изпълнението на т р у д о в и т е задачи
и др.
Компенсационната съставка на т р у д о в о т о
възнаграждение се базира на о ц е н к а т а по опре­
делени критерии. Тези критерии т р я б в а да са
максимално обективни и да п р е д о с т а в я т въз­
м о ж н о с т за реалистично определяне размера на
р а б о т н и т е компенсации. Най-често се използ­
в а т следните критерии:
• с т е п е н на квалификация на р а б о т е щ и т е в ла­
бораторията,
• м я с т о в служебната иерархия на лаборатори­
я т а (размерът на компенсациите за лаборант
и с т а р ш и л а б о р а н т т р я б в а да е различен),
• качество на извършваните о т л а б о р а н т и т е
изследвания,
• с т е п е н на професионални сръчности и умения,
• с т е п е н на о т г о в о р н о с т при изпълнение на
т р у д о в и т е задължения,
• наличие на значителен професионален о п и т ,
• спазване на условията за б е з о п а с т н о с т в про­
цеса на извършваната лабораторна дейност.
В крайна с м е т к а при определяне размера на
компенсациите се прави о п и т да се оцени с т о й ­
н о с т т а на „качествения'1, на „активния" човек
р а б о т е щ в л а б о р а т о р и я т а . Разбира се по-лесно
при о с т о й н о с т я в а н е т о би било, ако т е з и данни
„някой ги определи", "някой ги фиксира" и т е не
т ъ р п я т промени. В п а з а р н и у с л о в и я т о в а е
н е л ь и с л и л ю и т р у д н о AioJce д а б ъ д е р е а л и ­
зирано.
4. П р е с л ь я т а н е н а с р е д с т в а т а з а обо­
р у д в а н е н а л а б о р а т о р и я т а . Разходите
на с р е д с т в а за к а п и т а л н и вложения на ла­
б о р а т о р и я т а включват изразходваните
с р е д с т в а за покупка на а п а р а т у р а т а , взе­
м а н е т о ü за ползване на лизинг или чрез рен­
т а , с р е д с т в а т а за поддръжка и възстано­
вяване на оборудването и др. В повечето
случаи т е з и разходи са д о с т а високи и изис­
к в а т по-голям п р о ц е н т на възвръщаемост
на вложените средства. П р е с м я т а н е т о на
обезценката най-често се извършва по спе­
циални таблици, к о и т о в повечето случаи
не се а к т у а л и з и р а т а д е к в а т н о във време­
т о . Когато оборудването се поддържа чрез
абонаментни договори, цената на тази под­
дръжка е обикновенно 10 % от средствата,
изразходени за закупуването на апарату­
рата. За някои по-големи а п а р а т и този
процент може да бъде и около 15 %.
5. П р е с м я т а н е н а с р е д с т в а т а з а з а к у ­
пуване н а реактиви и лабораторни
к о н с у л г а т и в и . Към т е з и разходи се о т н а ­
с я т финансовите средства, к о и т о се израз­
х о д в а т за закупуване на реактиви, т е с т о ­
ве и консумативи за изследване, офисни кон­
сумативи, разходите за счетоводния и друг
вид персонал, ако има т а к ъ в в лаборатори­
я т а . В т о з и раздел се о т н а с я т разходите
за поддръжка на к о м п ю т ъ р н а т а мрежа (сис­
т е м а ) , ако има т а к а в а в л а б о р а т о р и я т а ,
к а к т о и разходите за закупуване на м а т е -
29
риали за о б р а б о т к а и стерилизиране н а ла­
б о р а т о р н а т а с т ъ к л а р и я и nocyga.
6. Р а з п р е д е л е н и е н а о б щ о б о л н и ч н и т е
р а з х о д и . С р е д с т в а т а за наеми, поддръж­
ка н а с г р а д и т е и други комунално б и т о в и
нужди се р а з п р е д е л я т н а л а б о р а т о р и я т а
най-често н а б а з а т а н а п л о щ т а , н а к о я т о е
разположена л а б о р а т о р и я т а . Не са рядко
случаите, к о г а т о болничното ръководство
о т д е л я или определя повече с р е д с т в а за ла­
б о р а т о р и я т а , т ъ й к а т о р а з ч и т а на т я х ­
н а т а реална в ъ з връщае мос т о т лаб ора т о ­
р и я т а за по к р а т ъ к период о т време.
7. Р а з х о д и з а х р а н а И л а б о р а т о р и я т а .
Най-често т е се п р е с м я т а т на б а з а т а брой
персонал.
Други разходи, напр. за покупка н а фишо­
ве (бланки) или пък друг т и п а д м и н и с т р а ­
т и в н и разходи също м о г а т да б ъ д а т вклю­
чени в т о з и раздел.
Б. Mukpoiviemocju з а о с т о й н о с т я в а н е
п а л а б о р а т о р и и т е у с л у г и . Ежедневно
р ъ к о в о д с т в о т о на л а б о р а т о р и я т а получа­
ва п л е т о р а о т информация за: о т р а б о т е ­
н и т е часове, р а з х о д и т е н а финансови сред­
с т в а з а т р у д , консумативни м а т е р и а л и и
др. С и с т е м а т и з и р а н е т о и о б р а б о т к а т а н а
т а з и информация е о т с ъще ст ве н о значе­
ние за н е й н о т о анализиране и оценка с оглед
в з е м а н е т о н а бързи и а д е к в а т н и управлен-
чески решения.
О б щ и т е разходи з а едно лабораторно из­
следване м о г а т да б ъ д а т п р е с м е т н а т и по
много п р о с т и е л е м е н т а р е н н а ч и н чрез
а р и т м е т и ч е н сбор н а п р е к и т е и непреки
разходи за труд, н а преките и непреки раз­
ходи за реактиви и консумативи, средст­
вата за оборудване и др., т . е . н а р а з х о д и т е
по реализирзнето му.
Преки разходи за труд. Тук се включват раз­
х о д и т е н а финансови с р е д с т в а з а т р у д а ,
положен о т лабораторния персонал при ре­
ализиране н а изследването. Този разход може
да бъде получен чрез разделяне н а годишни­
т е разходи за труд (фонд работна з а п л а т а )
на годишния брой извършени анализи. Полу­
ч е н и я т разход е д и р е к т н и я разход н а
финансови средства за труд, необходим за
реализирането н а едно лабораторно
изследване.
30
Непреки разходи за труд. Това са средства­
т а , к о и т о се изразходват за заплащане н а
положения т р у д о т лабораторния персонал,
к о й т о подпомага изпълнението н а лабора­
т о р н и т е изследвания. Тези средства се прес­
м я т а т к а т о общите индиректни разходи
за тр уд се разделят на броя на анализите.
Преки разходи за апаратура. В т о з и раздел
се о т н а с я т разходите за а п а р а т у р а т а , с
к о я т о се и з в ъ р ш в а т анализите. Този разход
се п р е с м я т а , к а т о ц е н а т а на с ъ о т в е т н и я
вид а п а р а т у р а ( о т ч и т а щ и а п а р а т и или
анализатори) се раздели н а срока н а амор­
т и з а ц и я (7, респ. 5 г.) за намиране с т о й н о с т ­
т а за 1 година и след т о в а - н а брой анализи,
к о и т о се и з в ъ р ш в а т с д а д е н и я а п а р а т
годишно.
Преки разходи за реактиви и консумативи.
В т о з и раздел се о т н а с я т д и р е к т н и т е раз­
ходи за р е а к т и в и и консумативи, к о и т о са
пряко свързани с реализиране н а лаборатор­
н и т е изследвания. Д и р е к т н и я т разход за
едно изследване се получава к а т о директни­
т е разходи за реактиви и консумативи се
раздели на общия брой направени анализи.
Р ъ к о в о д и т е л я т на л а б о р а т о р и я т а т р я б ­
ва да вземе решение в два случая: 1) к о г а т о
са закупени р е а к т и в и за дадено изследване,
но т е не са оползотворени (не са били годни,
или не е реализирано с ъ щ о т о т о в а изследва­
не през г о д и н а т а ) и 2) к о г а т о през година­
т а не са закупувани определени реактиви,
но изследването е реализирано с р е а к т и в и
о с т а н а л и о т минали години, подарени, за
и з п и т в а н е и др.
Непреки разходи за материали. Те включ­
в а т разходите, к о и т о са направени за обо­
рудването и за т е з и консумативи, к о и т о не
с а д и р е к т н о свързани с изпълнението н а
л а б о р а т о р н и т е изследвания. Към т о з и раз­
дел се причисляват разходите за компютър­
н и т е с и с т е м и , ц е н т р о ф у г и т е , хладилници­
т е сушилните, офисното оборудване на ла­
б о р а т о р н о т о звено и друг т и п спомагател­
ни консумативни материали. Разходите за
едно изследване се получават к а т о общите
индиректни разходи за м а т е р и а л и се раз­
делят на броя на направените изследвания.
Непреките разходи за консумативи може
д а се изчислят като от общите годишни
разходи за консумативи се приспаднат об-
щите преки разходи, направени през същия
период.
Общоболнични разходи. Те в к л ю ч в а т разхо­
д и т е на болничното заведение за комунал­
но-битови услуги и нужди, за п о д д р ъ ж к а т а
на с г р а д и т е , а д м и н и с т р а т и в н и разходи и
др. В т о з и раздел се включва и п е ч а л б а т а н а
болничното заведение, ако т е з и спечелени
с р е д с т в а се и з п о л з в а т за покриване на нуж­
ди, свързани с р а б о т а т а на болничното за­
ведение. При един о т подходите за у с т а н о ­
вяване влиянието н а общоболничните раз­
ходи върху ц е н а т а н а едно лабораторно из­
следване, болничното ръководство предос­
т а в я определен ф а к т о р , по к о й т о се умно­
ж а в а т о б щ и т е разходи н а л а б о р а т о р и я т а .
Съществува и друг подход, при к о й т о бол­
н и ч н о т о ръководство определя фиксирана
сума, к о я т о л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да въз­
върне. В т о з и а с п е к т в л и я н и е т о н а общо­
болничните с р е д с т в а върху ц е н а т а на едно
л а б о р а т о р н о изследване се у с т а н о в я в а т ,
к а т о д е л ъ т на общоболничните разходи,
падащ се на лабораторията, се раздели на
общия брой извършени а н а л и з и .
О т изложеното до т у к може да се напра­
ви с л е д н а т а примерна и обобщена клацифи-
кация на разходите:
{
Реактиви + консумативи (lO'X ) — ^ ИромснлиИи
Ц
Труд (24%)
Капитални вложения (6%)
I
Консумативи (10%)
/П о сто я н н и (90%)
' н а т р у д о в о т о възнаграждение би т р я б в а л о да
Труд (48%)
Капитални вложения (2%)
ПОДХОДИ ЗА ОЦЕНКА НА РАБОТНАТА
НАТОВАРЕНОСТ НА ЛАБОРАТОРИЯТА
Наи-добрият начин з а оценка на р а б о т н а ­
т а н а т о в а р е н о с т е да се и з р а б о т я т прав-
дободобни с т а н д а р т и за оценка на лабора­
т о р н а т а а к т и в н о с т . Т а к ъ в ecjun с т а н ­
д а р т е да се определи п р о и з в о д и т е л н о с т ­
т а н а к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я . По
принцип е особено т р у д н о да се п о с т и г н е
"идеална производителност". Това изисква
всеки ръководител на лаборатория да опре­
дели приемлива производителност на лабо­
р а т о р и я т а , к о я т о ръководи, т ъ й к а т о
н и т о една лаборатория не е еднаква по сво­
я т а дейност с други лаборатории.
П р о и з в о д и т е л н о с т т а на л а б о р а т о р и я т а
може сравнително лесно да бъде оценена, ако
т я се обвърже със зап л ащан ето на човеко­
час, на реално о т р а б о т е н и т е часове и на
специфични човеко-часове.
Според M.E.Travers л а б о р а т о р н а т а произво­
д и т е л н о с т е два вида -оперативна и финансова
производителност. D.W.Glenn предлага следни­
т е подвидове лабораторна производителност -
производителност на плащанията, трудова
производителност, и специфична производител­
ност.
Производителност п а плащанията.
Ако приемем, че една р а б о т н а лабораторна
единица е равна на 1 м и н у т а , т о н я м а лич­
н о с т , к о я т о да има производителност о т
60 р а б о т н и единици/час, т . е . да има 100%
н а т о в а р е н о с т . Времето, к о е т о не се о т р а ­
б о т в а е обикновено 1 0 - 2 0 % о т о б щ о т о вре­
ме за заплащане.
П р о и з в о д и т е л н о с т т а н а п л а щ а н е т о ще за­
виси о т п ъ л н о ц е н н о т о у п о л з о т в о р я в а н е н а ра­
б о т н о т о време, з а п л а щ а н е т о н а о т с ъ с т в и я т а
о т р а б о т а , з а п л а щ а н е т о н а п р а з н и ц и т е , зап­
л а щ а н е т о н а о т с ъ с т в и я по б о л е с т , с л у ж е б н и т е
о т п у с к и , о т с ъ с т в и я при обучаване н а персонала,
о т с ъ с т в и я з а решаване н а лични въпроси, и за­
д ъ л ж и т е л н о о т реално о т р а б о т е н и т е о т лиие-
т о часове. При п о л а г а н е т о н а т р у д извън опре­
д е л е н о т о о т н о р м а т и в н и т е а к т о в е време, т о
т о й т р я б в а д а се заплаща, к а т о н а всеки 1 час
извънреден т р у д се включва в р е м е т о , к о е т о не
се о т р а б о т в а т . е . 20-30 м и н у т и . При формиране
се в з е м е предвид ц я л о т о време - и
продуктивното, и непродуктивното.
Производителността на плащането
може лесно да бъде п р е с м е т н а т а по следна­
т а формула:
Производителност Обем на р а б о т а
на плащането Общ брой часобе
за заплащане
П р о и з в о д и т е л н о с т т а н а п л а щ а н е т о дава
в ъ з м о ж н о с т д а се преиени дали всеки р а б о т е щ
заслужава о п р е д е л е н о т о м у т р у д о в о възнаграж­
дение. З а п р е с м я т а н е н а п р о д у к т и в н о с т т а н а
п л а щ а н е т о з а в с я к а л а б о р а т о р н а секиия е необ­
ходимо р ъ к о в о д с т в о т о д а разпредели в р е м е т о
з а в с я к а секиия (подобно н а с т ъ п к о в и я м е т о д
за остойностяване).
П а й - ч е с т о м е д и а н а т а н а п л а щ а н е т о е о т 34-
31
36 изследвания на платен час за обикновенните
болниии и 31-35 изследвания на платен час за бол-
ниии, в които се ивършва обучение. Ръководст­
в а т а на някои лаборатории проявяват склон­
н о с т да п р е д с т а в я т специфичната продуктив­
н о с т к а т о работна продуктивност. Целта на
т о з и а к т е да оправдаят неприемливата за т я х ­
н а т а лаборатория производителност на плаща­
нето.
Т р у д о в а п р о и з в о д и т е л н о с т . Всички ре­
ално о т р а б о т е н и часове са равни на всички
платени часове минус всички н е о т р а б о т е -
ни п л а т е н и часове, т . е . всички п л а т е н и
о т с ъ с т в и я , болнични и др.
Трудовата производителност може да бъде
изчислена по следната формула:
Трудова Общ брой изследвания
производителност Общо о т р а б о т е н и
часове
Трудовата производителност е по-висо­
ка о т производителността на плащането,
т ъ й к а т о общо о т р а б о т е н и т е часове са по-
малко о т часовете, к о и т о се з а п л а щ а т .
С т р е м е ж ъ т на л а б о р а т о р и и т е да извър­
т а т по-голям брой изследвания на п л а т е н
час п о с т а в я под въпрос, какво ще е качест­
в о т о на т е з и изследвания. О ц е н к а т а на
т р у д о в а т а производителност е начин да се
оцени каква е р а б о т а т а на лабораторията.
С п е ц и ф и ч н а п р о и з в о д и т е л н о с т . При
оценката на т о з и т и п производителност
в з е м а т участие следните елементи:
• а д м и н и с т р а т и в н и действия, к о и т о са
свързани със събиране на данни за работ­
н а т а н а т о в а р е н о с т и т я х н а т а последва­
ща с т а т и с т и ч е с к а обработка;
• процесът на изготвяне на бюджета, на
р а б о т н и т е графици, остойностяване на
л а б о р а т о р н и т е изследвания, анализ на
п о с т а в е н и т е задачи и др.;
• обяд- и кафе-паузи, регламентирани със
с ъ о т в е т н и нормативни документи;
• времето за закупуване на реактиви и кон­
сумативи;
• компютърни дейности;
32
• счетоводни, съобщителни и други дейнос­
т и свързани с д е й н о с т т а на клиничната
лаборатория;
• научно изследователска дейност;
• преподавателска дейност;
• лабораторни срещи, участие в симпозиу­
ми, конгреси и др.;
• и н с т р у к т а ж и по безопасност на т р у д а в
л а б о р а т о р и я т а и др.;
• изготвяне на рапорти, регистриране на
данни и др.
Всички т е з и дейности не се включват във
времето, необходимо за извърщване на изс­
ледванията.
Специфичната производителност може
да бъде п р е с м е т н а т а по следната форму­
ла:
Общ б р о й
Специфична _ изследбаиия
производителност о б щ брой
специф. часове
Ако специфичната производителност е твър­
де висока и няма грешки в о т ч и т а н е т о на ра­
б о т н а т а натовареност, ръководството на ла­
б о р а т о р и я т а може да се принуди да вземе ре­
шение за нейното намаляване с оглед подобря­
ване к а ч е с т в о т о на лабораторните услуги.
З а к л ю ч е н и е . Убеден съм, че лабораторни­
т е специалисти след к а т о се запознаят с
начините за остойностяване на лаборатор­
н и т е услуги ще си з а д а д а т следните въпро­
си: „Защо е необходимо лекарят да познава
тези проблеми?", "Не са л и излишни тези
познания в областта на финансите и цено-
образуваннето след като икономистите
много добре ги познават?", "Не е л и по-ра-
зумно икономистите да се занимават с
тези проблеми, а лекарите да вършат това,
за което са у ч и л и ?"и мн. други. Не т р я б в а
да се забравя, че медицината също е бизнес,
и т о з и който иска да просперира в т о з и биз­
нес освен медицинските познания, к о и т о
има т р я б в а добре да познава и т е з и пробле­
ми.
Книгопис
Broughton P. Clinical laboratory management - IFCC course,
Sofia, 1992.
Takemura Y, Ishida H, Inoue Y, Beck JR. Common diagnostic
test panels for clinical evaluation o f new primary care outpa­
tients in Japan: A cost-effectiveness evaluation. Clin Chem,
45, 1999, 10, 1752-1761.
Tilton RC, Martincich M. laboratory organization and manage­
ment. In: Tilton R. Balows A, Hohnadel D, Reiss R (eds).
Clinical laboratory medicine. St. Louis-Baltimore - Boston -
London - Philadelphia - Sydney - T o r o n t o , Mosby Year Book,
1992, 2-12.
Vonderschmitt DJ. Laboratory management. In: Vonderschmitt
D J (ed). Laboratory Organzation. Automation. Berlin - New
York, W. de Gruyter, 1991, 1-40.
Young DS, Sachais BS, Jefferies LC. The cost o f disease. Clin
Chem, 46. 2000, 7, 955-966.
Young DS , Sachais BS, Jefferies LC. Laboratory costs in the
context o f disease. Clin Chem. 46. 2000, 7, 967-975.
* * *
Адамов В. Теоретически основи иа финансите. В: Теория на
финансите. Академично издателство - Свищов. 1995. 38-
62.
Адамов В. Източници на финансови средства и методи за
акумулирането им в бюджета. В: Теория на финансите.
Академично издателство Свищов, 1995, 132-147.
Гладилов С. Икономическата наука. Икономиката като прак­
тическа дейност. В: Икономика на здравеопазването, С ,
График консулт ООД, 1998, 10-14.
Гладилов С. Ресурси на здравеопазването. Работен потенци­
ал. В: Икономика на здравеопазването, С , График кон­
султ ООД, 1998, 123-128.
Делчева Е. Въведение в икономическата теория. В: Здравна­
та реформа в България, I част, С , Македония прес, 1997,
109-123.
Делчева Е. Икономиката в здравеопазването като научна дис­
циплина. В: Здравната реформа в България, I част, Со­
фия, Македония прес, 1997, 125-135.
Делчева Е. Икономически анализ в здравеопазването. В:
Здравната реформа в България, I част, С., Македония прес,
1997, 136-144.
Попов Д. Финанси и кредит, София. Издателство Век - 22,
1990.
Clark ТК. Financial management o f the Clinical laboratory. In:
Clinical Diagnosis Management/By Laboratory methods,
Henry JB (ed), USA, W B Saunders Company, 1991, 1321-
1328.
Travers ME. Managing laboratory costs. In: Clinical laboratory
medicine. Mc Clatchy KD (ed), USA. Williams & Wilkins a
Waverly Company, 1994, 12-33.
* * *
Делчева Е. Пазарна система; търсене, предлагане, цени. В:
Икономика на здравеопазването, С , График консулт ООД,
1998, 56-58.
Делчева Е. Цени и такси в здравеопазването. В: Икономика
на здравеопазването, С., График консулт ООД, 1998,195-
206.
Berkowitz NE. Pricing: Arriving at the Final Price. In: Market­
ing. Boston. IRWIN, Homewood, USA, 1989, 311-339.
Berkowitz NE. Pricing & Relating objectives to revenues and
costs. In: Marketing. Boston, IRWIN. Homewood. 1989,283-
309.
Traves ME.Cost Accouting. Pricig strategies. Cost control and
Cost Avoidance. In: Clinical laboratory medicine, McClatchey
KD (ed), Williams & Wilkins, Waverly Company, USA, 1994,
22-33.
Glen WD. Laboratory Cost-Accounting and Work-load analysis.
In; Administration and supervision in laboratory medicine.
Philadelphia, Lippincott J В Company, 1989, 457-475.
33
 Осигуряване на безопасни
условия за работа
в клиничната лаборатория
Т. Цветкова
Б е з о п а с н о с т т а н а р а б о т а 6 к л и н и ч н а т а ла­
б о р а т о р и я е юридическо и морално задъл­
жение н а р а б о т о д а т е л я и н а прекия ръко­
водител. У нас т о з и въпрос о т ч а с т и е уре­
ден съгласно Наредба No 13/ДВ, бр. 52 о т
28.06.1994 г., н а М и н и с т е р с т в о т о н а здра­
веопазването. Н а б а з а т а на т а з и наредба,
н а с ъ о т в е т н и т е служебни бюлетини, как­
т о и въз основа н а п р а в и л а т а , изисквани­
я т а и устройството на лабораторната
д е й н о с т във водещи с т р а н и , във всяка ла­
боратория следва стриктно да се опишат,
регламентират и спазват процедурите,
осигуряващи безопасност на персонал, па-
и и е н т и , с т у д е н т и , с п е и и а л и з а н т и и дру­
ги п о с е т и т е л и .
ОБЩИ ПРАВИЛА ЗА РАБОТА
В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИИ
Нравилата за р а б о т а в клиничната лабора­
т о р и я включват следните общи положения;
1. В р а б о т н и т е л а б о р а т о р н и помещения
н е с е д о п у с к а т Нъншни лица. Нри де-
м о н с т р а и и и пред с т у д е н т и или други
обучаващи се т о в а с т а в а само с прид­
ружител, о т г о в а р я щ за с ъ о т в е т н о т о
упражнение/демонстрация.
2. П е р с о н а л ъ т в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я
у ч а с т в а в р а б о т н и я процес з а д ъ л ж и ­
т е л н о е р а б о т н о облекло, р ъ к а б и ц и
и
ЯРУ«111 cpecjcmBa з а з а щ и т а (пред­
пазни очила, маски и др.) съобразно рис­
ка. О б у в к и т е т р я б в а д а б ъ д а т з а т в о ­
рени и с нисък т о к .
Желателно е върху работното облекло да се
носи идентификационна к а р т а (баджо) с името
на лицето и звеното, в което работи.
3. По време н а р а б о т а всички в р а т и н а ра­
б о т н и т е помещения т р я б в а да б ъ д а т
затворени.
34
Следва да се п о с т а в я т к л и м а т и ц и как­
т о за поддържане н а необходимата за фун­
кциониране н а а п а р а т у р а т а т е м п е р а т у ­
ра, т а к а и за осигуряване на комфортни ус­
ловия и за персонал, и з а п а ц и е н т и (в амбу­
л а т о р н и т е помещения).
4. Не се допуска и з л и з а н е н а п е р с о н а л а
и з б ъ н л а б о р а т о р и я т а с ъ с специал­
н о т о р а б о т н о облекло.
5. Лица о т персонала с дълга коса следва да
с ъ б л ю д а в а т т я д а б ъ д е п р и б р а н а , а не
р а з п у с н а т а , за да не влиза в допир с про­
б и т е , р а б о т н и т е плотове или пък с ро­
т о р и , или други движещи се ч а с т и н а
апаратите.
6. Не т р я б в а да се н о с я т украшения (грив­
ни, верижки и т . н . ) , з а к о и т о е възмо­
жен к о н т а к т с р а б о т н а т а повърхност,
движещи се модули и т . н .
7. Не се допуска х р а н е н е , п и е н е , п у ш е н е ,
к а к т о и гримиране в лабораторните
помещения освен в м е с т а т а , определе­
ни за т а з и цел.
Р ъ к о в о д с т в о т о н а к л и н и ч н а т а лабора­
т о р и я следва д а направи необходимото за
осигуряване н а п о м е щ е н и е / я з а хигиенни
цели (баня) и за почивка н а персонала с хла­
дилник, к о т л о н , микровълнова фурна, лег­
ло и др. б и т о в о оборудване.
8. В з е м а н е т о н а кръв или друг биологичен
м а т е р и а л за изследване с т а в а с а м о с ъ с
средства за еднократна употреба.
9. Получените проби о т клиничните звена
или о т друго здравно заведение се разо­
п а к о в а т о т л а б о р а т о р н и я персонал н а
специално, определено з а ц е л т а м е с т о
(приемна л а б о р а т о р и я ) к а т о с ъ о т в е т ­
н и т е лица р а б о т я т з а д ъ л ж и т е л н о с
ръкавици.
Ю.Не се допуска п и п е т и р а н е с у с т а при
р а б о т а с инфекциозен или потенциално
 инфекциозен м а т е р и а л , к а к т о и н а хи­
мически р а з т в о р и . Следва да се р а б о т и
само с а В т о м а т и ч н и n u n e m u , tjuc-
п е н с о р и или с т ъ к л е н и n u n e m u с п а ­
м у ч н и в т у л к и , г у м е н б а л о н или удъл­
ж и т е л (мундщук).
11.Всеки новопостъпил н а р а б о т а в клинич­
н а т а л а б о р а т о р и я т р я б б а д а б ъ д е за­
п о з н а т с о с н о в н и т е п р а б и л а з а бе­
з о п а с н о с т о т о т г о В о р н о т о з а цел­
т а лице. Ц е л и я т персонал подлежи н а
периодичен о п р е с н и т е л е н инструк­
таж.
БИОЛОГИЧНО ОБЕЗОПАСЯВАНЕ
> Персоналът в клиничните лаборатории
се с ч и т а з а високорискова група за ин­
фекция с HBV, HIV или други професио­
нално свързани заболявания. Д о б р а т а
п р а к т и к а изисква всеки биологичен ма­
т е р и а л - кръв или друга т е л е с н а т е ч н о с т
(екскрети, с е к р е т и или т ъ к а н е н м а т е ­
риал) да се т р е т и р а к а т о потенциално
опасен. З а д ъ л ж и т е л н о т о използване н а
затворената система за вземане, тран­
спорт и съхранение на биологичен мате­
риал cüeikya до минимум д и р е к т н и я кон­
т а к т на р а б о т е щ и т е с биологичен ма­
териал.
За л и ч н а т а безопасност н а персонала се
осигурява необходимото р а б о т н о облекло,
к о е т о се сменя с ч и с т о поне два п ъ т и сед­
мично, а при необходимост и по-често. Из­
п р а щ а н е т о му в ц е н т р а л и з и р а н а пералня
(дезинфекция, пране, автоклавиране, гладе­
не) дава необходимата сигурност.
Л а б о р а т о р и я т а следва да разполага с гар­
деробно помещение, к ъ д е т о да бъде осигу­
рено р а з д е л н о с ъ х р а н е н и е на ли ч н от о о т
р а б о т н о т о облекло.
>- След приключване н а р а б о т а т а р а б о т ­
н и т е м е с т а и помещения се п о ч и с т в а т
и дезинфекцират, к а т о се р а б о т и с ръ­
кавици. Р а б о т н и т е п л о т о в е се забърс­
в а т и дезинфекцират два до т р и п ъ т и
през р а б о т н и я цикъл. И з п о л з В а н и т е
м а т е р и а л и з а п о ч и с т В а н е и дезин­
фекция с е изхВърлит з а изгаряне
или д е з и н ф е к ц и р а т и п р и б и р а т .
>• Ц е н т р о ф у г а т а и ц е н т р о ф у г и р а н е т о е
сериозен и з т о ч н и к н а инфекция, ако не
се с п а з в а т с ъ о т в е т н и т е правила за ра­
бота: редовно п о ч и с т В а н е и дезин-
фекця на гнездата и Вътрешната
повърхност на капаците, центро­
ф у г и р а н е с а м о п р и з а т в о р е н а цен­
т р о ф у г а ( п р е д о т в р а т я в а се разпръск­
ване на образуваните аерозоли).
> В л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да бъде осигу­
рено а д е к в а т н о н а с в е т о в н и т е норми и
хигиенните предписания изхвърляне н а
о т п а д ъ ц и т е - т е ч н и и твърди. Преди из­
хвърляне о т п а д ъ ч н и т е м а т е р и а л и се
обеззаразяват чрез накисване в дезинфек­
ционен р а з т в о р или а в т о к л а в и р а н е . В
здравни заведения, разполагащи с крема-
т о р и у м г о р и м и т е т в ъ р д и о т п а д ъ ц и се
с ъ б и р а т в добре завързани полиетилено­
ви т о р б и , след к о е т о се и з п р а щ а т за из­
гаряне. Важно е п р и и з б о р н а з а т в о ­
р е н а с и с т е л г а з а в з е л ш н е п а биоло­
гичен м а т е р и а л да се предпочете
т а к ъ в п р о и з в о д и т е л , к о й т о осигу­
р яв а пълна г о р и м о с т н а п р о д у к т а ,
Вкл. и н а и г л и т е - и з г а р я н е д о СОо и
Н 2 0, б е з д и м и м и р и з м а , б е з с т о п я ­
в а н е и "заливане" н а с к а р и т е в кре-
маториума.
Много удобни са к о н т е й н е р и т е , предла­
гани о т фирмите-производители на зат­
ворена система за биологичен материал,
к о и т о о с и г у р я в а т лесно о т д е л я н е (без да
се докосват) и г л и т е след венозна процеду­
ра, к о е т о предпазва о т к о н т а к т , к а к т о и
о т убождане.
Лко болничното заведение не разполага
с крематориум, на с м е т и щ а т а н е бива
да п о п а д а т необеззаразени твърди
отпадъци о т клиничната лаборато­
рия.
Т е ч н и т е о т п а д ъ ц и ( о с т а т ъ ц и о т ури­
на, кръв, извършени проби с урина, о т п а ­
дъчна т е ч н о с т о т а н а л и з а т о р и т е ) задъл­
ж и т е л н о с е с ъ б и р а т в с ъ д с предвари­
т е л н о п о с т а в е н к о н ц е н т р и р а н дезин­
ф е к ц и о н е н р а з т в о р , с л е д к о е т о с е из­
хвърлят в канализацията.
Процедурите за т р е т и р а н е на всеки вид
о т п а д ъ к или за о т п а д ъ ц и т е о т отделни­
т е р а б о т н и м е с т а т р я б в а да б ъ д а т д е ­
т а й л н о о п и с а н и , р а з г л е д а н и с персо-
нал,а и с т р и к т н о с п а з в а н и . (Правилник
35

/ ф
BIOHAZARD
in c a s e o f thiniiigc o r l e a k a g e
immediately notify
public health a u t h o r i t y /
Фиг. 2.1. Международно възприет символ, означа­
ващ биологично опасен (инфеюдиозен) материал
за хигиена на труда и техническа безопас­
ност в лабораторията).
> В случай, че се налага изпращане на био­
логичен м а т е р и а л з а изследване в друго
селище или държава т р я б в а да б ъ д а т взе­
т и с ъ о т в е т н и т е мерки з а осигуряване
н а необходимата т е м п е р а т у р а , к а к т о и
подходяща опаковка.
При т р а н с п о р т н а инфекциозен м а т е р и ­
ал т о в а следва д а бъде о т б е л я з а н о чрез
международно в ъ з п р и е т и я символ з а обоз­
начаване н а биологично опасен м а т е р и а л
(фиг. 2.1), к о й т о задължително се п о с т а в я
върху о п а к о в к а т а .
Поведение п р и и н ц и д е н т и
• При з а ц а п в а н е н а р а б о т н о т о облек­
л о с и н ф е к ц и о з е н и л и д р у г биологи­
чен л ш т е р и а л т о се C O C L J U I незабавно,
н а к и с в а се в дезинфекционен р а з т в о р
и се и з п р а щ а з а и з п и р а н е / а в т оЛ а в и ­
ране. В лабораторията трябва д а
и л ш д о с т а т ъ ч е н брой р ъ к а в и ц и з а р а ­
ботещите.
• При р а з к ъ с в а н е и л и с р я з в а н е н а р ъ ка­
в и ц и т е т е с е с в а л я т в е д н а г а и ръце­
т е се излгиват с в о д а и с а п у н , с л е д
което и с дезинфекционен р а з т в о р .
На м е с т а т а за измиване т р я б в а да и м а
миещ п р е п а р а т ( т е ч е н или т в ъ р д ) , да е оси­
гурена т о п л а и с т у д е н а вода, индивидуал­
ни (еднократни кърпи) или ролки с х а р т и я
за бърсане н а ръце, к а к т о и флакони с под­
36
ходящ дезинфекционен р а з т в о р .
• При убоЖдане и л и порязване р а н а ­
т а се и з м и в а с вода и с а п у н и се де­
з и н ф е к ц и р а съ с 70% е т и л о в с п и р т ,
след което се поставя подходяща
превръзка.
• При п о п а д а н е н а б и о л о г и ч е н м а т е ­
р и а л в о ч и т е в е д н а г а с е н а к а п в а 1%
р а з т в о р н а сребърен нитрат; п р и
п о п а д а н е в н о с а с е н а к а п в а 1% р а з ­
твор на протаргол; п р и попадане в
у с т а т а - т я с е и з п л а к в а с ъ с 70%
етилов спирт.
Лично р ъ к о в о д и т е л я т н а л аб о р ато р и я ­
т а / о т г о в о р н о т о лице з а д ъ л ж и т е л н о оси­
гурява т е з и р а з т в о р и в п о м е щ е н и я т а , в
к о и т о се р а б о т и с биологичен м а т е р и а л ,
следи за срока н а г о д н о с т и периодичната
им подмяна с пресни.
• При и н ц и д е н т с ъ с с ъ м н и т е л е н з а
HIV м а т е р и а л р ъ к о в о д и т е л я т н а
л а б о р а т о р и я т а е з а д ъ л ж е н д а оси­
г у р и н а пострадалия серологично
и з с л е д в а н е з а HIV в е д н а г а с л е д инци­
д е н т а , с л е д 6 седл г ици и 3 м е с е ц а ,
а к о н е м о ж е д а с е и з я с н и състояни­
ето на заразеност н а източника н а
п р о б а т а . При и н ц и д е н т с м а т е р и ­
а л о т П 1 У - п о л о Л и т е л н о л и ц е , изс­
л е д в а н е т о продължава д о 1 година
след инцидента. Пострадалият се
п о с т а в я п о д льедицинско наблюде­
ние з а един м а к с и м а л е н инкубаци­
онен период.
О т с ъ щ е с т в е н о значение за л и ч н а т а бе­
з о п а с н о с т н а персонала е неговото имуни­
зиране срещу вирусен х е п а т и т т и п ''ЕТ, ко­
е т о се осигурява о т р а б о т о д а т е л я .
• При р а з л и в а н е н а б и о л о г и ч е н м а т е ­
р и а л по повърхността н а работния
плот, п о а п а р а т у р а и др. с л е д в а не­
з а б а в н о т о м у п о к р и в а н е с абсорби­
р а щ а к ъ р п а и з а л и в а н е с дезинфек­
ционен р а з т в о р з а 30 min. Използва­
н а т а кърпа се изхвърля при други­
т е твърди отпадъци, а лшетото се
д е з и н ф е к ц и р а п о в т о р н о чрез забър-
сване, к а т о п р е з ц я л о т о в р е м е се р а­
боти с ръкавици.
ИОЖАРООБЕЗОПАСЯВАНЕ
За редица анализи 6 клиничната лаборато­
рия се използват горими и лесно запалими
течности. Съществува и потенциална
опасност о т електрозапалване, а също и о т
запалване на някои отпадъци при р а б о т а .
Горенето е химическа реакция, к о я т о
включва бързо окисление на запалими ма­
териали или горива с последващо освобож­
даване на т о пл ина и светлина. В клинич­
н а т а лаборатория са налице всички необ­
ходими елементи за възникване на пожар -
горими материали, топлинен източник или
т а к ъ в на искри и кислород (въздух). Прие­
ма се, че е налице и още един - ч е т в ъ р т и
фактор - верижна реакция, при к о я т о въз­
никва горене, к о е т о продължава и дори се
усилва. Тя се причинява о т разграждане или
пренареждане на молекули, к о и т о п р а в я т
даден материал запалим при съприкоснове­
ние с кислорода на а т м о с ф е р а т а . Обобще­
но т е з и елементи са представени схема­
т и ч н о чрез т ъ й нар. тетраедър на пожар
(фиг. 2.2). Този модел показва, че възниква­
н е т о на пожар би могло да бъде предотвра­
т е н о или т а к ъ в да бъде потушен чрез о т ­
страняване на един о т ч е т и р и т е основни
елемента.
Фиг. 2.2. Т е т р а е д ъ р н а огъня - е л е м е н т и , к о и т о
м о г а т да п р и ч и н я т пожар в л а б о р а т о р и я т а ( я о
S. Conner)
Пожароопасните м а т е р и а л и / п р и ч и н и
м о г а т да се разделят в четири класа, спо­
ред е с т е с т в о т о на запалимия материал и
изискванията за потушаване при пожар.
• Клас А - обикновени горими твърди ма­
териали к а т о х а р т и я , дървен материал,
пластмаса и тъкани. Гасенето с т а в а или
с вода под налягане или с универсален по­
жарогасител (със сух химикал), предназ­
начен за АВС-клас.
• К л а с В - запалими т е ч н о с т и , газове и за­
палими петролни продукти. Г асен ето
с т а в а или с универсален пожарогасител
( з а АВС-клас), или с СОз ( з а ВС-клас)
• К л а с С - електромедицинска/лаборатор­
на техника. Потушаването с т а в а с по­
жарогасител (за ВС или АВС-клас). Ни­
кога н е с е г а с и с Вода, т ъ й к а т о т я е
проводник на електрически т о к !
• К л а с 1) - запалими реактивоспособни ме­
т а л и , к а т о магнезий, н а т р и й и калий.
Потушаването с т а в а к а т о горящата
смес се покрие със специален сух прах,
т ъ й нар. ' 'Metal-x", съдържащ т е р м о -
пластично вещество, с ч и я т о помощ се
образува твърдо покритие над горящия
обект. Може да се посипе и с пясък.
Доброто познаване на т е з и 4 т и п а по­
жароопасни материали предполага разпо­
лагането на о т д е л н и т е видове пожарога­
сители в близост на с ъ о т в е т н и т е работ­
ни м е с т а .
З а п а л и м и В е щ е с т В а . В р у т и н н а т а лабо­
ратори я за много химически процедури се
ползват различни рискови химикали, кои­
т о м о г а т да предизвикат пожар или експ­
лозия. Според т о ч к а т а на възпламеняване­
т о им, при к о я т о образуват избухлива смес
с въздуха, т е се разделят на два вида: л е с ­
н о з а п а л и л г и , к о и т о и м а т т о ч к а на въз­
пламеняване под 37.8 0С и з а п а л и л ш , кои­
т о се възпламеняват над 37.8 0С. Запалими
т е ч н о с т и са: а ц е т о н , е т а н о л , х е п т а н ,
изопропанол, метанол, толуол, ксилол и др.
Към т е з и химикали се включват и някои
газове и твърди вещества, напр. парафин.
Основните причини за пожар в лабора­
т о р и и т е са небрежност, л и п с а и а д о с ­
т а т ъ ч н и познапим п р и използване н а
определени х и м и к а л и , невнилгателно
извършени процедури, свръхнатовар-
в а н е н а е л е к т р и ч е с к а т а лгреЖа и н а ­
личие н а открит пламък.
П е р и о д и ч н о т о о б у ч е и и е н а персона­
ла п о В ъ п р о с и т е н а о б е з о п а с я в а н е м о ­
ж е д а п р е д п а з и о т п о ж а р и д р у г и ин­
ц и д е н т и . Лабораторният персонал
т р я б в а д а б ъ д е обучаВан ч р е з проВеж-
д а н е н а т р е н и р о в к и з а п о л з в а н е н а по­
ж а р о г а с и т е л и т е , к а к т о и з а насоче-
37
пи д е й с т в и я п р и симулиране и а по­
жар.
ПоНедение п р и п о ж а р
• В случай, че се появи пожар, т р я б в а да се
д е й с т в а според р а з р а б о т е н и я и сведен до
з н а н и е т о н а персонала план, к о й т о
включва н а ч и н н а а л а р м и р а н е , п о ­
викване н а помощ и н а ч а л н и дейс­
твия.
Да не се забравя, че и з т и ч а ценно време,
ако т о се губи в неуспешен о п и т за п о т у ­
шаване н а пожара и едва след к а т о се у с т а ­
нови, че не е възможно с п р а в я н е т о със соб­
с т в е н и сили се вика помош,-
• Основните стъпки, съгласно схема­
т а з а поведение включват:
1. Изнасяне и спасяване н а п о с т р а д а л и
и/или з а с т р а ш е н и .
2. Алармиране н а работеидшпе за възник­
нал пожар (по в ъ з п р и е т а т а с и с т е м а
в плана).
3. Изолиране н а помеидението с избухнал
пожар чрез з а т в а р я н е н а в р а т а т а .
4. И з в и к в а н е н а п р о т и в о п о ж а р н а т а
служба.
5. Предприемане о п и т и з а п о т у ш а в а н е
н а пожара.
6. Евакуация н а персонала.
ЕЛЕКТРООБЕЗОПАСЯВАНЕ
Р и с к ъ т о т електрически т о к може да бъде
д и р е к т е н - токов удар или изгаряне и ин­
д и р е к т е н - пожар и / и л и експлозия. По о т ­
ношение н а оборудването с електромеди­
цинска (лабораторна) а п а р а т у р а се препо­
р ъ ч в а т предпазни мерки и процедури, кои­
т о о п е р а т о р ъ т или р а б о т е г ц и т е т р я б в а
с т р и к т н о да спазват:
>• В рискова а т м о с ф е р а да се използва са­
мо устойчиво н а експлозия електрообо­
рудване.
> Изключително внимание се изисква при
р а б о т а с високоволтажно оборудване.
>• Да се използват само праВилно з а з е м е ­
н и а п а р а т и (съгласно и н с т р у к ц и и т е
н а производителя).
> Да се проверява за " п р о т р и т и " кабели з а
38
електрически т о к , к о и т о незабавно да се
п о д м е н я т след у с т а н о в я в а н е т о им.
>• Да се докладва з а всяко нарушение във
ф у н к ц и я т а н а а п а р а т у р а т а и се следи
за н е з а б а В н о о т с т р а н я В а н е н а поВ-
редата.
>• Да не се р а б о т и с "Жив", т.е. "удрящ с
т о к" е л е к т р о у р е д .
>• Никога да не се р а б о т и по електроуреди­
т е с влажни ръце.
>• Да се познава т о ч н о т о разположение н а
о т д е л н и т е р а б о т н и м е с т а върху к о н т ­
р о л н о то електрическо т а б л о .
>• Да се п о л з в а т само одобрени о т специа­
л и с т и т е връзки, а не свръхнатоварени
вериги.
> Да се о с и г у р я в а т с и с т е м н и п р о ф и л а к ­
тични проверки и поддръЖка н а
контактите и електрическата
лгрежа в л а б о р а т о р и я т а .
ХИМИЧЕСКА БЕЗОПАСНОСТ
В к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я ежедневно се
п о л з в а т голям брой р е а к т и в и и химикали,
к о и т о са потенционално рискови ф а к т о р и
за з д р а в е т о н а р а б о т е ш и т е или с токсич­
ния си е ф е к т , или чрез физическо, или био­
логично въздействие. Химическите веидес-
т в а - су б стан ц и и и т е ч н и р е а к т и в и м о г а т
да б ъ д а т категоризирани в няколко групи:
• КорозиВни - химикали с pH <2 или >12.5.
В т а з и к а т е г о р и я с а включени киселини
и основи.
• Т о к с и ч н и с у б с т а н ц и и - отрови, задуш-
ливи и дразнеши.
• К а н ц е р о г е н н и - м о г а т да п р и ч и н я т ра­
кови заболявания.
• М у т а г е н н и и т е р а т о г е н н и - м о г а т да
п р и ч и н я т хромозомни аберации или вро­
дени малформации.
• П о ж а р о о п а с н и - възпламеняваши се и
запалими.
• Р е а к т и В о с п о с о б н и - експлозивни и
окислители.
Международно п р и е т и т е символи за т я х ­
н о т о означаване са представени на фиг. 2.3.
За п ъ л н о т а на с ъ ш а т а фигура е представен
и знака за радиоактивни вешества.
 explosive
Дä
oxidizing flammahlc toxic
X
A.4
\sW ^
X
harmful to t h e
corrosive radiation
environment
Фиг. 2.3. Международно възприети символи, из­
ползвани за означаване на вещества с опасно въз­
действие
>• К о р о з и В и и т е х и м и к а л и п р и ч и н я в а т
при допир видима д е с т р у к ц и я н а човеш­
к и т е т ъ к а н и . Някои о т н а й - ч е с т о из­
п о л з в а н и т е корозиви в л а б о р а т о р и и т е
са концентрирани киселини - HCl, H 2 S0 4 ,
HNO3, СН3СООН и др. или основи - NH4OH,
NaOH, КОН и др. Тези в е щ е с т в а м о г а т
да п р и ч и н я т увреждания не само при ди­
р е к т е н к о н т а к т , но и при вдишване на
п а р и т е им.
>• Т о к с и ч н и т е х и м и к а л и включват о т ­
р о в и , д р а з н е щ и и з а д у ш л и в и Нсщсс
т в а и р а з т в о р и . Те не д е й с т в а т дирек­
т н о н а ч о в е ш к и т е т ъ к а н и , а чрез пов­
л и я в а н е н а м е т а б о л и т н и т е процеси.
П о с т ъ п в а т в човешкия организъм чрез
храна, вдишване или абсорбция през ко­
жата.
>• К а н ц е р о г е н н и х и м и к а л и - п о т е н ц и ­
ални или с ъ м н и т е л н и канцерогени след­
ва да б ъ д а т с ъ о т в е т н о маркирани и с
т я х да се р а б о т и само с подходящи лич­
ни предпазни с р е д с т в а . Към г р у п а т а на
к а н ц е р о г е н и т е се о т н а с я т : х л о р л г с -
т и л - л г с т и л о в е т е р , N-numpogujxie-
т и л а м и и , б е и з п и р е и , 4-ал1ипобифе-
и и л , б е п з и д и п , I - п а ф т и л а м и и , 2-
п а ф т и л а л г и п , 4-11итробифеиил, бен­
зол, е т и л е н и м и п , р - д и м е т и л а л т -
иоазобепзол, б и е - х л о р м е т и л о в етер,
о - т о л у и д и п и др. Формалдехидът съ­
що се с ч и т а к а т о потенциален канцеро­
ген. Освен с п а з в а н е т о н а п р е д п а з н и т е
мерки за р а б о т а с т е з и канцерогенни ве­
щ е с т в а т р я б в а да се т ъ р с я т ИъзлюЖ-
н о с т и з а з а м я н а т а и м /f л а б о р а ­
т о р н и т е п р о ц е д у р и е д р у г и подхо­
д я щ и х и м и к а л и без вреден ефект.
М у т а г е н н и т е и т е р а т о г е н н и т е хи­
м и к а л и са опасни за репродукцията, т ъ й
к а т о и м а т потенциала да п р и ч и н я т невъз­
в р а т и м и увреждания или л е т а л и т е т на бъ­
дещи генерации. Преди забременяване, му-
т а г е н и т е м о г а т да п р и ч и н я т хромозом-
ни м у т а ц и и и г е н е т и ч н о д а и н д у ц и р а т
вродени проблеми. Ако к о н т а к т и т е с т е з и
в е щ е с т в а са след забременяване т е м о г а т
да б ъ д а т причина за в ъ т р е у т р о б н а с м ъ р т
или малформации. По принцип бременните
служителки в клиничната лаборатория
т р я б в а да се у с т р о й в а т н а безопасни ра­
ботни места.
> П о ж а р о о п а с н и х и м и к а л и - способ­
н о с т т а н а т е з и химически в е щ е с т в а да
предизвикат пожар се определя о т т я х ­
н а т а т о ч к а на възпламеняване (вж по-
горе). Т о ч к а т а н а в ъ з п л а м е н я в а н е е
най-ниеката телтература, при
която се натрупват достатъчно
пари за образуване н а взривна смес
върху повърхността н а течност­
т а . П р и с ъ с т в и е т о на топлинен и з т о ч ­
ник може да причини възпламеняване. Та­
къв и з т о ч н и к може да бъде и електри­
ческа искра, искра о т с т а т и ч н о е л е к т ­
ричество или о т к р и т пламък. Пай-голе-
м и я т риск за пожар о т запалими т е ч ­
н о с т и в л а б о р а т о р и я т а е неправилното
им съхранение. В л а б о р а т о р и я т а т р я б ­
ва подробно д а с е р а з р а б о т я т и из­
п ъ л н я в а т и н с т р у к ц и и т е з а съхра­
нение н а опасните вещества.
• Основното правило, к о е т о т р я б в а да се
спазва е д а с е н а м а л я т з а п а л и м и т е
т е ч н о с т и д о к о л и ч е с т в о о к о л о 500
nil, а к о т е с а в с т ъ к л е н и к о н т е й н е ­
ри, а о с т а н а л а т а част д а с е с к л а
д и р а в противопоЛарно обезопасен
шкаф/изолирано помещение.
• Пожароопасните в е щ е с т в а никога н е би­
в а д а с е с к л а д и р а т в х л а д и л н и к , ос­
вен ако т о й е определен о т производите­
ля к а т о устойчив на експлозия, и к о й т о
има електрически ключ извън помещени­
е т о , в к о е т о е хладилника.
• К о г а т о се използват запалими в е щ е с т ­
ва, н а б л и з о н е т р я б в а д а илга и з т о ч ­
ници н а топлина и л и н а електри­
чески искри.
• З а п а л и м и т е в е щ е с т в а н е т р я б в а д а бъ-
39
 g a m п р е л и в а н и в д р у г к о н т е й н е р , за­
щото турбуленцията на веществото
може да генерира с т а т и ч н о електричес­
т в о . Това т р я б в а д а с т а в а чрез фуния,
ч и и т о връх е н а т о п е н в т е ч н о с т т а н а
приемащия съд,
> Р е а к т и В о с п о е о б н и х и м и к а л и - включ­
в а т експлозивни химикали, т . е . т а к и в а
к о и т о бързо се р а з г р а ж д а т , при к о е т о
се получава енергия, причиняваща експ­
лозия. П и к р и н о в а т а киселина н а п р . в
к р и с т а л н а т а си форма е силен експлозив
при удар. Към т а з и група се о т н а с я т и
съединения, к о и т о и м а т молекулна
с т р у к т у р а с висока реактивоспособ-
н о с т . М о г а т да б ъ д а т окислители, с ви­
соко съдържание н а кислород или съеди­
нения с редоксигрупи (хидразин, хидрок-
силамин); съединения, к о и т о бурно реа­
г и р а т с вода или влажен въздух (напр.
м е т а л н и хидридиУ, пирофорни съедине­
ния, к о и т о р е а г и р а т с п о н т а н н о с въз­
духа или съединения, к о и т о о б р а з у в а т
пероксиди и след определен период с е
п р е в р ъ щ а т в експлозиви {диетилов
етер).
Р а б о т а с опасии химически
ВещестВа
Важно изискване е да се п о л з в а т лични за­
щ и т н и с р е д с т в а при боравене с химикали
(гумена п р е с т и л к а , предпазни очила, мас­
ка, ръкавици и др.), чрез к о е т о силно се на­
малява риска о т увреждания.
Съхранение н а х и м и ч е с к и т е
ВещестВа
• Всички химикали - в първични или в т о ­
рични съдове т р я б в а да б ъ д а т със след­
н и т е обозначения върху е т и к е т а н а съ­
да - шие, х и л г и ч е е к а ф о р м у л а , л ю л е -
к у л н а лгаса, ч и с т о т а , опасност.
Производителите обикновено п о с т а в я т
върху е т и к е т а международно възприе­
т и т е символи според х а р а к т е р а н а ве­
ществото.
• Много важно е правилното съхранение н а
х и м и ч е с к и т е в е щ е с т в а . Най-общо т е
т р я б в а да се с ъ х р а н я в а т в просторни по­
40
мещения и д а с а далеч о т топлинен из­
то чн и к . Не б и в а д а с е п о д р е Ж д а т н а
в и с о ч и н а н а д н и в о т о н а очите. О т ­
д е л н и т е химикали не т р я б в а да се под­
р е ж д а т само по азбучен ред, т ъ й к а т о
и м а несъвлгсстильи noAiejkgy с и х и ­
м и ч е с к и съединения. В о т д е л н и т е по
вид групи подреждането им може да бъ­
де по азбучен ред. Неорганичните вещес­
т в а т р я б в а да се с ъ х р а н я в а т отделно о т
о р г а н и ч н и т е . Н е о р г а н и ч н и т е киселини
може да б ъ д а т в едно помещение с изк­
л ю ч е н и е н а а з о т н а т а к и с е л и н а . Тя
т р я б в а да бъде изолирана о т останали­
т е киселини. О ц е т н а т а киселина може
да се съхранява в близост до неорганич­
ни киселини.
З а п а л и т е л н и т е химикали т р я б в а да се
с ъ х р а н я в а т в хладилни и пожарообезопасе-
ни помещения.
• Токсичните химикали следва да се съхра­
н я в а т в и з к л ю ч и т е л н о с и г у р н и по­
м е щ е н и я , добре вентилирани. К о н т е й ­
н е р и т е да б ъ д а т с я с н о л ш р к и р а н и
е т и к е т и о т н о с н о х а р а к т е р а н а ве­
ществото. С ъ х р а н я в а н е т о им т р я б в а
да с т а в а о тд ел н о о т киселини и окисли­
т е л и . В т о р и ч н и т е контейнери не се сва­
л я т , т ъ й к а т о т е п р е д п а з в а т химика­
л и т е о т евентуално счупване на първич­
н а т а опаковка или о т и з т и ч а н е (изпаря­
ване), особено ако с у б с т а н ц и я т а е силно
т о к с и ч н а или канцерогенна. За ред т о к ­
сични в е щ е с т в а се иска специално разре­
шение о т с ъ о т в е т н и т е специални служ­
би к а т о се о п р е д е л я т л и ц а т а , к о и т о
са отговорн и з а изразходването и м .
Те се с ъ х р а н я в а т в надеждно заключени
помещения, най-добре в м е т а л н и каси.
Бурно р е а г и р а щ и т е с вода химикали -
н а т р и й , калий, м е т а л н и хидриди т р я б в а да
са изолирани о т о с т а н а л и т е химически ве­
щ е с т в а и да се с ъ х р а н я в а т в суха среда, без
и з т о ч н и ц и з а овлажняване.
Мерки при разлиВане/разсипВане
на химически ВещестВа
В к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я т р я б в а да има
предварително п о д г о т в е н п л а н за почис­
т в а н е в случай н а разливане (течни) или
разсипване { с у х и ) н а химически в е щ е с т в а .
Този план следва д а бъде консултиран и съг­
ласуван със с ъ о т в е т н и т е специализирани
органи за п о в е д е н и е т о при т а к и в а инци­
д е н т и , за необходимото оборудване и по­
ч и с т в а щ и процедури.
• При разливане н а концентрирани кисели­
ни или основи, преди п о ч и с т в а н е т о , вни­
м а т е л н о се о п и т в а р а з р е ж д а н е с вода.
М е с т о т о т р я б в а д а се покрие с н е у т р а -
лизатори, к а т о н а т р и е в б и к а р б о н а т за
киселини или борна киселина з а основи.
След т о в а се предприема абсорбиране с
предназначените з а ц е л т а "гъби" или аб­
сорбиращ м а т е р и а л , след к о е т о т е се из­
х в ъ р л я т според и н с т р у к ц и и т е . Н а к р а я
п о в ъ р х н о с т т а се п о ч и с т в а със сапун и
вода.
• При разсипване н а р а з т в о р и т е л не се до­
бавя вода или р а з р е д и т е л и не се допуска
и з т и ч а н е т о м у в к а н а л и з а ц и я т а . След
попиването му с абсорбиращ м а т е р и а л ,
последният т р я б в а да се з а т в о р и в кон­
т е й н е р , за да се п р е д о т в р а т и изпарява­
не н а а б с о р б и р а н а т а т е ч н о с т .
Ж е л а т е л н о е л а б о р а т о р и я т а да разпола­
га с т ъ р г о в с к и набори, съдържащи н е у т ­
рализиращи и абсорбиращи в е щ е с т в а и м а ­
териали.
О т с т р а н я в а н е и изхвърляне
н а omnacji>4iiu х и м и ч е с к и в е щ е с т в а
• Най-общо, с а м о малки к о л и ч е с т в а (под
100 ml) о т в о д н о р а з т в о р и м и химически
о т п а д ъ ц и м о г а т да б ъ д а т изхвърлени в
канализацията.
• Някои р е а к т и в и , с ъ д ъ р ж а щ и н а т р и е в
азид, м о г а т да р е а г и р а т с оловни или мед­
ни т р ъ б и до формиране н а силноекспло-
зивни м е т а л н и азиди. Ако о т п а д ъ ц и т е
се изхвърлят в к а н а л и з а ц и я т а е необхо­
димо обилно измиване с голямо количес­
т в о вода, за да се п р е д о т в р а т и свързва­
н е т о на азида.
• Запалими и възпламеняващи се т е ч н о с ­
т и к а т о ксилол, е т е р , азиди, пероксиди,
а също и т а к и в а , съдържащи живак или
други т е ж к и м е т а л и не т р я б в а да се из­
х в ъ р л я т в к а н а л и з а ц и я т а . При възмож­
н о с т за т а к о в а изхвърляне задължител­
но д а с с о с и г у р я в а п р о л ш в а н е с н а й -
лгалко 100-кратно по-голялю коли­
ч е с т в о в о д а , с п р я л ю х и л г и к а л а . Ка­
н а л и з а ц и я т а т р я б в а да води към пречис­
твателна станция.
• За унищожаване н а химикали с и з т е к ъ л
срок н а г о д н о с т следва да се проведе кон­
с у л т а ц и я със с ъ о т в е т н и т е специализи­
рани служби. Преди у н и щ о ж а в а н е т о им
не бива да се с м е с в а т о т д е л н и т е хими­
кали, а т р я б в а да се п а з я т в т е х н и т е ин­
дивидуални опаковки. Силно реактивос-
пособни в е щ е с т в а т р я б в а да се и н а к т и -
в и р а т посредством други, подходящи за
ц е л т а съединения.
ОБЕЗОПАСЯВАНЕ ПРИ РАБОТА
С ГАЗ ПОД НАЛЯГАНЕ
В к л и н и ч н а т а лаборатория ч е с т о се нала­
га извършване на анализи, за к о и т о се из­
п о л з в а т различни видове газ под налягане.
Някои о т т я х с ъ д ъ р ж а т опасен за здраве­
т о и ж и в о т а газ {пропан, пропан-бутан,
ацетилен и т . н . ) , а други - газ, к о й т о ди­
р е к т н о не е опасен {въздух), но и д в а т а ви­
да бутилки, съхраняващи газ под налягане
м о г а т да б ъ д а т изключително опасни - при
определени условия цилиндрите се превръ­
щ а т в "торпедо", к о е т о може да пробие до­
ри т у х л е н а с т е н а , ако се "откъсне" главния
вентил. С п а з в а т се следните правила:
• Когато се използва запалим газ т р я б в а да
се п р е д п о ч и т а т бутилки с най-малък раз­
мер, к а т о на р а б о т н о т о м я с т о се о с т а в я
само една бутилка.
• Основно прави^ю, к о е т о не бива да се заб­
равя е, че газовите бутилки никога не би­
ва да се съхраняват в м е с т а със запалими
и избухливи вещества. Те т р я б в а да се гру­
п и р а т по вида на съдържащия се в т я х газ
и да се съхраняват в добре проветриви по­
мещения, предназначени специално за цел­
т а . Такова помещение т р я б в а да осигуря­
ва устойчивост срещу огън поне до два ча­
са.
• К а к т о при ползване, т а к а и при съхране­
ние цилиндрите т р я б в а да са изправени и
прикрепени с верига или с друго подходя­
що средство към с т е н а т а , за да се пред­
п а з я т о т падане и откъсване на вентила.
41
• Добре е б у т и л к а т а , к о я т о се ползва да бъ­
де извън л а б о р а т о р н о т о помещение.
• При т р а н с п о р т задължително се ползва
предпазна капачка за вентила. К о г а т о бу­
т и л к а т а не се ползва, в е н т и л ъ т т р я б в а
да бъде добре затворен.
КРИОГЕННИ ВЕЩЕСТВА
Една о т най-широко използваните криоген­
ни т е ч н о с т и ( в т е ч н е н газ) в лаборатория­
т а е т е ч н и я т а з о т . О п а с н о с т и т е , свърза­
ни с използване н а криогенни в е щ е с т в а с а
многобройни: пожар или експлозия, задуша­
ване, т ъ к а н н и увреждания, подобни н а т е ­
зи о т т е р м и ч н и изгаряния, т р о ш л и в о с т
на п о т о п е н и т е материали.
ОбезопасяВаие
При р а б о т а с криогенни в е щ е с т в а се спаз­
в а т следните правила:
• Д а се използват с а м о контейнери,
изработени от м а т е р и а л и , пред­
назначени за ултраниски телтера-
тури.
• Да се п о л з в а т о ч и л а и м а с к а , предпаз­
ващи л и ц е т о и о ч и т е , с п е ц и а л н и р ъ к а ­
в и ц и за предпазване н а р ъ ц е т е о т пре-
охлаждане.
• Р ъ к а в и ц и т е , и з р а б о т е н и о т специален
непропусклив м а т е р и а л т р я б в а да б ъ д а т
х л а б а в и , за д а може лесно да се с в а л я т
при разливане н а т е ч н о с т т а върху т я х .
• За да се намали с и л н о т о к и п е н е и р а з -
плискване, контейнерите с пробите,
подлежащи н а замразяване т р я б в а да се
п о с т а в я т в охладителя м н о г о б а в н о .
• Криогенните т е ч н о с т и се с ъ х р а н я в а т в
д о б р е и з о л и р а н и , но х л а б а в о з а т в о ­
р е н и (запушени) контейнери, с к о е т о о т
една с т р а н а се намалява до минимум з а ­
г у б а т а п а течност поради изпаря­
в а н е , а о т друга се п р е д о т в р а т я в а
npekoAiepnomo п о в и ш а в а н е н а н а л я ­
г а н е т о в съда.
42
МЕХАНИЧНА ОПАСНОСТ
М е х а н и ч н и т е н а р а н я в а н и я н а й - ч е с т о се
п р и ч и н я в а т о т счупени с т ъ к л е н и съдове,
о т о п и т и да се спре р а б о т е щ а центрофуга
с ръка, без да се изчака а в т о м а т и ч н о т о ü
спиране, падане при хлъзгав под (разливане
н а вода), у б о ж д а н е и др. И з к л ю ч и т е л н о
опасно е " и з л и т а н е т о " н а е п р у в е т к а при ра­
б о т а с о т в о р е н а центрофуга. Съвременни­
т е центрофуги с а з а щ и т е н и в т о в а о т н о ­
шение, т ъ й к а т о се в к л ю ч в а т само след
з а т в а р я н е н а капака.
ПРОГРАМА ЗА ОСИГУРЯВАНЕ
НА БЕЗОПАСНА РАБОТА
И КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ
Б е з о п а с н о с т т а в л а б о р а т о р и я т а не може
да бъде о с ъ щ е с т в е н а само чрез провеждане
н а тренировки. Важно е да б ъ д а т о т с т р а ­
нявани р и с к о в е т е :
• и н с т а л и р а н е н а у с т р о й с т в а , к о и т о да
п р е д и з в е с т я в а т персонала ( и н д и к а т о р
з а дим).
• з а м я н а н а токсични с по-малко токсич­
ни в е щ е с т в а .
• ако в р е д н о с т и т е не м о г а т да б ъ д а т о т ­
с т р а н е н и е необходимо осигуряване на съ­
о т в е т н о т о з а щ и т н о облекло.
След осигуряване н а всички з а щ и т н и
средства, п е р с о н а л ъ т следва да бъде обу­
чен за р а б о т а при рискови условия.
Необходимо е да б ъ д а т разработени а в а ­
р и й н и п л а н о в е за поведение при пожар,
евакуация, разливане н а химикали, к а к т о и
да се п р о в е ж д а т тренировки за изпълнени­
е т о им. И з и с к в а н е т о н а много а к р е д и т и ­
ращи агенции е т е з и тренировки да се до­
к у м е н т и р а т ; р-аша, участници, вид на тре­
нировката, резултати.
Трябва да бъде изградена с и с т е м а за док­
ладване н а и н ц и д е н т и - с и без пострадали,
к о е т о ще подпомогне разследването н а при­
чините за произшествията и т я х н о т о
о т с т р а н я в а н е . П о л и т и к а т а за документи­
ране н а всеки инцидент, вкл. и н а т а к ъ в без
п о с т р а д а л и е насочена з а подобряване на
у с л о в и я т а и осигуряване н а безопасна сре­
да за р а б о т а .
В к л и н и ч н а т а лаборатория следва да се
определи лице - отговорн о з а безопасност­ химикали, противопожарни одеала, маски
т а , к о е т о да е наясно с и з и с к в а н и я т а н а за лице, ръкавици и др.
добрата лабораторна практика з а
безопасност. З а по-големи звена може да
бъде изградена комисия, к о я т о заедно с о т ­ З а к л ю ч е н и е . В к л и н и ч н а т а лаборатория
говорника да препоръчва н а с о к и т е и дейс­ е налице голямо разнообразие о т потенци­
т в и я т а , да и з г о т в и и а к т у а л и з и р а н а р ъ ч ­ ални в р е д н о с т и - биологични, химични и
н и к п о безопасност, да провежда прог­ о п а с н о с т о т запалителни, избухливи и дру­
р а м а з а о б у ч е н и е , д а п р о у ч в а възник­ ги химикали. Па л а б о р а т о р н и я персонал
нали и н ц иденти, да препоръчва периодич­ т р я б в а да се о с и г у р я т безопасни условия
ни проверки и т р е н и р о в к и , промени в ра­ за р а б о т а и почивка, да се п о д д ъ р ж а т не­
б о т н и т е процедури и да р а з п р о с т р а н я ­ г о в и т е познания и умения за безопасна ра­
в а и н ф о р м а ц и и и у к а з а н и я към о с т а ­ б о т а , и г о т о в н о с т з а изпълнение н а прог­
налия персонал. р а м а т а при различни с и т у а ц и и . В съвре­
Оборудването, к о е т о следва да бъде в на­ м е н н а т а лаборатория за о с н о в н а т а ч а с т
личност, за да се осигури безопасна среда о т а н а л и з и т е се използват г о то ви набори
включва: душове, пожарогасители, аспира­ и все по-рядко се налага съхранението на
тори за дима, камини, аларми за пожар и ограничен брой т е ч н и химикали и субстан­
др. Тези с р е д с т в а периодично се т е с т в а т , ции. Въпреки т о в а л а б о р а т о р н и я т лекар е
а персоналът се обучава за боравене с т я х . дължен добре да познава к а к т о т я х н о т о
Други с р е д с т в а , к о и т о т р я б в а да се осигу­ вредно въздействие, т а к а и потенциални­
р я т са: набор за оказване на първа помощ, т е опасности, за да б ъ д а т предприети не­
комплект за използване при разливане на обходимите мерки.

Книгопис

Н а р е д б а на М З на РБългария, N o П/ДЕЗ, бр. 5 2 / 2 8 . 0 6 . 1 9 9 4 г. ington D C , A m e r i c a n A s s o c i a t i o n for clinical chemistry, 9 ,

З а у с л о в и я т а и р е д а з а р а б о т а на М е д и ц и н с к и т е л а б о р а т о ­
рии.
C o n n e r SW . Laboratory S a f e l y . In: A n d e r s o n S C , C o c k a y n e S
( e d s ) , Clinical chemistry. C o n c e p t and applications. Philadel­
phia - London - Toronto - S y d n e y - Tokio, W U Saunders
company, 1993, 23-36.
FFA; M e d i c a l w a s t e tracking act. 4 0 C F K , parts 2 2 and 2 5 9 ,
1989.
Forrey AW, D e l a n y CJ, R u f f W L . Safety. In: Fulkner W R and
M e i t e s S ( e d s ) . Standard m e t h o d s o f clin ical chemistry. W a s h -
1982.
Kaplan A , Jack R, O p h e i m K, T o i o v a B , Lyon A . Introduction to
clinical chemistry. In: Kaplan А et al (eds). Clinical chemistry
(4' h ed). Baltimore - Philadelphia - I l o n g K o n g - London -
M u n i c h - S y d n e y - T o k y o . W i l l i a m s a n d Wilkins, 1 9 9 5 , 1 - 4 9 .
O S H A : Hazard c o m m u n i c a t i o n standard. 2 9 C F R 1910. 1 2 0 0 ,
1996.
Protection o f laboratory w o r k e r s for disease transmitted by b l o o d ,
b o d y fluids and tissue. N C C L S d o c u m e n t M 2 9 - I . Villanova
PA, National c o m m i t t e e for clinical laboratory standards, 1989.

43
I
 Осигуряване к а ч е с т в о т о
на биологичния материал
за клинично-лабораторен анализ
Т. Ц в е т к о в а

РОЛЯТА НА ЛАБОРАТОРНИЯ териала за изследване от персонала в

СПЕЦИАЛИСТ В ПРЕДАНАЛИТИЧНИЯ
ЕТАП
К а ч е с т в о т о на клиничпо-лабораторните
р е з у л т а т и , т я х н о т о максимално с ъ о т ­
в е т с т в и е н а д е й с т в и т е л н а т а величина н а
изследваните п о к а з а т е л и в биологичните
т е ч н о с т и и т ъ к а н и , а д е к в а т н о т о им т ъ л ­
куване и ползване в диагностичния проиес
се определя о т ц я л о с т н а т а о р г а н и з а ­
ц и я н а р а б о т а 6 з с | р а И н о т о заВес^ение.
Тя включва всички проиедури в npecjaiia-
л и т и ч н и я , а н а л и т и ч н и я и сле(|анали-
т и ч е н е т а п н а клинично-лабораторните
изследвания. Д о б р о т о познаване и спазва­
не н а и з и с к в а н и я т а към у с л о в и я т а и т е х ­
н и к а т а за изпълнение н а всички проиеду­
ри - о т п а и и е н т а до р е з у л т а т а , н а изиск­
в а н и я т а на вътрелабораторния контрол
и в ъ н ш н а т а оиенка н а к а ч е с т в о т о н а ла­
бораторните р е з у л т а т и , са съществен
е л е м е н т в с т р е м е ж а за п р е д о т в р а т я в а н е
или максимално ограничаване в л и я н и е т о
н а с ъ о т в е т н и т е з а всеки е т а п грешки -
преданалитични, а н а ли т и ч н и и следана-
литични. В сравнение с аналитичния, н р е -
д а н а л и т и ч н и я т е т а п е значително по-
т р у д о е м ъ к и изисква з н а ч и т е л н о време -
около 2/3 о т В р е м е т о , н е о б х о д и м о з а
п р о ц е д у р и т е 6 т р и т е е т а п а н а лабо-
раторно-диагностичния проиес. Той включ­
ва две фази;
> Предлабораторна ф а з а н а предана-
л и т и ч н и я е т а п ; избор на показател,
подготовка на паииента, вземане на би­
ологичен материал и изпращането м у в
клиничната лаборатория. В т а з и фаза
се "консумира!' около 20.25% о т и я л о т о
време з а л а б о р а т о р н о - д и а г н о с т и ч н и я
проиес.
> В ъ т р е л а б о р а т о р н а фаза н а преда-
н а л и т и ч н и я е т а п : подготовка на м а ­
44
к л и н и ч н а т а лаборатория. Тази ф а з а
включва приемане и регистрация, съхра­
няване на материала, разпределение и
предварителна подготовка на пробите
за анализ. В т а з и фаза се "консумира"
з н а ч и т е л н а ч а с т о т в р е м е т о за лабора-
т о р н о - д и а г н о с т и ч н и я проиес - 37.15%.
И р е д л а б о р а т о р н а т а фаза на преданали-
т и ч н и я е т а п се осъществява извън клинич­
н а т а лаборатория (с изключение на амбула­
т о р н о обслужени п а и и е н т и в лаборатория­
т а ) и не е под прекия контрол на лаборатор­
н и т е спеииалисти. К а ч е с т в о т о на р а б о т а
в т а з и фаза зависи изияло о т организаии-
о н н и т е мерки в а м б у л а т о р н и т е / с т а щ ю н а р -
н и т е звена и о т спазване на всички изиск­
вания о т екипа лекуваш лекар/медищлнска
с е с т р а . Тези организаиионни мерки най-об­
що включват:
• а д е к в а т е н н а д и а г н о с т и ч н а т а насоче­
н о с т избор н а клинично-лабораторни по­
казатели [сслективност н а назпаче-
нилта),
• създаване н а о п т и м а л н и условия според
и з и с к в а н и я т а з а подготовка н а паииен­
т а , вземане на биологичен м а т е р и а л и не­
г о в о т о съхранение до п р е д а в а н е т о му за
анализ, к а к т о и т р а н с п о р т и р а н е т о му
до к л и н и ч н а т а л аб о р ато р и я .
З а разлика о т р е з у л т а т а , получен при
л а б о р а т о р н и я анализ и ч е с т о обозначаван
сумарно к а т о "продукт", преданалитични-
я т е т а п би могло да се определи к а т о сбор
или съчетание о т разнородни проиедури,
пособия и м а т е р и а л и . Л а б о р а т о р н и я т спе-
щ ш л и с т т р я б в а да е сигурен, че и я л о т о т о ­
ва съчетание се к о н т р о л и р а по време н а
всички с т ъ п к и в и р е д л а б о р а т о р н а т а фаза.
Това се п о с т и г а чрез р е д о в н и срещи меЖ-
д у к л и н и ц и с т и и л а б о р а т о р н и one-
ц и а л и с т и , изпращане н а о т д е л н и и н с т ­
рукции, у ч а с т и е във в и з и т а ц и и и колегиу­
ми, и з г о т в я н е н а подходящи справочници
или наръчници с и н с т р у к т и в н и м а т е р и а ­
ли за всички анализи, извършвани в лабора­
т о р и я т а . П ерсонал ът в кли н и ки т е и лабо­
р а т о р и я т а следва да бъде т о ч н о з а п о з н а т
к а к т о с всички проиеси, т а к а и с всички не­
обходими пособия и м а т е р и а л и , к о и т о т о й
т р я б в а да к о н т р о л и р а във всяка о т д е л н а
с т ъ п к а н а преданалитичния е т а п ;
> П о д г о т о Н к а н а п а ц и е н т а . Следва да
се контролира дали п а ц и е н т ъ т е инфор­
миран з а д и е т а т а , з а п о л о ж е н и е т о н а
т я л о т о при вземане н а к р ъ в т а и подроб­
но з а с а м а т а процедура (напр. начален и
краен час на събиране н а диуреза). Да се
п р о в е р я т подходящи ли са контейнери­
т е за събиране н а урина з а количествен
анализ - химическа ч и с т о т а , консерван­
ти, етикети и т.н.
> П о к а з а т е л и з а изследбане. Контрол
н а н а н а с я н е т о им върху п о р ъ ч к о в и т е
форми (фиш, бланка), е т и к е т и р а н е н а
к о н т е й н е р и т е , проверка за наличие н а
необходимите бланки, к а к т о и н а възп­
р и е т и я начин за идентификация на про­
би и п а ц и е н т и .
> В з е м а н е н а п р о б а . К о н т р о л ъ т включ­
ва идентификация н а п а ц и е н т а , час на
вземане н а к р ъ в т а , правилен избор з а
п у н к т и р а н е - венозна, а р т е р и а л н а или
капилярна кръв, п о ч и с т в а н е на к о ж а т а ,
п р о д ъ л ж и т е л н о с т н а с т я г а н е с еластич­
ния б и н т , позициониране н а и г л а т а , пра­
вилен избор н а к о н т е й н е р и т е според
и з и с к в а н и я т а н а анализа. Пособията,
к о и т о п о д л е ж а т на к о н т р о л са: игли, еп­
р у в е т к и (моновети, вакутейнери и др.),
дезинфекционни м а т е р и а л и и пр.
> Т р а н с п о р т . Конт рол над събирането на
в з е т и т е проби и т е х н и я т р а н с п о р т , съ­
образно о б щ и т е и/или специфични изис­
квания. Пособията, к о и т о п о д л е ж а т на
к о н т р о л са к о н т е й н е р и т е за вземане и
пренасяне на проби, и з п р а в н о с т на пнев­
м а т и ч н а т а с и с т е м а (ако има в з в е н о т о )
или осигуряване н а т а к а в а .
> П р е д а н а л и т и ч н а о б р а б о т к а н а про­
б и т е . Тази ф а з а о т п р е д а н а л и т и ч н и я
е т а п се о с ъ щ е с т в я в а в л а б о р а т о р и я т а .
Тук к о н т р о л ъ т обхваща с л е д н и т е про­
цеси: регистрация н а п о с т ъ п и л и т е про­
би, ц е н т р о ф у г и р а н е и о т д е л я н е н а се­
рум/плазма, разпределение по с е к т о р и ,
идентификация, ек стр ак ц и я , у т а я в а н е ,
филтриране и т . н . Изисква се още к о н т ­
рол върху н а л и ч н а т а с и с т е м а (програма)
з а идентификация и регистрация, как­
т о и р азр аб о тван е н а т а к а в а , контрол
н а ц е н т р о ф у г и т е (зареждане, време и
с к о р о с т на центрофугиране).
> Съхранение н а м а т е р и а л и т е . Конт­
рол върху п р о д ъ л ж и т е л н о с т т а на съхра­
нение, избор н а м я с т о и т е м п е р а т у р а ,
размесване, реконституиране. Освен оси­
гуряване н а подходящи помещения се
к о н т р о л и р а т хладилници и фризери за
съхраняване н а биологичния м а т е р и а л ,
к а к т о и т е м п е р а т у р а т а , к о я т о т е под­
държат.
А д е к в а т н о с т т а н а в з е т а т а проба з а
клинично-лабораторно изследване, н е й н а т а
д о с т а т ъ ч н о с т по количество и съобраз­
н о с т спрямо определени изисквания се оце­
нява с различни критерии от пациент, ле­
к у в а щ л е к а р и лабораторен с п е ц и а л и с т ,
т . е . т я х н а т а гледна т о ч к а е различна:
Критерии о т позицията на пациента
- предпочита се биологичният м а т е р и а л да
бъде в з е т без болка; по-малко кръв е по-доб-
ре, о т к о л к о т о по-голямо количество; бър­
зо и з в ъ р ш е н а т а процедура се предпочита,
о т к о л к о т о п р о д ъ л ж и т е л н и процедури
(напр. с п о н т а н н а порция урина в сравнеие
с диуреза о т 24 h); и не на последно м я с т о
а н а л и з ъ т да не е скъп.
К р и т е р и и о т позиция н а лекуващия
л е к а р - за предпочитане е получаване на
възможно максимална информация о т ед­
на проба; получаване н а п р о б а т а в къс срок
в м е с т о време-консумиращи процедури; бър­
з и я т т е с т е за предпочитане в сравнение
с т а к ъ в , изискващ време за анализа; и д е ­
а л н а т а процедура з а получаване н а
б и о л о г и ч е н л ю т е р и а л е пгм д а е с н и ­
с ъ к р и с к - и з а п а ц и е н т , и з а флебото-
лгист/людицинска сестра и з а леку­
ващия лекар.
К р и т е р и и о т гледна т о ч к а н а лабора­
т о р и я т а - по-добре е да има на разполо­
жение повече биологичен м а т е р и а л в срав­
нение с н е д о с т а т ъ ч н о количество ( т р я б -
45
ва да се знае т о ч н о к о л и ч е с т в о т о серум,
плазма и т . н . ) , за всеки т е с т к а т о о п т и ­
м у м ъ т , к о й т о т р я б в а да се осигури е око­
ло д в у к р а т н о по-голямо количество о т не­
обходимото); предп очи т а се т ъ й нар. с т а н ­
д а р т н а , "нормална" проба в м е с т о т а к а в а
с потенциално интерфериращи (хемолиза,
липемия, л е к а р с т в а и др.) или рискови з а
предаване на инфекция ф а к т о р и ; за пред­
п о ч и т а н е е проба, в з е т а при с т а н д а р т н и
условия, с ненарушено съотношение кръв/
антикоагулант.
В к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я следва да се
регистрира в р е м е т о , о т н а с я щ о се за:
1. Час на вземане на биологичния мат ери ал .
2. Час на доставяне на пробите в лаборато­
рията.
3. Час на принтиране на р е з у л т а т и т е в ла­
бораторията.
4. Час н а д о с т а в я н е (съобщаване) на резул­
т а т и т е до п о т р е б и т е л я .
Р а з л и к а т а между в р е м е т о , о т б е л я з а н о
с т . 1 (час на вземане на пробата) и ni.2 (час
на доставяне в л а б о р а т о р и я т а ) включва
п р е д л а б о р а т о р и а т а ф а з а па предана-
л и т и ч н и и е т а п ; и н т е р в а л ъ т между т . З
(час на п р и н т и р а н е на резултатите) и т . 2
{час на доставяне на пробите в лаборато­
рията) п р е д с т а в л я в а в р е м е т о на И ъ т р е -
л а б о р а т о р п а т а фаза на прсдаиали-
т и ч п и я е т а п , сумирано с в р е м е т о за
а н а л и з а ( а н а л и т и ч н и я е т а п ) . Разлика­
т а между т . 4 {съобщаване, доставяне на
р е з у л т а т а до потребителя) и т . З {прин­
тиране на р е з у л т а т и т е в лабораторията)
съставлява в р е м е т о , к о е т о е необхо­
димо за следаналитичния е т а п .
Д о б р а т а организация в з д р а в н о т о
з а в е д е н и е н а л а г а н е п р е к ъ с н а т а рабо­
т а по скъсяване на б р е м е т о < 5 отдел­
ните етапи.
ПОВЛИЯВАНЕ НЛ ЛАБОРАТОРНИТЕ
РЕЗУЛТАТИ ОТ ФАКТОРИ
В ПРЕДЛАБОРАТОРНИЯ ЕТАП
Ц е л т а на л а б о р а т о р н и т е изследвания е по­
лучаване на достоверни р е з у л т а т и , к о и т о
са реална оценка на и с т и н с к а т а величина
и н о с я т полезна информация. Лаборатор­
н и я т р е з у л т а т е функция о т голям брой
46
ф а к т о р и , к о и т о по различни механизми
о к а з в а т влияние върху крайния р е з у л т а т .
Познаването на всички ф а к т о р и е предпос­
т а в к а з а т ъ р с е н е на начини за т я х н о т о
управление и е о т значение за правилен из­
бор на п о к а з а н и я т а за изследване на с ъ о т ­
в е т н и я лабораторен параметър, к а к т о и
з а тълкуване на н а х о д к а т а . Тези ф а к т о р и
м о г а т да се о б е д и н я т в няколко групи:
1. Патологични ф а к т о р и . Те са свързани с
болестния процес, к о й т о е о б е к т н а ди­
агностично търсене и обуславят
о т к л о н е н и е т о н а р е з у л т а т и т е из­
вън р е ф е р е н т н и я и н т е р в а л .
2. Биологични ф а к т о р и . Те определят био­
л о г и ч н а т а вариация на лабораторния ре­
з у л т а т , дължаща се н а биологични фе­
номени, несвързани със заболяването.
3. Ф а к т о р и , к о и т о са р е з у л т а т о т диаг­
н о с т и ч н и или лечебни процедури върху
пациента.
4. П р е д а н а л и т и ч н и ф а к т о р и . Те з а в и с я т
о т у с л о в и я т а н а в з е м а н е , съхраня­
в а н е и т р а н с п о р т и р а н е н а биоло­
гичния м а т е р и а л .
5. Аналитични ф ак то р и . Те определят ана­
л и т и ч н а т а вариация на р е з у л т а т а .
6. Следаналитични ф а к т о р и .
Биологични ф а к т о р и
К о л и ч е с т в е н и т е х а р а к т е р и с т и к и н а хи­
мичния и к л е т ъ ч е н с ъ с т а в на биологични­
т е т ъ к а н и и т е ч н о с т и в човешкия орга­
низъм са променливи велични и о т р а з я в а т
б и о л о г и ч н а т а в а р и а ц и я . Тя е израз как­
т о на физиологичните и обменни процеси
в организма ( ф и з и о л о г и ч н и ф а к т о р и ) ,
т а к а и на в з а и м о д е й с т в и е т о му с околна­
т а среда ( ф а к т о р и н а с р е д а т а ) . Биоло­
г и ч н а т а вариация включва:
• И н т е р и н д и в и д у а л н а в а р и а ц и я . Тя е
р е з у л т а т о т различието между х о р а т а ,
обусловено о т г е н е т и ч н и особености и
ф а к т о р и , свързани с о к о л н а т а среда. Все­
ки индивид има собствени биологични ва­
риации.
Под генетичен контрол се н а м и р а т редица със­
т а в к и на биологичните т е ч н о с т и - катехолами-
ни, холестерол, липопропгеини свисока плътност,
пикочна киселина и др. Вариациите в концентра-
цията на съставките на биологичните течности
обикновено са по-големи между различните инди­
види спрямо тези при едно и също лице, изследвано
в динамика.
• И и т р а и н д и В и д у а л н а В а р и а ц и я . Изра­
зява се в о т к л о н е н и е т о н а р е з у л т а т и т е
около с р е д н а т а с т о й н о с т за даден инди­
вид при проследяване в различно време.
Значение и м а т биологичните р и т м и , ко­
и т о се х а р а к т е р и з и р а т с циклично нас­
т ъ п в а щ и промени в определени и н т е р в а ­
ли о т време (фиг. 3.L). Ц и к л и ч н о с т т а на
б и о р и т м и т е е различна: под 20 h - у л т -
радианни; о т 24 до 28 h - циркадианни;
седмични - циркасептанни; двуседмични
- циркадисептанни; месечни - ц и р к а т р и -
г е н т а н н и ; 6-месечни - циркасемиануални;
12-месечни - циркаануални.
X ческа възраст - над 75-80 години.
р Линейно
о (напр. аъ^раст)
н напредване на възрастта се повишава и броят на
о в
Б Л
И И Циркадиатт
о я
1. 1>
ЦИКЛИЧНО Сеюиии
БИОЛОГИЧНИ
{напр и г ш iiitKHi)
Фиг. 3.1 Линейно и циклично хронобиологично влия­
ние върху анализите {no W. Gudcrcl al.)
Според в р е м е т р а е н е т о н а в ъ з д е й с т в и е т о
биологичните ф а к т о р и са:
Постоянно д е й с т в а щ и ф а к т о р и
Пол. Разликите между д в а т а пола за реди­
ц а клинично-лабораторни п о к а з а т е л и (хе­
моглобин, е р и т р о ц и т е н брой, х е м а т о к р и т ,
СУЕ, пикочна киселина, а к т и в н о с т на ЛФ,
ЛлАТ, АсАТ, КК, ГГТ, холестерол с висока
п л ъ т н о с т и др.) са добре и з в е с т н и и п о т ­
върдени в много проучвания. Някои разли­
чия не са пряко свързани с пола, а с разлики
в м у с к у л н а т а и т е л е с н а м а с а при мъже и
жени (креатинин и КК).
Раса. Установени са различия, зависещи о т
р а с а т а (лактазен дефицит на тънките черва, ва­
риации в нивото на пикочната киселина и др.), но е
възможно някои различия да са резултат о т разли­
ки в начина на хранене, обремененост и др.; сигни-
фикантна разлика е установена за серумната кон­
центрация на вит. В12 ( 1.35 пъти по-висока при
черната раса) и липопротеин (а) - (2 пъти по-висо-
ка концентрация при черната раса. Значими са раз­
ликите в броя на левкоцитите - по-нисък брой при
черни, дължащ се на по-ниския брой на гранулоци-
т и т е . Моноцитите са с по-висок брой при бялата
раса.
Дълговременно действащи фактори
Възраст. При анализа н а възрастово обус­
л о в е н и т е промени обикновено се п о л з в а т
следните периоди: период н а новороденото
- до 7 дни; ранна детска възраст - до 1 го­
дина; д е т с к а в ъ з р а с т - о т 1 до 12 години;
период на съзряване - о т 12-13 до 18-19 го­
дини; зряла възраст - о т 20 години до мено-
п а у з а т а при жени и до 50 години при мъже;
напреднала - о т 51 до 70-75 години и стар­
Освен настъпващите хормонални промени, с
прекараните заболявания. С нарастване на въз­
р а с т т а намалява серумната концентрация на ка­
лий, фосфор, белтък, албумин и др., а се повишават
стойностите на холестерол, глюкоза, активност
на ЛДХ.
Телесен строеж. При з а т л ъ с т я в а н е се по­
в и ш а в а т липидните фракции, к о р т и з о л ъ т
и др.
Физическа активност. При а к т и в н о спор­
т у в а щ и , с увеличаване на мускулната ма­
са се п о в и ш а в а т с т о й н о с т и т е н а хемог­
лобина и е р и т р о ц и т и т е , а к т и в н о с т т а н а
КК, АсАТ, н и в о т о н а урея, билирубин, пи­
кочна киселина и др.
Бременност. При и н т е р п р е т а ц и я на лабо­
р а т о р н и т е р е з у л т а т и е необходимо съоб­
разяване с г е е т а ц и о н н а т а седмица, през ко­
я т о е извършен анализа. Плазменият обем
се увеличава с около 50%. Н а р а с т в а кръвни­
я т обем и бъбречният кръвоток. Повиша­
ва се а к т и в н о с т т а на п л а ц е н т а р н и т е ен­
зими: АФ, х и с т а м и н а з а и др. Появява се ал-
фа-фетопротеин. Понижава се количество­
т о н а калия и н а т р и я в серума. Тези про­
мени са р е з у л т а т о т следните механизми:
и н д у к ц и я (повишаване а к т и в н о с т т а н а
АФ, ф а к т о р VII); повишаване на транспор­
т н и т е протеини (тироксин, липиди, мед,
церулоплазмин); х е м о д и л у ц и я (понижение
н а общ белтък, албумин, е р и т р о ц и т и и др.);
дефицит поради повишени изисквания (по-
47
нижение н а желязо, феритин); повишение рий, хлорид, магнезий, катехоламини.
н а б е л т ъ ц и т е н а о с т р а т а фаза (повише­ Сезон. Влиянието на сезона върху химичните и кле­
ние н а СУЕ - п е т к р а т н о ) ; п о в и ш е н у р и н е н тъчни съставки в човешкия организъм има харак­
обем (25-50%) ( п о в и ш е н а г л о м е р у л н а фил­ т е р на хронологично обусловени ритъмни биоло­
трация). гични вариации - ц и р к а с с м и а н у а л ни. Повечето
о т сезонните промени са свързани с околната т е м ­
Н а ч и н н а хранене. Много в а ж е н е в ъ п р о с ъ т ,
пература, с различия в д и е т а т а (пресни плодове и
доколко п р и е м а н е т о н а с т а н д а р т н а д и е т а зеленчуци), енергийни изисквания на организма през
оказва влияние върху определени п о к а з а т е ­ различните сезони. През л я т о т о във връзка с по­
ли. С ч и т а се, че е ф е к т д о 5% п р о м я н а в вишените температури е увеличен плазменият
н и в о т о с п р я м о изследване н а гладно, м о ж е обем. А\фа-глобулините са понижени, а гама-глобу­
д а бъде п р е н е б р е г н а т о , т ъ й к а т о е клинич­ лините се повишават до 50%. Повишена е актив­
но н е д о с т о в е р е н (напр. за пикочна киселина, общ н о с т т а на АДХ, концентрацията на триглицери­
белтък, албумин, урея, натрий, холестерол, които дите, на калция в серума и екскрецията му в ури­
не изискват с т р и к т н о гладуване преди изследва­ н а т а (променен калциев метаболизъм под влияние
не). Други показатели значително се променят след на слънчевата светлина). По-високо е и нивото на
прием на храна: повишение с около 10% - АлАТ, К, с калия, н а т р и я и хлоридите в серума, без да е пови­
20% - АсАТ, билирубин, глюкоза, неорганичен фос­ шено отделянето им в урината. По-високо е ниво­
ф а т и триглицериди (дори до 50%). Установено е, т о на т е с т о с т е р о н а в плазмата на мъже. През
че при прием на храна богата на белтъчини, след з и м а т а е по-висока а к т и в н о с т т а на АФ (консума­
около 4 дни се увеличава у р е я т а (със 75%), холесте- ция на мазнини), повишени са с т о й н о с т и т е на хо-
ролът (с 18%), ф о с ф а т ъ т (с 10%), а намалява кон­ лестерола, а на триглицеридите - понижени.
ц е н т р а ц и я т а на глюкозата (с 8%). При недохран­
ване настъпва хипоалбуминемия и хипергамагло- Кратковременно действащи
булинемия. Намалява концентрацията на холесте- фактори
рола, триглицеридите, липопротеините, креатини-
на. Ранни индикатори за нископротеинна храна е Д н е в н о - н о щ н и ( ц и р к а д и а н н и ) в а р и а ц и и . Те
понижението на преалбумин и ретинол-свързващ са р е з у л т а т о т редуването н а светлина и
белтък. Гладуване над 48 h води до повишението т ъ м н и н а , б о д ъ р с т в у в а н е и сън. В т а б л . 3.1.
на свободни м а с т н и киселини, л а к т а т (3-5 пъти), с а п о к а з а н и п р о м е н и т е н а някои п о к а з а т е ­
а ц е т о а ц е т а т (над 6-7 пъти), ß-хидроксибутират ли в р а м к и т е н а д е н о н о щ и е т о .
(над 30 пъти).
След 4 седмично гладуване се наблюдават същес­ Таблица 3.1. Дневно-нощна вариация на някои
твени промени - понижение на: глюкоза (5-8%), урея показатели
(до 20%), холестерол (до 15%), триглицериди (до 35%), Ширина
11Т (до 50%), хемоглобин, хематокрит, телесна ма­ Максимум Минимум на
Показател
(час) (час) колебание
са (до 10%); повишение на: креатинин (до 18%) и
(в%)
пикочна киселина (до 20%) поради понижения ü кли-
рънс в р е з у л т а т на кетонемията), АсАТ (до 40%) и Хемоглобин и 15-30
6-18 22-24
хематокрит
др. Уринната екскреция на амоняк и креатинин е
Еозинофили 4-6 18-20 30-40
повишена, докато т а з и на урея, калций и фосфат е
понижена. Тези промени са подобни на наблюдава­ Общ белтък* 30
6-10 18-22
в серум
н и т е след хирургични процедури.
Креатинин* 50
Екологични фактори. Тяхното въздействие обик­ 18-22 6-10
в серум
новено е по схемата: почва -» води -+ храна и/или Желязо в
14-18 2-4 25-100
въздействие на екзогенни вещества, попаднали в серум
организма във връзка с б и т а и т р у д а на индивида. Калий в
14-16 23-21 около 10
Повишена концентрация на някои т е ж к и метали серум
в кръвта (манган, олово, кадмий и др.) се наблюда­ Фосфат в около 30-40
2-4 8-12
ва при екологични неблагополучия в определени ра­ серум
йони, к а к т о и при работещи в с ъ о т в е т н и т е про­ Триглицериди пост-
6-9
изводства. и холестерол прандиално
Хормони
Климат. При силни горещини с обилно потене нас­ (АКТХ)
6-9 0-4 150-200
т ъ п в а сгъстяване на к р ъ в т а с относително на­
Кортизол 5-8 21-3 180-200
растване концентрацията на хемоглобин, плазме­
ни белтъци, електролити. При излагане на студ се * Iювишението е във връзка с д в и г а т е л н а т а а к т и в н о с т
увеличава отделянето на урина и загубата на н а т ­ и липсва при болни, приковани на легло.

48
Много в а ж н о е с ъ о б р а з я в а н е с д в е п о л е з ­
н и npaeiuia'.
>• В з е м а н е т о н а е д н а проба в грешно в р еме
м о ж е д а бъде много по-безполезно, о т к о л ­
к о т о д а не бъде в з е т а .
>• Е д н а проба, ч и и т о р е з у л т а т щ е се полу­
чи късно е безполезна проба.
Менструален цикъл. По време на мензис се наб­
людава повишение на фибриногена, а аминокисе­
лините в п л а з м а т а с п а д а т с около 50% в по-къс­
н а т а фаза на цикъла. Наблюдават се промени и в
концентрацията на половите хормони, алдосте-
рон и ренин.
Към к р а т к о т р а й н о д е й с т в а щ и т е фак­
т о р и се о т н а с я и п р и е м ъ т н а х р а н а непос­
р е д с т в е н о п р е д и в з е м а н е н а биологичния
материал, с т р е с ъ т , положението на т я ­
л о т о , н а л и ч и е т о н а венозна с т а з а и др., кои­
т о до г о л я м а с т е п е н м о г а т д а б ъ д а т кон­
т р о л и р а н и ч р е з п р е д в а р и т е л н а т а подго­
т о в к а на пациента.
Предварителна подготовка
на п а ц и е н т а
Психическо напрежение. П а ц и е н т ъ т т р я б ­
в а д а бъде и н ф о р м и р а н п р е д в а р и т е л н о з а
ц е л т а и хода н а п л а н и р а н о т о изследване,
з а д а се н а м а л и п с и х и ч е с к о т о напрежение.
Той следва д а бъде з а п о з н а т с у с л о в и я т а ,
к о и т о е необходимо д а с п а з в а при н я к о и
специфични изисквания к ъ м определено из­
следване ( д и е т а , п р и е м или ограничаване н а
т е ч н о с т и и др.). По в р е м е н а и з с л е д в а н е т о
се осигурява спокойна и п р и в е т л и в а о б с т а ­
новка и в н и м а т е л н о обслужване. При необ­
х о д и м о с т о т п о в т а р я щ о се през к р а т к и ин­
т е р в а л и в з е м а н е н а кръв, д а се осигури пос­
т а в я н е н а в е н о к а т . Не б и в а cja с е д а в а т
м е д и к а м е н т и з а у с п о к о я в а н е , т ъ й ка­
т о т е и м а т изразена интерферен-
ц и я . Психическото напрежение от една
страна затруднява вземането на кръв за
изследване, тъй като настъпва централи­
зация на кръвообръщението при страхови
състояния, а от друга - то се отразява вър­
х у резултатите на голям брой функционал­
ни проби Г г л ю к о з о т о л е р а н т е н т е с т , кли-
рънси, изследване н а с т о м а ш е н сок), к а к т о
и върху и з с л е д в а н е т о н а хормони.
Предшестващо хранене. З а д а се о т с т р а н и
в л и я н и е т о н а х р а н а т а к а т о с ъ с т а в , коли­
ч е с т в о и с т р е с о в е ф е к т о р се осигурява 12-
часово гладуване през н о щ н и т е часове, как­
т о и 24-часово изключване приема н а алко­
хол. Н е и з к л ю ч в а н е т о н а алкохола о т хра­
н а т а води до з а т р у д н е н и я при изясняване
н а х и п е р л и п о п р о т е и н е м и я т а , до повише­
н а а к т и в н о с т н а някои ензими, освободе­
ни о т ч е р н о д р о б н и я п а р е н х и м в к р ъ в т а
(АсАТ, АлАТ, ГГТ, ГлДХ), повлияване н а guy-
р е з а т а и нарушено о т д е л я н е н а някои об­
м е н н и п р о д у к т и , напр. пикочна киселина,
преминаване н а о т л о ж е н о т о в т ъ к а н и т е
олово в к р ъ в т а и т . н .
Приемането на храна преди изследване води до
повишена концентрация на много показатели в
кръвта (1-4 h след нахранване): левкоцитен брой,
глюкоза, триглицериди, свободни мастни киселини,
пикочна киселина (особено при месна храна), фос­
фат, желязо, а к т и в н о с т т а на АФ у индивиди с кръв­
на група O-Leewis-положителни (при богата на мас-
т и храна). Следпрандиалната липемия променя ре­
з у л т а т и т е на много фотометрични и имунологич­
ни изследвания, и поради м ъ т н и н а т а на серума.
Четири часа след нахранване е по-ниско нивото на
креатинина, общия белтък, албумина, уреята, а ни­
в о т о на билирубина нараства (с над 10%). Серум­
н о т о ниво на глюкоза, натрий, калций и холесте-
рол възстановява изходните си стойности. Прие­
м ъ т на кафе или кока кола засилва екскрецията на
катехоламините. Променя се глюкозният толе­
ранс, усилва се синтеза на кортизол. Консумация­
т а на храни, богати на серотонин (банани, баде­
ми, фъстъци, шоколад, сливи и др.) води до повиша­
ване на плазмената му концентрация.
физическа активност. Преди и по време н а
в з е м а н е н а биологичния м а т е р и а л е необ­
ходимо осигуряване н а физически покой. По­
в и ш е н и т е мускулни усилия п о в л и я в а т ла­
б о р а т о р н и т е анализи най-вече при изслед­
ва н е н а а м б у л а т о р н о болни. С т е п е н т а н а
п р о м е н и т е , к о и т о се п р е д и з в и к в а т о т мус­
кулни н а т о в а р в а н и я з а в и с я т о т физичес­
к а т а п о д г о т о в к а и с ъ с т о я н и е т о н а паци­
е н т а . При в ъ з р а с т н и п а ц и е н т и или при о т ­
слабен организъм о т прекарано заболяване
дори едно обичайно н а т о в а р в а н е м о ж е д а
бъде причина з а изразени о т к л о н е н и я в ла­
б о р а т о р н и т е р е з у л т а т и . П о в и ш е н о т о фи­
зическо н а т о в а р в а н е води до: 1. повишена
а к т и в н о с т в к р ъ в т а н а много ензими и уве­
личено ниво н а някои в е щ е с т в а поради ос­
вобождаването им о т мускулните к л е т к и
(АсАТ, КК, АДХ, миоглобин, к р е а т и н и н , ка-
49
лий); 2. н а т р у п в а н е н а обменни п р о д у к т и
( л а к т а т ) и понижение н а pH; 3. п р е н а с я н е
н а т е ч н о с т и о т в ъ т р е с ъ д о в о т о в междук­
летъчното пространство, в резултат на
к о е т о н а с т ъ п в а х е м о к о н ц е н т р а ц и я и се по­
в и ш а в а н и в о т о н а високомолекулните със­
т а в к и в к р ъ в т а и броя н а ф о р м е н и т е еле­
м е н т и ; 4. п о в и ш е н а диуреза; 5. п о в и ш е н а
а к т и в н о с т н а ф а к т о р и т е н а съсирване с
еднократно активиране н а фибринолизата;
6. п о в и ш е н а а г р е г а ц и я н а т р о м б о ц и т и т е
и др.
Положение на т я л о т о на пациента. Поло­
ж е н и е т о н а т я л о т о н е п о с р е д с т в е н о преди
изследване е в а ж е н ф а к т о р и о к а з в а влия­
ние върху к о н ц е н т р а ц и я т а н а р е д и ц а ла­
б о р а т о р н и п о к а з а т е л и поради хидродина­
мични п р о м е н и в к р ъ в т а . П р е м и н а в а н е ­
т о о т легнало 6 и з п р а в е н о поло^кение
tiocjju д о у в е л и ч а в а н е н а х и д р о с т а т и ч -
н о т о налягане 6 микроциркулацията
u преминаване на т е ч н о с т в интерс-
т и ц и у м а . Следва х е м о к о н ц е н т р а ц и я ,
повишаване н и в о т о н а в и с о к о м о л е к у л н и т е
в е ш е с т в а и п р е н а с я н и т е о т б е л т ъ ц и със­
т а в к и (мед, калций), н а к л е т к и т е в кръв­
т а (левкоцити, е р и т р о ц и т и , т р о м б о ц и т и )
и с в ъ р з а н и т е с т я х п о к а з а т е л и (хемогло­
бин, х е м а т о к р и т ) . Т е з и п р о м е н и с а и н ­
д и в и д у а л н и и д о с т и г а т д о 10%. По по­
добен начин се о т р а з я в а и с е д е н е т о с вися-
и ш надолу ръце, при к о е т о к о н ц е н т р а ц и я ­
т а н а к л е т к и т е и в и с о к о м о л е к у л н и т е ве­
ш е с т в а се п о в и ш а в а (локално) до 15%. П р и
заемане на хоризонтално положение
след х о д е н е или изправен с т о е ж , с т а ­
ва о б р а т н и я п р о ц е с - п р е м и н а в а н е н а
т е ч н о с т о т и н т е р с т и ц и у м а в микро­
ц и р к у л а ц и я т а и с е увеличава плазме­
н и я т о б е м и к о н ц е н т р а ц и я т а н а спо­
м е н а т и т е п о к а з а т е л и р е л а т и в н о на­
м а л я в а . В л и я н и я т а н а о р т о с т а з а т а с а из­
разени много по-силно при п а ц и е н т и с о т о ­
ци. В с л у ч а й , ч е с т о й н о с т и т е н а т е з и
п о к а з а т е л и с а о к о л о г о р н а т а и л и дол­
н а т а р е ф е р е н т н а граница, хидродина­
м и ч н и т е п р о м е н и н а о р т о с т а з а т а во­
д я т д о н е д е й с т в и т е л н о повишени или
понижени р е з у л т а т и (т.е. т е излизат
извън р е ф е р е н т н и т е граници) б е з на­
личие н а п а т о л о г и я .
Ф а к т о р и т е , определяши биологичната
вариация н а р е з у л т а т и т е м о г а т д а б ъ д а т
50
разглеждани в д в а а с п е к т а :
>• Ф а к т о р и , ч и е т о в ъ з д е й с т в и е т р я б ­
в а д а с е п о з н а в а и о т ч и т а при т ъ л к у ­
ва н е н а р е з у л т а т и т е : раса, пол (бремен­
н о с т , р а ж д а н е , м е н с т р у а л е н цикъл, ме-
нопауза), в ъ з р а с т , т е л е с е н с т р о е ж , фи­
зическа а к т и в н о с т , сезони, циркадиан-
ни р и т м и , к л и м а т , социална среда и ди­
е т а (влияние н а в о д а т а и п о ч в а т а ) , т е м ­
п е р а т у р а , в л а ж н о с т и др.
> Фактори, ч и е т о въздействие м о ж е
д а с е р е г у л и р а преди изследването:
п р и е м н а храна, физическо н а т о в а р в а н е ,
положение н а т я л о т о , някои навици - к а ­
фе, алкохол, цигари, д и а г н о с т и ч н и и ле­
чебни в ъ з д е й с т в и я .
Повлияване н а л а б о р а т о р н и т е
р е з у л т а т и о т медицински
процедури и лекарства
П е о т ч и т а н е т о н а в л и я н и е т о , к о е т о оказ­
в а т някои д и а г н о с т и ч н и и т е р а п е в т и ч н и
процедури или л е к а р с т в а върху р е з у л т а т и ­
т е м о ж е сериозно д а п р о м е н и смисъла н а
л а б о р а т о р н а т а и н ф о р м а ц и я и д а доведе до
г р е ш н и изводи.
Р е н т г е н о в о и з с л е д в а н е . След изследване
с венозно или перорално приложени р е н т -
г е н о - к о н т р а с т н и в е ш е с т в а ч е с т о се наб­
людава повишено ниво н а серумния б е л т ъ к
и п о л о ж и т е л н а р е а к ц и я з а б е л т ъ к в урина­
т а . Прилагането на к о н т р а с т н и вешест­
ва, к о и т о се и з л ъ ч в а т през ж л ъ ч к а т а , пре­
дизвиква хипербилирубинемия поради кон­
куренция с билирубина з а п ъ т н а излъчва­
не.
О п е р а т и в н и и н т е р в е н ц и и . Оператив­
н а т а н а м е с а или п о - т е ж к и т р а в м и предиз­
в и к в а т неспецифични м е т а б о л и т н и проме­
ни с цикличен х а р а к т е р . О т ч и т а н е т о н а
т я х н о т о в ъ з д е й с т в и е върху л а б о р а т о р н и ­
т е р е з у л т а т и п р е д п а з в а о т грешни изво­
ди при н я к о и усложнения в с л е д о п е р а т и в ­
н и я период или при с ъ п ъ т с т в а и ш заболя­
вания.
С т е п е н т а н а т е з и промени зависи о т т и п а на
използваната упойка, продължителността и обсе­
га на о п е р а т и в н а т а интервенция и о б х в а н а т и т е
органи. Най-често повлияваните показатели са: по­
вишена а к т и в н о с т на к р е а т и н к и н а з а т а , поняко-
га силно и внезапно, поради к о е т о определянето ü
не може да се ползва за изключване н а миокарден
и н ф а р к т в п о с т о п е р а т и в н и я период; повишаване
на АсАТ и АлАТ; повишен брой на левкоцитите; по­
вишени с т о й н о с т и н а СУЕ; повишено ниво на бел­
т ъ ц и т е на о с т р а т а фаза; увеличена концентра­
ция на у р е я т а , п и к о ч н а т а киселина и по-слабо на
билирубина. Това показва, че при т ъ л к у в а н е па
р е з у л т а т и т е в постоперативния период, т е
пе т р я б в а а в т о м а т и ч н о д а с е с р а в н я в а т с
в ъ з п р и е т и т е р е ф е р е н т н и с т о й н о с т и . Диаг­
н о з а т а на вторично заболяване или н а с т ъ п в а щ о
усложнение в т а к ъ в случай т р я б в а да се базира на
допълнителни лабораторни и други изследвания.
Други д и а г н о с т и ч н и или лечебни проце­
дури. При катстсризация на пикочния мехур{осо­
бено постоянен к а т е т е р ) се у с т а н о в я в а т повише­
ни с т о й н о с т и на п р о с т а т н а т а кисела фосфатаза,
к о е т о може да бъде причина за грешно тълкуване
(тумор на п р о с т а т а т а ) . Много физиотерапевтич­
ни процедури са причина за повлияване на ред лабо­
р а т о р н и показатели (левкоцитоза, повишена ак­
т и в н о с т на ензими о т мускулните клетки и др.).
Л е к а р с т в е н и с р е д с т в а . Т я х н о т о въз­
действие се о с ъ щ е с т в я в а основно по два пъ­
т я - независимо или в комбинация (фиг. 3.2):
1. Х и м и ч н о въздействие in vitro (ан алитич­
на интерференция в епруветка) и 2. Биоло­
гично въздействие (фармакологична интер­
ференция in vivo). В много случаи х а р а к т е ­
р ъ т на повлияване на р е з у л т а т и т е о т ня­
кои лсК, ;>ства е п о з н а т , а в други - о с т а в а
неиз I -n 1.
Киолм)НЧИИ te'iiiociH - в м и е с т а и K . I I M K H
(промени в концентрации u структура)
Лиалтнмси процсс
Резултат
Фиг. 5.2. Фармакологична (Ф) и химична (X) лекар­
ствена интерференция
Л и а л и т и ч п а т а и н т е р ф е р е н ц и я се
дължи н а физ икохими чн и т е или химични
свойства на п р и е м а н и т е л е к а р с т в а ( м е т а -
б о л и т и т е им). В ъ з д е й с т в и е т о н а й - ч е с т о
е р е з у л т а т о т с т р у к т у р н и сходства на мо­
л е к у л а т а им с изследваното вещество и о т ­
ч и т а н е н а по-висока к о н ц ен тр ац и я (напр.
т е т р а ц и к л и н и , д о п е г и т и хинидин проявя­
в а т флуоресценция), промени в pH или в ок-
сидоредукционната а к т и в н о с т (напр. в и т .
С). В други случаи се касае за въздействие
върху и м у н о х и м и ч н и т е ензимни реакции
чрез свързване на м е д и к а м е н т а с ензимни­
т е с и с т е м и или с т р а н с п о р т н и т е белтъ­
ци и др. Приема се, че а н а л и т и ч н а т а ин­
т е р ф е р е н ц и я о б х в а щ а около 2 0 ^ о т об­
щите възмоЖноети з а въздействие
в ъ р х у кл и п и ч п о л а бора т орп и т е пока­
затели.
Фармакологичната интерференция
се дължи н а физиологично биохимично въз­
действие върху м е т а б о л и т н и т е процеси в
организма, насочено към патологичния про­
цес, на с т р а н и ч н о действие върху различ­
ни органи и с и с т е м и , и н а т о к с и ч н и т е
е ф е к т и при предозиране и кумулация in
vivo. Фармакологичната интерференция на
л е к а р с т в а т а е р е з у л т а т или о т промени в
с т р у к т у р а т а и ф у н к ц и я т а на различни ор­
гани и т ъ к а н и , или о т промени в с т р у к т у ­
р а т а и к о н ц е н т р а ц и я т а на с ъ д ъ р ж а щ и т е
се в биологичните т е ч н о с т и в е щ е с т в а и
клетки. Механизмите на т о в а лекарстве­
но въздействие са различни:
• Потиснат синтез на някои вещества 6организ­
м а или специфично увреждане HÜ. кръвотворна­
т а , нервната или ендокринната система, на съ­
е д и н и т е л н а т а т ъ к а н и др. Л е к а р с т в а т а влия­
я т и върху органите, осъществяващи медика­
м е н т о з н а т а биотрансформация - черен дроб и
бъбреци. Х а р а к т е р ъ т и с т е п е н т а на т о в а въз­
действие са индивидуално различни и зависят о т
много фактори, някои о т к о и т о са генетично
детерминирани. А п л а с т и ч е н синдром може
да се развие при приемане на фенилбутазон, хло-
рамфеникол, индометацин, сулфонамиди, хини­
дин, т е г р е т о л , хидантоин, ц и т о с т а т и ц и . Си­
лен е ф е к т върху гранулоцитната редица ( о г р а -
иулоцитоза) окозЪлт: сулфонамиди, хлорпро-
мазин, фенилбузатон, индометацин, циклофос-
фамид, противотуберкулозни средства, някои
антихистаминови препарати (симетидин). Дру­
ги медикаменти предизвикват хемолиза - н и т -
рофурани, сулфонамиди, сулфапиридин, хинидин,
нафталени, фенилхидразин или образуват м е т -
хемоглобин - анилинови производни, хинидин, сул­
фонамиди, хлорамфеникол, н и т р и т и и др. Лекар­
с т в е н а тромбоцитопения настъпва по различ­
ни механизми, водещи до продукция на имунни
комплекси ( ц и т о с т а т и ц и ) , или до усиленото им
51
 разрушаване в периферията (някои а н т и б и о т и -
ии, фенилбутазони, guypemuuu, хинин и др.). Т р о м '
б о и и т н а т а фу^щия се уврежда най-често о т ас­
пирин, индометацин, фенилбутазон и др., кои­
т о н а р у ш а в а т баланса между простаииклин и
тромбоксан. С ъ щ и я т механизъм на действие по­
к а з в а т и някои седативни препарати, полимик-
син, антиконвулсивни и др.
• Влияние върху мсханизлгитс на излъчване, напр.
на жлъчен сок (спазъм на сфинктера на Одди при
приемане на опиати).
• Конкуренция за mpaiicnopnгиращ белтък. Проте-
ин-билирубиновото свързване и т р а н с п о р т и р а ­
не се влияе о т антибиотиии, сулфонамиди, сали-
иилати, кофеин, к о н т р а с т н и вещества. Проие-
с и т е н а глюкурониране, сулфатиране и окисле­
ние се в л и я я т о т фенобарбитал, тетраииклини,
феноли, стероиди и др. Тези въздействия се о т ­
р а з я в а т на билирубиновата кониентраиия в се­
рума.
• Филтрационно-реабсорбционно-секреционни бъб­
речни ефекти. Х е л и г т у р и л се наблюдава при
приемане на иитостатии,и. Прскмени в т у б у л -
п а т а с и с т е м а с последваща инфекиия са при­
същи на е ф е к т а о т б е т а - р е и е п т о р н и т е с т и м у ­
л а т о р и (изопреналин). Повечето диуретични
средства п р о м е н я т е л е к т р о л и т н о т о съдържа­
ние на серума и в о д я т преди всичко до х и п о к а -
л и е л т я (дехидратин, фуроземид, салуретин).
Спиронола1т10ните в о д я т до хиncpka^iиелi и я .
Минералкортикоидите з а д ъ р ж а т н а т р и й и во­
да, и в о д я т до алкалоза и хипокалиемия. Хипер-
калиемия се наблюдава след въздействие на де-
поляризиращите миорелаксанти. Естрогените и
пероралните к о н т р а и е п т и в н и средства в о д я т
до х и п е р к а л ц и с л и ш , р а с т е ж н и я т хормон - до
з а д р ъ Л к а н а фосфор u к а л и й и по-малко на
н а т р и й и калиий. Големи дози салииилати пре­
дизвикват м с т а б о л и т н а а ц и у о з а . При въз­
действие на дехидратин и желязосъдържащи пре­
п а р а т и се наблюдава намалено ниво на бикарбо­
н а т и т е в к р ъ в т а и аиидоза.
• Структурни ефект и вурху липопротеиновите
мембрани и к л е т ъ ч н и т е с т р у к т у р и ( и и т о с т а -
тици, глюкокортикоиди, сулфонамиди, имуносуп-
ресори и др.).
• Инхибиране или индуциране на синтез на ензи­
ми, т р а н с п о р т н и и други белтъща, к о е т о нама­
лява или повишава о б щ а т а кониентраиия на пре­
насяното вещество. Е н з и л и ю и и х и б и р а и е Q
чернодробния паренхим се предизвиква о т лидол,
морфин, кумаринови антикоагуланти, фенилбу­
тазони, полови хормони, кортикостероиди, ня­
кои контраиептивни средства. Нихибитори и а
б е л т ъ ч н и я с и н т е з са и и и т о с т а т и щ а , и ан­
тибиотиии (хлорамфеникол, тетраииклини и др.).
Над 300 лекарствени средства предизвикват ен­
52
з и м н а и н д у к ц и я (tump. /ш7ТТЛ*барбитура-
т и , аналептиии, стероидни и анаболни препара­
т и , антихистаминови, транквилизатори, а н т и -
епилептични средства, инсектиииди, етилов ал­
кохол и др.
Л е к у в а щ и я т лекар т р я б в а основно д а
познава не само т е р а п е в т и ч н о т о д е й с т ­
вие н а п р и л аг ан и те л е к а р с т в а и известни­
т е , очаквани е ф е к т и върху о р г а н и т е и сис­
т е м и т е в организма, но и л е к а р с т в е н а т а
и н т е р ф е р е н ц и я , к о я т о воалира р е а л н и т е
с т о й н о с т и н а клинично-лабораторните ре­
з у л т а т и . К о н к р е к т н о т о влияние на някои
лекарствени с р е д с т в а върху лабораторни­
т е п о к а з а т е л и е о т р а з е н о при с ъ о т в е т н и ­
т е аналитични методи.
Практически у к а з а н и я з а предотвра­
т я в а н е н а л е к а р с т в е н о т о въздейст­
вие върху лабораторните резултати:
> Ако с ъ с т о я н и е т о н а болния позволява,
т р я б в а да се изчака със започване на ле­
ч е н и е т о до приключване н а необходими­
т е лабораторни изследвания.
> В случай н а започнало вече лечение (или
не може да бъде изчакано) се в з е м а т мер­
ки в з а в и с и м о с т о т с п е ц и ф и к а т а н а ле­
к а р с т в е н а т а интерференция. Ако се о т ­
н а с я за в ъ з д е й с т в и е in vivo се подбира
при в ъ з м о ж н о с т показател, к о й т о не се
влияе о т с ъ о т в е т н о т о лекарство. Ако
се касае з а въздействие in vitro се т ъ р с и
в ъ з м о ж н о с т з а прилагане на м е т о д с под­
ходящ а н а л и т и ч е н принцип, неповлия-
в а щ се о т с ъ о т в е т н и я м е д и к а м е н т .
>- В случай, че не може да се и з п ъ л н я т т е ­
зи две изисквания о с т а в а в ъ з м о ж н о с т ­
т а при и н т е р п р е т а ц и я н а р е з у л т а т и ­
т е да се о т ч и т а л е к а р с т в е н о т о въздейс­
т в и е . Това ограничава д и а г н о с т и ч н а т а
с т о й н о с т н а и зсл ед ван ето , т ъ й к а т о
няма линейна заВисимост между
доза, к о н ц е н т р а ц и я н а медикамен­
т а Öк р ъ В т а и р а з м е р а н а и н т е р ф е -
ренцията.
ОСНОВНИ НРАВИЛА И ИЗИСКВАНИЯ
ЗА ВЗЕМАНЕ НА БИОЛОГИЧЕН
МАТЕРИАЛ ЗА КЛИНИЧНО-
ЛАБОРАТОРНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ
С п а з в а н е т о н а с т а н д а р т н и условия в пре-
д а н а л и т и ч н и я е т а п н а клинично-лабора-
т о р н и т е изследвания осигурява п о с т о я н ­
но (стационарно) с ъ с т о я н и е на паци­
е н т и т е , п р и к о е т о е ВъзмоЯшо у с т а ­
новяване на леки п а т о л о г и ч н и о т к л о ­
н е н и я в о т д е л н и т е п о к а з а т е л и . Извес-
т о е, че и н т р а и н д и в и д у а л н а т а в а р и а ц и я н а
някои в е щ е с т в а - о л и г о е л е м е н т и , индиви­
дуални б е л т ъ ц и и др. н а д х в ъ р л я о т к л о н е ­
н и я т а п р и по-леки п а т о л о г и ч н и с ъ с т о я ­
ния. Освен т о в а р е ф е р е н т н и т е с т о й н о с т и ,
с к о и т о се с р а в н я в а т р е з у л т а т и т е с а из­
р а б о т е н и при с т а н д а р т н и условия.
Нарушаване н а у с л о в и я т а за вземане н а
биологичен м а т е р и а л се допуска с а м о п р и
п о к а з а н и л з а н с о п и г о Ж н и u~iu с п е ш н и
изслсдМания, с к о е т о следва д а се съобра­
зим при т ъ л к у в а н е н а р е з у л т а т и т е .
О б щ о п р и е т и т е и з и с к в а н и я в предлабо-
р а т о р н и я е т а п в к л ю ч в а т с л е д н и т е пра­
вила:
1. Кръв, у р и н а и други биологични м а т е р и ­
али з а изследване се в з е м а т с у т р и н м е ж ­
ду 7 и 9 часа, н а гладно, след 12-часова хра­
н и т е л н а пауза, след изключване н а алко­
хол през п о с л е д н и т е 24 ч аса, н а кафе и
цигари преди в з е м а н е т о .
2. Преди и по време н а в з е м а н е н а м а т е р и а л
з а изследване се о с и г у р я в а физически и
психически покой н а п а ц и е н т а .
3. Грижливо и т о ч н о се попълва фиш з а ла­
б о р а т о р н о изследване.
4. Кръв з а изследване се в з е м а по възмож­
н о с т в седнало положение н а п а ц и е н т а ,
15-20 м и н у т и след з а е м а н е т о му. Допус­
ка се в з е м а н е и в легнало положение, съ­
що 15-20 м и н у т и след з а е м а н е т о му. Д а
не се седи с висящи надолу ръце. При пов­
т о р н и и следващи изследвания, к р ъ в т а
се в з е м а в с ъ щ о т о положение н а т я л о ­
т о , к а к т о при п р е д х о д н о т о вземане, з а
да се осигури с р а в н и м о с т н а р е з у л т а т и ­
те.
5. Точно д а се с п а з в а т п р о ц е д у р и т е н а ве-
непункция, в з е м а н е н а кръв о т п р ъ с т а ,
събиране н а у р и н а или в з е м а н е н а друг
биологичен м а т е р и а л .
6. Д а се с п а з в а т у с л о в и я т а и изисквания­
т а о т н о с н о срока з а съхранение и изп­
р а щ а н е н а биологичния м а т е р и а л до ла­
бораторията.
Освен о б щ и т е , е необходимо спазване и
н а специални изисквания з а някои видове
анализи (хормонални, л е к а р с т в е н о м о н и т о -
риране, функционални т е с т о в е и др.), кои­
т о с а о т р а з е н и по-долу или в с ъ о т в е т н и ­
т е раздели н а ч а с т 4.
В З Е М А Н Е НА К Р Ъ В ЗА И З С Л Е Д В А Н Е ,
СЪХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТ
К а п и л я р н а кръв
Необходимите пособия, задължителните правила,
т е х н и к а т а на вземане и източниците на грешки
се контролират в клиничната лаборатория.
Необходими пособия:
• Ланцети - малки пластмасови приспособления (за
еднократно ползване) с метален връх. Дълбочи­
н а т а на убождане може да се контролира пос­
редством предпазен фланг. Л а н ц е т а т а трябва
да се избира съответно на м е с т о т о на пункти­
ране и количеството на необходимата кръв. При
кърмачета критичната дълбочина е 2-4 mm, т ъ й
к а т о при по-голяма дължина на ланцетния връх
има опасност о т увреждане на п е т н а т а кост.
• Съдове за събиране на кръвта. Много удобни са
т ъ й нар. микротейнери/микровепги и т.н. ( о т
Затворената система за вземане на кръв), поз­
воляващи посредством специален улей да се съ­
бере достатъчно кръв.
• Дезинфекциращ разтвор - 70% воден разтвор на
спирт.
П о л у ч е н а т а чрез у б о ж д а н е н а к о ж а т а
кръв п р е д с т а в л я в а смес н а кръв о т а р т е -
риоли, капиляри и венули, к а т о т я може д а
бъде разредена о т и н т е р с т и ц и а л н а и и н т -
рацелуларна т е ч н о с т . О т н о с и т е л н и я т дял
н а о т д е л н и т е к о м п о н е н т и варира и силно
зависи най-вече о т кръвния п о т о к к ъ м ко­
ж а т а и о т д ъ л б о ч и н а т а н а убождане. Пред­
варителното затопляне на м я с т о т о на
убождане допринася з а а р т е р и а л и з и р а н е н а
кръвта в кожата.
53
Места з а убоЛдапе.
• п а л м а р н а т а повърхност на g u c т а л п а т а
фаланга на IV п р ъ с т на р ъ к а т а (при яеца
и възрастни) и
• л а т е р а л н а т а или м е д и а л н а т а п л а н т а р -
на повърхност на п е т и ч к а т а при кърма­
чета,
• в ис у лката н а у ш н а т а мида.
Проиедури при вземане на капилярна кръв:
>• Идентификация на п а ц и е н т а ;
> Уверение, че н я м а з а с т о й о т п р и т и с к а ­
не на р ъ к а т а ;
> Избор на м я с т о т о за убождане!IV п р ъ с т ,
п е т и ч к а , ушна висулка);
> З а т о п л я н е н а п е т и ч к а т а / п р ъ с т а (по­
т а п я н е в т о п л а вода (40 0С), за 3-5 min
или а л т е р н а т и в н о химическо з а т о п л я ­
не за 3-5 min.;
> Почистване и дезинфекция на м я с т о т о
с 70% с п и р т е н р а з т в о р ;
> Убождане с л а н ц е т к а
- п ъ р в а т а капка се о т с т р а н я в а със
стерилен т а м п о н
- събира се кръв в м и к р о в е т а / м и к р о -
тейнер
- дезинфекция
- размесване чрез обръщане (около 10 пъ­
т и ) на з а т в о р е н о т о микросъдче;
> Идентифициране на съда с п р о б а т а ;
>• Отбелязване час н а вземане;
> П р е к р а т я в а н е на д и е т а т а .
Чест източник на грешка е л о к а л н а т а
ацидоза поради дълготрайно притискане на
ръката при лежане върху нея (кърмачета,
тежко болни или неподвижни пациенти), не-
о т с т р а н я в а н е на п ъ р в а т а капка, използва­
не на погрешни с ъ д ч е т а (напр. с ЕДТА за хе-
мосгпаза и т . н . ) за събиране на к р ъ в т а , въз­
душни мехури в съда за газов анализ, грешна
идентификация и др.
Вземането на капилярна кръв се приема
по-лесно о т б о л н и т е и може да се ползва,
с а м о а к о а н а л и з ъ т позволиВа: за кръв­
ни газове, глюкоза, л а к т а т , при малки де­
ца, п о в т а р я щ и се з а къс период изследва­
ния, невъзможност за вземане на венозна
кръв.
През п о с л е д н и т е г о д и н и с е препо­
ръчва ограничаване н а анализите в
54
к а п и л я р н а к р ъ в п о р а д и н я к о и същес­
т в е н и н е д о с т а т ъ ц и . В е н о з н а т а кръв е
с п о сто я н ен с ъ с т а в , а к а п и л я р н а т а - с при­
мес на лимфа и не винаги с ъ о т в е т с т в а на
с ъ с т о я н и е т о на изследвания. С ъ с т а в ъ т на
к а п и л я р н а т а кръв зависи о т капилярния
к р ъ в о т о к в п у н к т и р а н а т а о б л а с т , напр.
при локална с т а з а се наблюдава хемокон-
ц е н т р а ц и я и ацидоза.
В е н о з н а крьП
В з е м а н е т о на венозна кръв за лаборатор­
ни изследвания изисква определена последо­
в а т е л н о с т , к а к т о и спазване на ред прави­
ла, осигуряващи стандартизирана проба.
IIpecjjBapumeAiiama п о д г о т о в к а н а па­
ц и е н т а бключВа:
> И д е н т и ф и к а ц и я н а п а ц и е н т а (съвпада
ли и м е т о с лицето);
> Уверение, че са спазени необходимите ди­
е т и ч н и ограничения;
> Разговор с п а ц и е н т а и спечелване на до­
в е р и е т о му, за да се преодолее психичес­
к о т о напрежение (напр. ман и п у л ац и я та
е безопасна, в з е т о т о количество кръв
н я м а да се о т р а з и н а с ъ с т о я н и е т о и
т.н.);
> Избор на лумен (номер) на и г л а т а , с ъ о т ­
в е т н о с ъ с т о я н и е т о н а в е н а т а и необ­
х о д и м о т о количество кръв;
>- Проверка на п р и г о т в е н и т е епруветки -
ЕДТА з а х е м а т о л о г и ч н и анализи, ц и т -
р а т за п о к а з а т е л и т е н а кръвосъсирва-
не и т . н . ;
>• Нанасяне на кодов номер и име на паци­
е н т а върху е т и к е т а на е п р у в е т к и т е ;
>• Уверение, че най-малко 15-20 min пациен­
т ъ т е бил в седнало, респ. легнало поло­
жение (без п р и т и с к а н е на ръцете). Не­
д о п у с т и м а е п р о м я н а т а на положе­
н и е т о на т я л о т о непосредствено
преди Венепункцията.
П р о ц е д у р и п р и В з е м а н е н а Венозна
кръВ ( в е н е п д н к ц и я ) :
> Избор на вена (кубитална, т е м п о р а л н а
и т.н.);
>• Избор н а м я с т о за венепункция (без хе-
м а т о м о т предишни венепункции и не
о т вена с включена с и с т е м а ) ;
> П о ч и с т в а н е о б л а с т т а н а венепункция-
т а (70% с п и р т ) ;
> П р и с т я г а н е н а р ъ к а т а (гумен шлаух, гу­
мен б и н т , т у р н и к е т ) - около 60 m m Hg
з а 30-60 s ( с а м о у о к а т о т р а е Вене-
пупкцията!);
>• Обхващане н а р ъ к а т а и опъване н а ко­
ж а т а , чрез к о е т о и з б р а н а т а вена се фик­
сира в о к о л н а т а т ъ к а н . Не с е п о т у п И а
Върху В е н а т а и п е с е "помпи" ч р е з
свиване и разпускане н а юмрука;
> Осъществяване н а п у н к ц и я т а . Caccj ус­
п е ш н о "влизане" въб В е н а т а , Ведна­
га с е п р е к р а т я в а п р и с т и г а н е т о ;
>• К р ъ в т а т р я б в а свободно да т е ч е о т иг­
л а т а в е п р у в е т к и т е ( в н и м а т е л н а аспи­
рация или вакуум);
> Спазва се с л е д н а т а п о с л е д о в а т е л н о с т
при вземане н а кръв:
I. Епруветки за бактериологично изследване
(хелюкул т у pa)
II. Епруветки без добавени вещества (за серулг)
HL Епруветки е ц и т р а т (за СУЕ, хелгоспгаза)
ГУ.Хепаризирани епруветки ( гишз-ма, mejkku
м е т а л и и др.)
V. ЕДТА-К, епруветки {хематология)
VI. Епруветки с инхибитори на гликолизата (за
глюкоза и л а к т а т )
Ако се взема кръв само з а хемокоагула-
ция, п ъ р в и т е 5 ml се и з х в ъ р л я т .
> Следва неколкократно и в н и м а т е л н о "об­
ръщане" н а е п р у в е т к и т е (5-7 п ъ т и ) за
размесване н а к р ъ в т а с добавените ан-
т и к о а г у л а н т и или ускорители на съсир-
в а н е т о (тромбин);
> След вземане н а д о с т а т ъ ч н о количест­
во кръв, и г л а т а с е изва^кда о т в е н а т а
и м я с т о т о н а убождане се п р и т и с к а със
стерилен т а м п о н и се прави превръзка.
П р о ц е д у р и с л е д о с ъ щ е с т Н п в а н с п а ве-
пепупкцин:
1. И д е н т и ф и к а ц и я н а п р о б и т е . Сравня­
в а т се д а н н и т е за п а ц и е н т а върху епру­
в е т к и т е с т е з и върху л а б о р а т о р н и я
фиш. Проверява се за п ъ л н о т а т а н а ин­
ф о р м а ц и я т а върху фиша. Обозначава се
д а т а и час на вземане н а к р ъ в т а .
2. З а д ъ л ж и т е л н о се в п и с в а т някои о т
п р и е м а н и т е л е к а р с т в а (хормони, а н т и -
коагуланти и др.), или ако има наруша­
ване на д и е т а т а , с ъ х р а н я в а н е т о или
т р а н с п о р т а на к р ъ в т а . Задължително се
включва и с и г н а л з а н а л и ч и е н а опас­
н а и н ф е к ц и я (боледувал или съмнение
з а х е п а т и т , с е р о п о з и т и в е н з а СПИП,
съмнение за хеморагична т р е с к а и др.).
3. П о д г о т о в к а н а п р о б и т е з а т р а н с ­
п о р т (охлаждане или затопляне).
4. И р е к р а т я В а н е н а д и е т а т а .
И з т о ч н и ц и н а грешки при Вземане н а
В е н о з н а кръВ. М е д и ц и н с к и я т персонал
т р я б в а добре да познава и з т о ч н и ц и т е на
грешки при вземане н а кръв, за да б ъ д а т
т е своевременно п р е д о т в р а т е н и :
/. Г р е ш к и п р и п о д г о т о в к а н а в е н е п у н -
кцията
• Грешна идентификация на п а ц и е н т а ;
• Неподготвен п а ц и е н т за вземане на кръв
(напр. не е спазена 12-часова гладна пау­
за);
• Поуспокоен предварително п а ц и е н т (пси­
хически с т р е с ) ;
• П е о т ч и т а н е влиянието н а промени в по­
л о ж е н и е т о н а т я л о т о , непосредствено
преди вземане на кръв.
II. Г р е ш к и п р и о с ъ щ е с т в я в а н е н а венс-
пункция
• Използване на и г л а с т е с е н л у м е н (чес­
т а причина за хемолиза)
• И р о д ъ л Ж и т е л н о п р и с т я г а н е . След
в т о р а т а м и н у т а н а с т ъ п в а локален зас­
т о й с ацидоза и хемоконцентрация, осо­
бено изразена при болни с отоци. Н а с т ъ п ­
в а т промени в някои р е з у л т а т и : пови­
шено ниво на албумин, калций, мед, е р и т -
р о ц и т е н брой, х е м а т о к р и т и хемоглобин,
левкоцити и т р о м б о ц и т и ;
• Венепункция в н е п р и е л г л и в о л 1 я с т о ( х е -
м а т о м , вземане о т включена с и с т е м а )
или преди изсъхване на дезинфекционния
разтвор;
• Потупване върху (хемолиза и /
или а к т и в и р а н е ф а к т о р и т е на съсирва­
но);
• "Помпенс г с ю м р у к п р и е д н о в р е м е н ­
н о п р и с т я г а н е (локална ацидоза и хе­
молиза - повишава се н и в о т о на л а к т а т
и калий с около 20%);
• " Н е с и г у р н а венепункция:' с "бодене" в
п о д к о ж н а т а т ъ к а н около в е н а т а (осво-
55
 бождаба се т ъ к а н е н т р о м б о п л а с т и н и се
а к т и в и р а кръвосъсирвапето - грешни ре­
зултати);
• М н о г о к р а т н и о п и т и /г/а с е "влезе" в ъ в
в е н а т а , к о е т о удължава с т я г а н е т о н а
ръката.
III. Г р е ш к и с л е д в е н е п у н к ц и я т а
• Неразпускане н а еластичним бинт
по време н а вземане н а к р ъ в т а (застой!);
• Енергично аспирираме, к а к т о и с и л н о т о
разклащане са причина з а (хемолиза и ос-
вобждаване н а калий, т р а н с а м и н а з и , ки­
села ф о с ф а т а з а , ЛДХ). Из елган е н а к р ъ в
в спринцовка и прехвърлянето и във
флакони н е се допуска;
• Вземане на кръв о т вена с в к л ю ч е н а с и с -
т е л г а - о п а с н о с т о т "замърсяване" с ин-
фузионен р а з т в о р ;
• Г р е ш н о п о д н а с я н е на е п р у в е т к и т е
(напр. първо за х е м о с т а з а ) ;
• Н е т о ч н о н а п ъ л в а н е с кръв на съдове­
т е с а н т и к о а г у л а н т . Нарушава се с ъ о т ­
н о ш е н и е т о к р ъ в / а н т и к о а г у л а н т . Обра­
зува се или съсирек (при по-голям обем на
к р ъ в т а ) , или се п о л у ч а в а т грешни резул­
т а т и поради р а з р е ж д а н е н а к р ъ в н и т е
к л е т к и (при излишък на а н т и к о а г у л а н т )
- н е а д е к в а т н и с т о й н о с т и на х е м а т о л о -
г и ч н и т е п о к а з а т е л и и СУЕ. К о г а т о ви­
димо не е образуван съсирек, но п р о и е с ъ т
н а съсирване е започнал или има излишък
н а и и т р а т е н р а з т в о р получените резул­
т а т и за п о к а з а т е л и т е н а х е м о с т а з а т а
ще б ъ д а т грешни;
• Грешно н а д п и с а н и и л и ненадписа­
н и е п р у в е т к и и р а з м я н а т а им с т е з и н а
други п а и и е н т и ;
• Н е т о ч н о о б о з н а ч е н а п о р ъ ч к а за изс­
ледваните показатели.
И з б о р н а н а ч и н з а п у н к т и р а н е . Начи­
н ъ т за вземане н а кръв се определя о т вида
н а лабораторния анализ:
> Венозна кръв с ЕДТА-К2 ( К 3 ) - ethylendia-
mine t e t r a a c e t i c acid) kamo а н т и к о а г у ­
л а н т c крайна к о н и е н т р а и и я 1,5 m g / m l
се използва за: хематол ог ичн и изследва­
ния, определяне н а хемоглобин А,; елект­
рофореза на хемоглобин, шиунофенотипи-
зиране на кръвните клетки и др.;
За хематологични изследвания може да
56
се ползва и капилярна кръв, но само след
в н и м а т е л н а преиенка.
> За СУЕ - кръв с и и т р а т е н р а з т в о р (край­
н а к о н и е н т р а и и я н а и и т р а т а 21,0
mmol/1);
>• За изследване п р о и еси те н а к р ъ в о с ъ с и р -
ване и е необходима плаз­
ма. Използва се венозна кръв с а н т и к о а ­
г у л а н т и и т р а т е н р а з т в о р (крайна кон­
и е н т р а и и я н а и и т р а т а 0.105 mol/1);
>• З а по-голяма ч а с т о т к л и н и ч н о - х и -
л ш ч н и т е и з с л е д в а н и л се използва се­
р у м , получен о т венозна кръв без при­
б а в я н е н а а н т и к о а г у л а н т или плазма
(при някои изследвания), получена с ан­
тикоагулант;
>• За о л и г о е л е м е н т и (желязо, иинк, мед
и др.) се и з п о л з в а т спеииални е п р у в е т ­
ки и игли (напр. Metallanalytik);
> За изследване на о л о в о и к а д л т й Ь кръв
- венозна кръв с л и т и е в хепарин к а т о ан­
т и к о а г у л а н т (крайна кониентраиия
14.30 IU/ml);
> За г л ю к о з а в к р ъ в т а - капилярна или ве­
нозна кръв (с инхибитори н а гликолиза-
та);
> Г л ю к о з о т о л е р а н т е н т е с т - капи­
л я р н а кръв;
>• К и с е л и н н о - а л к а л н о с ъ с т о я н и е - ар­
т е р и а л н а или артериализирана капиляр­
на кръв. К а т о а н т и к о а г у л а н т се ползва
е д и н с т в е н о хепарин.
С е р у м или п л а з м а . С е р у м ъ т представ­
лява т е ч н а т а фаза (без ф о р м е н и т е елемен­
т и ) , к о я т о се получава след съсирване н а
п ъ л н а кръв, и е н т р о ф у г и р а н е т о ü и о т д е ­
ляне на съсирека. С е р у м ъ т не съдържа фиб-
риноген. Но същество, т о й е а р т е ф а к т (де­
ло н а ч о в е ш к а т а ръка). С е р у м ъ т е л и ш е н
от факторите н а съсирване и от кръвните
клетки, но е о б о г а т е н с ред клетъчни ком­
поненти от тромбоцитите, както и с ме-
т а б о л и т н и продукти от формените еле­
м е н т и на кръвта.
П л а з м а т а п р е д с т а в л я в а т е ч н а т а фа­
з а (без ф о р м е н и т е е л е м е н т и ) след и е н т р о -
фугиране на кръв, към к о я т о е добавен ан­
т и к о а г у л а н т , инхибиращ проиесите на съ­
сирване. П л а з м а т а включва и фибриноген.
На фиг. 3.3. с х е м а т и ч н о е п р ед ставен а раз­
л и к а т а при получаване на серум и плазма
 Оставя с с 25-30 min без
размееваис,при въз­ Предимства при използване
Kci можност на тъмно
™ r y ,
" , T

Центрофугиран r 1
н а плазльа:
1. И з к л ю ч и т е л н а б ъ р з и н а н а п о л у ч а в а н е
(важно при спешност!). К р ъ в т а може д а
бъде ц е н т р о ф у г и р а н а веднага (не се ча­

иентрофушра
с 2. Н е з н а ч и т е л е н р и с к о т х е м о л и з а н а
1 Центрофугиране
Фиг. 3.3. Схематично представяне на разликата
при получаване на серум и плазма
Налице е и з в е с т н а д и а г н о с т и ч н а разли­
к а при н я к о и п о к а з а т е л и м е ж д у р е з у л т а ­
т и , получени при и з с л е д в а н е т о и м в серум
и т е з и - в п л а з м а ( т а б л . 3.2). П р и ч и н и т е з а
т е з и разлики с а физиологични и т е х н и ч е с ­
ки:
• Някои о т с ъ с т а в к и т е н а к р ъ в т а се из­
р а з х о д в а т по в р е м е н а с ъ с и р в а н е т о : фиб-
риноген, глюкоза, ф а к т о р и н а съсирване;
• Освобождаване о т к л е т к и т е по време н а
съсирване на: калий, ЛДХ, ф о с ф а т , а м о ­
няк, л а к т а т ;
• И н т е р ф е р е н ц и я н а а н т и к о а г у л а н т а : пов­
лияване н а ГГТ, л и т и й (при пл амъко в а фо­
т о м е т р и я и калибриране с л и т и й ) ;
• М е т о д о л о г и ч н о повлияване, вкл. и върху
т и п а н а измерване (монохроматично/
бихроматично);
• Фибриногенът може да окаже интерфе­
ренция в зависимост о т м е т о д а (имуно-
определяния).
0
к а с ъ с и р в а н е т о й),
/
\
е р и т р о ц и т и т е ( с в о б о д н и я т хемоглобин
в п л а з м а о т здрави е с 10 п ъ т и по ниска
к о н ц е н т р а ц и я , в сравнение с т о з и в се­
рум) и о т т р о м б о ц и т о л и з а (в п л а з м а т а
т р о м б о ц и т и т е о с т а в а т непроменени
in vitro). О т т о в а следва, че н я м а псевдо-
хиперкалиемия, к а к в а т о м о ж е д а и м а се­
рума)
3. Н и в о т о н а о т д е л н и т е п о к а з а т е л и с ъ о т ­
в е т с т в а в по-голяма с т е п е н н а с ъ с т о я ­
н и е т о и м i n vivo.
4. Н я м а и н т е р ф е р е н ц и я , д ъ лж а щ а се н а час­
т и ч н о започнал процес н а съсирване (без
оформен съсирек).
5. Н я м а с ъ с и р в а н е след ц е н т р о ф у г и р а н е ,
к а к в о т о м о ж е д а бъде наблюдавано по­
някога в серум. З а д а се избегне п о с т - к о -
а г у л а ц и я т а при получаване н а серум
т р я б в а д а се осигури п р е с т о й н а в з е т а ­
т а кръв поне 25 min н а с т а й н а т е м п е р а ­
т у р а и на тъмно. Пост-коагулацията
м о ж е д а бъде причина з а с ъ щ е с т в е н а
обемна грешка при н а к а п в а н е т о , к а к т о
и за ч е с т и запушвания н а проводната
с и с т е м а на анализаторите.

Т а бл ица 3.2. Показатели с диагностично значима разлика в концентрацията при изследването им

в серум и плазма, получена с антикоагулант-хепарин ( т ? W.Gudcr)
По-Висок По Висок П р о м я н а (В %)
ОспоВиа п р и ч и н а з а п р о м я н а н а
Показател резултат резултат В серум спрямо
резултата В серума
В ссрум В плазма плазма
Общ б е л т ъ к + -5.2 е ф е к т о т фибриногена
Албумин + -4.9
TSH + -4.0
Трансферин + -2.1
Амоняк + + 38.0 т р о м б о ц и т о л и з а , хидролиза н а г л у т а м и н
Лактат + + 22.0 освобождаване о т к л е т ъ ч н и т е е л е м е н т и
Калий + + 6.2 к л е т ъ ч н а лиза, главно о т т р о м б о ц и т и т е *
Неорг.фосфат + + 10.7 освобождаване о т к л е т к и т е
Трийоутиронин + + 5.0
ЛДХ + + 2.5 к л е т ъ ч н а лиза

* Други причини за високото пиво па калия в серума са - хемолиза, екстремна левкоцитоза (> 50,10 /I); всяко
повишение па тромбоцитите с 100. /О9// повишава разликата за калий между серум и плазма с 0.11 mmol/l.
{ а б о л е Ж к а : йод 1% е р а з л и к а т а В р е з у л т а т и т е меАуу серум и плазма з а общ билирубин, желязо, холинестераза,
алкална ф о с ф а т а з а и около 1-2% - з а д и р е к т е н билирубин, триглицериди
57
6. Полученият обем плазма е с около 15-20%
повече в сравнение със серум.
Недостатъци п р и и з п о л з в а н е
п а плазма:
1. Интерферениия на хепарина ( л и т и е в и я т
или амониевият к а т и о н м о г а т да о к а ж а т
влияние върху р е з у л т а т и т е за л и т и й или
амоняк).
2. Метод-зависима интерферениия. Л н т и -
к о а г у л а н т и т е са потенциално свързващи
а г е н т и и ензимни инхибитори.
3. Електрофорезата на общия б е л т ъ к е про­
менена, т ъ й к а т о фибриногенът се поя­
вява к а т о пик в о б л а с т т а на у-глобулини-
т е и може да симулира или маскира М-гра-
диент.
К о р е к т н а т а процедура за получаване на
плазма включва спазване на две важни изиск­
вания:
• При в з е м а н е н а п л а з м а о т п а ц и е н т а
з а д ъ л ж и т е л н о т р я б в а (ja с е о с и г у р и
пълно р а з м е с в а н е н а к р ъ в т а с а н т и -
к о а г у л а н т а ч р е з в н и м а т е л н о обръ­
щ а н е н а е п р у в е т к а т а (8-10 п ъ т и ) б е з
(ja с е д о п у с н е о б р а з у в а н е н а п я н а .
• Между н а ч а л о т о на с т а з а т а ( п о с т а в я ­
не на т у р н и к е т , еластичен б и н т ) и раз­
месване на к р ъ в т а с а н т и к о а г у л а н т се
д о п у с к а т не повече о т 2 min.
Глюкоза
Фиг. 3.4. Влияние на т е м п е р а т у р а т а и в р е м е т о върху к о н ц е н т р а ц и я т а на глюкоза, неорганичен
фосфат, калий и а к т и в н о с т н а ЛлЛТ, при съхранение н а съсирена кръв без а н т и к о а г у л а н т ( n o W. Gli­
der et at.) - • - 4 "C; • - 23 HC; • - 30 "C
58
Съхраняване н а В з е т а т а венозна
крьв и т р а н с п о р т и р а н е т о и
Пай-важните причини за нарушаване качес­
т в о т о на п р о б а т а при н е й н о т о съхране­
ние са: обмел}1ите процеси в к р ъ в н и т е
клетки, к о и т о п р о д ъ л ж а в а т и in vitro; из­
паряване na водната фаза на к р ъ в т а ; хи­
мически реакции', микробиологичноразграЛ-
дане, процеси на осмоза) ефект на светли­
ната-, дифузия на газообразни в е щ е с т в а и
др.
Основните правила за съхранение на взе­
т а т а кръв и т р а н с п о р т и р а н е т о ü до лабо­
р а т о р и я т а са:
1. К р ъ в т а , предназначена за получаване
на серум т р я б в а (ja с е ц е н т р о ф у г и р а и
с е п а р и р а н а й - к ъ с н о (jo е д и н ч а с с л е д
в з е м а н е т о и, к о е т о налага бързо д о с т а ­
вяне в л а б о р а т о р и я т а . Това не е проблем,
к о г а т о л а б о р а т о р и я т а е в близост до кли­
н и ч н и т е звена ( д о н а с я н е т о ü с т а в а с ку­
риер) или болничното заведение разполага
с пневматична система. Бързият транс­
п о р т и к р а т к о т о време на съхранение оси­
гурява възпроизводимост на р е з у л т а т и т е .
Влиянието на т е м п е р а т у р а т а и продъл­
ж и т е л н о с т т а на съхраняване на съсирена
вече кръв има различен е ф е к т върху отдел­
н и т е серумни показатели (фиг. 3.4.).
ЛлЛТ
24 4 8 часа
 Освобождаването на К+ о т еритроцитите е ми­
нимално при стайна температура, т ъ й к а т о се
дължи на температурно-зависимата активност
на Na-, К- АТР-аза. Този ефект силно се повишава и
при 4 0С, и над 30 0С. Концентрацията на глюкоза-
т а се понижава с повишаване на температурата,
докато обратният феномен се наблюдава при не­
органичния фосфат, под действие а к т и в н о с т т а
на фосфатазите в серума и в кръвните клетки.
Патологичните проби могат да покажат откло­
нение о т наблюдаваните ефекти. Зависешото о т
времето понижение на глюкозата в проби о т ця­
лостна кръв е по-изразено при левкоцитоза.
О т д е л е н и я т серум следва да се съхраня­
ва до 3 дни, к о е т о позволява п о в т о р н и ана­
лизи при с ъ м н и т е л н и р е з у л т а т и или ана­
лиз н а п р о п у с н а т и п о к а з а т е л и .
2. Ц я л о с т н а кръК з а к л и н и ч н о - х и -
м и ч н и а н а л и з и н е с е с ъ х р а н я в а 6 хла­
дилник.
3. За съхраняване н а к р ъ в т а по време н а
п р е н а с я н е т о ü се препоръчва т е м п е р а т у ­
р а между 8-12 0С, к о е т о усложнява р а б о т а ­
т а . Компромисно се допуска т о в а да с т а в а
н а с т а й н а т е м п е р а т у р а (20-24 С). Еп­
р у в е т к и т е не бива да се и з л а г а т на дирек­
т н а светлина.
4. П р о б л е м и т е при т р а н с п о р т и р а н е и
съхраняване н а к р ъ в т а н а м а л я в а т , ако се
използва З а т в о р е н а с и с т е м а з а биологичен
м а т е р и а л . С е п а р и р а щ и т е а г е н т и (напр.
гел-сепаратор) д о п р и н а с я т з а о т д е л я н е т о
на серума о т съсирека и ф о р м е н и т е елемен­
т и в оригиналните е п р у в е т к и . Д а с е и з ­
бягва р а з к л а щ а н е н а съровете с кръв­
т а (риск о т хемолиза!). С ъ х р а н я в а н е т о и
п р е н а с я н е т о н а к р ъ в т а да с т а в а ве рт и ка л­
но (ускорява се образуването на съсирека).
5. Д о п у с т и м а т а п р о д ъ л ж и т е л н о с т з а
съхраняване н а кръв с ЕДТЛ зависи о т вида
н а планираното изследване: до 2 h на с т а й ­
на т е м п е р а т у р а (20-24 0 С) за ДКК, СУЕ, фло-
у ц и т о м е т р и я , ц и т о х и м и я , MCV; go Я h за
левкоцитен брой; go 24 Ii за изброяване на
е р и т р о ц и т и , р е т и к у л о ц и т и , определяне на
хемоглобин, х е м а т о к р и т , хемоглобин-Л! и
т р о м б о ц и т е н брой. При с ъ х р а н я в а н е н а
кръв с ЕДТЛ при т е м п е р а т у р а о т 4 до 8 С
с т а б и л н о с т т а на левкоцити, хемоглобин,
е р и т р о ц и т и , х е м а т о к р и т , MCV, т р о м б о -
ц и т и се запазва до 7 д н и .
в. Кръв с ц и т р а т за изследване ф а к т о ­
р и т е на съсирване се изпраща в лаб ора т о­
р и я т а до 1 h след в з е м а н е т о и. О т д е л н и т е
ф а к т о р и и м а т различна т е м п е р а т у р н а
ч у в с т в и т е л н о с т , поради к о е т о следва д а
с е и с к а т у к а з а н и я о т к л и н и ч н а т а ла­
б о р а т о р и я з а н я к о и с п е ц и ф и ч н и изис-
кбания.
7. Ц е н т р о ф у г и р а н е т о се извършва само
при сигурност, че има съсирек (обикновено
са д о с т а т ъ ч н и 25-30 min след вземане н а
к р ъ в т а ) . При п а ц и е н т и , приемащи а н т и -
коагуланти или т а к и в а с д е ф е к т в кръво-
с ъ с и р в а н е т о / ф и б р и н о л и з а т а т о з и процес
е удължен. Центрофугирането за получава­
не н а серум/плазма обикновено се провеж­
да при 1000-1200 х д за 10-15 min. За обичай­
н и т е анализи в хемостазеологията ц и т р а т -
н а т а кръв се центрофугира при 2000 х д за
15 min.
Пробите не бива да се р е ц е н т р о ф у г и р а т
след вземане на ч а с т о т серум или плазма.
Нарушеното съотношение плазмена вода/
к л е т ъ ч е н с ъ с т а в повлиява концентрация­
т а н а клинично-химичните п о к а з а т е л и и
внася грешка в р е з у л т а т а . Пе се рецентро­
ф у г и р а т и проби с гел-бариера.
М и к р о в е т и т е с или без а н т и к о а г у л а н т
м о г а т да се ц е н т р о ф у г и р а т (за получава­
не на серум или плазма) в микроцентрофу-
га с а д а п т е р за е п р у в е т к и т е . Препоръчва
се центрофугиране при 6000-15 000 х д за
минимум 90 s.
Източници н а грешки при съхранява­
н е и пренасяне н а взетата венозна
к р ъ в (jo л а б о р а т о р и я т а . Източници на
грешки в периода на съхранение на к р ъ в т а
и т р а н с п о р т а ü до л а б о р а т о р и я т а м о г а т
да б ъ д а т следните ф а к т о р и :
• Пезатворени епруветки. Н а с т ъ п в а изпа­
ряване на вода и се повишава к о н ц е н т ­
р а ц и я т а н а к р ъ в н и т е с ъ с т а в к и . Кон­
т а к т с прах или цигарен дим о т околния
въздух води до повишаване н а амоняка.
При пренасяне на незатворени епрувет­
ки има о п а с н о с т о т разливане на кръв­
та.
• Съхраняване в близост до топлинни из­
т о ч н и ц и или на пряка слънчева светли­
на е причина за повишени обменни про­
цеси в е р и т р о ц и т и т е , к о е т о е причина
з а хемолиза, д е н а т у р и р а н е н а ензими и
други белтъци. При д и р е к т н а светлина
се п о н и ж а в а т с т о й н о с т и т е за билиру-
бин, порфирини, КК, ф о л а т .
59
• При замърсени съдове н а с т ъ п в а хемолиза. ЛДХ, кисела ф о с ф а т а з а , неорганичен фос­
• П о с т а в я н е н а още т о п л а т а кръв в хла­ ф а т поради лизис н а т р о м б о ц и т и т е .
дилник, веднага след в з е м а н е т о и, причи­ {Внилшние: в и н а г и д а с е п р а в и визу­
нява кондензиране н а вода по в ъ т р е ш н а ­ ален контрол н а плазмата след
т а повъ рхност н а к а п а ч к а т а . При пре­ ц е н т р о ф у г и р а н е т о и а к о плазлгени-
насяне к о н д е н з а т ъ т се влива о б р а т н о и я т слой не е достатъчно прозрачен
води до хемолиза. д а се центрофугира допълнително.
Па фиг. 3.5. е п р е д с т а в е н а номограма за
• Непрехвърляне н а серума в друга е п р у в е т ­
намиране н а RCF. Такава следва да се пре­
к а след съсирване н а к р ъ в т а . Н а с т ъ п в а
д о с т а в я о т ф и р м а т а производител.
хемолиза, д е н а т у р и р а н е н а белтъци, про­
мени в к о л и ч е с т в о т о н а някои м е т а б о -
л и т и - глюкоза, калий, ензими и др., т ъ й 20 000
15 000
к а т о м е т а б о л и т н и т е процеси във фор­ 10 000
30 000
м е н и т е е л е м е н т и п р о д ъ л ж а в а т и in vitro. 20 000
cm 10 000
6 000
• Неизползване н а оригинални (гумени или скорост
et 25 5 000 4 0^)0'
пластмасови) запушалки. Възниква опас­ 20 2 000 5 000
н о с т о т з а м ъ р с я в а н е , абсорбиране н а 18 1 00Ü- 2 000
16 ,-'500
с ъ с т а в к и о т к р ъ в т а (при т а м п о н о т па­ 14 1 500
200
мук или лигнин), 12,,-'' 100 1 000
'10 50
• Замразяване н а плазма/серум не се изпол­ 9
•50
« 20
зва з а съхранение, ако п р е д с т о и е л е к т ­ 7 10
рофореза н а липопротеини при изследва­ 6
3 L
20
не на: липопротеин X; аполипопротеини 5
относителна обороти за
А-1 и В; плазма, п о з и т и в н а н а фибринови центрофужна минута
сила
мономери. Н с с е з с и м р а з я в а и к р ъ в с -3
ЕДТА\
• Груба грешка е, ако след размразяване н а ^2
п р о б а т а (серум, плазма), т я не се разме­ радиус
на въртене
си чрез обръщане н а е п р у в е т к а т а (8-10
п ъ т и ) , с к о е т о се осигурява хомогенизи­
р а н е т о й. ( В н и м а н и е : р а з м е с в а н е т п о Фиг. 3.5. Номограма за определяне на относител­
д а с т а в а без образуване н а пяна). н а т а центрофужна сила (RCF)
Пример за грешен р е з у л т а т , ако не се раз­ RCF е функиия о т радиуса и с к о р о с т т а
меси серума след р а з м р а з я в а н е т о му, е
изследването н а калций, т ъ й к а т о в о т ­
д е л н и т е слоеве н а серума т о й е с различ­ ФАКТОРИ В МРЕДАНАЛИТИЧНИЯ
н а концентрация, напр. в горния слой-0.2 ЕТАП ПОВЛИЯВАЩИ АНАЛИЗА
mmol/1, в средния - 0.6 mmol/1 и в долния - И РЕЗУЛТАТИТЕ
1.75 mmol/1.
• Неспазването н а необходимото време з а Хемолиза
центрофугиране и н а RCF* води до малка
п л ъ т н о с т н а т р о м б о ц и т н и я слой ( т о й С п о н я т и е т о хемолиза се обозначава осво­
е над е р и т р о ц и т н и я ) и наличие н а т р о м - бождаване о т е р и т р о ц и т и т е н а в ъ т р е к ­
б о ц и т и в плазмения слой ( т ъ й нар. т р о м - л е т ъ ч н о т о съдържимо и п о с т ъ п в а н е т о му
б о ц и т е н г р а д и е н т в п л а з м а т а - нарядко в с е р у м а / п л а з м а т а . Установява се след цен­
тромбоцити в горната ч а с т и сгъстя­ т р о ф у г и р а н е н а к р ъ в т а по п р о м е н е н и я
ване към д о л н а т а ч а с т ) . П р и с ъ с т в и е т о ц в я т н а с е р у м а / п л а з м а т а о т освободения
н а т р о м б о ц и т и в п л а з м а т а причинява хемоглобин - о т бледо розово, п о - т ъ м н о чер­
фалшиво повишени р е з у л т а т и за калий, вено до "лакова" кръв. Интерференция мо­
ж е да и м а и при много ниска к о н ц е н т р а ­
• RCF - относителна центрофужна сила (вж глава 6). ция н а хемоглобин, без т я да е видима за
Изчислява се по емпирична формула или чрез номог- невъоръжено око. Хемолизата не винаги се
рама.
придружава о т освобождаване н а хемогло­
бин (напр., ако к р ъ в т а се съхранява н а хлад­
но, без замразяване). И н т е р ф е р е н ц и я вър­
ху р е з у л т а т и т е оказва и л и з и р а н е т о н а
т р о м б о ц и т и и г р а н у л о ц и т и , к о е т о нас­
т ъ п в а при п р о д ъ л ж и т е л н о и неправилно
съхранение н а к р ъ в т а .
Х е м о л и з а т а може да повлияе клинично-
л а б о р а т о р н и т е а н а л и з и / р е з у л т а т и по ня­
колко механизма:
> Чрез поВишаВане н и в о т о н а Вът­
р е к л е т ъ ч н и с ъ с т а В к и В извънкле­
т ъ ч н а т а т е ч н о с т (серум/плазма).
Освобождаване н а в ъ т р е к л е т ъ ч н о т о съ­
държимо н а к р ъ в н и т е к л е т к и може да
с т а н е in vitro, по време на вземане на про­
бата, както и във всички следващи стъп­
ки на преданалитичния етап. Хемоли­
з а т а води до нарушаване в различна с т е ­
пен н а с ъ о т н о ш е н и е т о между с ъ с т а в к и ­
т е в п р о б а т а и до промени в р е з у л т а т и ­
т е , напр. з а ЛДХ, АсАТ, АлАТ, калий.
ЛДХ. Активността на ензима рязко се повиша­
ва, к а т о при 0.5 g/1 хемоглобин в серума пови­
шението е 1.35 пъти, при 1 g/1 - 1.6 пъти; при 2
g/1 - 2 пъти и при 5 g/1 хемоглобин - 4 пъти над
действителната в серума;
АсАТ. При 0.5 g/1 хемолобин - а к т и в н о с т т а е
1.25 пъти; при 1 g/1 - 1.5 пъти; при 2 g/1 - 1.8
пъти и при 5 g/1 - 2 пъти над действителната
активност;
АлАТ- при 0.5 g/1 хемоглобин - а к т и в н о с т т а е
1.15 пъти; при 1 g/1 - 1.25 пъти; при 2 g/1 - 1.35
пъти и при 5 g/1 - 1.5 п ъ т и над действителна­
т а активност;
Калий - при 1 g/1 хемоглобин - нивото му е 1.08
пъти; при 2 g/1 - 1.1 п ъ т и и при 5 g/1 - 1.8 пъти
над действителното.
>• О п т и ч н а и н т е р ф е р е н ц и я . Дължи се
н а цвета на хемоглобина, к о й т о се про­
меня с т е ч е н и е н а в р е м е т о при съхране­
ние на п р о б а т а . К о н т р о л ъ т върху т а з и
интерференция може да се о с ъ ш е с т в и не
с а м о чрез д ъ л ж и н а т а н а в ъ л н а т а при
о т ч и т а н е , но съшо и посредством праз­
ната (blank) проба.
> Метосл-заВисеща и н т е р ф е р е н ц и я
{химична, биохимична или имунологич­
на интерференция). Например а д е н и л а т -
к и н а з а т а , к о я т о се освобождава о т кръв­
н и т е к л е т к и повлиява п о в е ч е т о м е т о ­
ди за определяне а к т и в н о с т т а н а креа-
т и н к и н а з а т а и зависи о т концентраци­
я т а н а и н х и б и т о р и т е н а аденилаткина-
з а т а в р е а к ц и о н н а т а смес. Псевдоперок-
с и д а з н и я т е ф е к т н а хемоглобина повли­
я в а някои диазо м е т о д и (напр. определя­
не н а билирубин в серум и др.).
В а ж н о изискВане, к о е т о т р я б В а
с т р и к т н о д а с е спазВа В к л и н и ч н а т а
л а б о р а т о р и я е проВеждане н а предва­
р и т е л е н Визуален к о н т р о л н а проби­
т е п р е д и анализ, з а д а н е с е п р о п у с н е
наличието н а хемолиза.
Важно за п а ц и е н т и лекуваш лекар е да
не се пропусне in vivo хемолиза. Това може
да с т а н е чрез сравняване н а последовател­
ни проби о т п а ц и е н т а и чрез изследване на
т ъ й нар. ч у в с т в и т е л н и маркери за in vivo
хемолиза, напр. хаптоглобин и насочено об­
съждане на клиничната информация. J\opu
ccuito п р и с ъ л т с н и е з а i n vivo х е м о л и ­
з а л е к у в а щ и я т л е к а р т р я б в а д а бъде
у в е д о м е н . Освен т о в а всяко неочаквано
повишение на ч у в с т в и т е л н и т е за наличие
на хемолиза показатели би могло да се счи­
т а к а т о р е з у л т а т о т т а к а в а in vitro, ос­
вен ако т я може да бъде изключена. Пара­
л е л н о т о повишение н а свободен хемогло­
бин, калий и висока а к т и в н о с т на ЛДХ е ха­
р а к т е р н о за т е з и случаи. In vitro хемолиза­
т а може да бъде п р е д о т в р а т е н а чрез с т р о ­
го спазване и с т а н д а р т и з и р а н е на проце­
д у р и т е в преданалитичния е т а п : с т а н д а р ­
т н и игли. З а т в о р е н а с и с т е м а за вземане
н а кръв, калибрирани центрофуги, подходя-
ищ т е м п е р а т у р а за съхранение на в з е т а ­
т а кръв. Използването на плазма в м е с т о
серум може съшо да намали х е м о л и з а т а ,
специално чрез избягване освобождаването
н а в ъ т р е к л е т ъ ч н о съдържимо о т т р о м б о -
цитите.
В л а б о р а т о р и я т а т р я б В а д а с е поз-
наВа В ъ з д е й с т В и е т о н а х е м о л и з а т а
Върху т е с т о В е т е , к о и т о с е п о л з В а т ,
к а к т о и д а с е проВери нейния е ф е к т
според ииформацията В п р о с п е к т и т е
па производителя.
Липемия
С е р у м ъ т / п л а з м а т а при липемия изглеж­
д а т м ъ т н и в различна с т е п е н - о т леко из­
разена м ъ т н и н а до млечнобял ц в я т пора­
ди повишеното съдържание на липопроте-
61
UHU. В с ъ щ н о с т м ъ т н и н а т а се дължи н а по­
в и ш е н а т а к о н ц е н т р а ц и я н а триглицериди-
т е . Такива проби се н а р и ч а т липемични. Ли-
п е м и я т а може да бъде причина за фалшиво
ниски или фалшиво високи лабораторни ре­
з у л т а т и поради д е й с т в и е т о н а няколко ме­
ханизма:
Нехомогенност иа серума/плазма­
т а . Б о г а т и т е н а триглицериди липопро-
т е и н и и з п л у в а т в горния слой при ц е н т р о ­
фугиране. Ако след центрофугиране о т д е ­
л е н и я т серум/плазма не се размеси внима­
т е л н о , т р и г л и ц е р и д и т е и други липидни
с ъ с т а в к и м о г а т да о с т а н а т неравномер­
но разпределени. Това е причина з а непро­
порционално висока к о н ц е н т р а ц и я н а ли-
п и д и т е в г о р н и я слой ( н е р е а л н о високи
с т о й н о с т и на с ъ о т в е т н и я показател),
к а к т о и интерференция при определяне на
други серумни показатели, напр. общ бел­
т ъ к . О т друга с т р а н а и з м е с т в а н е т о н а во­
д а т а о т л и п и д и т е в г о р н а т а фаза н а про­
б а т а води до по-ниска к о н ц е н т р а ц и я н а во­
д о р а з т в о р и м и т е к о м п о н е н т и (електроли­
т и и метаблити).
И з м е с т В а п е т о п а В о д а т а о т липиди­
т е е причина също з а по-високата концен­
т р а ц и я н а К + и Na + , изследвани чрез ди­
р е к т н о йон-селективно измерване в срав­
нение с п л а м ъ к о в а т а ф о т о м е т р и я . В н я ­
кои случаи л и п и д и т е м о г а т да и з м е с т я т
над 10% о т в о д н о т о съдържимо н а серума/
плазмата.
И н т е р ф е р е н ц и я н а м ъ т н и н а т а . Фо­
т о м е т р и ч н и т е процедури са ч у в с т в и т е л ­
ни н а м ъ т н и н а п о ч т и при всички дължини
н а вълните. Това води до абсорбция, изра­
зена в различна с т е п е н .
Физикохимични м е х а н и з м и н а ин­
т е р ф е р е н ц и я . Л и п о п р о т е и н и т е в проба­
т а може да инкорпорират в липофилните
с ъ с т а в к и , намалявайки т я х н а т а д о с т ъ п ­
н о с т за а н т и т е л а . По подобен начин о т ли­
п о п р о т е и н и т е м о г а т да б ъ д а т нарушени
в з н а ч и т е л н а с т е п е н електрофоретични и
хроматографски процедури.
М ъ т н и н а т а н а п р о б а т а може да бъде ус­
т а н о в е н а и с невъоръжено око. Освен т о в а
т я може да се измери при специфична дъл­
жина н а в ъ л н а т а . Степента на интерфе­
ренция върху всеки м е т о д може д а бъде оп­
ределена чрез прибавяне на различни коли­
чества от проба, взета о т х и п е р л и п е м и -
62
чен п а ц и е н т к ъ м друга бистра проба, ка­
т о впоследствие се анализира концентра­
ц и я т а на двете проби поотделно. Тригли­
ц е р и д и т е м о г а т да б ъ д а т о т с т р а н е н и о т
п р о б а т а чрез у л т р а ц е п т р о ф у г и р а н е
и л и п р с ц и п и т а ц и я , след к о е т о анали­
з ъ т се п о в т а р я вече с и з б и с т р е н а т а про­
ба. В други случаи с м я н а т а н а методологи­
я т а може да подпомогне елиминирането на
и н т е р ф е р е н ц и я т а , дължаща се н а липиди­
т е . Така напр. с в т о р а дължина н а вълна­
т а може да се компенсира м ъ т н и н а т а . Ал­
т е р н а т и в н о може да се използва blank-npo-
ба без с ъ о т в е т н и т е р е а к т и в и , но при иден­
т и ч н и условия. Във всеки един случай сте­
п е н т а и т и п а на м ъ т н и н а т а следва да бъ­
де документирана и съобщена, като се за­
пази част от пробата за по-късно опреде­
л я н е за верификационни цели.
В л а б о р а т о р и я т а следва да се докумен­
т и р а т всички процедури за т р е т и р а н е н а
липемични проби. О т производителите н а
т е с т - к и т о в е е необходимо да се и з и с к в а т
сведения о т н о с н о предварително и з п и т в а ­
не и н т е р ф е р е н ц и я т а н а л и п е м и я т а , к а к т о
и осигуряване н а н е о б х о д и м а т а информа­
ция във фирмения п р о с п е к т .
Интерференция
на серумни а н т и т е л а
С е р у м н и т е а н т и т е л а с а ч е с т интерфери-
р а щ ф а к т о р в к л и н и ч н а т а лаборатория, но
поради т р у д н о т о им доказване ч е с т о се
п р е н е б р е г в а т . Тези а н т и т е л а н а й - ч е с т о
п о в л и я в а т броя н а ф о р м е н и т е ел емен ти -
е р и т р о ц и т и , л евк о ц и ти и т р о м б о ц и т и .
Н а л и ч и е н а е н д о г е н н и а н т и т е л а . Ка­
сае се за два т и п а ендогенни а н т и т е л а .
Автоантитела. Те м о г а т да о к а ж а т вли­
яние върху и м у н о м е т р и ч н и т е м е т о д и .
Пример за т а к о в а въздействие е наличие­
т о н а а в т о а н т и т е л а , насочени срещу т р и -
йодтиронин и тироксин. К о н ц е н т р а ц и я т а
н а т и р е о и д н и я хормон е лъжливо повише­
на, т ъ й к а т о м а р к е р ъ т е свързан не само
към а н т и т я л о т о , добавено към п р о б а т а ,
но също и към а в т о а н т и т я л о т о . Наличие­
т о н а антифосфолипидни а н т и т е л а в плаз­
м а т а повлиява аРТТ при кръстосани про­
би с нормална плазма, т ъ й к а т о а н т и т я -
л о т о свързва фосфолипидите, включени в
реактива.
Хетерофилни антитела. Механизмът на
образуването им все още не е познат. В ня­
кои случаи т я х н а т а интерференция може да
има диагностично значение. Лко т е з и а н т и ­
т е л а са с а н т и м и ш а специфичност е възмож­
на аналитична грешка при анализи с използ­
ване на миши моноклонални а н т и т е л а .
М а к р о е п з и л г и . Всички д и а г н о с т и ч н о из­
ползвани ензими п о к а з в а т склонност за об­
разуване на комплекси с имуноглобулини -
л г а к р о е н з ш м и . В р е з у л т а т о т т о з и фе­
номен се увеличава полуживота н а т е з и ен­
зими и о т т а м - фалшиво повишена ензим­
на а к т и в н о с т . Ф е н о м е н ъ т н а макроензи-
м е м и я т а е у с т а н о в е н най-напред при въз­
р а с т н и п а ц и е н т и с хронични заболявания.
Пример в т о в а о т н о ш е н и е е макроамила-
з е м и я т а - привидно висока серумна а к т и в ­
н о с т на а м и л а з а т а (комплексът к а т о мак-
ромолекула не преминава в у р и н а т а ) и неп­
роменена а к т и в н о с т на ензима в у р и н а т а .
Друг пример е образуването на макрокреа-
т и н к и н а з а о т I и II т и п . При I т и п се касае
за комплекс между имуноглобулин и КК-ВВ.
При II т и п - за полимери н а митохондриал-
н а т а КК, к о и т о м о г а т да б ъ д а т определе­
ни електрофоретично. Д в а т а т и п а н а мак-
ро-креатинкиназа ч е с т о повлияват т о ч ­
н о с т т а на к о л и ч е с т в е н о т о определяне на
КК-МВ чрез КК-М инхибираши а н т и т е л а
(фалшиво повишение на КК-МВ).
ЕДТЛ-зависещи а н т и т е л а . Касае се за ан­
т и т е л а , к о и т о се а к т и в и р а т в присъствие
н а ЕДТА и с п о с о б с т в а т за образуване на
т р о м б о ц и т н и а г р е г а т и и псевдотромбоци-
т о п е н и я (без хеморагична диатеза). Колко­
т о повече се удължава в р е м е т о о т вземане
на к р ъ в т а и изброяване на т р о м б о ц и т и т е ,
толкова по-силно изразено е понижението на
т р о м б о ц и т н и я брой. При т р о м б а с т е н и я
л и п с в а т т р о м б о ц и т н и т е мембранни гли-
се у с т а н о в я в а нисък брой при същевремен­
но нормална хемоглобинова концентрация;
повишение н а MCV; ниски с т о й н о с т и на хе-
м а т о к р и т а и високи нива на МСН и МСНС.
Левкоцитния и т р о м б о ц и т н и я брой е фал­
шиво по-висок; К р ъ в н а т а н а т р и в к а показ­
ва аглутинация на е р и т р о ц и т и т е . Студо-
в а т а аг л у ти н ац и я може да повлияе корек­
т н о т о определяне на кръвногруповите ан­
тигени. О т друга с т р а н а с т у д о в и т е аглу-
т и н и р а щ и а н т и т е л а м а с к и р а т други ан­
т и т е л а , к о е т о може да промени имуномет-
р и ч н и т е процедури.
К р и о г л о б у л и и и . Криоглобулините в серу­
м а изкристализират при о с т а в я н е на про­
б а т а на с т а й н а т е м п е р а т у р а . Образувани­
т е частички и м а т различна форма и м о г а т
да фалшифицират най-често висок левкоци-
т е н брой. Високата концентрация на кри-
оглобулини повлиява не само е р и т р о ц и т н и я
брой, но и хемоглобина (флокулационен фено­
мен), к а к т о и т р о м б о ц и т н и я брой (псевдот-
ромбоцитоза). При оглед на кръвна натрив­
ка може да се в и з у а л и з и р а т флокулирани
тъмносини кристали, без да има увеличение
на л е в к о ц и т н и т е к л е т к и . Ф е н о м е н ъ т на
псевдолевкоцитозата зависи о т продължи­
т е л н о с т т а на престоя на пробата, т е м п е ­
р а т у р а т а , к о н ц е н т р а ц и я т а на глобулините
и взаимодействието на криоглобулините с
други плазмени протеини.
В т а б л и ц а 3.3. е обобщено влиянието на
о с н о в н и т е ф а к т о р и о т преданалитичния
е т а п върху в е л и ч и н а т а на някои клинич-
нолабораторни показатели.
Т а б л и ц а 3.3. Въздействие на някои фактори о т
преданалитичния е т а п върху л а б о р а т о р н и т е
резултати
ФАКТОР И
Показател Дълготрайно Положе­
Хемолиза ние па
на Erys
пристягане
на р ъ к а т а тялото
(-) +
Албумин +

Ензими + не винаги не винаги

копротеини lib и Ilia. Такива т р о м б о ц и т и не
Желязо Ф (-)
м о г а т да р е а г и р а т с ЕДТА-зависещи а н т и ­ +

Ф +
тела. В зависимост о т обема и ф о р м а т а н а Калий +

т р о м б о ц и т н и т е агрегати, т е м о г а т да бъ­ Калций + Ф +

д а т причина за лъжлива левкоцитоза. Натрий (-) (-) (-)

Ф +
Общ б е л т ъ к +
Cmyf/otfu а г л у т и п и п и . Високият т и -
Ф +
т ъ р на с т у д о в и а г л у т и н и н и срещу е р и т ­ Холестерол +

р о ц и т и т е е причина за т я х н а т а а г л у т и ­ + - д о к а з а н е ф е к т ; (-) - н е с ъ щ е с т в е н или л и п с в а щ

ефект; Т' 4 - повишение
нация и при е л е к т р о н н о т о им изброяване
63
 IIpu у с т а н о В я В а н е н а яВни и з т о ч н и ­
ц и н а г р е ш к и , л а б о р а т о р и я т а н е след-
Ва д а н р о В е ж д а е ъ о т В е т н о т о и з с л е д ­
ване. К р и т е р и и т е , к о и т о са основание з а
о т к а з о т с т р а н а н а л а б о р а т о р и я т а з а из­
вършване н а анализи и определяне н а про­
б а т а к а т о непригодна са:
1. Н е а д е к в а т н а или несигурна идентифика­
ция н а п р о б а т а .
2. Използване н а грешно подбрана е п р у в е т ­
к а (напр. ЕДТА з а анализ н а ф а к т о р и т е
на х е м о с т а з а т а ) .
3. Н е д о с т а т ъ ч н о количество кръв.
4. Наличие н а хемолиза или силна липемия
(ако л а б о р а т о р и я т а не р а з п о л а г а с ъ с
с р е д с т в а з а елиминирането им).
5. Наличие н а съсирек в е п р у в е т к а с а н т и -
коагулант.
6. Некоректно количество кръв в е п р у в е т ­
ка с антикоагулант.
7. Късно или грешно т р а н с п о р т и р а н а про­
ба (без лед, к о г а т о т о в а се изисква, не-
з а т в о р е н а е п р у в е т к а з а изследване н а
амоняк и т . н . )
ЗАТВОРЕНА СИСТЕМА
ЗА БИОЛОГИЧЕН МАТЕРИАЛ
Използването н а з а т в о р е н а с и с т е м а з а взе­
мане н а биологичен м а т е р и а л в п р а к т и к а ­
т а е добра п р е д п о с т а в к а за о т с т р а н я в а н е
н а голяма ч а с т о т р а з г л е д а н и т е по-горе
грешки. З а т в о р е н а т а с и с т е м а за вземане
н а кр ъв (Monovette, Venoject, K a b e v e t t e ,
Vacutainer и gp.) и м а peg п р е д и м с т в а з а ра­
б о т а т а и в клиниката, и в амбулатория­
т а , и в клиничната лаборатория:
За клиниката и а м б у л а т о р и я т а
• Безопасна р а б о т а н а персонала (няма кон­
т а к т с к р ъ в т а н а болния).
• Възможност з а получаване н а кръв само
чрез вакуум или по два начина (при ня­
кои с и с т е м и ) - чрез вакуум или аспира­
ция. По-удобни з а р а б о т а , особено в с т а ­
ционарни звена с а с и с т е м и т е с д в е т е
в ъ з м о ж н о с т и (напр. при " т р у д н и вени",
деца, т е ж к о болни и т . н . а с п и р а ц и я т а
улеснява успешно вземане н а к р ъ в т а ) . То­
зи т и п е п р у в е т к и са и икономически по-
64
изгодни, т ъ й к а т о позволяват донапъл-
ване, ако се налага смя н а н а в е н а т а , напр.
при колапс н а с ъ ш а т а , излизане н а игла­
т а и др. д о к а т о при т е з и , к о и т о са само
с вакуум, при с м я н а н а в е н а т а т р я б в а
да се вземе нова епруветка, поради нару­
шения вакуум.
• Улеснена р а б о т а , благодарение н а ц в е т о ­
во кодиране н а е п р у в е т к и т е з а различни­
т е видове анализи ( ц в е т о в о т о кодиране
е включено в ISO-нормативи).
• Дозиран обем и н а к р ъ в т а , и н а а н т и к о а -
г у л а н т а , к о е т о осигурява т о ч н о с т н а
анализите.
• Не се н а л а г а т п о в т о р н и изследвания (сил­
но намален брой н а случаите с хемолиза
или съсирване н а к р ъ в т а ) .
• Фабрично з а т в о р е н и т е и е т и к е т и р а н и
пластмасови е п р у в е т к и са едновременно
и т р а н с п о р т н о с р е д с т в о - сигурно пре­
насяне без счупване, без разливане на ма­
т е р и а л а , без риск за р а з м я н а между па­
циенти.
• Бързо о т д е л я н е н а серум (25-30 min), кое­
т о съкрашава п р е с т о я н а к р ъ в т а до цен­
т р о ф у г и р а н е т о ü и скъсява в р е м е т о за
получаване н а р е з у л т а т и т е . П р е д л а г а т
се и е п р у в е т к и със сепарирагцо веидест-
во (гел), к о е т о след центрофугиране н а
в з е т а т а кръв ограничава обмена между
е р и т р о ц и т и и серум.
За клиничната лаборатория
• Безопасна р а б о т а з а персонала през це­
лия цикъл н а р а б о т а .
• Е п р у в е т к и т е са едновременно средство
и з а т р а н с п о р т , и з а центрофугиране.
Липсва прехвърляне в ц е н т р о ф у ж н и и
други съдове.
• Е п р у в е т к и т е м о г а т д и р е к т н о да се за­
р е ж д а т в а н а л и з а т о р и с тапопробивач,
ако л а б о р а т о р и я т а разполага с т а к ъ в
т и п а п а р а т у р а или след о т в а р я н е т о им.
• Скъсен преданалитичен е т а п в лаборато­
р и я т а : бързо съсирване благодарение на
ускоряваши с ъ с и р в а н е т о ф а к т о р и в еп­
р у в е т к и т е з а серум, центрофугиране на
с ъ ш и т е т е з и епруветки и п о с т а в я н е т о
им в а п а р а т и т е з а анализ.
• Точно спазено съотношение между кръв­
т а и добавените в е ш е с т в а , к о е т о осигу-
 рява непроменен м а т е р и а л за изследване
• Ускорен анализ и скъсено време за получа­
ване н а р е з у л т а т и т е .
• Точна идентификация н а р е з у л т а т а ( е т и ­
к е т и щрих-код).
• Сигурно обезопасяване н а о т п а д ъ ц и т е .
П р е д п о ч и т а т се екологично ч и с т и плас­
тмасови епруветки, т . е . т а к и в а к о и т о
и з г а р я т go СО2 и Н 2 0 . Н а л и ч и е т о н а
с т ъ к л е н и видове (напр. з а СУЕ) при ня­
кои п р о и з в о д и т е л и т в ъ р д е много з а т ­
руднява л а б о р а т о р и я т а - о т д е л н а дезин­
фекция преди изхвърляне и о т д е л н о съ­
биране к а т о негорими о т п а д ъ ц и .
ПолучаВане, с ъ х р а н я в а н е
и изпращане на урина з а изследване
Е д и н и ч н а п о р ц и я . Р у т и н н и я т уринен
анализ е една о т н а й - ч е с т о н а з н а ч а в а н а т а
ла бо р а то р на процедура. З а к а ч е с т в е н и хи­
мически реакции и бактериологични изслед­
вания се използва т ъ й нар. случайна или
единична порция. П ъ р в а т а с у т р е ш н а ури­
н а е подходяща най-вече з а изследване н а
к л е т ъ ч н и я с ъ с т а в и наличие на цилиндри.
Ilpafiiivia з а с ъ б и р а и с и и з п р а щ а и с и а
у р и н а : С цел с т а н д а р т и з и р а н е на условия­
т а е необходимо спазване на определени изис­
квания:
1. И з п о л з в а т се химически ч и с т и съдове.
П р е д п о ч и т а т се п л а с т м а с о в и за еднок­
р а т н а употреба. За бактериологично изс­
ледване - с т с р и ^ т и съдове. Много удоб­
ни са специалните съдове за урина о т З а т ­
в о р е н а т а с и с т е м а за вземане на биологи­
чен материал.
2. Точно нанесени данни за п а ц и е н т а върху
лабораторния фиш - име, с т а я , легло, код,
к а к т о и име на лекуващия лекар и меди­
ц и н с к а т а с е с т р а . Точно обозначаване на
анализа за изследване.
3. Точно нанесени данни за п а ц и е н т а на е т и ­
к е т а върху съдовете - име, код, с т а я , лег­
ло. С р а в н я в а т се с д а н н и т е върху фиша.
4. Използва се п ъ р в а т а / в т о р а т а с у т р е ш н а
урина, отделена след 12 часова пауза, без
прием на храна и т е ч н о с т и .
5. Взема се урина о т средна с т р у я след т о а ­
л е т на г ен и тал и и те.
6. Бързо прехвърляне на у р и н а т а в предназ­
начените за ц е л т а контейнери о т Затво­
р е н а т а с и с т е м а и изпращането ü в лабо­
р а т о р и я т а . В случай, че у р и н а т а се дос­
т а в я в л а б о р а т о р и я т а в незатворени ча­
ши (обичайна п р а к т и к а у нас) изследване­
т о т р я б в а да се проведе до 1 h след о т д е ­
л я н е т о й.
Прегледът на най-често срещаните греш­
ки при анализа на урина показва, че т е са пре­
димно о т п р е д а н а л и т и ч п о е с т е с т В о :
престояла урина, замърсени съдове, изслед­
ване на нехомогенизирана урина и т . н . Ка­
ч е с т в о т о на к о н т е й н е р и т е за събиране на
урина е изключително к р и т и ч е н ф а к т о р -
идеалният контейнер трябва да бъде съд с
широко гърло и подходящ размер. Най-добре е
да се разполага със съдове за е д н о к р а т н а
употреба, предварително щателно провере­
ни за интерференция. При миене в лаборато­
р и я т а т р я б в а да има сигурност, че детер-
г е н т и т е са надеждно о т с т р а н е н и . З а бак­
териологични анализи koHmeüiwpume
т р я б в а д а б ъ д а т с т е р и л н и . Изследване­
т о на с у т р е ш н а т а урина има няколко пре­
д и м с т в а : висока с т е п е н на концентрация
(висок осмолалитет), к о е т о показва запазе­
на концентрационна възможност на бъбре­
ц и т е , и че отклоненията, дължащи се на ди­
е т а , физическа а к т и в н о с т , и положение на
т я л о т о са елиминирани. Да се има предвид,
че продължителното обездвижване води до
екстремно повишаване екскрецията на кал­
ций - о т 160% на в т о р а т а седмица, до 250% -
на ш е с т а т а . Екскрецията на електролити­
т е в у р и н а т а силно намалява след 4-дневно
гладуване и прием само на дестилирана во­
да: на н а т р и й - с 80%, на калий - с 50%, на
калций и магнезий - с около 40%, хлорид - с
70%, креатинин - с 25%, а се повишава излъч­
в а н е т о на амоняк - с 144%.
Урина з а к о л и ч е с т в е н и изследвания. За
количествени изследвания (белтък, глюко-
за, хормони и др.) е необходимо събиране на
урина за определен период - 3, 12 или 24 h,
т ъ й нар. диуреза - Дз, Д12, Д24 и т н -
Правила з а събираис н а у р и н а
з а количествен анализ:
>> Осигуряват се ч и с т и и изплакнати с дес-
65
 т ш ш р а н а вода съдове с е т и к е т , върху
к о й т о са нанесени д а н н и т е н а паииен-
та;
> О т л а б о р а т о р и я т а се осигурява консер­
в а н т , съобразно анализираното в е щ е с т ­
во;
>• Т о а л е т н а в ъ н ш н и т е г е н и т а л и и преди
уриниране;
> По време н а събиране н а у р и н а т а , изс­
л е д в а н и я т приема определено количест­
во ( о т 200 ml до 1,5 1) билков чай или во­
да, според вида н а изследването;
>• Събирането н а урина започва между 6 и
8 h;
> П ъ р в а т а п о р ц и я у р и н а (в н а ч а л н и я
час) с е и з х в ъ р л я ;
> Р е г и с т р и р а се ч а с ъ т н а о т д е л я н е н а пос­
л е д н а т а п о р и и я урина. През в р е м е т о
между началния и крайния час н а съби­
ране н а урина, м и ю д и я т а е според нуж­
д и т е на пациента;
> О б е м ъ т н а с ъ б р а н а т а урина се измерва
т о ч н о с градуиран цилиндър;
>• Размесва се с ъ б р а н о т о количество ури­
н а и о т нея в е п р у в е т к а за урина о т З а т ­
ворена с и с т е м а се и з п р а щ а т з а изслед­
ване в л а б о р а т о р и я т а о к о л о 10-20 m l
урина;
> К о н т р о л върху л а б о р а т о р н и я фиш. На­
н а с я т се с л е д н и т е данни: име и код н а
п а ц и е н т а , с т а я , легло, лекар, медицинс­
к а с е с т р а , час на започване и приключ­
ване събирането на урина, точно изме­
реното количество, и м е т о н а т е с т а ,
к о й т о е назначен.
По време н а събирането, у р и н а т а може
да се съхранява н а хладно (4-6 0С), при кое­
т о не е необходим химически к о н с е р в а н т с
изключение н а анализи, к о и т о и з и с к в а т
т а к ъ в . За някои анализи освен съхранява­
не н а хладно се изисква подкисляване н а ури­
н а т а (pH 1,5-2.5): з а определяне н а калций,
магнезий, о к с а л а т , ф о с ф а т и др., а за други
- алкализиране (pH > 8.0): з а определяне н а
пикочна киселина, микроалбуминурия и др.
Пай-често използваните консерванти, ко­
и т о се о с и г у р я в а т о т к л и н и ч н а т а лабора­
т о р и я са:
1. Тимол, 5 ml/1 урина о т 10% т и м о л в
2-пропанол - з а повечето анализи ( к р е а т и -
нин, глюкоза, хидроксипролин, урея, пикоч-
66
н а киселина); 2. Н а т р и е В азид, 10 mmol/1
урина - за глюкоза, урея, калий, калций, ок­
с а л а т ; 3. 5 mol/1 HCl - 25 ml/1 урина за серо-
т о н и н , катехоламини и м е т а б о л и т и т е им,
5-хидрокси индолоцетна киселина, калций,
магнезий, ф о с ф а т ; 4. Н а т р и е В к а р б о н а т ,
2 g/1 урина (за поддържане н а алкалност-
т а ) - порфирини, уробилиноген, порфобили-
ноген и др. 5. О ц е т н а к и с е л и н а - консер­
в а н т при събиране н а урина за аминолеву-
линова киселина, к а т е х о л а м и н и , хлорид,
кортизол, дезоксикортикостероиди, м е т а -
нефрини, ванилбадемова киселина и др; 6.
Ь о р н а к и с е л и н а (за подкисляване) при из­
следване н а алдостерон, дехидроепиандрос-
т е р о н , естриол, естроген, 5-хидроксииндо-
л о ц е т н а киселина, хомогентизинова кисе­
лина, 17-хидроксикортикостероиди, прег-
нандиол, 17-кетостероиди и т е с т о с т е р о н .
При събиране н а урина з а количествен
анализ са възможни следните и з т о ч н и ц и
н а грешки:
• Използване н а н е а д е к в а т е н з а вида н а из­
следването к о н с е р в а н т ;
• Загуба н а урина по време н а м и к ц и я т а ;
• Включване н а п ъ р в а т а порция урина, ко­
я т о подлежи н а изхвърляне в началния
час;
• Измерен е о б е м ъ т само н а една порция и
уеднаквен с т о з и н а всяка следваща;
• Некоректно измерване н а ч а с т о т ури­
н а т а и записване к а т о цял обем или пол­
зване н а неподходящи м е р и т е л н и съдо­
ве, най-често с т ъ к л е н и банки.
Гръбначномозъчна т е ч н о с т
(ликВор)
В п о в е ч е т о случаи се използва гръбначно­
мозъчна т е ч н о с т , получена чрез лумбална
пункция. П р а в и л а т а за събиране и изпра­
щ а н е н а м а т е р и а л а з а изследване включ­
ват:
> След успешна пункция п ъ р в и т е 4-5 кап­
ки се изхвърлят;
> Ликворът се събира в прозрачни и с т е ­
рилни е п р у в е т к и ;
> С ъ б и р а т се най-малко т р и отделни пор­
ции по 3 ml ликвор, к о и т о се н о м е р и р а т .
По този начин е възможно разграничава­
не на кървене от засегнат кръвоносен съд
 по време на п у н к ц и я т а о т действител­
но кървав ликвор;
> Проверява се и м е т о н а п а ц и е н т а върху
с ъ д о в е т е с ликвор и фиша с назначено­
т о изследване;
>• Ликворът се изпраща в л а б о р а т о р и я т а
с куриер в е д н а г а с л с д п у н к ц и я т а ;
> П ъ р в а т а порция ликвор се използва за из­
брояване н а к л е т к и и т я х н о т о диферен­
циране. Ликворът е х и п о т о н и ч е н р а з т ­
вор, поради което настъпва бърз разпад
на к л ет к ите;
> В т о р а т а / т р е т а т а е п р у в е т к а се изпол­
з в а т з а всички о с т а н а л и изследвания.
Последната епруветка се запазва за бак­
териологично изследване.
> П о в е ч е т о клинично-химични п о к а з а т е ­
ли са с по-дълъг срок н а съхраняване в
хладилник при 4 до 8 С>С; общ б е л т ъ к и
електрофореза - до 6 дни, албумин и иму-
ноглобулини - до 2 месеца;
>• Кървав ликвор би следвало да не се из­
следва химически и з а к л е т ъ ч е н брой, а
само з а намаз ка и т ъ р с е н е н а п а т о л о ­
г и ч н и к л е т к и ( т у м о р н и , левкемични),
освен при особени случаи ( п у н к ц и я т а не
може да бъде п о в т о р е н а , съдебно-меди-
цински е к с п е р т и з и и др.).
Изследването на клетъчния с ъ с т а в
(брой к л е т к и ) се прави до 1 h. Н а л и ч и е т о
н а л е в к о ц и т и - над 6 х 103/(il не променя
к о н ц е н т р а ц и я т а н а л а к т а т до 3 h н а с т а й ­
н а т е м п е р а т у р а . При н е о б х о д и м о с т о т
продължително съхранение (за някои видо­
ве анализи) по-добре е съхранението да се
осъществи н а -70 0С, о т к о л к о т о при -20 0С,
т ъ й к а т о в р ъ з к и т е н а олиго/слонални-
т с протеини се нарушават след в ме­
с е ч н о с ъ х р а н е н и е п р и - 2 0 0 С, а п р и -
7 0 ° С - о с т а в а т и н т а н к т н и . За клинич­
но-химични анализи, з а к о и т о се н а л а г а
т р а н с п о р т до друга л а б о р а т о р и я се препо­
р ъ ч в а т с л е д н и т е мерки з а съхранение н а
ликвора:
- до 1 h - не се охлажда,
- до 3 h - т р а н с п о р т и р а се върху лед; не
се д о б а в я т консерванти, не се замразя­
ва и не се фиксира
- дълговременно съхранение - ц ен т роф у­
гиране (20 min при 180 g) з а о т с т р а н я ­
ване н а к л е т к и т е и незабавно замразя­
ване при -70 С в с т ъ к л е н и или полипро-
пиленови съдове, добре з а т в о р е н и
И у п к т а т и о т серозии кухини
(плеВралиа, к о р е м н а , п е р и к а р д и а л н а )
С ъ б и р а т се в химически ч и с т и с т ъ к л е н и
съдове (колба, банка) с предварително пос­
т а в е н а н т и к о а г у л а н т - хепарин (1 ml/1 или
н а т р и е в ц и т р а т (около 4 ml/1 п у н к т а т ) за
п р е д о т в р а т я в а н е н а желиране. Изпраща се
за общо изследване. З а м о р ф о л о г и ч н о из­
с л е д в а н е н а к л е т ъ ч н и я с ъ с т а В с е изп­
р а щ а т 5-10 ml о т п о с л е д н и т е п о р ц и и
о т п у н к т а т а , к о и т о са най-богати н а кле­
т ъ ч е н м а т е р и а л . Те се с ъ б и р а т отделно в
е п р у в е т к а с 1-2 капки р а з т в о р на ЕДТА-Кд
или хепарин.
Фекалии з а изследване
С ъ б и р а т се в химически ч и с т и и добре з а т ­
ворени съдове. Да н я м а примес на вода или
урина. За окултно кървене, при използване
н а бензидинова проба, се провежда т ъ й нар.
бяла д и е т а (без месо и зеленчуци).
ПОВЛИЯВАНЕ НЛ ЛАБОРАТОРНИТЕ
РЕЗУЛТАТИ В АНАЛИТИЧНИЯ
И СЛЕДАНАЛИТИЧНИЯ ЕТАН
Задача н а к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я е да
осигури к о н тр о л над ф а к т о р и т е , к о и т о мо­
г а т да к о м п р о м е т и р а т р е з у л т а т и т е в
процеса на изследване. О т значение са след­
н и т е фактори; избор н а подходящ м е т о д ,
к а ч е с т в о на р е а к т и в и т е , качество на апа­
р а т у р а т а ; с ъ с т о я н и е на е л е к т р и ч е с к о т о
з а х р а н в а н е (промени в е л е к т р и ч е с к а т а
енергия се о т р а з я в а т н а функциониране­
т о на ч у в с т в и т е л н и звена в анализатори­
т е - електроника, т е р м и ч е н режим, дози­
ращи у с т р о й с т в а и др.); влажност и т е м ­
п е р а т у р а в р а б о т н и т е помещения; съхра­
няване н а м а т е р и а л а и р е а к т и в и т е ; калиб­
риране и юстиране; квалификация на пер­
сонала и т . н .
За контролиране и о т с т р а н я в а н е на
а н а л и т и ч н и т е грешки допринася провеж-
67
дането иа с и с т е м е н В ъ т р е л а б о р а т о -
реи контрол, к а к т о и у ч а с т и е т о на
клиничната лаборатория междуна­
р о д н а или н а ц и о н а л н а с и с т е м а з а Вън­
ш н а о ц е н к а н а к а ч е с т В о т о н а л абора ­
торните резултати.
Въпросите, о т н а с я щ и се до осигурява­
не к а ч е с т в о т о н а р е з у л т а т и т е в анали­
т и ч н и я и следаналитичния е т а п са р а з г ­
л е д а н и п о д р о б н о ff с л е д в а щ и т е г л а в и .
Ч е с т о т а т а н а значими о т к л о н е н и я н а
резултата о т действителната стойност
поради пропуски в следаналитичния е т а п
е под 0.5%. Тези грешки включват: погреш­
но записан р е з у л т а т при п р е д а в а н е т о му
по т е л е фона (Внимание: да се иска повта­
ряне на данните от записващия)', погреш­
но нанесен р е з у л т а т върху чужд фиш; не-
Книгонис
Д о ч е в Д. Стратегия н а к л и н и ч н о - л а б о р а т о р н а т а д и а г н о с т и к а .
В: Ш и п к о в Т, К р ъ с т е в 3 (ред). Л а б о р а т о р н и т е резултати в
д и а г н о с т и ч н и я п р о ц е с . С., М е д и ф и з к , 13-26.
Цветкова Т, П а в л о в П. О с н о в н и п р а в и л а п р и и з с л е д в а н е н а
болните и оценка на клинично-лабораторните резултати
( п р а к т и ч е с к о указание). П л о в д и в , В М П , 1988.
Calam К К , C o o p e r M H . R e c o m m e n d " o r d e r o f d r a w " for
colecting b l o o d s p e c i m e n s into additive c o n t a i n i n g tubes. Clin
C h e m 28, 1 9 8 2 , 1 3 9 9 - 1 4 0 3 .
G a u g e r C A . S p e c i m e n collection. In: Lotspeich-Steininger C h A ,
Stiene-Mortin E A , K o e p k e J A (eds). Clinical h e m a t o l o g y -
principles, procedures, correlations. Philadelphia - N e w York
- L o n d o n - H a g e r s t o w n , Lippincott, 1992.
Griffith J M . S a m p l e collection a n d processing. In: Tilton R C ,
B a l o w s A, H o h n a d e l D C , Reiss R F (eds). Clinical laboratory
medicine. St L o u s - Baltimore - B o s t o n - C h i c a g o - L o n d o n -
Philadelphia - S y d n e y - Toronto, M o s b y Year B o o k , Inc.,
1992, 2 5 - 3 9 .
68
т о ч н о изчислена или грешно нанесена с т о й ­
н о с т при мануална р а б о т а (пропусната или
п р е м е с т е н а д е с е т и ч н а точка). При съвре­
м е н н а т а а н а л и т и ч н а а п а р а т у р а грешки о т
т а к ъ в х а р а к т е р няма. Въвеждането на ин-
формаиионна с и с т е м а в болничните заве­
дения изияло премахва много о т рискове­
т е н а следаналитичния е т а п .
Важен м о м е н т е следлабораторния
е т а п В клиниката, т . е . тълкуВането
на р е з у л т а т и т е . Задължително тряб-
Ва д а с е п о з н а В а т и о т ч и т а т Всички
ф а к т о р и , к о и т о В л и я я т Върху лабора­
т о р н и я р е з у л т а т : биологични, лекар-
с т В е н и и д и а г н о с т и ч н и п р о ц е д у р и , на­
р у ш е н и я н а и з и с к в а н и я т а з а Вземане,
с ъ х р а н я В а н е и т р а н с п о р т и р а н е н а би­
ологичния м а т е р и а л и др.
Kaplan A, J a c k R, O p h c i m К, Toivola В, Lyon A. Introduction to
clinical chemistry. In: A Kaplan et al (eds) Clinical chemistry
(4' h ed). Baltimore - Philadelfia - H o n g K o n g - L o n d o n -
M u n i c h - S y d n e y - T o k y o , Williams a n d Wilkins, 1995.
M e i t e s D. S k i n p u n c t u r e a n d b l o o d c o l e c l i o n t e c h n i q u e s for
infants: update a n d problems. Clin c h e m . 34, 1980, 1988.
National c o m m i t t e e for clinical laboratory standards publication
П З - А 2 : procedurer for collection o f diagnostic blood speci­
m e n s by venipuncture (2 nd ed), Villanova, PA, N C C L S , 1984.
National c o m m i t t e e for clinical laboratory standards ( N C C L S )
d o c u m e n t M29-T. Tentative guideline, protection o f labora­
tory w o r k e r s from infectious disease transmitted dy blood,
b o d y fluids a n d tissue, 9, 1989, 1.
O x f o r d BS. D o v e n b a r g e r S. S p e c i m e n collection. In: Bishop M L ,
Üuben-Endelkirk JL, F o d y E P (eds). Clin c h e m (2 nJ ed). Phila­
delphia - N e w York - L o n d o n , Lippincott, 1992, 63-101.
Sibilia R, L o h f f M , Bush D , M a h a f f e y R. J o s e p h R. A n a l y t e
stability in closed containers after 6 d a y s storage. Clin c h e m
3 5 , 1989, 1158-63.
 Осигуряване качеството на
лабораторните резултати
КАЧЕСТВЕНИЯТ КОНТРОЛ
В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ
Л. Лсимбрсва
ОСНОВНИ ПОЛОЖ Е НИЯ И ПОНЯТИЯ
О т д е л н и я т р е з у л т а т о т клиничнолабора-
т о р н о т о изследване е о т н о с и т е л н а величи­
на, т ъ й к а т о о т р а з я в а в л и я н и е т о не само
на евентуален патологичен процес, но и на
редица фактори: о т една с т р а н а - биологич­
н а т а вариация, д и а г н о с т и ч н и т е и лечебни
въздействия върху п а ц и е н т а , а о т друга -
грешките в преданалитичния, аналитичния
и следаналитичен е т а п .
Ц е л н а л а б о р а т о р н и м а н а л и з с пос­
т и г а н о т о н а т о ч е н р е з у л т а т в опре­
делени граници, к о й т о д а бъде изпол­
з в а н з а в з е л ш н е н а а д е к в а т н и льеди-
цинеки решения (диагноза, люнитори-
р а н е н а лечението, прогноза). Пости­
г а н е т о н а т а з и цел се о с ъ щ е с т в я в а в ч е т и ­
ри последователни е т а п а :
> Решение з а извършване н а изследване,
подготовка н а п а ц и е н т а , подготовка на
п р о б а т а за анализ - преданалитичен
етап.
> Изследване п р о б а т а н а п а ц и е н т а , к о е т о
завършва с получаване н а лабораторен ре­
з у л т а т - аналитичен етап.
> Оценка н а а н а л и т и ч н о т о качество на ре­
зултата.
> Медицинска оценка - т ъ л к у в а н е на резул­
тата.
К а ч е с т в е н и я т к о н т р о л н а лабораторни­
т е р е з у л т а т и изисква познаване на многоб­
р о й н и т е източници н а грешки, за к о и т о е
отговорна л а б о р а т о р и я т а , к а к т о и на т е ­
зи о т извънлабораторен произход.
Грешките, п р о и з т и ч а ш и о т п р е д а н а ­
л и т и ч н и я е т а п м о г а т да з а е м а т по-го­
лям дял о т о б ш а т а вариация, о т к о л к о т о
а н а л и т и ч н и т е грешки. Л а б о р а т о р н и я т ре­
з у л т а т , к а к т о е о т р а з е н о в глава 3., може
да бъде повлиян о т п о д г о т о в к а т а на паци­
е н т а за изследване, о т времето, начина и
условията на вземане на биологичния м а т е ­
риал; о т т р а н с п о р т а , съхранението и пос­
л е д в а щ а т а п о д г о т о в к а н а м а т е р и а л а за
анализ. Необходими са редица организаци­
онни мерки и с р е д с т в а за постигане с т а н ­
д а р т и з а ц и я и ограничаване на грешките о т
т о з и е т а п на лабораторно-диагностичния
процес.
Грешките о т а н а л и т и ч н и я , е т а п мо­
г а т да се д ъ л ж а т на избрания м е т о д на из­
следване, начина на калибрация, на използ­
в а н и т е химикали и реактиви, н а а п а р а т у ­
р а т а и д о п ъ л н и т е л н и т е прибори за анализ,
к а к т о и на квалификацията на лаборатор­
ния персонал. Концепцията за грешките в
а н а л и т и ч н и я е т а п и т е х н и я произход и
оценка ше б ъ д а т разгледани със специално
внимание.
I'peuikume в с л е д а н а л и т и ч н и я е т а п са
в по-голямата си ч а с т груби, възникват по-
рядко, напр. грешка в изчисленията, размяна
на р е з у л т а т и на пациенти, размяна на „про­
б а / р е з у л т а т " и др., но подобно на преданали-
т и ч н и т е м о г а т да к о м п р о м е т и р а т прециз­
но извършени лабораторни анализи.
Осигуряването на качеството в
к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я {Quality as­
surance) изисква планирани и с и с т е м ­
н и д е й с т в и я Вьб В с и ч к и е т а п и н а ла­
бораторно-диагностичния процес, с
ц е л п о с т и г а н е н а с и г у р н о с т , ч е лабо­
раторните резултати отгоВарят на
определени р е г л а м е н т и р а н и изисква­
н и я з а к а ч е с т В о (ISO).
За правилното управление на а н а л и т и ч ­
н о т о к а ч е с т в о е необходимо да се позна­
в а т неговите т р и главни компонента:
69
• изискванията за аналитично качество
• създаване н а а н а л и т и ч н о к а ч е с т в о (лабо­
раторна практика)
• контролна с и с т е м а - вътрелабораторен
качествен контрол (ВЛКК) и външна оцен­
к а н а к а ч е с т в о т о (ВОК)
ИЗИСКВАНИЯ ЗЛ АНАЛИТИЧНО
КАЧЕСТВО
Колко т о ч н и т р я б в а да б ъ д а т лаборатор­
н и т е р е з у л т а т и , з а да м о г а т да о с и г у р я т
в з е м а н е т о н а правилни медицински реше­
ния? В л а б о р а т о р н а т а медицина о т г о в о р ъ т
н а т о з и въпрос не е еднозначен, т ъ й к а т о
се използват разнообразни подходи.
Въз о с н о б а н а р е ф е р е н т и и т е и п т е р В а -
ли. Според класическата концепция н а Tonks
д о п у с т и м а т а а н а л и т и ч н а вариация може
да бъде изчислена въз основа н а рефе ре н т-
ния интервал. Съвременните изисквания за
приемлива вариация са:
• з а с л у ч а й н и т е грешки. CV < 1/12 о т ре-
ферентния интервал, изразен в процент от
средната аритмети чна на интервала,
• з а с и с т е м н и т е грешки, b i a s < 1 / 4 о т
референтния интервал, изразен като про­
цент от средната аритметична на ин­
тервала.
Тази концепция е залегнала в „Препоръки­
те на Германската медицинска асоциация
за осигуряване на качеството в медицинс­
ките лаборатории", въпреки някои компро­
миси, п р и е т и чрез съгласуване поради все
огце с у б о п т и м а л н о т о с ъ с т о я н и е н а някои
аналитични м е т о д и .
С п о р е д м е д и ц и н с к и т е н у ж д и . Този на­
чин н а оценка се основава н а м н е н и е т о н а
о п и т н и лекари - клиницисти и лаб ора т ор ­
ни специалисти, к о е т о е използвано з а из­
числение н а д о п у с т и м и т е граници за лабо­
р а т о р н а грешка. К о е ф и ц и е н т и т е н а вариа­
ция (CV), изчислени по т о з и начин и м а т ре-
л а т и в н а информация, т ъ й к а т о са основа­
ни на субективна преценка.
Според д а н н и н а р е ф е р е н т н и лабора­
т о р и и . Р е з у л т а т и т е н а р е ф е р е н т и и т е ла­
боратории м о г а т да б ъ д а т сериозна основа
70
за изчисление н а д о п у с т и м и я CV. Но при оп­
ределяне н а к р и т е р и и т е за д о с т о в е р н о с т
( т о ч н о с т ) се изхожда о т положението, че в
п р а к т и к а т а за много лабораторни показа­
т е л и с ъ ш е с т в у в а разлика между получена­
т а о т л а б о р а т о р и я т а методично-зависима
с т о й н о с т и " и с т и н с к а т а с т о й н о с т " . Това
се о т р а з я в а о т р и ц а т е л н о н а диагностична­
т а ц е н н о с т н а р е з у л т а т а и ограничава
с р а в н и м о с т т а между р е з у л т а т и т е на раз­
лични лаборатории. В една по-нова концеп­
ц и я S t a m m предлага д о с т о в е р н о с т т а
( т о ч н о с т т а ) да се оценява със стойност­
та, получена с референтен метод, като
максимално разрешените отклонения се
уточнят след съобразяванесмедицинската
оценка на резултата. В САЩ се прилага кон­
цепцията за общата аналитична грешка,
к о е т о има предимство при и н т е р п р е т а ц и ­
я т а на р е з у л т а т и т е и за по-достъпно пред­
с т а в я н е пред к л и н и ц и с т и т е .
През последните години т е з и подходи бя­
ха к р и ти чн о преоценени и к а т о о с н о в н а з а
определяне на международно утВърде-
ни д о п у с т и м и граници з а грешки В
а н а л и т и ч н и я е т а п с е препоръчВа би­
ологичната концепция, поради с В о я т а
п р о с т о т а и универсалност и същест-
ВуВането на б о г а т а и добре докумен­
т и р а н а информация за биологичната
Вариации н а л а б о р а т о р н и т е показа­
тели.Според р а б о т н а група на IFCC (1996)
м а к с и м а л н а т а д о п у с т и м а граница за слу­
чайна грешка, изразена к а т о CV се определя
по ф о р м у л а т а :
CV ana | yt i ca i < 0.5 CVW
CVW - биологична интраиндивидуална вариация
Максималната допустима системна
грешка, изразена к а т о bias%, се определя по
формулата:
Bias11Ilalytk,ai < ().2rV(CV;+CVr,)
CVb - междуиндивидуална биологична вариация
Д о п у с т и м а т а обша а н а л и т и ч н а грешка
(ТЕ - total error), п р е д с т а в е н а к а т о сбор о т
с л у ч а й н а т а и с и с т е м н а грешки, се опреде­
ля по една о т д в е т е формули, според избра­
ния доверителен и н т е р в а л :
ТЕ < 1.65x1 + В {при 95% доверителен м о с т т а на грешките о т аналитичната
интервал) к о н ц е н т р а ц и я , т ъ й к а т о е и з в е с т н о , ч е ре-
ТЕ < 2.33x1 + В {при 99% доверителен л а т и в н и т е грешки с е у в е л и ч а в а т с нама­
интервал) ляване н а к о н ц е н т р а ц и я т а .
Понякога при ясна и специфична клинична
I - случайната грешка (imprecision), изразена с т р а т е г и я за диагноза и мониториране на лече­
к а т о CV нието, к а к т о е за серумен холестерол, НЬА1с, до­
В - с и с т е м н а т а грешка, изразена к а т о bias % пустимите граници за грешки се определят спо­
ред максимално приемливата диагностична чув­
Независимо о т т е з и публикувани вече в науч­ с т в и т е л н о с т на б а з а т а на експертна оценка,
н а т а л и т е р а т у р а критерии, едва ли в близко бъ­ становище на клиницисти, работни групи и др.
деще ще б ъ д а т възприети окончателни между­ Но т а к и в а случаи са няколко в медицинската
народно възприети критерии. Една о т с е р и о з ­ практика, поради което биологичната концепция
н и т е причини з а т о в а e a с ъ щ е с т в е н и т е остава като най-добра основа за определяне на
различия в с п е ц и ф и ч н о с т т а и т о ч н о с т т а общите изисквания за аналитично качество на
на използваните о т клиничните лаборато­ голяма част от лабораторните показатели.
рии р у т и н н и м е т о д и , а д р у г а т а - зависи­ Н а т а б л . 4.1 с а п р е д с т а в е н и д о п у с т и м и -
Т а бл ица 4.1. Препоръки за допустими CV, bias и обща аналитична грешка, изчислени
въз основа на биологичната вариация (no Ricos и съавт.,1999)
Обща грешка Обща г р е ш к а
Показател cv% Bias% Показател CV% Bias%
ТЕ% (р<0.05) ТЕ% (р<0.05)
АлАТ 12.2 12.0 32.1 Кортизол 10.5 12.5 29.8

Албумин 1.6 1.3 3.9 Креатинин 2.2 3.4 6.9

Алфа-амилаза 4.8 7.8 15.7 Левкоцити 5.3 5.6 14.6

аПТТ (аРТТ) 1.4 2.3 4.5 АПВП (HDD 3.6 5.2 11.1

АсАТ 6.0 5.4 15.2 ЛПНП (LDL) 4.3 6.8 13.6

AT III 2.6 4.0 8.3 Мед 4.0 5.2 11.8

АФ 3.2 6.4 11.7 Натрий 0.4 0.3 0.9

Билирубин - дир. 18.4 14.2 44.5 Общ белтък 1.4 1.2 3.4

Билирубин - общ 12.8 10.0 31.1 Пикочна к-на 4.3 4.8 11.9

ГГТ 6.9 10.8 22.2 Протромб. вр. 2.0 2.0 5.3

Гликиран IIb 1.4 1.8 4.1 Триглицериди 10.5 10.7 28.0

Глюкоза 3.3 2.5 7.9 ттх 9.9 8.4 24.6

Еритроцити 1.6 1.7 4.4 Урея 11.4 8.6 27.3

Желязо 13.3 8.8 30.7 феритин 7.5 5.0 17.3

Иг А 2.5 9.3 13.4 фибриноген 5.4 4.8 13.6

Иг Г 2.3 4.3 8.0 ФСХ (FSH) 5.1 8.4 16.7

Иг М 3.0 11.9 16.8 св. Т4 (FT4) 3.8 3.6 9.9

Калий 5.8 св. Т3 (FTj) 1.7 1.7 4.5

2.4 1.8

Калций 0.8 2.4 Хемоглобин 1.4 1.8 4.1

1.0

КК 38.1 Хлориди 0.6 0.5 1.5

11.4 11.5

КК-МВ - актив. 24.1 Холестерол 3.0 4.1 9.0

9.9 7.8

КК-МП - % 16.5 Холинестераза 3.5 3.1 8.9

3.5 10.8

КК-МИ - маса 31.2 Хомоцистеин 3.9 7.7 14.1

9.2 16.0
71
•
me граници за случайна, с и с т е м н а и обща
а н а л и т и ч н а грешка, изчислени въз основа н а
л и т е р а т у р н и данни з а биологичната вари­
ация при 95% д о в е р и т е л е н и н т е р в а л . О т
т а б л и ц а т а се вижда, че при някои с ъ с т а в ­
ки под с т р о г х о м е о с т а т и ч е н контрол, напр.
к а т о н а т р и й , калий, калций, хлор, рИ, кръв­
ни газове и др., биологичната вариация е мал­
ка, д о к а т о при някои крайни м е т а б о л и т и
к а т о урея, пикочна киселина, к л е т ъ ч н и ен­
зими т я д о т и г а до 25%. На т а б л . 4.2 са пред­
с т а в е н и к р и т е р и и т е н а Германското меди­
цинско д р у ж е с т в о и използваните в САЩ
(CLIA, 88) к р и т е р и и з а а к р е д и т а ц и я н а кли­
н и ч н и т е лаборатории.
Д о п у с т и м и т е граници за грешки н а ла­
б о р а т о р н и т е р е з у л т а т и не т р я б в а да се
р а з г л е ж д а т к а т о нещо постоянно. Те в мно­
го случаи з а в и с я т о т с т е п е н т а н а усъвър-
шенствуване н а а н а л и т и ч н и т е м е т о д и и ла­
б о р а т о р н а т а техника. Бъдещите системи
за к а ч е с т в е н к о н т р о л т р я б в а да р а б о т я т с
гъвкави граници з а грешки, с ъ о т в е т н и н а
м е д и ц и н с к о т о предназначение н а лабора­
т о р н и я р е з у л т а т (за диагноза, мониторинг,
скрининг) при р а з л и ч н и т е клинични с и т у а ­
ции и за о т д е л н и т е медицински специалнос­
ти.
ВЪТРЕЛАБОРАТОРЕН
КАЧЕСТВЕН КОНТРОЛ
п р е д с т а в е н а със следния линеен модел (no J.
Buttner, 1995):
Аналитичен резултат = условна истинска стойност
системни грешки
други грешки
случаиии грешки
През 1993 г. след съгласуване о т 7 между­
народни организации {ISO, IFCC, IUPAC, IEC,
IUPAP, O/ML) беше преиздаден Международ­
ния речник за основни и общи т е р м и н и в
м е т р о л о г и я т а - VIM и бяха въведени поня­
т и я т а д о с т о в с р н о с т (trueness) и неси­
г у р н о с т (uncertainty), к о е т о доведе до ре-
дефиниране н а и з п о л з в а н а т а д о т о г а в а т е р ­
минологична с и с т е м а и преразглеждане н а
п о н я т и е т о a c c u r a c y . При досега използва­
н а т а терминология, т о ч н о с т т а (accuracy)
се означаваше к а т о близост н а лаборатор­
ния р е з у л т а т до " и с т и н с к а т а " с т о й н о с т и
се определяше о т размера н а с и с т е м н и т е
грешки в а н а л и т и ч н и я процес, к а т о с т а ­
т и с т и ч е с к и я п о к а з а т е л за оценка н а т е з и
грешки беше d% или b i a s . На фиг, 4.1 е пред­
с т а в е н модел н а н о в а т а концепция за до­
с т о в е р н о с т и възпроизводимост.

Още Gauss през 1823 г. разделя г р е ш к и т е н а

два вида: п о с т о я / т а (наричани системни)
и случайни.
Дефиницията н а г р е ш к и т е се основава н а
предположението, че "истинската" стой­
ност съществува. "Истинската "стойност
е теоретично понятие. В математически
смисъл не е възможно т о ч н о т о ü определя­
не по експериментален п ъ т . З а п р а к т и ч е с ­
ки цели се използва п о н я т и е т о условна ис­
тинска стойност (conventional true value, Фиг. 4.1. Н о в а т а концепция за в р ъ з к а т а меж­
assigned value), получена най-често c рефе- ду т о ч н о с т , д о с т о в е р н о с т и възпроизводимост
{no L. Thomas, 1999, мод. по J. Buttner, 1995)
р е н т е н м е т о д или с надежден р у т и н е н ме­
тод.
О т к л о н е н и е т о н а л а б о р а т о р н и я ре­ Точност
з у л т а т о т "истинската** с т о й н о с т
с е н а р и ч а г р е ш к а н а и з с л е д В а н е т о , ко­ Според показания модел н а фиг. 4.1 т о ч н о с т ­
я т о обединява с л у ч а й н и т е и с и с т е м ­ т а (асшгасг/) се използва вече к а т о общ т е р ­
ни грешки. О б щ а т а грешка н а клинично- мин и п р е д с т а в л я в а б л и з о с т т а л ю Ж д у
л а б о р а т о р н и т е изследвания може да бъде л а б о р а т о р н и я р е з у л т а т и "истинс-
72
Т а б л и ц а 4.2. Допустими с т о й н о с т и на CV и bias (d%), използвани к а т о критерии за акредитация
Германско медицинско
Показател дружеетВо
CLIA'88 T a r g e t value** ± %
CV d%*
Рутинни клинично
-химични п о к а з а т е л и
АлАТ 7 21 ± 20%
АсАТ 7 21 ± 20%
Алкална ф о с ф а т а з а 7 21 ± 30%
Алфа-амилаза ± 30%
П Г 7 21 -

КК 8 24 ± 30%
КК-МВ ± 3SD
ЛДХ 7 21 ±20%
АДХ-изоензими 7 21 ± 30%
Албумин 6 18 ± 10%
Билирубин - общ 7 21 ± 6.8 |unoI/I или ± 20% (при високи с т о й н о с т и )
Общ б е л т ъ к 3 9 ± 10%
Глюкоза 5 15 ± 0.33 mmol/1 или ± 10% (при високи с т о й н о с т и )
Креатинин 6 18 ± 26 mmol/1 или ± 15% (при високи с т о й н о с т и )
Пикочна киселина 6 18 ± 17%
Урея 8 24 ± 0.33 mmol/1 или ± 9%
Холестерол 6 18 ± 10%
ХАВП (HDL) ± 30%
Триглицериди 7 21 ± 25%
Калий 2.7 8 ± 0.5 mmol/1
Натрий 2 6 ± 4 mmol/1
Хлориди 2 6 ±5%
Калций 3.3 10 ± 0.295 mmol/I
Неорг. фосфор 5 15 -

Желязо 7 21 ± 20%
Магнезий 4 12 ± 25%
РП ± 0.04
рсо2 ± 5mm Hg или ± 8%
Р02 ± 3SD
Хормони
Кортизол 11 33 ± 25%
Естрадиол 11 33
Прогестерон 11 33 -

Тестостерон 15 45 -

Т4(Тироксин) 8 24 ±20%
Алдостерон 10 30 -

Имунология
Иг Г 11 33 ± 25 %
Иг А 6 18 ± 3SD
Иг М 10 30 ± 3SD
Хематология и коагулация
Хемоглобин ± 7%
Еритроцити ±6%
Хематокрит ± 6%
Левкоцити ± 15%
Тромбоцити ± 25%
Фибриноген ± 20%
Протромбиново време ± 15%
a FIT ± 15%
* П р о ц е н т н о т о отклонение е изчислено по о т н о ш е н и е на с т о й н о с т , получена е референтен м е т о д или с методично зависи
ма с т о й н о с т ;
** Target value - к а т о прицелна с т о й н о с т може д а се използва средна а р и т м е т и ч н а на у ч а с т н и ц и т е във ВОК след о т с т р а н я
ване на „бегълци", или с т о й н о с т , получена с официално у т в ъ р д е н и дефинитивни или референтни м е т о д и

73

случайна 2SD
Х-Ц
грешка J системна i pcniKa
обща грешка
Фиг. 4.2. Обща с х е м а н а г р е ш к и т е
ц - "истинска" с т о й н о с т
SD - с т а н д а р т н о отклонение
х - средна а ри т ме т и ч н а с т о й н о с т
к а т а " с т о й н о с т . Н я м а цифров израз. Из­
мерва се с н е т о ч н о с т т а (inaccuracy), ко­
я т о е м я р к а за о б щ а т а грешка, включваща
системната и с л у ч а й н а грешка (фиг. 4.2).
Изразява се с п р о ц е н т н о т о отклонение (d%)
о т у с л о в н а т а и с т и н с к а с т о й н о с т . При т о ­
ва е важно да се отбележи, че п р и е д и н и ­
чен л а б о р а т о р е н р е з у л т а т е невъз­
можно отделянето н а случайната
о т систелтата грешка.
На фиг. 4.3 е п р е д с т а в е н модел-мишена,
н а к о й т о к а т о кръг е п р е д с т а в е н а " и с т и н ­
ската" стойност.
Фиг. 4.3. Класически м о д е л - м и ш е н а з а п р е д с т а ­
вяне н а в ъ з п р о и з в о д и м о с т и д о с т о в е р н о с т
А - добра възпроизводимост, лоша достоверност
{системна грешка)
Б - лоша възпроизводимост, добра достоверност
{случайна грешка)
В - добра възпроизводимост, добра достоверност
Достоверност
За с и с т е м н а т а грешка е въведен нов т е р ­
мин - д о с т о в е р н о с т {trueness). Достовер­
н о с т т а е съвпадение между с р е д н а т а а р и т ­
м е т и ч н а с т о й н о с т , получена в лаборатори­
я т а и "истинската" стойност н а съшия по­
74
к а з а т е л . Н я м а цифров израз. Зависи о т раз­
мера н а с и с т е м н и т е грешки. С и с т е м н а т а
грешка е к о м п о н е н т на о б ш а т а грешка, кой­
т о при извършване н а серия о т едни и същи
изследвания о с т а в а п о с т о я н е н или се про­
меня по предсказуем начин (ISO). Представ­
лява р а з л и к а т а между средната ариггиме-
т и ч н а стойност на определен брой изслед­
вания на дадената съставка при условия н а
повторяемост и "истинската" стойност
на същия показател. Тази разлика се нари­
ча „отклонение? 1 (bias) и е о б р а т н а циф­
рова х а р а к т е р и с т и к а н а достовер­
ността.
Различава се постоянна системна греш­
ка, к о я т о зависи о т н е с п е ц и ф и ч н о с т т а н а
м е т о д а и пропорционална системна греш­
ка, к о я т о е зависима о т к о н ц е н т р а ц и я т а
(вж. п о - н а т а т ъ к фиг. 4.24).
Най-важните причини за с и с т е м н и греш­
ки са:
• н е а д е к в а т н а дефиниция на изследваната
с ъ с т а в к а - напр. х и м и ч н а т а природа н а
изследваната съставка не е достатъчно
позната',
• н е д о с т а т ъ ч н о с т на калибрацията - напр.
използваният калибратор не е сравним
(traceable) със сертифициран референтен
материал]
• н е д о с т а т ъ ч н а аналитична специфичност
н а м е т о д а - напр. ефект на матрикса (ин-
терференция) и др.\
• с и с т е м н и грешки, дължащи се н а отдел­
ни процедури при анализа - напр. фото­
метрия, волуметрия и др.;
• компрометиране на п р о б а т а за изследва­
не в преданалитичния е т а п .
Важно е да се отбележи, че о т к р и т и ч ­
но значение за осигуряване достовер­
н о с т т а на р е з у л т а т и т е е системата
з а к а л и б р а ц и я , к о я т о т р я б в а д а оси­
гурява м е т р о л о г и ч н а „проследимост"
(traceability) н а к р а й н и я р е з у л т а т п р е з
п о с л е д о в а т е л н а н е п р е к ъ с н а т а верига
о т и з м е р в а н и я и с р а в н и м о с т с калиб-
рационни м а т е р и а л и о т най-висок
клас.
ВъзпроизВос^имост
В ъ з п р о и з в о д и м о с т т а {precision) п р е д с т а в ­
л я в а с ъ в п а д е н и е т о м е ж д у независими резул­
т а т и о т п о в т а р я щ и се изследвания при оп­
ределени условия. Подразделя се н а :
• п о в т о р я с л ю с т {repeatability) - съвпаде­
ние м е ж д у р е з у л т а т и о т и з с л е д в а н е т о н а
една и с ъ щ а с ъ с т а в к а при едни и с ъ щ и ус­
ловия: метод, а п а р а т , р е а к т и в и , к а л и б -
ратор, оператор, лаборатория, з а к р а т ъ к
период о т в р е м е п р и е д н а к в и д р у г и усло­
вия',
• възпроизПодилюст п р и пролюпепи
у с л о в и я {reproducibility) - съвпадение
м е ж д у и з с л е д в а н и я т а н а е д н а и с ъ щ а със­
т а в к а при променени условия н а анализ:
време, оператор, а п а р а т , л а б о р а т о р и я и
9Р\
В ъ з п р о и з в о д и м о с т т а н я м а иифров израз.
Оценява се с о б р а т н а т а х а р а к т е р и с т и к а -
н е в ъ з п р о и з И о д и л ю с т {imprecision), к о я т о
изразява разсейването н а р е з у л т а т и т е о т
п о в т а р я щ и се изследвания н а един и с ъ щ м а ­
т е р и а л около е д н а с р е д н а а р и т м е т и ч н а
с т о й н о с т . ЗаКиси с а м о о т р а з м е р а п а
случайните грешки 6 аналитичния
п р о ц е с , к о и т о м о г а т (|а п о в л и я я т р е ­
з у л т а т а , к а т о г о п о в и ш а в а т или на­
маляват.
Според ISO „случайната грешка е компонент
на общата грешка, който при извършване на се­
рия от едни и същи изследвания се променя по
непредсказуем начин". Представлява разликата
между р е з у л т а т а о т изследването и средната
а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т (х) на определен брой
изследвания на същия показател при условия на
повторяемост. Случайните грешки м о г а т с т а ­
тистически да се изследват к а т о се използва
т я х н о т о разпределение. При нормално разпре­
деление размерът на случайната грешка се оп­
ределя о т стандартното отклонение (SD), дис­
персията (SI?) и коефициента на вариация (CV),
които са цифров израз на невъзпроизводимост-
т а (imprecision).
С л у ч а й н и т е грешки с а неизбежни. С по­
м о щ т а н а подходящи мерки т е м о г а т д а бъ­
д а т намалени в определени граници. Най-чес-
т и т е и з т о ч н и ц и н а случайни грешки с а :
• нестабилност на и з м е р в а т е л н а т а апара­
тура;
• вариация н а т е м п е р а т у р а т а ;
• р е а к т и в и - п р и г о т в я н е , съхранение, раз­
лични п а р т и д н и н о м е р а и др.
• п и п е т и р а н е , смесване, инкубация;
• л а б о р а т о р е н персонал
• с м я н а н а о п е р а т о р и т е , умора, н е д о с т а ­
т ъ ч н а квалификация и др.
Несигурност на изследването
Н е с и г у р н о с т т а н а и з с л е д в а н е т о {uncer­
t a i n t y o f measurement) е п о к а з а т е л , к о й т о
характеризира интервала о т стойности­
т е , в к о й т о се н а м и р а " и с т и н с к а т а " с т о й ­
ност н а и з с л е д в а н о т о количество или опре­
д е л я границите, в които един резул­
т а т с е р а з г л е Ж д а к а т о т о ч е н - т.е.
ИъзпроизИодил1 и д о с т о в е р е н . Включва
всички и з т о ч н и ц и н а случайни и с и с т е м н и
грешки в а н а л и т и ч н а т а процедура, к о и т о
е възможно да б ъ д а т измерени. Някои о т т е ­
зи и з т о ч н и ц и н а грешки м о г а т д а б ъ д а т оце­
нени със с т а т и с т и ч е с к о разпределение в се­
р и я и д а се х а р а к т е р и з и р а с е к с п е р и м е н т а л ­
но SD или с други и з т о ч н и ц и н а информация
з а с и с т е м н и т е грешки. К о м б и н и р а н а т а
с т а н д а р т н а н е с и г у р н о с т се изчислява ка­
т о сбор н а д и с п е р с и и т е (SÜ 2 ) н а компонен­
т и т е н а несигурност и се изразява к а т о SD.
Важно е cja с е п р а в и р а з л и к а м е ж д у н е ­
с и г у р н о с т и грешка. Г р е ш к а т а с е оп­
ределя к а т о разлика м е ж д у измерена­
т а и "истинската" стойност, докато
н е с и г у р н о с т т а е интервал. Оценката
н а г р е ш к а т а изисква също т а к а познаване
н а " и с т и н с к а т а " с т о й н о с т , д о к а т о несигур­
н о с т т а - не.
Г р у б а т а грешка се дължи н а неправилно
изпълнение н а п р о ц е д у р а т а з а изследване.
П р е д с т а в л я в а р а з л и к а т а м е ж д у единичен
р е з у л т а т о т изследването и очакваната
или " и с т и н с к а " с т о й н о с т , к о я т о при избра­
н и я уровен н а з н а ч и м о с т е извън д о п у с т и ­
м и т е граници, напр. извън ±3SD (WHO/LAB/
81.3).
Т е о р и я т а н а к а ч е с т в е н и я к о н т р о л н а греш­
к и т е е р а з в и т а и приложена през 1931 година
о т S h e w a r t з а к о н т р о л и р а н е к а ч е с т в о т о н а ин­
д у с т р и а л н о т о производство. През 1950 година
т я е а д а п т и р а н а з а н у ж д и т е н а клинично-хи-
м и ч н а т а л а б о р а т о р и я о т Levey и Jenings чрез
използване н а к о н т р о л н а к а р т а н а с р е д н а т а
а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т и ранга н а д в о й н и т е оп­
ределяния. През 1952 г. Henry и Segalove популя-
75
ризират концепцията за качествен контрол в
клиничната химия.
ВЛКК следва да се о с ъ щ е с т в я в а з а всички
лабораторни изследвания. Функциите, кои­
т о т р я б в а да изпълнява една о п т и м а л н а
програма за ВЛКК с а следните:
>• К о н трол н а случайните грешки, т . е . н а
възпроизводимостта,
> Ко н трол на с и с т е м н и т е грешки, т . е . н а
достоверността,
>• К о н т р о л н а в л и я н и е т о н а м а т р и к с а вър­
ху въ зпроизвод и мос т т а, д о с т о в е р н о с т ­
т а и специфичността,
> Контрол на тенденциите.
П р о г р а м а т а з а ВЛКК т р я б в а да о т г о в а ­
ря н а следните и з и с к в а н и я т а :
1. К о н т р о л върху ц я л а т а клинично-значима
област,
2. Н е п р е к ъ с н а т а приложимост,
3. Бързо разпознаване на отклонения в ана­
л и т и ч н а т а вариация,
4. Приложимост при а в т о м а т и з и р а н и ана­
лизи,
5. Приложимост във всички видове лабора­
т о р и и - о т т а з и н а ч а с т н и я лекарски ка­
б и н е т до ц е н т р а л н а т а лаб ора т ори я,
6. Р а з ходите за време и с р е д с т в а да б ъ д а т
в разумни граници,
7. Да не е необходим специално п о д г о т в е н
персонал.
Провеждането н а ВЛКК изисква наличие­
т о н а контролни м а т е р и а л и и проби на бол­
ни.
Контролни материали
М а т е р и а л и т е , к о и т о се и з п о л з в а т за нуж­
д и т е н а к а ч е с т в е н и я к о н т р о л и оценка н а
а н а л и т и ч н а т а н а д е ж д н о с т н а лаборатор­
н и т е м е т о д и се н а р и ч а т к о н т р о л н и м а ­
т е р и а л и . Към т я х се п р е д я в я в а т следни­
т е изисквания:
> да н а п о д о б я в а т максимално п р о б а т а н а
п а ц и е н т а по химически с ъ с т а в и физичес­
ки х а р а к т е р и с т и к и ; т е т р я б в а да съдър­
ж а т всички основни и в т о р о с т е п е н н и
съставки, к о и т о се с ъ д ъ р ж а т в п р о б и т е
на п а ц и е н т и т е ;
76
>• к о н ц е н т р а ц и я т а н а о т д е л н и т е с ъ с т а в ­
ки в контролния м а т е р и а л да бъде с т а ­
билна;
> к о н ц е н т р а ц и я т а н а с ъ с т а в к и т е да бъде
в р е ф е р е н т н а т а и клинично-значимите
патологични области, к а т о бъде съобра­
зена със с т о й н о с т и т е , к о и т о са к р и т и ч ­
ни за вземане н а медицински решения.
Търговските контролни м а т е р и а л и мо­
г а т да б ъ д а т създадени на б а з а т а на след­
н и т е видове м а т р и ц и :
• биологична м а т р и ц а - използват се серум­
ни фракции, р азтво р ен и в е с т е с т в е н се­
рум или пул о т е с т е с т в е н серум;
• п о л у с и н т е т и ч н а м а т р и ц а : изолирани ен­
зими в ч и с т албуминов р а з т в о р ; ч и с т и
субстанции, р а з т в о р е н и в серумни със­
т а в к и ; комбинация о т серумни фракции,
ч и с т и субстанции, р азтво р ен и в н а т у р а ­
лен серум.
По произход контролните материали с био­
логична матрица могат да бъдат о т човешки
или животински произход (говежди, свински, кон­
ски серуми).
Животинските контролни материали и м а т
някои предимства: т е са по-евтини, има въз­
можност да бъдат произведени в по-големи се­
рии, безопасност о т х е п а т и т и други инфекции.
Но използването им е ограничено поради редица
проблеми; ниски концентрации на някои състав­
ки к а т о холестерол, триглицериди, пикочна ки­
селина, албумин, което налага добавка на пър­
вични стандарти; т е са неподходящи за конт­
рол на имунохимичните методи за изследване
на някои серумни протеини; ензимите и белтъ­
ц и т е в животинските контролни материали
и м а т различни кинетични свойства - напр. АсАТ
о т говежди произход има по-висок субстратен
афинитет о т човешкия ензим, което може да
доведе до фалшиво по-високи резултати. Изпол­
зването на холестеролови естери о т животин­
ски и друг произход може да предизвика грешки
при ензимните холестеролови методи, при кои­
т о ензимите са оптимирани за човешки холес­
теролови естери.
З а п о - г о л я м а т а ч а с т о т клинично-
л а б о р а т о р н и т е м е т о д и с е препоръч­
ва и з п о л з в а н е т о н а ч о в е ш к и к о н т р о л ­
ни материали, поради по-голямата
близост до матрикса на пробите на
болните.
Основен проблем на контролните материа­
ли е стабилността. За продължаване срока на
с т а б и л н о с т се и з п о л з в а т две технологии: н а л и -
офилизация или н а добавяне на консерванти, при
к о е т о се запазва т е ч н о т о с ъ с т о я н и е на к о н т ­
ролния м а т е р и а л . П р о ц е с ъ т н а лиофилизация
обаче повишава т у р б и д и т е т а н а с е р у м и т е след
р а з т в а р я н е т о им. Това се дължи на променена­
т а п р о с т р а н с т в е н а с т р у к т у р а на липопроте-
и н и т е при и з п а р я в а н е т о н а в о д а т а , к а к т о и н а
д е н а т у р а ц и я т а на б е л т ъ ч н и т е молекули по вре­
ме н а з а м р а з я в а н е т о . М ъ т н и н а т а е с е р и о ­
з е н и з т о ч н и к н а г р е ш к а - повишава абсорб-
ц и я т а при с п е к т р о ф о т о м е т р и ч н и т е и колори-
метрични методи.
С п е ц и а л н и т е и з и с к в а н и я к ъ м лиофилизи-
р а н и т е контролни материали включват:
> О п т и м а л н а и д е н т и ч н о с т между
ф л а к о н и т е (CV = 0.1%);
> Х о м о г е н н о с т н а л и о ф и л и з а т а пре­
ди р а з т в а р я н е т о - различно о ц в е т е н а по­
в ъ р х н о с т или к р и с т а л и в ц е н т ъ р а показ­
в а т н е к а ч е с т в е н а лиофилизация, к о я т о
м о ж е д а доведе до промени в е н з и м и т е ,
белтъците ц липопротеините;
> Д о б р а р а з т в о р ш м о с т - повечето т ъ р ­
говски к о н т р о л н и м а т е р и а л и се р а з т в а ­
р я т напълно след 30 m i n .
При лиофилизираните контролни м а т е р и а л и
е известен феноменът с алкалната фосфатаза.
А к т и в н о с т т а н а т о з и ензим н а р а с т в а след раз­
т в а р я н е т о н а к о н т р о л н и я серум понякога до
60% о т н а ч а л н а т а а к т и в н о с т . С к о р о с т т а на
н а р а с т в а н е зависи о т т е м п е р а т у р а т а , услови­
я т а н а р е а к ц и я т а , о т произхода на контрол­
ния м а т е р и а л , о т н а ч а л н а т а а к т и в н о с т . Този
феномен се дължи н а д и с о ц и а ц и я т а на комплек­
са, образуван между АФ и л и п о п р о т е и н и т е по
време на лиофилизацията или при ниски т е м п е ­
р а т у р и . При т е м п е р и р а н е т о с т а в а р е а к т и в и -
ране на ензима и т о й се освобождава в серума.
Специални проучвания у с т а н о в я в а т , че а к т и в ­
н о с т т а н а ДФ с е с т а б и л и з и р а з а 8 ч а с а п р и
4 0 С и о с т а В а с т а б и л н а 36 часа. Установено
е известно н а р а с т в а н е н а АДХ и КК в някои лио-
филизирани серуми в з а в и с и м о с т о т в р е м е т о за
преинкубация и т е м п е р а т у р а т а н а дилуента.
При т е ч н и т е контролни м а т е р и а л и се избяг­
ва г р е ш к а т а о т р а з т в а р я н е т о , но м а т р и к с ъ т
може да причини грешка поради с ъ д ъ р ж а н и е т о
на необичайни за човешкия м а т р и к с консерван­
т и . Основното изискване към т е ч н и т е к о н т ­
ролни м а т е р и а л и е по о т н о ш е н и е на вискози­
т е т а - т о й т р я б в а д а с ъ о т в е т с т в а н а чо­
вешки с е р у м , з а д а с е и з б е г н е в л о ш а в а н е
на в ъ з п р о и з в о д и м о с т т а и т о ч н о с т т а
при п и п е т и р а н е н а м а л к и к о л и ч е с т в а . До­
б а в к а т а на етиленгликол напр. може да доведе
до повишаване н а в и с к о з и т е т а . Освен т о в а по
външен вид т е ч н и т е контролни м а т е р и а л и се
р а з л и ч а в а т видимо о т биологичните проби на
пациентите.
>• А б с о р б ц и о н н и т е с п е к т р и н а к о н т р о л ­
н и т е серуми н а определени дължини н а
в ъ л н а т а с а в а ж н и при ф о т о м е т р и ч н и т е
о т ч и т а н и я . Напр. при >^=700 п т о п т и ч ­
н а т а п л ъ т н о с т н а неразреден серум
т р я б в а д а е < 0.5 - к р и т е р и й з а прозрач­
н о с т ; ако н а 4 1 0 п т се у с т а н о в и п и к -
т о в а показва н а л и ч и е т о н а порфириндег-
радационни п р о д у к т и и хемолиза в серу­
м а , използван к а т о м а т р и ц а ; н а 460 п т
се измерва с у м а т а о т билирубиновата и
б а з о в а т а абсорбция (главно к а р о т е н о в а )
- при неразреден серум т а з и абсорбция
т р я б в а д а е < 1.0. П о - в и с о к а т а абсорбция
показва и н т е р ф е р е н ц и я н а к а р о т е н . Р е ­
д и ц а м е т о д и и з и с к в а т н и с к а базо­
в а а б с о р б ц и л н а 410 п т .
> Б а к т е р и а л н о т о з а л г ъ р с я в а н е може
д а влоши сериозно к а ч е с т в а т а н а кон­
т р о л н и я м а т е р и а л . То м о ж е д а бъде оце­
нено освен чрез микробиологични м е т о д и
и косвено след р а з т в а р я н е със с т е р и л н а
вода при а с е п т и ч н и условия, ако и м а бак­
т е р и а л н а к о н т а м и н а ц и я се измерва дра­
с т и ч н о н а м а л я в а н е н а г л ю к о з а т а след 2-
3 дни п р е с т о й н а с т а й н а т е м п е р а т у р а
(20 ()С). В з а в и с и м о с т о т у с л о в и я т а н а съх­
ранение при т е ч н и серуми м о ж е д а се ус­
т а н о в я т ензими в р е з у л т а т н а бавно раз­
граждане н а някои к о м п о н е н т и за дни, ме­
сеци или години. Голям брой б а к т е р и а л н и
п р о т е а з и м о г а т д а п р е д и з в и к а т поява­
т а н а с ъ с т а в к и к а т о аминокиселини и /
или т е х н и деградационни п р о д у к т и .
>> С т а б ь и г н о с т н а с ъ с т а в к и т е след раз­
т в а р я н е ( о т в а р я н е ) н а контролния м а т е ­
риал определя с п о с о б н о с т т а н а к о н т р о л ­
н а т а с и с т е м а д а о т к р и в а грешки в ана­
л и т и ч н и я процес във в р е м е т о . Многоб­
ройни проучвания д о к а з в а т , че най-нес­
табилни в повечето търговски контрол­
ни м а т е р и а л и с а г л ю к о з а т а (Ф), билиру-
б и н ъ т (Ф), и в различна с т е п е н някои ен­
зими (АДХ (Ф), КК (Ф), АР (I4) ц др.)*
>. И н т е р ф е р и р а щ и в е щ е с т в а - амоние­
в и я т йон, к о й т о нормално в човешка плаз­
м а е под 50 цто1/1, може д а се повиши мно­
г о к р а т н о (до няколко mmol/1) благодаре­
ние н а е н з и м н а а к т и в н о с т или б а к т е р и -
77
 ална к о н т а м и н а ц и я и да предизвика се­
риозни грешки при много изследвания.
При л и о ф и л и з а ц и я т а се о т н е м а т 15
mmol/1 бикарбонати, к о и т о т р я б в а да се
з а м е с т я т с около 15 mmol/1 други к а т и о -
ни, за да се п о с т и г н е pH 7.4 н а 37 0С . Из­
п о л з в а т се обикновено SOj; НР042' и/или
карбоксилни киселини (пируват, л а к т а т ,
глюкуронова киселина и др.), к о и т о м о г а т
да и н т е р ф е р и р а т при редица а н а л и т и ч ­
ни м е т о д и .
> Обявените с т о й н о с т и в к о н т р о л н и ­
т е Aiamepucuiu е необходимо да б ъ д а т
iiacje^kcjiiu и „ п р о с л е д и м и ". Необходимо
е да б ъ д а т посочени с т о й н о с т и , получе­
ни с различни р у т и н н и м е т о д и , к а т о : из­
ползваните м е т о д и да б ъ д а т т о ч н о ци­
т и р а н и ; т е з и с т о й н о с т и д а са получени
въз основа н а р е ф е р е н т н и м е т о д и , в на­
деждни лаборатории и да са сравними с
международни с т а н д а р т и ; концентраци­
и т е на с ъ с т а в к и т е да б ъ д а т т а к и в а , при
к о и т о се в з е м а т важни медицински ре­
шения за „нормо" и „патология"', желател­
но е в к о н т р о л н и т е м а т е р и а л и да е посо­
чена с т о й н о с т , получена с дефинитивен
или референтен м е т о д .
Търговските контролни материали са
р а з р а б о т е н и за всички изследвани биологич­
ни т е ч н о с т и : серум, урина, ликвор, пълна
кръв, плазма и др. При избор на контролни
м а т е р и а л и е необходимо да се с п а з в а т след­
н и т е критерии:
- за предпочитане е м а т е р и а л и т е да са
о т човешки произход;
- с т а б и л н о с т т а да бъде поне до 12 месе­
ца и по в ъ з м о ж н о с т да са с еднакъв се­
риен номер;
- да се използват контролни м а т е р и а л и
с две или т р и концентрации.
В зависимост о т предназначението си,
к о н т р о л н и т е м а т е р и а л и се д е л я т н а две
групи:
• За контрол на възпроизводимостта,
• За к о н т р о л н а д о с т о в е р н о с т т а и т о ч ­
ността.
К о н т р о л н и т е материали, предназначени
за ко н трол н а в ъ з п р о и з в о д и м о с т т а са без
посочени с т о й н о с т и н а с ъ с т а в к и т е и мо­
г а т да се използват з а определяне н а собс­
т в е н и средна а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т , SD
78
и CV, д о к а т о при к о н т р о л н и т е м а т е р и а л и
за оценка н а д о с т о в е р н о с т т а и т о ч н о с т ­
т а са посочени с т о й н о с т и за с ъ с т а в к и т е
(желателно е т о в а да е с референтен м е т о д ,
а съидо с различни р у т и н н и методи).
При използване на търговски контролни
м а т е р и а л и е необходимо с т р о г о спазване
у к а з а н и я т а н а производителя за съхране­
ние, начин на р а з т в а р я н е , съхранение след
р а з т в а р я н е и с т а б и л н о с т на различните
с ъ с т а в к и . Р а з т в о р е н и я т контролен м а т е ­
риал може да се разпредели в необходимите
з а един ден количества в малки пластмасо­
ви е п р у в е т к и т и п Епендорф със запушалки
и да се замрази на -20 0С. Преди у п о т р е б а е
необходимо т е м п е р и р а н е н а с т а й н а т е м п е ­
р а т у р а . За избягване на бактериално замър­
сяване к о н т р о л н и я т м а т е р и а л следва да се
о т л и в а о т флакона.
Основни н е д о с т а т ъ ц и н а ВЛКК с к о н т ­
ролни м а т е р и а л и са, че с т я х не м о г а т да
се о т к р и я т грешки, к о и т о се предизвикват
о т някои л е к а р с т в а и ендогенни с ъ с т а в к и ,
к о и т о се с р е ш а т само при някои проби н а
болни; м а т р и ц а т а не е абсолютно идентич­
н а с п р о б и т е н а п а ц и е н т и т е поради т е х ­
нологичната обработка, а при „полусляпо-
т о " въвеждане на к о н т р о л н и т е проби в ана­
л и т и ч н а т а серия н а болните, о б е к т и в н о с т ­
т а е ограничена. Независимо о т т о в а ВЛКК
е к о н т р о л н и м а т е р и а л и о с т а В а осноб-
и и я т начин з а к о н т р о л н а л а б о р а т о р -
л н и т е р е з у л т а т и . Всички о с т а н а л и фор­
ми на к о н т р о л са само допълнителни.
ВЛКК НА ВЪЗПРОИЗВОДИМОСТТА
(НА СЛУЧАЙНИТЕ ГРЕШКИ)
Преди въвеждане н а с и с т е м а т а за ВЛКК е
необходима т о ч н а информация за аналитич­
н а т а н а д е ж д н о с т н а м е т о д а , т ъ й к а т о ко­
личествените аналитични методи прите­
ж а в а т неизбежна, присъищ им а н а л и т и ч н а
вариация, к о я т о т р я б в а да се познава (вж.
раздела а н а л и т и ч н а надеждност).
Основна предпоставка н а ВЛКК с к о н т ­
ролни м а т е р и а л и е, че к о н т р о л н и т е проби
и м а т съидите о т н а с я н и я в а н а л и т и ч н а т а
с и с т е м а , к а к т о и п р о б и т е на болните и о т ­
р а з я в а т с ъ и ш т е грешки, к о и т о о к а з в а т вли­
яние н а т е з и проби. Важно изискване е кон­
т р о л н и т е проби да се изследват при съши-
me условия и начин, к а к т о п р о б и т е н а бол­
н и т е . П о с т и г а н е т о н а определено к а ч е с т ­
во на а н а л и т и ч н и я е т а п зависи о т к а ч е с т ­
в о т о н а а н а л и т и ч н и я процес и ч у в с т в и т е л ­
н о с т т а н а к о н т р о л н и т е процедури за о т к ­
риване н а грешки.
Контролна к а р т а
Най-широко приложение в к л и н и ч н а т а лабо­
р а т о р и я има използването на контролни
карти, които представляват графични
изобрсиксния п а к о н т р о л н и т е р е з у л ­
т а т и . Във всяка л а б о р а т о р и я з а всеки ко­
личествен лабораторен п о к а з а т е л следва да
се води к о н т р о л н а к а р т а .
Построяване на контролна к а р т а
Предварителен период. В продължение на 22
р а б о т н и дни се изследва к о н т р о л н а проба
о т един съш, контролен серум заедно с про­
б и т е н а п а ц и е н т и т е при едни и съши усло­
вия. Важно изискване е д а н е с е с ъ з д а в а т
с п е ц и а л н и услоНии з а и з с л е д б а н е н а
к о н т р о л н и т е п р о б и . Най-ефикасна е сис­
т е м а т а з а контрол, ако к о н т р о л н и т е про­
би се в ъ в е ж д а т „сляпо", к а т о р а б о т е и д и т е
не з н а я т , че и з с л е д в а т к о н т р о л н а проба;
възможно е и „полусляпо" въвеждане - т . е .
знае се, че се р а б о т и к о н т р о л н а проба, но
не са и з в е с т н и с т о й н о с т и т е на п о к а з а т е ­
л и т е . Приема се че разпределението е о т Га-
усов т и п .
Статистическа обработка. П ъ р в и т е 20 ре­
з у л т а т а се о б р а б о т в а т с т а т и с т и ч е с к и по
следния начин:
- изчисляват се х, SD;
- извършва се проверка з а рязко о т к л о н я -
ваиди се с т о й н о с т и (груби грешки) с по-
м о ш т а на Т - т е с т . При наличие на грубо
погрешна с т о й н о с т т я се изхвърля о т ва­
риационния peg и се з а м е с т в а със с т о й ­
н о с т о т 21-ия ден. Р е з у л т а т и т е се пре­
изчисляват о т н о в о з а х, SD. Извършва се
п о в т о р н а проверка с Т - т е с т . При у с т а ­
новяване на в т о р а груба грешка т я се из­
хвърля и се з а м е с т в а със с т о й н о с т о т 22-
ия ден;
- преизчисляват се х, SD и CV. Изчисляват
се следните граници:
x+lSD и x-lSD
X+2SD и X-2SD
X+3SD и X-3SD
П о с т р о я в а се к о н т р о л н а т а к а р т а , н а ко­
я т о т р я б в а да б ъ д а т нанасяни с т о й н о с т и ­
т е на ежедневните контролни проби.
С п о с о б н о с т т а на к о н т р о л н и т е процеду­
ри за о тк р и ван е на различните видове греш­
ки е в зависимост о т к о н т р о л н и т е граници
и броя на к о н т р о л н и т е наблюдения. Оценя­
в а т се две х а р а к т е р и с т и к и : в е р о я т н о с т ­
т а з а ф а л ш и в о о т х в ъ р л я н е н а анали­
т и ч н а т а серия без да е налице значима ана­
л и т и ч н а грешка, к о я т о в е р о я т н о с т т р я б ­
ва да е ниска и в е р о я т н о с т т а з а о т к р и ­
в а н е н а грешка, която вероятност тряб­
ва да е висока.
Класическата контролна к а р т а на She-
wart (Levey-Jenings) функционира само с два
вида граници: x±2SI), к о и т о се н а р и ч а т пре-
д у п р е д и т е л н и , и x±3SD, к о и т о се нари­
ч а т к о н т р о л н и - граници за отхвърляне
на а н а л и т и ч н а т а серия. К о г а т о аналитич­
н а т а с и с т е м а е в к о н т р о л , ежедневните
контролни р е з у л т а т и са разпределени рав­
номерно о т д в е т е с т р а н и на л и н и я т а на
с р е д н а т а а р и т м е т и ч н а (фиг. 4.4).
mmol/
Фиг. 4.4. Shewahrt-koHmpoAHa карта със с т а ­
билна вариация
Увеличаването на размера на случайните
грешки се п р е д с т а в я с увеличаване на раз­
сейването на к о н т р о л н и т е р е з у л т а т и (уве­
личава се SD), д о к а т о възникването на сис­
т е м н а грешка се п р е д с т а в я или с рязко пре­
м е с т в а н е на р е з у л т а т и т е о т с р е д н а т а
а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т {shift), или с п о с т е ­
пенно н а р а с т в а н е на о т к л о н е н и е т о на ре­
з у л т а т и т е о т с р е д н а т а с т о й н о с т (drift
79
 а) стабилна б) системна в) случайна За съжаление използваните две граници
вариация грешка грешка
при к л а с и ч е с к а т а к о н т р о л н а к а р т а на She­
w a r t не о т г о в а р я т на съвременните изиск­
кон ip. ipaiiHiia вания. Съгласно з а к о н о м е р н о с т т а на Гаусо-
в о т о разпределение, една а н а л и т и ч н а про­
цедура, която е в контрол, и м а 5% вероят­
ност (веднсик н а всяка 21 серия) да излезе из­
вън предупредителнитеграницих±280 - си­
Komp. ipaimna туация на ф а л ш и в а тревога, ах±380-гра-
н и ц а т а - 0.2% (веднъж на всяка 357 серия)
вероятност за фалшиво отхвърляне. С д р у ­
ги д у м и * ± 2 8 0 границите, особено когато се
използват по-голям, брой контролни проби,
Разпределение на контролните наблюдения м о ж е да п р и ч и н я т фалшиво отхвърляне н а
иначе надеждни резултати и да компроме­
т и р а т ефекта на контролната процедура.
Понякога е т р у д н о да се к а ж е дали сигна­
л ъ т за отхвърляне се дължи на п р и с ъ щ а т а
случайна г р е ш к а на а н а л и т и ч н и я м е т о д
{фалшиво отхвърляне) или се е появила до­
пълнителна грешка (истинско отхвърляне).
В т о з и случай е необходимо повторение н а
к о н т р о л н а т а проба, и ако и т я е извън пре­
д у п р е д и т е л н и т е граници се приема, че се ка­
сае за и с т и н с к о отхвърляне. Г р а н и ц а т а
Време
x±3SD е н е ч у в с т в и т е л н а за о т к р и в а н е к а к ­
Фиг. 4.5. Проекция на разпределението на раз­
т о на с и с т е м н и , т а к а и на случайни греш­
личните видове грешки върху контролната кар­
ки, к а т о ч у в с т в и т е л н о с т т а ü не се пови­
т а на Shewart
а) стабилна вариация шава даже при увеличаване броя на к о н т ­
б) проблем с достоверността - "shifl" (системна грешка) р о л н и т е проби (на 2, 4 и т . н . ) . П р и прилага­
в) проблем с възпроизводимостта (случайна грешка) не на тази граница вероятността за фал­
шиво отхвърляне рязко намалява, но заедно
или trend). с това намалява и способността за откри­
Н а фиг. 4.5 и фиг. 4.6 са показани к о н т ­ ване на грешки.
ролни к а р т и със с т а б и л н а вариация, с уве­ Б р о я т на к о н т р о л н и т е проби е важен за
личаване на с л у ч а й н а т а грешка и с увелича­ е ф и к а с н о с т т а на с и с т е м а т а за к о н т р о л ,
ване на с и с т е м н а т а грешка. поради к о е т о се препоръчва м и н и м у м една
к о н т р о л н а проба за всяка а н а л и т и ч н а серия.
Използването на повече к о н т р о л н и проби по­
вишава в е р о я т н о с т т а за о т к р и в а н е н а
грешки, к о и т о с ъ щ е с т в у в а т и м о г а т да бъ­
д а т пропуснати.
О т 1981 година в к л и н и ч н и т е лаборато­
рии в с в е т а широко се използват к р и т е р и и ­
т е на J. О. Westgard, с к о и т о се повишава
ч у в с т в и т е л н о с т т а на т р а д и ц и о н н а т а кон­
т р о л н а к а р т а за о т к р и в а н е на случайни и
с и с т е м н и грешки, без да се п о в и ш а в а т слу­
ч а и т е на фалшивото отхвърляне. При т а ­
Фиг. 4.6. К о н т р о л н а к а р т а със с и т е м н а г р е ш ­ зи програма се използва к а т о основа класи­
к а (drift) - п о с т е п е н н о н а р а с т в а и д о о т к л о н е н и е ч е с к а т а к о н т р о л н а к а р т а , к о я т о се оценя­
на контролните резултати о т средната а р и т ­ ва с два вида к р и т е р и и , п о з н а т и к а т о кри­
метична стойност т е р и и н а Westgard {Westgard m u l t i r u l e s ) :
80
предупредителни и критерии за отх­
в ъ р л я н е . В п р а к т и к а т а е възможно прила­
г а н е т о и м к а к т о при използване н а един кон­
т р о л е н м а т е р и а л , т а к а и при прилагане н а
два или повече к о н т р о л н и м а т е р и а л а .
Критерии при използване
н а ecjuii к о н т р о л е н м а т е р и а л :
x ± 2 S D . Ако к о н т р о л н и я т р е з у л т а т е в
г р а н и ц и т е н а x±2SD, а н а л и т и ч н а т а серия
се приема, р е з у л т а т и т е н а б о л н и т е се
с м я т а т з а н а д е ж д н и и м о г а т д а се и з п р а ­
тят.
bsD. Ако един к о н т р о л е н р е з у л т а т е и з ­
в ъ н И ± 2 8 0 - г р а н и ц а (фиг 4.7) се с ч и т а з а
п р е д у п р е д и т е л е н к р и т е р и й . Необходи­
м о е д а се п р о в е р я т о с т а н а л и т е к о н т р о л и
в п р е д и ш н и т е а н а л и т и ч н и серии, к а т о се
използват о с т а н а л и т е контролни крите­
рии: l3si), 22si), 1()х. К о г а т о някой о т т е з и
к р и т е р и и покаже,че а н а л и т и ч н а т а серия е
и з в ъ н к о н т р о л , р е з у л т а т и т е н а пациен­
т и т е се з а д ъ р ж а т , а п р о б и т е се реанализи-
рат. Когато в с и ч к и показват, ч е сери­
я т а е в контрол, р е з у л т а т и т еи а па­
циентите са валидни.
+3SD
428Г)
41SD
X X
-1SD
•2SI)
-3SI)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Фиг. 4.7. Контролен р е з у л т а т извън х + 2SD
l3si). Ако един к о н т р о л е н р е з у л т а т е и з -
вънх+:№1)-грании 1 а{(\>иг. 4.8), а н а л и т и ч н а ­
т а серия се о т х в ъ р л я , т я е извън к о н т р о л .
Прилага се с а м о в е д н а а н а л и т и ч н а серия.
Този к р и т е р и й е ч у в с т в и т е л е н з а случайна
грешка, но м о ж е д а по казв а с ъ ш о и възник­
в а н е т о н а с и с т е м н а г р е ш к а с особено голям
размер.
+3SI)
•2S1)
• ISD
X лични р а з н о в и д н о с т и н а к о н т р о л н и т е гра­
-ISD
-2.SI)
-3SD
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Фиг. 4.8. Контролен р е з у л т а т извън х + 3SD
22si). Ако два последователни к о н т р о л н и
р е з у л т а т а с а и з в ъ н е д н а и с ъ щ а X+2SD-
грании,а{<\)\хг. 4.9). С т о з и к р и т е р и й се о т ­
крива 'случаи1ш грешка. А н а л и т и ч н а т а се­
р и я се о т х в ъ р л я .
+3SD
+2SI)
+ 1SD
X
•1SD
-2SI)
-3SD
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Фиг. 4.9. Два последователни контролни резул­
т а т а извън х + 2SD
4isi). П о с л е д н и т е ч е т и р и к о н т р о л н и
с т о й н о с т и н а един и с ъ щ к о н т р о л е н м а т е ­
риал с а и з в ъ н е д н а и с ъ щ а х + 1 S D - г р а н и ­
ц а (фиг. 4.10). К р и т е р и я т е ч у в с т в и т е л е н
к ъ м с и с т е м н и грешки. При т о з и к р и т е р и й
а н а л и т и ч н а т а серия не се о т х в ъ р л я . Той
сигнализира з а р а Ж д а н е т о л а с и с т е м н а
г р е ш к а , поради к о е т о е необходимо д а се
провери к а л и б р а ц и я т а н а а п а р а т а и анали­
т и ч н и я м е т о д . Това следва д а с т а н е и при
к р и т е р и й 3ISD.
+3SI)
+2SI)
• I SI)
-1SI)
-2.SI)
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Фиг. 4.10. Ч е т и р и последователни контролни
р е з у л т а т а са извън x-lSD
1()х. Д е с е т п о с л е д о в а т е л н и к о н т р о л н и
с т о й н о с т и са о т една и съща с т р а н а н а
с р е д н а т а а р и т м е т и ч н а (фиг. 4.11), без дру­
ги изисквания з а р а з м е р а н а о т к л о н е н и е т о .
К р и т е р и я т е чувствителен към системна
грешка. При т о з и к р и т е р и й а н а л и т и ч н а т а
серия м о ж е да не бъде о т х в ъ р л е н а . По-скоро
се н а л а г а н е з а б а в н а п р о в е р к а н а к а ­
л и б р а ц и я т а , к а к т о и н а поддръжка­
т а н а а п а р а т у р а т а . П р и л а г а т се раз­
ници: 7, 8, 9 или 12 с т о й н о с т и о т една и съ­
щ а с т р а н а н а с р е д н а т а а р и т м е т и ч н а , кои­
т о п р и т е ж а в а т различна ч у в с т в и т е л н о с т
к ъ м с и с т е м н и грешки.
81
 +3SD mama о т всеки о т т я х са и з в ъ н е д н а и с ъ ­
+2SD щ а к + Х S D - г р а н и ц а (фиг. 4.14). К р и т е р и ­
+ 1SD я т е ч у в с т в и т е л е н кълг с и с т е м н и

1 5 г р е ш к и . Важи съшия коментар.

+3SD

+2SD
-2SD

-3SD + 1SD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
X
ф и г . 4.11. Д е с е т последователни контролни ре­ -1SD
з у л т а т а са о т е д н а т а с т р а н а на х
-2SD

-3SD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Критерии при използване н а повече
о т един контролен лштериал: Фиг. 4.14. Два контролни м а т е р и а л а - два после­
дователни р е з у л т а т а о т всеки о т т я х е извън
2 2 S D . Ако два контролни р е з у л т а т а са ед­ х + 1SD
новременно и з в ъ н е д н а и е ъ щ а к + 2 8 0 { § и г .
4.12). С т о з и критерий се о т к р и в а случайна 3isD.При използване на т р и контролни
грешка. А н а л и т и ч н а т а с е р и я с е о т х - материала, к о г а т о контролните резулта­
върля. т и и о т т р и т е материала са и з в ъ н е д н а
+3SI) и с ъ щ а х+1S D - г р а н и ц а - с и г н а л з а с и с -
+2SD т е л т а грешка.
+ 1SI) 10х. При два контролни материала, ко­
X г а т о 5 последователни р е з у л т а т а о т всеки
-ISD контролен материал са о т е д н а и с ъ щ а
-2SD с т р а н а н а средната арипиметична,
-3SI) без други изисквания за размера на откло­
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
нението (фиг. 4.15). К р и т е р и я т е чувстви­
Фиг. 4.12. Р е з у л т а т и о т два контролни м а т е ­ т е л е н към системна грешка.
риала са едновременно извън X-2SD +3SD

+2SD
R4SD. Ако о т два контролни р е з у л т а т а
единият е и з в ъ н х + 2 & 0 , а другият - и з в ъ н + 1SD

х-.2£Ш(фиг. 4.13). Този критерий е чувстви­ X

телен за с л у ч а й н а г р е ш к а . Прилага се са­ -1SD

мо в една аналитична серия, за да не може -2SD

с и с т е м н а т а грешка между две аналитични -3SD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
серии погрешно да се тълкува к а т о случай­
на грешка. Когато т о з и критерий се нару­ Фиг. 4.15. Два контролни м а т е р и а л а - 5 после­
ши, т о в а показва, че разликата между две­ дователни р е з у л т а т а о т всеки о т т я х са о т
т е контроли е по-голяма о т 4 S D , Т . е . а н а ­ една и съща с т р а н а н а х
л и т и ч н а т а серия е извън контрол. 9х. При използване на т р и контролни ма­
+3SD териала, к о г а т о т р и п о с л е д о в а т е л н и
+2SD р е з у л т а т ао т в с е к и к о н т р о л е н л ш т е ­
+ 1SD р и а л с а едноврелгенно о т е д н а и съща
X страна н а средната аритметична.
-1SD
А н а л и т и ч н а т а серия с е отхвърля.
-2SD На фиг. 4.16 е представена последовател­
-3SD н о с т т а на к р и т е р и и т е на Westgard, при ко­
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
я т о оценката започва о т bso к а т о с к р и -
Фиг. 4.13. Два контролни р е з у л т а т а - е д и н и я т
н и р а щ к р и т е р и й , след което се прилагат
е извън х + 2SD, а д р у г и я т - извън X-2SD
последователно о с т а н а л и т е правила и се
При използване на два контролни ма­
4ISD. вземат съответно р е ш е н и яз а отхвър.хя
териала, когато два последователни резул- н е н а а н а л и т и ч н а т а серия и з а о т
82
 к а р т а , ако е невъзможно и д е н т и ф и ц и р а ­
н е т о и о т с т р а н я в а н е т о н а източника на
с и с т е м н а т а грешка.
>• М е т о д н а к у м у л а т и в н и т е суми - CUSUM,
к о й т о позволява бързо о т к р и в а н е н а сис­
т е м н и грешки. При т о з и м е т о д ежеднев­
н и т е разлики н а к о н т р о л н а т а проба о т
х н а п р е д в а р и т е л н и я период се с у м и р а т ,
като се спазва алгебричния знак. Препо­
ръчва се к о н т р о л н а граница х+.2. ZSZ* Над
т а з и с т о й н о с т се с ч и т а , че е налице с т а ­
т и с т и ч е с к и з н а ч и м а с и с т е м н а грешка.
Фиг. 4.16. Последователност на контролните П р о г р а м а т а CUSUM се а к т и в и р а к о г а т о
процедури {no Westgard, 1981) к у м у л и р а н а т а сума н а е ж е д н е в н и т е раз­
лики надмине т а з и граница. Възможно е
страплване н а източниците н а греш­ д а се прилага и к а т о комбинирана
ки. GUSUM-Shewart к о н т р о л н а к а р т а . Подхо­
П р о м я н а в н е в ъ з п р о и з в о д и м о с т т а (раз­ д я щ а е за а в т о м а т и ч н и програми за
м е р а н а с л у ч а й н и т е грешки) н а два к о н т ­ ВЛКК. Н а т а б л . 4.3 с а показани изчисле­
ролни периода м о ж е д а бъде о т к р и т а още с н и я т а , необходими з а т о з и м е т о д .
п о м о щ т а н а F - m e c m a з а сравняване н а дис­
персии. Таблица 4.3. CUSUM-контрол на резултати о т
определяне на пикочна киселина {резултати от
предварителния период: х = 340 у то l/l; SD = 15. 7
у то1/1)
ВЛКК ЗА КОНТРОЛ н л
Получена
ДОСТОВЕРНОСТТА (ТОЧНОСТТА) Ден х. - X CUSUM
с т о й н о с т (Xj)
1 326 -14
Независимо, че чрез к р и т е р и и т е н а Westgard
2 349 9 -5
се о т к р и в а т промени в н е д о с т о в е р н о с т т а ,
3 355 15 10
п о - т о ч н о т о определяне н а с и с т е м н и т е
4 340 0 10
грешки м о ж е д а се извърши по следния на­
чин: 5 333 -7 3
6 340 0 3
> Във в с я к а а н а л и т и ч н а серия се изследва
7 353 13 16
контролен м а т е р и а л с у с л о в н а и с т и н
8 335 -5 11
с к а с т о й н о с т н а п о к а з а т е л я , опреде­
9 345 5 16
лен с р е ф е р е н т е н м е т о д или с м е т о д а , из­
ползван в л а б о р а т о р и я т а . Р а з л и к а т а 10 355 15 31
между о б я в е н а т а с т о й н о с т и получена­ 11 349 9 40
т а в л а б о р а т о р и я т а единична с т о й н о с т 12 347 7 47
е л т р к а з а о б щ а т а г р е ш к а - систем­ 13 345 5 52
на + случайна, и т я не т р я б в а д а бъде п о 14 333 -7 45
г о л п л ^ о т +3SI) н а льетода. 15 327 -13 32
> Оценява се с и с т е м н о т о о т к л о н е н и е (bias Коментар: На 12-ия ден се активира CUSUM; кумулатив­
%) н а средна а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т х н а т а сума на разликите (47.00 Йто1/1) е над 2.7SD (42.39
о т определен период (п = 10) о т у с л о в н а ­ м то1/1) - налице е системна грешка, докато в същото
време получената с т о й н о с т - 347 ^mol/l, оценена по кла­
т а и с т и н с к а с т о й н о с т или л г е т о - сическата контролна карта е в контрол, т ъ й к а т о по­
дично-зависилшта стойност. пада в интервала 309-371 ^mol/l (x±2Sü)
> Може д а се използва също ч и ф т н и я t-
т е с т з а с р а в н я в а н е н а средни а р и т м е ­
т и ч н и с т о й н о с т и и при у с т а н о в я в а н е н а
д о с т о в е р н а разлика, следва д а се преиз-
числят параметрите на контролната
83
ВЛКК НА АВТОМАТИЧНИТЕ
АНАЛИЗАТОРИ
Всички съвремении клшшчно-химични анали­
з а т о р и п р и т е ж а в а т к о м п ю т ъ р н и програ­
ми за ВЛКК, в к о и т о са включени ос н овн и те
с т а т и с т и ч е с к и т е с т о в е за откриване на
случайни и с и с т е м н и грешки, в т . ч . к р и т е ­
р и и т е н а Westgard, д и а г р а м и н а Youden,
CUSUM и др. Въпреки т о в а е подходящо да
се с п а з в а т следните основни правила:
• начална проверка - без анализ н а проби н а
п а ц и е н т и , к а т о се и з п о л з в а т контролни
граници Issd и 22Sd;
• т е к у щ к о н т р о л по време н а а н а л и т и ч н а ­
т а серия;
• к о н т р о л н а две или повече а н а л и т и ч н и се­
рии.
П р е п о р ъ ч в а т с е п о п е n o ecjuii н о р м а ­
лен и е д и н п а т о л о г и ч е н к о н т р о л е н ма­
т е р и а л з а а н а л и т и ч н а с е р и я , а п р и Въз­
м о ж н о с т - контролни материали на
т р и ниВа, к а т о н а Всяка 20.-50. п р о б а
на п а ц и е н т с е изсле(|Ват к о н т р о л н и
проби.
Ако р е з у л т а т и т е п о к а з в а т , че анали­
т и ч н а т а с и с т е м а е извън контрол, з а о т к ­
риването и о т с т р а н я в а н е т о на грешките
се п р е д п р и е м а т д е й с т в и я в с л е д н а т а пос­
ледователност:
1. Проследява се основно ц я л а т а а н а л и т и ч ­
н а процедура.
2. К о н т р о л н и т е проби се изследват с нов,
т о к у - щ о р а з т в о р е н к о н т р о л е н серум -
предполага се, че с а н а с т ъ п и л и н е к о н т ­
ролируеми промени в контролния серум за
деня (особено ако не е бил р а з т в о р е н съ­
щия ден!).
3. П р о в е р я в а т се: н и в о т о н а р е а к т и в и т е ,
биологичната проба з а съсиреци, наличи­
е т о н а механични грешки.
4. Търси се дали п р и ч и н а т а за грешка не е
свързана с: използване н а нов набор реак­
т и в и , нов контролен серум, предшеству-
ващ р е м о н т н а а п а р а т у р а т а , поддръж­
к а т а н а а п а р а т у р а , п р е м е с т в а н е н а апа­
ратурата.
5. Проверява се т е м п е р а т у р а т а , влажност­
т а и др. в л а б о р а т о р и я т а .
6. Извършва се рекалибрация за п о к а з а т е л я .
84
к о й т о е извън контрол.
7. С м е н я т се р е а к т и в и т е с нова опаковка
или с опаковка о т друг сериен номер за
един или всички показатели, след к о е т о
се извършва рекалибрация и о т н о в о изс­
ледване на к о н т р о л н и т е серуми.
8. Периодично се извършва поддръжка и ре­
калибрация; к о н т р о л и т е се изследват н а
всеки 20.-50. серум н а болен.
9. Изследват се други контролни м а т е р и а ­
ли, различни о т р у т и н н о използваните,
със с т о й н о с т и , определени с референт-
ни м е т о д и , с к о и т о л а б о р а т о р и я т а
т р я б в а да разполага з а т а к и в а случаи.
10.Проверява се в наръчника н а производи­
т е л я за в ъ з н и к н а л а т а грешка. Уведомя­
ва се производителя, за да реши причина­
т а за възникналия проблем. Предписани­
я т а се изпълняват. К о н т р о л и т е и про­
б и т е н а болните се реанализират.
1 I J I p u проблеми, свързани с р е а к т и в и и кон­
т р о л н и м а т е р и а л и поради причини извън
л а б о р а т о р и я т а , се информира производи­
т е л я з а разрешаване н а проблема.
Важно е да се и м а предвид, че ссим п о се­
б е с и ВЛКК н е л t о Л е д а п о д о б р и к а ч е с ­
т в о т о п а р е з у л т а т и т е , а к о п е пос­
л е д в а т незабавни д е й с т в и л и лгерки
з а отстраняването н а ана^штични-
т е грешки, в т.ч. и в з е л ш н е н а реше-
nuji з а подльяна н а м е т о д , а п а р а т и л и
р е а к т и в и . П и т о една к о н тр о л н а програ­
ма, колкото и съвършена да е т я , не може
да компенсира ненадежден аналитичен ме­
т о д или а п а р а т . Едно по-високо ниво н а уп­
равление н а к а ч е с т в о т о би следвало да на­
сочи у с и л и я т а к ъ м п р е д о т в р а т я в а н е н а
грешките. О т особено значение в т а з и връз­
к а е с т р о г о т о спазване н а писмени указа­
ния з а а н а л и т и ч н и т е процедури - с т а н д а р ­
т н и р а б о т н и процедури (SOP), включител­
но и за разрешаване н а с и т у а ц и и извън кон­
трол.
С т а т и с т и ч е с к и я т ВЛКК е с а м о к с и т б -
р и р а щ се. Само размера н а х и SD определя
предупредителните критерии и критерии­
т е за отхвърляне, без т е да са съобразени с
т е р а п е в т и ч н и и диагностични нужди. Е т о
защо при някои с и т у а ц и и може да се рабо­
т и с емпирични контролни граници, неза­
висимо о т а н а л и т и ч н и я CV. При п о к а з а т е -
ли, к о и т о и м а т г о л я м а междуиндибидуална
биологична в а р и а ц и я се допуска д а и м а т по-
голяма невъзпроизводимост без п о с л е д с т в и я
з а м е д и ц и н с к о т о решение. Е т о з а щ о е необ­
ходимо в н и м а т е л н о подбиране н а к о н т р о л ­
н и т е процедури с цел ограничаване н а р а з ­
х о д и т е . Широко и з п о л з в а н а т а п р а к т и к а з а
п о в т о р е н и е н а а н а л и т и ч н и т е серии е не­
нужна з а о т к л о н е н и я без к л и н и ч н о значение,
независимо, ч е с а с т а т и с т и ч е с к и достовер­
ни.
В големите централни лаборатории ч е с т о се
работи с дублиращи се апар ати. Възниква въп­
росът може ли при ВЛКК на д в а т а (или повече)
а п а р а т и да се използват едни и същи контрол­
ни граници? Това може да се осъществи чрез из­
числяване на общо SD, съотв. C V u о т т у к да се
определят общите контролни граници. На пръв
поглед т о в а би опростило мониторирането на
ВЛКК. Но въвеждането на т а к ъ в начин на кон­
т р о л т р я б в а да с т а в а много предпазливо, защо­
т о контролните граници, определени за всеки
отделен анализатор са по-строги, с по-голяма
способност за откриване на грешки в аналитич­
н а т а процедура. Когато се използват общи гра­
ници, които във всички случаи са по-широки, се
намалява т а з и ч у в с т в и т е л н о с т .
Използването н а к о н т р о л н и к а р т и се
препоръчва с цел д а се подпомогне поддър­
жането с т а б и л н о с т т а на аналитичната
процедура - п р о м е н и т е , н а с т ъ п в а щ и в сред­
н а т а а р и т м е т и ч н а и SD м о г а т много по
бързо и лесно д а се в и д я т при г р а ф и ч н о т о
п р е д с т а в я н е н а о т д е л н и т е к о н т р о л н и ре­
з у л т а т и . С ъ в р е м е н н и т е и з и с к в а н и я з а доб­
р а л а б о р а т о р н а п р а к т и к а н а л а г а т поддър­
жането н а п р е ц и з н а д о к у м е н т а ц и я з а ця­
л о с т н а т а л а б о р а т о р н а дейност, в т.ч. и з а
о с игу ряв ане н а качеството, к о я т о т р я б в а
д а бъде с ъ х р а н я в а н а отделно. З а а в т о м а ­
тично представяне на контролните к а р т и
е подходящо д а се използва с о ф т у е р ъ т н а
Л а б о р а т о р н а т а информационна с и с т е м а
(ЛИС), ако и м а т а к а в а , или персонален ком­
п ю т ъ р . Всички с о ф т у е р н и п р о д у к т и з а
ВЛКК о с и г у р я в а т графично п р е д с т а в я н е н а
т р а д и ц и о н н а т а к а р т а н а Levey-Jenings
(Shewart), а п о в е ч е т о о т т я х и к р и т е р и и ­
т е н а Westgard. А в т о м а т и ч н о т о м о н и т о -
риране н а ВЛКК прави п р и л а г а н е т о н а т е ­
зи к р и т е р и и много по-лесно и т о ч н о .
ВЛКК С ПРОБИ НА ПАЦИЕНТИ
Лабораторните резултати на пациентите
с а к р а й н и я п р о д у к т н а а н а л и т и ч н и т е про-
иедури и м о н и т о р и р а н е т о и м е п о - д и р е к т ­
ния начин в сравнение с използването н а кон­
т р о л н и м а т е р и а л и . З а съжаление, к о н т р о ­
л ъ т н а п р о б и т е н а б о л н и т е е процедура, ко­
я т о е н е ч у в с т в и т е л н а и с м а л к а възмож­
н о с т з а о т к р и в а н е н а грешки. Най-ефектив­
н а би била к л и н и ч н а т а корелация н а лабо­
р а т о р н и т е р е з у л т а т и с д р у г а т а налична
информация з а б о л н и т е - напр. хирургична
находка, т е р а п е в т и ч е н о т г о в о р , биопсия,
а у т о п с и я . По-малко ч у в с т в и т е л н и , но по-
лесни з а приложение с а с р а в н е н и я т а с дру­
ги л а б о р а т о р н и р е з у л т а т и , к а к т о и с пред­
шестващи резултати.
Клинична корелации
В г о л е м и т е ц е н т р а л н и л а б о р а т о р и и е неп­
р а к т и ч н о з а л а б о р а т о р и и т е д а т ъ р с я т ко­
релация между п о л у ч е н и т е л а б о р а т о р н и ре­
з у л т а т и и клиничния с т а т у с н а п а ц и е н т и ­
т е . В т о в а о т н о ш е н и е к л и н и ц и с т и т е , по­
ръчали л а б о р а т о р н и изследвания, с а в по-
добра позиция при и н т е р п р е т а ц и я т а н а ре­
з у л т а т и т е . Те се н у ж д а я т о т л а б о р а т о р ­
ни р е з у л т а т и , з а д а в е р и ф и ц и р а т клинич­
н а т а си диагноза или е ф е к т а о т лечение­
т о . З а съжаление, много о т л а б о р а т о р н и ­
т е р е з у л т а т и не к о р е л и р а т п е р ф е к т н о със
с ъ с т о я н и е т о н а з а б о л я в а н е т о . Всеизвест­
но е, че о г р о м н а т а ч а с т о т л а б о р а т о р н и ­
т е изследвания с а в р е ф е р е н т н а т а о б л а с т
(над 80-90%) к а т о някои о т т я х се назнача­
в а т по-скоро з а о т х в ъ р л я н е н а диагноза, о т ­
колкото обратно. Препоръчва с е Всеки
с ъ м н и т е л е н о т г л е д н а т о ч к а н а кли-
н и ц и с т а р е з у л т а т д а бъде о б е к т н а
д и а л о г ме^кду л а б о р а т о р н и я с п е ц и а ­
л и с т и лекуващия лекар.
> К о н т р о л з а правдоподобност н а лабора­
торните резултати (плаузибилитетен
контрол). К а т о с р е д с т в о з а к о н т р о л се
използува к л и н и ч н а т а корелация н а лабо­
р а т о р н и я р е з у л т а т , напр. у с т а н о в я в а ­
н е т о н а нормална к о н ц е н т р а ц и я н а би-
лирубин в с е р у м а при болен с и к т е р е сиг­
нал з а р а з м е н е н а проба или р е з у л т а т н а
пациента. ИоудърЖапсто п а непрс-
85
 късната връзка с клшшциститс и
д и с к у с и я з а з а б е л я з а н и о т т я х про­
м е н и в качеството н а лаборатор­
н и т е р е з у л т и л ю Ж е д а д а д е полез­
н а допълнителна информация н а
лабораторните специалисти.
> Корелация с други лабораторни резулта­
ти. Използването н а ла б орат орн и конс-
т е л а ц и и (обсъждане н а р е з у л т а т а в съ­
ч е т а н и е с други л а б о р а т о р н и п о к а з а т е ­
ли, х а р а к т е р н и за определени заболявания
или с ъ с т о я н и я ) позволява о т к р и в а н е т о
н а л а б о р а т о р н и грешки: напр. б р о я т н а
е р и т р о ц и т и т е х 3 = хемоглобина в g/dl;
хемоглобин в g / d l х 3 = х е м а т о к р и т а в %.
Х а р а к т е р н а при хронична бъбречна не­
д о с т а т ъ ч н о с т е к о н с т е л а ц и я т а : l4 кре-
а т и н и н / 1 4 у р е я / ф пикочна киселина. Лко
в л а б о р а т о р и я т а при т а к ъ в болен се по­
лучи висока к о н ц е н т р а ц и я за к р е а т и н и н
и нормална за урея, т о т о в а е сигнал з а
л а б о р а т о р н а грешка при определяне н а
у р е я т а ; при з а с т о й в черния дроб се наб­
людава увеличението е д н о в р е м е н н о н а
ГГТ и АФ - ако се у с т а н о в и увеличение
само н а ГГТ, в е р о я т н о с т т а т о в а да се
дължи н а л е к а р с т в е н а интерференция е
много висока и т . н. Може да се използва
и о ц е н к а т а н а т ъ й нар. а н и о н н а п р а з ­
н и н а { a n i o n g a p , AG). AG п р е д с т а в л я в а
р а з л и к а т а между к а т и о н и т е и аниони-
т е , изразени в моларна к о н ц е н т р а ц и я :
AG = (Na + + К + ) - ( С Г + НСОз). Установено
е, че р а з л и к а т а между а н и о н и т е и к а т и ­
о н и т е при 90% о т х о с п и т а л и з и р а н и т е
болни е между 7 и 16 mmol/1. С т о й н о с т и
извън т а з и разлика и з и с к в а т проверка н а
аналитичната точност.
> Delta-check контрол. Най-широко използ­
в а н а т а форма с р е з у л т а т и на п а ц и е н т и ,
въведена в големи лаборатории, п р и т е -
жавагци ЛИС. Предназначена е за оценка
н а възможна с м я н а н а р е з у л т а т и т е н а
п а ц и е н т а . П р е д с т а в л я в а сравнение н а
настояидите р е з у л т а т и на пациента с
неговите предишни р е з у л т а т и . К р и т и ч ­
н а при т о з и м е т о д е с е л е к ц и я т а н а пред­
в а р и т е л н и т е граници. Н а б л ю д а в а н а т а
разлика между р е з у л т а т и т е зависи о т
изследвания п о к а з а т е л и в р е м е т о между
д в е т е изследвания. Пякои а в т о р и препо­
р ъ ч в а т делта-че/с с т о й н о с т и т е да се из­
ч и с л я в а т в п р о ц е н т по о т н о ш е н и е пър­
86
в о н а ч а л н а т а с т о й н о с т (напр. делта-чек
г р а н и ц а т а з а албумин е до 20%, за КК -
99%, за калий - до 20%, за н а т р и й - до 5%,
за к р е а т и н и н до 50%, к о е т о означава, че
отклонения о т т а к ъ в порядък са възмож­
ни и очаквани при различни заболявания.
> Контролни граници на патологичните
стойности. Р е з у л т а т и т е н а п а ц и е н т и ­
т е т р я б в а да се о ц е н я в а т и по о т н о ш е ­
ние на т о в а , дали са във физиологични гра­
ници, с ъ в м е с т и м и с ж и в о т а , т ъ й к а т о
понякога в л а б о р а т о р и я т а се получават
е к с т р е м н и с т о й н о с т и н а някои резулта­
т и , к о и т о м о г а т да б ъ д а т в р е з у л т а т
н а д о п у с н а т а груба грешка - напр. т е х ­
ническа грешка (размяна н а числа, пре­
м е с т в а н е н а десетичен знак). Подходяицо
е всяка л а б о р а т о р и я да п р и т е ж а в а спи­
сък с гранични максимални и минимални
патологични с т о й н о с т и особено за вери-
фициране н а възможни, но рядко срегца-
гци се р е з у л т а т и при ж и в о т о з а с т р а ш а -
ваши с ъ с т о я н и я . Л а б о р а т о р н и я т п е р ­
с о н а л е задължен д а повтори изслед­
в а н е т о с цел проверка з а г р у б а греш­
к а , напр. при с т о й н о с т и за глюкоза под
1 mmol/1 и над 25 mmol/1. На т а б л . 4.4 са
представени препоръчани граници за ми­
нимални и максимални патологични
с т о й н о с т и н а някои р у т и н н и изследва­
ния. Те с а в з а в и с и м о с т о т използвания
а н а л и т и ч е н м е т о д или о т изследваната
популация п а ц и е н т и .
Т а б л и ц а 4.4. Препоръчани патологични граници
на някои лабораторни показатели {мед. no While-
hurst et al.)
Ни ск а Висока
Показател граница
граница
15 60
Албумин (g/1)
Алфа-амилаза (U/1) 20 1000
Билирубин (f.imol/1) 3.5 170
Калций (mmol/1) 1.9 3.8
КК (U/1) 5 1500
Креатинин (цто1/1) 26 700
Калий (mmol/1) 3.0 6.5
Натрий (mmol/1) 120 160
Урея (mmol/1) 1 16
Глюкоза (mmol/1) 1 25
>• Контрол сдвойни проби на пациенти, из­
вестен още к а т о П-контрол. Изследват
се ежедневно а л и к в о т и о т една и съгца
 проба н а п а ц и е н т и , к о я т о се п о с т а в я н а
различни м е с т а в а н а л и т и ч н а т а серия.
Получените разлики о т д в о й н и т е опре­
деления м о г а т д а се н а н е с а т н а R-конт-
ролна к а р т а , к о я т о и м а контролни гра­
ници, изчислени въз основа ±2SD н а раз­
л и к и т е или ±2.5 R, к ъ д е т о R е средна
а р и т м е т и ч н а н а р а з л и к и т е , получени за
един к о нтролен период о т 20 дни. Това е
н а й - п р о с т а т а форма н а контрол, к о я т о
е с ограничена и н ф о р м а т и в н а с т о й н о с т
- к о н т р о л и р а т се само случайните греш­
ки. Може да се използва само к а т о допъл­
н и т е л е н контрол. Подходяща е също за
показатели, з а к о и т о с а т р у д н о д о с т ъ п ­
ни т ъ р г о в с к и к о н т р о л н и м а т е р и а л и
(фиг.4.17).
ДНИ
Ф и г . 4.17. R-контролна к а р т а на двойните опре­
деляния: с т о й н о с т и т е на 29-ия и 30-ия ден са
извън контрол
К о г а т о р а з л и к и т е с а получени с два раз­
лични м е т о д а , т о г а в а R-kapmama к о н т р о ­
лира и с и с т е м н и т е грешки между т я х , но
не може да ги разграничи. И н т е р п р е т а ц и я ­
т а може да се з а т р у д н и , особено ако е нали­
це п о с т о я н н а с и с т е м н а грешка между два­
т а м е т о д а . В т о з и случай се н а л а г а т спе­
циални допълнителни е к с п е р и м е н т и за оп­
ределяне вида н а г р е ш к и т е .
> Метод на средната дневна норма. С по­
м о щ т а на т о з и м е т о д , к о й т о се основа­
ва па разпределението н а р е з у л т а т и т е
на голям брой п а ц и е н т и , може да се ус­
т а н о в я т с и с т е м н и грешки, но е невъз­
можно у с т а н о в я в а н е т о н а случайни
грешки. Това би било полезна допълнител­
н а информация към основните контрол­
ни процедури с к о н т р о л н и м а т е р и а л и .
Трябва да се и м а предвид, че р е з у л т а т и ­
т е н а п а ц и е н т и т е включват различни из­
т о ч н и ц и н а вариация - демографска, био­
логична, патологична, преданалитична
к а т о добавка към а н а л и т и ч н а т а . Важно
при т о з и м е т о д е използването н а о т н о ­
си тел н о хомогенна популация н а пациен­
т и - съотношение мъже/жени, или хос­
питализирани/амбулаторно болни. Нали­
ч и е т о в един и същи ден н а голям брой
п а ц и е н т и о т специализирани клиники
(хематологични, ендокринологични) може
да опорочи е ф е к т и в н о с т т а н а м е т о д и ­
к а т а . С р е д н а т а д н е в н а н о р л г а зави­
си също о т броя н а о б р а б о т в а н и т е ре­
з у л т а т и , к а к т о и о т границите, избра­
ни за изчисляването и. М е т о д ъ т е под­
ходящ за лаборатории с информационна
система.
> М е т о д на подвижната средна д н е в н а
стойност. Използва се за к о н т р о л н а хе-
м а т о л о г и ч н и т е броячи. Приложението
му изисква ползване а л г о р и т ъ м а н а Bull,
с ъ с т о я щ се о т 6 с т а т и с т и ч е с к и проце­
дури. За изчислението им са необходими
20 проби.
С и с т е м и т е , използващи р е з у л т а т и н а
п а ц и е н т и и з и с к в а т с ъ о т в е т н о ниво на ком-
пютъризация, необходими са голям брой ре­
з у л т а т и , за да се о т к р и я т промени в ана­
л и т и ч н а т а надеждност. Те са с ниска чувс­
т в и т е л н о с т за о т к р и в а н е н а грешки - 2-3%.
М о г а т да се п р и л а г а т само к а т о допълни­
т е л н и и не бива да з а м е н я т качествения
к о н т р о л с контролни материали. О т друга
с т р а н а обаче, много о т проблемите, о т к ­
р и т и с т е з и м е т о д и , м о г а т да не б ъ д а т ус­
т а н о в е н и с контролни м а т е р и а л и .
87
СТАТИСТИЧЕСКИ МЕТОДИ
В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ
Л. Лсимбрсва
Използването н а с т а т и с т и ч е с к и м е т о д и в
к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я е сериозна пред­
п о с т а в к а за вземане н а важни решения по
отношение на лабораторните р е з у л т а т и .
Те м о г а т да се о т н а с я т напр. до подмяна
н а един а н а л и т и ч е н м е т о д с друг, до и н т е р ­
п р е т а ц и я т а н а р е з у л т а т и т е - дали са па­
тологични или не, до п р о м е н и т е в лабора­
т о р н и т е р е з у л т а т и на отделния п а ц и е н т
- дали са клинично значими или не и т . н . Тъл­
куването на р е з у л т а т и т е о т ежедневните
процедури за к а ч е с т в е н к о н т р о л съшо е ос­
новано на с т а т и с т и ч е с к и к р и т е р и и , с кои­
т о се преценява з н а ч и м о с т т а н а информа­
ц и я т а о т контролните карти.
П ъ р в а т а с т ъ п к а в т о з и процес за взема­
не н а решение включва използването н а ну­
л е в а т а х и п о т е з а , к о я т о се приема за вяр­
на, д о к а т о не се докаже а л т е р н а т и в н а т а
хипотеза.
В е ж е д н е в н а т а клинично-лабораторна
п р а к т и к а е необходимо и з п о л з в а н е т о н а
с т а т и с т и ч е с к и м е т о д и при с л е д н и т е ос­
новни д е й н о с т и :
• калибрация н а а н а л и т и ч н и т е м е т о д и ,
• оценка н а а н а л и т и ч н а т а н а д е ж д н о с т н а
лабораторните методи,
• провеждане н а в ъ т р е л а б о р а т о р е н качес­
т в е н к о н т р о л (ВЛКК),
• провеждане н а външна оценка н а к а ч е с т ­
в о т о н а л а б о р а т о р н и т е р е з у л т а т и (ВОК),
• изработване н а референтни интервали на
клинично-лабораторните п о к а з а т е л и .
За н у ж д и т е н а к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я
се използват н а й - ч е с т о с л е д н и т е с т а т и с ­
тически методи:
>- определяне вида н а разпределение н а изс­
л е д в а н а т а извадка,
> оценка н а с л у ч а й н а т а вариация н а ана­
литичните методи,
>- сравняване размера н а с л у ч а й н а т а вари­
ация между две извадки,
оценка н а с т а т и с т и ч е с к а т а з н а ч и м о с т
на вариацията,
• сравняване н а средни с т о й н о с т и за зна-
88
чимост на разликата,
>• сравняване с т е п е н т а н а корелация меж­
ду две извадки.
К о г а т о се с ъ б и р а т данни, напр. за изра­
б о т в а н е на референтни интервали, е невъз­
можно да се изследва ц я л а т а човешка попу­
лация. Р е п р е з е н т а т и в н о т о с т а т и с ­
т и ч е с к о п р о у ч В а н е е т а к о в а проучва­
не, п р и к о е т о и н т е р е с у в а щ и т е н и ха­
р а к т е р и с т и к и н а cjafjena с ъ в к у п н о с т
с е получават чрез наблюдение само н а
ч а с т о т единиците на съвкупността.
При т о в а проучване винаги има една гене­
р а л н а с ъ в к у п н о с т , о т к о я т о се излъчва
п р е д с т а в и т е л н а и з в а д к а , к о я т о подле­
ж и н а наблюдение. Необходимо е и з в а д к а т а
да възпроизвежда правилно генералната съв­
к у п н о с т , т . е . да и м а приблизително съща­
т а с т р у к т у р а , к а к т о г е н е р а л н а т а съвкуп­
н о с т . Важно при т о з и т и п проучване е
г р е ш к а т а да бъде предвидена и контроли­
рана.
Тъй к а т о при излъчването н а и з в а д к а т а
д е й с т в а т случайни ф а к т о р и , н е й н и т е ха­
р а к т е р и с т и к и не с ъ в п а д а т напълно с харак­
т е р и с т и к и т е н а г е н е р а л н а т а съвкупност.
С в о й с т в е н а т а н а р е п р е з е н т а т и в н о т о про­
учване грешка е случайна и се нарича огце
стохастична грешка.
П р о я в л е н и я т а н а т ъ й нар. з а к о н з а
г р е ш к и т е при р е п р е з е н т а т и в н и проучва­
ния са доказани т е о р е т и ч н о и проверени ек­
спериментално. Н а й - с ъ щ е с т в е н и т е з а к о -
н о м е р н о с т и н а т о з и з а к о н м о г а т да бъ­
д а т формулирани по следния начин:
а) ако се н а п р а в я т д о с т а т ъ ч н о голям брой
извадки, с р е д н а т а величина и други харак­
т е р и с т и к и , извлечени о т всички извадки,
възпроизвеждат п о ч т и без грешка и с т и н ­
с к и т е характеристики на генералната
съвкупност;
б) с р е д н и я т размер н а а б с о л ю т н а т а греш­
к а е по-малък, о т к о л к о т о о т к л о н е н и я т а
при индивидуалните случаи;
в) разпределението н а г р е ш к и т е е близо до
нормалното, ако о т д е л н и т е извадки съ­
д ъ р ж а т най-малко 50 случая (п > 50).
ОПРЕДЕЛЯНЕ ВИДА НА
РАЗПРЕДЕЛЕНИЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
Разпределението н а р е з у л т а т и т е се о т н а ­
ся до начина, по к о й т о група о т числа е раз­
положена около една и е н т р а л н а т о ч к а . Оп­
ределянето вида н а разпределение н а резул­
т а т и т е има изключително важно значение
по две причини:
• разпределението дава п р е д с т а в а за усло­
в и я т а , при к о и т о с ъ щ е с т в у в а т проучва­
н и т е п а р а м е т р и н а г е н е р а л н а т а съвкуп­
ност,
• ф о р м а т а н а разпределение задължава да
се избере един или друг м е т о д за провеж­
дане на с т а т и с т и ч е с к и я анализ.
З а определяне вида н а разпределение н а
р е з у л т а т и т е се и з п о л з в а т с л е д н и т е с т а ­
тистически методи:
Построяване н а хистограма
Х и с т о г р а м а т а п р е д с т а в л я в а графика н а
разпределението н а р е з у л т а т и , при к о я т о
ч е с т о т а т а на някои с т о й н о с т и или о б х в а т
о т с т о й н о с т и се н а н а с я върху скала о т
всички с т о й н о с т и на р е з у л т а т и т е .
Хоризонталната скала (х) се разделя на оп­
ределен брой групи (интервали ) о т кониент-
рации, к о й т о е о т значение за правилното пос­
трояване на х и с т о г р а м а т а . Когато броят на
наблюденията е малъ к и резултатите са гру­
пирани в по-широк обхват (малък брой), се по­
лучава неверен вид на хистограмата. Кога­
т о б р о я т на наблюденията е висок, а обхва­
т ъ т по-тесен, се получава хистограма, коя­
т о е п о - р е п р е з е н т а т и в н а за изследваната
съвкупност (фиг. 4.18).
18
14
10
-I L оценка н о р м а л н о с т т а на разпределението.
S40 880 920 960 1000 1040 1080 1120
Фиг. 4.IH. Хистограма - нормално разпределение
Ф о р м и т е н а разпределение н а резулта­
т и т е са представени н а фиг. 4.19:
• нормално (Гаус-Лапласово) разпределение
- к р и в а т а и м а напълно с и м е т р и ч н а фор­
м а и прилича на к с и м б а н а с ъ с c i u i i e m -
р и ч н и р а л ю н е , к о и т о се приближават
към а б с ц и с н а т а ос,
• логнормално,
• несиметрично разпределение - ляво и з т е г ­
лено, дясно изтеглено, бимодално - раз­
пределение на Поасон.
УНИМОДЛЛПО БИМОДАЛНО ГЛУСОВО
X=Мо=Ме
полсопово СЛУЧАЙНО ЛОГНОРМАЛНО
X
Мс
Ф и г . 4.19. Видове разпределения
х - срсфш аритметична стойност
Мо - мода
Ме - медиана
За първи п ъ т с и м е т р и ч н о т о разпределение
е описано през 1733 г. о т френския м а т е м а т и к
Abraham de Moivre, а след т о в а разработено о т
Karl Friedrich Gauss през 1800 г. За да бъде едно
разпределение оценено к а т о нормално, не е дос­
т а т ъ ч н о само да бъде построена хистограма,
т ъ й к а т о т о з и м е т о д е субективен - изисква
визуална оценка н а с и м е т р и ч н о с т т а . О т голя­
мо значение е да се о ц е н я т още следните особе­
н о с т и н а с т а т и с т и ч е с к и т е редове - т я х н а т а
с и м е т р и ч н о с т , а с и м е т р и ч н о с т и ексцесив-
носпг.
Параметричните статистически мето­
ди се използват само при условие, че раз­
пределението е нормално. За доказване нор­
м а л н о с т т а на разпределението се използ­
в а т допълнително следните с т а т и с т и ч е с ­
ки т е с т о в е :
Т с с т п а K o l m o g o r o v - S m i m o f f - един о т
най-мощните с т а т и с т и ч е с к и т е с т о в е за
К р и т и ч н и т е с т о й н о с т и за с т а т и с т и ч е с ­
к а д о с т о в е р н о с т се получават о т с т а т и с -
89
тическа таблица;
К о е ф и ц и е н т н а а с и м е т р и я (skew-
n e s s ) - измерва а с и м е т р и я т а в разпределе­
нието на р е з у л т а т и т е . Стойности > 0
п о к а з в а т , че д я с н а т а с т р а н а н а графика­
т а е по-дълга о т л я в а т а - касае се з а л я в а ,
п о л о Ж и т е л н а асилгетрия-, о т р и ц а ­
т е л н и т е р е з у л т а т и п о к а з в а т , че лява­
т а с т р а н а н а г р а ф и к а т а е по-дълга о т дяс­
н а т а - тогава асиметрията е дясна, от­
р и ц а т е л н а а с и л г е т р и я (фиг. 4.20 Б).
К о е ф и ц и е н т н а е к с ц е с ( k u r t o s i s ) - из­
м е р в а п л о с к о с т т а или с т р ъ м н и н а т а н а
к р и в а т а н а разпределение. Коефициент н а
k u r t o s i s > 0 показва, че к р и в а т а е стрълг-
н а в ц е н т ъ р а и е с о т н о с и т е л н о по-дълги
рамене; с т о й н о с т и < 0 п о к а з в а т , че кри­
в а т а е плоска Ü центъра и тогава двете
рамене са по-къси (фиг. 4.20 В).
При нормално разпределение коефициен­
т и т е н а а с и м е т р и я и ексцес т р я б в а да са
между -1 и + 1 (фиг. 4.20 А).
Y2 = 0
Б)
Yi > 0 Yi < 0
/ Yi<0
\ Yi>0
Фиг. 4.20. Илюстрация на асиметрия (skew-ness)
и ексцес (kurtosis)
A) Симетрично разпределение
Б) Лява и дясна асиметрия (skewness)
B) Kurtosis
К о г а т о с о п и с а н и т е по-горе т е с т о в е се
у с т а н о в и , че разпределението е н е с и м е т ­
рично или неправилно, н ай -че ст о се извър­
шва п р о с т а м а т е м а т и ч е с к а т р а н с ф о р м а ­
ция н а д а н н и т е (напр. л о г а р и т м и ч н а тран­
сформация, коренуване, добавяне н а посто­
я н н и числа и т . н . ) . Ч е с т о след т а з и м а т е ­
м а т и ч е с к а манипулация разпределението
се нормализира. Ако въпреки т о в а т о о с т а ­
ва ненормално, се и з п о л з в а т сложни модул­
ни експоненциални функции. Ако и след т о ­
ва разпределението не се нормализира при
90
п о - н а т а т ъ ш н а т а с т а т и с т и ч е с к а обра­
б о т к а се и з п о л з в а т н е п а р а л г е т р и ч н и
л г е т о д и (напр. персентилен).
В о б л а с т т а на медицинските проучвания по­
чести са несиметричните или бимодални раз­
пределения. Например референтният интервал
на ГГТ е обикновено дясно изтеглен; общият ре-
ферентен интервал на пикочната киселина е би-
модален, което показва полово обусловени раз­
личия при този лабораторен показател. В об­
л а с т т а на ВОК бимодално разпределение се ус­
тановява при алкална фосфатаза и а-амилаза,
което предполага използването на методи с раз­
лики в аналитичните принципи, докато при общ
белтък разпределението е симетрично, т ъ й ка­
т о всички лаборатории използват един и същ
метод.
Т е с т о в е т е за у с т а н о в я в а н е н а нормал­
н о с т на разпределението са включени в съв­
ременните компютърни статистически
програми (REFVAL).
Разпределението н а р е з у л т а т и т е се ха­
рактеризира с п о м о ш т а на 2 категории
с т а т и с т и ч е с к и показатели:
• за измерване н а ц е н т р а л н а т а т е н д е н ц и я
н а разпределението,
• за измерване н а в а р и а ц и я т а
Показатели за измерване
на ц е н т р а л н а т а тенденция
Ц е н т р а л н а т а т е н д е н ц и я н а едно разпреде­
ление може да бъде определена с п о м о щ т а
н а т р и п о к а з а т е л я : средна а р и т м е т и ч н а
стойност (х), м е д и а н а и мода.
Средната аритметична стойност
(х) х а р а к т е р и з и р а р а з п о л о ж е н и е т о н а
с т о й н о с т и т е , само ако разпределението е
нормално. Получава се о т с у м а т а н а отдел­
н и т е р е з у л т а т и н а с л у ч а й н а т а извадка
(х! + х2 + Хз + ...хп) разделена н а броя н а ре­
з у л т а т и т е п.
x-IiL
П
М е д и а н а т а (Ме) е с т о й• н о с т , ,к о я т о се
намира по с р е д а т а н а и з в а д к а т а о т с т о й ­
н о с т и , подредени по възходяш ред, т а к а че
1/2 о т с т о й н о с т и т е са над, а д р у г а т а 1/2 -
под м е д и а н а т а . Д р у г о т о и наименование е
50-ия персентил (Р50).
М о д а т а (Мо) е с т о й н о с т или и н т е р в а л
о т и з в а д к а т а , при к о й т о се наблюдава най-
голяма ч е с т о т а т . е . най-голям брой резул­
т а т и с една и с ъ щ а с т о й н о с т или и н т е р ­
вал. Ако ч е с т о т и т е н а р а з п р е д е л е н и е т о
и м а т два пика, т о е бимодално (вж. фиг.
4.19).
При нормално разпределение х = Ме = Мо,
д о к а т о при ненормално разпределение т е са
с различни с т о й н о с т и . При умерено а с и м е т ­
рични редове т е се н а м и р а т в сле д н от о по­
ложение: Мо < Ме < х з а лява а с и м е т р и я - с
п о л е г а т о дясно бедро и по-голямо н а т р у п ­
ване в ляво, д о к а т о при дясна умерена аси­
метрия отношението е обратно:
Мо > Ме > х (вж. фиг. 4.20 Б).
Важно е д а се о т б е л е ж и , че с р е д н а т а
а р и т м е т и ч н а се повлиява в по-голяма с т е ­
пен о т е к с т р е м н и с т о й н о с т и в и з в а д к а т а ,
отколкото медианата.
Показатели за измербане н а
с л у ч а й н а т а Вариации ( р а з с е й в а н е т о )
н а и з м е р В а н и т е Вел ичини
О б х В а т ( r a n g e , R). П р е д с т а в л я в а абсо­
л ю т н а т а р а з л и к а т а между н а й - в и с о к а т а и
най-ниската с т о й н о с т и о т извадката:
R = хг - хmin
Прилага се при малък брой наблюдения. Ко­
г а т о се използва т о з и показател, не м о г а т да
се правят предположения за вида на разпреде­
лението. R e e ограничено приложение к а т о мяр­
ка за вариацията и поради това, че се основава
само на две стойности о т извадката и при не­
го не се държи см етка за другите членове на
статистическия ред. Той е само приблизите­
лен статистически т е с т . Използва с е п р и ка­
ч е с т в е н к о н т р о л с двойни определяния на
проби на п а ц и е н т и .
С т а н д а р т н о о т к л о н е н и е (standard
d e v i a t i o n , SD). Парича се още средно квад-
р а т и ч н о отклонение, с т а н д а р т н а грешка
- най-широко прилагания п о к а з а т е л к а т о
л ь я р к а п а с л у ч а й н а т а в а р и а ц и я . Из-
полза се, з а д а се о ц е н я т р а з л и к и т е между
м н о г о к р а т н и изследвания н а една и съща
проба при определени условия. Зависи о т раз­
мера на с р е д н а т а а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т .
Представлява корен к в а д р а т е н о т с у м а т а
о т к в а д р а т и т е н а р а з л и к и т е между всеки
индивидуален р е з у л т а т о т и з в а д к а т а (Xi)u
с р е д н а т а а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т , разделе-
на на п-1 (при о б р а б о т в а н е на р е з у л т а т и ­
т е о т единични определяния):
SI) =
При обработване н а р е з у л т а т и о т двой­
ни определяния, при к о е т о d е р а з л и к а т а
между д в о й н и т е определяния, се прилага
с л е д н а т а формула, к о я т о се използва за
оценка н а с е р и й н а т а вариация при т а к а
нар. R-контрол:
SI) =
Vп
Д и с п е р с и я (variance, SD 2 ). Формулата
е с ъ щ а т а к а к т о при определяне на с т а н ­
д а р т н о т о о т к л о н е н и е , с а м о че д я с н а т а
с т р а н а на уравнението е повдигната на
к в а д р а т . Използва се при сравняване н а слу­
ч а й н а т а вариация на две извадки (F-test):
SD 2 =
п-1
Д и с п е р с и я т а се използва също в с т а т и с ­
т и ч е с к а процедура, п о з н а т а к а т о ANOVA,
при к о я т о о б щ а т а вариация се п р е д с т а в я
к а т о сбор от различни компоненти на ва­
риация. О т м а т е м а т и ч е с к а гледна т о ч к а
SD не може да се сумира и осреднява, но пов­
д и г н а т а т а н а к в а д р а т с т о й н о с т на всяко
SD - SD2 може да се използва за сумиране на
дисперсията. Изчисленията се и з в ъ р ш в а т
по с л е д н а т а формула:
'(п, - D S D ; + ( п 2 - DS D, +(Пз - DSD;
SI) =
п, + п 2 + п 3 - 3
К о е ф и ц и е н т н а Вариация ( c o f f i c i e n t
o f variation, CV). Представлява отношение
н а с т а н д а р т н о т о отклонение и с р е д н а т а
а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т , изразено в про­
цент:
C V ( % ) = -Tf-lO®
Използва се още т е р м и н ъ т р е л а т и в н о
с т а н д а р т н о отклонение, к о й т о е по-корек­
т е н о т CV, т ъ й к а т о в д е й с т в и т е л н о с т CV
не е коефициент. Този т е р м и н обаче не е на­
мерил широко приложение в п р а к т и к а т а . CV
е о т н о с и т е л е н показател, к о й т о улеснява
с р а в н я в а н е т о на с л у ч а й н а т а вариация при
различни извадки независимо о т знаменате­
ля (х).
91
 Общ к о е ф и ц и е н т н а Вариация - CVt.
Ако са и з в е с т н и Xj и SDj, и Х2 и SD2 (напр.
при използване н а два контролни серума за
контрол на един и същ п о к а з а т е л при ВЛКК)
е възможно да се изчисли общ CV по следна­
т а формула:
, si): , SD
("l " 12 ^ (П2 - 1 ) ^ 2
CV. =
Тази формула е лесно приложима за раз­
личен брой извадки. За н у ж д и т е на ВЛКК кон­
т р о л н а т а к а р т а за всеки п о к а з а т е л се пос­
т р о я в а със с л е д н и т е п а р а м е т р и : х и x1CVt и
х2, X2CVl, к ъ д е т о XiCVt, респ. X2CVt са преиз­
числените SD.
Доверителен интервал
Средната а р и т м е т и ч н а стойност, с т а н ­
д а р т н о т о о т к л о н е н и е и CV се и з п о л з в а т
широко в л а б о р а т о р н а т а п р а к т и к а за це­
л и т е н а ВЛКК при оценка н а с л у ч а й н и т е
грешки н а а н а л и т и ч н и т е м е т о д и и при оп­
ределяне н а р е ф е р е н т н и т е и н т е р в а л и н а
клинично-лабораторните показатели.
Използването на т е з и показатели може да
се извърши само при доказано нормално разпре­
деление на р е з у л т а т и т е . При нормално разпре­
деление с р е д н а т а а р и т м е т и ч н а и с т а н д а р т н о ­
т о отклонение, к о и т о са с една и съща мерна
единииа, м о г а т да се използват за изчисляване
на п р о ц е н т о т с т о й н о с т и т е , попадащи в оп­
ределена о б л а с т на Г а у с о в а т а крива. П л о щ т а
под н о р м а л н а т а крива т е о р е т и ч н о п р е д с т а в ­
лява всички с т о й н о с т и на изследваната гене­
рална съвкупност.
Нормалното разпределение има едно важ­
но свойство, к о е т о гласи: ако от к р и в а т а
на нормалното разпределение се с п у с н а т
перпендикуляри к ъ м абсцисната ос от две­
т е страни на средната а р и т м е т и ч н а
стойност (х) на разстояние t-пъти стан­
дартното отклонение (SD), то относител­
н и я т дял от п л о щ т а под н о р м а л н а т а кри­
ва, заградена от д в а т а перпендикуляра, за­
виси само от стойността на t пред SD.
Най-важните особености н а нормалното
разпределение (фиг. 4.21) са:
• средна а р и т м е т и ч н а = медиана = мода
• 68.2% о т с т о й н о с т и т е са в о б л а с т т а
xtlSD
92
95.5% о т с т о й н о с т и т е с а о б л а с т т а
x±2SD
99.7% о т с т о й н о с т и т е са в о б л а с т т а
x±3SD
-3SD -2SD -1SD + 1SD +2SD +3SD
Фиг. 4.21. Гаусово разпределение на резулта­
тите
Тези интервали, к о и т о с ъ д ъ р ж а т п о с т о ­
янен п р о ц е н т о т с т о й н о с т и т е на изслед­
в а н а т а генерална съвкупност, се н а р и ч а т
д о в е р и т е л н и и н т е р в с и ш {confidence in­
tervals). Това означава, че в е р о я т н о с т т а
един случаен р е з у л т а т да попадне в с ъ о т ­
в е т н и я и н т е р в а л е 0.95 за 95%-ия и н т е р в а л
(x±2SD) и 0.99 за зй:38В-интервала. Деветде­
с е т и п е т п р о ц е н т н и я доверителен и н т е р ­
вал е в о с н о в а т а н а с т а т и с т и ч е с к и я ВЛКК
за определяне н а к о н т р о л н и т е граници, при
к о и т о една а н а л и т и ч н а серия се „приема"
или „отхвърля", к а к т о и за изчисляване н а
референтни интервали.
В с т а т и с т и ч е с к и я анализ широко се из­
ползва д о п ъ л в а щ а т а до 1 в е р о я т н о с т р, ко­
я т о се нарича у р о в е н н а з н а ч и л ю с т и
п р ед ставл я ва р и с к ъ т т в ъ р д е н и е т о да бъ­
де погрешно. Обикновено се приема, че т о ­
зи риск е д о с т а т ъ ч н о малък, к о г а т о не над­
вишава 5% (р = 0.05). В зависимост о т цел­
т а на проучването може или т р я б в а да се
избере по-строг (по-малък) уровен н а значи­
м о с т , напр. р = 0.01.
С т а н д а р т н а грешка
н а с р е д н а т а а р и т м е т и ч н а (Sx)
Представлява р а з м е р ъ т на в а р и а ц и я т а при
мн о г о к р атн о определяне н а х и се определя
с отношението:
SI)
 Този п о к а з а т е л и м а в а ж н о значение п р и
използване н а t-test н а Student-Fisher з а срав­
н я в а н е н а средни а р и т м е т и ч н и с т о й н о с т и
н а две извадки с цел определяне з н а ч и м о с т ­
т а на разликите между т я х . С п о м о щ т а на
Sx се осигурява в ъ з м о ж н о с т т а д а се опре­
дели д о в е р и т е л н и я и н т е р в а л , в к о й т о би по­
паднала с р е д н а т а а р и т м е т и ч н а н а генерал­
н а т а с ъ в к у п н о с т (ц):
т = х ± tSx
ц, - средна а р и т м е т и ч н а на генералната съвкуп­
ност
х - средна а р и т м е т и ч н а на извадката
t - множител, свързан с разпределението на Stu-
dent-Fisher (зависи о т с т е п е н и т е на свобода -
п-1 и желания уровен на значимост р). Уровен
на значимост р = 0.05 означава, че вероят­
н о с т т а интервалът да включва и с т и н с к а т а
т е 95%.
СТАТИСТИЧЕСКИ МЕТОДИ
ЗА СРАВНЯВАНЕ НА ИЗВАДКИ
НулеВа х и п о т е з а и
статистическа значимост
Н у л е в а т а х и п о т е з а е р а б о т н а х и п о т е з а при
с т а т и с т и ч е с к а т а о б р а б о т к а н а две извад­
ки н а една г е н е р а л н а с ъ в к у п н о с т , при коя­
т о се приема, че н я м а з н а ч и м а разлика м е ж ­
ду т е х н и т е п а р а м е т р и jq и х 2 и SÖ! и SD2:
X! = Х2 и SDj = SD2 - нулева х и п о т е з а (Н 0 )
Xj ж х 2 и SÖ! х SD2 - а л т е р н а т и в н а х и п о т е з а
Например при определянето на серумен кал­
ций с колориметричен и AAS-метод са получени
две различни средни а р и т м е т и ч н и с т о й н о с т и
X! и Х2. Т я х н а т а разлика може да бъде случайна
и да се дължи на случайна грешка при определя­
н е т о на д в е т е с т о й н о с т и . Но р а з м е р ъ т на слу­
ч а й н а т а грешка на всяка средна а р и т м е т и ч н а
(Sx), може да се определи. Ако установеното раз­
личие надхвърли определен размер, к о й т о при
определена в е р о я т н о с т може да се дължи на слу­
чайност, ще следва, че между с р а в н я в а н и т е
средни е възникнала неслучайна разлика, т . е . че
Xi и Х2 са достоверно различни.
Тези разсъждения са залегнали в основата на
с т а т и с т и ч е с к и т е т е с т о в е за значимост, с ко­
и т о се извършва сравнение между различни с т а ­
тистически параметри. Т е с т о в е т е за с т а т и с ­
тическа значимост определят в е р о я т н о с т т а
или по-точно уровена на значимост на т ъ й нар.
нулева хипотеза: разликата между сравнявани­
т е показатели е случайна, т я не съществува
между с ъ о т в е т н и т е генерални параметри. Ко­
г а т о уровенът на значимост р е д о с т а т ъ ч н о
с т р о г , нулевата хипотеза се отхвърля к а т о
неправдоподобна. Когато се приема алтерна­
т и в н а т а хипотеза - разликата наистина съ­
ществува.
З а д о с т а т ъ ч н о с т р о г к р и т е р и й се прие­
м а р = 0.05. С т е п е н и т е н а свобода d f (degrees
0
f f r e e d o m ) с е о п р е д е л я т по ф о р м у л а т а
d f = п-1. Р а з л и к а т а м е ж д у с р а в н я в а н и т е по­
к а з а т е л и се о п р е д е л я к а т о з н а ч и м а , а к о
р < 0.05; ако р < 0.01, р а з л и к а т а се определя
к а т о високо з н а ч и м а ( с и г н и ф и к а н т н а ) при
и з б р а н и т е условия н а сравнение.
Един о т н а й - ч е с т о и з п о л з в а н и т е т е с т о ­
ве з а сравняване н а средни а р и т м е т и ч н и н а
две извадки, с цел д а се у с т а н о в и з н а ч и м о с т ­
т а н а р а з л и к а т а м е ж д у т я х е t-тестът н а
Student-Fisher. Две п р е д п о с т а в к и с а необхо­
дими з а п р а в и л н о т о използване н а т о з и
тест:
а) р а з п р е д е л е н и е т о н а д в е т е извадки е нор­
мално,
б) н я м а з н а ч и м а р а з л и к а м е ж д у т е х н и т е
дисперсии (SD2)
Н у л е в а т а х и п о т е з а по о т н о ш е н и е н а
в т о р о т о условие (б) т р я б в а д а бъде прове­
р е н а с F-test.
С р а в н я в а н е н а д и с п е р с и и (F-mecm)
F - т е с т ъ т е с т а н д а р т н о уравнение, к о е т о
се използва з а сравняване н а разлики във въз-
п р о и з в о д и м о с т т а , при к о е т о SÜ! > SD2 т . е .
в ч и с л и т е л я винаги е п о - г о л я м о т о с т а н д а р ­
т н о отклонение:
(SI) 2 ) !
F - т е с т ъ т се използва, з а д а се определи
дали н а б л ю д а в а н а т а разлика между две дис­
персии е с т а т и с т и ч е с к и значима. Изчисле­
н а т а по ф о р м у л а т а с т о й н о с т н а F се срав­
н я в а с к р и т и ч н а с т о й н о с т F k , получена о т
т а б л и ц а з а F при уровен н а з н а ч и м о с т
р = 0.05 и определени с т е п е н и н а свобода
d f = п-1 ( т а б л . 4.5). Напр. при р = 0.05 и п ^
п 2 = 20, d f = 19, F k = 2.12. Ако и з ч и с л е н а т а
с т о й н о с т е F < 2.12 д в е т е дисперсии с а нез-
93
Т а б л и ц а 4.5. Критични с т о й н о с т и на F (при р = 0.05)
С т е п е н и н а свобода (df)
С т е п е н и н а свобода (df)
5 10 15 20 30 60 00
1 230.00 242.00 246.00 248.00 250.00 252.00 254.00
2 19.30 19.40 19.40 19.40 19.50 19.50 19.50
3 9.01 8.79 8.70 8.66 8.62 8.57 8.53
4 6.26 5.96 5.86 5.80 5.75 5.69 5.63
5 5.05 4.74 4.62 4.56 4.50 4.43 4.36
6 4.39 4.06 3.94 3.87 3.81 3.74 3.67
7 3.97 3.64 3.51 3.44 3.38 3.30 3.23
8 3.69 3.35 3.22 3.15 3.08 3.01 2.93
9 3.48 3.14 3.01 2.94 2.86 2.79 2.71
10 3.33 2.98 2.85 2.77 2.70 2.62 2.54
15 2.90 2.54 2.40 2.33 2.25 2.16 2.07
20 2.71 2.35 2.20 2.12 2.04 1.95 1.84
30 2.53 2.16 2.01 1.93 1.84 1.74 1.62
60 2.37 1.99 1.84 1.75 1.65 1.53 1.39
00 2.21 1.83 1.67 1.57 1.46 1.32 1.00

начимо различни, ако F > 2.12, д в е т е диспер­ н и е т о е следното:

сии се р а з л и ч а в а т значимо - т . е . н у л е в а т а
х и п о т е з а се о т х в ъ р л я . Това показва, че t-
т е с т ъ т не може да се използва и се прила­
г а т а л т е р н а т и в н и м е т о д и , посочени в с т а ­
т и с т и ч е с к а т а л и т е р а т у р а . Трябва да се
отбележи, че т о з и т е с т се използва най-чес-
т о за с т а т и с т и ч е с к о сравняване на м е т о ­
ди. Но т о й не може да определи дали възп-
р о и з в о д и м о с т т а н а проучвания м е т о д е
приемлива за л а б о р а т о р н и цели.
С р а в н я в а н е н а cpecjiiu а р и т м е т и ч н и
с т о й н о е т и (t-meem). За проучване с т а ­
т и с т и ч е с к а т а значимост на разликата
между две средни а р и т м е т и ч н и с т о й н о с т и
е подходящо да се използва t - m e e m a н а Stu­
dent. При сравняване н а м е т о д и т о з и т е с т
би определил дали п о л у ч е н а т а с проучвания
м е т о д средна а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т се
различава достоверно о т средна с т о й н о с т ,
получена напр. с референтен м е т о д или друг
м е т о д , избран з а сравнение. С ъ щ е с т в у в а т
два в а р и а н т а н а t-mecma - нечафтен и чиф­
тен.
Н е ч и ф т с н (пезависияг) t-mccm. При­
лага се при сравняване н а средни стойнос­
т и н а две независими групи, напр. референ-
т н и с т о й н о с т и н а определен лабораторен
показател, получени в две различни населе­
ни м е с т а , в различни лаборатории. Уравне-
94
|Х| - X2
t=
SI).
Това уравнение представлява абсолютна­
т а с т о й н о с т н а р а з л и к а т а между д в е т е
сравнявани средни а р и т м е т и ч н и стойнос­
т и X! и Х2, разделена н а с т а н д а р т н а т а
грешка н а т а з и разлика SDd. SDd се изчисля­
ва по следното уравнение:
II, +11. V (п, - l)SI); + (п 2 -l )S I); •
SI),, =
п ,П п, + п 2 - 2
П! - брой изследвания с първия метод
п2 - брой изследвания с втория метод
SÜ! - стандартно отклонение на първия метод
SD2 - стандартно отклонение на втория метод
При П! = Пз = 20, d f = 19, т а б л и ч н а т а с т о й ­
н о с т н а t = 2.09. Това означава, че при срав­
н я в а н е н а две средни с т о й н о с т и с т о з и
т е с т р а з л и к а т а ще бъде достоверна, ако
получената с т о й н о с т н а t > 2.09.
Чифтен t-mecm. При ч и ф т н и я t-mecm
се с р а в н я в а т средни а р и т м е т и ч н и с т о й ­
н о с т и н а два м е т о д а , получени при изслед­
ване н а една и съща популация, напр. един и
същ биологичен м а т е р и а л . Използва се урав­
нението:
 Таблица 4.7. Чифтен t-mecm (пример)
№ Метод А Метод В d d - b i a s (d-bias)2
1 61 59 2 -0.3 0.09
2 68 68 0 -2.3 5.29
n- брой изследвания, получени с проучвания ме­
3 71 70 1 -1.3 1.69
тод
4 75 76 -1 -3.3 10.89
bias - абсолютната стойност на разликата меж­
5 78 74 4 1.7 2.89
ду У и х
6 84 80 4 1.7 2.89
у - средна аритметична стойност, получена с
7 90 81 9 6.7 44.89
проучвания метод
8 93 90 3 0.7 0.49
х - средна аритметична стойност на референ- 9 98 99 -1 -3.3 10.89
т н и я метод или метода, използван за срав­ 10 105 103 2 -0.3 0.09
нение X 82.3 80.0 Bias = 82.3-80.0 = 2.3 2 = 80.10
SDd - стандартна грешка на разликата у - х
t |bias|>/n 2,3x3,16 , ш
Sl)(1 2,983
При ч и ф т н и я t-mecm SDd се изчислява по
О т таблицата за t-mecm (табл. 4.6) се намира критичната
уравнението: с т о й н о с т Ц = 2.262 (р = 0.05; с т е п е н на свобода df = п - 1 = 9).
Тъй к а т о изчислената с т о й н о с т на t = 2.439, т о t > tk и сле­
дователно разликата между с р е д н и т е а р и т м е т и ч н и
с т о й н о т и на д в а т а м ет о д а е значима.

yi и х; - чифтовете резултати, получени лага t-разпределението н а Student-Fisher.

с д в а т а метода При с т е п е н и на свобода d f =п-1 и при уро­
(у - х) - bias, т . е . разликата между средните вен на з н а ч и м о с т р = 0.05 по т а б л и ц а т а на
аритметични на д в а т а метода t-test на Student-Fisher се о т ч и т а к р и т и ч ­
Таблица 4.6. t-разпределение на Student-Fischer н а т а с т о й н о с т t k (напр. при п = 20, d f = 19,
(при р = 0.05) t = 2.093), к о я т о се сравнява с получената по
Степени на Степени на формулата:
свобода (df) O
K
.S с(к)бода ( d f ) ^0.»5
|х - Хо|
5 2.571 15 2.131
6 2.447 16 2.120 sx
7 2.365 17 2.110 След з а м е с т в а н е на се получава:
8 2.306 18 2.101
9 2.262 19 2.093 Ix - Xо Iл/п
t= —
10 2.228 20 2.086 SI)
11 2.201 25 2.080 Най-често в клиничната лаборатория се
12 2,179 60 2.000 прилага ч и ф т н и я t-test, с к о й т о се сравня­
13 2,160 120 1.980 в а т средни с т о й н о с т и , получени с два раз­
14 2.145 00 1.960 лични м е т о д а при изследване на едни и съ­
щи биологични м а т е р и а л и .
Чрез използване н а т а б л и ц а т а за t-mecm
(табл. 4.6) се намира к р и т и ч н а т а с т о й н о с т Т е с т з а проПерка з а р я з к о отклопяВа-
t k при определените с т е п е н и н а свобода df щ и с е с т о й н о с т и ("бегълци"). При ва­
и с ъ о т в е т н и я уровен на з н а ч и м о с т р = 0.05 риационен анализ на извадки с ограничен
(табл. 4.6). Получената к р и т и ч н а с т о й н о с т брой изследвания, к а к т о е при обработка на
t k се сравнява с и з ч и с л е н а т а с т о й н о с т н а t: вариационен ред о т предварителен период
ако t > t k - р а з л и к а т а между у и х е значима, при ВЛКК, е необходимо да се извърши т е с -
ако t < t k - р а з л и к а т а между у и х не е значи­ т у в а н е за „бегълци". Използва се Т - т е с т по
ма. Пример з а изчисляване н а ч и ф т е н формулата:
t-mecm е п р е д с т а в е н в т а б л . 4.7.
К о г а т о е и з в е с т н а само с р е д н а т а а р и т ­
м е т и ч н а на г е н е р а л н а т а съвкупност х0, без
да са известни SD и п, при брой на изследва­ SD - стандартно отклонение на извадката
н и я т а на проучвания м е т о д п < 30, се при- х - средна аритметична на извадката
95
X
max" най-високата рязко от1слоняваща
се с т о й н о с т
x min - най-ниската рязко отклоняваща
се с т о й н о с т
При п = 20 и в е р о я т н о с т з а грешка 5%,
Т=2.56; ако се получи с т о й н о с т , по-голяма
о т 2.56, с т о й н о с т т а се о т с т р а н я в а к а т о
грубо погрешна.
НЕПАРАМЕТРИЧНИ МЕТОДИ
ЗА СРАВНЯВАНЕ НА ПОПУЛАЦИИ
О п и с а н и т е досега с т а т и с т и ч е с к и м е т о д и
се н а р и ч а т оиде п а р а м е т р и ч н и , т ъ й к а т о
т е и з и с к в а т нормално, Гаусово разпределе­
ние н а р е з у л т а т и т е . Много изследвани по­
пулации не о т г о в а р я т н а т о з и к р и т е р и й ,
поради к о е т о с а необходими с т а т и с т и ч е с ­
ки т е х н и к и за сравняване и оценяване, кои­
т о са независими о т вида н а разпределение.
П е р с е н т и л с п м е т о д . Използва се з а об­
р а б о т к а н а р е ф е р е н т н и граници. Най-прос­
т а т а непараметрична методика е т а з и ,
при к о я т о ч и с л а т а се п о д р е ж д а т по възхо-
дяш, ред о т н а й - н и с к а т а до н а й - в и с о к а т а
с т о й н о с т . М е д и а н а т а (Pso) е к р и т е р и й з а
ц е н т р а л н а т а тенденция, а интервалът
между Р2.5 и Р97>5 се използва н а й - ч е с т о ка­
т о р с ф с р о н т е н и н т е р в а л . Определяне­
т о н а номера по ред н а Рз 5 при п изследвани
здрави лица в п о п у л а ц и я т а се изчислява по
формулата:
132.б =
0.025(ii+l), а н а Р97.5= 0.975(п + 1)
Метод на знаците (Sign test), к о й т о е ана­
логичен н а t-meema, з а сравняване н а две не-
п а р а м е т р и ч н и популации.
Метод на Mann-Whitney.
Хи-квадрат и др., описани подробно в учеб­
н и ц и т е по с т а т и с т и к а .
В с ъ в р е м е н а т а лаборатория, ползването
на г о т о в и к о м п ю т ъ р н и п р о д у к т и за различ­
н и т е с т а т и с т и ч е с к и методи значително
улеснява о б р а б о т к а т а н а р е з у л т а т и т е .
96
ВЪНШНА ОЦЕНКА НА
КАЧЕСТВОТО НА
ЛАБОРАТОРНИТЕ РЕЗУЛТАТИ
К. Ц а ч е в
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
В ъ н ш н а т а оценка н а к а ч е с т в о т о (ВОК) е
т е р м и н , к о й т о следва да се използва вмес­
т о т е р м и н а външнолабораторен качествен
к о н т р о л и се о т н а с я до система за обектив­
на оценка на лабораторните резултати от
определена външна за лабораторията служ­
ба. Тази проверка е по същество ретроспек­
тивна, тъй като направената оценка на
дейността на дадена лаборатория се съоб­
щава на въпросната лаборатория определе­
но време по-късно, т.е. когато резултати­
те за този ден вече са „пуснати" от лабо­
раторията. Следователно тази оценка не
може да има какъвто и д а е било ефект вър­
х у вече „пуснатите"от лабораторията ре­
з у л т а т и за деня на проверката. О с н о в н а
ц е л н а ВОК е д а с е о с и г у р и с р а в н и м о с т
на р е з у л т а т и т е давани о т различни
лаборатории.
ИСТОРИЧЕСКИ БЕЛЕЖКИ
Първият о п и т за външна оценка на качество­
т о е извършен о т Belk и Sunderman през 1947 г.
в САЩ. В него са участвали 59 лаборатории о т
щ а т а Пенсилвания. К а т о контролни материа­
ли са използвани водни разтвори на глюкоза,
у рея, серум за общ белтък и цяла кръв за хемог­
лобин. Критерият за приемливост е бил ±10% и
т о й е бил определен въз основа само на личния
о п и т и виждане на организаторите. Над 60% о т
участниците не са дали приемливи р е з у л т а т и
за повече о т половината резултати. Други ав­
т о р и провеждат аналогични проверки в регио­
нален (щатски) мащаб и получават сходни ре­
з у л т а т и . Започват да се т ъ р с я т причините за
т о в а разсейване на р е з у л т а т и т е и мерки за не­
говото преодоляване. През 1951 г. Levey и Jen­
nings въвеждат в клиничната лаборатория сис­
т е м а за вътрелабораторен качествен контрол
(ВКК), аналогична на използваната в индустри­
алното производство система, разработена о т
Shewhart през 1931 г.
В н а ч а л о т о н а 6 0 - т е години с т а в а ясно,
че к о л к о то сложна и съвършенна да е една
с и с т е м а за ВКК т я не може с а м а по себе си
да осигури с р а в н и м о с т н а р е з у л т а т и т е по­
лучавани о т различни лаборатории. Toßa
м о ж е д а с е п о с т и г н е с а м о чрез дей­
н о с т т а на с и с т е м а з а външна оценка
на качестВото.
Наличието н а с р а в н и м о с т на р е з у л т а т и ­
т е , получавани о т различни лаборатории, е
о т с ъ щ е с т в е н о значение поради: използва­
не на общи референтни стойности; двиЛе-
нието на персонал от болница в болница;
двшкение на болните; изследвания, провеж­
дани на различни места в различни етапи
на диагностичния процес или лечението на
болните.
Днес д е й н о с т т а н а една съвременна кли­
нична л а б о р а т о р и я е немислима без нейно­
т о у ч а с т и е в с и с т е м а з а ВОК. Всички раз­
в и т и страни и м а т т а к и в а системи, к о и т о
д е й с т в а т о т години. Нещо повече, у ч а с т и ­
е т о в с и с т е м а за ВОК е един о т о с н о в н и т е
к р и т е р и и при а к р е д и т и р а н е т о на лабора­
т о р и и т е , к о е т о е в ход във всички с т р а н и
н а Европейския съюз, СЛЩ, Австралия и др.
ОСНОВНИ ЦЕЛИ НЛ ВОК
А н а л и т и ч н и ц е л и - основна задача на сис­
т е м а т а за ВОК се явява п р е ц е н к а т а на меж-
дулабораторната сравнимост на резулта­
т и т е . С п о м о щ т а на с и с т е м а за ВОК се оце­
нява независимо и о б е к т и в н о д е й н о с т т а на
о т д е л н и т е лаборатории, к а т о получената
информация се п р е д о с т а в я на лаборатори­
и т е и служи к а т о с т и м у л за подобряване на
т я х н а т а дейност. Тази с и с т е м а п р е д о с т а ­
вя също т а к а ценни данни з а о б щ о т о ниво
на л а б о р а т о р н а т а дейност в национален ма­
щаб, за н а д е ж д н о с т т а на о т д е л н и т е м е т о ­
ди, к а к т о и за използваните калибратори,
контролни материали, р е а к т и в и и а п а р а т у ­
ра. С п о м о щ т а н а с и с т е м а т а за ВОК се по­
добрява с р а в н и м о с т т а н а р е з у л т а т и т е , по­
лучавани о т различни лаборатории, к а к т о
и н а д е ж д н о с т т а на р е з у л т а т и т е о т о т ­
делните лаборатории. По т о з и начин се из­
б я г в а т излишни п о в т о р н и изследвания и се
реализира значителен икономически е ф е к т .
Всичко т о в а налага и з г р а ж д а н е т о на наци­
онална с и с т е м а з а външна оценка на качес­
т в о т о , к о я т о съгласно препоръките н а СЗО
т р я б в а да бъде задължително независима
о т производителите н а лабораторна апа­
р а т у р а , реактиви, калибрационни и к о н т ­
ролни м а т е р и а л и и др.
Цели свързани със з д р а в н а т а полити­
к а - к р а й н а т а цел н а ВОК е подобряване н а
здравното обслужване чрез подобряване на
л а б о р а т о р н а т а дейност.
Националната с и с т е м а за ВОК допринася
за подобряване на л а б о р а т о р н а т а дейност,
респ. к а ч е с т в о т о н а здравно обслужване
чрез:
1. Предоставяне н а н у ж д а е щ и т е се лабора­
т о р и и н а непосредствена п р ак ти ческ а
помощ, обучение и квалификация.
2. Налагане н а санкции н а л а б о р а т о р и и т е
с незадоволителна дейност.
В повечето с т р а н и се набляга на първа­
т а възможност, но в редица държави се дър­
жи на финансови, професионални или други
предвидени в закона санкции спрямо лабо­
р а т о р и и т е с незадоволителна дейност. При
финансовите санкции обикновено се касае за
о т к а з на здравно о с и г у р и т е л н а т а каса да
з а п л а т и извършените изследвания о т лабо­
р а т о р и я , к о я т о н я м а с е р т и ф и к а т за задо­
волителна дейност, издаден о т с и с т е м а т а
за ВОК. Професионалните санкции се изра­
з я в а т в о т к а з да се потвърди с т а т у т а на
л а б о р а т о р и я т а к а т о ц е н т ъ р за следдиплом­
на квалификация и специализация. Предви­
д е н и т е в закона санкции обикновено се из­
р а з я в а т в о т н е м а н е лиценза за дейност на
л а б о р а т о р и и т е , к о и т о не о т г о в а р я т н а
п р и е т и т е критерии за качество.
ОРГАНИЗАЦИЯ И ДЕЙНОСТ
НА СИСТЕМА ЗА ВОК
Редица международни организации к а т о
ISO, lUPAC, IFCC, WHO и др. са разработи­
ли и приели редица инструкции за извърш­
в а н е т о на междулабораторни проучвания.
Па п р а к т и к а , една с и с т е м а за ВОК включва
следните дейности:
1. Подбор н а п о д х о д я щ к о н т р о л е н ма­
т е р и а л . Основните изисквания към из­
ползвания контролен м а т е р и а л са:
• да наподобява максимално м а т е р и а л а о т
изследваните болни;
97
• да бъде т р а е н най-малко за в р е м е т о , през
к о е т о се провежда к о н т р о л а ;
• да бъде безопасен u да о т г о в а р я н а всички
национални законови и други изисквания
в т о в а о т н о ш е н и е - ч о в е ш к и т е кръвни
п р о д у к т и т р я б в а да с а о т р и ц а т е л н и з а
х е п а т и т В и С, HIV I, II и III (за някои
географски райони);
• всички контролни м а т е р и а л и , с изключе­
ние н а т е з и за к о н т р о л н а микробиологич­
н и т е изследвания, т р я б в а да б ъ д а т с т е ­
рилни; с т е р и л н о с т т а се проверява при
т я х н о т о производство чрез изследване на
случайно подбрани флакони; б р о я т н а про­
в е р е н и т е флакони зависи о т размера н а
с е р и я т а и условията, при к о я т о т я се раз­
лива (обикновено е д о с т а т ъ ч н а проверка
н а 1 флакон н а всеки 500).
2. И з п р а щ а н е н а к о н т р о л н и я м а т е р и ­
ал п р и д р у ж е н е п о д р о б н а и н с т р у к ­
ц и я cjo у ч а с т в а щ и т е л а б о р а т о р и и .
Изпраидането н а биологичния м а т е р и а л
т р я б в а да о т г о в а р я н а всички национал­
ни и международни изисквания в т о в а о т ­
ношение. У ч а с т в а щ и т е лаборатории след­
ва да п о л у ч а т к о н т р о л н и я м а т е р и а л въз­
можно най-бързо. В определени случаи е з а
предпочитане използването н а куриер з а
разнасяне н а м а т е р и а л а . Трябва да се кон­
тролира и о т ч и т а влиянието на т р а н с ­
п о р т а върху к о н т р о л н и я м а т е р и а л .
3. И з с л е д в а н е н а к о н т р о л н и я м а т е р и ­
ал п о м е с т а о т у ч а с т в а щ и т е лабо­
р а т о р и и . То т р я б в а да се извърши съг­
ласно п р и д р у ж а в а щ и т е го указания и по
същия начин, к а к т о се изследват проби­
т е о т пациентите.
4. С ъ б и р а н е н а п о л у ч е н и т е р е з у л т а т и
и н е о б х о д и м а т а и н ф о р м а ц и я з а из­
п о л з в а н и т е м е т о д и . Получените резул­
т а т и и п р и д р у ж а в а щ а т а ги информация
се и з п р а щ а т о т у ч а с т в а щ и т е л а б о р а т о ­
рии по п о щ а т а или чрез факс.
5. О п р е д е л я н е н а п р и ц е л н и т е с т о й н о с ­
т и . Прицелните с т о й н о с т и з а всеки изс­
ледван п о к а з а т е л в контролния м а т е р и ­
ал м о г а т да се о п р е д е л я т проспективно
чрез използване н а р е ф е р е н т н и м е т о д и
или р е т р о с п е к т и в н о чрез изчисляване н а
съгласувана средна с т о й н о с т { c o n s e n s u s
value) о т р е з у л т а т и т е н а всички у ч а с т ­
98
ници в проучването. Пай-висока надежд­
н о с т и м а т прицелните с т о й н о с т и опре­
делени чрез дефинитивни м е т о д и или у т ­
върдени референтни м е т о д и използвайки
сертифицирани р е ф е р е н т н и м а т е р и а л и .
Съгласувани средни с т о й н о с т и следва да
се използват, к о г а т о л и п с в а т у т в ъ р д е н и
дефинитивни или референтни методи, ка­
т о в т о з и случай б р о я т н а у ч а с т н и ц и т е
т р я б в а да бъде о т с т а т и с т и ч е с к а глед­
н а т о ч к а д о с т а т ъ ч н о голям.
6. О ц е н к а н а р е з у л т а т и т е и съобщава­
н е т о и м на у ч а с т в а щ и т е лаборато­
рии. С ъ щ е с т в у в а т различни подходи з а
определяне г р а н и ц а т а н а приемливост н а
получените о т у ч а с т в а щ и т е лаборато­
рии р е з у л т а т и :
>• И з п о л з в а н е р е з у л т а т и т е н а в с и ч к и
у ч а с т н и ц и след изключване н а ряз­
к о отклоняващите се стойности.
Това е н а й - п р о с т и я т начин за оценка н а
възпроизводимостта на р е з у л т а т и т е ,
к о й т о се основава н а ч и с т о с т а т и с т и ­
чески критерии. Г р а н и ц и т е за приемли­
в о с т се о п р е д е л я т о т с р е д н а т а с т о й ­
н о с т или м е д и а н а т а н а всички у ч а с т н и ­
ци минус, респективно плюс две с т а н д а р ­
т н и отклонения (x±2SD). При т о з и начин
н а оценка около 4% о т р е з у л т а т и т е са
извън г р а н и ц и т е н а приемливост поради
с т а т и с т и ч е с к и причини. Н а п р а в е н о т о
заключение може да варира при различни­
т е проверки или при използване н а раз­
лични контролни материали. Направена­
т а оценка дава п р е д с т а в а за д е й с т в и т е л ­
н о т о к а ч е с т в о н а д е й н о с т т а на лабора­
торията.
> И з п о л з в а н е р е з у л т а т и т е н а подб­
р а н и у ч а с т н и ц и показали добро ка­
ч е с т в о . Това е по-строг начин н а оцен­
ка. В т о з и случай г р а н и ц и т е на приемли­
в о с т се о п р е д е л я т к а т о се и з п о л з в а т
напр. 20% о т р е з у л т а т и т е , к о и т о са най-
близки до р е ф е р е н т н а т а с т о й н о с т . Този
начин н а оценка с т и м у л и р а лаборатори­
и т е да п о д о б р я в а т к а ч е с т в о т о на дей­
н о с т т а си. Подобно на предишния начин
се основава н а с т а т и с т и ч е с к и к р и т е р и и
и не е свързан с медицинските или науч­
ни изисквания към р е з у л т а т и т е .
> Използване н а постоянно стандар­
т н о о т к л о н е н и е (SD). При т о з и начин
 н а оценка г р а н и ц и т е н а приемлибост се
о п р е д е л я т о т с т а н д а р т н о отклонение
(SD), изчислено о т д е с е т последователни
р е з у л т а т а . Той е свързан с определен ме­
т о д или а п а р а т и е приложим само з а по­
к а з а т е л и , к о и т о и м а т малка вариабил-
н о с т в изследвания човешки м а т е р и а л .
> Използване н а п р е д в а р и т е л н о опре­
д е л е н к о е ф и ц и е н т н а в а р и а ц и л (CV).
В т о з и случай г р а н и ц и т е н а приемливост
се о п р е д е л я т о т предварително възпри­
е т въз основа н а различни съображения
коефицент н а вариация. Н е д о с т а т ъ к н а
т о з и м е т о д е, че един и същ к а ч е с т в е н
к р и т е р и й се използва за ц я л а т а клинич­
но значима о б л а с т н а определяне.
>• И з п о л з в а н е н а к р и т е р и и с в ъ р з а н и с
б и о л о г и ч н а т а в а р и а ц и л и л и лгеди-
цинската значилюст н а изследва­
н и я п о к а з а т е л . При т о з и начин н а
оценка към ч и с т о с т а т и с т и ч е с к и т е кри­
т е р и и се п р и б а в я т и т а к и в а , свързани с
биологичната вариация или медицинска­
т а значимост на показателя. В дейст­
в и т е л н о с т г р а н и ц и т е на приемливост
т р я б в а да о т г о в а р я т н а медицинските
нужди. Този начин, м а к а р че е най-издър-
Жан от теоретична и практическа глед­
на точка, е свързан с редица проблеми.
При редица п о к а з а т е л и г р а н и ц и т е н а
приемливост, основаващи се н а медицин­
с к а т а з н а ч и м о с т , с а различни за различ­
н и т е концентраци он н и области. Освен
т о в а при здрави индивиди съществува оп­
ределена и н т р а - и интериндивидуална ва­
риация. Тази вариация може да се о т р а з и
н а м е д и ц и н с к а т а оценка и следователно
т р я б в а да се познава. Поради т о в а ана­
л и т и ч н а т а възпроизводимост н а даден
показател т р я б в а да бъде по-малка о т не­
г о в а т а биологична вариация. З а редица
показатели и н т р а - и интериндивидуал-
н а т а вариация е надеждно определена.
Границите н а приемливост м о г а т да се
о т н е с а т към р е ф е р е н т н и т е с т о й н о с т и
на показателя, определени въз основа н а
биологичната му вариация у здрави ин­
дивиди. Във връзка с т о в а е предложено
г р а н и ц а т а н а приемливост, изразена ка­
т о коефициент н а вариация да се изчис­
лява по с л е д н а т а формула:
^ % референтен интервал х 100
среда иа референтиня нитервал
Това изчисление се прави к а т о се използ­
в а т р е ф е р е н т н и т е интервали, к о и т о са оп­
ределени за много показатели. Трябва да се
има предвид, че т е з и референтни и н т е р в а ­
ли са различни за различни групи о т населе­
н и е т о и з а в и с я т о т броя н а индивидите, из­
ползвани при определянето им.
БЪЛГАРСКА НАЦИОНАЛНА СИСТЕМА
ЗА ИОК В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ
Б ъ л г а р с к а т а национална с и с т е м а за ВОК е
създадена през 1994 г. по инициатива на Бъл­
г а р с к о т о научно дружество по клинична ла­
боратория, Е к с п е р т н и я т с ъ в е т по клинич­
на лаборатория към МЗ и К а т е д р а т а по кли­
нична лаборатория и клинична имунология
на Софийския медицински университет. О т ­
т о г а в а редовно функционира с и с т е м а за
ВОК на клинично-химичните лабораторни
показатели, в к о я т о у ч а с т в а т повече о т
80 лаборатории у нас. Направени са пилот­
ни проучвания и предстои въвеждането н а
отделни с и с т е м и на ВОК за хематологич-
ни показатели, хормони и др.
К о н т р о л н и м а т е р и а л и . За контрола на
клинично-химичните показатели се използ­
в а т лиофилизирани човешки серуми, к о и т о
се изследват всеки месец о т у ч а с т в а щ и т е
лаборатории за следните 20 показателя: общ
белтък, албумин, креатинин, урея, пикоч­
на киселина, глюкоза, общ билирубин, кал­
ций, фосфор, калий, натрий, желязо, холес-
терол, триглицериди, АСАТ, АААТ, КК, АФ,
Г/Т.
При подбора на контролния м а т е р и а л се
спазва принципа т о й максимално да се доб­
лижава до р е а л н и т е проби, к о и т о се изслед­
в а т в е ж е д н е в н а т а п р а к т и к а . Изпращане­
т о на к о н т р о л н и т е материали с т а в а по по­
щ а т а или чрез куриер, а получаването на ре­
з у л т а т и т е о т т я х н о т о изследване се из­
вършва по п о щ а т а или чрез факс. Всяка ла­
б о р а т о р и я получава заедно с контролния
м а т е р и а л книжка с инструкции за кодира­
не на използваните м е т о д и , калибратори,
контролни м а т е р и а л и и а п а р а т у р а , график
99
за извършване на изследването и изпраща­
не на р е з у л т а т и т е , начина за подготовка
н а контролния серум з а изследване, к а к т о и
начина н а оиенка н а получените р е з у л т а т и .
За оиенка на д е й н о с т т а на о т д е л н и т е ла­
боратории се използва съгласуваната сред­
на стойност (consensus mean) и стандарт­
ното отклонение на лабораториите изпол­
зващи един и същ метод, к о и т о се изчисля­
в а т след о т с т р а н я в а н е н а рязко о т к л о н я ­
в а щ и т е се с т о й н о с т и . З а и е л т а е разрабо­
т е н а спеииална к о м п ю т ъ р н а програма. Из­
ползва се също с т а н д а р т н и я индекс н а о т ­
клонение (SDI), изчислен по ф о р м у л а т а :
(х, - х )
Sl)l =
SI)
Xj - индивидуалния р е з у л т а т
х - съгласуваната средна стойност
(consensus mean)
SDI > о т 2,0 се приема з а незадоволите­
лен. На фиг. 4.22 е показан формуляра с оиен­
ка, к о й т о се изпраща н а у ч а с т в а щ и т е ла­
боратории. В левия горен ъгъл е о т б е л я з а н
кода на у ч а с т в а щ а т а лаборатория. Той е из­
в е с т е н само н а о р г а н и з а т о р и т е и на инди­
в и д у а л н а т а л а б о р а т о р и я . Тайната на ре­
з у л т а т и т е е основен принцип на система­
та. Н а р ъ к о в о д н и т е а д м и н и с т р а т и в н и и
п р а в и т е л с т в е н и органи се предоставя са­
мо обобщена информация за к а ч е с т в о т о на
изследваните показатели, използвана апара­
т у р а и пр. Досега у ч а с т и е т о е доброволно и
незадоволителните р е з у л т а т и не се санк­
ц и о н и р а т . Основна задача н а с и с т е м а т а е
преди всичко помощ и обучение н а колеги­
т е . В бъдеще обаче, у ч а с т и е т о в национал­
н а т а с и с т е м а за ВОК следва да с т а н е за­
дължително във връзка с въвеждането на ак-
редитация н а клиничните лаборатории, а
също и н а здравна осигурителна система.
Съобщението, изпращано н а лаборатори­
и т е (вж. фиг. 4.22), съдържа още р е з у л т а т а ,
получен о т индивидуалната лаборатория и
данни о т с т а т и с т и ч е с к а т а о б р а б о т к а ,
п р е д с т а в е н и в т а б л и ц а : брой у ч а с т н и ц и ;
средна с т о й н о с т ; с т а н д а р т н о отклонение
и коефициент н а корелация н а всички учас­
т н и ц и , к а к т о и н а т е з и , използващи един и
същ м е т о д .
Основен проблем по принцип са к р и т е р и ­
и т е за оценка н а р е з у л т а т и т е н а отделна­
т а лаборатория. Засега н я м а с т а н д а р т и ­
зация в международен план. Ние с ч и т а м е ,
че р е з у л т а т и т е н а л а б о р а т о р и я т а са при­
емливи, к о г а т о п о п а д а т в и н т е р в а л а сред­
н а с т о й н о с т ± 2SD. Този начин н а оценка
има н е д о с т а т ъ к а , че при голям б и а с на да­
дена л а б о р а т о р и я и н т е р в а л ъ т за приемли-

БЪЛГАРСКА ИСВОК- КЛИНИЧНА ЛАБОРАТОРИЯ

BULGARIAN EQAS - CLINICAL LABORATORY

9/1999 проба № 3 Лаборатороя ОП

бр. лаб. КРЕАТИНИН цто1Л бр. лаб. УРЕЯ mmol/1
3(Н Всички 4(h Всички

^ Вашият метод - 3 Вашият метод - 2

30-
20-

20-

И)-
lO

27 96 165 234 3.00 6.00 9.00 12.00

1 5.% 1 1 Вашият резултат
Вашият метод
п(6р. рет.) 39
х ОСЗУЛ. D
J' SDI
3 127 125 -1.7 -0.07 n(fip pel.) 51 .1 5.94 5.90 -0.7 -0.04
* ( С Р . СТ.) 120 * (ср. C T . ) 5.95
SD(CT. ОТКЛ.)
CV* 255,
3 1 S)I 06.7
cv%
(СТ. ОТКЛ.)

\\2
Обща гр^па ОГнца група
ii(6p. p e r ) 78 п (бр. рет.) 69
х (ср ст.) 127 х (ср ст.) 5.94
S D (ст. откл.) 3.3
cv% 261. SI) (ст. откл.)
CV%
0.98
16.5

Фиг. 4.22. Оценка на резултатите, които се изпращат на всяка лаборатория, участваща в нацио­
налната система за ВОК
100
ßocm н а р е з у л т а т и т е с т а в а т в ъ р д е широк.
По-добър начин е използване н а с р е д е н в а ­
риационен коефициент о т определен
б р о й л а б о р а т о р и и , показали най-добри ре­
з у л т а т и през последните няколко години.
Най-добрият начин е да се използват кри­
т е р и и , основаващи се н а к л и н и ч н а т а з н а -
ч и л ю с т н а п о к а з а т е л я . . Последните два
начина з а оиенка ще се и з п о л з в а т в бъдеща­
т а дейност на с и с т е м а т а .
Съобщението з а л а б о р а т о р и и т е съдържа
още и х и с т о г р а м а , показваща положението
н а индивидуалната л а б о р а т о р и я .
Всяка лаборатория получава с е р т и ф и к а т
за у ч а с т и е т о си в Н а ц и о н а л н а т а с и с т е м а
з а ВОК с п о л у ч е н а т а оценка.
ДРУГИ ОБЛАСТИ ЗА КОНТРОЛ
И ОЦЕНКА НА КАЧЕСТВОТО
НА РЕЗУЛТАТИТЕ
Т. Ц в е т к о в а
К о н т р о л ъ т върху к а ч е с т в о т о на лаборатор­
н и т е р е з у л т а т и , освен п р о г р а м а т а за в ъ т -
релабораторен к о н т р о л и външна оценка,
включва и к о н т р о л върху п р е д а н а л и т и ч -
ните, а 1 ш л и т и ч н и т е и следа/ш^ттич-
н и п р о ц е с и . По т р а д и ц и я само аналитична­
т а фаза е основно „в р ъ ц е т е на лабораторни­
т е специалисти". Съвременният напредък в
клинично-лабораторната п р а к т и к а , к о й т о
включва увеличен брой видове анализи, пови­
ш е н а т а им сложност, к а к т о и т е х н и я е ф е к т
върху диагностично-лечебната р а б о т а , изис­
к в а т о ц е н к а т а на к а ч е с т в о т о на лаборатор­
н и т е р е з у л т а т и да се разпростира и извън
л а б о р а т о р и я т а . З а да б ъ д а т успешни преда-
н а л и т и ч н а т а и с л е д а н а л и т и ч н а т а фази на
качествения контрол, освен л а б о р а т о р н и т е
специалисти, т р я б в а да се включат още и кли­
ничните, и поликлиничните звена.
ОЦЕНКА НЛ КАЧЕСТВОТО
ИЛ ЛАБОРАТОРНИТЕ РЕЗУЛТАТИ
В НРЕДАНАЛИТИЧНАТА ФАЗА
Гази фаза следва да осигурява к а ч е с т в о т о
на всички процедури, к о и т о п р е д ш е с т в а т
а н а л и т и ч н и я процес к а к т о извън, т а к а и в
лабораторията. Преданалитичният е т а п
изисква много повече време о т к о л к о т о ана­
л и т и ч н а т а фаза. Приема се, че о т времето
з а цялостния процес н а клинично-лабора-
торното изследване п р е д а н а л и т и ч н а т а
ф а з а (предлабораторно и вътрелабо-
р а т о р н о п р е д а н а л и т и ч н о в р е л г е ) със­
та в л яв а 57.45%. От т я х 20.25% е времето
за преданалитични процеси извън лаборато­
рията, а 37.20% - вътрелабораторното вре­
м е за всички процедури по отношение на про­
бата преди анализа.
П р о г р а м а т а за ефективен преданалити-
чен к о н т р о л н а к а ч е с т в о т о включва с т р о ­
го съблюдаване на:
1. К о р е к т н о н а з н а ч а в а н е н а к л и н и ч -
н о - л а б о р а т о р н и т е т е с т о в е . Това озна­
чава, че с п е ц и а л и с т и т е о т клиничната ла­
б о р а т о р и я т р я б в а да с ъ д е й с т в а т на леку­
ващия лекар при избора н а подходящи т е с ­
т о в е за н у ж д и т е н а д и а г н о с т и к а т а и за мо-
н и т о р и р а н е на лечението. Л е к а р я т о т своя
с т р а н а т р я б в а да получи най-добрия с ъ в е т
о т л а б о р а т о р н и т е специалисти. Това тяс­
но сътрудничество е изключително важно,
когато к л и н и ч н а т а лаборатория възнаме­
рява да внедри нов тест, и л и се сменят ре-
ферентни интервали поради смяна на ме­
тод.
2. П о д г о т о в к а н а п а ц и е н т а : п а ц и е н ­
т ъ т т р я б в а д а бъде д о с т а т ъ ч н о под­
р о б н о и н ф о р л ш р а н omwocno назначените
т е с т о в е , т а к а че т о й или т я да не се безс-
покои по отношение в з е м а н е т о на биологич­
ния м а т е р и а л ; да бъде информиран за цяла­
т а подготовка преди вземане на биологичен
м а т е р и а л - гладна пауза или ограничаване
на медикаменти.
3. К о р е к т н а и д е н т и ф и к а ц и я н а п а ­
ц и е н т а о т ф л е б о т о м и с т а . Сигурност, че
и д е н т и ф и к а ц и я т а на п а ц и е н т а върху блан­
к а т а т о ч н о о т г о в а р я на т а з и върху контей­
нера с биологичен м а т е р и а л .
4. Б и о л о г и ч н и я т м а т е р и а л д а б ъ д е
в з е т в п о д х о д я щ и с ъ д о в е (контейнери о т
з а т в о р е н а т а система), при с т р о г о опреде­
лени условия според вида н а назначения ана­
лиз.
5. Н а в р е м е н н о т р а н с п о р т и р а н е н а
п р о б и т е до л а б о р а т о р и я т а . Времето меж­
ду в з е м а н е т о н а биологичния м а т е р и а л и
д о с т а в я н е т о му в л а б о р а т о р и я т а т р я б в а
101
ga бъде 6 границите, определени о т лабора­ се следи колко т а к и в а случаи ше има. Ако ла­
т о р и я т а , според изискванията на анализа б о р а т о р и я т а разкрие след 15 дни, че докла­
за отделния показател. д ъ т на лаборанта не е изолиран инцидент
6. Подходящо п о в е д е н и е п о отноше­ и се установи, че е направен компромис с
н и е н а п р о б а т а б и о л о г и ч е н м а т е р и ­ к а ч е с т в о т о , незабавно се в з е м а т необходи­
а л о т донасянето ü в л а б о р а т о р и я т а до м и т е мерки за отсраняване на нарушение­
времето на анализа. То може да включва от­ т о . Корекцията изисква т я с н о сътрудни­
хвърляне на пробата к а т о неподходяща за чество между болничния персонал, отгово­
анализ, извършване на подготвителните рен за приема и обгрижването на пациен­
процедури преди анализа или съхранението т и т е и уверение, че урините ше се н о с я т в
й при подходящи условия. Всички проби л а б о р а т о р и я т а в къс срок след о т д е л я н е т о
т р я б в а да се с ч и т а т к а т о п о т е н ц и а л е н им о т п а ц и е н т и т е , за да бъде спазен с т а н ­
инфекциозен льатериал. дарта.
1. П р о ц е д у р и т е в л а б о р а т о р и я т а Може да се установи, к о г а т о т о з и проб­
т р я б в а да включват коректно документи­ лем се обсъжда със с е с т р и т е , че носенето
ране и идентификация на п р о б а т а в лабо­ на урините е неудобно за с а н и т а р и т е о т
р а т о р и я т а , к о р е к т н а т е х н и к а на центро­ д н е в н а т а смяна и пречи на другите дейнос­
фугиране, и ако е необходимо своевременно т и ( т о а л е т на болните, раздаване на закус­
сепариране на к л е т к и т е о т серума или плаз­ ка и т.н.). В т о з и случай може след обсъжда­
мата. не да се с ти г н е до ново решение, напр. ури­
О т д е л н и т е процедури о т т а з и програма н и т е да се н о с я т о т с а н и т а р и т е на ноищо
в преданалитичния е т а п не м о г а т да б ъ д а т дежурство, в края на с м я н а т а им (6:30-7:00
потвърдени или мониторирани с традици­ h). След к а т о се достигне до решение на т о ­
онните с т а т и с т и ч е с к и методи. Индикаци­ зи пропуск, следва ново наблюдение за около
я т а , че има пропуск в к а ч е с т в о т о обикно­ 15 дни спазва ли се с т а н д а р т а .
вено достига в л а б о р а т о р и я т а под форма­
т а на оплакване или сигнал за н е с ъ о т в е т с -
тващи резултати. ОЦЕНКА НА КАЧЕСТВОТО
Възможният показател (индикатор) за НА ЛАБОРАТОРНИТЕ РЕЗУЛТАТИ
нарушено качество се оценява чрез стандар­ В АНАЛИТИЧНАТА ФАЗА
т н а (формализирана) процедура, к о я т о ус­
т а н о в я в а определен пропуск, нарушаваш Аналитичната фаза включва п р о ц е с и т е в
правила, касаеши т о з и показател и механиз­ к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я , отнасящи се
ми за мониториране. Или, т а з и процедура до с ъ щ и н с к и я ансиьиз н а пробите. Вре­
включва н а л и ч и е н а и н д и к а т о р , к о й т о мето за тази дейност съставлява 25.20% от
с о ч и н а р у ш е н о к а ч е с т в о , п о с о ч в а н е времето за цялостния процес на изследване
к о и с т а н д а р т и с а н а р у ш е н и и опре­ на пациента.
деляне люханизлгите з а следене спаз­ Допълнително към програмата за в ъ т ­
ването н а тези стандарти. решна и външна оценка на к а ч е с т в о т о на
Този процес може да се представи със клиничнолабораторните р е з у л т а т и к о н т ­
следния пример: р о л ъ т в а н а л и т и ч н а т а фаза включва:
1. Подходящо е т и к е т и р а н е и изпол­
И н д и к а т о р з а пропуск: л а б о р а н т ъ т док­ з в а н е н а р е а к т и в и т е . Върху е т и к е т и т е
ладва, че урините о т клиниките/отделени­ т р я б в а да бъде обозначена концентрация­
я т а се н о с я т в л а б о р а т о р и я т а значително т а на разтвора, д а т а на производство или
по-късно (около 8:00-8:30 h) о т м о м е н т а на на приготвяне, д а т а на започване на полз­
"даването" на урина о т п а ц и е н т а (около в а н е т о му, крайна д а т а на годност.
6:00-6:30 h). 2. П е р и о д и ч н о к а л и б р и р а н е н а пипе-
С т а н д а р т : Изследването на у р и н а т а т и т е .
т р я б в а да се проведе до 1 h след отделяне­ 3. П р о ф и л а к т и ч н а п о д д р ъ ж к а н а
т о и, т . е . изисква се бързо изпрашдне на ури­ а п а р а т и т е според фирмените указания,
н а т а в лабораторията. 4. П е р и о д и ч н а п р о в е р к а н а т е л т е р а -
Мониториране: В продължение на 15 дни т у р и т е н а з а л г р а з и т е л и т е и л и тер-
102
м о с т ат и р ащ и т е у с т р о й с т в а .
5. П е р и о д и ч н а п р о в е р к а л а т о ч н о с т ­
т а н а всички а н а л и т и ч н и везни, тср-
люметри и фотолютри.
6. П е р и о д и ч н а в е р и ф и к а ц и я н а т о ч ­
ността н а скоростта н а центрофу­
гите и н а техните таймери.
7. П е р и о д и ч н и п р о в е р к и з а с ъ в р е л ю н -
ността н а лгануалните методи.
8. П о с т о я н н а о ц е н к а , ч е п р о ц е д у р и ­
т е осигуряващи безопасна работа
стриктно се спазват.
Тези процеси обикновено се п р о с л е д я в а т
посредством функционални к а р т и или пери­
одично нанасяне в дневници н а данни за про­
ф и л а к т и ч н и т е и к о н т р о л и р а щ и процедури,
и че т е с ъ о т в е т с т в а т н а определени с т а н ­
д а р т и . Тези писмени уверения м о г а т да бъ­
д а т и под ф о р м а т а н а листовки, к о и т о ла­
б о р а т о р н и т е специалисти п о п ъ л в а т при из­
пълнение на о т д е л н и т е процедури. Тези кар­
т и се у т в ъ р ж д а в а т периодично о т ръково­
д и т е л я н а л а б о р а т о р и я т а з а т я х н а т а пъл­
н о т а и съобразност.
ОЦЕНКА НА КАЧЕСТВОТО
НА РЕЗУЛТАТИТЕ
В САЕДАНАЛИТИЧНАТА ФАЗА
Следаналитичната фаза включва всички
процеси, свързани с обработване на резулта­
тите (проверка, нанасяне/залепване върху
фишовете, архивиране и т.н.) и изпращане­
то им до лекуващия лекар (или пациента).
Счита се, че времето за тази фаза състав­
лява 17.35% от общото време за изследване
на пациента. От него - 13.65% е с л с д а н а -
литичното в р е м е в к л и н и ч н а т а лабо­
р а т о р и я и 3.70% - за изпращане на резул­
татите.
Следаналитичният контрол на качест­
в о т о е процес н а верифициране н а к а ч е с т ­
в о т о във всички процедури, к о и т о съпровож­
д а т крайния р е з у л т а т , напускащ лаборато­
р и я т а и попадащ в р ъ ц е т е на лекуващия ле­
кар. Освен използването н а к о р е к т е н р е -
ф е р е н т е н и н т е р в а л , о б л а с т т а н а следа-
налитичния к о н т р о л включва;
1. В е р и ф и ц и р а н е н а и з ч и с л е н и я т а в
крайния резултат.
2. П р о в е р к а н а р е з у л т а т и т е з а въз-
м о Ж н и г р е ш к и п р и н а н а с я н е т о илг
върху бланките.
3. Л е с н и з а ч е т е н е и и н т е р п р е т а ц и я
резултати върху бланките.
4. П р о ц е д у р и з а и н ф о р л г и р а н е н а л е ­
куващия лекар з а рязко отклоняващи
с е р е з у л т а т и , които изискват неза­
бавно внилгание и действие.
5. П а в р е л г е н н о и б е з г р е ш к и н а н а с я ­
н е н а п о л у ч е н и т е с т о й н о с т и в исто­
р и я н а з а б о л я в а н е т о u^iu к а р т о н а н а
п а ц и е н т а . Утвърждаване н а п р а к т и к а т а
за с ъ х р а н е н и е н а о р и г и н а л н и т е б л а н ­
к и с р е з у л т а т и т е о т лабораторията.
6. П о т в ъ р Ж д е н и е з а п р а в и л н а т а и н ­
т е р п р е т а ц и я н а л а б о р а т о р н и т е тес­
т о в е о т л е к у в а щ и я л е к а р (познаване на
л е к а р с т в е н а или друга интерференция).
7. П о с т о я н н о в з а и л ю д е й с т в и е лгеЖ-
д у лабораторните специалисти и ле­
к у в а щ и т е л е к а р и , з а да се осигури необ­
ходимото качество в непосредствените
грижи за п а ц и е н т а , к а т о р е з у л т а т на ла­
б о р а т о р н и т е данни. Това т я с н о сътрудни­
ч е с т в о може да има различни форми: съвмес­
тни колегиуми, участие на лабораторни­
те специалисти във визитации, срещи сле­
карите на клиниките/отделенията по вре­
м е на сутрешните рапорти, системни сре­
щи на старшите лаборанти със старшите
сестри, тесни контакти на приемното от­
деление със манипулационните сестри за
навременно отстраняване на евентуални
пропуски.
М о п и т о р и р а н е т о н а т о з и раздел н а
к а ч е с т в о т о има д в е форл1и\
• Е д н а т а е п р о ц е с ъ т описан в преданали-
т и ч н а т а фаза, т . е . в ъ з м о ж н и я т пропуск
може да бъде идентифициран чрез п о с т ъ ­
пило оплакване о т лекуващия лекар. Тези
оплаквания се о т н а с я т най-често до не­
к о р е к т н и лабораторни данни или голям
п р о м е ж д у т ъ к о т време между поръчка и
получен р е з у л т а т и се т р е т и р а т съглас­
но примера по-горе.
• Д р у г и я т вид е, чрез т е к у щ а оценка н а
у ч а с т и е т о и влиянието на лабораторни­
т е процедури и р е з у л т а т и върху цялост­
н а т а р а б о т а на звеното, ч и и т о болни об­
служва. Ц е л т а н а т е з и оценки е повиша­
ване к а ч е с т в о т о н а здравеопазването,
чрез подходящи препоръки и мерки.
Пр о г р ами те за к о н тр о л и оценка на ка-
103
честбошо н а р е з у л т а т и т е обикновено се ре­ ОЦЕНКА НА КОЛИЧЕСТВЕНИТЕ
а л и з и р а т о т комисии (към Е к с п е р т е н съ­
АНАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
в е т ) , к а т о ц е л т а е н е m e cja р е ш а В а т
п р о б л е м и т е , а д а п р е у о т В р а т я В а т по-
Л. ЛамбреВа
я б а т а и м . О т друга с т р а н а , лаборатори­
я т а т р я б в а да има собствена форма за оиен-
к а н а к а ч е с т в о т о . Включва се и оценка н а
Оценката на количествените методи
л а б о р а т о р н а т а е ф е к т и в н о с т , предвид ква­
включва две основни х а р а к т е р и с т и к и ; т я х ­
л и ф и к а ц и я т а н а персонала и п о о щ р я в а н е т о
н а т а аналитична надеждност и практич-
му з а п о в и ш а в а н е т о й. О ц е н к а т а н а ка-
ност.
честВото на цялостната работа В
р а м к и т е н а л а б о р а т о р и я т а е отгоВор-
н о с т н а Всеки член н а персонала и
АНАЛИТИЧНА НАДЕЖДНОСТ
т р я б В а д а с т а н е начин н а поВедение
н а Всяко е д н о ниВо В р а м к и т е н а лабо­
А н а л и т и ч н а т а н а д е ж д н о с т {analytical reli­
р а т о р и я т а . Такъв т и п оценка следва да
ability) п р е д с т а в л я в а съвкупност о т харак­
се разшири и извън л а б о р а т о р и я т а и д а
т е р и с т и к и н а п р о ц е д у р а т а за изследване,
ВключВа о т г о в о р н о с т т а н а л е к а р я ,
к о я т о определя а н а л и т и ч н а т а и пригод­
к о й т о н а з н а ч а В а изследВане, к а к т о и
н о с т за т о ч н о определени цели. Всяка о т о т ­
д а бъде о б е к т н а Внимание и о т паци­
делните аналитични характеристики
е н т а , к о й т о получаВа л е ч е н и е В резул­
т р я б в а да може да бъде определена експе­
т а т н а т е з и данни.
риментално, О ц е н к а т а на а н а л и т и ч н а т а

Табл ица 4.8. Изисквания към описанието на аналитичната процедура

Изискване Описание
Наименование Най-напред се пише о б щ о п р и е т о т о наименование, а след т о в а - а л т е р н а т и в н о т о .
Посочва се о б щ о п р и е т о т о съкращение.
Клинично П р е д с т а в я се н а к р а т к о з н а ч е н и е т о н а п о к а з а т е л я в к л и н и ч н а т а медицина. За
значение специфичните заболявания допълнително се п р е п о р ъ ч в а т граници, освен р е ф е р е н т н и т е ,
з а вземане н а медицинско решение - диагностично или т е р а п е в т и ч н о .
Аналитичен П р е д с т а в я се н а к р а т к о а н а л и т и ч н и я принцип, н а к о й т о е основан м е т о д а . Посочва се
принцип н а л и т е р а т у р н и я източник.
метода
Проба з а Описва се вида н а биологичния м а т е р и а л з а изследване, препоръчания, к а к т о и
изследване минималния обем, необходим за извършване н а изследването. Посочват се у с л о в и я т а ,
к о и т о п р а в я т п р о б а т а неприемлива за изследване; хемолиза, липемия и др. Посочват се
и з и с к в а н и я т а за подготовка н а п а ц и е н т а за изследване, к а к т о и за п о д г о т о в к а т а н а
п р о б а т а за анализ.
Реактиви О п и с в а т се необходимите р е а к т и в и по реда н а п о л з в а н е т о им, включително
к а л и б р а т о р и и контроли. Подробно се описва начина н а п р и г о т в я н е и с ъ х р а н е н и е т о им
вкл. п р о в е р к а т а за г о д н о с т преди у п о т р е б а .
Апаратура Посочва се необходимото оборудване - основна и с п о м а г а т е л н а а п а р а т у р а , к а к т о и
начина н а р а б о т а .
Аналитична Описва се подробно, последователно е т а п след е т а п включително процедурите н а
процедура калибрация и ВАКК. А н а л и т и ч н а т а процедура т р я б в а д а е описана т о л к о в а подробно, че
и зс л ед в ан ет о д а може д а се извърши о т лице, н е з а п о з н а т о с м е т о д а . Да се в к л ю ч а т
необходимите изчисления.
Референтни Посочват се р е ф е р е н т н и т е и н т е р в а л и з а здрави лица. Посочва се в л и я н и е т о н а пола,
интервали в ъ з р а с т т а и др. Посочва се б р о я т н а изследваните здрави лица и л и т е р а т у р н а справка
з а оригиналния и з т о ч н и к .
Коментар Включва всички а н а л и т и ч н и ф а к т о р и , к о и т о в л и я я т н а м е т о д а , напр. pH,
т е м п е р а т у р а , к а к т о и е ф е к т и н а ч е с т о използвани л е к а р с т в е н и с р е д с т в а ; рискове при
извършване н а п р о ц е д у р а т а з а изследване, к а к т о и специални изисквания за
безопасност.
Литературна Посочват се п ъ р в и т е л и т е р а т у р н и източници, описващи м е т о д а или референции, върху
справка к о и т о м е т о д ъ т е бил р а з р а б о т е н .
104
н а д е ж д н о с т не е и д е н т и ч н а с к а ч е с т в о т о
н а изпълнение н а а н а л и т и ч н и я м е т о д . С нея
се цели определяне размера н а п р и с ъ щ а т а
н а м е т о д а а н а л и т и ч н а грешка, к о я т о е не­
разделна ч а с т о т о т д е л н и я лабораторен ре­
з у л т а т . А н а л и т и ч н а т а н а д е ж д н о с т се ха­
р а к т е р и з и р а чрез с л е д н и т е к а ч е с т в а н а ме­
т о д а : линейност, възпроизводимост, досто­
верност, специфичност, чувствителност,
стабилност.
Задължителни предпоставки за получава­
не н а валидни р е з у л т а т и са:
• Основно познаване н а м е т о д а в д е т а й л и ,
к а к т о и н а с п е ц и а л н а т а а п а р а т у р а , за ко­
е т о е необходима т о ч н а информация съг­
ласно и з и с к в а н и я т а з а х а р а к т е р и с т и к а
на к о л и ч е с т в е н и т е а н а л и т и ч н и м е т о д и и
п р о ц е д у р а т а з а изследване ( т а б л . 4.8);
• С т а б и л н о с т н а р е а к т и в и т е , калибрато-
р и т е и контролните материали, к о я т о
т р я б в а да бъде д о к у м е н т и р а н а .
Линейност
П ъ р в о т о изискване к ъ м а н а л и т и ч н и я ме­
т о д , к о е т о т р я б в а да бъде верифицирано в
л а б о р а т о р и я т а е л и н е й н о с т т а (linearity).
Тя н и к о г а н с с е п р и е м а a p r i o r i . Провер­
к а т а н а д е к л а р и р а н а т а линейност е всъщ­
н о с т предварителна проверка н а т о ч н о с т ­
т а и д о с т о в е р н о с т т а на новия м е т о д . За
подробности вж. правила з а п о с т р о я в а н е на
калибрационна крива. Независимо о т вида
н а използвания м а т е р и а л з а калибрация при
п р о в е р к а т а н а л и н е й н о с т т а са о т значение
още следните ф а к т о р и :
- да се провери л и н е й н о с т т а в к о н ц е н т р а ­
ционна о б л а с т , при к о я т о се в з е м а т важ­
ни медицински решения,
- да се п р о в е р я т г о р н а т а и д о л н а т а грани­
ца на л и н е й н о с т т а , посочени о т произво­
дителя (автора).
П р о у ч Н а н и н т а з а о ц е н к а Възпрочз-
HocjUMoemma u с ^ о е т о Н е р н о с т т а с е нз-
Въ р ш Ват с а м о 6 л и н е й н и я д и а п а з о н н а
Mcmocja.
ИъзпроизНодимост
За определяне на в ъ з п р о и з в о д и м о с т т а
(precision) се изследва о б р а т н а т а количест­
вена х а р а к т е р и к а - невъзпроизводимостта,
к а т о се и з п о л з в а т подходящи контролни
м а т е р и а л и и серуми н а болни.
Невъзпроизводилюст в непрекъсната
с е р и я {within-run, intraassay), при условия
н а п о в т о р я е м о с т {repeatability). Използват
се т р и еквидистантни концентрационни
зони, к о и т о р а з д е л я т линейния диапазон. За
всяка о т т я х се изследва серия о т минимум
10 проби. Р е з у л т а т и т е се о б р а б о т в а т с т а ­
т и с т и ч е с к и за средна а р и т м е т и ч н а с т о й ­
н о с т и с т а н д а р т н о отклонение, т ъ й к а т о
се изхожда о т допускането, че р е з у л т а т и ­
т е и м а т Гаусово разпределение. Изчислени­
т е SD, респ. CVса валидни само за съответ­
н и т е средни а р и т м е т и ч н и с т о й н о с т и .
Пай-често с т а н д а р т н о т о отклонение се из­
разява к а т о процентно отношение към съ­
о т в е т н а т а средна с т о й н о с т {coefficient of
variation, CV).
НеИъзпроизИоуилюст в п р е к ъ с н а т а се-
р и я . Определят се една или повече контрол­
ни проби о т един и същ серум, к о и т о се пос­
т а в я т на произволни м е с т а в аналитична­
т а серия о т проби на болни и се изследват
заедно с т я х . Ако се п о с т а в я т 10 контрол­
ни проби, т е м о г а т да б ъ д а т обработени
с т а т и с т и ч е с к и по същия начин. В т о з и слу­
чай се оценява и влиянието на о с т а н а л и т е
проби при изследването {carry-over - е ф е к т
на пренасяне н а биологичен м а т е р и а л о т
проба с по-висока концентрация върху про­
ба с по-ниска), к о е т о ще се изрази с по-голя-
мо с т а н д а р т н о отклонение.
Средна невъзпроизводилюст с проби н а
п а ц и е н т и . Изследват се пробите на паци­
е н т и т е и т о в о б р а т е н ред, в к о й т о вече са
били изследвани за деня - последният серум
се изследва първи, а п ъ р в и я т - последен. Из­
числява се р а з л и к а т а между всеки ч и ф т про­
би, к а т о се спазва алгебричния знак. Полу­
ч е н и т е разлики се о б р а б о т в а т с т а т и с т и ­
чески ( т е с т на з н а ц и т е ) и се определя дали
разликите се различават достоверно о т ну­
ла. По т о з и начин също се разкрива и с а г г у -
o v e r - е ф е к т а , т . е . е ф е к т а на пренасяне о т
проба с по-висока концентрация на изслед­
в а н а т а с ъ с т а в к а върху т а к а в а с по-ниска.
НеИъзпроизводилtост в ъ в в р е м е ( d a y -to-
d a y , i n t e r a s s a y i m p r e c i s i o n ) . Изследва се
един и същ контролен м а т е р и а л в продъл-
105
жение на 60 последователни дни. Изследва­
н е т о се извършва с едни и същи р е а к т и в и и
а п а р а т и о т един и същ или различни анали­
т и ц и при възможно малка промяна на всич­
к и останали условия. Изследването се извър­
шва в т р и к о н ц е н т р а ц и о н н и зони на област­
т а на измерване. Р е з у л т а т и т е се о б р а б о т ­
в а т с т а т и с т и ч е с к и . Р а з л и к и т е между о т ­
д е л н и т е SD се о ц е н я в а т за з н а ч и м о с т н а
р а з л и к а т а с п о м о щ т а на с т а т и с т и ч е с к и
к р и т е р и й за сравняване на дисперсии - F-test.
М е Л ду л а б о р а т о р н а нсвъзпроизводи-
л ю с т ( i n t e r l a b o r a t o r y imprecision). Срай-
н я в а т се р е з у л т а т и т е , получени о т изслед­
ване на един и същ к о н т р о л е н м а т е р и а л в
различни лаборатории, при използване н а
един и същ а н а л и т и ч е н п р и н ц и п и по-въз-
м о ж н о с т на един и същ а н а л и т и ч е н м е т о д
(вж. Външна оценка на к а ч е с т в о т о ) .
ДостоВериост
Валидирането на р у т и н н и т е м е т о д и по о т ­
ношение на т я х н а т а д о с т о в е р н о с т
(trueness) се извършва с п о м о щ т а на рефе-
р е н т н и м а т е р и а л и и референтни м е т о д и
к о и т о и м а т условна истинска стойност в
смисъла н а т ъ й нар. златен стандарт.
С ъ щ е с т в у в а т следните в ъ з м о ж н о с т и за
оценка д о с т о в е р н о с т т а на р е з у л т а т и т е :
• Изследване на к о н т р о л е н м а т е р и а л със
с т о й н о с т , получена с референтен м е т о д .
Изследват се 20 проби о т к о н т р о л н и я ма­
т е р и а л с м е т о д а , подлежащ на оценка, п р и
условия на п о в т о р я е м о с т . Изчислява се
средна а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т и SD, ко­
и т о се о ц е н я в а т с п о м о щ т а на ч и ф т н и я
t-mecm по с л е д н а т а формула:
_ ( х - Хо ) л / п
SI)
V с т о й н о с т т а , получена с референтен метод
п - брой изследвания
При п = 20, d f = 19 и уровен на з н а ч и м о с т
р > 0.05, t т р я б в а да е < 2.09, за да се вземе
решение, че с р е д н и т е с т о й н о с т и на д в а т а
м е т о д а не се различават достоверно, т . е .
че п р о у ч в а н и я т лгетод е т о ч е н .
• Успоредни изследвания на едни и същи про­
би на болни с м е т о д а , подлежащ на оцен-
106
к а и референтен м е т о д . Ако при оценка­
т а на с р е д н а т а а р и т м е т и ч н а и SD н а
проучвания м е т о д се у с т а н о в и , че т е са
различни със с т а т и с т и ч е с к а достовер­
н о с т о т референтния м е т о д , т о в а не е
д о с т а т ъ ч н о основание да се приеме или
о т х в ъ р л и новия м е т о д . Полезно е за взе­
мане на о к о н ч а т е л н о т о решение да се про­
учи к а к корелират о т д е л н и т е р е з у л т а т и ,
получени при изследване на проби о т па­
ц и е н т и . За т а з и цел се използват различ­
ни регресионни м е т о д и .
С п о м о щ т а на т о з и е к с п е р и м е н т се оп­
ределя с и с т е м н а т а грешка на кандидат-ме-
т о д а , подлежащ на оценка. Важно изисква­
не е р е ф е р е н т н и я т м е т о д да е с докумен­
т и р а н а м н о г о добра възпроизводимост и
д о с т о в е р н о с т . При липса на д о с т ъ п е н ре­
ферентен м е т о д , се допуска сравнение със
надежден р у т и н е н м е т о д о т клас А (с из­
в е с т е н размер на с л у ч а й н а т а и с и с т е м н а
грешка).
Подготовка на експеримента:
> необходимо е да б ъ д а т изследвани най-
малко 100 проби на болни - около 50 в гра­
н и ц и т е на р е ф е р е н т н а т а о б л а с т и по 25
- в п а т о л о г и ч н и т е ниски и високи облас­
т и ( м и н и м а л н и я т брой проби за извърш­
ване на т о з и анализ е 40), к о и т о да бъ­
д а т подбрани с к о н ц е н т р а ц и и в целия ди­
апазон на измерване. При неспазване н а
т е з и условия, р е г р е с и о н н и я т анализ ще
даде н е т о ч н и данни;
>• желателно е х е м о л и т и ч н и т е , липемични-
т е и и к т е р и ч н и серуми да не б ъ д а т изс­
ледвани заедно с о с т а н а л и т е серуми; ако
б ъ д а т изследвани, т р я б в а да б ъ д а т иден­
т и ф и ц и р а н и и к о м е н т и р а н и отделно;
>• о т всеки серум се изследват проби и с два­
т а метода;
>• п р о б и т е с по-големи о т 3.5SD vx разлики
м е ж д у д в а т а м е т о д а се реанализират.
Ако р а з л и к а т а се п о т в ъ р д и , може да се
предположи евентуална интерференция.
Незабавното допълнително изследване н а
с ъ м н и т е л н и т е проби е съществено, за­
щ о т о може да доведе до погрешни изводи
за м е т о д а - к а н д и д а т .
> желателно е д в а т а м е т о д а да се р а б о т я т
едновременно или в един ден; ако т о в а е
 невъзможно, п р о б и т е т р я б в а д а б ъ д а т
съхранени при условия, г а р а н т и р а щ и
т я х н а т а стабилност.
> д в а т а м е т о д а т р я б в а д а б ъ д а т поддър­
ж а н и в с т а б и л н и к о н т р о л н и граниии през
периода н а и з п и т а н и е .
П о л у ч е н и т е д а н н и се п о д л а г а т н а коре-
лаиионен и регресионен анализ.
Корелационеи анализ
К о р е л а и и о н н и я т к о е ф и ц и е н т (г) се изчисля­
ва по ф о р м у л а т а :
г =
Коефициентът на корелация е с т а т и с т и ч е с ­
ки показател, който оценява връзката между две
групи взаимносвързани променливи величини и
с т е п е н т а на т а з и връзка в диапазона о т -1 д о 1.
Ако r = 1, т о в а показва много висока положител­
на корелация; над 0,9 - висока положителна коре-
лационна зависимост; стойности на г о т -0.7 до
+ 0.7 показват, че в е р о я т н о с т т а за линейна за­
висимост между X и У е по-малка о т 50%; ако г е
близо до 0 в е р о я т н о с т т а за линейна зависимост
също е 0. Ако т а к и в а р е з у л т а т и се получат о т
рутинни лабораторни методи, практически мо­
же да се вземе решение, че ниската с т о й н о с т на
г е предизвикана о т лоша възпроизводимост на
единия или и на д в а т а метода. Важно е да се о т ­
бележи, че г е извънредно чувствителен към раз­
мера на концентрационния диапазон на пробите
- например при ограничен диапазон г намалява, а
при широк - дава стойности близо до 1, независи­
мо о т разсейването на р е з у л т а т и т е .
Много и з с л е д о в а т е л и и з п о л з в а т корела-
ц и о н н и я т к о е ф и ц и е н т по-скоро з а верифи-
циране н а р е з у л т а т и т е по о т н о ш е н и е н а
необходим брой и д о с т а т ъ ч н о широк диапа­
зон. Добре е да се знае, че корелационнияпг
коефициент е с ограничена информатив-
ност - т о й е к р и т е р и й з а с ъ о т н о ш е н и е
м е ж ( ) у (jBe г р у п и с р а б н я б а н и Иеличини,
п о п е и з а с ъ в п а д е н и е м е ж д у сраВняВа-
н и т е ч и ф т о В е , Т р я б в а д а се използва са­
мо в комбинация с други с т а т и с т и ч е с к и ме­
т о д и - например р с г р е с и о п е н а н а л и з и ни­
кога не бива д а се н а д ц е н я в а к а т о се използ­
ва к а т о с а м о с т о я т е л е н с т а т и с т и ч е с к и
т е с т з а оценка н а нов м е т о д .
Р а з б и р а н е т о н а к о н ц е п ц и я т а з а CV, F-
т е с т , ч и ф т н и я t - т е с т , s l o p e и y-inter-
c e p t прави п о ч т и б е з п р е д м е т н о използва­
н е т о н а г, освен при п о с о ч е н и т е по-горе ус­
ловия. По о т н о ш е н и е чувствителност­
т а н а г кълг о т д е л н и т е в и д о в е г р е ш к и
е в а л и д н о следното: п р и ч и н а т а г ни­
к о г а д а н е е 1 с е дължи н а с л у ч а й н и т е
грешки, д о к а т о с и с т е л г н и т е г р е ш к и
н е м у о к а з в а т н и к а к в о в л и я н и е и по­
н я к о г а г люЖе д а е л т о г о висок въпре­
к и че л г е т о д ъ т - к а н д и д а т е неточен.
Регресионен анализ
Л и н е й н и т е анализи се и з п о л з в а т широко ос­
вен при сравняване н а м е т о д и , при калибри­
р а н е н а м е т о д и , к а к т о и з а изчисляване н а
п р е д и к т и в н а с т о й н о с т н а у при и з в е с т н а
с т о й н о с т н а х. Ако се приеме, че х ( с т о й ­
н о с т т а , получена с р е ф е р е н т е н м е т о д ) е
фиксирана или независима променлива вели­
чина, т о у ( с т о й н о с т т а получена с и з п и т ­
в а н и я м е т о д ) се нарича зависима променли­
в а и м о ж е м а т е м а т и ч е с к и д а бъде опреде­
лена к а т о функция о т х. З а т а з и цел много
ч е с т о се и з п о л з в а т регресионни анализи,
н а й - ч е с т о и з п о л з в а н и я модел н а к о и т о е
п р о с т а т а линейна регресия - проста, защо­
то има само една независима променлива.
Н а й - п р о с т и я т модел з а връзка между 2 про­
менливи е п р а в а т а линия. Графично се из­
ползва к о о р д и н а т н а с и с т е м а , н а к о я т о се
н а н а с я т всеки два взаимносвързани резул­
т а т а к а т о н а а б с ц и с а т а (X) се н а н а с я т ре­
з у л т а т и т е н а р е ф е р е н т н и я м е т о д , а н а ор-
д и н а т а т а (Y) - н а к а н д и д а т - м е т о д а . П о с т ­
роява се р е г р е с и о н н а т а линия. Ур а в н е н и е т о
н а линейна регресия е с л е д н о т о :
у = а + Ьх
у - зависимата променлива величина (средна стой­
ност, получена с проучвания метод)
х - независима променлива (средна стойност, по­
лучена с референтен метод)
b - наклон на регресионната линия (slope)
а - Y-intercept, т.е. отрязъкът, който прави рег­
ресионната права о т о р д и н а т а т а Y при х = 0
Графичният израз на ураВнението
н а л и н е й н а р е г р е с и я е праВа линия с
п о с о ч е н и т е по-горе п а р а м е т р и (фиг.
4.23).
Н а к л о н ъ т (slope) се о т н а с я з а специфич­
н а дължина н а р е г р е с и о н н а т а линия и се оп-
107
 10 р
у = 0.519х + 2.000
8
-

6
+y
t Ау = 4
4 ~

' Ах = 7.7

1 1 1 t 1 1 1 1 1 1 1 1 1
-х 2 4 6 8 10 12
+х—»-
• л

Ф и г . 4.23. Линейна регресия {по Weisbrot, 1985) Рсферентен метод

Ду 4.00
Slope = = 0.519
Дх 7.7
Y-intercept = 2.00
ределя о т с ъ о т н о ш е н и е т о н а с т о й н о с т и ­
т е о т Y-ocma, к о и т о се с ъ д ъ р ж а т 6 т а з и
о т с е ч к а о т л и н и я т а към X. Основното урав­
нение за slope е:
slope = —
ЛХ
В изчислението н а регресионния коефици­
е н т (Ь) е включена к о н ц е п ц и я т а з а най-мал­
к и т е квадрати:
"Е"2 " < S x :
Нов м е т о д , к о й т о и м а slope > 1 ще опре­
деля по-високи с т о й н о с т и о т р е ф е р е н т н и я
м е т о д , избран з а сравнение, a slope < 1 - по-
ниски с т о й н о с т и . И в д в а т а случая т е з и о т ­
клонения с т а в а т по-високи с н а р а с т в а н е на
к о н ц е н т р а ц и я т а , поради к о е т о се с ч и т а , че
slope е к р и т е р и й з а р а з л г е р а н а пропор­
ционалната грешка н а проучвания
м е т о д (фиг. 4.24). З а п р и е м л и б с е с ч и т а
s l o p e В д и а п а з о н а о т 0.95 д о 1.05.
Т о ч к а т а , в к о я т о р е г р е с и о н н а т а линия
пресича Y - о с т а се нарича Y-intercept. Фак­
т и ч е с к и Y-intercept е bias, коригиран с нак­
лона н а р е г р е с и о н н а т а линия. Изчислява се
по ф о р м у л а т а :
а = у - Ьх
а - м а т е м а т и ч е с к и символ н а Y-intercept
b - наклон на к р и в а т а (slope)
х - средна а р и т м е т и ч н а н а референтния м е т о д
у - средна а р и т м е т и ч н а н а оценявания м е т о д
108
Ф и г . 4.24. Сравнение н а референтен и р у т и н е н
метод
А - без грешка
Б - постоянна системна грешка
В - пропорционална системна грешка
Изчислението н а Y-intercept ни дава по­
т о ч н а информация за bias - с и с т е м н о т о о т ­
клонение, основния с т а т и с т и ч е с к и к р и т е ­
рий з а оценка н а н е д о с т о в е р н о с т т а .
Ако ч и ф т н и я т t-meem показва, че н я м а
с т а т и с т и ч е с к а разлика между сравнявани­
т е средни {bias е с приемлива стойност), и
ако slope е в о п т и м а л н и граници, обикнове­
но се предполага, че Y-intercept е приемлив.
Нов м е т о д , к о й т о и м а сигнификантен Y-
intercept, ще определя по-високи или по-нис­
ки с т о й н о с т и о т р е ф е р е н т н и я м е т о д , в за­
в и с и м о с т о т знака пред а. Трябва да се о т ­
бележи, че т о в а отклонение о т референт­
ния м е т о д о с т а в а постоянно по ц я л а т а рег­
ресионна линия, независимо о т к о н ц е н т р а ­
ц и я т а . Y-intercept с е с ч и т а к р и т е р и й
за оценка размера на п о с т о я н н а т а
с и с т е м н а грешка н а к а н д и д а т - м е т о -
да.
Разсейването н а т о ч к и т е около регреси­
о н н а т а линия зависи о т с л у ч а й н а т а греш­
к а н а новия м е т о д , к о я т о може да се изчис­
ли с у р а в н е н и е т о за с т а н д а р т н а т а грешка
н а р е г р е с и я т а SDy х:
l y ( yJ i - Y i ) 2
SI) _ Zrf ' L_
y , x
V n - 2
С т а н д а р т н а т а грешка н а р е г р е с и я т а
SD....
У.х
е п о к а з а т е л з а п р и с ъ щ а т а случайна
грешка н а к а н д и д а т - м е т о д а Y. За съжале-
ние не с ъ щ е с т в у в а т с т а н д а р т н и к р и т е р и и
за приемливи с т о й н о с т и н а SDv х. Експери­
м е н т а л н о т о проучване н а възпроизводи-
м о с т т а при оиенка н а а н а л и т и ч н и я м е т о д
дава д о с т а т ъ ч н о информаиия в т о в а о т н о ­
шение.
И д е а л н а т а линейна регресия би следвало
да има: Slope (b)=1.0; Y-intercept (a) = 0 0-
SD,,, = 0.0.
Тъй к а т о случайните и с и с т е м н и греш­
ки са неизбежни, т е м о г а т да п р и ч и н я т из­
кривяване на р е г р е с и о н н а т а линия. Оиенка-
т а н а вида н а г р е ш к и т е би била валидна са­
мо при спазване н а с л е д н и т е правила:
> Преди да б ъ д а т нанесени на координат­
н а т а с и с т е м а , използваните р е з у л т а т и
за изчисление н а у р а в н е н и е т о н а линейна
регресия т р я б в а в н и м а т е л н о да се разг­
л е д а т с иел о т к р и в а н е на нелинейно свър­
зани р е з у л т а т и . Важно е д а се с п а з в а т
г р а н и и и т е н а л и н е й н о с т на м е т о д и т е .
Н е л и н е й н о с т т а при високи к о н и е н т р а -
иии би довела до намаляване наклона на
к р и в а т а (slope) и повишаване размера на
Y-intercept, к а к т о и н а с т а н д а р т н а т а
грешка SD .
> Р е з у л т а т и т е т р я б в а в н и м а т е л н о да бъ­
д а т прегледани з а „бегълци", т . е . грубо
о т к л о н я в а щ и се с т о й н о с т и . Например
ако р а з л и к а т а между две с т о й н о с т и е по-
голяма о т 3.5SD у., х , п р о б и т е т р я б в а да се
изследват о т н о в о , к а т о се идентифици­
р а т п р и ч и н и т е з а т о в а . Б р о я т на п о т ­
върдените „бегълци"е важна характерис­
т и к а на м е т о д а - к а н д и д а т . С и с т е м н а т а
грешка н а м е т о д а т р я б в а да се изчисли с
и без рязко о т к л о н я в а щ и т е се стойнос­
т и . С ъ щ е с т в у в а т специални с т а т и с т и ­
чески т е с т о в е з а о т с т р а н я в а н е на „бе­
гълци". При и з п и т в а н е н а а н а л и т и ч ­
н а т а н а д е ж д н о с т н е с е д о п у с к а по­
в е ч е о т е д и н т а к ъ в р е з у л т а т н а 40
проби н а б о л н и .
> К а к т о вече беше казано, д и а п а з о н ъ т н а
а н а л и т и ч н и т е концентрации т р я б в а да
е широк.
Основна п р е д п о с т а в к а з а използване н а
м е т о д а на линейна регресия е, че на всяка
известна с т о й н о с т на х съществува с ъ о т ­
в е т н о нормално разпределение на у - с т о й -
н о с т и . Графично т о в а е п р е д с т а в е н о н а
фиг. 4.25 Л. Регресионната линия преминава
Ф и г . 4.25. И л ю с т р а ц и я н а п р о с т а регресия (А)
и Deming-регресия (Б)
през с р е д н и т е с т о й н о с т и н а у- разпределе­
нията.
Основни и з и с к в а н и я з а и з п о л з в а н е н а
л и н е й н а т а регресия с а следните:
• х - с т о й н о с т и т е са с т р о г о фиксирани с ни­
щожна случайна грешка,
• за всяка с т о й н о с т н а х съществува нор­
мално разпределение на у - с т о й н о с т и ,
• разпределенията н а у за всяка с т о й н о с т
на х и м а т и м а т еднаква дисперсия, коя­
т о е независима о т с т о й н о с т т а на х.
Ограничения п а м е т о д а н а проста
л и н е й н а регресия:
• Линейната регресия е основана на един не­
подходящ т е о р е т и ч е н модел, при к о й т о
се приема, че независимата променлива е
определена без грешка. Това е най-голяма­
т а клопка н а т о з и м е т о д . Теоретично е
позволена вариация само на у, к о е т о пра­
ви м е т о д а по-подходящ за построяване на
калибрационна крива, о т к о л к о т о за срав­
нение на методи. При ситуации с доказа­
на значима вариация на Х-метода, биха се
получили недопустимо големи с т о й н о с т и
на с т а н д а р т н а т а грешка SDy,x, на s l o p e
и Y - i n t e r c e p t , к а к т о и неприемливо нисък
г. При т е з и условия се препоръчват дру­
ги с т а т и с т и ч е с к и т е х н и к и , най-често
м е т о д а на Deming и непараметричния ме­
т о д на Passing-Bablok.
• Ограничен концентрационен диапазон -
к о г а т о ч и ф т н и т е изследвания с д в а т а ме­
т о д а се п р о с т и р а т в ограничен концен­
т р а ц и о н е н диапазон, едно приемливо ни­
во на случайната грешка може да доведе
до н е т о ч н а оценка на slope и Y-intercept
на регресионната линия.
За да се прецени кой о т д в а т а регресион-
109
 GOD-PAP
12 16 20 24 28
Линейна р е ф е с и я (n=40)
Slope: 0 . 9 7 0 (от 0 . 9 4 4 д о 0 . 9 9 6 )
Intercept: 0 . 4 5 (от 0.31 д о 0 . 6 0 )
Ф и г . 4.26. Сравнение на р е з у л т а т и т е о т изследване на глюкоза (GOD-PAP метод) с китове о т два
различни производителя чрез линейна, Deming-регресия и регресия на Passing-Bablok
ни м е т о д а да се и з б е р е р е г р е с и я и л и
Deming-регресия, се предлага следния подход:
най-напред се п о с т р о я в а линейна регресия,
к а т о н а Х - о с т а се н а н а с я т с т о й н о с т и т е с
р е ф е р е н т н и я м е т о д , а н а Y - с проучвания
м е т о д . Изчислява се у р а в н е н и е т о н а регре­
сия. След т о в а м е с т а т а н а х и у се с м е н я т
и се преизчислява ново уравнение с нова рег­
ресионна линия. Ако д в е т е регресионни ли­
нии са с ъ щ е с т в е н о различни една о т друга,
трябва да се използва Deining- регресия.
М е т о д ъ т п а D o m i n g взема предвид ва­
р и а ц и я т а и н а д в а т а сравнявани м е т о д а ,
т . е н а н е з а в и с и м а т а х и з а в и с и м а т а про­
менлива у. Тук се въвежда допълнителен па­
р а м е т ъ р : съотношението на дисперсиите
между д в а т а метода (F-mecm). Обикновено
F е и з в е с т е н още о т първия е т а п н а оценка
на а н а л и т и ч н а т а надеждност на методи­
т е - чрез определяне н а т е х н и т е CV. Дове­
р и т е л н и я т и н т е р в а л се изчислява чрез из­
ползване а л г о р и т ъ м а , и з в е с т е н в с т а т и с ­
т и к а т а к а т о jackknife. Г р а ф и ч н и я т модел
н а м е т о д а н а Deming ще даде една регреси­
онна линия между х и у, к о я т о е съобразена
със с л у ч а й н а т а грешка о т и з м е р в а н е т о и
н а д в е т е променливи - х и у (вж. фиг. 4.25 Б).
Една важна забележителност н а Deming-рег-
р е с и я т а е, че о б р ъ щ а н е т о н а м е с т а т а н а
променливите величини х и у и преизчисля­
ване н а р е г р е с и о н н а т а с т а т и с т и к а ще да­
де данни, аналогични с първоначалното из­
числение, за разлика о т м е т о д а н а п р о с т а
линейна регресия.
Методът п а Passing и Bablok, к а т о
всички н е п а р а м е т р и ч н и м е т о д и , е по-мал­
ко ч у в с т в и т е л е н към „бегълци". И з п о л з в а т
се две техники: т е с т за съвпадение между
д в а т а аналитични м е т о д а и определяне н а
110
GOD-PAP
8 12 16 20 24 28 12 16 20 24 28
Deming-pei ресия (n^40) Pel ресия на Passing-Bablok (п=40)
Slope: 0 . 9 7 3 (от 0 . 9 4 6 д о 1.000) Slope. 0 . 9 9 0 (от 0 . 9 3 8 д о 1.011)
Intercept: 0 . 4 4 (от 0 . 3 0 д о 0.58) Intercept: 0.41 (от 0 . 2 4 д о 0.71)
регресионните п а р а м е т р и .
Тъй к а т о посочените с т а т и с т и ч е с к и
методи са сложни, з а препоръчване е да се
използват съответни компютърни програ­
ми.
На фиг. 4.26 е представено сравнение н а
един м е т о д с използване н а к и т о в е о т два
различни производителя чрез използване н а
т р и регресионни м е т о д и : л и н е й н а регресия
о т I порядък, Deming-регресия и Passing-
Bablok.
Един п о - п р о с т и ефикасен начин н а срав­
няване н а м е т о д и е изчисляването на раз­
л и к и т е между р е ф е р е н т н и я и кандидат-ме-
т о д а и графичното им нанасяне н а коорди­
н а т н а с и с т е м а срещу с т о й н о с т и т е н а ре­
ф е р е н т н и я м е т о д (фиг. 4.27), к а т о се спази
алгебричния знак пред р а з л и к а т а . За изчис­
ление н а г о р н а т а , респ. долна к о н т р о л н а
граница се използва с р е д н а т а а р и т м е т и ч ­
н а н а р а з л и к и т е D {difference), н а графика­
т а п р е д с т а в е н а к а т о mean. При добро съв­
падение р а з л и к и т е се к о л е б а я т около нула­
т а . О т разположението н а разликите в об­
л а с т т а над 0 или под нея, може да се преце­
ни дали с и с т е м н а т а грешка н а к а н д и д а т -
м е т о д а е положителна или о т р и ц а т е л н а .
8
4
&ХТ о ©
__О
10 15 20 25 30 35
Ф и г . 4.27. К а р т а на абсолютните разлики меж­
ду два метода за определяне на желязо
11а абсцисата - стойности, получени с AAS, на ордината
- разликите между AAS и метод с Ferrozine. С пунктира­
на линия са обозначени контролните граници на разли­
ките; п = 30, средна разлика: -2.27 ( о т -3.24 до -1.30).
Този начин позволява също оценка и н а не- порционалната грешка. Подходящ пример е
възпроизводимостпш н а м е т о д а . представен в т а б л . 4.9.
С р е з у л т а т и т е , получени по д в а т а ме­
т о д а , може да се изчисли ч и ф т е н t-test за Т а б л и ц а 4.9. А н а л и т и ч н а о т к р и в а е м о с т
оценка д о с т о в е р н о с т т а н а р а з л и к и т е меж­ (recovery)
ду т е х н и т е средни а р и т м е т и ч н и . Получе­ Подготовка на пробите

н а т а с т о й н о с т на t представлява съотно­ Пълна к р ъ в St

Проба Физ. St г л ю к о з а
(K-EDTA) глюкоза
ш е н и е т о между с и с т е м н а т а и с л у ч а й н а т а разтВор 5000 mg'Tf
6 000 mg%
грешка и е к р и т е р и й з а размера н а обидата Д
(базова)
1 ml 0.10 ml - -

грешка. Ако b i a s н а р а с т в а с ъ о т в е т н о на Б 1 ml - 0.10 ml -

SD, има малка в е р о я т н о с т т о в а да е резул­ В 1 ml - - 0.10 ml

т а т н а с л у ч а й н а т а вариация, а е по-голяма Извършват сс трикратни опродалеиия п а всяка от
в е р о я т н о с т т а т о в а да се дължи действи­ пробите. Получават се следните резултати:
Глюкоза Глюкоза
т е л н о н а с и с т е м н а грешка между д в а т а ме­ Глюкоза
(добавена (намерена Recovery
Проба (получена
тода. стойност)
концент­ концентр­
рация) ация)
А 5.6 mmol/1 - - -

Б 30.3 mmol/1 25.2 mmol/1 24.7 mmol/1 98%

Оценка н а п р о п о р ц и о н а л н а т а
В 35.0 mmol/1 30.3 mmol/1 29.4 mmol/1 97%
с и с т е м н а грешка
Изчисления. Проба Б:
Извършва се с помоидта н а м е т о д а на стан­ Добавена кониентрация =
0.1 ml
454.5 mg% = 25.2 mmol/1
I.I ml
дартната добавка и изчисляване на анали­ Намерена кониентрация = 30.3 - 5.6 = 24.7 mmol/1;
т и ч н а т а о т к р и в а е м о с т (recovery). Този ме­ Recovery =
24.7
= 98%
т о д се изразява в добавяне н а предварител­ 25.2
По същия начин се извършват изчисленията и за проба В.
но изчислени количества о т изследваната
с ъ с т а в к а в а л и к в о т и о т п р о б а т а за изслед­ При провеждане на експеримента за ана­
ване. За ц е л т а се и з п о л з в а т концентрира­ л и т и ч н а о т к р и в а е м о с т о т изключителна
ни калибрационни р а з т в о р и . Важно е обе­ в а ж н о с т е:
м ъ т н а добавеното количество разт­ • изключително т о ч н о пипетиране,
в о р д а н е б ъ д е по-голлль о т 10% о т обе­ • спазване изискването за добавен обем по-
м а н а пробата, з а д а н е предизвика малък о т 10% о т общия обем,
г р у б и пролгени в лшпгрикса. Приготвя
• к о н ц е н т р а ц и и т е на добавените количес­
се съицо базова проба (без добавка), в к о я т о
т в а т р я б в а да се изчислят т а к а , че да се
в м е с т о к о н ц е н т р и р а н калибрационен р а з т ­
получат с т о й н о с т и , при к о и т о се в з е м а т
вор се добявя съшия обем дестилирана во­
важни медицински решения,
да. П р о б и т е се изследват с м е т о д а , подле­
жащ, н а оценка, след к о е т о се и з в ъ р ш в а т • препоръчително е да се извършват о т 2
следните изчисления: до 4 изследвания н а всяка проба, за да ог­
раничи в ъ з д е й с т в и е т о н а с л у ч а й н а т а
Количество намерено Komi, int проба 1а Коми. на iipoGaia
вешество -
с добавка _
без добавка грешка (невъзпроизводимост) на м е т о д а .
За приемливи се с ч и т а т с т о й н о с т и на
К о л и ч е с т в о т о добавено в е ш е с т в о се из­
а н а л и т и ч н а т а о т к р и в а е м о с т между 95 и
числява о т к о н ц е н т р а ц и я т а н а калибраци-
онния р а з т в о р ( с т а н д а р т ) умножена по съ­ 105%.
о т н о ш е н и е т о н а добавения и общ обем н а
пробата:
ml St
Оценка н а п о с т о я н н а т а
Добавена концентрация = Komi, на Si с и с т е м н а грешка
ml серум + ml St

Намерена к о н ц е т р а н и м За оценка наличието и размера на постоян­

recovery ( % ^
Добавена к о н н е т р а н н и
Р а з л и к а т а между изчисления п р о ц е н т
recovery и 100% recovery е п р о ц е н т а на про­
ПИ)
на с и с т е м н а грешка, к о я т о се дължи на нес-
п е ц и ф и ч н о с т т а н а м е т о д а , се извършва из­
следване на а н а л и т и ч н а т а интерференция.
111
А н а л и т и ч н а с п е ц и ф и ч и о с т . Специфич­
н о с т т а н а а н а л и т и ч н и я м е т о д {analytical
specificity) се определя о т с п о с о б н о с т т а му
да определя к о н ц е н т р а ц и я т а само н а т о з и
компонент, за к о й т о е предназначен. Изпол­
з в а се о щ е т е р м и н ъ т с е л е к т и в н о с т
(selectivity). Н я м а цифров израз. Специфич­
н о с т т а н а един сложен а н а л и т и ч е н м е т о д
зависи о т с п е ц и ф и ч н о с т т а на о т д е л н и т е
реакции. Например у р е а з н а т а и г л у т а м а т -
дехидрогеназната реакция при определяне
на урея са високоспецифични, д о к а т о уреаз­
н а т а реакция, последвана о т р е а к ц и я т а н а
Б е р т л о води до намаляване специфичност­
т а на м е т о д а ; глюкозооксидазната реакция
е високоспецифична, д о к а т о пероксидазна-
т а не е, к о е т о намалява о б щ а т а специфич­
н о с т н а т о з и м е т о д з а определяне на глю-
коза. Най-високо специфични м е т о д и са де­
ф и н и т и в н и т е , респ. р е ф е р е н т н и м е т о д и .
Проверката на специфичността на м е т о ­
да т р я б в а да се извършва с проби о т раз­
лични болни, ч и и т о концентрации п о к р и в а т
ц я л а т а клинично значима концентрацион­
н а област. П о д б р а н и т е по т о з и начин про­
би се и зследват с р е ф е р е н т е н м е т о д и с ме­
т о д а , ч и я т о специфичност се оценява по на­
чина, описан по-горе.
А н а л и т и ч н а и н т е р ф е р е н ц и я . При оцен­
к а н а а н а л и т и ч н а т а специфичност е необ­
ходимо да се провери в л и я н и е т о н а различ­
ни ендогенни и екзогенни с ъ с т а в к и н а м а т -
рикса върху л а б о р а т о р н и я р е з у л т а т . Със­
т а в к и т е н а м а т р и к с а м о г а т да и м и т и р а т
физична, спектрални и л и хроматографски
свойства на изследваната съставка. Ком­
б и н и р а н и я т е ф е к т н а всички физични и хи­
мични х а р а к т е р и с т и к и н а п р о б а т а , к о и т о
не п о д л е ж а т н а анализ, се н а р и ч а т ефект
на матрикса или интерференция.
Най-напред се изследва е ф е к т а на ендо­
г е н н и т е с ъ с т а в к и н а м а т р и к с а (дали глю-
коза, пикочна киселина, билирубин, п и р у в а т
и др. в л и я я т върху м е т о д а н а Jaffe за опре­
деляне на к р е а т и н и н ) .
О т особен клиничен и н т е р е с е проучва­
н е т о и н т е р ф е р е н ц и я т а н а различни екзо­
генни с ъ с т а в к и к а т о лекарст ве н и с р е д с т ­
ва, н а р к о т и ц и и др. Специално внимание се
о т д е л я н а и н т е р ф е р е н ц и я т а н а проби с хе-
молиза и липемия върху а н а л и т и ч н и т е ре­
з у л т а т и . In vitro и н т е р ф е р е н ц и я т а може да
112
се подраздели н а две групи; с п е к т р а л н а и хи­
мична. П р и с п е к т р а л н а т а и п т е р ф е -
р е и ц и л п р ечещо то в е щ е с т в о предизвиква
с п е к т р а л е н отговор, подобен н а с ъ с т а в к а ­
т а подлежаща н а анализ, без да е задължи­
т е л н о да причинява химични промени в ана­
л и т и ч н а т а реакция. П р о с т пример з а т а ­
къв вид интерференция е т а з и н а хемогло­
бина (при проби с хемолиза) и н а билирубина
(при проби с и к тер ). С п е к т р а л н а интерфе­
ренция о т общ т и п може да предизвика и
т у р б и д и т е т а при липемични проби, к о й т о
се дължи н а АДА холестерола. П р и хилгич-
п а т а и н т е р ф е р е н ц и я интерфериращи-
т е вещества реагират с реактивите о т
а н а л и т и ч н а т а реакция, к а т о реакционни­
я т п р о д у к т може да предизвика положител­
на, а в някои случаи и о т р и ц а т е л н а и н т е р ­
ференция.
П р о у ч в а н и я т а н а и н т е р ф е р е н ц и я т а се
и з в ъ р ш в а т в линейния диапазон на м е т о д а .
О п и т н и я т модел з а подготовка н а проби­
т е е с ъ щ и я т к а к т о при recovery. Р а з л и к а т а
между проба с добавка н а потенциален ин-
т е р ф е р е н т и б а з о в а т а проба е мярка на пос­
тоянната системна грешка.
Освен посочените изисквания при експе­
р и м е н т а за recovery е необходимо да се съ­
образи още следното условие:
• к о л и ч е с т в о т о н а добавения и н т е р ф е р е н т
да бъде т а к о в а , че к р а й н а т а к о н ц е н т р а ­
ция в п р о б а т а да е близка да максимална­
т а физиологична концентрация. Ако се из­
следва л е к а р с т в е н а интерференция, кон­
ц е н т р а ц и я т а т р я б в а да о т г о в а р я н а т е ­
р а п е в т и ч н а т а плазмена концентрация на
л е к а р с т в е н о т о средство. За всяка изслед­
вана к о н ц е н т р а ц и я н а проба с добавка н а
и н т е р ф е р е н т е необходимо да се извър­
ш а т по 20 определяния. Р а з л и к а т а между
с р е д н и т е с т о й н о с т и н а т а з и проба и н а
к о н т р о л н а т а проба се оценява за д о с т о ­
в е р н о с т с п о м о щ т а н а t-test н а S t u d e n t
при уровен н а з н а ч и м о с т р=0.01 (IFCC). В
д о к у м е н т и т е н а ШРАС к а т о к р и т е р и й
з а оценка н а интерференцилта се
п р е п о р ъ ч в а р а з л и к а , по-голялга о т
три стандартни отклонения н а
м е Ж д у с е р и й н а т а а н а л и т и ч н а ва­
р и а ц и я н а Atemoga. Независимо о т с т а ­
т и с т и ч е с к а т а оценка, за н у ж д и т е на кли­
н и ч н а т а п р а к т и к а е необходимо да се из­
върши и медицинска оценка н а получени-
 me разлики. Ако m e не в о д я т до вземане т а н а о т к р и в а н е (limit o f detection). Изразя­
н а различно медицинско решение, се счи­ ва се с о т н о ш е н и е т о н а н а р а с т в а н е т о на
т а т з а незначителни. Таблица 4.10 пред­ и з м е р в а н а т а величина у за единица изслед­
с т а в я подходящ пример. вано веидество х. Ако и з м е р в а н а т а величи­
Таблица 4.10. Интерференция на билирубин при на е абсорбция (А), а изследваното веидест­
определяне на креатинин no Jaffe во се измерва в концентрация (С), чувстви­
Подготовка н а пробите т е л н о с т т а н а м е т о д а гце се изрази с о т н о ­
шението:
Проба Серум Д е с т . Н20 St б и л и р у б и н
250 mgCc
А 1.0 ml 0.10 ml
Slope =
(базова) -
ЛС
Ь 2.0 ml 0.05 ml
-
О п т и м а л н а за н у ж д и т е на р у т и н н а т а
с 2.0 ml 0.10 ml
-
практика чувствителност притежават
Интсрфсрсицията в пробите с добавка се определя по
следния начин
м е т о д и т е , при к о и т о н а к л о н ъ т на калиб-
Креатинин St б и л и р у б и н р а ц и о н н а т а к р и в а е п р и б л и з и т е л н о 45°
Интерферен­
Проба (получена (добавена
ция
(tg(x= 1). М е т о д и т е с н а к л о н п о - г о л я л 1
стойност) концентрация)
о т 45" с а п о - ч у в с т в и т е л н и и и з и с к в а т
А 172 цто1/1
(базова) -
еЖедневна калибрация, докато тези с
В 6.1 mgVc
154 цто1/1
(104 цто1/1) -18 цто1/1 п о - л ю л ъ к nali^ioH с а н е ч у в с т в и т е л н и
с 11.9 mgVr и н е н а д с Л д н и и трябва д а бъдат изх­
128.8 цто1/1 -43.2 цто1/1
(204 цто1/1) върлени от практиката.
Добавеното количество St билирубин се изчислява по анало­ А н а л и т и ч н а т а ч у в с т в и т е л н о с т зависи
гичен начин с е к с п е р и м е н т а за recovery
о т с т а н д а р т н о т о отклонение на м е т о д а ,
Видовете а н а л и т и ч н и грешки и с т а т и с ­ т . е . о т размера на случайните грешки в ана­
т и ч е с к и т е показатели, използвани за опре­ л и т и ч н а т а серия. Ако за определен концен­
д е л я н е т о им са п р е д с т а в е н и н а т а б л . 4.11. т р а ц и о н е н и н т е р в а л е известно с ъ о т в е т ­
н о т о с т а н д а р т н о отклонение в серия, мо­
Т а б л и ц а 4.11. Видове грешки и с т а т и с т и ч е с к и же да се изчисли к р и т и ч н а т а разлика Dk при
показатели, използвани з а о п р е д е л я н е т о и м уровен на з н а ч и м о с т р = 0.01 с уравнението;

Вид г р е ш к а
Статистически I).к = 2.88S1) wr
показател
SD wr - с т а н д а р т н о о т к л о н е н и е в серия
Случайна грешка CV
Случайна грешка F-test
Например, ако при един GOD/РАР-метод
Обша с и с т е м н а чифтен t-test
грешка
за определяне на глюкоза х = 6.0 mmol/1, а
Пропорционална slope (b)
SD = 0.10, к р и т и ч н а т а разлика за т о з и кон­
системна грешка центрационен диапазон ще бъде 0.29 mmol/1;
Пропорционална Recovery при х = 16.0 mmol/1 и SD = 0.30, к р и т и ч н а т а
системна грешка разлика гце бъде 0.86 mmol/1.
Постоянна с и с т е м н а Y-intercept (a) О т изчисленията се вижда, че две изме­
грешка рени с т о й н о с т и в п а т о л о г и ч н а т а област за
Постоянна с и с т е м н а интерференция (bias) определяне на глюкоза м о г а т да се разгра­
грешка
н и ч а т със сигурност, само ако т я х н а т а раз­
лика възлиза над 0.86 mmol/1.

Аналитична чуИстКителпост
А н а л и т и ч н а т а ч у в с т в и т е л н о с т (analytical
sensitivity) е н а й - м а л к а т а разлика в концен­
т р а ц и и т е н а изследвания к о м п о н е н т в ли­
н е й н а т а о б л а с т на измерване, к о я т о може
да се разграничи със сигурност. Определя се
с наклона на а н а л и т и ч н а т а калибровъчна
функция - slope{b). Не е синоним н а граница­
Граница н а о т к р и В а н е
Под граница н а откриване {limit o f detection,
Ld) се разбира най-ниската концентрация на
изследваната с ъ с т а в к а , к о я т о може да се
определи с аналитичния м е т о д . Необходи­
мо е сигналът (измерената величина) на т а ­
зи концентрация достоверно да се различа-
113
6a om п р а з н а т а проба за р е а к т и в и , в к о я т о
липса и з с л е д в а н а т а с ъ с т а в к а .
Ако определянето г р а н и ц а т а н а о т к р и ­
ване е с ъ щ е с т в е н о з а количествения анали­
т и ч е н м е т о д , се препоръчва 20-кратно изс­
ледване н а п р а з н а т а проба. Получените ре­
з у л т а т и се о б р а б о т в а т с т а т и с т и ч е с к и з а
х и SD. Г р а н и ц а т а н а о т к р и в а н е се изчисля­
ва по следния начин:
L , = х + 3SI)
С т о з и е к с п е р и м е н т в с ъ щ н о с т се опре­
деля м а к с т м а л п а т а с л у ч а й н а г р е ш к а
н а п р а з н а т а проба, над к о я т о може да
се с ч и т а , че е г р а н и ц а т а н а от кри ва н е. То­
зи начин н а определяне е е в т и н и п р о с т , но
има съществени н е д о с т а т ъ ц и , т ъ й к а т о
м а т р и к с ъ т н а п р а з н а т а проба не е същи­
я т к а т о н а п р о б а т а н а болния. С т о з и мо­
дел м о г а т да б ъ д а т определени само една
ч а с т о т грешките.
Нестабилност па метода.
Н е с т а б и л н о с т т а н а м е т о д а се определя о т :
• ч е с т о т а т а н а грубо п о г р е ш н и т е с т о й ­
н о с т и , к о и т о в ъ з н и к в а т поради т р у д н и
за преодоляване процедури. Груби грешки,
к о и т о са о т субективен х а р а к т е р , к а т о
напр. с м я н а н а п и п е т и , н а ф и л т р и и пр.
не се и м а т предвид при оценка с т а б и л ­
н о с т т а на метода;
• ч е с т о т а т а , с к о я т о м е т о д ъ т излиза из­
вън к о н т р о л по време н а о ц е н к а т а на ана­
л и т и ч н а т а му н а д е ж д н о с т .
Основен п р и о р и т е т н а л а б о р а т о р н и я
персонал т р я б в а да бъде получаване н а на­
деждни р е з у л т а т и . Но о т п р о у ч в а н и я т а н а
а н а л и т и ч н а т а н а д е ж д н о с т н а лаб ора т ор ­
н и т е м е т о д и с т а в а ясно, че т е п р и т е ж а ­
в а т присъщи, неизбежни а н а л и т и ч н и греш­
ки, к о и т о не м о г а т да се е л и м и н и р а т изця­
ло. И възпроизводимостта, и т о ч н о с т т а са
зависими о т а н а л и т и ч н и я м е т о д и използ­
в а н а т а а п а р а т у р а . Д о к а т о възпроизводи­
м о с т т а може ч у в с т в и т е л н о да бъде подоб­
рена чрез а в т о м а т и з а ц и я на анализите, дос­
т о в е р н о с т т а и т о ч н о с т т а м о г а т да се по­
в и ш а т чрез използване н а сертифицирани
стандарти и калибратори о т висок 1слас.
П о с т о я н н а т а с и с т е м н а грешка може да се
114
ограничи чрез използване на м е т о д и с по-ви-
сока а н а л и т и ч н а специфичност, к о е т о чес­
т о з а съжаление е в конфликт със себестой­
н о с т т а на анализите.
ПР АНТИЧНОСТ
Под п р а к т и ч н о с т (practicability) се разбира
с ъ в к у п н о с т т а о т к а ч е с т в а н а процедура­
т а з а изследване, к о и т о са необходими за
оценка н а п р и л о ж и м о с т т а ü в конкретни­
т е условия.
Критерии при оценка п р а к т и ч н о с т т а н а
изпитвания метод:
1. В р е м е т о , необходимо за извършване на
1 анализ или серия о т 10, 100 анализа, ка­
т о се о т ч и т а в р е м е т о о т с ъ с т а в я н е т о
н а п о р ъ ч к а т а за изследване до получава­
н е т о н а л а б о р а т о р н и я р е з у л т а т . Това
време зависи о т начина н а анализа - в се­
рия или не.
2. С е б е с т о й н о с т т а н а един, 10 или 100
анализа. При о ц е н к а т а н а с е б е с т о й н о с т ­
т а е важна големината н а една аналитич­
н а серия. О т значение е също к р и т и ч н а ­
т а дължина н а с е р и я т а , к о я т о обуславя
з а м я н а т а н а един мануален м е т о д с ав­
томатичен.
3. С л о ж н о с т н а а н а л и з а . Преценява се
д о с т а т ъ ч н а ли е квалификацията н а ла­
б о р а т о р н и я персонал за извършване н а
обсъждания м е т о д ; необходимо ли е про­
дължително обучение.
4. Доказана ли е м е д и ц и н с к а т а н у ж д а о т
определяне н а въпросния лабораторен по­
казател?
5. Необходима ли е с п е ц и а л н а а п а р а т у ­
ра?
6. Необходими ли са с п е ц и а л н и м е р к и з а
б е з о п а с н о с т н а персонала?
7. Съществува ли д о с т а т ъ ч н о квалифици­
ран персонал?
8. С ъ щ е с т в у в а ли В ъ з м о ж н о с т з а а в т о ­
м а т и з а ц и я - напр, при серийност над
50 анализа.
9. Дали е и к о н о м и ч е с к и о п р а В ц а н о из­
вършването н а м е т о д а в с о б с т в е н а т а ла­
боратория?
При въвеждане н а нов м е т о д е необходи­
мо да се и м а предвид, че за да бъде е ф е к т и -
Ben u о п р а в д а н , м е т о д ъ т т р я б в а да се из­
вършва поне веднъж седмично.
ДИАГНОСТИЧНА НАДЕЖДНОСТ
НА ЛАБОРАТОРНИТЕ
ПОКАЗАТЕЛИ
К. Ц а ч е в
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
В и с о к а т а а н а л и т и ч н а н а д е ж д н о с т н а кли-
н и ч н о - л а б о р а т о р н и т е м е т о д и е задължи­
т е л н о качество, но т о не е д о с т а т ъ ч н о за
прилагане н а даден м е т о д в к л и н и ч н а т а
п р а к т и к а . Това налага н а всеки нов м е т о д ,
респ. п о к а з а т е л да бъде оценена к а к т о ана­
л и т и ч н а т а , т а к а и д и а г н о с т и ч н а т а му на­
деждност. При оценка н а д и а г н о с т и ч н а т а
надеждност на определени клинично-лабора-
т о р н и п о к а з а т е л и се прави извод з а способ­
н о с т т а им вярно да о т р а з я в а т истинско­
то състояние на пациента - наличие и л и
отсъствие на патология. П р а к т и к а т а по­
казва, че с т о й н о с т извън р е ф е р е н т н и я ин­
т е р в а л не означава "сигурно болен", н и т о ре­
з у л т а т в р е ф е р е н т н и я о б х в а т - "сигурно
здрав1. С п о м о щ т а н а т ъ й нар. с т а т и с т и ­
чески дискриминантен анализ може да се
определи разграничителна (дискриминант-
на, прагова, о т р я з в а щ а , cut off) с т о й н о с т
за определен п о к а з а т е л , к о я т о максимално
сигурно разграничава с ъ с т о я н и е т о н а бо­
л е с т о т о т с ъ с т в и е т о н а заболяване. Чрез
р а з г р а н и ч и т е л н а т а с т о й н о с т (при някои
показатели може да бъде и с ъ о т в е т н а т а ре-
ф е р е н т н а граница) к о л и ч е с т в е н а т а инфор­
мация о т изследвания п о к а з а т е л се преоб­
разува в к а ч е с т в е н отговор: - "да", респ. по-
л о Ж и т с л с п (+) р е з у л т а т или "не", респ.
о т р и ц а т е л е н (-) р е з у л т а т . По т о з и на­
чин о т диагностична гледна т о ч к а един ре­
з у л т а т може да бъде:
1. Истински положителен (ИII) - положите­
лен р е з у л т а т при болни с наличие н а да­
д е н о т о заболяване.
2. Истински о т р и ц а т е л е н (ИО) - о т р и ц а ­
т е л е н р е з у л т а т при п а ц и е н т и с о т с ъ с ­
т в и е на д а д е н о т о заболяване (или при
здрави лица).
3. Лъжливо положителен (ЛП) - положите­
лен р е з у л т а т при п а ц и е н т и с о т с ъ с т в и е
н а д а д е н о т о заболяване (или при здрави
лица).
4. Лъжливо о т р и ц а т е л е н (ЛО) - о т р и ц а т е ­
лен р е з у л т а т при болни с наличие на да­
д е н о т о заболяване.
С т а т и с т и ч е с к о т о разпределение на ре­
з у л т а т и т е о т определен п о к а з а т е л при
здрави лица и болни показва, че идеалният
случай, при к о й т о к р и в и т е са напълно раз­
делени, т . е . всички положителни р е з у л т а т и
са истински положителни и всички о т р и ц а ­
т е л н и р е з у л т а т и са истински о т р и ц а т е л ­
ни, реално не съществува. На п р а к т и к а ви­
наги има известно припокриване между ис­
т и н с к и п о л о ж и т е л н и т е и истински о т р и ­
ц а т е л н и т е р е з у л т а т и , изразено в различна
с т е п е н (фиг. 4.28). Това означава, че сред кли­
нично з д р а в и т е ще има лица с лъжливо по­
ложителни (ЛП), а сред болните - т а к и в а с
лъжливо о т р и ц а т е л н и (ЛО) р е з у л т а т и . При­
ч и н и т е за т о в а припокриване на д в е т е кри­
ви са: биологичната вариация на резулта­
тите; някои неустановени нарушения при
подбора на контролната група здрави ли­
ца; възможностите на аналитичния метод;
обхващане на преходни клинично неустано­
вени форми между двете групи и др. С т е ­
п е н т а на припокриване е мярка за диагнос­
т и ч н а т а с т о й н о с т на даден показател, т . е .
за в ъ з м о ж н о с т т а му да разграничава нали­
чие или о т с ъ с т в и е на дадено заболяване. Съ-
фиг. 4.2Н. Разпределение на р е з у л т а т и т е при
здрави и болни
Защрихованата зона показва припокриване на резул­
т а т и т е . При стесняване на р е ф е р е н т н а т а граница
(отсечка А) се увеличава д е л ъ т на истински положи­
т е л н и т е р е з у л т а т и (ИП) - висока чувствителност, а
при разширяване на референтния о б х в а т (отсечка Б)
се увеличава д е л ъ т на истински о т р и ц а т е л н и т е ре­
з у л т а т и (ИО) - висока специфичност
115
о т н о ш е н и е т о межаду ИП, ИО, ЛП u ЛО
р е з у л т а т и позволяВа и з ч и с л я Н а и е т о
на индекси. Те д а б а т В ъ з м о ж н о с т з а
о ц е н к а н а < л и а г н о с т и ч н а т а надеж,-
н о с т ч р е з о п р е д е л е н и к р и т е р и и , улес­
н я в а щ и и з б о р а н а п о д х о д я щ и л абора­
т о р н и п о к а з а т е л и п р и к о н к р е т н о за­
боляване.
П о с л е д о в а т е л н о с т т а при проучване на
д и а г н о с т и ч н а т а н а д е ж д н о с т н а дадено ла­
б о р а т о р н о изследване при к о н к р е т н о забо­
ляване обхваща няколко е т а п а :
• у т о ч н я в а н е н а д в е т е групи лица - здрави
лица или п а ц и е н т и без проучваното забо­
ляване, напр. миокарден и н ф а р к т и болни
с доказан чрез други м е т о д и и н ф а р к т н а
миокарда;
• включване н а получените р е з у л т а т и о т
изследването в ч е т и р и к л е т ъ ч н а т а б л и ц а ,
с ъ о т в е т н о брой н а ИП, ИО, ЛП и ЛО;
• изчисляване к р и т е р и и т е н а диагностич­
н а т а надежност;
• п о с т р о я в а н е н а ROC криви.
ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА КРИТЕРИИТЕ
НА ДИАГНОСТИЧНАТА НАДЕЖНОСТ
Д и а г н о с т и ч н а т а н а д е ж н о с т на един клинич-
но-лабораторен т е с т при определено забо­
ляване зависи о т две условия:
1. Разпределението н а р е з у л т а т и т е о т оп­
ределянето му при лица без и с наличие
н а т о в а заболяване;
2. О т р а з г р а н и ч и т е л н а т а с т о й н о с т н а
т е с т а , определяща абнормални нива.
Д и а г н о с т и ч н а ч у в с т в и т е л н о с т . Диаг­
ностичната чувствителност е вероят­
н о с т т а (в %) даден р е з у л т а т да е положи­
т е л е н , к о г а т о е налице заболяването, з а чи­
я т о диагноза т о й е предназначен. Изчисля­
ва се по ф о р м у л а т а :
Диапюсгичиа ПИ
чувствителност (%) х 100
ИП + ЛО
Д и а г н о с т и ч н а с п е ц и ф и ч н о с т . Диагнос­
т и ч н а т а специфичност е в е р о я т н о с т т а (в
%) даден п о к а з а т е л да е о т р и ц а т е л е н сред
индивидите без заболяването, з а ч и я т о ди­
агноза т о й е предназначен. Тя се изчислява
116
по с л е д н а т а формула:
Диипюстична ИО
спсцифичност (%) = х 100
ИО + ЛИ
Д и а г н о с т и ч н а е ф е к т и В н о с т . Диагнос­
т и ч н а т а ефективност отразява вероят­
н о с т т а (в %), с к о я т о при използване н а оп­
ределен т е с т може да се постигне правил­
но насочване към д и а г н о з а т а к а к т о при на­
личие, т а к а и при о т с ъ с т в и е на дадено за­
боляване. Д и а г н о с т и ч н а т а е ф е к т и в н о с т
представлява отношение н а общия брой вер­
ни р е з у л т а т и спрямо общия брой изследва­
ни п а ц и е н т и :
ИП + ИО
Диа1 п о с т ч п а
сфекппшос г (%)
х 100
ИП + ИО + ЛП + ЛО
НредсказВащи с т о й н о с т и . Те определят
с п о с о б н о с т т а на получените р е з у л т а т и
правилно да о т р а з я в а т наличието или о т ­
с ъ с т в и е т о н а дадено заболяване съобразно
ч е с т о т а т а му в изследваната популация.
ИолоЖителната предсказваща
с т о й н о с т (11+) показва каква е в е р о я т ­
н о с т т а (в %) даден п а ц и е н т , ч и й т о лабора­
т о р е н р е з у л т а т е патологичен, да и м а в
д е й с т в и т е л н о с т д а д е н о т о заболяване:
ИП
(П+) % = X 100
ИП + ЛП
Отрицателнат а предсказваща
с т о й н о с т (II-) показва в е р о я т н о с т т а (в
%) дадено лице с о т р и ц а т е л е н р е з у л т а т да
н я м а заболяването, к о е т о изключваме:
ИО
(П-) % = X 100
ИО + ЛО
В р у т и н н а т а п р а к т и к а н а клиничните
лаборатории посочените к р и т е р и и рядко се
о п р е д е л я т и използват, но т е т р я б в а да се
п о зн ават. Критериите на диагностичната
надежност на определен показател винаги
се отнасят само за конкретно заболяване.
Възможно най-висока ч у в с т в и т е л н о с т
(близо 100%) н а даден лабораторен т е с т е
ж е л а т е л н а при сериозни, но лечими заболя­
вания, з а да не се п р о п у с н а т (напр. феохро-
м о ц и т о м , хипотиреоидизъм).
Възможно най-висока специфичност е не­
обходима, к о г а т о т р я б в а да се диагности­
цира т е ж к о и т р у д н о лечимо (или неличимо
засега) заболяване (напр. някои злокачест-
вени заболявания).
Възможно най-висока е ф е к т и в н о с т (висо­
ка ч у в с т в и т е л н о с т и с п е ц и ф и ч н о с т ) с е
изисква при т е ж к и заболявания, ч и е т о ле­
чение е съпроводено със сериозни странич­
ни прояви. В т о з и случай к а к т о лъжливо по­
л о ж и т е л н и т е , т а к а и лъжливо о т р и ц и т е л -
н и т е р е з у л т а т и и м а т еднакво т е ж к и пос­
ледствия за п а ц и е н т а .
ROC К Р И В И
С п о с о б н о с т т а на даден показател да разг­
раничава наличието или о т с ъ с т в и е т о на за­
боляване чрез използване на определена кри­
т и ч н а с т о й н о с т може да се представи гра­
фично чрез т ъ й нар. receiver-operating char­
acteristic (ROC) крива. Последната се п о с т ­
роява к а т о на а б с ц и с а т а на координатна
с и с т е м а се нанася ч е с т о т а т а на лъжливо
п о л о ж и т е л н и т е р е з у л т а т и , а на о р д и н а т а -
т а - ч е с т о т а т а на истински положител­
н и т е р е з у л т а т и . Точките на к р и в а т а съ­
о т в е т с т в а т на ч е с т о т а т а на лъжливопо-
л о ж и т е л н и т е р е з у л т а т и при използване на
различни критични с т о й н о с т и за разграни­
чаване наличието или о т с ъ с т в и е т о на за­
боляване. Точката о т кривата, к о я т о е най-
близко до горния ляв ъгъл на координатна­
т а с и с т е м а с ъ о т в е т с т в а на к р и т и ч н а т а
Дял па ПО
(специфичност)
0.8 0.4
Г-.
^ S
*^
f 5г
(•4
0.4 0.8
Лял па ЛИ
(песпецифичпост)
Фиг. 4.29. ROC-криви
Крива Л сьотвотспШа на лабораторен показател с доб­
ро разграничаване между болни и здрави, а крива Б - на
такъв, при който разграничаването е недостатъчно,
т.е. т о й не дава полезна диагностична информация.
с т о й н о с т , при ч и е т о използване се п о с т и ­
га най-голяма диагностична т о ч н о с т , респ.
е ф е к т и в н о с т на показателя. Колкото по-
добре се различават д в е т е състояния, т о л ­
кова по-отдалечена е кривата о т ъглополо-
в я щ а т а , т . е . п р о с т р а н с т в о т о под ROC кри­
в а т а е по-голямо (фиг 4.29).
При неправилно подбрана разграничител­
на с т о й н о с т или се пропускат болни (при
разширен референтен интервал), или е не­
обходимо провеждане на допълнителни изс­
ледвания за разграничаване на ИП резулта­
т и при с т е с н е н а референтна област, кое­
т о оскъпява проучването.
РЕфЕРЕНТНМ СТОЙНОСТИ
М ГРАНИЦИ НА РЕФЕРЕНТНАТА
ОБААСТ
К. Ц а ч с в
При тълкуване на получените р е з у л т а т и
обикновено т е се сравняват с предварител­
но определени референтни с т о й н о с т и или
референтна област. Този е т а п в процеса на
клинично-лабораторното изследване повли­
ява директно к а ч е с т в о т о на р е з у л т а т и т е .
Използването на ненадеждни референтни
с т о й н о с т и може да компрометира качест­
в о т о на проведеното изследване, независи­
мо че преданалитичният и аналитичният
е т а п о т г о в а р я т на всички критерии за ка­
чество. Изграждането на референтни с т о й ­
н о с т и е отговорна, скъпа и трудоемка ра­
§ б о т а . С т а н о в и щ е т о , че всяка лаборатория
т р я б в а да изработва собствени референт­
ни с т о й н о с т и за всички анализирани пока­
з а т е л и не е оправдано, т ъ й к а т о понастоя­
^ щем прилагането на м е т о д и с висока ана­
а:
литична надеждност, к а к т о и с т а н д а р т и ­
з и р а н е т о им в международен план чрез сер­
тифицирани калибрационни материали да­
ва възможност да се използват общи рефе­
р е н т н и с т о й н о с т и . Собствени за лаборато­
р и я т а референтни с т о й н о с т и съобразно об­
служвания болничен к о н т и г е н т се препоръч­
в а т само за ограничен брой показатели,
напр. нововъведени или такива, отличава­
щи се с генетична х е т е р о г е н н о с т .
117
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НА ПОНЯТИЕТО
И ВИДОВЕ РЕФЕРЕНТНИ СТОЙНОСТИ
Референтните стойности са резултати за
даден лабораторен показател, получени от
изследването на един индивид или група ин­
дивиди при точно описани условия за полу­
чаването илг (подбор на индивидите, начин
на вземане на материала за изследване, х а ­
рактеристика на използваните методи, на­
чин на статистическа обработка и пр.).
Р а з л и ч а в а т се главно два вида р е ф е р е н т -
ни с т о й н о с т и - индивидуални и групови (по-
пулационни). И н д и в и д у а л н и т е рсфсрси-
т н и с т о й н о с т и се п о л у ч а в а т чрез с т а ­
т и с т и ч е с к а о б р а б о т к а н а с т о й н о с т и , по­
лучени о т същия индивид, к о г а т о moü е бил
в с ъ с т о я н и е н а доказано добро здраве. Гру­
повите (популационни) референтни
с т о й н о с т и се п о л у ч а в а т чрез с т а т и с т и ­
ческа о б р а б о т к а на р е з у л т а т и , получени о т
група р е ф е р е н т н и индивиди и к о г а т о се го­
вори най-общо за р е ф е р е н т н и и н т е р в а л и се
подразбира т о з и вид р е ф е р е н т н и стойнос­
ти.
П о д б о р п а р е ф е р е н т н а т а г р у п а . Явфе-
р е н т н и т е индивиди са лица, подбрани съоб­
разно т о ч н о определени к р и т е р и и , к о и т о
включват в ъ з р а с т , пол, начин на вземане н а
м а т е р и а л а за изследване, здравословно със­
т о я н и е н а индивида и др.
Подборът н а р е ф е р е н т н и т е индивиди мо­
же да бъде директен и индиректен. При ди­
р е к т н и я подбор т е се п о д б и р а т съобразно
предварително определени к р и т е р и и и т о ­
ва е начина, к о й т о се препоръчва о т Меж­
д у н а р о д н а т а федерация по клинична лабо­
р а т о р и я (IFCC). Н е д о с т а т ъ к на т о з и на­
чин е н е г о в а т а т р у д о е м к о с т и висока цена.
При индиректния подбор се използват с т о й ­
н о с т и , получени о т ежедневното р у т и н н о
изследване н а болничния к о н т и г е н т . Този
начин се основава н а наблюдението, че по-
г о л я м а т а ч а с т о т ежедневно получаваните
в л а б о р а т о р и я т а р е з у л т а т и са „нормални".
Чрез с ъ о т в е т н а с т а т и с т и ч е с к а о б р а б о т ­
к а о т т е з и „нормални" р е з у л т а т и се опре­
д е л я т р е ф е р е н т н и т е с т о й н о с т и и граници­
т е н а р е ф е р е н т н а т а област. К а к т о вече се
подчерта надеждни референтни с т о й н о с т и
се получават при д и р е к т е н подбор н а рефе­
р е н т н и т е индивиди, к о й т о начин е д и н с т ­
118
вено се препоръчва о т IFCC.
Задължителнен първи етап при опреде­
л я н е т о н а референтни с т о й н о с т и т р я б в а
винаги да бъде събиране н а информация за
и з т о ч н и ц и т е н а вариация н а дадения пока­
з а т е л . Редица ф а к т о р и н а биологичната ва­
риация м о г а т да се к о н т р о л и р а т чрез с т а н ­
д а р т и з и р а н е начина н а подготовка н а ре-
ф е р е н т н и я индивид и в з е м а н е т о н а м а т е ­
риала з а изследване. Други ф а к т о р и н а био­
л о г и ч н а т а вариация к а т о пол, в ъ з р а с т , се
к о н т р о л и р а т чрез използването им к а т о
к р и т е р и и за подразделяне н а референтна­
т а група.
Случайният подбор н а р е ф е р е н т н и т е ин­
дивиди е най-добрия начин на подбор, но н а
п р а к т и к а т о в а не винаги е възможно. Пай-
ч е с т о използваните общи к р и т е р и и за изк­
лючване при подбора н а р е ф е р е н т н и т е ин­
дивиди са:
• наличие н а заболяване;
• рискови ф а к т о р и ;
• затлъстяване;
• хипертония;
• професионални вредности и вредности о т
о к о л н а т а среда;
• г ен ети чн и рискови ф а к т о р и ;
• л е к а р с т в а и фармакологично а к т и в н и ве­
щества;
• л е к а р с т в е н а т е р а п и я н а дадено заболява­
не;
• орални к о н т р а ц е п т и в н и средсва;
• наркомания;
• злоупотреба с алкохол;
• тютюнопушене;
• специфични физиологични с ъ с т о я н и я (бре­
м е н н о с т , л а к т а ц и я , мензис и др.);
• стрес;
• прекомерно физическо обременяване.
Тези к р и т е р и и задължително т р я б в а да
се д о п ъ л в а т с други к р и т е р и и съобразно из­
следвания п о к а з а т е л и н е г о в а т а биологич­
н а вариация.
П о д р а з д е л я н е п а р е ф е р е н т н а т а група.
Пай-често използваните к р и т е р и и за под­
разделяне на р е ф е р е н т н а т а група са пол и
в ъ з р а с т , но е възможно използването и н а
други критерии. По принцип подразделяне-
mo т р я б в а g a бъде no в ъ з м о ж н о с т минимал­
но, з а д а не се н а м а л и б р о я т н а и н д и в и д и т е
в о т д е л н и т е групи. В п р о т и в е н случай оп­
ределянето н а р е ф е р е н т н и т е с т о й н о с т и Събиране на
с т а в а много т р у д о е м к о и скъпо. референтните етойноети

Групиране на
С т а н д а р т и з и р а н е в з е м а н е т о н а био­ референтните стойности
логичен м а т е р и а л и и з с л е д в а н е т о м у . (ако е необходимо)

Всички е л е м е н т и н а п р е д а н а л и т и ч н и я е т а п
11роверка на вида
т р я б в а д а б ъ д а т по в ъ з м о ж н о с т еднакви на разпределение
к а к т о при определяне н а р е ф е р е н т н и т е
с т о й н о с т и , т а к а и при изследване н а паци­ Откриване и отстраняване
на рязко отклоняващи се
е н т и т е в е ж е д н е в н а т а п р а к т и к а . Следова­ стойности
т е л н о т р я б в а д а се с т а н д а р т и з и р а т , респ.
к о н т р о л и р а т с а м о т е з и ф а к т о р и , при кои­ Избор на статистически
метод
т о т о в а с т а в а с р а в н и т е л н о лесно. С т е п е н ­
т а н а п р е д а н а л и т и ч н а в а р и а ц и я е различна
з а р а з л и ч н и т е п о к а з а т е л и . Това означава, че Интуитивна оценка
следва д а се к о н т р о л и р а т т е з и ф а к т о р и , ко­
и т о п о в л и я в а т к о н к р е т н и я изследван пока­
з а т е л . О т друга с т р а н а обикновено се из­
следва не един, а няколко п о к а з а т е л я едно­
временно. З а т о в а т р я б в а д а се използва об­
1j e 1a pа м е jjniче н м ст рд
щ а схема н а с т а н д а р т и з а ц и я .
При определяне н а р е ф е р е н т н и с т о й н о с ­
т и т р я б в а д а б ъ д а т т о ч н о определени и
описани: Jla pa метр11 чен м етрл
• използвания а н а л и т и ч е н м е т о д ( а п а р а т у ­
ра, р е а к т и в и , к а л р и б р а т о р и , начин н а из­ I"аусово разпределение?
числение и др);
• качествен контрол (вътрелабораторен и Трансформация на
в ъ н ш н а оценка н а к а ч е с т в о т о ) ; данните

• х а р а к т е р и с т и к а н а а н а л и т и ч н а т а на­
1[араметрично
деждност на метода. определяне

О п и с а н и е т о т р я б в а т а к а д а бъде н а п р а ­
вено, че и з с л е д в а н е т о д а м о ж е лесно д а се
възпроизведе.
С т а т и с т и ч е с к а о б р а б о т к а на рефе­
р е н т н и т е с т о й н о с т и и определяне
границите на р е ф е р е н т н а т а област.
Н а фиг. 4.30 е п р е д с т а в е н а л г о р и т ъ м а н а
препоръчания о т IFCC м е т о д з а с т а т и с т и ­
ческа о б р а б о т к а н а р е ф е р е н т н и т е с т о й н о с ­
т и и определяне н а г р а н и ц и т е н а референ­
т н а т а о б л а с т . Този а л г о р и т ъ м лежи в ос­
н о в а т а н а р а з р а б о т е н а т а о т Solberg прог­
р а м а IIEFVAL з а с т а т и с т и ч е с к а о б р а б о т ­
ка н а с ъ б р а н и т е р е ф е р е н т н и с т о й н о с т и и
определяне г р а н и ц и т е н а р е ф е р е н т н а т а об­
ласт.
ia проверка вида н а разпределението
( к""'1 )
ф и г . 4.30. Алгоритъм на препоръчания о т IFCC
м е т о д за определяне г р а н и ц и т е на референт­
н а т а област
( с т ъ п к а 3 ) с е използва п о с т р о я в а н е н а хис­
т о г р а м и , т е с т о в е т е н а Коллюгоров-Смир-
нов, Anderson-Darling, Cramer von Mises и ко­
е ф и ц и е н т и т е н а а с и м е т р и я и ексцес. При
Гаусово разпределение н а р е з у л т а т и т е не­
о б х о д и м и я т м и н и м а л е н брой р е ф е р е н т н и
с т о й н о с т и , респ. р е ф е р е н т н и индивиди е 40,
а при негаусово - 120.
З а о т к р и в а н е и о т с т р а н я в а н е н а рязко
о т к л о н я в а щ и т е се с т о й н о с т и (стъпка 4)се
използва визуална оценка н а х и с т о г р а м а т а
119
u съответни математически тестове.
И з б о р ъ т н а с т а т и с т и ч е с к и м е т о д за оп­
ределяне н а р е ф е р е н т н и т е граници (стъп­
ка 5) се определя о т вида н а разпределение­
т о . При Гаусово разпределение се прил аг а
направо парсшетричен метод (вариационен
анализ). При негаусово разпределение се из­
вършва трансформация на д а н н и т е чрез из­
ползване на експоненциална и м о д у л н а фун­
кция за корекция на а с и м е т р и я т а и ексце­
са. При нормализиране н а разпределението
след т р а н с ф о р м а ц и я т а , доказано с т е с т а
н а Anderson-Darling и к о е ф и ц и е н т и т е н а
а с и м е т р и я и ексцес, се прилага параметри-
чен метод, а в п р о т и в н и я случай - непара-
м е т р и ч е н метод.
КНИГОПИС
Л а м б р с в а ЛГ. Въ'зможности за о ц е н к а е ф е к т и в н о с т т а на о с ­
новни програми за качествен контрол н а клинично-лабора-
т о р н и т е резултати в НРБ. Д и с е р т а ц и я з а п р и с ъ ж д а н е н а
научната степен " к а н д и д а т н а медицинските науки", 1988,
София, М А .
Цачев КН. Референтни г р а н и ц и н а селен, цинк, мед, желязо и
магнезий в кръвен с е р у м и а м н и о т и ч н а т е ч н о с т и и н ф о р ­
мативното и м с ъ д ъ р ж а н и е п р и някои злокачествени забо­
лявания. Л в т о р е ф е р а т н а д и с е р т а ц и я за п р и с ъ ж д а н е н а на­
учната степен "кандидат н а медицинските науки", 1987, С о ­
фия, М Л .
Anderson SC, Cockayne S: Clinical Chemistry. Concepts and ap­
plications, Philadelphia etc, W B Saunders Company, 1993.
Burtis C A , A s h w o o d ER, Tietz IN (ed). Text Book o f Clinical
Chemistry ( l * ed). 1994, 3 8 3 - 5 2 5 .
Bultner J. T h e Need for Accuracy in Laboratory Medicine. E u r J
Clin C h e m Clin Biochem, 33, 1995, 981-988.
Cembrowski G S , Carey RN. Consideration for the implementa­
tion o f clinically derived quality control procedures. Lab M e d ,
20, 1989, 400-405.
Cembrowski GS, Carey RN. Laboratory quality management, C h i ­
cago, A S C P Press, 1989.
Garber C C , Carey RN. Evaluation o f methods. In: Kaplan L A and
Pesce AJ (eds). Clinical Chemistry. St Louis - Baitimor, C.V.
Mosby Company, 1995, 4 0 2 - 4 2 3
Kahh SE, Jandreski, M. Laboratory Statistics. In: Kaplan L A and
Pesce AJ (eds). Clinical Chemistry. St. Louis - Baltimor, C.V.
Mosby Company, 1995, 3 4 2 - 3 6 3
Keller H. K l i n i s c h - c h e m i s c h e l a b o r d i a g n o s t i k f u r die p r a x i s .
Analyse, Befund, Interpretation (2 auf) 1. Sttutgart G.Thieme,
4, 1991.
Libeer JCP. External quality assessment in clinical laboratories,
European perspectives: today and tomorrow. Thesis, Antwerpen,
1993
Passey RB. Quality control for the clinical chemistry laboratory.
120
ИзползВаие н а р е ф е р е н т н и т е с т о й ­
н о с т и . Р е з у л т а т ъ т , получен о т клинично-
лабораторно изследване н а даден п а ц и е н т ,
се оценява чрез сравняване с р е ф е р е н т н и т е
с т о й н о с т и . К л и н и ц и с т ъ т т р я б в а да разпо­
лага с възможно най-подробна информация
з а начина н а определяне н а р е ф е р е н т н и т е
интервали. Това може да с т а н е к а т о рефе­
р е н т н и т е с т о й н о с т и заедно с необходима­
т а информация з а т я х се и з д а д а т в малка
книжка или са заложени в база данни за ин-
т р а н е т . Опростен, но добър начин е предс­
т а в я н е т о на р е ф е р е н т н и т е с т о й н о с т и н а
с ъ о т в е т н а т а р а з п е ч а т к а (или лабораторен
фиш) с р е з у л т а т и т е н а п а ц и е н т а . При из­
ползване н а л а б о р а т о р н а информационна
с и с т е м а (ЛИС) може да се извърши и а в т о ­
м а т и з и р а н а оценка н а р е з у л т а т и т е н а па­
ц и е н т а , придружена със с ъ о т в е т е н комен­
тар.
In: Kaplan L A and Pesce A J (eds). Clinical Chemistry. St Louis
- Baltimor. Mosby Company, 1995, 382- 401.
Petersen P H . Ricos C. and al. Proposal guidelines for the internal
quality control o f analytical results in the medical laboratory.
Eur J Clin C h e m Clin Biochem, 3 4 1996, 983-989.
Ricos C and al. Current databases on biological variation: pros,
c o n s and progress. Scand J Clin Lab Invest, 59, 1999,491-500.
Rohle G , Siekmann L. Quality assurance o f quantitative determi­
nations. In: T h o m a s L (ed). Clinical laboratory diagnostics.
Frankfurt/Main, T H - B o o k s Verladsgesellchaft, 1998, 1393-
1400.
S t a m m D. D e r analytische teilschritt und seine Zuverlässigkeit.
Westgard J Q and Klee JG. quality management. In: Tietz N (ed).
Text Book o f clinical chemistry, 1994, 548-578.
W H O . Basics o f Quality Assurance. Geneva: World Health Orga­
nization, 1992, 126-127.
* * *
Deutshe forschungsgemeinschaft М А К - und BAT-werte liste 1995.
Maximale arbeitsplatzkonzentrazionen und biologische
arbeitsstofftoleranzwerte. Weinheim, Verlag Chemie, 1995.
Grafmeyer D, Bondon M . M a n c h o n M. Levillain P. T h e influence
o f bilirubin, haemolysis and turbidity o n 2 0 analytical tests per­
formed on automatic analyzers. E u r J Clin C h e m Clin Biochem
33, 1995, 31-52.
Greiling II. Gressner A M . Lehrbuch d e r klinischen chemie und
p a t h o b i o c h e m i e (З"1 cd). Stuttgart - N e w York, Schattauer-
Verlag, 1995.
G u d e r W G , Narayanan S, Wisser H , Zawta B. Samples: from the
patient to the laboratory. T h e impact o f preanalytical variables
o n the quality o f laboratory results. Darmstadt, G I T Verlag
GmbH.
Heins M . Heil W, Withold W. Storage o f serum o r whole blood
samples. Effects o f time and temperature o n 22 serum analytes.
Eur J Clin C h e m Clin Biochem, 35. 1995, 231-238.
Lob W S . Robotic transportation. Clin C h e m . 36. 1990,1544-1550.
 Акредитация на
клиничните лаборатории
Добра лабораторна п р а к т и к а

АКРЕДИТАЦИЯ НА
че о б щ е с т в о т о срещу заделените с р е д с т в а
КЛИНИЧНИТЕ ЛАБОРАТОРИИ може д а р а з ч и т а н а медицински услуги с
доказано високо к а ч е с т в о . Въз основа на
Т. Ш и п к о в а к р е д и т а ц и я здравното заведение (респек­
Д. С в и п а р о в т и в н о клиничната лаборатория) може да
Т. Ц в е т к о в а м о т и в и р а обществено признание, к о е т о не
С. Д а п с в само може да даде право за обучение (напр.
на с т у д е н т и ) , но и за заслужено по-висока
СЪЩНОСТ НА АКРЕДИТАЦИЯТА с т о й н о с т на предлаганите услуги.
За извършване на а к р е д и т а ц и я е необхо­
Т е р м и н ъ т а к р е д и т а ц и я произхожда о т димо изграждане на организация, к о я т о да
л а т и н с к и - c r e d e r e = вярвам, доверявам се. я провежда. По принцип т а з и организация
Според м е ж д у н а р о д н а т а о р г а н и з а ц и я з а не т р я б в а да бъде т е ж к а и бюрократична и
с т а н д а р т и з а ц и я (International Oranization т р я б в а да включва висококвалифицирани
for Standardization) в ISO/IEC Guide 2 a k p e - специалисти по клинична лаборатория. Въз­
д и т а ц и я т а c процедура, чрез която можно е да бъде администрирана о т дър­
авторитетна организация издава ж а в а т а или да бъде професионална органи­
официално признание, че д а д е н а гру­ зация. Във всеки случай и с к а щ о т о акреди­
п а хора (дадена личност) е колтетен- т а ц и я здравно звено т р я б в а да з а п л а т и
т н а д а извършва специфична дей­ р а з н о с к и т е направени във връзка с т о в а .
н о с т . В здравеопазването а к р е д и т а ц и я - А к р е д и т а ц и я т а т р я б в а да осигурява пови­
т а означаНа п р о ф е с и о н а л н о и н а ц и о ­ шаване, респ. поддържане на високо равни­
н а л н о п р и з н а н и е н а з б е н а , к о и т о оси- ще на медицинските услуги и защищаване
г у р я В а т к а ч е с т В е н и здраВни д е й н о с ­ и н т е р е с и т е на о б щ е с т в о т о . Акредитаци-
т и . А к р е д и т а ц и я т а по принцип предпола­ о н н а т а организация приема и о б р а б о т в а
га доброволно изискана преценка с п р я м о з а я в к и т е за акредитиране, организира оце­
високи професионални с т а н д а р т и и призна­ нъчни посещения, подготвя и предоставя
ние за с ъ о т в е т с т в и е в з н а ч и т е л н а с т е п е н инспекционните протоколи. Необходимо е
с т е з и с т а н д а р т и . Спорен е въпроса, дали да се осигури възможност за а р б и т р а ж при
а к р е д и т а ц и я т а т р я б в а непременно да бъде възникване на различна професионална оцен­
доброволна. О п и т ъ т е показал, че след пре­ ка за дадена с и т у а ц и я о т с т р а н а на инс­
одоляване н а п ъ р в о н а ч а л н а т а несигурност, п е к т о р и т е и п р е д с т а в и т е л и на обследва­
след к а т о се наложи с т а н о в и щ е т о , че н я м а н а т а лаборатория. С ъ щ е с т в у в а т два под­
нищо с т р а ш н о в добре организирана акре- хода за срок н а а к р е д и т а ц и я т а - за фикси­
д и т а ц и о н н а схема, в редица с т р а н и се въз­ ран срок о т напр. 5 години или за к р а т ъ к
приема задължителна акредитация. В край­ срок напр. 2 години при лаборатории, кои­
на с м е т к а о т а к р е д и т а ц и я т а са з а и н т е ­ т о и м а т проблеми при осигуряване на не­
ресовани к а к т о о б щ е с т в о т о , т а к а и здрав­ обходимите с т а н д а р т и и по-дълъг период -
н и т е заведения. А к р е д и т а ц и я т а означава. напр. 6 години при „отличниците".
М п т с р и а л ъ т представлява п р е р а б о т к а па п р о е к т за акредитация па българските клипичпи лаборатории представен на 6
BCLF Meeting, Пловдив - 1998 (11). П р о е к т ъ т имаше за цел да създаде в ъ з м о ж н о с т з а авангардно приближаване на клинични­
т е лаборатории към с в е т о в н и т е с т а н д а р т и . Предлаганите с т о к и и услуги (включая медицинските) в р а з в и т и т е с т р а н и се
предлагат с декларирано качество. Това г а р а н т и р а н о качество се осигурява чрез акредитация. За съжаление бюрократична-
т а м у д н о с т о т л о ж и о с ъ щ е с т в я в а н е т о на п р о е к т а .

121
КРИТЕРИИ НЛ АКРЕДИТАЦИЯТА.
АКРЕДИТАЦИОНЕН ВЪПРОСНИК
А к р е д и т а ц и я т а предполага п р е д о с т а в я н е
н а п р о в е ж д а щ а т а организация, респ. н а об­
щ е с т в е н о с т т а н а о б ш и р н а информация. В
значителна степен процесът на акредити­
р а н е м о ж е д а бъде о п р о с т е н с и з г о т в я н е н а
а к р е д и т а ц и о н е н въпросник, к о й т о д а под­
помогне п о д г о т в я н е т о и п р е д с т а в я н е т о н а
н е о б х о д и м а т а информация. Д о к о л к о т о кли­
н и ч н и т е л а б о р а т о р и и се р а з л и ч а в а т в з н а ­
ч и т е л н а с т е п е н в з а в и с и м о с т о т вида и
о б х в а т а н а и з в ъ р ш в а н и т е изследвания, н а
персонала и н а л и ч н а т а а п а р а т у р а и пр. в
някои с т р а н и се п р е д л а г а т различни акре-
д и т а ц и о н н и въпросници (вж. т а б л . 5.1 - 5.8).
Всеки въпросник т р я б в а д а осигури т о ч н о
дефинирана и н ф о р м а ц и я о т н о с н о организа­
цията и ръководството на лабораторията;
не йната структу ра и местоположение,
щат, налична апаратура; видовете анали­
зи; ползваните методики (с подробно опи­
сание на техниката на изпълнение); осигу­
рената безопасност за пациентите и пер­
сонала; начина на вземане и съхраняване на
биологи чните материали; сроковете за пре­
доставяне на резултатите и съхраняване­
то на тези резултати и за внедрената сис­
тема за качество.

Т а б л и ц а 5.1. Ръководство на л а б о р а т о р и я т а
Име, бащино, Специалност
No Длъжност Придобита Забележка
презиме Квалификация
1 Ръководител
2 Заместник
3 Cm. лаборант
4 Заместник

Т а б л и ц а 5.2. Обем на извършваната дейност

Извършени л а б о р а т о р н и изследвания
Година
Клинично-хим. Хематологични Уринни и други Общо
1995
1996
1997

Т а б л и ц а 5.3. Организация, с т р у к т у р а и местоположение

а. Лабораторията е ч а с т о т държавно (общинско) здравно заведение
б. Лабораторията е кооперативно здравно заведение
в. Лабораторията е ч а с т н а
а. Лабораторията е единно звено с общо ръководство
б. Лабораторията е изградена о т сектори, к а к т о следва

а. Лабораторията е разположена в с г р а д а т а на
(здравно заведение)
б. Лабораторията е разположена в отделна сграда ; ул No
град (комплекс)
Разположена е в помещения, ползува обща (отделна) чакалня;
а. Обеззаразява о т п а д н и т е води/подава т в ъ р д и т е отпадъци в крематориум (да/не)
б. Ползва друг способ за обеззаразяване на потенцеално инфекциозните оптадъчни
материали (описва се).
Попълващият следва да даде отговор на всеки въпрос в таблиците.
При а л т е р н а т и в н и възможности се зачерква излишното.
122
Т а бл ица 5.4. Щ а т на лабораторията
Име, бащино,
No Длъжност Специалност Квалифи­ Трудов
презиме кация стаж *

• В графата трудов стаж се отбелязват продължително отсъстващи - напр. отпуск по майчинство и т. н.

Табл ица 5.5. Налична (използвана) апаратура*

Вид Фирма Година Наличен
анализатор производител на внос Годност**
сервиз
Клинично-химичен
Хематологичен
Коагулометър
Кръвно-газов
Йон-селективен
Друг
* В табл. 5.5. се посочват само полуавтоматични и автоматични анализатори, които осигуряват възможности за осъ­
ществяване анализите на съвременно ниво. При липса на такива анализатори извършващият инспекцията на място се
запознава сдругата налична апаратура.
** Напълно годен, подлежи на ремонт, амортизиран, негоден

Табл ица 5.6. Показатели анализирани в лабораторията

С п а з е н и ли с а п р е п о р ъ к и т е н а Е к с п е р т н и я с ъ в е т п о клинична л а б о р а т о р и я
з а о б е м а н а с ъ о т В е т н и я т и п л а б о р а т о р и и : ДА/НК

Клинично-химични
Фирма доставчик Потенциална
No Показател Принцип
Собств. производство токсичност
Jaffe, кинетичен без NaOH, пикринова
Ф
Креатинин Randox
обезбелтъчаване киселина

* IJpuMep
Хематологични
Фирма доставчик Потенциална
No Показател Принцип токсичност
Собств. производство
Калиев цианид,
Хемоглобин Хемиглобин цианиден Собствено производство детергент

* Пример
Упинни п о к а з а т е л и
фирма доставчик Потенциална
No Показател Принцип токсичност
Собств. производство
3% Сулфосалицилова Сулфосалицилова
Белтък в урината Собствено производство киселина
киселина

* Пример
JInvzu п о к а з а т е л и ( с п с и и а л и з и р а и и и з с л е я В а п и я )
Фирма доставчик Потенциална
No Показател Принцип Собств. производство токсичност
Ф
Тироксин (Т 4) ELISA Бьорингер Няма

* Пример
123
Т а б л и ц а 5.7. Осигурена безопасност 6 л а б о р а т о р и я т а за п а ц и е н т и и персонал
С п р я м о п о т е н ц и а л н а В р е д н о с т о т биологичен м а т е р и а л
Дейност Профилактични мерки Да Не
Вземане на кръв Затворена с и с т е м а
Ползване на ръкавици
Ваксинация срещу HBV
Вземане на урина Еднократни чаши
Отделяне на серум, плазма Автоматични п и п е т и
Пренасяне на серум, плазма Автоматични п и п е т и
Спрямо потенциална Вредност о т реактиВи*
Токсично ВещеетВо Профилактични мерки Начин н а д е й с т В и е
Натриев азид (съдържа се к а т о При попадане върху лигавици или кожа -
Незабавно, на м я с т о !
консервант в редица реактиви) обилно проплакване с вода
При попадане върху лигавици или кожа -
Живачен н и т р а т Незабавно, на м я с т о !
обилно проплакване с вода
При попадане върху лигавици или кожа -
Калиев цианид, д е т е р г е н т и Незабавно, на м я с т о !
обилно проплакване с вода
* Пример

Т а б л и ц а 5.8. С и с т е м а за осигуряване к а ч е с т в о т о н а л а б о р а т о р н а т а д е й н о с т

Вътрелаборатореи качествен контрол*

Налична
Група п о к а з а т е л и Н а ч и н н а проВе^кдане Контролен материал документация
Клинично химични С всяка серия Прецинорм и преципат О т м. януари 1997
Хематологични Ежеседмично Кръв о т пациенти О т м. април 1997
Уринни Не се провежда v -

Специализирани При всяко калибриране Биорау О т м. м а р т 1998

* Пример
Задължително се представя п ъ л н а д о к у м е н т а ц и я за вътрелаб. качествен контрол (качествено-контролна книга).

Външна о и е н к а н а к а ч е е т В о т о *
Налична
Група п о к а з а т е л и Начин н а проВеждане Системно участие о т : документация
Клинично химични Българска НСБОК О т м . м а р т 1996 О т м.януари 1997
Хематологични Българска НСБОК О т м.януари 1998 О т м.януари 1998
Уринни Не участвува - -

Специализирани Не участвува - -

• Пример
Задължително се представя п ъ л н а д о к у м е н т а ц и я за в ъ н ш н а т а оценка на качеството (качествено-контролна книга).

Други п а р а м е т р и н а к а ч е с т в о т о на л а б о р а т о р н а т а д е й н о с т *
Актуално Осъществявано Налична
Група п о к а з а т е л и документация
състояние подобрение
Срок на предаване р у т и н н и Лабораторен
6 часа 4 часа наръчник
изследвания
Срок на предаване р у т и н н и Лабораторен
изследвания 2 часа 90 м и н у т и наръчник
Обем на вземана кръв за Лабораторен
клин. химични изследвания 5 мл. 3 мл. наръчник
Обем н а вземана кръв з а Лабораторен
хематолог. изследвания 5 мл. 3 мл. наръчник
Системен к о н т р о л н а
Ме се провежда Провежда се Протокол
пипетиращи у с т о й с т в а
* Пример
Във връзка с този раздел задължително се представя "Наръчник за дейността н а к л и н и ч н а т а лаборатория" със сво-
беден текст, но с я с н о у к а з в а н е на задълженята н а лабораторията и тези н а консуматорите н а н е й н а т а продукция.
124
 Документацията на с и с т е м а т а за качес­
т в о трябва да бъде подробна и да бъде пре­
доставяна при поискване о т персонала на
лабораторията, ръководството на здравно­
т о заведение и инспектиращи органи със
с ъ о т в е т н и правомощия.
Основно м я с т о в процеса на акредитация
заема с и с т е м а т а за качество, к о я т о се съ­
поставя с международните изисквания за
„ д о б р а л а б о р а т о р н а п р а к т и к а " . Сис­
т е м а т а за осигуряване качеството на вся­
ка медицинска дейност е непрекъснат про­
цес. Toü т р я б в а да изгражда в персонала
с т р е м е ж за непрекъснато усъвършенства­
не. Примери за параметри, които подлежат
на подобряване са:
• срокът за предаване на резултатите (на-
люляване),
• броят на оплакванията от потребите­
ли (нальа^шване),
• обем на взетата за извършване на изслед­
вания кръв (псима-швапс),
• невъзпроизводимостта и неточността
на изследванията (па-ма-тванс) - напр.
чрез контролиране на използваните пипе-
тиращи устройства; качеството на пол­
званата вода и пр.
Подготвянето и издаването на наръчник
на клиничната лаборатория не само „кана­
лизира" о т н о ш е н и я т а с консуматорите на
лабораторни изследвания (пациентите, ка­
б и н е т и т е и клиничните звена), но и ще указ­
ва ясно сроковете за получаване (вземане)
на биологични материали и предаването на
р е з у л т а т и о т анализа, начина на съхраня­
ване на д о к у м е н т а ц и я т а и условията за
издаване на копия о т загубени бланки с ре­
з у л т а т и . Наръчникът също е съществена
съставка на акредитационния процес. При
възможност включва и предоставя инфор­
мация на консуматорите относно изслед­
ваните параметри, референтните им гра­
ници и гарантираната надеждност, к а к т о
и начина за валидиране на р е з у л т а т и т е о т
анализите.
ЕТЛИИ НА ПРОВЕЖДАНЕ
НА АКРЕДИТАЦИЯТА
В рамките на проекта се предвижда през
първия е т а п на акредитацията на клинич­
н и т е лаборатории в Република България да
се реализира б а з и с н а (начална) акреди­
т а ц и я . Лабораториите, които покриват
напълно изискванията ще б ъ д а т акредити­
рани за тригодишен срок.
Допуска се и възможност за частична
едногодишна акредитация при покриване на
най-съществените изисквания. За т а з и час­
тична акредитация съгласно препоръката
на е к с п е р т н а т а група утвърдена о т МЗ,
задължителен минимум представляват;
1. Завеждащ лабораторията със специал­
н о с т по клинична лаборатория.
2. Информация за изработените анализи о т
т р и предходни години.
3. Списък на анализираните показатели при
спазване на препоръките за необходим
обем според експертната група (МЗ) за
държавни лаборатории.
4. Прилагане на минимум мерки за сигур­
н о с т - затворени системи за вземане на
кръв, еднократни чашки за урина, авто­
матични пипети за отделяне на серум и
плазма.
5. Писменно указание за задължителни мер­
ки при попадане на токсични реактиви
върху лигавици или кожа.
6. Книга за качеството, която съдържа най-
малко тримесечни данни за вътрелабора-
торен качествен контрол за всички ана­
лизирани клинично-лабораторни показа­
тели.
7. Участие в Националната система за вън­
шна оценка на качеството, данни о т най-
малко един цикъл без да има повече о т 10%
отклоняващи се с повече о т 2 с т а н д а р т ­
ни отклонения о т консенсусната средна
на р е з у л т а т и т е .
8. Лабораторен наръчник, о т който да личи,
че има система за подобряване на качес­
т в о т о на извършваните медицински ус­
луги.
След тригодишната базисна акредита­
ция, с осигуряване на необходимата профе­
сионална информация се предвижда да започ­
не постепенно преминаване към акредити­
ране, което напълно да покрива изисквани­
я т а в ЕО. Както добре може да се разбере
о т материалите на IFCC-WordLab 99, със­
т о я л се през юни 1999 във Флоренция, сери­
озно се работи върху общи правила на акре­
д и т а ц и я т а за клиничните лаборатории в
125
с т р а н и т е о т о б щ н о с т т а . Съобщава се и
д о с т и г н а т о т о о т у н г а р с к и т е и чешки ла­
б о р а т о р н и лекари в т а з и насока.
В заключение м о г а т да се ц и т и р а т изво­
д и т е н а V. Palicka предложени н а форума във
Флоренция. С ъ щ е с т в у в а т т р и основни при­
чини з а а к р е д и т и р а н е н а клиничните лабо­
ратории:
1. П о л з а т а з а л а б о р а т о р и и т е - а к р е д и т а ц и -
я т а подкрепя по-добра с и с т е м а н а орга­
низация н а л а б о р а т о р и я т а и н е й н и т е
с т р у к т у р и . Т я внедрява с и с т е м а за оси­
гуряване н а к а ч е с т в о т о в ла б орат орн а­
т а дейност. Подобрява п о д г о т о в к а т а и
обучението н а л а б о р а т о р н и я персонал.
2. П о л з а т а за з д р а в е о п а з н а т а с и с т е м а - ак-
р е д и т а ц и я т а води до с т а н д а р т и з и р а н е
л а б о р а т о р н и т е дейности, к а т о позволя­
ва по-добра с р а в н и м о с т н а р а з у л т а т и т е
и вземане н а по-добри управленски реше­
ния, вкл. разпределение н а с р е д с т в а т а .
3. П о л з а т а за п о т р е б и т е л я - п а ц и е н т и т е .
Всички д о с т и ж е н и я н а л а б о р а т о р и я т а и
с и с т е м а т а н а здравеопазването се опол­
з о т в о р я в а т о т п а ц и е н т и т е . Това т р я б ­
ва да бъде о с н о в н а т а причина за въвежда­
не н а а к р е д и т а ц и я т а и всички правила и
разпоредби следва да б ъ д а т насочени к ъ м
благото на пациента.
ДОБРА ЛАБОРАТОРНА
ПРАКТИКА
Т. Ш и п к о в
Т. Ц в е т к о в а
Поради з н а ч и т е л н и я н е д о с т и г н а с р е д с т в а
в з д р а в н и т е заведения о т една с т р а н а , а о т
друга - б ъ р з о т о увеличаване и осъвременя­
ване н а м е т о д и т е в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о ­
рия, о т г о в о р н о с т и т е и д е й н о с т и т е н а кли­
н и ч н и т е лаборатории са подложени н а об­
съждане и контрол. Важно е да се провери и
оцени с т а н д а р т а н а д е й н о с т н а л а б о р а т о ­
р и и т е . Това може да се извърши с п о м о щ т а
н а правила, дефиниращи с т а н д а р т а Д о б р а
л а б о р а т о р н а п р а к т и к а * . Те са необхо-
* С и с т е м а на организация и условия, при к о и т о лабораторни­
т е изследвания се планират, изпълняват, к о н т р о л и р а т , до­
кументират и съхраняват
126
П о н а с т о я щ е м а к р е д и т и р а н е т о в Р. Бъл­
гария сравнително бързо навлиза в здравни­
т е заведения. По смисъла н а Наредба №1 н а
МЗ о т 27.04.2000 з а к р и т е р и и т е , п о к а з а т е ­
л и т е и м е т о д и к а т а н а а к р е д и т а ц и я на ле­
ч е б н и т е заведения з а болнична помощ и
диагностично-консултативните центрове
препоръките з а "базисна" а к р е д и т а ц и я са
напълно д о с т а т ъ ч н и .
Същевременно Б ъ л г а р с к а т а служба за ак­
р е д и т а ц и я към К о м и т е т а за с т а н д а р т и ­
зация и метрология създава в ъ з м о ж н о с т з а
ак р ед и ти р ан е н а л а б о р а т о р и я за и з п и т в а ­
не и/или калибриране в с ъ о т в е т с т в и е с всич­
ки изисквания н а ЕО. Всяка клинична лабо­
р а т о р и я (след к а т о подготви вн и мател н о
необходимата документация) може да кан­
д и д а т с т в а за национална акредитация. На­
ложително е ползването н а редица с т а н д а р ­
т и и указания (вж. книгопис към глава 5, о т
2 до 8), к а т о основно ръководство за под­
готвяне на д о к у м е н т а ц и я т а е детайлното
ръководство з а с ъ с т а в я н е наръчник по ка­
ч е с т в о т о . Тази а к р е д и т а ц и я създава пред­
п о с т а в к и за реализиране н а изискванията
към медицинските лаборатории според най-
ви со к и те съвременни критерии, но същев­
ременно изисква з н а ч и т е л н а подготовка и
"обемна" д о к у м е н т а ц и я .
дими н е с а л ю з а а к р е д и т и р а н е и к о н ­
т р о л н а д л а б о р а т о р и и т е , но изпълня­
в а т и р о л я т а на доброволен к о д е к с з а са-
лгодисциплина.
Първоначално т е з и правила бяха създаде- •
ни за аналитично-химичните лаборатории.
В Западна Германия т е придобиват законов
х а р а к т е р със закона за з а щ и т а о т опасни
в е щ е с т в а . Подобни правила бяха изготвени
във връзка с а к р е д и т а ц и я т а и т е с т в а н е т о
н а лаборатории no ISO с т а н д а р т 25 и Евро- I
пейския С т а н д а р т EN 45001. Проблемът, 1
к о й т о се наблюдава при о п и т а т е з и прави- 1
ла да се п р и л о ж а т з а клиничните лаборато- I
рии е, че т е з и д о к у м е н т и т р е т и р а т само •
техническата с т р а н а на лабораторната
р а б о т а : тестът се разбира единствено ка- |
то техническото извършване на анализа, а
получените тестови резултати са салю с |
технико-научни стойности. По т о з и начин '
п р а в и л а т а за Добра л а б о р а т о р н а п р а к т и к а \
u а к р е д и т а ц и я к о н ц е н т р и р а т единствено
върху л а б о р а т о р и я т а и т е х н и ч е с к о т о из­
вършване н а анализа. Те д е ф и н и р а т органи­
з а ц и о н н а т а процедура н а изследванията и
у с л о в и я т а з а провеждане н а т е с т о в е т е и
изискват т о ч н о д о к у м е н т и р а н и и н с т ­
р у к ц и и з а д е й с т в и е - стандартни проие-
дури за действие и д е т а й л е н к о н т р о л н а ка­
ч е с т в о т о . Но р а б о т а т а в клиничните ла­
боратории не се с ъ с т о и само о т техничес­
ки операции. Трябва да се държи с м е т к а за
специфично медицинския х а р а к т е р н а
к л и н и ч н и т е л а б о р а т о р и и . Дори се пред­
лага (J.Bühner), че по-правилно е в м е с т о Доб­
ра лабораторна практика д а се използва
т е р м и н а Добро медицинско лабораторно об­
служване, к о й т о включва и в а ж н и т е клинич­
ни изисквания и х а р а к т е р и с т и к и .
В предходните глави - о т 1. до 5., к а к т о и
в с л е д в а щ а т а 6. глава, д е т а й л н о с а разгле­
дани важни е л е м е н т и о т н о с н о р а б о т а т а в
к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я - организационни
и с т р у к т у р н и ; т а к и в а касаещи основни ла­
бораторни процедури и изисквания;безопас­
н о с т н а р а б о т а ; изисквания към биологич­
ния м а т е р и а л ; в ъ п р о с и т е на к а ч е с т в е н и я
контрол - в ъ т р е л а б о р а т о р е н и външна оцен­
к а на к а ч е с т в о т о н а л а б о р а т о р н и т е резул­
т а т и ; въпросите за а к р е д и т а ц и я на клинич­
н и т е лаборатории. Всичките т е з и въпроси
са о т де л н и е л е м е н т и о т и з и с к в а н и я т а н а
Добрата лабораторна практика. С ч и т а м е ,
че ще бъде полезно да п р е д с т а в и м с и с т е м а ­
т и з и р а н о целия о б х в а т о т правила на с т а н ­
д а р т а Д о ф а л а б о р а т о р н а практика. За цел­
т а ще изложим с малки съкращения публи­
к у в а н а т а в Clinical Laboratory (1999 г.) Кон­
цепция з а Д о б р а л а б о р а т о р н о - д и а г н о с -
т и ч н а п р а к т и к а * разработена о т работ­
н а група н а германски лекари (Arbeitsgrup­
pe der Deutchen Diagnostika Gruppe, DDG),
включваща: W.Appel, п р е д с е д а т е л , Brieh,
Bruggemann, de Fonseca-Wollheim, Fischbach,
Koppen, M a y e r - L u e r b e n , Rodt, V. Rucker,
Warlo, Wood.
ПРЕАМБЮЛ
Д о к у м е н т ъ т н а DDG и м а за цел в ъ в е ж д а н е т о
на о б х в а т а на Д о б р а т а лабораторно-диагнос-
т и ч н а п р а к т и к а (ДАП) в медицинските лабора­
т о р и и , п р е н а с я н е т о му в с и с т е м а т а на мерки­
т е за осигуряване на к а ч е с т в о т о в клиничните
л а б о р а т о р и и и същевременно к о н ц е н т р и р а н е
към п р а к т и ч е с к о т о приложение. По т о з и начин
се изгражда и о с н о в а т а на внедряване на изиск­
в а н и я т а за добра лабораторно-диагностична
п р а к т и к а в Германското законодателство. Сред
ц е л и т е на д о к у м е н т а е и п р е н а с я н е т о н а вклю­
ч е н и т е в т е к с т а национални и международни
норми към специфичните изисквания насочени
към клиничните лаборатории, приспособяване­
т о им към с е г а ш н о т о състояние на аналити-
к а т а и разширяване на изискванията към пред-
и следаналитичния е т а п . По т о з и начин концеп­
ц и я т а т р я б в а да допринесе за по- н а т а т ъ ш н о ­
т о р а з в и т и е на д е й н о с т т а на клиничните ла­
боратории и да подготви о т к р и т и дискусии.
ВЪВЕДЕНИЕ
Осигуряването на к а ч е с т в о т о в медицинските
лаборатории във Федералната република е об­
щ о п р и е т а даденост. За т о в а принос и м а т Пра­
в и л а т а на федералната камера на лекарите
(BÄK) и въвеждането им в обсега н а контроли­
ране (наблюдение) о т упълномощените провери­
т е л и . Възникнаха нови схаващания в р е з у л т а т
о т препоръките на п р а в и л а т а 98/79 EG на Ев­
ропейския п а р л а м е н т и I V D - п р а в и л а т а о т
27.10.1998 за диагностика in vitro. Предлагани­
я т д о к у м е н т може да допринесе за преработка
на IVD-правилата в германското право и да бъ­
д а т принос при подготвяне на нови т е к с т о в е .
Подразбира се и запълване на п р а з н и н а т а меж­
ду а к т у а л н о т о състояние н а п р а в и л а т а на фе­
д е р а л н а т а камера на л е к а р и т е и изпълнението
на изискванията на IVD-правилата.
В д о к у м е н т а Добра лабораторна п р а к т и к а
на DDG са описани есенциалните елементи на
с и с т е м а за управление на к а ч е с т в о т о в меди­
ц и н с к и т е лаборатории (напр. йерархичен поря­
дък, с т р у к т у р а , организационна схема, аспек­
т и т е на анализ-разходи-нужди, правна отговор­
ност). Централно м я с т о има осигуряване качес­
т в о т о н а д е й н о с т и т е в л а б о р а т о р и я т а и на­
д е ж д н о с т т а на л а б о р а т о р н и т е р е з у л т а т и и на­
ходки.
Обединените в т о з и д о к у м е н т изисквания
към дейности на медицинските лаборатории се
б а з и р а т върху осигуряване на к а ч е с т в о т о и вър­
ху добре оценените правила на федералната ка­
мера н а лекарите, включени или все още невклю­
чени в законови рамки. Допълнителните изиск­
вания о б х в а щ а т мерки в преданалитичния, ана­
литичния и следаналитичен е т а п .
Съдържанието на т о з и документ на DDG е
изградено въз основа на законови - национални
* З а публикуване в н а с т о я щ а т а книга и м а м е
с ъ г л а с и е т о н а W. Appel.
127
(DIN), европейски (CEN) и международни (ISO)
норми, правила и указания на документи на СЗО,
на указанията за изграждане на система за уп­
равление на качеството в медшдинските лабо­
ратории на DDG, на научни съобщения, преди
всичко на немски организаиии, както и на Инс­
т и т у т а за документаиия и стандартизиране
в медииинските лаборатории (INSTAND) и Рефе-
рентния и н с т и т у т за биоаналитика на герман­
ското общество за клинична химия (DGKC).
Д о к у м е н т ъ т е насочен за подпомагане н а
а к т и в н о с т и т е за а к р е д и т и р а н е и с ерт и фи-
циране и може да бъде п р е д п о с т а в к а за т я х .
Toü може да бъде използван за о с ъ щ е с т в я ­
ване на външен и в ъ т р е ш е н о д и т . При т о в а
т р я б в а да бъде подчертано, че п р о в е р к а т а
н а м е р к и т е за подготовка н а пациенти/про-
банди з а вземане н а биологични м а т е р и а л и /
първични проби о т п р а к т и ч е с к а гледна т о ч ­
к а не може да се о с ъ щ е с т в и или е възможно
в много ограничени граници.
Н а с т о я щ и я т д о к у м е н т да се п о д р а з б и ­
р а сдипствсно к а т о л ю у с л з а подпо­
м а г а н е н а т о з и , к о й т о г о п р и л а г а , но
не и за н а к а з в а н е т о му. Ц е л т а му е да се
предостави помощно с р е д с т в о н а медицин­
с к и т е лаборатории з а подобряване к а ч е с т ­
в о т о н а д е й н о с т т а им. Toü би т р я б в а л о д а
служи к а т о осноВа з а п о - н а т а т ъ ш н о по­
добряване (ongoing improvement) н а
о е и г у р я В а н е т о н а к а ч е с т в о т о (law i n
action) и 6 никакъб случай н е т р я б В а
д а Води д о поВишаВане с т о й н о с т т а н а
л а б о р а т о р н и т е изследВания.
ОБХВАТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ
Този д о к у м е н т с п е ц и ф и ц и р а изисква­
н и я з а о с и г у р я В а н е к а ч е с т В о т о н а ме­
дицинските л а б о р а т о р н и изследвания. Те се
о т н а с я т към конвенциални и неконвенциал-
ни к а ч е с т в е н и и количествени изследвания
във всички раздели н а л а б о р а т о р н а т а меди­
цина, ч и и т о р е з у л т а т и се и з р а з я в а т в по­
редни или номинални с т о й н о с т и или с ъ о т ­
ношения. Според него т р я б в а да се осъщес­
т в я в а с т р и к т н о и с и с т е м н о приложение н а
реактивите, тест-опаковките, апарати­
т е , аналитичните системи, указанията за
изпълнение н а изследванията, принадлеж­
н о с т и т е , калибрационните и к о н т р о л н и т е
материали за вътрешния качествен к о н т ­
рол (доколкото т е се п р е д л а г а т о т произ­
128
водителя), к а т о т о в а се контролира о т са­
м а т а лаборатория. В т о з и смисъл н а с т о ­
я щ и я т д о к у м е н т с е о т н а с я к ъ м Всич­
к и д е й н о с т и н а м е д и ц и н с к а т а лабора­
тория.
Ръководните кадри н а медицинските ла­
боратории в р а м к и т е н а п р а в и л а т а на сис­
т е м а т а з а осигуряване н а к а ч е с т в о т о
т р я б в а да о с и г у р я т р а з б и р а н е т о и въвеж­
д а н е т о н а с ъ д ъ р ж а щ и т е се указания и инс­
т р у к ц и и н а всички нива. Това е изключител­
но важно по о т н о ш е н и е н а н о р м и т е н а DIN,
CEN и ISO.
Трябва да се п о с т а в я т също изисквания
към изпълнението н а изследвания извън ме­
д и ц и н с к и т е л а б о р а т о р и и . Тук се о т н а с я
т ъ й нар. Point of care testing (изследване до
леглото н а болния) в к л и н и к а т а , в амбула­
т о р и и т е и о т д е л е н и я т а за и н т е н з и в н а ме­
дицина, в л е к а р с к и т е п р а к т и к и при легло­
т о н а болния (напр. определяне н а кръвна
глюкоза), к а к т о и при изследвания за цели­
т е н а с ъ д е б н а т а медицина, работническо­
т о здравеопазване и о с и г у р и т е л н о т о дело.
Определения
При изготвянето на документа са ползвани де­
финиции на Международния речник по метро­
логия (VIM, 1994), Наръчник за изразяване на не­
сигурността при измерване (GUM, 1993), ISO/
IEC Guide 2 (1991), нормативите ISO 8402 (1997)
и валидните в резултат о т т о в а нормативи DIN
EN ISO 17025 (1999), DIN EN 15189 (1999), DIN 58936-
1 и DIN 58936-2. Когато в т е з и публикации са
използвани различни определения са прилагани
т е з и дефиниции, които се намират в ISO/IEC
Guide 2(1991) и VIM.
М е д и ц и н с к а л а б о р а т о р и я : лаборато­
рия, к о я т о е о т г о в о р н а за измервания и наб­
людения във връзка със з д р а в е т о и заболя­
в а н и я т а (EAL-G25).
Р е а к т и в и : химикали о т т е ч е н х а р а к т е р ,
необходими з а а н а л и з и т е .
С п е с и м е н : една или повече съставк и , кои­
т о произхождат о т даден п а ц и е н т или под­
с и с т е м а на п а ц и е н т а и п р е д о с т а в я т инфор­
мация за същия п а ц и е н т или с л у ж а т к а т о
база за вземане н а решение о т н о с н о с ъ с т о ­
я н и е т о му (ISO/CD 15189).
Проба: По отношение н а т о з и комплекс сис­
т е м а т и з и р а н о определение предлага DIN EN
12286:1998 к а к т о следва:
П ъ р в и ч н а п р о б а {primary sample): една
или повече ч а с т и о т една с и с т е м а , к о и т о
са извлечени, з а д а се получи информация за
с и с т е м а т а , или з а д а п о с л у ж а т за основа за
решения о т н о с н о с и с т е м а т а . В говоримия
език междувременно навлезе п о н я т и е т о спе-
симен, к о е т о ч е с т о се използва еднозначно
с п о н я т и я т а биологична проба и м а т е р и а л
за изследване. Това не е правилно. По прин-
цшх определението първична проба о т г о в а ­
р я н а спесимен т а к а , че в т о з и д о к у м е н т се
използва определението спесимен/първична
проба.
Л а б о р а т о р н а п р о б а {laboratory sample):
първична проба или ч а с т о т нея (вторична
проба), т а к а к а к т о е п о с т ъ п и л а в лабора­
т о р и я т а , или к а к т о се изпраща о т нея и е
предназначена з а а н а л и т и ч н и цели.
А н а л и т и ч н а п р о б а (analitical sample):
проба, получена о т л а б о р а т о р н а т а проба,
и о т к о я т о може д а бъде получена анали­
т и ч н а порция.
А н а л и т и ч н а п о р ц и я (analytical
sample): порция о т м а т е р и а л , к о я т о е взе­
т а о т а н а л и т и ч н а т а проба, и к о я т о се пол­
зва непосредствено за и з м е р в а н е т о или наб­
людението.
А н а л и т и ч е н р а з т в о р (analitycal
solution): р а з т в о р , к о й т о се получава чрез
смесване н а а н а л и т и ч н а порция с или без
п р о т и ч а н е н а реакция с газ, т е ч н о с т или
твърдо вещество.
ПЕРСОНАЛ
Увеличаващата се а в т о м а т и з а ц и я и елек­
т р о н н а т а о б р а б о т к а н а д а н н и т е облекча­
в а т н а т о в а р в а н е т о в медицинските лабо­
р а т о р и и и п о к р и в а т н е п р е к ъ с н а т о повиша­
ващия се брой изследвания. О р г а н и з и р а н а т а
в с ъ о т в е т с т в и е с д е й с т в а щ и т е правила ла­
б о р а т о р и я т р я б в а да използва всички т е х ­
нически ресурси, з а да поддържа р а з х о д и т е
за т р у д , к о л к о т о е възможно по-малко. Тол­
кова по-важно е п е р с о н а л ъ т според квали­
ф и к а ц и я т а си да с ъ о т в е т с т в а на п о с т а в е ­
н и т е задачи и т о при спазване разпоредби­
т е на т р у д о в о т о з а к о н о д а т е л с т в о .
Начело н а м е д и ц и н с к а т а л а б о р а т о р и я
т р я б в а да с т о и р ъ к о в о д и т е л , ч и я т о про­
фесионална квалификация с ъ о т в е т с т в а н а
п о с т а в е н и т е задачи. По принцип е лекар със
следдипломна квалификация по с ъ о т в е т н а ­
т а с п е ц и а л н о с т клинична л а б о р а т о р и я ,
микробиология, епидемиология, имунология.
Ръководенето н а лаборатория предпола­
га и з г р а Ж д а н е н а с и с т е л г а з а о с и г у р я ­
ване н а качеството и наблюдение н а
п р и л о ж е н и е т о й. Ръководенето н а качес­
т в о т о изисква в раздела персонал у т в ъ р ­
ж д а в а н е и пиелгено д о к у м е н т и р а н е н а
следните постановки:
>- О р г а н и г р а л г а (схема на организация­
та). Тя показва й е р а р х и я т а в организа­
ц и я т а . Взаимоотношенията между ръко­
в о д и т е л и т е и подчинените т р я б в а да бъ­
д а т съобразени с изпълнението на всяка
задача;
> З а д а ч и т е и з а д ъ л Ж е н и я т а н а персо­
нала т р я б в а ясно да б ъ д а т написани;
> Необходимата за изпълнение на задачи­
т е к в а л и ф и к а ц и я на персонала да бъ­
де документирана;
>- Т р у д о вата з а е т о с т т р я б в а да бъде спра­
ведливо разпределена чрез документира­
не на н а т о в а р е н о с т т а по длъжности
и работни места;
>• Провеждането на о б у ч е н и е т о на с ъ т ­
рудниците, к а к т о и т я х н о т о усъвършен­
с т в а н е ( п о - н а т а т ъ ш н а квалификация)
т р я б в а да б ъ д а т регламентирани и за
всички задачи да б ъ д а т професионално
ориентирани;
>- При разпределение на р а б о т н и т е задачи
трябва д а с е д о к у м е н т и р а салюини-
ц и а т и в н о с т т а и професиона^тото
усъвършенстване н а сътрудници­
те;
> В л а б о р а т о р и и т е т р я б в а да бъде органи­
зирано п о - н а т а т ъ ш н о т о професионално
усъвършенстване в с а м а т а лаборатория
и с о т к ъ с в а н е о т р а б о т а (извън лабора­
т о р и я т а ) . Трябва д а б ъ д а т д о к у л г е н -
т и р а н и м е р к и т е з а професионално
усъвършенстване;
> Трябва да бъде осигурен п р е н о с ъ т н а
и н ф о р м а ц и я в лабораторията, к а к т о
между о т д е л н и т е с ъ с т а в н и л а б о р а т о ­
рии, т а к а и между ръководещите ги с ъ т ­
рудници. Трябва да бъде подсигурено за­
познаване с н а р е ж д а н и я т а и обсъждани­
я т а , к а т о вси чко с е докулгентира;
129
>• В о р г а н и з а ц и я т а н а л а б о р а т о р и я т а
трябва д а се з а ч и т а т правата н а
сътрудниците;
>• Р ъ к о в о д с т в о т о н а л а б о р а т о р и я т а т р я б ­
ва да познава с ъ о т в е т н и т е законови раз­
поредби, да провежда с ъ о т в е т н и т е пред­
писания и д а ги п р е д о с т а в я н а разполо­
жение н а с ъ т р у д н и ц и т е . Тук се о т н а с я т
законови разпоредби з а охрана н а
труда, з а сигурност, предложения
н а професионалните организации и
разпоредби з а частнопрактикуба­
щите.
СИГУРНОСТ
С ъ т р у д н и ц и т е н а медицинските л а б о р а т о ­
рии са з а с т р а ш е н и о т ред физически, х и м и ­
чески и микробни вредности:механични на­
р а н я в а н и я (напр. порязвания п р и счупване
на стъкла, убождания о т игла); т а к и в а ,
при чинени от физични агенти - изгаряне о т
нагорещени п р е д м е т и и л и е л е к т р и ч е с к и
ток, и н х а л и р а н е н а т о к с и ч н и вещества
(прах, изпарения - етидиев бромид); от х и ­
м и к а л и (напр. увреждане от киселини, раз­
творители, преди всичко на очите); контак­
т н и увреждания н а х р а н о с м и л а т е л н и я
т р а к т (напр. о т канцерогенни вещества);
излагане на ултравиолетова светлина
(напр. в м о л е к у л я р н а т а биология, при хро-
матография); излагане на (респ. прием н а )
радиоактивни вещества (особено 125 1при RIA
и IRMA и не н а последно м я с т о опасности
при работа с биологични м а т е р и а л и (особе­
но в микробиологията).
Голяма ч а с т о т т е з и рискове м о г а т д а
б ъ д а т и з б е г н а т и или силно намалени чрез
програма з а с и г у р н о с т и чрез спазва­
н е н а с ъ о т В е т н и предписанил з а наме­
с а п р и е в е н т у а л н о В ъ з н и к в а н е . Тук
т р я б в а д а се обърне особено внимание н а
п о д г о т о в к а т а за трудова безопасност и
п р е д п и с а н и я т а за поведение н а р а б о т н о т о
място.
Ръководството на лабораторията т р я б ­
ва да подготви с т р и к т н и п и с м е н и п р е д ­
писания з а с ъ т р у д н и ц и т е В р а м к и т е
н а м е т о д и ч н и т е у к а з а н и я . Те т р я б в а да
с ъ д ъ р ж а т освен п р а в и л а т а з а р а б о т а и
предписания з а хигиена, с и г у р н о с т н а ра­
б о т н о т о м я с т о , обеззаразяване и дезинфек­
130
ция и преди всичко з а р а б о т а с инфекциозни
материали. Р ъ к о в о д с т в о т о н а лаборатори­
я т а т р я б в а да обучи н о в и т е сътрудници в
т о в а о т н о ш е н и е преди започване на т р у д о ­
в а т а им д е й н о с т и да им осигури льетодич-
н и т е у к а з а н и я в п и с л ь е н а форльа. Ме­
тодичните указания трябва д а се
п р е г л е Ж д а т и а к т у а л и з и р а т перио­
дично, най-лгалко е д и н п ъ т годишно.
Ръководството на лабораторията т р я б ­
ва да организира р е д о в н о з а н я т и я за по­
вишаване квалификацията по отношение си­
г у р н о с т т а в л а б о р а т о р и я т а . Следва да се
с ъ х р а н я в а т описания н а съдържанието и но­
вовъведените мерки по време н а т е з и заня­
тия. Задължително е и регистриране­
т о н а необходилште Atepku з а предот­
вратяване н а нещастни случаи и з а
д е й н о с т т а н а сътрудниците н а лабо­
раторията при такива случаи.
Особено внимание т р я б в а да се обръищ
по о т н о ш е н и е на рискове о т инфекции. Спе-
симени/първични проби т р я б в а да се счи­
т а т по принцип к а т о п о т е н ц и а л н о и н ­
ф е к ц и о з е н л ш т е р и а л и да се о б р а б о т в а т
в с ъ о т в е т с т в и е с т о в а . Сътрудниците на
л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да п о л а г а т особено
внимание при м а т е р и а л и о т изследвани за
първи п ъ т п а ц и е н т и (по правило непозна­
т и з а л а б о р а т о р и я т а ) - да се о б р а б о т в а т
к а т о потенциално инфекциозни (HIV, хепа­
т и т , туберкулоза). Заедно с т о в а ръковод­
с т в о т о н а л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да пола­
га усилия за а к т и в н о т о имунизиране и прос­
ледяване н а р е з у л т а т и т е о т т а з и имуни­
зация н а персонала.
Ръководството на лабораторията т р я б ­
ва да изгради с и с т е м а з а р е г и с т р и р а н е
н а Всички п р о ф е с и о н а л н и у В р е ж д а н и я
и д а с л е д и с и с т е м н о д а н н и т е с указ-
Ване н а п р е д п р и е т и т е м е р к и .
ПРЕДАНАЛИТИЧЕН ETAII
Качеството на р е з у л т а т и т е , подучени о т ме­
дицинските лаборатории се определя о т т я х ­
н а т а т о ч н о с т и В ъ з п р о и з В о д и м о с т и за­
виси в голяма с т е п е н о т качеството на изпъл­
нението в аналитичната фаза, което за сега се
определя само о т правилата на федералната ле­
карска камера. Тази камера формулира задания
за допустими отклонения при измерване, за не­
т о ч н о с т и невъзпроизводимост на резултати
о т контролни проби и определя точно величи­
н а т а им за определени параметри. Това осигу­
ряване на качеството се основава на биологич­
ни и математически статистически правила.
То се основава на осигуряване качество на ре­
зултата, а не на с т р у к т у р а т а .
К а ч е с т в о т о на р е з у л т а т и т е о т измер­
в а н и я т а в а н а л и т и ч н а т а фаза зависи в оп­
ределена с т е п е н о т о т д е л н и е т а п и в пре-
д а н а л и т и ч н а т а фаза. Точни и възпроизводи-
ми р е з у л т а т и о т измерванията не изпъл­
н я в а т предназначението си, ако включена­
т а в изследване проба или аналитична про­
ба е променена преди началото на аналитич­
ния процес и вече не о т г о в а р я на здравос­
ловното с ъ с т о я н и е на пациента; т о в а мо­
ж е да доведе до погрешна диагноза.
К а ч е с т в о т о на получаваните в медицин­
с к и т е лаборатории р е з у л т а т и и находки за­
виси о т цяла поредица други фактори: к а ­
чество н а и з п о л з в а н и т е реактиви,
комбинации о т р е а к т и в и (тест опа­
ковки), а п а р а т и и к о н с у м а т и в и и пре­
д и всичко от качеството н а калибра-
торите, н а ана^ьизаторите и косвено
н а к о н т р о л н и т е Aiamepucuiu (вкл. по­
с о ч е н и т е в т п х п р и ц е л н и стойности).
Съществено значение за к а ч е с т в о т о и м а т
освен редица биологични и други - т ъ й нар.
п р ечещ и ф а к т о р и .
Особено важно, ч е с т о решаващо о т р и ц а ­
т е л н о значение за н а д е ж д н о с т т а на лабо-
р г т о р н и т е р е з у л т а т и има вземането и
първичната обработка на биологичните ма­
териали (спесимени/първични проби).
За да б ъ д а т п р е м а х н а т и или поне реду­
цирани в голяма с т е п е н влиянията на т е з и
фактори, к о и т о влияят о т р и ц а т е л н о на ка­
ч е с т в о т о на р е з у л т а т и т е се прилага поре­
дица о т предварителни мерки.
Вземане н а биологични м а т е р и а л и
(спесимени/пърНични проби)
Ръ ководството на л а б о р а т о р и я т а т р я б в а
да предоставя информации о т н о с н о избора
на подходящи изследвания при наличие на да­
дени индикации.
Л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да определи спе­
цифичните изисквания за вземане и първич­
на обработка на спесимени/първични про­
би за извършваните о т нея изследвания и
да ги обедини в С п р а в о ч н и к з а в з е л ш н е и
п ъ р в и ч н а обработка н а спесилгени/
п ъ р в и ч н и проби. Този справочник служи
при всички изследвания, особено при изслед­
вания в хемостазеологията, микробиологи­
я т а , медицината на околната среда и съ­
д е б н а т а медицина.
Справочникът не т р я б в а непременно да
бъде о т п е ч а т а н , но може да се предава на
ползващите лекари к а т о а к т у а л н и новос­
т и и чрез е л е к т р о н н а т а п о щ а н а л а ­
бораторията.
Л а б о р а т о р и я т а може да п о с т а в я с в о и т е
изисквания по свое у с м о т р е н и е и в каталог,
к о й т о обхваща извършваните о т нея изс­
ледвания и справочника за вземане и първич­
на обработка на спесимени/първични про­
би.
Между изпращащия лекар и лаборатори­
я т а , к о я т о извършва изследванията т р я б ­
ва да се извършва и н т е н з и в н а облияна н а
и н ф о р л ю ц и я в д в е т е н а п р а в л е н и я , ко­
я т о да предоставя на л а б о р а т о р и я т а ин­
формация о т н о с н о медицинските индика­
ции и въпросите, к о и т о се п о с т а в я т с изс­
ледването, а л а б о р а т о р и я т а да предлага
възможни подходящи за п о - н а т а т ъ ш н а т а
диагностика изследвания.
Справочникът за вземане и първична об­
р а б о т к а на с п е с и м е н и / п ъ р в и ч н и проби
т р я б в а да съдържа следните елементи:
• Информация относно пациента/пробанда,
ако т я е необходима или наложителна.
• Документирани данни за съхранение на би­
ологичния материал извън лабораторията.
• Инструкция за пациента/пробанда о т ­
носно неговата собствена подготовка и
поведение преди изследването.
• Указания за предварителна подготовка на
пациента/пробанда.
• Изисквания за клинична или лекарска ин­
формация, ако е необходима или наложи­
телна.
• Детайлни указания за позитивна иденти­
фикация на пациента/пробанда, о т кой­
т о произхожда п р о б а т а .
• Указания за установяване и д е н т и ч н о с т ­
т а на вземащия пробата, ако т о в а се на­
ложи.
• Указния за е с т е с т в о т о на спесимена/пър-
вичната проба.
• Указания за вземане на спесимена/първич-
131
 н а т а проба: пункция н а вена, пункция н а
а р т е р и я , капилярна кръв; вземане н а лик-
вор, н а урина, н а п у н к т а т и и други т е ­
лесни т е ч н о с т и , н а изпражнения, н а ко­
са, н а к о с т е н мозък и други т ъ к а н и , как­
т о и при други особени изследвания.
• Указания за в з е м а н е т о н а спесимена/пър-
в и ч н а т а проба при микробиологични изс­
ледвания.
• Описание н а необходимия съд за спесиме-
на.
• Описание н а необходимите добавки (напр.
хепарин, ЕДТА, ц и т р а т , флуорид, малеи-
н а т , монойод а ц е т а т и пр.).
• Описание н а необходимите с р е д с т в а при
пренасяне з а микробиологични изследва­
ния.
• Указание з а най-малкия необходим обем
биологичен м а т е р и а л (напр. обем кръв).
• Указания за най-големите възможни коли­
ч е с т в а , за да не се обременява излишно па­
циента.
• Специални указания з а т о ч е н час н а взе­
мане (напр. при изследване н а кръвни га­
зове; кръвна глюкоза, върхова и най-ниска
концентрация на лекарства).
• Указания з а първична о б р а б о т к а н а спе-
с и м е н а / п ъ р в и ч н а т а проба (handling) меж­
ду в р е м е т о н а в з е м а н е т о му и п о с т ъ п в а ­
н е т о в л а б о р а т о р и я т а ; особено з а съхра­
нение (напр. н а т ъ м н о ) , т р а н с п о р т (ох­
лаждане, т е м п е р и р а н е , без д о с т ъ п н а въз­
дух и пр.).
• Указания з а начина н а предаване (преда­
ване н а определено р а б о т н о м я с т о , пре­
даване чрез т р е т о лице, лично предаване).
• Описание н а начина н а надписване (мар­
к и р а н е / т е к с т ) н а спесимена/първичната
проба (labeling).
• Указания з а сигурно съхранение и разпре­
деление н а с ъ д о в е т е за спесимена/първич­
н а т а проба извън л а б о р а т о р и я т а ; т о в а е
особено важ но з а лекарски п р а к т и к и и
с т а р ч е с к и домове или хосписи.
• Указания з а о т л а г а н е , ограничаване, про­
меняне или о т м е н я н е н а направена поръч­
к а за изследвания.
• Списък н а физиологични, фармакологични,
биохимични или клинични с ъ с т о я н и я по
време н а вземане н а п р о б а т а о т пациен­
132
та/пробанда, доколкото т е м о г а т да
и м а т значение за хода н а анализа, за ва-
лидирането или з а п р е ц е н к а т а н а резул­
т а т а ( о т а н а л и т и ч н а или медицинска
гледна т о ч к а ) . Тук се о т н а с я т напр. въп­
роси о т н о с н о п р и е м а н и м е д и к а м е н т и ,
п р о д ъ л ж и т е л н о с т н а м е д и к а ц и я т а , мен­
струалния цикъл и естрадиола, наличие на
бременност, приложение н а а н т и б и о т и ­
ци, прием н а дроги, алкохол или н и к о т и н ,
стресово с ъ с т о я н и е н а пациента/пробан-
да, приложение н а кислород ( с ъ о т в е т н о
количеството), к а к т о и основните забо­
лявания н а пациента/пробанда, к а т о за­
харен д и а б е т или други обменни или ен­
докринни заболявания.
• Списък н а специфични изисквания при оп­
ределени изследвания, напр. при микроби­
ологични, хематологични, молекулярноби-
ологични, хемостазеологични изследвания,
изследвания на о к о л н а т а среда и съдебно­
медицински изследвания.
• Изисквания при предаване м а т е р и а л и о т
заболявания с повишен инфекциозен риск
к а т о HIV, х е п а т и т , туберкулоза.
Обработка
н а спесимени/пърВични проби
Съдовете, в к о и т о се п о с т а в я т спесимени/
първични проби т р я б в а да б ъ д а т маркира­
ни чрез ц в е т о в о кодиране и баркод в с ъ о т ­
в е т с т в и е със с ъ д ъ р ж а щ и т е се в т я х добав­
ки (противосъсирваиш, стабилизатори, кон­
с е р в а н т и ) и допълнително т р я б в а да и м а т
писмено или електронно означение (с имена
или цифри), за да бъде възможно идентифи­
циране н а п а ц и е н т а / п р о б а н д а , о т к о й т о е
в з е т м а т е р и а л а . Това е валидно и за съдове
с проби, к о и т о са получени о т с ъ о т в е т н и ­
т е спесимени/първични проби. При биоло­
гични м а т е р и а л и , к о и т о т р у д н о се получа­
в а т (напр. ликвор, биопсии, к о с т е н мозък и
п у н к т а т и н а околоплодна вода) л е к а р я т или
о т г о в о р н и я т за вземане н а п р о б а т а т р я б ­
ва да поеме о т г о в о р н о с т т а и да осигури н а
л а б о р а т о р и я т а насочена информация. В т а ­
къв случай п о р ъ ч к а т а т р я б в а да носи и под­
писа и и м е н а т а н а о т г о в о р н о т о за вземане
н а п р о б а т а лице (проблем при изпрашани по
електронен п ъ т заявки з а изследване). Това
е валидно особено за кръвни проби за ц е л т а
 н а хемотрансфузиологията, респ. имунохе-
м а т о л о г и ч н и т е изследвания.
Л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да и з г о т в и пис­
мено определени к р и т е р и и з а вземане и об­
р а б о т к а н а биологичните м а т е р и а л и . Спе-
симени/първични проби и поръчки, к о и т о не
п о з в о л я в а т сигурно и д е н т и ф и ц и р а н е н е
трябВа да б ъ д а т приемани и обработ­
вани о т л а б о р а т о р и я т а и р е з у л т а т и
о т т я х н о т о изеледВане н е т р я б В а д а
с е д а В а т . В случай, че възникне т ъ р с е н е н а
р е з у л т а т за т а к ъ в м а т е р и а л е необходимо
да бъде предоставено писмено сведение, ка­
т о се достигне у т о ч н я в а н е н а о т г о в о р н о с т ­
т а относно идентифицирането на матери­
ала о т с т р а н а н а възложителя. Лко въз ос­
нова н а някакво основание, неясно и д е н т и ­
фицирания м а т е р и а л е п р и е т и обработен,
л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да посочи в лабора­
т о р н и я р е з у л т а т х а р а к т е р а н а проблема,
риска за погрешна и н т е р п р е т а ц и я о т ле­
каря, и ако е възможно д а б ъ д а т посочени
в ъ з м о ж н и т е последствия. О т лаборатори­
я т а т р я б в а да б ъ д а т указани и периодите,
и начина н а пренасяне н а м а т е р и а л и , раз­
лични напр. з а урина и з а кръв, за определя­
не н а кръвни групи.
Л а б о р а т о р и я т а следва да подготви пис­
мено указание з а предадени у с т н о поръчки
| (напр, о т т р е т о лице). Последните т р я б в а
да б ъ д а т след т о в а п о т в ъ р д е н и писмено о т
с т р а н а н а възложителя.
При с п е ш н и и з с л е д В а н и я лаборатори­
я т а т р я б в а д а и м а д о к у м е н т и р а н о сведе­
ние о т н о с н о в р е м е т о н а получаване, марки­
ране, идентифициране, о б р а б о т к а , провеж­
дане н а анализа и съобищване н а р е з у л т а ­
т а . М а т е р и а л ъ т з а изследване и поръчка­
т а т р я б в а да б ъ д а т ясно означени (напр.
със знак с п е ш н о , с п е ш е н с л у ч а й , н а й -
д о б р е с д р у г цвят). Означението спешен
случай т р я б в а да бъде свързано със спешен
случай о т медицинска гледна т о ч к а , за да
може да се о т л и ч а в а о т р у т и н н и т е изслед­
вания. Трябва да и м а писмено указание за
поведението спрямо спешни изследвания в
р а м к и т е н а л а б о р а т о р и я т а . В него т р я б в а
да бъде изяснен начина н а маркиране н а спе-
с и м е н и т е / п ъ р в и ч н и т е проби, н а ч и н а н а
т р а н с п о р т и р а н е , м я с т о т о н а приемане,
м я с т о т о на обработване в л а б о р а т о р и я т а ,
за да се п о с т и г н е бързо изпълнение, различ­
но о т т о в а на р у т и н н и т е проби, да бъде оз­
начено и м е т о н а приелия м а т е р и а л а в лабо­
р а т о р и я т а и я с н и т е указания как следва да
бъде предаден р е з у л т а т а , к а к т о и инфор­
мация кому и кога е предаден р е з у л т а т а .
Л а б о р а т о р и я т а т р я б в а д а и м а ясни и
пълни указания за получаването и съхраня­
в а н е т о н а спесимените/първичните проби
между в р е м е т о н а получаването им в лабо­
р а т о р и я т а и началото на аналитичния про­
цес: н а ч и н н а с ъ х р а н е н и е (особено в тран-
сфузиологията), з а в ъ т р е л а б о р а т о р н и я
транспорт, центрофугирането, п р и
необходилюст т е м п е р и р а н е и съхра­
н я в а н е без д о с т ъ п н а въздух, к а к т о и
з а предаване н а спесилюните/първич-
н и т е проби н а д р у г о работно млсто.
Л а б о р а т о р и я т а следва да има и указание
за влизането и м е с т а т а к ъ д е т о е разрешен
д о с т ъ п на п о с е т и т е л и , за да се и з б е г н а т
неудачи при преноса и съхранението на про­
бите.
АНАЛИТИКА
В а н а л и т и ч н а т а фаза са вградени основни­
т е правила за поддържане н а к а ч е с т в о т о .
Всички правила за поведение в лаборатори­
я т а т р я б в а да са указани писмено. Трябва
да са ясно написани, за да са разбираеми о т
персонала, д о к у м е н т и р а н и и най-малко в
к р а т к а форма да б ъ д а т налице н а всяко ра­
б о т н о м я с т о . Това е валидно особено по о т ­
ношение на поведението при калибриране и
провеждане на м е р к и т е по качествения кон­
трол.
Р а б о т н и указания
М е т о д и ч н и т е указания т р я б в а да б ъ д а т
подготвени в ясна форма (standard operation
procedures - SOP). Те т р я б в а да с ъ д ъ р ж а т :
• Цел на изследването (пробата).
• Принцип на изследването и м е т о д а .
• Указания за валидиране н а р е з у л т а т а о т
изследването преди включването му в ру­
т и н н а т а програма, при евентуална про­
м я н а н а м е т о д и к а т а на измерване или н а
други п а р а м е т р и .
• Указания за спесимени/първични проби
(включва съдове за проби и добавки).
133
• Указания за критерии за о т к а з на анализ
на спесимени/първични проби о т преда-
н а л и т и ч н а т а фаза преди п о - н а т а т ъ ш н а
о б р а б о т к а при; неясно идентифициране,
н е д о с т а т ъ ч н о количество проба, о т ч е т ­
ливо променена проба (напр. о т вторич­
на хемолиза, образуване на съсиреци), при­
мес на инфузионни р а з т в о р и (напр. при
вземане о т с и с т е м и ) и при погрешно в з е т
м а т е р и а л (напр. п у н к т а т в м е с т о кръв).
• Детайлни указания за калибратори и ка­
либриране, с посочване на о б р а т е н д о с т ъ п
до прицелните с т о й н о с т и на калибрато-
р и т е , получени о т т а к и в а с по-висок м е т ­
рологичен порядък.
• Указания за п о с л е д о в а т е л н и т е с т ъ п к и
при провеждане на анализите.
• Детайлни указния за провеждане на в ъ т ­
решния качествен контрол.
• Указания за в ъ з м о ж н о с т и т е за наруша­
ване к а ч е с т в о т о на изследванията и при­
чините, к о и т о м о г а т да ги предизвикат
доколкото е възможно.
• Указания за принципа на п р е с м я т а н е на
р е з у л т а т и т е о т измерванията въз осно­
ва на и з м е р е н и т е сигнали.
• Указания за п р е с м я т а н е на осреднен ре­
з у л т а т о т измервания.
• Указания за осредняване на р е з у л т а т и т е
о т измерването при т ъ й нар. количест­
вени и полуколичествени изследвания (ко­
г а т о р е з у л т а т и т е се о т п е ч а т в а т в но­
минална и порядкова скала).
• Указания з а р е ф е р е н т н и т е и н т е р в а л и
(нормална с т о й н о с т , таблици за нормал­
ни или референтни с т о й н о с т и ) , при указ­
ване на ползваните за ц е л т а аналитични
методи.
• Установяване на граници за т р е в о г а при
р е з у л т а т и т е о т изследванията и за дейс­
т в и я при получаване на р е з у л т а т и извън
т е з и граници.
• Указания за аналитична преценка и плау-
з и б и л и т е т е н к о н т р о л на р е з у л т а т и т е
о т изследванията.
• Предписания за п о в т а р я н е на изследвани­
ята.
• Указания за връищне на спесимени/пър-
вични проби, напр. при т р а н с ф у з и о н н а т а
медицина, при анализи на ликвор, в хема­
т о л о г и я т а (натривки - клетки о т пунк-
т а т и , допълнителни неоцветени натрив­
ки о т п у н к т а т и на к о с т е н мозък), указа­
ния за в ъ з м о ж н о с т и т е , м я с т о т о , услови­
я т а и п р о д ъ л ж и т е л н о с т т а на съхраня­
ване на спесимени/първични проби и ла­
бораторни проби (при указания за стабил­
н о с т т а по о т н о ш е н и е на даден анализ)
т р я б в а да б ъ д а т предоставени. Трябва да
се и м а т предвид законовите изисквания.
• Указания за разпределяне в лаборатория­
т а на р е з у л т а т и т е о т изследванията.
• Установени предписания за спазване на
биологично обезопасяване и хигиена.
• Указания за обгрижване при инцидент.
Калибриране
Калибрирането на аналитичните подходи и на
in vitro диагностичните способи с измерващи
функции, като се включват и апаратите за обе­
мен анализ служи за изграждане на връзката
между с т о й н о с т т а на изходна величина (напр.
концентрация на дадена съставка, дозиран
обем) и установената стойност за изследвана
величина (действителна, истинска, точна стой­
ност). Установяването на т а з и взаимозависи­
м о с т служи за изпълнението на калибрираща­
т а функция съответно на корекционните фак­
тори за показанията. Калибрирането на всяко
(количествено) изследване, както и междинни ка­
либрирания в хода на протичане на лаборатор­
но медицинските изследвания, доколкото т е мо­
г а т да повлияят резултатите о т изследвания­
т а , трябва да бъдат точно регламентирани в
упътванията за работа.
При качествени и полуколичествени изс­
ледвания (с о т п е ч а т в а н е на р е з у л т а т и т е
в номинални или поредни скали) следва да бъ­
де проверена т я х н а т а функционална год­
н о с т . Трябва да б ъ д а т представени:
• Информация за необходимите м а т е р и а ­
ли и пособия за калибриране, в т о в а число
- производител, доставчик, п а р т и д е н но­
мер, начин на съхранение, г о д н о с т .
• Описание на начина на провеждане на ка­
либрирането, вкл. с т о й н о с т и т е на въве­
д е н и т е величини (напр. концентрации,
предвидени обеми) и броя на измервания­
т а на всеки показател.
• Ч е с т о т а на калибрирането и критерии­
т е за извънпланово калибриране.
• К р и т е р и и за и з п о л з в а е м о с т т а на резул­
т а т и т е о т калибрирането, к а к т о и ука­
зания за п р а в а т а н а изпълнителя по о т ­
ношение н а получените р е з у л т а т и .
• Указания з а п р е н о с и м о с т н а р е з у л т а т и ­
т е ( о т калибриране) върху национални и
международни норми или при и з р а б о т в а ­
не н а р е ф е р е н т н и граници. К о г а т о не съ­
щ е с т в у в а т а к а в а в ъ з м о ж н о с т (за използ­
ване) създаден ли е о п и т з а осигуряване
т о ч н о с т т а н а калибрирането (напр. меж-
дулабораторни сравнения или външни про­
верки н а к а ч е с т в о т о ) .
• М е т о д и к а за д о к у м е н т и р а н е н а р е з у л т а ­
т и т е о т калибрирането и о б р а т н о т о
пренасяне на р е з у л т а т и т е към национал­
ни и международни нормали, к а к т о и при
с ъ п о с т а в я н е с р е з у л т а т и о т други про­
учвания за осигуряване н а т о ч н о с т т а им.
Вали^ираие
Ц е л т а н а валидирането е д а у с т а н о в и м , че
дадено изследване с ъ о т в е т с т в а за предви­
д е н о т о приложение. Това се предполага о т
познаване на и з и с к в а н и я т а към изпълнени­
е т о и спазване н а н е г о в и т е п а р а м е т р и . Ка­
т о п а р а м е т р и н а изследването м о г а т да бъ­
д а т считани;
• Н а д е ж дност н а изследването ( т о ч н о с т и
възпроизводимост).
• Граница н а долавяне н а определяне (ана­
литична чувствителност).
• Линейност ( р а б о т е н о б х в а т , спазване на
закона н а Ламберг-Беер).
• Селективност на м е т о д а (аналитична
специфичност),
• П о в т о р я е м о с т и/или с р а в н и м о с т .
• У с т о й ч и в о с т спрямо външни в ъ з д е й с т ­
вия.
• Клинична ( д и а г н о с т и ч н а ) ч у в с т в и т е л ­
н о с т и специфичност, к а к т о и граници н а
вземане на решения (cut off values).
За определяне н а изброените п а р а м е т р и
м о г а т да се п р и л а г а т различни м е т о д и :
- Калибриране с р е ф е р е н т н и м а т е р и а л и .
- Сравняване с р е з у л т а т и , получени чрез
други м е т о д и .
- Двойни успоредни изследвания.
- Сравняване между различни лаборато­
рии (междулабораторни сравнявания).
- Преценка на н а д е ж д н о с т т а на изслед­
ването.
- Данни о т повторни анализи н а изслед­
вания.
В отделни случаи може да се направи пре­
ценка въз основа на:
- Предишни познания за м е т о д и т е .
- Осреднени р е з у л т а т и , получени с м е т о ­
дите.
- Л и т е р а т у р н и данни за въпросните ме­
тоди.
При т о в а т р я б в а да се прави разлика меж­
ду валидиране на с т а н д а р т н и т е методики
и т е з и , разработени в клиничната лабора­
тория:
1. В а л и д и р а н е п а с т а н д а р т н и т е
методики
Под с т а н д а р т н и методики се р а з б и р а т
нормирани и общопризнати или комерсиал­
но наложени о т производителя методики,
к о и т о при р а з р а б о т в а н е т о се валидират о т
с т р а н а на произвидителя. Тези методики
н а л а г а т при изпълнението им в лаборато­
р и я т а ограничено валидиране, к о е т о е свър­
зано с т о ч н о т о им спазване. Н а й - ч е с т о т о
т а к о в а е п р о в е р к а т а на р е ф е р е н т н и т е / и л и
к о н т р о л н и т е матер и ал и .
2. И а л и д и р а н с н а р а з р а б о т е н и т е
в лабораторията методики
Към т е з и мето д и к и приндлежат не само
р а з р а б о т е н и т е о т с а м а т а лаборатория ме­
тодики, но и с т а н д а р т н и методики, к о и т о
са били модифицирани (напр. а д а п т и р а н е на
търговски достъпни тест-опаковки към
различни о т предвидените о т производите­
ля анализатори) или за приложение в други
освен предвидените при производството би­
ологични м а т е р и а л и (напр. при ликвор или
п у н к т а т и освен при серум).
В т о з и случай т р я б в а да се о б с ъ д я т по­
лучените р е з у л т а т и и п р и л а г а н а т а м е т о ­
дика, к а т о се вземе предвид вида на изслед­
в а н е т о к а т о се внимава за свързаните с пог­
решни р е з у л т а т и рискове, к а к т о и да се оп­
р е д е л я т е в е н т у а л н и т е технически и финан­
сови възможности. При т о в а следва да се
к о н т р о л и р а т възникващите задачи по о т ­
ношение на референтни граници и граници
за т р е в о г а (опасност) по отношение на т о ч -
135
Hocmma им, и ако и м а необходимост о т н о ­
во да б ъ д а т определени.
Л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да изгради с т а н ­
д а р т и з и р а н подход при валидиране, напр.
възникващите методични особености да бъ­
д а т предвидени и определени под ф о р м а т а
н а писмено указание. Р а з р а б о т к и т е по ва-
лидирането поне за в р е м е т о н а въвеждане
н а м е т о д и к а т а т р я б в а да се с ъ х р а н я в а т . В
о п и с а н и ето н а м е т о д и к а т а т р я б в а да бъ­
д а т въведени с ъ щ е с т в е н и п а р а м е т р и , напр.
по о т н о ш е н и е н а н а д е ж д н о с т т а ( т о ч н о с т /
възпроизводимост), гранииа н а долавяне/
откриване (аналитична чувствителност),
с е л е к т и в н о с т н а изследването (аналитич­
н а спеиифичност), граниии н а п о в т о р я е ­
м о с т и/или с р а в н и м о с т ( р а б о т е н о б х в а т ,
о б х в а т н а линейност). У с т о й ч и в о с т спря­
мо външни въздействия, клинична ч у в с т в и ­
т е л н о с т и спеиифичност (граниии за взема­
не н а решение, cut off values).
СЪХРАНЕНИЕ НА БИОЛОГИЧНИТЕ
МАТЕРИАЛИ И ПРОБИ
(РЕЗЕРВНИ МОСТРИ)
Д а н н и т е з а в ъ з м о ж н о с т и т е , м я с т о т о , ус­
л о в и я т а и п р о д ъ л ж и т е л н о с т т а н а съхране­
ние н а биологични м а т е р и а л и , изследвани
м а т е р и а л и и проби (съобразно с указания з а
с т а б и л н о с т т а н а дадено изследвано вещес­
т в о ) т р я б в а да се п р е д л а г а т под ф о р м а т а
н а с т а н д а р т н и указания. При т о в а освен
с т а б и л н о с т т а , т р я б в а да бъде указано и по­
л у ч а в а н е т о н а биологичните м а т е р и а л и /
първични проби ( п у н к т а т и , ликвор), ако т о ­
ва е оправдано или наложително.
ВЪТРЕШЕН КАЧЕСТВЕН КОНТРОЛ
lDV-правилата, з а к о н ъ т з а медицинските про­
д у к т и , к а к т о и специално п р а в и л а т а н а бундес-
к а м е р а т а з а осигуряване н а к а ч е с т в о т о в ме­
дицинските лаборатории, с ъ д ъ р ж а т поредица
о т к о н к р е т н и изисквания з а мерки за провеж­
дане н а с т а т и с т и ч е с к и к а ч е с т в е н к о н т р о л и
изисквания за н а д е ж д н о с т т а н а р е з у л т а т и т е .
Те т р я б в а безусловно да се с п а з в а т о т лабора­
т о р и и т е , к а т о д о п ъ л н е н и я т а в т а з и глава са­
мо д о п ъ л в а т т е м а т а .
Препоръчва се общо, л а б о р а т о р и я т а д а из­
хожда о т приложение 1 н а П р а в и л а т а н а бун-
136
д е с к а м е р а т а за осигуряване н а к а ч е с т в о т о в ме­
дицинските лаборатории.
ВЪНШНО ОСИГУРЯВАНЕ
НА КАЧЕСТВОТО
Д и р е к т и в а т а за in vitro д и а г н о с т и к а т а н а EG
о с т а в я в ъ з м о ж н о с т за изпълнение на предписа­
н и я т а за външно осигуряване н а к а ч е с т в о т о в
с ъ о т в е т с т в и е с националните предписания. Те
се о п р е д е л я т по-точно о т закона за медицинс­
к и т е продукти и с ъ о т в е т н и т е прилежащи пред­
писания, к а к т о и специално о т Правилника н а
б у н д е с к а м е р а т а за осигуряване н а к а ч е с т в о т о
в медицинските лаборатории. Те т р я б в а да се
с п а з в а т о т всяка лаборатория, т а к а че в нас­
т о я щ и я д о к у м е н т не се п р е д л а г а т допълнител­
ни указания. Па л а б о р а т о р и и т е се препоръчва
да п о л з в а т к а т а л о г а в Правилника н а бундеска­
м е р а т а за осигуряване н а к а ч е с т в о т о в меди­
ц и н с к и т е лаборатории за у ч а с т и е в национал­
н и т е външни проверки за к а ч е с т в о т о .
СЛЕДАНАЛИТИЧЕН СТАДИЙ
Съобщаване н а р е з у л т а т и т е
В ц е н т ъ р а н а следаналитичния с т а д и й с т о и
с ъ о б щ а в а н е т о н а р е з у л т а т и т е , т . е . преда­
в а н е т о н а л а б о р а т о р н и т е р е з у л т а т и , на­
ходки или съобщения н а поръчалия ги. Фор­
м а т ъ т и съдържанието н а д о к у м е н т и т е са
свързани в една р а б о т н а цялост. Лаборатор­
н и т е съобщения, особено с ъ д ъ р ж а щ и т е се
в т я х цифрови с т о й н о с т и и р а з м е р и т е им
т р я б в а да б ъ д а т лесни за ч е т е н е . Лабора­
т о р н и т е съобщения и находки не т р я б в а да
се п р е д а в а т непосредствено н а п а ц и е н т и ­
т е или пробандите, а чрез с ъ о т в е т н о на­
т о в а р е н и лица, отговорни з а т о в а . По же­
лание на п а ц и е н т а или пробанда може да се
дава к о п и е о т р е з у л т а т а , к о е т о люже
д а се п о л у ч и с а л ю чрез лекуващия ле­
кар, к о й т о е н а з н а ч и л и з с л е д в а н е т о .
При к р и т и ч н и лабораторни находки (напр.
при о с т р и з а с т р а ш а в а щ и ж и в о т а с ъ с т о я ­
ния, неопластични заболявания, опасни ин­
фекции, HIV и бременност, к о г а т о у с т а н о ­
в е н о т о о т лекаря е неделимо о т лаборатор­
н и т е р е з у л т а т и ) може да се п о с т ъ п и в за­
в и с и м о с т о т з а к о н о в и т е разпоредби н а
страната.
К о г а т о л а б о р а т о р н и т е изследвания се
п р о в е ж д а т з а научни или с т а т и с т и ч е с к и
цели, или в р а м к и т е н а мерки з а осигурява­
не на к а ч е с т в о т о , т о в а т р я б в а да бъде оз­
начено и н а първо м я с т о по правило - приз­
н а т и т е данни за специфичност, чувстви­
т е л н о с т , т о ч н о с т , аналитична чувстви­
т е л н о с т и о т с ъ с т в и е т о н а интерференции.
В определени, обосновани случаи (напр.
спешни случаи) л а б о р а т о р н и т е р е з у л т а т и
и находки т р я б в а д а б ъ д а т н а разположе­
ние веднага щом б ъ д а т получени, с ъ о т в е т ­
но установени.
За предаване н а л а б о р а т о р н и т е р е з у л т а ­
т и и находки посредст вом телефон, т е л е ­
факс, e-mail или други еле кт рон н и носители
(напр. дискети, CD) и с р е д с т в а ( и н т е р н е т ,
и н т р а н е т ) т р я б в а да има с т а н д а р т н и
предписания най-вече по о т н о ш е н и е н а пе­
риода о т време з а предаване н а р е з у л т а т и ­
т е след п о с т ъ п в а н е т о н а спесимена/пър-
в и ч н а т а проба в л а б о р а т о р и я т а , за надеж­
д н о с т т а на предаването на р е з у л т а т и т е ,
за и д е н т и ф и к а ц и я т а н а п р и е м а щ о т о лице
и за съхранение н а д а н н и т е .
Съдържание
на л а б о р а т о р н о т о съобщение
З а у ъ л Ж и т с л н о с ъ у ъ р Ж с и ш с . Лаборатор­
н и т е съобщения т р я б в а да с ъ д ъ р ж а т след­
н и т е данни к а т о минимално изискване:
• Име и презиме, д а т а н а раждане и пол на
п а ц и е н т а или пробанда: т е з и изходни дан­
ни т р я б в а да се ч е т а т лесно и без съмне­
ние, доколкото о т т о в а зависи разпреде­
лението на р е з у л т а т и т е и и н т е р п р е т а ­
ц и я т а им.
• Д а т а и час н а вземане н а спесимена/пър-
в и ч н а т а проба, ако т е са и з в е с т н и .
• М я с т о н а вземане н а спесимена/първич-
н а т а проба, ако т о е и з в е с т н о .
• Д а т а и час н а получаване н а спесимена/
п ъ р в и ч н а т а проба в л а б о р а т о р и я т а ( о т ­
п е ч а т ъ к з а р е г и с т р а ц и я в ла б орат орн а­
т а информационна с и с т е м а ) .
• Д а т а и час на установяване на лаборатор­
ния р е з у л т а т ( о т п е ч а т в а н е ) , при к о е т о
лесно да може да се о т л и ч а в а т дублика­
ти.
• Изпращач и вид на спесимена/първична-
т а проба.
• Указания за с ъ с т о я н и е т о н а спесимена/
п ъ р в и ч н а т а проба, к о г а т о т о може да
има влияние върху получените р е з у л т а т и
(напр. силна м ъ т н и н а , а т и п и ч н а мириз­
ма, онечиствания, неподходяща т е м п е р а ­
т у р а , погрешно вземане).
• Указания за с ъ с т о я н и е т о на лаборатор­
н а т а проба, к о г а т о т о може да има влия­
ние върху получените р е з у л т а т и (напр.
хемолиза, липемия, разпенване, оцветява­
не, съсиреци, нехомогенност).
• Указания за н а з н а ч а в а н и т е изследвания
или поне на г р у п а т а изследвания, към ко­
и т о спада т ъ р с е н и я п а р а м е т ъ р .
• Ясно и недвусмислено идентифициране н а
изследваните п а р а м е т р и , означени с т о й ­
н о с т и , величини или р е з у л т а т и о т наб­
людението.
• При микробиологични изследвания: данни
о т предходни изследвания с описание (мик-
роскопиране, култури, намерени микроор­
ганизми, с ъ о т в е т н о брой на микробите/
колониите).
• А н т и б и о г р а м а / р е з и с т е н т н о с т , прило­
жен м е т о д : серологична/молекулярнобио-
логична а н т и г е н н а находка; други у с т а ­
новени данни (провеждащи се изследвания/
ß ход, причина за забавяне).
• П р и с п е ш н и и з с л е д в а н и я : т о ч н и дан­
ни за д а т а и час на вземане на спесиме-
н а / п ъ р в и ч н а т а проба; време на п о с т ъ п ­
ване на спесимена/първичната проба в ла­
б о р а т о р и я т а (респективно о т ч е т е н о
време о т л а б о р а т о р н а т а информационна
система), време н а предаване на лабора­
т о р н и т е р е з у л т а т и или находки (съот­
в е т н о и на ч а с т о т горе посочените), дан­
ни за и н с т и т у ц и я т а , с ъ о т в е т н о лицето),
н а к о е т о са предадени р е з у л т а т и т е
(напр. отделение, факс, лекар, сестра).
• Д а т а и час н а предаване на лабораторни­
т е р е з у л т а т и (в някои случаи желателно
или при възможност).
• Референтни интервали. Доколкото т е з и
не са специално съобщени, т р я б в а най-
малко да б ъ д а т предоставени на разполо­
жение.
ф а к у л т а т и в н о съдържание н а лабо­
р а т о р н о т о съобщение. Лабораторните
съобщения м о г а т или т р я б в а , ако т о в а се
137
изисква или е иелесъобразно да с ъ д ъ р ж а т
следните данни:
• Местоживеене н а п а и и е н т а или нробан-
да.
• Спеииални задачи з а о б р а б о т к а т а н а спе-
с и м е н а / п ъ р в и ч н а т а проба.
• Данни за а н а л и т и ч н а т а ч у в с т в и т е л н о с т .
• Идентификаиия н а извършващия изслед­
ването.
• Данни за изследването н а интерферира-
щи с анализа в е щ е с т в а .
• Данни дали при изследване н а л е к а р с т в а в
биологични т е ч н о с т и се касае за върхови
или минимални нива.
Д а н н и т е о т н о с н о р е ф е р е н т н и т е грани-
ии т р я б в а да б ъ д а т предоставени н а раз­
положение н а п о т р е б и т е л я ; т о в а може да
бъде независимо о т л а б о р а т о р н и т е съобще­
ния, напр. под ф о р м а т а н а о т п е ч а т ъ и и ,
т а б л и и и или данни, предадени чрез е л е к т ­
ронна поща. Препоръчва се референтните
граници да се дават върху лабораторните
съобщения, доколкото това облекчава зна­
чимо интерпретацията на резултатите.
Данни о т н о с н о н е с и г у р н о с т т а на изслед­
в а н е т о (uncertainity), доколкото т е с а поз­
н а т и са много полезни при лабораторно-ме-
д и и и н с к а т а и л е к а р с к а т а оиенка н а лабора­
т о р н и т е находки. При определени п а р а м е т ­
ри или понякога при групи п а р а м е т р и т а ­
кива данни м о г а т да б ъ д а т събрани и пре­
д о с т а в е н и о т л а б о р а т о р и я т а . Общо в з е т о
е д о с т а т ъ ч н о , к о г а т о д а н н и т е за несигур­
н о с т т а н а изследването се п р е д о с т а в я т в
л а б о р а т о р н и я справочник.
З а д а ч и т е з а м е д и и и н с к а т а преиенка об­
х в а щ а т оиенка и и н т е р п р е т а и и я н а всички
лабораторни р е з у л т а т и . З а д а ч и т е за лабо­
р а т о р н и я лекар при и н т е р п р е т а и и я н а на­
х о д к а т а о б х в а щ а т лекарска оиенка н а ре­
з у л т а т и т е и л а б о р а т о р н и т е находки, ка­
т о се и м а т предвид п о с т а в е н и т е към лабо­
р а т о р и я т а въпроси, а н а м н е з а т а , с и м п т о ­
м а т и к а т а и д а н н и т е при предварителни­
т е изследвания и н а с т о я щ о т о с ъ с т о я н и е с
оглед о п т и м и р а н е н а д и а г н о з а т а , т е р а п и я ­
т а и прогнозата.
Медииинската преиенка, т . е . к о м п е т е н ­
т н а т а , ясна и професионална и н т е р п р е т а ­
иия и преиенка е особено незаменима при из­
следвания, к о и т о о б х в а щ а т спеииални ана­
138
л и т и ч н и въпроси (напр. медикаменти, пун-
к т а т и , т у м о р н и маркери, хормони, ликвор,
серологични и микробиологични изследва­
ния).
Съхранение
на л а б о р а т о р н и т е съобщения
Данни за в ъ з м о ж н о с т и т е , м я с т о т о , усло­
в и я т а и п р о д ъ л ж и т е л н о с т т а на съхранение
н а л а б о р а т о р н и т е съобщения т р я б в а да бъ­
д а т п о д г о т в е н и във ф о р ма н а у к а з а н и я .
Трябва да се п р е д в и д я т особени мерки при
съхраняване върху е л е к т р о н н и носители.
При т о в а т р я б в а да б ъ д а т дадени указания
з а съхранение н а и н ф о р м а и и я т а и съдебно-
медииински данни.
Отстраняване на отпадъците
В р а б о т н и т е указания т р я б в а да се съдър­
ж а т инструкиии з а о т с т р а н я в а н е н а о т -
п а д ъ и и т е . Те включват: излишни вече спе-
симени и проби, реактивни смеси след за­
вършване на анализите, неизползвани реак­
тиви и консумативи, промивни течности,
радиоактивни (маркирани) вещества и об­
щи отпадъци (напр. хартия, ръкавици, пи-
петни връхчета, материали, които са вече
неизползваеми, помощни средства и апара­
ти, както и лабораторни съобщения и до­
кументи от всякакъв порядък). При т о в а
т р я б в а да се с п а з в а т законовите разпоред­
би (напр. за обеззаразяване, изхвърляне н а
химикали (не смесващи се с вода р а з т в о р и и
токсични химикали) з а п р е д о т в р а т я в а н е на
н е щ а с т н и случаи и за биологична сигурност,
особено при р а б о т а с инфеюдиозни м а т е р и ­
али.
Диферени,иране между потенииални и си­
гурни инфекциозни, респ. инфектирани ма­
т е р и а л и е желателно. Препоръки за персо­
нала извън непосредствено з а е т и т е в лабо­
р а т о р и я т а (напр. лекари, п о ч и с т в а щ пер­
сонал, обгрижващ персонал, помощен персо­
нал, сътрудници н а външни служби за почис­
т в а н е и изхвърляне н а боклук и технически
персонал о т външни фирми) също са полез­
ни, особено в случаи за опасни вещества, по­
ради к о е т о също т р я б в а да б ъ д а т включе­
ни в р а б о т н и т е указания.
 При изхвърляне н а писмени или електрон-
но-съхранявани документи т р я б в а да б ъ д а т
посочени данни з а определения срок за съх­
ранение.
З а к л ю ч е н и е . И з г о т в я н е т о н а правила з а
Добра лабораторна практика произтича о т
п р е з у м п ц и я т а , че о т д е л н и т е процеси мо­
г а т да се о п р е д е л я т със с т а н д а р т и з и р у е -
ми единици. Това е възможно за техничес­
к а т а ч а с т н а анализа, но при генерирането
и о б м я н а т а н а информация, особено при кон­
с у л т и р а н е т о , сме все още н а изходни пози­
ции. С т а р т о в а т о ч к а може да бъде възпри­
е м а н е т о н а с т р а т е г и я за решаване на проб­
леми в медицинските лаборатории, к о и т о
да се п р и л а г а т и към по-сложни комплекси
о т въпроси. О т значение ще бъде и разра­
б о т в а н е т о н а т а к и в а с т р а т е г и и в главни­
т е о б л а с т и к а т о диагноза, прогноза, т е р а ­
пе в т ич е н контрол, изследване на жизнени
функции в и н т е н з и в н и т е отделения и т . н .
Друг о т к р и т въпрос е използването н а ком­
п ю т р и при и н т е р п р е т и р а н е н а р е з у л т а т и
о т анализите. Важно условие е наличието
н а база данни при и н т е р п р е т а ц и я т а и кон­
с у л т и р а н е т о , к а к т о и необходимост резул­
т а т и т е о т р а з л и ч н и т е групи м е т о д и (кли-
КНИГОПИС
Наредба № 1 н а М З о т 27.04.2(Ю0 за критериите, показателите
и методиката на акредитания н а лечебните заведения за бол­
нична п о м о щ и диагностично-консултативните центрове
Д В 38/9.05,2000.
Български д ъ р ж а в е н с т а н д а р т / Б Д С E N 30012-1/ Изисквания
за осигуряване на качеството н о средствата за измерване.
Част 1; С и с т е м а за м е т р о л о г и ч н о потвърждаване на средс­
т в а за измерване. С о ф и я , Стандартизация, март 1999.
Български д ъ р ж а в е н стандарт / Б Д С E N 4 5 0 0 1 / О б щ и крите­
рии за д е й н о с т т а на изпитвателните лаборатории. С о ф и я ,
Стандартизация, април 1993.
Български д ъ р ж а в е н с т а н д а р т / Б Д С E N 30011-1 (ISO 10011 -
1)/ Указания за одит на с и с т е м и п о качеството. София, Стаи-
дартизация, юли 1998.
Комитет п о стандарт изация и метрология. Ръководство за със­
тавяне на наръчник по качеството н а лаборатории за изпит­
ване и/или калибриране. Стандартизация, С о ф и я , 1996.
Процедура з а акредитация на лаборатории за изпитване и/или
калибриране Българска с л у ж б а за акредитация, С о ф и я ,
1999.
11роцедура за надзор на акредитирани лаборатории Българс­
ка служба за акредитация, С о ф и я , 1999.
Процедура за оценяване и акредитация па органи по ссртифи-
кация иа системи п о качество Българска служба за акре­
дитация, С о ф и я , 1999.
Uurnett D . Understanding accreditation in laboratory medicine.
London, Л Н С Venture, 1996.
H U 4 H O - X U M U 4 H U , имунологични, молекулярно-
биологични, клетъчно-биологични и т. н . ), да
се комбинират в подходяща форма. Клинич­
н и т е лаборатории и м а т основна роля в ди-
агностично-лечебния процес, к о е т о включ­
ва наличие в т я х н а комплексни познавател­
ни процеси, при к о и т о се генерира и обменя
информация, и к о и т о процеси т р я б в а да се
о т ч и т а т при изготвяне на п р а в и л а т а з а
д о б р а т а л а б о р а т о р н а п р а к т и к а , респ.
за добрите лабораторни услуги.
Диалогът между лаборатория и клиника
е п о с т о я н е н . Л е к у в а щ и я т лекар п о с т а в я
своя въпрос и л а б о р а т о р и я т а му осигурява
отговор. В повечето лаборатории резулта­
т и т е се п р е д а в а т към клиниките к а т о пис­
мена справка. Това е възможно при с т а н д а р ­
т н и изследвания или при некомплицирани
случаи при условие, че към р е з у л т а т а се да­
в а т референтни с т о й н о с т и , интерферен-
ции и т . н . При сложни случаи т о в а не е дос­
т а т ъ ч н о , напр. при определени когулацион-
ни изследвания, молекулярнобиологични ана­
лизи, ф л о у ц и т о м е т р и я , съмнителни диаг­
ностични случаи. Тогава се налага вербална
обмяна на информация (консултация). Ефек­
т и в н а т а консултация зависи о т з н а н и я т а
и опита, натрупан в лабораторията.
Burnett D. Medical laboratory accreditation - the road ahead. Clin
C h e m Lab Med, 37, 1999, Spec. Suppl. 1, 64.
CPA. Standards for accreditation. London, CPA, 1991.
E N 4 5 001 Allgemeine Kriterien z u m Betreiben von
Prüflaboratorien. Brüssel, CEN\Cenelec, 1989.
European Confederation o f Laboratory medicine. Accreditation for
medical laboratories EAL-G25; E C L M - 1
l a b o r A. Accreditation in candidate E U countries and other coun­
tries. Clin C h e m Lab Med, 37, 1999, Spec. Suppl. 1, 64.
Jansen RTP. Accreditation in the European Union: Where we are,
where should w e go. Clin C h e m Lab Med, 37, 1999, Spec.
Suppl. 1, 6 3 .
McQueen M l . Accreditation. In: Majkic-Singh N (ed). Advances
in l a b o r a t o r y Medicine, Belgrade, YuSMB, 1996, 151-162.
Palicka V. Accreditation in clinical chemistry: Benefit for patients,
clinical chemistry o r healthcare system? Clin Chem Lab Med,
37, 1999, Spec. Suppl. 1, 63.
Rej R. Accreditation o f medical laboratories: Has quality improved?
Clin C h e m I^ib Med, 37, 1999, Spec. Suppl. 1, 64.
Shipkov T, Svinarov D, Tzvetkova T, Danev S. A simple scheme
for accreditation in clinical laboratories. BJCL, 5, 1998, 2, 27.
* * *
Arbeitsgruppe der Deutschen Diagnostika Gruppe. Gute
l a b o r d i a g n o s t i s c h e p r a x i s ( G L D P ) - K o n z e p t e i n e r guten
labordiagnostischen praxis. Clin Lab 1999, 9+10, 569-580
Büttner J. G o o d laboratory practice; the medical aspects. Eur J
Clin C h e m Clin Biochem, 35, 1997, 251-256.
139
 Основни х и м и ч е с к и п р о ц е д у р и
6 клиничната лаборатория
ЕДИНИЦИ И СИСТЕМИ
ЗА ИЗМЕРВАНЕ
НА ФИЗИЧНИ ВЕЛИЧИНИ
В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ
Т. Ц в е т к о в а
О с но в н ата задача н а к л и н и ч н а т а лаборато­
рия е да извършва анализ и измерване на ка­
ч е с т в е н и я и количествения с ъ с т а в ( к л е т ъ ­
чен и химичен) н а биологичните т е ч н о с т и
и т ъ к а н и . Всеки количествен р е з у л т а т се
п р е д с т а в я к а т о число и единица. Ч и с л о т о
о т р а з я в а и описва ч и с л о в а т а величина, а
е д и н и ц а т а н а измерване определя физичес­
к о т о свойство (величина или размер). Изме­
р и т е л н и т е единици м о г а т да б ъ д а т изра­
зени к а т о основни или производни с в о й с т ­
ва. О с н о в н о с в о й с т в о е т о в а физическо
свойство, к о е т о се дефинира със собствени
т е р м и н и (напр., време, м а с а и т .н .). Коли­
чествените резултати в клиничната
лаборатория обикновено се и з р а з я в а т к а т о
количество н а измервания к о м п о н е н т з а
единица обем или т е г л о н а п р о б а т а .
Единица н а измерВане е величината
н а определено количествено свойство. Сис­
т е м а т а е група о т единици на измерване,
използвани заедно.
В к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я са п о з н а т и
две системи на измерване: м е т р и ч н а т а
с и с т е м а и SI. Те с а р е з у л т а т о т о п и т и т е
д а се с т а н д а р т и з и р а т и з м е р в а н и я т а н а
международно ниво.
Исторически бележки. М е т р и ч н а т а система е
била използвана за първи п ъ т през 1790 г. във
Франция, а впоследствие е била възприета в по­
вечето държави. САЩ и Канада са предпочели
да използват с т а р а т а английска с и с т е м а за
мерки и теглилки, к о я т о е била разработена
* Systeme International d'Unites - М е ж д у н а р о д н а т а с и с т е м а за измерителни единици на физичните свойства (величини) е разра­
б о т е н а и п р и е т а о т международни групи по с т а н д а р т и з а ц и я на мерки и теглилки на Conference Generali des Poids e t Measures
(CGPM) през 1960 г.
140
през XIII век. Едва през 1975 г. в САЩ е приет
план за постепенно въвеждане на метричната
система. Приблизително по същото време Све­
т о в н а т а здравна организация препоръча по-лес­
но разбираемата система о т единици - SI. Тя
включва голяма ч а с т о т м е т р и ч н а т а система.
МЕТРИЧНА СИСТЕМА
М е т р и ч н а т а с и с т е м а е десетично базира­
н а с и с т е м а , с ъ в м е с т и м а с използваните в
м а т е м а т и к а т а десетични дроби. Тя включ­
ва гралг, лгетър, л и т ъ р и с е к у н д а к а т о
основни единици з а и з м е р в а н е н а т е г л о
(маса), дължина, обем и време. Предимст­
в а т а н а м е т р и ч н а т а с и с т е м а са, че изпол­
зва една и съща база при измерване н а маса,
обем и дължина, к а к т о и в ъ з м о ж н о с т т а з а
получаване н а по-малки или по-големи еди­
ници чрез умножаване по 10 н а определена
с т е п е н (10п), к а т о п е със знак ( + ), респ. (-).
С ъ о т в е т н и т е числови с т о й н о с т и и м а т
определени означения - представки: 1/1000
или 10"3, или 0.001 е A I U J L U ; 1/10 или 10"1, или
0.1 е д е ц и и т . н , , к о и т о се п о с т а в я т пред
о с н о в н а т а единица ( м е т ъ р , л и т ъ р и др.).
В т а б л . 6.1. е п р ед ставен а в р ъ з к а т а меж­
ду п р е д с т а в к и т е н а м е т р и ч н а т а с и с т е м а
с т е х н и т е символи, числов израз и с ъ с т а в ­
н о т о име.
SI ЕДИНИЦИ
За преодоляване н а объркването о т вариа­
ц и и т е н а м е т р и ч н а т а с и с т е м а (напр.
m g / d l или g/1) бе в ъ з п р и е т а измерителна
с и с т е м а , използваща д е в е т основни свойс­
т в а , о т к о и т о се о б р а з у в а т о с т а н а л и т е .
Това е Systeme International cTUnitcs*, чия­
т о а б р е в и а т у р а н а всички езици е SI. На
Таблица 6.1. Метрична система - представки, символи, съставно име, десетична степен
и числов израз
Пред Десетична
Символ Съставно и м е Числов и з р а з
ставка степен
Еха Е квинтилион 10 18
1 000 000 000 000 000 000.0
Peta P квадрилион (билиард) 1015 1 000 000 000 000 000.0
Тега T трилион 1012 1 000 000 000 000.0
Giga G билион (милиард) 109 1 000 000 000.0
Mega M милион 10б 1 000 000.0
Kilo k хиляда 103 1 000.0
Hecto h сто 102 100.0
Deca da десет 10' 10.0
Deci d една десета 101 0.1
Centi c една с т о т н а 102 0.01
Mili m една хилядна 103 0.001
Micro И една милионна ю45 0.000001
Nano n една билионна 10" 0.000000001
Pico P една трилионна 1012 0.000000000001
Femto f една квадрилионна 10 16 0.000000000000001
Atto a една квинтилионна ю 18 0.000000000000000001
Забележка: В т а б л и ц а т а след милион (106) е използвана общоприетата система - всяко следващо съставно
име отразява предходното умножено no 103. Срещат се и източници, в които посочените съставни имена
(след 106) о т р а з я в а т предходното умножено по 10в, например билион = 1012 (106х106); трилион = 1018 (106х1012);
квадрилион = 1024 (ЮЪсЮ1*); квинтилион = 1030 (ЮЪсЮ24).

т а б л . 6.2. са показани 9 - т е основни с в о й с т ­ kilo - к). П р е д с т а в к и т е се п и ш а т с л я т о с

ва и с в ъ р з а н и т е с т я х единици и символи.
П р е д с т а в к и т е , т е х н и т е символи и ф а к т о ­
ри (10п), показани в т а б л . 6.1. се и зп олзват
също и за изразяване н а подединиците и мно­
г о к р а т н и т е н а о с н о в н и т е SI единици.
Някои о т SI е д и н и ц и т е и м а т символи с
главна буква (келвин - К, ампер - А), за да се
избегне объркването с п р е д с т а в к и т е , изпол­
зващи същия буквен символ (напр. atto - а;
ед и н и ц ата. О т п р е д с т а в к и т е , посочени в
т а б л . 6.1, се препоръчва използването н а
т е з и , к о и т о са к р а т н и на 103 (не се у п о т р е ­
б я в а т п р е д с т а в к и т е hecto, deca, deci и
centi).
Пякои о т и з п о л з в а н и т е в к л и н и ч н а т а
лаборатория единици не са съвместими с
д е в е т т е основни SI единици: м и н у т а (min),
час (h), ден (d) и л и т ъ р (1). През 1964 г. CGPM

Т а б л и ц а 6.2. Основни SI единици

Основно Символ н а Име на Символ н а
свойство свойството единицата единицата
Дължина метър т
Маса т килограм kg
Количество вещество п мол mol
Време t секунда s
Големина на ампер Л
електричен т о к
Термодинамична келвин К
температура
И н т е н з и т е т на кандела cd
светлина
Равнинен ъгъл о, ß, Y
> 0, Ф радиан rad
Пространствен ъгъл 0) стерадиан sr
141
препоръча използването н а л и т ъ р а к а т о
специален т е р м и н з а кубичен д е ц и м е т ъ р - 1
dm 3 ( л и т ъ р ъ т е 0.001 т 3 или 10'3 т 3 ) . Основ­
но се п о л з в а т п р е д с т а в к и т е м и л и - , м и / с -
р о - и н а н о л и т ъ р {и\\\\\-, micro-, nanoliter).
Съгл асно п р е п о р ъ к и т е н а СЗО, IFCC и
С в е т о в н а т а а с о ц и а ц и я н а д р у ж е с т в о т о по
а н а т о м и ч н а и клинична п а т о л о г и я в съоб­
р а ж е н и е с а с л е д н и т е п р а к т и ч е с к и насоки:
• к о н ц е н т р а ц и я т а н а всички с ъ с т а в к и , чи­
я т о химична с т р у к т у р а и молекулна
м а с а с а и з в е с т н и , се и з р а з я в а к а т о кон­
центрация на количеството вещество
(mol/1, mmol/1 или |дто1/1). Ио т о з и н а ч и н
се и з р а з я в а к о н ц е н т р а ц и я т а н а по-голя-
м а ч а с т о т к л и н и ч н о - х и м и ч н и т е показа­
т е л и , с к о е т о п р е д с т а в а т а з а взаимо­
д е й с т в и я т а и п р е в р ъ щ а н и я т а н а биоло­
г и ч н и т е с ъ с т а в к и и в е щ е с т в а в човеш­
к и я о р г а н и з ъ м е много т о ч н а .
• К о н ц е н т р а ц и я т а н а всички в е щ е с т в а с
неизяснени молекулна м а с а и с т р о е ж се
и з р а з я в а к а т о g/1 или mg/1. По с ъ щ и я н а ­
чин се и з р а з я в а и к о н ц е н т р а ц и я т а н а
различни с ъ с т а в н и в е щ е с т в а (общ серу­
м е н б е л т ъ к ) , а с ъ щ о и н а няко и м а к р о м о -
лекули (фибриноген, хемоглобин и пр.).
• Б р о я т н а ф о р м е н и т е е л е м е н т и н а кръв­
т а се и з р а з я в а н а л и т ъ р , а н е в микроли-
т ъ р кръв, (11 = 10° |.d), т . е . ф а к т о р ъ т е
106; х е м а т о к р и т ъ т се и з р а з я в а к а т о де­
с е т и ч н а дроб (0.44); ф о р м е н и т е елемен­
т и в л е в к о ц и т н а т а формула се и з р а з я ­
в а т с ъ щ о к а т о д е с е т и ч н а дроб, но съг­
ласно БДС е д о п у с т и м а и у п о т р е б а т а н а
п р о ц е н т (%), По БДС е д о п у с т и м а с ъ щ о и
у п о т р е б а т а н а промил (%о), н а п р и м е р при
р е т и к у л о ц и т е н брой.
• З а и з р а з я в а н е н а а к т и в н о с т т а н а ензи­
м и т е все о щ е се използва единица ензим­
н а а к т и в н о с т (U) н а л и т ъ р биологична
т е ч н о с т (U/1). З а преизчисляване в нано-
к а т а л и се използва ф а к т о р ъ т 16.67, т . е .
Ш = 16.67 n e a t .
З а к л ю ч е н и е : Въпреки че у нас о т д а в н а с а
внедрени SI е д и н и ц и т е , с ч и т а м е че изложе­
н и т е данни щ е п о д п о м о г н а т л е к а р и т е , спе­
циализиращи клинична л а б о р а т о р и я в раз­
б и р а н е т о и п р е и з ч и с л я в а н е т о н а единици­
т е н а измерване, необходимо з а у с в о я в а н е
на специалността.
142
ВОДАТА В КЛИНИЧНАТА
ЛАБОРАТОРИЯ
ИЗИСКВАНИЯ И КРИТЕРИИ
Т. Ц в е т к о в а
ВИДОВЕ ВОДА
ЗА ЛАБОРАТОРНИ ЦЕЛИ
В о д а т а е н а й - ч е с т о и най-широко използва­
н и я "реактив" в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я .
В з а в и с и м о с т о т п р и л о ж е н и е т о ü се изиск­
в а различна с т е п е н н а ч и с т о т а , подобно н а
и з и с к в а н и я т а к ъ м п о л з в а н и т е химикали и
р е а к т и в и . Не с ъ щ е с т в у в а е с т е с т в е н и з т о ч ­
ник н а вода, к о й т о д а е с д о с т а т ъ ч н а чис­
т о т а , з а д а бъде ползван в л а б о р а т о р и я т а
без о п р е д е л е н и п р е ч и с т в а щ и п р о ц е д у р и .
Дори д ъ ж д о в н а т а вода с ъ д ъ р ж а р а з т в о р е ­
ни в е щ е с т в а к а т о С0 2 , N2 и различни а з о т ­
ни окиси. К а т о вода о т п о в ъ р х н о с т н и т е во­
д о и з т о ч н и ц и т я д о п ъ л н и т е л н о се з а м ъ р с я ­
в а и включва д в а т а вида йони - п о л о ж и т е л ­
но и о т р и ц а т е л н о заредени (Na + , Са 2 + , Mg 2 + ,
Fe 2 + , ПСО3, SO'f, СГ, NO3). Освен т о в а в т е з и
води се н а м и р а т различни органични със­
т а в к и - б а к т е р и и , м и к р о о р г а н и з м и и д р.
Вода б о г а т а н а Са 2 + , M g 2 + или Fe 2 + и други
е л е м е н т и н е м о ж е д а се ползва з а клинични
или а н а л и т и ч н и процедури без подходящо
о ч и с т в а н е . Най-общо и з п о л з в а н а т а з а лабо­
р а т о р н и цели вода бива няколко вида:
1. Т е ч а щ а ч е ш м я п а ( В о д о п р о В о д н а )
Иоца. Т я м о ж е д а се използва с а м о з а обик­
новено измиване н а с ъ д о в е т е .
2. Д е с т и л и р а н а б о д а . Използва се з а раз­
лични л а б о р а т о р н и цели, к а к т о и з а измива­
не н а с ъ д о в е т е (крайно проплакване).
3. Д Н о й н о д е с т и л и р а н а Вода. Получава се
с а м о в изцяло с т ъ к л е н а д е с т и л а ц и о н н а сис­
т е м а . К о н ц е н т р а ц и я т а н а йони е минимал­
н а и в о д а т а не с ъ д ъ р ж а редуциращи вещес­
т в а . При осигуряване и спазване н а опреде­
лени условия м о ж е д а се получи н а п р а во в
с т е р и л н о с ъ с т о я н и е . Използва се предимно
з а п р и г о т в я н е н а р е а к т и в и и рядко з а край­
но и з м и в а н е н а с ъ д о в е т е , най-вече поради
малкия д е б и т на а п а р а т и т е .
4. Д е м и н е р а л и з и р а н а ( д е й о н и з и р а н а )
Вода. Получава се чрез йонообменни а п а р а ­
т и , с въ р з а н и н а п р а в о к ъ м ч е ш м а т а . Тази
вода е с най-ниска к о н ц е н т р а ц и я н а йони.
МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ
НА ВОДАТА
Всички м е т о д и з а п р е ч и с т в а н е се п р и л а г а т
към ч е ш м я н а т а вода ( о т дълбоки или повър­
х н о с т н и водоизточници), к о я т о съдържа
разнообразни в е щ е с т в а : амониеви йони, хло­
рид, въглероден диоксид, к а р б о н а т и , бикар­
б о н а т и , калций, магнезий, желязо, манган,
н и т р а т и и н и т р и т и , кислород, ф о с ф а т и ,
силициеви примеси, н а т р и й , калий, сулфиди
и сулфати, цинк, някои р а з т в о р е н и т в ъ р д и
в е щ е с т в а ( т е о с т а в а т след изпаряване на
в о д а т а ) и др. Освен изброените примеси се
п р и б а в я т още и микробни, и други органич­
ни замърсители.
За о ч и с т в а н е н а в о д а т а о т съдържащи­
т е се в нея примеси се и з п о л з в а т различни
методи:
• Д е й о н и з а ц и я . При т о з и м е т о д се о т ­
с т р а н я в а т йони и минерали с п о м о щ т а на
с и н т е т и ч н и йонообменни смоли.
• Адсорбцин. М е т о д ъ т е свързан с изпол­
зване н а в е щ е с т в а , к о и т о м о г а т да поглъ­
щ а т други в е щ е с т в а . Например активни­
я т въглен о т с т р а н я в а о т в о д а т а хлориди
и органични примеси.
• Ф и л т р а ц и и . Използва се к а т о предва­
р и т е л н а или с а м о с т о я т е л н а процедура. Во­
д а т а преминава при е с т е с т в е н о налягане
през ф и л т ъ р със специфична порьозност.
Ф и л т ъ р ъ т задържа п о в е ч е т о ч а с т и ц и .
• У л т р а ф и л т р а ц и н . Използва се за о т с ­
т р а н я в а н е н а пирогенни в е щ е с т в а и б а к т е ­
рии. В о д а т а преминава под налягане през
Т а б л и ц а 6.3. Възможности на о т д е л н и т е м е т о д и за о т с т р а н я в а н е на различни примеси във вода-
тга
Memocju па
Йонизирани Органични
очисшИапс
Вещества вещества
Дейонизация +++ 0 +++
Адсорбция 0 +++
Филтрация 0 0
Ултрафилтрация 0 ++
О б р а т н а осмоза ++ ++
Дестилация +++/++ ++
UV - оксидация 0 ++
( -f + -f ) - отлично очистване; ( + + ) - цобро очистване - , (0)- слабо (jo липсващо очистване
мембрана с размер на п о р и т е под 0.005 mm,
при к о е т о се з а д ъ р ж а т всички ч а с т и ц и над
т о з и размер.
• О б р а т н а о с м о з а (RO). Използва се за
предварително очистване. Еднакви количес­
т в а о т ч и с т а вода и сблев р а з т в о р са раз­
делени с полупропусклива мембрана в U-вид-
на т р ъ б а . При прилагане н а външно наляга­
не към с т р а н а т а н а солевия разтвор, по­
лупропускливата мембрана позволява пре­
минаване на в о д а т а , д о к а т о солите се кон­
ц е н т р и р а т и изхвърлят в о б р а т н а т а вода.
Сегашните с и с т е м и включват предварите­
лен модул, през к о й т о водопроводната вода
преминава преди п о с т ъ п в а н е т о ü в RO-ka-
с е т а т а . По т о з и начин чрез комбиниране на
филтрация, адсорбция през а к т и в е н въглен
и при добавяне н а специални с ъ с т а в к и се
предпазва RO м е м б р а н а т а о т замърсяване
и затлачване, о т хлорно въздействие и об­
разуване на к о т л е н камък. RO м е м б р а н а т а
позволява о т с т р а н я в а н е на > 90% монова-
л е н т н и йони, > 95% поливалентни йони, раз­
т в о р е н и органични с ъ с т а в к и , ч а с т и ц и и
микроорганизми > 99%.
• Д е с т и л а ц и я . Това е процес, при к о й т о
в о д а т а се загрява до преминаване в газооб­
разно състояние, след к о е т о рекондензира
в отделен съд.
• О к и с л е и и е е у л т р а в и о л е т о в а (UV)
с б е т л и н а . При т о з и м е т о д в о д а т а преми­
нава през UV светлина, при к о е т о се разру­
ш а в а т бактерии, вируси и всякакви следи о т
органични в е щ е с т в а .
В ъ з м о ж н о с т и т е на изброените м е т о д и
за о т с т р а н я в а н е на о т д е л н и т е примеси във
в о д а т а са представени в т а б л . 6.3.
Примеси
Йонизирани ,, Пирогенни
' Частици Бактерии
газове вещества
0 0 0
0 0 0 0
0 +++ +++ 0
0 +++ +++ +++
0 +++ +++ +++
0 +++ +++ +++
0 о ++ 0
143
ИЗИСКВАНИЯ К Ъ М КАЧЕСТВОТО
НА ВОДАТА З А Л А Б О Р А Т О Р Н И Ц Е Л И
СПЕЦИФИКАЦИИ
За к а ч е с т в о т о н а в о д а т а в к л и н и ч н а т а ла­
б о р а т о р и я е в ъ з п р и е т препоръчания о т
Наиионалния к о м и т е т з а клинично-лабора-
т о р н и с т а н д а р т и н а САЩ т е р м и н степен
на чистота (reagent grade water). Използва
се с т е п е н у в а н е чрез означаване к а т о вода
със с т е п е н п а ч и с т о т а I т и п , 11 т и п и
111 т и п . О с н о в н а т а ц е л п р и у с т а н о в я ­
ване н а стандарти з а качествата на
в о д а т а с д а с е п о л у ч и у в е р е н и е , ч е nui
е подходяща з а приготвяне н а реакти­
в и и з а п р о в е Ж д а н е н а ансиьизи, т.е. т я
и м а с ъ о т в е т н а т а степен н а чисто­
та.
За определяне к а ч е с т в о т о н а в о д а т а или
н е й н а т а с т е п е н н а ч и с т о т а се п р и л а г а т
различни проиедури:
• и з м е р в а н е н а с ъ п р о т и в л е н и е т о , респ.
проводимостта на водата,
• измерване pH н а в о д а т а ,
• определяне брой микробни колонии (напр.
колиформи) върху селективна или неселек-
т и в н а среда,
• определяне н а йони,
• определяне н а н и т р и т и и н и т р а т и ,
• определяне н а т е ж к и м е т а л и и пр.
В п р а к т и к а т а з а определяне н а т и п о в е ­
т е вода най-често се използва измерване н а
съпротивлението н а в о д а т а в о м о в е ( Q / c m )
или н е й н а т а проводимост в л т к р о с и м е н -
с и (\is/cm). Д о к а т о с ъ п р о т и в л е н и е т о н а
0.05% р а з т в о р н а NaCl е 1000 Q/cm, н а морс­
Т а б л и ц а 6.4. Водата в клиничната лаборатория - степен на ч и с т о т а {препоръки н а Commission on
Inspection a n d Accreditation f o rWater Quality Control, и на College o fAmerican Pathologists)
Спецификация
Tun I
0
Съпротивление (MQ/cm, 25 С) 10.00
Силикати (mg/1, к а т о Si0 2 ) 0.05
pH
Микробно число (CFU/ml)* 10
Частици ( > 0.2 ц т ) < 500/1
Органични съставки използван е
. не се определят
активен въглен
*CFU/ml - колония формиращи единици
144
к а т а вода - 50 Q/cm, н а H2SO4 - 1 Q/cm, т о
н а дейонизираната вода е > 10MQ/cm, т . е .
ч и с т а т а вода, к о я т о е свободна о т йони има
голямо електрическо съпротивление и е лош
проводник н а електрическия т о к . Например
ч е ш м я н а т а вода показва висока проводи­
м о с т - 2 9 0 f.is/cm, а при деминерализирана-
т а т я е много ниска - 0.20 | i s / c m . З а в и с и -
л ю с т т а м е Ж д у ч и с т о т а т а н а вода­
т а и съпротивлението е л и н е й н а - ви­
с о к а ч и с т о т а и голялго съпротивле­
ние, а п о о т н о ш е н и е н а п р о в о д и м о с т ­
т а е обратна - висока чистота и сла­
б а п р о в о д и л ю с т ( т а б л . 6.4). Само т о в а
измерване не е д о с т а т ъ ч н о за определяне н а
и с т и н с к а т а ч и с т о т а на в о д а т а , т ъ й к а т о
наличието н а нейонни замърсители оказва
нищожен е ф е к т върху съпротивлението. За
някои изследвания ( т е ж к и м е т а л и , олигое-
л е м е н т и ) т р я б в а д а се п у с к а т проби н а
в о д а т а (blanks), за да се определи т о ч н а т а
к о н и е н т р а и и я н а м е т а л и т е във в о д а т а ,
използвана з а п р и г о т в я н е н а р е а к т и в и т е ,
к а к т о и проби н а вода след 24 h п р е с т о й в
л а б о р а т о р н и т е съдове, у ч а с т в а щ и в
анализите, за да се провери к а ч е с т в о т о н а
м а т е р и а л а ( с т ъ к л о или п л а с т м а с а ) , о т
к о й т о са изготвени, с к о е т о да се предотв­
р а т и е в е н т у а л н а интерферениия върху ре­
зултатите.
Препоръките н а CAP {College o f American
Pathologists) о т н о с н о с т е п е н и т е ч и с т о т а
н а в о д а т а ( т и п вода) з а ползване в клинич­
н а т а л а б о р а т о р и я са представени в т а б л .
6.5.
B o c j a m a о т III т и п е подходяща само
за първоначално измиване \\з. лабораторна­
т а стъклария, к а к т о и за почистване на по-
С т е п е н на ч и с т о т а
T u n II T u n III
2.00 0.10
0.10 1.00
не е критерий 5.0 - 8.0
10 3
не е критерий
не се определят
Ta&iuna 6.5. П р е п о р ъ ч и т е л н и спеиификащш з а
лация се о т с т р а н я в а т определени замърси­
л а б о р а т о р н а бода (College o f American Pathologists)
т е л и . Препоръчителните спецификации за
Вид н а В о д а т а Спецификация к а ч е с т в о т о н а д е с т и л и р а н а т а и дейонизи-
Д е с т и л и р а н а в о д а (степен р а н а т а вода са о т р а з е н и в т а б л . 6.6. Въз­
на ч и с т о т а - II и III т и п ) можно е допълнително повишаване ч и с т о ­
О с т а т ъ к след изпаряване < 1.00 р р т * т а т а на д е с т и л и р а н а т а вода чрез приба­
Хлорид < 0.10 р р т
вяне на калиев п е р м а н г а н а т към съдовете
за дестилация или т а з и процедура да се из­
Амоняк < 0.10 р р т
върши след д е с т и л а ц и я т а .
Тежки м е т а л и < 0.01 р р т
Т а б л и ц а 6.6. Х а р а к т е р и с т и к а н а в о д а т а - съп­
си2 < 5.00 р р т
ротивление и проводимост в зависимост о т
Твърдост липсва с т е п е н т а на ч и с т о т а
pH 5.5 - 7.0 Съпро- Пробо-
Съпротивление > 0.10 MQ/cm Вид н а В о д а т а тибление димост
(MQ/cm) (цв/ст)
Д е й о н и з и р а н а Вода
(степен на ч и с т о т а - I т и п ) Д е с т и л и р а н а Оода
(брой дестилации)
Силикати липсват
28 х (кварцово стъкло) 23.00 0.05
Амоняк < 0.20 р р т
3 х (кварцово стъкло) 2.00 0.20
Натрий липсва
3 х (обикновено стъкло) 1.00 1.00
pH 6.7 - 7.0
1 х (обикновено стъкло) 0.50 5.00
Съпротивление > 1.00 MQ/cm
1 х (метал) .50 - 0.10 -

Органичен въглерод < 1.00 р р т

Общо твърди примеси < 1.00 р р т
*part per million
м е щ е н и я т а , но не и з а п р и г о т в я н е на реак­
т и в и или за анализи.
В о д а т а о т И т и п е подходяща за пове­
ч е т о а н а л и т и ч н и процедури вкл. п р и г о т в я ­
не н а р е а к т и в и , м а т е р и а л и за к а ч е с т в е н и я
контрол и с т а н д а р т и .
В о д а т а о т I т и п е с най-висока с т е п е н
н а ч и с т о т а . Тя е р е з у л т а т о т прилагане
н а многобройни с т ъ п к и за п р е ч и с т в а н е -
префилтрация с о б р а т н а осмоза, д е с т и л а ­
ция, дейонизация, ф и л т р а ц и я през а к т и в е н
въглен и мембранна ф и л т р а ц и я . Получава­
н е т о ü е т в ъ р д е скъпо за л а б о р а т о р и я т а .
Използва се з а м е т о д и , изискващи минимал­
н а интерференция, напр. анализ на олигое-
л е м е н т и , т е ж к и м е т а л и , ензими, п р и г о т ­
вяне н а с т а н д а р т и или к л е т ъ ч н и к у л т у р и
и др.
С и с т е м и з а получаване
н а Нода с в и с о к а с т е п е н н а ч и с т о т а
Д е с т и л и р а н а т а Hocja се получава посред­
с т в о м и з в е с т н а т а т е х н и к а за дестилация.
В о д а т а може да бъде дестилирана повече о т
един п ъ т , к а т о при всеки цикъл на д е с т и ­
Дейонизирана бода
монопластова единица -
18.00 0.05
смесен т и п
двупластова слабоалкална
0.25 0.50
анийонитна система
двупластова силноалкална
.10 - 0.05 1.00
анийонитна система
При (jeüonu'jupaiiama Вода са о т с т р а ­
нени повечето или всички йони, въпреки че
може да има органични примеси. Дейонизи-
р а н а т а вода се получава с помоидта на ани-
он- или катион-обменни смоли чрез замяна
н а о т с т р а н е н и т е йони с хидроксилни и
водородни йони (фиг. 6.1). В зависимост о т
сп ец и ф и к ата н а целите, за о т с т р а н я в а н е
на различните йони се използват с ъ о т в е т е н
т и п йонообменни колони, т . е . определен вид
колони не може да се използва за о т с т р а н я ­
ване на всички йони. Чрез комбиниране на
няколко вида колони може да бъде получена
дейонизирана вода с необходимата с т е п е н
на ч и с т о т а . Наличните органични и суспен­
дирани т в ъ р д и примеси т р я б в а да б ъ д а т
о т с т р а н е н и предварително, т . е . преди де-
й о н и з а ц и я т а . Това с т а в а чрез подходящи
филтри, вградени в с и с т е м а т а .
Напоследък Millipore въведе т ъ й нар. ЕИх
с е р и я , к о я т о използва н е п р е к ъ с н а т а
е л е к т р о д е й о н и з а ц и л за пречистване на
145
 Водопроводна лягането на п о с т ъ п в а щ а т а вода, с което
вода г а р а н т и р а т постоянен п о т о к и оптимал­
на р а б о т а на RO-картриджа ( к а с е т а т а за
о б р а т н а осмоза).
О т съществено значение за много анали­
oч зи е к о н т р о л ъ т върху органичните замър­
c
i Г
с 3н
i1^"•"
vr
^i 0 сители във водата, получена о т системи­
т е за дейонизирана вода. Замърсяването с

f
1
^ Na | . W Na •
органичен въглерод може да достигне о т
1000 до 2000 ppb в ч е ш м я н а т а вода и над 500
ppb в дейонизираната вода. Органичните за­

11 Jl
Отпадна вода
11рсчистена вода
Фиг. 6.1. Принципиа схема на ЕИх технология­
та
А - полупропусклива мембрана за аниони
К - полупропусклива мембрана за катиони
+ собност. Те м о г а т също т а к а да са причи­
jcmgab )—80зН Na'« Цсмола — s o - N a + Н
А.
У CHjCH, yCHjCHj
смола ^ _ N — - И О Н - + сГ< »• смола -—N^—HCl • OH
\сн,сн, \cHjCH,
Б.
Ф и г 6.2. Принцип на действие на йонообменни
смоли
А - катион обменна смола
Б - анион обменна смола
в о д а т а в л а б о р а т о р и я т а (фиг. 6.2). Проти­
воположно на традиционните техники (дес­
тилация или йонообменни смоли) ЕИх систе­
м и т е в д е й с т в и т е л н о с т не се н у ж д а я т о т
поддръжка и не в о д я т до колебания в ниво­
т о на ч и с т о т а на водата. Електродейони-
з а ц и я т а осигурява качество на в о д а т а о т
15 MQ/cm, с нива на общия органичен въгле­
род под 30 ppb (part per billion). Смолите в
ЕИх модула непрекъснато се саморегенери-
р а т и практически не се „изтощават". Не
се налага подмяната им и по т о з и начин под­
д р ъ ж к а т а на електродейонизационния мо­
дул е минимална. Освен т о в а ЕИх с е р и я т а е
лесна за ползване и о т н о с и т е л н о е в т и н а :
напр. за получаване на вода с качества на
двойно дестилирана вода се изразходват 3
до 5 п ъ т и по-малко чешмяна вода и около
200 п ъ т и по-малко електроенергия, откол­
к о т о конвенционалните системи за дейони-
зирана вода. Друго предимство на ЕИх сис­
т е м и т е е, че т е включват помпи, к о и т о
д е й с т в а т съобразно т е м п е р а т у р а т а и на­
146
мърсявания във в о д а т а м о г а т да о к а ж а т
влияние върху немалка ч а с т о т анализите.
> При HPLC, LC и ILC например, органичните
примеси м о г а т да покрият външната с т р а ­
на на о т д е л н и т е частици на смолите и да
п р е у с т а н о в я т достъпа на молекулите или
йоните в м е с т а т а за обмен, силно намаля­
вайки по т о з и начин разделителната спо­
'
на за висок "шум" по базисната линия. В кле­
т ъ ч н и т е култури органичните субстанции
м о г а т да в ъ з д е й с т в а т върху т я х н а т а
жизнеспособност и р а с т е ж . Проблемът за
контрол на органичните замърсители е ре­
шен чрез възможностите за оптимизиране
в предлаганите ЕИх дейонизиращи системи:
вградено измерващо устройство за наличие
на органични з а м ъ р с и т е л и - ТОС (total
oxidisable carbon)монитор и фотоокислите-
лен модул за осигуряване на свръхниски ор­
ганични нива. Новост е и специалният ул-
трафилтър за ефективно отстраняване на
нуклеази и пирогенни вещества. За да се о т ­
говори на изискванията на добрата лабора­
т о р н а п р а к т и к а всички данни, свързани с
к а ч е с т в о т о на в о д а т а се показват на ек­
ран и м о г а т да б ъ д а т о т п е ч а т а н и при свър­
зване с принтер. Тези системи и м а т произ­
водителност о т 3 до 75 1/h. Новите модели
са със значително намален обем и лесно пре­
носими, и т ъ й к а т о с в р ъ х ч и с т а т а вода при
необходимост се получава "на място" не се
налага нейното съхранение, к о е т о би вло­
шило к а ч е с т в а т а й. Важно условие, което е
изпълнил производителят е, че пречиства­
щ а т а среда не влиза в допир с човешките
ръце или с а т м о с ф е р а т а , к о е т о значи, че не
е замърсител на околната среда.
В а ж н о с т т а и з н а ч е н и е т о н а ес|ин
с и г у р е н и з т о ч н и к з а с в р ъ х ч и с т а Hoya
6 к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я в никакъв
случай н е т р я б в а д а с е подценяват.
Дори следи о т з а м ъ р с и т е л и във в о д а т а , ко­
я т о се използва з а "сляпа" проба и/или за
разреждане н а п р о б и т е м о г а т да о к а ж а т
влияние върху р а б о т а т а , водещо до невъзп-
роизводими и н е т о ч н и р е з у л т а т и .
В зависимост о т п о т р е б н о с т и т е се пред­
л а г а т няколко с и с т е м и за дейонизирана вода.
С и с т е м и з а у л т р а ч и с т а воца. Таки­
ва са напр. Purelab Plus & Maxima, UHQ - USF/
Elga, Multi-Q u l t r a p u r e w a t e r s y s t e m s -
Millipore. П о л у ч е н а т а п о с р е д с т в о м т е з и
с и с т е м и вода се използва в молекулярн а т а
биология, HPLC, GC-MS, ICP-MS, ISP-ES,
атомноабсорбционната спектрофотомет-
рия, к л е т ъ ч н и к у л т у р и , производство н а
моноклонални а н т и т е л а . У л т р а ч и с т а т а
дейонизирана вода н е съдържа йони и орга­
н и ч н и примеси, а също рибо- и дезоксирибо-
нуклеази (R-nase и D-nase). Тя показва след­
н и т е х а р а к т е р и с т и к и : съпротивление -18.2
М Ш с т , общ органичен въглеводород - < I p p b
и б а к т е р и и - < 1 колония формираща еди­
ница в 1 ml (CFU/ml).
C u c m c A i u з а д е й о н и з и р а н а Пода с
к а ч е с т в а н а д в о й п о д е с т и л и р а п а Пода
или по-добра, напр. Option Plus - USF Elga и
др. Такава вода е подходяща за пламъкова
а т о м н а абсорбция, т ъ к а н н и култури, при­
г о т в я н е на к л е т ъ ч н и култури, електрофо­
реза на б е л т ъ к , разреждане н а серум. Показ­
ва следните данни: съпротивление -1-15 М12/
cm, общ органичен въглеводород - < 50 ppb,
б а к т е р и и - < 1 CFU/ml.
С и с т е м и , к о и т о п р о и з в е ж д а т Пода
о т II т и п , п р е ч и с т е н а ч р е з е л е к т р о -
д е й о н и з а ц и я , напр. Elect или Option - USF
Elga. К а ч е с т в а т а с а к а т о н а вода след ед­
н о к р а т н а дестилация или дори по-добри. Из­
ползва се за измиване на с т ъ к л а р и я , п р и г о т ­
вяне на реактиви, разреждане на серум, елек­
трофореза н а б е л т ъ к , п р и г о т в я н е на среда
за клетъчни култури, пълнене на а в т о к л а ­
ви, т е р м о с т а т и и др. Характеризира се със
следните данни: съпротивление - 5-15 М12/
cm, общ органичен въглеводород - < 30 ppb и
б а к т е р и и - < 1 CFU/ml.
Проблемите във водоснабдяването у нас
и к а ч е с т в а т а на водопроводната вода во­
д я т до бързо износване и ч е с т а подмяна н а
модулите за о б р а т н а осмоза, к о е т о т в ъ р д е
много оскъпява п о л у ч а в а н а т а вода. Предла­
г а н и т е у нас о т български производители
а к т и в н и ф и л т р и ("компютърно управляем
двойно осигурен пясъчен филтър") позволя­
в а т първоначално водоочистване "на входа",
преди с и с т е м а т а за получаване на вода с
висока с т е п е н на ч и с т о т а . Тези ф и л тр и за
предварително водоочистване и м а т д е б и т
о т 300 до около 2000 1/h к а т о о ч и с т в а н е т о
е в г р а н и ц и т е о т 3 до 15 [лт. Филтриращи­
я т кварцов пясък подлежи на подмяна след
използване о т една до една и половина годи­
на. На б а з а т а н а т о з и ф и л т ъ р у нас се пред­
л а г а т о т български производители комплек­
сни с т а н ц и и за дейонизирана вода.
Не бива да се подценява и в ъ п р о с ъ т за
съхраняването на получената за лаборатор­
ни цели вода. Съхранение на вода о т I т и п
не се препоръчва, а н а т и п II - с а м о з а
к р а т ъ к срок при избягване на химическо или
бактериално замърсяване. През последните
години някои фирми п р е д л а г а т специални
резервоари за съхранение на п р е ч и с т е н а т а
вода с м и н и м у м р е к о н т а м и н а ц и я (напр.
Millipore), Резервоарите са с в м е с т и м о с т о т
30, 60 и 100 1, направени са о т ч и с т , н а т и -
вен полиетилен - полимер, к о й т о предпазва
п р е ч и с т е н а т а вода о т повторно замърся­
ване с о тд ел я н и о т м а т е р и а л а на съда ве­
щ е с т в а . Производството на т е з и съдове е
чрез формуване (отливане във форми), т . е .
процес, генериращ много т ъ н к а в ъ т р е ш н а
повърхност, к о я т о силно понижава образу­
в а н е т о на бактериален биофилм по с т е н и ­
т е . Те са цилиндрични, с конично дъно, оси­
гуряващо пълен дренаж на резервоара, с цел
избягване у т а я в а н е и развитие на бактерии.
П р е ч и с т е н а т а вода се ползва чрез кранче на
п р е д н а т а с т е н а н а р е з е р в о а р а или се
и з т о ч в а през д в е т е клапи на долния край на
съда. Въздухът, навлизащ о т горния край на
р е з е р в о а р а при и з т и ч а н е н а в о д а т а се
пречиства чрез преминаване през вентила­
ционен филтър. Последният е предназначен
да о т с т р а н я в а различни замърсители във
въздуха, к о и т о биха оказали въздействие
върху в о д а т а : с л о й о т а к т и в е н в ъ г л е н
о т с т р а н я в а всички разтворени органични
субстанции, след т о в а с л о й о т н а т р и е в
к а р б о н а т о т с т р а н я в а въглеродния диок-
сид и накрая един х и д р о ф о б е н л г е м б р а н е н
ф и л т ъ р о т д у р а п о р предпазва о т преми­
наване на ч а с т и ц и и микроорганизми. Резер­
в о а р ъ т може д и р е к т н о да се свърже към
всички съвременни дейонизиращи с и с т е м и
на с ъ о т в е т н а т а фирма.
147
З а к л ю ч е н и е : Ч и с т о т а т а н а в о д а т а , пол­
звана в к л и н и ч н а т а лаборатория, е н е р а з ­
д е л н а чает о т м е р к и т е з а осигурява­
н е качеството н а лабораторните ре­
з у л т а т и . К а ч е с т в о т о на в о д а т а е к а т е ­
горизирано в няколко с т е п е н и , к а т о т и п I
КОНТРОЛ НА ТЕМПЕРАТУРАТА
В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ
Зл. К р и в о ш и е в а
ИЗМЕРВАНЕ НЛ ТЕМПЕРАТУРАТА
В п р а к т и к а т а се и з п о л з в а т т р и вида т е м ­
п е р а т у р н и скали; Celsius ( 0 С), F a h r e n h e i t
(F) и Kelvin (K). В п ъ р в и т е две скали са фик­
сирани т о ч к и т е н а з а л г р ъ з в а н е и к и п е н е
н а дестилираната вода н а люрското
р а в н и щ е . По с к а л а т а на Ф а р е п х а и т т о ч ­
к а т а н а залгръзване е 32 градуса, а на
к и п е н е - 212 г р а д у с а , д о к а т о по с к а л а т а
на Целзий - т о ч к а т а н а з а л г р ъ з в а н е е 0
г р а д у с а , а н а к и п е н е - 100 г р а д у с а . Ска­
л а т а н а Целзий е разделена н а 100 единици,
а т а з и по Ф а р е н х а й т - н а 180 единици. Еди­
ницата за термодипамичпа темпера­
т у р а n o SI е Kelvin (К). С к а л а т а по Кел-
вин и м а с ъ щ о т о разделяне к а к т о т а з и по
Целзий, но н е й н а т а н у л е в а т о ч к а с ъ о т ­
в е т с т в а н а а б с о л ю т н а т а нула, равна н а
-273 0С. Тази скала се ползва при условия н а
р а б о т а с много ниски и много високи т е м ­
пе р а т ури. Въпреки че в к л и н и ч н а т а лабора­
т о р и я основно се използва с к а л а т а по Цел­
зий, понякога се налага конвертиране меж­
ду т е з и т р и вида скали з а о т ч и т а н е н а
т е м п е р а т у р и т е . И з п о л з в а т се с л е д н и т е
формули:
F = (0С х 9/5) + 32 0
С = К - 273
0
С = (F - 32) х 5/9 К = 0С + 273
О т д е л н и т е а н а л и т и ч н и реакции и м а т
о п т и м а л н а т е м п е р а т у р а , к а т о з а някои о т
т я х (напр. ензими) се изисква поддържане
н а т е м п е р а т у р а т а в и н т е р в а л не по-голям
о т ± 0.1 0С.
П о н а с т о я щ е м у нас е в ъ з п р и е т о провеж­
дането на в с и ч к и а н а л и з и и о т ч и т а ­
нето н а р е з у л т а т и т ед а се извършва
п р и 37 0С.
148
има най-висока с т е п е н н а ч и с т о т а . Не съ­
щ е с т в у в а процедура, к о я т о би могла да се
изпълни при ползване н а вода с по-ниска чис­
т о т а , о т к о л к о т о се изисква, т . е . компро­
миси в т о в а о т н о ш е н и е не се допускат.
О т д е л н и т е р е а к т и в и и з и с к в а т различни
условия з а съхранение - лабилните р а з т в о ­
ри се с ъ х р а н я в а т при т е м п е р а т у р а около
40С ( о т 20С до 60С) или в замразено с ъ с т о я ­
ние (-20оС). П о н я т и е т о с т а й н а т е м п е р а т у ­
р а (между 15 и 250С) т р я б в а да се използва
много критично, т ъ й к а т о в зависимост о т
сезона ч е с т о т о е извън т о з и интервал. Това
е важно и не бива да се подценява не само
при много анализи, но и при приготвяне н а
р а з т в о р и т е и измерване н а обеми. Послед­
н о т о т р я б в а да се извършва при 20оС, т . е .
т о в а е т е м п е р а т у р а т а , при к о я т о са ка­
либрирани м е р и т е л н и т е съдове.
УРЕДИ ЗА ИЗМЕРВАНЕ,
ПОДДЪРЖАНЕ И КОНТРОЛИРАНЕ
НА ТЕМПЕРАТУРАТА
Лабораторни т е р м о м е т р и
И з м е р в а н е т о н а т е м п е р а т у р а т а се извър­
шва предимно с т е р м о м е т р и , градуирани по
с к а л а т а на Целзий с т о ч н о с т ±10С. В кли-
н и ч н о - л а б о р а т о р н а т а п р а к т и к а се използ­
в а т няколко вида т е р м о м е т р и .
О б и к н о в е н и Ж и в а ч н и терлголгетри. Из­
р а б о т е н и са о т с т ъ к л о с различна дължина
н а с т е б л о т о , в к р а я н а к о е т о се н а м и р а
живачен резервоар. За о т ч и т а н е н а положи­
т е л н и и близки до н у л а т а т е м п е р а т у р и се
използват живачни, а за много ниски т е м ­
п е р а т у р и - с п и р т н и т е р м о м е т р и . Живач­
н и т е т е р м о м е т р и са най-популярните т е р ­
м о м е т р и в м е д и ц и н а т а , но в лабораторна­
т а п р а к т и к а т е с ъ з д а в а т и неудобства.
Поради и н е р т н о с т т а и големия топлинен
к а п а ц и т е т н а живака с т я х не м о г а т да се
с л е д я т бързи т е м п е р а т у р н и промени. Пре­
ди използването им т р я б в а да се провери за
прекъсвания на живачния с т ъ л б и за нали­
чие н а мехурчета. За да се възстанови це­
л о с т т а н а ж и в а ч н а т а колона т е р м о м е т ъ -
р ъ т се охлажда 6 лед или с въртеливо дви­
жение н а изтръскване. С п и р т н и т е т е р м о ­
м е т р и се и з п о л з в а т з а о т ч и т а н е к а к т о н а
ниски, т а к а и н а високи т е м п е р а т у р и .
Важно условие з а т о ч н о о т ч и т а н е н а
т е м п е р а т у р а т а е г р а д у и р о в к а т а да бъде в
т ъ м е н ц в я т , добре к о н т р а с т и р а щ с ц в е т а
н а с т ъ к л о т о . Калибриране н а т е р м о м е т р и ­
т е се извършва чрез сравняване с е т а л о н н и
т е р м о м е т р и , к о е т о се препоръчва з а т е м ­
п е р а т у р и в и н т е р в а л а о т 24 до 380С. За кон­
т р о л н а т е м п е р а т у р а т а извън т о з и и н т е р ­
вал се препоръчва купуване н а т е р м о м е т р и
със с е р т и ф и к а т за т о ч н о с т .
А в т о м а т и ч н о т о поддържане н а п о с т о ­
я н н а т е м п е р а т у р а в т е р м о с т а т и т е или в
други з а т в о р е н и п р о с т р а н с т в а се п о с т и г а
с к о н т а к т н и т е р м о м е т р и , свързани с т е р -
мореле.
Т е р л ю д в о й к а (шсрлюслслгсптп). Ако два
различни проводника (напр. мед и к о н с т а н -
т а н ) се з а п о я т т а к а , че да се образува з а т ­
ворена верига и д в е т е спойки се п о с т а в я т
при различни т е м п е р а т у р и , възниква т е р -
м о е л е к т р о д в и ж е щ о напрежение, к о е т о е
пропорционално н а т е м п е р а т у р н а т а разли­
к а между д в е т е спойки.
П о л у п р о в о д н и к о в т е р м о м е т ъ р (тер-
м и с т о р ) . Полупроводниците и з м е н я т сил­
но е л е к т р о п р о в о д и м о с т т а си под д е й с т в и е
н а външни ф а к т о р и к а т о т е м п е р а т у р а ,
светлина, налягане и др. При някои м е т а л ­
ни оксиди з а в и с и м о с т т а между т е м п е р а т у ­
р а и електропроводимост е о б р а т н о пропор­
ционална: с повишаване н а т е м п е р а т у р а т а
с ъ п р о т и в л е н и е т о намалява експоненциално
и може да се преобразува и о т ч е т е к а т о
градуси по Целзий с т о ч н о с т ± 0.1оС в ши­
рок т е м п е р а т у р е н и н т е р в а л .
Термостати
В л а б о р а т о р н а т а п р а к т и к а за поддържане
н а п о с т о я н н а т е м п е р а т у р а при провежда­
не н а а н а л и з и т е се и з п о л з в а т различни ви­
дове т е р м о с т а т и . Д о п у с т и м и я т и н т е р в а л
н а поддържана т е м п е р а т у р а е ± 0.5 0С. Пос­
т о я н е н т е м п е р а т у р е н режим с минимални
•о т к л о н е н и я е о т и з к л ю ч и т е л н а в а ж н о с т
при к и н е т и ч н и т е и с фиксирано време ре­
акции, т е р м и ч н а т а д е н а т у р а ц и я и хемос-
' . т а з н и т е изследвания.
Т е р л ю с т а т и р а п а в а н а . С ъ с т о и се о т
съд - м е т а л е н или з а н у ж д и т е на кръвосъ-
сирването о т прозрачен материал, к о н т а к ­
т е н т е р м о м е т ъ р , бъркалка и к о н т р о л е н
т е р м о м е т ъ р (фиг. 6.3).
Фиг. 6.3. Термостатирана вана
Правила за р а б о т а и поддържане:
• П и в о т о н а в о д а т а (дестилирана) във ва­
н а т а т р я б в а да бъде над н и в о т о н а т е ч ­
н о с т т а в епруветките, поставени за
термостатиране.
• Е п р у в е т к и т е и колбите, поставени за по-
продължителна инкубация т р я б в а да бъ­
д а т з а т в о р е н и със запушалки, за да се из­
бегне замърсяване и разреждане на про­
б и т е с кондензационна вода.
• В о д а т а във в а н а т а следва да се сменя ре­
довно, за да се п р е д о т в р а т и р а з в и т и е т о
на бактерии. Тя може да се запази ч и с т а
и прозрачна, ако се прибави малко н а т р и ­
ев азид.
Използват се и т ъ й нар. "сухи" т е р м о с ­
т а т и . При т я х в о д а т а , к о я т о се нагрява и
поддържа н е о б х о д и м а т а т е м п е р а т у р а е
между в ъ н ш н а т а и в ъ т р е ш н а с т е н а на т е р ­
м о с т а т а . Трябва да се ползва само д е с т и ­
лирана вода, за да не се образува к о т л е н ка­
мък, к а т о н и в о т о ü се проверява редовно.
Важно правило за темпериране, к о е т о мно­
го ч е с т о се пренебрегва е, че епруветки (кол­
би) или други съдове ( с ъ о т в е т н о запушени)
се п о т а п я т в по-голям съд с дестилирана
вода, к о й т о предварително е п о с т а в е н в
т е р м о с т а т а . Н и в о т о на т е ч н о с т т а в еп­
р у в е т к и т е (колбите) т р я б в а да бъде под
н и в о т о на в о д а т а . Само по т о з и начин вре­
м е т о за т е м п е р и р а н е ще бъде д е й с т в и т е л ­
но необходимото. В п р о т и в е н случай, без
п о т а п я н е на с т а т и в а с е п р у в е т к и т е в
предварително т е м п е р и р а н а вода, в р е м е т о
149
за т е м п е р и р а н е ще се окаже н е д о с т а т ъ ч ­
но.
Твърди термостати. Представляват
м е т а л е н блок о т специална сплав с различ­
на форма и профили н а г н е з д а т а , в к о и т о се
п о с т а в я т реакци он н и т е кювети. М о г а т да
б ъ д а т с а м о с т о я т е л н и уреди или модули към
осмометри и а в т о м а т и ч н и анализатори.
З а г р я в а н е т о им се извършва с т о п ъ л въздух
или вграден в м е т а л а нагревател. Благода­
рение н а д о б р а т а т о п л о п р о в о д и м о с т н а
м е т а л н а т а сплав и е ф е к т а н а Пелтие, ис­
к а н а т а т е м п е р а т у р а и поддържането ü в
много т е с н и граници се д о с т и г а много бър­
зо. К о н т р о л и р а н е т о н а т е м п е р а т у р а т а се
извършва с т е р м и с т о р .
Нискотемпературни термостати -
хладилници и залгразители. Те м о г а т да оси­
г у р я в а т минусови т е м п е р а т у р и н а т р и
нива: - 20оС, -50оС, -80оС. И з п о л з в а т се за съх­
ранение н а р е а к т и в и и проби о т биологични
м а т е р и а л и . Нормално в п р и р о д а т а т о п л и ­
н а т а преминава о т т о п л о т о към с т у д е н о ­
т о т я л о . При хладилниците т о в а движение
е о б ъ р н а т о посредством п р о ц е с и т е н а из­
парение и кондензация н а т е ч н о с т и т е . При
изпарението се консумира енергия, нарече­
на с к р и т а топлина. Тя се абсорбира о т окол­
н а т а среда (хладилната камера), к о е т о води
до понижение н а т е м п е р а т у р а т а в н е я .
ЛАБОРАТОРНИ СЪДОВЕ
Т. Ц в е т к о в а
Зл. К р и в о ш и е в а
В п р а к т и к а т а на клиничната лаборатория
широко приложение н а м и р а т разнообразни
с т ъ к л е н и уреди и пособия. Те се и зп олзв ат
практически във всички а н а л и т и ч н и лабо­
р а т о р и и независимо о т профила. В и д ъ т и
к а ч е с т в о т о н а л а б о р а т о р н и т е съдове неми­
нуемо се о т р а з я в а т върху к о л и ч е с т в е н и т е
и к а ч е с т в е н и т е анализи, респ. р е з у л т а т и в
к л и н и ч н а т а лаборатория. О с н о в н а т а кон­
фигурация о т л а б о р а т о р н и т е съдове не се
е променила много през годините. Общо взе­
т о т е се и з б и р а т според специфичното и м
приложение в к л и н и ч н о - л а б о р а т о р н а т а
практика. Т е х н и я т дизайн, особено на с т ъ к ­
150
И з п а р и т е л и т е н а хладилниците се п ъ л н я т
с т е ч н о с т и , к о и т о и м а т т о ч к а н а кипене
под с т а й н а т а т е м п е р а т у р а при нормално
налягане. Най-често използвани са ф р е о н ъ т
( т . к . 30 0С), к о й т о е екозамърсител и амо­
н я к ъ т . Те циркулират в з а т в о р е н а т р ъ б н а
с и с т е м а , к о я т о свързва и з п а р и т е л я с кон­
д е н з а т о р а (на в ъ н ш н а т а задна с т р а н а н а
хладилника). Хладилниците са конструира­
ни н а два принципа - абсорбция и компре­
сия. Абсорбционният принцип се използва
при м а л к и т е хладилници, а к о м п р е с и я т а се
прилага при хладилните камери. Съвремен­
н и т е хладилни камери и з а м р а з и т е л и са
снабдени с механизъм за външно показване
на т е м п е р а т у р а т а в реално време.
Поддържане н а хладилниците:
• Хладилникът се разполага т а к а , че да се
о с ъ щ е с т в и нормална конвекция н а възду­
ха около а г р е г а т а му, з а да се предпази
к о н д ен зато р а о т прегряване.
• В р а т а т а н а хладилника т р я б в а да при­
лепва добре, з а да изолира хладилната ка­
мера о т околното п р о с т р а н с т в о .
• Да се проверява периодично т е м п е р а т у ­
р а т а със с т ъ к л е н т е р м о м е т ъ р , п о с т а в е н
за продължително време в хладилната ка­
мера. Веднъж месечно хладилника следва
да се размразява и проверява съдържани­
е т о му.
л а р и я т а , е п о ч т и без особени промени, въп­
реки че навлизането н а п л а с т м а с о в и т е съ­
дове доведе до предлагане на ред нови фор­
ми.
В з а в и с и м о с т о т е с т е с т в о т о на м а т е ­
риала, о т к о й т о са изработени т е б и в а т :
стъклени, пластмасови, порцеланови и ме- |
талии. П ъ р в и т е два вида и м а т значително
по-широко приложение. П о р ц е л а н о в и т е
съдове се използват много по-рядко и само j
к о г а т о е необходима по-голяма у с т о й ч и в о с т
н а механични или т е р м и ч н и въздействия, |
напр. порцеланови т и г л и , панички за I
изпаряване, х а в а н ч е т а , мензури, порцелано- |
ви подложки, порцеланови Бюхнерови фунии.
М е т а л н и т е съдове п о ч т и не се използват
(специални т и г л и о т с т о м а н а или п л а т и ­
на).
ЛАБОРАТОРНИ СЪДОВЕ -
ВИДОВЕ СТЪКЛО
ЗА ИЗРАБОТВАНЕТО ИМ
В з а в и с и м о с т о т у с т о й ч и в о с т т а му при
нагряване се и з п о л з в а т два вада стъкло за
изработване н а л а б о р а т о р н а т а с т ъ к л а р и я .
И д в а т а т и п а с т ъ к л о н а м и р а т приложение
в клиничната лаборатория.
Ь о р - с и л и к а т и о с т ъ к л о . Пример за т а к о ­
ва "твърдо" с т ъ к л о с а и з в е с т н и т е марки
Pyrex®, Corex®, Kimax®, Vycor®. То е здраво,
не съдържа т е ж к и м е т а л и , вкл. цинк и е ус­
т о й ч и в о н а т е м п е р а т у р н о въздействие и
алкални корозиращи в е щ е с т в а . Т о ч к а т а му
н а т о п е н е е между 750оС и 1100оС. То може
да се използва при с и т у а ц и и н а резки т е м ­
п е р а т у р н и промени (замразяване до нагоре-
щяване), издържа н а д и р е к т е н пламък или
върху електроуреди. Това с т ъ к л о може да
се о б р а б о т в а с оксижен.
Н а т р и е в о - к а л ц и е в о с т ъ к л о . То е о т н о ­
с ит е л н о по-евтино, "меко" с т ъ к л о с т о ч к а
на т о п е н е до 600оС. Понякога се о т н а с я к а т о
к р и с т а л , и м а висок к о е ф и ц и е н т н а
разширение и не би могло да се използва при
голяма т е м п е р а т у р н а вариация на съдър­
ж а щ и т е се в съдове о т натриево-калциево
с т ъ к л о р а з т в о р и или при очакване на т а к и ­
ва промени по време н а химични анализи.
С т ъ к л о т о е о т н о с и т е л н о лесно за р а б о т а с
Бунзенова горелка и е устойчиво н а алкални
разтвори. Този т и п с т ъ к л о най-общо се из­
ползва за и з р а б о т в а н е н а мерителни стък­
лени съдове, размесващи перли, еднократно
използваеми п и п е т и и л и епруветки и за
размесване на различни съставки на стай­
на температура. Тези съдове т р я б в а да се
използват много в н и м а т е л н о в к л и н и ч н а т а
лаборатория, т ъ й к а т о м и н е р а л и т е м о г а т
да п р е м и н а т о т с т ъ к л о т о в съхранявани­
т е р а з т в о р и и да и н т е р ф е р и р а т различни­
т е процедури при анализа.
Освен по т е з и основни к р и т е р и и на с т ъ к ­
л о т о ( т в ъ р д о и меко) се п р е д л а г а т и някол­
ко други в а р и а н т и . Това са специални с т ъ к ­
ла, к о и т о ч е с т о и м а т единично приложение
или и м а т уникална роля в л а б о р а т о р и я т а .
Например б е з а к т и п и е в о стъ/слосе изпол­
зва за намаляване на с в е т л и н н о т о въздейс­
т в и е върху с ъ д ъ р ж а щ и т е се 6 т а к и в а съдо­
ве в е щ е с т в а . Тези кехлибарено оцветени
съдове п о зво л я ват запазване н а с ъ с т а в к и
к а т о каротини, в и т а м и н А, билирубин и др.,
к о и т о са ч у в с т в и т е л н и към светлина в об­
сега между 300-500 п т . Н е с ъ д ъ р Ж а щ о б о р
с т ъ к л о п р и т е ж а в а висока у с т о й ч и в о с т
към алкални разтвори. То е много меко и със
значително ниска т е р м и ч н а у с т о й ч и в о с т и
не би могло да се използва при резки т е м п е ­
р а т у р н и промени. Б о г а т о п а с и л и ц и й
с т ъ к л о - с в о й с т в а т а му са подобни на квар­
ц а и о т него са изработени о т н о с и т е л н о
е в т и н и т е , но прецизни с п е к т р о ф о т о м е т -
рични кювети. Corex® ( C o r n i n g ) е високо-
устойчиво с т ъ к л о и се използва в производ­
с т в о т о на центрофужни епруветки, а
Vycor® ( C o r n i n g ) има изключителна здра­
вина и т е р м о у с т о й ч и в о с т .
Според о с н о в н о т о си предназначение
с т ъ к л а р и я т а в клиничната лаборатория се
подразделя на два вида - стъклени съдове с
универсално предназначение и стъклени съ­
дове за измерване на обем.
СТЪКЛЕНИ СЪДОВЕ
С УНИВЕРСАЛНО ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ
Тук се о т н а с я т различни видове епруветки
(облодънни, конични и т и п епендорф), чаши,
колби, фунии, к р и с т а л и з а т о р и , т е г л о в н и
с т ъ к л а , делителни фунии, цилиндри, хладни-
ци, р еак ти вн и с т ъ к л а , банки, ексикатори,
стъклени вани и др. Много о т т е з и съдове
са с отвори, к о и т о са шлифовани, к а т о най-
ч е с т о т е с а със с т а н д а р т н а ширина и
наклон на шлифованата запушалка ("норма­
лен шлиф"). В ежедневната п р а к т и к а на кли­
н и ч н а т а лаборатория едни о т най-често из­
ползваните съдове о т т о з и т и п са различ­
н и т е видове е п р у в е т к и , разнообразни по
обем чаши и разнообразни по форма и обем
колби (фиг. 6.4). Някои о т т я х може да и м а т
белег за обем, или дори да са с повече подраз-
делителни линии, но т о в а п с о з н а ч а в а , ч с
с т я х л ю Л с д а се д о з и р а количество.
М а р к и р а н е т о е с а м о , з а д а с с отбеле-
jku количеството, което л ю Л е д а се
п о б е р е в т е з и съдове. Пе е възможно т о ч ­
н о т о определяне на обема поради широка­
т а повърхност н а т е ч н о с т т а в т е з и съдо­
ве и н е в ъ з м о ж н о с т т а за о т ч и т а н е на ме-
ниск. Лабораторните чаши не следва да се
използват за аналитични цели, а само к а т о
151
 з а 30 min във водна баня при т е м п е р а т у р г
20оС.
Съобразно т о ч н о с т т а при определяне нг
обема т е з и съдове са обикновени, прецизнь
и официално проверени. При последните все
ки о т т я х носи контролен номер. Н а й - т о ч
ни са т е з и о т клас А ( т а б л . 6.7), к а т о т о ч
н о с т т а варира според обема н а съдовете
М е р и т е л н а т а с т ъ к л а р и я е градуирана (
милилитри.
Калибрираните с т ъ к л е н и съдове не бивс .
да се н а г р я в а т , т ъ й к а т о се нарушава пред
варително калибрирания обем.
Т а б л и ц а 6.7. Допустима н е т о ч н о с т на мерител
ни съдове о т клас А (по Е. Carreiro-Lewandowski)

Размер Неточ­ Размер Неточ­

на обема ност на обема ност
(ml) (ml) (ml) (ml)
Мерителни
Пипети (TD)
колби (ТС)
Ф и г 6.4. Стъклария с универсално предназначе­
1-10 ±0.02 0.5-2 ±0.006 8
ние; А - колби и Б - различни лабораторни чаши
25 ±0.03 3-5 ±0.01
първоначални съдове при приготвяне н а раз­ 50 ±0.05 10 ±0.02
т в о р и , Обикновените колби са плоско- или 100 ±0.08 15-25 ±0.03
облодънни ( т и п Florence) или о т т и п а н а 200 ±0.10 50 ±0.05
Erlenmeyer - конична форма и късо гърло. Те 250 ±0.12 Бюрети (TD)
също м о г а т д а с а градуирани, но само з а 500 ±0.20 5 ±0.01
ориентиране о т н о с н о обема, т . е . п о к а з в а т 1000 ±0.30 10 ±0.02
приблизително к о л и ч е с т в о т о т е ч н о с т . 2000 ±0.50 25 ±0.03
50 ±0.05
100 ±0.10 U—
СТЪКЛЕНИ СЪДОВЕ
ЗА ИЗМЕРВАНЕ НА ОБЕМИ > Колби. М е р и т е л н и т е колби (фиг. 6.5
с л у ж а т за п р и г о т в я н е н а р а з т в о р и с т о ч н г
Най-често използваните с т ъ к л е н и съдове к о н ц е н т р а ц и я и не следва да се п о л з в а т зг
о т т о з и т и п са: мерителни колби, м е р и т е л ­ т я х н о т о съхранение. След п р и г о т в я н е не
ни цилиндри, мензури, б ю р е т и , п и п е т и , гра­ р а з т в о р и т е , т е се п р ех вър л я т в реактив­
дуирани е п р у в е т к и и пр. С ъ щ е с т в е н о т о з а ни ш и ш е т а с е т и к е т , н а к о й т о задължител­
т я х е, че според калибрирането им т е се но се н а н а с я т всички данни за р а з т в о р а (със
о з н а ч а в а т или к а т о ТС (to-contain) - калиб­ тав, концентрация, pH, д а т а на приготвя
рирани н а б а з а т а н а целия им обем или к а т о
TD (to-deliver) - калибрирани по о т н о ш е н и е
н а ч а с т и о т о т д а в а н и я обем. Важно е д а
припомним, че калибрацията е осъществе­
на при 2СРС на х и м и ч е с к и чисти съдове. Ако
м е р и т е л н и т е съдове се п о л з в а т при т е м ­
п е р а т у р а , различна о т т а з и при калибри­
р а н е т о им или не са химически ч и с т и , може
да се п о я в я т значими грешки в измервани­
А
т е обеми. З а по-голяма с и г у р н о с т в т о ч ­
н о с т т а се препоръчва и з м е р в а н а т а т е ч ­
н о с т предварително да бъде т е м п е р и р а н а Фиг. 6.5. Мерителни колби
152
Ив). С ъ х р а н я в а т се п р и с ъ о т в е т н и т е изис­
квания за т е м п е р а т у р а . М е р и т е л н и т е кол­
би се п р е д л а г а т в р а з л и ч н и размери в обхва­
т а м е ж д у 10 и 4000 m l . Те са о з н а ч е н и с а м о
к а т о Т С калибраиия. Н а й - ч е с т о м е р и т е л н и ­ К1МЛ
USA
TU
т е колби са с окръглена, п л о с к о д ъ н н а ч а с т WC
—ml 1K
II
и т я с н а , по-дълга г о р н а ч а с т , в ъ р х у к о я т о
е отбелязан п р ъ с т е н о в и д е н белег, м а р к и р а щ
н и в о т о н а обозначения обем.
При използване н а м е р и т е л н и т е колби з а
приготвяне н а т о ч н и р а з т в о р и т р я б в а да
се с п а з в а т н я к о л к о основни правила:
1. Х и м и ч е с к и ч и с т а т а к о л б а се и з п л а к в а
предварително с р а з т в о р и т е л я .
2. Точно п р е т е г л е н а т а с у х а с у б с т а н ц и я о т
дадено в е щ е с т в о се п р е н а с я к о л и ч е с т в е ­
но в к о л б а т а п о с р е д с т в о м м а л к а ф у н и й к а
с къса о п а ш к а .
3. Ф у н и й к а т а се п р о п л а к в а н е к о л к о к р а т н о
с 5-10 m l о т р а з т в о р и т е л я .
4. В к о л б а т а се налива до около 2 / 3 о т обема Фиг. в.в. Видове градуирани цилиндри (ТС и TD)
ü р а з т в о р и т е л и се р а з к л а щ а до п ъ л н о
р а з т в а р я н е н а в е щ е с т в о т о , след к о е т о се в а т , т ъ й к а т о с а и з р а б о т е н и о т дебело
долива до н и в о около 1 с м под м а р к и р а щ и я с т ъ к л о , к о е т о е чупливо п р и на г р ява не .
белег. >• Б ю р е т и . Те са с а м о с обозначение T D
5.С п о м о щ т а н а м а л к а п и п е т а се п р и б а в я (фиг. 6.7 А), и з п о л з в а т се за т и т р у в а н е и с а
на к а п к и още р а з т в о р и т е л , д о к а т о дол­ извънредно т о ч н и п р и о т м е р в а н е н а алик-
н а т а ч а с т н а м е н и с к а д о с т и г н е белега в о т н и к о л и ч е с т в а . П р е д л а г а т се в различни
( в и ж п р и п и п е т и ) . За у с т а н о в я в а н е н а
т о ч н о т о м я с т о на мениска о ч и т е т р я б ­
ва да са н а н и в о т о н а белега. 11ри т о в а по­ TD
ложение п р ъ с т е н о в и д н и я белег се в и ж д а
к а т о права ч е р т а .
6. П о с т а в я се ш л и ф о в а н а т а з а п у ш а л к а и
к о л б а т а се обръща 8-10 п ъ т и за пълно раз-
месване н а с ъ д ъ р ж и м о т о , след к о е т о се
прехвърля в р е а к т и в н о с т ъ к л о .

> r p a c j y u p a n u ц и л и н д р и . Те м о г а т д а
б ъ д а т с обозначение T D или Т С , к о е т о изис­
ква спазване н а с ъ о т в е т н и т е правила п р и
р а б о т а с т я х , независимо о т м а р к и р а н и т е
4
деления. П р е д с т а в л я в а т съдове за измерва­
не на т е ч н о с т и и са м а р к и р а н и със с е р и я
о т линии, п о к а з в а щ и о б е м и т е , к о и т о м о г а т
да се и з м е р в а т (фиг. 6.6). О б и к н о в е н о се из­
ползват, к о г а т о и з и с к в а н е т о за с т е п е н н а
т о ч н о с т н а и з м е р в а н и я обем не е критич­
но- Те са и з к л ю ч и т е л н о п о х о д я щ и за бързо Л
измерване н а т е ч н о с т и и се п р е д л а г а т 6 фиг. в.7. Бюрета (Л) и шлифована запушалка с
различни размери - о т 10, 25, 50, 100, 500, 1000 т о ч н о отбелязване на м е с т а т а за покриване с
и
2000 ml. Ц и л и н д р и т е не бива да се н а г р я - вазелин (В)
153
обеми, включително и к а т о м и к р о б ю р е т и с
обем nog 10 ml. С п и р а т е л н о т о кр анч е н а
б ю р е т и т е е и з р а б о т е н о или о т с ъ щ о т о
с т ъ к л о , или о т Teflon®. П о с л е д н и т е не изис­
к в а т покриване със смазка, д о к а т о с т ъ к л е ­
н и т е запушалки т р я б в а д а с а п о к р и т и с
т ъ н ъ к слой минерално масло - глицерин (вод­
но р а з т в о р и м , но н е р а з т в о р и м в органични
р а з т в о р и т е л и ) ; силиконова грес ( р а з т в о р и ­
м а в хлорни раз тво р и) . С м а з к а т а т р я б в а д а
се нанесе о т д в е т е с т р а н и н а о т в о р а , к а т о
се внимава т о й д а не бъде з а ц а п а н (фиг. 6.7
Б).
>• П и п е т и . Наред с е п р у в е т к и т е п и п е т и -
т е са най-широко и з п о л з в а н и т е с т ъ к л е н и
съдове в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я , предим­
но з а пренасяне н а определен обем о т р а з т ­
вори между о т д е л н и съдове при п р и г о т в я н е
н а р е а к т и в и или при извършване н а анали­
зи. Н а й - о б щ о т е с а д в а о с н о в н и в а д а -
мапуални и автолштични. Пипетите
с високо к а ч е с т в о и м а т фабричния знак Т С
или TD, о т б е л я з а н до т е х н и я горен край, с
цел д а бъде осведомен п о т р е б и т е л я з а пред­
н а з н а ч е н и е т о им: ТС (to-contain) - з а т о ч н о
фиксиран цял обем или TD (to-deliver) - въз­
м о ж н о с т з а о т м е р в а н е н а определени час­
т и о т обема и м или н а целия обем. Според
начина н а п и п е т и р а н е н а т е ч н о с т т а м а -
н у а л н и т е п и п е т и са: с и з д у х в а н е и т а к и ­
ва с и з т и ч а н е п о д д е й с т в и е н а г р а в и ­
т а ц и я т а ( с а л ю и з т и ч а н е ) . Освен т о в а
п и п е т и т е м о г а т д а б ъ д а т още н е г р а д у и -
р а н и , с к о и т о се пренася т о ч н о определен
обем, напр. Ostwald Polin п и п е т и , а в т о м а ­
т и ч н и макро- или м и к р о п и п е т и , или т а к и ­
ва с неопределен (без белег) обем ( P as teu r пи­
п е т и , к о и т о не с а предназначени з а количес­
т в е н анализ) и г р а д у и р а н и п и п е т и , напр.
Mohr п и п е т и , м и к р о п и п е т и и др.
К о г а т о в б л и з о с т до горния край н а пи­
п е т и т е и м а гравиран (оцветен) един или два
близо един до друг н е п р е к ъ с н а т и п р ъ с т е н а ,
с ъ д ъ р ж а н и е т о н а п и п е т а т а следва д а се
п и п е т и р а чрез издухване, т.е. п о с л е д н а т а
к а п к а се и з х в ъ р л я в п р и е м а щ и я съд. А к о
такива Atapkepuлипсват, т о пипета­
т а се оставя н а салюизтичане под
действие н а гравитацията. Върхът на
п и п е т а т а не т р я б в а д а се допира до т е ч ­
н о с т т а в приемащия съд по време н а пипе­
т и р а н е , а т р я б в а д а о с т а н е до с т е н а т а н а
154
с ъ д а з а няколко секунди след и з т и ч а н е н а
р а з т в о р а и ч а к т о г а в а се и з т е г л я навън.
Г р а д у и р а н и т е п и п е т и с а предназна­ - Б
чени з а измерване н а различни обеми. С т я х XI
м о ж е д а се п и п е т и р а не с а м о общия обем,
но и ч а с т и о т него - к а к т о м е ж д у о т д е л н и ­ -и
т е цели деления, т а к а и м е ж д у подразделе­ -9
н и я т а н а м и л и л и т ъ р а . Например п и п е т а о т т
5 ml м о ж е д а се използва з а измерване н а 5, S
4, 3, 2 или 1 ml о т т е ч н о с т т а , а с п о м о щ т а ßi
н а г р а д у и р о в к а т а м е ж д у всеки м и л и л и т ъ р -
и з а ч а с т и о т него. Обикновено т е з и данни ш
с а означени върху п и п е т а т а , в случая напр, •q
5 ml е о б щ и я обем, но м о ж е д а се п и п е т и р а т ш
о б е м и до 1/10 о т м и л и л и т ъ р а (фиг. 6.8). .(!
Други п и п е т и м о г а т д а б ъ д а т обозначе- -е
Щ
((о /•
'•т
7 общ обем основни подразделения
Фиг. 6.8. Означения за обем върху п и п е т а
ни к а т о е д н о м и л и л и т р о в и п и п е т и (1 ml) с
подразделения 1/100 о т м и л и л и т ъ р а и т . н .
Г р а д у и р а н и т е п и п е т и с а няколко т и п а , о т
к о и т о н а й - ч е с т о в п р а к т и к а т а се използ­
ват:
• П и п е т и н а Mohr. Тези п и п е т и не с а гра­ -ßi
дуирани до и з т е г л е н и я връх, а п о с л е д н о т о о л
деление з а в ъ р ш в а н а 2-3 с м над него. Те с а БО
о т т и п а TD. Т е ч н о с т т а и з т и ч а до с ъ о т ­ -ГГ.
в е т н и я белег, к о й т о о г р а н и ч а в а ж е л а н и я jRU
обем, т . е . о п и м е р в а н е т о в и н а г и е лгеЖ-
д у д в е точки. Течността никога н е с е
издухва.
• Д р у г и я т вид градуирани п и п е т и с а из­ -et
в е с т н и в чужбина к а т о "серологични" п и п е ­ -ör
т и , а у нас к а т о "крайни". Те също с а о т тс
т и п а TD. Градуирани с а по дължина н а пи­ -ш
п е т а т а до с а м и я ü връх. О б щ и я т и м обем М9
м о ж е д а бъде о т д е л е н с а м о чрез издухване, ,91
к о г а т о с а м а р к и р а н и с д в а п р ъ с т е н а в гор­ -qc
н и я к р а й . Ако т е л и п с в а т , з а д ъ р ж а н а т а
ч а с т о т т е ч н о с т т а в капилярния край след
п и п е т и р а н е не се издухва, т ъ й к а т о е взе­
т а под внимание при г р а д у и р а н е т о н а пи­
п е т и т е . П и п е т и р а н е т о н а no-малки коли­
ч е с т в а , т . е . м е ж д у две деления е к а к т о при
M o h r п и п е т и т е . Т р я б в а д а се знае, че пос-
л е д н а т а порция е най-малко т о ч н а , поради
к о е т о о т м е р в а н е т о н а 4 порции по 1 ml
т р я б в а да с т а н е поне с п и п е т а о т 5 ml. Този
т и п п и п е т и се п р е д л а г а т и с широк о т в о р ,
к о й т о осигурява по-бързо и з т и ч а н е , а също
и с много т е с е н и удължен връх.
Н е т о ч н о с т т а на градуираните пипети
се увеличава с намаляване размера н а пипе-
ш и р а н и т е ч а с т и о т обема им. Освен т о в а
зависи и о т р а з н о в и д н о с т и т е н а даден вид,
напр. о б и к н о в е н и т е серологични п и п е т и
и м а т н е т о ч н о с т ±0.03 ml при обем 10.0 ml и
±0.10 ml при обем 25 ml; nunemume с широк
о т в о р п о к а з в а т н е т о ч н о с т ±0.05 ml при 1
ml, ±0.10 ml при 5 ml и 10 ml и ±0.20 ml при 25
ml. Тези със с т е с н е н и дълъг връх - с ъ о т в е т ­
но ±0.02 ml при 1 ml, ±0.04 ml при 5 ml, ±0.06
ml при 10 ml и ±0.10 ml при обем 25 ml.
• Микропипети. Това са п и п е т и , ч и й т о
т о т а л е н обем е под 1 ml (20,100 или 200 ul).
Те м о г а т да б ъ д а т о т т и п а н а Mohr или о т
т о з и н а серологичните п и п е т и . О п и с в а т ги
още к а т о "lambda" п и п е т и . Това са най-ши­
роко ползваните п и п е т и в к л и н и ч н а т а ла­
боратория, особено т ъ й нар. хемоглобино-
ви п и п е т и (20 \х\). Обикновено т е са за из­
мерване н а единичен обем, т . е . - ТС т и п . Тъй
к а т о о т н о ш е н и е т о между п о в ъ р х н о с т т а и
обема им е високо, ч а с т о т к о л и ч е с т в о т о
на т е ч н о с т т а (най-често биологичен м а т е ­
риал) о с т а в а по с т е н и т е им, к о е т о нама­
лява общия му обем. З а т о в а е необходимо
неколкократно п о т а п я н е и проплакване в
разтвора, в к о й т о се п и п е т и р а (разрежда­
ща т е ч н о с т ) , к а т о п о с л е д н а т а к а п к а се
издухва. Те се з а м е н я т п о ч т и п о в с е м е с т н о
с а в т о м а т и ч н и микропипети.
Н е г р а д у и р а п и п и п е т и . Касае се за го­
ляма група п и п е т и , наричани още в о л у м е т -
рични (фолпипети) или пренасящи п и п е т и ,
к о и т о са предназначени за накапване на оп­
ределен обем без п о - н а т а т ъ ш н о т о му под­
разделяне, т . е . т о в а са п и п е т и с т о ч н о фик­
сиран цял обем. Обозначени са к а т о ТС т и п .
В повечето случаи и м а т по два п р ъ с т е н а на
горния край, т . е . след п и п е т и р а п е течност­
та се издухва. П р и т е ж а в а т разширение,
к о е т о е над с р е д а т а н а ц и л и н д р и ч н о т о
т я л о , а белегът, показващ обема на пипе­
т а т а е над него. Тези п и п е т и о т г о в а р я т
на к л а с Л з а т о ч н о с т и се п о л з в а т при
необходимост о т най-голяма т о ч н о с т (раз­
реждане на с т а н д а р т и , калибратори, м а т е ­
риали з а к а ч е с т в е н контрол). Тези о т т я х ,
които не са м а р к и р а н и с два пръстена в гор­
н а т а си част, при п и п е т и р а н е се поста­
в я т строго вертикално срещу п р и е м а щ а т а
течност. След свободно и з т и ч а н е на теч­
ността п и п е т а т а се изважда, но в ника­
к ъ в с л у ч а й не се и з д у х в а т о с т а н а л и т е в
капилярния край части от течността.
Тези п и п е т и са предназначени за нисковис-
козни водни р а з т в о р и .
В а р и а н т на nunemume с фиксиран обем
са nunemume н а Ostwald-Folin, к о и т о са по-
къси, с по-широк о т в о р , а разширението им
е по-близо до д о л н а т а ч а с т . Те са предназ­
начени за т е ч н о с т и с по-голям в и с к о з и т е т .
При т о з и т и п п и п е т и р а н е т о е с издухване
( и м а т един и л и два пръстена в горната
част).
С най-добро к а ч е с т в о са nunemume, изра­
б о т е н и о т бор-силикатно стъкло. Те м о г а т
м н о г о к р а т н о д а се п о л з в а т , т ъ й к а т о
о т д е л н и т е деления с а г р а в и р а н и върху
с т ъ к л о т о . Дори и след о т м и в а н е на б о я т а ,
т е ясно л и ч а т . П о д м е н я т се само след счуп­
ване. Ч е с т о се п р е д л а г а т с т ъ к л е н и п и п е т и
о т натриево-калциево стъкло, при к о и т о
д е л е н и я т а върху п о в ъ р х н о с т т а им са нане­
сени само с боя и при миене се и з т р и в а т .
И з б о р ъ т на п и п е т и - о т т в ъ р д о или меко
с т ъ к л о т р я б в а да с т а в а съобразно р а з т в о ­
р и т е , к о и т о ще се п и п е т и р а т с т я х .
Техника и правила з а п и п е т и р а н е
Т о ч н о с т т а н а измервания обем зависи о т
начина на пипетиране, ч и с т о т а т а на nu­
nemume и т е м п е р а т у р а т а на р а з т в о р и т е .
За осигуряването ü е необходимо т о ч н о спаз­
ване на определени изисквания, к а т о някои
основни и важни положения, казани по-горе,
о т н о в о са повторени:
• Винаги да се използва каучуков балон или
друго механично приспособление, но н и ­
кога директно с уста.
• П и п е т а т а т р я б в а да бъде химически чис­
т а , с ненарушена ц я л о с т на върха (греш­
на и вредна п р а к т и к а е да се чупи върха
за по-бързо пипетиране). Чистотата на
n u n e m u m e (а и на всякакъв вид стъклария)
се проверява по следния начин: при напъл-
155
 ване с вода, пья се разлива по повърхност­ зване н а микропипети т е се проплакват
т а на стените под формата н а тънък н е к о л к о к р а т н о с р а з т в о р а , в к о й т о се
филм. Замърсени пипети и л и сухи части­ nunemupa.
ци по вътрешната повърхност се устано­
вяват индиректно, по наличието на оста­
тъчни капчици след пълно изливане н а во­
дата или пипетираната течност.
При пълнене на п и п е т а т а , независимо о т
т и п а , н е й н и я т връх се п о т а п я д о с т а т ъ ч ­
но дълбоко в р а з т в о р а и след в н и м а т е л н о
аспириране т е ч н о с т т а се довежда малко
над маркера. П и п е т а т а се държи през
и я л о т о време с т р о г о вертикално (не под
ъгъл). Тогава г о р н и я т о т в о р на п и п е т а ­
т а се з а т в а р я бързо с показалец и т я се
изважда о т раз твора . Чрез леко повдига­
не на показалеца дол н ият край н а менис-
ка бавно се довежда до знака на желаното
деление (фиг. 6.9). В и с я щ а т а н а д о л н и я
край капка се отстранява чрез докосване
с чиста повърхност, напр. с т е н а т а н а
съда с разтвора, от който се изтегля оп­
ределено количество.

Фиг 6.10. Правилно и неправилно положение н а

Мениск п и п е т а т а при пипетиране: А - п и п е т и Mohr или
Маркираща линия т а к и в а е крайно градуиране; В - фол п и п е т и

А Б
Фиг. 6.9. Техника на пипетиране: А - менискьт е
малко над м а р к и р а щ а т а линия; В - о с н о в а т а на
мениска се довежда до к о н т а к т с желания белег
• П и п е т а т а се внася в приемащия съд (еп­
руветка, колба или чаиш). П и п е т и т е о т
т и п а на Mohr и "серологичните" п и п е т и
се държат отвесно (фиг. 6.10 А), като тех­
н и я т връх не бива д а се докосва до стени­
т е на съда. При пипетиране с п и п е т и о т
т и п а на Polin, върхът и м се опира до сте­
н а т а (фиг. 6.10 Б). При всички видове м а -
нуални п и п е т и , за да и з т е ч е съдържащи­
я т се в т я х р а з т в о р , показалецът се ос­
вобождава леко и т е ч н о с т т а се о с т а в я да
т е ч е свободно/ При пипетите, маркира­
ни сдвойни пръстени т я се издухва, а п р и
другите видове (Mohr) течността изтича
докато д о л н и я т м е н и с к достигне до
долния ограничаващ желания обем белег.
По с ъ щ и я н а ч и н се р а б о т и и п р и
пипетиране на части от обема. При пол-
156
• Правилното у с т а н о в я в а н е положението
н а мениска ( н а й - н и с к а т а м у ч а с т да се
допира до ж е л а н о т о деление) е сигурно, ко­
г а т о т о в а с т а в а на нивото на очите. В
п р о т и в е н случай, вследствие на паралак-
са, може да се въведе з н а ч и т е л н а грешка
при п и п е т и р а н е .
А в т о м а т и ч н и п и п е т и . Терминът авто­
м а т и ч н и п и п е т и означава, че т е п р и т е ж а ­
в а т механизъм, к о й т о и з т е г л я и и з т л а с к в а
т е ч н о с т т а , и е съставна ч а с т на пипета­
т а . П о н а с т о я щ е м т о в а са най-често изпол­
з в а н и т е п и п е т и с ред п р е д и м с т в а ; пести
се време, осигурява се безопасно пипетира­
не, работата с т я х се усвоява лесно, не се
налага почистване (еднократни връхчета),
к а к т о и д о с т а т ъ ч н а точност, особено в
новите варианти. Според обема, к о й т о се
nunemupa т е най-общо са два вида - с фик­
сиран обем, различен за о т д е л н и т е подгру­
пи и с вариращ обем (избира се само 1 обем в
определен м о м е н т ) . О б х в а т ъ т н а обема
п и п е т и р а н а т е ч н о с т е д о с т а широк - о т
0.2 д| 1 go 10 ml. П и п е т и , с к о и т о се п и п е т и -
pam обеми nog 1 ml се н а р и ч а т микропипе- на у п о т р е б а нерядко п р о м е н я т обема си, без
т и (0.1-2, 2-20, 10-100, 20-200 и 100-1000 |xl), а т о в а да може да се у с т а н о в и визуално, кое­
т е з и , к о и т о п и п е т и р а т обеми над 1 ml - т о е по-рядко при с т ъ к л е н и т е пипети. Из­
макропипети. П р е д л а г а т се и а в т о м а т и ч ­ в е с т н и са няколко м е т о д а за проверка - гра-
ни многоканални п и п е т а - о т 8-12-16 кана­ виметричен метод сдестилирана вода и л и
ла в различни обеми ( о т 5 до 50 ц1). Н о в о с т живак и спектрофотометричен метод с р-
при т е з и п и п е т и е м е х а н и з м ъ т , к о й т о изх­ нитрофенол и л и калиев бихромат.
върля последователно у п о т р е б е н и т е вече
връхчета, к о е т о щади о п е р а т о р а . Гравилютричеп м е т о д с у с с т и л и р а п а
Различните фирми-производители н а ав­ (fof/a. Toü е лесно възпроизводим и с добра
т о м а т и ч н и п и п е т и са развили пълен комп­ а н а л и т и ч н а надеждност.
л е к т о т едноканални или многоканални пи­ Принцип на метода: използва се равенство­
пети, връхчета и к у т и и за съхранението т о между количество дестилирана вода (g)
им, допълнителни приспособления и специ­ и т о в а , п и п е т и р а н о в ml, т ъ й к а т о специ­
ални набори з а периодична проверка на ка- ф и ч н о т о ü т е г л о е 1. За повишаване на т о ч ­
л и б р а ц и я т а им, съгласно ISO или DIN. Пред­ н о с т т а се въвежда ф а к т о р за корекция F, с
л а г а т се и а в т о м а т и ч н и п и п е т и със с е р т и ­ к о й т о се о т ч и т а т влиянието на т е м п е р а ­
ф и к а т , у д о с т о в е р я в а щ калибровка до DIN т у р а т а и а т м о с ф е р н о т о налягане.
12650. Необходимо оборудване: ан ал и ти чн а везна,
А в т о м а т и ч н и т е п и п е т и са ергономични т е р м о м е т ъ р и барометър, ч и с т малък плас­
и не предизвикват умора при продължител­ т м а с о в съд (20-50 ml).
на р а б о т а . З а т я х н о т о правилно ползване и Начин на работа: изморйат се т е м п е р а т у ­
за о т д е л н и т е с т ъ п к и при р а б о т а т р я б в а р а т а и б а р о м е т р и ч н о т о налягане в с т а я ­
внимателно да се следва и н с т р у к ц и я т а на т а . Претегля се празния съд. П р а в я т се най-
производителя. малко 10 п и п е т и р а н и я с проверяваната пи­
По-големите обеми се о т м е р в а т с доза­ п е т а . При а в т о м а т и ч н и т е п и п е т и - всеки
тори. А в т о м а т и ч н о т о дозиране може да се п ъ т с отделно връхче. Претегля се съда за­
с ъ ч е т а е и с разреждане в определено с ъ о т ­ едно с п и п е т и р а н о т о количество вода и о т
ношение. Най-новите в а р и а н т и на а в т о м а ­ него се изважда т е г л о т о на съда. П р а в я т се
т и ч н и т е п и п е т и и д о з а т о р и са т е з и , при необходимите изчисления.
к о и т о м е х а н и ч н а т а пружина е заменена с
Т а б л и ц а 6.8. Ф а к т о р и за преизчисляване обема
е л е к т р о м о т о р , контролиран о т микропро­
н а п р е т е г л е н а т а д е с т и л и р а н а вода в зависи­
цесор. Тези п и п е т и и м а т много п р е д и м с т ­ м о с т о т т е м п е р а т у р а т а и атмосферното
ва, благодарение н а к о и т о се изключва су­ налягане (по Е. Carreiro-Lewandowski)
бективния ф а к т о р при дозиране на р а з т в о ­
ри или биологичен м а т е р и а л , к а т о р и с к ъ т Темпе­ Барометрично налягане
о т грешки е минимален. З а х р а н в а н е т о е о т р а т у р а mmHg 640 680 720 760
литиевойонна б а т е р и я , осигуряваща до 5000 Г О кРа 85.3 90.7 96.0 101.3
пипетирания, к о я т о след изчерпване може 19.5 1.0026 1.0026 1.0027 1.0028
да се зарежда. В а р и а б и л н о с т т а е о т 1 д| 1 до 1.0027 1.0027 1.0028 1.0029
20.0
50 ml, а нулирането и с к о р о с т т а на пипе- 1.0029 1.0030 1.0030 1.0031
21.0
т и р а н е се у п р а в л я в а т а в т о м а т и ч н о . 11а ма­
22.0 1.0031 1.0032 1.0032 1.0033
лък екран се осигурява информация за пипе­
23.0 1.0033 1.0034 1.0035 1.0035
т и р а н и я обем, брой с т ъ п к и и режим на пи-
потиране. Аспирираното и п и п е т и р а н е т о 24.0 1.0036 1.0036 1.0037 1.0038
с т а в а само чрез н а т и с к на микробутонче. 25.0 1.0038 1.0039 1.0039 1.0040

Пример', проверка на п и п е т а о т 0.500 ml.

Точност на пипетирании обем -
проНерка
Проверката се прави предимно при а в т о м а ­
т и ч н и т е п и п е т и , к о и т о след продължител­
Средна с т о й н о с т на п р е т е г л е н о т о количес­
т в о вода е 0.498 g. Т е м п е р а т у р а на в о д а т а
19.50С, барометрично налягане 680 mm Hg
с т ъ л б . Ф а к т о р ъ т F = 1.0026 m l / g се намира
о т т а б л и ц а 6.8. Изчислява се обема на пипе-
157
mama u п р о ц е н т а н а отклонение. т е с т а в а първоначално чрез обилно измива­
не с чешмяна вода, а след т о в а с т о п л а вода.
V = 0.498 х 1.0026 = 0.4991 ml
подходяща ч е т к а , сапун или прах за пране.
проверяван изчислен О т с т р а н я в а т се полепналите по с т е н и т е
отклонение обем обем у т а й к и , о с т а т ъ ц и о т органични м а т е р и а ­
на обема (%) проверяван обем ли и др. След т о в а следва обилно измиване с
чешмяна вода. П и п е т и т е задължително се
0.500
и з м и в а т чрез пропускане през т я х н а силна
с т р у я вода. След механичното почистване
О т к л о н е н и е т о обикновено е посочено о т задължително се извършва химическо почис­
производителя, но т о н е б и в а д а б ъ д е тване 6.9).
> 1.5%. С т ъ к л а р и я , замър сен а с о с т а т ъ ц и о т
П о в т о р я е м о с т т а може да се определи б е л т ъ к се п о ч и с т в а най-добре с накисване 6
к а т о CV% или к а т о с т а н д а р т н о отклоне­ алкален р а з т в о р , например 10% р а з т в о р на
ние (SD) о т серия п о в т а р я щ и се п и п е т и р а - н а т р и е в а основа или 20% р а з т в о р н а калие­
ния: ва основа, или бихромна смес ( н а с и т е н раз­
т в о р на калиев б и х р о м а т в концентрирана
CV% = -§2-xl00 сярна киселина). К р и т е р и й за н е й н а т а год­
V п-1 х
н о с т е запазване н а специфичния ü ж ъл то -
х - средна с т о й н о с т (общото т е г л о н а в о д а т а к а ф я в ц в я т . Б и х р о м а т н а смес със зелек
о т всички п и п е т и р а н и я се дели н а броя пипе-
ц в я т т р я б в а да се изхвърли след многократ­
тирания)
х - т е г л о на в о д а т а о т п и п е т и р а н и я т а
но разреждане с вода.
п - брой п и п е т и р а н и я З а някои изследвания (определяне н а оли-
Е - сума гоелементи) се изисква специално измиване
(вж. т а б л . 6.9). О к о н ч а т е л н о т о проплаква-
Допустимо отклонение ±1 SD и CV% - под 1%. не се извършва с вода о т т и п I с т е п е н на
При с п е к т р о ф о т о л ъ е т р и ч л а т а п р о ­ ч и с т о т а .
в е р к а е необходимо да се познава моларния Съдове, в к о и т о се и з в ъ р ш в а т е н з и м т ;
екстинкционен коефициент на веществото реакции не т р я б в а д а н о с я т и най-малк1;
в разтвора, който се пипетира. П р и н ц и п ъ т следи о т бихромна смес, основи, детерген-
е, че о б е м ъ т на п и п е т а т а ще се о т р а з и в т и и други.
промяна н а к о н ц е н т р а ц и я т а , к о я т о се о т ­ В с ъ в р е м е н н и т е лаборатории измиване­
чита. т о н а с ъ д о в е т е може да се извърши а в т о ­
Техниките за калибриране са изключител­ м а т и ч н о с миялни машини, к о и т о имагг
но трудоемки и и з и с к в а т време. Те не са с ъ о т в е т н и т е м п е р а т у р н и програми.
ежедневна практика. Препоръчва се провер­ И з м и т и т е съдове се и з с у ш а в а т в сушил­
о о
к а т а на п и п е т и р а н и я обем да с т а в а първо­ ни при 80-90 С за с т ъ к л е н и и 60 С за пласт­
начално и периодично 3-4 п ъ т и годишно. З а масови съдове, след к о е т о се п о д р е ж д а т 6
бърза проверка се препоръчва използване на специални шкафове или с т а т и в и за пипети­
колба от клас А с определена вместимост, т е . П р е ц и з н а т а м е р и т е л н а с т ъ к л а р и я (клас
напр. в 10 ml колба т р я б в а д а се п и п е т и р а т А) се изсушава н а въздух, за да се избегне
4 х 2.5 ml о т п р о в е р я в а н а т а п и п е т а или дру­ е в е н т у а л н а т а п р о м я н а в т о ч н о с т т а uiv
го подходящо за определен анализ количест­ при нагряване.
во. Удобни за п р а к т и к а т а са и ултразвуко­
в и т е вани. Те м о г а т да се използват за по­
чистване на лабораторна стъклария - с
Почистване и измиВане фина или по-особена форма, или с много т е с ­
на лабораторната стъклария ни о т в о р и . След п о ч и с т в а н е т о им, т е з 1
съдове т р я б в а д а б ъ д а т внимателно и обил­
В клиничната лаборатория се р а б о т и с хи­ но и з п л а к н а т и с вода о т т и п II или I с т е ­
мически ч и с т и съдове. Макар и рядко к ъ м пен н а ч и с т о т а , а след т о в а да се провер!
т я х се п р е д я в я в а т изисквания и за с т е р и л ­ дали е осигурена химическа ч и с т о т а .
н о с т . Механичното почистване пъ съдове- Дезинфекцията н а л а б о р а т о р н и т е съдо
158
Таблица 6.9. Практически указания за измиване на лабораторна стъклария
(по Е. Carreiro-Lewandowski)
Изисквания н а анализа
Механично п о ч и с т в а н е
Процедура 1. се препоръчва като
рутинно измиване, когато нялш.
други специални изисквания.
Химическо п о ч и с т в а н е
Iе х н и к а н а п о ч и с т в а н е и измиване
1. А. И з п о л з в а н а т а и з а м ъ р с е н а т а с т ъ к л а р и я незабавно се измива с
вода, а след т о в а със сапунен р а з т в о р или с подходящ д е т е р г е н т ,
предназначен за лабораторни цели.
Б. Изплаква се неколкократно с чешмяна вода, а след т о в а 3-5
п ъ т и с вода о т т и п II или I според изис кв а ния т а н а м е т о д и т е , за
к о и т о е предназначена с т ъ к л а р и я т а . Изсушава се при
т е м п е р а т у р а 80-90 0С.
2. Ь и х р о м а т п а с м е с . С т ъ к л а р и я т а се п о т а п я и накисва за 12-14 h
в б и х р о м а т н а смес, след к о е т о се изплаква с разреден амоняк и
п о - н а т а т ъ к следва измиване, к а к т о в т . 1-Б. Р а з т в а р я т се 50 g т е х ­
нически калиев б и х р о м а т в 50 ml д ест и ли р ан а вода и се д о б а в я т 500 ml
т е х н и ч е с к а к о н ц е н т р и р а н а сярна киселина. Съхранява се в зат в о р ен и съ­
дове, подходящи за о т д е л н и т е видове стъклария. Р а з т в о р ъ т има ж ъ л т о -
кафяв ц в я т и е годен до р а з в и т и е т о н а зелено оцветяване. Изхвърлянето
н а с м е с т а с т а в а след силно разреждане с вода.

3. А з о т н а к и с е л и н а (20гг). П о т а п я н е за 12-24 h и последващо

Кръвни о с т а т ъ ц и или съсиреци
Нови п и п е т и , чаши, колби и др.
При анализ н а олигоелементи
Смазочни масла
Оц в етяв а н е с калиев
перманганат
измиване, к а к т о в т . 1-Б.
NaOH (lOT^). Накисване за 12-24 h. И з м и в а н е т о е съгласно
р у т и н н а т а процедура ( т . 1-Б).
ПроплакВане е HCl (5^) или HN0 3 (5%). Измиването е к а к т о
при п р о ц е д у р а т а в т . 1-Б.
20^ НХОд - накисване за 12-24 h. Измиване 3-4 п ъ т и с дестилирана
вода ( в о д а т а т р я б в а да бъде прясно дестилирана). Следва ново
изплакване с у л т р а ч и с т а вода и изсушаване.
Накисване в о р г а н и ч е н р а з т в о р и т е л .
Накисване в следния разтвор: р а з т в а р я т се 100 g КОН в 100 ml
д е с т и л и р а н а вода. След охлаждане се п р и б а в я т 900 ml търговски
е т а н о л (10%). Впилшние: н е се препоръчва за ф и н а
стък~1ария.
HCl (50^) - накисване за 1-2 h, след к о е т о се изплаква с чешмяна
и д е с т и л и р а н а вода.
Еднопроцентен р а з т в о р на феросулфат в 25% H 2 S0 4 .

ве се извършва при р а б о т а с инфекциозен ма­ лия в л а б о р а т о р и я т а се прояви най-очевид­

териал. Веднага след у п о т р е б а т е се накис­
в а т за 2-3 h в 1% р а з т в о р н а с у б л и м а т , 2-3%
разтвор на карбол, 5% р а з т в о р на хлорамин
или в с ъ в р е м е н н и т е дезинфекциозни р а з т ­
вори, предлагани п о н а с т о я щ е м (според пред­
писанието з а ползването им).
ПЛАСТМАСОВИ С Ъ Д О В Е
Използването н а п л а с т м а с о в и съдове в кли­
н и ч н а т а л а б о р а т о р и я все повече н а р а с т в а .
Използват се не само съдове с п о з н а т а т а
форма на с т ъ к л а р и я т а , но дори се създадо­
ха нови, уникални и полезни форми (накрай­
ници за п и п е т и , многогнездни плаки, мик-
роцентрофужни е п р у в е т к и и др). Още с на­
чалното навлизане на п л а с т м а с о в и т е изде­
н о т о им предимство пред с т ъ к л е н и т е съ­
дове - здравина, у с т о й ч и в о с т , нечупливост
и о т т а м - икономичност и повишена безо­
п а с н о с т при р а б о т а .
В сравнение с обикновените пластмасо­
ви съдове с т ъ к л о т о запазва няколко основ­
ни предимства, к о и т о са важни за някои по-
особени предназначения:
• п л а с т м а с о в и т е п и п е т и не получиха попу­
л я р н о с т , т ъ й к а т о някои видове п л а с т
маси лесно се р а з т в а р я т о т р а з т в о р и т е ­
ли, д о к а т о при с т ъ к л е н и т е съдове т а к ъ в
проблем няма;
• някои видове п л а с т м а с и пропускат газо­
ве, поради к о е т о вещества, к о и т о лесно
се окисляват п р о м е н я т pH на р а з т в о р а .
З а т о в а се предпочита т е да се съхраня-
159
 в а т в стъклени съдове;
• с т ъ к л о т о лесно и безпроблемно моуке да
се стерилизира.
През последните години продължаба раз­
ширяването к а к т о на видовете п л а с т м а ­
си, т а к а и на т я х н о т о прилагане. Напри­
мер м е т и л п с н т а л о в и т е п л а с т м а с и
п р и т е ж а в а т много о т с в о й с т в а т а на с т ъ к ­
лото; у с т о й ч и в о с т на автоклавиране, проз­
р а ч н о с т , о п т и ч н и с в о й с т в а (подобно н а
с т ъ к л о т о ) , в ъ з м ожн ос т за формуване и из­
работване напр. н а бехерови чаши, градуи­
рани цилиндри, фунии, колби и др., но с ус­
т о й ч и в о с т т а на п л а с т м а с и т е .
Важно п р е д и м с т в о н а п л а с т м а с о в и т е
съдове е, че формените е л е м е н т и н а кръв­
т а не прилепват към с т е н и т е им, к о е т о е
особено важно за З а т в о р е н и т е с и с т е м и з а
вземане на кръв. Някои п л а с т м а с и след под-
ходяищ обработка лесно з а д ъ р ж а т к л е т ъ ­
чен материал, поради к о е т о при необходи­
м о с т се използват за получаване и р а з в и т и е
на клетъчни култури.
П л а с т м а с о в и т е л а б о р а т о р н и съдове се
и з р а б о т в а т о т различни полимери. Всеки
о т т я х п р и т е ж а в а специфични п р е д и м с т ­
ва, отнасяиди се go прозрачност, т е м п е р а ­
т у р н а устойчивост, р е з и с т е н т н о с т към
химически в е ш е с т в а , гъвкавост, здравина i
др. И з б о р ъ т и използването н а пластмасо­
ви съдове в л а б о р а т о р и я т а зависи о т пред­
назначението и условията, при к о и т о т е 1щ
б ъ д а т използвани.
О т д е л н и т е химически в е ш е с т в а оказват
различно въздействие върху с т а б и л н о с т т г
и здравината на пластмасовите материа­
ли. Възможни с а т р и основни т и п а ефекть
при взаимодействие между о т д е л н и т е плас­
т м а с и и р а з л и ч н и т е химикали:
• не н а с т ъ п в а т никакви промени к а к т о 6
п л а с т м а с а т а , т а к а и в химическите ве-
ш е с т в а , т . е . п л а с т м а с а т а е и н е р т н а къ1У
дадения вид химикали;
• определени в е ш е с т в а а т а к у в а т химичес­
ки полимерите, изразяваидо се в окисление
деполимеризация или реакция с функцио­
нални групи о т п л а с т м а с а т а с краек
е ф е к т - промяна н а т е х н и т е физически
свойства;
• физически промени в п л а с т м а с а т а - раз­
дуване или омекване в р е з у л т а т н а абсор-
бция н а химическите р а з т в о р и .
В ъ з д е й с т в и е т о н а различни химически
в е ш е с т в а върху основните т и п о в е п л а с т ­
маси, к а к т о и някои о т т е х н и т е с в о й с т в а
с а о т р а з е н и в т а б л . 6.10.
При използване н а п л астмасо ви съдове 6

Таблица 6.10. Х а р а к т е р и с т и к а на основните видове п л а с т м а с и и у с т о й ч и в о с т

към някои химикали (no D. Wright)

К а ч е с т в а или х и м и к а л и LPE ETFE

СРЕ РР/РА PC PSF PS РМР
TFE
Прозрачност Т Т Т Т с с с с
Автоклавиране - ± + + ± + - +
Гъвкавост + - . + - - - -

Слаби киселини + + + + + + ± +
Силни киселини + + + + - + - +
Алкохол + + + + + + + +
Алдехиди - . + + ± ± _ +
Основи + + + + - + ± +
Естери + + + + _ - - +
Алифатни въглеводороди ± + + + ± + - ±
Ароматни въглеводороди ± ± ± + _ - - ±
Халогенни въглеводороди ± ± ± + _ _ . -

Кетони + + + + . _ _ +
Оксиданти ± + ± ±
± + _ -

иилиеши, ETFE - т е ф ц е л Т - полупрозрачност

LPE - линеен полиетилен PC - поликарбонат С - прозрачност
РР - полипропилен PSF - полисулфон ( + ) - устойчивост
РА - полиаломер PS - полистирен (±) - слаба у с т о й ч и в о с т
TFE - тефлон
РМР - п о л и м е т и л п е н т е н (-) - н е у с т о й ч и в о с т
160
клиничната лаборатория следва да б ъ д а т
съблюдавани дВе о с н о в н и праВила:
1. Силни окислители не се съхраняват в плас­
тмасови съдове с изключение на т а к и в а
о т Teflon
2. Пластмасовите съдове не се излагат на
директен пламък и не се п о с т а в я т върху
нагревателни уреди.
Най-общо при производството на п л а с т ­
масови лабораторни съдове се използват 3
основни вида пластмаси:
• п ъ р в а т а г р у п а , к о я т о е и най-широко
използвана е т а з и на п о л и о л е ф и н и т е .
Полиолефини е генеричното име за група
пластмаси, к о я т о включва полипропиле­
ни, полисти*1сни и полилюпгилпсппгс-
ни. Химикалите п о ч т и не п о л е п в а т към
т е з и пластмаси, к о е т о улеснява т я х н о т о
почистване само със сапун и вода. Поняко­
га се налага, за о т с т р а н я в а н е на някои по-
упорити замърсители, да се ползва алкохол
или метилов хлорид. О с т а т ъ и и о т кисели­
ни м о г а т да б ъ д а т о т с т р а н е н и чрез проп-
лакване с р а з т в о р на н а т р и е в карбонат или
натриев бикарбонат, а на алкални м а т е р и ­
али - чрез измиване със слабокисели разтво­
ри. Не се използват х и м и ч е с к и р а з т ­
вори с корозираща активност з а изми­
ване н а п^шспимасови съцове от т а з и
група.
• в т о р а т а г р у п а пластмаси е съставена
о т т ъ й нар. п о л и к а р б о н а т и . Касае се за
пластмаси с изключителна здравина, изпол­
звани за производство на иентрофужни еп­
руветки, ексикатори, съдове за р а б о т а при
анаеробни условия. Този т и п пластмаса е
стабилна в широк т е м п е р а т у р е н диапазон,
но не е напълно подходяща за р а б о т а със
силни киселини, основи или други а г е н т и
(напр. силни окислители). Т е з и и з д е л и я с е
м и я т със с а п у н или д р у г и д е т е р г е н т и ,
к а т о осноВно с е и з м и В а т с Вода п р е д и
аВтоклабиране.
• т р е т а т а г р у п а пластмаси обхваща
т е з и , за ч и е то производство са използвани
ф л у о р о к а р б о н о В и с м о л и . Съдовете о т
т о з и вид пластмаси п р и т е ж а в а т немокре-
ща се повърхност. Те са химически инерт­
ни и стабилни при условия о т -200 до + 250
0
С. Пай-често използваната пластмаса о т
т а з и група е Teßon®, о т к о я т о се произ­
в е ж д а т шлаухи, епруветки, накрайниии,
перли за размесване и др. Тази пластмаса е
устойчива на киселини, основи и органични
разтворители, но лесно се надрасква и из­
носва особено при неправилна работа.
При съдове о т полипропилен, полиметил-
пентен, Teßon® и Tefzei® е възможно многок­
р а т н о автоклавиране, а линейният полие-

Таблица 6.11. Химическа у с т о й ч и в о с т на основните т и п о в е пластмаси

[ . (no J. L. Dubcn-Engelkirk, В. Smith Michacl, М. L. Bishop)
Пластмаса Химическа у с т о й ч и в о с т *
Полистирен Използването на т а к и в а съдове е подходящо за вода и водно-солеви разтвори. Не
(PS) се препоръчват при р а б о т а с киселини, алдехиди, кетони, маслени разтвори и
е т е р . Алкохоли и основи м о г а т да б ъ д а т съхранявани в съдове о т полистирен,
но не за повече о т 24 h при с т а й н а т е м п е р а т у р а .
Полиетилен Д в а т а вида полиетилен (обикновен - СРЕ и линеен - LPE) и м а т сходна химическа
(СРЕ и LPE) р е з и с т е н т н о с т . Последната е изразена спрямо повечето химикали с изключение
на алдехиди, амини, е т е р , въглеводороди, масла, 'ia обикновения полиетилен
изключенията включват също и силикони. За изброените групи о т химикали
ползването се ограничава до 24 h при с т а й н а т е м п е р а т у р а .
Полипропилен Показва с ъ щ а т а у с т о й ч и в о с т , к а к т о и линейния полиетилен.
(РР)
Тефлон П р и т е ж а в а о т л и ч н а химическа у с т о й ч и в о с т към повечето химикали,
(TFE) използвани 6 клиничната лаборатория.
Поликарбонат Много податлив към въздействие на повечето химикали. Устойчив е към вода,
(PC) водни разтвори, храна, неорганични киселини за о т н о с и т е л н о дълъг период о т
време.
Г9П-9900 и нормално атмосферно налягане.
* Данните ß таблицата се о т н а с я т за стайна темпоргпиу! < т е м п е р а т у р а т а до съответния макси-
Устойчивостта към химикалите се понижава при добли a ai < „ к о н ц е н т р а ц и я т а на разтворите,
мум на всеки материал. Химическата устойчивост варира с повишаване конц
161
тилен може д а се а б т о к л а в и р а само при
побишено внимание. Поликарбонатитв не
бива да б ъ д а т автоклавирани повече о т 20
минути. Други, нерядко използвани п л а с т ­
маси не п о д л е ж а т н а а в т о к л а в и р а н е (вж.
т а б л . 6.10).
Химическата у с т о й ч и в о с т на о т д е л н и т е
видове пластмаси е представена в т а б л . 6.11.
П о ч и с т в а н е т о н а п л а с т м а с о в и т е съдо­
ве с т а в а съгласно т . 1-А о т т а б л . 6.9, след
к о е т о следва обилно измиване с чешмяна, а
след т о в а с вода със с т е п е н н а ч и с т о т а т и п
II или I в зависимост о т предназначението
на съда. Възможно е и ползване н а у л т р а з в у ­
кови вани. Г о л я м а т а ч а с т о т пластмасови­
т е съдове в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я е з а
е д н о к р а т н а у п о т р е б а , поради к о е т о н е
подлежи на измиване след използване.
При избор н а пла с т ма сови съдове з а кли­
н и ч н а т а лаборатория т р я б в а в н и м а т е л н о
ХИМИЧЕСКИ СУБСТАНЦИИ
СТЕПЕНИ НА ЧИСТОТА
Е. Н а к о в а
За приготвяне на реактиви в клинично-лабо-
р а т о р н а т а п р а к т и к а се използват различни
химически субстанции. О т основно значение
за к а ч е с т в о т о н а извършваните определяния
в аналитичната практика е ч и с т о т а т а на
изходните химически субстанции.
Унифицирана дефиниция за с т е п е н и т е н а
ч и с т о т а на химикалите засега не съществу­
ва. На табл. 6.12 - 6.14 са представени опреде­
л е н и я т а за степени на химическа ч и с т о т а
на фирма FLUKA - Швейцария, на Американс­
к а т а химическа общност и на Български Дър­
жавен С т а н д а р т .
Независимо о т съществуващите различия,
наложително е да се съблюдават някои основ­
ни изисквания при избор на химически субс­
т а н ц и и за а н а л и т и ч н а т а п р а к т и к а .
1. Задължителна е у п о т р е б а т а н а химика­
ли с означения: p.a. (pro analyse - за анализ),
ч.з.а. (чист за анализ) или Висока ч и с т о т а
(high purity - по т е р м и н о л о г и я т а на Амери­
к а н с к а т а химическа общност), и з б ъ н р е д и о
ч и с т (extra p u r e - Merk), к а т о следва всич­
ки т е да са снабдени със свидетелство за вида
и количеството на онечистванията. Терми-
162
да се п р о у ч а т предварително в и д ъ т на плас­
т м а с а т а , о т к о я т о са произведени и да се
п о д б е р а т т а к и в а съдове, ч и и т о к а ч е с т в а на
м а т е р и а л а о т г о в а р я т н а ц е л и т е , за к о и т о
са предназначени.
З а к л ю ч е н и е : Разгледани са основния набор
и у п о т р е б а н а най-често използваните ла­
б о р а т о р н и съдове, к о е т о следва да улесни
л а б о р а т о р н и я лекар в н е г о в а т а практичес­
к а р а б о т а и най-вече в контрола, к о й т о т о и
т р я б в а да оказва в д е й н о с т т а на лаборато­
р и я т а . Точният р е з у л т а т о т анализите
з а в и с и к а к т о о т и з п о л з в а н и я принцип,
р е а к т и в и , калибратори и контролни м а т е ­
риали, вода със с ъ о т в е т н а т а с т е п е н на
ч и с т о т а , т а к а и о т използваната стъкла­
рия и с п а з в а н е т о н а п р а в и л а т а з а поддър­
ж а н е т о й.
н ъ т p.a. не характеризира ч и с т о т а т а , а по­
казва само предназначението, к о е т о не е дос­
т а т ъ ч н а гаранция, че даден химикал отго­
варя на определени изисквания. Гаранция за
ч и с т о т а т а дава придружаващото химикала
свидетелство (сер ти ф и к ат).
2. За приготвяне на с т а н д а р т н и разтво­
ри следва да се използват само с т а н д а р т н а
химикали, дефинирани к а т о т а к и в а с най-ви­
соко съдържание н а основно вещество - пон€
99.95% и е т и к е т с данни за р е з у л т а т и т е огг
предварителния анализ на веществото. Orr
т а к и в а химикали се п р и г о т в я т не само стан ­
д а р т н и разтвори, но и разтвори за стандар­
т и з а ц и я ( т и т р у в а н е ) на други разтвори.
3. При специализирани анализи (цитохимич-
ни, хроматографски, микроскопски) следва да
се използват специални солвенти и масла. Те
т р я б в а да б ъ д а т пречистени по специален
начин, за да б ъ д а т о т с т р а н е н и замърсява­
ния, пречещи за с ъ о т в е т н о т о приложение
Тези в е щ е с т в а са с ъ о т в е т н о е т и к е т и р а н и .
Независимо о т в ъ з п р и е т и т е изисквания i
означения за с т е п е н на химическа ч и с т о т а
основното правило е, че с п о в и ш а в а н е нс
х и м и ч е с к а т а ч и с т о т а р а с т е процеп
т ъ т п а основното вещество и намалял
в а процентът н а отделните онечист
ванил.
Т а б л и ц а в. 12. Определение за степени на ч и с т о т а на химическите субстанции (Fluka)
С т е п е н на Основно Онечист-
чистота Вид Физически
вещество вания
показатели
Purissimum >99% <0.1% съгласно литературни според
(най-чисти) данни, без допълнително каталожната
оцветяване спецификация
Purum (чисти) >97% < 0.5% възможно леко допълни­
телно оцветяване, откло­
нение о т изискванията по -//
литературни данни
Practicum >90% <5% възможно е по-изразено
(за практически максимално 95% отклонение о т данните
цели) по литературни - / / -
източници
Technicum променливо значително отклонение "възможно е и
(технически (според каталога) о т данните по литера­ изразено
чисти) турни източници. отклонение"
Standart Fluka основно бои за според
микроскопия, каталожната
идентични със спецификация
с т а н д а р т и т е по
качество

Т а б л и ц а 6.13. Определение за степени на ч и с т о т а на химическите субстанции

(Американска Химическа Общност)
Категория на
Чистота Забележка
химическата субстанция
Техническа или търговска неопределена no качество може да бъде използвана само при
приготвяне на чисти разтвори
С.Р. (Chemically pure) по-пречистена, но още с
неопределени качества
U.S.P. удовлетворителна съобразена с толеранса, определен о т
чистота фармакопеята на СЛЩ (United States
Pharmacopeia)
A.C.S. reagent висока ч и с т о т а съобразена с набора спецификации на
к о м и т е т а по химически реагенти на
американската химическа общност
(American Chemical Society)
Primary standart най-висока ч и с т о т а препоръчвана за точни волуметрични
анализи (за с т а н д а р т н и разтвори)

Т а б л и ц а 6.14. Определение за степени на ч и с т о т а на химическите субстанции

(Български Държавен Стандарт - БДС)
-^^^11оказатели Н о р м а Ö%
Субстанция Химически ч и с т (х.ч.) Ч и с т за анализ (ч.з.а.) Чист (ч.)
1. Основно вещество 99.5 99
(пример - ВаС12.2Н20) 99.5

2. Неразтворими във вода 0.005 (0.01) 0.01 (0.02)

вещества, не повече о т 0.005

3. Общ а з о т , не повече о т 0.001 0.002 0.005

4. Желязо, не повече о т 0.0001 0.0002 0.0005
и т.н.
163
ИЗМЕРВАНЕ НА ТЕГЛО
ВЕЗНИ
Е. Н а к о в а
О т с ъ щ е с т в е н о значение з а п р а в и л н о т о
приготвяне на р а з т в о р и т е в клиничната ла­
боратория е т о ч н о т о измерване н а т е г л о ­
т о на химическите субстанции. З а ц е л т а
се използват различни видове везни.
КЛАСИФИКАЦИЯ
По своето принципно у с т р о й с т в о в е з н и т е
се д е л я т на л о с т о в и , п р у ж и н н и и т о р -
зиоини. К а т о мярка за г оле ми н ат а н а дейс­
т в а щ а т а сила при п р у ж и н н и т е везни се из­
ползва е л а с т и ч н а т а д е ф о р м а ц и я . Тор-
зионнаша везна н а Кавендиш е п о с т р о е н а н а
принципа н а определената о т него г р а в и ­
т а ц и о н н а к о н с т а н т а , ч и я т о числена
с т о й н о с т зависи о т избора н а единиците,
в к о и т о се и з м е р в а т м а с и т е и р а з с т о я н и я ­
т а между т я х . К о н с т а н т а т а влиза к а т о
м н о ж и т е л в закона н а Н ю т о н . Главна със­
т а в н а ч а с т н а л о с т о в и т е везни е л о с т ъ т
о т п ъ р в и р о д ( н а п р е ч н а т а ос н а в е з н а т а ) .
В з а в и с и м о с т о т с ъ о т н о ш е н и е т о между
р а м е н е т е н а л о с т а в е з н и т е о т т о з и вид се
разделят на в е з н и с р а в н о м е р н а и в е з н и
с н е р а в н о л г е р н а н а п р е ч н а ос. О т своя
с т р а н а последните се р а з д е л я т на в е з н и с
постоянно и в е з н и с прольенливо съот­
ношение лгеЖду р а м е н а т а .
Широко използваните в к л и н и ч н а т а ла­
боратория аналитични везни п о п а д а т в гру­
п а т а на везни с равномерна напречна ос.
ПРИНЦИП НА ИЗМЕРВАНЕ
К о г а т о говорим за измерване н а т е г л о т о н а
дадено вещество в а н а л и т и ч н а т а химия, на
п р а к т и к а разбираме о п р е д е л я н е н а н е г о ­
в а т а лгаса. Т е г л о т о н а о б е к т а е с и л а ­
т а , у п р а Ж н я в а н ав ъ р х у н е г о о т з е м н о ­
т о п р и т е г л я н е . Тази сила е различна в раз­
личните области н а з е м н а т а повърхност.
Масата, о т д р у г а с т р а н а е количес­
твото лгатерия, о т к о я т о е н а п р а в е н
о б е к т а и е н е в а р и а б и л н а . В е з н а т а е пър­
в о т о ниво за сравнение н а 2 маси. На фиг.
164
6.11 е п р е д с т а в е н а п р и н ц и п н а т а схема н а
а н а л и т и ч н а т а везна. О п о р н а т а т о ч к а А
лежи между т о ч к и т е н а приложение н а две­
т е сили В и С. М, п р е д с т а в л я в а н е п о з н а т а ­
т а маса, а М2 - п о з н а т а т а . L, и L2 са дъл­
ж и н и т е на раменете на лоста. Принципът
н а и з м е р в а н е т о е базиран н а ф а к т а , че при
равновесие MjL^ = M2L2 Ако Li и L2 са коне-
ft——Т——2
I Е 1
^ А
М, Мг J
Фиг. 6.11. Принципна схема на аналитична вез­
на (обяснението - в текста)
т р у и р а н и т а к а , че да б ъ д а т равни, т о г а в а
при д о с т и г а н е н а равновесие М! = М2 и по­
казалецът, поставен точно в средата на
л о с т а ( н а п р е ч н а т а ос н а в е з н а т а ) , сочи вър­
ху с к а л а т а , намираща се в долния край, по­
ложение н а равновесие. С т о й н о с т т а н а М2
се наглася д о к а т о п о к а з а л е ц ъ т се върне н а
и з х о д н а т а си позиция н а с к а л а т а . При т о в а
положение с ъ о т н о ш е н и е т о н а м а с и т е о т ­
говаря н а с ъ о т н о ш е н и е т о н а т е г л а т а , кое­
т о ни дава право да използваме т е р м и н а
т е г л о в м е с т о маса. П о з н а т и т е маси ( т е г ­
лилките) се н а р и ч а т с т а н д а р т н и т е г л а .
ВИДОВЕ АНАЛИТИЧНИ ВЕЗНИ
Основните видове а н а л и т и ч н и везни включ­
в а т : двублюдни везни, везни с едно блюдо,
полумикро- и микровезни, и електронни вез­
ни. Тъй к а т о двублюдните везни с а добре
п о з н а т и , ще б ъ д а т разгледани направо с
т е х н и к а т а на измерването.
В е з н и с ecjHo блюдо. Повечето аналитич­
ни везни в м о д е р н а т а л а б о р а т о р и я използ­
в а т едноблюден баланс с оглед бързина н а
и з м е р в а н е т о . Н а фиг. 6.12 е п р е д с т а в е н а
п р и н ц и п н а т а схема н а едноблюдна везна.
К а к т о обикновено, н а п р е ч н а т а ос ( л о с т ъ т )
е м о н т и р а н а н а ръба н а призма, к а т о блю­
д о т о е в единия ü край. Па другия край н а
л о с т а се намира т ъ й нар. и с п и р а ч н о б у ­
тало"'. То балансира с е р и я т а о т теглилки,
намиращи се над блюдното рамо н а о с т а .
К о г а т о върху блюдото се п о с т а в и о б е к т а
н а измерването, т е г л и л к и т е се придвижват
с п о м о щ т а н а клавиши, н а м и р а щ и се н а

фиг. 6.12. Едноблюдна аналитична везна (обяс­
нението - в текста)
предния панел на в е з н а т а . Е д и н и я т клавиш
е за д е с е т и ц и т е (10-90 g), в т о р и я т - за еди­
ниците (1 - 9 g) и т р е т и я т з а д е с е т и т е час­
т и о т е д и н и ц а т а (0.1 - 0.9 g). В с к а л а т а са
включени още 3 деления, т а к а че възможнос­
тите на повечето едноблюдни везни са до
четвъртия знак след десетичната точка.
В е з н а т а се о т в а р я с п о м о щ т а н а с т р а ­
ничен л о с т . Ц е н т р а л н а т а позиция н а лос­
т а спира д в и ж е н и е т о н а блюдното рамо н а
везната; в т о р а т а позиция о т ч а с т и осво­
бождава д в и ж е н и е т о н а р а м е н а т а , д о к а т о
се намери п р и б л и з и т е л н о т о т е г л о на обек­
т а върху блюдото; т р е т а т а позиция осво­
бождава напълно н а п р е ч н а т а ос, с к о е т о се
преминава към о к о н ч а т е л н о т о определяне
на т е г л о т о до д о с т и г а н е т о ч к а т а на по­
кой на скалния показалец.
П р е д и м с т в о т о н а едноблюдната везна е,
че из м е рв ането може д а бъде направено за
време по-малко от минута. О т друга с т р а ­
на - броят на грешките при това измерване
е по-малък, тъй като операциите са огра­
ничени. Погрешно е д а се с м я т а обаче, че
едноблюдните везни са з а д ъ л ж и т е л н о по-
прецизни о т двублюдните. Тук и д в а т в съ­
ображение фирмите-производители и съпро­
вождащото в е з н а т а гаранционно свидетел­
ство.
Полумикро- и микроКезни. „Ма/сро"-апа-
л и т и ч н и т с Псзпи в най-общ план д а в а т
Възможност за измерване на т е г л а с т о ч ­
н о с т до 0.1 mg (горна граница - 100 и 200 g).
Те са удачни з а най-големия брой р у т и н н и
аналитични измервания. Описаните по-горе
везни м о г а т да б ъ д а т направени по-чувст­
в и т е л н и чрез п р о мя н а н а п а р а м е т р и т е ,
касаещи ч у в с т в и т е л н о с т т а на измерване,
а именно: намаляване м а с и т е на напречна­
т а ос и блюдата, повишаване д ъ л ж и н а т а на
н а п р е ч н а т а ос и промяна н а ц е н т ъ р а н а
т е ж е с т т а на о с т а . Освен т о в а , за напра­
в а т а н а н а п р е ч н а т а ос може да бъде у п о т ­
ребен по-лек материал, о т к о л к о т о т о з и при
конвенционалните а н а л и т и ч н и везни. По
т о з и начин в ъ з м о ж н о с т и т е за т о ч н о с т при
и змер ван ето се увеличават многократно.
Така са конструирани п о л у м и к р о - и лгик-
ровезните к а т о ч у в с т в и т е л н о с т т а на
полумикро- е до 0.01 mg, а т а з и на микро-
в е з н и т е е до 0.001 m g (1 ^g). Границите на
натоварване на т е з и везни са с ъ о т в е т н о по-
малки и р а б о т а т а с т я х изисква по-голямо
внимание.
Е л е к т р о н н и Везни. Модерните електрон­
ни везни предлагат допълнителни удобст­
ва за намаляване на грешките и механични­
т е неудачи при измерването. Операциите
за набиране на т е г л о т о , з а т в а р я н е т о , о т ­
ч и т а н е т о на микрограмовете, спиране дви­
ж е н и е т о на о с т а и блюдото са елиминира­
ни. Те н я м а т т е ж е с т и и призмени ръбове.
Блюдото с т о и върху ръка на подвижно за­
качащо у с т р о й с т в о и т а з и подвижна сис­
т е м а се компенсира чрез к о н с т а н т н а елек­
т р о м а г н и т н а сила. Позицията на закачва-
щ о т о у с т р о й с т в о се мониторира чрез е л е к ­
т р и ч е с к и п о з и ц и о н е н с к е н е р , к о й т о до­
вежда и з м е р в а щ а т а с и с т е м а о б р атн о към
н у л е в а т а позиция. Компенсационният т о к
е пропорционален н а т е г л о т о , поставено
върху блюдото. Сигналът се изпраща към
микропроцесора, к о й т о го превръща в с ъ о т ­
в е т н а числова с т о й н о с т на т е г л о т о , коя­
т о се появява на екрана. Теглото на контей­
нера се изважда а в т о м а т и ч н о о т т е г л о т о
н а и з м е р в а н и я о ^ е к т . З а включване и
изключване на в е з н а т а , п о с т а в я н е на дисп­
лея на 0 и т а р и р а н е на контейнера се изпол
зва п р о с т контролен л о с т . Р е з у л т а т и т е и
необходимите изчисления се з а п а м е т я в а т
автоматично.
К а к т о конвенционалните т а к а и елект­
р о н н и т е аналитични везни и м а т различен
о б х в а т на измерване и о т ч и т а н е .
Макровезните имат ранг от порядъка на
165
160 д, о т ч и т а н и към 0.1 m g , полумикровез-
нитб ~ puns от около 30 д , о т ч и п ю н и к ъ м
0.01 т д и т.н. Конструирани са електрон­
ни ултрамикробезни с ч у в с т в и т е л н о с т go
0.1 ß g и по-малко.
Уреди з а определяне л г а с а т а в ъ в в а к у -
ул1. Обикновеното измерване с везни дава
т е г л о т о във въздушна среда. Съгласно за­
кона н а Лрхимед, всеки о б е к т и з м е с т в а оп­
ределен обем въздух, равен н а собствения му
обем, при к о е т о о б е к т а намалява т е г л о т о
си с толкова, колкот о е т е г л о т о н а измес­
т е н и я о т него въздух. П л ъ т н о с т т а н а въз­
духа е 0.0012 g (1.2 mg) н а ml. Ако п л ъ т н о с т ­
т а н а т е г л и л к и т е и п л ъ т н о с т т а н а обек­
т а са равни, т о г а в а т е ще о л е к в а т с еднак­
ва величина, равна н а к о л и ч е с т в о т о н а из­
м е с т е н и я о т т я х въздух. В безвъздушно
п р о с т р а н с т в о (вакуум) " т е г л а т а " им щ е
б ъ д а т равни. Това именно е залегнало к а т о
принцип н а определяне м а с а т а н а в е щ е с т ­
в а т а във вакуум.
ТЕХНИКА НА ИЗМЕРВАНЕ
С АНАЛИТИЧНИ ВЕЗНИ
Р а б о т а е дВублюдна Везна
>• При започване н а р а б о т а с в е з н а т а , най-
напред се проверява дали с ъ щ а т а е ниве­
лирана чрез специалния маркер за хори­
зонтално положение.
> Н а п р е ч н а т а ос се освобождава с помощ­
т а на в и н т , намиращ се н а предния па­
нел. Изчаква се с п и р а н е т о н а движение­
т о на показалеца, д о к а т о с ъ щ и я т се ус­
т а н о в и н а н у л е в а т а позиция,
> Н а т о в а р в а н е т о н а в е з н а т а започва, к а т о
най-напред н а л я в о т о блюдо се п о с т а в я
мерителния съд, а н а д я с н о т о теглилки­
т е , приблизително о т г о в а р я щ и н а т е г ­
л о т о му.
>• Прибавянето и с в а л я н е т о н а теглилки­
т е продължава до д о с т и г а н е нулева по­
зиция н а показалеца. С б о р ъ т о т в с и ч ­
к и тегла и а дясното блюдо отгова­
р я н а т е г л о т о н а лгерителния съд.
>• М е р и т е л н и я т съд се снема о т блюдото.
С п о м о щ т а на ш п а т у л а в съда се п о с т а ­
вя приблизително количество о т измер­
в а н о т о вещество.
166
> На д я с н о т о блюдо се п о с т а в я т теглил­
ки, с ъ о т в е т н о н а т ъ р с е н о т о т е г л о н а хи­
мическата субстанция.
>• М е р и т е л н и я т съд с в е щ е с т в о т о се връ­
щ а н а л я в о т о блюдо, при к о е т о в е з н а т г
о т н о в о се "освобождава" с в и н т а на пред­
ния панел.
>• М а н и п у л а ц и я т а се п о в т а р я к а т о се о т ­
н е м а или прибавя в е щ е с т в о , д о к а т о се
^ д о с т и г н е равновесие в т е г л а т а о т две­
т е с т р а н и н а л о с т а и показалецът спре
н а нулева позиция.
П р и в с я к а прольяна в н а т о в а р в а н е
т о н а едното и л и д р у г о т о блюдо д в и
Жението н а оста н а везната задължи
т е л н о с е с п и р а с в и н т а н а предни*
панел. При извършване н а излгерване
везната трябва д а се пази о т въздуш
н и течения и навлаЖняване.
Р а б о т а с е д н о б л ю д н а Везна
> Проверява се дали в е з н а т а е нивелиранг
( к а к т о при р а б о т а с двублюдна везна).
>• П р и б л и з и т е л н о т о т е г л о н а мерителния
съд се определя предварително.
> П о с т а в я се м е р и т е л н и я съд н а блюдото
в е з н а т а се н а т о в а р в а в с ъ о т в е т с т в и е (
предварително определеното т е г л о käme
т е г л и л к и т е се п р и д в и ж д а т с клавишите
н а предния панел.При започване на рабо
т а с в е з н а т а с т р а н и ч н и я т л о с т се прид
вижва внимателно, при к о е т о напречна
т а ос се освобождава постепенно. Опре
деля се т о ч н о т о т е г л о н а мерителния
съд.
>- С ъ д ъ т се снема. При з а т в о р е н о положе
ние н а в е з н а т а , п о с т и г н а т о чрез прид
вижване н а с т р а н и ч н и я л о с т , се спускап
т е г л и л к и т е върху блюдното рамо kam«
се довежда числото н а ж е л а н о т о т е г л о
В м е р и т е л н и я съд се п о с т а в я приблизи
т е л н о количество о т измерваното вещес
т в о . С ъ д ъ т се в р ъ щ а о т н о в о в ъ р х ;
блюдото. Следи се о т к л о н е н и е т о н а ска
л а т а , к а т о движението н а о с т а се успо
коява със с т р а н и ч н и я л о с т без да се gag
възможност з а бързо придвижване на ска
л а т а . При прекомерно н ато вар ван е, съп
роводено о т бързо движение на с к а л а т а
с ъ щ е с т в у в а о п а с н о с т о т огъване на нап
р е ч н а т а ос.
>• В з а в и с и м о с т о т о т к л о н е н и е т о н а ска­
л а т а се добавя или изважда и з в е с т н о ко­
личество о т измерваното вещество. Това
се п о в т а р я д о к а т о се п о с т и г н е желано­
т о тегло, о т ч е т е н о на с к а л а т а .
> В е з н а т а се " з а т в а р я " със с т р а н и ч н и я
л о с т . М е р и т е л н и я т съд се снема.
Не се и з в ъ р ш в а изльерване п р и в д и г ­
н а т с т р а н и ч е н п а н е л . При в с я к а про­
м я н а н а т е г л о т о в ъ р х у блюдото, о с т а
се б л о к и р а с ъс с т р а н и ч н и я лост, е ог­
л е д п р е д о т в р а т я в а н е н а о г ъ в а н е т о й.
ОСНОВНИ ИЗИСКВАНИЯ И ПРАВИЛА
ЗА РАБОТА С АНАЛИТИЧНИ ВЕЗНИ
1. В е з н а т а т р я б в а д а бъде п о с т а в е н а н а
идеално нивелирана п о в ъ р х н о с т (плот). В
близост д а н я м а иентрофуги, миксери и
други уреди, предизвикващи вибраиии.
2. И з м е р в а н е т о да се извършва при спусна­
т и преден или с т р а н и ч н и панели (в зави­
с и м о с т о т модела), з а да се ограничи въз­
душното течение в п р о с т р а н с т в о т о на
измерването. Освен ч и с т о м е х а н и ч н о т о
отклонение н а н а п р е ч н а т а ос, при т е з и
условия се избягва п р о м я н а т а във влаж­
н о с т т а и т е м п е р а т у р а т а във в ъ т р е ш ­
РАЗТВОРИ
Т. Ш и п к о в
Преобладаващата ч а с т о т а н а л и з и т е в кли­
н и ч н и т е л а б о р а т о р и и ц е л я т определяне
концентрацията на вещества в разтворе­
но състояние. Голяма ч а с т о т използвани­
т е р е а к т и в и са водни р а з т в о р и . Това опре­
деля н е о б х о д и м о с т т а о т познаване на ос­
новните с в о й с т в а н а р а з т в о р и т е и т е х н и ­
т е характеристики.
Р а з т б о р е хомогенна (еднородна)
с и с т е м а , к о я т о с е с ъ с т о и о т дВе или
поВече с ъ с т а И н и ч а с т и - р а з т И о р и т е л
и е д н о или поВече р а з т В о р е н и В н е г о Ве-
ЩестВа. Най-често р а з т в о р и т е л е с ъ с т а в ­
н а т а ч а с т , к о я т о се намира в ч и с т вид и е
6 т а к о в а с ъ с т о я н и е , в к о е т о е и получения
разтвор. В случай, к о г а т о и д в е т е с ъ с т а в ­
н о т о пространство на везната, което е
о т съществено значение за т о ч н о с т т а на
измерване.
3. Задължително се и з п о л з в а т м е р и т е л н и
съдове, а не х а р т и е н и изрезки при п о с т а ­
вяне на измерваното вещество върху блю­
д о т о . С т р о г о е забранено в е щ е с т в о т о да
се изсипва д и р е к т н о върху блюдото.
4. Да се п а з я т о т замърсяване б л ю д а т а ,
н а п р е ч н а т а ос, т е г л и л к и т е . С ъ щ и т е да
б ъ д а т проверявани редовно о т контрол­
н и т е органи.
5. М е р и т е л н и я т съд и т е г л и л к и т е не се до­
к о с в а т и х в а щ а т с ръка, а със специално
пригодени за ц е л т а щипки.
6. Преди промяна в положението на мери­
т е л н и я съд или т е г л и л к и т е , задължител­
но се спира движението н а р а м о т о и блю­
д о т о на в е з н а т а .
7. В е з н а т а се п о ч и с т в а периодично с т ъ к а н
без власинки. За ц е л т а е добре да се изпол­
зва п т и ч е перо или ч е т к а о т камилски
косъм.
8. Хигроскопичните субстанции и течнос­
т и т е се и з м е р в а т в затворени мерител­
ни съдове, с оглед избягване на овлажнява­
не или изпарение. Нехигроскопичните суб­
с т а н ц и и м о г а т да се и з м е р в а т в отворе­
ни съдове и в мерителни ладийки.
ки на р а з т в о р а са в еднакво агрегатно съ-
т о я н и е напр. вода и етанол, т о за р а з т в о ­
р и т е л се приема в е щ е с т в о т о , к о е т о е в по-
голямо количество.
Благодарение на дифузията молекулите
н а р а з т в о р е н о т о вещество се разпределят
равномерно в р а з т в о р и т е л я . С постепено
увеличаване количеството на р а з т в о р е н о т о
в е щ е с т в о се д о с т и г а до е т а п , к о г а т о
колкото молекули (йони) се о т д е л я т о т него
за единица време и п р е м и н а в а т в разтвори­
т е л я , т о л к о в а се с ъ е д и н я в а т о т н о в о към
т в ъ р д а т а (неразтворена) ч а с т . В р а з т в о ­
р а (при д а д е н а т а т е м п е р а т у р а ) винаги има
неразтворено количество о т т в ъ р д о т о ве­
щ е с т в о . Получава се н а с и т е н р а з т в о р .
При определена т е м п е р а т у р а н а с и т е н и я т
р а з т в о р н а дадено вещество има постоян­
н а к о н ц е н т р а ц и я . В клиничната лаборато­
рия н а с и т е н и р а з т в о р и се ползват сравни-
167
т е л н о рядко, к а т о и з т о ч н и к з а получаване
н а р а з т в о р и с определена к о н ц е н т р а ц и я .
КОНЦЕНТРАЦИЯ НА РАЗТВОРИТЕ -
МОЛАРНА, ПРОЦЕНТНА И НОРМААНА
С въвеждането на международната с и с т е ­
м а единици (SI) в з н а ч и т е л н а с т е п е н се пос­
т и г а уеднаквяване н а т е р м и н о л о г и я т а при
характеризиране с ъ с т а в а н а р а з т в о р и т е .
При използване н а р а з т в о р и з а а н а л и т и ч н и
цели, к а к т о и при съобщаване к о н ц е н т р а ­
цията на съставни части на разтвори
(напр. биологични т е ч н о с т и ) т р я б в а ясно д а
бъде д е ф и н и р а н н а ч и н а н а и з р а з я в а н е н а
к о л и ч е с т в е н и т е с ъ о т н о ш е н и я . В наръчни­
к а з а м е ж д у н а р о д н а т а с и с т е м а единици (SI)
в з д р а в е о п а з в а н е т о СЗО п р е п о р ъ ч в а к а т о
единица за количество ВещестНо м о л
(mol) з а в с и ч к и ЮещестВа, ч и я т о о т н о ­
с и т е л н а молекулна м а с а е изОестна.
Препоръчва се д а се п о л з в а т единици, кои­
т о о т р а з я в а т к о л и ч е с т в о в е щ е с т в о - мол
или п р о и з в о д н и т е м у ( т а б л . 6.15), в м е с т о
е д и н и ц и т е з а м а с а (килограм, г р а м , милиг­
рам, микрограм). З а о б е м с е з а п а з в а п о л ­
з в а н е т о н а е д и н и ц а т а л и т ъ р (1). Д а н е
се ползва т е р м и н ъ т к о н ц е н т р а ц и я без до­
п ъ л н и т е л н о определение, з а д а се и з б е г н а т
н е я с н о т и ( т а б л . 6.16).
П о н а с т о я щ е м в с ъ о т в е т с т в и е с изисква­
н и я т а н а SI с и с т е м а т а н а й - ч е с т о в клинич­
н а т а л а б о р а т о р и я се използва м о л а р н а т а
к о н ц е н т р а ц и я , к а к т о з а означаване концен­
т р а ц и я т а н а р а з т в о р и , т а к а и з а съдържа­
щ и т е се в биологичните т е ч н о с т и в е щ е с т в а
(напр. при определяне а к т и в н о с т т а на у-глута-
милтрансферазата (ГГТ) Европейският к о м и т е т
за с т а н д а р т и в клиничната лаборатория
(European Committee for Clinical Laboratory Stan­
dards, ECCLS) препоръчва използването на два
водни разтвори -150 mmol/1 глицилглицинов буфер
с pH 7.7 и 6.0 mmol/1 с у б с т р а т е н разтвор на L-y-
глутамил-З-карбокси-4-нитроанилид. За преобла­
д а в а щ а т а ч а с т о т клинично-химичните пара­
м е т р и се съобщава концентрацията к а т о за мо-
ларни разтвори - за серумните показатели глю-
коза, урея, натрий, калий в mmol/1, за креатинин,
билирубин и желязо в umol/1, за уропорфирините
и тироксина - в nmol/1 и за инсулин - в pmol/1).
Концентрацията на вещества, ч и я т о
о т н о с и т е л н а молекулна м а с а не е и з в е с т н а
- напр. о б щ и я т серумен белтък, к о й т о
включва индивидуални б е л т ъ ц и с различна
о т н о с и т е л н а молекулна м а с а се о з н а ч а ва с
концентрацията на м а с а т а вещество в

Т а б л и ц а 6.15. Единици за количество вещество

Мол ( m o l )
1 mol се равнява на
1 mmol се равнява на
1 цто! се равнява на
Моларната маса на в е щ е с т в о т о в грамове (g)
Количеството вещество на с и с т е м а , к о я т о съдържа същия брой
елементарни частици колкото е б р о я т а т о м и С12 в 0.012 kg.
При използване на единицата mol задълЖително се указва вида на
елементарните частици: атоми, йони, молекули и пр.
1000 mmol
1000 |дто1
1000 nmol

Т а б л и ц а 6.16. Концентрация, количества и единици (по СЗО, със съкращения)

Наименование н а
Определение Единици
количеството
Концентрация на вещество Количество на разтвореното вещество разделено
(в разтвор) mol/1
на обема на разтвора
Молалност (на дадено Количество на разтвореното вещество разделено
вещество в разтвора) mol/kg
на м а с а т а на разтвора
Молален дял (на дадено Количество на разтвореното вещество разделено
вещество в разтвора) mol/mol
на количеството на разтворителя
Концентрация на м а с а т а на М а с а т а на разтвореното вещество разделена
дадено вещество (в разтвор) kg/1
на обема на разтвора
Обемен дял на дадена Обем на с ъ с т а в к а т а разделен на обема
съставка на разтвора 1/1
на с и с т е м а т а (сместа)
168
л и т ъ р (g/1). 6 ) m g / d l (mg%) в m e q / 1 и о б р а т н о
Не се препоръчва използване н а „ о с т а р я ­
meq//lх
лото" название п р о ц е н т е н р а з т в о р . Под mg/dl- -молекулна м а с а
т о в а н а з в а н и е с е р а з б и р а ш е м а с а (най-чес- 10 х валентност
т о в g ) о т д а д е н о в е щ е с т в о н а 100 m l р а з т ­ 10 Х m
тед/1= Sl/dl х валентност
в о р и т е л , н а п р . ф и з и о л о г и ч е н р а з т в о р = 0.9%
м о л е к у л н а Aiaca
воден р а з т в о р н а NaCl (0.9 g N a C l / d l ) . Н е с ъ ­
о т в е т с т в а н а п р е п о р ъ к и т е н а SI с и с т е м а ­ О б е м ъ т н а р а з т в о р и т е л я зависи о т т е м ­
т а и означаването н а „нормалност" н а раз­ п е р а т у р а т а , к о е т о води и до и з в е с т н а про­
твори. Разтвор, к о й т о съдържа 1 грамек- м я н а в м о л а р н о с т т а , р е с п е к т и в н о нормал­
в и С а л е н т в 11 р а з т в о р и т е л с е о з н а ч а в а к а т о н о с т т а н а р а з т в о р и т е . Д а н н и з а т е з и про­
нормален ( е д н о н о р м а л е н ) р а з т в о р . Е д и н г р а - мени з а н а й - ч е с т о ползвания р а з т в о р и т е л -
м е к в и в а л е т н т е к о л и ч е с т в о т о о т дадено в о д а т а с а п р е д с т а в е н и н а т а б л . 6.17.
вещество в грамове, к о е т о при химическо
в з а и м о д е й с т в и е о т г о в а р я по д е й с т в и е т о с и Т а б л и ц а 6.17. Температурна вариация на кон­
на е д и н г р а м а т о м в о д о р о д или н а п о л о в и н ц е н т р а ц и я т а на водни р а з т в о р и
г р а м а т о м кислород. В случай, че в р а з т в о р а се Темпе­ Темпе­
съдържат не един, а повече или по-малко грамек- ратура Фактор ратура Фактор
0 о
виваленти о т в е щ е с т в о т о , т о пред символа п С с
(нормален) се вписваше с ъ о т в е т е н коефициент - 15 0 С 1.0009 21 0С 0.9998
напр. 0.1п - една д е с е т а (децинормален) р а з т в о р ; 16 о
с 1.0007 22 0С 0.9996
2п - двунормален разтвор; 36п - т р и д е с е т и ш е с т 0 0
17 С 1.0006 23 С 0.9994
нормален р а з т в о р . Р а з т в о р и н а в е щ е с т в а , при 0 0
които молекулната м а с а се равнява н а грамекви- 18 С 1.0004 24 С 0.9991
0 0
Валентното тегло, напр. NaOH, и м а т едни и същи 19 С 1.0002 25 С 0.9989
количествени изрази при изразяването с mol/1 или 20 С 0
1.0000 26 С0
0.9986
п. За с я р н а т а киселина, к о я т о при дисоциацията
си отделя два водородни к а т и о н а , р а з т в о р и т е
изразени със с в о я т а нормалност и м а т два п ъ т и
Р Е Д О K C l Ю Т Е И11.ИАЛ
по-голяма с т о й н о с т , о т к о л к о т о при изразяване
с mol/1. В м е с т о нормални понякога се ползва наз­
ванието еквивалентни (милиеквивалнтни) маси, Р е д о к с п о т е н ц и а л ъ т е п о к а з а т е л з а "реак­
съответно разтвори. Еквивалентна маса е б р о я т т и в н о с т т а " н а р а з т в о р и т е . Голяма ч а с т
грамове о т дадено вещество, к о и т о р е а г и р а т със о т х и м и ч е с к и т е р е а к ц и и с а с в ъ р з а н и с про­
с ъ о т в е т е н е л е м е н т или вещество. В клиничната ц е с и т е н а р е д у к ц и я ( о т д а в а н е н а кислород,
лаборатория к о н ц е н т р а ц и я т а на "електролити­ п р и е м н а водород или е л е к т р о н и ) и о к и с л е ­
т е " се представяше в meq/1. За Na + и К + (първа н и е ( п р и е м н а кислород, о т д а в а н е н а водо­
валентност) meq/1 = mmol/1, за Са 2+ и Mg 2+ ( в т о ­ род или е л е к т р о н и ) . Х и м и ч е с к и т е к а ч е с т в а
ра в а л е н т н о с т ) meq/1 = '/г mmol/l. н а в е щ е с т в а т а с а с в ъ р з а н и с б р о я н а елек­
За превръщане н а концентрационните т р о н и т е в ъ в в а л е н т н и т е о р б и т и н а йони­
величини, п р и н е о б х о д и м о с т м о г а т д а с е т е , а т о м и т е или м о л е к у л и т е . Р а з л и ч и я т а
ползват с л е д н и т е формули: в с п о с о б н о с т т а з а с в ъ р з в а н е н а кислород о т
х е м о г л о б и н а (Fe 2 + ) и м е т х е м о г л о б и н а (Fe ),
а) m m o l / I в m g / d l (nig%) и о б р а т н о
к а к т о и в а б с о р б ц и о н н и т е к а ч е с т в а н а NAD
_ 10 х m g—/ d l IOOOOxg/dl и NADU с е д ъ л ж а т н а т а к и в а п р о м е н и .
тто1Д=
.молекулна м а с а молекулна м а с а По п р и н ц и п п о т е н ц и а л ъ т е израз н а енер­
гия, р е д о к с п о т е н ц и а л ъ т е и з р а з н а с В о
... mniolA х м о л е к у л н а м а с а б о д н а енергия, к о я т о позболяба осъ-
пгд/dl =
10 щ е е т б я б а н е т о н а редукционни и окис­
л и т е л н и р е а к ц и и . П о т е н ц и а л ъ т се харак­
б) m m o l / I в m e q / 1 и о б р а т н о т е р и з и р а с единици енергия на заряд. Един volt
п о т е н ц и а л п р е д с т а в л я в а един joul н а coulomb
mmol/l = meg/l х валентност или, з а д а се п р е м е с т и пълнеж о т един coulomb
о т м я с т о с п о т е н ц и а л 0 V н а м я с т о с -1 V е
Пален т п о с т необходим един J.
169
 Всяка окислишелно-редукционна р е а к ц и я [H + ] [A ]
Ka=
включва две в е щ е с т в а . Е д н о т о е о к и с л и т е л , [НА]
д р у г о т о редуктор. О к и с л и т е л я т се редуци­
ра, р е д у к т о р ъ т се окислява. Редуцираното Чрез т р а н с ф о р м и р а н е н а т о в а равенсп
в е щ е с т в о намалява з а р я д а си понеже приема во - р е ш а в а н е п о о т н о ш е н и е к о н ц е н т р а ц и и
е л е к т р о н и , к о и т о с а о т р и ц а т е л н о заредени т а н а водородните к а т и о н и | Н+1 и логарип
(2Н + се р е д у ц и р а т до Н2 С12 се редуцира go 2С1 • муване се д о с т и г а до добре п о з н а т о т
Fe 3+ се редуцира до Ре 2 + ). Окисленото в е щ е с т в о уравнение н а Henderson - Hasselbalch, к о е т
формално увеличава заряда си, понеже о т д а в а п р я к о м о ж е д а б ъ д е и з п о л з в а н о з а изчисли
о т р и ц а т е л н о з а р е д е н и т е електрони (Н 2 се окис­
ване с т о й н о с т т а н а pH:
лява до 2Н + , Ре 2+ се окислява до Ре 3 + ).
При някои клинично-химични анализи се пол­ [А]
pH = р К а + l o g
з в а т редоксиндикатори, к о и т о п р о м е н я т цве­ [НА]
т а си при редуциране н а 50% о т м а с а т а си
(табл. 6.18, по Merck, Hilfstabellen für das chemi­ С т о й н о с т т а н а p H н а в с е к и буферен р а :
sche Laboratorium). т в о р се променя не само при прибавяне н
к и с е л и н и или основи, н о и п р и р а з р е ж д а н е н
Т а б л и ц а 6.18. Редоксиндикатори р а з т в о р а или п р и п р о м я н а в т е м п е р а т у р а
V (Е и ); т а н а о к о л н а т а с р е д а . Д в у к р а т н о т о ра^
Промяна
Индикатор pH 7; р е ж д а н е н а б у ф е р н и я р а з т в о р води до прс
0 вцвета
20 С м я н а н а p H с няколко с т о т н и . Д а н н и т е з
червено - влиянието н а промяната в температура
Неутрално червено - 0.32
безцветно т а с а о т р а з е н и п о - г о р е в т а б л . 6.17. В т а б /
синьо - 6.19 с а п р е д с т а в е н и д а н н и з а ш и р о к о и з п о /
Метиленово синьо + 0.01 з в а н и т е в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я буфер
безцветно
ни р а з т в о р и , подредени по д о л н а т а г р а т
виолетово -
Тионин + 0.06 ца на стабилизираната pH стойност, а
безцветно
т а б л . 6.20 е п о к а з а н о б е м а (в ml) н а изхос
2,6-дихлорфенол- синьо -
+ 0.23 н и я б у ф е р о т т а б л . 6.19 о з н а ч е н с „х" т
индофенол безцветно
к о е т о п о з в о л я в а с р а в н и т е л н о лесно пригогг
синьо - в я н е н а б у ф е р н и р а з т в о р и в ъ в в с я к а клини^
Дифениламин + 0.76
безцветно н а л а б о р а т о р и я . К а к т о и з х о д н и т е раз
Дифениламинсулфо- тВори, т а к а и разрежданията т р я б
нова кис. бариева виолетово -
+ 0.83 Ва д а с е п р и г о т В я т с п р е ч и с т е н а Въ
сол безцветно
Висока с т е п е н ( н а й - д о б р е д е й о н и з и р а
Фероин червено - н а ) Вода, с В о б о д н а о т С 0 2 ( т . е . Врял;
+ 1.06
бледо синьо п р о д ъ л ж и т е л н о и грижлиВо з а т В о р е
н а след тоВа), к а к т о и Висококачест
Вени х и м и к а л и . Т ъ р г о в с к и д о с т ъ п н и с
БУФЕРИ - КЛАСИФИКАЦИЯ г о т о в и б у ф е р н и р а з т в о р и или к о н ц е н т р и р а
И СВОЙСТВА н и изходни р а з т в о р и с г а р а н т и р а н о качес
т в о ( н а п р . M e r c k ) , или п р е т е г л е н и х и м и к а
Разтвор, к о й т о п р и т е ж а в а способ­ ли в сухо с ъ с т о я н и е з а п р и г о т в я н е н а буфер
н о с т т а максимално д а намали промя­ н и р а з т в о р и (напр. Seibold, Boehringe
н а т а В pH п р и п р и б а В я н е н а с и л н и ки­ Mannheim).
с е л и н и или осноВи с е н а р и ч а б у ф е р . П о През п о с л е д н и т е години з а научни цели,.
правило б у ф е р и т е п р е д с т а в л я в а т с м е с о т и при ензимни изследвания в л а б о р а т о р н а
с л а б а к и с е л и н а (НА) и н е й н а сол (А): т а практика навлизат т.нар. цвитерйон
н и буфери. Молекула, к о я т о в к л ю ч в а две р а з
НА *-> Н+ + А л и ч н и й о н и з и р а н и г р у п и , к о и т о п р и различ
При д о с т и г а н е н а р а в н о в е с н о с ъ с т о я н и е , но p H н а с р е д а т а и м а т противоположе!
м о ж е д а бъде о п р е д е л е н а д и с о ц и а ц и о н н а - п ъ л н е ж се н а р и ч а ц в и т е р й о н ( т а б л . 6.2i;
т а к о н с т а н т а н а с л а б а т а киселина о т При проверка н а pH н а различни р а з т в о р и i
буферния р а з т в о р : биологични т е ч н о с т и с е п о л з в а т о р г а н и ч н 1
170
вещества - pH индикатори, които проме­
н я т ц в е т а си в зависимост о т pH на окол­
н а т а среда (табл. 6.22).
Т а б л и ц а 6.19. Ч е с т о използувани буферни разтвори (по H.K.Naito с модификации)
Буфер pH Изходни р а з т в о р и Рецептура
№
по: обсег A В
1 Clark и 1.0-2.2 0.2 mol/1 KCl 0.2 mol/1 HCl 25 ml A + x ml В
Lubs go 100 ml
2 Sörensen 1.2-3.6 0.1 mol/1 глицин + 0.1 mol/1 HCl x ml A + (100-x) ml В
0.1 mol/1 NaCl
3 Sörensen 1.2-5.0 0.1 mol/1 0.1 mol/1 HCl x ml A + (100-x) ml В
двунатриев ц и т р а т
4 Mcllvaine 2.2-7.8 0.1 mol/1 0.2 mol/1 Na 2 HP0 4 x ml A + (100-x) ml В
лимонена киселина
5 Clark и 2.4-4.0 0.1 mol/1 0.1 mol/1 HCl 50 ml A + x ml B;
Lubs калиев б и ф т а л а т H 2 0 go 100 ml
6 Walpole 3.8-5.6 0.1 mol/1 0.1 mol/1 x ml A + (100-x) ml В
натриев а ц е т а т оцетна
киселина
7 Clark и 4.2-6.2 0.1 mol/1 0.1 mol/1 NaOH 50 ml A + x ml B;
Lubs калиев б и ф т а л а т H 2 0 go 100 ml
8 Sörensen 5.0-8.0 1/15 mol/1 КН 2 Р0 4 1/15 mol/1 x ml A + (100-x) ml В
Na 2 HF0 4
9 Sörensen 5.2-6.6 0.1 mol/1 0.1 mol/1 NaOH x ml A + (100-x) ml В
двунатриев ц и т р а т
10 Merz и 6.2-7.8 0.2 mol/I имидазол 0.1 mol/1 HCl 25 ml A + x ml B;
Owen H 2 0 go 100 ml

11 Beisenherz 7.0-8.8 0.5 mol/1 т р и е т а н о л а м и н 0.05 mol/1 HCl 10 ml A + x ml B;

и сътр. + 0.054 mol/1 EDTA.2Na H 2 0 go 100 ml

12 Michaelis 7.0-9.0 0.1 mol/1 барбитал-На 0.1 mol/1 HCl x ml A + (100-x) ml В

13 Gomori 7.2-9.0 0.2 mol/1 Tris 0.1 mol/1 HCl 10 ml A + x ml B;

H 2 0 go 100 ml

14 Sörensen 7.8-9.2 0.2 mol/1 борна киселина + 0.1 mol/1 HCl x ml A + (100-x) ml В
0.1 mol/1 NaOH
15 Gomori 7.8-10.0 0.1 mol/1 2-амино- 0.1 mol/1 HCl 50 ml A + x ml B;
2-метилпропан-1,3-диол H 2 0 go 100 ml

0.1 mol/1 глицин + 0.1 mol/1 NaOH x ml A + (100-x) ml В

16 Sörensen 8.6-12.8
0.1 mol/1 NaCl
0.2 mol/1 борна киселина + 0.1 mol/1 NaOH x ml A + (100-x) ml В
17 Sörensen 9.4-10.6
0.1 mol/1 NaOH

171
Т а б л и ц а 6.20. Приготвяне на буферни р а з т в о р и
(стойности на обема х (ml) за рецептите от таблица 6.5.)

22 2.6 3.0 3.4 3.8 4.2 4.6 5.0 5.4 5.8 6.2 6.6 7.0 7.4 7.6 7.8 8.0 8.4 8.8 9.2 9.6 10.0
№
Буфер по:
1 Clark и Lubs 3.8

2 Sörensen 56.5 68.4 81.0 90.3

3 Sörensen 32.2 36.0 39.9 44.8 51.2 60.0 74.9 100

4 Mcllvaine 98.8 90.0 80.3 72.0 65.1 59.1 53.7 49.0 44.7 40.0 34.5 27.9 19.0 9.8 6.8 4.6

5 Clark и Lubs 34.3 21.6 10.9 3.3

6 Walpole 10.9 23.9 44.9 67.8 84.0

7 Clark и Lubs 3.0 11.1 22.6 34.4 42.4 46.7

8 Sörensen 99.2 97.3 92.8 83.0 65.3 41.3 19.7 12.8 7.4 3.7

9 Sörensen 34.4 42.4 46.7 53.2 8.8 9.2 9.6 10.0

10 Merz и Owen 43.4 36.5 25.4 14.6 10.2 6.6

Beisenherz и 86.2 71.3 62.0 52.0 42.0 22.5 11.7

11
сътр.
12 Michaelis 53.3 57.6 60.8 65.2 70.6 81.2 90.1

13 Gomori 42.0 39.3 33.7 27.9 17.3 8.8

14 Sörensen 53.0 55.4 62.1 7 3 . 6 95.6

15 Gomori 43.9 41.6 34.8 23.3 13.3 5.2 2.3

16 Sörensen 92.0 84.0 73.2 62.5

17 Sörensen 87.0 65.1

Т а б л и ц а 6.21. Цвитерйонни буфери (по азбучен ред)

Моларна рКа п р и
Наименование н а б у ф е р н о т о в е щ е с т в о Формула
маса 25 0
С

^ ( 2 - а ц е т а м и д о ) - 2 амииоетансулфоиова 6.88
ch10n2o4s 182.2
киселина (ACES)
N-(2 ацетамидо) алгинодиацетна киселина (ADA) СвН1Д06 190.16 6.62
1^,№бис(2 хидроксиетил)-2 аминоетансулфонова киселина
C A W 213.26 7.16
(ВЕЯ)
N.N бис(2 хидроксиетил)-глии 1 ин (BICEN) 163.17 8.36
2,2-бис(2 хид poke иетил) имино т р и е - c
A N0 209.24 6.6
(хидроксиметил) м е т а н (BIB-TRI8) 9 6

2 морфолиноетансулфонова киселина
c6h13no4s Н 2 0 213.26 6.16
(монохидрат) (MES)
3 морфолинопропансулфонова киселина (МР8) C A W 209.26 7.20
Пиперазин-1,4 бис-(2-етансулфонова киселина) (PIPE8) С А Л 0 4 в 302.36 6.80
Пиперазин 1,4 бис-(2-етансулфонова киселина)
CAANa204S 346.33 6.80
двунатриева сол (PIPES Na2)
К-[трис(хидроксиметил) метил]-2 а м и н о е т а н
сулфонова киселина (ТЕ8) C A W 229.26 7.60

Г^-[трис(хидроксиметил)-метил]-3 аминопропан-
сулфонова киселина (TAPS) C A W 243.28 8.4

N [ т р и с ( х и д p o k e и м е т и л ) м е т и л ] глицин (TRICIN) с А з Ш 179.17 8.16

б

2 (4-[2-х ид рокс иетил ] 1-nun ер ацин ил) em ан-

сулфонова киселина (HEPES) с а д о 4 в 238,30 7.66

2 (4-[2-хидроксиетил]1-пиперацинил)етан
сулфонова киселина н а т р и е в а сол (HEPES-Na) С А Д Na
2
0
4
8 260.28 7.66

2 (4-[2-хидpoke иетил] 1-пипераи | инил)пропан

сулфонова киселина (HEPPS) сАДО4В 262.33 8.0

2-(циклохексиламино)етансулфонова киселина (CHES) 207.29 966

C A W
172
Таблица в.22. pH индикатори (no Merck, И Щ з Ш Ш е п ^ das chcmisdw Laboratoru^
pH и н д и к а т о р llpexoq pH Промяна в ц в е т а
Тимолово синьо 1,2-2,8 червено-жълто
m-Крезолово червено 1,2-2,8 червено-жълто
4-Диметиламшюазобензол 2,9-4,0 червено-жълтооранжево
Бромфеноловосиньо 3,0-4,6 ж ьлто-червеновиолетово
Конгочервено 3,0-5,2 синьовиолетово-оранжевочервено
Метилоранж 3,1-4,4 червено-жълтооранжево
Бромкрезолово зелено 3,8-5,4 жълто-синьо
Смесен индикатор no Mortimer 4,3-5,2 червено-синьо
Метилово червено 4,4-6,2 червено-жълтооранжево
Лакмус 5,0-8,0 червено-синьо
Бромкрезолово пурпурно 5,2-6,8 жълто-пурпурно
Бромфенолово червено 5,2-6,8 жьлгпооранжево-пурпурно
Бромтимолово синьо 6,0-7,6 жълто-синьо
Фенолово червено 6,4-8,2 жълто-червено
Неутрално червено 6,8-8,0 синкаво червено- жълтооранжево
Крезолово червено 7,0-8,8 жълто-пурпурно
т-Крезолово червено 7,4-9,0 жълто-пурпурно
Тимолово синьо 8,0-9,6 жълто-синьо
Фенолфталеин 8,2-9,8 безцветно-червено виолетово
Тимолфталеин 9,3-10,5 безцветно-синьо
Ализариново ж ъ л т о GG 10,0-12,1 светло ж ъ л т о - кафяво ж ъ л т о
Епсилоново синьо 11,6-13,0 оранжево-виолетово

РАЗРЕЖДАНЕ - П Р О С Т О И С Е Р И Й Н О обема н а целевото разреждане:

СЪХРАНЕНИЕ ИЛ Р А З Т В О Р И Т Е
В много случаи при р а б о т а 6 к л и н и ч н и т е
лаборатории 6 хода н а а н а л и т и ч н и я проиес
се изисква промяна в к о н ц е н т р а ц и я т а на
използваните р а з т в о р и . Примерно необхо­
димо е т р и к р а т н о разреждане на биологич­
на т е ч н о с т предвид висока с т о й н о с т н а
анализирано вещество. В случая се прилага
т.нар. п р о с т о р а з р с Ж ( / а п с , } ш п р . 1:3. Това
най-често се о с ъ щ е с т в я в а с прибавяне н а
две обемни ч а с т и р а з р е д и т е л (напр. 2 ml
физиологичен р а з т в о р ) към 1 ч а с т (1 ml) о т
б и о л о г и ч н а т а т е ч н о с т . Друг п р и м е р з а
просто разреждане може да бъде получава­
не о т изходен калибрационен р а з т в о р с кон­
ц е н т р а ц и я 1000 ц т о ! / ! к р е а т и н и н на рабо­
т е н к а л и б р а т о р с к о н ц е н т р а ц и я 100 fimol/l.
Най-често използваното уравнение з а цел­
т а е:
V, х С, = V2 х С 2
У р а в н е н и е т о се р е ш а в а по о т н о ш е н и е
VixCi
V2 = или в примера
С2
V<2 = 1 ml х 1000 ц т о Ш = 10 ml,
.
100 |imol/l
т . е . разреждане 1:10 и следва към 1 ml изхо­
ден калибрационен р а з т в о р да б ъ д а т при­
бавени 9 ml разредител.
П о л з в а т се и т . н а р . с е р и й н и р а з р е ж ­
д а н и я , най-често при серологични тех н и ­
ки. При с е р и й н о т о разреждане определен
и з х о д е н р а з т в о р се разрежда неколкок-
р а т н о с едно и също количество разредител.
За определяне т и т ъ р а , до к о й т о има поло­
ж и т е л н а серологична реакция е необходимо
разреждане на а н т и г е н а в биологичния ма
т е р и а л (серум) в серия падащи концентра­
ции. Например за т и т р и о т 1:10 до 1:320 се
п о д г о т в я серия о т ш е с т епруветки: в пър-
в а т а е п р у в е т к а се п р а в и изходно р а з
р е Л д а п е 1:10 (1 ml серум + 9 ml разреди­
тел), а И о с т а н а л и т е с е о т м е р в а ед­
н а к в о количество, напр. п о 1 m l разре-
173
д и т е л . Om съдържанието н а п ъ р в а т а еп­
р у в е т к а се прехвърля 1 ml във в т о р а т а .
С м е с т а се размесва добре и о т нея се прех­
върля 1 ml в т р е т а т а епруветка. След ново
размесване о т нея се прехвърля 1 ml в ч е т ­
в ъ р т а т а е п р у в е т к а и т . н . П о л у ч а в а т се
серийни падащи к о н ц е н т р а и и и 1:10, 1.20,
1:40, 1:80, 1:160 и 1:320 в ш е с т а т а е п р у в е т ­
ка. Може да бъде даден и друг пример н а се­
рийно разреждане:
т е м п е р а т у р а 4 - 8 0С. Съдовете т р я б в а да
са е т и к е т и р а н и , с ясно означение, ако съ­
д ъ р ж а т токсични, корозионни или инфекии-
озни р а з т в о р и , к а к т о и срока н а годност,
ако с ъ д ъ р ж а т р е а к т и в или срока н а начало­
т о н а съхранение, ако с ъ д ъ р ж а т биологич­
н а т е ч н о с т . Малък брой р е а к т и в и , най-чес­
т о р а з т в о р и н а киселини (напр. н а пикри­
нова киселина при р е а к ц и я т а н а Jaffe) мо­
г а т да б ъ д а т съхранявани н а с т а й н а т е м -

9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

yiml/
\J \ J \J
Епруветка Изходна 1 2 3 4 5
Разреждане 1:2 1:20 1:200 1:2000 1:20000 1:200000
Фактор на 20 200 2000 20000 200000
разреждане

• И з х о д ната е п р у в е т к а съдържа 1 ml серум п е р а т у р а . Други с а ф о т о ч у в с т в и т е л н и и

и 1 ml буфер
• Е п р у в е т к и т е о т 1 до 5 с ъ д ъ р ж а т по 9 ml
буфер
• Един ml о т изходното разреждане (1:2) се
прибавя в е п р у в е т к а 1
• Един ml о т р а з т в о р а в е п р у в е т к а 1 се при­
бавя в е п р у в е т к а 2
• По същия начин се продължава з а всяка
следваща е п р у в е т к а
Разтворите в клиничната лаборатория
се съхраняват в добре з а т в о р е н и съдове, при
следва да б ъ д а т съхранявани в т ъ м н и съдо­
ве (напр. р а з т в о р н а v a n Kampen Zijstra -
модифициран Drabkin), Тези указания, мар­
кирани в м е т о д и ч н о т о указание за с ъ о т в е т ­
ния п а р а м е т ъ р следва да б ъ д а т означени н а
е т и к е т а върху съда. Биологични м а т е р и а ­
ли, предназначени з а по-рядко изпълнявани
анализи м о г а т д а б ъ д а т съхранявани
"дълбоко замразени" при -20 0С или -75 0С. Тази
о с о б е н о с т също т р я б в а д а бъде я с н о
посочена в м е т о д и ч н о т о указание.

ОСНОВНИ РАЗДЕЛИТЕЛНИ ц и о н н о т о разделяне н а в е щ е с т в а , ч и и т о

ТЕХНИКИ НРИ ПОДГОТОВКА НА п л ъ т н о с т и или маси значимо се р а з л и ч а в а т
помежду си. В г р а в и т а ц и о н н о т о поле н а
ПРОБИТЕ И/ИЛИ ц е н т р о ф у г а т а ч а с т и ц и т е , к о и т о и м а т по-
НЯКОИ АНАЛИЗИ голяма п л ъ т н о с т се п р и д в и ж в а т по-бързо q
о т онези, к о и т о и м а т по-малка п л ъ т н о с т .
Н. Койчева В о б л а с т т а на клиничната лаборатория
ц е н т р о ф у г и р а н е т о се използва за:
ЦЕНТРОФУГИРАНЕ И ЦЕНТРОФУГИ • разделяне на частиците от течността,
в която са суспендирани, напр. отделяне
Центрофугирането е т е х н и к а з а разде­ на клетъчните елементи от кръвта и
ляне на ч а с т и ц и в зависимост о т разлики в получаване на плазма или серум, концен­
т я х н а т а п л ъ т н о с т или маса. Центрофу­ триране на клетъчни елементи и други
г а т а е а п а р а т , к о й т о ускорява г р а в и т а - съставки на биологични течности с цел
174
 микроскопско или химическо изследване,
отстраняване на белтък след х и м и ч н а
преиипитаиия, разделяне на свързан с бел­
тък и л и а н т и т я л о л и г а н д от свободен
лиганд при илгунохимични и други изслед­
вания;
• разделяне на две течни фази, които и м а т
различни плътности, напр. за екстрахи-
ране на разтворени вещества от водна в
органична фаза, разделяне на хиломикро-
ни от други серумни или плазмени ком­
поненти, както и на л и п о п р о т е и н и т е
едни от други.
TunoBe ц е н т р о ф у г и
Центрофугите м о г а т да се разделят на 3
типа: с хоризонтален (излитащ) ротор, с
ъглов (фиксиран под определен ъгъл) ротор и
ултрацентрофуги. П ъ р в и т е два т и п а мо­
г а т да б ъ д а т хладилни или без охлаждане,
предназначени за поставяне върху п л о т или
директно на пода.
При иентрофугите с х о р и з о н т а л е н ро­
т о р гнездата се д в и ж а т свободно и епру­
в е т к и т е в т я х з а е м а т хоризонтално поло­
жение по време на иентрофугиране и верти­
кално, к о г а т о р о т о р ъ т е в покой. По време
на иентрофугирането ч а с т и и и т е се прид­
вижват по един и същи начин към д ъ н о т о
на е п р у в е т к а т а , к о г а т о т я з а с т а н е под
прав ъгъл спрямо о с т а на въртене. По т о з и
начин с е д и м е н т ъ т се разпределя равномер­
но на дъното на е п р у в е т к а т а . Повърхност­
та на седимента е успоредна на оста на
въртене на ротора и е перпендикулярна на
повърхността по надлъжната ос на епру­
ветката. Н а д с т о я щ а т а т е ч н о с т се о т с ­
т р а н я в а с пипета, а при компактен седи­
м е н т т я може да се о т л е е .
В иентрофугите с ъ г л о в р о т о репрувет­
ките се поддържат фиксирани под ъгъл 25°
- 45° по отношение на в е р т и к а л н а т а ос на
въртене. При въртене на ъгловия р о т о р час­
т и и и т е се придвижват хоризонтално по по­
сока навън не само към дъното, но и към
с т е н а т а на е п р у в е т к а т а . С е д и м е н т ъ т се
събира на дъното и с т е н а т а на епруветка­
т а . Повърхността м у е ycnopegita на оста
на ротора и е под ъгъл спрямо надлъжната
ос на епруветката. При спиране на р о т о ­
ра, ч а с т и ц и т е се плъзгат надолу по дължи­
н а т а на е п р у в е т к а т а и се получава по-ре­
хав седимент, въпреки че при високооборот-
н и т е иентрофуги с ъглов р о т о р т о з и недос­
т а т ъ к е преодолян. Поради аеродинамична­
т а си форма фиксираните под ъгъл ротори
м о г а т да се в ъ р т я т с по-големи скорости,
откол кото и з л и т а щ и т е ротори. При вър­
т е н е т о се създава топлина вследствие т р и ­
е н е т о с въздуха. При някои високооборотни
иентрофуги съпротивлението се намалява
чрез създаване на вакуум.
Ссдилюитацилта н а голелт части­
ц и е н а п ъ л н о з а д о в о л и т е л н а и п р и по-
н и с к и обороти, т а к а ч е ц е н т р о ф у г и ­
т е с и з л и т а щ и ротори са подходящи
за отделяне н а п л а з м а и л и серум о т
кръвта, к а к т о и н а преципитиран
белтък о т надстоящата течност.
У л т р а ц е н т р о ф у г и т е са а п а р а т и , в
които р о т о р ъ т се в ъ р т и с висока скорост
във вакуум или във водородна атмосфера.
Постига се голяма иентрофужна сила - о т
100 000 х g до 500 000 х g. Ултраиентрофуги-
р а н е т о се извършва под с трог т е м п е р а т у ­
рен контрол и при охлаждане на камерата
(високите скорости на въртене и продължи­
т е л н о т о иентрофугиране създават условия
за образуване на з н а ч и т е л н а топлина).
Подразделянето на ултраиентрофугите на
препаративни и аналитични в известен
смисъл е условно - аналитичните може да
се използват за препаративни иели (с под­
ходящ ротор), а на препаративните може
да се постави оптична система. С препа­
р а т и в н и ултрацентрофуги обикновено се
изолират клетъчни компоненти, белтъии,
нуклеинови киселини и др. колоидни части-
ци или макромолекули с размери над 0,1цт.
Може също т а к а се изолират (и определят
по холестероловото съдържание) основните
класове л и п о п р о т е и н и . А н а л и т и ч н и т е
ултраиентрофуги са снабдени с оптични
системи (абсорбиионни и рефрактометрич-
ни). А н а л и т и ч н и т е ултраиентрофуги са
предназначени за определяне на молекулна­
т а маса на макромолекули, но д а в а т въз­
можности и за количествен анализ на смеси
о т макромолекули на основата на зависи­
м о с т т а между кониентрацията на р а з т ­
вора и поглъщането или пречупването на
светлината. Молекулната маса се опреде
ля по скоростта н а седиментаиия{се$\хълеп-
т а и и о н н и я т коефиииент (s) е пропорииона-
175
лен на молекулната маса) или по м е т о д а на регистриране А.
седиментационно равновесие. При движени­ Ш
е т о на р о т о р а изследваните молекули с е S ош ика
насочват към единия край на контейнера в с .
зависимост о т разликата между т я х н а т а
п л ъ т н о с т и п л ъ т н о с т т а на р а з т в о р и т е ­
ля. Постепенно в първоначално хомогенна­
т а среда се създава п л ъ т н о с т н а граница,
к о я т о бавно се п р е м е с т в а по д ъ л ж и н а т а на
контейнера. Молекулната м а с а н а макро-
молекулите е пропорционална на скорост­
т а на преместването на п л ъ т н о с т н а т а
граница. Положението на г р а н и ц а т а се оп­
ределя оптично чрез разликата между по­
к а з а т е л и т е на пречупване или отслабване­
т о на сноп светлина, к о я т о се пропуска
напречно през контейнера. Получават с е източник на светлина
ясни образи, к о и т о се р е г и с т р и р а т (фотог­
Б.
рафират) на определени интервали о т вре­ мениск основа

ме. Седиментационните данни се п р е д с т а ­

в я т к а т о седиментационни диаграми (фиг.
6.13).
n s J н а EEzi
У с т р о й с т в о т о на зоналните или гради- Разпределение в кювета
е н т н и ултрацентрофуги е различно о т т о в а
на д р у г и т е у л т р а ц е н т р о ф у г и . Т е х н и я т
р о т о р е плитък цилиндричен съд, к о й т о в t
движение се напълва последователно с раз­
т в о р и с различна п л ъ т н о с т ( к о н ц е н т р а ­
ция), най-голяма в периферията. По т о з и Разпределение на концентрациите

начин във въртящия се р о т о р се о б р а з у в а т

концентрични зони с различна п л ъ т н о с т на
р а з т в о р и т е ( п л ъ т н о с т е н г р а д и ен т ) . Ако
близо до о с т а на в ъ р т е н е се внесе суспен­
зия, к о я т о съдържа ч а с т и ц и с нееднаква
п л ъ т н о с т , при ц е н т р о ф у г и р а н е т о т е с е
у с т а н о в я в а т в з о н а т а с п л ъ т н о с т на раз­
твора, равна на т я х н а т а . Така може да се
получат произволен брой фракции. Изважда­
н е т о на о т д е л н и т е фракции с т а в а п о с т е ­
пенно о т най-леката към н а й - т е ж к а т а чрез
внасянето (при бавно движение на р о т о р а )
на допълнителен р а з т в о р с още по-голяма
п л ъ т н о с т , к о й т о ги и з м е с т в а последова­
телно о т периферията към о с т а . По прид­
вижването на г р а д и е н т и т е при центрофу­
гиране може да се изчисли седиментацион-
н а т а к о н с т а н т а . Тя с ъ о т в е т с т в а на кое­
фициента на с е д и м е н т а ц и я (s), приведен
към вода при т е м п е р а т у р а 20 0С (S20,w).
Седиментационната к о н с т а н т а се изра­
зява в единици на S w e d b e r g (S). Една Свед-
бергова единица се равнява на концентра­
ц и я т а , умножена по Ю13. Седиментацион-
176
I
iA. L i
II III
J
Разпределение на концентрационните градиенти
Фиг. 6.13. Ултрацентрофуга u ултрацентрофу-
гиране: А. - схематично представена аналитич­
на ултрацентрофуга; Б. - схематично предста­
вена седиментация в ултрацентрофуга във вре­
ме I, II, III (м- ъглова скорост, р - плътност).
н а т а к о н с т а н т а на а л б у м и н а е S20 = 4.6, н а
основното количество глобулини - 820 = 7.0,
на макроглобулините- S20 = 16 -18. Седимен-
т а ц и я т а при центрофугиране зависи о т го­
л е ми н а та , ф о р м а т а и п л ъ т н о с т т а на час­
т и ц и т е , о т п л ъ т н о с т т а и в и с к о з и т е т а на
р а з т в о р и т е л я и о т т е м п е р а т у р а т а . Плът­
н о с т т а н а л и п о п р о т е и н и т е е по-ниска
(1006-1210 g.l"1), о т к о л к о т о на о с т а н а л и т е
плазмени б е л т ъ ц и (над 1300 g.l 1 ). К а т о се
повишава п л ъ т н о с т т а на буферния р а з т ­
вор чрез прибавяне на соли, може да се пре-
дизбика изплуване (флотация) на липопроте-
и н и т е к ъ м мениска. Р а з д е л е н и т е чрез
ултрацентрофугиране липопротеинови кла­
сове и субкласове се х а р а к т е р и з и р а т с фло­
тационната си к о н с т а н т а (Sj). Хиломикро-
н и т е и VLDL ф л о т и р а т при най-ниска п л ъ т ­
н о с т н а солния р а з т в о р , 1006 g.l'1, LDL - при
1063 g.l'1, a HDL - при 1210 g.l"1. Аналитично­
т о зонално у л т р а ц е н т р о ф у г и р а н е е референ-
тен м е т о д за. разделяне н а липопротеинови
субкласове в солен г р а д и е н т и т о ч н о т о им
количествено определяне с шлиренова о п т и ­
ка (die Schliere - п о - п л ъ т н о м я с т о в с т ъ к л о ,
различно пречупващо с в е т л и н а т а ) . С шли­
ренова о п т и к а се р е г и с т р и р а т з а в и с и м и т е
о т к о н ц е н т р а ц и я т а промени в индекса на
пречупване по време н а ц е н т р о ф у г и р а н е .
К о н ц е н т р а ц и я т а н а всяка фракция се изчис­
лява въз основа н а з а в и с и м о с т т а между
индекса н а пречупване и с у х о т о т е г л о н а
с ъ о т в е т н и я липопротеинов клас.
У л т р а ц е н т р о ф у г а т а Airfuge представля­
ва м и н и а т ю р н а въздушна т у р б и н а с малък
р о т о р , к о й т о д о с т и г а ц е н т р о ф у ж н а сила
165 000 х g. Използва се за и з б и с т р я н о н а се­
руми о т хиломикрони.
Устройство и компоненти
Всички центрофуги с ъ д ъ р ж а т д ю т о р (цен­
т р о ф у ж н а глава), в ъ р т я щ в а л и с л с к т -
р о л ю т о р . Р о т о р ъ т е з а т в о р е н в камера с
капак и ключ, к о й т о не позволява о т в а р я н е ­
т о на капака на ц е н т р о ф у г а т а преди спи­
р а н е т о й. Ц е н т р о ф у г и т е с а сн а б д ен и с
включващо, часовниково, спирачно у с т р о й с ­
т в о , к о н т р о л н а с к о р о с т т а на в ъ р т е н е и
тахометър. В съвременните центрофуги
п р о д ъ л ж и т е л н о с т т а на центрофугиране,
ускорението и п о с т е п е н н о т о спиране н а
р о т о р а се к о н т р о л и р а т о т микропроцесор
съгласно з а д а д е н а т а програма. Звукова или
видима аларма показва неправилно функци­
ониране, напр. неуравновесен (ас и мет ри ч н о
натоварен) р о т о р .
Т и п и ч н а т а ц е н т р о ф у г а с хоризонтален
(излитащ) р о т о р и м а ч е т и р и с и м е т р и ч н о
разположени гнезда (контейнери). Всяко о т
шях се движи свободно между две о т ч е т и ­
р и т е еднакви р а м е н а на м е т а л н а опора с
ф о р м а т а "Хм. Г н е з д а т а с а окачени на оси
между периферните краища на р а м е н а т а и
м о г а т да п о е м а т различни а д а п т о р и или
с т а т и в и според вида на е п р у в е т к и т е . Гнез­
д а т а с л у ж а т к а т о д ъ р ж а т е л и н а епрувет­
к и т е или н а а д а п т о р и т е за т я х . Повечето
д ъ р ж а т е л и с ъ д ъ р ж а т подложки на д ъ н о т о
н а г н е з д а т а за предпазване н а епруветки­
т е о т счупване по време на центрофугира­
не. Някои центрофуги за р а б о т а н а п л о т
позволяват в едно гнездо да се п о с т а в и с т а ­
т и в за 60 проби, т а к а че едновременно да се
ц е н т р о ф у г и р а т 240 проби.
С к о р о с т т а н а центрофужния р о т о р се
регулира о т потенциометър, к о й т о проме­
ня приложения в о л т а ж . Тахометърът по­
к а з в а с к о р о с т т а н а р о т о р а {обороти з а
min), но не и г о л еми н ата н а центрофужна-
т а сила, приложена към съдържанието на
е п р у в е т к и т е в р о т о р а . Спирачното уст­
ройство д е й с т в а чрез смяна (обръщане) н а
п о л я р н о с т т а н а електричния т о к , прило­
жен към р о т о р а . Часовниковото устройст­
во позволява на р о т о р а да достигне предва­
р и т е л н о п р о г р а м и р а н а т а скорост при оп­
т и м и з и р а н и условия и да спре постепенно
(без задействане на спирачното у с т р о й с т ­
во) след к а т о и з т е ч е програмираното вре­
ме. Температурата в к а м е р а т а на повече­
т о центрофуги може да се повиши с около 5
0
С само при еднократно центрофугиране за
разделяне на плазма или серум о т кръвни
клетки. Промените в т е м п е р а т у р а т а за­
в и с я т о т н а ч а л н а т а околна т е м п е р а т у р а
в к а м е р а т а на ц е н т р о ф у г а т а , с к о р о с т т а
и вида н а р о т о р а , к а к т о и о т продължител­
н о с т т а на центрофугиране. Концентраци­
я т а н а изследваните в е щ е с т в а в п р о б а т а
може да се промени поради изпарение. В по-
големи центрофужни камери нагряването е
по-слабо. За центрофугиране на топлинно
лабилен м а т е р и а л се препоръчва хл а д и л на
центрофуга. В съвременните хладилни цен­
трофуги може да се поддържа предварител­
но зададена т е м п е р а т у р а с т о ч н о с т 1 0С.
Предлагат се модели с пластмасов капак над
к а м е р а т а на р о т о р а или на всеки контей­
нер, за да се намали образуването на аеро­
зол в случай на счупване на епруветка.
Р а з д е л и т е л н а сила н а ц е н т р о ф у г а т а
С к о р о с т т а н а р о т о р а в обороти за m i n
не дава представа за разделителната цен-
177
трофуЖна сила. Последната се х а р а к т е р и ­
зира с т е р м и н а отппоситслно' ц с ч т р о
фуЖпа с и л а (relative c e n t r i f u g a l f o r c e ,
RCF) и л и относително центрофужно поле.
Изчислява се по формулата:
RCF = 1.118 х 10 6 х г х п 2
1,118 х 10"5 - емпиричен фактор
г - хоризонтално разстояние, т.е. радиусът (в
cm) о т иентъра на ротаиия до дъното на епру­
в е т к а т а в гнездото на ротора по време на иен-
трофугиране
п - скорост на въртене в o6opomu/min (revolu­
tions per minute, rpm).
RCF се изразява к а т о к р а т н о с т н а гра­
в и т а ц и я т а ( п ъ т и g), напр. 400 х g. Така се
изчислява м а к с и м а л н а т а RCF, к о я т о н е
действа върху ц я л о т о съдържание н а епру­
в е т к а т а . RCF в една и с ъ щ а е п р у в е т к а е
различна в зависимост о т р а з с т о я н и е т о о т
о с т а на в ъ р т е н е (фиг. 6.14) к а т о е много по-
малка на п о в ъ р х н о с т т а н а т е ч н о с т т а . RCF
може да се определи също т а к а по номогра-
м а (обикновено се п р е д о с т а в я о т произво­
дителя на центрофугата).
Фиг. 6.14. Зависимост на ускорението в една и
съща центрофужна епруветка о т разстояние­
т о до о ста на въртене при постоянна скорост
на ротора (12 000 rpm)
Ускорението п а ц е н т р о ф у г и р а н е (т^)
е основна х а р а к т е р и с т и к а н а всяка ц е н т ­
рофуга. То е право пропорционално н а чес­
т о т а т а н а в ъ р т е н е (и) и р а з с т о я н и е т о (г)
и о бр а тно пропорционално н а з е м н о т о ус­
корение (g):
r|=4^ 2 u 2 r/g
В съвременните у л т р а ц е н т р о ф у г и чес­
т о т а т а н а в ъ р т е н е д о с т и г а до д е с е т к и
хиляди o6opoma/min, при к о е т о ускорение­
т о на центрофугиране с т а в а м н о г о к р а т н о
по-голямо о т земното, напр. г\ = 4х105. При
178
определени геометрични размери н а р о т о ­
р а и се определя о т ч е с т о т а т а п а вър­
тене. Г о л е м и н а т а н а и групира центрофу­
г и т е в няколко класа - о т обикновени (v^2000
m i n ' ) д о ултрацентрофуги (v~80000 m i n 1 ) .
Ирелгето з а с с д и л ь е н т а ц и я н а час­
т и ц и т е зависи о т с к о р о с т т а на р о т о р а ,
радиуса н а р о т о р а и о т е ф е к т и в н а т а дъл­
ж и н а н а п ъ т я , и з м и н а т о т у т а е н и т е час­
тици, т . е . о т височината на т е ч н о с т т а в
е п р у в е т к а т а . З а п о с т и г а н е н а с ъ щ а т а цен­
т р о ф у ж н а сила с друг р о т о р ( р о т о р с раз­
личен радиус), с к о р о с т т а н а в ъ р т е н е и вре­
м е т о за центрофугиране м о г а т да се изчис­
л я т по формулите:
Rpm (друг pomop)=Vl000x RCF/11.18x г
RCF - относителна центрофужна сила на ори­
гиналния ротор
г - хоризонтално разстояние на другия ротор
„ , . /времехКСР(ориг.ротор)
В р е м е («руг р о т о р ) = л / — —
V 11СГ(друг р о т о р )
Точното възпроизвеждане на условията на
центрофугиране с друг ротор не е напълнс
възможно.
Правила з а р а б о т а и п о д д р ъ ж к а
Специфични препоръки з а RCF или за време­
т о на центрофугиране с цел о т д е л я н е серум
или п л а з м а о т к р ъ в т а не с ъ щ е с т в у в а т
въпреки дългогодишния о п и т в т а з и област.
Обикновено се центрофугира при 1000-1200
g за 10 min (5-15 min). При 1000g, 1ml е р и т р о ­
ц и т и " т е ж и " 1kg. По-голяма RCF позволява
по-бърза седиментация, но ч е с т о води до не­
ж е л а т е л н о излизане н а к л е т ъ ч н о съдържи­
мо.
За правилното функциониране н а ц е н т ­
р о ф у г а т а т р я б в а да се използват само пре­
п о р ъ ч а н и т е о т производителя епруветки.
Ако след ц е н т р о ф у г и р а н е т о н а д с т о я щ а т а
т е ч н о с т се о т с т р а н я в а , по-подходящи са
конични центрофужни епруветки. Големи­
н а т а и ф о р м а т а н а ц е н т р о ф у ж н и т е епру­
в е т к и т р я б в а да позволява т я х н а т а с т а ­
билна позиция в г н е з д а т а .
При ц е н т р о ф у г и т е с и з л и т а щ р о т о р гор­
н а т а ч а с т н а е п р у в е т к а т а не бива да сс
издава много над контейнера, з а щ о т о пре­
чи н а " и з л и т а н е т о " .
 Много важно за р а б о т а т а на центрофу­
г и т е е уравновесяването и л и симетрично­
то зареждане на ротора. Това означава ма­
с а т а и ц е н т ъ р ъ т на м а с а т а ( ц е н т ъ р ъ т на
т е ж е с т т а ) на симетрично разположените
контейнери да б ъ д а т еднакви, к о е т о изиск­
ва някои гнезда да се з а р е ж д а т с б а л а с т н а
т е ч н о с т . Асиметричното натоварване на
ротора предизвиква вибрации, к о и т о м о г а т
да доведат до повреди на ц е н т р о ф у г а т а .
Теглото на с т а т и в и , епруветки и друго съ­
държание о т две противоположни с т р а н и
на р о т о р а не бива да се различава с повече
о т 1% или с определен л и м и т , установен о т
производителя. Преди ц е н т р о ф у г и р а н е ,
а д а п т о р и т е с епруветки, в к о и т о са проби-
Б.
Фиг. в. 15. Натоварване »а ротора на центро­
фуга с м е с т а за 48 епруветки (празните кръгче­
та означават свободни места): А. - правилно на­
товарваме на ротора; Б. - неправилно натовар­
ване на ротора.
т е , се п о с т а в я т на д в е т е блюда на везна и
се уравновесяват. Епруветките в два про­
т и в о с т о я щ и контейнера ( с т а т и в а ) т р я б ­
ва да се подредят симетрично (фиг. 6.15). За
уравновесяване м о г а т да се използват също
т а к а епруветки с вода. Общото тегло на
всеки контейнер не бива да достига грани­
ц а т а , посочена о т производителя за с ъ о т ­
в е т н а т а изчислена скорост. Асиметрично
натовареният ротор предизвиква вибрации,
к о и т о д о в е ж д а т до по-бързо износване,
повреди на ц е н т р о ф у г а т а и до по-често
чупене н а е п р у в е т к и . В и б р а ц и и т е
намаляват к о м п а к т н о с т т а на седимента.
Слаба вибрация, дори на добре уравновесен
ротор, се очаква при ниските скорости в
началото и края на центрофугирането, но
ц е н т р о ф у ж н а т а сила е д о с т а т ъ ч н а да за­
пази к о м п а к т н о с т т а на седимента. Вибра­
ц и я т а се усилва при центрофугиране на кри­
т и ч н а т а за с ъ о т в е т н а т а центрофуга ско­
рост. Продължителна р а б о т а в критичния
обхват т р я б в а да се избягва.
Епруветките с в з е т а кръв се центрофу­
г и р а т запушени, за да се намали вероят­
н о с т т а о т образуване на аерозол.
П р а к т и к а т а да се освобождава съсирек в
г о р н а т а ч а с т на е п р у в е т к а т а или на запу­
ш а л к а т а с дървена, стъклена пръчка и др.
т р я б в а да се избягва к а т о потенциална при­
чина за хемолиза. Центрофугирането при
подходяща RCF обикновено осигурява осво­
бождаване на съсирека о т с т е н а т а на еп­
р у в е т к а т а и придвижването му към дъно­
т о на е п р у в е т к а т а .
Ц е н т р о ф у г а т а т р я б в а д а с с почис­
т в а редовнок а к т о з а намалмвапс раз-
пространлванспю н а инфекции, т а к а
и з а осигурявано н а правилната й ра­
бота. При счупвано н а епруветка ста­
тивите и к а м е р а т а внилштелно се
п о ч и с т в а т . Сив п р а х в к с и м е р а т а п о ­
казва, че в нея се н а м и р а т стъклени
отломки о т счупени епруветки и
също н а л а г а почистването н а цент­
р о ф у г а т а . Стъклени п а р ч е н ц а в пред­
п а з н и т е у п л ъ т н и т е л и нерядко пре­
дизвикват непрекъснато чупене н а
епруветки . Предпазните подлоЖки
н а дъното н а гнездата трябва внилш­
телно д а се огледат при почистване
н а центрофугата.
Периодично се п р о в е р я в а т с к о р о с т т а ,
179
часовниковият механизъм, к о м у т а т о р и т е
и ч е т к и т е , а при хладилни центрофуги - и
т е м п е р а т у р а т а . Скоростта н а центрофу­
гата се проверява поне един п ъ т на 3 месе­
ца със стробоскопска с в е т л и н а или с вън­
шен о т ч и т а щ вибрациите т а х о м е т ъ р , чи­
я т о т о ч н о с т е известна. И з м е р е н а т а ско­
р о с т не бива да се различава с повече о т 5%
о т посочената о т производителя. Проверя­
в а т се всички скорости, при к о и т о ц е н т р о ­
фугирането е ч е с т о . Часовниковият меха­
низъм се сверява ежемесечно, например със
секундомер, к а т о за д о п у с т и м а разлика се
п р и е м а т 10%. Т е м п е р а т у р а т а в хладилните
ц е н т р о ф у г и се п р о в е р я в а е ж е м е с е ч н о ;
допустими разлики - до 20С. Кому таторите
а четките се п р о в е р я в а т поне веднъж н а 3
месеца. При много о т съвременните индук­
ционно движени м о т о р и ч е т к и не са необ­
ходими ( о т с т р а н я в а се и з т о ч н и к ъ т н а
прах, к о й т о може да причини повреди н а
е ле ктр о мотора) .
ФИЛТРАЦИЯ
Ф и л т р а ц и я т а е т е х н и к а за разделяне н а
ч а с т и ц и в зависимост о т т я х н а т а големи­
на. За разделянето н а ч а с т и ц и о т т е ч н о с ­
т и се използват два вида филтрация: повър­
хностна и дълбока. В клиничната лаборато­
рия обикновено се извършва повърхностна
(пресяваща) ф и л т р а ц и я през филтърна х а р ­
тия, мембрана и л и сито. Б р о я т и големи­
н а т а на п о р и т е се контролира в процеса н а
производство. При дълбока ф и л т р а ц и я час­
т и ц и т е се з а д ъ р ж а т не само по повърх­
н о с т т а , но и в с а м а т а ф и л т р и р а щ а среда -
п а м у к , фибростъкло, азбест, ин фуз орн а
пръст. В м а т р и ц а т а н а дълбокия ф и л т ъ р
в л а к н а т а н я м а т определено разположение,
з а д а се избегне о б р а з у в а н е н а к а н а л и .
Нееднаквата с т р у к т у р а н а м а т р и ц а т а не
позволява т о ч н а х а р а к т е р и с т и к а н а дълбо­
к и т е филтри. Тя се посочва след експеримен­
т а л н а оценка о т производителя, фибро-
с т ъ к л о т о се използва за филтруване на груб
материал. С ъ ч е т а в а н е т о н а дълбок с повър­
х но с т е н ф и л т ъ р е целесъобразно при пре­
чистване на р а з т в о р и .
Ф и л т р а ц и я т а бива гравитачна, под ва­
куум и л и под налягане. В а к у у м н а т а ф и л т ­
рация е по-бърза о т г р а в и т а ч н а т а поради
180
комбинираното действие на т е ж е с т , всмук­
ване и капилярно привличане. Б ъ р з и н а т а н а
г р а в и т а ч н а т а ф и л т р а ц и я т а зависи о т
е с т е с т в о т о , п о в ъ р х н о с т т а и г о л еми н ата
на порите на филтъра.
Други фактори, о т к о и т о зависи бързина­
т а на ф и л т р а ц и я т а , са броят и големината
на частиците в разтвора и неговото pH.
Различните видове ф и л т ъ р н а х а р т и я се
р а з л и ч а в а т по големина на порите, ретен-
ция, скорост н а филтруване и онечиства-
ния, к о и т о д а в а т о с т а т ъ к при изгаряне
(има значение при гравиметричен анализ).
За ф и л т р и р а н е под вакуум се използва ус­
т о й ч и в а н а намокряне ф и л т ъ р н а х а р т и я с
по-висока с т е п е н н а т в ъ р д о с т . Х а р т и я т а
с фибростъкло с ъ ч е т а в а бърза ф и л т р а ц и я
със задръжка н а много малки ч а с т и ц и .
П о н а с т о я щ е м ф и л т р а ц и я т а в клинична­
т а лаборатория се извършва най-често през
мембрани с т о ч н о определена големина н а
п о р и т е , к о я т о се к о н т р о л и р а при производ­
с т в о т о им. Мембранните филтри се състо­
я т от хомогенен полимер - поливинилиде-
нов флуорид, целулозни естери, целулозоаце-
тат, политетрафлуоретилен, поливинил­
хлорид. Най-често се и з п о л з в а т целулозоа-
ц е т а т н и и целулозонитратни филтри. Про­
и з в е ж д а т се ф и л т р и с най-различна големи­
н а (до 30 cm в д и а м е т ъ р ) , к а к т о и с най-раз­
личен размер н а п о р и т е - о т 10 до 0,025 |.im.
П о с л е д н и т е з а д ъ р ж а т микроорганизми и
позволяват стерилизиране н а т е ч н о с т и . По­
р и т е с ъ с т а в л я в а т 80% о т т и п и ч н и я мемб­
ранен ф и л т ъ р . Това позволява бърза ф и л т ­
рация дори к о г а т о п о р и т е и м а т много ма­
лък д и а м е т ъ р . О с н о в н а т а с т р у к т у р а н а
м е м б р а н н и т е ф и л т р и е хидрофобна, въпре­
ки че п о в ъ р х н о с т т а н а м е м б р а н а т а може
да бъде химически модифицирана т а к а , че
да с т а н е хидрофилна. М е м б р а н н и т е ф и л т ­
ри м о г а т да се и з п о л з в а т под вакуум или на­
лягане. П р е д л а г а т се д ъ р ж а т е л и н а ф и л т ­
ри, закрепващи се към спринцовка, чрез коя­
т о се упражнява налягане. В някои видове
накрайници н а п о л у а в т о м а т и ч н и п и п е т и ,
с к о и т о се взима м а т е р и а л з а амплифика-
ция н а ДНК или з а микробиологични изслед­
вания, са включени филтри. Те значително
н а м а л я в а т о б м я н а т а н а аерозолни капки
между п и п е т а т а и накрайника. Важно при­
ложение на м е м б р а н н и т е ф и л т р и е у л т р а -
филтрацията.
•
Д И А Л И З А
за концентриране на макромолекули - най-
ч е с т о белтъчни - в бедни н а белтъци биоло­
Д и а л и з а т а п р е д с т а в л я в а обмен н а вещес­ гични т е ч н о с т и к а т о урина и гръбначномо­
т в а през полупропусклива мембрана. Тъй зъчна т е ч н о с т .
к а т о о б м е н ъ т почива преди всичко н а ди- Проби о т биологичен м а т е р и а л с много
фузионни процеси, д и а л и з а т а е бавна. За да малък обем м о г а т да б ъ д а т концентрира­
се ускори, върху подлежащия н а диализа раз­ ни чрез центрофугиране в конични целуло-
т в о р се у п р а ж н я в а налягане. Диализа под з о а ц е т а т н и филтри, поставени в подходя­
налягане се означава като молекулна фил­ щи епруветки. Ц е н т р о ф у ж н а т а сила прид­
трация или ултрафилтрация. В о д н а т а със­ вижва в о д а т а и м о л е к у л и т е с молекулна
т а в к а заедно с малки молекули и електроли­ маса под 50 000 Da през анизотропния мем­
т и се пресова или изсмуква през мембрана­ бранен ф и л т ъ р . Ф и л т р и о т т ъ н к и кухи
т а . Г о л е м и т е молекули (в з а в и с и м о с т о т влакна с п о р е с т и с т е н и ( п о р и т е и м а т оп­
избрания размер н а п о р и т е ) не м о г а т д а ределени размери) също се използват за по­
п р е м и н а т през м е м б р а н а т а и се к о н ц е н т ­ лучаване на у л т р а ф и л т р а т и и за концент­
рират в т е ч н о с т т а . Ултрафьиьтрацил риране на белтъци. Г о л я м а т а повърхност
та е т е х н и к а з а о т д е л я н е н а ч а с т и ц и с позволява бързо концентриране.
п о м о щ т а н а много фин ф и л т ъ р . Използва се

КНИГОПИС

Carrciro-Lcwandowski Е. Basic principles a n d practices o f clini­
c a l c h e m i s t r y - U n i t s o f m e a s u r e . I n: B i s h o p M , D u b e n -
Engelkirk J, T o d y Е (eds); Clinical chemistry ( Z ^ e d ) . Phila­
delphia, Lippincott c o m p a n y , 1992, 4 - 6 .
International U n i o n o f p u r e a n d allied c h e m i s t r y a n d I F C C :
O u a n t i t e s a n d u n i t s in c l i n i c a l c h e m i s t r y . B u l l e t i n 2 0 . O x ­
ford, l U l ' A C , 1972.
Zureick M . Weights, m e a s u r e s a n d principles o f instrumenta­
tion - M e t r i c s y s t e m a n d S I . In: T i l t o n R , B a l o w s A , I l o h n a d e l
D, Reiss P (eds). Clinical Laboratory medicine. St Louis -
Baltimore - B o s t o n - C h i g a g o , M o s b y Year B o o k , 1992, 4 0 -
41.
* * *
C a r r e i r o - L e w a n d o w s k i E. B a s i c p r i n c i p l e s a n d p r a c t i c e s o f c l i n i ­
cal c h e m i s t r y . In: B i s h o p M . D u b e n - E n g e l k i r k J , F o d y Е ( e d s ) .
C l i n i c a l c h e m i s t r y . P h i l a d e l p h i a , Y.B. L i p p i n c o t t C o m p a n y ,
1993, 3 - 2 8 .
Harris D . Q u a n t i t a t i v e c h e m i c a l a n a l y s i s . S a n F r a n c i s k o , F r e e ­
man, 1982.
Kaplan L A , Pesel AJ. Clinical c h e m i s t r y , theory, a n a l y s i s a n d
correlation (ed 2), St Louis, M o s b y - Year B o o k Inc,
1989.
Milli p o re - p r o d u c t p r o f i l e . E u r o p e a n c l i n i c a l l a b o r a t o r y , A p r i l ,
1999, 2 8 - 2 9 .
Winstead M . R e a g e n t g r a d e water. H o w , W h e n , W h y ? H o u s t o n ,
Texas American Society o f Medical Technologists, 1987.
U S F Elga s y s t e m s product profile. E u r o p e a n clinical laboratory.
April, 1999, 2 6 - 2 7 .
* * *
Carreiro-Lewandowski E. Basic principles a n d practices o f clini-
j cal c h e m i s t r y - T e m p e r a t u r e . In: B i s h o p M , D u b e n - E n g e l k i r k
J, F o d y Е ( e d s ) : C l i n i c a l c h e m i s t r y (2"*' e d ) . P h i l a d e l p h i a ,
Lippincott c o m p a n y , 1992, 8 - 9 .
* * *
B u d a v a r i s J. T h e M e r c k I n d e x ( 1 2 , h c d ) . R a h w a y , N .J., M e r c k
& C o , 1989.
C a r r e i r o - L e w a n d o w s k i E. B a s i c p r i n c i p l e s a n d p r a c t i c e s o f c l i n i ­
cal c h e m i s t r y . In: B i s h o p M , D u b e n - E n g e l k i r k J, F o d y Е ( e d s ) :
Clinical chemistry (2mled). Philadelphia, Lippincott company,
1992, 7-18.
Duben-Engelkirk JL, W Smith Michael, Bishop ML. Appendi­
c e s . In: B i s h o p M . D u b e n - E n g e l k i r k J , F o d y Е (eds): C l i n i c a l
c h e m i s t r y (2'K) e d ) . P h i l a d e l p h i a , L i p p i n c o t t c o m p a n y , 1 9 9 2 ,
661-677.
Finnpipette. Labsystems. Product Information, European clini­
cal laboratory, 7.1999.
Harris D. Quantitative chemical analysis. S a n Francisco, Free­
m a n , 1982.
Morey G W . T h e properties o f glass (American Chemical Soci­
ety M o n o g r a p h ) , N e w York, Reinhold, 1984.
N a l g e n e L a b w a r e Catalog. Nalge company, Division o f Sybron
corporation, N . Y Rochester, 1983-1984.
O x f o r d l a b o r a t o r i e s . Inc. P i p e t t i n g d e v i c e s a n d t h e i r c a l i b r a t i o n .
F r e d W i l l i a m s F l u i d h a n d l i n g s y s t e m s , 1990, T I S : 2 4 .
P r o c e d u r e f o r c o m p a r i n g p r e c i s i o n o f p i p e t tips. B i o R a d L a b o ­
ratories. P r o d u c t I n f o r m a t i o n N 8 1 - 0 2 0 8 .
Raphaels. L y n c h ' s Medical laboratory technology. Philadelphia,
Saunders, 1983.
W r i g h t D. L a b o r a t o r y r e s o u r c e s - t e m p e r a t u r e . G l a s s w a r e . I n :
A n d e r s o n S. anfl C o c k a y n e S (ed). C l i n i c a l c h e m i s t r y . P h i l a ­
d e l p h i a - L o n d o n - T o r o n t o , S a u n d e r s c o m p a n y , 1993, 2 - 2 2 .
Z u r e i c k M . M e a s u r e s , V o l u m e t r i c m e a s u r e m e n t . In: T i l t o n R ,
B a l o w s A , H o h n a d e l D, Reiss P (eds). Clinical Laboratory
medicine. St Louis - Baltimore - Boston --Chigago, Mosby
Year B o o k , 1 9 9 2 , 4 2 - 4 4 .
* * *

Cockayne S. T e m p e r a t u r e . In: A n d e r s o n S , C o c k a y n e S ( e d s ) . Б ъ л г а р с к и д ъ р ж а в е н с т а н д а р т 8 1 1 0 - 7 0 , 1984, 3 .

I Clinical chemistry. Philadelphia - L o n d o n - Toronto, S a u n d e r s
C h r i s t i a n G D : A n a l y t i c a l c h e m i s t r y (5"' e d ) . N e w York, J o h n
company, 1993, 12-14.
181
 Wiley & Sons, INC, 1994. N a i t o H K . P h y s i c a l and c h e m i c a l data. In: H a n d b o o k o f clinical
chemistry. Vol.1., Werner M . ( e d . ) , B o c a Raton, C R C Press,
Fluka, Chemika, B i o c h e m i c a , An alyt ik a, 1 9 9 7 / 9 8 , 1 3 .
1982, 67-286.
* * *

W e b e r S G . E l e c t r o c h e m i s t r y . In: C l i n i c a l C hemistry. T h e o r y ,
Вранскн BK: М е д и ц и н с к а физика, 2 и з д а н и е , C , М е д и ф и з к ,
a n a l y s i s and correlation. Kaplan L A , P e s c e AJ ( e d s ) , S t . L o u i s
1957. - Toronto - Princeton. M o s b y , 1 9 8 4 , 2 4 0 - 2 5 1 .
Илков Л. О с н о в и на количествения анализ. А н а л и т и ч н а в е з ­
W H O . T h e SI for the health p r o f e s s i o n s , G e n e v a , W H O , 1 9 7 7 .
на - теглене. В: Каракашов А . , П а н д о в X ( р е д ) . К л и н и ч н а
* * •
лаборатория, С о ф и я , М е д . и ф и з к . , 1 9 7 0 .
Т о д о р о в : В. М е д и ц и н с к а ф и з и к а . С о ф и я . 1 9 9 5 .
Christian O D ; A n a l y t i c a l c h e m i s t r y (5 , h e d ) . N e w York, J o h n
Wiley & Sons, INC, 1994. B a c h o r i k P S , R i f k i n d I3M, K w i t e r o w i c h P O . L i p i d s a n d
* * * D y s l i p o p o p r o t e i n e m i a s . In: H e n r y J B { e d ) : Clinical D i a g n o ­
s i s and M a n a g e m e n t b y Laboratory M e t h o d s (19 l h ed). Phila­
Пенчев Н П , Загорчев БИ. В о д а и в о д н и разтвори. В; К а ч е с ­
delphia, W B S o u n d e r s C o m p a n y , 1 9 9 6 , 8 3 6 - 8 7 9 .
твен анализ, С. Наука и и з к у с т в о , 1956, 8 7 - 9 2 .
B e r m e s EW, Y o u n g D S . General laboratory t e c h n i q u e s and pro­
Keitges FW, Mohrbacher RJ. Reagents, s p e c i m e n c o l l e c t i o n , cal i­
c e d u r e s . In: Burtis C A , A s h w o o d E R ( e d s ) . T i e t z textbook o l i
brators, reference materials and standards. In: Werner M ( e d )
clinical c h e m i s t r y (2 n J e d ) . Philadelphia, W B S o u n d e r s C o m ­
H a n d b o o k o f Clinical Chemistry, B o c a Raton, C R C Press,
pany, 1 9 9 4 , 2 - 4 6 .
1982, 289-335.
B o w e n TJ: A n introduction to ultracentrifugation. L o n d o n , W i l e y
Keller H. M e s s e n und Maße. In: Klinisch-chemische
Interscience. 1 9 7 1 .
l a b o r d i a g n o s t i k für d i e p r a x i s . S t u t t g a r t - N e w York,
G.Thieme, 1991, 2-6. Keller H: K l i n i s c h - c h e m i s c h e labordiagnostik fuer d i e praxis (2
A u f l ) . Stuttgart. G e o r g T h i e m e Verlag. 1 9 9 1 .
Merck K G a A . Buffers, 6 4 2 7 1 ; pH-Indicators, D - 6 7 2 7 1 , M e r c k ,
Darmstadt.

182
ЧАСТ

КЛИНИЧНО ЛАБОРАТОРНИ
ПРОЦЕДУРИ И ТЕХНИКИ
УРЕДИ И АПАРАТИ ЗА ИЗМЕРВАНЕ
СЪЩНОСТ И ПРИНЦИПИ НА
АНАЛИЗА
F
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
Cnekmpo<J)omoMempuH,
нефелометрия,
турбидиметрия
Н. А т а н а с о в
Спектрофопгометрията е аналитичен под­
ход за откриване и измерване на вещества
или т е х н и химически производни, к о и т о
поглъщат светлина с определена дължина
на вълната. В съвременната клинична ла­
боратория с п е к т р о ф о т о м е т р и я т а се из­
ползва широко за измерване на разтворени
в биологичните т е ч н о с т и вещества, ч и я т о
кониентрация има клинично значение. Из­
ложеният по-долу материал не о т м е н я не­
обходимостта о т с т а р а т е л н о запознава­
не с д о к у м е н т а ц и я т а на ф и р м а т а
доставчик, но може да подпомогне лабора­
торния лекар при избор на а п а р а т , въвеж­
дане на спектрофотометрични м е т о д и и
при о т с т р а н я в а н е на някои проблеми свър­
зани с т я х н о т о приложение.
ТЕОРЕТИЧНИ ОСНОВИ
НЛ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯТА
Х а р а к т е р и с т и к а и cöoücmBa па сНет-
л и н а т а . Светлината представлява елект­
ромагнитна лъчиста енергия. Тя се прена­
ся о т фотони, ч и е т о излъчване и поглъща­
не се извършва на порции - кванти. ф о т о ­
ните проявяват свойства на частици или
вълни, но никога на д в е т е едновременно. Те
се излъчват с определена ч е с т о т а к а т о
частици, които вълнообразно разпростра­
няват светлината. Енергията на ф о т о н а
е променлива. Тя зависи о т ч е с т о т а т а на
лъчение и о т дължината на вълната - дис­
т а н ц и я т а между две вълни с еднаква елек­
тромагнитна лъчиста енергия.
Е л е к т р о м а г н и т е н с п е к т ъ р . Светлина­
т а се разпространява к а т о сноп о т лъче-
Фиг. 7.1. Електромагнитен спектър
При преминаване през кварцова призма светлината се раз­
лага на снопове лъчения с различна дължина на вълната и с
различен ц в я т (вж. табл. 7.1).
ния с различна дължина на вълната - о т на-
нометров до микрометров обхват. Когато
премине през кварцова призма, т я претър­
пява дифракция, т . е . разлага се на състав­
ни лъчи в зависимост о т дължината на въл­
н а т а . Тяхната съвкупност образува елек­
т р о м а г н и т н и я с п е к т ъ р на с в е т л и н а т а
(фиг. 7.1). Както излъчваните, т а к а и по­
гълнатите фотони м о г а т да и м а т различ­
на дължина на вълната и с ъ о т в е т с т в а т на
различни участъци о т т о з и спектър. Улт­
равиолетовият (UV)спектъробхйаща. свет­
лина с дължина на вълната о т 180 до 390
п т . Тази светлина не може да се долови с
просто око. Спектърът на видимата свет-
лииа обхваща диапазона о т 390-420 п т до
1100 п т . Човешкото око възприема цвета
на предмети и разтвори по преминалата
или отразена светлина, т . е . възприема до­
пълнителния цвят, който остава след аб-
сорбцията на светлина о т предмета (таб­
лица 7.1). Над т е з и дължини е микровълно­
вия диапазон, наричан още инфрачервен
спектър с диапазон о т 1100 до 2000 п т .
Измерванията в клиничната лаборато­
рия най-често се извършват в ултравиоле­
т о в а т а област (180-390 п т ) и във видима­
т а област на електромагнитния спектър
185
Т а б л и ц а 7.1. Х а р а к т е р и с т и к а н а видимия
спектър на с в е т л и н а т а
Дължина Абсорбиран Д о п ъ л н и т е л е н
на в ъ л н а т а цвят цвят
380 - 430 п т Виолетов Жълто-зелен
Жълт
430 - 475 п т Син
475 - 495 п т Синьо-зелен Оранжев
495 - 505 п т Зелено-син Червен
505 - 555 п т Зелен Пурпурно-червен
555 - 575 п т Жълто-зелен Виолетов
575 - 600 п т Жълт Син
600 - 620 п т Оранжев Зелено-син
620 - 700 п т Червен Синьо-зелен
(390-780 п т ) . Значително по-рядко се изпол­
з в а т измервания в о б л а с т т а под 180 п т ,
к о е т о изисква вакуум и квариова о п т и к а .
Някои функционални групи и м а т х а р а к т е р ­
но поглъщане в микровълновия диапазон,
к о е т о се измерва чрез инфрачервена (вибра­
ционна) с п е к т р о ф о т о м е т р и я при с т р о г о
контролиран т е м п е р а т у р е н режим. Моле­
к у л н и я т с т р о е ж н а по-сложни съединения
се проучва чрез Раманова с п е к т р о ф о т о м е т ­
рия, к о я т о измерва с в е т л и н н о т о разсейва­
не предизвикано о т специфични химически
групи.
Абсорбционна с п е к т р о ф о т о м е т р и я .
К о г а т о с в е т л и н а с определен и н т е н з и т е т
попадне върху р а з т в о р (или т в ъ р д слой) н а
дадено вещество, ч а с т о т с в е т л и н а т а се
поглъща (абсорбира), разсейва или о т р а з я ­
ва. З а т о в а и н т е н з и т е т ъ т н а преминалия
сноп светлина се оказва по-малък, отколко­
т о и н т е н з и т е т а на падналата светлина.
А т о м и , йони или молекули, погълнали
светлинна енергия п р е м и н а в а т във „възбу­
дено" състояние. Е н е р г и я т а н а погълнати­
т е фотони води до преход н а електрони о т
по-ниско н а по-високо енергийно ниво, про­
меня в и б р а ц и я т а и с т е п е н т а н а р о т а ц и я
на к о в а л е н т н и т е връзки в молекулите. В
бистри разтвори на някои съединения, енер­
гийното ниво може да се възстанови след
емисия на светлина с по-голяма дължина н а
в ь лна т а, т . е . излъчване на ф о т о н и с по-нис-
ка енергия - флуоресценция. В други р а з т ­
вори, ч а с т о т с в е т л и н а т а се разсейва о т
п р е ц и п и т а т и , мултимолекулни комплекси
и
9Руги ч а с т и ц и . Т я х н а т а к о н ц е н т р а ц и я
може се измери по с т е п е н т а н а м ъ т н о с т -
186
т у р б и д и м е т р и я , или по и н т е н з и т е т а на
с в е т л и н а т а , измерена под ъгъл о т 9 0 ° - не-
ф е л о м е т р и я . При м е т о д и основани н а „суха
химия", о т р а з е н а т а под различни ъгли с в е т ­
лина се измерва чрез р е ф л е к т н а ф о т о м е т ­
рия.
О п т и ч н а п л ъ т н о с т . Абсорбционната
с п е к т р о ф о т о м е т р и я измерва с т е п е н т а на
абсорбция н а с в е т л и н а т а о т даден разтвор,
т . е . о п т и ч н а т а плътност. Измерването се
извършва, к а т о се с ъ п о с т а в я и н т е н з и т е т а
н а п р е м и н а л а т а с в е т л и н а (Is) с
и н т е н з и т е т а н а п а д н а л а т а с в е т л и н а (1о),
О т н о ш е н и е т о се п р е д с т а в я к а т о пропуск-
л и в о с т (Т - om Transmittance), п р о ц е н т про-
п у с к л и в о с т (%Т) или абсорбция* (А - огг
Absorbance):
Т = 4— %Т = 4^- х 100%
А = 2 - log %Т
IG IG
Закон на Beer-Lambert. Абсорбцията завиех,
о т : 1. д ъ л ж и н а т а н а в ъ л н а т а (>0 2. дебели
н а т а н а слоя р а з т в о р , през к о й т о минавг
с в е т л и н а т а - п л а с т о в а ширина (1) 3. специ
ф и ч н и т е абсорбционни с в о й с т в а н а вещес
твото.
Моларен абсорбционен коефициент. А б с о р
бцията н а свспитна с определена д ъ л
jkutia н а в ъ л н а т а от еднолюларег
р а з т в о р н а веществото, п р и п л а с т а
в а ширина 1 c m се означава като л ю
л а р с н а б с о р б ц и о н е н к о е ф и ц и е н т . Той <
х а р а к т е р е н за всяко вещество и може да имг
различни с т о й н о с т и по п р о т е ж е н и е ш
абсорбционния с п е к т ъ р .
При добре дефинирани условия н а pH, дъл
жина на вълната, м а т р и к с (разтворител)
т е м п е р а т у р а и др., а б с о р б ц и я т а н а едш
разтворено вещество е право пропорционал
н а н а к о н ц е н т р а ц и я т а му (закон н а Beer \
Bouquer-Lambert, наричан ч е с т о закон ш
Beer-Lambert):
А = е Iе
А- абсорбция
Е - моларен абсорбционен коефициент (1 mol/cm
1 - п л а с т о в а ширина н а р а з т в о р а (cm)
с - концентрация на разтвореното
в е щ е с т в о (mol/1).
* абсорбция заменя употребяваното до скоро
название екстинкция
Референтно измерване (blank). Абсорбцията
на едно разтворено вещество, „проба", е сбор
о т а б с о р б ц и я т а н а в е щ е с т в о т о и абсорб­
ц и я т а на разтворителя. Абсорбцията н а
м а т р и к с а с е н а р и ч а р е ф е р е н т н а аб-
сорбцил и л и „ п р а з н а п р о б а " ( b l a n k ) .
Абсорбцията н а р а з т в о р е н о т о в е щ е с т в о се
намира к а т о а б с о р б ц и я т а н а м а т р и к с а се
извади о т а б с о р б ц и я т а н а п р о б а т а , т а к а
че е д и н с т в е н а т а разлика между „проба" и
„празна проба" е н а л и ч и е т о н а измервано­
т о вещество. Р е ф е р е н т н о т о измерване при
еднолъчевите с п е к т р о ф о т о м е т р и се извър­
шва к а т о с п е к т р о ф о т о м е т ъ р ъ т се „нули­
ра" спрямо п р а з н а т а проба к о л к о т о се може
по-често. Някои к о м п ю т е р и з и р а н и с п е к т ­
рофотометри извършват референтните
измервания а в т о м а т и ч н о , а д в у л ъ ч е в и т е
спектрофотометри - непрекъснато, к о е т о
е значително п р е д и м с т в о .
Стандарт. За да се определи н е п о з н а т а т а
концентрация н а в е щ е с т в о в „пробата", е
необходим т о ч е н р а з т в о р на и з м е р в а н о т о
вещество в същия р а з т в о р и т е л - „ с т а н ­
дарт". Х и м и ч е с к а т а чистота и точност­
та в п р и г о т в я н е т о н а с т а н д а р т а и м а т
решаващо з н а ч е н и е за специфичността и
точността «а спектрофотометричния
анализ. Абсорбцията на с т а н д а р т а се о т ­
нася към а б с о р б ц и я т а н а п р о б а т а т а к а ,
к а к т о и т е х н и т е концентрации. О т т у к ,
н е п о з н а т а т а к о н ц е н т р а ц и я на в е щ е с т в о ­
т о в п р о б а т а е равна на а б с о р б ц и я т а на про­
б а т а у м н о ж е н а по к о н ц е н т р а ц и я т а н а
с т а н д а р т а и разделена н а а б с о р б ц и я т а н а
стандарта:
, ^стапоарт
Т = ^ствпиврт | UAU »K
У
np<)fil, =
^сгааииарт XАпроб,
»
робе '»проба Астаидарт
А - абсорбция
К - концентрация
К а т о разделим к о н ц е н т р а ц и я т а на с т а н ­
д а р т а н а н е г о в а т а абсорбция получаваме
ф а к т о р (F). При с т а б и л н и условия, концен­
т р а ц и я т а на определено в е щ е с т в о в различ­
ни проби може да се определи, к а т о абсорб­
ц и я т а на всяка проба се умножи по изчисле­
ния ф а к т о р :
Концентрация
Ф и г . 7.2. Калибрационна крива - графика на за­
висимостта между абсорбция и позната кон­
центрация на стандартен разтвор
Калибрационна крива. Графичното изра-
Ж с н и с н а з а в и с и л ю с т т а Aiejkgy абсор­
бция и концентрация се означава
к а т о „ка^тбрационна крива". Тя се из­
гражда чрез измерване абсорбцията на по­
редица п о з н а т и н а р а с т в а щ и концентрации
н а с т а н д а р т а . Съгласно закона н а Beer-
Lambert, абсорбцията е нула при концент­
рация нула и т о в а позволява по-точно опре­
деляне на ф а к т о р а и по-добра ориентация
за т о ч н о с т т а на измерване чрез анализ на
получената крива (фиг. 7.2). За измерване н а
к о н ц е н т р а ц и я т а н а едно вещество (едно-
компонентен анализ) е необходимо вещест­
в о т о да абсорбира с в е т л и н а с определена
дължина на в ъ л н а т а и да има линейна или
квадратична калибрационна крива (фиг. 7.3).
При измерване к о н ц е н т р а ц и я т а на няколко
в е щ е с т в а (мултикомпонентен анализ), т р я б в а
да се знае броя на к о м п о н е н т и т е 6 пробата, да
и м а ч и с т и с т а н д а р т и с различна спектрална
х а р а к т е р и с т и к а за всеки компонент, да няма
взаимодействие между т я х и абсорбцията на
всеки компонент да се подчинява на закона Beer-
Lambert. Изборът се определя о т вида на вещес­
т в а т а и л и н е й н о с т т а в измервания о б х в а т .
П о в е ч е т о к л и н и ч н о - л а б о р а т о р н и анализи из­
м е р в а т едно в е щ е с т в о , но в д е й с т в и т е л ­
н о с т рядко и м а ч и с т а еднокомпонентна
система.

,, = ^-.„царп, K n p o 6 a = F X Лпроба
А<-тп11ф|рт
187
 Ьрой
Kpußa Уравнение стандарти
1 f С = l^x f
2 f С= к2х f
С = к ^ f + к, х f2
4 f С = к,^ к 2 х f + k^ х Г
фиг. 7.3. Видове калибрационни криви с уравне­
н и я т а , к о и т о ги о п и с в а т и минималния брой
с т а н д а р т и за а в т о м а т и ч н а калибровка
1. Зависимост съгласно закона на Beer-Lambert;
2. Същата с компенсация;
3. Квадратична крива;
4. Същата с компенсация.
Абсорбционен спектър. Измерването на едно
вещество има максимална ч у в с т в и т е л н о с т
и специфичност, к о г а т о а н а л и з ъ т се извър­
шва при дължини н а вълните, к о и т о осигу­
р я в а т максимална абсорбция. При т е з и ус­
ловия ф а к т о р ъ т има най-голяма абсолют­
на с т о й н о с т и н е т о ч н о с т т а н а измерване­
т о е най-малка. Следователно, п р и и зб о р
н а аналитичен спектрофотомстри-
чен м е т о д , с л е д в а д а с е п р е д п о ч е т е
този, ч и й т о х р о л ю г е н илга п о - в и с о к
лголарен абсорбционен к о е ф и ц и е н т и
в по-широки г р а н и ц и с л е д в а з а к о н а н а
Beer-Lambert п р и с ъ о т в е т н а д ъ л ж и н а
н а вълната.
Проследяването н а а б с о р б ц и я т а к а т о
функция о т д ъ л ж и н а т а н а в ъ л н а т а се на­
рича абсорбционен с п е к т ъ р или с п е к т р а л ­
на абсорбционна крива (фиг. 7.4). При снема­
не н а абсорбционен с п е к т ъ р се налага д а се
о т с т р а н и абсорбцията н а м а т р и к с а чрез
референтно измерване при няколко или всич­
ки дължини на вълните. В ъ т р е ш н и я т с т а н ­
д а р т (включване н а п о з н а т о к о л и ч е с т в о
с т а н д а р т в п р о б а т а ) подобрява т о ч н о с т ­
т а на измерването, намалява п р о м е н и т е в
б а з и с н а т а линия (shift) и о т с т р а н я в а о т к ­
лоненията в и н т е н з и т е т а на л а м п а т а
{drift). Ако и н т е р ф е р е н ц и я т а засяга целия
188
60
500 600 700
Дължина на в ъ л н а т а
Фиг. 7.4. Абсорбционен с п е к т ъ р . Графика н а за­
в и с и м о с т т а между абсорбция и дължина н а въл­
н а т а при р а з т в о р н а оксихемоглобин
абсорбционен с п е к т ъ р и води до с и с т е м н о
о т к л о н е н и е , о т с т р а н я в а н е т о ü изисква
в ъ т р е ш н о рефериране в различни к о н ц е н т ­
рации.
Калибриране, р е ф е р е н т н о измерване и
изчисление н а н е п о з н а т а к о н ц е н т р а ц и я н а
дадено в е щ е с т в о чрез п о з н а т с т а н д а р т се
и з в ъ р ш в а т бързо о т с о ф т у е р а на съвремен­
н и т е с п е к т р о ф о т о м е т р и . Микропроцесо­
р ъ т прилага м е т о д а н а н а й - м а л к и т е квад­
р а т и и м е т о д а н а максимална правдоподоб-
н о с т {likelihood) при е д н о к о м п о н е н т н и и
м у л т и к о м п о н е н т н и анализи а в т о м а т и ч н о
без у ч а с т и е т о н а о п е р а т о р а .
УСТРОЙСТВО НА ДИФЕРЕНЦИАЛЕН
АБСОРБЦИОНЕН СНЕКТРОФОТОМЕТЪР
А п а р а т ъ т , с к о й т о се измерва абсорбция­
т а н а м о н о х р о м а т и ч н а с в е т л и н а о т даде­
но в е щ е с т в о (най-често в разтвор), се н а ­
рича с п е к т р о ф о т о м е т ъ р (диференциа­
лен абсорбционен с п е к т р о ф о т о м е т ъ р ) . В
рационализиран вид т о й е неизбежен модул
в много клинично-лабораторни а н а л и з а т о ­
ри. А п а р а т и т е се п р е д л а г а т с а м о с т о я т е л ­
но к а т о с т а н д а р т н и модели з а измерване
о т 190 до 360 п т (означени UV), о т 190 дс
510 или 820 п т (означени UV/VIS) и з а измер­
ване във видимия с п е к т ъ р о т 470 до 1100 т г
(означени VIS). Те са изградени о т о п т и ч н а
с и с т е м а и електроника.
 О п т и ч н а т а с и с т е л г а н а еднолъчебия
с п е к т р о ф о т о м е т ъ р (фиг. 7.5) в1^лючва :
1. Източник на светлина. Н а й - ч е с т о се из­
ползват д е у т е р и е в и или волфрамови лампи.
Те е м и т и р а т с в е т л и н а в широк с п е к т ъ р ,
но с различен и н т е н з и т е т в о т д е л н и т е час­
т и на спектъра. Д е у т е р и е И и т е л а м п и
излъчват с в е т л и н а с дължина н а в ъ л н а т а
между 190 и 820 п т . Те и м а т ж и в о т около 1
000 р а б о т н и часа и не „ и з г а р я т " внезапно,
но с в р е м е т о и н т е н з и т е т ъ т на излъчване­
т о им намалява, к о е т о понижава и ч у в с т ­
в и т е л н о с т т а на измерването. Волфрамо­
в и т е л а м п и се и з п о л з в а т при измервания
във видимия с п е к т ъ р , о т 470 до 1100 п т . Те
и м а т ж и в о т около 3 000 р а б о т н и часа и „из­
г а р я т " к о г а т о ж и ч к а т а се прекъсне. Жи­
вачните лампи и м а т прекъснат спектър
(емисия н а 365, 405, 436 и 546 п т ) и сега се
използват само з а калибровка н а дължини­
т е н а в ъ л н и т е . З а по-специални цели се
използват в о д о р о д н и , й о д п о - в о л ф р а л г о -
ви и други лампи.
8 т о се о т р а з я в а на ч у в с т в и т е л н о с т т а на
Фиг. 7.5. Схема на о п т и ч н а т а система на ед-
нолъчев спектрофометър
1. Източник па светлината; 2. Леща; 3. Бленда (шутср);
4 . Кювета; 5. Спектрографска леща; 6. Процеп;
7. Холографска решетка или кварцова призма;
8. Диодна поредица на д е т е к т о р а .
2. Колиматична оптика. С и с т е м а о т лейди
и филтри, получава с в е т л и н а т а о т лампа­
т а и благодарение на „колиматична" о п т и ­
ка, осигурява паралелен сноп лъчи. Устройс­
т в о , подобно на бленда (shutter) се з а д е й с т ­
ва електромеханично и позволява с н о п ъ т
с в е т л и н а да премине през п р о б а т а . При
смяна на п р о б а т а , т о й се з а т в а р я и т а к а
измерва „ т ъ м н и я т о к " . К о м п ю т ъ р с ъ ч е т а -
Ьа о п т и м а л н о ф у н к ц и я т а н а б л е н д а т а със
с к о р о с т т а н а измерването.
Много субстанции са ф о т о ч у в с т в и т е л н и .
Ге се р а з л а г а т о т с в е т л и н а т а и по време
на и змер ван ето абсорбцията им непрекъс­
н а т о намалява. В т е з и случаи се п о с т а в я
с в е т л и н е н ф и л т ъ р между източника на
с в е т л и н а и к ю в е т а т а . Ако п р о б а т а абсор­
бира само определена дължина н а в ъ л н а т а ,
ч у в с т в и т е л н о с т т а на измерване се пови­
шава с използване на филтри, к о и т о поглъ­
щ а т д о п ъ л н и т е л н а т а светлина. Референт-
н о т о и з м е р в а н е се извършва със с ъ щ и я
филтър. Използването на неутрални фил­
т р и намалява ч у в с т в и т е л н о с т т а на измер­
ването. Ф и л т р и т е с В р е м е т о п о м ъ т -
н я в а т и с л е д б а cja с е з а м е н я т п р и не­
обходимост.
3. Кювета. След к а т о премине през ф и л т ­
р и т е , п а р а л е л н и я т сноп лъчи преминава
през к ю в е т а с п р о б а т а . К ю в е т а т а (или ня­
колко к ю в е т и при „multicell transport") е пос­
т а в е н а в к ю в е т о д ъ р ж а т е л . Използват се
к ю в е т и с различна п л а с т о в а ширина, кое­
измерването: к ю в е т и за малки обеми, кю­
в е т и за л е т л и в и р а з т в о р и и много други
видове. За ензимни определяния се използва
т е р м о с т а т и р а щ к ю в е т о д ъ р Ж а т е л за
една или повече кювети. За серийни опреде­
ляния са удобни проточни кювети, някои о т
к о и т о се п р е д л а г а т с „програмабилен а в т о -
семплер" за а в т о м а т и ч н о подаване на 20 и
повече проби. За измервания nocj 360 п т се
и з п о л з в а т само к в а р ц о в и и л и с и л и ц и е ­
в и к ю в е т и . Във видимия диапазон (420-950
п т ) се използват кювети изработени о т ви­
сококачествено о п т и ч н о ст ък ло и л и под­
ходяща п л а с т м а с а . Д р а с к о т и н и или за-
мърсявания п р а в я т к ю б е т и т е неиз­
ползваеми.
4. Спектрографска леща. Тя фокусира пре­
м и н а л а т а през к ю в е т а т а светлина. Във
фокуса н а с п е к т р о г р а ф с к а т а леща е мон­
т и р а н процеп. Той ограничава размера на
п р е м и н а в а щ и я светлинен сноп, т а к а че да
с ъ о т в е т с т в у в а по размер на фотодиодите,
к о и т о и з г р а ж д а т ф о т о д и о д н а т а редица.
5. Монохроматор. Комплекс о т ф и л т р и ,
189
кварцова призма или конкавна холографска
р е ш е т к а о с ъ щ е с т в я в а т сщсперсия и спек­
т р а л н о разлагане н а с в е т л и н а т а , т а к а че
снопа паралелни лъчи се превръща в широк
с п е к т ъ р монохроматични лъчи (светлина с
определена дъл?кина н а в ъ л н а т а ) . Призма­
т а пр едоставя най-ефективен с в е т л и н е н
спектър, д о к а т о холографската р е ш е т к а
(множество еднакви паралелни линии грави­
рани върху една повърхност, наричана още
дифракционна решетка) не разлага с в е т л и ­
н а т а т а к а ефективно, но и м а з н а ч и т е л н о
по-ниска цена.
6. Детектор. Д е т е к т о р ъ т улавя с в е т л и н ­
ния сигнал и го преобразува в електричен
импулс. С в е т л и н н и я т лъч попада върху ме­
т а л е н л и с т , п о к р и т с полупроводников слой
о т селениум (фотодиоди) и с в е т л о ч у в с т в и ­
т е л е н слой. Л и с т ъ т д е й с т в а к а т о събира­
т е л е н електрод и генерира електричен сиг­
нал, к о й т о променя в о л т а ж а във фотодио-
д и т е - с в е т л и н н и я т сигнал се превръща в
електричен импулс. По п ъ т я н а с в е т л и н а ­
т а с т о и редица о т фотодиоди, т а к а че все­
ки сноп монохроматична с в е т л и н а попада
върху с ъ о т в е т е н фотодиод о т фотодиод-
н а т а редица (diod-array detector). Фотодиод-
н а т а редица е сърцето н а съвременната
спектрофотометрична оптика и п ре д ст ав ­
лява серия о т 320-350 индивидуални ф о т о -
диода с контролен п р ъ с т е н м о н т и р а н вър­
ху полупроводников чип. Всеки фотодиод е
предназначен за една дължина н а в ъ л н а т а ,
обикновенно за сноп о т 2 п т .
7. Фотомножител. Ф о т о м н о ж и т е л я т гене­
рира многократно п о в т а р я щ а се в т о р и ч н а
емисия н а електрони. В р е з у л т а т н а т о в а
е л е к т р и ч н и я т импулс се умножава (усилва)
хиляди п ъ т и . У м н о ж е н и я т сигнал се измер­
ва о т о т ч и т а щ о у с т р о й с т в о (ридер) и по­
лучава цифрово изражение,
Ь л е к т р о н и к а т а е о т с ъ щ е с т в е н о значе­
ние за с п е к т р о ф о м е т р и я т а . Ф у н к ц и и т е н а
съвременния с п е к т р о ф о т о м е т ъ р се к о н т ­
ролират о т микропроцесор и к о м п ю т ъ р с
оперативни с и с т е м и MS-DOS или WINDOWS.
Е л е к т р о н и к а т а им се с ъ с т о и о т няколко
печатни платки. М н о ж и т е л я т (ргеатр/
ADC) преобразова аналоговия сигнал о т фо-
тодиода в цифров сигнал и го изпраща к ъ м
190
микропроцесор, з а щ и т е н чрез алуминиевг
п л а т к а о т е л е к т р о н н и „шумове", коипк
м о г а т да в л о ш а т к а ч е с т в о т о на о т ч и т а
не. Микропроцесорът събира д а н н и т е on
ф о т о м н о ж и т е л я , изчислява абсорбция и в а
риация, извършва в ъ т р е ш н а диагностика
контролира с т а т у с а н а и н с т р у м е н т а , зах
ранването на лампата, о т в а р я н е т о ш
б л е н д а т а , съобщава д а н н и т е и разпредели
напрежението о т захранващото устройс
т в о към всички п л а т к и . З а х р а н в а щ о т о ус
т р о й с т в о на с п е к т р о ф о т о м е т ъ р а преобра
зува н а п р е ж е н и е т о з а о т д е л н и т е модули i
к о н т р о л и р а т е х н и т е данни. При свръхнап
режение, п р и б о р ъ т се изключва а в т о м а т и ч
но благодарение н а висока з а щ и т а о т чес
т о т н а и н тер ф ер ен ц и я и е л е к т р о с т а т и ч
ни изпразвания. О т д е л н о у с т р о й с т в о зах.
ранва и з т о ч н и к а н а светл и н а, б л е н д а т а i
и н д и к а т о р н и т е л амп и н а и н с т р у м е н т а
Нововъведената diod-array технология пра
ви с ъ в р е м е н н и т е с п е к т р о ф о т о м е т р и по
бързи, по-точни и по-чувствителни, а резул
т а т и т е - с висока възпроизводимост.
При необходимост м о г а т да се д о с т а в я г
д о п ъ л н и т е л н и п р и н а д л е ^ к н о с т и : спе
циални т е р м о с т а т и р а щ и к ю в е т о д ъ р ж а т е
ли снабдени с е л е м е н т и на Peltier, к о и т о поз
в о л я в а т бързо п о с т и г а н е н а ж е л а н а т а т е м
п е р а т у р а , п р о то чн и к ю в е т и , п е р и с т а л т и ч
ни помпи с различен брой канали, а в т о с е м
плер, п р и н т е р и и др. К о м п ю т ъ р със съопт
в е т н и програми (software) н а ф и р м а т а прс
изводител к о н т р о л и р а ф у н к ц и и т е н а всич
ки допълнителни принадлежности, благоде
рение н а вградения сериен или паралеле:
интерфейс.
Един с ъ в р е м е н е н с п е к т р о ф о т о м е т ъ
и м а различни размери, приблизителн
60x20x40 cm, т е г л о 10-18 kg и консумаци.
около 100 w при 220 V и 50 Hz. Toü осигуряв
приблизително с л е д н и т е данни: време з
о т ч и т а н е и п о с т р о я в а н е н а абсорбционн
крива з а целия с п е к т ъ р о т 0.1 до 1.8 секуг
ди (в з а в и с и м о с т о т б ъ р з и н а т а на компк
т ъ р а ) , т о ч н о с т н а дължина н а в ъ л н а т а ±1
2 п т , възпроизводимост н а д ъ л ж и н а т а н
в ъ л н а т а ±0.05 п т , с п е к т р а л н а ширина 1-
п т , и пр.
При y dу л ъ ч е в и т е с п е к т р о ф о т о л г е п
ри, м о н о х р о м а т и ч н и я т лъч се разделя н
два п о т о к а с абсолютно еднакъв и н т е н л
т е т . Е д и н и я т п о т о к о т ч и т а референтнг
m a абсорбция, а д р у г и я т - а б с о р б и и я т а н а
п р о б а т а . И з м е р в а н е т о с т а в а едновремен­
но. Това осигурява н е п р е к ъ с н а т о а в т о м а ­
т и ч н о в ъ т р е ш н о рефериране и създава изк­
лючителна с т а б и л н о с т на о т ч и т а н е т о ,
разбира се с по-висока цена н а а п а р а т а .
КОНТРОЛ НЛД КАЧЕСТВОТО
НЛ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНИЯ
АНАЛИЗ
ф и р м и т е д о с т а в ч и ц и п р е д о с т а в я т подроб­
ни указания з а м о н т и р а н е , проверка и обс­
лужване, к о и т о о с и г у р я т с и г у р н о с т в ра­
б о т а т а на а п а р а т а . С ъ в е с т н и я т потреби­
т е л т р я б в а да познава и грижливо да спаз­
ва о п и с а н и т е в т я х изисквания. Упомена­
т и т е по-долу мерки м о г а т лесно д а се при­
л о ж а т при съмнение в н а й - в а ж н и т е пара­
м е т р и на к а ч е с т в о т о н а с п е к т р о ф о т о м е т -
ричния анализ:
В ъ з п р о и з В о д и м о с т . Мри добре п р и г о т в е ­
ни р а з т в о р и , т я е свързана н а й - ч е с т о със
с ъ с т о я н и е т о на и з п о л з в а н а т а к ю в е т а . 11ре-
ди и з м е р в а н е т о , к ю в е т а т а т р я б в а да се
измие 3-5 п ъ т и с р а з т в о р и т е л я н а п р о б а т а
и да се обърне върху л и с т ч и с т а ф и л т ъ р н а
х а р т и я з а п о п и в а н о т о му. О п т и ч н и т е по­
върхности н а к ю в е т и т е т р я б в а грижливо
да се п а з я т о т докосване с п р ъ с т и и замър­
сявания. П о ч и с т в а н е т о им с т а в а с м е к а
памучна т ъ к а н . Върху веднъж и з м е р е н а т а
празна (blank) не се извършва никакво допъл­
нително п о ч и с т в а н е и к ю в е т а т а следва да
се п о с т а в я винаги в едно и съшо положение.
Най-добре е к ю в е т а т а да се фиксира в под­
ходящо положение, к а т о пълнене и празне­
не се извършва с п и п е т а . Следва да се о т ч и ­
т а т само б и с т р и р а з т в о р и . Лко е необхо­
димо, избистряно може да се п о с т и г н е с цен­
трофугиране или ф и л т р и р а н е . Измерване­
т о на вискозни р а з т в о р и създава проблеми,
к о и т о м о г а т да се о т с т р а н я т с използва­
не на т е р м о с т а т и р а н и к ю в е т и . При о т ч и ­
т а н е в UV и н т е р в а л следва да се и з п о л з в а т
кварцови к ю в е т и . Пад 360 п т може да се
използват к ю в е т и о т к а ч е с т в е н о с т ъ к л о .
П л а с т м а с о в и т е к ю в е т и са з н а ч и т е л н о по­
евтини, но са н е т р а й н и , с т е н и т е им лесно
се н а д р а с к в а т и с т а в а т бързо негодни за
употреба. П р о т о ч н и т е к ю в е т и , к о и т о се
използват при серийни измервания н а малки
обеми, следва да се п р о м и в а т между отдел­
н и т е проби. Гова с т а в а най-добре с ч а с т о т
с л е д в а щ а т а проба.
О т к л о н е н и я о ш л и н е й н о с т т а . Законът
н а Beer-Lambert описва и д е а л н а т а зависи­
м о с т . Отклонения м о г а т да се получат при
измерване н а високи концентрации, липса
на монохроматичност, висока абсорбция на
м а т р и к с а , значително пречупване и разсей­
ване на с в е т л и н а т а о т неподходящ м а т -
рикс, непаралелни с т е н и н а к ю в е т а т а и др.
Добра информация може да даде вида на една
нова калибрационна крива (фиг. 7.6).
Концентрация Концентрация
1 2
Концен т р а ц и я Концентрация
3 4
Ф и г 7.6. Проверка чрез калибрационна крива
1. Нулева абсорбция при концентрация нула - нормално;
2. Значима абсорбция при концентрация нула - замърсена
кювета или матриксоба интерференция;
3. Нулева абсорбция при значима концентрация - загуба на
чувствителност;
4. Загуба на линейност - проблем в о п т и ч н а т а система
и яр.
Т о ч н о с т . Д е т е к т о р ъ т гарантира точ­
н о с т т а на анализите к а т о осигурява линей­
н о с т между реална и о т ч е т е н а абсорбция.
При съмнение, п р о в е р к а т а се извършва с
поредица ф и л т р и ( ф и л т р и т е „ с т а р е я т " !),
или с различни п о з н а т и концентрации на
р а з т в о р и , за к о и т о сме сигурни, че с л е д в а т
закона на Beer-Lambert. За т а з и цел са удоб­
ни разредки о т р а з т в о р на п а р а - н и т р о ф е -
нол за измерване при 405 п т , оксихемогло-
бин - при 415 п т , меден с у л ф а т - при 6о0 п т ,
191
калиев б и х р о м а т или калиев н и т р а т . I ра-
ф и к а т а о т абсорбция спрямо концентрация
следва да е права линия. Л и п с а т а н а линей­
н о с т говори за проблем в с п е к т р о ф о т о м е -
т ъ р а , но и за небрежно извършени разреж­
дания (!), к о е т о компрометира п р о в е р к а т а .
Г о л е м и н а н а а б с о р б ц и я т а . При съмне­
ния в големината н а а б с о р б ц и я т а се налага
калибровка на д ъ л ж и н а т а н а в ъ л н а т а . Не­
зависимо о т м е т о д а н а калибриране се из­
м е р в а т най-малко две дължини н а в ъ л н а т а .
Използва се д и р е к т н о измерване е м и с и я т а
на д е у т е р и е в а т а лампа н а 486 п т и 656 п т
или на живачна лампа, к о я т о е м и т и р а в 313,
365, 405, 436 и 546 п т . И з п о л з в а т се оиде и
стъклени ф и л т р и о т холмиев оксид със сил­
ни абсорбционни линии н а 241, 279, 287, 333,
361, 418, 453, 536 и 636 п т . Ф и л т р и о т диди-
ум абсорбират при 573, 586, 685, 741 и 803 п т .
С течение на в р е м е т о ф и л т р и т е с т а р е я т
и в л о ш а в а т к а ч е с т в а т а си. И з п о л з в а т се и
р а з т в о р и н а в е щ е с т в а с п о з н а т и абсорб­
ционни линии. Калибровката с т я х не е осо­
бено т о ч н а , ако абсорбционните им върхове
са платовидни.
За потвърждение н а монохроматичност-
т а се използва ч и с т р а з т в о р на кофеин, чий­
т о абсорбционен максимум е при 274 п т , а
абсорбцията при 264 и 284 п т е с и м е т р и ч ­
на (фиг. 7.7). При нарушена монохроматич-
н о с т т а з и с и м е т р и ч н о с т изчезва. Тя изчез­
ва и при н е д о с т а т ъ ч н а ч и с т о т а н а р а з т -
274 п т
Ф и г 7.7. Проверка н а д ъ л ж и н а т а н а в ъ л н а т а е р а з т в о р о т кофеин
Загуба на с и м е т р и ч м о с т сочи примеси в р а з т в о р а .
192
бора, с н а р а с т в а н е н а с у м а р н а т а абсорбция
о т т р и т е дължини н а в ъ л н и т е .
Измерване з а г у б а т а н а с в е т л и н а (stray)
може да се извърши с а ц е т о н , к о й т о „изряз­
ва" с в е т л и н а под 320 п т . О т ч е т е н а т а про-
пускливост се умножава по 100 и не т р я б в а
да надхвърля 1%. При измерване с ф и л т р и
при 220, 340 и 530 и 650 п т т я следва да е по-
малка о т 0.05%. В п р о т и в е н случай се про­
в е р я в а т източника на светлина, д ъ л ж и н а т а
н а в ъ л н а т а , ч и с т о т а т а н а о п т и ч н и т е по­
в ъ р х н о с т и и ред други к о м п о н е н т и н а инс­
т р у м е н т а . При подмяна н а и з т о ч н и к а н а
с в е т л и н а т р я б в а грижливо д а се избягва
п и п а н е т о с п р ъ с т и н а кварцовия балон н а
д е у т е р и е в а т а л а м п а или с т ъ к л е н и я балон
на в о л ф р а м о в а т а лампа. М а с т н и т е следи
по з а м ъ р с е н а т а п о в ъ р х н о с т а б с о р б и р а т
светл и н а, н а м а л я в а т и н т е н з и т е т а и жи­
в о т а на л а м п а т а .
З а к л ю ч е н и е . О п и с а н и т е принципи, апара­
т и и к о н т р о л се о т н а с я т не само до самос­
т о я т е л н и т е измерващи а п а р а т и , но и за
п о в е ч е т о клинично-химични а н а л и з а т о р и ,
които интегрират спектрофотометрични
модули с м н о ж е с т в о други с а м о с т о я т е л н и
единици в единна п р о с т р а н с т в е н а и функ­
ционална с т р у к т у р а . Д о б р и я т к о н тр о л вър­
ху с п е к т р о ф о т о м е т р и ч н и я анализ е необ­
ходима п р е д п о с т а в к а за добри п о к а з а т е л и
о т вътрелабораторния качествен контрол
и добра меж д у л аб о р ато р н а оценка.
 НЕФЕЛОМЕТРИЯ И
ТУРБИДИМЕТРИЯ
Н. К о й ч е в а
РАЗСЕЙВАНЕ НА СВЕТЛИНАТА
Светлината взаимодейства с веществото, през
което преминава. Тя се поглъща, разсейва или
преминава безпрепятствено. Ако през разтвор на
молекулно или йонно диспергирано вещество се
пропусне сноп о т успоредни лъчи, една ч а с т о т
т я х се абсорбира, а друга ч а с т преминава през
разтвора. Ако обаче р а з т в о р ъ т представлява ко­
лоидно дисперсна или грубо дисперсна система,
т о ч а с т о т лъчите се поглъщат, а други се пре­
чупват или разсейват под ъгъл спрямо оптична­
т а ос. Енергията на ч а с т о т ф о т о н и т е възбуж­
да във в е щ е с т в о т о хармонични т р е п т е н и я на
заредените частици, най-вече на електроните.
Енергията на ч а с т о т електроните, извършва­
щи принудени т р е п т е н и я , се трансформира о т ­
ново в електромагнитно лъчене (светлина), което
напуска веществото. Така ч а с т и ц и т е с т а в а т
източници на вторични електромагнитни вълни
с ч е с т о т а т а на възбуждащата светлина. Този
вид лъчене се н а р и ч а разсеяна светлина, а
процесът - разсейване на светлината. Разсейва­
н е т о е предимно е л а с т и ч н о - д ъ л ж и н и т е на
вълните ( ч е с т о т и т е ) на възбуждащата и разсе­
я н а т а с в е т л и н а са еднакви, различна е само
посоката на разпространение. Под действието
на електричното поле на с в е т л и н а т а електро­
ните и я д р а т а на ч а с т и ц а т а се д в и ж а т в про­
тивоположни посоки. Това причинява т р е п т е н е
на е л е к т р о н и т е около ч а с т и ц а т а в синхрон с
електричното поле на възбуждащата светлина,
която индуцира в ч а с т и ц а т а трептящ (осцили-
ращ) дипол. Т р е п т я щ и я т дипол с т а в а източник
на електромагнитно лъчене във всички посоки.
. Електромагнитното лъчене на трептящия ди­
пол представлява разсеяна светлина. Големина­
т а на диполния м о м е н т е пропорционална на
силата на електричното поле на п а д а щ а т а свет­
лина.
Разсейване н а с в е т л и н а т а о т м а л к и час­
т и ц и е описано и характеризирано о т
Rayleigh с у р а в н е н и е т о :
I,=I, f 1вл 2 а81п 2 0/Л. 4 r 2 ! (1)
1„ - и н т е н з и т е т на р а з с е я н а т а светлина
I It - и н т е н з и т е т на възбуждащата светлина
а - поляризация на м а л к а т а молекула (т.е., въз­
м о ж н о с т т а на електричното поле да разде­
ли електронните и ядрените компоненти на
частицата)
0 - ъгъл на наблюдение, измерен о т линията на
п а д а щ а т а светлина
А, - дължина на вълната на възбуждащата свет­
лина
г - разстояние на наблюдение.
О т уравнението следва, че:
• и н т е н з и т е т ъ т на р а з с е я н а т а светлина е
функция о т дължината на вълната на въз­
буждащата светлина на ч е т в ъ р т а степен,
следователно при малки дължини на вълната
разсейването ще е по-интензивно, отколкото
при големи;
• и н т е н з и т е т ъ т на разсеяната светлина ще
намалява с квадрата на разстоянието на наб­
людение, т а к а че колекторите или измерва­
щ и т е у с т р о й с т в а т р я б в а да се разположат
близо до източника на светлина;
• д я с н а т а с т р а н а на уравнението има две важ­
ни съставки - п ъ р в а т а е и н т е н з и т е т ъ т на
п а д а щ а т а светлина, в т о р а т а - съчетание о т
фактори и к о н с т а н т и , които характеризи­
р а т дадена система. Следователно за дадена
система и н т е н з и т е т ъ т на разсеяната свет­
лина ще се увеличава право пропорционално на
увеличаването на и н т е н з и т е т а на възбужда­
щ а т а светлина. Интензивни източници на
светлина, каквито са лазерите, ще усилят
разсеяната светлина.
Г о р н о т о уравнение се о т н а с я з а ч а с т и ­
ци, суспендирани в газова среда. С ъ о т в е т ­
н о т о уравнение з а ч а с т и ц и , суспендирани в
т е ч н а среда при в ъ з б у ж д а щ а с в е т л и н а , ко­
я т о не е поляризирана, включва к ъ м уравне­
ние (1) няколко к о м п о н е н т а :
I s =I. ( 4 j t 2 ( d n / d c ) 2 M c ( l + c o s 0 ) / N X4 r 2 ] (2)
dn/dc - фактор за корекция на промяната в ин­
декса на пречупване на разтвора, нас­
т ъ п в а щ с промяна в концентрацията на
ч а с т и ц и т е dn/dc
М - молекулна маса
с - концентрацията на ч а с т и ц и т е
N - число на Avogadro
У р а в н е н и е т о показва з а в и с и м о с т т а меж­
ду к о н ц е н т р а ц и я т а и м о л е к у л н а т а м а с а н а
ч а с т и ц и т е и и н т е н з и т е т а на разсеяната
с в е т л и н а и е приложимо к ъ м с и с т е м и т е з а
uj\iyпотурбщ/ujitcmpuji и илгунонефе-
л о м е п г р и я . Р а з с е я н а т а с в е т л и н а е по-ин­
тензивна, когато възбуждащата светлина
не е поляризирана.
О т у р а в н е н и я т а (1) и (2) следва, че важ-
193
ни фактори, определящи и н т е н з и т е т а н а
р а з с е я н а т а светлина са: интензитет, дъл­
жина на вълната и поляризаиия на възбуж­
д а щ а т а светлина, ъгъл и разстоян ие н а
измерване, индекс на пречупване н а м ъ т н и я
разтвор, концентрация и м о л е к у л н а м а с а
(големина) на частиците. В з а в и с и м о с т о т
големината н а ч а с т и ц а т а спрямо дължина­
т а на в ъ л н а т а н а в ъ з б у ж д а щ а т а с в е т л и н а
са възможни т р и т и п а разсейване:
• Ч а с т и ц и с д и а м е т ъ р , значително по-ма­
лък о т д ъ л ж и н а т а на в ъ л н а т а н а възбуж­
д а щ а т а с в е т л и н а т а (d<X/10), я разсей­
в а т симетрично {разсейване т и п
R a y l e i g h ) . К о л к о т о по-големи с т а в а т
ч а с т и ц и т е , т о л к о в а по-несиметрично е
разсейването.
• Ако д и а м е т ъ р ъ т н а ч а с т и ц а т а е близък
до д ъ л ж и н а т а н а в ъ л н а т а , повече с в е т ­
лина се разсейва напред и по-малко - в дру­
ги посоки { R a y l e i g h - D c b y e - р а з с с й в а п с ) .
• К о г а т о ч а с т и ц а т а има д и а м е т ъ р , значи­
т е л н о по-голям о т д ъ л ж и н а т а н а вълна­
т а (d > Х/10), с в е т л и н а т а се разсейва нап­
ред под малък ъгъл спрямо възбуждаща­
т а светлина (М1е-разсейване).
Различният ъгъл н а разсейване в зависи­
м о с т о т големината н а ч а с т и ц и т е (ъглова
з а в и с и м о с т ) е п р е д с т а в е н а н а фиг. 7.8.
А с и м е т р и я т а н а разсейване и п р о м я н а т а в
и н т е н з и т е т а н а разсейване на с в е т л и н а т а
в зависимост о т размера на ч а с т и ц а т а
позволяват характеризиране и диференци­
ране н а различни класове макромолекули и
к л е т к и с проточен ц и т о м е т ъ р .
Посока на
възбуждащата
светлина
d <X
• Kuyligh-
разсейване
ds X
Kayliyh-Debye-
разсснване
d >X
М1е-разссйванс
Фиг. 7.8. Разсейване н а с в е т л и н а т а в зависи­
м о с т о т големината на ч а с т и ц и т е
194
РАЗСЕЙВАНЕ НА СВЕТАИНАТА
И ПЛАЗМЕНИТЕ БЕЛТЪЦИ
М н о з и н с т в о т о б е л т ъ ч н и молекули и м а т
среден д и а м е т ъ р 5-10 п т и р а з с е й в а т с в е т ­
л и н а т а симетрично, т . е . по т и п а Rayleigh.
Г о р н а т а граница н а д и а м е т ъ р а н а ч а с т и ­
ц и т е , к о и т о д а в а т т о з и т и п разсейване при
X = 400 п т на в ъ з б у ж д а щ а т а светлина, е око­
ло 40 п т . Повечето плазмени б ел тъц и са под
т а з и граница. По-големи ч а с т и ц и (40-400 п т )
к а т о IgM, х и л о м и к р о н и и м а л к и к о м п ­
лекси о т а н т и г е н / а н т и т я л о р а з с е й в а т
с в е т л и н а т а по т и п а Rayleigh-Debye, при
к о й т о м а т е м а т и ч е с к а т а з а в и с и м о с т е по-
сложна. Големи ч а с т и ц и к а т о имунни ком­
плекси, в к л ю ч в а щ и л а т е к с о в и ч а с т и ц и
(>1000 п т ) , е р и т р о ц и т и и б а к т е р и и (7000-
40000 п т ) р а з с е й в а т с в е т л и н а т а по т и п а
Mie.
У с т а н о в е н и т е физически закономернос­
т и са важни з а о п т и м и з и р а н е н а ан ал и ти ч­
н а т а а п а р а т у р а . Те п о к а з в а т пряка зави­
симост между концентрацията на части­
ц и т е и разсеяната светлина п р и фиксиран
ъгъл на наблюдение, при еднаква м о л е к у л н а
м а с а и подходящи размери на частиците.
З а в и с и м о с т т а между и н т е н з и т е т а н а раз­
с е я н а т а светлина и концентрацията с т а ­
ва по-сложна, к о г а т о се приложи з а с и с т е ­
ми, в к о и т о се я в я в а агрегация. При реакци­
я т а между а н т и г е н и а н т и т я л о н а с т ъ п в а
промяна к а к т о в к о н ц е н т р а ц и я т а , т а к а и
в мо л ек у л н ата м а с а и г о л е м и н а т а н а час­
тиците.
СЪЩНОСТ НА НЕФЕЛОМЕТРИЯТА
И ТУРБИДИМЕТРИЯТА
Нефелометрията и т у р б и д и м е т р и я т а са
о п т и ч н и м е т о д и з а измерване степента н а
м ъ т н и н а . С нефелометрия и т у р б и д и м е т -
рия се измерва разсеяна с в е т л и н а о т час­
т и ц и н а колоиднодисперсни или грубодиспер-
сни р а з т в о р и . Р а з с е я н а т а с в е т л и н а е
пропорциона.гна н а броя частици, сус­
пендирани в т е ч н а среда (преципита-
т и и к о л о и д н и с у с п е н с и и ) . Нри н е ф е ­
л о м е т р и я т а се мери разсеяната сбет-
л и н а п о д ъгъл, р а з л и ч е н о т 0° с п р я м о
п о с о к а т а н а В ъ з б у ж д а щ и я лъч, т . е .
с в е т л и н н а е н е р г и я , р а з с е я н а или р е ф -
лектирана n o посока па д е т е к т о р а ,
к о я т о пе с е намира на прекия п ъ т н а
п р е м и н а в а щ а т а с В е т л и н а . При т у р б и -
д и м е т р и я т а с е измерва намалението
на и н т е н з и т е т а н а р а з с е я н а т а с В е т ­
лина п о д ъгъл 0° с п р я м о п о с о к а т а н а
в ъ з б у ж д а щ и я лъч.
Аналогично н а а б с о р б и и о н н а т а с п е к т р о -
ф о т о м е т р и я , м ъ т н и н а т а (t) се х а р а к т е р и ­
зира с у р а в н е н и е т о :
t=(l/b)In(I0/I)
b - дължина на п ъ т я на светлина през разтвора
10- и н т е н з и т е т т на с в е т л и н а т а о т източни­
ка и
I - и н т е н з и т е т ъ т на преминалата светлина
В с ъ в р е м е н н а т а клинично-лабораторна
практика нефелометрията и турбидимет-
р и я т а се и з п о л з в а т н а й - ч е с т о з а изследва­
не на а н т и г е н и или х а п т е н и - специфични
(индивидуални) белтъци, някои лекарствени
средства и някои т у м о р н и маркери. Полу­
ченият в р е з у л т а т на имунологичната
реакция имунен п р е ц и п и т а т се определя
н е ф е л о м е т р и ч н о или т у р б и д и м е т р и ч н о .
Имунонефелометрията и имунотурбиди-
м е т р и я т а с а д и р е к т н и (без маркери) и м у -
нометрични методи. В м и к р о б и о л о г и я т а
т у р б и д и м е т р и ч н о може д а се оцени б а к т е ­
риален р а с т е ж и ч у в с т в и т е л н о с т н а бак­
териални к у л т у р и към а н т и б и о т и ц и . Чрез
измерване н а р а з с е я н а т а с в е т л и н а може да
се определи к о н ц е н т р а ц и я т а н а общ б е л т ъ к
в гръбначно-мозъчна т е ч н о с т , урина и т е ч ­
ни п у н к т а т и след п р е ц и п и т а ц и я с кисели­
на; л и п а з н а т а а к т и в н о с т по и з б и с т р я н е т о
на м а с т н а емулсия под д е й с т в и е н а ензима;
фибриногенът по н а р а с т в а н е н а м ъ т н и н а -
ша в с л е д с т в и е п р е в р ъ щ а н е т о м у във
фибрин. С ъ в р е м е н н и т е хематологични ана­
лизатори д а в а т в ъ з м о ж н о с т з а диференци­
ране на кръвни к л е т к и според р а з с е я н а т а
о т т я х светлина.
НЕфЕЛОМЕТРИЧНА АПАРАТУРА
Н е ф е л о м е т р и я т а измерва сигнала о т раз­
с е й в а н е т о срещу нулев (липсващ) сигнал.
Чувствителността на нефелометрията
зависи о т о т с ъ с т в и е т о н а преминала или
Разсеяна о т фона ( м а т р и ц а н а п р о б а т а ,
реактиви) светлина, т ъ й к а т о д е т е к т о р ъ т
р е г и с т р и р а малка п р о м я н а в о т ч е т е н и я
сигнал срещу т е о р е т и ч н о нулев (черен) фон.
В идеалния случай не се регистрира разсеяна
с в е т л и н а в отсъствието н а частиците,
к о и т о подлежат н а измерване. При
нефелометрия се о т ч и т а слаб сигнал н а че­
рен фон. С и г н а л ъ т се усилва о т фотомно-
ж и т е л , за да се повиши о б х в а т а н а д е т е к ­
ция. При последните поколения нефеломет-
ри с лазер или LED (Light Emitting Diod) т о в а
не е необходимо.
Принципно важни за н е ф е л о м е т р и ч н а т а
а п а р а т у р а са: и н т е н з и т е т и дължина н а
в ъ л н а т а на възбуждащата светлина, ъгъл
на измерване, п р и н ц и п на измерване, разс­
тояние на детектора до реакционната кю-
вета, високо съотношение сигнал/шум, из­
готвяне и съхранение н а калибрационни
криви, разпознаване на излишък на а н т и ­
ген и на неспецифични реакции.
Основни к о м п о н е н т и на н е ф е л о м е т ъ -
ра. Те включват: източник н а светлина,
колиматор, селектор на дължината на въл­
н а т а (филтър), реакционна кювета, систе­
м а за у л а в я н е н а случайна светлина („ка­
пани") и фотодетектор {§\iz. 7.9). При лазе­
рен източник н а с в е т л и н а колиматор и фил­
т ъ р не са необходими. Т ен д ен ц и я та е да се
о т ч и т а при по-малки ъгли, т ъ й к а т о с ъ о т ­
ношението сигнал/шум е по-високо и и н т е н ­
з и т е т ъ т н а р а з с е я н а т а светлина е по-го­
лям, о т к о л к о т о при с т а р и т е о т ч и т а щ и на
90° а п а р а т и („Тиндалова светлина")-
Наред с о п т и ч н а с и с т е м а за нефеломет­
рия, съвременните нефелометри са снабде­
ни с т р а н с п о р т н а с и с т е м а за проби и реак­
т и в и , спринцовки за разреждане на проби­
т е , карусели или с т а т и в и за проби и реак­
т и в и , р о б о т н и ръце за пипетиране и ком­
п ю т ъ р . Всички д ей стви я на различните сис­
т е м и са програмирани и се к о н т р о л и р а т о т
микропроцесор. Извършва се сложна матема­
тическа оценка на зависимостта концент­
рация/измерен сигнал и изготвяне и
съхранение на калибрационни криви, оценка
на хода на и м у н о п р е ц и п и т а ц и о н н а т а
реакция, разпознаванена антигенен излишък
и н е с п е ц и ф и ч н и р е а к ц и и , проверка д а л и
пробата е в зададения концентрационен
обхват на измерване, контрол на невъзпроиз-
водимостта и неточността и др.
195
 процеп
Фиг. 7.9. Принципно у с т р о й с т в о н а нефелометър
Източник п а с в с т л и л а . Такъв може да
бъде кварцова халогенна лампа, ксенонова
лампа, LED или лазер (LASER - съкращение
о т Light Amplification Stimulated Emission of
Radiation). Лазерът дава кохерентни лъчи с
голяма интензивност и е много подходящ
за имунонефелометрия. Н е д о с т а т ъ ц и на
лазерните източници са високата цена,
проблеми със сигурността и ограничен брой
фиксирани дължини на вълните.
Дъ л Жи на п а в ъ л н а т а и ъгъл н а излюр-
ванс. Те са свързани с големината на час­
т и ц и т е в суспензията. Оптимални условия
са: по-малка дължина на вълната при нефе-
лометрия на малки частици (400-670 п т ) и
голяма дължина на вълната при нефеломет-
рия на големи частици (840 п т или 940 п т ) .
При разтвори с относително малки части­
ци разсеяната светлина може да се измерва
под ъгъл 90° или ъгъл 50° - 70°. Малки ъгли
(между 0° и 25°) позволяват измерване на
разсеяна светлина о т частици с различни
размери - както с малък, т а к а и с голям ди­
аметър. Когато д и а м е т ъ р ъ т на имунните
комплекси надвишава 1000 п т , т о при 840
п т светлината се разсейва предимно нап­
ред (Mie-лъчене), към което се примесва и
Rayleigh-лъчене, предизвикано о т по-малки
имунни комплекси.
Принципи н а излгерване. Имунонефело-
м е т р и я т а бива крайноточкова и кинетич­
на. Кинетичната имунонефелометрия има
следните разновидности: кинетична иму­
нонефелометрия п р и фиксирано време,
VLinlntegral и степенна нефелометрия. Не-
фелометрията при фиксирано време включ­
ва две отчитания на всяка проба: първо -
196
кювета с проба
секунди след смесване на антигена и а н т и ­
т я л о т о , второ - минути след т о в а (време­
т о до първото и в т о р о т о о т ч и т а н е е раз­
лично при различните апарати). Разликата
в сигнала между първото и второто отчи­
тане е пропорционална на концентрация­
та на антигена. VLinlntegral е нов м а т е ­
матически алгоритъм за оценка на имуно-
преципитационни реакции. Ширината и
м я с т о т о на процепа, през който преминава
възбуждащата светлина се определят ди­
намично о т реакционната кинетика, за да
се намери интервала на максималната и
промяна. Промяната в абсорбцията се пре­
с м я т а за интервал о т време. На б а з а т а на
кинетична крива се изчислява колко точки
на измерване трябва да включва калибраци-
о н н а т а крива. С използването на VLinlntegra
се постига по-висока чувствителност, раз
ширен концентрационен обхват на измер
ване, надеждно откриване на антигенеь
излишък и скъсено време за изследване.
К и н е т и ч н а т а с т е п е н н а нефелометрия
(фиг. 7.10) позволява мониториране на иму-
''(Х-
п
о. ~
иь
Повишаваща с е концентрация на антигена при постоянна
концентрация на антитялото
Фиг. 7.10. Принцип н а измерване при сшепенш
нефелометрия
нопреципитационнагла реакция о т с а м о т о
и начало. М о н и т о р и р а се с т е п е н т а на про­
м я н а т а н а сигнала, получен 6 р е з у л т а т н а
разсейването н а с в е т л и н а т а в много малки
интервали о т време - о т порядъка н а ms.
Най-високата степен н а промяна в сигна­
л а е пропорционална на концентрацията н а
антигена. С т е п е н н а т а н е ф е л о м е т р и я се
о т л и ч а в а с много висока с п е ц и ф и ч н о с т и
бързина - в р е м е т о з а определяне н а повече­
т о а н т и г е н и или х а п т е н и е 90 s. М н о з и н с т ­
в о т о съвременни а п а р а т и и з п о л з в а т прин­
ципа н а к и н е т и ч н а имунонефелометрия или
т у р б и д и м е т р и я при фиксирано време.
Влияние п а л т т р и ц а т а и исспсци-
фични р е а к ц и и . При ниски к о н ц е н т р а ц и и
на а н т и г е н а р а з р е ж д а н и я т а н а п р о б а т а са
по-малки и и н т е р ф е р е н ц и я т а о т с т р а н а н а
м а т р и ц а т а се увеличава, особено при л и п е -
мия. Е ф е к т и в е н м е т о д з а намаляване ин­
т е р ф е р е н ц и я т а н а фона е с т е п е н н а т а не­
фелометрия. Н а м а л е н и е т о н а б е л т ъ ч н а т а
концентрация намалява абсорбцията о т
с т р а н а н а фона, поради к о е т о се и з п о л з в а т
а н т и т е л а с голям а ф и н и т е т , позволяващ
големи разреждания. Прах, бактерии и дру­
ги големи частици също м о г а т да предиз­
в и к а т значима интерференция. Тя се к о н т ­
ролира чрез използване н а г о т о в и р е а к т и в и
е линеен код, к о й т о се разпознава о т апара­
т а и подаване серума д и р е к т н о в е п р у в е т ­
ки - з а т в о р е н а с и с т е м а з а вземане на кръв.
Всички имунопреципитационни т е х н и к и в
т е ч н а среда се и з в ъ р ш в а т в п р и с ъ с т в и е н а
полиетиленгликол {PEG), к о й т о се съдържа
в реакционния буфер. PEG усилва
о б р а з у в а н е т о н а а г р е г а т и о т комплекси
а н т и г е н / а н т и т я л о и скъсява в р е м е т о за
о т ч и т а н е , но намалява р а з т в о р и м о с т т а н а
високомолекулни с ъ с т а в к и (липопротеини,
RI1, циркулиращи имунни комплекси, монок-
лонални имуноглобулини, а в т о а н т и т е л а ,
фибриноген и др). Те п р е ц и п и т и р а т в при­
съствие на PEG, особено при замразявани
серуми. И н т е р ф е р е н ц и я т а зависи о т край­
ното разреждане н а пробата, от p H u о т
концентрацията н а PEG. И н т е н з и в н и т е
източници на с в е т л и н а п о з в о л я в а т много
големи разреждания.
ТУРБИДИМЕТРИЯ - ИЗМЕРВАНЕ
При т у р б и д и м е т р и я т а се измерва намале­
н и е т о н а силния сигнал н а п р е м и н а л а т а
с в е т л и н а (малки разлики между големи чис-
ла). Ч у в с т в и т е л н о с т т а на т у р б и д и м е т р и ­
я т а зависи о т ф о т о м е т р и ч н а т а т о ч н о с т
и ч у в с т в и т е л н о с т на а п а р а т а . Съвремен­
н и т е ф о т о м е т р и се о т л и ч а в а т с висока
разделителна способност, к о я т о позволява
да се определят малки промени в силен сиг­
нал. Принципно важно за ту р б и д и метр и ч-
н и т е измервания е с ъ о т н о ш е н и е т о си гна л /
шум. За т у р б и д и м е т р и я са подходящи фо­
т о м е т р и ч н и системи с електрооптичен
шум в о б х в а т а о т ±0,0002 абсорбционни еди­
ници или по-малко. А п а р а т у р а т а за ту р б и ­
д и м е т р и я варира о т п р о с т мануален спек-
т р о ф о т о м е т ъ р до сложни дискретни ана­
лизатори. Последните д а в а т възможност
к а к т о за изследване н а ензими и субстра­
т и , т а к а и за надеждно определяне на ши­
рок с п е к т ъ р о т белтъци. Апарати, предназ­
начени само за т у р б и д и м е т р и ч е н анализ на
специфични б е л т ъ ц и се п р о и з в е ж д а т о т
различни фирми. Според у с т а н о в е н и т е фи­
зични закономерности, и н т е н з и т е т ъ т на
разсейване н а р а с т в а с намаляване на дъл­
ж и н а т а н а в ъ л н а т а . Под 300 п т обаче се
наблюдава силна абсорбция на б е л т ъ ц и т е ,
между 400 и 425 п т - абсорбират порфири-
н и т е . По т е з и причини се и з б и р а т дължини
на в ъ л н а т а между 320-380 п т или 500-650 п т .
Клинично-химичните анализатори предла­
г а т голямо разнообразие на дължини на въл­
н и т е , к а к т о и възможности за бихроматич-
но о т ч и т а н е (например: 340 п т - дължина
на в ъ л н а т а , подходяща за малки комплекси
и 700 п т - за корекция на абсорбцията о т
по-големи ч а с т и ц и и ц в е т н и вещества).
Времето за еднократно о т ч и т а н е на
а б с о р б ц и я т а при крайноточковите имуно-
т у р б и д и м е т р и ч н и м е т о д и се съобразява с
в ъ з м о ж н о с т т а з а получаване на силен сиг­
нал, с ъ о т в е т н о с абсорбционната крива във
в р е м е т о за дадения б е л т ъ к .
При к и н е т и ч н а т у р б и д и м е т р и я с фикси­
рано време се п р а в я т две о т ч и т а н и я н а
абсорбцията: п ъ р в о и н к у б а ц и я на про­
б а т а с буфера, второ - след прибавяне на
а н т и т я л о т о . К о н ц е н т р а ц и я т а на а н т и г е
на се изчислява о т р а з л и к а т а в абсорбции-
т е по калибрационна крива.
197
 И м у н о т у р б и д и м е т р и я т а с т а н а надеж­
ден м е т о д за определяне н а специфични бел
т ъ ц и едва след създаване н а по-нови поколе­
ния а в т о м а т и з и р а н и клинично-химични
анализатори. Нелинейната зависимост
между концентрация и сигнал при имунохи-
м и ч н и т е реакции, н е о б х о д и м о с т т а о т
с т р о г о с т а н д а р т н и условия н а р а б о т а и
разпознаване на излишък н а а н т и г е н изиск­
в а т микропроцесори и софтуеър с възмож­
н о с т и за сложна о б р а б о т к а на данни и ана­
лиз на сложни криви.
АНТИГЕНЕН ИЗЛИШЪК -
РАЗПОЗНАВАНЕ И ПРОВЕРКА
Р е а к ц и я т а между а н т и г е н и а н т и т я л о за­
почва в р а м к и т е н а милисекунди и продъл­
жава часове. К о л и ч е с т в о т о п р е ц и п и т а т ,
к о е т о се образува о т различно количество
а н т и г е н при п о с т о я н н а к о н ц е н т р а ц и я н а
антитяло, следва параболична к р и в а
( к р и в а н а H e i d e l b e r q - K e n d a l l ) ( ^ и г . 7.11).
Тя показва з а в и с и м о с т т а между к о н ц е н т ­
р а ц и я т а на а н т и г е н а и измерения сигнал
при п о с т о я н н а к о н ц е н т р а ц и я н а а н т и т я ­
лото. Въпреки че о б щ а т а к о н ц е н т р а ц и я н а
а н т и т я л о т о е п о с т о я н н а , концентрация­
т а на свободното (несвързано в комплекси
а н т и т я л о ) и к о н ц е н т р а ц и я т а н а свободния
а н т и г е н се п р о м е н я т в хода н а р е а к ц и я т а
за всяко конкретно съотношение а н т и г е н /
Концет рацпн на а т т ена
Фиг. 7.11. Крива на Heidelberg-Kendall, характе­
ризираща имуно-преципитационната реакция
при постоянна концентрация на а н т и т я л о т о и
нарастваща концентрация на антигена: А - зона
на излишък на антитяло, Б - зона на еквивалент­
ност, В - зона на излишък на антиген. Разсеяна­
т а о т имунните комплекси светлина се измерва
в зоната на излишък на антитяло (зона А).
198
а н т и т я л о . На к р и в а т а м о г а т да се разли­
ч а т 3 области: излишък на а н т и т я л о (А),
е к в и в а л е н т н о с т (Б) и излишък н а а н т и г е н
(В).
A. И з л и ш ъ к л а а и т и т л л о . Свързващите
м е с т а н а а н т и г е н а се н а с и щ а т веднага и се
о б р а з у в а т малки р а з т в о р и м и комплекси о т
а н т и г е н / а н т и т я л о . В р а з т в о р а се намира
с в о б о д н о т о а н т и т я л о , но не се н а м и р а
свободен а н т и г е н . В т а з и о б л а с т н а преци-
п и т а ц и о н н а т а крива к о н ц е н т р а ц и я т а н а
а н т и г е н а е пропорционална н а измерения
сигнал.
Б. О б л а с т н а е к в и в а л е н т н о с т . С изчер­
пване н а а н т и т я л о т о р а з м е р ъ т н а имун­
н и т е комплекси се увеличава до достигане­
т о на еквивалентност. А н т и г е н ъ т и а н т и ­
т я л о т о са в оптимално съотношение за
образуване н а комплекси, въпреки че не се
н а м и р а т в съотношение н а т о ч н а моларна
е к в и в а л е н т н о с т (2-3 молекули а н т и т я л о за
една молекула антиген). О б р а з у в а т се голе­
ми н е р а з т в о р и м и комплекси {максимална
преципитаиия).
B. О б л а с т н а а н т и г е н е н и з л и ш ъ к . Свър­
з в а щ и т е м е с т а н а а н т и т я л о т о са н а с и т е ­
ни с а н т и г е н . Р а з т в о р и м о с т т а н а имунни­
т е комплекси н а р а с т в а , и з м е р в а н и я т сиг­
нал намалява.
При оценка н а п р е ц и п и т а ц и о н н а т а кри­
ва се вижда, че зад един измерен сигнал може
да се к р и я т две концентрации н а а н т и г е ­
на: п ъ р в а т а т о ч к а се намира на възходя­
щия клон в областта на излишък на анти­
тяло (ниска кониентрация на антигена),
докато в т о р а т а т о ч к а се намира в низ­
ходящия клон на кривата в областта на
антигенен излишък (висока концентраиия
на антигена). Този феномен може да се наб­
людава при всички белтъци, ч и я т о концен­
т р а ц и я при ч о в е ш к а т а п ато л о г и я варира в
широк о б х в а т . С в ъ р з а н и я т с т о в а проблем
е, че при един и същи сигнал {разсейване на
светлината, абсорбция) м о г а т да се полу­
ч а т две различни концентрации. Създадени
са к о м п ю т ъ р н и а л г о р и т м и за а в т о м а т и ч ­
но о т б е л я з в а н е н а а н т и г е н излишък чрез
проследяване н а к и н е т и к а т а на р е а к ц и я т а .
Даден а п а р а т е надежден, ако дава възмож­
н о с т за о т к р и в а н е н а а н т и г е н е н излишък.
С проверката за антигенен излишък се изк­
лючва получаването на погрешно ниски ре­
зултати за проби с много високи кониент-
i рации на антигена, н а п р и м е р з а монокло-
» нални илгуноглобулини. Съвременните иму-
; нонефелометрични с и с т е м и предлагат два
начина на проверка за а н т и г е н е н излишък:
• чрез предварителна реакция (по кинети-
к а т а на р е а к ц и я т а в предварителна ре­
акция с а н т и г е н а о т п р о б а т а ) ;
• д и р е к т н а проверка чрез добавяне на ан­
т и г е н в определена концентрация (разре­
ден калибрационен м а т е р и а л ) и проследя­
ване с т е п е н т а на промяна в сигнала при
с т е п е н н а т а нефелометрия.
М е т о д ъ т с добавка на а н т и г е н се изпол­
зва също т а к а при и м у н о т у р б и д и м е т р и ч -
ни определяния на специфични белтъци (дис­
к р е т е н анализатор Cobas Mira Plus, фирма
HofTmann La Roche и gp.).
КАЛИБРАЦИОННИ КРИВИ
ПРИ ИМУНОНЕФЕЛОМЕТРИЯ
И ИМУНОТУРБИДИМЕТРИЯ
З а в и с и м о с т т а между р а з с е я н а т а светлина
и к о н ц е н т р а ц и я т а на а н т и г е н а не е линей­
на. Калибрационните криви за имунонефе-
лометрични и имуно т у р б и д и м ет р и ч н и оп­
ределяния н я м а т праволинеен ход и се пос­
т р о я в а т след м а т е м а т и ч е с к а трансформа­
ция н а в е л и ч и н и т е н а а б с ц и с а т а и
о р д и н а т а т а . Ч е с т о използвана е функция­
т а logit-log. Калибрационната крива на фиг.
7.12 показва с ъ о т н о ш е н и е т о между и н т е н ­
з и т е т а на р а з с е я н а т а св ет л и н а и концен­
т р а ц и я т а . Прилага се формулата:
1п(у-уо/у п 1 а Х -у)=а1п(С) + b
у - изм е р ения т сигнал
Уо и Утах " с ъ о т в е т н о най-ниският и най-ви­
с о к и я т измерен сигнал
а - г р а д и е н т на н а р а с т в а щ и я сигнал
I С - концентрация на изследваното в е щ е с т ­
во (на а б с ц и с а т а )
b - о т с е ч е н а т а о т кривата ордината.
Избрано е двойно логаритмично п р е д с т а ­
вяне. К а л и б р а ц и о н н и т е криви в к л ю ч в а т
ш е с т или повече т о ч к и (многоточкова ка-
либрация). При някои а п а р а т и се прави ед-
ноточкова калибрация за верификация на ка­
либрационната крива. Последната се опре­
деля предварително о т производителя на
а п а р а т а и р е а к т и в и т е на основата на мно­
г о к р а т н и измервания на всяка т о ч к а о т
кривата. К о н ц е н т р а ц и о н н и я т о б х в а т на
кривата определя о б х в а т а на измерване за
дадения а н т и г е н или х а п т е н и зависи о т ки-
н е т и к а т а на с ъ о т в е т н а т а имунопреципи-
т а ц и о н н а реакция.
Фиг. 7.12. Калибрационна крива на имунонефе-
лометрично определяне на индивидуални белтъ­
ци н а б а з а т а н а функция logit-log с а п а р а т
Behring Nephelometer II (Dade Behring). Посочен
е концентрационния о б х в а т н а измерване на ан­
т и г е н а съгласно калибрационата крива с него­
в и т е горна и долна граници.
Кратки д а н н и з а някои съвременни
UAiyнонефелометрични с и с т е м и
BN II (Dade Behring) измерва р а з с е я н а т а
светлина при 840 п т под променящ се ъгъл -
между 13° и 24°- с д е т е к т о р хибриден диод.
О п т и м а л н и я т ъгъл на измерване след фил­
т р и р а н е на първичния лъч ( с в е т л и н а т а ,
к о я т о не се разсейва о т имунните комплек­
си) се определя о т дължината на вълната
на излъчваната о т LED светлина и о т голе­
м и н а т а на ч а с т и ц и т е (на комплексите
а н т и г е н / а н т и т я л о ) по време на измерване­
т о . Д е т е к т о р ъ т превръща р а з с е я н а т а
светлина в електрически сигнал, к о й т о е
пропорционален на к о н ц е н т р а ц и я т а на
и м у н н и т е комплекси, с ъ о т в е т н о на белтъ­
ка в п р о б а т а . Сигналът се дигитализира,
сравнява се с калибрационната крива и се
превръща в концентрация на изследвания
белтък. Поради и н т е н з и в н и я т сигнал не е
необходим ф о т о м н о ж и т е л . Сигнал, к о й т о
д о с т и г а прага, определен за предварителна­
т а реакция, води до а в т о м а т и ч н о повта­
ряне на п р о б а т а с по-голямо разреждане.
Излишъкът на а н т и г е н се оценява по кине-
199
т и к а т а н а предварителна реакция с проба­
т а . Прави се проверка з а неспецифични ре­
а к ц и и с един или д в а р е а к т и в а .
IMMAGE ( В е с к т а п , м о д е л 1998) в к л ю ч в а д в е
технологии: с т е п е н н а н е ф е л о м е т р и я п р и
670 п т под ъ г ъ л 90° з а м а л к и к о м п л е к с и ( п р е ­
ки реакции) и с р е д н и к о м п л е к с и ( а н т и т е л а ,
прикрепени к ъ м м а л к и ч а с т и ц и ) и NIPIA
(Near I n f r a r e d P a r t i c l e I m m u n o a s s a y ) - m y p -
бидиметрия при дължина н а в ъ л н а т а 9 4 0 п т
з а големи к о м п л е к с и ( а н т и т е л а , с в ъ р з а н и с
л а т е к с о в и ч а с т и ц и ) . Всеки ц и к ъ л с в р е м е т ­
р а е н е 5 s включва 200 о т ч и т а н и я . П о з в о л я в а
а в т о м а т и ч н а оценка н а а н т и г е н е н излишък
чрез добавка н а а н т и г е н , к а к т о и д и н а м и ч н о
проследяване н а с л я п а т а п р о б а з а н е с п е ц и ­
фични р е а к ц и и . К а л и б р а ц и я т а е е д н о т о ч -
кова.
И д в е т е описани имунонефелометрични
с и с т е м и п о з в о л я в а т р а з ч и т а н е н а баркодо-
ве върху е п р у в е т к и о т т и п а з а т в о р е н и сис-
КНИГОПИС
Илков Л. Л б с о р б п и о н е н спсктралем анализ. В: К а р а к а ш о в Л ,
П а н д о в X (ред). К л и н и ч н а л а б о р а т о р и я . С . , М е д и ф и з к ,
1970, 4 5 - 5 0 .
Caraway WT. Photometry. In: T i e t z N W ( ed ) . Clinical C h e m i s ­
try. Philadelphia-Ltindon-Toronto etc. W В Saunders C o , 1 9 8 6 ,
55-77.
H P Diod-Array S p e c t r o p h o t o m e t e r H a n d b o o k . H e w l e t t Packard,
1990.
P e s c e AJ, Frings JG. Spectral Tech n ics. In: Kaplan L and P e s c e
A . (eds). Clinical Chemistry. St L o u i s - Baltimore - B o s t o n
etc. M o s b y , 1 9 9 6 , 8 3 - 1 0 6 .
200
т е м и и контрол на невъзпроизбодимостта
и неточността.
Турбидиметрията и нефелометрията са
сравними по о т н о ш е н и е н а ч у в с т в и т е л н о с т
в много о т случаите, но ч у в с т в и т е л н о с т ­
т а н а н е ф е л о м е т р и я т а е м а л к о по-висока.
Г р а н и ц а т а н а о т к р и в а е м о с т п р и нефело-
м е т р и я н а с е р у м н и б е л т ъ ц и е ~ 1-10 mg/1. З а
белтъци в у р и н а т а и гръбначно-мозъчната
т е ч н о с т т я е по-ниска поради т я х н о т о по-
н и с к о б е л т ъ ч н о и л и п и д н о с ъ д ъ р ж а н и е (по-
ниско с ъ о т н о ш е н и е сигнал к ъ м шум).
Ч у в с т в и т е л н о с т т а н а м е т о д и т е се
повишава чрез л а т е к с о в о усилване ( а н т и т я ­
ло, с в ъ р з а н о с л а т е к с о в и ч а с т и ц и ) . Нефело-
м е т р и ч н и т е м е т о д и з а специфични б е л т ъ ­
ци с а р е ф е р е н т н и по о т н о ш е н и е н а т у р б и -
д и м е т р и ч н и т е . В ъ з п р о и з в о д и м о с т т а в се­
р и я (CV) п р и н е ф е л о м е т р и я т а и т у р б и д и -
м е т р и я т а е под 5%. П о д а н н и н а ф и р м и т е -
производителки, о б ш и т е коефициенти н а
в а р и а ц и я з а п о в е ч е т о п о к а з а т е л и с а под 5%.
"k "k "k
Т о д о р о в В. М е д и ц и н с к а ф и з и к а С о ф и я . 1 9 9 5 , 1 8 0 - 1 8 6 .
S c h o e f f L Е. N e p h e l o m e t r y and turbidimetry. In: S c h o e f f L E and
W i l l i a m s R ( e d s ) . Laboratory instruments. S t L o u i s , 1 9 9 3 ,
221-238.
T i f f a n y T O . Fluorometry, N e p h e l o m e t r y , Turbidimetry. In: Burtis
C A , A s h w o o d EK ( e d s ) . T i e t z t e x t b o o c k o f clinical chemistry
(2'Kl e d ) . Philadelphia, S o u n d e r s C o m p a n y , 1994, 183-308.
Kricka L I.Principles o f i m m u n o c h e m i c a l T e c h n i q u e s . In: Burtis
C A , A s h w o o d E R ( e d s ) . T i e t z t e x t b o o c k o f clinical c h e m i s t r y
(2 n d e d ) . Philadelphia, S o u n d e r s C o m p a n y . 1 9 9 4 , 1 8 3 - 3 0 8 .
Burri N . In: B e c k m a n D i a g n o s t i c s , 1 9 9 7 .
B e h r i n g N e p h e l o m e t e r II. Instruction M a n u a l . D a d e Behring.
 Аналитична атомна
спектроскопия
К. Ц а ч е в
В о б л а с т т а н а а т о м н а т а сп е кт роскоп и я
са р а з р а б о т е н и т р и а н а л и т и ч н и м е т о д а :
а т о м н а е м и с и я , а т о м н а абсорбция и
а т о м н а флуоресценция.
П р и н ц и п и т е н а т е з и м е т о д и са били из­
в е с т н и преди повече о т 100 години. За пър­
ви п ъ т я в л е н и е т о а т о м н а абсорбция е опи­
сано о т W o l l a s t o n ü 1Н02 г. Toü у с т а н о в и л
наличието н а т ъ м н и линии в слънчевия спек­
т ъ р получили по-късно н а и м е н о в а н и е т о
Ф р а у н х о ф с р о в и л и н и и . П р е з 1НвО г .
K i r c h o f f и B u r t s e n д о к а з в а т , че а т о м н и ­
т е с п е к т р и , наблюдавани при емисия или
абсорбция, м о г а т д а се и з п о л з в а т з а разра­
б о т в а н е н а нов, високочувствителен анали­
тичен метод.
Най-голямо р а з в и т и е и р а з п р о с т р а н е н и е
к а т о аналитичен м е т о д получава а т о м н а ­
т а е м и с и я . В е р о я т н о е м и с и я т а е била
предпочитана, т ъ й к а т о получаваните при
нея с п е к т р и с а по-осезаеми и по-лесно се
п о д д а в а т на измерване. С ъ з д а д е н а т а за це­
л и т е н а емисионния анализ а п а р а т у р а е с
различна с л о ж н о с т - о т п р о с т и т е ф и л т р о -
ви пламъкови ф о т о м е т р и до е м и с и о н н и т е
с п е к т р о м е т р и с инд укт и вн о свързана плаз­
ма (ICP), позволяващи едновременно опреде­
ляне в една проба на 20-30 е л е м е н т а за вре­
ме 20-30 секунди.
М е т о д ъ т н а а т о м н а т а абсорбция, ос­
вен две специални приложения - индентифи-
циране на някои е л е м е н т и в а т м о с ф е р а т а
на з в е з д и т е и о т к р и в а н е н а живачни пари в
лабораторни помещения, п р а к т и ч е с к и не
намира а н а л и т и ч н о приложение до 1955 г.,
к о г а т о Wal.sh предлага принципа на а т о м ­
н а т а абсорбция да се използва з а количест­
вено определяне на е л е м е н т и в лаб ора т ор­
н а т а п р а к т и к а . След няколко години на все­
обща недооценка н а с т ъ п в а т г о д и н и т е н а
с т р е м и т е л н о р а з в и т и е н а новия м е т о д .
У с ъ в ъ р ш е н с т в а н е т о на а п а р а т у р а т а , съз­
д а в а н е т о на по-надеждни източници на ре-
зонансно излъчване, н а по-горещи и по-доб-
ре контролирани пламъци даде възможност
с т о з и аналитичен м е т о д да се определят
п о ч т и всички е л е м е н т и н а периодичната
система.
И д е я т а за е л е к т р о т е р м и ч н а а т о м н о аб­
сорбционна с п е к т р о ф о т о м е т р и я с графит­
на пещ (ЕТААС) е предложена за първи п ъ т
о т Б о р и с Л ь в о в п р е з 1959 г. Тя слага нача­
л о т о н а нов революционен е т а п в развити­
е т о на а т о м н о абсорбционния анализ. Ос­
н о в н о т о предимство на ЕТААС с г р а ф и т н а
пещ в сравнение с п л а м ъ ч н а т а ААС е огром­
н а т а ü ч у в с т в и т е л н о с т (100 до 1000 п ъ т и
по-голяма о т т а з и на п л а м ъ ч н а т а ААС),
к а к т о и в ъ з м о ж н о с т т а за използване на ул-
трамикроколичества о т м а т е р и а л а за изс­
ледване (5-10 о т предварително разреден
кръвен серум). Съвременното развитие на
ЕТААС прави възможен абсолютния м е т о д
н а анализ т . е . изчисление на концентраци­
я т а на изследвания е л е м е н т о т абсорбци­
онния сигнал и фундаментални физични кон­
станти.
А т о м н о ф л у о р е с ц е н т н и я т анализ
предложен о т W i n c f o r d n e r и Vickersn^e^
19(>4 г. не намира широко практическо при­
ложение поради неизчерпания огромен по­
т е н ц и а л на а т о м н а т а емисия и абсорбция
и ограниченото предлагане на пазара на апа­
р а т у р а за т о з и анализ.
П о н а с т о я щ е м в клиничната лаборато­
рия а т о м н а т а емисия се използва за опре­
деляне на К, Na и Li, а а т о м н а т а абсорбция
в различните и в а р и а н т и (пламъчна, елек­
т р о т е р м и ч н а с г р а ф и т н а пещ или студени
пари) за определяне на всички останали еле­
м е н т и имащи физиологично или клинично
значение.
201
ОСНОВНИ НРИНЦМНМ
НА АНАЛИТИЧНАТА
АТОМНА СПЕКТРОСКОПИЯ
За разбиране с ъ щ н о с т т а и бзаимобръзката
между а т о л т а т а е м и с и я , а т о м н а т а
абсорбция и а т о л т а т а флуоресцен­
ция е необходимо да се познава с т р о е ж а на
а т о м а и а т о м н и т е процеси, на к о и т о се
основава всеки един о т т е з и м е т о д и .
Атомът, както е известно, се състои о т яд­
ро заобиколено о т електрони. Всеки елемент има
точно определен, специфичен за него брой елект­
рони, които образуват електронната обвивка на
ядрото, чийто строеж е строго специфичен за
съответния елемент. Разположението на елек­
троните в електронната обвивка е строго опре­
делено. Най-стабилн а е т а з и е л е к т р о н н а
конфигурация на а т о м а , при к о я т о т о й
п р и т е ж а в а най-ниска енергия. Това състоя­
ние е известно като „основно съ ст о я н и е" на
атома и е нормалното състояние на определен
атом. Ако на атома се придаде енергия отвън,
т о при нейното абсорбиране даден по-външен
електрон ще се придвижи в по-малко стабилно със­
тояние или „възбудено състояние". Тъй като
това състояние е нестабилно, т о а т о м ъ т вед­
нага спонтанно се връща към основното си със­
тояние. Съответно даденият електрон ще се вър­
не в своето първоначално стабилно орбитално по­
ложение и ще се излъчи светлинна енергия (фо­
т о н ) еквивалентна на първоначално абсорбира­
ното количество енергия (фиг. 8.1). Първият е т а п
на процеса - възбуждането на атома, се предиз­
виква чрез съобщаване на енергия. Процесът на
затихване във втория етап, който е свързан с
излъчване на светлина настъпва спонтанно, т . е .
о т само себе си.
ВЪЗБУЖДАНЕ
(1) Енергия +
Основно Възбудено
състояние състояние
на а т о м а
на а т о м а
ЗАТИХВАНЕ
X т о д а използвани в а т о м н а т а спектроско­ -0
Възбудено
състояние на
Основно
състояние
атома на а т о м а
Физ. 8.1. Възбуждане на а т о м и т е и спонтан­
ното им връщане в основно състояние
202
Е н е р г и я т а АЕ на излъчения или абсорби­
ран ф о т о н е х а р а к т е р н а за дадения еле­
м е н т и м о ж е да се изчисли о т с л е д н о т о
уравнение:
ЛЕ = Ei - Е 2 = hy
Е, - енергия на електрона във възбудено
състояние
Е2 - енергия на електрона в основно състояние
h - константа на Planck
у - ч е с т о т а на светлината
Дължината на вълната на излъчената
светлина зависи пряко о т извършения елек­
т р о н е н преход, т . е . о т п р о м я н а т а в
енергията на а т о м а :
he
ЛЕ
с - скорост на светлината
В с е к и е л е м е н т ильа с т р о г о опреде­
л е н , с п е ц и ф и ч е н з а н е г о строеЖ н а
а т о м а , о т к о е т о с л е д в а , че д ъ л б и н а ­ -j
т а н а в ъ л н а т а н а и з л ъ ч е н а т а свет­ -1
л и н а е специфично свойство з а всеки и
отделен елемент.
К о г а т о на група а т о м и се придаде енер­
гия по т е р м и ч е н или електричен п ъ т , как­
т о е при е м и с и о н н а т а спектроскопия, т а ­
зи е н е р г и я с е р а з п р е д е л я м е ж д у всички
а т о м и в р е з у л т а т на в з а и м н о т о им сблъс­
кване. К о л и ч е с т в о т о енергия, к о е т о с е
предава о т а т о м на а т о м в м о м е н т а н а . в
с б л ъ с к в а н е т о варира в широки граници. В а
р е з у л т а т на т о в а о т д е л н и т е а т о м и с е 9:
о к а з в а т в различно с ъ с т о я н и е на възбуж­ -1
дане. П о с л е д в а щ о т о излъчване на енергия R
(под ф о р м а т а на с в е т л и н а ) с т а в а не с а м о t 0 ]
о т в и с о к о л е ж а щ и т е , но и о т всяко едно O J
е н е р г е т и ч н о ниво различаващо се о т ос­ ; -с
н о в н о т о . Поради т о в а е м и с и о н н и я т спек­
т ъ р на д а д е н е л е м е н т м о ж е да бъде дос­
т а сложен.
П р о ц е с ъ т на възбуждане на а т о м а и пос­ -з
ледващо възвръщане в основното състояние 91
лежи в о с н о в а т а и на т р и т е аналитични ме­ - 9
пия. С аналитична цел се измерва или абсор­
б и р а н а т а п р и В ъ з б у ж д а н е т о е н е р г и я RJ
или е н е р г и я т а и з л ъ ч е н а п р и п р о ц е с а н а ßl
з а т и х в а н е (Връщане В о с н о В н о т о със­ -О
тояние).
При а т о м н а т а е м и с и я на п р о б а т а се 93
съобщава голямо количество енергия ( т е р ­
мична) с оглед получаването н а а т о м и във
възбудено състояние, способни да и з л ъ ч в а т
светлина. К а т о енергетичен източник може
да се използва електрическа дъга, пламък,
напоследък плазма. Е м и с и о н н и я т с п е к т ъ р
на даден елемент, подложен н а въздействие­
т о на подобен енергетичен източник се
състои о т набор позволени дължини н а
вълната, обикновено наричани емисионни
линии поради д и с к р е т н и я х а р а к т е р н а
излъчените дължини. Този с л ш с и о п е н
с п е к т ъ р люЯсс д а с е и з п о л з в а к а т о спе­
цифична х а р а к т е р и с т и к а з а качест­
вено и н д е п т и ф и ц и р а н е н а с л е л ь с н т а .
А т о м н а т а емисия с използване на електри­
ческа дъга е широко прилагана за качествен
анализ.
Емисионните м е т о д и се и з п о л з в а т и з а
количественото определяне на даден еле­
мент в п р о б а т а . П р и к о л и ч е с т в е н и я
анализ се измерва интензитета н а
излъчената светлина с дължина н а
вълната отговаряща н а специфична­
т а д ъ л Ж и н а з а д а д е н и я е л е м е н т . Ин­
т е н з и т е т ъ т н а с в е т л и н а т а при т а з и дъл­
жина н а в ъ л н а т а е право пропориионален на
броя н а а т о м и т е о т с ъ о т в е т н и я е л е м е н т .
Пламъковата ф о т о м е т р и я е пример за при­
ложение н а а т о м н а т а емисия за количест­
вен анализ.
Ако с в е т л и н а с т о ч н о определена дължи­
на на в ъ л н а т а се насочи върху свободен, на­
миращ се в основно с ъ с т о я н и е а т о м , т о
а т о м ъ т ще абсорбира с в е т л и н а т а и ще пре­
мине във възбудено с ъ с т о я н и е . Този процес
е известен к а т о а т о м н а а б с о р б ц и н u е
показан на фиг. 8.2. С в е т л и н а т а , к о я т о пре­
дизвиква възбуждане н а а т о м а в с ъ щ н о с т
представлява специфична форма на енергия.
Способността н а апюлга д а абсорби­
р а с а л ю с в е т л и н а със строго опреде­
л е н а д ъ л Ж и н а н а в ъ л н а т а л е Ж и в ос­
новата н а а т о л т о абсорбционната
спектрофотолгетрия.
Светлинна Основно Възбудено
[ енергия състояние състояние
на а т о м а на а т о м а
Фиг. 8.2. А т о м н а а б с о р б ц и я
И з ч и с л е н и я т а н а Walsh п о к а з в а т , ч е абсор­
б ц и о н н и т е преходи о т всички о с т а н а л и равни­
щ а , р а з л и ч н и о т о с н о в н о т о се с р е щ а т м н о г о р я д ­
ко. В с л ъ н ч е в и я с п е к т ъ р а б с о р б ц и о н н и т е прехо­
ди о т р а в н и щ е различно о т о с н о в н о т о се озна­
ч а в а т к а т о Фрауенховерови линии. П р и л а б о р а ­
т о р н и условия обикновено се н а б л ю д а в а т с а м о
абсорбционни преходи започващи о т о с н о в н о т о
с ъ с т о я н и е . Л и н и и т е , о т г о в а р я щ и н а абсорбци­
онни преходи започващи о т о с н о в н о т о с ъ с т о я ­
н и е с е н а р и ч а т резопанспи линии. Е т о з а щ о аб­
сорбционните спектри н а повечето елементи,
п о л у ч е н и п р и л а б о р а т о р н и ус л ов ия , се х а р а к т е ­
р и з и р а т с изключителна п р о с т о т а . В т о в а се
и з р а з я в а е д н о о т о с н о в н и т е п р е д и м с т в а н а из­
ползването н а а т о м н о абсорбционните с п е к т ­
р и з а а н а л и т и ч н и цели - малкият брой линии в
спектъра намалява вероятността за съвпада­
не }ia линиите и съответно - възможността за
появата но интсрфсре}1ция от спектрален ха­
рактер, т . е . т о в а обуславя високата специ­
фичност на м е т о д а .
Обект н а излгсрванс п р и атолгната
абсорбция е количеството светлина с
о п р е д е л е н а д ъ л ж и н а н а в ъ л н а т а , кое­
т о се с абсорбирало п р и прелшнаване
н а светлината през облак от атоми.
Увеличаването броя на а т о м и т е намиращи
се на п ъ т я на с в е т л и н а т а води до пропор­
ционално увеличение на количеството погъл­
н а т а светлина. Следователно ч р е з излгер-
ване количеството н а абсорбираната
с в е т л и н а люЖс д а с е определи коли­
чеството н а изследвания елемент.
О б л а к ъ т о т а т о м и , необходим за измер­
в а н е т о на а т о м н а т а абсорбция се получа­
ва чрез придаване (съобщаване) на изследва­
н а т а проба на т е р м и ч н а енергия д о с т а т ъ ч ­
на да дисоциира химичните съединения до
свободни а т о м и . Важно е да се отбележи, че
светлина поглъщат само атомите
н а м и р а щ и се в основно състояние.
Т р е т и я т аналитичен м е т о д , използван
в о б л а с т т а на а т о м н а т а спектроскопия, е
а т о м н а т а ф л у о р е с ц е н ц и я . Този м е т о д
включва в себе си елементи к а к т о на а т о м ­
н а т а абсорбция, т а к а и на а т о м н а т а еми­
сия. К а к т о при а т о м н а т а абсорбция полу­
ч е н и т е в р е з у л т а т на д е й с т в и е т о на т о п ­
лина и намиращи се в основно с ъ с т о я н и е
а т о м и се в ъ з б у ж д а т чрез фокусиране върху
т я х на светлинен лъч. В м е с т о измерване на
абсорбираната о т а т о м и т е светлина, се из­
мерва излъчената о т възбудените а т о м и
с в е т л и н а при с п о н т а н н о т о им връщане в
203
 лювио състояние. И н т е н з и т е т ъ т н а
получената „флуоресценция" е про­
порционален н а концентрацилта н а
amoAiume, /соето л е Ж и в о с н о в а т а н а
.'величественото ium о п р е д е л и т е .
Светлиннияп! източник при а т о м н а т а
флуоресиешдия е извън о п т и ч н а т а ос на ос­
т а н а л а т а ч а с т на о п т и ч н а т а система, т а ­
ка че светлинния д е т е к т о р „вижда" само
флуоресиениията в пламъка, но не и с в е т ­
лината о т светлинния източник.
Изп о лзв а нит е с в е т л и н н и и з т о ч н и ц и
при а т о м н а т а флуоресценция са обикно­
вено по-мощни, о т к о л к о т о т е з и използва­
ни при а т о м н а абсорбция с оглед повиша­
ване с т е п е н т а на възбуждане н а а т о м и ­
т е , и о т т а м повишаване ч у в с т в и т е л ­
н о с т т а на м е т о д а .
Високата с т о й н о с т на о т н о ш е н и е т о
брой а т о м и в основно с ъ с т о я н и е към брой
а т о м и във възбудено с ъс т о я н и е , к о г а т о
т е се н а м и р а т в равновесие, обуславя ед­
но о т основните п р е д и м с т в а на а т о м н а ­
т а абсорбция и флуоресценция пред а т о м ­
н а т а емисия. То се изразява в т о в а , че до­
колкото абсорбцията и флуоресценцията
са директни начини за определяне броя н а
атомите, намиращи се в основно състоя­
ние, то т я х н а т а чувствителност ще бъ­
де по-голяма от тази на а т о м н а т а еми­
сия.
АТОМНО А Б С О Р Б Ц И О Н Н А
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
Принципно ycmpoücmöo и geücmßue
Основните елементи на един атомно абсор­
бционен спектрофотометър са представе­
ни на фиг. 8.3. Те осигуряват изпълнението
на следните функции:
-c=>i?tQ •Е •вН>Н!
а ра светлина със строго определени дължи
Фиг. 8.3. Основни елементи на атомно абсорб­
ционен спектрофотометър.
Ь Светлинен източник; 2. Прекъсвач; 3. Ат о миза т о р (пла­
мък или графитна пещ); 4. Монохроматор; б.Детектор;
ь. Ьлектронно устройство; 7. О т ч и т а щ о устройство.
204
• получаване на светлина с определена дъ/
жина на вълната ( с в е т л и н е н изто^
ник),
• атомизиране на пробата (атолгизс
тор),
• измерване на специфичната светлина (or
т и ч н а и е л е к т р о н н а систелш).
С в е т л и н н и я т лъч о т източника, излъч
ваш х а р а к т е р н и я за изследвания елеменг
с п е к т ъ р , се пропуска през облака о т а т с
ми получен в а т о м и з а т о р а (пламък ил
г р а ф и т н а пеш)- О б л а с т т а на спектърг
с ъ о т в е т с т в а щ а на разположението на ш
м е р в а н а т а резонанена линия се изолира
п о м о щ т а на л ю н о х р о л г а т о р . Изолирана
т а линия се насочва върху фотоелектри
чен д е т е к т о р , обикновено ф о т о м н о ж и
т е л , к о й т о генерира електрически т о
пропорционален на и н т е н з и т е т а н а пс
п а д н а л а т а светлина. Електрическият
т о к о т ф о т о м н о ж и т е л я се усилва и обра
б о т в а о т електронно у с т р о й с т в о с огле
получаване на сигнал, к о й т о е мярка за огг
слабването на с в е т л и н а т а (намаление н
нейния и н т е н з и т е т ) в а т о м и з а т о р а . Сле
допълнителна о б р а б о т к а н а т о з и сигна
изследваният е л е м е н т се о т ч и т а напрг
во в концентрационни единици.
О т с т р а н я в а н е т о н а наслагването н
излъчваната светлина от атомите, koi;
т о са възбудени в а т о м и з а т о р а , върху и:
лъчваната светлина от източника се пое
т и г а чрез модулиране с в е т л и н а т а на пър
вичния източник (обикновено н е й н а т а чес
т о т а е 50 или 400 Hz). У с и л в а т е л я т се нас
т р о й в а на с ъ щ а т а ч е с т о т а , в резултаг
на к о е т о се о т с т р а н я в а т а з и п о с т о я н н
ч а с т на сигнала, к о я т о се дължи на собс
т в е н о т о излъчване на пламъка или гра
ф и т н а т а пещ.
Характеристика иа осиоВните
елемеити
Светлинен източник. Даден а т о м абсорби
ни на вълната. За да се измери т а з и с в е т
линна абсорбция с максимална ч у в с т в и т е /
н о с т е необходимо да се използва светлине:
източник, к о й т о излъчва строго определе
н и т е дължини на вълната, които м о г а т д
се абсорбират о т дадения а т о м . Това не са
мо осигурява висока ч у в с т в и т е л н о с т , но съ­
що т а к а прави а т о м н а т а абсорбция един
много спеиифичен а н а л и т и ч е н м е т о д с нез­
начителни с п е к т р а л н и интерференции. Из­
п о л з в а т се к у х о к а т о д н а или безелектродна
разрядна лампа.
К у х ок а т о д н а ш а л а л т а е добър, ярък,
с т е с е н линеен с п е к т ъ р източник, к о й т о е
подходящ за повечето е л е м е н т и определяни
с а т о м н а абсорбция. Не й н от о принципно ус­
т р о й с т в о е показано н а фиг. 8.4. К а т о д ъ т
на л а м п а т а представлява кух цилиндър из-
анод прозорче
уТ \ I
катод пълнежен газ
Фиг. 8.4. Кухокатодна лампа
р а б о т е н о т м е т а л а , з а ч и й т о определяне е
предназначена л а м п а т а . Анодът и к а т о д ъ т
са запоени в с т ъ к л е н цилиндър напълнен с
инертен газ - неон или аргон. На края на ци­
линдъра се намира прозорче, к о е т о е
прозрачно за излъчваната светлина. К о г а т о
между анода и к а т о д а се приложи напреже­
ние ч а с т о т а т о м и т е на пълнежния газ се
йонизират. Положително заредените йони
се у с к о р я в а т в е л е к т р и ч е с к о т о поле и се
сблъскват с о т р и ц а т е л н о заредения к а т о д .
В р е з у л т а т на т е з и удари о т к а т о д а се
избиват м е т а л н и йони. Те се сблъскват с
йоните на пълнежния газ и се възбуждат о т
енергията, к о я т о им се съобщава при удара.
При последващия процес на з а т и х в а н е възбу­
дените м е т а л н и йони излъчват светлина.
К у х о к а т о д н и т е лампи и м а т ограничена
продължителност на ж и в о т а . При използва­
н е т о им и з б и т и т е о т к а т о д а м е т а л н и
а т о м и се о т л а г а т навсякъде в л а м п а т а .
Лампите за летливи м е т а л и к а т о арсен,
селен и кадмий с т а р е я т по-бързо поради
бързото изпаряване н а к а т о д а по време на
работа. К у х о к а т о д н и т е лампи и м а т също
т а к а и ограничен период на съхранение, кой­
т о е независим о т п р о д ъ л ж и т е л н о с т т а на
у п о т р е б а т а . О с н о в н а т а причина в т о з и
случай за износване на л а м п а т а е отлагане­
т о на а т о м и на и н е р т н и я пълнежен газ
върху в ъ т р е ш н а т а повърхност на т я л о т о
на л а м п а т а . Всяка кухокатодна лампа има
определена големина на т о к а , при к о я т о се
постига оптимална работа. Обикновено по-
силният т о к дава по-ярка емисия и по-малък
базален шум. Прекалено силният т о к обаче,
води до разширение на с п е к т р а л н а т а ивица.
1 ова е причина за намалена ч у в с т в и т е л н о с т
и ограничение на линейната област. Силата
на т о к а , к о я т о е обозначена на л а м п а т а
представлява възможно най-силния т о к ,
ч и е т о използване не води до разширение на
с п е к т р а л н а т а ивица. При тази стойност
на тока се постига най-добро съотношение
сигнал/шум.
Бсзслсктродната разряднал а л т а
се с ъ с т о и о т кварцов балон, в к о й т о са въ­
ведени няколко милиграма о т с ъ о т в е т н и я
е л е м е н т във вид н а м е т а л или л е т л и в а сол
и и н е р т е н газ под налягане няколко мили­
м е т р а живачен с т ъ л б (дълбок вакуум). То­
зи балон е п о с т а в е н в керамичен цилиндър,
върху к о й т о е н а в и т а н а м о т к а , през коя­
т о п р о т и ч а т о к с висока ч е с т о т а ( н а м о т ­
к а т а се з а х р а н в а о т специален генера­
т о р ) . Е н е р г и я т а на е л е к т р о м а г н и т н о т о
поле с микровълнова ч е с т о т а , к о е т о въз­
никва при п р о т и ч а н е н а т о к през н а м о т ­
к а т а , предизвиква изпаряване на елемен­
т а и възбуждане н а а т о м и т е му с послед­
ващо излъчване н а с в е т л и н а .
Б е з е л е к т р о д н и т е лампи обикновено са
с по-голям и н т е н з и т е т . Поради т о в а т е
п р е д л а г а т а н а л и т и ч н и п р е д и м с т в а , изра­
з я в а щ и се в по-добра ч у в с т в и т е л н о с т и
възпроизводимост и по-ниска граница н а
о т к р и в а н е . Освен че п р и т е ж а в а т по-доб­
ри р а б о т н и х а р а к т е р и с т и к и безелектрод­
ните разрядни л а м п и и м а т и по-дълъг жи­
вот от съответните кухокатодни л а м ­
пи.
Лтомизатор. Л т о м и з а т о р ъ т е у с т р о й с т ­
во, с ч и я т о помощ изследваната проба се
а т о м и з и р а т . е . превръща се в облак о т сво­
бодни а т о м и . Е н е р г и я т а , к о я т о е необхо­
дима за извършване на т о з и процес се полу­
чава о т т о п л и н а т а на пламък или е л е к т ­
рически т о к . С ъ о т в е т н о се различават два
вида а т о м н о абсорбционна с п е к т р о ф о т о -
метрия - плалгъчиа и елсктротсрлшч-
па.
Е ф и к а с н о с т т а н а а т о м и з и р а н е н а проба-
205
m a е важен ф а к т о р , определящ ч у в с т в и ­
т е л н о с т т а н а анализа. Идеален а т о м и з а -
т о р е т о з и , при к о й т о п р о б а т а по възпро-
изводим начин се превръща напълно в
а т о м н и пари, а получените а т о м н и пари
са с голяма п л ъ т н о с т н а а т о м и т е и н я м а
взаимодействия с а т о м н и т е пари, к о и т о
м о г а т да п о в л и я я т е м и с и я т а , абсорбиия-
т а или флуоресцениията.
Д и р е к т н о т о аспиране н а р а з т в о р о т
п р о б а т а в пламък си о с т а в а и досега най-
удобен, стабилен, бърз и икономичен начин
за получаване н а а т о м н и пари.
11лал1ъчен а т о м и з а т о р . Н а фиг. 8.5 е
представено у с т р о й с т в о т о н а пламъчен
а т о м и з а т о р с предварително смесване.
При него р а з т в о р ъ т н а п р о б а т а се аспири­
ра през р а з п р а ш и т е л и се разпрашва под
ф о р м а т а на фин аерозол в с м е с и т е л н а ка-
Фиг. 8.5. Пламъчен атомизатор с предварител­
но смесване
мера. В нея аерозолът н а п р о б а т а се смес­
ва с горивния и окислителния газове, след
к о е т о получената горивна смес п о с т ъ п в а в
г л а в а т а н а горелката, к ъ д е т о се запалва и
под влияние н а в и с о к а т а т е м п е р а т у р а се
осъществява а т о м и з а ц и я т а . Г о р и в н и я т
газ п о с т ъ п в а в с м е с и т е л н а т а камера през
спещшлен входящ о т в о р , а о к и с л и т е л н и я т
газ навлиза през с т р а н и ч н о т о рамо н а раз-
прашителя. Препоръчва се да и м а в т о р и
допълнителен входящ о т в о р - д и р е к т н о в
с м е с и т е л н а т а камера з а окислителен газ.
1ова позволява да се променя п о т о к а н а
окислителния газ в с м е с и т е л н а т а камера
без да се променя п о т о к а му през разпра-
шителя. По т о з и начин с к о р о с т т а н а зас­
206
мукване н а п р о б а т а е независима о т усло­
в и я т а н а горене н а пламъка и не се налага
п о в т о р н о ю с т и р а н е н а р а з п р а ш и т е л я след
всяка промяна н а у с л о в и я т а н а горене.
Аерозолът н а п р о б а т а при получаване­
т о му в с м е с и т е л н а т а камера е с различна
големина н а к а п ч и ц и т е . При навлизане в
пламъка в о д а т а в т е з и капчици се изпаря­
ва. С у х и я т о с т а т ъ к се р а з т а п я и изпаря­
ва, при к о е т о се р а з к ъ с в а т а т о м н и т е
връзки и се п о л у ч а в а т свободни а т о м и в ос­
новно състояние. При големи начални раз­
мери н а к а п к а т а и з п а р я в а н е т о и а т о м и з а ­
ц и я т а не м о г а т да се и з в ъ р ш а т за к р а т к о ­
т о време, през к о е т о п р о б а т а пребивава в
пламъка преди д а премине през светлинния
лъч. Н е п ъ л н а т а а т о м и з а ц и я н а п р о б а т а
води до а н а л и т и ч н и интерференции. Пора­
ди т о в а в с м е с и т е л н а т а камера непосредс­
т в е н о след р а з п р а ш и т е л я се п о с т а в я една
перка. По-големите капки, к о и т о не м о г а т
да се п р е н е с а т о т газовия п о т о к покрай
п е р к а т а (между п е р к а т а и с т е н и т е н а
с м е с и т е л н а т а камера) се у д р я т в п е р к а т а
и п а д а т н а д ъ н о т о н а с м е с и т е л н а т а каме­
ра, о т к ъ д е т о се о т в е ж д а т през специален
дренажен о т в о р навън. В д р е н а ж н а т а т р ъ ­
ба и м а водна т а п а , к о я т о п р е д о т в р а т я в а
и з т и ч а н е т о н а г о р и в н и т е газове през нея.
В ъ т р е ш н а т а п о в ъ р х н о с т н а смесителна­
т а камера е п о к р и т а с немокрещ се плас­
т и ч е н м а т е р и а л с оглед осигуряване н а сво­
боден дренаж н а и з л и ш е к ъ т о т п р о б а т а и
п р е д о т в р а т я в а н е н а е ф е к т а н а „запаме­
т я в а н е " . При добре к о н с т р у и р а н а горелка
д о с т и г а н е т о н а равновесие в абсорбцион­
ния о т г о в о р при с м я н а н а вида н а р а з т в о ­
р а се п о с т и г а за 1-2 секунди.
Р а з п р а ш и т е л я т е важна съставна ч а с т
н а г о р е л к а т а и т р я б в а д а о т г о в а р я н а оп­
ределени изисквания. С оглед получаване н а
ефикасно разпрашване н а различни по при­
рода р а з т в о р и е необходимо р а з п р а ш и т е ­
л я т да бъде регулиращ се. Разпрашители-
т е се и з р а б о т в а т о т неръждаема с т о м а ­
на, а напоследък о т и н е р т н а п л а с т м а с а ,
к о я т о е у с т о й ч и в а н а корозия.
Главата на горелката е изработена о т
т и т а н с цел п о с т и г а н е н а висока устойчи­
в о с т н а т о п л и н а и корозия.
При а т о м и з и р а н е в пламък к а т о горивен
газ обикновено се и з п о л з в а т пропан, водо­
род и ацетилен, а к а т о окислителен газ -
въздух и азотен окис. К о л и ч е с т в е н о т о съ­
отношение на горивния газ към окислител­
ния газ в с м е с т а м о ж е да бъде с т е х и о м е т -
рично, а също т а к а над или под него. Сме­
с и т е , к о и т о с ъ д ъ р ж а т горивен газ в с ъ о т ­
ношение по-малко о т с т е х и о м е т р и ч н о т о
се н а р и ч а т обеднени и о б р а т н о - с м е с и т е
съдържащи горивен газ в количество по-го­
лямо о т с т е х и о м е т р и ч н о т о се о з н а ч а в а т
к а т о обогатени. Haü-широко използваната
газова смес е въздушно-ацетиленовата, ко­
я т о позволява о п р е д е л я н е т о на около 30
различни е л е м е н т а .
Т е м п е р а т у р а т а на пламъка е различна
при о т д е л н и т е газови смеси ( т а б л . 8.1.).
Таблица Ä i . Температура на пламъка на газо­
вите смеси използвани за атоми-
зация в пламък
Температура
ГазоВа с м е с
( 0 С)
Въздух-пропан 1850-1900
Въздух-ацетилен 2125-2400
Въздух-водород 2000-2050
Азотен окис-ацетилен 2600-2800
Графитен а т о л ш з а т о р (графитна
пещ). И д е я т а за е л е к т р о т е р м и ч н а ЛЛС с
графитна пещ е предложена з а първи п ъ т
о т Борис Львов през 1959 г. В оригиналният
си вид т я е много п р о с т а и е л е г а н т н а .
Малко количество о т и з с л е д в а н а т а проба
се п о с т а в я в специално пригоден г р а ф и т е н
електрод, к о й т о се загрява по електричен
п ъ т . Под д е й с т в и е т о на т о п л и н а т а про­
б а т а се изсушава и о р г а н и ч н а т а м а т р и ц а
се опепелява и о т с т р а н я в а . След т о в а
електрода се внася в предварително загря­
т а по електрически п ъ т г р а ф и т н а т р ъ ­
бичка, през к о я т о преминава с в е т л и н е н
лъч със специфична за изследвания е л е м е н т
дължина на в ъ л н а т а . Под д е й с т в и е т о на
т о п л и н а т а в н е с е н а т а проба в г р а ф и т н а ­
т а тръбичка се превръща в а т о м н и пари и
свободните а т о м и на изследвания е л е м е н т
поглъщат специфичната з а т я х светлина,
В р е з у л т а т на к о е т о и н т е н з и т е т ъ т на
светлинния лъч намалява пропорционално
На броя на а б с о р б и р а щ и т е с в е т л и н а а т о ­
ми.
Най-широко приложение намира т е х н и ­
ческото реализиране на и д е я т а на Львов
Фиг. 8.6. Схема н а г р а ф и т н а п е щ н а
Massmann
1. Светлинен лъч; 2. Кварцово прозорче; 3. Графитни
предложено о т M a s s m a n n (фиг. 8.6). Изслед­
в а н а т а проба с п о м о щ т а на а в т о м а т и ч н а
п и п е т а или автосемплер се въвежда в гра­
ф и т н а т а тръбичка, к о я т о се намира в
хода на светлинния лъч на атомно-абсорб-
ционния с п е к т р о ф о т о м е т ъ р на м я с т о т о
на пламъка. Г р а ф и т н а т а тръбичка се дър­
жи о т два п о с то я н н о охлаждани графитни
к о н т а к т н и п р ъ с т е н а , чрез к о и т о се пода­
ва т о к в д в а т а ü края. О т с т р а н и т я е
з а т в о р е н а с две кварцови прозорчета. При
подаване на т о к с голяма сила (около 500 А)
в к р а и щ а т а на г р а ф и т н а т а тръбичка, по­
ради г о л я м о т о ü специфично съпротивле­
ние, се о т д е л я значително количество т о п ­
лина и т я се загрява до около 3000 0С. Това
загряване се извършва стъпаловидно, при
к о е т о п р о б а т а се изсушава, след т о в а се
опепелява и о т с т р а н я в а придружаващата
я органична м а т е р и я и накрая изследвани­
я т е л е м е н т се атомизира. Но време на
р а б о т а г р а ф и т н а т а тръбичка се намира в
и н е р т н а а т м о с ф е р а (аргон), при к о е т о
външният газов п о т о к (около т р ъ б и ч к а т а )
предпазва г р а ф и т н а т а тръбичка о т изга­
ряне, а в ъ т р е ш н и я т газов п о т о к о т с т р а ­
нява възможно най-бързо о т хода на лъча
леснолетливите вещества, съдържащи се в
п р о б а т а . Но време на е т а п а на атомизира-
не, в ъ т р е ш н и я т газов п о т о к се прекъсва
или намалява с цел по-дълъг престой на по­
лучените а т о м и в хода на лъча, и о т т а м
постигане на по-голяма ч у в с т в и т е л н о с т .
Основното предимство на е л е к т р о т е р -
м и ч н а т а ЛЛС с графитна пещ в сравнение
с пламъчната ЛЛС е огромната ü чувстви­
т е л н о с т (100 д о 1000 пъти по-голяма о т
т а з и на п л а м ъ ч н а т а ААС). Д р у г о предим-
207
ство на ЕТААС е възможността з а изслед­ с в е т л и н а т а о т с в е т л и н н и я и з т о ч н и к как­
ване на твърди проби. Съществен недоста­ т о при п л а м ъ ч н а т а и е л е к т р о т е р м и ч н а г т
ААС с г р а ф и т н а п е щ .
тък на метода е наличието н а много ин-
терференции за разлика от п л а м ъ ч н а т а
О п т и ч н а си стема (измерване на светли
АЛС. С р а в н и т е л н а т а х а р а к т е р и с т и к а н а
ната). С п о м о щ т а н а о п т и ч н а т а с и с т е м г
д в а т а начина н а а т о м и з а ц и я е п р е д с т а в е ­
с в е т л и н а т а о т с в е т л и н н и я и з т о ч н и к с(
на в т а б л . 8.2.
фокусира в облака о т свободни а т о м 1
Т а б л и ц а 8.2. Сравнение н а п л а м ъ ч н а ААС е получен при а т о м и з а ц и я т а н а п р о б а т а
ЕТААС с г р а ф и т н а п е щ т . е . в пламъка или г р а ф и т н и я а т о м и з а т о {
и о т т а м се насочва към монохроматора
ЕТААС с
Пламъчна ААС к ъ д е т о с в е т л и н а т а се разлага, к а т о спе
графитна пещ
ц и ф и ч н а т а за изследвания е л е м е н т дължи
Обем на пробата Обем на пробата
н а на в ъ л н а т а се фокусира върху д е т е к т о
> 500 ц1 5-50 ц!
ра.
Непрекъсната Дискретна атомизация,
атомизация бързо преходни сигнали В з а в и с и м о с т о т у с т р о й с т в о т о н а on
10-20% о т аспирирана Ц я л а т а проба се т и ч н а т а с и с т е м а се р а з л и ч а в а т е д н о л ъ
проба се оползотворява оползотворява чсви и д в у л ъ ч е в и а т о л т о абсорбциоп
Разреждане на а т о м и т е и и с п с к т р о ф о т о л г с т р и . При еднолъче
По-малко разреждане -
о т газовете - ниска
висока чувс твите л нос т в и т е всички измервания се о с н о в а в а т ш
чувствителност п р о м е н и т е в и н т е н з и т е т а н а един единс
Загряване в графитна т в е н с в е т л и н е н лъч. При двулъчев а т о м ж
Загряване о т пламък
пещ
абсорбционен с п е к т р о ф о т о м е т ъ р , с в е т л и
Малко съединения в
Много съединения в н а т а н а л а м п а т а се разделя н а два с в е т
сравнително п р о с т а
комплексна среда линни п о т о к а (лъча) - е д и н и я т е фокусира!
среда
Ниска неселективна Висока неселективна през а т о м и з а т о р а (пламък или г р а ф и т ш
абсорбция абсорбция пещ), а д р у г и я т е насочен покрай а т о м и з а
т о р а и служи з а к о н т р о л н а и н т е н з и т е п и
Други методи за атомизиране. н а л а м п а т а (референтен лъч). При двулъче
Освен г о р н и т е д в а в и д а а т о м и з а т о р и - в а т а с и с т е м а о т ч и т а н е т о не о т р а з я в ;
пламъчен и е л е к т р о т е р м и ч е н , в п р а к т и к а ­ просто промяната в и н т е н з и т е т а HJ
т а се п р и л а г а т и д р у г и м е т о д и : м е т о д с ъ с един е д и н с т в е н лъч, а о т н о ш е н и е т о н а ин
студени живачни пари и т ъ й нар. хидридна т е н з и т е т а н а д в а т а лъча, произхождащ!
система. о т с в е т л и н н и я и з т о ч н и к - т о з и премина
Система за анализиране на студени жи­ в а щ през пламъка (респ. г р а ф и т н а т а т р ъ
вачни пари. И з п о л з в а н е т о н а м е т о д а с ъ с бичка) и р е ф е р е н т н и я лъч. По т о з и начш
с т у д е н и живачни п а р и се о т л и ч а в а с висока
п р о м е н и т е в и н т е н з и т е т а н а източника
чувствителност и дава възможност за о т ­
криване н а по-малко о т 5 n g живак. Ж и в а ­ к о и т о п о в л и я в а т в еднаква с т е п е н и д в а т ;
к ъ т в р а з т в о р а се р е д у ц и р а до а т о м н о със­ лъча, не се о т р а з я в а т н а о т ч е т е н а т .
т о я н и е чрез станохлорид. П о л у ч е н и т е п а р и промяна в и н т е н з и т е т а н а с в е т л и н а т е
се п р е к а р в а т п р е з с т ъ к л е н а к ю в е т а , р а з п о ­ Тази независимост о т п р о м е н и т е в и н т е н
ложена в с в е т л и н н и я лъч н а с п е к т р о ф о т о - з и т е т а на и з т о ч н и к а дава възможносг
м е т ъ р а и се и з м е р в а а б с о р б ц и я т а п р и р е з о - л а м п и т е да се и з п о л з в а т без предварител
н а н с н а т а линия з а живак. но загряване, к о е т о п е с т и време на опера
Хидридна система. П р и х и д р и р а н е н а с о ­ т о р а и увеличава полезния ж и в о т н а лам
л и т е н а някои е л е м е н т и (селен, т е л у р , а р ­
пата.
сен) се о б р а з у в а т л е т л и в и х и д р и д и . З а ц е л ­
т а може д а се използва н а т р и е в борхидрид.
Важен ф а к т о р , к о й т о определя н и в о т
С и с т е м а т а з а хидриране прекарва образу­ н а шума (фона) при а т о м н о абсорбционни
вания хидрид през н а г р е в а е м а т р ъ б и ч к а , анализ, е к о л и ч е с т в о т о н а с в е т л и н н а т
р а з п о л о ж е н а в о п т и ч н а т а ос н а с п е к т р о ф о - енергия д о с т и г а щ о ф о т о м н о ж и т е л я . Ко/
т о м е т ъ р а , к ъ д е т о хидрида се разлага н а к о т о по-голямо количество с в е т л и н н
с ъ с т а в н и т е си а т о м и . П о л у ч е н и т е с в о б о д ­ енергия попада върху д е т е к т о р а , т о л к о в
ни а т о м и н а и з с л е д в а н и я а т о м а б с о р б и р а т по-малко електронно усилване е необходъ
208
мо u т о л к о в а no-малък е н а л и ч н и я т ш у м .
Обикновено и н т е н з и т е т ъ т на л а м п а т а се
нагласява т а к а , че да се получи максимална яр­
кост, но т о в а е свързано с разширяване на спек­
т р а л н а т а ивица, к о е т о ограничава възмож­
н о с т т а за използване на максималния интензи­
т е т на лампата. Е т о защо о п т и ч н а т а система
т р я б в а да бъде т а к а конструирана, че да се
използва максимално наличната светлина о т
светлинния източник с оглед получаване на ми­
нимален шум.
В а ж н а ч а с т н а о п т и ч н а т а с и с т е м а , ко­
я т о е с в ъ р з а н а със з а г у б а н а с в е т л и н н а
енергия е л ю н о х р о л т т о р ъ т . Р а з л а г а н е ­
т о н а с в е т л и н а т а в него с т а в а с п о м о щ т а
н а дифракционна р е ш е т к а , ч и я т о о т р а ж а ­
т е л н а п о в ъ р х н о с т е набраздена с много
т ъ н к и , успоредни е д н а н а друга линии. При
о т р а з я в а н е н а с в е т л и н а т а о т т а к а в а наб­
раздена п о в ъ р х н о с т н а с т ъ п в а я в л е н и е т о
дифракция, при к о е т о с в е т л и н а т а с р а з ­
лична д ъ л ж и н а н а в ъ л н а т а се о т к л о н я в а о т
р е ш е т к а т а под различен ъгъл.
Фиг. 8.7. Монохроматор
Схемата на монохроматор е представена на
фиг. 8.7. Светлината на източника навлиза в мо-
нохроматора през входящия процеп, след което
се насочва към дифракционната решетка,
където т я се разлага. Получената светлина с
различни дължини на вълната се насочва към
изходящия процеп на монохроматора. Чрез про­
мяна на наклона на р е ш е т к а т а може да се под­
бере определена дължина на вълната и само т я
да бъде насочена през изходния процеп върху де­
т е к т о р а . Всички останали дължини на вълната
се спират на изхода. С т е п е н т а на дисперсия
(разлагане) на с в е т л и н а т а зависи о т г ъ с т о т а ­
т а на линиите на дифракционната решетка.
Високата степен на дисперсия е о т значение за
по-добрата ефективност на монохроматора в
енергетично отношение.
За добро разделяне на о т д е л н и т е линии (дъл­
жини на вълната) входящият и изходящият
процеп на монохроматора трябва да са с еднак­
ви размери. Това означава, че при решетка с нис­
ка разрешителна способност т р я б в а да се
използва малък процеп респ. ще има загуба на
светлина, т ъ й к а т о значителна ч а с т о т нея
няма въобще да навлезе в монохроматора. Об­
р а т н о при решетка с голяма разрешителна спо­
собност ще се използва по-голям процеп и няма
да има загуба на светлина т . е . ш у м ъ т ще бъде
по-малък, поради по-пълното използване на на­
личната светлинна енергия.
Детектор. П о н а с т о я щ е м к а т о о п т и ч е н
д е т е к т о р се и з п о л з в а т изключително фо-
т о м н о ж и т е л и . Ф о п ю л ш о Ж и т е л л т пред­
с т а в л я в а с т ъ к л е н балон под вакуум с по­
м е с т е н и в него ф о т о ч у в с т в и т е л е н к а т о д
и серия диноди, усилващи м н о г о к р а т н о вхо­
д я щ и я сигнал. Е л е к т р о н и т е , и з б и т и о т
ф о т о ч у в с т в и т е л н и я к а т о д под д е й с т в и е
н а с в е т л и н а т а , се у с к о р я в а т о т е л е к т р и ­
ч е с к о т о поле във ф о т о м н о ж и т е л я и изби­
в а т е л е к т р о н и о т първия динод. П р о ц е с ъ т
е лавинообразен и при последния динод
у с и л в а н е т о н а началния т о к м о ж е д а над­
хвърли един милион п ъ т и . К о е ф и ц и е н т ъ т
н а усилване се регулира п о с р е д с т в о м пода­
в а н о т о н а ф о т о м н о ж и т е л я напрежение.
Трябва д а се о т б е л е ж и , че к о л к о т о по-голя-
м о е т о в а напрежение т о л к о в а по-голям е
шумът.
Система за регистрация. С а м о т о р е г и с т ­
р и р а н е н а сигнала (респ. о т ч и т а н е т о )
обикновено с т а в а чрез цифрова индикация
н а екран.
КоличестНсно определяне
чрез а т о м н а абеорбция
При а т о м н а т а абеорбция п о л у ч е н и т е в
а т о м и з а т о р а свободни а т о м и в основно
с ъ с т о я н и е а б с о р б и р а т специфична з а изс­
ледвания е л е м е н т с в е т л и н а о т с в е т л и н н и я
и з т о ч н и к . А б с о р б ц и я т а н а а т о м и т е (А),
к о я т о се подчинява н а закона н а Beer-
L a m b e rt , е пропорционална н а к о н ц е н т р а ­
ц и я т а на елемента в пробата.
A=log,„j , =kCL
I - и н т е н з и т е т на началната светлина
I - и н т е н з и т е т на преминалата светлина
209
k - коефициент н а абсорбция
С - концентрация н а изследвания е л е м е н т
L - дължина на светлинния п ъ т заключен в аб­
сорбционната к ю в е т а (пламък, г р а ф и т н а
тръбичка)
К а т о се и з м е р я т абсорбциите н а с т а н ­
д а р т н и разтвори, съдържащи п о з н а т а
концентрация о т изследваното в е щ е с т в о
и получените данни се н а н е с а т срещу кон­
ц е н т р а ц и я т а се п о с т р о я в а калибрациолна
крива. Извършването н а т а к а в а калибра-
ция позволява измерване а б с о р б ц и я т а н а
разтвори с н е п о з н а т а к о н ц е н т р а ц и я и оп­
ределяне на т я х н а т а к о н ц е н т р а ц и я по ка-
либрационната крива. В с ъ в р е м е н н и т е
апарати калибрацията и о т ч и т а н е т о на
к о н ц е н т р а ц и я т а с т а в а напълно а в т о м а ­
т и ч н о и е възможно т о ч н о о т ч и т а н е н а
к о н ц е н т р а ц и я т а даже в н е л и н е й н а т а об­
ласт.
Характеристична концентрация. Харак­
т е р и с т и ч н а т а к о н ц е н т р а ц и я е условно
п р и е т о п о н я т и е х а р а к т е р и з и р а щ о накло­
на на калибрационната крива з а всеки
елемент. За п л а м ъ ч н а т а а т о м н а абсорб­
ция т я се изразява к а т о к о н ц е н т р а ц и я н а
е л е м е н т а в mg/1 даваща 1% абсорбция.
Характеристична _ к о Н 1 ^ н а с т а н д а р т а х 0,0044
концентрация (mg/1) =
м е р е н а абсорбция
Тъй к а т о и з м е р в а н и я т а обикновено се пра­
в я т в линейната област, т о характерис­
т и ч н а т а к о н ц е н т р а ц и я з а даден е л е м е н т
може да се определи к а т о се о т ч е т е абсорб­
ц и я т а на с т а н д а р т с п о з н а т а концентра­
ция и се използва г о р н о т о уравнение.
С т о й н о с т и т е на х а р а к т е р и с т и ч н а т а
концентрация з а даден а п а р а т при опреде­
лени с т а н д а р т н и условия са обикновено
дадени. Знаейки каква х а р а к т е р и с т и ч н а
концентрация се очаква, о п е р а т о р ъ т вед­
нага може да прецени дали всички условия
са оптимални само чрез измерване абсорб­
ц и я т а н а п о з н а т а к о н ц е н т р а ц и я и сравня­
ване на получения р е з у л т а т с о ч а к в а н а т а
стойност.
Граница на откриване. Това п о н я т и е харак­
теризира размера на сигнала и фоновия шум
и дава възможност да се определи минимал­
н а т а концентрация, к о я т о може достовер­
но да бъде определена. Границата на о т к р и ­
210
ване се дефинира к а т о концентрация, която
дава отношение сигнал/шум равно на 2, т.е.
концентрация даваща сигнал два пъти по-
голям от сигнала на шума.
Автоматизация на а т о м н о
абсорбциоииия анализ
В ъ в е ж д а н е т о н а а в т о м а т и ч н и т е пода­
вачи н а п р о б и т е (автосемплери) п о с т а ­
ви н а ч а л о т о н а а в т о м а т и з а ц и я т а в
а т о м н о а б с о р б ц и о н н и я анализ. В к р а я н а
с е д е м д е с е т т е години се с ъ з д а д о х а п ър ­
в и т е а в т о м а т и ч н и многоелементни
а т о м н о абсорбционни с п е к т р о ф о т о -
м е т р и . При т я х ц е л и я т а н а л и з о т по­
д а в а н е н а п р о б а т а до о т ч и т а н е т о н а
крайния р е з у л т а т е напълно а в т о м а т и ­
з и р а н и м о ж е д а се и з в ъ р ш в а и без при­
съствието на оператора. По-нататъш­
н а т а к о м п ю т ъ р и з а ц и я н а анализа дава
в ъ з м о ж н о с т при с ъ в р е м е н н и т е а т о м н о
а б с о р б ц и о н н и с п е к т р о ф о т о м е т р и д а се
извършва о б р а б о т к а , о т п е ч а т в а н е и ар­
х и в и р а н е н а д а н н и т е с ъ о б р а з н о специ­
ф и ч н и т е изисквания н а п о т р е б и т е л я .
С ъ х р а н е н и т е д а н н и м о г а т д а б ъ д а т въ­
веждани в с т а н д а р т н и п о т р е б и т е л с к и
п р о г р а м и з а п е р с о н а л е н к о м п ю т ъ р и по-
н а т а т ъ к о б р а б о т в а н и според ж е л а н и е ­
т о на потребителя.
Контрол на аналитичните
интерференции
Съгласно п р е п о р ъ к и т е н а IUPAC и н т е р -
ф е р е н ц и и т е в с п е к т р а л н и я анализ се
п о д р а з д е л я т н а с п е к т р а л н и и неспект-
рални. С п е к т р а л н и т е и н т е р ф е р е н ­
ц и и се д ъ л ж а т н а н е п ъ л н о изолиране н а
с в е т л и н а т а , к о я т о е а б с о р б и р а н а о т из­
следвания е л е м е н т , о т друга с в е т л и н а
или а б с о р б ц и я , у л а в я н а и и з м е р в а н а о т
електронната измерителна система.
При н е с п е к т р а л н и т е и н т е р ф е р е н ­
ц и и а н а л и т и ч н и я с и г н а л се повлиява ди­
ректно.
Спектрални интерференции. Спектрални
интерференции при ААС м о г а т да възник­
нат от:
• абсорбция н а с в е т л и н а при припокриване
 на а т о м н и т е или молекулните спектри
на с ъ с т а в к и т е на пробата,
• разсейване на с в е т л и н а т а на източника
о т неизпарили се твърди частици,
• индиректно влияние на с ъ с т а в к и т е вър­
ху сляпата фонова абсорбция или разсей­
ване в а т о м и з а т о р а ,
• абсорбция на друга светлина, ако т я се
излъчва наред с дължината на изследва­
ния елемент и минава през използваната
ширина на процепа на монохроматора.
Д и р е к т н о т о припокриване на абсорбци­
онната линия на изследвания елемент с аб­
сорбционните линии на други елементи е
изключително рядко явление при ААС, кога­
т о се използват препоръчваните процепи
на монохроматора. Това явление, ако е на­
лице, не зависи о т начина на атомизиране,
което означава, че н а т р у п а н и я т о п и т в
това отношение с пламъчната ЛСС може
да се използва направо при ЕТАЛС с гра­
фитна пещ.
Най-честият вид спектрална интерфе-
ренция, к о я т о представлява и един о т ос­
новните аналитични проблеми при използ­
ването на ЕТЛЛС е неселективната абсорб­
ция наричана още ф о н о в а а б с о р б ц и я и л и
фон. К а т о неселективна абсорбция се оз­
начава намалението на и н т е н з и т е т а на
светлинния лъч, ч и я т о дължина на вълна­
т а е специфична за изследвания елемент.
То се дължи на разсейване на с в е т л и н а т а
о т материални частици (недисоциирани
съставки на м а т р и ц а т а ) и на молекулна
абсорбция. Тъй к а т о неселективната аб­
сорбция е широколентова (обхваща широка
част о т спектъра), т о в е р о я т н о с т т а за
припокриване със специфичната за изслед­
вания елемент дължина на вълната е мно­
го голяма. Това налага при ЕТЛЛС почти
винаги да се използват м е т о д и з а к о р е к ­
ции н а н е с е л е к т и в н а т а а б с о р б ц и я .
Тези методи включват р е д у к ц и и н а н е с е ­
лективната абсорбция чрез предва­
рителна х и м и чн а людификация н а
матрицата н а пробата и специални
оптични льетоди з а к о н т р о л и корек­
ция н а н е с е л е к т и в н а т а а б с о р б ц и я .
Модификацията иа матрицата е предложе­
на за първи път о т Edlgerd976 г.^като мето^
за по-добро разделяне на изследвания елемент
от състаВките на матрицата чрез повишава­
не летливостта на матрицата и/или стабили­
зиране на изследвания елемент. Модификация­
т а на матрицата е една о т съществените ин­
тегрални части на S T P F к о н ц е п ц и я т а п р е д ­
л о ж е н а о т S l a v i n . Действието на всеки моди-
фикатор е сложно и многопосочно, в резултат
на което се повлияват в определена степен всич­
ките четири компоненти на аналитичната сис­
тема: изследвания елемент, матрицата, ато­
мизатора (повърхностния графитен слой) и га­
зовата фаза.
Приложението на модификаторите
цели да се променят и по т о з и начин да се
контролират редица нежелателни свойст­
ва на:
• и з с л е д в а н и я е л е л ю н т - много висока
или много ниска летливост, присътвие
под различни химични форми в пробата и
калибрационните разтвори,
• м а т р и ц а т а - присътвие на интерфе-
риращи съставки, много висока, непода-
ваща се на корекция неселективна абсор­
бция,
• а т о л т з а т о р а - липса на изотермич-
н о с т във времето и пространството,
порьозност и реактивоспособност на
графита,
• г а з о в а т а ф а з а - парциално налягане на
някои активни компоненти.
В р е з у л т а т на химичната модификация
се подобряват аналитичната надеждност
( т о ч н о с т , възпроизводимост, чувствител­
н о с т , граница на откриване) и редица т е х ­
нически характеристики на ЕТЛЛС (опрос­
т е н а предварителна обработка на проба­
т а , улеснена калибрация, съкратена и оп­
ростена т е м п е р а т у р н а програма на пещ­
т а , удължен ж и в о т на графитните т р ъ ­
бички).
Използването на химична модификация
на м а т р и ц а т а е свързано с някои пробле­
ми, които трябва да се познават, за да се
п р е д о т в р а т я в а т или контролират. Изпол­
званите к а т о модификатори разтвори
трябва да б ъ д а т с възможно най-висока
ч и с т о т а и да не съдържат изследваните
елементи в измерими количества. Предла­
ганите на пазара такива реактиви или го­
т о в и разтвори ч е с т о не са д о ста тъчно
чисти (високи слепи проби) за някои еле­
м е н т и (Л1, Cd, Cr, Си, Ге, Мп , Pb, Zn).
Предложени са методи за допълнително пре­
чистване на модификатори о т Cd, Pb, Sn и др.
211
Някои метали използвани к а т о модификато-
ри (Ag, AI, Au, Co, Cr, Си, Mn, Mo, P, Pd, V) за­
мърсяват необратимо г р а ф и т н и т е ч а с т и
(иилиндри и др), използваните съдове и т . н . и
правят невъзможно по-късно с о б с т в е н о т о
им определяне. Това налага т ъ р с е н е т о и из­
ползването на подходящи начини за декон-
таминация. Друг перспективен начин за ре­
шаването на т о з и проблем е т ъ р с е н е т о на
„универсални модификатори", к о и т о рядко
(Pd,Mg,благородни м е т а л и ) или никога (Се,
La, Th, W, Zr) не се определят с ЕТААС.
И з п о л з в а н и я т м о д и ф и к а т о р не т р я б в а
д а увеличава н е с е л е к т и в н а т а абсорбция.
О т т а з и гледна т о ч к а ф о с ф а т ъ т , к о й т о е
един ч е с т о у п о т р е б я в а н м о д и ф и к а т о р ,
създава най-големи проблеми. Н е г о в и я т бо­
г а т с п е к т ъ р в UV о б л а с т т а ч е с т о н а л а г а
използването н а Зееманова корекиия н а не­
с е л е к т и в н а т а абсорбиия. ф о с ф а т с ъ д ъ р ж а -
щ и т е м о д и ф и к а т о р и в о д я т до с и с т е м н и
грешки, к о г а т о се използва д е у т е р и е в ко­
р е к т о р н а н е с е л е к т и в н а т а абсорбция.
Описани с а и редица други с п е к т р а л н и ин-
т е р ф е р е н ц и и о т вече у т в ъ р д е н и или новоп-
редложени м о д и ф и к а т о р и . Р е ш е н и е т о н а
т о з и проблем т р я б в а д а се т ъ р с и в използ­
в а н е т о н а п о - т е с н и процепи н а монохрома-
т о р а , З е е м а н о в а т а корекция н а неселек­
т и в н а т а абсорбция (в п о в е ч е т о случаи
решава проблема, но не винаги), н а м а л е н и е
н а а т о м и з а ц и о н н а т а т е м п е р а т у р а и вре­
м е т р а е н е т о и (не повече о т 2-3 секунди
при л е т л и в и е л е м е н т и ) , смесени модифика­
т о р и и др. Някои м о д и ф и к а т о р и м о г а т съ­
ществено да с ъ к р а т я т ж и в о т а н а гра­
ф и т н а т а тръбичка респ.платформата.
Деструкцията на пиролитното покритие
може д а доведе до д р а с т и ч н о с п а д а н е н а
чувствителността.
Р е а к т и в и т е , к о и т о се и з п о л з в а т к а т о
м о д и ф и к а т о р и т р я б в а д а б ъ д а т с най-ви­
сока ч и с т о т а и с ъ о т в е т н о т е с а с висока
цена. 1 я х н а т а консумация м о ж е с ъ щ е с т в е ­
но д а се намали к а т о се използва а у т о с е м -
плера з а i n s i t u смесване, в м е с т о предвари­
т е л н о външно смесване н а п р о б а т а с
м о д и ф и к а т о р а . Н а п р а в е н о т о по-подробно
разглеждане н а х и м и ч н а т а модификация
н а м а т р и ц а т а се н а л а г а поради две причи­
ни. първо - п о н а с т о я щ е м т о в а е един о т
о с н о в н и т е м е т о д и з а о т с т р а н я в а н е или
контрол к а к т о на спектралните, т а к а и
на неспектралните(химични) интерферен-
212
ции, к о й т о е и основна и н т е г р а л н а ч а с т нг
STPF к о н ц е п ц и я т а и второ - п р а к т и ч е с к о
т о приложение н а т о з и м е т о д не се о г р а
н и ч а в а о т ф и н а н с о в и т е в ъ з м о ж н о с т и нг
л а б о р а т о р и я т а з а разлика о т оптичнигш
м е т о д и з а корекция н а н е с е л е к т и в н а т а а б
сорбция и з а в и с и е д и и с т в е п о о т колг
петситността п а аналитика.
П р и л а г а н е т о н а х и м и ч н а модификации
н а м а т р и ц а т а н е винаги м о ж е д а о т с т р а
ни н а п ъ лн о с п е к т р а л н и т е пречения, п о р а
ди к о е т о и з п о л з в а н е т о н а о п т и ч н и м е т о д ;
з а к о р е к ц и я н а н е с е л е к т и в н а т а абсорбцш
при ЕТААС е п о ч т и винаги з а д ъ л ж и т е л н о
Понастоящем най-често използваните т а
к и в а м е т о д и с а к о м п е н с а ц и я н а неселек
т и в н а т а абсорбция чрез използване н а к о
р е к т о р с н е п р е к ъ с н а т и з т о ч н и к (деу
т е р и е в к о р е к т о р ) и к о л т е н с а ц и я ос
н о в а в а щ а с е н а е ф е к т а н а З е е л ш н (Зе
е л ш н о в а корекция).
Принципът на корекцията с непрекъснат из
точник е предложен о т K o i r t y o h a n и P i c k e
п р е з 1965 г. Той е п р о с т и сравнително надеж
ден, поради к о е т о о т 1968 г. насам и понастоя
щем намира успешно приложение в ААС. Емиси
онният спектър на деутериевата дъга е чувс
т в и т е л е н до 400 п т , след к о е т о чувствител
н о с т т а му намалява почти до нула в областпи
на видимия спектър. Корекцията на неселектив
н а т а абсорбция се осъществява к а т о светли
н а т а на деутериевата дъга и кухокатоднагт
лампа се алтернира бързо ( д е с е т и повече пъгт
в секунда) през атомизираната проба. Светли
н а т а о т кухокатодната лампа се абсорбира как
т о о т изследвания елемент (специфична абсор
бция), т а к а и о т молекули и се разсейва (несе
лективна абсорбция). Светлината о т деутери
е в а т а дъга не се абсорбира о т изследвания еле
м е н т , но се абсорбира о т молекулите и се раз
сейва. Разликата между абсорбцията на кухе
к а т о д н а т а лампа и абсорбцията о т деутерие
в а т а лампа дава и с т и н с к а т а абсорбция т . е . аб
сорбцията само о т изследвания елемент. Деу
териевата корекция е надеждна, но с нея мож.
да се коригира неселективна абсорбция до 0,5 at
сорбционни единици. При изследване на сложн
матрици, каквито са биологичните проби несе
лективната абсорбция е много по- голяма. Дру
съществен недостатък на деутериевата kopel
ция е това, че тя е ефективна главно в ултре
виолетовата област(от 190 до 350 пт). Над 35
п т трябва да се използва втори непрекъснат
източник(волфрамова лампа). Друг проблем е не
обходимостта д в а т а оптични лъча(от кухокг
т о д н а т а лампа и о т деутериевата лампа) то*-:
но ga съвпадат в оптичния п ъ т и т а з и юсти-
ровка често п ъ т и е трудно осъществима пора­
ди различната геометрия на източнииите. Лип­
сата на точно съвпадение на двата лъча огра­
ничава степента на корекция на неселективна-
та абсорбция. Съществен недостатък на деу-
териевата корекция е, че тя компенсира само
непрекъсната неселективна абсорбция, напр.
тази, дължаща се на разсейване на светлина­
та от материалните частици. Редица моле­
кули напр. NO2, РО или SO2 и м а т фино струк­
турирана абсорбция дължаща се на ротацион­
ни или вибрационни преходи и т а к а в а „струк­
турна неселективна абсорбция" не може да се
корегира с деутериев коректор. Освен т о в а деу-
териевата корекция не компенсира дрдги видо­
ве спектрални интерференции, освен неселектив-
ната абсорбция - напр. припокриване на резо-
нансната линия на други елементи с емисион­
н а т а линия на кухокатодната лампа.
В края н а 7 0 - т е години в а т о м н о абсорб­
ционния анализ бе внедрен нов м е т о д за ко­
рекция н а н е с е л е к т и в н а т а абсорбция осно­
ваващ се н а е ф е к т а н а Z e e m a n .
Приложението н а е ф е к т а н а Зееман в
а т о м н о абсорбционния анализ може да
бъде осъществено по различен начин в зави­
с и м о с т о т м я с т о т о и начина на разполо­
жение н а м а г н и т а и неговия вид, т а к а че
са възможни 8 в а р и а н т а .
О п т и м а л н а т а с и с т е м а за Зееманова ко­
рекция е т а з и с м а г н и т разположен около
а т о м и з а т о р а захранван с променлив т о к .
При т а з и с и с т е м а са възможни два вариан­
т а в з а в и с и м о с т о т разположението на
м а г н и т н о т о поле спрямо хода на с в е т л и н ­
ния лъч - напречно или надлъжно. Доскоро
най-разпространен бе в а р и а н т ъ т с нап­
речно разположение н а м а г н и т н о т о поле,
но напоследък се о т д а в а предпочитание н а
надлъжното разположение, при к о е т о о т ­
пада н е о б х о д и м о с т т а о т използването н а
поляризатор, а с т о в а и с в ъ р з а н и т е с него
загуби н а с в е т л и н а .
О с и о в н и т е п р е д и м с т в а н а Зеелга-
н о в а т а к о р е к ц и я н а н е с е л е к т и в н а т а аб­
сорбция се и з р а з я в а т в: о п т и м а л н а двойно-
лъчева с и с т е м а ; корекция н а неселективна­
т а абсорбция т о ч н о н а р е з о н а н е н а т а дъл­
жина на в ъ л н а т а ; в ъ з м о ж н о с т за корекция
на ф и н о с т р у к т у р и р а н фон до 2,0 абсорбци­
онни единици; л и н е й н о с т и ч у в с т в и т е л ­
н о с т еднакви с т е з и при използването на
непрекъснат и з т о ч н и к з а корекция на
» ( ' с е л е к т и в н а т а абсорбция; най-ниски гра­
ници н а откриване; висока с т а б и л н о с т на
о с н о в н а т а линия.
З е е л г а н о в а т а к о р е к ц и я ильа и н я ­
к о и н е д о с т а т ъ ц и , к о и т о следва да се
п о з н а в а т и и м а т предвид при практичес­
к о т о ü приложение. Н а първо м я с т о това е
фенолюнът наречен „rollover". При нарас­
т в а н е к о н ц е н т р а ц и я т а н а изследвания
е л е м е н т с т р а н и ч н и т е линии(8-компонен-
т и т е ) се р а з ш и р я в а т и з а п о ч в а т да абсор­
б и р а т все повече и повече светлина о т пер­
пендикулярната к о м п о н е н т а н а светлин­
ния източник. Тази абсорбция се възприема
к а т о неселективна и се изважда, в резул­
т а т на к о е т о калибрационната крива се
закривява и обръща п о с о к а т а си. Това огра­
ничава о б л а с т т а на линейност н а крива­
т а . К о г а т о се използва о б р а т е н Зееманов
е ф е к т с д о с т а т ъ ч н о силно променливо
м а г н и т н о поле т о з и проблем в значителна
с т е п е н се намалява и се д о с т и г а т харак­
т е р и с т и к и т е на д е у т е р и е в а т а корекция.
По-съществен проблем е намалението на
чувствителността при елементи с ано­
м а л е н ефект на Зееман (наличие на много
s- и ф-компоненти), което се движи между
10 и 50%. О т н о в о използването на о б р а т е н
Зееманов е ф е к т и силно променливо маг­
н и т н о поле ч а с т и ч н о решава проблема, но
и в най-добрия случай ч у в с т в и т е л н о с т т а е
по-малка о т к о л к о т о при обикновената
ЛАС. Накрая З е е м а н о в а т а корекция е т в ъ р ­
де скъпа.
Иеспектрални интерференции. При неспек-
т р а л н и т е интерференции аналитичния
сигнал се повлиява директно. В зависимост
о т м я с т о т о на възникване и обуславящи­
т е ги процеси, н е с п е к т р а л н и т е интерфе­
ренции се подразделят н а и н т е р ф е р е н ­
ц и и свързани с транспорта, изпаре­
нието, разпределението и г а з о в а т а
фаза.
Т р а н с п о р т н и т е интерференции са присъщи
изключително за пламъчната АЛС и са свърза­
ни с разпрашването на п р о б а т а и т р а н с п о р т а
на получения аерозол в пламъка. 1е са добре опи­
сани и м о г а т сравнително лесно да се контро­
лират. С ъ щ о т о се о т н а с я и за интерференции-
т е свързани с разпределението. Интерференци-
и т е свързани с изпарението се с р е щ а т к а к т о
при пламъчната, т а к а и при ЕТААС. При пламъч­
н а т а АЛС т е се изразяват в различна скорост
на изпарение на изследвания е л е м е н т о т аеро-
213
золните ч а с т и ц и 6 присъсшбивгпо и при липса
т а на дадена с ъ с т а в к а н а п р о б а т а , а при ЕТА-
АС в изпарение н а изследвания е л е м е н т при по-
ниска т е м п е р а т у р а в п р и с ъ с т в и е т о н а дадена
с ъ с т а в к а в сравнение, к о г а т о т я о т с ъ с т в а . Из­
ползването на подходяща химична модификация
на м а т р и ц а т а в повечето случаи решава про­
блема. Друго решение е прилагане м е т о д а н а
с т а н д а р т н и т е добавки. И н т е р ф е р е н ц и и т е
свързани с г а з о в а т а фаза (газово-фазови и н т е р -
ференции) се и з р а з я в а т в непълна дисоциация
на изследвания е л е м е н т в свободни а т о м и на­
миращи се в основно състояние. Това може да
се дължи на образуване н а съединения н а изслед­
вания е л е м е н т с някоя с ъ с т а в к а в п р о б а т а и
т о в а съединение да не се дисоциира в с ъ щ а т а
с т е п е н к а к т о калибрационния р а з т в о р . Друга
причина може да бъде б ъ р з о т о реагиране н а об­
разувалите се а т о м и с други а т о м и .
Посочените интерференции известни
още к а т о х и л т ч п и и н т е р ф е р е н ц и и
пречат на количествената атомизация на
изследвания елемент, в р е з у л т а т на к о е т о
броят на а т о м и т е образували се за едини­
ца време или в единица обем е различен при
атомизиране на п р о б а т а и на калибрацион­
ния разтвор при едни и същи използвани
условия. Основните начини за т я х н о т о ог­
раничаване или о т с т р а н я в а н е са внимате­
лен подбор на т е м п е р а т у р а т а на пиролиза
и селективно изпарение на пречещите със­
т а в к и на пробата, химична модификация
на м а т р и ц а т а и използване на възможно
най-висока т е м п е р а т у р а на пиролиза, как­
т о създаване и подържане на изотермични
условия в г р а ф и т н а т а пещ.
Концепция з а т е м п е р а т у р н о
стабилизирана с платформа
г р а ф и т н а пеш, ( S T P F )
Най-добрият, ако не идеалният начин за
определяне на олигоелементи в биологични­
т е т е ч н о с т и и т ъ к а н и е използването на
директни методи. ЕТАЛС с графитна пещ
благодарение на високата си чувствител­
н о с т дава възможност за директно опре­
деляне, но непреодолима пречка доскоро
бяха мнотгобройните интерференции при­
същи на м е т о д а и подробно описани по-
горе.
Предложената о т Борис Львов през 1978
г. платформа и последвалите разработки на
Walter Slavin довели до създаването на STPF
214
концепцията по същество представляват
революция в ЕТААС, изразяваща се в пови­
шаване н а д е ж д н о с т т а на м е т о д а и добли­
ж а в а н е т о му до и де ята, изказана още о т
б а щ а т а на а т о м н а т а абсорбция Sir Alan
Walsh, за абсолютен м е т о д за определяне на
олигоелементи. STPF концепцията обединя­
ва в едно хармонично цяло всички достиже­
ния на съвременната технология на а т о м -
но-абсорбционния анализ. Нейните основни
компоненти са следните:
• платформа на Аьвов,
• бърза дигитална електроника,
• измерване п л о щ т а на пика т . е . използва­
не на интегрирана абосорбция A.s, а не
височина на пика,
• химична модификация на м а т р и ц а т а ,
• пиролитно п о к р и т а г рафи тн а тръбич­
ка,
• бързо загряване на п е щ т а , повече о т
1500 0 C/s,
• газ-стоп по време на а т о м и з а ц и я т а ,
• корекция на неселективната абсорбция
основаваща се на е ф е к т а на Зееман.
П р о м я н а т а направена о т Massmann на
оригиналния дизайн на г р а ф и т н а т а пеш
предложена о т Аьвов, довежда до едно десе­
т и л е т и е на проблеми свързани с наличие­
т о на множество интерференции, кои тс
се д ъ л ж а т на невъзможност за контрол на
т е м п е р а т у р а т а на газовата фаза, незави­
симо о т т е м п е р а т у р а т а на изпарение
Аьвов предлага решение на проблема, коетс
в основата си се свежда до използването на
малка г р а ф и т н а платформа, известна
днес к а т о п л а т ф о р м а н а Львов.
З а в и с и м о с т т а между т е м п е р а т у р а т а
и времето в г р а ф и т н а т а пещ на Massmanr
е представена на фиг, 8.8.
При дадена т е м п е р а т у р а с ъ о т в е т н а н а ес­
т е с т в о т о н а п р о б а т а и м а т р и ц а т а , изследва­
н и я т е л е м е н т се а т о м и з и р а и възниква абсорб
ционен сигнал ( п р е д с т а в е н вляво н а ф и г у р а т а )
При а т о м и з а ц и я н а същия е л е м е н т със съща
т а к о н ц е н т р а ц и я , но в друга проба с различш
м а т р и ц а , а т о м и з а ц и я т а може да с т а н е при по
ниска или по-висока т е м п е р а т у р а . Това води дс
и з м е с т в а н е н а абсорбционния сигнал по оспи
н а в р е м е т о . Освен т о в а абсорбционният сиг
нал зависи о т в р е м е т о н а п р е с т о й на образува
л и т е се свободни а т о м и в хода н а лъча, т . е . on
т е м п е р а т у р а т а н а г а з о в а т а фаза. Това води дс
получаване н а различни абсорбционни сигнал!.

Фиг. 8.8. Зависимост между т е м п е р а т у р а т а и
времето при атомизация о т с т е н а т а на гра­
ф и т н а т а тръбичка и о т п л а т ф о р м а т а на Львов
при изследване на една и съща концентрация
о т даден елемент и важи к а к т о при измерване
на височината, т а к а и на п л о щ т а на пика. При
забавяне на изпарението и а т о м и з а ц и я т а , до­
к а т о т р ъ б и ч к а т а достигне т е м п е р а т у р н о рав­
новесие (атомизация о т платформа на Львов,
пика вдясно на фигурата), лекото изместване
на пика вляво или дясно няма да промени ин­
тегрирания абсорбционен сигнал. При т о в а про­
мените в с ъ с т а в а на м а т р и ц а т а повлияват са­
мо ш и р и н а т а или височината на пика, без да се
о т р а з я в а т на интегрирания абсорбционен сиг­
нал, И з о т е р м и ч н и т е условия в п е щ т а се пос­
т и г а т благодарение на п л а т ф о р м а т а на Львов.
Г р а ф и т н а т а тръбичка се загрява о т електри­
ческия т о к минаващ през нея, а п л а т ф о р м а т а
на Львов - индиректно в р е з у л т а т на лъчение­
т о о т с т е н и т е на г р а ф и т н а т а тръбичка. В ре­
з у л т а т п л а т ф о р м а т а се загрява по-бавно о т
т р ъ б и ч к а т а (закъснение с няколко секунди).
През т о з и интервал о т време се дава възмож­
ност на г р а ф и т н а т а тръбичка и инертния газ
в нея допълнително да се н а г р е я т и т я х н а т а
т е м п е р а т у р а да се стабилизира. Следователно
създадената о т п л а т ф о р м а т а лаг-фаза поз­
волява ц я л а т а с и с т е м а да достигне т е м п е р а ­
турно равновесие преди изследвания елемент да
се атомизира. Редица проучвания показват, че
при т е з и условия е налице значително намале­
ние на м а т р и ч н и т е интерференции.
А б с о р б ц и о н н и т е сигнали, к о и т о се полу­
ч а в а т в г р а ф и т н а т а п е щ с а много бързи.
Това н а л а г а и з п о л з в а н е т о н а б ъ р з а диги­
т а л н а е л е к т р о н и к а з а проследяване н а аб­
сорбционния профил. И о - с т а р и т е а т о м н о
абсорбционни с п е к т р о ф о т о м е т р и с а пред­
назначени з а п о с т о я н н и сигнали генерира­
ни в п л а м ъ к и з а т о в а с а с к о н с т а н т а з а
бреме р я д к о под 1 s. В с ъ в р е м е н н и т е а п а р а ­
т и корегирания сигнал се получава з а време
около 16 ms. И з м е р в а н е т о н а п л о щ т а н а
п и к а т . е . и з п о л з в а н е т о н а и н т е г р и р а н и аб­
сорбционни сигнали (A.s) осигурява т о ч ­
н о с т т а на р е з у л т а т и т е . И н т е г р и р а н и я т
сигнал е с у м а о т и н д и в и д у а л н и т е сигнали
з а време избрано о т а н а л и т и к а . Т о ч н о с т ­
т а н а и н т е г р и р а н и я сигнал зависи о т с т а ­
б и л н о с т т а н а б а з и с н а т а линия. П о - с т а р и -
т е АА а п а р а т и не п р и т е ж а в а т възмож­
н о с т з а к о н т р о л н а б а з и с н а т а линия, пора­
ди к о е т о се п о л у ч а в а т много невъзпроизво-
дими р е з у л т а т и при измерване п л о щ т а н а
пика. И н т е г р а ц и я т а н а сигнала е много съ­
щ е с т в е н е л е м е н т н а STPF. Ако з а п о с т р о я ­
в а н е н а к а л и б р а ц и о н н а т а крива се ползва
в и с о ч и н а т а н а пика, се п о л у ч а в а т погреш­
ни р е з у л т а т и независимо о т т о в а , че се
п р и л а г а т всички о с т а н а л и е л е м е н т и н а
STPF.
И з п о л з в а н е т о н а химична модификация
н а м а т р и ц а т а е с ъ щ е с т в е н а ч а с т н а STPF.
М о д и ф и к а ц и я т а е н а л о ж и т е л н а при пове­
ч е т о елементи. Ц е л т а е т я х н о т о стаби­
лизиране до к а т о се д о с т и г н а т и з о т е р м и ч ­
ни условия в п е щ т а . З а д а м о ж е с и с т е м а т а
д а се доближи до т е о р е т и ч н и т е условия е
необходимо изследвания е л е м е н т д а не
реагира с г р а ф и т н а т а тръбичка, к о е т о
н а ла г а и з п о л з в а н е т о н а високачествени пи-
р о л и т н о п о к р и т и г р а ф и т н и тръбички. С
б ъ р з о т о н а г р я в а н е н а т р ъ б и ч к и т е (Maxi­
m a l power heating) се цели п о с т и г а н е н а
и з о т е р м и ч н о с т по о с т а н а т р ъ б и ч к а т а
преди д а се е а т о м и з и р а л изследвания еле­
м е н т о т платформата, т ъ й к а т о центъ­
р ъ т н а т р ъ б и ч к а т а се з а г р я в а по-бързо
о т к о л к о т о к р а и щ а т а й. В п р о т и в е н случай
възникват интерференции.
О т т е о р е т и ч н а гледна т о ч к а , з а д а се по­
лучи м а к с и м а л н а ч у в с т в и т е л н о с т , а т о м н и ­
т е пари т р я б в а д а н а п у с н а т г р а ф и т н а т а
т р ъ б и ч к а със с к о р о с т , зависеща е д и н с т в е ­
но о т д и ф у з и я т а н а г а з о в е т е . Е т о защо по
в р е м е н а а т о м и з а ц и я т а т р я б в а д а се спре
в ъ т р е ш н и я п о т о к н а и н е р т н и я г а з (газ-
стоп).
При о п т и м и р а н е н а всички посочени до­
с е г а условия м о г а т д а б ъ д а т о т с т р а н е н и
н е с п е к т р а л н и т е и н т е р ф е р е н ц и и , но спек
т р а л н и т е и н т е р ф е р е н ц и и в най-добрия
случай с а м о се н а м а л я в а т . П ъ л н о т о осво­
б о ж д а ва н е н а анализа о т и н т е р ф е р е н ц и и
215
о с т а в а да зависи о т използваната корек­
ция на неселективната абсорбция. Основ
н и т е начини за т а з и цел, т е х н и т е предим­
с т в а и н е д о с т а т ъ ц и вече бяха разгледани.
Прилагането на Зееманова корекция прави
анализа независим о т размера и х а р а к т е р а
на неселективната абсорбция.
ЕМИСИОННА АТОМНА
СПЕКТРОМЕТРИЯ
Емисионна пламъкоВа
фотометрия
Принципно устройство и действис.
Основните елементи на един пламъков фо-
т о м е т ъ р са представени на фиг. 8.9.
Процеп Процеп
I Фотомножител
Призма
Решетка
Монохроматор
Проба
Фиг. 8.9. Основни елементи на пламъков фотометър
Атомизатор. Служи за а т о м и з и р а н е на
пробата. Последната под ф о р м а т а на раз­
т в о р се аспирира чрез п о т а п я н е долния
край на капилярна тръбичка в р а з т в о р а на
пробата. Създаденото о т р и ц а т е л н о наля­
гане о т въздуха, к о й т о минава покрай гор­
ния край на капилярната тръбичка образу­
ва вакуум осъществяваш засмукването на
разтвора. При с м е с в а н е т о на р а з т в о р а на
п р о б а т а с въздуха се образува фин аерозол.
Топлината на пламъка предизвиква а т о м и ­
зиране на п р о б а т а к а к т о вече бе описано
при ААС.
При определяне на алкални м е т а л и (К,
Na и Li) обикновено к а т о горивен газ се из­
ползва пропан, а к а т о окислителен - въз­
дух. Т е м п е р а т у р а т а на пламъка е около
1950оС.
Монохроматор. М о н о х р о м а т о р ъ т изолира
216
с в е т л и н а т а излъчвана само о т изследва­
ния е л е м е н т , к о я т о след т о в а попада вър­
ху д е т е к т о р а . К а т о монохроматор м о г а т
да се използват интерференционни филт­
ри, призма или дифракционна р е ш е т к а .
Най-често се използват интерференционни
филтри. Понеже при пламъковата ф о т о ­
м е т р и я се използва в ъ т р е ш е н с т а н д а р т ,
т о обикновено има два монохроматора.
Е д и н и я т изолира с п е к т ъ р а на вътрешния
с т а н д а р т , а д р у г и я т с п е к т ъ р а на изслед­
вания е л е м е н т . Обикновено калий и н а т ­
рий се о п р е д е л я т едновременно. В т а к ъ в
случай има т р и монохроматора.
Светлинен детектор. При пламъковите
ф о т о м е т р и използвани в клиничните лабо-
р а т о р и и за изследване на Na + , К + и Li +
Усилвател
Детектор Отчитащо
устройство
обикновено се у п о т р е б я в а т фотоклетки, а
не ф о т о м н о ж и т е л .
Отчитащо устройство. То се калибрира д а
о т ч и т а направо к о н ц е н т р а ц и я т а на изс­
ледвания е л е м е н т в с т а н д а р т а , контролния
серум и п р о б а т а . В ъ т р е ш н и я т с т а н д а р т
се засмуква с п о с т о я н н а с к о р о с т заедно с
калибрационния р а з т в о р и п р о б а т а . Кон­
ц е н т р а ц и я т а на изследвания е л е м е н т в про­
б а т а се изчислява о т о т ч и т а щ о т о у с т ­
р о й с т в о по с л е д н а т а формула:
Концентрация = ЕпГоЛ./ЬЯкт1Н.и1(.мгт,нвярП1
на пробата р /р
^ с т а н д а р т ' ^Оъгарешен с т а н д а р т
Е - емисионен и н т е н з и т е т
С - концентрация
П о д г о т о в к а н а п р о б а т а . Определянето
на н а т р и й и калий 6 биологични т е ч н о с т и
с т а в а чрез разреждане н а последните с
р а з т в о р съдържащ д е т е р г е н т в ниска кон­
ц е н т р а ц и я и в ъ т р е ш е н с т а н д а р т обикно­
вено л и т и й . В ъ т р е ш н и я т с т а н д а р т се из­
ползва, з а д а се к о р е г и р а т к о л е б а н и я т а в
т е м п е р а т у р а т а н а пламъка или с к о р о с т ­
т а н а засмукване н а р а з т в о р а . Ако болни­
я т е н а л и т и е в а т е р а п и я и е необходимо да
се определи к о н ц е н т р а ц и я т а н а л и т и я , т о
к а т о в ъ т р е ш е н с т а н д а р т може да се из­
ползва цезий. И н т е н з и т е т ъ т н а с в е т л и н а ­
т а , к о я т о се излъчва о т изследвания еле­
м е н т и в ъ т р е ш н и я с т а н д а р т зависи о т
броя н а т е х н и т е а т о м и в основно с ъ с т о я ­
ние в пламъка. Всеки п ъ т , к о г а т о се зас­
муква р а з т в о р н а п р о б а т а се р е г и с т р и р а т
два сигнала - е д и н и я т н а изследвания еле­
м е н т , а другият на вътрешния с т а н д а р т .
О т н о ш е н и е т о н а и н т е н з и т е т а н а емисия­
т а на п р о б а т а и е м и с и я т а на вътрешния
с т а н д а р т се използва з а изчисляване кон­
ц е н т р а ц и я т а н а изследвания е л е м е н т в
пробата.
В ъ т р е ш н и я т с т а н д а р т т р я б в а да о т ­
говаря н а с л е д н и т е изисквания:
• да не се съдържа в и з с л е д в а н а т а проба,
• е н е р г и я т а н а възбуждане н а в ъ т р е ш н и я
с т а н д а р т т р я б в а д а е близка до т а з и н а
изследвания е л е м е н т - по т о з и начин
п р о м е н и т е в т е м п е р а т у р а т а н а плъмъ-
ка ще п о в л и я в а т еднакво изследвания
елемент и вътрешния с т а н д а р т ,
• емисионните линии н а в ъ т р е ш н и я с т а н ­
д а р т и изследвания е л е м е н т т р я б в а да
са добре разграничени.
А н а л и т и ч н и п р о б л е м и . О с н о в н и т е ана­
литични проблеми с а свързани с т е м п е р а ­
т у р а т а н а пламъка, а т о м и з а т о р а , с някои
замърсявания и/или о т л а г а н е н а б е л т ъ к .
Температура на пламъка. Т е м п е р а т у р а т а
на пламъка т р я б в а д а се поддържа п о с т о ­
янна чрез правилен подбор н а п о т о к а н а го­
ривния и окислителния газ. К о л е б а н и я т а в
о т н о ш е н и е т о горивен/окислителен газ
в о д я т до промени в т е м п е р а т у р а т а н а
пламъка и с ъ о т в е т н а промяна в броя н а
възбудените а т о м и . Н а м а л е н и е т о на броя
възбудени а т о м и намалява ч у в с т в и т е л ­
н о с т т а и о б р а т н о . При много висока т е м ­
п е р а т у р а н а с т ъ п в а йонизация н а а т о м и ­
т е и с ъ о т в е т н о намаление н а ч у в с т в и т е л ­
н о с т т а , т ъ й к а т о йонизираният е л е м е н т
излъчва с в е т л и н а с различна дължина н а
вълната.
Атомизатор. С к о р о с т т а н а засмукване на
р а з т в о р а т р я б в а правилно да се контроли­
ра. При голяма с к о р о с т н а засмукване се
понижава т е м п е р а т у р а т а н а пламъка и по
г о р е л к а т а се о т л а г а т соли. П р о с в е т ъ т н а
к а п и л я р н а т а т р ъ б и ч к а при продължител­
н а у п о т р е б а ч а с т и ч н о се запушва и з а т о в а
т р я б в а периодично да се почиства (отпуш­
ва).
Замърсявания. Замър ся ван ето на използва­
н а т а вода и съдове с н а т р и й или калий води
до получаване на грешни р е з у л т а т и . Циа-
н и д н и т е съединения и з л ъ ч в а т подобна
с в е т л и н а к а к т о изследваните елементи,
к о е т о води до повишение и н т е н з и т е т а на
и з м е р в а н а т а с в е т л и н а и погрешни резул­
тати.
Отлагане на белтък. С т е ч е н и е на време­
т о с е р у м н и т е б е л т ъ ц и може да се о т л о ­
ж а т и п о к р и я т о т в ъ т р е с т е н и т е на а т о ­
м и з а т о р а . Ако а т о м и з а т о р ъ т не се почис­
т в а редовно с п о ч и с т в а щ р а з т в о р образу­
в а н и я т б ел тъчен налеп може да доведе до
получаване на грешни р е з у л т а т и .
Емисионна спсктроскопия
с uiKjykmuBiio с в ъ р з а н а п л а з м а
При е м и с и о н н а т а спектроскопия с индук­
т и в н о свързана плазма (ICP) за атомизира-
не н а п р о б а т а и възбуждане на а т о м и т е се
използва т о п л и н а т а н а аргонова плазма.
В и с о к а т а т е м п е р а т у р а н а аргоновата
плазма подобрява ч у в с т в и т е л н о с т т а за
р е ф р а к т е р н и т е е л е м е н т и и премахва хи­
м и ч н и т е интерференции. К а к т о при пла-
мъковия ф о т о м е т ъ р и т у к не се използват
лампи. К о м п ю т е р и з а ц и я т а н а м е т о д а поз­
волява да се определят едновременно голям
брой елементи. Г р а н и ц а т а н а откриване
при използване на ICP за повечето елемен­
т и е сравнима с т а з и на п л а м ъ ч н а т а ААС.
Само за р е ф р а к т е р н и т е елементи т я е по-
добра и се доближава до т а з и на E l ААС.
217
Емисионна с п е к т р о с к о п и я
с индуктивно свързана
плазма-мас с п е к т р о м е т р и я (ICP-MS)
При ICP-MS индуктивно с в ъ р з а н а т а плаз­
ма се използва за получаване на йони, кои­
т о п о с т ъ п в а т в мас с п е к т р о ме т ър , къде­
т о се разделят според т я х н а т а маса и
електрически т о в а р и се определят инди­
видуално.
Основните предимства на ICP-MS се из­
р а з я в а т в изключително висока чувстви­
т е л н о с т комбинирана с голяма бързина на
КНИГОПИС
Прайс В: Лналитическая атоммо-абсорбционмая спектроско­
пия, Москва, Мир, 1976.
Хавезов И., Цалсв Д: Лтомно-абсорбпионен анализ, С., Нау­
ка и изкуство, 1980.
Хавезов И, Цалев Д: Безпламъкови методи на атомно-абсор-
бпионен анализ, София, Унив.изд. "Св. Кл. О х р и д с к и ,
1991.
Цачев КН: Рационализиране на изследването на олигоеле-
менти в клиничната лаборатория, София, Дисертация,
1993.
218
анализа. За повечето елементи границата . ß i
на откриване с ICP-MS е сравнима или по-
добра о т т а з и на ЕТААС.
ICP-MS не е спектроскопски м е т о д и за­
т о в а при него не се наблюдават спектрал­
ни интерференции. При него м о г а т да се
наблюдават интерференции в р е з у л т а т на
припокриване на м а с и т е поради присъст­
в и е т о на други изотопи, но т е м о г а т да се Гf s :
контролират. Основен н е д о с т а т ъ к на ме­ - а
т о д а засега о с т а в а високата цена на апа­
ратурата.
Anderson SC, Cockayne S; Clinical Chemistry. Concepts and
Applications, Philadelphia etc., W B Saunders, 1993.
Beaty R D , Kerber JD & Concepts, instrumentation and tech­
niques in atomic absorption spectrophotometry, Norwalk,
Perkin Elmer, 1993.
Slavin W. Graphite furnace A S S . A source book, Norwalk, Perkin
Elmer, 1984.
Welz B. Atomic absorption spectrometry (2 ,K) ed). Weinheim, V C H
Publishers, 1985.
 Молекулна емисионна
снектроскопия
Луминесцентен анализ
А. Ц о н ч е в а
СЪЩНОСТ И ПРИНЦИП НА АНАЛИЗА
ВИДОВЕ ЛУМИНЕСЦЕНЦИЯ
Луминесцентните аналитични методи
включват измервания н а ф л у о р с с ц с н ц и л
(флуори^мстрнл) и ф о с ф о р с с ц с н ц и я . Те
и м а т широка о б л а с т н а приложение: за
идентификация на вещества, а н а л и з н а
протичащи х и м и ч н и реакции, откриване и
количествено определяне на ниски концен­
трации на вещества.
Л у м и и е с ц е п ц и я т а е физико-химич-
но яВление, к о е т о с е х а р а к т е р и з и р а с
излъчВаие н а е В е т л и н а или л ъ ч и с т а
енергия, к о г а т о е л е к т р о н с е Връща о т
по-Високо В п о - н и с к о е н е р г е т и ч н о
киВо. Въпреки че л у м и н е с ц е н т н и т е явле­
ния се р а з л и ч а в а т по начина, по к о й т о елек­
т р о н ъ т се а к т и в и р а до възбудено с ъ с т о я ­
ние, р е з у л т а т ъ т е един и същи - светлинно
излъчване (емисия) и л и лъ ч и с т а енергия.
Абсорбцията н а с в е т л и н н а т а енергия о т
възбудена молекула с т а в а в д и с к р е т н и
единици или кванти. Е н е р г и я т а н а един
к в а н т с в е т л и н а се изразява по ф о р м у л а т а :
е = hv или Е = hc/X,
Е - енергия
h - Планкова к о н с т а н т а 6.63x10 ' erg/s
V- ч е с т о т а
с - скорост на светлината
У. - дължина на вълната
Всеки а т о м или молекула п р и т е ж а в а
т о ч н о определени е н е р г е т и ч н и нива, в кои­
т о може да с ъ щ е с т в у в а (Ео, Е^ Е2, Е 3 . . . ) . Най-
н и с к о т о о т т я х (Ео) о т г о в а р я н а нор­
м а л н о т о с ъ с т о я н и е , а във всички о с т а н а л и
нива т е м о г а т да п р е м и н а в а т след к а т о
б ъ д а т възбудени - т . е . к о г а т о в т я х се вне­
се необходимо количество енергия. Погъл­
н а т о т о количество енергия (Е) не е произ­
волно, а с т р о г о определено и винаги еднакво
при п о с т о я н н и условия. П о с т о я н н и са и
р а з л и к и т е м е ж д у е н е р г е т и ч н и т е нива,
напр. Е! - Е0, Eg - Ej и т . н . С т о й н о с т т а на
е н е р г е т и ч н о т о ниво при възбудено с ъ с т о ­
яние е: Е, = Е 0 + Е
А к т у а л н и я т брой молекули във възбуде­
но с ъ с т о я н и е при т и п и ч н и реакционни ус­
ловия и възбуждане с обичайния източник
н а с в е т л и н а о т 220 W е много малко и
п р е д с т а в л я в а около 10"13 mol за mol флуо-
рофор. Веднъж възбудена молекулата може
да се върне към обичайното си енергийно
ниво по различни начини:
• нерадиационно вибрационно уравновеся­
ване;
• флуоресценция;
• погасяване н а възбуждането;
• нерадиационно к р ъ с т о с в а н е н а т р и -
п л е т н о състо я н и е;
• погасяване н а първо т р и п л е т н о ниво;
• фосфоресценция.
Освободената енергия увеличава енерги­
я т а н а п о с т ъ п а т е л н о т о д ви ж ен и е н а
ч а с т и ц и т е н а в е щ е с т в о т о , предизвиква
п р о т и ч а н е н а х и ми чн и процеси или се
излъчва к а т о л у м и н е с ц е н т н а с в е т л и н а .
С в о й с т в о т о н а ня/сои т е ч н и и л и
твърди всщсства или техните
р а з т в о р и д а с в е т я т , к о г а т о с е въз-
6ijjk(/aт п р и о б и к н о в е н а т е л т е р а т у -
р а , с е н а р и ч а л у л т н е с ц е н ц и я . Кван-
т и т е , к о и т о даден а т о м или молекула по­
г л ъ щ а т и след т о в а излъчват са с т о ч н о
определени с т о й н о с т и и са характерни за
всеки един о т т я х . На т а з и база е изграден
п р и н ц и п ъ т на качествения и количествен
луминесцентен анализ.
В зависимост о т н а ч и н а н а в ъ з б у Л
q a n c л у л ъ и н е с ц е н ц и я т а е няколко вида.
>• ф о т о л у л г и н е с ц с н ц и я - възбуждане о т
к в а н т о в о лъчение;
>• Е л е к т р о л у м и н с с ц е н ц и я - възбуди­
т е л е п о т о к о т наелектризирани час-
219
 пищи - електрони, йони;
> Хелтлултпесцепция възбудител е
химична реакция.
Според л t с х п н и з л т н а и з л ъ ч в а н е л у -
л ш н е с ц е н ц и я т а се разделя на:
> фосфоресцеп ц ия и
>• ф л у о р е с ц е н ц и я .
фосфоресценция. При т о з и процес възбу­
дените молекули не се връщат веднага и на­
право в нормалното си състояние, а след
някакво време, ч и я т о продължителност
зависи о т с в о й с т в о т о на в е щ е с т в о т о и
т е м п е р а т у р а т а му. Тук процесът на излъч­
ване настъпва по-късно след възбуждането.
Поради т а з и причина фосфоресценцията
продължава и след като престане действи­
ето на възбудителя, от порядъка дори на
часове, фосфоресценцията в т е ч н и раз­
твори при с т а й н а т е м п е р а т у р а се на­
блюдава извънредно рядко. По правило т я се
наблюдава в твърда среда (кристали) или
при ниски температури. Фосфоресценция­
т а показва по-дълго изместване на излъ­
чената X о т т а з и при флуоресценцията.
Елиминационното време или гаснене при
фосфоресценцията е по-дълго (10"4 за 100 s),
о т к о л к о т о в р е м е т о за гаснене на флуо­
ресцентната емисия. То се изразява с про­
мяна във времето о т няколко порядъка (на
величината X) в зависимост о т вида на мо­
лекулата и разтвора, който я обкръжава.
Ф л у о р е с ц е н ц и я . При флуоресценцията
молекулата на веществото след много късо
време прекарано във възбудено състояние се
връща направо в нормалното си състояние.
Процесът на излъчването настъпва почти
непосредствено след поглъщането, к а т о
т о з и интервал е много къс - о т порядъка на
10 8 s. Затова при флуоресценцията след спи­
ране на действието на възбудителя се пре­
късва и флуоресцентното лъчение. Флуо­
ресценция се наблюдава в т е ч н а и твърда
среда, и даже в газове.
Флуоресценцията е най-често срещания
луминесцентен анализ при типичните ус­
ловия на реакциите, използвани о т клинич­
н а т а химия и се характеризира със свой­
с т в о т о да прехвърля частици. Както е по­
казано на фиг. 9.1, вибрационното урав­
новесяване преди флуоресценцията се проя-
220
Перадиатюниа енергия
ч /
Л
Ei
БС
0!
£
Ю
о. и
V
и
ю о
е Хг
G
фиг. 9.1. Принцип на флуоресценция
вява в известна загуба на възбуждаща енер­
гия. Следователно излъчената флуорес­
центна светлина има по-малко енергия и
по-голяма дължина на вълната, отколко­
то възбуждащата светлина. Разликата
между т а х Х на възбуждащата светлина и
m a x X на излъчващата флуоресценция
светлина е константна величина, опреде­
лена като и з л ъ ч е н о прелюстване. Тази
к о н с т а н т а се измерва с енергията, загу­
бена през времето на възбудено състояние
(нерадиационна вибрационна д е а к т и в а -
ция), преди връщане на изходно ниво Sq
(флуоресцентно излъчване или емисия).
Емисията на флуоресцентната светлина се
характеризира също и с бързо (10 8 s) гас­
нене.
Х и м и л у м и н е с ц е н ц и я (ХЛ) и б и о л у -
м и н е с ц е н ц и я (БЛ). Те се отличават о т
другите луминесцентни процеси по това, че
излъчената светлина е причинена о т хи­
мическа или електрохимическа енергия, а не
о т фотоилюминация. Физическото явление
на светлинна емисия при ХЛ и БЛ е подобно
на флуоресценцията по т о в а , че т я се
появява о т възбудено ниво и светлината се
излъчва, когато електронът се връща в
начално състояние. ХЛ включва окисление­
т о на органични съставки к а т о луминол, |Л0
изолуминол, акридинови естери или луцифе- 9(|
рин чрез окислители - напр. Н2О2, хипохло- -Oi
рид, или кислород. Светлината е излъчена ЕШ'
о т възбуден продукт, образуван при окис­
лителна реакция. Тези реакции се извърш
в а т в присъствие на катализатори, напр,
ензими (Аф, пероксидаза), метални йони или
метални комплекси (Cir + и Fe3 + , фотоциа-
нинов комплекс и хемин).
Биолуминесценцията е специална форма
 н а хемилуминесценция. При БЛ ензим или
ф о т о п р о т е и н увеличава п р о д у к ц и я т а н а
л у м и н е с ц и р а щ а т а реакция. Два примера за
биологична к а т а л и з а н а БЛ с а луциферин и
екворин. Р е а к ц и о н н а т а схема н а ХЛ и БЛ за­
почва о т п р о с т и е д н о с т ъ п а л н и реакции,
включващи напр. т а з и с адсиманил-1,2-дио-
ксетсим с у б с т р а т и с ДФ до по-комплексни
многостъпални реакции, к а к т о т а з и включ­
ваща глюкозо-6-фосфатдехидрогеназа и бак­
т е р и а л н а луцифераза, свързана с NADH-FMN
оксидоредуктаза. Приложението н а ХЛ и БЛ
се увеличава с а в т о м а т и з а ц и я т а и някои
нови реакционни с и с т е м и .
Е л е к т р о х е м и л у м и и е с ц е п ц и я Тя се
о т л и ч а в а о т ХЛ и БЛ по т о в а , че р е а к т и в ­
н и т е ч а с т и ц и , к о и т о п р о и з в е ж д а т ХЛ реак­
ция са електрохимично генерирани о т с т а ­
билни предшеств ен и ц и н а е л е к т р о д н а по­
върхност. ЕХЛ процеси с а д е м о н с т р и р а н и
за много различни молекули чрез няколко раз­
лични механизми, включващи окислително-
редукционен т и п р е а к ц и я с рутениум(11)
трис(бипиридил) и т р и п р о п и л а м и н .
ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ - ОСНОВНИ
ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ВЛИЯНИЯ
ВЪРХУ НЕЯ
В луминесцентния анализ се използва главно
ф о т о л у м и н е с ц е н ц и я т а н а в е щ е с т в а най-
ч е с т о в т е ч н о или р а з т в о р е н о с ъ с т о я н и е ,
т . е . флуоресценция. Някои о т о с н о в н и т е
закономерности н а т о з и процес включ ва т :
• З а к о н н а С т о к с - Л о м е л (1903 г) - излъче­
н а т а светлина (F) е в и н а г и с по-голяма дъл­
жина на в ъ л н а т а Л о т т а з и н а възбужда­
щата светлина /0^70 се излъчва и к а т о топ­
л и н а и к а т о фотохимични импулси). Т о з и
1 з а к о н f/affa н а й - в < и к н и т е з а в и с и л г о с т и
Mcjkgy абсорбцията и л у л т п с с ц с п т
п и я с п с к т ъ р п а в е щ с с т Н о п ю . Според
закона на Стокс-Ломел м а к с и м у м ъ т на
с п е к т ъ р а на излъчване винаги е п р е м е с т е н
в дълговълновата о б л а с т , в сравнение с мак­
симума в с п е к т ъ р а н а поглъщане ( т а к а }шр.
стоксово изместване). Този закон е валиден
само при определени гранични условия - абсо­
л ю т н а нула и поглъщане н а един ф о т о н . Ко­
г а т о т е м п е р а т у р а т а се о т л и ч а в а о т абсо­
л ю т н а т а нула, винаги е възможно комбини­
ране н а е н е р г и я т а н а к в а н т а с то п л и н н а
енергия н а молекулата и възникване на ан-
т и с т о к с о в о и зместван е (излъчване).
• Закон н а Николс и М е р и т (1931 г) - спек­
т р и т е на поглъщане и флуоресценция на да­
дено вещество притежават огледална си­
метрия.
Е ф е к т и в н о с т т а н а процеса н а преобразу­
ване н а в ъ з б у ж д а щ а т а енергия в енергия н а
флуоресценция се характеризира с величи­
н а т а к в а н т о в д о б и в - д е л т а (6). К в а п т о -
в и я т д о б и в е равен н а о т н о ш е н и е т о на
броя на излъчените при флуоресценцията
к в а н т и (фотони) - п е (излъчената Е в кван-
т и ) към броя на п о г ъ л н а т и т е при възбуж­
д а н е т о к в а н т и - п а (погълната Е в кванти):
<5 = "^
"а
• Въпросът за к в а н т о в и я добив е разрабо­
т е н подробно о т Вабилоб (1951 г). Той ус­
т а н о в я в а , че при силно разредени р а з т в о р и
с к о н ц е н т р а ц и я под 10"4-10'5 g / m l и н т е н ­
з и т е т ъ т н а ф л у о р есц ен ц и я та е пропор­
ционален на к о н ц е н т р а ц и я т а на флуоресци­
р а щ о т о вещество. Пад т а з и пределна кон­
ц е н т р а ц и я (С0) флуоресцентното лъчение се
увеличава все по-бавно, след к о е т о намалява
рязко т . е . н а с т ъ п в а с а л ю з а г а с я в а н е н а
ф л у о р с с ц с н ц и л т а . Това е едно о т основ­
н и т е положения, върху к о и т о е изграден ко­
личествения флуоресцентен анализ. Само-
загасяването не е т о ч н о изяснено, но се смя­
т а , че колкото к о н ц е н т р а ц и я т а е по-висо­
ка, т о л к о в а по-голям п р о ц е н т о т възбуде­
н и т е молекули се у д р я т в съседни молекули
и им п р е д а в а т п р и д о б и т а т а о т т я х енер-
гия под ф о р м а т а на кинетична енергия. По
т о з и начин ч а с т о т възбудените молекули
се в р ъ щ а т в нормалното си състояние без
да о т д е л я т к в а н т лъчение. Външно т о в а се
проявява к а т о части чн о загасване на флуо­
р е с ц е н ц и я т а и понижение н а к в а н т о в и я
добив.
ЗаИисимост на флуоресцентното
излъчване о т в р е м е т о
В р емето необходимо на една молекула да аб­
сорбира излъчена енергия и да достигне въз­
будено с ъ с т о я н и е е приблизително 10 s.
Времето за вибрационно изравняване на най-
221
ниско ниво на възбуждане е о т порядъка н а
10 14 go 1012 s. В р е м е т о необходимо за флуо­
ресцентно излъчване е 10 8-10 s. С други ду­
ми значително удължаване на в р е м е т о с т а ­
ва между абсорбирането на с в е т л и н н а т а
енергия, в р ъ щ а н е т о к ъ м н а й - н и с к о въз­
будено състояние и излъчването на флуорес­
ц и р а щ а т а с в е т л и н а . Н а фиг. 9.2 фаза I
представлява периода о т време между аб-
сорбцията на с в е т л и н н а т а енергия и нера-
диационната загуба на енергия при вибра­
ц и о н н о т о пренареждане и връщане к ъ м по-
ниско възбудено състояние. Този период е
представен о т насочени нагоре и надолу не-
п у н к т и р а н и с т р е л к и на д и а г р а м а т а . Фаза-
11 показва излъчването и з а г а с в а н е т о н а
флуоресценцията с к р а т к о (Ь) и продължи­
т е л н о (а) преживяване. Ако флуоресцентно­
т о излъчване е измерено след в р е м е т о след­
ващо пула на с в е т л и н а т а о т възбуждащия
и з т о ч н и к , напр. ксенонова лампа или лазер,
и н т е н з и т е т ъ т на излъчената светлина за-
гасва к а к т о процес о т първи порядък, подо­
бен на р а д и о а к т и в н о т о гаснене. В р е м е т о ,
необходимо на излъчената светлина да дос­
т и г н е 1/е о т своя начален и н т е н з и т е т (е -
основа на Naperian 2.303) е наречено в р е м е
н а флуоресцентното гаснене.
Времето задържано между а б с о р б ц и я т а
на к в а н т енергия и флуоресценция може да
се използва в и н с т р у м е н т и с ч у в с т в и т е л ­
н о с т подобна на т а з и на гама-броячи. Тези
и н с т р у м е н т и се н а р и ч а т ф л у о р и м е т р и .
Те се разделят на две к а т е г о р и и в зависи­
м о с т о т т о в а к а к се измерва излъчената
светлина: 1. П у л с о в и ф л у о р и м е т р и , п р и
И
Е
V ч
\ N
\ ь
ю" 1 0 " 10,J 1 0 " 1 0 " 1 0 , и 10 s
10' 10 10
Време (s)
Фиг. 9.2. Процес н а ф л у о р е с ц е н т н о п о г а с я в а н е
Е - абсорбция на енергия; I - фаза на дезактивация;
II - фаза на флуоресцентна емисия; а - продължително
флуоресцентно гаснене; b - кратковременно флуорес­
ц е н т н о гаснене
222
к о и т о п р о б а т а се о с в е т я в а със силна к р а т ­
к а с в е т л и н а и и н т е н з и т е т ъ т на получено­
т о флуоресцентно излъчване се измерва ка­
т о функция о т в р е м е т о с бързо о т ч и т а щ а
с и с т е м а и 2. Ф а з о в и фотолгетри, при кои­
т о п о с т о я н н о вълнов лазер о с в е т я в а проба­
т а и флуоресцентния емисионен о т г о в о р е
м о н и т о р и р а н в импулс и ч е с т о т е н о т г о в о р .
Зависимост между концентрация и
сила н а ф л у о р е с ц е н т н о т о излъчВане
З а в и с и м о с т т а между к о н ц е н т р а ц и я т а и
и н т е н з и т е т а на ф л у о р е с ц е н т н о т о излъч­
ване може да се получи о т закона на Beer-
Lambert:
abc
I/Io= Ю
I - и н т е н з и т е т на подадената светлина
10 - е силата на случайната светлина
а - поглъщаемост
b - п ъ т на светлината
с - концентрация на абсорбентите
К о л и ч е с т в о т о на абсорбираната светли­
на може да се изчисли о т преобразуването
на г о р н а т а формула:
1 < ) -1 = 1 о (1-10 аЬ<: )
Ф л у о р е с ц е н т н а т а и н т е н з и в н о с т F е про­
порционална на к в а н т абсорбирана светли­
на и добива на излъчената светлина, изразе­
но в у р а в н е н и е т о :
аЬс
F = 0 1(1-10 )
F - о т н о с и т е л е н добив
0 - ф л у о р е с ц е н т е н добив ( о т н о ш е н и е т о м е ж д у
к в а н т излъчена с в е т л и н а и к в а н т абсорбирана
светлина)
10 - начален и н т е н з и т е т н а в ъ з б у ж д а н е
а - моларна п о г л ъ щ а е м о с т
b - о б е мна ч а с т , определена о т г е о м е т р и я т а н а
п р о ц е п и т е за в ъ з б у ж д а н е и е м и с и я
с - к о н ц е н т р а ц и я в mo l / 1 .
Флуоресценцията се излъчва във всички
посоки, но се измерва само п р е м и н а л а т а
през емисионния процеп. След л о г а р и т м и ч н о
10 10 преобразуване ф о р м у л а т а придобива след­
н и я вид:
F = 0 ^ (2.3abc)
Ф о р м у л а т а показва, че ф л у о р е с ц е н т н а т а
и н т е н з и в н о с т е право пропорционална н а
 юнцентрацията на флуорофора и интензи-
п е т а на възбуждане. На практика флуорес­
центните измервания са изразявани ч е с т о
]о т н о с и т е л н и и н т е н з и т е т н и е д и н и ­
ци, т ъ й к а т о измерването на и н т е н з и т е -
па не е абсолютно количество. Това е малка
ш е т о т о б щ о т о флуоресцентно излъчване
j величината зависи о т ширината на проце-
ia на и н с т румент а, ч у в с т в и т е л н о с т т а на
детектора, е ф е к т и в н о с т т а на монохро-
viamopa и и н т е н з и т е т а на излъчването,
ф л у о р е с ц е н т н и т е измервания ч е с т о се
азразяват и в е д и н и ц и н а к о н ц е н т р а ц и л
ipu условие, че с и с т е м а т а е изчислена спря­
но количество на флуоресциращи референт-
4U материали.
Химитирапе
Ина ф л у о р е с ц е н т н и т е и з м е р б а н и л
Фактори, коит о влияят на флуоресцент-
iume замервания включват концентрацион­
ни ефекти {напр. вътрешнофилтров ефект
и концентрационно гасене), разтворителни
зфекти {напр. интерференция на неспеци-
шфична флуоресценция и гасене от разпгвори-
теА), ефект о т пробите {напр. разсейване
на светлината, интерферираща флуорес­
ценция и абсорбция от пробата), темпера-
пурен ефект и избледняващ ефект (фотораз-
лагане на пробата).
Вътрефилтров ефект. Линейната зави­
симост между концентрация и флуорес­
центно излъчване се задържа толкова дълго,
колкото р а з т в о р и т е се у п о т р е б я в а т за аб-
зорбиране на по-малко о т 2% о т възбуж­
д а щ а т а светлина. Колкото абсорбцията на
разтвора се увеличава над т о в а количество,
отношението с т а в а нелинейно. Този фено­
мен се нарича в ъ т р е ф и л т р о в е ф е к т и е
причинен о т загуба на и н т е н з и т е т на въз­
б у ж д а н е при преминаване на с в е т л и н а т а
• през к ю в е т а т а , т ъ й к а т о възбуждащата
светлина е абсорбирана о т флуорофора.
Вътрефилтровият ефект не е проблем при
много клинични изследвания понеже повече
| флуоресцентни замервания се правят в мно­
го разредени разтвори.
Концентр а цио н н о п о г а с я в а н е . Друг фе­
номен, свързан с р е з у л т а т и в по-нисък коли­
ч е с т в е н добив о т очаквания, се нарича
к о н ц е н т р а ц и о н н о п о г а с я в а н е . То може
да се получи, когато макромолекула (анти­
тяло) е обилно маркирана с флуорофор напр.
флуоресцин изотиоцианат (FITC). Когато
т о в а съединение се възбуди, флуоресцира­
щ и т е маркери са пространствено толкова
близо, че нерадиационната енергия не може
да се пренесе. Така получената флуоресцен­
ция е много по-ниска отколкото очакваната
концентрация на маркера.
С в е т л и н н о р а з с е й в а н е . Светлинно
разсейване се проявява, когато светлинна­
т а енергия се сблъска с молекулите в раз­
твора и разсейва светлината във всички по­
соки. Порция о т т а з и разсеяна светлина мо­
же да влезе във ф о т о д е т е к т о р а и т а к а да
спомогне за образуване на фонов „шум". Тази
интерференция води до загуба на чувстви­
т е л н о с т , дължаща се на фоновото разсей­
ване.
И з л ъ ч в а н о р а з с е й в а н е . То може да се кон­
тролира чрез използване на добре дефини­
рано възбуждане и емисионни интерфе-
риращи филтри или чрез използване на моно-
хроматорни прибори или поларизатори. Ро-
лшновото разсейванеьлоке да се контролира
чрез осигуряване на по-отдалечени дължини
на вълните на възбуждащата и излъчената
светлина за избягване на разсейването. Кон­
т р о л ъ т може да се осъществи и чрез с т е с ­
няване процепа на възбуждащия монохро-
матор. Въпреки т о в а и в д в а т а случая е въз­
можно да се намали чувствителността.
В л и я н и е н а pH в ъ р х у ф л у о р е с ц е н ц и я ­
т а . Когато pH на разтворите се променя,
т о в а води до промяна в и н т е н з и т е т а и въл­
новия характер на флуоресценцията. Явле­
н и е т о има сложен характер и не е напълно
изяснено. За всяко отделно вещество зави­
с и м о с т т а има специфичен характер. Зато­
ва е необходимо да се съобразява pH на раз­
т в о р и т е за с ъ о т в е т н о т о вещество.
Влияние п а р а з т в о р и т е л и т е върху
флуоресценцията. По отношение на т е ч
н и т е разтворители, флуоресцентните ве­
щества се разделят на две групи.
А) Въглеводородите запазват непромене­
ни флуоресцентните си спектри в различни
223
разтворители.
Б) При всички о с т а н а л и органични съе­
динения флуоресиентните с п е к т р и з а в и с я т
о т р а з т в о р и т е л я (влияе диполния м о м е н т ,
киселия х а р а к т е р , допълнителния кислород
и а з о т в молекулите им).
Влияние н а г а с и т е л и Върху ф л у о р е с ­
ц е н ц и я т а . Различни в е щ е с т в а внесени чрез
р а з т в о р и т е л и или р е а к т и в и в р а з т в о р а н а
изследваното вещество п р и ч и н я в а т гасене
на флуоресиенцията. За да се у с т а н о в и (при
съмнение) дали и з с л е д в а н и я т р а з т в о р н а
в е щ е с т в о т о съдържа или не г а с и т е л и се
провежда т е с т . П р и г о т в я т се серия раз­
т в о р и на в е щ е с т в о т о с к о н ц е н т р а ц и я под
10"4 g/ml. Ако п р о п о р ц и а л н о с т т а между ин­
т е н з и т е т а на флуоресценцията и концен­
т р а ц и я т а е нарушена, т о в а е признак з а
присъствие на гасители. Г а с и т е л е напр. Ог-
Влияние н а ф л у о р е с ц е н т н и п р и м е с и .
Те са източници на п а р а з и т е н фон и т р я б в а
да се о т с т р а н я т о т р а з т в о р и т е л и т е или
реактивите. Пречистването на разтвори­
т е л я се провежда дотогава, д о к а т о след два
следващи един след друг еднакви с т а д и и н а
процедурата не се о т ч и т а понижение н а
флуоресценцията. П о н а с т о я щ е м се произ­
в е ж д а т ч и с т и з а ф л у о р е с ц е н т е н анализ
реактиви, к о и т о г а р а н т и р а т т о ч н о коли­
чествено о т ч и т а н е .
Връзка м е ж д у ф л у о р е с ц е н ц и я т а и м о ­
л е к у л н а т а с т р у к т у р а . При органичните
съединения флуоресценцията се определя о т
наличието на: затворени въглеродни пръс­
тени, спрегнати двойни връзки, проява на
мезомерия и тавтомерия, молекулна си­
метрия (напр. а р о м а т н и въглеводороди,
стероли, хинин, акридин и др). Б р о я т н а
неорганичните съединения, к о и т о флуорес­
ц и р а т в р а з т в о р е ограничен. Такива са йо­
н и т е на редки м е т а л и - напр. л а н т а н и д и .
Кюветен материал и разтВороВ
е ф е к т . Някои кварцови с т ъ к л а и п л а с т м а ­
сови материали, к о и т о с ъ д ъ р ж а т ултравио­
л е т о в и абсорбенти, флуоресцират. Също
т а к а някои р а з т в о р и т е л и к а т о е т а н о л , мо­
г а т да предизвикат ч у в с т в и т е л н а флуорес­
ценция. Следователно, к о г а т о се извършва
флуоресцентно определяне е важно д а се
224
провери ф о н о в а т а флуоресценция на всичк
к о м п о н е н т и н а р е а к ц и о н н а т а смес. Пред
л а г а т се специален клас р а з т в о р и т е л и с ми
нимална флуоресцентна емисия. Погасяван
о т р а з т в о р и т е л я може също да бъде прс
блем и т р я б в а да се изследва, к о г а т о се при
лага нов а н а л и т и ч е н м е т о д . П о г а с я в а н е т
е свързване с взаимодействие н а флуорофор
с р а з т в о р а или с р а з т в о р е н о т о вещество
р а з т в о р а . Подобно взаимодействие води д
загуба н а флуоресценция поради енергие;
т р а н с ф е р или по друг механизъм, без да с
повлиява а б с о р б ц и о н н и я с п е к т ъ р н;
флуорофора.
Е ф е к т н а п р о б н и я м а т р и к с . Серумъг
или у р и н а т а с ъ д ъ р ж а т много компоненгт
к о и т о флуоресцират, поради к о е т о проб
н и я т м а т р и к с е потенциален и з т о ч н и к н
нежелана фонова флуоресценция. Този ефекг
може да бъде у с т а н о в е н при р а з р а б о т в а н
н а нов м е т о д . По-сериозни причинители н
нежелана флуоресценция са протеините
билирубинът. Тъй к а т о б е л т ъ ч н и я т Makci
мум н а излъчване е в р а м к и т е н а 260 до 29
п т , и н т е р ф е р е н ц и я т а при високофонов
флуоресценция е минимална, к о г а т о с
използва емисия над 300 п т . Обаче светлиъ
н о т о разсейване о т п р о т е и н и т е и т е х н и т
макромолекули в пробния м а т р и к с м о г а т д
п р и ч и н я т нежелан фон. Липемични проб
п р и т е ж а в а т подчертано интензивно свегг
линно разсейване и о т н о с и т е л н и я т прино
н а л и п и д и т е з а фоновия сигнал при флус
р е с ц е н т н о замерване може да се у с т а н о в
при въвеждане н а нов м е т о д . Р а з т в о р и т е
за флуорофорите може да предизвика поде
бен проблем, освен т о в а и нежелана фонов
и н т е р ф е р е н ц и я , Флуорофорите в концеь
т р а ц и о н н и граници около 10'9 mol/1 и по ние
ки м о г а т да п о к а ж а т значителна абсорбци
в с т ъ к л е н и контейнери или реакционни c i
дове. Също р а з т в о р и н а флуорофори, к о и т
се о б л ъ ч в а т за дълъг период о т време, са пс
д а т л и в и н а фотодекомпозиция о т unmet
зивна излъчена светлина. Тези проблеми мс
г а т да се и з б е г н а т чрез специална селекци
н а реакционните съдове, чрез прибавяне н
мокрещи а г е н т и и чрез намаляване екеш
з и ц и я т а н а в ъ з б у ж д а щ а т а светлина.
Т е м п е р а т у р н и е ф е к т и , флуоресцешт
п и я т к в а н т о в е ф е к т н а много с ъ с т а в к и
ч у в с т в и т е л е н н а т е м п е р а т у р н и колебания.
Най-общо, ф л у о р е с ц е н т н а т а и н т е н з и в н о с т
намалява с повишаване н а т е м п е р а т у р а т а
приблизително с 1 go 5% з а градус по 0С. Ос­
вен т о в а погасяване след сблъсък намалява
с увеличение н а в и с к о з н о с т т а , к о е т о реду­
цира г а с е н е т о н а флуоресценцията. Флуо­
р е с ц е н т н а т а и н т е н з и в н о с т може да бъде
повищена к а к т о о т увеличение н а реак­
т и в н и я в и с к о з и т е т , т а к а и о т понижение
т е м п е р а т у р а т а н а р а з т в о р и т е л я . Темпе­
р а т у р н и я т е ф е к т м о ж е д а бъде миними­
зиран чрез контролиране н а р е а к т и в н а т а
т е м п е р а т у р а и затопляне на пробите и
р е а к т и в и т е , ако т е с а били в хладилник.
Е ф е к т и в н о с т т а н а ф л у о р е с ц е н ц и я т а се
понижава с повищение н а т е м п е р а т у р а т а .
Слабо флуоресциращи в е щ е с т в а м о г а т да
с т а н а т при ниска т е м п е р а т у р а силно флуо­
ресциращи. И з м е р в а н е т о н а флуоресцен­
ц и я т а в т е з и случаи т р я б в а да с т а в а при
ниска т е м п е р а т у р а .
Ф о т о д е к о м п е н с а ц и я . При конвенционал­
н а т а и лазерно-индуцираната флуоримет-
рия, възбуждане н а слаба флуоресценция или
разтвор с интензивен светлинен източник
може да предизвика ф о т о х и м и ч н а декомпо-
зиция на анализа. Някои процедури м о г а т
да н а м а л я т р а з л а г а щ и т е е ф е к т и :
• Винаги да се и з п о л з в а т най-дългите въз­
можни дължини н а в ъ л н и т е з а възбуж­
дане, к о е т о да не води до светлинно раз­
сейващ е ф е к т .
• Намаляване п р о д ъ л ж и т е л н о с т т а на про­
б а т а чрез измерване на ф л у о р е с ц е н т н а т а
и н т е н з и в н о с т в е д н а г а след възбужда­
нето.
• Предпазване н а н е с т а б и л н и р а з т в о р и о т
о к о л н а т а с в е т л и н а чрез съхранението им
в тъмни шишета.
• Да се о т д е л я р а з т в о р е н и я кислород о т
разтворите.
КОЛИЧЕСТВЕН
ЛУМИНЕСЦЕНТЕН АНАЛИЗ
Този анализ се основава на в р ъ з к а т а между
к о н ц е н т р а ц и я т а на флуоресциращото веще­
с т в о и и н т е н з и т е т а на лъчението. Тази врьз-
ка е линейна само при много ниски концен­
т р а ц и и - под Ш М О 6 g/ml или 10 7-10"10 mol/1.
И р с ш м у щ е с т в а на количествения лумини-
с ц е н т е н анализ - висока ч у в с т в и т е л н о с т .
Недостатъци:
1. Ф л у о р е с ц е н т н и т е с п е к т р и се в л и я я т
значително повече о т примесите, откол­
к о т о абсорбционните;
2. Ц в е т ъ т и с п е к т р а л н и я т с ъ с т а в на флуо­
р е с ц е н ц и я т а се в л и я я т сравнително сил­
но о т външни условия - т е м п е р а т у р а , pH
и др.
Измерване на флуоресценцията
Източници н а възбуЖдащо лъчение.
Флуоресценцията се възбужда обикновено
о т лъчи с дължина на в ъ л н а т а в интервал
о т 200 до 600 п т . Използват се два основни
вида източници:
А. С л и н е й н и с п е к т р и :
• Hg-аргонови лампи - кварцова горелка с
електроди и минимално количество на
живак и аргон. К о г а т о между електро­
д и т е се създаде потенциална разлика в
г о р е л к а т а се разгаря електрична дъга,
ж и в а к ъ т се изпарява и с т а в а източник
на лъчение. Аргонът улеснява запалване­
т о на д ъ г а т а . Ж и в а ч н и т е лампи излъч­
в а т преди всичко в UV о б л а с т и о т ч а с т и
в ъ в в и д и м а т а о б л а с т (250-450 п т ) .
И н т е н з и т е т ъ т на лъчението и неговото
с п е к т р а л н о разпределение з а в и с я т о т
н а л я г а н е т о на ж и в а ч н и т е пари. При нис­
ко н а л я г а н е - най-голям и н т е н з и т е т
и м а т л ъ ч и т е с Х = 253.6 п т . След 300 п т
и н т е н з и т е т ъ т им е минимален. При
високо н а л я г а н е Х н а й - и н т е н з и в н и с а
л ъ ч и т е с ^ = 404.7 п т , 435.8 п т , 546 п т и
577 п т .
• Дъгови лампи (лъчение о т електрична дъ­
га) с Ре-електроди - получават се лъчи с
X- 200-240 п т .
• Дъгови лампи с AI-електроди . Лъчението
е с дължина под 200 п т .
Б . С н е п р е к ъ с н а т с п е к т ъ р Те са най-це-
лесъобразни.
• Криптонови лампи - на същия принцип
к а к т о ж и в а ч н и т е лампи. И м а т непре­
к ъ с н а т и н т е р в а л на излъчване о т 200 до
225
 600 nm c интензивен максимум около 440
nm.
• Ксеноноби лампи - кбарцоби т р ъ б и с ксе-
нон и електроди. И м а т н е п р е к ъ с н а т ин­
т е р в а л н а излъчване о т 200 до 650 п т . I. Разположение в една линия
И з т о ч н и к ъ т н а с в е т л и н а се п о с т а в я в
к у т и я , к о я т о се изолира о т р а б о т н о т о _С
помещение. Тъй к а т о се получава йони- 1о
зация на въздуха - озониране, о т к у т и я т а
има извод, к о й т о извежда озона. В н о в и т е
технологии ксеноновите т р ъ б и са с нов
дизайн, малки размери и не се н у ж д а я т
о т специална изолация.
II. Разположение под прав ъгъл
К в а р ц о в и л е щ и (или вдлъбнати огледала).
Те н а с о ч в а т и к о н ц е н т р и р а т л ъ ч е н и е т о lo
към първични с в е т о ф и л т р и , к о и т о пропус­
к а т максимално с в е т л и н а в о б л а с т т а н а
възбуждане н а о б е к т а . Използват се с т ъ к ­
лени филтри. За в и д и м а т а о б л а с т т е са бели
( о т обикновено стъкло), а з а UV са о т квар­
цово или увилово стъкло, оц вет ен о с никелов
III. Фронтално повърхностно разположение
окис (филтри н а Ууд).
Фиг. 9.3. Видове разположения на възбуждащите
М о п о х р о л г а т о р I. О т д е л я о т вълновия и излъчващи монохроматори
10 - възбуждаща енергия; ЕхМ - възбуждащ монохро­
с п е к т ъ р лъчи с необходимата дължина н а матор; С - кювета; If - интензивност на флуоресиен-
вълната за възбуждане н а обекта. Входният иията; Е т М - емисионен монохроматор; D - д е т е к т о р
процеп се подбира с д о с т а голяма ширина
(1-2 mm), за д а осигури и н т е н з и в н о с т н а
флуоресценцията. Смес о т флуоресциращи
в е щ е с т в а може да се изследва, к о г а т о н а
с ъ щ а т а позиция н а с х е м а т а се включи и
в т о р и монохроматор. О т него възбуждаща­
т а с в е т л и н а се насочва к ъ м изследвания
обект.
На фиг. 9.3 са представени в ъ з м о ж н о с т и
за разположение н а к ю в е т а с проба, а фиг.
9.4 показва диаграма н а т и п и ч е н флуори-
м е т ъ р за мануално о т ч и т а н е н а проби.

Мопохролгатор II. О т д е л я лъчи с опреде­

лена дължина о т емисионния с п е к т ъ р н а
флуоресциращия о б е к т . Ш и р и н а т а н а изхо­
дящия процеп се определя чрез с ъ о т н о ш е ­
н и е т о между г е о м е т р и ч н а т а ширина н а
процепа (S) и с п е к т р а л н а т а ш и р и н а н а
процепа (Д>^ п т ) , к о я т о е зависима о т ли­
н е й н а т а дисперсия н а прибора D l ( к о н т -
с т а н т а , к о я т о представлява р а з л и к а т а в
дължините н а 2 спектрални линии н а раз­
с т о я н и е 1 m m една о т друга).
ФотолгноЖител. С л а б а т а с в е т л и н а н а
226
Фиг. 9.4. Схема на спектрофлуориметър - моно­
хроматор I отделя лъчи е необходимата X . за въз­
буждане на обекта, а монохроматор II отделя
лъчи с определена к" о т емисионния спектър на
флуоресциращия обект
1 - ксенонова лампа; 2 - перка; 3 - дифракционна ре­
шетка; 4 - сплитер; 5 - огледална призма; 6 - референ-
т е н фотомножител; 7 - кювета за пробата; 8 - фил­
тър; 9 - дифракционна решетка; 10 - фотомножител
флуоресценцията се насочва върху ф о т о ­
множител. Тук с в е т л и н н и я т сигнал се пре­
връща в електрически сигнал, ч и я т о сила е
пропорционална н а и н т е н з и т е т а н а флуо-
ресценцията.
Р е г и с т р и р а щ и у с т р о й с т в а . С и л а т а на
т о к а се измерва о т регистриращо устрой­
с т в о - галванометър. Флуоресценцията се
о т ч и т а о т трансмисионна скала, т ъ й к а т о
се о т ч и т а к в а н т о в добив с линейна пропор­
ционалност.
Основни а п а р а т и
А п а р а т и т е , к о и т о се използват за мерене
на флуоресценция са флуори^мстри и спск-
трофлуори+мстри. Ф л у о р и м е т ъ р ъ т из­
ползва интерфериращи или стъклени фил­
три, продуциращи монохроматична светли­
на за възбуждане на пробите и за изолиране
на ф л у о р е с ц е н т н о т о излъчване, д о к а т о
спектрофлуориметрите използват за т е з и
цели решетъчен или призмов монохроматор.
Основните к о м п о н е н т и необходими за
флуоресцентна с п е к т р о м е т р и я са 1. Източ­
ник на възбуждане; 2. Възбуждащ монохрома­
тор; 3. Клетка за проба; 4. Излъчващ моно­
хроматор и 5. Д е т е к т о р .
И з т о ч н и к н а В ъ з б у ж д а н е . Абсорбоцион-
н и я т спектър на повечето представляващи
интерес флуоресценции е в границите о т 300
до 550 п т . И н т е н з и т е т ъ т на флуоресцент­
ното излъчване е пропорционален на начал­
ния възбуждащ и н т е н з и т е т , к а к т о и на
концентрацията и на обема на е л е м е н т и т е
измервани в п р о б н а т а клетка. Желателно
е и з т о ч н и к ъ т на светлина да е лампа, спо­
собна да излъчва интензивна лъчиста енер­
гия с широк спектрален интервал. Добър
светлинен източник, о т г о в а р я щ на т е з и
критерии е ксенонова дъгова лампа, но и
кварцова халогенна кръгова лампа може да
се използва за възбуждане при специални слу­
чаи. Ксеноновата лампа е популярна, т ъ й
к а т о дава продължителна високоинтен-
зивна лъчиста енергия в спектрален обсег
между 250 и 800 п т . Л и м и т и р а н е т о н а
ксеноновата лампа за аналитично изпол­
зване е дъговото блуждаене или т р е п т е н е .
Ла зерните източници са наложителни при
флуоресцентно приложение, при к о е т о е
необходим висок интензитет, добро фоку­
сиране и главно монохроматична светлина.
Флуориметър за измерване
н а поляризация
Флуоресцентна поляризация се използва за
количествен анализ на лекарствени нива,
напр. чрез измерване на промяната във флуо­
р е с ц е н т н а т а деполяризация, последваща
имунологична реакция. Светлината е съста­
вена о т електрични и магнитни вълни под
прав ъгъл една към друга. В светлинните
вълни, продуцирани о т с т а н д а р т е н въз­
буждащ източник, електричните вектори
са ориентирани произволно. В светлинните
вълни, минаващи през някакъв кристален
м а т е р и а л (поляризатор) е л е к т р и ч н и т е
вектори са ориентирани в една плоскост -
плоскостна поляризация, флуорофорите
абсорбират с в е т л и н а т а по-ефективно в
п л о с к о с т т а на т е х н и т е електронни енер­
гийни нива. Ако т я х н о т о въртеливо отслаб­
ване (Брауново движение) е по-бавно о т т я х ­
н о т о време за флуоресцентно погасяване,
к а к т о при с л у ч а и т е с големи флуорес-
центно-маркирани молекули, излъчената
ф л у о р е с ц е н т н а с в е т л и н а може да бъде
поляризирана. Тъй к а т о малките молекули
и м а т ротационно релаксантно време, кое­
т о е много по-късо о т времето за флуорес­
ц е н т н о погасяване, т я х н а т а емисионна
фруоресцентна светлина е деполяризирана.
Когато малките флуоресциращи молекули са
прикрепени към макромолекули или са по­
ставени във вискозни разтвори, малките мо­
лекули м о г а т да и з л ъ ч а т поляризирана
светлина, флуоресцентната поляризация
(Р) се дефинира о т следната формула:
lv lh
р =
+
Iv Ih
Iv - флуоресцентна светлина, излъчена във
вертикална плокост
Ih ' флуоресцентна светлина, излъчена
6 хоризонтална плокост
На фиг. 9.5 е представена вертикална и
хоризонталана посока на излъчената свет­
лина в а н а л и з а т о р , използващ флуорес­
ц е н т н а поляризация.
227
 1(1

If
E x M P
\r

EmM

•
1r

Ф и г . 9.5. Схема на анализатор, използващ флуоресиентна поляризаиия

Р - п о л я р и з а т о р , о с и г у р я в а щ п о л я р и з и р а щ а в ъ з б у ж д а щ а с в е т л и н а ; РА - п о л я р и з а т о р , а н а л и з и р а щ ч р е з р о т а ц ш
у с п о р е д н и и п е р п е н д и к у л я р н и и з л ъ ч е н и ф л у о р е с ц е н ц и и ; 10 - в ъ з б у ж д а щ а е н е р г и я ; Е х М - в ъ з б у ж д а щ м о н о
х р о м а т о р ; С - к ю в е т а ; lf - и н т е н з и в н о с т н а ф л у о р е с ц е н ц и я т а ; Е т М - е м и с и о н е н м о н о х р о м а т о р ; D - д е т е к т о )

Редица имунохимични анализатори из­ към апарати за ВЕТХ. По-специални апара

мерват флуоресценция или луминесценция. т и са лазерните флуориметри и флоуцито
Флуоресцентна детекция може да се включи метрите.

КНИГОПИС

Rhys Williams AT. Fluorescence detection in liquid chromatog­
raphy. Perkin-Elmer F L Publication, England, 1980.
Tiffany TO. Fluorometry, Nephelometry, and Turbirimetry. In:
Ashwood ER, üurtis C A (eds), Tietz fundamentals o f clini­
cal chemistry (4lh ed). Philadelphia, W B Saunders Company,
1996, 70-81.
Wampler JE. Measurements and physical characteristics o f lu
minescence. In: Herring PJ (ed), Bioluminescence in action
New York, Academic Press, 1978.
Wilson K., Walker J M (eds). Principles and techniques o f prac
tical biochemistry (4 ,h ed), Cambridge, University press, 199f
Wolfbeis OS. Fluorescence spectroscopy: New methods and ap
plications. NewYork, Elsevier/North-Holland, 1978.

228
 Електрохимични
методи
Биосензори
Д. С в и н а р о в
Е л е к т р о х и м и ч н и т е м е т о д и з а анализ се
п р и л а г а т широко 6 к л и н и ч н а т а л а б о р а т о ­
рия з а определяне н а много йони, газове,
хормони, л е к а р с т в а и м е т а л и . Те п р и т е ж а ­
в а т отлична аналитична надеждност -
ниски граници н а о т к р и в а н е и определяне,
широк линеен о б х в а т , висока т о ч н о с т и
възпроизводимост, с е л е к т и в н о с т , специ­
фичност и удобства за а в т о м а т и з а ц и я и
високосериен анализ. С ъ ч е т а в а н е т о им с
биоаналитични с и с т е м и т р а с и р а внедря­
в а н е т о н а биосензори т е в д и а г н о с т и ч н а ­
т а медицина и заедно с м е т о д и т е , осно­
вани н а суха химия променя революцион­
но в ъ з м о ж н о с т и т е з а спешен анализ и ана­
лиз в м о м е н т а н а в и з и т а ц и я при пациен­
та.
ОСНОВНИ П О Н Я Т И Я
Електрохимия
u електроаналитична химия
Е л е к т р о х и м и я т а е клон н а физикохимия-
т а . Тя изучава я в л е н и я т а , извършваши се
в йонни р а з т в о р и н а ф а з о в а т а г р а н и ц а
между проводник о т първи род - м е т а л ( т о ­
к ъ т е насочено движение н а електрони) и
проводник о т в т о р и род - е л е к т р о л и т ( т о ­
к ъ т е насочено движение н а йони). Теоре­
т и ч н а т а е л е к т р о х и м и я изследва с т р о е ж а
на е л е к т р о л и т и т е , х а р а к т е р а н а връзка­
т а между п р о т и ч а ш а т а химична реакция
и електрическия т о к и п р и р о д а т а н а про­
ц е с и т е , к о и т о се и з в ъ р ш в а т на междуфа-
з о в а т а граница. П р и л о ж н а т а електрохи­
мия използва е л е к т р о х и м и ч н и м е т о д и з а
решаване на п р а к т и ч е с к и въпроси - произ­
в о д с т в е н и процеси и а н а л и т и ч н и задачи
{електроаналитична химия).
Електрохимична клетка
и електрохимичии реакции
Всяка последователност н а проводници о т
първи и в т о р и род {метали и електроли­
ти), намираиш се в електрически к о н т а к т
помежду си, образува електрохимична сис­
т е м а . Наличието н а фазова граница меж­
ду д в а т а вида проводници (хетерогенност)
е главна особеност н а всяка електрохимич­
на с и с т е м а . Комбинацията о т м е т а л , по­
т о п е н в е л е к т р о л и т е н р а з т в о р на негови
йони се нарича е л е к т р о д или п о л у к л е т ­
к а и представлява най-елементарна т а к а ­
ва с и с т е м а , например медна нишка (Си),
п о т о п е н а в р а з т в о р н а меден с у л ф а т
(CuS0 4 ). В т а з и с и с т е м а м е т а л н и я т елек­
т р о д може да о т д е л я йони в р а з т в о р а ка­
т о се окислява:
Си • С и " + + 2е"
Електроните о с т а в а т в металната
нишка и т я се зарежда о т р и ц а т е л н о спря­
мо околния р а з т в о р . При други условия в
съидата с и с т е м а р е а к ц и я т а може да про­
т е ч е в о б р а т н а посока - редукция на мед­
ни йони о т р а з т в о р а върху повърхност­
т а на м е д н а т а нишка:
Си 2+ + 2 е •Си
Това води до д еф и ц и т на електрони в ме­
т а л а и т о й се зарежда положително спря­
мо околния р а з т в о р . И в д в а т а случая се
създава потенциална разлика на гранична­
т а повърхност м е т а л / е л е к т р о л и т , к о я т о
се нарича е л е к т р о д е н п о т е н ц и а л . Мно­
го електродни реакции п р о т и ч а т по т о з и
т и п . Съшествува и друг т и п полуклетка,
при к о я т о и окислената и редуцираната
форма н а в е ш е с т в о т о са в разтвор. Нап­
ример при п о т а п я н е на нишка о т п л а т и ­
н а в р а з т в о р о т феро- и ферийони равнове-
229
cuerno се определя ош реакцията.
Fe 3+ + е ч > ¥ег+
Такива електроди се н а р и ч а т р е д о к с
е л е к т р о д и , макар че не се различават
принципно о т предходния т и п .
Е л е к т р о х и л т ч н а ш а к л е т к а (еле-
л г е н т ) се състои о т два (или повече) елек­
т р о д а (полуелементи), свързани вътреш­
но с помощта на общ електролит или вън­
шно - чрез „солев мост" о т концентриран
разтвор на индиферентни йони (напр. на­
с и т е н или 4 mol/1 KCl или KNO3). фигура
10.1 представя схематично най-опростен
модел на т а к а в а клетка - к л е т к а т а на
Daniell. Тя се състои о т цинкова и медна
нишки, потопени с ъ о т в е т н о в разтвори
на ZnS04 и CUSO4. Ако концентрациите на
Zn2+ и Си2+ са приблизително равни, ще нас­
тъпи окисление на металния цинк в лява­
т а полуклегпка и редукция на медни йони в
дясната. При свързване на д в а т а електро­
да с метален проводник, ще се увеличи кон­
центрацията на цинкови йони в първата
полуклетка и ще се понижи концентраци­
я т а на медни йони във в т о р а т а . По свърз­
ващия проводник електроните ще се прид­
вижат о т цинковия а н о д към медния к а ­
тод. Солевият м о с т позволява миграция
на йони между разтворите, но пречи на гру­
б о т о им смесване и компенсира в д о с т а ­
тъчна с т е п е н величината на дифузионния
потенциал.
Zn нишка Си шипка
1®
солев м о с г
Си 2 +
SO4
Zn -V Zn 2+ + 2с" Си 2 + + 2е" -> Си
Фиг. 10.1. Схема н а к л е т к а т а н а Daniell {по Р.К.
Robinson)
Следователно при електрохимичните
реакции се извършва обмен на електрони,
спрегнат с химически промени, които нас­
т ъ п в а т на фазовата граница на дадено ве-
230
щество в твърдо състояние и неговия раз­
твор.
Номенклатура и класификация
на електрохимичните техники
Електроаналитичните м е т о д и се разде­
л я т на две големи групи; методи, при кои­
т о о т с ъ с т в а електродна реакция {кондук-
тометрия) и методи, които се основават
на електродни реакции (електрохимични
методи).
При к о н д у к т о м е т р и я т а , чрез измерва­
не на електропроводимостта на един раз­
реден разтвор, може да се получи информа­
ция за о б щ а т а йонна концентрация, или
да се проследи изменението на концентра­
ц и я т а на един о т йоните, ако т о й у ча ст­
ва в химична реакция. В клиничната лабо­
ратория к о н д у к т о м е т р и я т а намира при­
ложение при Култеров принцип за броене
на кръвни клетки (вж. т а м ) .
Терминологията в е л е к т р о х и м и я т а е
д о с т а объркваща и н е с и с т е м а т и з и р а н а .
Наименованията на о т д е л н и т е техники
са възниквали исторически, а о п и т и т е за
системно подреждане и единна номенкла­
т у р а се с в е ж д а т не до преименуване, а до
групиране. З а т о в а едни а в т о р и наричат
кислородния електрод на Clark амперомет-
ричен уред, други - волтамперометричен,
а т р е т и - полярографски (в т о в а число са­
мия Clark). Един удобен и опростен подход
за разбиране и класификация на електро­
химичните м е т о д и се основава на разде­
лянето им в зависимост о т вида на изпол­
званите електрохимични клетки.
Електрохимичните клетки са два основ­
ни вида - галванични и електролизни. В гал­
ваничните клетки химичните реакции про­
т и ч а т спонтанно, без външен източник
на т о к - при поставяне на електродите в
к о н т а к т . Наричат се още галванични еле­
менти. Те произвеждат електрична енер­
гия за с м е т к а на извършващите се в т я х
химични реакции. Такава е разгледаната
клетка на Daniell. В електролизните клет­
ки се прилага електрически т о к о т външен
източник, за да се предизвикат химични­
т е реакции на г р а н и ч н а т а повърхност
електрод/разтвор, т . е . реакциите не про­
т и ч а т спонтанно. Наричат се още галва-
нични вани или елекпгролизатори. При т я х
химичните реакции се и з в ъ р ш в а т з а с м е т ­
ка н а външна е л е к т р и ч е с к а енергия.
В с ъ о т в е т с т в и е с т о в а , електрохимич-
н и т е м е т о д и се п о д р а з д е л я т н а две под­
групи: п о т е н ц и о м е т р и ч н и м е т о д и , осно­
вани н а галванични к л е т к и , и в о л т а м п е р о -
м е т р и ч н и м е т о д и , използваиди електролиз-
ни к л е т к и .
ПОТЕНЦИОМЕТРИЧНИ МЕТОДИ
П о т е н ц и о м е т р и ч н и т е м е т о д и се основа­
в а т н а измерване н а п о т е н ц и а л н а т а раз­
лика н а галванична к л е т к а , к о я т о е функ­
ция о т к о н ц е н т р а ц и я т а или а к т и в н о с т ­
т а н а т ъ р с е н и я в биологичния м а т е р и а л
компонент. П р и н ц и п н о т о у с т р о й с т в о н а
апарат за п о т е н ц и о м е т р и я е показано н а
фиг. 10.2. Г а л в а н и ч н а т а к л е т к а н а ап а ра ­
т а се с ъ с т о и о т два е л е к т р о д а (полуклет­
ки) п о т о п е н и в р а з т в о р а з а измерване (ка-
либратор, к о н т р о л а или м а т е р и а л о т па­
ц и е н т ) и о т ч и т а ш уред, к о й т о н а й - ч е с т о
е миливолтметър. Единият о т електро­
д и т е се подбира т а к а , че н е г о в и я т полу-
клетъчен п о т е н ц и а л д а о т г о в а р я н а про­
мени в а к т и в н о с т т а или к о н ц е н т р а ц и я ­
т а на определяния к о м п о н е н т . Нарича се
и н д и к а т о р е н е л е к т р о д (излгерващ).
Д р у г и я т е л е к т р о д се нарича р е ф е р е н т е н
( с р а в н и т е л е н , с т а н д а р т е н ) и негови­
я т п о т е н ц и а л не се променя в у с л о в и я т а
mV-метър
Фиг. 10.2. С х е м а н а апарат за п о т е н ц и о м е т р и я
(no J. R. Кirchoffcl at)
н а анализа. А п а р а т ъ т не измерва абсолют­
н и т е с т о й н о с т и на с ъ о т в е т н и т е елект­
родни потенциали, а п о т е н ц и а л н а т а раз­
лика между индикаторния и референтния
електрод, к о я т о е пропорционална н а т ъ р ­
с е н а т а а к т и в н о с т или концентрация. Сле­
дователно потенциолгетрнята е рав­
новесен електрохилгичен метод, п р и
к о й т о с е и з м е р в а в е л и ч и н а т а н а по­
тенциал, генериран в рездлтат н а
с п о н т а н н о п р о т и ч а щ електрохилги­
чен п р о ц е с (вж. съгцо предходния раздел).
Уравнението н а Kernst (извеждането му
е дадено в специализирани ръководства по
е л е к т р о х и м и я и физикохимия) описва ха­
р а к т е р а н а в р ъ з к а т а между измерения о т
а п а р а т а потенциал и т ъ р с е н а т а актив­
н о с т или к о н ц е н т р а ц и я :
Е = Е с + 2.3 RT/nF х log1()A
или Е = Е с + S / n х log 10 C
Е - общ потенциал между индикаторния и рефе­
рентния електрод
Ес - константен потенциал на референтния елек-
трод
2.3RT/F ( = S) - фактор на Nernst или наклон на
зависимостта потенциал/концентрация (R - мо-
ларна газова константа, Т - абсолютна темпе­
ратура, F - к о н с т а н т а на Faraday)
п - брой заряди на определяния йон
При 250С ф а к т о р ъ т н а Nernst е равен на
0.059. Следователно при д е с е т о к р а т н а про­
м я н а в а к т и в н о с т т а на едновалентен йон,
о б ш и я т п о т е н ц и а л се променя с 59 mV, а
на двувалентен йон - с 29.5 mV. Тази лога­
р и т м и ч н а връзка между потенциала на гал­
в а н и ч н а т а к л е т к а и а к т и в н о с т т а н а оп­
ределяния йон е в о с н о в а т а на всички по­
т е н ц и о м е т р и ч н и измервания. В клинична­
т а л а б о р а т о р и я л и н е й н и я т х а р а к т е р на
з а в и с и м о с т т а между п о т е н ц и а л а и лога-
р и т ъ м а о т а к т и в н о с т т а ( т . е . Нернсто-
во поведение н а и н д и к а т о р н и я електрод)
следва да се поддържа в целия клинично ва­
жен диапазон. Основните фактори, к о и т о
в о д я т до отклонения о т Н е р н с т о в о т о по­
ведение .на индикаторния електрод са чув­
с т в и т е л н о с т т а и с е л е к т и в н о с т т а на
е л е к т р о д н а т а мембрана към а к т и в н о с т
т а (респ. к о н ц е н т р а ц и я т а ) на определяния
йон, величината на дифузионния потенци­
ал и а к т и в н о с т т а (респ. к о н ц е н т р а ц и я т а )
н а и н т е р ф е р и р а щ и т е йони.
231
 Връзката между а к т и в н о с т т а и концен­
т р а ц и я т а на определяния к о м п о н е н т е
важна концепция в п о т е н ц и о м е т р и ч н и т е
измервания. Повечето аналитични м е т о ­
ди, в т о в а число пламъковата ф о т о м е т ­
рия и атомно-абсорбционната с п е к т р о -
метрия, определят т о т а л н а т а йонна кон­
центрация. При д и р е к т н а т а потенцио-
м е т р и я на неразредени биологични течнос­
т и се определя к о н ц е н т р а ц и я т а на свобод­
ния, несвързан с белтъци и други носите­
ли йон, или още по-точно казано - а к т и в ­
н о с т т а на йона. При всички химически и
биологични взаимодействия в организма
йоните у ч а с т в а т именно със свободната
си концентрация ( т ъ й нар. налична момен­
т н а моларна активност), а не с т о т а л н а ­
т а си концентрация. З а т о в а в повечето
случаи определянето на а к т и в н о с т т а е по-
адекватно о т определянето на т о т а л н а ­
т а концентрация. Разбира се, за балансо­
ви нужди с о т ч и т а н е на разликата между
внесеното в организма и елиминирано ко­
личество, определянето на о б щ а т а йонна
концентрация има предимства. Връзката
между т о т а л н а т а моларна концентрация
и а к т и в н о с т т а има следния вид:
А = уС
А - о т н о с и т е л н а а к т и в н о с т н а определяния йон
С - н е г о в а т а т о т а л н а моларна к о н ц е н т р а ц и я
Y' коефициент на а к т и в н о с т (за извеждане и т е р -
модинамична дефиниция н а у вж. с ъ о т в е т н и ръ­
ководства по физикохимия).
Резултатите о т потециометричното
определяне на йони в неразредена пълна
кръв, плазма или серум, се п р е д с т а в я т във
вид на концентрации, к а т о измерената ак­
т и в н о с т се умножи със с ъ о т в е т е н фак­
т о р , о т р а з я в а щ м а с о в а т а концентрация
на в о д а т а в биологичните т е ч н о с т и (0.93
kg/1 за нормална човешка плазма). Напри­
мер при фактор за н а т р и й 1.25 и при изме­
рена п о т е н ц и о м е т р и ч н а а к т и в н о с т о т
112 mmol/1, р е з у л т а т ъ т се представя ра­
вен на 1.25x112 mmol/1 = 140 mmol/1. На
практика превръщането на а к т и в н о с т т а
в концентрация се постига чрез директно
калибриране на потенциометричните ме­
т о д и в концентрационни единици. Така се
избягва н у ж д а т а о т специални референт-
ни с т о й н о с т и и при и н т е р п р е т а ц и я т а на
232
р е з у л т а т и т е се прилагат общоприетите
за т о т а л н а концентрация референтни ин­
тервали. Тази корекция налага много вни­
м а т е л н а и н т е р п р е т а ц и я , к о г а т о се срав­
н я в а т р е з у л т а т и о т определяне на н а т ­
рий и калий с пламъкова ф о т о м е т р и я и ди­
р е к т н а потенциометрия. При изразена хи-
перлипемия масовата концентрация на во­
д а т а в плазмата може да спадне до 0.80 kg/.T
и тог а ва пламъковата фотометрия ще да­
де р е з у л т а т за натрий о т 120 mmol/1, с греш­
но заключение за наличие на хипонатриемш?
и/или водна интоксикация. В т о з и случаи
п о т е н ц и о м е т р и ч н о т о определяне показвг
140 mmol/1.
Референтни електроди
Основните изисквания към референтншш
електроди са с т а б и л н о с т , о б р а т и м о с т НЕ
е л е к т р о х и м и ч н и т е процеси, химическа
и н е р т н о с т и удобства при масово произ­
водство.
С т а н д а р т н и я т водороден електрод
(СВЕ) се с ъ с т о и о т нишка п л а т и н а покри­
т а с платиново черно, к о я т о е потопена Е
р а з т в о р о т солна киселина (донор на Н + ) с
определена концентрация. През електродг
се пропуска водород под налягане о т 1 а т м
Равновесната реакция е:
v2 Н 2 < > Н+ + е
П о т е н ц и а л ъ т на СВЕ е еднакъв при всич­
ки т е м п е р а т у р и и т о в а го прави уникалеь
с в ъ з м о ж н о с т т а да се използва к а т о е т а ­
лон за сравнение. П о т е н ц и а л ъ т му се при­
ема за 0.0 V. Този електрод е неудобен 3£
практическа р а б о т а , но има фундаментал­
но значение, з а щ о т о спрямо него се отчи­
т а т п о т е н ц и а л и т е на всички останалъ
електрохимични системи.
Н а с и т е н и я т калольелов електрод
(НКЕ) се състои о т нишка живак (Hg), пок­
р и т а с каломел (меркурохлорид, HggC^), коя­
т о е потопена в наситен разтвор на KCl (фиг
10.ЗА). Потенциалът му е + 0.242 V спрямс
СВЕ и се отличава с извънредна стабилносп
докато има кристали KCl в тръбичката н£
електрода. Лесен е за производство и нами­
ра широко приложение в п р а к т и к а т а .

Pt нишка
"Ag'/AgCl
•H^Hg2Cl2
наситен KCl
разтвор KCl ратгвор
KCl кристали
норьозна
порьозна запушалка
запушалка
HgjQj + 2с'« ' 2Hg' + 2СГ AgCI(s) + с" . ' Ag*(s) + СГ
Е = + 0.242 V спрямо СВЕ Е = + 0.197 V спрямо СВЕ
Фиг. 10.3. Референтни електроди (модификаиия
no J.R. Kirchojfet al и P.K. Robinson)
A - наситен каломелоб електрод
Б - сребърнохлориден електрод
Срсбъриох~1 о р и (/и lui т (Ад/ЛдС1) е л е к т ­
р о д се с ъ с т о и о т нишка сребро, п о к р и т а с
т ъ н ъ к филм о т сребърен хлорид, к о я т о е
п о т о п е н а 6 р а з т в о р н а KCl (фиг. 10.ЗБ). По­
т е н ц и а л ъ т м у се фиксира о т к о н с т а н т ­
н а т а к о н ц е н т р а ц и я н а KCl и възлиза н а
+ 0.197 V с п р я м о СВЕ. О т л и ч а в а се съшо
със с т а б и л н о с т и у д о б с т в а , и се използва
к а т о вътрешен референтен електрод на
п о т е н ц и о м е т р и ч н и т е мембранни електро­
ди.
Индикаторни електроди
В к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я к а т о индика­
т о р н и е л е к т р о д и се и з п о л з в а т йон-селек-
т и в н и електроди (ЙСЕ). Те се с ъ с т о я т о т
мембрана, к о я т о к о н т а к т у в а с изследва­
ния биологичен м а т е р и а л , в ъ т р е ш е н рефе­
р е н т е н е л е к т р о д ( н а й - ч е с т о Ag/AgCl) и
е л е к т р о л и т е н р а з т в о р с п о с т о я н е н със­
т а в , разположен в п р о с т р а н с т в о т о меж­
ду м е м б р а н а т а и в ъ т р е ш н и я електрод. По­
т е н ц и а л ъ т н а ЙСЕ се о т ч и т а спрямо срав­
нителен електрод, к о й т о съшо е п о т о п е н
в м а т е р и а л а з а изследване (фиг. 10.4).
М е х а н и з м ъ т н а д е й с т в и е на ЙСЕ се ос-
иои-селективен
външен
електоод (ЙСЕ)
референтен
mV-метър електрод
(сравнителен)
вътрешен
. референтен
/ електрод
вътрешен
разтвор
мембрана §;•
разтвор за и з м е р в а н е
Фиг. 10.4. Схема на йон-седективен електрод (по
J.R. Kirchojfet а [)
новава на йонен обмен, о с ъ щ е с т в я в а щ се
о т й о н - с е л е к т и в н а т а мембрана. Тя п р и т е ­
жава избирателна пропускливост за опре­
деляния йон, к о й т о е с вариабилна концен­
т р а ц и я о т в ъ н ш н а т а ü с т р а н а (в проба­
т а за анализ) и с п о с т о я н н а концентрация
о т в ъ т р е ш н а т а и с т р а н а (в р а з т в о р а меж­
ду м е м б р а н а т а и в ъ т р е ш н и я референтен
електрод). З а т о в а величината на мембран­
ния п о т е н ц и а л зависи о т а к т и в н о с т т а на
йона в м а т е р и а л а з а изследване съгласно
уравнението на Nernst. В ъ т р е ш н и я т рефе­
р е н т е н електрод регистрира равновесния
п о т е н ц и а л н а й о н - с е л е к т и в н а т а мембра­
на и и з м е р е н а т а спрямо външния референ­
т е н електрод потенциална разлика е мяр­
ка за т ъ р с е н а т а йонна концентрация. Чув­
с т в и т е л н о с т т а на ЙСЕ се дава о т ф а к т о ­
р а н а Nernst (S, наклон на з а в и с и м о с т т а
E/log 10 C - т е о р е т и ч н а ч у в с т в и т е л н о с т ) ,
умножен по коефициент н а о т н о с и т е л н а
ч у в с т в и т е л н о с т , х а р а к т е р е н за всяка йон-
селективна мембрана. С е л е к т и в н о с т т а на
м е м б р а н а т а не е абсолютна и з а т о в а урав­
н е н и е т о на Nernst се усложнява о т ефек­
т а н а интерфериращи йони и величината
н а дифузионния потенциал.
М а т е р и а л ъ т , о т к о й т о се и з р а б о т в а
м е м б р а н а т а се определя о т т и п а на йони­
т е , ч и я т о к о н ц е н т р а ц и я подлежи н а из­
мерване ( т а б л . 10.1). Д и з а й н ъ т н а ЙСЕ е
много разнообразен, а класификацията им
според вида н а м е м б р а н а т а и агрегатно­
т о с ъ с т о я н и е на определяните п а р а м е т ­
ри включва: стъклени електроди, електро­
д и с течни и полимерни мембрани, твър-
дофазови електроди и газови електрод и. Ш-
вън п о т е ц и о м е т р и ч н и я анализ, към ЙСЬ
м о г а т да се в к л ю ч а т кислородният е л е к т -
233
Т а б л и ц а 10,1. Йон-селективни е л е к т р о д и (ЙСЕ) в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я
{модификация no М. MeyerhoJJ)
Вид м е м б р а н а Йон СъстаК на м е м б р а н а т а Интерференция
Стъкло 1Г 72.17% Si0 2 , 6.44% СаО, 21.39% Na 2 0 (mol%) Na*
Na + 11% Na 2 0, 18% Л12Оя, 71% S i 0 2 K*,Ag*
Твърдофазова F ЬаГ3 crystal он-
С1- Ag2S/AgCl B r , CN-, S2-
Течност или Na + Na* йонофор (ЕТН 227) 2-нитрофепилоктил е т е р Li*, К*, Са* *
полимер натриев т е т р а ф е н и л б о р а т
С1- три-п-октилпропиламониев хлорид, деканол OH", B r , F"
К* валиномицин, диоктиладипат, PVC NH4*
Li* Li* йонофори (ЕТН 1810) Ca* *, Na*
t +
Ca Са* * йонофор (ЕТН 1001), 2-нитрофенилоктил е т е р , -

натриев т е т р а ф е н и л б о р а т
Са+ +
калциев ди-(п-децил)фосфат, ди-(п-октилфенил) Mg**
фосфат, PVC
Газ-чувствителна со2 комбиниран стъклен pH електрод/0.01-0.1 mol/1 органични k-ни
NaHC03-NaCl зад мембрана о т силиконова гума
NH3 комбиниран стъклен pH електрод/0.1 mol/1 NH4C1 зад летливи амини
порьозна тефлонова газ-пропусклива мембрана

род и ензимните електроди с или без до­ т о й д е й с т в а к а т о катионообменник по

пълнителни мембрани.
Стъ/слспо-лгелгбраппи ЙСЕ. Стъклени­
я т p H електрод е п ъ р в и я т и най-често из­
ползван в п р а к т и к а т а ЙСЕ. Състои се о т
стъклено или пластмасово т я л о (тръбич­
ка), което завършва с т ъ н к о (около 50 |дт)
балонче о т стъкло със специален с ъ с т а в -
pH чувствителна йон-селективна мембра­
на. В ъ т р е ш н о с т т а на балончето е запъл­
нена с воден разтвор на 0.1 mol/1 HCl, в кой­
т о е потопен сребърнохлориден (Ag/AgCl)
референтен елекрод (фиг. 10.5А). Вътреш­
н и я т р а з т в о р осигурява формиране н а
вътрешен хидратен слой на с т ъ к л е н а т а
мемрана, к о й т о съдържа постоянно коли­
чество Н + . С е л е к т и в н о с т т а и действие­
т о на с т ъ к л е н а т а мембрана зависи к а к т о
о т нейния състав, т а к а и о т формиране­
т о на външен хидратен слой след п о т а п я ­
н е т о ü във воден р а з т в о р . За в ъ н ш н о т о
хидратиране на нов, „сух" pH електрод са
необходими поне няколко часа престой („на­
кисване") във вода. Поглъшането на вода
води до частично р а з т в а р я н е на стъкле­
н а т а мембрана и л и м и т и р а ж и в о т а н а
електрода. Образуването на външния хид­
р а т е н слой обаче, е о т ключово значение за
функцията на м е м б р а н а т а и ефектив­
н о с т т а на йонообменния процес. Дебелина­
т а на хидратния слой (гел) е около 0.1 |.im и
234
следния начин: наличието на КагО в с ъ с т а ­
ва на м е м б р а н а т а води до разграждане на
ч а с т о т SiOa и формиране на о т р и ц а т е л н о
заредени кислородни области (SiO ); т е з и J
области се с в ъ р з в а т със стъкления м а т -
рикс, к о й т о освобождава Na + йони; Na + йо­
ни п о с т ъ п в а т във външния хидратен слой
и м о г а т да се о б м е н я т срешу п р о т о н и i
(Н + ). П о т а п я н е т о на електрода в кисела
среда води до замяна на Na + с Н + в хидрат­
ния гел. При п о т а п я н е в алкална среда по­
с о к а т а на йонния обмен е о б р а т н а - замя­
на на П + с Na + , к а т о Н + м и г р и р а т о т хид­
р а т н и я слой в разтвора. Следователно ко­
л и ч е с т в о т о протони във външния хидра-
т и р а н слой на м е м б р а н а т а варира в зави­
с и м о с т о т к о н ц е н т р а ц и я т а на протони
в измервания р а з т в о р . Р а з л и к а т а в про-
т о н н о т о съдържание на вътрешния и вън­
шния хидратен слой определя в ъ з н и к в а н е ­
т о н а люлгбранен потенциал. Вът­
р е ш н и я т е л е к т р о д р е г и с т р и р а вели­
чината н а този потенциал и разли­
к а т а м е Ж д у него и потенциала н а
в ъ н ш н и л р е ф е р е н т е н е л е к т р о д , отче­
т е н а е ягиливолтльетър, е м я р к а з а
pH. Външният референтен електрод е най-
ч е с т о н а с и т е н каломелов електрод. Той мо­
же да е в отделен корпус или по-често - да е
вграден към с т ъ к л е н и я pH електрод под
форма на комбиниран електрод (фиг. 10.5Б). !
 |>
изолиран кабел изолиран кабел
вътрешен
референтен
електрод
(Ag/AgCI)
0.1 mol/1 HCl
стъклено
млонче
(мембрана)
Ф и г . 10.5. Схема на стъклено-мембранен ЙСЕ (по
P.K. Robinson)
А - стъклен pH електрод
Б - комбиниран електрод
Ако за измерване на pH се използва комби­
ниран електрод, п о т а п я н е т о в измервания
разтвор следва да се контролира т а к а , че
нивото на т е с т у в а н и я материал да бъде
между нивото на KCl разтвор и кристали­
т е на KCl (или порьозната запушалка). Та­
ка се осигурява бавна дифузия на KCl в
т е с т - р а з т в о р а и минимално влияние на ди-
фузионния п о т е н и и а л върху р е з у л т а т а .
О т ч и т а щ и я т уред, с т ъ к л е н и я т електрод
и р е ф е р е н т н и я т каломелов електрод с а
направени т а к а , че рИ 7 дава нулев потен­
циал. При алкално pH (над 9-10) стъклени­
я т pH електрод реагира и на други монова-
лентни катиони - особено на Na + u К + . То­
зи отговор се нарича алкална грешка на рИ-
мотъра, к о я т о може да се елиминира чрез
замяна на НагО и CaO с Li 2 0 и ВаО в с ъ с т а ­
ва на с т ъ к л е н а т а мембрана.
С промени в състава на с т ъ к л о т о са по­
лучени м е м б р а н и с висока селективност з а
други йони - Na* у Лд*, N 1 1 / . В клиничната
лаборатория намират практическо прило­
жение стъклените електроди за определя­
не на Na + .
1\ЙСЕ с т е ч н и и п о л и м е р и и м е м б р а н и ,
С ъ с т о я т се о т инертна, водонеразтвори-
*
ма т е ч н а среда (носител), в която е р а з т ­
ворен подходящ йонофор (хидрофобен орга­
ничен йонообменник или неутрална моле-
кула-носител) със с ъ о т в е т н а селектив­
н о с т за определяния йон. Течната среда е
импрегнирана в тънка порьозна мембрана
о т целулозоацетат или в матрикс о т по­
ливинилхлорид. При потапяне в разтвора
за изследване възниква мембранен потеци-
ал, който се сравнява с референтния елек­
т р о д и измерената потенциална разлика е
мярка за концентрацията на изследвания
йон. Механизмът на действие на т о з и т и п
мембрани е аналогичен на стъкления pH
електрод и се определя о т а финитета на
специфичния йонофор: външната мембран­
на повърхност (към пробата за анализ) по­
ема различно, пропорционално на концен­
т р а ц и я т а количество о т търсения йон, а
в ъ т р е ш н а т а мембранна повърхност е на­
товарена с постоянно количество о т съ­
щия йон. Затова величината на мембран­
ния потенциал зависи о т а к т и в н о с т т а на
йона в пробата за анализ. В клиничната ла­
боратория ЙСЕ с течни и полимерни мем­
брани се използват за определяне на К + ,
Na + , С а + + и СГ.
К* - с е л е к т и в н а т а м е м б р а н а е израбо­
т е н а чрез разтваряне на антибиотика ва-
линомицин в подходяща смес о т органич­
ни т е ч н о с т и . Валиномицинът е неутрал­
на молекула с висока селективност за К + .
Представлява цилиндрична хетероциклич-
на с т р у к т у р а със силно хидрофобна външ­
на повърхност и хидрофилна вътрешност,
к о я т о образува легло о т кислородни а т о ­
ми за К+ (фиг. 10.6). Размерът на т о в а „лег-
ф и г . 10.6. Модел н а К + /валиномицинов комплекс
(по J. Ii. Kirchojfet al)
235
ло" о т г о в а р я много т о ч н о н а г о л е м и н а т а
тяло на
н а К + без х и д р а т н а т а обвивка, д о к а т о Na + стъкления
е със значително no-малък д и а м е т ъ р и за­ електрод

т о в а не може да се задържи в м е м б р а н а т а .
Така се обяснява о т л и ч н а т а диференциал­
н а с е л е к т и в н о с т н а валиномициновия елек­ общ
т р о д за К + срещу N a + и п р и г о д н о с т т а м у корпус

за определяне н а К + в биологични т е ч н о с ­ референтен вътрешен

електрод електрод
ти. (Ag/AgCI) (Ag/AgCi;
Йон-селекпгивните мембрани за Na*, NaHCOj
фосфатен!
Са*+ и СГ са изработени по подобен начин буфер

с използване н а подходящи йонофори (вж. гумен

т а б л . 10.1). Те с в ъ р з в а т с ъ о т в е т н и т е йо­ пръстен
ни по механизъм аналологичен н а К + - селек­ вход за изход за
пробата пробата
т и в н и я валиномицинов електрод. NH4 + -се­
pH чувствителна стъклена
л е к т и в н а т а мембрана съдържа смес о т ан­ стъклен прозорец
мембрана
т и б и о т и ц и т е н о н а к т и н и м о н а к т и н , ко­ кювета порьозно пространство
и т о са също н е у т р а л н и молекули-носите- СО2 пропусклива мембрана

ли. Фиг. 10.7. Схема н а рС0 2 електрод (no R.A. Dursi

ЙСЕ с т в ъ р д о ф а з о в и л ю м б р а п и . Мемб­
р а н и т е на т е з и електроди п р е д с т а в л я в а т
единични т в ъ р д и к р и с т а л н и соли н а из­
следвания йон (хомогенни мембрани) или
пресовани п е л е т и н а соли, включени в инер­
т е н м а т р и к с (хетерогенни мембрани). И в
д в а т а случая м е м б р а н и т е са п р а к т и ч е с к и
неразтворими във вода и п р и т е ж а в а т оп­
ределена е л е к т р о п р о в о д и м о с т . О т т а з и
група електроди в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о ­
рия н а м и р а т приложение ф л у о р и д н и я т и
хлоридният. М е м б р а н а т а н а флуоридния
електрод представлява хомогенен к р и с т а л
о т LaFß, обработен с Еи2+ з а да се осигури
е л е к т р о п р о в о д и м о с т . К р и с т а л н а т а ре­
ш е т к а п р и т е ж а в а празнини, к о и т о ефек­
т и в н о с в ъ р з в а т F о т и з с л е д в а н а т а про­
ба. С е л е к т и в н о с т т а е много добра, защо-
т о
9РУ2и аниони не м о г а т д а н а в л я з а т в
к р и с т а л н а т а с т р у к т у р а . Е л е к т р о д ъ т се
прилага за определяне н а F в кръв, урина,
слюнка и к о с т и (след р а з т в а р я н е т о и м в
подходящи среди). Х л о р и д н и я т е л е к т р о д
използва мембрана, изградена о т пресова­
ни п е л е т и AggS и AgCl. Използва се з а опре­
деляне н а С1 в кръв а също и в п о т - чрез
директен к о н т а к т с к о ж а т а .
и О. Sigga a rd-A ndcrscn)
И д в а т а с а базирани н а с т ъ к л е н pH елек­
т р о д , о т д е л е н о т биологичната среда със
с ъ о т в е т е н е л е к т р о л и т е н р а з т в о р и газ-
пропусклива с е л е к т и в н а мембрана.
Електродът за определяне на рС0 2 (фиг.
10.7) п р е д с т а в л я в а в с ъ щ н о с т цяла галва­
нична к л е т к а , з а щ о т о и н д и к а т о р н и я т и
в ъ н ш н и я т р е ф е р е н т е н електрод са вграде­
ни в общ блок. П р о б а т а з а анализ е в кон­
т а к т с пропусклива з а СО2 мембрана о т си-
ликонова гума, к о я т о е разделена о т с т ъ к ­
л е н а т а мембрана н а pH е л е к т р о д а с т ъ н ъ к
филм о т б и к а р б о н а т е н р а з т в о р . Въглерод­
н и я т диоксид дифундира през силиконова-
т а мембрана под форма н а газ о т п р о б а т а
към бикарбонатния разтвор, измества
равновесието н а дисоциация н а въглената
киселина и предизвиква с ъ о т в е т н а pH про­
м я н а (фиг. 10.8). По т о з и начин pH н а би-
рИ Е Л Е К Т Р О Д
pH чувствителна f (
) -R
ТЬМЪК фнлм Т
О I НЛ;
бикарбонатен разтвор
+
COj + Н , 0 5 = ^ Н2СО,, HCOj

СО: пропусклива ^— (
ЙСЕ с г а з - ч у в с т в и т е л н и м е л г б р а п и . мембрана 1(
О т т о з и вид в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я ^ у
се използват два е л е к т р о д а - з а определяне С 0
2 ПРОБА

съдържанието н а въгледоден диоксид (С0 2 ) Фиг. 10.8. Схема н а газ-чубстбителен електрос

и а м о н я к (NHg) в биологични т е ч н о с т и . за С0 2 (no J. R. Kirchojfet at)
236
к а р б о н а т н и я р а з т в о р е функция н а парци­
а л н о т о налягане н а въглеродния диоксид
(рСОз) в и з с л е д в а н а т а проба и в е л и ч и н а т а
му зависи о т о т н о с и т е л н а т а с е л е к т и в -
н о с т н а е л е к т р о д а , к о е ф и ц и е н т а н а раз­
т в о р и м о с т н а СО2 и к о н с т а н т а т а н а ди-
социация н а в ъ г л е н а т а киселина.
Електодът за определяне н а N H 3 e конс­
т р у и р а н к а т о С 0 2 е л е к т р о д а , но порьозна-
т а тефлонова м е м б р а н а е селективно про­
пусклива за NH3 к а т о газ, а бикарбонатни-
я т р а з т в о р е заменен с р а з т в о р н а амони­
ев хлорид. Тук, и з м е р е н о т о pH е пропорци­
онално н а п а р ц и а л н о т о налягане н а амоня­
ка (рКНз) в и з с л е д в а н а т а проба.
ВОЛТАМПЕРОМЕТРИЧНИ МЕТОДИ
В о л т а м п е р о м е т р и ч н и т е м е т о д и се осно­
в а в а т н а използване н а електролизни к л е т ­
ки, при к о и т о приложен о т в ъ н п о т е н ц и а л
предизвиква е л е к т р о х и м и ч н а т а р е а к ц и я
(електролиза), а г е н е р и р а н и я т в р е з у л т а т
на т а з и реакция т о к е м я р к а з а концен­
т р а ц и я т а н а определяния компонент.
Електрохимичните клетки за волтамперо-
метрия най-често и м а т триелектродна
конфигурация и се с ъ с т о я т о т р а б о т е н ,
референтен и допълнителен електрод. Вън­
ш н и я т п о т е н ц и а л се прилага между р а б о т ­
ния и р е ф е р е н т н и я е л е к т р о д . П о т е н ц и а ­
л ъ т се подбира по знак и величина т а к а , че
да предизвика химични промени н а опреде­
л я н о т о в е щ е с т в о върху г р а н и ч н а т а повър­
х н о с т на р а б о т н и я електрод. М е х а н и з м ъ т
на т е з и промени се свежда до електролиза
чрез окисление или редукция, к о я т о се реа­
лизира чрез пренос ( с ъ о т в е т н о - о т д а в а н е
или приемане) н а е л е к т р о н и между веще­
с т в о т о и е л е к т р о д а . Ендогенни и екзо-
геннни с ъ с т а в к и н а биологичните т е ч н о ­
с т и и т ъ к а н и , к о и т о м о г а т при определе­
ни условия д а се о к и с л я в а т или р е д у ц и р а т
върху р а б о т н и я елекрод се о з н а ч а в а т ка­
т о е л е к т р о а к т и в н и . Именно т е са подхо­
дящи з а определяне чрез в о л т а м п е р о м е т -
рия. Д о п ъ л н и т е л н и я т е л е к т р о д д о с т а в я
т о к за поддържане н а е л е к т р о л и з а т а вър­
ху р а б о т н и я е л е к т р о д и з а осигуряване н а
е л е к т р о н е у т р а л и т е т а на ц я л а т а клетка.
Така р е ф е р е н т н и я т е л е к т р о д се предпазва
о т големи т о к о в и вариации, к о и т о биха
променили неговия п о т е н ц и а л . По-рядко
в о л т а м п е р о м е т р и я т а се прилага в двуелек-
т р о д е н в а р и а н т , при к о й т о липсва допъл­
н и т е л н и я електрод и р е ф е р е н т н и я т елек-
т р о д поема целия т о к н а с и с т е м а т а .
Р а б о т н и т е е л е к т р о д и за волтампе-
р о м е т р и я следва да п р и т е ж а в а т много доб­
р а проводимост, химична и електрохимич-
н а и н е р т н о с т . Р азн о ви д н о сти те им се об­
с ъ ж д а т п о - н а т а т ъ к в изложението. К а т о
р е ф е р е и т п и се използват описаните на­
с и т е н каломелов електрод (НКЕ) и сребър-
но-хлориден (Ag/AgCl) електрод. Д о п ъ л н и ­
т е л н и т е е л е к т р о д и се и з р а б о т в а т о т
всякакъв проводим м а т е р и а л , най-често -
п л а т и н е н а нишка.
Независимо о т р а з н о в и д н о с т и т е по­
м е ж д у им, всички в о л т а м п е р о м е т р и ч н и
т е х н и к и се о с н о в а в а т н а анализ н а зави­
с и м о с т т а между приложения п о т е н ц и а л
Е (измерван в mV) и г е н е р и р а н и я т т о к i
(измерван в т А , |дА или пА). Графиката на
т а з и з а в и с и м о с т се нарича волтамперо-
гралш, полярографска Вълна или волтампер-
на крива. Фигура 10.9 показва волтамперо-
г р а м а н а електроредуцируемо в е щ е с т в о .
П о с т е п е н н о т о повишаване н а о т р и ц а т е л ­
ния потенциал формира т р и зони на кри­
в а т а на измервания т о к . В зона А п о т е н ­
ц и а л ъ т е н е д о с т а т ъ ч е н да предизвика елек­
т р о л и з а и з а т о в а реакционен т о к не се ре­
г и с т р и р а . Е л е к т р о л и з а т а з а п о ч в а при
с т о й н о с т на потенциала Ej, о т к о я т о се
р е г и с т р и р а бързо н а р а с т в а н е н а т о к а и
формиране на зона В. Т о к ъ т д о с т и г а мак­
симална с т о й н о с т при потенциал и п0'
237
н а т а т ъ ш н о т о повишаване на потенциа­
ла не променя т о з и максимум - формира се
плато на т о к а (зона С на волтамперната
крива). Максималният т о к се нарича гра­
ничен т о к it, или полярографски дифузио-
нен ток. Принципите на волтамперомет-
рия чрез окисление са аналогични и м о г а т
да се изведат при прилагане на увеличаваш
се положителен потенциал върху електро-
лизната клетка. Прието е редукцията да
се описва с положителен (катоден) т о к , а
окислението - с отрицателен (аноден) т о к .
Волтамперната крива притежава д в е
важни свойства, които правят волтампе-
рометричните методи едновременно под-
ходяиш за качествен и количествен анализ
на изследваните електроактивни състав­
ки на биологичните т е ч н о с т и :
• инфлексната точка на кривата, опреде­
лена к а т о потенциал за получаване на
полумаксимален т о к (полувълнов п о т е -
циал, Е ^ ) е уникално характерна за ана­
лизираното вешество, което се електро-
лизира чрез окисление или редукция. Сле­
дователно, с т о й н о с т т а на полувълно-
вия потенциал Е 1 / 2 е важна качествена
характеристика на изследваната със­
тавка, к о я т о се използва за идентифи­
кацията й;
• с т о й н о с т т а на граничния т о к i/ е важ­
на количествена характеристика на из­
следваната съставка - директно пропор­
ционална на концентрацията й, з а ш о т о
при д о с т а т ъ ч н о висок редукционен по­
тенциал (над Е2) с к о р о с т т а на електро­
лизата е зависима единствено о т дифу-
зионната скорост на вешеството, коя-
т о е функция о т неговата концентра­
ция.
Както вече беше споменато, волтампе-
рометричната терминология остава дос­
т а объркана и, въпреки че някои автори
въобше не използват термина амперомет-
рия, все повече се налага следната класи­
фикация;
а л т е р о л г е т р и л - измерване на електро-
лизния т о к при к о н с т а н т е н външен по­
тенциал;
полярография и Оолталтеролютрил
в тесен смисъл - измерване на електролиз-
ния т о к при непрекъсната промяна на вън­
шния потенциал чрез п о т е н ц и о с т а т
238
А м п е р о т е т р и я т а намира широкс
приложение в клиничната лаборатория Ri
При нея се изследват чрез редукция илъ
окисление е л е к т р о - а к т и в н и в е ш е с т в а
обикновено при потенциал д о с т а т ъ ч е н зе
генериране на граничен т о к , т а к а че изме­
реният т о к да бъде пропорционален на кон­
ц е н т р а ц и я т а на вешеството. Трите най-
важни амперометрични сензора за клинич­
н а т а лаборатория са кислородният елек­
трод на Clark, глюкозният електрод и елек-
тро-химичният детектор з а високоефек­
тивна течностна хроматография.
И о л я р о г р а ф и я т а е термин за означа­
ване на отделен вид волтамперометрия.
използваш^ к а т о работен електрод живак
във форма на капещ живачен електрод, раз­
работен о т Heyrovsky през 1922 г. Този елек­
т р о д се състои о т малки капчици живак,
отделяищ се в края на т ъ н к а стъклена ка-
пилярка. Така повърхността за извършва­
не на електрохимичната реакция непрекъс­
н а т о се подновява и се елиминира възмож­
н о с т т а за замърсяване на електрода о т
продукти на реакцията и плазмени белтъ­
ци.
В о л т а м п е р о м е т р и ч н и т е лгстоди,
използващи променлив потенциал за пре­
дизвикване на е л е к т р о л и з н а т а реакция
и м а т много разновидности, но заедно с по-
лярографията, н а м и р а т о тно сител но ог­
раничено приложение в клиничната лабо­
ратория. З а т о в а в т о з и т е к с т т е се пред­
с т а в я т н а к р а т к о , предимно о т гледна \
т о ч к а на в и д о в е т е използвани р а б о т н и
електроди. За разлика о т полярографията
т е з и работни електроди не се подновяват
в хода на анализа и са податливи на замър­
сяване о т компоненти на изследвания ма­
териал. Изработени са най-често о т пла­
т и н а , з л а т о , живак и г р а ф и т в стъклен
корпус. Променливият потенциал се при­
лага в най-различна форма и в зависимост
о т т о в а се различават линейна волтам-
перометрия (разгледана в преходните па­
раграфи), пулсова, диференциална пулсова
волтамперометрия и други, които изпол­
з в а т по-сложни волтажни промени. Пре­
д и м с т в а т а на т е з и техники спрямо поля­
рографията се д е м о н с т р и р а т най-добре
чрез анод-обелващата волтамперометрия,
която се извършва на два е т а п а . В начало­
т о , под действие на отрицателен потен-
циал м е т а л н и т е йони о т п р о б а т а се реду­
ц и р а т върху р а б о т н и я е л е к т р о д - г р а ф и т ­
на пръчка п о к р и т а с жи ва к - и се н а т р у п ­
в а т н а п о в ъ р х н о с т т а му. Т а к а определя­
н и я т к о м п о н е н т се п р е к о н ц е н т р и р а чрез
електрохимична е к с т р а к ц и я о т п р о б а т а
върху е л е к т р о д а . И м е н н о т о в а с т ъ п а л о ,
продължаващо о т 1 до 30 min, определя ви­
с о к а т а ч у в с т в и т е л н о с т на т а з и техни­
ка. След т о в а се р е г и с т р и р а в о л т а м п е р о -
грама между п о к р и т и я с изследваните ме­
т а л и е л е ктрод к а т о анод и един неполяри-
зируем к а т о д . На т о з и в т о р и е т а п о т ана­
лиза м е т а л и т е се о т с т р а н я в а т (обелват)
о т п о в ъ р х н о с т т а н а анода чрез окисление
във ф о р ма н а с ъ о т в е т н и йони, к о е т о се
п о с т и г а с прилагане н а н а р а с т в а щ поло­
ж и т е л е н потенциал. Този процес дава наи­
менованието на метода. Р е д ъ т , в к о й т о
м е т а л и т е се о т д е л я т о т анода е в зависи­
м о с т о т т е х н и я специфичен редокс п о т е н ­
циал Е 1 / 2 , а р е г и с т р и р а н и я т т о к е м я р к а
за к о н ц е н т р а ц и я т а им. Следователно
анод-обелващата волтамперометрия е
подходяща з а едновременна и д е н т и ф и к а ­
ция и определяне н а няколко м е т а л а в био­
логични м а т е р и а л и . З а съжаление, висока­
т а ч у в с т в и т е л н о с т н а м е т о д а се компро­
м е т и р а о т н е д о с т а т ъ ч н о възпроизводимо
о ч и с т в а н е н а а н о д н а т а п о в ъ р х н о с т . Ме­
т о д ъ т се прилага з а анализ н а т е ж к и ме­
т а л и в биологични м а т е р и а л и , но в клинич­
н а т а л а б о р а т о р и я о т с т ъ п в а н а по-съвър-
шени технологии - а т о м н о - а б с о р б ц и о н н а
с п е к т р о м е т р и я и високоефективна т е ч -
ностна хроматография.
Кислороден е л е к т р о д
Конструиран е о т Clark пред 1956 г. и пред­
с т а в л я в а пълна двуелектродна електрохи-
' мична к л е т к а (фиг. 10.10). С ъ с т о и се о т дис­
ков п л а т и н о в к а т о д ( р а б о т е н електрод) и
сребърно-хлориден (Ag/AgCl) анод (референ-
т е н електрод), к о и т о с а п о т о п е н и във фос-
фатно-буфериран р а з т в о р н а н а с и т е н ка­
лиев хлорид. К а т о д ъ т е разделен о т проба­
т а за анализ чрез кислород-пропусклива по-
липропиленова мембрана и т ъ н ъ к филм о т
буферния р а з т в о р . В ъ н ш н и я т з а к л е т к а ­
т а п о т е н ц и а л се прилага т а к а , че п л а т и ­
н о в и я т к а т о д д а е о т р и ц а т е л н о зареден
спрямо сребърния анод и п о т е н ц и а л н а т а
разлика да е в диапазона о т -0.5 до -0.65 V.
При т е з и условия е л е к т р о н и т е генерира­
ни н а анода се и з п о л з в а т з а редукция н а
кислород върху к а т о д а . В р е з у л т а т н а елек­
т р о л и з а т а п а р ц и а л н о т о налягане (мярка
з а к о н ц е н т р а ц и я н а газовете) н а кислоро-
да (рОз) върху к а т о д а спада рязко и з а т о в а
п о в ъ р х н о с т т а н а е л е к т р о д а служи к а т о
капан з а кислород. За да се покрие създаде­
ния д е ф и ц и т започва дифузия на кислород
о т п р о б а т а през м е м б р а н а т а и буфера. Ди-
ф у з и о н н а т а с к о р о с т н а кислорода през мем­
б р а н а т а е л и м и т и р а щ о с т ъ п а л о , к о е т о за­
виси о т р02 н а п р о б а т а и з а т о в а генерира­
н и я т в р е з у л т а т н а р е д у к ц и я т а т о к е мяр­
к а за рОг в изследвания м а т е р и а л . Е л е к т ­
р о д н и т е реакции м о г а т да се р е з ю м и р а т
така:
на сребърния анод: 4Ag+ + 4CI -> 4AgCl + 4е"
на платиновия катод: 0 2 + 2Н + 2е' —•> Н 2 0 2
Н 2 0 2 + 2Н + 2е -• 2Н 2 0
или сумарно: О, + 4Н + 4е -> 2Н 9 0
М е м б р а н а т а осигурява равномерна ди-
фузионна с к о р о с т н а кислорода, зависеща
само о т парциалното му налягане в проба­
т а и пречи н а б е л т ъ ц и т е и други окисли­
т е л и д а д о с т и г н а т р а б о т н а т а повърх­
н о с т н а електрода. Неправилното функци­
ониране на кислородния електрод се обус­
лавя о т увреждане на м е м б р а н а т а , промя­
н а н а pH н а буфера и о т л а г а н е на сребро
върху платиновия к а т о д . С м я н а т а на бу-
срсбърно-хлориден
референтен електрод
работен
платинов
електрод
Pt диск
гумен
пръстен s ч
тънък филм мембрана Ag пръстен
от буфер (>2
Фиг. 10.10. Схема на кислороден електрод (no J.R.
Kirchojfet a l )
A - напречно сечение
Ь - ф р о н т а л е н изглед
239
фера u м е м б р а н а т а решава о т с т р а н я в а н е ­
т о на п ъ р в и т е две причини, а полирането
на к а т о д а със специална п а с т а регенерира
р а б о т н а т а му повърхност.
Кислородният е л е к т р о д н а м и р а много
широко приложение в к л и н и ч н а т а лабора­
т о р и я . Той се използва в к р ъ в н о г а з о в и т е
анализатори за определяне н а рОг на а р т е ­
риална и капилярна кръв и в още по-миниа-
тюризиран в а р и а н т - за д и р е к т е н т р а н с -
к у т а н е н анализ н а рОг- За съжаление, т о ч ­
н о с т т а на директн и я безкръвен анализ не
винаги е д о с т а т ъ ч н а , з а ш о т о зависи о т
физични х а р а к т е р и с т и к и н а к о ж н а т а по­
върхност, о т т е м п е р а т у р а т а на пациен­
т а и о т периферното кръвоснабдяване, ко­
е т о се изменя ч у в с т в и т е л н о в условия н а
шок и други к р и т и ч н и с ъ с т о я н и я . Кисло­
р о д н и я т електрод се използва и к а т о ин­
дикатор - сензор и преобразувател в конс­
т р у к ц и я т а на много ензимни биосензори.
При т я х а н а л и т и ч н а т а реакция е оксидаз-
на и измерването н а кислородната консу­
мация или производството н а Н2О2 в хода
на реакцията, е мярка з а т ъ р с е н а т а кон­
центрация. П р и л а г а т се за определяне н а
глюкоза, холестерол, пикочна киселина и др.
Глюкозеи електрод
Исторически глюкозният електрод е пър­
в и я т истински биосензор - ензимен ампе-
рометричен уред за определяне на глюкоза
в биологични материали, к о й т о и до сега е
сред най-често използваните биосензори в
клиничната лаборатория. К о н с т р у и р а н е
о т Clark и Lyons през 1962 г. Представлява
кислороден електрод, комбиниран с имоби-
лизирана глюкозооксидаза. Е н з и м ъ т е ин­
крустиран в гел или р а з т в о р е н подходящо
в п р о с т р а н с т в о т о между две мембрани -
външна, пропусклива з а глюкоза, к о я т о
о т д е л я сензора о т биологичната проба и
в ъ т р е ш н а - газ-пропускливата м е м б р а н а
на кислородния електрод. Глюкозооксида-
з а т а катализира с л е д н а т а реакция:
1 люкоза + Оа -> ГлюкопоВа киселина + Н202
Е л е к т р о д ъ т може да се н а с т р о и з а оп­
ределяне на рОз или Н 2 0 2 . В първия случай
т о й действа при о т р и ц а т е л е н външен по­
тенциал к а т о кислороден електрод и глю-
240
к о з н а т а к о н ц е н т р а ц и я в п р о б а т а е про­
порционална н а с к о р о с т т а н а кислородна­
т а консумация в биосензора. Проблем н а
т о з и в а р и а н т са п р о м е н и т е в рОз н а про­
б а т а , к о и т о м о г а т да се е л и м и н и р а т чрез
включване н а в т о р и , свободен о т ензим
кислороден електрод. Последният мери са­
мо рОг и чрез сравнение с т о к а н а биосен­
зора компенсира в а р и а ц и и т е . Във в т о р и я
случай се подава положителен в о л т а ж меж­
ду р а б о т н и я и р е ф е р е н т н и я е л е к т р о д н а
а м п е р о м е т р и ч н и я сензор т а к а , че п л а т и ­
н о в и я т е л е к т р о д е поляризиран с + 0.6 V
о т н о с н о сребърния електрод. При положи­
т е л е н в о л т а ж кислородът не е електроак-
т и в е н , но к л е т к а т а окислява количестве­
но водородния прекис. Този режим н а рабо­
т а позволява о т ч и т а н е н а н а т р у п в а н е т о
н а П2О2 независимо о т вида н а о к с и д а з а т а
и с у б с т р а т а . Нарича се прекисен електрод
и намира приложение при к о н с т р у и р а н е т о
н а редица биосензори о т първо поколение.
В к о н к р е т н и я случай т ъ р с е н а т а глюкозна
к о н ц е н т р а ц и я е право пропорционална н а
произведения о т е н з и м н а т а реакция П202.
Аскорбиновата киселина, п и к о ч н а т а кисе­
лина и п а р а ц е т а м о л ъ т са е л е к т р о а к т и в -
ни в у с л о в и я т а н а анализа, но не и н т е р ф е -
р и р а т , т ъ й к а т о в ъ т р е ш н а т а мембрана е
непропусклива з а т я х . Проблем н а т о з и ва­
р и а н т може да бъде изчерпването н а кис­
лорода, к о й т о е необходим и з а извършва­
не н а е н з и м н а т а реакция, и з а окисление­
т о н а Н20 2 .
Електрохимични д е т е к т о р и
за Високо-ефектиНна
т е ч п о с т п а хроматография
Независимо о т с ъ щ е с т в у в а щ и т е к о н с т ­
р у к т и в н и различия, всички електрохимич­
ни д е т е к т о р и з а високо-ефективна т е ч -
н о с т н а х р о м а т о г р а ф и я (ЕХД з а ВЕТХ) са
основани н а принципа н а а м п е р о м е т р и я -
т а и и з п о л з в а т т р и - е л е к т р о д н а конфигу­
рация о т о п и с а н и т е р а б о т е н , р е ф е р е н т е н
и допълнителен електрод. Р а б о т н и я т елек­
т р о д е г р а ф и т вграден в с т ъ к л о , референ-
т н и я т е Ag/AgCl, а д о п ъ л н и т е л н и я т е ме­
т а л е н , обикновено в корпуса н а д е т е к т о ­
ра. Е л е к т р о д и т е с а събрани в блок форми­
р а щ м и н и а т ю р н а п р о т о ч н а к ю в е т а , през
к о я т о п р о т и ч а nog високо налягане идва­
щ а т а о т а н а л и т и ч н а т а колона подвижна
фаза, със с т р у я обикновено насочена сре­
щу р а б о т н и я е л е к т р о д . Р а з д е л е н и т е съе­
динения п о с т ъ п в а т едно след друго в к л е т ­
к а т а н а д е т е к т о р а и онези о т т я х , к о и т о
са е л е к т р о а к т и в н и в у с л о в и я т а н а анали­
за, в з а и м о д е й с т в а т с р а б о т н и я е л е к т р о д
к а т о о б м е н я т е л е к т р о н и с него. П о т е н ц и ­
а л ъ т н а д е т е к т о р а се избира т а к а , че елек­
т р о л и з а т а да п р о т и ч а в зона С н а в о л т а м -
п е р н а т а крива н а всички определяни ком­
п о н е н т и (вж. фиг. 10.9). Д е т е к т о р ъ т за­
писва к р и в а т а н а генерирания т о к к а т о
мярка з а т я х н а т а к о н ц е н т р а ц и я и полу­
ч е н а т а графика о т н е с е н а к ъ м в р е м е т о е
аналогична н а х р о м а т о г р а м а т а , получена
с други д е т е к т о р и .
Ч у в с т в и т е л н о с т т а н а ЕХД е по-висока
о т с п е к т р о м е т р и ч н и т е (с цял порядък) и
ф л у о р е с ц е н т н и т е д е т е к т о р и за ВЕТХ - гра­
н и ц а т а н а определяне з а някои е л е к т р о а к ­
т и в н и с ъ с т а в к и д о с т и г а единични pmol/1.
Едновременно с т о в а анализъ п е високо се­
л е к т и в е н и специфичен - възможно е при
едновременно елуиране н а няколко съедине­
ния д а се получи „ ч и с т " х р о м а т о г р а ф с к и
пик, з а щ о т о само едно о т т я х се окислява
или редуцира в д е т е к т о р а и с ъ о т в е т н о -
генерира сигнал, к о й т о се записва. Селек-
т и в н о с т т а ( р е г и с т р и р а н е само на е л е к т -
роактивните компоненти на елуата о т
а н а л и т и ч н а т а колона) д а в а важно допъл­
нително п р е д и м с т в о н а ВЕТХ с ЕХД - оп­
р о с т е н а п о д г о т о в к а н а п р о б и т е за/анализ,
ч е с т о приключваща с п р о с т о е д н о с т ъ п а л ­
но о б е з б е л т ъ ч а в а н е . П р и л о ж е н и я т а н а
ВЕТХ с ЕХД в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я се
о т н а с я т към г р у п а т а н а специализирани­
т е анализи. С п е к т ъ р ъ т обхваща аниони,
катехоламини, 5-хидроксииндоли и с е р о т о -
нин, ц и с т е и н , х о м о ц и с т е и н и г л у т а т и о н ,
о п и а т и , в и т а м и н и и др. З а много о т т е з и
компоненти ВЕТХ с ЕХД е р е ф е р е н т е н ме­
т о д за определяне.
КУЛОНОМЕТРИЯ
Кулонометрията е електрохимичен м е т о д ,
при к о й т о се измерва к о л и ч е с т в о т о елек­
т р и ч е с т в о , п р о т и ч а щ о между два е л е к т ­
рода на е л е к т р о л и з н а т а к л е т к а . Съгласно
закона на Faraday, к о л и ч е с т в о т о в е щ е с т ­
во, к о е т о се произвежда или консумира чрез
редокс-процеса върху е л е к т р о д и т е , е дирек­
т н о пропорционално на к о л и ч е с т в о т о елек­
т р и ч е с т в о , п р о т и ч а щ о между т я х :
Q = п МF
Q" количеството електричество (мерна единица
С = Ах s, коломб = ампер х секунда)
п - брой електрони участващи в окислението или
редукцията
М - количеството вещество (mol), което се окис­
лява или редуцира
F - к о н с т а н т а т а на Faraday (96 486 С тоГ 1 )
В к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я кулономет­
р и я т а намира приложение за определяне на
хлориди чрез кулонометрично т и т р у в а н е ,
при к о е т о се и з п о л з в а т комбинирано две
електрохимични с и с т е м и . П ъ р в а т а гене­
рира т и т р у в а щ а г е н т при постоянно нап­
режение, а в т о р а т а засича амперометрич-
но или п о т е н ц и о м е т р и ч н о в р е м е т о за из­
вършване на т и т р у в а н е т о . При т а з и пос­
т а н о в к а в р е м е т о е м я р к а за количество­
т о е л е к т р и ч е с т в о , изразходвано за т и т -
р а ц и я т а и следователно - за концентраци­
я т а на хлоридите, з а щ о т о при к о н с т а н т ­
но напрежение з а к о н ъ т на Faraday добива
вида:
Q = n M F = it
i - генерирания т о к (в А, ампери)
t - времето (в s)
Определянето се основава на р е а к ц и я т а
с получаване на у т а й к а о т AgCl. Титрува-
щ и я т а г е н т са Ag + , к о и т о се г е н е р и р а т
електрохимично о т сребърен анод при кон­
с т а н т н о напрежение. Въвеждането на про­
б а т а за анализ с т а р т и р а а н о д н а т а реак­
ция и х р о н о м е т ъ р а н а уреда. Хлоридите о т
п р о б а т а р е а г и р а т непрекъснато с получе­
н и т е сребърни йони и д о к а т о се и з ч е р п я т
напълно, п о д д ъ р ж а т много ниска концен­
т р а ц и я т а н а Ag + :
анодна реакция: Ag •Ag4 + е
реакция в р а з т в о р а : Ag + + CI •AgCl
След изчерпване н а С1 о т п р о б а т а за из­
следване рязко се покачва к о н ц ен тр ац и я ­
т а н а Ag + (еквивалентен п у н к т н а т и т ­
руването), и а м п е р о м е т р и ч н и я т (или по-
т е н ц и о м е т р и ч е н ) сензор з а Ag се задей-
241
cmßa u спира хронометъра.
Кулонометричното т и т р у б а н е н а хло­
риди е много т о ч н о и е сравнително необ-
ременено о т интерференция. Понякога оба­
че м о г а т да се п о л у ч а т фалшиво по-високи
р е з у л т а т и поради образуване н а н е р а з т ­
ворими сребърни комплекси с други анио-
ни. Възпроизводимостта може да се пони­
жи при високи к о н ц е н т р а ц и и н а хлориди
заради г о л я м о т о к о л и ч е с т в о образувана
утайка.
БМОСЕНЗОРМ
Б и о с е нзоръ т е а н а л и т и ч н о у с т р о й с т в о ,
к о е т о представ лява комбинация о т био­
логичен компонент и преобразува­
тел. Биологичният к о м п о н е н т е имобили-
зиран (нанесен върху мембрана, включен в
гел или свързан ковалентно направо за пре­
образувателя) и з а т о в а л ю Ж е д а с е и з ­
п о л з в а м н о г о к р а т н о . Той реагира по спе­
цифичен начин с определяното в е щ е с т в о в
п р о б а т а и в р е з у л т а т н а т о в а разпозна-
в а т е л н о взаимодействие се генерира био­
логичен или биохимичен сигнал. Разпозна-
в а т е л н о т о взаимодействие може да се ос­
новава на комплементарно свързване с ан­
т и т е л а , б е л т ъ ч н и носители, р е ц е п т о р и ,
ДНК-сонди и др. или н а биохимична реак­
ция, к а т а л и з и р а н а ензимно. З а т а з и био-
к а т а л и з а м о г а т да се използват п р е ч и с т е ­
ни ензими, к л е т ъ ч н и органели, и н т а к т н и
клетки, т ъ к а н и и дори - цели органи. Пре­
о б р а з у в а т е л я т долавя биологичния сигнал
и го транформира в електричен пропорци­
онално на к о л и ч е с т в о т о н а определяното
вещество. Преобразуването се п о с т и г а по
различен начин; о п т и ч н о {светлинна аб-
сорбция, флуоресценция, химична луминес-
ценция и биолуминесценция), чрез излгер-
в а н е нал1аса{пиезоелектрично, акустич­
но), н а т о п л и н а и л и е л е к т р о х и л т ч -
но. Засега електрохимичното преобразува­
не е преобладаващо в клинично-лаборатор-
н а т а п р а к т и к а и з а т о в а биосензорите се
р а з г л е ж д а т заедно с е л е к т р о х и м и ч н и т е
методи.
В зависимост о т с т е п е н т а н а и н т е г р а ­
ция между биокомпонента и преобразува­
т е л я биосензорите се к а т е г о р и з и р а т ка-
т о
Уреди о т първо, второ и трето поколе-
242
ние. При и н с т р у м е н т и т е о т първо поко­
ление д в а т а к о м п о н е н т а м о г а т да функ­
ц и о н и р а т с а м о с т о я т е л н о , т . е . - физичес­
к о т о им разделяне не п р о мен я т я х н о т о
действие. При биосензорите о т в т о р о по­
коление и н т е г р а ц и я т а между д в а т а ком­
п о н е н т а е п о - т я с н а и р а з д е л я н е т о им во­
ди до функционални нарушения и невъзмож­
н о с т з а с а м о с т о я т е л н а р а б о т а поне при
единия о т т я х . При и н с т р у м е н т и т е о т
т р е т о поколение б и о х и м и ч н и я т и е л е к т -
р о х и м и ч н и я т модул се х а р а к т е р и з и р а т с
пълна и н т е г р а ц и я , е л е к т р о х и м и я т а е ба­
зирана н а полупроводници и ф у н к ц и я т а н а
уреда се загубва напълно при о п и т з а раз­
деляне н а к о мп о н ен ти . Тези биосензори се
о з н а ч а в а т с т е р м и н а биочипове.
b u o c e i u o p i i о т п ъ р в о п о к о л е н и е . В кли­
н и ч н а т а л а б о р а т о р и я са навлезли ензимо-
амперометрични и ензимо-потенциомет-
рични у с т р о й с т в а . П ъ р в и я т р а з р а б о т е н и
въведен в к л и н и ч н о - л а б о р а т о р н а т а прак­
т и к а биосензор - г л ю к о з н и я т електрод - е
модел н а ензимо-амперометричен и н с т р у ­
м е н т о т първо поколение. Освен разгледа- i
н и т е два в а р и а н т а ( о т ч и т а н е н а глюкоз- -I
н а т а к о н ц е н т р а ц и я по с к о р о с т т а н а кис­
л о р о д н а т а консумация или н а т р у п в а н е т о
н а водороден прекис) е възможно ензимо-
п о т е н ц и о м е т р и ч н о определяне н а глюко-
з а т а с п о м о щ т а н а с т ъ к л е н рП електрод,
к о й т о р е г и с т р и р а п о н и ж е н и е т о н а pH в ре­
з у л т а т н а н а т р у п в а н е н а глюконова кисе­
лина. П р е к и с н и я т е л е к т р о д (кислороден
е л е к т р о д с положителен в о л т а ж , р е г и с т ­
риращ U 2 0 2 ) може да се комбинира с кисло­
родни о к с и д о - р е д у к т а з и з а най-различни
с у б с т р а т и , имобилизирани в мембрана или
гел върху него. Така с а к о н с т р у и р а н и ам-
п е р о м е т р и ч н и биосензори з а определяне н а
етанол, лактат, ацетилхолин, пикочна ки­
селина, холестерол и др. В т е з и случаи мем­
б р а н а т а съдържа с ъ о т в е т н о алкохолокси-
даза, л а к т а т о к с и д а з а , а ц е т и л х о л и н е с т е
раза, уриказа и т . н .
П ъ р в и т е п о т е н ц и о м е г п р и ч н и ензимни
елекроди и з п о л з в а т к а т о п р ео б р азу вател At
с т ъ к л е н рП е л е к т р о д или ПСЕ. Добър при­ -L
мер з а т о з и т и п биосензори е урея-чувст- -Г
в и т е л н и я т електрод, при к о й т о е н з и м ъ т т
уреаза е имобилизиран във форма н а гел вър
ху м е м б р а н а т а н а N1 ^ + -сел ек ти вен елек-
 mpog. Полученият 6 р е з у л т а т н а ензимна­
т а реакция а м о н я к хидролизира go NH4 + ,
к о й т о се р е г и с т р и р а о т е л е к т р о д а . Този
подход се използва с п о в е ч е т о деаминазни
ензими. Най- успеш н и т е п о т е н ц и о м е т р и ч -
ни ензимни е л е к т р о д и с а к о н с т р у и р а н и н а
о с н о в а т а на г а з - ч у в с т в и т с л н и т с е л е к ­
т р о д и за определяне н а а м о н я к (биосензо-
ри за определяне н а к р е а т и н и н , a c n a p m a m ,
някои аминокиселини, например фенилала-
нин и аденозин) и в ъ г л е р о д е н д и о к с и д
1 (биосензори з а определяне н а урея, о к с а л а т
и аминокиселини). Съгласно определението,
К + - с е л е к т и в н и я т е л е к т р о д с валиномици-
нова мембрана е също биосензор, при кой­
т о б и о к о м п о н е н т ъ т е валиномицин, а пре­
образувател - п о т е н ц и о м е т р и ч н и я т елек­
трод.
Биосензори о т И т о р о и т р е т о поко­
л е н и е . По-висока с т е п е н н а и н т е г р а ц и я
между ензима и е л е к т р о д а се п о с т и г а по
различни начини, но най-успешния о т т я х
е включването н а м е д и а т о р . Така с а конс­
т р у и р а н и биосензори о т в т о р о поколение.
Медиаторът е съединение, което се
р е д у ц и р а по-лесно о т к и с л о р о д а и к а ­
т о с о в а л к а п р е н а с я е л е к т р о н и меж­
д у е н з и м а и е л е к т р о д н а т а повърх­
ност. Примери з а електрон-пренасяиди ме-
д и а т о р и са бензохинон, м е т и л е н о в о синьо,
виологен, фероцин и негови производни.
Н а й - р а з п р о с т р а н е н и я т биосензор о т т о ­
зи т и п е глюкомер з а д о м а ш н а у п о т р е б а
о т д и а б е т н о болни. Основан е пак н а глю-
козооксидазната реакция, к а т о между имо-
б и л и з и р а н и я т ензим и е л е к т р о д н а т а по­
върхност е включен диметилфероцин. О т ­
ч и т а н е т о се извършва не по изчерпване­
т о н а с у б с т р а т и т е (кислород) или н а т р у п ­
в а н е т о н а п р о д у к т и т е (водороден прекис,
глюконова киселина), а по с к о р о с т т а н а
електронния п о т о к о т глюкозата към
е л е к т р о д н а т а повърхност. Р е а к ц и и т е мо­
г а т да се о б о б щ я т по следния начин:
Глюкоза + GO/FAD—>.Глюкоиова киселина + GO/FADH.2
[ (ред.) (ок.) (ок.) (ред.)
GO/FADH2 + 2М * X J O / F A D + 2М + 21Г
I (ред.) (ок.) (ок.) (ред.)
Върху електрода: 2М >• 2М + + 2е
(ред.) (ок.)
GO/FAD - каталитичем редокс ц е н т ъ р ма FAI)-3a(iu-
с и м а т а глюкозооксидаза в окислена форма
GO/FADH2 - в редуцирана форма
М - м е д и а т о р ъ т диметилфероцин
Е л е к т р о н и т е предадени н а електродна­
т а повърхност формират т о к , който е
пропорционален н а с к о р о с т т а на окисление
н а г л ю к о зата, и следователно - на нейна­
т а концентрация.
Биочиповете (биосензори о т т р е т о по­
коление) с а н а изследователско равнище.
Н я м а съмнение, че след усъвършенстване
и навлизане в промишлено п р о и з в о д с т в о
т е з и у с т р о й с т в а ще п р о м е н я т съществе­
но облика н а п р а к т и ч е с к а т а медицина.
Клетъчни и имунологични биосензори.
Използването н а к л е т к и , т ъ к а н и и органи
к а т о биокомпоненти н а п о т е н ц и о м е т р и ч -
ни сензори (Rechnitz e t al., 1979) се харак­
т е р и з и р а с определени предимства; избяг­
ва се т р у д о е м к о т о и скъпо получаване на
пречистени ензими, използва се уникална­
т а природна комбинация о т ензими, коен-
зими и други ф а к т о р и , к о м п а р т м е н т а л и -
зирани в м е т а б о л и т н и каскади и се удъл­
ж а в а ж и в о т а на биокомпонента. Едновре­
менно с т о в а обаче се удължава р а б о т н и я
цикъл на уреда и се налага специален к о н т ­
рол на с е л е к т и в н о с т т а на отговора - ин-
хибиране на нежелани ензимни реакции и
е л е к т р о н - т р а н с п о р т и р а щ и вериги. Добър
пример за к л е т ъ ч е н биосензор е имобили-
з и р а н е т о на Nocardia erythropolis върху кис­
лороден електрод за определяне на холесте-
рол. Р е а к ц и я т а е:
N. e r y l h r o p o l i a
Холестерол+О;. >-XoAecm-4-eii-3-oii+H 2 0 2
Холестгрол оксидаза
К и с л о р о д н и я т е л е к т р о д измерва ско­
р о с т т а н а кислородната консумация, ко­
я т о е пропорционална н а к о н ц е н т р а ц и я ­
т а н а холестерола в п р о б а т а за изследва­
не.
Имунобиосензорите използващи разпоз-
н а в а т е л н и т е възможности на р е а к ц и я т а
а н т и г е н - а н т и т я л о , ч е с т о комбинирана с
маркиране по подобие на белязания имуно­
логичен анализ, са в процес н а усъвършенс­
т в а н е . Пример е е н з и м н и я т имуносензор
з а определяне на IgG, при к о й т о анти-IgG-
а н т и т я л о е имобилизирано върху кислоро­
ден електрод. IgG о т п р о б а т а конкурира с
243
каталаза-белязан IgG з а ограничения брой
а н т и т е л а върху м е м б р а н а т а н а електро­
да. Търсената кониентраиия е о б р а т н о про-
пориионална н а к а т а л а з н а т а а к т и в н о с т ,
к о я т о се определя чрез кислородния е л е к т ­
род по с к о р о с т т а н а кислородната консу­
мация. Неудобства н а т о з и биосензор с а
н у ж д а т а о т последователни е т а п и з а из­
вършване н а и м у н н а т а реакция, за проми­
Книгонис
Ненов И. Основи на електрохимията. С , Д И "Техника", 1989,
374.
Петров Б и съав. Ръководство за упражнения по аналитична
химия и физични методи в аналитичната химия. С , Д И "Тех­
ника", 1985,474.
Durst RA, Siggaard-Andersen О. Electrochemistry. In: Burtis CA,
Ashwood ER (eds), Tietz textbook o f clinical chemistry, Phila­
delphia - London - Toronto - Montreal - Tokyo, WB Sound­
ers Company, 1994, 159-183.
Durst RA, Siggaard-Andersen O. Electrochemistry. In: Burtis CA,
Ashwood ER, Tietz (eds). Fundamentals o f clinical chemistry,
Philadelphia - London - Toronto -Montreal - Tokyo, W B
Sounders Company, 1996, 82-93.
Kirchoff JR, Wheeler JE, Lunte СЕ, Jenkins SH, Heineman W R .
Electrochemistry: principles and measurements. In: Kaplan
244
ване, за въвеждане в с у б с т р а т е н р а з т в о р
(водороден прекис) и в ъ з с т а н о в я в а н е по­
в ъ р х н о с т т а н а биосензора. Освен електро-
химични п р е о б р а з у в а т е л и при създаване­
т о н а имунобиосензори се експерименти­
р а т флуоресцентни, биолуминесцентни и
химичнолуминесцентни у с т р о й с в а , с кое­
т о з н а ч и т е л н о се повишава ч у в с т в и т е л ­
н о с т т а н а анализа.
LA, Pesce AJ (eds). Clinical chemistry - theory, analysis,
correlation. St Louis, Mosby, 1996, 277-291.
Meyerhoff ME, Opdycke WN. Ion-selective electrodes. In: Spiegel
HE (ed). Advances in clinical chemistry. New York, Academic
Press, 25, 1986.
Okorudu AO. Electrochemistry. In: Schoeff LE, Williams RH
(eds.) Principles o f laboratory instruments. St Louis - Balti­
more - Loston - Chicago - Philadelphia - S y d n e y - Toronto,
Mosby, 1993, 150-164.
Rechnitz GA, Arnold MA, Meyerhoff ME. Bio-selective mem­
brane electrode using tissue slices. Nature, 278. 1979, 466.
Robinson PK. Electrochemical techniques. In: Wilson K, Walker
JM. Principles and techniques o f practical biochemistry. Cam­
bridge, University Press, 1995, 530-573.
 Осмометрия
Т. Ш и п к о в
СЪЩНОСТ И П Р И Н Ц И П
НА ОСМОМЕТРИЯТА
Осмозата е предвижване на вода през мем­
браните о т п р о с т р а н с т в а с ниска кониен-
т р а ц и я на р а з т в о р е н и т е в е щ е с т в а към
п р о с т р а н с т в а с висока кониентраиия на
т е з и вещества. Тя се определя о т кониен-
т р а и и о н н а т а разлика по отношение на во­
д а т а . В р е з у л т а т на преминаване на р а з т ­
ворител (вода) през полупропускливи мемб­
рани, к о и т о р а з д е л я т р а з т в о р и т е л и
разтвор или два различни р а з т в о р а и про­
п у с к а т р а з т в о р и т е л я , а нс пропускат
(всички) разтворени вещества, се повиша­
ва х и д р о с т а т и ч н о т о налягане в ч а с т т а
о т с и с т е м а т а , к о я т о съдържа разтворе­
н и т е вещества - осмотично налягане (фиг.
11.1). Ослюпгичпото псиьягаис и з р а з я ­
в а х и д р о с т а т и ч н о т о л а л п г а п с , кое­
т о е необхоцUJMO, з а д а с е с ъ х р а н и обе­
м а н а д в е пространства, разделени
от п о л у п р о п у с к л и в а м е м б р а н а .
В биологичните системи р а з т в о р и т е л е
водата. К л е т ъ ч н и т е мембрани разделят
разтвори, к о и т о с ъ д ъ р ж а т различни ве­
щества. По пршщип т е са частично по-
Изходно с ъ с т о я н и е
Чист р а з т в о р и т е л Разтвор
Полупропусклива м е м б р а н а
ф и г . 11.1. Схематично п р е д с т а в я н е на осмо­
за
лупропускливи мембрани - пропускат освен
вода и някои малки молекули и йони, за раз­
лика о т с т р и к т н о полупропускливите
мембрани, които пропускат само вода. Ос-
м о л а л н а т а концентрация характе­
р и з и р а броя н а о с л ю т и ч н о а к т и в н и ­
т е ч а с т и ц и в 1 k g вода. Тя зависи о т
дисоииацията на разтворените вещества
- включва неелектролити, йони и колоидни
вещества. Прибавянето на разтворими ве­
щ е с т в а променя физичните свойства на
разтворителя: понижава се точката на
замръзване и налягането на парите; пови­
шава се точката на кипене и осмотично-
то налягане. Тези промени не за ви сят о т
вида, а само о т броя на разтворените час­
тици. Поради т о в а се означават к а т о ко-
лигативни ( о т colligare - свързвам, обобща­
вам) свойства. Теоретично един mol вещес­
т в о , к о е т о не се дисоциира при разтваря­
н е т о си в 1 kg вода съдържа 6.023 х 1023
молекули (число на Avogadro). Когато моле­
к у л а т а на дадено вещество при разтваря­
н е т о си във вода се дисоциира на две (напр.
NaCl) или т р и (напр СаС12) частици (йони),
осм оти ч н ото налягане се увеличава двой­
но, респ. тройно. В биологични системи.
Равновесно с ъ с т о я н и е
Чист р а з т в о р и т е л Разтвор
Осмотично
налягане
245
където са разтворени м н о ж е с т в о в е щ е с т ­ регва се о с м о т и ч н о т о д е й с т в и е н а серум­
ва не се осъществява дисоциация в с ъ о т ­ н и т е б е л т ъ ц и - нормално т о е по-малко о т
в е т с т в и е с м а т е м а т и ч е с к и я модел. Ч а с т 0,5% о т серумния о с м о л а л и т е т .
о т молекулите не се дисоииират. Напри­ И з м е р в а н е т о н а о с м о л а л и т е т а предос­
мер в човешка плазма NaCl е 93% дисоции- т а в я по-надеждна информация в сравнение
ран, к о е т о се означава с корекционен фак­ с изчисляването. То се о с ъ щ е с т в я в а с два
т о р ( коефициент н а а к т и в н о с т ) = 0.93. т и п а о с м о м е т р и , к о и т о и з м е р в а т понижа­
Най-общо о с м о л а л и т е т ъ т се изчислява в а н е т о или н а т о ч к а т а н а замръзване, или
по формулата; н а н а л я г а н е т о н а п а р и т е . Р а з л и к а т а меж- vi
ду измерения о с м о л а л и т е т и изчисления ос­
Os m ol/kg = фпС м о л а л и т е т се означава к а т о osmolal gap qi
ф - коефициент на а к т и в н о с т (осмолален дефицит), Л о з т , осмолална раз­
п - брой на р а з т в о р е н и т е ч а с т и ц и лика и обикновено се пренебрегва по о т н о ­
С - концентрация на в е щ е с т в а т а в mol/kg вода шение н а биологичните т е ч н о с т и . Число­
в и я т израз н а osmolal gap е < 10 mOsm/kg
С о с м о л а л и т е т с е о з н а ч а в а к о н ц е н ­ т е л е с н а вода. У с т а н о в я в а н е т о н а разлика
т р а ц и я т а на осмотично а к т и В п и т е > 10 m O s m / k g е указание з а наличие н а дру­
ч а с т и ц и р а з т В о р е и и В о п р е д е л е н а ги о с м о т и ч н о а к т и в н и в е щ е с т в а освен
м а с а (1 kg) Вода, д о к а т о о с м о л а р и т е т н а т р и й , глюкоза и урея ( е т а н о л , м е т а н о л ,
е к о н ц е н т р а ц и я т а н а о с м о т и ч н о ак- к е т о н н и т е л а ) във висока ( з а с т р а ш а в а щ а
т и В н и т е ч а с т и ц и р а з т В о р е и и В оп­ ж и в о т а ) к о н ц е н т р а ц и я .
р е д е л е н о б е м (1 1) Вода. От термодина- Р е ф е р е н т н и т е с т о й н о с т и на осмо­
м и ч н а гледна точка по-правилно е д а се л а л и т е т а в серум или плазма н а р а с т в а т с
ползва терминът о с л ю л а л и т е т , т ъ й в ъ з р а с т т а : при новородени - 265-275
като концентрацията на разтвореното m O s m / k g , при в ъ з р а с т н и до 60 год. - 275-
вещество, изразена въз основа м а с а т а н а 295 m ü s m / k g и при в ъ з р а с т н и над 60 год. -
разтворител, не зависи от температурата 280-300 mOsm/kg. В о т д е л н и порции урина
за разлика от тази, изразена въз основа на о с м о л а л и т е т ъ т варира в широки граници -
обема на разтворителя. Мерните едини­ о т 50 д о 1400 m O s m / k g , а в сборна урина
ци за означаване са съответно m O s m / k g и о т 24 h - м е ж д у 300 и 900 mO s m/ k g .
mOsm/l. В клиничната п р а к т и к а измерването на J
В п л а з м а т а о с м о т и ч н о т о налягане е о с м о л а л и т е т а следва д а замени определя­
сбор о т в ъ з д е й с т в и е т о н а н е е л е к т р о л и т и н е т о н а специфичното ( о т н о с и т е л н о т о )
(напр. глюкоза и урея), е л е к т р о л и т и (Na + , т е г л о н а урина. Изследването н а осмола- е
К + , СГ, НСОз ) и белтъци. Големите молеку­ л и т е т а се ползва з а х а р а к т е р и з и р а н е със­
ли в серума - б е л т ъ ц и т е и м а т о т н о с и т е л ­ т о я н и я н а х и п о х и д р а т а ц и л , д е х и д р а -
но висока к о н ц е н т р а ц и я изразена к а т о т а ц и л и х и п с р х и д р а т а ц и л .
тегло/обем, но поради т о в а , че не се дисо- При запазена бъбречна функция х и п е р о с -
ц и и р а т във водна среда и са с голяма моле­ м о л а л н и с ъ с т о я н и я (хипо- и д е х и д р а т а -
кулна маса и м а т много по-малко значение ция) н а с т ъ п в а т при н е д о с т а т ъ ч е н прием
за о с м о т и ч н о т о налягане в сравнение с йо­ или при повишена загуба н а т е ч н о с т и о т
н и т е к а т о Na + и СГ. организма (обилно п о т е н е , изгаряния, загу­
В п р а к т и к а т а широко се използва след­ ба н а т е ч н о с т и през г а с т р о и н т е с т и н а л н и я
н а т а формула за изчисляване на осмолари- т р а к т ) . Нарушена к о н ц е н т р а ц и о н н а спо­
тета:
с о б н о с т н а бъбреците, свързана с повише­
н а загуба н а вода освен при бъбречна недо­
mOsm/l=2xNa(mmol/l)+glucose (mmol/1) с т а т ъ ч н о с т може да възникне при инсипи-
+urea (mmol/1) ден д и а б е т , черепно-мозъчни т р а в м и , мо­
зъчни т у м о р и . О т д е л я н е т о н а големи коли­
В т а з и формула к о н ц е н т р а ц и я т а н а ч е с т в а о с м о т и ч н о а к т и в н и в е щ е с т в а -
н а т р и я се умножава по 2, за да се включи и у р е я при бъбречна н е д о с т а т ъ ч н о с т , глю­
о с м о т и ч н о т о действие н а с ъ п ъ т с т в а щ и ­
к о з а при захарен д и а б е т и а л ко х о л също
т е аниони (хлорид, бикарбонат). Пренеб­ може д а причини д е х и д р а т а ц и я .
246
 Х и п о о с м о л а л и и с ъ с т о я н и я се у с т а ­
новяват много по-рядко. При запазена бъб­
речна функция, за да възникне хипоосмола-
л и т е т на серума, човек т р я б в а да приеме
над 12 I вода. Недоимък на осмотично ак­
тивни вещества поради нарушена екскре-
ция на вода може да н а с т ъ п и при нарушена
филтрационна способност, повишена сек­
реция на а н т и д и у р е т и н ( т ъ й нар. синдром
на болните клетки) и нарушено хранене
при хроничен алкохолизъм, а повишена за­
губа на осмотично а к т и в н и вешества - при
б о л е с т т а на Addison и прием на диурети-
ци.
Измерването на о с м о л а л и т е т а на ури­
н а т а дава възможност за най-надеждно из­
следване на концентрационната и разреж­
даща способност на бъбреците. Съпоста­
вянето на уринния със серумния осмолали­
т е т - урина/серум индекс (нормално о т 1,0
до 3,0) позволява оценка на а к т у а л н о т о
състояние на х и д р а т а ц и я т а . При болни с
о с т р а и хронична бъбречна н е д о с т а т ъ ч ­
ност, к о г а т о с т о й н о с т т а на т о з и индекс
е > 1,01 няма задържане на т е ч н о с т и в ор­
ганизма, а к о г а т о е < 0,99 е налице задръж­
ка в т ъ к а н и т е на подлежащата за отделя­
не вода.
У С Т Р О Й С Т В О НА О С М О М Е Т Ъ Р А
В клиничните лаборатории осмолалите-
т ъ т се измерва най-често с осмометър,
който о т ч и т а понижаването на т о ч к а т а
на замръзване. О с м о л а л и т е т ъ т на дадена
10
е
ОС
ft
Е на биологичната проба
я-
D
О/
-5
-10
1 2 3 4
Време (min)
Фиг. 11.2. Принцип на измерване на осмолалитет чрез понижаване
т о ч к а т а на замръзване (обяснението - в т е к с т а )
биологична т е ч н о с т се определя чрез из­
мерване т о ч к а т а на замръзване на проба­
т а при сравняване с т о ч к а т а на замръзва­
не на с т а н д а р т е н разтвор (NaCl) с п о з н а т
осмолалитет. Графически измерването на
осмолалитета на т о з и принцип е предста­
вено на фиг, 11.2. Биологичната т е ч н о с т ,
к о я т о ще бъде изследвана се поставя в кю-
в е т а , к о я т о след т о в а се п о т а п я в камера,
охладена предварително до -7 0С (а-б). За ох­
лаждането се използва е ф е к т а на Peltier.
При бързото охлаждане пробата, к а т о вся­
ка преохладена т е ч н о с т о с т а в а в т е ч н о
състояние. След т о в а е п р у в е т к а т а с про­
б а т а се издига над нивото на охлаждаща­
т а т е ч н о с т и чрез вибрационно у с т р о й с т ­
во се предизвиква кристализиране. При
кристализацията се освобождава топлина,
к о я т о з а т о п л я биологичната проба до
т о ч к а т а ü на замръзване (б-в). До 2-3 min
се получава равновесна т е м п е р а т у р а - на­
лице е равновесие между процесите на зам­
ръзване и топене (в-г) и след т о в а под влия­
ние на охлаждащата т е ч н о с т т е м п е р а т у ­
р а т а отново се понижава (г-д).
На фиг. 11.3 схематично са представени
к о м п о н е н т и т е на осмометър, който из­
мерва понижаването т о ч к а т а на замръз­
ване. Основен компонент е камерата, съ­
държаща охлаждаща т е ч н о с т (а). В епру­
в е т к а т а с биологична т е ч н о с т са потопе­
ни вибриращо у с т р о й с т в о (б) и термис-
т о р (в) за о т ч и т а н е т е м п е р а т у р а т а на
пробата. Във веригата са включени потен­
циометър (г) и галванометър (д). С потен­
циометъра се нулира галванометърът по
т е м п е р а т у р а па замръзване
5 6
247

mo измерва понижаване т о ч к а т а на замръзва­
не (обяснението - в т е к с т а )
време н а п о с т и г а н е т о н а р а в н о в е с н а т а
т е м п е р а т у р а . Понижението н а т е м п е р а ­
т у р а т а н а замръзване н а даден р а з т в о р е
право порпорционално на о с м о л а л и т е т а
му. Т о ч к а т а н а замръзване н а р а з т в о р с
1000 mOsm/kg се понижава с 1.86 0С в срав­
нение с ч и с т а вода. С к а л а т а на потенцио­
м е т ъ р а , благодарение н а с ъ о т в е т н о калиб­
риране позволява д и р е к т н о о т ч и т а н е н а
о с м о л а л и т е т а н а биологичния р а з т в о р в
mOsm/kg,
Много по-ограничено приложение и м а т
о с м о м е т р и т е , к о и т о и з м е р в а т понижава­
а б
100
и \
\ понижаване
03
\ температурата
Й \
Е
аа0>3
С
а»
Е
ч 95
0 10 20
Ф и г . 11.4. Принцип на измерване на осмолалитет чрез понижаване
т о ч к а т а на кипене (обяснението - в т е к с т а )
248
не н а л я г а н е т о н а п а р и т е в р а з т в о р в срав­
нение с т о в а н а ч и с т и я р а з т в о р и т е л . Е
д е й с т в и т е л н о с т т е з и о с м о м е т р и измер­
в а т п о н и ж а в а н е т о н а т е м п е р а т у р а т а на
кондензиране н а р а з т в о р и т е л я ( в о д а т а '
под влияние н а р а з т в о р е н о т о вещество. Е
з а т в о р е н а т е р м о к а м е р а съдържаща т е р -
модвойка се въвежда биологичната проба.
К а м е р а т а се з а т в а р я и след достигане
т о ч к а т а н а кипене (фиг. 11.4 а-б) се охлаж­
да до т е м п е р а т у р а под к о н д е н з н а т а т о ч ­
к а (б-в). П р е к р а т я в а се о х л а ж д а н е т о и
т е м п е р а т у р а т а в к а м е р а т а се повишава
до к о н д е н з н а т а т е м п е р а т у р а (в-г), к а т с
н а с т ъ п в а равновесно с ъ с т о я н и е (г->) меж­
ду ф а з и т е т е ч н о с т и пара. Измерва се о
т а з и т е м п е р а т у р а , к а т о понижението е
пропорционално н а о с м о л а л и т е т а н а въве­
дения р а з т в о р .
Предложен е и о с м о м е т ъ р , к о й т о измер­
ва в е л и ч и н а т а н а о н к о т и ч н о т о налягане.
Две камерки се р а з д е л я т с полупропусклива
мембрана, през к о я т о не п р е м и н а в а т час­
т и ц и с молекулна м а с а > 30 kD. В измери­
т е л н а т а камерка се п о с т а в я серум или
плазма, в д р у г а т а (референтна) 150 mmol/]
р а з т в о р н а NaCl, Тъй к а т о п л а з м е н и т е (се­
р у м н и т е ) б е л т ъ ц и не м о г а т да п р е м и н а т
през м е м б р а н а т а в р е ф е р е н т н а т а камерка
възниква о т р и ц а т е л н о налягане. Рефе-
р е н т п и т е с т о й н о с т и н а т о в а налягане
в серум з а лежащи п а ц и е н т и са 2,8010,27
kFa, а за а м б у л а т о р н и п а ц и е н т и 3,33± 0,27
кРа. С ч и т а се, че и з м е р в а н е т о н а колоид­
н о т о (онкотично) о с м о т и ч н о налягане е
о т значение при провеждане н а постопера-
А
на кипене
\ ^ 3
» в
30 40 50 60
Време (sec)
ти б н а инфузионна терапия. Този т и п ос- т а на кипене, т я е почти два п ъ т и по-голя­
мометри не са намерили широко приложе­ ма - около 2,8%.
ние 6 клиничните лаборатории 6 Европа. Най-честа причина за аналитични греш­
ки при използване на осмометри на принци­
па на понижаване т о ч к а т а на замръзване е
Качества на о с м о м е т р и т е ползването на EDTA плазма вместо серум
Източници на грешки или плазма, получена с помошта на хепарин.
При осмометрите, които се основават на
По данни о т междулабораторните провер­ понижаване т о ч к а т а на кипене, аналитич­
ки на качеството, изнесени о т Колежа на ни грешки възникват при недостатъчно по­
американските патолози (CAP) значимо по- чистване на камерата и термодвойката.
възпроизводими р е з у л т а т и се получават Според J.E. Davies наличието на осмоме-
при използване на осмометри, които се ос­ т ъ р в клиничната лаборатория създава цен­
новават на понижаване т о ч к а т а на замръз­ на възможност за контролиране качество­
ване. Според т е з и данни невъзпроизводи- т о на реактивите. Доколкото осмолалите-
м о с т т а (CV%) при използване на осмомет­ т ъ т е назависим о т вида на молекулите в
ри на принципа на понижаване т о ч к а т а на даден разтвор, системното измерване на ос-
замръзване е около 1,5% д о к а т о при осмо­ молалитета на ползваните реактиви оси­
метри на принципа на понижаване точка- гурява постоянния им състав.

Книгопис

D a v i s JE. M e a s u r e m e n t o f c o l l i g a t i v e properties. In; Kaplan L A , Juel R. S e r u m o s m o l a l i t y . A C A P s u r v e y analysis. A m J Clin

P e s c e AJ ( e d s ) . C l i n i c a l C h em ist ry: T h e o r y , A n a l y s i s and C o r ­ Pathol, 68, 1977 (Suppl), 165-169.
relation, S t L o u i s - T o r o n t o - P r i n c e t o n , M o s b y , 1 9 8 4 , 2 3 2 - Maturen A , Webster R A . O s m o m e t r y . In: S c h o e f f L, W i l i a m s
239. (eds). Laboratory Instruments. St L o u i s - Baltimore etc.
Freier EF. O s m o m e t r y . In: T i e l z N A ( e d ) . F u n d a m e n t a l s o f C l i n i ­ Mosby, 1993, 221-230.
cal C h e m i s t r y (3"* e d ) , P h i l a d e l p h i a - L o n d o n e t c . , S a u n d e r s , M c O u e e n MJ. O s m o m e t r y . In: Werner M (ed). H a n d b o o k o f
1987, 101-104. Clinical Chemistry, B o c a Raton, C R C Press, 1 9 8 2 , 5 2 3 - 5 2 8 .
Heil W, S c h u c k l i e s s F, Z a w t a 13. R e f e r e n z b e r e i c h e für Kinder
und E r w a c h s e n e . Präanalytik. M a n n h e i m , H o e h r i n g e r , 4 0 ,
1996, 7 2 .

249
 Електрофореза
Е. Ц в е т а н о в а
СЪЩНОСТ И ОСНОВНИ ПОНЯТИЯ
Електрофорезата заема важно м я с т о в кли­
н и ч н а т а лаборатория. К а т о а н а л и т и ч н а
техника, т я е релативно бърза и п р о с т а .
Използва се главно за анализ, пречистване и
изолиране н а белтъци и нуклеинови кисели­
ни, но също т а к а и за пептиди, нуклеоти-
ди, аминокиселини, захари, ензими, изоензи-
ми и др. Въведена преди повече о т 60 години
и претърпяла изключително много проме­
ни във всички а с п е к т и , т я е и ще продължа­
ва да бъде метод на избор до п ъ л н о т о раз­
гадаване на човешкия протеом. Чрез т а з и
те х ника бяха получени важни сведения о т ­
носно с т р у к т у р а т а и ф у н к ц и я т а на много
белтъци и ДНК продукти.
Е л е к т р о ф о р е з а т а (ЕФ) е п р о ц е с п а
двшкение п а натоварени частички в
разтвор чрез п р и л а г а н е н а електрич-
н а с и л а п р е з с л г е с т а (фиг. 12.1). Клинич­
н а т а лаборатория разглежда главно пове­
дението н а някои макромолекули. Скорост­
т а на придвижване н а молекулата зависи
предимно о т нейния т о в а р , размер и фор­
ма. Н а т о в а р е н а т а ч а с т и ч к а показва т е н ­
денция за поляризиране н а близките а т о м и
или молекули. Макромолекулите си взаимо­
Токоизправтел
Фиг. 12.1. Схематично представяне н а електро­
фореза
д е й с т в а т с в о д н и т е молекули и се хидра-
т и р а т . Н а т о в а р е н и т е молекули с т а в а т
подвижни и се р а з д е л я т .
Е л е к т р о ф о р е т и ч н о поле. То се прилага
в р а з т в о р чрез о б р а т н о н а т о в а р е н и „елек­
троди". Н е г а т и в н о н а т о в а р е н и т е белтъци,
при повече о т м е т о д и т е , се д в и ж а т основ­
но към анода. Р а з д е л я н е т о н а б е л т ъ ч н и т е
молекули зависи о т в з а и м о д е й с т в и е т о на:
• в ъ н ш н о т о електрично поле
• приложения в о л т а ж н а с а н т и м е т ъ р
(V/cm)
• електричен т о в а р н а б е л т ъ ч н а т а моле­
кула (Q), к о й т о е функция н а р а з л и к а т а
между pH н а буферния р а з т в о р и изоелек-
т р и ч н а т а т о ч к а на д а д е н а т а белтъчна
молекула. Следователно, с и л а т а (F) н а
придвижване на б е л т ъ ч н а т а м о л е к у л а
зависи от товара на ч а с т и ч к а т а с ней­
н и я коефициент и волтажа. Изчислява се
по ф о р м у л а т а :
F = QV
V с к о р о с т т а (леснината), е к о я т о протеино­
в а т а молекула може д а премине през м а т -
рикса (целулоза, х а р т и я , агароза, акриламид
и др.)
Q - е л е к т р о е н д о о с м о т и ч н и я т т о к , к о й т о се по­
явява през с и с т е м а т а , поради разлика в т о ­
вара н а в о д н и т е молекули и т о в а р а на под­
държащия м а т е р и а л
Б у ф е р и и pH н а с р е д а т а . Р а з л и ч н и т е
ел ек тр о ф о р ети чн и т е х н и к и и з и с к в а т мно­
го добър подбор н а с ъ с т а в а , pH и й о н н а т а
сила н а използвания буфер. Й о н н а т а с и ­
л а се определя о т к о н ц е н т р а ц и я т а на все­
ки йон умножена по к в а д р а т а н а неговия
ефективен т о в а р . Д в и ж е н и е т о на молекули
с т о в а р зависи о т т я х н о т о {отрицате­
л е н л о г а р и т ъ м на дисоциационна констан-
Таблица 12.1. Основни компоненти, засягащи електрофоретичното разделяне
Показател Ефект
pH Променя товара на белтъците и е ф е к т и в н о с т т а на придвижване.
Рядко може да засегне с т р у к т у р а т а и да доведе до денатурация.
Йонна сила Променя волтажа и силата. С увеличаване на йонната сила се намалява
придвижването и се увеличава затоплянето.
Йонен с ъстав Може да промени мигрирането, ако взаимодействието с белтъците е силно.
Може да се получи е ф е к т на опашата фракция.
Волтаж По правило придвижването е пропорционално на волтажа.
Температура Температурният градиент в носещата среда причинява наклон на
фракциите. Свръхзатоплянето денатурира белтъците, а ниската
т е м п е р а т у р а намалява дифузията, но не променя разделянето.
Време Разделянето се увеличава с времето, но се наблюдава дифузия на
фракциите, която е равна на корен квадратен о т времето.
Среда Главните фактори на средата са: размер на порите, които засягат
с к о р о с т т а на придвижване и едноосмотичния ефект.

та) и о т pH н а р а з т в о р а . К о г а т о рК е рав­ и отрицателните групи и протеините не

но н а pH , т . е . и м а м е слаба киселина, само
50 % о т ч а с т и ч к и т е ще б ъ д а т н а т о в а р е ­
ни. Ако pH е с единииа под рК, 90 % о т бел-
т ъ и и т е ще б ъ д а т н е н а т о в а р е н и , а при pH
с единииа над рК, 90% о т т я х ще б ъ д а т на­
товарени. С л е д о в а т е л н о , е ф е к т и в н и я т
товар н а л ю л е к у л а т а и поувшкност-
т а й в а р и р а е p H н а с р е д а т а (табл.
12.1).
Белтъците e a альфотерни субстан­
ц и и и при ниско pH с а силно позитивни, ну­
леви (изоелектрични) - при изоелектрична-
т а т о ч к а и н е г а т и в н и - при алкално pH. То­
ва изисква в проиеса н а е л е к т р о ф о р е т и ч н о ­
т о разделяне да б ъ д а т използвани буфери с
възможност да п о д д ъ р ж а т к о н с т а н т н о рИ.
Подборът н а pH u вида н а буфера зависи о т
вида н а молекулите, к о и т о разделяме и по­
ведението им в даден р а з т в о р . Т о в а р ъ т , ка­
т о важен к о м п о н е н т при разделянето, за­
виси не само о т г р у п и т е , к о и т о носи даде­
н а т а молекула, но и о т й о н и з а ц и я т а на съ­
щ а т а при дадено pH. З а б е л т ъ и и т е т о в а с а
карбоксилните групи и аминогрупите. Чис­
т и я т т о в а р н а б е л т ъ и и т е се определя и о т
pH на о б к р ъ ж а в а щ а т а среда. Т о в а р ъ т н а
б е л т ъ и и т е може да п р е т ъ р п и п о с т т р а н с -
лационни промени при прибавяне на н а т о ­
варени или н е н а т о в а р е н и захари, сулфхид-
рилни групи и др. Стойността на рИ, при
която има баланс между положителните
са натоварени, и не се движат се нарича
изоелектрична точка (pi). Всеки белтък има
т о ч н о определена pi, напр. за хемоглобина
т я е 7.07. При р а з т в о р с pH над pi, б е л т ъ ­
к ъ т е о т р и ц а т е л н о н а т о в а р е н и се движи
към анода, и обратно. Важно изискване към
буфера е грижлив к о н т р о л на й о н н а т а сила.
При многократно използване на буфера
се получава свръхзатопляне н а м а т р и к с а и
д е н а т у р и р а н е на б е л т ъ ц и т е .
Р азр ед ен и те буфери п р и ч и н я в а т топли­
нен е ф е к т в ъ т р е в е л е к т р о ф о р е т и ч н а т а
к л е т к а , а в и с о к а т а йонна сила з а т р у д н я в а
д о б р о т о разделяне.Чрез грижливо манипу­
лиране на солите, с ъ с т а в я щ и буфера и на
е н д о о с м о т и ч н и т е особености на м а т р и к ­
са може да се осигури по-добро разделяне на
с ъ о т в е т н и т е компоненти. Е л е к т р о д и т е ,
потопени в буфера следва да са в отделна
к л е т к а , т а к а че pH промените, к о и т о въз­
н и к в а т в е л е к т р о д н а т а камера да не про­
м е н я т pH на буфера в м а т р и к с а .
11олислекгпролигпи. Б е л т ъ ц и т е при елек­
трофореза се д ъ р ж а т к а т о полиелектроли-
т и (с много н ато вар ен и групи) поради т о ­
ва, че аминокиселинните групи си взаимо­
д е й с т в а т с н а т о в а р е н и малки молекули о т
буфера (фиг. 12.2). Това взаймодействие чес­
т о води до промяна на рК и н а т о в а р а на
белтъка.
251

фиг. 12.2. Макромолекула представена к а т о по-
лиелектролит
Б е л т ъ ч н о п о л е или зона. При разделяне­
т о б е л т ъ ч н а т а молекула о с т а в а в едно гра­
нично поле - зона. Между о т д е л н и т е зони
о с т а в а т свободни о т белтъци полета. Кол­
к о т о дадени белтъци или изоформи са раз­
положени на п о - т я с н а зона, толкова по-мал­
ка е миграционната д и с т а н ц и я между т я х
и следователно т е и м а т по-близки физико­
химични х а р а к т е р и с т и к и .
З е т а п о т е н ц и а л . Той се определя о т о т ­
ношението х и д р а т а ц и я на б е л т ъ ч н а т а мо­
лекула и хидратирани противоположни йо­
ни. Н а т о в а р е н и т е макромолекули привли­
ч а т противоположно н а т о в а р е н и т е малки
молекули о т с р е д а т а и последните се раз­
п о л а г а т около макромолекулата без да я не­
у т р а л и з и р а т . М а л к и т е н а т о в а р е н и моле­
кули около макромолекулата образуват т ъ й
нар. йонна атмосфера. Това намалява ефек­
т и в н и я т о в а о н а макромолекулата н а ни­
во, известно к а т о зета потенциал. Ефек­
т и в н о с т т а н а взаимодействие н а м а л к и т е
йони с макромолекулите е пропорционална
на к в а д р а т а на електричния т о в а р върху
м а л к и т е йони.
В о л т а ж . Той е о с н о в н а т а водеща сила при
електрофорезата. В о л т а ж ъ т се измерва във
волтове (V). С и л а т а на т о к а (I) се измерва в
ампери (А), а съпротивлението (R) н а сре­
д а т а се измерва в ома (Q). С к о р о с т т а н а
придвижване н а молекулата е право пропор­
ционална н а обкръжаващия в о л т а ж е н гра-
д и е н т , при к о е т о е в сила закона н а Ом:
V=IR. Това налага е л е к т р о ф о р е з а т а да про­
252
т и ч а при к о н с т а н т е н в о л т а ж , сила и т о к .
Д и ф у з и я т а н а молекулите се увеличава с
к в а д р а т е н корен о т в р е м е т о . По принцип
е необходимо е л е к т р о ф о р е з а т а да п р о т е ч е
колкото се може по-бързо и т о в а налага из­
ползването н а максимален в о л т а ж . О т дру­
га с т р а н а в о л т а ж ъ т винаги е ограничен по­
ради п р о д у к ц и я т а н а т о п л и н а (Joule е ф е к т )
и е ф е к т и в н о с т т а н а и з с т у д я в а н е т о . Тем­
п е р а т у р е н г р а д и е н т повече о т 0.1 0С през
м а т р и к с а води до забележимо нарушаване
н а макромолекулната зона. При някои т е х ­
ники т е м п е р а т у р н и я т к о н т р о л не е т о л ­
кова съществен. Буфер, електроди и м а т -
рикс влияят на съпротивлението, което се
променя по време на електрофорезата. Про­
в о д и м о с т т а н а е л е к т р о ф о р е т и ч н а т а сис­
т е м а варира с в р е м е т о , поради промяна в
йонния с ъ с т а в в р е з у л т а т н а движение н а
к о м п о н е н т и т е . Тази промяна е минимална
при в и с о к о в о л т н а т а електрофореза. Най-
ч е с т о и зп о л зван и я т в о л т а ж е 3-5 V/cm, ма­
кар при някои т е х н и к и да се използва много
по-нисък или много по-висок в о л т а ж . Р у т и н ­
но при ц е л у л о з о а ц е т а т н а т а и а г а р о з н а £
електрофореза най-често използваният вол­
т а ж е 3-10 V/cm.
Р е л а к с и р а щ е ф е к т . Макромолекулата не •9
се движи по един н е п р е к ъ с н а т начин, или по 0
една права линия. Причина з а т о в а е, че ня­
кои крайни молекули н а б е л т ъ ц и т е са под­
ложени на в ъ з д е й с т в и е т о на електрично по­
ле. Е т о защо макромолекулите се д в и ж а т П
чрез т ъ й нар. прескачане. Електрофоретич-
н и я т е ф е к т е функция н а о б р а т н о н а т о в а ­
р е н и т е е л е к т р о л и т и , к о и т о се д в и ж а т в
противоположни направления и макромоле­
кулите, к о и т о се д в и ж а т срещу п о т о к а н а
разтвора.
Електроендоосмоза или еидоосмоза
(ЕЕО). Това е взаймодействие на матр и к с-
н и т е т о в а р и с т е з и н а разделящите се моле­
кулни, в р е з у л т а т н а к о е т о се явява придвиж­
ване на к о м п о н е н т и т е в направление о б р а т ­
но на т о в а на общия поток, най ч е с т о към
к а т о д а . К о г а т о е л е к т р о о с м о т и ч н а т а сила
е по-голяма о т е л е к т р о ф о р е т и ч н а т а , чрез
д е й с т в и е т о си върху слабо анионните белтъ­
ци (напр. у-глобулини), т я с т а в а причина т е ­
зи б е л т ъ ц и д а се д в и ж а т о т м я с т о т о на
с т а р т а към к а т о д а , въпреки че т е х н и я т
т о в а р е слабо негативен.
Т о п л и н е н е ф е к т . Регулирането на т е м ­
п е р а т у р а т а е критично във всяка с т ъ п к а
на електрофорезата. Излишната топлина
може да доведе до:
• полимеризация на гела с нарушение на по-
р о з н о с т т а и на ситовия ефект, по-силно
при акриламида и по-слабо при агарозата,
• стопяване на гела, особено на а г а р о з а т а ,
• денатуриране и инактивиране на някои
макромолекули (белтъци, ензими и др.),
• промяна във ф о р м а т а на дадена фракция,
поради различната подвижност при ви­
сока т е м п е р а т у р а . Получава се т . н а р .
smiling ефект, при к о й т о в ц е н т ъ р а на
п л а к а т а б е л т ъ ч н а т а молекула се движи
по-бързо о т к о л к о т о в края.
Н о с е щ и с р е д и ( м а т р и к е ) . Познати са из­
ключително голям брой носеиди среди, изпол­
звани в ЕФ и т е х н и т е к а ч е с т в а непрекъс­
н а т о се усъвършенстват. К а т о разделящи
среди се използват инертни материали. Но­
сещите среди м о г а т да б ъ д а т плоски, ци­
л и н д р и ч н и , п о д ф о р л ю п а з ъ р н а и др.
Плоските среди позволяват включването на
по-голямо количество материал. Дебелина­
т а на слоя при плоските гелове може да бъ­
де о т у л т р а - т ъ н к а до няколко mm. Цилинд­
ричните гелове п о к а з в а т по-голяма чувст­
вителност, Основни изисквания към носе­
щ а т а среда са:
1. Свободна пенетрация на изследвания би­
ологичен компонент. Това изисква пори­
т е на н о с е щ а т а среда на б ъ д а т правил­
но подбрани. П о р о з н о с т т а и р а з м е р ъ т
на порите за някои среди е ф и к с и р а н
{хартия, целулозоацетат, целогел), а на
други може да бъде к о н т р о л и р а н {ага-
роза, акриламид, скорбяла). Лко размерът
на порите е близък до средния д и а м е т ъ р
на разделящите се макромолекули се наб­
людава т ъ й нар. е ф е к т на молекулно си­
то. Той увеличава разделителната спо­
собност на средата. По правило търгов­
ски предлаганите среди са с фиксирана
порозност, а ръчно приготвените среди
м о г а т да б ъ д а т с желана големина на по­
рите.
2. Носещите среди следва да б ъ д а т макси­
мално електронеутрални. Трябва да има
минимално е л е к т р о с т а т и ч н о взаймо-
действие между н а това рен и те групи на
биологичния материал и буфера о т една
с т р а н а и на носещата среда - о т друга.
В противен случай т о в а води до силен
ЕЕО е ф е к т (напр. к а к т о е при агара).
3. Липсваща или минимална адсорбция на
разделящите се компоненти.
4. Да позволява максимално лесно иденти­
фициране на разделените молекули.
5. Носещата среда следва да бъде о т инер­
т е н материал.
6. Да може лесно да се обезцветява
Р а з д е л и т е л н а с п о с о б н о с т Това е въз­
можност на м е т о д а да се разделят компо­
н е н т и т е на повече фракции. Различните
електрофоретични техники се различават
една о т друга главно по т а з и характерис­
т и к а , к о я т о е функция на:
• носещата среда,
• pH на средата,
• използвания волтаж и ампераж,
• т е м п е р а т у р а т а в електрофоретичната
камера,
• начин на визуализиране или о т ч и т а н е ,
• дензитометрична техника,
• други.
Разделителната способност зависи и о т
подвижността на различните компоненти.
В електрично поле бавните йони следват по-
бързите, з а т о в а за по-бавните йони се при­
лага по-висок в о л т а ж . Б е л т ъ ц и т е и м а т
междинна ефективна подвижност, между
бързите и бавните йони и разделянето им
зависи о т концентрацията и товара.
ВИДОВЕ ЕЛЕКТРОФОРЕЗА
СНободна е л е к т р о ф о р е з а
Електрофорезата к а т о метод е предложе­
на о т TiseHus (1937-1939). Това е т ъ й нар. сво­
бодна електрофореза. При нея в кварцова
тръбичка с U-форма се поставя буфериран
(pH 7.6) протеиновия разтвор и се прилага
определена електрична сила. Чрез т о з и ме­
т о д за първи п ъ т са идентифицирани 4
фракции {албумин, a-, ß-, и у-глобулини) по
253
рефрактерния им индекс, l a s u т е х н и к а се
нарича още ф р о н т а л н а или зранично под
вижна електрофореза. Този м е т о д и м а са­
мо историческо значение, но т о й е послу­
жил к а т о основа н а много последващи т е х ­
ники. По-късно т о з и т о з и м е т о д е многок­
р а т н о усъвършенстван, при к о е т о днес се
е к с п л о а т и р а т над 30 вида електрофоретич-
ни техники.
Зонална е л е к т р о ф о р е з а
Свободната електрофореза в скоро време се
из м е с т в а о т техники, при к о и т о се прила­
г а т различни носещи среди. Така компонен­
т и т е се р а з д е л я т и о ф о р м я т н а д и с к р е т ­
ни зони/фази и з а т о в а т о з и вид електрофо­
реза се нарича още зонална. Последната, из­
в е с т н а още к а т о класическа ЕФ, направи ре­
волюция между 50 и 8 0 - т е години н а мина­
лия век в о б л а с т т а н а протеиновия анализ,
изоформи н а о т д е л н и б е л т ъ ц и , ензими и
т е х н и т е изоензими и изоформи, а н т и г е н и
и а н т и т е л а и др. Въпреки т о в а класическа­
т а ЕФ намира все по-ограничено приложе­
ние. С ъ щ е с т в у в а т много видове зонална ЕФ,
к о и т о позволяват п л а з м е н и т е б е л т ъ ц и да
б ъ д а т разделени н а различен брой фракции
- о т 4 до 56 (фиг. 12.3).
I Alb
I | «г | ßi Pi I Y I
TIFiMMiWl
Фиг. 12.3. Електрофоретично разпределение и ре-
лативна концентрация на главните плазмени
белтъци
1 - преалбумин; 2 - антихимиотрипсин; 3 - церулоплаз-
мин; 4 - криоглобулин; 5 - С4-компонент на компле-
мента; 6 - С-реактивен протеин; 7 - y - t r a c e глобулин
254
Х а р т и е н а електрофореза. Първата
предложена носеща среда е ф и л т ъ р н а т а
х а р т и я . З а първи п ъ т чрез х а р т и е н а т а
електрофореза при pH 8.6 се п о с т и г а разде­
ляне н а Uj-, о т (Хг-глобулини в кръвен серум,
в допълнение н а албумин, a-, ß- и у-глобули-
ни разделени чрез с в о б о д н а т а ЕФ. Х а р т и я ­
т а к а т о н а й - с т а р а т а носеща среда пре­
т ъ р п я в а много модификации. Т я е подходя­
щ а за разделяне н а б е л т ъ ц и с по-ниско мо­
лекулно тегло. Главното предимство н а т а - А
зи среда е з д р а в и н а т а н а м а т р и к с а . По-тън­
к а т а х а р т и я осигурява по-голяма чувстви- -1
т е л н о с т и изисква по-малко м а т е р и а л . Хар­
т и е н а т а п р о т е и н о г р а м а може да бъде под-
ложена след д е н а т у р и р а н е и о ц в е т я в а н е н а
белтъците на директна дензитометрия
или след елуиране н а ф р а к ц и и т е - н а колори-
м е т р и я . Н е д о с т а т ъ ц и н а т а з и носеща сре­
да са слаба ч у в с т в и т е л н о с т , недобре офор­
мени фракции, адсорбция н а белтъци, поя­
в а т а н а т ъ й нар. „опашки" след определена
фракция, н е д о с т а т ъ ч н а хомогенност н а по­
р и т е , т р у д н о о б езц ветя ван е н а фона и др.
С ъ щ е с т в у в а т много т ъ р г о в с к и видове хар­
т и я за ЕФ. К а к т о в целия с в я т , т а к а и у
нас т а з и т е х н и к а е с определено историчес­
ко значение и следва д а бъде заменена о т п
други по-съвременни м е т о д и .
Целулозоацетатна електрофореза.
Въвъведена е след х а р т и е н а т а и непрекъс­
н а т о се модифицира и усъвършенства. Це-
л у л о з о а ц е т а т н и т е фолии с а т ъ н к и и здра­
ви и с добра хомогенност. По-подходящи са
о т х а р т и я т а , с по-висока ч у в с т в и т е л н о с т ,
по-малка адсорбция н а б е л т ъ ц и , с п о - ч и с т
фон между ф р а к ц и и т е , с по-малко образу­
ване н а опашкови зони, лесно се о б р а б о т в а т
и т . н. П р е д л а г а т се различни видове целу-
л о з о а ц е т а т н и фолии. У с и л и я т а з а увеличе­
ние н а р а з д е л и т е л н а т а способност н а т о ­
зи м е т о д доведе до р а з в и т и е т о и предлага­
н е т о н а високоразделителни фолии и цело-
гели. С т е з и носители с е р у м н и т е п р о т е и ­
ни н ай -често се р а з д е л я т н а 6-7 фракции,
но с някои целогели се п о л у ч а в а т 8-10 фрак­
ции. Ц е л у л о з о а ц е т а т н а т а ЕФ продължава
широко д а се използва в клиничните лабора­
т о р и и . На пазара се п р е д л а г а т различни фо­
лии, целулозо-ацетатни, целулозо-полиаце-
т а т н и и др.
Агарозна електрофореза. О т десетиле­
т и я а г а р ъ т к а т о м а т р и к с е изместен о т
агарозата. Последната, поради по-ниското
съдържание на а г о п е к т и н , има по-слаба
електроосмоза и по-слабо адсорбира белтъ­
ци 6 сравнение с агара. Агарозата е високо
пречистен натурален полизахарид, дериват
о т агар и подходяща за разделяне на п о ч т и
всички биомолекули, носещи определен елек-
тричен т о в а р . Тя е за предпочитане и по­
ради т о в а , че п о ч т и не развива повърхнос­
т н и товари, к о и т о м о г а т да интерфери-
р а т с мигрирането на б е л т ъ ц и т е . Предла­
г а т се агарози с различна ЕЕО, т е м п е р а т у ­
ра на топене, сила на гела и др. Някои ага­
рози са специализирани за различните видо­
ве ЕФ, имуноелектрофореза, или за мануал-
на подготовка на гелове, позволяващи раз­
деляне на компоненти, базирано на дифузия
и електрокинетично движение на биомоле­
кули. Агарозата се р а з т в а р я на водна баня
и о с т а в а т е ч н а при понижение на т е м п е ­
р а т у р а до 40 0С. О ц в е т я в а н е т о и обезцве­
т я в а н е т о е бързо и лесно и ф о н ъ т между
фракциите о с т а в а ч и с т . Р а з м е р ъ т на по­
р и т е и с и т о в и я т е ф е к т з а в и с я т о т кон­
ц е н т р а ц и я т а ü . При по-висока концентра­
ция се получават по-малки размери на по­
рите. Р а б о т н а т а концентрация обикнове­
но варира о т 0.4 до 4 % (w/v). Агарозните
гелове са с висока прозрачност и ниска ос­
новна флуоресценция, релативно чупливи и
хидроколоидни. Дебелината на гела може да
варира о т 0.1 до 5 mm. Много н и с к а т а ага­
розна концентрация може да намали адхе-
з и я т а към н о с е щ а т а плака (стъкло или по-
лиглас) По принцип р а з м е р и т е на п о р и т е
са по-големи в сравнение с акриламида. То­
ва дава предимство на агарозата за иму-
ноелектрофоретичните техники. Особено
е подходяща за разделяне на големи белтъ­
ци, белтъчни комплекси и нуклеинови кисе­
лини (50 до 30 000 бази). За подобряване на
разделителната способност към агарозния
гол м о г а т да се добавят различни компонен­
т и - калииевлактат, натриевдодецил сул­
фат и др. П р о з р а ч н о с т т а на гела се увели­
чава при промиване с 15% глицерол. Използ­
в а т се различни модификации на класичес­
к а т а агарозна електрофореза с цел подоб­
ряване на разделителната способност. На­
последък все по-често се използва високо раз­
делителната агарозна електрофореза
(HRAGE), (SDS-AGE) и други, за к о и т о се
предлагат и готови плаки.
А к р и л а м и д н а електрофореза. Акрила-
м и д ъ т е и н е р т н а носеща среда, ч и я т о по-
розност лесно се нагласява чрез промяна на
с ъ с т а в а преди полимеризацията. По-жилав
е о т агарозата. Р а з м е р ъ т на порите се оп­
ределя по:
• % Т, общо съдържание на акриламид плюс
бис,
• % С, о т н о ш е н и е т о бис към общото съ­
държание на акриламид плюс бис.
Полимеризацията изисква създаване на
кръстосани връзки с добавка на различни
компоненти:
• N,N'-methylen-bis-acrylamide или бис,
• N,N'l,2-dihydroxyethylene-bis-akrylamide,
• N,N'-cystamine-bis-akrylamide,
• 1,4-diakrylopiperazine,
• N,N'-diallyItartaratdiamide (DATO).
Инициирането на полимеризацията с т а ­
ва или по химичен или фотохимичен начин,
напр. чрез:
• Ammonium persulfate,
• Potassium persulfate,
• 3-(Dimethylamino)propionitrite,
• Riboflavin,
• Flavin mononucleotide,
• N,N',N,N - t e t r a m e t h y l e t h y l e n d i a m i n e
(TEMED),
• UV лампа.
Полимеризацията се инхибира о т висо­
ко ниво на кислород и т о в а налага разтвора
да се дегазира под вакуум или върху гела да
се излее вода или бутанол. Започне ли, реак­
ц и я т а се автокатализира. Средният раз­
мер на акриламидния гел при концентрация
о т 5 д о 10 % е ефективен за протеини с мол.
маса о т 15 000 до 250 000 Da, а според други
а в т о р и - о т 5 000 до 200 000 Da и за полинук-
леотиди о т 5 до 2 000 бази. Най-често се из­
ползва 5% Т и 3% С. Това е подходящо за мо­
лекули до 500 000 Da. В т о з и случай 100 ml
о т гел, съдържа 4.85 g акриламид и 0.15 g
бис. При 5% С имаме минимален размер на
порите. За определяне на молекулния раз-
255
мер се използва градиентен гел, базиран вър­
ху в р ъ з к а т а меАду ефективния размер н а
белтъка (Stokes radius) и н е г о в а т а способ­
н о с т да пенетрира през гела. Разделител
н а т а способност н а т а з и среда е много ви­
сока. С добавка на някои д е т е р г е н т и т я се
увеличава. Особено подходяща е комбинаци­
я т а на Sodium Dodecyl Sulfate плюс поли-
акриламид (SDS-PAGE). Тук разделянето е
базирано не толкова на електричния т о в а р ,
колкото на молекулното т е г л о .
С к о р б е л г е л н а е л е к т р о ф о р е з а . Скорбяла­
т а к а т о носеща среда рядко се използва в
клиничната лаборатория. Тя т р я б в а да бъ­
де затоплена до 100 0С и дегазирана. И м а по-
висока разделителна способност о т агаро-
з а т а , но е по-трудна за приготвяне. Изпол­
зва се главно за препаративни цели.
И з о т а х о ф о р е з а . Позволява разделяне н а
макромолекули в зависимост о т намалява­
щ а т а им ефективна подвижност. Използ­
в а т се два различни е л е к т р о л и т н и р а з т в о ­
ра, един водещ йон, най-често хлорен и един
терминален, най-често глицин. Освен т о в а
е необходим един противоположен н а буфер­
н а т а с и с т е м а йон. Разделянето п р о т и ч а в
тефлонова капилярка с в ъ т р е ш е н д и а м е т ъ р
около 0.5 mm в свободен р а з т в о р . Разделя­
н е т о на биологичния м а т е р и а л е под форма
на граници или стъпки. Разделящите се ком­
поненти се р а з п о л а г а т к а т о сандвич меж­
ду е л е к т р о л и т н и т е разтвори. Б е л т ъ ц и т е
при мигрирането о т единия до другия край
на к а п и л я р к а т а се р а з п о л а г а т пропорцио­
нално на е л е к т р о ф о р е т и ч н а т а си подвиж­
н о с т . В края на к а п и л я р к а т а п р о т е и н и т е
се д в и ж а т в динамично равновесие и при ед­
на постоянна скорост п р е м и н а в а т през т е ­
сен UV лъч (280-285 п т ) за да б ъ д а т и д е н т и ­
фицирани, без д е н а т у р а ц и я и о ц в е т я в а н е .
И н т е г р а л н а т а повърхност под протеино­
вия пик е пропорционална н а к о л и ч е с т в о т о
н а
дадена белтъчна фракция. Те м о г а т да
се о т к р и я т и по т я х н а т а т е м п е р а т у р а ,
проводимост или рефрактерен г р а д и е н т е н
индекс. Д ъ л ж и н а т а н а з о н а т а е пропорцио­
нална на к о н ц е н т р а ц и я т а . Прилага се за йо­
ни, аминокиселини и нуклеотиди, б е л т ъ ц и
и други. Чрез т о з и м е т о д м о г а т да б ъ д а т
о т к р и т и компоненти с к о н ц е н т р а ц и я noq
10 ng н а cm 2 .
256
И з о е л е к т р о ф о к у с и р а п е (ИЕф). Този ме­
т о д е близък до и з о т а х о ф о р е з а т а , но при
него в о д е щ и я т и завършващ йон са кисели­
н а и основа, при к о е т о се получава pH гра-
диент между д в а т а р а з т в о р а . Ако т р е т и
р а з т в о р с ъ с т а в е н о т специални молекули
(амфолини) се п о с т а в и между киселината и
о с н о в а т а , се създава pH г р а д и е н т на т р е ­
т и я , или междинния разтвор. Буферните со­
ли на е л е к т р о л и т н и я р а з т в о р се з а м е с т в а т
о т голям брой различни а м ф о т е р н и субс- о
т а н ц и и . Амфолините са изключително хе­
т е р о г е н н и смеси о т а-полиамино-поликар- q
боксилни киселини. П о с т а в е н и между кисе­
лия и алкален р а з т в о р , амфолините мигри­
р а т според т я х н а т а е ф е к т и в н а подвиж­
н о с т . Например, з а да се създаде един пла- Б
вен г р а д и е н т о т pH 4 до 10 е необходима
смес о т 180 индивидуални амфолини. З а съз­
даване н а т е с е н pH г р а д и е н т о т 1 единица
са необходими 30 индивидуални амфолини.
С ъ щ е с т в у в а н е т о н а pH г р а д и е н т между
д в а т а е л е к т р о д а определя м и г р и р а н е т о н а
амфолините до м о м е н т а , к о г а т о се достиг­
не рП, при к о е т о всеки т и п ще бъде е л е к т -
рично н е у т р а л е н (префокусиране). Позитив­
н и т е и н е г а т и в н и т о в а р и н а молекулата са
еднакви. П р о т е и н и т е м и г р и р а т в pH г р а - ß
д и е н т , д о к а т о т е д о с т и г н а т една точка,,
при к о я т о са н е у т р а л н и или изоелектрич-
ни. Основно предимство на ИЕФ е висока­
т а разделителната сила, при която моле­
кулите с много близки p i се разделят. Раз­
д е л я н е т о се увеличава к а т о се използва ви­
сок в о л т а ж и нисък pH г р а д и е н т , с т и г а ш
до 0.01 pH единици, ф о к у с и р а н е т о продъл­
ж а в а 1-2 часа и и м а определени граници о т
време, при к о е т о п р о б а т а може да се дър­
ж и фокусирана. Този м е т о д позволява мно­
го добро разделяне н а близко мигриращи бел­
т ъ ц и или различни форми н а един и същ бел­
т ъ к , к о и т о и м а т минимални разлики в т о ­
вара, т . е . п о с т т р а н с л а ц и о н н и модифика­
ции. Чрез т а з и т е х н и к а б е л т ъ ц и т е мигри-
р а т през един гел, съдържащ г р а д и е н т опт
pH получен със смес о т амфолини. Всеки бел­
т ъ к д о с т и г а гелна локализация, к ъ д е т о pH
е еднакво н а н е г о в о т о pi. Най-често се из- j
ползва акриламиден гел с дебелина около 1
m m и к о н ц е н т р а ц и я Т 5% и С 3%. Към гела
м о г а т да се в к л ю ч в а т амфолини с т в ъ р д е
различно pH (3-10, 4-6, 8-10 и др.) В зависи­
м о с т о т г о л е м и н а т а н а молекулата се съ-
 i образябаме със с и т о в и я е ф е к т на гела. Проб-
j л е м и т е при т о з и м е т о д са свързани със съз-
; даване на плавен pH г р а д и е н т , к о е т о зави-
: си о т броя и к а ч е с т в о т о н а амфоли н и т е и
о т използваното е л е к т р и ч н о поле. Съще-
' с т в е н н е д о с т а т ъ к е свързан с градиентния
. дрифт, особено н а к а т о д н а т а с т р а н а , по­
ради б а в н о т о намаляване н а pH към к а т о ­
да. Трудно се п о с т и г а и добра възпроизво-
д и м о с т з а една и с ъ щ а проба. Някои амфо-
лини м и г р и р а т заедно с даден б е л т ъ к и т а ­
ка п р о м е н я т обичайното му м я с т о . Не н а
последно м я с т о има т р у д н о с т и при премах­
ване н а а м ф о л и н и т е о т гела, даже и с диа-
лиза. К а т о а л т е р н а т и в а н а а м ф о л и н и т е се
използват буфери {акрнлсшидобуфери), ко-
, и т о о б р а з у в а т к о в а л е н т н и м о с т о в е с акри-
| ламида и т а к а се получава имобилизационен
pH градиент. В т о з и случай п р о б и т е се при­
л а г а т незабавно, не се използва префокуси-
ране, н я м а д р и ф т и р а з д е л и т е л н а т а способ­
н о с т н а т е з и буфери е по-голяма о т т а з и
на амфолините (х 10 до 100).
Д и с к е л е к т р о ф о р е з а . Това е зонална елек­
трофореза н а й - ч е с т о в полиакриламид. Въ­
ведена е през 1964 о т Ornstein a n d Davis. Мо­
же да се използва гел с една к о н ц е н т р а ц и я
или два гела с различна к о н ц е н т р а ц и я или
концентрационен г р а д и е н т . При т а з и елек­
трофореза може да се приложи голямо ко­
личество биологичен м а т е р и а л и т о в а поз­
волява в о т д е л н и случаи д а се използва ка­
т о препаративна. Високата ü чувствител­
н о с т и голяма разделителна сила се д ъ л ж а т
на и з о т а х о ф о р е т и ч н а т а с т ъ п к а , молекул-
но-ситовия е ф е к т и н а р е с т р и к ц и я т а на
макромолекулната дифузия. Този м е т о д поз­
волява определяне на макромолекулния раз­
мер с п о м о щ т а н а г р а д и е н т е н гел, базиран
върху в р ъ з к а т а между е ф е к т и в н и я размер
на макромолекулата (Stokes radius) и него­
в а т а способност да п е н е т р и р а през гела.
По-високата к о н ц е н т р а ц и я на полимера да­
ва по-малък размер на п о р и т е . Б е л т ъ ц и т е
в т а к ъ в гел м и г р и р а т до т я х н а т а изключ­
ваща граница.
Д в у п о с о ч н а е л е к т р о ф о р е з а (TDK). Въве­
дена е през 1975 г о т О. Farrell и се приема,
че т о з и м е т о д ще бъде един о т о с н о в н и т е
при идентифициране на к о м п о н е н т и т е на
п р о т е о м а . П р о т и ч а в две направления, в
един и същ м а т р и к с или в две различни но­
сещи среди. Особено ч е с т о се комбинират
агароза с агароза, целогел с агароза, агароза
с акриламид и др. След п ъ р в о т о електрофо-
ретично разделяне н а к о м п о н е н т и т е се про­
вежда в т о р о , к о е т о п р о т и ч а н а 90° спрямо
първото. Във всяко о т н ап р авл ен и я та раз­
д е л я н е т о н а б е л т ъ ц и т е е базирано н а т е х ­
н и т е физикохимични х а р а к т е р и с т и к и , ка­
т о pi, молекулна м а с а , молекулно-ситов
е ф е к т на м а т р и к с а , pH и др. В първото нап­
равление е за предпочитане да се използва
разделяне, базирано на молекулните особе­
н о с т и . Например по електричен т о в а р в
п ъ р в о т о направление и по молекулния раз­
мер във в т о р о т о . Комбинират се и е л е к т ­
рофореза в п ъ р в о т о направление и имуное-
лектрофореза във в т о р о т о , к а к т о и агароз-
на електрофореза с изотахофореза, агароз-
на ЕФ със SDS-PAGE или с г р а д и е н т н а диск
електрофореза и много др. Разделените ком­
п о н е н т и се я в я в а т под форма на п е т н а , пи­
кове или фракции, но най ч е с т о к а т о п е т ­
на. М о г а т да б ъ д а т установени над 1 000
п е т н а . За и д е н т и ф и ц и р а н е т о им е необхо­
димо да се използват х- и у-координатите.
Това е много ч у в с т в и т е л е н , възпроизводим
и ценен м е т о д . И д е н т и ф и к а ц и я т а изисква
използването на о п и т , контроли и стан д ар ­
т и . Използването на т о з и м е т о д все пове­
че се разширява и в клиничната лаборато­
рия с оглед демонстриране н а специфични
б е л т ъ ц и и ДНК продукти.
Капилярна електрофореза
Класическата ЕФ к а т о много важна т е х н и ­
ка в клиничната химия непрекъснато се усъ­
вършенства. Това наложи т ъ р с е н е т о на но­
ви методологии. П р е д ш е с т в а щ о т о разви­
т и е на други високоразделителни техники
(газова и т е ч н а хроматография и компютъ-
ризация) доведе до създаването на нов вид
т е х н и к а - капиларна ЕФ (КЕФ) (фиг. 12.4).
Началото ü е през 1967 г., к о г а т о Hjerter при­
лага високо напрежение н а р а з т в о р в капи-
лярка с Ш 3 mm. Този м е т о д о с т а в а в науч­
н и т е л а б о р а т о р и и и 12 години по-късно
Mikkers и с ъ т р . предлагат разделяне н а бел­
т ъ ц и в значително п о - т я с н а капилярка (ID
200 mm). Следващите години усъвършенст­
в а н е т о на КЕФ п р о т и ч а в следните направ
257
ления: к а п и л я р к и , детекция, а в т о м а т и з а ­
ция и компютъризация. Т я навлиза в клинич­
н а т а л а б о р а т о р и я с а м о преди няколко го­
дини, к а т о з а и м с т в а п р е д и м с т в а т а н а к а -
п и л я р к и т е о т г а з о в а т а х р о м а т о г р а ф и я , де­
т е к т о р и т е о т HPLC и а в а т о м а т и з а и и я т а
на сепариращите техники и компютъриза-
ц и я т а . О с н о в н и т е х а р а к т е р и с т и к и н а КЕФ
са:
• Малък в ъ т р е ш е н д и а м е т ъ р (II)) н а капи-
л я р к а т а - н а й - ч е с т о в г р а н и ц и т е 30-70
mm.
• Вътрешна с т е н а на капилярката - н а т о ­
варена или н е н а т о в а р е н а в з а в и с и м о с т о т
к о м п о н е н т и т е , к о и т о п о д л е ж а т н а раз­
деляне
• Вид н а н а т о в а р е н о с т т а - к о в а л е н т н о
свързана ф а з а {целулоза, п о л и е т и л е н г л и -
кол, п о л и в и н и л а л к о х о л и др.) или използ­
ване н а д о п ъ л н и т е л н и в е щ е с т в а к ъ м р а ­
б о т н и я буфер, т ъ й нар. с ъ р ф а к т а н т и , ко­
и т о б и в а т аниони (SDS), к а т и о н и (СТАВ),
нейонни (BRIS), хидрофилни полимери ( а л -
килцелулоза, декстран, а к р и л а м и д и др.),
буфери с висока йонна сила. Този процес е
и з в е с т е н още к а т о д и н а м и ч н а д е а к т и в а -
ция.
• Напрежение - в а ж н а х а р а к т е р и с т и к а н а
т о з и м е т о д е в и с о к о т о напрежение (10-
30 kV), силно е л е к т р и ч н о поле (100-500
V/cm) при о т н о с и т е л н о нисък а м п е р а ж (0-
300 цА) и м о щ н о с т (0.6 W).
• Ч у в с т в и т е л н о с т н а КЕФ - з а увеличава­
не н а ч у в с т в и т е л н о с т т а се и з п о л з в а т
два подхода: 1. увеличаване н а в ъ т р е ш н и я
диаметър н а капилярката само н а мяс­
т о т о н а д е т е к ц и я т а ; 2. м е м б р а н н а сис­
т е м а , п о с т а в е н а в н а ч а л о т о н а капиляр­
к а т а с цел елиминиране н а и н т е р ф е р е н -
ц и я т а н а някои к о м п о н е н т и . Това е т ъ й
нар. п р е т р е т и р а н е н а КЕФ.
• Д е т е к ц и я - п о з н а т и с а много видове: а )
UV/VIS д е т е к ц и я , к о я т о н е п р е к ъ с н а т о се
у с ъ в ъ р ш е н с т в а , включително и чрез DAD;
б ) комбинация о т UV-лазер; В) флуоресцен­
т н а д е т е к ц и я ; г) м а с с п е к т р а л н а ; д ) а м -
п е р о м е т р и я ; е ) и н д и р е к т н а UV флуорес­
ц е н т н а амперометрия; ж ) кондуктомет-
рия и др. Чрез някои о т т е з и д е т е к т о р и
границите н а откриваемост в а р и р а т о т
Ю'5 go 10 16 mol.
• К о м п ю т ъ р и з а ц и я , к о я т о позволява ав-
258
т е н т и ч н а р е г и с т р а ц и я н а п и к о в е т е , про­
м я н а н а т е х н и я размер към намаляване w
или уголемяване, к о л и ч е с т в е н а оценка к а ­
т о п р о ц е н т или а б с о л ю т н а с т о й н о с т ,
съхраняване н а д а н н и т е , сравняване н а
д а н н и т е чрез п р и п о к р и в а н е и др. Е д н а
ч а с т о т а п а р а т и т е з а КЕФ р а з п о л а г а т
с б а з а данни и с п е к т р а л н а библиотека, ко­
я т о позволява и д е н т и ф и ц и р а н е н а полу­
ч е н и т е пикове по м и г р а ц и о н н о т о време,
по с п е к т р а л н а т а х а р а к т е р и с т и к а или п о
д в а т а показателя.
• С к о р о с т н а разделяне - разделяне н а раз­
лични к о м п о н е н т и се п о с т и г а з а 1-15 m i n ,
м а к а р п о н я о г а д а се използва и по-дълго
време. П о д в и ж н о с т т а н а р а з д е л я щ и т е с е
к о м п о н е н т и зависи о т е л е к т р о ф о р е т и ч -
н а п о д в и ж н о с т ( т ) , с к о р о с т (V), сила н а
п о л е т о (Е), йонен т о в а р (q), йонен радиус
(г), в и с к о з и т е т н а р а з т в о р а (h) и др.
• Комбиниране с други т е х н и к и . Р а з в и т и е ­
т о н а КЕФ е свързано и със с ъ ч е т а н и е т о
ü с HPLC, MS, GC, TDE и др. З а усъвършен­
с т в а н е н а КЕФ през п о с л е д н и т е години
се в ъ в е ж д а т чипове и микрочипове.
Детектор
волгаж
ВИСОК
Фиг. 12.4. Основна конфигурация на система за
капилярна електрофореза
Т е х н и ч е с к о т о изпълнение при КЕФ и м а
много общи ч е р т и с к л а с и ч е с к а т а ЕФ. Как­
т о личи о т и м е т о н а т а з и т е х н и к а използ­
в а се к а п и л я р к а (фиг. 12.4), ч и и т о д в а к р а я
с а свързани с две буферни п р о с т р а н с т в а .
П р о б а т а се и н ж е к т и р а чрез хидродинами­
чен (налягане, в а к у у м или сифонен) механи­
зъм) или е л е к т р о к и н е т и ч е н подход. Предва­
р и т е л н о т р е т и р а н а или н е т р е т и р а н а био­
логична проба се и н ж е к т и р а , след к о е т о с е
прилага високо н а п р е ж е н и е з а късо време.
Р а з д е л е н и т е м о л е к у л и т е се о т ч и т а т чрез
д е т е к т о р а и се р е г и с т р и р а т под ф о р м а т а
 на пикове.
К а к т о при п о в е ч е т о видове електрофо-
р е т и ч н и т е х н и к и , т а к а и при КЕФ същес­
т в у в а т много проблеми з а решаване. Един
о т т я х е т о п л и н н и я т е ф е к т (Joule effect)
при т о в а високо напрежение. Понижение н а
т о з и е ф е к т се п о с т и г а чрез намаляване н а
в ъ т р е ш н и я д и а м е т ъ р н а к а п и л я р к а т а . При
КЕФ т о з и е ф е к т е много по-слаб в сравне­
ние с т р а д и и и о н н и т е ЕФ т е х н и к и . Топлин­
н и я т е ф е к т се редуцира и с п о м о щ т а н а
т е р м о с т а т , осъществяващ активен т е м ­
п е р а т у р е н контрол. Друг проблем е адсорб-
ц и я т а на белтъци към капилярната с т е ­
на, к о е т о води до поява н а опашки след да­
дения пик. Р е ш е н и е т о н а т о з и проблем изис­
ква премахване н а н е г а т и в н о н а т о в а р е н и ­
т е групи о т п о в ъ р х н о с т т а н а с т е н а т а , ка­
т о се използва по-ниско pH, о б р а б о т к а н а
в ъ т р е ш н а т а капилярна с т е н а с хидрофил-
ни полимери, добавяне н а алкални м е т а л и и
др. В някои случаи м о ж е да се използва и
pH > 9. Тогава б е л т ъ ц и т е се н а т о в а р в а т не­
г а т и в н о , над т е х н и т е pi. Например при рП
9.4 и силния ЕЕО е ф е к т , б е л т ъ ц и т е к о и т о
са о т р и ц а т е л н о н а т о в а р е н и се д в и ж а т към
к а т о д а в следния порядък: y-, 1^-, ( v , и
глобулинии и албумин. Р е ш а в а н е т о на ч а с т
о т т е з и проблеми при КЕФ през последни­
т е 2-3 години с т а в а , к а т о се и з п о л з в а т ка-
пилярки не о т с т ъ к л о или кварц, а о т поли­
мерни м и к р о с т р у к т у р и . Последните са по­
е в т и н и и по-лесни з а манипулиране. Н е у т ­
р а л н а т а хидрофилна природа н а т е з и мик­
р о с т р у к т у р и не се нуждае о т повърхност­
на модификация за намаление н а с т е н н а т а
адсорбция
Най-често в ъ з п р о и з в о д и м о с т т а н а КЕФ
оценена по миграционното време възлиза з а
повечето фракции н а < 3%. Използва се из­
ключително малко количество биологична
проба - о т 1до 50 nl, без разход н а р е а к т и в и ,
, освен много малко буфер.
Днес се и з п о л з в а т различни подвидове
КЕФ, по-голямо приложение о т к о и т о и м а т :
• Капилярна зонална електрофореза
- разделянето н а к о м п о н е н т и т е е функ­
ция на с ъ о т н о ш е н и е т о електричен т о ­
вар/маса. Тя е особено подходяща за раз­
д е л я н е т о на йони, п е п т и д и , хормони,про­
т е и н и и др.
• Капилярно изоелектрофокусиране -
при т о з и подВид се използва добре позна­
т и я принцип за разделяне н а молекулите
н а б а з а т а на изоелектричната т о ч к а (pi),
създадена с п о м о щ т а на различни амфо-
лини. Тази т е х н и к а е приложима при раз­
деляне н а белтъци, т е х н и изоформи, пеп­
т и д и и др. Р а ц и о н а л н и я т подбор н а ам-
фолини позволява разделяне на компонен­
т и с pi разлики под 0.005 pH единици.
• Капилярна г е л н а електрофореза -
п р и н ц и п ъ т н а т а з и т е х н и к а е базиран
върху молекулноситовия е ф е к т . Тя се из­
ползва при анализ главно н а въглехидра­
т и , белтъци, липиди, аполипопротеини,
хормони, ДНК продукти и др.
• М и ц е л а р н а е л е к т р о к и н е т и ч н а хро-
м а т о г р а ф и л - р а з д е л я н е т о н а компо­
н е н т и т е се базира н а т я х н а т а хидрофоб-
н о с т . Този подвид н а КЕФ намира широ­
ко приложение при анализ н а лекарства,
о п и а т и , м е т а б о л и т и , ДНК продукти и др.
• К а п и л я р н а и з о т а х о ф о р е з а - при т а ­
зи т е х н и к а разделянето на компоненти­
т е се базира н а принципа н а подвижна
граница (moving boundary). Използва се за
анализ на малки молекули, витамини, хор­
мони и п е п т и д и .
КЕФ позволява използването на т в ъ р д е
различен биологичен м а т е р и а л в т о в а число
всички биологични т е ч н о с т и , клетки, м а т е ­
риал о т биопсии, клетъчни л и з а т и и други.
Изключително широк е броя н а компонен­
т и т е , к о и т о м о г а т да б ъ д а т разделени чрез
т а з и т е х н и к а . Това са: белтъци, пептиди,
аминокиселини, ензими, изоензими, хемогло-
бинови т и п о в е , гликиран хемоглобин и гли-
кирани белтъци, липопротеини и т е х н и т е
изоформи, въглехидрати, с у б с т р а т и , хормо­
ни, е к т р о л и т и , лекарства, о п и а т и и други.
П р е д и м с т в а н а КЕФ:
1. Широк обсег на приложение в п о ч т и всич­
ки раздели на клиничната и експеримен­
т а л н а медицина.
2. Разход н а изключително малко количес­
т в о биологичен м а т е р и а л - 1 до 50 nl в
т о в а число и на х о м о г е н а т о т няколко
к л е т к и и даже само о т една клетка. То­
ва има голямо клинично значение за деца
и в ъ з р а с т н и пациенти, при к о и т о се на­
лага ч е с т о изследване на кръв и други би­
ологични т е ч н о с т и .
3. Анализ н а различни биологични т е ч н о с т и
259
 (кръв, плазма,серум, ликвор, урина, абдо-
минална, плеврална и синовиална шсч
носш, т ъ к а н и получени чрез биопсия и
др-).
4. Възможност за директно и н ж е к т и р а н е
на п р о б а т а без предварителна о б р а б о т ­
ка.
5. Откриване на даден к о м п о н е н т в много
широки граници, извън р е ф е р е н т н и т е .
6. Висока аналитична надеждност - възпро
изводимост и т о ч н о с т .
7. Висока ч у в с т в и т е л н о с т с ниска граница
на о т к р и в а е м о с т .
8. Бързо получаване н а р е з у л т а т и т е в рам­
к и т е на 10-15 min.
9. Ниска цена - разход само за минимално
количество буфер.
БИОЛОГИЧЕН МАТЕРИАЛ
За електрофоретично разделяне може да се
използва най-различен биологичен м а т е р и ­
ал, в к о и т о се т ъ р с и разделяне и идентифи­
циране на отделни компоненти. Най-често
в клиничната лаборатория се използва кръ­
вен серум, ликвор и урина, но при необходи­
м о с т може да се използват и други биоло­
гични материали {кръвна плазма, асцитна
течност, плеврална течност, ставна теч­
ност, преднокамерна очна течност, биоп-
сии от различни тъкани, клетъчни хомо-
генати и макар и рядко група от клетки
или единични клетки). В зависимост о т чув­
с т в и т е л н о с т т а на м е т о д а и б е л т ъ ч н а т а
концентрация на м а т е р и а л а , може да се из­
ползва н а т и в е н или предварително обрабо­
т е н биологичен материал. Б е л т ъ ч н а т а кон­
ц е н т р а ц и я е най-добре да се дава в ^g/ml.
П р е д в а р и т е л н а т а о б р а б о т к а най-често е
свързана с концентриране, разреждане, елу-
иране, филтриране и др. При в ъ з м о ж н о с т
много по-добре е да се р а б о т и с н а т и в е н би­
ологичен м а т е р и а л напр. кръвен серум.
П л а з м а т а е по-малко подходяща, поради ви­
с о к а т а концентрация н а фибриноген. Ури­
на и ликвор без т е ж к а протеинурия и про-
теинрахия за повечето м е т о д и и з и с к в а т
предварително концентриране (20 до 100 пъ­
т и ) особено за ц е л у л о з о а ц е т а т н а т а и ага-
розна електрофореза.
При разреждане н а биологичен м а т е р и а л
260
е за предпочитане използването на и з о т о -
ничен р а з т в о р н а н а т р и е в хлорид.
К о н ц е н т р и р а н е т о може д а се о с ъ щ е с т ­
ви чрез един о т с л е д н и т е начини:
• И з п а р е н и е - най добре във вакумен изпа­
р и т е л или концентриране чрез продухва­
не н а с т р у я о т и н е р т е н газ ( а з о т ) през
повърхността на пробата.
• Чрез к о и ц е н т р а т о р и - микроконцент-
р а т о р и , при к о и т о се използва полимерен
филм или мембрана с определен размер н а
п о р и т е , к о и т о з а д ъ р ж а т б е л т ъ ц и с оп­
ределена молекулна м а с а , напр. 15000,
25000, 75000, 125000 и др. (напр. Amicon,
Булком).
• Ф и л т р а ц и я - т о з и м е т о д на концент­
риране ч е с т о се с ъ ч е т а в а с центрофуги­
ране, но и м а разход н а голямо количество
биологичен материал. Използва се и вакум-
н а у л т р а ф и л т р а ц и я , напр. с колодиеви чо­
рапчета.
• Д и а л и з а - при т а з и т е х н и к а к о н ц е н т ­
р и р а н е т о е с п о м о щ т а н а диализационна
мембрана, ч и и т о пори и з п ъ л н я в а т моле-
кулно-ситов е ф е к т , и задържа колоидно
диспергираните макромолекули. При кон­
ц е н т р и р а н е т о се п р е м а х в а т чрез дифу-
зия в о д н и т е и други малки молекули. О т
е д н а т а с т р а н а н а /диализационната ди­
афрагма е п р о б а т а , а о т д р у г а т а може
да се използва вода, различни р а з т в о р и ,
смоли (напр. Gummi Arabic, Sephadex G
200), сухи полимери, Polyvi nylpyrrolidone 5
(PVP) и др. На п а з а р а се п р е д л а г а т специ­
ални диализационни а п а р а т ч е т а .
При к о н ц е н т р и р а н е т о в ъ з н и к в а т и проб­
леми свързани с;
а) адсорбция н а б е л т ъ ц и т е върху мембра­
ната,
б) залавяне н а б е л т ъ ц и ,
в) д е н а т у р а ц и я н а б е л т ъ ц и ,
г) загуба н а определени белтъци, напр. (V
микроглобулин и имуноглобулини леки ви-
риги,
д) успоредно с б е л т ъ ц и т е се к о н ц е н т р и р а т
и гликозаминогликаните, к о е т о води до
интерференция н а ЕФ образец, особено
при у р и н а т а . Ч а с т о т т е з и проблеми мо­
г а т д а б ъ д а т и з б е г н а т и , ако концент-
р а т о р и т е предварително се о б р а б о т я т с
 амониев с у л ф а т з а преципитиране н а
б е л т ъ ц и т е , с ЕДТА з а р а з т в о р и м о с т н а
к о м п л е к с и т е и със солна киселина з а хид­
ролиза н а г л и к о з а м и н о г л и к а н и т е
З а д а се и з б е г н а т к о н ц е н т р и р а н е т о и
п р о б л е м и т е с в ъ р з а н и с него, м о ж е д а се из­
ползва п р е д в а р и т е л н о високо ч у в с т в и т е л ­
но о ц в е т я в а н е н а п р о б а т а със сребро или
злато.
ОЦВЕТЯВАНЕ
О ц в е т я в а н е т о е важен е т а п за повечето о т
е л е к т р о ф о р е т и ч н и т е м е т о д и . З а прекъсва­
не н а п р о д ъ л ж а в а щ а т а дифузия е необходи­
м о след ЕФ д а се и з в ъ р ш и п р е д в а р и т е л н о
промиване, фиксиране, изсушаване и др. Пре-
ципитирането на белтъците в съответния
м а т р и к с м о ж е д а се п о с т и г н е с киселини, с
алкохоли и др. Преди о ц в е т я в а н е т о т р я б в а
д а се р е ш и дали всичко, разделено чрез елек­
т р о ф о р е з а т а т р я б в а д а се о ц в е т я в а , или
м о ж е д а се подхожда с е л е к т и в н о . О ц в е т я ­
в а н е т о м о ж е д а бъде е т а п н о или последова­
т е л н о , д а се и з п о л з в а т едно, две или повече
различни о ц в е т я в а н и я . О ц в е т и т е л и т е мо­
г а т д а б ъ д а т специфични з а е д н а или друга
химична г р у п а (напр. нинхидрин з а аминог-
р у п и т е н а нуклеинови киселини и б е л т ъ ц и ,
к а р б о х и д р а т н и групи н а алдехиди и др.). О т
друга с т р а н а о ц в е т и т е л и т е м о г а т д а бъ­
д а т о т н о с и т е л н о специфични з а б е л т ъ ц и ,
г л и к о п р о т е и н и , липиди и др. С т а н д а р т е н
метод за оцветяване на белтъци е с
Amidoblack, P o n c e a u S, Coomassie Brilliant
Blue R 250 F a s t Green FCF и др. Р а з л и ч н и т е
бои д а в а т различна с т о й н о с т з а о т д е л н и ­
т е фракции. Ако се използва нехомогенна боя
к а т о Amidoblack се н а р у ш а в а л и н е й н о с т т а
между ц в е т н а т а и н т е н з и в н о с т и п р о т е и ­
н о в а т а к о н ц е н т р а ц и я . При о ц в е т я в а н е с
Coomassie Brilliant Blue м о ж е д а се о т к р и е 1
fig б е л т ъ к в д а д е н а ф р а к ц и я . О ц в е т я в а н е ­
т о със сребро обаче е около 100 п ъ т и по-чув­
с т в и т е л н о и м о ж е д а визуализира I n g бел­
т ъ к в дадена фракция. Подобна ч у в с т в и т е л ­
н о с т може д а се п о с т и г н е и с мицеларен раз­
т в о р на злато, с к о й т о о ц в е т и т е л може да
се о т к р и е 1 n g б е л т ъ к н а mm 2 . О ц в е т я в а н е ­
т о със сребро и з л а т о м о ж е д а е д и р е к т н о
или след друго обичайно о ц в е т я в а н е . З а ви­
зуализиране н а ли п о п р о т е и н и и гликопроте­
ини се и з п о л з в а т Oil Red, Sudan Black, Peri­
odic Acid и др. При р а д и о а к т и в н о белязани
проби след р а з д е л я н е т о о т к р и в а н е т о с т а ­
ва с авторадиография.
ЛОКАЛИЗИРАНЕ И ИДЕНТИФИЦИРАНЕ
НА ЕФ КОМПОНЕНТИ
Познати са директни и индиректни м е т о ­
ди з а локализация и и д е н т и ф и к а ц и я н а елек­
т р о ф о р е т и ч н и т е компоненти.
Д и р е к т н а л о к а л и з а ц и я . При н е я се из­
м е р в а т ф и з и ч е с к и т е о с о б е н о с т и н а даден
к о м п о н е н т . Това с т а в а чрез:
• Измерване н а а б с о р б ц и я т а н а с в е т л и н а
при 280 п т ( т р и п т о ф а н , т и р о з и н , фени-
лаланин), но също т а к а и при 220 п т , 210
п т и други. З а превръщане н а абсорбция­
т а при 280 п т в п р о т е и н о в а к о н ц е н т р а ­
ц и я е необходимо д а се знае, че всеки бел­
т ъ к с ъ д ъ р ж а различно количество о т т е ­
зи аминокиселини. Нуклеиновите кисели­
ни а б с о р б и р а т по-силно при 260 п т . Ако
б е л т ъ ч н а т а проба с ъ д ъ р ж а и нуклеинови
киселини, з а изчисление н а б е л т ъ к а с е
използва с л е д н а т а формула: б е л т ъ к 6
m g / m l = 1 . 5 5 х А28() - 0.76 х А2в0. Този м е т о д
е особено подходящ з а б е л т ъ ц и в грани­
ц и т е о т 0.05 до 1.5 m g / m l .
• Д и р е к т н о измерване н а ф л у р е с ц е н ц и я т а
н а с в е т л и н а . Този м е т о д е хиляди п ъ т и
по-чувствителен о т спектрофотомет-
р и я т а и к о л о р о м е т р и я т а . Този начин н а
о т ч и т а н е обаче се влияе о т многобройни
и н т е р ф е р е н ц и и , в т о в а число и н т е р ф е -
ренция н а буфера, н а м а т р и к с а , н а т е м ­
п е р а т у р а т а и др. Може д а се измерва как­
т о д и р е к т н а флуоресценция, т а к а и пред­
в а р и т е л н о белязване н а к о м п о н е н т а с
флуоресциращ химикал.
• Измерване н а р е ф р а к т е р н и я индекс н а да­
дения к о м п о н е н т .
И н д и р е к т н а л о к а л и з а ц ш г В т о з и случаи
се и з п о л з в а т различни химични реакции, по­
вече или по-малко специфични з а т ъ р с е н и я
к о м п о н е н т . Тук се в к л ю ч в а т о ц в е т я в а н е н а
б е л т ъ ц и и т е х н и с ъ с т а в к и , ензимни реак­
ции и др.
261
ДЕНЗИТОМЕТРИЯ
Д е н з и т о м е т р и я т а е един о т м е т о д и т е з а
количествена оценка н а електрофоретично
разделените компоненти. Най-често оцве­
т е н и т е и изсушени протеинограми се пос­
ле д в а т о т д е н з и т о м е т р и ч н о скениране н а
мембраната или гела. Основно изискване при
д е н з и т о м е т р и я т а е и н т е г р а л н а т а площ
под протеиновия пик да е пропорционална
на количеството на дадена б е л т ъ ч н а фрак­
ция. При д е н з и т о м е т р и р а н е т о количество­
т о на дадена фракция се определя по абсор­
б и р а н а т а или п р е м и н а л а т а светлина. Сле­
дователно, к о н ц е н т р а ц и я т а н а електрофо-
р е т и ч н а т а фракция т р я б в а да бъде дирек­
т н о пропорционална н а а б с о р б и р а н а т а
светлина или о б р а т н о пропорционална н а
логаритъма на преминалата светлина. Ден-
з и т о м е т р и т е б и в а т с н е п р е к ъ с н а т или с
прекъснат с п е к т ъ р (филтрови). При т р а н ­
с м и с и я т а се изчислява о т н о ш е н и е т о н а
преминалата светлина (I) към н а ч а л н а т а
светлина (10).
Видове д е н з и т о м е т р и
С в е т л и н н и д е н з и т о м е т р и (фиг. 12.5).
К а ч е с т в о т о н а скенирания с п е к т ъ р (абсор-
б ц и я т а или п р о ц е н т н а т а т р а н с м и с и я %Т)
се определят о т :
• източника н а светлина,
• к а ч е с т в а т а н а монохроматора,
• интерференция на ф и л т р и т е ,
• еднолъчев д е н з и т о м е т ъ р ,
• двойнолъчев д е н з и т о м е т ъ р ,
• Рекордер,
• възможност за мануално или а в т о м а т и ч ­
но компенсиране н а абсорбцията н а фона
между фракциите,
• процепа на лъча.
В зависимост о т използваната боя ден­
з и т о м е т р и р а н е т о се осъществява при раз­
лична дължина н а в ъ л н а т а (напр.за Amido
Black - 490 п т , 482 и/или 610 п т . Ponceau S -
470 п т , Procion Blue - 590 п т ) . Amido Black и
Ponceau се с в ъ р з в а т с б е л т ъ ц и т е електрос­
т а т и ч н о , a Procion Blue - ковалентно.
За плотиране н а ф е р о г р а м а т а м о г а т да
се използват с п е к т р о ф о т о м е т р и с е к с т и н -
262
кционни рекордери.
и© и I т и
Д А АД I
•
Alb cxi az ßi [h у-ГЛ0бУЛИНИ
Фиг. 12.5. Д е н з и т о г р а м а н а серумна електро­
фореза
ф л у о р о м е т р и ч н и д е н з и т о м е т р и . Из­
ползва се с п о с о б н о с т т а н а някои о т е л е к т -
р о ф о р е т и ч н и т е к о мп о н ен ти да абсорбират
е л е к т р о м а г н и т н а радиация и да флуоресци­
р а т . В зависимост о т източника на свет­
лина, т е също м о г а т да б ъ д а т с п р е к ъ с н а т
(филтри) или н е п р е к ъ с н а т с п е к т ъ р . К а т о
и з т о ч н и к н а с в е т л и н а се използва живачна,
ксенонова или друг вид лампа. Те с а до хиля­
ди п ъ т и п о -чу встви тел н и .
Д е н з и т о м е т р и я т а е свързана и с д о с т а
проблеми. Възпроизводимостта и т о ч н о с т ­
т а н а д е н з и т о м е т р и ч н о т о скениране се
в л и я я т о т редица ф а к т о р и , к а т о :
• вида н а д е н з и т о м е т ъ р а ,
• вида н а м а т р и к с а върху к о и т о е проведе­
но р азд ел я н ето ,
• и з п о л з в а н а т а дължина н а в ъ л н а т а ,
• използвания ф и к с а т о р ,
• о ц в е т я в а н е т о и вида н а б о я т а ,
• обезцветяването.
За о тб ел я зван е е, че р а з л и ч н и т е б е л т ъ ­
ци не винаги а б с о р б и р а т с ъ о т в е т н а т а боя
пропорционално н а с в о я т а к о н ц е н т р а ц и я .
Висока б е л т ъ ч н а концентрация, разположе­
н а н а т я с н а основа, води до н е д о с т а т ъ ч н а
експресия н а с ъ о т в е т н и т е химични групи,
у ч а с т в у в а щ и в о ц в е т я в а н е т о Това е особе­
но в сила за албумина и гама-глобулините.
Е т о защо ч е с т о д е н з и т о г р а м а т а показва
релативно по-ниска к о н ц е н т р а ц и я за албу­
мина и за гама-глобулините в сравнение с
д р у г и т е фракции. Друг н е д о с т а т ъ к на ден-
1 з и т о м е т р и ч н о т о скениране лежи 6 субек-
; т и б н о с т т а н а м а н у а л н о т о нагласябане н а
j г р а н и ц а т а н а п р о т е и н о в и т е зони. Ч е с т о се
р е г и с т р и р а н е г а т и в н а девиация н а албуми-
н о в а т а к о н ц е н т р а ц и я получена чрез дензи-
т о м е т р и ч н о т о скениране в сравнение с из­
мерване на албумина чрез Bromocresol Green
м е т о д а . Не н а последно м я с т о е и с т е п е н т -
т а н а о безцв етяв ан е н а фона, спрямо кой­
т о се нагласява д е н з и т о м е т ъ р а . Това на­
лага максимално о б е з ц в е т я в а н е н а м а т р и к -
са, разположен между о т д е л н и т е фракции.
ЛАБОРАТОРНИ УРЕДИ И ПОСОБИЯ
ЗА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА
АВТОМАТИЧНИ СИСТЕМИ
Необходимото оборудване зависи о т избра­
ния м е т о д . З а п о в е ч е т о е л е к т р о ф о р е т и ч -
ни м е т о д и може д а се е к с п л о а т и р а т ману-
ални, п о л у а в т о м а т и ч н и или напълно а в т о ­
м а т и ч н и с и с т е м и . И з б о р ъ т се определя о т
броя н а изследванията, т е х н и я вид и разби­
ра се о т ф и н а н с о в и т е възможности. Ману-
а л н и т е м е т о д и в някои случаи са за предпо­
ч и т а н е , поради п о - г о л я м а т а им флексибел-
н о с т и ниска цена. З а п о в е ч е т о о т м е т о д и ­
т е о с н о в н и я т и н с т р у м е н т а р и у м включва:
• Източник иа т о к .
• Т о к о и з п р а в и т е л с в ъ з м о ж н о с т за из­
мерване на в о л т а ж , ампераж и време (най-
ч е с т о 0 до 400 V и 0-100 т А и 0-120 min).
• Електрофоретична к л е т к а с доста­
т ъ ч н о голямо буферно п р о с т р а н с т в о , изо­
лирано физически, но не електрично о т но­
с е щ а т а среда ( ц е л у л о з о а ц е т а т , агароза,
акриламид).
• Е л е к т р о д и - поставени са в отделна
к л е т к а на е л е к т р о ф о р е т и ч н а т а камера
и свързани с нея т а к а , че pH п р о м е н и т е ,
к о и т о се н а б л ю д а в а т да не п р о м е н я т pH
н а буфера, насищащ м а т р и к с а . Особено
важен е м а т е р и а л ъ т , о т к о й т о са и з г о т ­
вени е л е к т р о д и т е . Ж е л а т е л н о е да б ъ д а т
о т п л а т и н а поради по-високата си про­
водимост и по-слабо подаване н а химич­
на деградация.
• М а т р и к с / и о с е щ а cpecja - т у к и з б о р ъ т
е много голям, з а п о ч т и всички носещи
среди. Те м о г а т да се п р и г о т в я т мануал-
но о т к а ч е с т в е н и изходни с у б с т а н ц и и ,
или да се използват готови, също с т в ъ р ­
де различни к а ч е с т в а {cellulose acetate
strips, cellogel strips, agarose gel film, Poly­
acrylamide gel film, agarose a n d acrylamy-
de ultraphoresis gel f i l m s и други c различ­
н а разделителна способност и за различ­
ни биологични материаели),
• Ф и л т ъ р и а х а р т и я - различни видове не­
обходима з а м о с т ч е т а в някои видове
електрофорези. Необходимо е да бъде с доб­
р а порозност, хомогенност, проводимост
и у с т о й ч и в о с т - напр. Watmann 1-4.
• Д е т е р г е и т и и р а з т В о р и т е л и - необ­
ходими за денатуриране н а белтъци чрез
свързване и разрушаване н а дисулфидни и
други връзки между полипептидите, как­
т о и за подобряване н а р а з т в о р и м о с т т а
н а б е л т ъ ц и т е и други компоненти. Това
с а преди всичко Sodium dodecyl sulfate,
Urea, Lithium dodecyl sulfate, BRIJ 35,
CHAPSO, Chaps (последният за подобря­
ване на р а з т в о р и м о с т т а на мембранни­
т е протеини) и други. Особено ч е с т о се
използва н а т р и е в и я додецил сулфат (SDS),
к о й т о д е н а т у р и р а б е л т ъ ц и т е . Мигрира­
н е т о н а комплекса белтък/додецил сул­
ф а т е пропорционално н а л о г а р и т ъ м а о т
молекулното тегло. Използва се в с ъ ч е т а ­
ние с агароза, акриламид и други. Тази ком­
бинация е особено за предпочитане при
разделяне н а ДНК продукти.
• А п л и к а т о р з а п о с т а В я н е н а биоло-
г и ч н и я м а т е р и а л (най-често о т 1 до 10
|il. Използват се собственоръчно пригот­
вени, к а к т о и готови, за един или много
с т а р т о в е . Предлагат се и механични ръ­
це, подходящи особено при боравене с опа­
сен биологичен м а т е р и а л . М а т е р и а л ъ т
може да се прилага директно върху повър­
х н о с т т а на м а т р и к с а или след пригот­
вяне н а специално с т а р т о в о гнездо, ма­
кар, че съществу ва и възможност за ин­
ж ек ти р ан е. В повечето случаи успоредно
с изследвания м а т е р и а л се използват сви­
детели и с т а н д а р т и .
• Посуда з а оцВетяВане и обезцВетя-
В ан е.
• К о м п ю т ъ р , с а м о с т о я т е л е н или к а т о
ч а с т о т система, снабден със различни сен­
зори, при к о е т о може да се контролира по­
з и ц и я т а на механичната ръчичка, с т а р т а ,
количеството на материала и др.
263

• Po6om/mu.
• pH м е т р и з а к о н т р о л н а б у ф е р и т е , как­
т о и з а измерване н а pH н а м а т р и к с а . В
някои случаи се н а л а з а изрязване и елуи
ране н а м а т р и к с а и проверка н а негово­
т о pH.
• П о в ь р х и о с т и и е л е к т р о д и за контрол
н а pi, особено при изоелектрофокусиране-
то.
• Маркери з а е л е к т р о ф о р е т и ч и а т а
п о д б и г к и о с т . Н а й - ч е с т о т о в а е предва­
р и т е л н о о ц в е т е н със с е л е к т и в н а боя бел­
т ъ к или кръвен серум.
• М а р к е р и ( е д и н и ч н и и л и с е р и я ) з а сви­
д е т е л и и с т а н д а р т и за идентифици­
ране н а дадена фракция, б е л т ъ к , друг ком­
п о н е н т . И з п о л з в а т се и молекулно т е г л о в ­
ни маркери (напр. с ц и т о х р о м 13 000, м и -
оглобин 18 000, х и м и о т р и п с и н о г е н 24 000 ,
яйчен албумин 45 000, говежди серумен ал­
бумин 67 000, човешки гамаглобулин 160
000, а п о ф е р и т и н 480 000 и др.)
• Охладителна с и с т е м а , к а т о ч а с т о т
е л е к т р о ф о р е т и ч и а т а к а м е р а или самос­
т о я т е л н а . П р е д л а г а т се к о м п л е к т у в а н и
с т е м п е р а т у р е н контрольор, т е р м о п о м ­
па, циркулираща в а н а и др. С т о в а се оси­
гурява поддържане н а т е м п е р а т у р а ±1 0С
през целия м а т р и к с по време н а п р о т и ­
чане н а е л е к т р о ф о р е з а т а .
А в т о м а т и з и р а н и с и с т е м и за подготов­
ка, провеждане и о т ч и т а н е н а е л е к т р о ф о -
р е т и ч н и т е образци. А в т о м а т и ч н о се при­
лага м а т е р и а л а , о ц в е т я в а н е т о , о б е з ц в е т я ­
ването, д е н з и т о м е т р и р а н е т о и количест­
в е н о т о о т ч и т а н е . При някои о т т е з и сис­
т е м и и м а и примерни образци, к а к т о и ба­
з а данни з а и н т е р п р е т а ц и я н а п о л у ч е н и т е
резултати.
Автоматични с и с т е м и за различни
видове е л е к т р о ф о р е з а .
ТЬАКУВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
1 ъ л к у в а н е т о н а р е з у л т а т и т е е изключи­
т е л н о т р у д н а , много полезна и изисква оп­
ределен клиничен о п и т . Високоразделител-
н и т е е л е к т р о ф о р е т и ч н и т е х н и к и н а серум,
ликвор, урина и други биологични т е ч н о с т и
264
се и з п о л з в а т при д и а г н о з а т а н а редица за­
болявания. З а улеснение се п р е д л а г а т б а з а
данни с различни образци. С някои о т т е з и
м е т о д и е в ъ з м о ж н о д а се п р е д с т а в я т всич­
ки б е л т ъ ч н и к о м п о н е н т и в даден биологи­
чен м а т е р и а л в к о н ц е н т р а ц и я 0.1 g/1. Най-
ч е с т о се и з п о л з в а т з а анализ н а :
• определени б е л т ъ ц и , особено албумин и
глобулини,
• моноклонални и олигоклонални б е л т ъ ц и ,
• хемоглобинови т и п о в е и п о д т и п о в е ,
• изоензими н а определени ензими, особено
АДХ, КК, АФ и др.
• изоформи н а б е л т ъ ц и и изоензими,
• генетични дефекти,
• анализ н а специфични б е л т ъ ц и , липиди.
Е л е к т р о ф о р е з а т а е особено полеза з а ди­
а г н о з а т а н а м у л т и п л е н миелом, амилоидо-
за, макроглобулинемия, различни гамапа-
т и и , м н о ж е с т в е н а склероза, СПИН, г е н е т и ­
чен д е ф и ц и т и др. Т я се използва и з а мони-
т о р и р а н е н а п а ц и е н т и с н я к о и о т горепо­
с о ч е н и т е заболявания. Електрофореза н а
у р и н а и ликвор е много полезна з а х а р а к т е ­
ризиране н а т и п а н а п р о т е и н у р и я т а и про-
т е и н р а х и я т а . Н а м а л е н и е т о н а специфични
серумни б е л т ъ ц и е р е з у л т а т н а н а м а л е н а
с и н т е з а или н а скъсен п о л у ж и в о т . Агамаг-
л о б у л и н е м и я т а е г е н е т и ч н о обусловена. Хи-
п о а лб у м и н е м и я се с р е щ а при чернодробна
цироза, с и с т е м е н лупус, н е ф р о т и ч е н синд­
ром, някои кръвни заболявания, лош храни­
т е л е н с т а т у с и др. Хиперимуноглобулине-
м и я о т поликлонален т и п х а р а к т е р и з и р а
х р о н и ч н и т е инфекции, ч е р н о д р о б н и т е и м а -
л и г н е н и т е заболявания. Моноклонални хипе-
римуноглобулинемии (обичайно с една, но мо­
ж е и с повече о т е д н а ф р а к ц и я ) с а т и п и ч н и
з а миелом, макроглобулинемия и г а м а п а т и и
с н е у т о ч н е н о клинично значение, но се сре­
щ а т в значимо по-нисък п р о ц е н т и при ре­
д и ц а други заболявания. П р о м е н и т е в лик-
в о р н а т а п р о т е и н о г р а м а (напр. олигоклонал-
н о с т ) с а з а д ъ л ж и т е л е н к р и т е р и и з а диаг­
н о з а т а н а х и п е р к и н е т и ч н и я левкоенцефа-
л и т , м н о ж е с т в е н а т а склероза, някои фор­
м и н а невролуес и др, П р о т е и н о г р а м а т а н а
у р и н а т а позволява д а се диференцира селек­
т и в н а т а о т н е с е л е к т и в н а , к а к т о и гломе-
рулна о т т у б у л н а или смесена, преренална
о т р е н а л н а ( с е л е к т и в н а или н е с е л е к т и в н а )
u постренална протеинурия. Електрофорег-
р а м а т а е един о т к р и т е р и и т е за разграни­
чаване на т р а н с у д а т (с нискомолекулни бел-
тъ ии) о т ексудат (с ниско и високо моле­
кулни белтъии). Електрофоретичното оп­
ределяне на изоензимите позволява еднов­
ременна демонстрация на всички форми,
к а к т о и на някои т е х н и изоформи. При изс­
ледване на LDH изоензими се в и ж д а т и 5 - т е
форми. Напр. при белодробни заболявания
най-често е увеличен LDH 3 изоензим, кой­
т о не може да бъде определен по друг начин
освен електрофоретично. Подобно нещо мо­
же да се каже и за СРК изоензими, з а щ о т о
+
само електрофоретично е възможно опреде
лянето на ВВ MB и ММ едновременно. Ос­
новните изоензими на ALP, жлъчна, чернод­
робна, к о с т н а и чревна м о г а т едновремен­
но да б ъ д а т демонстрирани също само чрез
електрофоретично изследване.
На фиг. 12.6-12.10 са представени някои
о т електрофоретичните образци на серум­
ни белтъци върху различни носители, как­
т о и протеинограми на ликвор и урина, а
на фиг. 12.11-12.13 са показани електрофо-
ретични образци на изоензимите на ЛДХ, КК
и АФ.

§1 М И Хипопротеимемия при
анорсксия

Рядък случаи на две

фракции при ММ

Моноклонална гамапашя - IgG

миелом

i IIUi И И •
Alt U2 Pl ß2 У"ГЛОбУЛИ"И
Нормална

Ф и г . 12.6. Е л е к т р о ф о р е г р а м и н а серум - агароза

старт

1 9 91 1 Хипоалбуммнсмия

•• 11' Хииср-аг-макроглобу-
линсмия —нсфропатия

I If i Хинср-аг-макроглобули-
нсмия с раздвояване -
нефропатия

§ 1 1 \m Хипертрансферинемия -
анемия

@1 9 i щт
Xmicpi амаглобулинсмия
—чернодробно заболяване

Alb а , ix2 (Ii ß2 | Y ф и г . 12.7. Електрофореграми на серум - агароза

старт
265
 целогел

Хнпогамаглобулинемия с
д е ф и ц и т н а IgG u IgM

Хипер-агглобулинемия -
остро възпалително заболяване

ß-y глобулинов мост при

чернодробна цироза

целулозоацетат

Alb a i аг ßi+ß2 углобулини

Фиг. 12.8. Е л е к т р о ф о р е г р а м и н а серум - целогел и ц е л у л о з о а ц е т а т

illi i m
Серумен Т И П ликворна
протеинофама при мозъчен
инсулт

I f II ни
Моноклонална хииер-
гамаглобулинрахия - IgG
миелом

l®ll IUI
Моноклонална хипер-
гамаглобулинрахия - IgA
миелом

1Щ 1i т и Застоен ликвор с
ление на
нама­
нреалбумин -
снинален тумор

1@! i пий Олигоклоналност с три

фракции при множествена
склероза

Iii 1 3 4
^^II
5 6
Нормална

crapi

Фиг. 12.9. Е л е к т р о ф о р е г р а м и н а ликвор - а г а р о з а

1 - преалбумин; 2 - албумин; 3 - ct.; 4 - а 2 ; 5 - ß,; 6 - ß2; 7 - у-глобулини

266
 траисудат

1 2
!3
1
ексудат

1 2
1ц 1
3 4 5 6
1 i
7
ci up I

Ф и г . 12.10. Е л е к т р о ф о р е з а н а плебрална т е ч н о с т
1 - албумин; 2 - сц-антитрипсин; 3 - трансферин; 4 - иг-макроглобулин;
5 - хаптоглобин; 6 - р-липопротеин; 7 - у-глобулини

I Нормална урина

I Селективна
протеинурмя

t 1 11
I 2 3
!
Нссслсктнвна
протсинурия

I II
Хипергамаглобулинурия
- IgG миелом

I
Хипергамаглобулин­
урия —Ig Амислом

/
старт

Ф и г . 12.11. Е л е к т р о ф о р е з а н а у р и н а
1 - албумин; 2 - и,; 3 - с^; 4 - ß, + 5 - у-глобулини

267
 Нормална

Миокардсп и н ф а р к т с
ТЛДХ, и ТЛДХ 2

Мускулна дистрофия с
ТЛДХ4 и t ЛДХ 5

Белодробен инфаркт с
ТЛДХз

Ф и г . 12.12. И з о е н з и м и н а ЛДХ
1. ЛДХ, - Н4; 2. ЛДХ2; 3. ЛДХ;1; 4. ЛДХ4; ЛДХ5 - М4; 'Т4 - повишение

Нормална

Миокардсн
инфаркт с | М В

Мускулна
дистрофия с | М М

Мозъчен инсулт с
ТВВ

Ф и г . 12.13. Изоензими н а КК
1 КК-ВВ, 2 - КК-МВ; 3 - КК-ММ; ф - убеличение
268
 +
Нормална АФ
нзограма

Постхепатална
жълтеница с | АФ1

1 2

Остсобластна
активност с | АФЗ

Аденокарцином на
ректума с f АФ4

ciapr

Фиг. 12.14. Изоензими н а а л к а л н а т а ф о с ф а т а з а

1. А Ф - ж л ъ ч н а ; 2. А Ф - ч е р н о д р о б н а ; 3. А Ф - к о с т н а ; 4. А Ф - ч р е в н а ; ф - п о в и ш е н и е

КНИГОПИС

Aslion M L , Rank J, W e n e r M et al. Electrophoresis - Tutor: an
image-based personal c o m p u t e r p r o g r a m that teaches clini­
cal interpretation o f protein e l e c t r o p h o r e s i s patterns o f s e ­
rum, urine a n d cerebrospinal fluid, Clin C h e m , 41, 1995, 9 ,
1328-1332.
B r e w e r J. Electrophoresis. In: H e n r y J B (ed). Clinical d i a g n o s i s
m a n a g e m e n t b y laboratory m e t h o d s (18 , h ed), Philadelphia,
W B Saunders, 1991, 1 5 2 - 1 6 5 .
Chen M L , L a m C h W . Protein z o n e electrophoresis o f pleural
effusion: T h e diagnostic separation o f transudates a n d e x u ­
dates, Clin C h e m , 45, 1999, 10, 1882-1884.
Epstein E, Karcher RE. Electrophoresis. In: B u r t i s C A , Ashwood
E R (eds). Tietz textbook o f clinical chemistry (2 ,к, ed), Phila­
delphia: W B Saunders, 1994, 191-205
Kjeldsberg C R , Knight JA. Body Fluids (3 ,и ed). Chicago, IL,
A S C P Press, 1993, 1- 4 3 6 .
L a n d e r s J M . Clinical capillary electrophoresis, Clin C h e m , 4 1 ,
1995, 4, 4 9 5 - 5 0 9 .
Watzig H , D e g e n h a r d t M, Kunkel A. Strategies for capillary
electrophoresis, 19, 1998, 2 6 9 5 - 2 7 5 2 .

269
 Имунологичен а н а л и з
ДИРЕКТЕН
ИМУНОХИМИЧЕН АНАЛИЗ
Н. К о й ч е в а
ИМУНОЛОГИЧЕН АНАЛИЗ - ОСНОВНИ
ПОНЯТИЯ И ВИДОВЕ ИМУНОЛОГИЧНИ
РЕАКЦИИ
Имунохимичните м е т о д и се о с н о в а в а т н а
р е а к ц и я т а между а н т и г е н и а н т и т я л о . Те
са и з к л ю ч и т е л н о с п е ц и ф и ч н и и се из­
ползват за откриване, идентифициране и
количествено определяне н а а н т и г е н и ,
х а п т е н и и а н т и т е л а . Основен р е а к т и в
при имунохимичните м е т о д и е а н т и т я л о ­
то.
Антигени, имуногени, х а п т е н и
А н т и г е н ъ т е вещество, к о е т о предизвик­
ва образуване н а а н т и т е л а . А н т и т е л а т а
се с и н т е з и р а т в жи вот и н с ки я организъм
под действие н а а н т и г е н н а стимулация. Те
м о г а т да б ъ д а т ц и р к у л и р а щ и {хуморал-
нй) или с в ъ р з а н и с т ъ к а н и {клетъчни).
Някои а в т о р и н а р и ч а т а н т и г е н всяка ма­
т е р и я , к о я т о взаимодейства с а н т и т я л о ,
независимо о т т о в а дали е в с ъ с т о я н и е да
предизвика имунен отговор. Други а в т о р и
използват п о н я т и е т о а н т и г е н по-свобод-
но, к а т о включват и живи микроорганизми.
Трябва да се има предвид обаче, че една мик­
робна к л е т к а може да п р и т е ж а в а над 100
различни антигени. Под а н т и г е н н о с т се
разбира п о т е н ц и а л ъ т н а а н т и г е н а д а се
свързва със с ъ о т в е т н о т о му а н т и т я л о . Ня­
кои а в т о р и използват п о н я т и е т о а н т и г е н ­
н о с т к а т о синоним н а имуногенност. Ан-
т и г е н н о с т т а зависи о т много ф а к т о р и ,
между к о и т о са физикохимичните с в о й с т ­
ва и количеството н а а н т и г е н а , н а ч и н ъ т
270
н а прилагането му, в и д ъ т н а имунизирания
ж и в о т и н с к и организъм.
И м у н о г е н е всеки а г е н т , к о й т о може да
предизвика имунен отговор. Всеки имуно­
ген е а н т и г е н , но не всеки а н т и г е н п р и т е ­
ж а в а имуногенни с в о й с т в а . Условията за
имуногенност включват с л о Ж е н х и м и ­
чески строеЖ, в и с о к а л г о л е к у л н а м а ­
с а и ч у Я с у о р о у н о с т . Колкото по-сложен
е х и м и ч е с к и я т с т р о е ж и по-голяма - моле­
к у л н а т а м а с а н а дадено вещество, т о л к о ­
ва по-силна е н е г о в а т а имуногенност. Иму­
ногенни свойства и м а т белтъците, поли-
захаридите, гликолипидите, нуклеиновите
киселини и полинуклеотидите. Най-мощни
имуногени с а макромолекулите с молекул­
н а м а с а над 100 000 Da. Важна з а имуноген-
н о с т т а е и ч е т в ъ р т и ч н а т а с т р у к т у р а или
п р о с т р а н с т в е н а т а н а г ъ н а т о с т н а молеку­
лата. Естествените а н т и т е л а не се
свързват с д е н а т у р и р а н и белтъци.
Х а п т е н и . В е щ е с т в а с малка молекулна
маса - монозахариди, липиди, пептиди, сте-
роидни хормони, както и лекарствени сред­
ства с различен химически състав, не мо­
гат да стимулират имунен отговор, но при
с в ъ р з в а н е т о им с н о с и т е л ( б е л т ъ ч н а моле­
кула), т е придобиват имуногенни свойст­
ва. Такива в е щ е с т в а се н а р и ч а т х а п т е н и .
А н т и т е л а т а , индуцирани по т о з и начин са
насочени не само срещу х а п т е н а , но и сре­
щу м о л е к у л а т а н а н о с и т е л я .
А н т и т я л о т о свързва само малка ч а с т
(приблизително с размери н а хексапептид |
или хексазахарид) о т п о в ъ р х н о с т т а н а мо­
л е к у л а т а н а а н т и г е н а , т ъ й нар. е п и т о п 4
и л и специфична антигенна детерми­
н а н т а . А н т и г е н н и т е д е т е р м и н а н т и оп­
р е д е л я т с п е ц и ф и ч н о с т т а н а р е а к ц и я т а ан­
т и г е н - а н т и т я л о . Свързващото м я с т о на
а н т и т я л о т о „приляга" към а н т и г е н н а т а
д е т е р м и н а н т а т а к а , к а к т о ключ към клю­
чалка. А ф и н и т е т ъ т н а а н т и т я л о т о е пра-
6о пропорционален н а б л и з о с т т а н а кон­
т а к т а с а н т и г е н н а т а д е т е р м и н а н т а . Кол­
к о т о по-разтворим е даден а н т и г е н , т о л ­
кова т о й е п о - д о с т ъ п е н и в е р о я т н о с т т а
да взаимодейства с а н т и т я л о е по-голяма.
Броят на антигенните детерминанти е
различен в з а в и с и м о с т о т г о л е м и н а т а и
с л о ж н о с т т а на молекулата. Х а п т е н и т е
и м а т една а н т и г е н н а д е т е р м и н а н т а . По-
големите и по-сложни молекули, к а к в и т о са
е с т е с т в е н и т е а н т и г е н и , п р и т е ж а в а т по-
голям брой а н т и г е н н и д е т е р м и н а н т и . Та­
кива молекули с а в с ъ с т о я н и е да р е а г и р а т
с няколко а н т и т е л а и д а в а т в ъ з м о ж н о с т
за к р ъ с т о с а н о свързване и образуване н а го­
леми имунни комплекси. Б р о я т н а молеку­
л и т е а н т и т я л о , к о и т о а н т и г е н ъ т свърз­
ва едновременно, о п р е д е л я т н е г о в а т а ва-
лентност.
Антитела
А н т и т е л а с а имуноглобулините Ig(J, IgA,
l^M, IgD и IgE. С и н т е з и р а т се о т В-лим-
ф о ц и т и т е . Имуноглобулините с а г л и к о -
протеиии. Изградени с а о т полипептид-
ни вериги - две еднакви тежки вериги (съ­
о т в е т н о н а имуноглобулиновия клас - у, (t,
Ц , Ö , Е) и две леки вериги ( К или Х), свързани С
ковалентни (дисулфидни) и н е к о в а л е н т н и
връзки. П о з н а т и са 4 субкласа н а IgG, 2 - н а
IgA и 2 - н а IgM. П о л и п е п т и д н и т е вериги са
изградени о т домени - полипептидни пос­
л е д о в а т е л н о с т и с еднакви размери (100 или
110 аминокиселинни о с т а т ъ ц и ) , свързани с
вътреверижни дисулфидни м о с т о в е . Тежки­
т е вериги се с ъ с т о я т о т една вариабилна
и 3 или 4 к о н с т а н т н и о б л а с т и , а л е к и т е -
о т 1 вариабилна и 1 к о н с т а н т н а о б л а с т .
Илгуноглобулипите с а изключително
хетерогенни п о отношение н а специ­
фичност, а л т н о к и с е л и н н а с е к в е н ц и я
н а Иариабилните области, ф у н к ц и я и
е л е к т р о ф о р е т и ч н а п о у в ш к н о с т . Най-
използвани к а т о р е а к т и в з а имунохимични
изследвания с а а н т и т е л а т а о т класа н а
IgG. Най-важни к а ч е с т в а н а а н т и с е р у м и т е
к а т о р е а к т и в са с п е ц и ф и ч н о с т , а ф и н и ­
тет и титър.
Получаване н а п о л и к л о н а л н и
и моноклонални а н т и т е л а
Имуногенът се въвежда парентерално в т я ­
л о т о н а о п и т н о ж и в о т н о . В отговор на т о ­
ва В - л и м ф о ц и т и т е в далака н а ж и в о т н о т о
с и н т е з и р а т а н т и т е л а , насочени срещу раз­
л и ч н и т е а н т и г е н н и д е т е р м и н а н т и на ан­
т и г е н а . Те п р е м и н а в а т в кръвообръщение-
т о , к ъ д е т о се съдържа хетерогенна смес о т
а н т и т е л а , с и н т е з и р а н и о т повече на брой
В - л и м ф о ц и т н и к л е т ъ ч н и клонове (фиг.
13.1А). Вариабилната аминокиселинна сек­
венция на дадена имуноглобулинова верига
определя а н т и г е н н а т а специфичност н а
а н т и т я л о т о . Всяка уникална аминокисе­
линна секвенция е п р о д у к т н а о т д е л н а кле­
т ъ ч н а линия (клетъчен клон). К л е т к и т е , по­
т о м ц и на една родоначална к л е т к а с ъ с т а в ­
л я в а т к л е т ъ ч н и я клон. В с е к и к л о н син­
т е з и р а а н т и т е л а с е у и н с т в е н а по ро-
д а с и специфичност. С л о ж н и я т а н т и г е н
е в с ъ с т о я н и е да предизвика с и н т е з а на
м н о ж е с т в о а н т и т е л а с различна специфич­
н о с т , к о и т о се получават о т различни кле­
т ъ ч н и клонове. Така получените а н т и т е ­
ла се н а р и ч а т п о л и к л о н а л н и и п р о я в я в а т
различна специфичност в р е а к т и в н о с т т а
си към а н т и г е н а . Е с т е с т в е н и я т а н т и с е -
рум съдържа различни а н т и т е л а , синтези­
рани о т о т д е л н и клетъчни клонове. Само
при някои заболявания в р е з у л т а т на раз­
р а с т в а н е н а един единствен В-лимфоцитен
к л е т ъ ч е н клон се с и н т е з и р а моноклонален
имуноглобулин. Типичен пример е миелом-
ната болест. За получаване на поликлонал­
ни а н т и т е л а се и м у н и з и р а т зайци, свине,
овце, коне, кози,
Моноклоналните а н т и т е л а , к о и т о ши­
роко се използват к а т о р е а к т и в при имун­
ния анализ, п р е д с т а в л я в а т п р о д у к т на ед­
н а ед и н ствен а к л е т ъ ч н а линия. Техниката
за получаването им е разработена о т Koller
и Milstein, 1975. Имуноглобулините, с и н т е ­
зирани о т единствен клетъчен клон п р и т е ­
ж а в а т еднаква специфичност - насочени са
срещу е д и н с т в е н а а н т и г е н н а детерминан­
т а , и м а т еднаква аминокиселинна секвен­
ция във в а р и а б и л н а т а си о б л а с т и еднакви
свързващи свойства. Имуногенът се въвеж­
да п а р е н т е р а л н о н а о п и т н о т о ж и в о т н о
(мишка) (фиг. 13.1Б). О т далака на ж и в о т ­
н о т о се изолират лимфоцити, к о и т о син-
271
 антигенни
детерминанти
А, В, С, D

изолиране иа миеломна
лимфоцити клетъчна
синтезиращи антитела линия

смес от антитела срещу

различни антигенни
детерминанти на антигена

Ф и г . 13.1. Принцип на получаване на а н т и т е л а

А - поликлонални а н т и т е л а
Б - моноклонални а н т и т е л а

т е з и р а т а н т и т е л а in vitro. В к л е т ъ ч н а кул­ ки се с к а н и р а т з а продукция н а а н т и т я л о

т у р а изолираните лимфоцити се с л и в а т с
„безсмъртна" миеломна к л е т ъ ч н а линия
{клетъчна фузия). Така създадените хибрид­
ни к л е т к и с ъ ч е т а в а т с в о й с т в а т а н а вся­
к а о т к л е т к и т е , о т к о и т о произхождат.
Те р а с т а т н е о г р а н и ч е н о и с и н т е з и ­
р а т антитела в голялю количество
и с еднакво качество - а н т и т е л а , които
свързват специфично единствена а н т и г е н -
н а д е т е р м и н а н т а . След ф у з и я т а к л е т к и т е
се селекционират ( Ъ ю к и р а т ) , за д а се полу­
ч а т клонове, с и н т е з и р а щ и моноклоналнЬ
а н т и т е л а . К л е т ъ ч н и т е клонове о т хибрид­
ни клетки се разделят. Колониите о т к л е т -
272
и онези к л е т ъ ч н и линии, к о и т о с е к р е т и р а т
а н т и т я л о с ж е л а н а т а специфичност се кло-
н и р а т в субкултури. С к л е т к и о т о т д е л е н
хибриден клон о т н о в о се и н ж е к т и р а о п и т ­
но ж и в о т н о , в р е з у л т а т н а к о е т о негови­
т е В-лимфоцити с и н т е з и р а т моноклонал­
ни а н т и т е л а . Моноклоналните а н т и т е л а
се о т л и ч а в а т с много висока специфичност i
- р а з г р а н и ч а в а т т в ъ р д е сходни а н т и г е н н и i
д е т е р м и н а н т и . Друго т я х н о предимство е,
че веднъж с ъ з д а д е н и я т к л е т ъ ч е н клон рас­
т е н е п р е к ъ с н а т о и с е к р е т и р а еднакви ан­
т и т е л а . У н и к а л н а т а способност н а монок­
лоналните а н т и т е л а д а се с в ъ р з в а т с един- н
с т в е н enumon върху м у л т и в а л е н т е н (с по­
вече епитопи) а н т и г е н означава, че мнозин­
с т в о т о моноклонални а н т и т е л а не м о г а т
да се с в ъ р ж а т к р ъ с т о с а н о - не п р е ц и п и т и -
р а т макромолекулни а н т и г е н и . Поради т о ­
ва моноклоналните а н т и т е л а не се изпол­
з в а т при и м у н о п р е ц и п и т а ц и о н н и т е м е т о ­
ди. Изключение п р а в я т у с и л е н а т а с ч а с т и ­
ци им у н о нефелометри я и имунотурбиди-
метрия.
Моноклоналните а н т и т е л а н а м и р а т
широко приложение при и н д и р е к т н и т е (бе­
лязани с маркери) имунохимични м е т о д и .
Тъй к а т о моноклоналното а н т и т я л о е в
с ъ с т о я н и е да се свърже специфично с един­
с т в е н е п и т о п н а а н т и г е н а , т о към анали­
т и ч н а т а смес м о г а т да се п р и б а в я т едно­
временно две моноклонални а н т и т е л а , ед­
н о т о о т к о и т о е маркирано. Така се нама­
лява б р о я т н а а н а л и т и ч н и т е е т а п и (после­
дователно прибаване н а а н т и т е л а , инкуба-
ции, о т м и в а н е и т . н , ) .
ИМУНОЛОГИЧНА РЕАКЦИИ
ГвързВащи с и л и м е ж . 9 у
антигена и а н т и т я л о т о
Силите, к о и т о с в ъ р з в а т а н т и г е н а и а н т и ­
т я л о т о , са и с к о в а л с п т л и . Те в ъ з н и к в а т
при г о л я м а т а п р о с т р а н с т в е н а близост, ко­
я т о се създава между дадена а н т и г е н н а де­
т е р м и н а н т а и с ъ о т в е т н а т а ü аминокисе-
линна секвенция в м о л е к у л а т а н а а н т и т я ­
л о т о . Според S. Bassion, най-важни са с л с к -
стростатичлитс сили н а привлича­
н е - при физиологично pH т е се п о р а ж д а т
о т в з а и м о д е й с т в и е т о н а електрично заре­
дени полярни групи н а о с т а т ъ ц и т е о т ами­
нокиселини, и з г р а ж д а щ и б е л т ъ ц и т е . З а
свързването на а н т и г е н а и а н т и т я л о т о
допринасят още в о д о р о д н и в р ъ з к и , с и л и ­
т е н а v a n d e r Waals и х и д р о ф о б н и връз­
ки. Водородните връзки се с ъ з д а в а т меж­
ду аминогрупите и карбоксилните групи н а
п е п т и д н и т е връзки. С и л и т е н а v a n d e r
Waals са най-слаби и д е й с т в а т на много мал­
ки р а з с т о я н и я . Н а р а с т в а щ а т а б л и з о с т
между а н т и г е н н а д е т е р м и н а н т а и с ъ о т ­
в е т н а т а ü аминокиселинна секвенция о т
а н т и т я л о т о индуцира флуктуации в заря­
да в ъ т р е в а т о м и т е н а молекулите. При
много голяма близост между молекули или
а т о м и , я д р о т о н а даден а т о м може да бъ­
де привлечено о т в ъ н ш н а т а електронна об­
вивка на съседен а т о м .
При pH 6.0-8.0 и т е м п е р а т у р а между 250С
и 35"С р а з л и ч и я т а при свързване н а а н т и ­
гена и а н т и т я л о т о в комплекси са незна­
чителни. При рП < 4.0 и pH > 8.0 се инхибира
свързването или образуваните вече имун­
ни комплекси се дисоциират, о т ч а с т и по­
ради д е н а т у р а ц и я н а б е л т ъ ц и т е . Промени
в й о н н а т а сила в л и я я т в по-голяма с т е п е н ,
о т к о л к о т о рП и т е м п е р а т у р а т а .
Механизъм на р е а к ц и я т а
А ф и н и т е т и aöugumem
Р е а к ц и я т а между а н т и г е н а и а н т и т я л о т о
е о б р а т и м а и се изразява с уравнението:
к
а w ^
+
^ Л Ь Ч Г— ^Ag/Ab
kd
СЛк - концентрация на антиген
CAb - концентрация на а н т и т я л о
Слг/ль" концентрация на комплексите антиген/
антитяло
ка и к(1 - асоциационна и дисоциационна констан­
т а , различни за всяка двойка антиген и анти­
тяло
З а в и с и м о с т т а между к о н ц е н т р а ц и я т а
на антигена, а н т и т я л о т о и имунните ком­
плекси се характеризира с равновесна кон­
с т а н т а К:
1Л CAR/Ab
IV =
С дц х С д|,
Популации о т а н т и т е л а с висок афини­
т е т се о т л и ч а в а т с високи с т о й н о с т и на
р а в н о в е с н а т а к о н с т а н т а , т . е . т я е лиьр-
к а з а афинитета н а антитялото
кълг а н т и г е н а .
Т е р м и н и т е а ф и н и т е т и а в и д и т е т ха­
р а к т е р и з и р а т с и л а т а и е н е р г и я т а на вза­
имодействие между а н т и г е н и а н т и т я л о .
Л ф и н и т е т ъ т определя с и л а т а на свърз­
ване н а а н т и г е н н а д е т е р м и н а н т а със съ­
о т в е т н о свързващо м я с т о о т а н т и т я л о ­
т о . А в и д и т е т ( Ж а д н о с т ) е т е р м и н , кой­
т о характеризира о б щ а т а свързваща енер­
гия между а н т и т е л а и множествени а н т и
генни д е т е р м и н а н т и върху е с т е с т в е н и ан
т и г е н и . А в и д и т е т ъ т се о т н а с я до цялос
273

т н а т а сила н а свързване н а а н т и г е н а и ан­
т и т я л о т о и представлява сумираните
а ф и н и т е т и на всички у ч а с т в а щ и а н т и г е н -
ни д е т е р м и н а н т и . А н т и т е л а т а о т класа
на IgM к а т о цяло и м а т по-голям а в и д и т е т
о т IgG а н т и т е л а т а - м о л е к у л а т а н а IgG
има 2 свързващи м е с т а , т а з и н а IgM - 10
свързващи м е с т а . Лв и д и ш е ш ъ ш е л ь я р к а
з а стабилността н а колтлекса ан­
тиген-антитяло.
Кръстосана р е а к т и В н о с т
Свързването на а н т и т я л о с а н т и г е н , раз­
личен о т т о з и , к о й т о е стимулирал иму­
нен отговор, се нарича к р ъ с т о с а н а реак­
тивност. Антигенните детерминанти на
кръстосано р е а г и р а щ и т е в е щ е с т в а и м а т
еднаква химична с т р у к т у р а или сходни фи­
зикохимични конфигурации, т . е . и м а т ед­
накви или подобни а н т и г е н н и д е т е р м и н а н ­
т и . Такава кръстосана р е а к т и в н о с т се наб­
людава ч е с т о при а н т и т е л а , индуцирани
о т някои лекарства, например пеницилин.
Р е а к т и в н о с т т а на а н т и т я л о т о спрямо
пеницилина може да бъде много висока, но
производните м е т а б о л и т и , съдържащи ос­
н о в н а т а с т р у к т у р а н а л е к а р с т в о т о също
м о г а т да р е а г и р а т с а н т и т я л о т о , индуци-
рано о т пеницилина.
Преципитационна реакция
Свързването на а н т и г е н а и а н т и т я л о т о е
динамичен процес представляващ равновес­
на реакция, к о я т о включва 3 фази:
I ф а з а - н а ч а л н а р е а к ц и я между мул-
т и в а л е н т е н а н т и г е н и бивалентно а н т и ­
тяло
II ф а з а - н а р а с т в а н е на комплексите
антиген-антитяло
III ф а з а - п р е ц и п и т а ц и я н а комплек­
с и т е след достигане н а к р и т и ч н а големи­
на.
Н а ч а л н а т а реакция п р о т и ч а много по-
бързо в сравнение с последващото н а р а с т ­
ване н а комплексите. П р е ц и п и т а ц и я н а
комплексите о т а н т и г е н и а н т и т я л о нас­
т ъ п в а , к о г а т о молекули н а а н т и т е л а с две
или повече свързващи м е с т а з а а н т и г е н а се
274
ИЗЛИШЪК на антитяло еквивалентност излишък на
(прозон) на антиген- антиген
100-
Концентрация на антигена
Фиг. 13.2. Имунопреципитационна крива
(по Bassion)
с в ъ р з в а т кръстосано с поливалентните мо­
лекули н а а н т и г е н а до образуването н а ре­
ш е т к а . З а в и с и м о с т т а между к о н ц е н т р а ­
ц и я т а н а а н т и г е н а и величината, с к о я т о
се измерва и м у н о п р е ц и п и т а ц и я т а , следва
определена з а в и с и м о с т и графично се пред­
с т а в я с п р е ц и п и т а ц и о н н а к р и в а (фиг.
13.2). В нея се р а з л и ч а в а т 3 зони: на изли­
шък на антитяло, на еквивалентност и на
излишък на антиген. В з о н а т а н а еквива­
л е н т н о с т съотношението на антигена
към а н т и т я л о т о е о п т и м а л н о за получа- в
ване н а п р е ц и п и т а т . Р е а к ц и я т а между ан- н
тигени, п р и т е ж а в а щ и множество антиген- h
ни д е т е р м и н а н т и и а н т и т е л а с две ( к а т о
IgG) или повече ( к а т о IgM) свързващи мес­
т а води до образуване н а р е ш е т к а . Молеку­
л и т е н а а н т и т я л о т о м о г а т да с в ъ р з в а т
к р ъ с т о с а н о е п и т о п и върху една и съща мо­
лекула а н т и г е н или върху различни молеку­
ли а н т и г е н . С увеличаване размера и слож­
н о с т т а на р е ш е т к а т а т я с т а в а неразт­
ворима и п р е ц и п и т и р а . В з о н и т е н а изли­
шък н а а н т и т я л о или н а излишък н а а н т и ­
ген не се с т и г а до е ф е к т и в н о к р ъ с т о с а н о
свързване и образуване н а п р е ц и п и т а т . При
излишък н а а н т и г е н или при излишък н а ан­
т и т я л о се п о л у ч а в а т р а з т в о р и м и ком­
плекси. З о н а т а н а е к в и в а л е н т н о с т не
п р е д с т а в л я в а с ъ о т н о ш е н и е н а т о ч н а мо-
ларна е к в и в а л е н т н о с т , а о п т и м а л н о с ъ о т ­
ношение з а . к р ъ с т о с а н о свързване в изслед­
в а н а т а с и с т е м а - 2-3 молекули а н т и т я л о
за молекула а н т и г е н (фиг. 13.3).
И м у н о п р е ц и п и т а ц и о н н и т е реакции се
влияят о т е с т е с т в о т о на антигена и на
 мално разклоняване) и много добра р а з т в о ­
р и м о с т във вода. На т е з и условия о т г о в а ­
р я Polye-thylene glycol 6000 (PEG 6000), най-
антиген излишък на
подходящ за имунопреципитационни м е т о ­
разтворими ди в т е ч н а среда (3-5% PEG във ф о с ф а т е н
антитяло комплекси
буфер, съдържащ NaCI).
Х
0 о
О О
f хУ
У у
± •
^ ВИДОВЕ ИМУНОЛОГИЧНИ РЕАКЦИИ
оптимално съотношение неразтворими
антиген/антитяло комплекси Р а з л и ч а в а т се п ъ р В и ч н а , В т о р и ч н а и
т р е т и ч п а имунологична реакция. В
В
п ъ р в и ч н а т а реакция а н т и т я л о т о разпоз­
О С)
о 0 нава а н т и г е н а и специфично го свързва. След
о о ЧУ т о в а може да се яви в т о р и ч н а реакция - опи­
излишък на антитяло разтворими с а н а т а по-горе п р е ц и п и т а ц и я ( к о г а т о ан­
антиген комплекси т и г е н ъ т е разтворим), аглутинация ( а н т и ­
г е н ъ т е н е р а з т в о р и м а ч а с т и ц а или е свър­
Фиг. 13.3. Образуване на комплекси антиген-ан-
зан за т а к а в а ) , фиксиране на комплемент.
т и т я л о в зависимост о т концентрацията на
антигена и а н т и т я л о т о в реакционната смес П р о д у к т ъ т н а в т о р и ч н а т а реакция може
(по Keller) да се визуализира (в зависимост о т концен­
А - излишък на а н т и т я л о т р а ц и я т а ) и да се оцени качествено или ко­
Б - оптимално съотношение на антиген личествено. Третични реакции (предимно in
към а н т и т я л о vitro) с а ф а г о ц и т о з а т а , х е м о т а к с и с ъ т ,
В - излишък на антиген
и м у н н а т а а д х е р е н т н о с т и др. Компонен­
а н т и т я л о т о - специфичност, афини­ т и т е н а п ъ р в и ч н а т а реакция не м о г а т да
тет, а в и д и т е т , p H и т е м п е р а т у р а се изследват директно - т е с т а в а т достъп­
н а средата, йонен с ъ с т а в и й о н н а си­ ни за анализ едва след к а т о се б е л е ж а т с
л а н а буфера, в к о й т о п р о т и ч а р е а к ­ радиоактивни изотопи, ензими, флуоресци­
цията, к а к т о и о т присъствието н а ращи или луминесциращи вещества. Имуно-
н е й о н е н х и д р о ф о б е н п о л и м е р . Реша­ х и м и ч н и т е м е т о д и , к о и т о се основават на
първична имунологична реакция, се н а р и ч а т
ващо обаче е к о л и ч е с т в е н о т о с ъ о т н о ш е н и е
на а н т и г е н а към а н т и т я л о т о . О п т и м а л ­
индиректни {методи с маркери). За разли­
ка о т т я х , м е т о д и т е на о с н о в а т а н а в т о ­
на преципитация се получава с белтъчни ан­
р и ч н а т а имунологична реакция се н а р и ч а т
т и г е н и , ч и я т о молекулна м а с а е м е ж д у
( j u p e k m n u поради в ъ з м о ж н о с т т а пряко да
40 000 и 160 000 Da. Полизахаридни а н т и г е ­
се измери п р о д у к т ъ т н а р е а к ц и я т а .
ни, д е н а т у р и р а н и б е л т ъ ц и и вируси д а в а т
по-широка преципитационна крива. Големи­
т е размери н а подобни а н т и г е н и п о д т и с ­
ДИРЕКТНИ ИМУНОХИМИЧНИ МЕТОДИ
к а т п р о с т р а н с т в е н о к р ъ с т о с а н о т о свър­
зване. Е л е к т р и ч н и я т заряд и ф о р м а т а н а
Д и р е к т н и т е м е т о д и включват:
комплекса а н т и г е н - а н т и т я л о също и м а т
1. И м у н о п р е ц и п и т а ц и о н н и м е т о д и
значение - комплекси с по-голям електричен
В г е л н а с р е д а (агарозен или агаров гел)
заряд п р е ц и п и т и р а т по-трудно. Прибавя­
• качествени
н е т о на полимер към р е а к ц и о н н а т а смес ус­
- двойна имунодифузия - т е х н и к а н а
корява образуването н а и м у н н и т е комплек­
Ouchterlony
си и ги стабилизира - т е н а р а с т в а т по-бър­ - п р о т и в о п о т о ч н а електрофореза
зо, особено в н а ч а л н а т а фаза н а р е а к ц и я т а ;
- имуноелектрофореза
под де й с твие н а полимера се усилва преци- - имунофиксационна електрофореза
п и т а ц и я т а н а имунен комплекс, в к о й т о
• количествени
у ч а с т в а а н т и т я л о с нисък а в и д и т е т . Под­
- радиална имунодифузия
ходящи с а полим ери т е с висока молекулна - р а к е т н а имуноелектрофореза
маса, висока с т е п е н н а линейност (мини­
275
2. И м у н о п р е ц ш ш г п а ц и о ш ш м е т о д и
В т е ч н а среда
- имунотурбидиметрия
- имунонефелометрия
3. А г л у т и н а ц и о н н и м е т о д и
- латексова аглутинация
- инхибирана латексова а г л у т и н а ц и я

Имунопреципитация В гел

Разработени са различни качествени и ко­

личествени техники за а г а р о з е н и а г а р о в
гел. Ге л ната среда стабилизира дифузион-
ния процес и позволява п р е ц и п и т а т и т е да
се в и д я т директно. С ъ о т н о ш е н и е т о а н т и -
ген:антитяло, с о л н а т а концентрация и по­
лимерите в л и я я т върху имунопреципита-
ц и я т а в гел т а к а , к а к т о и в р а з т в о р . Па­
с и в н а т а дифузия в гел се подчинява н а след­
н а т а м а т е м а т и ч е с к а зависимост (уравне­
ние на Pick):
d Q / d t = DA(dC/dx)
dQ - количество дифундиращо вещество, което
за време t преминава през полето А
d C / d x - концентрационен градиент
D - дифузионен коефициент (D е право пропор­
ционален на температурата и обратно пропор­
ционален на хидрирания молекулен обем на ди-
фундиращото вещество)
Позицията на п р е ц и п и т а т а зависи о т мо­
лекулните маси на антигена и а н т и т я л о т о
- по-тежки молекули дифундират по-бавно.
Различията в с к о р о с т т а н а дифузия к а к т о
на антигена, т а к а и н а а н т и т я л о т о са ре­
з у л т а т о т различия в т я х н а т а к о н ц е н т ­
рация, големина и форма н а молекулите.
Д в о й н а и м у н о д и ф у з и я . Д в о й н а т а иму-
нодифузия {техника на Ouchterlony) се из­
ползва ч е с т о в имунологията за о т к р и в а н е
на антигенно сродство. В агаров гел се из­
р я з в а т ямки, в к о и т о се н а н а с я т изследва­
н и т е а н т и г е н и и а н т и т я л о т о . След про­
дължителна инкубация във влажна камера
се о т ч и т а вида н а имунопреципитацион-
н а т а линия, к о я т о характеризира изслед­
в а н и т е а н т и г е н и к а т о идентични (непре­
к ъ с н а т а п р е ц и п и т а ц и о н н а линия - фиг.
13.4А), частично идентични (линия е шип -
фиг. 13.4Б) или неидентични (кръстосани ли­
нии - фиг. 13.4В).
276
Фиг. 13.4. Двойна имунодифузаия {техника на
Ouchterlony)
Л - реакция на и д е н т и ч н о с т
Б - реакция на ч а с т и ч н а и д е н т и ч н о с т
В - реакция на н е и д е н т и ч н о с т
ПротиВопоточна имуиоелектрофоре-
з а (двойна електроимунодифузия). В агаров
гел се и з р я з в а т две ямки н а няколко мили­
м е т р а един срещу друг - з а изследвания ан­
т и г е н и з а а н т и т я л о т о (фиг. 13.5). При при­
лагане н а електрично поле а н т и г е н ъ т и ан­
т и т я л о т о м и г р и р а т едно срещу друго в ре­
з у л т а т н а к а т о д н о т о и з м е с т в а н е н а гама-
глобулините, к о е т о се дължи н а силно изра­
зения електроендоосмотичен ефект на ага-
ровия гел. Между я м к а т а , съдържаща ан­
т и г е н и т а з и , съдържаща с ъ о т в е т н о т о му
а н т и т я л о се получава п р е ц и п и т а т . Про-
т и в о п о т о ч н а т а електрофореза е пресяващ
м е т о д за о т к р и в а н е н а бактериални, гъбич-
ни, вирусни а н т и г е н и в кръв, урина и гръб-
начно-мозъчна т е ч н о с т .
©
ЯМКИ за ангисерума
електросндоосмоза
i— имунопреципитат
електрофоретична
миграция
антигении ямки (проба)
©
Фиг. 13.5. Противопоточна имуноелекрофореза
Проба 1 - проба, положителна за изследвания антиген
Проба 2 - проба, отрицателна за изследвания антиген
И м у н о е л е к т р о ф о р с з а {no G r a b a r a Wil­
liams, 1953 и Scheiddeger, 1955). В а г а р о з е н
или агаров гел върху с т ъ к л о или п р о з р а ч н а
п л а с т и ч н а подложка, п о к р и т а с филм, кой­
т о с в ъ р з в а г е л а ( н а п р . Gel B o n d F i l m -
Pharmacia), се и з р я з в а т а н т и г е н н и я м к и . В
т я х се н а н а с я т изследвания м а т е р и а л и
к о н т р о л е н м а т е р и а л з а сравнение. Имуно-
е л е к т р о ф о р е з а т а включва д в а е т а п а :
е л е к т р о ф о р е з а И I U M I J H о д и ф у з и я . След
е л е к т р о ф о р е з а н а б е л т ъ и и т е о т биологич­
ния м а т е р и а л и к о н т р о л а т а , между а н т и -
г е н н и т е я м к и (успоредно н а п о с о к а т а н а
е л е к т р о ф о р е т и ч н а т а м и г р а и и я ) се изряз­
ва канал, к о й т о се запълва с а н т и с е р у м .
След п р о д ъ л ж и т е л н а имунодифузия н а а н ­
т и г е н а с р е щ у а н т и т я л о т о (24-72 h ) в ъ в
блажна к а м е р а се п о л у ч а в а т п р е ц и п и т а -
т и във ф о р м а т а н а дъги (фиг, 13.6), Всяка
имунопреиипитаиионна дъга с ъ о т в е т с т в а
н а определен а н т и г е н - спеиифичен (инди­
видуален) б е л т ъ к о т и з с л е д в а н и т е м а т е р и ­
али. М я с т о т о и ф о р л г а т а п а д ъ г а т а
са характерни з а всеки о т ипдивиду-
а л п и т е б е л т ъ ц и . Сравнение н а преиипи-
т а и и о н н и т е дъги в н о р м а л е н ( к о н т р о л е н )
горум с т е з и в с е р у м н а болен м о ж е д а р азк­
рие отсъствие, п а т о л о г и ч н о повишениеМАМ
понижение, к а к т о и д р у г и а н о м а л и и н а бел­
т ъ и и т е в с е р у м а н а болния. К о л к о т о п о -
голяльа е м о л е к у л н а т а льаса п а бел­
тъка, толкова по-далече о т аптисе-
р у л т и я к а п а л е р а з п о л о Ж е п а ильупо-
п р е ц и п и т а ц и о п п а т а дъга. Интензив­
н о с т т а ü о р и е н т и р а п р и б л и з и т е л н о з а кон-
Anli-T-Ig
Anii-IgG
Anli-IgA
Anli-IgM
Anli-Kappa
Anli-Iximhda
<J>iu?. 13.6. Имуноелектрофореза {по Bassion)
В а и т и г е и н и т е ямки с кръгла форма са нанесени
Посменно контролен серум (к) и серум на един и съ­
щи болен (б) с моноклонален имуноглобулин IgG/k. В
каналите са нанесени антисеруми срещу човешки
Имуноглобулин и (Anti-T-Ig) и различни моноспеци-
фични антисеруми
центрацията на антигена - ш и р и н а т а и
диалгетърът н а преципитационна-
т а д ъ г а с а пропорционални н а кон­
ц е н т р а ц и я т а н а а н т и г е н а . При висо­
к а к о н ц е н т р а и и я н а а н т и г е н а д ъ г а т а дос­
т и г а до а н т и с е р у м н и я канал, при много ви­
с о к а (много голям излишък н а а н т и г е н ) мо­
ж е д а не н а с т ъ п и п р е и и п и т а щ ш поради не­
д о с т и г н а а н т и т я л о . Ако в а н т и г е н н а т а
я м к а с м е п о с т а в и л и човешки серум, а в к а ­
нала - полиспеиифичен а н т и с е р у м срещу чо­
вешки серумни б е л т ъ и и , се п о л у ч а в а т око­
ло 30 и м у н о п р е ц и п и т а ц и о н н и дъги. Ако в
а н т и г е н н а т а я м к а се п о с т а в и човешки се­
рум, а в к а н а л а - моноспеиифичен а н т и с е ­
р у м срещу IgG, след и м у н о д и ф у з и я т а щ е се
наблюдава с а м о една дъга, к о я т о с ъ о т в е т ­
с т в а н а с в ъ р з а н и я о т а н т и с е р у м а IgG. В
о б л а с т т а н а к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я с по­
м о щ т а н а и м у н о е л е к т р о ф о р е з а т а се раз­
п о з н а в а т ( п о т в ъ р ж д а в а т след е л е к т р о ф о ­
реза) и х а р а к т е р и з и р а т моноклонални иму-
ноглобулини и т е х н и ф р а г м е н т и по дефор­
м а ц и я т а н а с ъ о т в е т н а т а им преципита-
ц и о н н а дъга. И з с л е д в а н е т о се извършва ед­
новременно със с е р у м а и у р и н а т а н а бол­
ния. С п о м о щ т а н а имуноелектрофореза мо­
ж е д а се д о к а ж е силно намаление н а п р о т е -
а з н и я и н х и б и т о р и,-анпгипгрипсин, н а иеру-
л о п л а з м и н , и м у н о г л о б у л и н и , фибриноген
( с ъ о т в е т н и т е п р е и и п и т а ц и о н н и дъги лип­
с в а т ) . И м у н о е л е к т р о ф о р е з а т а позволява
о б щ поглед върху б е л т ъ ч н и я с ъ с т а в н а ури­
н а т а при п р о т е и н у р и я , к а к т о и върху бел­
т ъ ч н и я с ъ с т а в н а други биологични т е ч н о с ­
т и . Н а й - н и с к а т а доказуема к о н ц е н т р а ц и я
е около 200-300 тд/1. Р е з у л т а т ъ т о т иму­
н о е л е к т р о ф о р е з а т а се оценява по позиция­
т а и вида ( ш и р и н а , д и а м е т ъ р , форма) н а
н а т и в н и т е или о ц в е т е н и п р е ц и п и т а ц и о н -
ни дъги. След продължително промиване във
физиологичен р а з т в о р , г е л ъ т се изсушава и
о ц в е т я в а с багрило з а б е л т ъ ц и к а т о
Coomassie Brilliant B l u e R250 {СВВ), р а з т ­
ворено в смес о т е т а н о л , о ц е т н а киселина
и д е с т и л и р а н а вода. Ф о н ъ т се о б е з ц в е т я в а
с р а з т в о р и т е л я н а б а г р и л о т о . Г е л ъ т се из­
с у ш а в а и м о ж е д а се с ъ х р а н я в а продължи­
т е л н о време.
Имунофиксационна електрофореза
(Alper и Johnson, 1969; Johnson, 1982; B a n s и
др., 1986; B a u e r и Molinari, 1989). Б е л т ъ ц и т е
277
о т биологичния м а т е р и а л се фракционират
електрофоретично 6 т ъ н ъ к агарозен гел.
Върху фракционираните б е л т ъ ц и се н а н а
ся моноспецифичен антисерум. След имуно-
фиксация на а н т и г е н и т е 6 гела с а н т и т е ­
ла се о б р а з у в а т п р е ц и п и т а т и , к о и т о се
п р о м и в а т във физиологичен р а з т в о р и оц­
в е т я в а т с СВВ (фиг. 13.7). В р е м е т о з а иму-
нофиксация е само 5-10 min поради непос­
редствения к о н т а к т н а а н т и г е н а с а н т и ­
т я л о т о . След всяко промиване във физио­
логичен разтвор, г е л ъ т се пресова под фил­
т ъ р н а х а р т и я и т е ж е с т (ускорява се о т с ­
т р а н я в а н е т о н а непреципитирани б е л т ъ ­
ци, к о и т о също се о ц в е т я в а т и з а т р у д н я ­
в а т о т ч и т а н е т о н а р е з у л т а т а ) . В сравне­
ние с имуноелектрофорезата, имунофикса-
HY DRAG EL II Ф
I I
ELI» G Л M K L с ензим; изследваният а н т и г е н с т а в а ви­
sebia © дим след п р о т и ч а н е т о н а подходяща инди­
IIYDRAGELIF
ELP
A M K
sebia
Фиг. 13.7. Имунофиксационна електрофореза на
кръвен серум върху тънък агел {„Electrophoresis
program"- Sebia)
Електрофоретично фракционираните белтъци на
^ о ч е Р т а н и т е правоъгълници с означения
LP, G, А, М, К, L са фиксирани с ъ о т в е т н о с полива-
лентен антисерум и с антисеруми срещу IgG, IgA,
gM, леки вериги т и п к и X. Серумът на едно лице се
изследва върху гел - нанася се 6 п ъ т и във всеки пра­
воъгълник срещу стрелката.
А - серум на здрав с поликлонални имуноглобулини
ь - болест на леките вериги (моноклоналните леки
вериги т и п 1 6 серума трябва да се п о т в ъ р д я т с
имунофиксационна електрофореза на урина)
278
ц и о н н а т а електрофореза позволява много
по-бързото получаване н а р е з у л т а т - за око­
ло 3 h в м е с т о з а 24-52 h (в т о в а време не е !•
включено п р о м и в а н е т о и о ц в е т я в а н е т о н а I ß
имуноелектрофорезата!). Имунофиксацион- И
н а т а електрофореза намира приложение в [8
л а б о р а т о р н а т а д и а г н о с т и к а н а монокло­
н а л н и т е имуноглобулинопатии и е по-съв-
р е м е н п а т а а л т е р н а т и в а н а шмуно-
и
е л е к т р о ф о р е з а т а . Р е з у л т а т ъ т , получен
с имунофиксационна електрофореза е по-
ясен и недвусмислен, ч у в с т в и т е л н о с т т а -
по-висока (доказуема граница за имуногло­
булини - около 20-25 mg/1). Основните изис­
квания к ъ м м е т о д а в к л ю ч в а т т ъ н ъ к гел л
(под 0.5 m m - фабричен), к о й т о се обработ­ -I
ва лесно и бързо, к а к т о и добре пречистени
бистри високотитърни антисеруми.
Western blot(immunoblot, имунопопаване).
Касае се за к а ч е с т в е н м е т о д основаващ се
н а принципа н а и н д и р е к т н и т е м е т о д и ( с
маркер). Е л е к т р о ф о р е т и ч н о разделеният в
гел м а т е р и а л се попива с нитроцелулозен
л и с т . Последният се п о с т а в я в р а з т в о р н а
разредено а н т и т я л о (или се наслоява с ан­
т и т я л о ) . А н т и т я л о т о е маркирано, напр.
к а т о р н а реакция. Western blot е високочув­
с т в и т е л е н м е т о д ( ч у в с т в и т е л н о с т за ан­
т и г е н и - 500 n g / m l и л и до 2.5 n g / m l за от­
делна фракция). Ч у в с т в и т е л н о с т т а н а ме­
т о д а се повишава чрез използване н а 3 ан­
т и т е л а или н а с и с т е м а т а авидин-биотин.
Намира приложение в о т к р и в а н е н а моно-
клонални п р о т е и н и или т е х н и ф р а г м е н т и
к а т о м и к р о п а р а п р о т е и н а н а Bence Jones,
н а олигоклонален имуноглобулин в гръбнач­
номозъчната течност, в диагностиката
н а СПИН, за изследване н а различни а н т и ­
гени в ниски к о н ц е н т р а ц и и в т е л е с н и т е ч ­
н о с т и или в к л е т ъ ч н и к у л т у р и .
Р а д и а л н а илгунодифузия {Manchini,
Carbonara и Heremans, 1965). За разлика о т
о п и с а н и т е по-горе имунопреципитационни
м е т о д и , р а д и а л н а т а имунодифузия (РИД) е
количествен метод. Р а з т в о р е н в буфер агар
или агароза се смесва с моноспецифичен ан­
т и с е р у м . В а н т и г е н н и ямки с точно опре­
делен еднакъв диалгетър се н а н а с я т после­
дователно 3 с т а н д а р т а с различни концен-
 стандарти
контрола ссрумм на болни
Ф и г . 13.8. Радиална имунодифузия
трации, контролен серум и с е р у м и т е на
болните. След продължителна пасивна иму­
нодифузия се получават преципитационни
пръстени (фиг. 13.8). Д и а м е т ъ р ъ т на иму-
нопреципитационния пръстен е пропорци­
онален на концентрацията на антигена (из­
следвания специфичен белтък). За изчисля­
ване на р е з у л т а т а , в координатната сис­
т е м а д и а м е т ъ р ъ т (mm) се нанася срещу
концентрацията. Построява се калибраци-
онна крива, по к о я т о се о т ч и т а т неизвес­
т н и т е концентрации на пробите въз осно­
ва на и з м е р е н и т е им д и а м е т р и . Според
уравнението на Fick, дифузията зависи от
размера, молекулната м а с а и концентра­
цията на антигена, но при достигане на
равновесие диаметърът на преиипитаци­
онния пръстен зависи само от съотноше­
нието на концентрациите на антигена и
антитялото. Колкото молекулната маса
на антигена е по-малка, толкова имуноди-
фузията е по-бърза - и о б р а т н о т о . При по-
висока т е м п е р а т у р а имунодифузията про­
т и ч а по-бързо, но д и а м е т ъ р ъ т на пръсте­
н и т е след завършване на имунодифузионния
процес не зависи о т т е м п е р а т у р а т а . Вър­
ху дифузионния процес оказват влияние аб­
с о л ю т н о т о количество на антигена в про­
б а т а , неговите дифузионни свойства, вида
на антисерума ( а н т и т е л а т а у различните
животински видове се различават по моле­
кулна маса, напр. имунодифузията е по-бър­
за при използване на заешки, отколкото на
конски антисерум). Д и а м е т ъ р ъ т (D) на пре-
ципитационния пръстен показва следната
зависимост:
D - д и а м е т ъ р н а преиипитационния п р ъ с т е н
VAg- обем н а а н т и г е н а (ml)
Р - а н т и с е р у м (ml) 6 100 ml гел
d - д и а м е т ъ р н а а н т и г е н н а т а я м к а (mm)
Т - т и т ъ р на антисерума
h - височина н а слоя гел (обикновено 2-3 mm)
СлЙ - кониентращая н а а н т и г е н а .
Т и т ъ р ъ т на антисерума показва колко
mg антиген може да преципитира 1 ml ан­
тисерум. Надеждни р е з у л т а т и се получа­
в а т при диаметър на п р ъ с т е н и т е между 4
и 9 mm - д и а м е т ъ р ъ т на по-малките о т 4
mm пръстени не може да се о т ч е т е точно,
а п р ъ с т е н и т е , по-големи о т 9 mm ч е с т о
и м а т неясни очертания. Диаметърът на
пръстена се увеличава когато се увеличи
о б е м ъ т на пробата, д и а м е т ъ р ъ т на анти­
генната ямка и концентрацията на анти­
гена. При изследване на бедни на белтък
т е ч н о с т и к а т о урина или гръбначно-мозъч-
на т е ч н о с т в по-голямата антигенна ям­
ка се поставя повече проба. За да се полу­
ч а т преципитационни пръстени с по-мал­
ки размери се намалява о б ем ът на проба­
т а и д и а м е т ъ р ъ т на антигенната ямка,
увеличава се количеството на антисерума
в гела и дебелината на гела. Колкото по-ви-
сок е т и т ъ р ъ т на антисерума, толкова по-
малък обем о т него се поставя в гела. Ре­
з у л т а т ъ т се изчислява на основата на след­
н и т е математически зависимости:
d = lo^ CAt, + к; S = S 0 + kCAG; pr 2 = SQ + СЛ8
d - д и а м е т ъ р н а преципитаиионния п р ъ с т е н
S - повърхност на преципитаиионния п р ъ с т е н
CAK - к о н ц е н т р а ц и я н а а н т и г е н а
S() - повърхност на а н т и г е н н а т а я м к а {на ка-
либрационната крива - отсечка от ордината-
та, която съотвстства па диаметъра на ан-
тигенпата ямка)
к - к о н с т а н т а , к о я т о зависи о т концентраци­
я т а н а а н т и с е р у м а в гела и о т дебелината н а
гелния слой (к определя наклона на к р и в а т а )
При постоянни к и S0, количеството на
антигена е пропорционално на диаметъра
на пръстена, повдигнат на квадрат. Резул­
т а т и т е м о г а т да се о т ч е т а т и изчислят
по два начина: след завършена имунодифу­
зия (48-52 h ) no Manchini или след 18 h о т
н а ч а л о т о на д и ф у з и я т а - no F a h e y и
McKelvey. При м е т о д а на Manchini диамет-
279
pume на п р ъ с т е н и т е се и з м е р в а т в услови­
я т а на равновесие, т ъ й к а т о при т е з и ус­
ловия:
1. съществува линейна зависимост ме?кс|у
к о н ц е н т р а ц и я т а н а а н т и г е н а и диаме­
т ъ р а на преципит а ц и он н и т е п р ъ с т е н и ,
повдигнат на к в а д р а т и
2. възпроизводимостта н а измерване диа­
м е т р и т е на п р ъ с т е н и т е е по-добра, о т ­
колкото преди достигане н а равновесие,
т . е . преди завършване н а д и ф у з и я т а .
При м е т о д а на Fahey и McKelvey (1965)
д и а м е т р и т е н а п р ъ с т е н и т е се о т ч и т а т
преди установяване н а равновесие. Същес­
т в у в а линейна зависимост между д и а м е т ъ ­
ра на п р ъ с т е н и т е и десетичния л о г а р и т ъ м
на к о н ц е н т р а ц и я т а н а а н т и г е н а . Калибра-
ц и о н н а т а крива се п о с т р о я в а н а полулога-
ритмична х а р т и я (деленията н а ордината-
т а са логаритмични) - н а а б с ц и с а т а се на­
нася диаметъра, а н а о р д и н а т а т а - logCAg.
Този м е т о д показва много висока с т е п е н н а
корелация с м е т о д а на Manchini; изисква ка-
либрационна крива за всеки гел и по-висок
процент на а н т и с е р у м в гела, но е по-бърз
и практичен за клиничната лаборатория.
РИД е лесна за изпълнение т е х н и к а , коя­
т о не се нуждае о т а п а р а т у р а . С РИД мо­
же да се определят редица диагностично
важни серумни белтъци в концентрация над
100 mg/1. По данни н а Bassion ч у в с т в и т е л ­
н о с т т а на м е т о д а е 50 mg/1. М е т о д ъ т е
бавен - р е з у л т а т ъ т се получава след 1-3 дни,
а при оцветяване н а п р е ц и п и т а т и т е - след
5 дни. Границите н а линейност са много
тесни, п о в т а р я н е т о н а изследването с но­
во разреждане още повече забавя предава­
н е т о на р е з у л т а т а . Р е з у л т а т и т е о т оп­
ределянето на IgG, IgA и особено н а IgM в
случаи н а по-големи отклонения о т рефе-
р е н т н и т е граници нерядко са неточни и мо­
г а т да подведат, особено при моноклонал-
н и т е г а мапатии. П р и г о т в я н е т о н а гелове
изисква о п и т н о с т , а предлаганите о т фир­
ми гелове са н е т р а й н и и скъпи. Коефициен­
т ъ т на вариация е 10-15%.
Р а к е т н а и м у п о с л е к т р о ф о р е з а (елект-
роимунодифузпя, метод н а Lowrell, 1966). В
агарозен гел, к о й т о съдържа хомогенно раз­
пределен моноспецифичен а н т и с е р у м , се
п р а в я т антигенни ямки. В т я х се н а н а с я т
280
последователно с т а н д а р т и , контролен ма­
т е р и а л и проби биологичен м а т е р и а л . При­
лага се електрично поле, при к о е т о едно­
временно с е л е к т р о ф о р е з а т а се извършва
имунопреципитация. П о л у ч а в а т се имуно-
п р е ц и п и т а т и с ф о р м а т а н а р а к е т а (фиг
13.9). В и со чи н ата н а п р е ц и п и т а т а е про­
порционална н а к о н ц е н т р а ц и я т а на а н т и ­
гена. Калибрационна крива се п о с т р о я в а ка­
т о н а а б с ц и с а т а се нанася концентрация­
т а , а н а о р д и н а т а т а - в и с о ч и н а т а н а пре­
ц и п и т а т а (mm). След промиване във физи­
ологичен р а з т в о р и изсушаване н а гела пре­
ц и п и т а т и т е се о ц в е т я в а т с СВВ R 250.
MYDRAGEL Lp (a) scbia 0
шУУ
Фиг. 13.9. Ракетна имуноелектрофореза
{„Electrophoresis program"- Sebia)
Имуноелектрофореза на липопротеин (а)
Р а к е т н а т а имуноелектрофореза е по-
ч у в с т в и т е л е н м е т о д о т РИД - предел н а
ч у в с т в и т е л н о с т (в з а в и с и м о с т о т вида н а
б е л т ъ к а и т е х н и к а т а ) м е ж д у 15 mg/1 и
0,5 m g /1, a CV е 8-12%. О п т и м а л н а т а висо­
чина на п р е ц и п и т а т и т е е между 10 и 40 mm;
заоблени върхове н а „ р а к е т и т е " п о к а з в а т
излишък на а н т и г е н . Електроимунодифузи-
я т а позволява получаване н а р е з у л т а т а в
същия ден. При подходящи условия, с елек-
троимунодифузия може да се о п р е д е л я т ед­
новременно два а н т и г е н а - напр. аполипо-
п р о т е и н AI и АП.
Б и д т м е н с и о н а л н а ( к р ъ с т о с а н а ) илгу-
н о с л е к т р о ф о р е з а (no Clarke и Freeman,
1968). Б е л т ъ ц и т е се ф р а к ц и о н и р а т е л е к т -
рофоретично в агарозен гел. След т о в а о т ­
ново се п о д л а г а т н а електрофореза, но в по­
сока, перпендикулярна н а п ъ р в а т а ; е л е к т ­
р о ф о р е з а т а във в т о р а т а посока п р о т и ч а в
гел, в к о й т о хомогенно е разпределен моно­
специфичен антисерум - едновременно с елек-
т р о ф о р е т и ч н а т а миграция н а с т ъ п в а и
имунопреципитация (фиг. 13.10). П л о щ т а на

Фиг. 13.10. Бидименсионална имуноелектрофо­
реза
пиковете е пропориионална на кониентра-
и и я т а на преципитирания белтък. М е т о ­
д ъ т дава възможност за изследване на мо­
лекулна хетерогенност (изоформи) на бел-
т ъ и и , напр. на трансферин и асиалотранс-
ферин. Ч у в с т в и т е л н о с т т а на бидименсио-
н а л н а т а имуноелектрофореза е около 500
mg/1.
Имунопреципитациотш методи
в т е ч н а среда
Имунопреиипитаиионните методи в т е ч ­
на среда включват iLAtynomypöufjujMcm-
р и л и 11Л1унопсфслол1стрш1{\)азг\е§ък\1
в глава 7). Тези методи показват редииа пре­
димства пред р а д и а л н а т а имунодифузия и
електроимунодифузията:
• обективно регистриране на имунопреии-
питаиията;
• висок предел на ч у в с т в и т е л н о с т , особе­
но при усилване на имунопреиипитаиия-
т а с полистиролови частиии;
• калибраиионни криви с широк кониентра-
иионен обхват;
• възможности за с т р о г о с т а н д а р т и з и р а ­
не на условията;
• автоматизаиия;
• съхранение на калибраиионните криви;
• оиенка на излишък на а н т и г е н ;
• а в т о м а т и ч н о повтаряне п р о б а т а с по-
голямо или по-малко разреждане 6 зави­
симост о т измерената концентрация;
• бързо получаване на р е з у л т а т .
Аглутинационни м е т о д и
Л а т е к с о в а а г л у т и н а ц и я . Аглутинаци­
я т а представлява групиране и седимента-
ция на антиген в р е з у л т а т на реакция с ан­
т и т я л о . Аглутинирашото а н т и т я л о може
да бъде насочено срешу е с т е с т в е н и а н т и ­
гени на повърхността на клетки (активна
или директна аглутинация) или срещу ве­
щества, пасивно пренесени на повърхност­
т а на клетки, напр. човешки е р и т р о ц и т и
или на инертни частици, напр. латексови
(пасивна или индиректна аглутинация). Ла-
т е к с ъ т представлява суспенсия о т сферич­
ни полистиролови частици. Те лесно адсор­
б и р а т на повърхността си белтъци и по-
лизахариди. Когато адсорбираните вещес­
т в а у ч а с т в а т в имунологична реакция, при­
нудително се увлича ц я л а т а частица; имун­
н а т а реакция се усилва и с т а в а видима (фиг.
13.11). Л а т е к с о в а т а аглутинация отдавна
се използва за бързи полуколичествени из­
следвания, напр. на ревматоиден фактор
(RF), фибрин-разградни продукти и др. Раз­
работена е количествена разновидност на
директна латексова аглутинация; реакти­
в ъ т съдържа хомогенни и еднакво наслоени
частици; след протичане на имуноаглути-
национната реакция, аглутинираните час­
т и ц и се изброяват с помощта на брояч ка­
т о се о т д е л я т интерфериращите състав­
ки.
г=<
# +д
• # =>V
А ^ *
— О
-
латексови частнци апгитяло (IgG) латексов реактив за R F
, Ь-р
V ' Yр
• Q
RP аглутинация
фиг. 13.11. Л а т е к с о в а а г л у т и н а ц и я {по Keller)
RF - ревматоиден фактор
PACIA - particle counting immunoassay
(Cambasio et at. 1977) е техника, к о я т о се
основава на аглутинация на латексови час­
т и ц и с диаметър 0.8 ц т в свободен р а з т -
281
бор, последвана о т е л е к т р о н н о - о п т и ч н о •^ лЛ
аеткстI
оценяване броя н а ч а с т и ц и т е . Б р о я т неаг-
лутинирани ч а с т и ц и е о б р а т н о пропорци моноклонално
антитяло
/ латексЛI
Ч
онален н а к о н ц е н т р а ц и я т а н а а н т и г е н а .
Разделянето на аглутинирани о т неаглути-
нирани ч а с т и ц и се о с ъ щ е с т в я в а електрон­
молекули на антигена
но (не механично). Електронно (чрез селек­
т о р , по височината н а импулсите) се о т ­
a б
с я в а т по-малките (с д и а м е т ъ р 0.6 ц т - хи- I 1
ломикрони, прах) и по-големи (над 1.0 ц т ) малко свободен антиген много свободен антиген
частици. През п р о т о ч н а т а к ю в е т а н а о т ­
ч и т а щ и я уред п р е м и н а в а т аглутинирани
и неаглутинирани латексови ч а с т и ц и в спе­
циален о п т и ч е н ред. Измерва се разсеяна­
т а о т ч а с т и ц и т е по посока напред с в е т ­
лина. Ъ г ъ л ъ т н а разсейване зависи о т голе­ X 'л1* ^
м и н а т а на ч а с т и ц и т е - колкото по-голяма
е а г л у т и н и р а н а т а л а т е к с о в а сфера, т о л к о ­ : * f• . X
ва повече светлина се разсейва към ф о т о м - аглутинация не настъпва аглутинация
ножителя и дава по-силни електрически им­
пулси. Ч у в с т в и т е л н о с т т а и възпроизводи- Ф и г . 13.12. Инхибирана латексова аглутинация
м о с т т а на PACIA се д об ли жават до т е з и (no Keller)
на радиоимунологичните м е т о д и . С FACIA
може да се определят антигени, антите­
ла, хаптени (хормони, лекарствени средс­
тва), имунни комплекси в серум, урина и ИНДИРЕКТЕН БЕЛЯЗАН
гръбначно-мозъчна течност). Изследването С НЕРАДИОИЗОТОПНИ
се о с ъ щ е с т в я в а с напълно механизирани
системи. МАРКЕРИ ИМУНОХИМИЧЕН
АНАЛИЗ
Инхибирана латексова а г л у т и н а ц и я
(аглутинационно инхибиране). Р е а к т и в и т е А. Ц о н ч е в а
включват: латексови ч а с т и ц и , наслоени с
а н т и г е н и моноклонално а н т и т я л о срещу ИМУНОЛОГИЧЕН АНАЛИЗ - СЪЩНОСТ
а н т и г е н а върху ч а с т и ц и т е . Ако в п р о б а т а И МЕТОДОЛОГИЧНИ НРИНЦИНИ
се намира свободен а н т и г е н о т същия вид,
т о й конкурира наслоения върху латексови­ Имунохимичните м е т о д и се б а з и р а т н а ви-
т е ч а с т и ц и а н т и г е н з а свързва щи т е мес­ сокоспецифично и устойчиво, нековалент-
т а н а а н т и т я л о т о и а г л у т и н а ц и я не се но свързване н а а н т и т е л а т а към прицелни
наблюдава; ако в п р о б а т а т о з и а н т и г е н о т ­ молекули. А н т и т е л а т а са с т р о г о специфич­
съства, н а с т ъ п в а аглутинация (фиг. 13.12). ни в избора и с в ъ р з в а н е т о с комплементар-
Техниката е подходяща за доказване и оп­ н а ( с ъ о т в е т с т в а щ а ) прицелна молекула в
ределяне н а нискомолекулни ( л е к а р с т в а , сложна смес к а т о плазма или серум. Иму-
наркотици, хормони) и високомолекулни ве­ н о х и м и ч н а т а т е х н и к а прави възможно оп­
щества. На принципа н а аглутинационно- ределянето в серума н а много к о м п о н е н т и
т о инхибиране е р а з р а б о т е н а бърза преся­ о т клиничен и н т е р е с , например лекарст­
ваща полуколичествена проба з а бремен­ ва, стероидни хормони, пептидни хормони,
н о с т , при к о я т о се изследва НСО в урина протеини, т ъ й к а т о е възможно използва­
к а т о ч у в с т в и т е л н о с т т а е о т порядъка н а не н а специфични а н т и т е л а срещу т я х .
15 mg/1.
И м у н о л о г и ч н и я т анализ е а н а л и т и ч е н
м е т о д , к о й т о зависи о т р е а к ц и я т а а н т и ­
г е н - а н т и т я л о . Добре е известно, че прило­
ж е н и е т о н а имунологичната т е х н и к а в ла-
282
З о р а т о р н а т а медицина д а т и р а о т 1896 г., н а последователност) - т о г а в а е п и т о п ъ т е сек-
адгато F e rnand Widal прави съобщение о т - вентен. К о г а т о т а з и п р о с т р а н с т в е н а допъл­
iOGHO д и а г н о с т и к а н а т и ф о и д н а т а т р е с - н и т е л н о с т се дължи н а т р е т и ч н а или ч е т в ъ р -
ia. К о н к у р е н т н и я т р а д и о и л г у п о л о г и ч е н т и ч н а с т р у к т у р а , е п и т о п ъ т се означава ка­
а н а л и з е о т к р и т о т Yalow и Berson през т о конформационен или дисконтуитетен.
1959 г., а п р и н ц и п и т е с а съобщени о т Ekins. За да бъде едно в е щ е с т в о имуноген (обикно­
вено б е л т ъ ч н а молекула) т р я б в а да о т г о в а р я
Впоследствие е приложен и неконкурентен
н а няколко изисквания - размер, с т е п е н на „чуж-
д м у н о р а д и о м е т р и ч е н а н а л и з о т Miles и д о с т " {филогенетична отдалеченост), химичес­
Hales. През 1971 г. Van Weemen и Schuurs съ- ка с л о ж н о с т и др. Ч а с т и о т имуногена, съдър­
з б щ а в а т за ензимна имуноаналитична т е х - ж а щ и един или няколко е п и т о п а , не м о г а т да
аика, к о я т о о т к р и п ъ т я н а с ъ в р е м е н н о т о предизвикат сами имунен отговор, но ако т о й
развитие н а н е и з о т о п н о т о ( а л т е р н а т и в н о ) е вече предизвикан м о г а т in vivo или in vitro да
имунотестуване. се с в ъ р ж а т със с ъ о т в е т н и т е а н т и т е л а . В т е с ­
Днес имунологичните м е т о д и се използ- ния смисъл на д у м а т а в с ъ щ н о с т т о в а са ан­
З а т в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я к а к т о за ко- т и г е н и - молекули, способни да се свържат с
антитялото. Моноклоналното а н т и т я л о
ш ч е с т в е н , т а к а и з а к а ч е с т в а н анализ. Ко-
представлява молекула, с т р о г о специфично раз­
ш ч е с т в е н и т е м е т о д и м о г а т да се разде­ познаваща ограничен у ч а с т ъ к о т дадена бел­
л я т н а два вида в з а в и с и м о с т о т о т ч и т а - т ъ ч н а молекула.
й е т о на р е а к ц и я т а между а н т и г е н а и ан­ Успехите н а м о л е к у л я р н а т а биология
титялото. Единият е д и р е к т е н м е т о д през последните 15 години позволиха разга­
лзползващ о б р а з у в а н е т о н а комплекси ан­ д а в а н е т о н а н е в е р о я т н а т а способност на
тиген-антитяло, а в т о р и я т - лгаркиращ и м у н н а т а с и с т е м а да разпознава огромно
м е т о д , при к о й т о се и з п о л з в а т маркери количество разнообразни с т р у к т у р и - е п и -
ш и н д и р е к т н о определяне н а т ъ р с е н и т е т о п и , к о е т о обяснява и практически неиз­
имунологични комплекси. черпаемия п о т е н ц и а л н а моноклоналните
В първоначалния и все още използван смисъл, а н т и т е л а да и д е н т и ф и ц и р а т с т р у к т у р и
антигенът представлява вещество - клетка, върху к л е т к и или с ъ с т а в к и в биологични
иолекула или надмолекулен комплекс, к о е т о вне-
течности.
:ено в организма предизвиква образуване н а ан-
В имуноглобулиповата молекула (фиг. 13.13)
з ш т е л а - т . е . молекули, способни да се с в ъ р ж а т
се различават две половини - е д и н и я т ф р а г м е н т
: въпросния а н т и г е н . Това разбиране се осно-
F(ab') 2 е отговорен за свързването на а н т и г е н а
Заваше н а експерименти, при к о и т о се бораве­
и следователно е н о с и т е л на паратопа. В т о ­
не с в е щ е с т в а , н е у т о ч н е н и о т все още нераз­
р и я т ф р а г м е н т Fe не носи а н т и г е н разпозна-
в и т а т а имунохимия и молекулна биология. То-
в а т е л н а способност, но е биологически важен.
За с т а р о п о н я т и е а н т и г е н сега с ъ о т в е т с т в а
повече на п о н я т и е т о имуиоген - вещество, пре­
дизвикващо в организма имунен о т г о в о р (кле­
т ъ ч е н или хуморален). В последния случай най-
ч е с т о се о б р а з у в а т а н т и т е л а , насочени срещу
различни у ч а с т ъ ц и н а имуногена - а н т и г е н н и
д е т е р м и н а н т и или е п и т о п и . Те п р е д с т а в л я в а т
: т р у к т у р и само о т няколко аминокиселини, ко-
jmo се р а з п о з н а в а т о т само един вид а н т и т е -
\а. В една и съща б е л т ъ ч н а молекула м о г а т да
:е н а с л о ж а т няколко е п и т о п а и да о б р а з у в а т
антигенни зони, т а к а че е възможно свързва-
demo на няколко различни а н т и т е л а . Ири ес-
н е с т в е н и условия т о в а е обичайна с и т у а ц и я и
l a т о в а обикновения хуморален имунен о т г о -
Зор е поликлонален. Някои о т е п и т о п и т е с а из-
\ожени на п о в ъ р х н о с т т а н а молекулата, а дру-
!и са с к р и т и ( к р и п т о т о п и ) . С т р у к т у р а т а н а
Jnumona е п р о с т р а н с т в е н о допълнителна към
зазпознаващия у ч а с т ъ к н а а н т и т я л о т о (/ш^я-
ф и г . 13.13. Схема на молекулата н а имуногло-
Tiona). Тази д о п ъ л н и т е л н о с т може да се опре­
деля о т п ъ р в и ч н а т а с т р у к т у р а (аминокиселин- булин G (IgG) а н т и т я л о
283
т ъ й к а т о чрез взаимоотношението със с ъ о т ­
в е т н и т е клетъчни реиептори, к о м п л е м е н т а и
други съставки осмисля с ъ щ е с т в у в а н е т о н а ан­
т и т е л а т а в з а щ и т а н а организма. le^kkume и
леки пептидни вериги, к о и т о и з г р а ж д а т иму-
ноглобулиновата молекула се к о д и р а т о т мно­
гобройни генни сегменти, к о и т о н а определен
ранен с т а д и й о т р а з в и т и е т о н а В-лимфоцити-
т е се пренареждат т а к а , че при т р а н с к р и т д и -
я т а се образува комбинация о т с е г м е н т и о т
т ъ й нар. вариабилни и други гени, к о и т о с а ха­
рактерни за дадена родоначална B-клетка, о т
к о я т о в хода на антиген-независимо и а н т и -
ген-зависимо р а з в и т и е се р а з м н о ж а в а т к л е т ­
к и т е , произвеждащи а н т и т е л а с определена
специфичност. В биологията т е р м и н ъ т клетъ­
чен клон се о т н а с я за всички клетки, к о и т о про­
и з х о ж д а т о т е д н а - е д и н с т в е н а родоначална
клетка. О с н о в н о т о в м е т о д о л о г и я т а з а по­
лучаване н а м о н о к л о н а л н и а н т и т е л а i n
vitro е д а с е о т д е л и е д н а е д и н с т в е н а ро­
доначална к л е т к а , с п о с о б н а д а с е к у л т и ­
вира и д а д а д е начало н а к л е т ъ ч е н клон,
способен д а произвежда същия имупогло-
булин. З а т р у д н е н и е т о в р е ш а в а н е т о н а т а з и
задача идваше о т т о в а , че не с ъ щ е с т в у в а т
клетки, п р и т е ж а в а щ и д в е т е к а ч е с т в а : способ­
н о с т да п р о и з в е ж д а т определено а н т и т я л о
(специфичност) и способност да се самоподдър-
ж а т в клетъчна к у л т у р а in vitro. З а д а ч а т а бе
разрешена чрез създаване н а хибридна к л е т к а
о т две клетки, п р и т е ж а в а щ и поотделно едно­
т о и другото качество. За р а з р а б о т в а н е т о н а
т о з и м е т о д (1975 г.) Milstein и КцЬ1ег получиха
Нобелова награда.
Механизъм н а р е а к ц и я т а а н т и г е н - а н ­
т и т я л о . Образуването н а комплекса ан­
т и г е н - а н т и т я л о се с ъ п ъ т с т в а о т някол­
ко физикохимични процеса, к а т о основни­
т е спомагателни сили са: електростатич­
но van der Waals-London dipole-dipole взаи­
модействие-, хидрофобно взаимодействие и
йонно свързване (първично между СОО" и
NH4+ групи н а а н т и г е н а и а н т и т я л о т о ) .
Свързването на а н т и г е н а с а н т и т я л о т о не
е с т а т и ч н о , а е равновесна реакция, к о я т о
п р о т и ч а в т р и фази: началната реакция (I
фаза) на м у л т и в а л е н т н и а н т и г е н и и бива-
л е н т н и а н т и т е л а се извършва много бързо
в сравнение с последващото нарастване на
колгплексите (II фаза) и е посочено в след­
н а т а реакция:
k
i к2
Agn + Ab < ^ Ag n Ab ^ • Ag a Ab b
k
i к 2 Б. Радиоизотопни м е т о д и (индиректен
284
Ag - а н т и г е н
Ab - а н т и т я л о
к, и к2 - с к о р о с т н а к о н с т а н т а за п р а в а т а ре­
акция
к., и к.2 - с к о р о с т н а к о н с т а н т а з а о б р а т н а т г
реакция
kj > к2
п - брой е п и т о п и за молекула
а и b - брой н а а н т и г е н и т е и а н т и т е л а т а i
комплекса
Т р е т а т а ф а з а н а р е а к ц и я т а включвг
п р е ц и п и т а ц и я н а комплекса след достига­
не н а к р и т и ч е н размер. С к о р о с т т а н а т е ­
зи реакции зависи о т е л е к т р о л и т н а т а кон­
ц е н т р а ц и я , pH и т е м п е р а т у р а т а , к а к т о i;
о т т и п а на антигените и а н т и т е л а т а и
свързващия а ф и н и т е т н а а н т и т я л о т о .
К л а с и ф и к а ц и я н а и м у н о л о г и ч н и я ана­
лиз. На б а з а т а н а някои основни критерии
може да бъде направено следното разделя­
не н а имунологичните м е т о д и :
I. Т е с т п р о б а т а може да бъде: а н т и г е н или
антитяло.
II. Според р е а к ц и о н н и т е с ъ с т а в к и :
• Реакция а н т и г е н - а н т и т я л о
• Течна фаза или т в ъ р д а фаза
III. Според п р и л а г а н е т о н а маркер:
• Небелязан м е т о д (директен)
• Белязан м е т о д (индиректен)
IV. Б е л я з а н и т е с маркери м е т о д и се бази­
р а т на:
• Хетерогенен или хомогенен принцип
• К о н к у р е н т е н или н е к о н к у р е н т е н
принцип
V. Имунологично определяне:
А.Нерадиоизотопни м е т о д и (индиректен
белязан с неизотопни маркери имуноанализ)
1. Ензимно белязани а н т и г е н и / а н т и т е л а
• Ензимимуноанализ
• Флуоресцентен имуноанализ
• Флуоресцентно поляризационен
имуноанализ
• Луминесцентен имуноанализ
2. Неензимно белязани а н т и г е н и / а н т и ­
тела
• Д и р е к т н а флуоресценция
• Д и р е к т н а хемилуминесценция
• Електрохемилуминесценция
белязан с и з о т о п н и маркери имуноанализ) 1
 • Радиоимунологичен а н а л и з
• Имунорадиометричен анализ 'old' o o
o
Инку­ Декан-
М а р к и р а н е т о н а а н т и г е н и или а н т и т е ­ бация тиране
л а се е оказало м н о г о удобно з а разбиване н а
т е х н о л о г и я з а в и с о к о ч у в с т в и т е л н и и спе­
цифични имунохимични м е т о д и . Равновес­
н а т а р е а к ц и я при обр азу в ане н а комплек­
с и т е а н т и г е н - а н т и т я л о се и з р а з я в а с ъ с
с л е д н а т а формула: зо% H
к,
Ab + A g 4 ^AbAg
k.i
20% H
lADAgJ
IV =
lADJIAgJ

K - равновесна к о н с т а н т а на целия процес io%H

К а к т о е п р е д с к а з а н о о т з а к о н а з а дейс­
т в и е н а м а с и т е , к о н ц е н т р а ц и я т а н а Ab, Ag
и AbAg щ е бъде з а в и с и м а о т в е л и ч и н а т а н а
к! и k.j.
Конкурентен и неконкурентен
имунохимичен анализ
При к о н к у р е н т н и н и м у н о х и м и ч е н а н а ­
л и з всички р е а к т и в и се с м е с в а т едновре­
м е н н о или разделно. П р и е у п о в р е м е н л о
с м е с в а н е н а всички с ъ с т а в к и н а а н а л и з а ,
м а р к и р а н и т е а н т и г е н и (Ag*) и н е м а р к и р а -
н и т е т ъ р с е н и а н т и г е н и (Ag) к о н к у р и р а т
з а свързване с а н т и т я л о т о (фиг. 13.14). При
т а з и система а ф и н и т е т ъ т на антитяло­
т о за маркирания и немаркиран а н т и г е н
т р я б в а д а бъде еднакъв. В е р о я т н о с т т а а н ­
т и т я л о т о д а се с в ъ р ж е с м а р к и р а н а н т и ­
ген е о б р а т н о пропорционална н а к о н ц е н т ­
р а ц и я т а н а немаркирания а н т и г е н . При
р а з д е л н о т о к о н к у р е н т н о определяне, не-
м а р к и р а н и я т а н т и г е н п р ъ в се с м е с в а с из­
лишък о т а н т и т е л а , при к о е т о п р о т и ч а
равновесна р е а к ц и я 1. След т о в а се приба­
в я т б е л я з а н и т е а н т и г е н и и о т н о в о се с т и ­
г а до равновесна р е а к ц и и 2. След сепари­
ране, с в ъ р з а н и т е белязани а н т и г е н и се оп­
р е д е л я т и се и з п о л з в а т з а изчисляване кон­
ц е н т р а ц и я т а н а небелязаните антигени:
1) Ag + Ab ^ ^ AgAb + Ab
ki
2) AgAb + Ab + A g \ > AgAb + Ag* Ab + Ag*
1.0 2.0 3.0 To 5.0
Концентрация (nmol/1)
Б
Фиг. 13.14. Конкурентен имунохимичен анализ
{хомогенен тип)
А. Принцип на анализа
О * - маркиран антиген
О- антиген в пробата на пациента
- антитяло, свързано към стената на пластмасова
Б. Крива на о б р а т н о пропорционалната зависимост
межс)у к о н ц е н т р а ц и я т а на т ъ р с е н и я а н т и г е н (на
абециса) и о т н о с и т е л н и я дял на свързания маркиран
а н т и г е н (на о р д и н а т а )
Използването н а двустъпалния м е т о д
позволява увеличение н а ч у в с т в и т е л н о с т ­
т а с 2-4 п ъ т и и д а в а в ъ з м о ж н о с т з а доказ­
в а н е н а ниски к о н ц е н т р а ц и и н а т ъ р с е н и я
антиген.
При н е к о н к у р е н т н и я и м у н о х и м и ­
ч е н а н а л и з (фиг. 13.15) обикновено се при­
л а г а прикрепване н а а н т и т я л о т о чрез па­
сивна адсорбция или к о в а л е н т н о свързване
к ъ м п о в ъ р х н о с т т а н а т в ъ р д а фаза. При
п р о ц е д у р а т а н а т о з и анализ а н т и г е н ъ т о т
п р о б а т а реагира с п р и к р е п е н о т о к ъ м т в ъ р ­
д а т а фаза а н т и т я л о . О с т а н а л и т е п р о т е ­
ини се о т с т р а н я в а т чрез промиване и т о ­
г а в а се прибавя м а р к и р а н о а н т и т я л о , кое­
т о р е а г и р а със свързания а н т и г е н в друг
у ч а с т ъ к н а н е г о в а т а молекула - в т о р и о т ­
далечен е п и т о п . След п о в т о р н о промиване
се о п р е д е л я т с в ъ р з а н и т е м а р к е р и , к а т о
285
т я х н а т а а к т и в н о с т или к о н ц е н т р а ц и я е
право пропорционална н а концентрацията
на търсения антиген. При неконкурентния
анализ фиксираното и маркирано а н т и т я ­
ло може да бъде к а к т о поликлонално, т а к а
и моноклонално. Ако се използва моноклонал-
но а н т и т я л о със специфичност към о т д а ­
лечен е п и т о п е възможно и н к у б а ц и я т а н а
п р о б а т а да с т а н е едновременно с т а з и н а
прикрепеното а н т и т я л о , к о е т о о п р о с т я ­
ва процедурата н а определяне.
+Ag +Ab^
-Ab -Ab:Ag l-AbrAgrAb51
Концентрация
Ф и г . 13.15. Неконкурентен (сандвичев) имуно-
химичен анализ {хетерогенен т и п )
А. Принцип на анализа
първо антитяло, прикрепено върху твърда повърхност
Ю - антиген от пробата на пациента
белязано второ антитяло
Б. Крива на правопропорционалната з а в и с и м о с т
между к о н ц е н т р а ц и я т а на т ърсен ия а н т и г е н и си­
л а т а на сигнала ( к о н ц е н т р а ц и я т а на с в ъ р з а н и т е
маркери)
286
Тези м е т о д и с а п о з н а т и к а т о сандвич-
образуващи. Те се и з п о л з в а т широко за оп­
ределяне к о н ц е н т р а ц и и т е н а полипептид-
ни и б е л т ъ ч н и молекули.
Хомогенен и х е т е р о г е н е н
имунохимичен анализ
Имунохимичен анализ, к о й т о изисква раз­
деляне н а свободните о т с в ъ р з а н и т е мар­
кирани к о м п о н е н т и се нарича х е т е р о г е ­
н е н . Р а з д е л и т е л н а т а т е х н и к а при х е т е р о ­
генния анализ може да бъде различна.
П р е ц и п и т а ц и о н н а т е х н и к а - преципи-
т а ц и я т а н а с в ъ р з а н и т е белязани а н т и г е ­
ни (Ag*Ab) о т р е а к ц и о н н а т а смес може д а
се извърши химически чрез прибавяне н а
п р о т е и н - п р е ц и п и т и р а ш и химикали к а т о
(NH4)2S04 или имунологично чрез прибавяне
на преципитираиш а н т и т е л а .
При течнофазова абсорбция свободният
а н т и г е н е абсорбиран върху ч а с т и ц и н а ак­
т и в е н въглен или декстран-свързан въглен,
к о и т о се п р и б а в я т д и р е к т н о към реакци­
о н н а т а смес. Ч а с т и ц и т е н а въглена и аб­
сорбирания а н т и г е н се о т д е л я т чрез у т а ­
я в а н е и л и центрофугиране. Течнофазовата
абсорбция е най-популярна и широко изпол­
звана сепарационна техника. При т а з и т е х ­
ника, свързването и конкуренцията н а мар­
к и р а н и т е и немаркирани а н т и г е н и за свър-
звагците м е с т а н а а н т и т я л о т о се извър­
шва на п о в ъ р х н о с т т а н а т в ъ р д а т а фаза.
И з п о л з в а т се няколко различни вида т в ъ р ­
да повърхност, включваиди в ъ т р е ш н а т а по­
в ъ р х н о с т н а полиетиленови е п р у в е т к и или
гнезда и други повърхности о т н е р а з т в о ­
рими м а т е р и а л и к а т о целулоза, латексови,
пластмасови, м а г н и т н и зрънца или други
частици.
При х о м о г е н н и я а н а л и з не се изисква
е т а п н о разделяне н а р е а к т и в н и т е с ъ с т а в ­
ки. С о т к р и в а н е т о му се оказа, че т о й е удо­
бен за а в т о м а т и з и р а н е н а имунохимичния
анализ и може да се модулира чрез а к т и в ­
н о с т т а н а б е л я з а н о т о свързване. Тук голя­
мо значение и м а вида н а м а р к и р а ш о т о ве­
щ е с т в о . Колкото no-малка е м о л е к у л а т а
н а маркера, толкова по-малко в л и я н и е и м а
т я върху и м у н о г е н н а т а активност на ан­
т и г е н и т е и а н т и т е л а т а . И д е а л н и я т хо­
могенен анализ т р я б в а д а се базира н а ви-
 АНТИТЯЛО

/ Нуклеинова
киселина

Микрочастици Стреитавидин Биотин

Ф и г . 13.16. Стрептавидин-биотиново усилване на свързването на полистиролови микрочастици
с антигени, а н т и т е л а и нуклеинови киселини за имунохимичен анализ

сока ч у в с т в и т е л н о с т и висока р е з и с т е и т - ОСНОВНИ ВИДОВЕ БЕЛЯЗАН

н о с т к ъ м в з а и м о д е й с т в и е със с р е д а т а . С НЕРАДИОИЗОТОПНИ МАРКЕРИ
ИМУНОАНАЛИЗ
А н с и т т и ч н а ч у в с т в и т е л н о с т . Анали­
т и ч н а т а чувствителност на конкурент­ Ензимен имуноанализ
н и я имуноанализ се определя по приниип о т
а ф и н и т е т а н а а н т и т я л о т о , д о к а т о при не­ Е и з ш м н и я т и м у н о а н а л и з ( E I A ) изпол­
к о н к у р е н т н и я а н а л и з т я е з а в и с и м а о т по- зва к а т а л и т и ч н и т е свойства на е н з и м и т е
н и с к а т а г р а н и и а з а д е т е к и и я н а използва­ з а к о л и ч е с т в е н а оиенка н а имунологичните
н и я маркер. Р а д и о и з о т о п н о т о м а р к и р а н е с е реакции. Н а й - ч е с т и т е ензимни маркери и
съпоставя с ензимните, хемилуминесиент- т е х н и т е с у б с т р а т и са представени на
ни и ф л у о р е с и е н т н и м а р к е р и . Най-висока т а б л и и а 13.1.
ч у в с т в и т е л н о с т и м а т м е т о д и т е , използ­ Т а б л и ц а 13.1. Ензимни маркери, използвани в
ващи д и р е к т н и т е х е м и л у м и н е с и е н т н и м а р ­ имунохимичния анализ
кери - о т 10'15 до 10 18 g. В т о р и ч н о м а р к и р а ­
Ензими маркери Субстрати
не к а т о т о в а с б и о т и н се използва к а т о н а ­
Пероксидаза диамониев 2,2-азино-ди-З-етил-
чално усилване в имуноанализа. С в ъ р з в а щ а ­ бензтиазолин сулфонат (ABTS)
т а к о н с т а н т а н а б и о т и н - а в и д и н комплекс р-нитрофенилфосфат
4-аминофеназон
е и з к л ю ч и т е л н о висока (10 11 mol/1). Б и о т и н - б-аминосалицилоба киселина
авидин с и с т е м а т а (фиг. 13.16) използва би- о-фенилендиамин (OPD)
5-амино-2-хидрокси-бензоена киселина
о т и н - б е л я з а н о първо а н т и т я л о . Б и о т и н ъ т
Алкална р-нитрофенилфосфат
м о ж е д а се п р и к р е п в а к ъ м а н т и т я л о т о в фосфатаза 4-метилумбериферил-фосфат
о т н о с и т е л н о високи с ъ о т н о ш е н и я без з а ­ фенолфталеинмонофосфат (РМР)
губа н а и м у н о р е а к т и в н о с т н а а н т и т я л о ­ Глюкозооксидаза о-дианизидин
р-хидроксифенилоцетна киселина
т о . К о г а т о се п р и б а в и ав идин- ко нюгир ан
Бета- р-нитрофенил-|5-0-галактозид (PNPG)
м а р к е р се образува комплекс Ag-Ab-6uomuH- галактозидаза 4-метилумбелиферил галактозид
авидин-маркер. П ъ р в о т о амплифиииране
(усилване) м о ж е д а се д о с т и г н е о т б и о т и н - П о в е ч е т о о т ензимно-белязаните имуно­
а в и д и н - б и о т и н в р ъ з к а т а , з а щ о т о свързва­ логични м е т о д и и м а т к а т о краен р е з у л т а т
щ о т о о т н о ш е н и е б и о т и н - а в и д и н е 4:1. Лко образуване н а и в е т е н комплекс. А н а л и з ъ т
м а р к е р ъ т е е н з и м т о г о л е м и я т брой ензим­ н а т е з и к о м п о н е н т и , к о й т о м о ж е д а бъде
ни молекули в иелия комплекс д о в е ж д а т д о м о н и т о р и р а н ф о т о м е т р и ч н о е много попу­
силно увеличение н а е н з и м н а т а а к т и в н о с т , лярен, з а щ о т о се и з п о л з в а т к о м п а к т н и , ви­
свързано с м а л к о т о к о л и ч е с т в о н а а н т и г е ­ с о к о е ф е к т и в н и ф о т о м е т р и , лесни з а рабо­
на, к о й т о се определя и ч у в с т в и т е л н о с т ­ т а и същевременно е в т и н и .
т а н а а н т и г е н н о т о определяне е с ъ о т в е т ­ Друга група м е т о д и м о г а т д а о б р а з у в а т
но по-голяма. п р о д у к т , к о й т о флуоресцира. Т р е т и м о г а т
д а о к и с л я в а т луминофори и д а се о т ч и т а хе-
м и л у м и н с с ц е н ц и я . Този вид анализи м о г а т
д а и м а т висока ч у в с т в и т е л н о с т (фиг. 13.17).
287

min
Ф и г . 13.17. Ензимно маркиране с усилена луми-
несиениия о т окисление н а луминол при имуно-
химична реакиия
А. Принцип на усилено луминесцентно определяне
Б. Крива на луминесцентен и усилен луминесцентен
сигнал
Хетерогенна ензимимунна техника, ко­
я т о е много разпространена за клинични
анализи е ензилтосвързан имуносорбсн-
т е н а н а л и з (ELISA). Този анализ се бази­
ра на използване на фиксирани на т в ъ р д а
фаза (или носител) а н т и т е л а и последова­
телно прибавяне на материала за изслед­
ване, съдържащ т ъ р с е н и т е антигени. След
инкубация за свързване на а н т и г е н и т е с
ч а с т о т а н т и т е л а т а се изливат излишни­
т е антигени, промиват се образуваните
комплекси, за да се елиминира влиянието на
наличните в пробата модулатори на ензим­
н а т а активност. След т о в а се прибавят
разтворени в буфер ензимно маркирани ан­
т и г е н и / а н т и т е л а (в зависимост о т т и п а
на реакцията) за в т о р а инкубация. Следва
второ промиване и накрая се прибавя хро-
моген за развиване на ензимната реакция и
о т ч и т а н е количеството на антигена, кой-
288
т о изследваме.
Друг вид техника е е н з и м л щ л т и п л и -
цирана илгуноаналитична техника
(EMIT). Тъй к а т о т а з и техника не се нуж­
дае о т сепарационна с т ъ п к а , т я се прила­
га за изследване на лекарства, хормони и ме-
т а б о л и т и . Този анализ позволява а в т о м а ­
т и з а ц и я и се използва в повечето клинични
и имунологични анализатори. Базира се на
следния принцип:
-f A ß
Ag-Einiiivi + ЛЬ ——* Ab:Ag + Ag-EiniiM
Лктивсп ензим
липса иа A g
Т
Ab:Ag-Eii3HM
Нима ензимна активност
Имунофлуоресцентен анализ
Д и р е к т н и т е флуоресцентни техники из­
ползват к а т о маркери лантаниди. Една о т
най-удачните технологии е т а з и на з а б а ­
в е н и я у с и л е н л а н т а н и д ф л у оресцен ­
т е н ил1уноанализ, п о з н а т със съкраще­
н и е т о DELFIА. Молекулата на лантаниди-
т е е толкова малка, колкото радиоактив­
н и т е маркери. Това позволява дори еднов­
ременно изследване на два различни а н т и ­
гена в една проба к а к ъ в т о е случаят с ме­
т о д а за скрининг на Down's синдрома - hAFP
и hCG6. На т в ъ р д а т а фаза ( с т е н а на съдче) .
са прикрепени два вида а н т и т е л а . Използ­
ва се неконкурентен принцип с два вида мо-
ноклонални а н т и т е л а с различни маркери -
Еи (европий) и Sm (самарий), к о и т о излъч­
в а т светлина в близка, но различна област
на с п е к т ъ р а с д о с т а т ъ ч н а разделителна
способност (фиг. 13.18).
Една модерна и много надеждна техно­
логия беше разработена в последните годи­
ни. К а т о маркер т у к се използва новосин-
тезирана молекула носител КРИПТАТ бипи-
ридин-Еи { + . Това съединение е о т к р и т о о т
френски учен химик Jean-Marie Lehn, за ко­
е т о през 1987 е получил Нобелова награда. В
последствие се разработва технология за
хомогенен а н а л и з с продължителна
ф л у о р е с ц е н ц и я , наречен TRACE ( T i m e *
Resolved A m p l i f i e d C r y p t a t e Emission).
Европий-криптата може да бъде конюгиран
към а н т и т е л а , антигени или хаптени без
 t Твърда фаза hAFP Белязан с Eu
анти hAFP IgG молекупа анти-hAFP IgG nrn започва 50 |.isec след всеки лазерен им­

rhr
^ + о + пулс и продължава 350 [isec (фиг. 13.19).
>
>
¥ Eu

>
+ S) + YSm Инкубация
Т върла фаза
анти-ЬСС|! IgG
hCG((
молекула
Белязан c Sm
анти-hCGlt IgG Y Sm

N
> c P A
>
\ OöD
4D

Y ocP
1 (мсриамс па
A. флуорссисицпя

А.

дьлжнма на вълна! а

Ь.
Ф и г . 13.18. Имунофлуоресценция с л а н т а н и у и
при едновременно определяне на два вида а н т и ­
гени Донор А к цс т о р
Ь.
А. П р и н ц и п ма а н а л и з а
Б. Г р а ф и ч н о п р е д с т а в я н е н а в р ъ з к а т а м е ж д у е м и с и ­
онна дължина на в ъ л н а т а , забавяне и и н т е н з и т е т Нмбужлямс ( r n n i u U ) )
н а флуоресценция з а д в а т а м а р к е р а - Е и ( е в р о п и й ) и HbTiytMuumc (ЛГС)
I mhciu ( I ИГ(Пи^*))
t Sm ( с а м а р и й ) —
-—- [мисия (AIC' )
е
к
S
ZI
никаква загуба на и м у н н а р е а к т и в н о с т . ю
Q-
о
П р и и м у н о м е т р и ч н о т о определяне, т р и с - о
ю
б и п и р и д и н д и а м и н - Е и е свързан с а н т и т я ­ <
ло, к о е т о е с в и с о к а с п е ц и ф и ч н о с т к ъ м да­
ден а н т и г е н . В т о р о а н т и т я л о е свързано с
1 ,
-i—-**— JLA
флуорофор к а т о а к ц е п т о р н а е н е р г и я - про- 750
250 350 450 550 650
т е и н - п и г м е н т е п комплекс (фикобилизоми Дължина на вълната (nm)
о т червени водорасли) с к о д о в о н а з в а н и е И.
ХЬ6в5. След и н к у б а ц и я н а 37 "С, и м у н н и я т фиг. 13.19 Kpunmam-Eu флуоресцентна т е х ­
к о м п л е к с се в ъ з б у ж д а с лазер. Т рансформи ­ ника
Л. М о л е к у л н а с т р у к т у р а н а м а р к е р а
р а н а т а е н е р г и я се п р е н а с я о т к р и п т а т а
В. В ъ т р е - и междумолекулен енергиен трансфер п р и
(донор) к ъ м флуорофора ( а к ц е п т о р ) и се о т ­ к р и п т а т - Е и ф л у о р е с ц е н т н а т е х н и к а (111ЛСЛ)
м и т а к а т о п р о д ъ л ж и т е л е н с и г н а л п р и 665 В. С п е к т ъ р на флуоресценцията на к р и п т а т - Ь и
п т . О т ч и т а н е т о н а с и г н а л а п р и 620 и 665 (ТВР(ЕиЗ + ) и а л о ф и к о ц и а н и н (АРС)

289

ф л у о р е с ц е н т н о п о л я ри з а ц й о н е н
и м у н е н а н а л и з (FPIA), FPIA-технологи-
я т а на имунохимичния анализ се счиша з а
д о с т а т ъ ч н о надеждна. Касае се за хомоген­
но определяне - антитяло-сбързанише и сбо-
бодните фракции на белязаните с флуорес-
цеин а н т и г е н и (Ag-F) м о г а т да се разграни­
ч а т 6 р а з т в о р а без необходимост о т пред­
варителна сепарация. А н т и г е н и т е (хормо­
ни или медикаменти), маркирани с флуорес-
цеан се н а р и ч а т ф л у о р о ф о р и . FPIA е кон­
курентен имуноанализ, при к о й т о опреде­
лено количество белязани а н т и г е н и се кон­
к у р и р а т с а н т и г е н а о т п р о б а т а за свърз­
в а щ и т е м е с т а н а ограничено количество
а н т и т е л а (фиг. 13.20).
i
Ag
4 #
Ag-F
Ab:Ag
Фиг. 13.20. Антигени - свободни и белязани се кон­
курират за свързващи места на а н т и т я л о т о
Молекулата н а ф л у о р о ф о р а абсорбира
енергия - възбуждаща с в е т л и н н а енергия с
определена дължина н а в ъ л н а т а и я излъчва
с по-висока дължина н а в ъ л н а т а . Ако флуо-
рофорът се възбуди чрез поляризирана с в е т ­
лина, с т е п е н т а на поляризация н а излъче­
н а т а светлина з а в и с и о т с к о р о с т т а н а
ротация н а маркирания антиген.
С к о р о с т т а н а р о т а ц и я е в о б р а т н а зави­
симост о т размера н а молекулата. При нис­
ка концентрация н а т ъ р с е н и я а н т и г е н в се­
рума н а с т ъ п в а свързване предимно н а мар­
кирания а н т и г е н с а н т и т я л о т о . Получени­
я т комплекс (Ab:Ag-F) забавя р о т а ц и я т а
на флуорофора, т а к а че с в е т л и н а т а се из­
лъчва в е д н а е д и н с т в е н а р а в н и н а , ед­
наква с т а з и н а в ъ з б у ж д а щ а т а с в е т л и н а .
Р е з у л т а т ъ т е повишаване н а поляризаци­
я т а (фиг. 13.21). Малките, маркирани с флу-
%
Ab:Ag-F
Фиг. 13.21. Комплексите Ab:Ag-F р о т и р а т бав­
но, поради което светлината се излъчва в една
плоскост - Висока поляризация
290
Г
Ag-F w
Фиг. 13.22. Маркираните антигени р о т и р а т
бързо, поради което излъчената светлина е в
различни плоскости - ниска поляризация
оресцеин молекули н а а н т и г е н а (Ag-F) са сил­
но подвижни, р о т и р а т бързо и и з л ъ ч в а т
с в е т л и н а в м н о ж е с т в о различни равнини, в
р е з у л т а т н а к о е т о п о л я р и з а ц и я т а се по­
н и ж а в а (фиг. 13.22). П о л я р и з а ц и я т а е
право пропорционална н а разлгера н а
м о л е к у л а т а : повишава се, к о г а т о моле­
к у л н и я т размер н а р а с т в а (образувани с а
комплекси) и се понижава, к о г а т о белязани­
т е молекули о с т а в а т несвързани с а н т и ­
тела. П р о м я н а т а В поляризацията н а
излъчената флуоресценция отразява
к о н ц е н т р а ц и я т а н а и з с л е д в а н и я ан­
т и г е н : в и с о к а к о н ц е н т р а ц и я н а Ag в
б и о л о г и ч н а т а п р о б а - ниска поляриза­
ц и я , р е с п . н и с к а к о н ц е н т р а ц и я н а Ag
в б и о л о г и ч н а т а п р о б а - в и с о к а поляри­
зация.
Т о ч н а т а з а в и с и м о с т между поляризация
и к о н ц е н т р а ц и я н а изследваните в е щ е с т ­
ва се у с т а н о в я в а ч р е з изл1ерване стой­
ностите н а поляризация н а калибра-
тори с позната концентрация.
Хемилуминесцентен имуноанализ
Неензимно б ел я зан и те а н т и г е н и и а н т и т е ­
ла са маркирани с химически съединения, ко­
и т о и м а т свойство да и з л ъ ч в а т светлин­
ни сигнали след а к т и в и р а н е о т светлинен
източник. Пример за подобни маркери са лу-
минол/изолуминол, диоксетани, акридино-
ви фенилестери и рутениеви соли. Тези съе­
динения са използвани з а д и р е к т н а с и н т е ­
за н а луминофори (mpeücepu) след п р о т и ч а ­ -i
не н а е л е м е н т а р н а химична реакция. През Ef
последните години се наложи използването Oi
н а акридинови производни в а в т о м а т и з и ­ I
р а н е т о н а имунохимичния анализ. Акриди-
н о в и т е е с т е р и лесно се о к и с л я в а т о т водо­
роден прекис до образуване н а метилакри-
дон, к о й т о излъчва к р а т к о т р а е н светлинен
сигнал при X= 450 n m . О к и с л и т е л н и я т про-
ТРА**
иес се м а к с и м а л и з и р а п р и ниски с т о й н о с ­
т и н а pH. NaOH се д о б а в я з а у с т а н о в я в а н е
н а н е о б х о д и м о т о pH, к о е т о у с к о р я в а окис­ ТРА
л и т е л н и я процес (фиг, 13.23).
Ru(bpy)^ +

.%
П ьрна с г ь п к а
Ru(bpy)| +
^възбудено
Ru(bpy)^ + състояние
ОСНОВНО фотон
състояние (620 nm)

Фиг.13.24. Електрохемилуминесцентна техни­

ка с маркер рутениева сол

Вюра стъпка
Фиг. 13.23. Х е м и л у м и н е с ц е н т н а им унохим ична
техника е маркер акридилов е с т е р
Първа с т ъ п к а : Свързване на антигена в серума с
а н т и т е л а т а , покриващи ч а с т и ч к и т е
В т о р а стъ/гАа.* Детекция на сигнали
Електрохемилуминесцепция
При т а з и имунохимична т е х н и к а к а т о м а р ­
кери се и з п о л з в а т р у т е н и е в и т е т р и с - к о п -
лексни соли. Тези химически съединения с а
с т а б и л н и и водно р а з т в о р и м и . Те м о г а т лес­
но д а б ъ д а т модифицирани с р е а к т и в н и гру­
пи до образуване н а а к т и в и р а н и хемилуми-
н е с ц е н т н и к о м п о н е н т и , к о и т о м о г а т лес­
но д а се с в ъ р з в а т с аминогрупи н а п р о т е и ­
ни, х а п т е н и и нуклеинови киселини, к о и т о
се о к и с л я в а т и о т д е л я т е л е к т р о н и и ф о т о ­
ни (фиг. 13.24).
П р е д и м с т в а т а н а м е т о д и т е , използва­
щ и м а р к и р а н е с химически съединения, ко­
и т о се п р е в р ъ щ а т в луминофори и излъч­
в а т с в е т л и н а з а много к р а т ъ к период, с а
свързани не само с т о ч н о с т , специфичност,
ч у в с т в и т е л н о с т и с т а б и л н о с т н а свързва­
н е т о , но и с бързина н а анализа, к о е т о ги
п р а в и н а й - н а д е ж д н и т е в н а с т о я щ и я мо­
м е н т . П а фиг. 13.25 е п р е д с т а в е н а сравни­
т е л н а с х е м а з а ч у в с т в и т е л н о с т т а н а раз­
л и ч н и т е технологии.

Флуоресцентен
имуноанализ

Флуоресцентна
поляризация

Ензимен Радиоимунен Хемилуминесцентен

Излъчване имуноанализ анализ имуноанализ

vl5
g 10-9g iol2g ю -g
(микрограм) (нанограм) (пикограм) (фемтограм)
Фиг. 13.25. С х е м а т и ч н о п р е д с т а в я н е ч у в с т в и т е л н о с т т а н а о т д е л н и т е видове имунологичен анализ

291
 лекула, ковалентно свързана с радиоизотоп.
ИНДИРЕКТЕН БЕЛЯЗАН Най-често се използва радиоактивен йод -
С РАДИОИЗОТОПНИ МАРКЕРИ 125
1, ч и я т о к о н ц е н т р а ц и я о т съображения
ИМУНОЛОГИЧЕН АНАЛИЗ за безопасност не т р я б в а да надвишава 0.5
jiCi в е п р у в е т к а . Буферите, к о и т о се изпол­
Г.Цветкова з в а т в т ъ р г о в с к и т е Р И Л - т е с т о в е са в раз-
т в о р u с ъ д ъ р ж а т основно ЕДТА, т е л е ш к и
РАДИОИМУНОЛОГИЧЕН АНАЛИЗ серумен албумин (за намаляване на неспе­
цифичното свързване) и консерванти.
Радиоимунологичният анализ, РИЛ (К1Л) С т а н д а р т и т е и к о н т р о л и т е са о т човеш­
представлява индиректен имунологичен ме­ ки произход и в к л ю ч в а т н а т р и е в азид и обя­
т о д , при к о й т о к а т о маркери се използват в е н а к о н ц е н т р а ц и я н а а н т и г е н или хап­
радиоактивни изотопи на йод - 1311, 12о1 или т е н . К а к т о РИЛ, т а к а и други имунологич­
т р и т и й - 3Н. Определят се предимно а н т и ­ ни к и т о в е с ъ д ъ р ж а т потенциално инфек­
гени в биологични т е ч н о с т и . РИЛ-техника- циозен м а т е р и а л .
т а е р а з в и т а през 1959 г. о т R. Yalow и S. РИЛ м е т о д и т е са хетерогенен имуноа-
Berson. нализ. З а физическото разделяне н а несвър­
М е т о д ъ т се базира на конкурентно свър­ з а н и т е о т с в ъ р з а н и т е с а н т и т я л о т о изо­
зване, при к о е т о определено количетво о т топно-маркирани а н т и г е н и преди измерва­
маркирани с и з о т о п а н т и г е н и и а н т и г е н и ­ не на р а д и о а к т и в н о с т т а н а свързания мар­
т е в п р о б а т а се к о н к у р и р а т за ограничен кер се и з п о л з в а т т р и техники:
брой специфични свързващи м е с т а в а н т и ­ А. И р и к р е п В а п е к ъ м т в ъ р д а ф а з а
т е л а т а . К а к т о белязаните, т а к а и немар- (фиг. 13.26). Това е н а й - п р о с т и я т и най-чес-
кираните с и з о т о п а н т и г е н и се с в ъ р з в а т с
а н т и т е л а т а , при к о е т о се о б р а з у в а т ком­ А.
плекси а н т и г е н - а н т и т я л о . Преди измерва­
Ц L I
не на р а д и о а к т и в н о с т т а на с в ъ р з а н и т е с ЛЬ ] Ab Ag
а н т и т е л а маркирани а н т и г е н и , т е т р я б ­ Ag Ag
ва да се о т д е л я т о т свободните белязани 6
н L. I
антигени. П р о ц е н т ъ т н а с в ъ р з а н и т е с ан­ ль ЛЬ Ag
в Г Ag
т и т я л о т о изотопно-маркирани а н т и г е н и
Ag
намалява, к о г а т о к о н ц е н т р а ц и я т а н а не- • i_ Ag
белязаните а н т и г е н и в п р о б а т а е повише­ ЛЬ # ЛЬ Ag
г Ag
на. Следователно к о н ц е н т р а ц и я т а н а
антигените в пробата е 6 обратно li.
п р о п о р ц и о н а л н а зависилгост с п р я л ю
pafjиоакт ивпост т а н а о б р а з у в а н и т е В 1
t.
тг
п
J
Н

комплекси.
<
<

Ag
п
и
Е

А н т и т е л а т а , к о и т о се п о л з в а т в РИА- Ag
анализа най-често са прикрепени към т в ъ р ­ ь L -i
^

Ag АЬ Ag
<

Ag
да подложка (пластмасови епруветки или н г п
К
и

полистиролови перли). Те специфично раз­ В 0

# г Ag
Фг
г

познават а н т и г е н или х а п т е н ( т . е . опре­

Agl ле1
>

делен медикамент или нискомолекулни с т е -

1"

роидни хормони). А н т и т е л а т а м о г а т да бъ­ 1

д а т п о л и к л о н а л н и (смес о т пречистени
а н т и т е л а , разпознаващи различни антиген-
пи де т ерм инанти, к а к т о и т а к и в а - със спе­
цифичен а ф и н и т е т ) или л ю н о к л о н а л н и
( а н т и т я л о разпознаващо единичен а н т и г е -
нен д е т е р м и н а н т ) .
Радиоизотопно-маркираният а н т и г е н
или х а п т е н представлява пречистена мо-
292
Фиг. 13.20. РИА - т в ъ р д а ф а з а {no M. Steinbock и
L. Wyner)
A. И з о т о п н о маркиран а н т и г е н (*Ag) и н р о б а / с т а н -
д а р т / к о н т р о л а , съдържащи а н т и г е н (Ag) са внесе­
ни в епруветки, п о к р и т и с а н т и т я л о (Ab). Марки­
рани и немаркирани а н т и г е н и се конкурират за ог­
раничен брой свързващи м е с т а на а н т и т е л а т а и об­
р а з у в а т комплекси.
B. Свободните изотоппо-белязани а н т и г е н и се о т с ­
т р а н я в а т и се измерва р а д и о а к т и в н о с т т а на обра­
з у в а н и т е комплекси.
m o използван н а ч и н з а р а з д е л я н е .
Първоначално Catt e t al през 1966 г. откри­
в а т , че а н т и т е л а т а м о г а т да се свързват към
полистиренови или полипропиленови сфери, а по-
късно съобщават, че а н т и т е л а т а м о г а т да се
адсорбират и о т с т е н а т а на епруветки, изра­
ботени о т т е з и материали. Сегашните иму-
нотехники използват а н т и т е л а , адсорбирани
в ограничено количество към в ъ т р е ш н и т е с т е ­
ни на епруветките. Пробите, съдържащи небе-
лязани антигени и изотопно-маркирани а н т и ­
гени се в н а с я т директно в епруветките. По вре­
ме на инкубацията, а н т и г е н и т е се конкурират
за свързване към ограничен брой имобилизира-
ни а н т и т е л а . След инкубацията, т е ч н о с т т а
се аспирира или декантира до о т с т р а н я в а н е на
свободния изотопно-маркиран а н т и г е н в р а з т ­
вора. Р а д и о а к т и в н о с т т а на маркирания ком­
плекс а н т и г е н - а н т и т я л о , свързан към с т е н и ­
т е на е п р у в е т к а т а се определя количествено
посредством гама-брояч.
А н т и т е л а т а м о г а т да б ъ д а т адсорбирани
върху полистиренови сфери, к о и т о да б ъ д а т
„обелени" чрез центрофугиране или върху час­
т и ч к и о т железен оксид, п о к р и т с полимер. Те­
зи частици се о т д е л я т посредством м а г н и т е н
сепаратор, к о й т о задържа м е т а л н и т е частич­
ки в т ъ н ъ к слой върху с т е н а т а на епруветка­
т а , к о е т о позволява т е ч н о с т т а лесно да се де­
кантира.
Б. М е т о д з а с е п а р а ц и я с „активен 4 *
Въглен. А к т и в н и я т въглен (или въглен покрит
с декстран) адсорбира антигени с ниска моле­
кулна маса, а свързаните а н т и т е л а в комплек­
с и т е а н т и г е н - а н т и т я л о не се адсорбират. Сво­
бодните изотопно-маркирани антигени м о г а т
да б ъ д а т отделени о т свързаните посредст­
вом центрофугиране, след к о е т о се измерва ра­
диоактивността. Прсушмство п а м е т о д а
е па~11а~ьяваис п а и с с п с ц и ф и ч п о т о свърз­
ване. Т а з и т е х н и к а fie л ю Ж е д а с е използ­
ва з а определяне н а а н т и г е н и с висока лю-
лекулна маса, тъй като големите моле­
к у л и н е е е а д с о р б и р а т о т а к т и в е н в ъглен.
Предлагат се и методи, ползващи полистиро-
лови сфери, покрити с а к т и в е н въглен, к о е т о
улеснява разделянето на с в ъ р з а н а т а и свобод­
н а т а фракция.
В. П р е ц и п и т а ц и о н н а т е х н и к а . Анти­
г е н - а н т и т я л о комплексите, к о и т о са образу­
вани се о т д е л я т о т свободните маркирани ан­
тигени посредством преципитирането им с на­
с и т е н амониев сулфат (Рагг-техника). За да се
разделят свързаните и свободните маркирани
антигени се добавя в т о р о а н т и т я л о . Образу­
в а т се големи комплекси, състоящи се о т пър­
во а н т и т я л о , изотопно-белязан антиген и в т о ­
ро а н т и т я л о . П р е ц и п и т а т и т е о т подобен ме­
т о д м о г а т да б ъ д а т отделени чрез центрофу­
гиране. Радиоактивността на маркираните ан­
тигени, съдържащи се в п р е ц и п и т а т а се изпол­
зва за изчисляване количеството на изследва­
ния антиген в пробата.
За измерване на р а д и о а к т и в н о с т т а се из­
ползват два вида броячи - гама-брояч и сцин-
т и л а т о р , които измерват гама-лъчи или елек­
т р о м а г н и т н а радиация, излъчени о т много ви-
сокоенергийни и з о т о п и ( р а д и о и з о т о п е
а т о м от д а д е н е л е м е н т , притеЖаващ по­
в и ш е н брой н е у т р о н и в ядрото, к о е т о во­
д и д о н е г о в а т а н е с т а б и л н о с т ; п р и спон­
танното трансформиране н а ядрото в
по-стабилен в и д с е о т д е л я р а д и а ц и я ; нес-
табьитите радиоизотопни я д р а се нари­
чат радионуклеидии м о г а т д а излъчват
т р и в и д а р а д и а ц и я : алфа-частици, поло-
жително или отрицателно заредени
е л е к т р о н и и гама-лъчи). Гама-броячът из­
мерва отделеното гама-лъчение, обозначавано
к а т о радиоактивност. О т ч и т а н е т о на резул­
т а т и т е с т а в а чрез калибрационна крива.
Предложен е и несепарационен РИА (неу­
добен з а р у т и н н а т а п р а к т и к а ) - чрез моду-
лиране н а 3 Н п о с р е д с т в о м ч а с т и ц и , н а т о ­
варени със с ц и н т и л а ц и о н н и молекули.
О с н о в н а т а ч а с т о т п р о ц е д у р и т е при
РИА с а а в т о м а т и з и р а н и : 1. прибавяне н а
п р о б а т а , н а фиксирано к о л и ч е с т в о специ­
фично а н т и т я л о и определено к о л и ч е с т в о
м а р к и р а н а н т и г е н ; 2. инкубация и разделя­
не н а свързани и несвързани белязани а н т и ­
гени; 3. измерване н а р а д и о а к т и в н о с т т а ;
4. изчисляване к о н ц е н т р а ц и я т а н а а н т и г е ­
н и т е в п р о б а т а след п о с т р о я в а н е н а калиб-
р а ц и о н н а т а крива. Независимо о т дизайна
си, п о в е ч е т о а п а р а т и и з в ъ р ш в а т анализа
без у ч а с т и е н а о п е р а т о р , с к о е т о се н а м а ­
л я в а риска о т р а б о т а с р а д и о а к т и в н и ве­
щества.
П р е д и м с т в а . П р е д и м с т в о н а РИА е изпол­
з в а н е т о н а 1261 з а маркиране, к о й т о п р и т е ­
ж а в а високо г а м а - и з л ъ ч в а н е , позволяващо
ч у в с т в и т е л н о с т , д о с т а т ъ ч н а з а определя­
не н а а н т и г е н в пикомоларна к о н ц е н т р а ­
ц и я или по-ниска. РИА лесно се а в т о м а т и ­
зира, к о е т о позволява изследване н а големи
серии.
Н е д о с т а т ъ ц и . Радиоизотопният маркер
и м а къс срок н а г о д н о с т (1-2 месеца), к о е т о
прави РИА н е е ф е к т и в е н и с висока цена, чес­
т о поради н е о п о л з о т в о р я в а н е н а р е а к т и
293
ßume 6 срока н а г о д н о с т . К и т о в е т е изиск­
в а т специално съхранение и специални ус­
ловия з а изхвърляне н а о т п а д ъ ц и т е . Пора­
ди н е о б х о д и м о с т т а о т събиране н а големи
серии, и з р а б о т в а н е т о н а п р о б и т е и полу­
ч а в а н е т о н а р е з у л т а т и т е с т а в а след оп­
ределен срок о т вземане н а биологичния м а ­
т е р и а л . Независимо, че а н а л и т и ч н а т а сис­
т е м а е напълно а в т о м а т и з и р а н а , опас­
н о с т т а о т излагане н а р а б о т е щ и т е н а
вредно лъчение не бива д а се пренебрегва.
П р и л о ж е н и е . РИА се използва з а опреде­
ляне н а високо- и нискомолекулни в е щ е с т в а
- хормони, б е л т ъ ц и , а н т и т е л а срещу вирус­
ни а н т и г е н и , изоензими, ликворни п р о т е и ­
ни и др. Използва се и з а м о н и т о р и р а н е н а
л е к а р с т в е н и нива.
ИМУНОРАДИОМЕТРИЧЕН АНАЛИЗ
Имунорадиометричниягп анализ, ИРМА
(IRMA) се основава н а използване н а изли­
шък о т радиоизотопно маркирани а н т и т е ­
ла з а определяне н а в с и ч к и н а л и ч н и а н ­
т и г е н и в п р о б а т а н а б а з а т а н а неконку­
р е н т н и я анализ. З а р азгр анич ав ане н а м а р ­
к и р а н и т е а н т и т е л а (свързани с а н т и г е н )
о т с в о б о д н и т е е необходимо р а з д е л я н е т о
им. О т ч и т а н е т о е п о с р е д с т в о м гама-бро-
яч.
ИРМА е м е т о д , подобен н а РИА, к а т о и
при д в а т а се о т ч и т а т и з о т о п н о б е л я з а н и
молекули з а определяне н а р е а к ц и я т а а н т и -
ген-антитяло. П р и ИРМА б е л я з а н а т а
л ю л е к у л а е а н т и т я л о , а п р и РИА - а н ­
т и г е н . С в ъ р з в а т се в с и ч к и н е л г а р к и р а
н и антигени (излишък о т антите­
ла), което п р а в и а н а л и з а с л и ю г о по-
голялга ч у в с т в и т е л н о с т спрялго РИА.
И з п о л з в а т се д в а т и п а и м у н о р а д и о м е т -
ричен анализ: определяне п о с р е д с т в о м
т в ъ р д а ф а з а и определяне в т е ч н а ф а з а .
Анализът на т в ъ р д а фаза, п о з н а т к а т о сан-
двич-техника (фиг. 13.27) се прилага за опреде­
ляне на антигени с голяма молекулна маса, при­
тежаващи поне две антигенни детерминанти.-
Анализът се осъществява чрез използване на
имобилизирано а н т и т я л о , специфично за даде­
на детерминанта на определяния антиген, и
второ а н т и т я л о , маркирано с 1251, к о е т о се
свързва с втора, уникална д е т е р м и н а н т а на съ­
щия антиген. По време на инкубацията а н т и -
294
+е=е=
3
ль Ab
З
©
Б.
\ т
Р Ч. Н Ab
Ab A + С
1 V Г ¥ 1 "ъ*
Фиг. 13.27. ИРМА - т в ъ р д а фаза (по М. Steinbeck
и L. Wyner)
А. Проба/стандарт/контрола, съдържащи изслед­
вания антиген (Ag) се прибабят към епруветки, пок­
р и т и с а н т и т я л о (Ab), при к о е т о се образуват ком-
плеси Ag:Ab.
Б. Прибавя се второ, белязано а н т и т я л о (*АЬ), кое­
т о се свързва към специфична д е т е р м и н а н т а на съ­
щия антиген, при к о е т о се формират макрокомп-
лекси. Р а д и о а к т и в н о с т т а на пробата се измерва
след отстраняване на в т о р о т о , несвързано а н т и ­
тяло.
г е н ъ т се свързва с имобилизираното а н т и т я ­
ло, к о е т о ориентира а н т и г е н а т а к а , че беляза­
н о т о в т о р о а н т и т я л о да "разпознае" и да се
свърже със с ъ о т в е т н о т о м я с т о , образувайки
сандвич. След инкубация свободните маркира­
ни а н т и т е л а се о т с т р а н я в а т чрез декантира-
не. Определя се р а д и о а к т и в н о с т т а на свърза­
н и т е комплекси. Предложени са опростени и
бързи модификации, при к о и т о р е а к т и в ъ т с ан­
т и т я л о т о се прибавя едновременно с пробата,
респ. с т а н д а р т а или контролния материал.
Адсорбираните а н т и т е л а най-често са
моноклонални, с висок а ф и н и т е т . В т о р о т о
(маркирано) а н т и т я л о обикновено също е
моноклонално. К а к т о п р и РИА, т а к а и п р и
ИРМА м а р к е р ъ т н е б и в а д а надхвърля 0.5
цС! в е п р у в е т к а , к о е т о о г р а н и ч а в а количес­
т в о т о н а в т о р о т о , белязано а н т и т я л о .
О т ч и т а н е т о с т а в а с п о м о щ т а н а калиб-
рационна крива.
ИРМА в т е ч н а ф а з а зависи о т с е л е к т и в ­
н а т а п р е ц и п и т а ц и я н а имуноглобулините.
Р а д и о б е л я з а н и т е а н т и т е л а в р а з т в о р а се
и н к у б и р а т с ъ с с т а н д а р т , к о н т р о л а или
проба, с ъ д ъ р ж а щ и а н т и г е н . О б р а з у в а н и я т
маркиран а н т и г е н - а н т и т я л о комплекс се
о т д е л я о т свободното маркирано а н т и т я ­
ло чрез п р е ц и п и т а ц и я п осред с т вом амони­
ев сулфат. Р а д и о а к т и в н о с т т а н а преципи-
т а т и т е зависи о т к о н ц е н т р а ц и я т а н а не-
м а р к и р а н и т е а н т и г е н и , с ъ д ъ р ж а щ и се в
пробата /контролата/стандарта.
И з л и ш ъ к ъ т о т свободни, маркирани ан­
т и т е л а може д а се о т с т р а н и и чрез приба­
вяне н а п р е ц и п и т и р а щ и ч а с т и ч к и (най-чес­
т о п о к р и т и с а н т и г е н сфери), след к о е т о
се измерва р а д и о а к т и в н о с т т а н а т е ч н а т а
фаза. Р е з у л т а т ъ т се изразява к а т о про­
ц е н т р а д и о а к т и в н о с т о т о б щ о т о количес­
т в о маркер, внесен във всяка епруветка. По­
л у ч е н а т а информация се н а н а с я и о т ч и т а
чрез линейно-логаритмична крива.
П р е д и м с т в а . ИРМА е по-бърз u по-чувст­
в и т е л е н анализ в сравнение с РИА поради
наличието н а а н т и т е л а в излишък, к о е т о
повишава в ъ з м о ж н о с т т а з а взаимодейст­
вие между а н т и г е н и и а н т и т е л а , а също и
поради свързване н а всички а н т и г е н и в раз­
т в о р а . Използването н а белязани а н т и т е ­
ла: 1. премахва н е о б х о д и м о с т т а о т изоли­
ране и п р е ч и с т в а н е н а а н т и г е н и ; 2. използ­
в а н и т е р е а к т и в и са с т а б и л н и и 3. намаля-
КНИГОПИС
Bassion S. I m m u n o l o g i c a l reactions. In: Kaplan LA, Fescc A J
(eds.). Clinical c h e m i s t r y : theory, a n a l y s i s a n d correlations
(3* ed). M o s b y Year B o o k , Inc, 1996, 2 1 3 - 2 2 5 .
F e l d k a m p C S . I m m u n o c h e m i c a l t e c h n i q u e s . In: K a p l a n L A ,
Pesce A J (eds). Clinical c h e m i s t r y ; theory, analysis a n d c o r ­
relations (3' h ed). M o s b y Year B o o k , Inc. 1996, 2 2 5 - 2 4 9 .
G r e i l i n g A M , T h o m a s L. I m m u n o c h e m i s c h e n m e t h o d e n . In;
Greiling H, Gressner A M (eds). Lehrbuch d e r klinischen
c h e m i e und p a t h o b i o c h e m i e ( 3 Aufl). Stuttgart, Schattauer,
1995, 2 3 9 - 2 4 5 .
Keller H . Klinisch-chemische labordiagnostik fuer die praxis.
Stuttgart, G e o r g T h i e m e Verlag, 1991, 3 7 - 5 2 .
Kricka 1 J , Phil D , Path P R C . P r i n c i p l e s o f i m m u n o c h e m i c a l
techniques. In; Burtis C A , A s h w o o d E R (eds). T i e t z textboock
o f clinical c h e m i s t r y (2Ж) ed). Philadelphia, S o u n d e r s C o m ­
pany, 1994, 2 8 3 - 2 9 8 .
* * *
И м у н о е н з и м н и методи. Б о ж к о в Б (ред). С., М е д и ф и з к , 1988.
Цветкова Т, О г н я н о в М. И м у н о ф е н о т и п н а х а р а к т е р и с т и к а
и а к р ъ в н и т е клетки. С., В Е Н Е Л О О Д , 1995.
B o w i e LI. A u t o m a t e d instrumentation for r a d i o i m m u n o a s s a y .
ва проблемите о т свързване н а с т р у к т у р ­
но различни а н т и г е н и ( н е с п е ц и ф и ч н о т о
свързване при РИА е по-често, о т к о л к о т о
при ИРМА). При т е х н и к а т а с т в ъ р д а фаза
са необходими две а н т и т е л а , к о е т о пови­
ш а в а с п е ц и ф и ч н о с т т а н а анализа, но съ­
щевременно и го оскъпява. Комбинирано
маркиране (напр, 57Со и 1251) се използва при
едновременно определяне, напр. н а в и т .
и фолат.
Н е д о с т а т ъ ц и т е с а сходни с т е з и при
ИРА. Освен т о в а ч е с т проблем при ИРМА е,
че може да н а с т ъ п и йодиране н а лабилни ан­
тигени.
П р и л о Ж е п и е . Използва се за определяне н а
някои индивидуални серумни белтъци, фак­
т о р и на съсирване, хормони, т у м о р н и мар­
кери.
З а к л ю ч е н и е . П о н а с т о я щ е м радиоизотоп-
н и я т анализ все повече се и з м е с т в а о т раз­
г л е д а н и т е в т а з и глава клинично-лабора-
т о р н и т е х н и к и и би т р я б в а л о да о с т а н е са­
мо з а показатели, за к о и т о все още не се
предлага нерадиоизотопен м е т о д .
B o c a Ralon FL, C R C Press, 1980.
E k i n s R, C h u F. I m m u n o a s s a y and other ligand assays; present
status a n d future trends. J I F C C , 9, 1997, 3, 100-109.
Forrest A. C h r o m i u m dioxide p a v e s the w a y to integration. Eur
Clin Lab, 19, 2000, 8 .
R ö m e r M , Haeckel R, Capelli M, Rocipon J. T h e analytical
performance o f the C i b a C o r n i n g A C S & 1 8 0 Automated Im­
m u n o a s s a y S y s t e m . A Multicentre Evaluation. E u r J Clin
C h e m Clin Biochem, 3 2 , 1994, 3 9 5 - 4 0 7 .
* * *
B ö r n s e n KO. A radionuclide detection s y s t e m for metabolic
s t u d i e s u s i n g m l l P L C . International Laboratory, 30, 2 0 0 0 ,
6-9.
Catt K, Niall I ID, T r e g e a r GW. Solid-phase radioimmunoassay
o f h u m a n grawth hormone. B i o c h e m J, 100, 1966, 31 C .
Steinbeck MJ, W y n e r LR. I m m u n o a s s a y a n d related principles.
In: A n d e r s o n S C , C o c k a y n e S (eds). Clinical chemistry. St
L o u i s etc., M o s b y Year Book, 1993, 93-98.
Yalow RS. R a d i o i m m u n o a s s a y o f hormons. In: Williams E. Text­
b o o k o f endocrinology. Philadelphia, W B Saunders, 1985,
123-132.
295
 Хроматография

Д. Свиларов

СЪЩНОСТ И ВИДОВЕ другата - нсподвшкла. Неподвижната

ХРОМАТОГРАФСКМ МЕТОДИ
Хроматографията е м е т о д за разде­
ляне на една с м е с н а с ъ с т а в н и т е ü
компоненти, при к о й т о с ъ щ и т е с е
разпределят между göe несмесбащи с е
фази. Е д н а т а о т ф а з и т е е п о д в ш к п а , а
ф а з а м о ж е д а бъде твърда, течна или гел\
т я м о ж е д а бъде заредена в колона или раз­
стлана в плоскост. П о д в и ж н а т а ф а з а м о ж е
д а бъде газова или течна.
С ъ в р е м е н н а т а н о м е н к л а т у р а и класифи­
к а ц и я н а х р о м а т о г р а ф с к и т е м е т о д и е пред­
с т а в е н а н а т а б л . 14.1.

Таблица 14.1. Н о м е н к л а т у р а и класификация н а х р о м а т о г р а ф с к и т е м е т о д и

Класификационни
критерии
А. Ф о р м а н а
неподвижна ф а з а
Б. Начин з а в о д е н е н а
пробата през
неподвижната фаза
В. Ф и з и ч н о
състояние на
подвижна фаза
н е п о д в и ж н а ф а з а 1. т е ч н а
Г. О т н о с и т е л н а поляр­ 1. нормалнофазова
н о с т на д в е т е фази
Д. Механизъм н а
разделяне
296
ВидоОе
Обяснителни бележки
хроматография
1. колонна к о м п о н е н т и т е са в зони о т п о д в и ж н а т а фаза,
получавани след напускане на к о л о н а т а
2. плоскостна к о м п о н е н т и т е са п е т н а зад ч р о н т а на
- хартиена п о д в и ж н а т а фаза
- тънкослойна
1. ф р о н т а л н а к о м п о н е н т и т е се с ъ д ъ р ж а т в целия обем подвиж­
на фаза и само най-слабо адсорби ращи ят се се
получава в ч и с т вид
2. е л у е н т н а п р о б а т а се нанася в малък обем и при х р о м а т о -
г р а ф и р а н е т о се п о с т и г а пълно разделяне; ф а з и т е
не в з а и м о д е й с т в а т
3. и з м е с т и т е л н а к а т о е л у е н т н а т а , но п о д в и ж н а т а фаза взаимо­
д е й с т в а с н е п о д в и ж н а т а по-силно о т компонен­
т и т е н а п р о б а т а и ги и з т л а с к в а напред
1. газова в зависимост о т а г р е г а т н о т о с ъ с т о я н и е на
2. т е ч н о с т н а ф а з и т е се р а з л и ч а в а т г а з о в о - т е ч н о с т н а ,
газово-адсорбционна, т е ч н о с т н о - т е ч н о с т н а ,
2. т в ъ р д а течностно-адсорбционна х р о м а т о г р а ф и я и
3. гел гел-филтрация
н е п о д в и ж н а т а фаза е хидрофилна, а п о д в и ж н а т а -
хидрофобна
2. обратнофазова н е п о д в и ж н а т а фаза е хидрофобна, а п о д в и ж н а т а -
хидрофилна
1. адсорбционна различен адсорбционен а ф и н и т е т към
н е п о д в и ж н а т а фаза
2. разпределителна различна р а з т в о р и м о с т на к о м п о н е н т и т е в
д в е т е фази
3. йонообменна йонни взаимодействия между к о м п о н е н т и т е и
д в е т е фази
4. гел-филтрация различия в молекулната м а с а и р а з м е р и т е на
компонентите
5. а ф и н и т е т н а използва биологичната специфичност на в р ъ з к а т а
белтък-лиганд
 При въвеждане в х р о м а т о г р а ф с к а т а сис­
т е м а всеки подлежащ н а разделяне компо­
н е н т преминава м н о г о к р а т н о о т подвиж­
н а т а в н е п о д в и ж н а т а фаза. Той се задържа
в с и с т е м а т а д о к а т о п р и с ъ с т в а в неподвиж­
н а т а фаза и се придвижва напред само по
време н а п р е б и в а в а н е т о си в п о д в и ж н а т а
фаза. Следователно р а з л и ч н и т е компонен­
т и н а с м е с т а се разделят поради различ­
ния си афинитет к ъ м двете фази.
При а д с о р б ц и о и п а т а х р о м а т о г р а -
ф и я р е д ъ т н а елуиране е пропориионален на
силата, с к о я т о с ъ о т в е т н и я т компонент
се адсорбира върху т в ъ р д а т а неподвижна
фаза. К о л к о т о по-слаба е а д с о р б ц и я т а ,
т о л к о в а по-дълго време к о м п о н е н т ъ т
пребивава в п о д в и ж н а т а фаза и се елуира по-
бързо.
При р а з п р е д е л и т е л н а т а х р о м а т о -
г р а ф и я н е п о д в и ж н а т а фаза е слой о т т е ч ­
н о с т , нанесена върху т в ъ р д носител. Раз­
д е л я н е т о се основава н а р а з л и ч н а т а р а з т ­
воримост на о т д е л н и т е компоненти на
п р о б а т а в д в е т е фази, в с ъ о т в е т с т в и е с
принципа „подобно се разтваря в подобно11.
Р е д ъ т н а елуиране е право пропорционален
н а р а з т в о р и м о с т т а в п о д в и ж н а т а фаза.
При й о н о о б м е п н а т а х р о м а т о г р а ф и я
к а т о неподвижна фаза се използват органич­
ни смоли (йонити), к о и т о в з а в и с и м о с т о т
ШШШ Е
В ШШ
V « • д р у г и я т се т ъ р с и на основата на специфич
Ф и г 14.1. Йонообменна х р о м а т о г р а ф и я
електрическия си заряд и с п о с о б н о с т т а да
о б м е н я т положително или о т р и ц а т е л н о на­
т о в а р е н и компоненти, се д е л я т на к а т и -
й о н и т и и анийонити. Разделянето се осно­
вава на йонния обмен между компоненти­
т е н а п р о б а т а и елуирагция буфер о т една
с т р а н а и й о н и т и т е н а неподвижната фаза
- о т друга. То п р о т и ч а в т р и е т а п а : въвеж,-
(/апе п а с л ю с т а в й о п о о б л ю н п а т а ко­
л о н к а : р а з д с л л и е - едноименните товари
и електронеутралните компоненти се про­
п у с к а т през колонката, а разноименните
се задържат на различни нива и с различна
сила, в зависимост от т и п а на йонните вза­
имодействия] е л у и р а н е н а з а д ъ р Ж а н и -
т с к о л т о н с п т и , като се използват буфе­
р и вариращи по състав, p H и йонна сила
(фиг. 14.1).
При г е л - ф и л т р а ц и я т а разделянето се
основава на р а з л и ч и я т а в р а з м е р и т е на о т ­
делните компоненти (фиг. 14.2). К а т о непод-
Гел-носител
Малки
молекули
Големи
молекули
ф и г . 14.2. Гел-филтрация
вижна фаза се и з п о л з в а т различни гелове
(декстранови, агарозни) или перли (полисти-
ролови, силициеви, стъклени), к о и т о и г р а я т
роля н а „молекулно сито . Големите моле­
кули п р е м и н а в а т през м е ж д и н и т е на пъл­
нежа, пребивавайки изцяло в п о д в и ж н а т а
фаза и з а т о в а се е л у и р а т бързо. М а л к и т е
молекули се з а д ъ р ж а т на различна дълбочи­
н а в п о р е с т а т а с т р у к т у р а на геловете и
се е л у и р а т в различна с т е п е н по-бавно.
При а ф и н и т е т н а т а х р о м а т о г р а ф и я
(фиг. 14.3) неподвижната фаза съдържа еди­
ния е л е м е н т н а д в о й к а т а белтък/лиганд, а
но свързване (например а н т и г е н / а н т и т я л о ,
297
 Носител на т о з и слой, а п о д в и ж н а т а фаза, представ­
ляваща смес о т органични р а з т в о р и т е л и
(напр. м е т а н о л , хлороформ, е т и л а ц е т а т и
др.), п ъ т у в а о т същия к ъ м срещуположния
к р а й на слоя (фиг 14.4). Разпределението се
о с ъ щ е с т в я в а по адсорбционно-разпредели-
телен м е х а н и з ъ м и продължава д о к а т о
ф р о н т ъ т на органичните разтворители
Белтък наближи к р а я на н е п о д в и ж н а т а фаза. Раз­
делените к о м п о н е н т и п р е д с т а в л я в а т п е т ­
на зад ф р о н т а на п о д в и ж н а т а фаза. Иден­
т и ф и к а ц и я т а се извършва по с ъ о т в е т н и ­
т е R f стойности, а к о л и ч е с т в е н и я т анализ
Други
компоненти
се основава на размера и плътността н а
съответното петно, к о и т о се определят по
различни начини - спектрофотометрично,
дензитометричнои др. Технологията е т р у ­
доемка, без да изисква специална а п а р а т у ­
Фиг. 14.3. Афинитетна хроматография ра и се извършва в с л е д н а т а последовател­
ност:
е н з и м / с у б с т р а т , хормон/белтъчен н о с и т е л >• изливане на п л а к а т а ,
и др.). При въвеждане на с м е с т а за анализ > нанасяне на п р о б и т е за анализ,
к о м п л е м е н т а р н и я т елемент се задържа, а > р а з в и т и е на х р о м а т о г р а м а т а - единия
о с т а н а л и т е к о м п о н е н т и се п р о п у с к а т . Елу- к р а й на слоя се п о т а п я във вана, съдър­
ирането се извършва с вещества, разкъсва­ ж а щ а п о д в и ж н а т а фаза и се изчаква до­
щи в р ъ з к а т а между б е л т ъ к а и лиганда - ин- к а т о последната д о с т и г н е другия край,
хибитори, с у б с т р а т и и др. > изсушаване,
При т ъ н к о с л о й н а т а х р о м а т о г р а ф и я > проявяване (оцветяване),
неподвижната фаза е смес о т алуминиеви >• измерване - и д е н т и ф и к а ц и я и количест­
окиси и хидроокиси или с и л и к а т и , р а з с т л а ­ вен анализ.
на в т ъ н ъ к слой върху плака. С м е с т а за раз­
деляне се нанася в малък обем на единия к р а й При г а з о В а т а х р о м а т о г р а ф и я (ГХ)
н е п о д в и ж н а т а фаза е т в ъ р д а (различни с т и -
Плака с неподвижна фаза Фронт на
рол-дивинил-бензолови полимери) или т е ч ­
подвижната фаза
н о с т върху т в ъ р д н о с и т е л (въглеводород или
силиконово производно, нанесени върху зрън­
ца о т силициев guokcug), а п о д в и ж н а т а фаза
е и н е р т е н газ ( а з о т , аргон, хелий и др.). В
Компонент В
з а в и с и м о с т о т т о в а се различават газово-
а д с о р б ц и о и п а и г а з о в о - т е ч п о с т н а хро-
Компонент А л г а т о г р а ф и я , а м е х а н и з м и т е на разделя­

ш: Нанасяне на
сместа А + В
не са адсорбционен и разпределителен. Смес­
т а за разделяне се въвежда в п о т о к а на газа-
/старт/ н о с и т е л и под ф о р м а т а н а пари се насочва
к ъ м а н а л и т и ч н а т а колона, заредена с непод­
в и ж н а фаза. Обикновено разделянето се из­
вършва при т е м п е р а т у р а до 350 0С, к о е т о
Вана, съдържаща подвижната фаза означава, че газово-хроматографският ана­
Фиг. 14.4. Т ъ н к о с д о й н о - х р о м а т о г р а ф с к о разде­ л и з по п р и н ц и п е п р и л о ж и м салю при ниско­
ляне н а д б у к о м п о н е н т н а смес молекулни, летливи и термостабилни ор­
а - р а з с т о я н и е о т с т а р т а до ц е н т ъ р а н а п е т н о А
р а з с т о я н и е о т с т а р т а до ц е н т ъ р а н а п е т н о В
ганични вещества. След разделянето, отдел­
с - р а з с т о я н и е о т с т а р т а до ф р о н т а н а п о д в и ж н а т а фаза н и т е к о м п о н е н т и с п о т о к а на г а з а - н о с и т е л
А с"' Ш В = с - се п р е н а с я т в д е т е к т о р - н а й - ч е с т о пламъ-
298
кобо-йонизационен, е л е к т р о н н о - з а х б а т е н и
азот-фосфор селективен. Условия за абсо­
л ю т н а специфичност и идентификация оси­
гурява м а с - с п е к т р о м с т р и ч п а т а д е -
т с к ц и л , но т я е с ограничено приложение
поради в и с о к а т а а п а р а т н а с е б е с т о й н о с т .
Фигура 14.5 п р е д с т а в я п р и н ц и п н о т о ус­
т р о й с т в о на а п а р а т з а газова х р о м а т о г р а -
фия.
д; Инжектор Детектор
Пишещ
уред
Колона
Термостат
Фиг. 14.5. Блок-схема на газов хроматограф
При В и с о к о е ф е к т и в н а т а т е ч н а хро-
м а т о г р а ф и я - BETX {High Performance
Liquid Chromatography - HPLC) п о д в и ж н а т а
фаза е т е ч н о с т (обикновено смес о т вода и
органични р а з т в о р и т е л и ) , а н е п о д в и ж н а т а
фаза е т в ъ р д а , т е ч н о с т върху т в ъ р д носи­
т е л (най-често 8- или 18-атомен въглеводо­
род, свързан к о в а л е н т н о з а с и л и к а т е н носи­
т е л ) или гел, заредена в колона. В зависимост
о т с ъ ч е т а н и е т о н а д в е т е фази м о г а т да се
прилагат нормалнофазов и обратнофазов ва­
риант н а елуиране и всички м е х а н и з м и н а
разделяне. Подходяща е з а анализ на всякак-
Зи по р а з м е р о р г а н и ч н и и н е о р г а н и ч н и
молекули, при з н а ч и т е л н о по-меки и лесно-
изпълними условия в сравнение с г а з о в а т а
кроматография - с т а й н а т е м п е р а т у р а ,
Подвижна фаза
Неподвижна фаза
Твърд н о с и т е л
К
Пишещ ]
Урея J
Фиг. 14.6. Блок-схема на а п а р а т у р а за БЕТХ
спекшрофотометрична (най-често в у л т р а ­
в и о л е т о в а т а област) и по-рядко флуоресцен­
т н а и електрохимична д е т е к ц и я .
Е д и н с т в е н о т о принципно различие меж-
ду т р а д и ц и о н н а т а т е ч н а хроматография и
ВЕТХ се о т н а с я до размера н а ч а с т и ц и т е
за напълване н а а н а л и т и ч н а т а колона. При
ВЕТХ се използват пълнежи с много по-мал­
ки размери - о т 3 до 10 | д т в д и а м е т ъ р , и
т а к а се п о с т и г а ч у в с т в и т е л н о увеличава­
не н а с к о р о с т т а и е ф е к т и в н о с т т а на раз­
делянето. Преминаването н а п о д в и ж н а т а
фаза през п л ъ т н о п а к е т и р а н а с т а к и в а мал­
ки ч а с т и ц и колона, изисква налягане о т 10
до 50 МРа (до 400 а т м . ) , к о е т о се п о с т и г а
със специална помпа. Па фиг. 14.6 е показа­
но принципното у с т р о й с т в о н а а п а р а т за
ВЕТХ.
ОСНОВНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ
НА РАЗДЕЛЯНЕТО В ЕАУЕНТЕН РЕЖИМ
Елуешпнаша колонна х р о м а т о г р а ф и я
е най-често използвания в а р и а н т н а хрома-
т о г р а ф с к и я анализ в клиничната лаборато­
рия. При нея с м е с т а за разделяне се въвеж­
да в малък обем в н а ч а л о т о н а к о л о н ата,
през последната се пропуска непрекъснат
п о т о к о т подвижна фаза, к о й т о след напус­
кане н а к о л о н а т а п о с т ъ п в а в д е т е к т о р .
Д е т е к т о р ъ т измерва някакво физико-хи-
мично свойство на е л у е н т а и под ф о р м а т а
н а електричен сигнал го предава за р е г и с т ­
рация. Графичният еквивалент на този сиг­
н а л се нарича хроматограма. Хролгатог-
р а л г а т а с е с ъ с т о и о т базоИа л и н и я ,
о т р а з я в а щ а с в о й с т в а т а н а п о д вник­
н ат а ф а з а и с е р и я о т пикове, съот­
ветстващи н а зоните о т подвткна-
т а фаза, к о и т о съдържат отделните
к о л т о н е н т и . Фигура 14.7 п р е д с т а в я фа­
з и т е н а разделителния процес в елуентен
режим.
Всяко елуирано вещество {всеки пик) се
характеризира със с ъ о т в е т е н обем (V) и вре­
ме (Rt) на задържане, височина (h) и площ (S)
н а пика. О б е м ъ т (врельето) н а з а д ъ р Ж а -
н е е ваЖна качествена характеристи­
к а н а с ъ о т в е т н о т о с ъ е д и н е н и е и с е из­
ползва з а неговата идентификация.
При сравняване на р е з у л т а т и о т различни
лаборатории се използва о т н о ш е н и е т о меж-
299
 Колона Детектор
Старт
- i i
0 ml
VI-VQ
k, - Vo
1+2
1 ml
v„0
Ж*Ж
2+1 K2 = V
' 2. - V n V,

2 ml Vo

i
3 ml w,

t a= VI-VQ
4 ml v 2 -v 0
i
z: 5 ml w,

t N = 5.54 I v,
6 ml v W1/2 ;
Ф и г . 14.7. Фази на разпределителния процес и запис на хроматограма на двукомпонентна смес
V0 - мъртъв обем, мъртво време на колоната
V, и Уг - обеми на задържане (ml), времена на задържане (sec), с ъ о т в е т н о на пикове 1 и 2
W, и Wa - ширини на пикове 1 и 2 в основата, W1/2 - полуширина на с ъ о т в е т н и я пик
К,, К2 - капацитетен фактор на съответния пик; а - коефициент на селективност

ду елуационния обем на дадено съединение се р е а л и з и р а т по дължина н а к о л о н а т а .

(V) и м ъ р т в и я обем н а с и с т е м а т а (Vo), на­
речено к а п а ц и т е т е н ф а к т о р (К). В и с о ч и ­
н а т а и п л о щ т а н а п и к а с а в а Ж н и ко­
личествени х а р а к т е р и с т и к и н а съот­
ветния колгпонент и с е и з п о л з в а т к а ­
т о льярка з а и з ч и с л я в а н е н а търсени­
т е концентрации.
За характеризиране к а ч е с т в а т а н а една
хроматографска колона и н е й н а т а пригод­
н о с т з а с ъ о т в е т н и анализи се и з п о л з в а т
п о к а з а т е л и т е с е л е к т и в н о с т и е ф е к т ив­
ност. С е л е к т и в н о с т т а о т р а з я в а степен­
та на разделяне, к о я т о се п о с т и г а при ед­
нократно разпределяне на в е щ е с т в а т а меж­
ду п о д в и ж н а т а и н е п о д в и ж н а т а ф а з а .
Коефициентът на селективност (а) е прак­
тическа мярка на селективността при раз­
деляне на две вещества и се представя като
отношение на техните капацитетни фак­
тори. Е ф е к т и в н о с т т а н а хроматографска-
т а колона о т р а з я в а с п о с о б н о с т т а з а кон­
центриране н а дадено, подлежащо н а разде­
ляне вещество и получаването му к а т о доб­
ре оформен, остър пик на тясна основа в за­
писаната хроматограма. Тя зависи о т броя
(N) на разпределителните а к т о в е н а веще­
с т в о т о между д в е т е фази, к о и т о м о г а т д а
300
ПОДГОТОВКА
НА БИОЛОГИЧНИЯ МАТЕРИАЛ
ЗА ХРОМАТОГРАФСКИ АНАЛИЗ
Биологичните м а т е р и а л и са т в ъ р д е разно­
родни и сложни по с ъ с т а в за д и р е к т н о въ­
веждане в х р о м а т о г р а ф с к а т а с и с т е м а . За­
т о в а х р о м а т о г р а ф с к и я т анализ започва с
предварителна о б р а б о т к а н а пробите, коя- r
т о цели извличане на представляващите
интерес компоненти, пречистване на из­
влека и концентрация на пречистения про­
дукт. Така се п о с т и г а предварително уве­
личаване на чувствителността и специ­
фичността на изследването и налгаляване
на интерференцията от сродни по физико-
хилгично поведение съставки на биологичния
матрикс. Нал и чи ето н а т о з и предварите­
лен е т а п е необходимо за п о ч т и всички ТСХ^
FX и ВЕТХ процедури в к л и н и ч н а т а лабора­
т о р и я и ч е с т о се сочи за т е х е н н е д о с т а т ъ к .
Рационалното му решаване определя в зна­
ч и т е л н а с т е п е н н а д е ж д н о с т т а и пригод­
н о с т т а н а даден м е т о д з а ежедневна серий­
на работа.
 Класическо средство з а о б р а б о т к а н а про­
б а т а преди х р о м а т о г р а ф с к о т о разделяне е
т е ч н о - т е ч н а п г а е к с т р а к ц и я . При н е я
към биологичния м а т е р и а л (водна фаза) се
прибавя несмесващ се с вода органичен раз­
т в о р и т е л (напр. хексан, е т е р , дихлорметан)
и при с ъ о т в е т н о подходящо рИ, последва­
щ о т о разклащане осигурява преминаване на
т ъ р с е н и т е к о м п о н е н т и о т в о д н а т а в ор­
г а н и ч н а т а фаза. П о - н а т а т ъ к о р г а н и ч н а т а
фаза може да се пречиства, ф и л т р и р а и обез­
воднява, а и з п а р я в а н е т о ü до сух о с т а т ъ к
и последващото му р а з т в а р я н е в по-малък
обем осигурява к о н и е н т р а и и я н а с м е с т а за
анализ. Класическите екстракиионни проие-
дури са трудоемки, продължителни и свър­
зани с проблеми при о т д е л я н е на в о д н а т а
о т о р г а н и ч н а т а фаза. Тези основни
н е д о с т а т ъ и и се преодоляват с прилагане­
т о н а по-нови подходи з а п р ед вар и тел н а
обработка на пробите преди анализ - колон­
н о извличане, о б е з б е л т ъ ч а В а щ и проце-
9УР и 6 с ъ ч е т а н и е е о р г а н и ч н о - ф а з о б о
р а з д е л я н е и др. с висока с т е п е н н а робо-
т и з а ц и я . Възможно е и д и р е к т н о въвежда­
не н а биологични т е ч н о с т и за анализ в хро-
м а т о г р а ф с к а т а с и с т е м а , но прилагането
на т о з и подход е все още ограничено по спек­
т ъ р , н е с т а н д а р т и з и р а н о и изисква скъпи
допълнителни м а т е р и а л и .

ПРИЛОЖЕНИЕ
НЛ ХРОМАТОГРЛФСКИТЕ МЕТОДИ
В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ

Х р о м а т о г р а ф с к и т е м е т о д и и з и с к в а т спе­ брой вродени веществообменни заболявания

циално оборудване, к о н с у м а т и в и и високо­ и изясняване на метаболитния профил на ня­
квалифициран персонал, поради к о е т о въ­ кои широко разпространени, социално значи­
веждането им в к л и н и ч н а т а лаборатория се м и болести като захарен диабет, атеро­
прецизира в н и м а т е л н о и предпазливо при склероза, хипертонична болест и др.
решаване н а по-сложните а н а л и т и ч н и зада­ ВЕТХ е референтен м е т о д за определяне
чи - например изследване н а хормони, в и т а ­ на глюкоза, креатинин, билирубин, пикоч­
мини, л е к а р с т в а , аминокиселини. на киселина, катехоламини и др. В сравне­
ТСХ се прилага н а й - ч е с т о з а анализ на ние с ГХ т я позволява по-гъвкав преход о т
CLHUHokaceAUHu, пептидно картиране на хе- един към друг м е т о д , по-бърз анализ, по-лес­
моглобинови м о л е к у л н и варианти, леци- н а подготовка на п р о б и те за хроматограф-
тин/сфингомиелиново отношение за ранна ско разделяне и по-широк с п е к т ъ р на прило­
диагноза на респираторния дистрес синд­ жение. Чрез ВЕТХ м о г а т да се анализират
ром и като екранираща и потвърдителна п о ч т и всички органични и неорганични със­
процедура в аналитичната токсикология. т а в к и на биологичните м а т е р и а л и - лекар­
ГХ е референтен м е т о д за анализ на инди­ ства, аминокиселини, въглехидрати, порфи-
видуални мастни киселини, органични кисе­ рини, витамини, жлъчни киселини, ендорфи-
лини, лекарствени средства и пестициди, ни, простаноиди, индивидуални белтъци (в
биогенни амини, простаноиди, ацетон и ал­ т. ч. гликиран хемоглобин), ну1слеинови ки­
кохоли - етилов, метилов, изопропилов и др. селини, микроелементи и др. Тя е основно
Въвежданите о т 6 0 - т е години системни ана­ средство за лабораторията по лекарствен
литични ходове за м е т а б о л и т н о профилира­ мониторинг и клинична токсикология.
не чрез ГХ, доведоха до разкриване на голям

КНИГОПИС

Станчев П. Гаюво-хроматографски анализ на биологични ма-
I тсриали, С , БАН, 1985, 249.
Bender GT. Liquid c h r o m a t o g r a p h y . In: Principles o f c h e m i c a l
instrumentation. Philadelphia, W 13 S o u n d e r s C o m p a n y , 1987,
173-194.
Bnwcrs L D . C h r o m a t o g r a p h y . In: T e x t b o o k o f clinical c h e m i s ­
try. Philadelphia, W В S o u n d e r s C o m p a n y , 1986, 135-143.
B o w e r s LD, Ultman M D , Burtis C A . Chromatography. In Tietz
N (ed). T e x t b o o k o f clinical chemistry. Philadelphia, W В
S o u n d e r s C o m p a n y , 1994, 206-255.
Chattoraj SC. G a s chromatography. In: Textbook o f clinical c t i c r " -
istry. Philadelphia, W В Sounders Company, 1986, 149-158.
Poklis A , I x h r e r M. Liquid chromatography (Chapter 6), G a s
c h r o m a t o g r a p h y (chapter 7), M a s s spectometry (chapter 8).
In- Clinical chemistry, 1996, 150-166, 167-184.
301
 Микроскопия
М. П е н е в
П. Д ук о в а - П е н е в а
Микроскопът е един о т най-разпростране­
н и т е оптически уреди, к о й т о намира при­
ложение във всички области на н а у к а т а . В
клиничната лаборатория микроскопът се
използва в д и а г н о с т и ч н а т а р а б о т а , учебна­
т а дейност и н а у ч н и т е изследвания.
За оптимално и дълготрайно използване
в ъ з м о ж н о с т и т е н а микроскопа са необхо­
дими познания по г е о м е т р и ч н а о п т и к а ,
строго спазване п р а в и л а т а за юс т и ровка и
наблюдение с микроскопа, поддържане и съх­
ранение на уреда в зависимост о т клима­
т и ч н и т е и м е с т н и т е условия.
П р а в и л н а т а к о м п л е к т а ц и я и изправ­
н о с т т а на микроскопа в з н а ч и т е л н а с т е ­
пен о т р а з я в а о т н о ш е н и е т о на изследовате­
ля към м и к р о с к о п и я т а и р а б о т а т а му в
л а б о р а т о р и я т а и е предпоставка за пред­
пазване н а о ч и т е о т о т с т р а н и м и нефизио-
логични въздействия при използването н а
микроскопа.
М и к р о с к о п ъ т , о т гръцки - micros (ма­
лък) и scopien (наблюдавам), е о п т и ч е с к и
уред, предназначен за получаване н а увели­
чени образи н а малки о б е к т и , невидими с
просто (невъоръжено) око.
Исторически бележки. Galileo Galilei (1564 - 1642) е
конструирал един о т п ъ р в и т е светлинни мик­
роскопи. Холандецът Antonie van Leeuwenhoek
през 1674 г е използвал за първи п ъ т микроскоп за
изучаване на биологични обекти, к а т о е наблю­
давал бактерии с д и а м е т ъ р 2-3 ц т . Joseph Lister
В Англия през 1830 г е извел т е о р е т и ч н и т е
принципи, въз основа на к о и т о е с т а н а л о възмож­
но да се к о н с т р у и р а т лещи, свободни о т хрома­
т и ч н а и сферична аберация.
Микроскопът е получил качествено ново разви­
т и е през в т о р а т а половина на 19 век в р е з у л т а т
на р а б о т и т е на E m s t Abbe в Йена. През 1872 г. Е.
Abbe е изчислил а х р о м а т и ч н и т е и апохроматич-
н и т е обективи и е определил т я х н а т а макси­
мална разделителна способност.
През 20-те години на 20 век се появиха п ъ р в и т е
данни, че за оптически цели е възможно да се
302
използват п о т о ц и о т ускорени електрони вмес­
т о светлинни лъчи. Създаденият на т а з и база
електронен микроскоп и м а многократно по-го­
ляма разделителна способност о т светлинния.
О к о т о предствлява оптическа с и с т е м а ,
к о я т о п р о е к т и р а изображението н а наблю­
д а в а н и т е п р е д м е т и върху р е т и н а т а . Невъ
о р ъ ж е н о т о око може д а различи о т д е л н и
д е т а й л и в наблюдавания о б е к т само в слу­
чай, че ъ г ъ л ъ т между л ъ ч и т е , к о и т о и д в а т
в о к о т о о т к р а й н и т е т о ч к и н а д е т а й л а не
е по-малък о т определена с т о й н о с т . Тази
с т о й н о с т се нарича зрителна острота. З а
нормално, е м е т р о п н о око, при д о с т а т ъ ч н а
о с в е т е н о с т н а наблюдавания о б е к т и голя­
м а к о н т р а с т н о с т н а д е т а й л и т е му, мак­
с и м а л н а т а з р и т е л н а о с т р о т а е Е = Г. Сред­
н а т а з р и т е л н а о с т р о т а без н а п р е г н а т о
внимание е в г р а н и ц и т е 2,< е <4'. При разс­
т о я н и е н а най-добро виждане з а нормално
око, к о е т о условно приемаме за D = 250 m m
и з р и т е л н а о с т р о т а е = 2', о к о т о може д а
различи д е т а й л и не по-малки о т 0.15 mm.
Ако е необходимо д а се н а б л ю д а в а т по-мал­
ки о б е к т и , се и з п о л з в а т с р е д с т в а за увели­
чаване ъгъла н а зрение. Такива с р е д с т в а са
л у п и т е и микроскопите.
ГЕОМЕТРИЧНА ОПТИКА
Р а з д е л ъ т о т о п т и к а т а , в к о й т о светлина­
т а се разглежда к а т о снопове о т лъчи, к а т о
се п р е н е б р е г в а т в ъ л н о в и т е ü свойства, се
нарича геометрична оптика. Л ъ ч означава
т в ъ р д е т е с е н с в е т л и н е н сноп, ч и е т о сече­
ние е пренебрежимо малко в сравнение с раз­
м е р и т е н а лещи, образи и т . н . Лъчите, по
к о и т о се р а з п р о с т р а н я в а л ъ ч и с т а т а енер­
гия, се о з н а ч а в а т к а т о геометрични линии.
Г е о м е т р и ч н а т а о п т и к а е изградена върху
няколко основни закона, у с т а н о в е н и о п и т -
HO.
Законът за праволинейното разпростра­
нение н а с в е т л и н а т а гласи, ч е В х о м о г е н ­
н а cpecja с В е т л и н а т а с е р а з п р о с т р а н я ­
ва п р а В о л и н е й н о .
Съгласно закона за в з а и м н а т а незави­
симост на лъчите, т е п р и с В о е т о р а з п ­
ространение не си пречат, н и т о си
Влияят Взаимно.
Законът за о б р а т и м о с т т а н а п ъ т я н а
светлината гласи, ч е хос^ът н а л ъ ч и т е
н е заВиси о т т я х н а т а посока, н а п р .
при пречупВане п а д а щ и я т и пречупе­
н и я т лъч Винаги м о г а т 9 а с е р а з м е н я т
ecjuii с яруг.
На г р а н и ц а т а между две среди, в к о и т о
с в е т л и н а т а се р а з п р о с т р а н я в а с различни
скорости, с в е т л и н н и т е лъчи се о т р а з я в а т
и пречупват. З а к о н и т е з а о т р е и к е п и е и
п р е ч у п в а н е н а с в е т л и н а т а се опреде­
л я т по следния начин:
1. П а д а щ и я т , о т р а з е н и я т и п р е ч у п е н и я т
лъч и н о р м а л а т а к ъ м о т р а з я в а щ а т а по­
върхност в т о ч к а т а на падането, л е ж а т
в една равнина.
2. Ъ г ъ л ъ т на о т р а ж е н и е т о а1 е равен н а ъгъ­
ла н а п а д а н е т о а .
3. О т н о ш е н и е т о н а с и н у с и т е о т ъгъла н а
п а д а н е т о и ъгъла н а п р е ч у п в а н е т о е пос­
т о я н н а величина, равна н а о т н о ш е н и е т о
на скоростите на с в е т л и н а т а в д в е т е
среди и се нарича о т н о с и т е л е н коефици­
е н т на пречупване н а в т о р а т а среда спря­
мо п ъ р в а т а :
п2, - s ' n a - с '
sinß Сг
К о е ф и ц и е н т ъ т н а пречупване н а една
среда спрямо вакуум се нарича абсолютен
коефициент н а пречупване на т а з и среда (N).
К о г а т о а б с о л ю т н и т е коефициенти N! и N2
н а две среди са извест н и , о т н о с и т е л н и я т
коефициент п ^ н а в т о р а т а спрямо п ъ р в а т а
е равен н а т я х н о т о о т н о ш е н и е :
п„ = —
N2- , о т .к о е т о слепва
„ —
N—
2 = ———,
s i n a или
"21 м
N, Nj sinß
Nj.sina = N2.sinß
Произведението о т абсолютния коефици­
е н т на пречупване и синуса о т ъгъла на пре­
чупване в една среда, се нарича числена апер-
т у р а н а л ъ ч а спрямо н о р м а л а т а в т о ч к а ­
т а н а пречупването.
С ф е р и ч н и о г л е д а л а . Сферичните огледа­
ла п р е д с т а в л я в а т ч а с т о т сфера. К о г а т о
огледалото о т р а з я в а л ъ ч и т е с вдлъбната си
повърхност, т о се нарича вдлъбнато огле­
дало. К о г а т о ги о т р а з я в а с и з п ъ к н а л а т а си
повърхност, огледалото е изпъкнало.
Оптична о с н а огледалото се нарича пра­
в а т а , к о я т о съединява върха на огледалото
с ц е н т ъ р а на сферата, ч а с т о т к о я т о е
огледалната повърхност, фокус{¥) н а вдлъб­
н а т о т о огледало е т о ч к а т а , в к о я т о се пре­
с и ч а т о т р а ж е н и я т а н а всички лъчи, успо­
редни на о п т и ч н а т а ос и разположени бли­
зо до нея. ф о к у с ъ т лежи в с р е д а т а н а о т ­
с е ч к а т а , ограничена о т ц е н т ъ р а на сфера­
т а и върха н а огледалото:
Р а з с т о я н и е т о о т фокуса (F) до върха на ог­
ледалото се нарича фокусно разстояние (f).
С ф е р и ч н и л е щ и . Сферична леща се нарича
всяка хомогенна среда, ограничена о т две
сферични повърхности и поставена във в т о ­
р а среда, о п т и ч н о нееднакво п л ъ т н а с пър­
в а т а . Л е щ и т е б и в а т изпъкнали и вдлъбна­
ти.
П р а в а т а , к о я т о съединява ц е н т р о в е т е на
сферичните повърхности, се нарича оптич­
н а ос на лещата. Лъчите, успоредни на оп­
т и ч н а т а ос и много близки до нея, след пре­
чупване се п р е с и ч а т в една т о ч к а , наречена
фокус на лещата. К о г а т о през една леща се
пропусне успореден сноп лъчи, след преми­
н а в а н е т о му, т о й се променя в конверген-
т е н или д и в е р г е н т е н . С ъо б р азн о т о в а
явление, л е щ и т е се д е л я т на две групи - съ­
бирателни и разсейвателни. Събирателни­
т е се п о д р а з д е л я т н а д в о й н о и з п ъ к н а л и ,
п л о с к о и з п ъ к н а л и и вдлъбнатоизпъкнали.
Р а з с е й в а т е л н и т е също с а т р и подвида -
двойновдлъбнати, плосковдлъбнати и изпък-
наловдлъбнати.
Р е ц и п р о ч н а т а с т о й н о с т н а фокусното
р а з с т о я н и е се нарича оптична (пречупва-
телна) сила на л е щ а т а и се измерва в диоп­
т р и (D), к о г а т о f е в м е т р и :
Л у п а . Л у п а т а е н а й - п р о с т о т о оптическо
средство за увеличение. С ъсто и се ош една
303
или няколко изпъкнали лещи. С п р о с т а т а
лупа, к о я т о се с ъ с т о и о т една двойноизпък-
нала или плоскоизпъкнала леща, м о г а т да се
получат увеличения до 5-6 х. Тази лупа оба­
че притежава всички н е д о с т а т ъ и и н а лещи­
т е - сферична и х р о м а т и ч н а абераиия, изк­
ривяване р а в н и н а т а на образа, дисторзия,
а с т и г м а т и з ъ м , кома. З а т о в а , при по-голе­
ми изисквания и спеииално за получаване н а
по-големи увеличения, се и з п о л з в а т лупи,
съставени о т две или повече лещи, к о е т о
съставлява оптическа с и с т е м а . В зависи­
м о с т о т т о в а , кои о т н е д о с т а т ъ ц и т е н а
лещите са коригирани в по-голяма с т е п е н ,
лупите се н а р и ч а т апланатачни, ахрома-
тачни и т . н . С т а к и в а лупи може да се по­
лучи увеличение на образа до 25-30 х, т . е .
толкова п ъ т и се увеличава ъ г ъ л ъ т на зре­
ние и се дава възможност о к о т о да различа­
ва точки, к о и т о о т с т о я т н а по-малко о т
0.01 m m една о т друга. Фокусното р а з с т о ­
яние на използваните в п р а к т и к а т а лупи е
о т 10 m m до 100 mm. О б е к т ъ т за наблюде­
ние се п о с т а в я в п р е д н а т а фокална равни­
на на л у п а т а , през к о я т о се получава прав,
недействителен увеличен образ на о б е к т а ,
о т с т о я щ на 250 m m о т окот о. Увеличение­
т о на л у п а т а се определя по ф о р м у л а т а :
D - разстояние на най-добро виждане
f - фокусното разстояние на си с т е мат а
Увеличението на л у п а т а зависи не само
о т размера н а фокусното р а з с т о я н и е , но
Фиг. 15.1. Схема на оптическата система на микроскопа
и
Si Ч р а б о т н и р а з с т о я н и я на о б е к т и в а , в с ъ о т в е т с т в и е с о т н о ш е н и е т о
J 1__ 1 ъ
5; ~ | f| '
304
също о т р а з с т о я н и е т о между о к о т о и зад­
ния фокус, и о т а к о м о д а ц и я т а на окото. Лко
се приеме, че р а з д е л и т е л н а т а способност
н а о к о т о е Dt, т о р а з д е л и т е л н а т а способ­
н о с т н а с и с т е м а т а лупа-око е:
D - разстояние на най-добро виждане
е - разделителна способност на окото
М - увеличение на лупата
МИКРОСКОП
УСТРОЙСТВО И СЪСТАВНИ ЧАСТИ
РАЗДЕЛИТЕЛНА СПОСОБНОСТ
И УВЕЛИЧЕНИЕ
М и к р о с к о п ъ т м о ж е д а се определи к а т о
сложна лупа, с п о м о щ т а н а к о я т о се п о с т и ­
г а з н а ч и т е л н о по-голямо увеличение о т
л у п а т а и с ъ о т в е т н о - по-голяма разделител­
н а способност. Увеличението при микроско­
п а се о с ъ щ е с т в я в а н а два е т а п а (фиг. 15.1):
н а първия е т а п - о т о б е к т и в а (намира се
близо до о б е к т а з а наблюдение), н а в т о р и я -
о т о к у л я р а ( н а м и р а се близо до о к о т о ) .
О б е к т и в ъ т и окулярът в с х е м а т а са
означени условно к а т о единични лещи. Реал­
но т е п р е д с т а в л я в а т повече или по-малко
сложни о п т и ч е с к и с и с т е м и . Наблюдавани­
я т о б е к т (1) се п о с т а в я между фокусното и
двойното фокусно р а з с т о я н и е н а о б е к т и в а .
Обективът създава действителен,
увеличен и обърнат образ на обекта (2), к а т о
о б р а з ъ т е р а з п о л о ж е н близо до п р е д н и я
9егпо f
' фокусно р а з с т о я н и е
фокус н а о к у л я р а , м а л к о п о - м а л к о о т
фокусното му разстояние. О к у л я р ъ т дейс­
т в а к а т о лупа. Образът създаден от обек­
тива е обект за окуляра. О к у л я р ъ т дава
прав, недействителен и увеличен образ {?>),
разположен спрямо о к о т о н а изследователя
между р а з с т о я н и е т о на най-добро виждане
D = 250 mm и безкрайност. В р е з у л т а т мик­
р о с к о п ъ т дава в ъ з м о ж н о с т за разглеждане
на образа н а наблюдавания о б е к т под много
по-голям ъгъл в сравнение с невъоръжено око,
к а т о наблюдаваният образ е обърнат по от­
ношение на обекта.
Микроскопът се с ъ с т о и о т т р и с и с т е ­
ми (фиг. 15.2):
• механична,
• оптическа,
• осветителна.
Механична с и с т е м а н а м и к р о с к о п а
Това е м е х а н и ч н и я т носител на оптическа­
т а и о с в е т и т е л н а т а с и с т е м и на микрос­
копа. С ъ с т о и се о т с т а т и в , к о й т о в горна­
т а си ч а с т се нарича т у б у с о д ъ р Ж а т с л .
Към т у б у с о д ъ р ж а т е л я се прикрепва т у б у -
сът. Тубусът бива монокулярен и биноку-
лярен. С ъ щ е с т в у в а т микроскопски с и с т е ­
ми за учебни иели и с повече изводи за наб­
людение. Тубусът може да има различна дъл­
жина, но най-често е 160 mm. В ъ т р е ш н а т а
му повърхност е п о к р и т а с черна боя, коя­
т о не бива да се нарушава. При бинокуляр-
н и т е тубуси, е д и н и я т о т т я х е снабден с
п р ъ с т е н за променяне на фокусното разс­
т о я н и е . П р ъ с т е н ъ т се използва при ю с т и -
р а н е т о на микроскопа за постигане на оп­
т и м а л н о бинокуларно виждане. Д в а т а т у -

oGpai в ретимгиа

окуляр

реален образ

револвер
недействителен
образ
обеюмви

лостче на нрнсовата
мремара ю в о л ш е л диафрагма

винтове та центриране
внит па комлемюра на кондешора

макровимт

ммкровии r контроли на
осветлението

вградено
осветително тяло

основа
ф и г . 15.2. С в е т л и н е н микроскоп
305
буса могат да се приближават и отдалеча­
в а т един о т друг до желаното о т изследо­
вателя междузенично разстояние. Под т у -
буса, към с т а т и в а е прикрепен револверът
с обективите. Към с т а т и в а е монтирана
масичката с препаратоводител. В съвре­
менните микроскопи масичката има най-
ч е с т о квадратна форма. Движението на
препаратоводителя се осъществява о т
винт с възможности за две перпендикуляр­
ни една спрямо друга посоки на движение.
Това дава възможност за оглеждане на 360°,
т . е . на всички точки о т изследвания препа­
р а т . Масичката е снабдена с два нониуса,
разположени перпендикулярно един към
друг. С т я х н а помощ е възможно локализи­
ране на наблюдавана точка о т препарата
при повторно наблюдение. Плавността на
придвижването на препарата с препарато­
водителя е по-важна характеристика о т
скоростта на т о в а движение.
В долната ч а с т на с т а т и в а на съвремен­
н и т е микроскопи се намират м а к р о в и л -
т ъ т и лткровинтъгги С помощта на мак-
ровинта се осъществява бързото и прибли­
зително придвижване на обектива към и о т
препарата за наблюдение. В п о - с т а р и т е
системи микроскопи подвижна ч а с т за т о в а
движение нагоре-надолу е т у б у с ъ т с револ­
вера с обективите. Тази конструкция има
неудобството, че при монтиране на фотог­
рафска система на микроскопа, добавената
т е ж е с т се предава на з ъ б ч а т а т а с и с т е м а
на макровинта и т о в а затруднява фокуси­
рането на обекта. Макровинтът трябва да
позволява леко, но не много лесно движение
при завъртането му. Ако макровинтът се
движи трудно, т о в а означава, че е з а т е г н а т
и трябва да се разхлаби. Разхлабването се
извършва, к а т о с лявата ръка се фиксира
левия макровинт и с дясната се завърта дес­
н и я т макровинт против хода на часовни­
ковата стрелка. В случай, че макровинтът
се движи т в ъ р д е лесно и о б е к т и в и т е
произволно се приближават (или отдалеча­
ват) спрямо препарата, макровинтът се
затяга с движение по хода на часовникова­
т а стрелка. С микровинта се постига до­
пълнително движение на обектива към обек­
т а до възможно най-ясно виждане.
В долния си край с т а т и в ъ т е свързан с
основата на микроскопа.Основата има фор­
ма и плоскости, които осигуряват стабил­
306
но положение на микроскопа при работа. Е
съвременните микроскопи светлинниягг
източник е монтиран в основата. В основа­
т а са вградени също плоско огледало за пре­
насочване на с в е т л и н а т а о т светлинния
източник към кондензора и обекта, ирисо-
ва диафрагма, наричана полева диафрагма
и м а т о в филтър. Със шарнирно лостче т о з и
филтър може да бъде поставян в хода на
светлинния лъч, ко йто идва о т източника
на светлина или да се о т с т р а н я в а о т него.
Оптическа с и с т е м а н а микроскопа
О б е к т и в и . Обективът е най-сложният и
важен елемент в о п т и ч е с к а т а система на
микроскопа. Възможностите на микроско­
па зависят в най-голяма с т е п е н о т качест­
в а т а на обектива. Микроскопите се изпол­
з в а т в много и различни видове дейности и
т о в а обуславя с ъ з д а в а н е т о на различни
типове обективи. Обективите м о г а т да се
характеризират по няколко критерия:
1. Степен на компенсиране аберациите на
лещите,
2. Дължина на т у б у с а на микроскопа,
3. Свойството имерсия,
4. Особености на механичното и оптическо
у с т р о й с т в о на обектива.
В зависимост о т с т о й н о с т и т е на увели­
ч е н и е т о (N) и ч и с л е н а т а а п е р т у р а (А),,
обективите условно се д е л я т на обективи с
малко увеличение и числена апертура-N<lü y
А<0.2, със средни - N<40, А<0.65 и с голямо
увеличение и числена а п е р т у р а - N > 40,
А >0.65.
Обективите за микроскопи се изграждат
о т няколко лещи, чиито брой в някои о т т я х
достига 10. Челната леща дава увеличение­
т о на обектива. Разположените зад нея
лещи са предназначени за коригиране абера­
ц и и т е на лещите. Главните недостатъци,
които се проявяват особено силно при лещи
с голяма сила на пречупване, са сферичната
и хроматичната аберация, и изкривяване­
то равнината на образа. По-малко влияние
оказват кома, астигматизъм идисторзия.
В зависимост о т с т е п е н т а на коригиране
на аберациите о б е к т и в и т е се д ел ят на две
големи групи - ахромати и апохромати. При
ахроматите сферичната аберация е кори- |
гирана за жълтозелен ц в я т - в т а з и област
(X = 556 п т ) човешкото око има най-висока
чувствителност, а х р о м а т и ч н а т а аберация
е коригирана за два ц в я т а - син и червен. При
а п о х р о м а т и т е с ф е р и ч н а т а аберация е
коригирана за син и червен ц в я т , хроматич­
н а т а - за син, жълтозелен и червен ц в я т ,
т . е . х р о м а т и ч н а т а аберация практически
е о т с т р а н е н а в ц я л а т а видима о б л а с т .
Корекцията на изкривяването равнината
н а образа н а о б е к т и в а се о з н а ч а в а с
представката план - напр. планахромати
и планапохромати. П л а н о б е к т и в и т е с а
подходящи за визуално наблюдение, и особе­
но за микрофотография.
При наблюдение на прозрачни обекти се
използват обективи за преминаваща с в е т ­
лина. К о г а т о наблюдаваният о б е к т е не­
прозрачен (и с в е т л и н а т а се о т р а з я в а ) се
използват обективи за падаща светлина. И
к л и н и ч н а т а лабораторил обикновено
се работи с обективи з а прелтнаваща
светлина.
Обективите, при к о и т о наблюдението се
извършва през въздух, между наблюдавания
о б е к т и обектива, се н а р и ч а т „сухи,, обек­
тиви. Обективите, к о и т о са пригодени за
наблюдение с имерсионни т е ч н о с т и се на­
р и ч а т имерсионни. Върху в ъ н ш н а т а обвив­
ка на обектива са означени основните му
характеристики - степен на увеличение в
пъти, числена апертура, дължината н а
тубуса и пределната дебелина на покрив­
ното стъкло на препарата. Имерсионните
обективи н о с я т означението HI (Homogen
Immersion) и ц в е т е н кръг (черен или друг
ц в я т , в зависимост о т п р и е т и я о т фирма­
т а производител начин) за отбелязване на
имерсионния обектив. Всички големи и ня­
кои средни обективи и м а т вградена буфе-
рираща пружинка за омекотяване на натис­
ка към п р е д м е т н о т о стъкло при непредпаз­
ливо приближаване на обектива към обекта.
Някои о т имерсионните обективи и м а т
вградена ирисова диафрагма, с ч и я т о помощ
може да се променя числената а п е р т у р а на
обектива.
Окуляри. В микроскопията се използват
различни по с в о я т а конструкция окуляри;
окуляри на Huygens, на Kölner, компенсаци­
онни, ортоскопични, панкратични, интер-
ферентни и др. В микроскопите, предназна­
чени за изследване на биологически обекти.
най-често се използват окулярите на Хюй-
генс. Те са приложими за обективи ахрома-
т и . С ъ с т о я т се о т две плоскоизпъкнали
лещи - колекторна и очна, обърнати с из­
пъкналата си с т р а н а към обектива. Пред­
н и я т фокус на ц я л а т а система се намира
между лещите, к о е т о е характерна особе­
н о с т на окулярите о т т о з и т и п . Предназ­
начението на колекторната леща е да кон­
центрира повече лъчи, които и д в а т о т обек­
т и в а . О ч н а т а леща е д е й с т в и т е л н и я т оку­
ляр. Тя създава увеличен и недействителен
образ на образа, създаден о т обектива. Във
фокалната си равнина по-голяма ч а с т о т
окулярите и м а т вътрешен пръстен, върху
който може да се постави окулярмикроме-
т ъ р или бленда за ограничаване на зрител­
н о т о поле.
С о б е к т и в и т е апохромати, планобекти­
в и т е и обективи ахромати с голямо увели­
чение, се използват компенсационни окуля­
ри. Те коригират хроматизма, получен при
увеличенията с т е з и видове обективи, при
к о и т о ч а с т о т аберацията о с т а в а некори-
гирана. На въ н шн ата повърхност на окуля­
ра е означена с т е п е н т а на увеличение в
п ъ т и и в ъ з м о ж н о с т т а за компенсация, ако
окулярът е компенсационен. Освен това, на
по-голяма ч а с т о т окулярите е означен ко­
ефициента на окуляра (окулярно число), кой­
т о обикновено е заграден с кръгче. Коефи­
ц и е н т ъ т на окуляра умножен по увеличени­
е т о на окуляра (Nok), дава размера на при­
видния диаметър на зрителното поле в mm.
Например при коефициент на окуляра 15.5 и
Nük = 10, привидният диаметър на зрител­
н о т о поле е 155 mm. Коефициентът на оку­
ляра разделен на увеличението на обектива
No6 дава действителния диаметър на наб­
людаваното зрително поле о т обекта в mm
(напр. 15.5:100 = 0.155 mm).
ОсВетитслпа система
н а микроскопа
О г л е д а л о . Огледалото се използва при мик­
роскопи с външно осветление - слънце, с т р а ­
нично разположена електрическа лампа, за
да препрати светлинните лъчи 6 кондензо-
ра, с ъ о т в е т н о до обекта за наблюдение. То
има две повърхности - плоска и вдлъбната.
При микроскопи с кондензор се използва плос-
307
ката повърхност на огледалото. Вдлъбната­
т а п о в ъ р х н о с т се използва с а м о ако
микроскопът няма кондензор, с цел огледа­
лото да концентрира светлинните лъчи в
равнината на обекта вместо кондензора.
К о н д е н з о р . Кондензорът е предназначен за
осветяване на наблюдавания препарат. С
известно приближение, т о й може да се срав­
ни с обърнат обектив. Състои се о т две или
т р и лещи с голяма пречупвателна сила. С
помощта на кондензора светлината о т из­
точника се концентрира върху малка площ
на обекта. За т а з и цел предната фокална
равнина на високоапертурните кондензори
трябва да е разположена в равнината на
обекта или в непосредствена близост до нея.
Това се постига лесно чрез преместване на
кондензора по височина.
Кондензорите се характеризират с чис­
лена апертура Ak и корекции на аберации.
Числената апертура най-често е о т 0.8 до
1.4. Хроматичната аберация обикновено е
коригирана за жълтозелен цвят. В такъв
случай кондензорът се означава к а т о ахро-
матичен. Всеки кондензор има вградена ири-
сова диафрагма с променяем диаметър, на­
ричана апертурна диафрагма. С нея се ре­
гулира ширината на светлинния сноп и чис­
лената апертура на кондензора. При свива­
не на диафрагмата а п е р т у р а т а намалява.
Най-добри условия за наблюдение се съз­
дават, когато числените апертури на обек­
тива и на кондензора са равни. Лко аперту­
р а т а на кондензора е по-малка, разделител­
н а т а способност на обектива не се използ­
ва напълно. При по-голяма числена аперту­
ра на кондензора, обратно, обективът не
използва ч а с т о т светлината, която е пре­
минала през кондензора, и ще бъде осветена
само ц ент р алнат а ч а с т о т з р и т е л н о т о
поле. В такива случаи числената апертура
се регулира с а п е р т у р н а т а диафрагма на
кондензора или с придвижване на целия кон­
дензор по хода на о п т и ч н а т а ос.
1 1 а н к р а т и ч е н к о н д е н з о р . Кондензорът с
панкратична система дава възможност за
плавна промяна на числената му апертура
6 границите о т 0.16 до 1.4 за постигане на
точно с ъ о т в е т с т в и е с числената аперту­
ра на използвания обектив.
308
Методи за осВстлепие
Преобладаващата ч а с т о т о б е к т и т е , кои­
т о се изследват с микроскоп не с в е т я т са­
мостоятелно. За да б ъ д а т наблюдавани, т е
трябва да б ъ д а т осветявани о т страничен
източник на светлина. Осветлението на
микроскопа има изключително значение за
получаване на качествен, равномерно осве­
т е н и к о н т р а с т е н образ на наблюдавания
обект. О б е к т и т е за микроскопско изследва­
не биват прозрачни или непрозрачни. Проз­
рачните се изследват с осветителна систе­
ма с преминаваща светлина. При непрозрач­
н и т е се използва осветителна система с
падаща върху о б е к т а и отразена о т него
светлина.
В зависимост о т начина на осветяване
на обекта, м е т о д и т е за наблюдение с мик­
роскоп се д е л я т на две групи - наблюдение в
светло поле и наблюдение в тъмно поле.
Осветяването по м е т о д а на светло поле се
осъществява о т лъчи, които след излизане­
т о си о т о с в е т и т е л н а т а система, преми­
нават през прозрачния о б ект (преминава­
ща светлина), или се о т р а з я в а т о т повърх­
н о с т т а на непрозрачния о б е к т (отразена
светлина), след к о е т о по законите на гео­
м е т р и ч н а т а оптика попадат в обектива и
създават образ на по-малко прозрачните
части на обекта във вид на т ъ м н и участъ­
ци на светъл фон. Когато по п ъ т я на с в е т ­
лината няма о б е к т , з р и т е л н о т о поле на
микроскопа е осветено равномерно.
Тъмно поле се създава, когато в обекти­
ва не попада пряка светлина, а само разсея­
ни (дифузно отразени) о т обекта лъчи. Това
се постига със специален кондензор за т ъ м ­
но поле. Получава се картина, която изглеж­
да противоположна на наблюдаваната при
светло поле - п о в ъ р х н о с т т а на обекта е
повече или по-малко т ъ м н а , с ярко освете­
ни отделни детайли в нея. Поради въздейс­
т в и е т о на к о н т р а с т а , подробностите в
обекта се различават по-добре, отколкото
при осветление по м е т о д а на светло поле,
I юдходящи за наблюдение с м е т о д а на т ъ м ­
но поле са например точковидни обекти,
размерите на които са сравними с дължи­
н а т а на светлинната вълна. Микроскопът
с т ъ м н о поле се нарича ултрамикроскоп.
Названието не означава, че микроскопът
притежава по-голяма разделителна способ-
н о с т , a nopagu в ъ з м о ж н о с т т а c него ga ce
в и д я т неоцветени д е т а й л и , к о и т о са неви­
дими с микроскопа със с в е т л о поле.
Източници на сВетлииа
на микроскопа
Основните изисквания към и з т о ч н и ц и т е н а
с в е т л и н а на микроскопите с а следните:
1. Я р к о с т н а с в е т л и н н и я и з т о ч н и к ,
2. С т а б и л н о с т н а с в е т л и н н и я п о т о к ,
3. Коефициент н а полезно действие, к о й т о
характеризира величината на светлинния
п о т о к спрямо и з р а з х о д в а н а т а е л е к т р и ­
ческа енергия,
4. С п е к т р а л н а х а р а к т е р и с т и к а на излъчва­
н а т а светлина,
5. Продължителност на ж и в о т а на светлин­
ния из т очник,
6. Форма и размери на светлинния източник.
К а т о източници н а с в е т л и н а на микрос­
к о п и т е се и з п о л з в а т главно два т и п а елек­
трически лампи - л а м п а с нажежаваща се
м е т а лна нишка и газоразрядни лампи. В
първия т и п се прилага нагряване на м е т а л ­
н а т а нишка о т преминаващия електричес­
ки т о к , к а т о при високи т е м п е р а т у р и ниш­
к а т а излъчва св етлин а. З а п р и г о т в я н е на
н и ш к а т а н а й - ч е с т о се използва волфрам,
т ъ й к а т о т о з и м е т а л и м а най-висока т о ч ­
ка н а т о п е н е - 33870С и н и ш к а т а може да
бъде загрявана до 2400оС, без да се размеква.
Волфрамовата нишка се п о с т а в я в с т ъ к л е ­
н а колба, к о я т о съдържа разреден до наля­
гане няколко т о р а и н е р т е н или благороден
газ. Р а з р е д е н и я т газ намалява с к о р о с т т а
на изпаряване н а волфрама и с т о в а се удъл­
ж а в а д ъ л г о т р а й н о с т т а на л а м п а т а . Лам­
п и т е с н а ж е ж а в а щ а се нишка, к о и т о съдър­
ж а т халоген п о з в о л я в а т нагряване до по-
високи т е м п е р а т у р и и с т о в а до получава­
не на по-голяма я р к о с т спрямо л а м п и т е с
разреден газ. Излъчването н а л а м п и т е с на­
жежаваща се нишка е с н е п р е к ъ с н а т спек­
т ъ р , с максимум към л ъ ч и т е с по-голяма
дължина на в ъ л н а т а в сравнение с дневна­
т а светлина о т слънцето и небето.
С в е т е н е т о н а г а з о р а з р я д н и т е лампи се
основава на излъчването н а газове или пари
на м е т а л , к о и т о в ъ з н и к в а т под д е й с т в и е
н а преминаващ през т я х електрически т о к .
За разлика о т л а м п и т е с нажежаваща се
м е т а л н а нишка, газоразрядните и м а т зна­
ч и т е л н о по-висок к о е ф и ц и е н т н а полезно
действие, в р е з у л т а т н а к о е т о се получава
по-голяма я р к о с т при една и съща мощност.
Г а з о р а з р я д н и т е лампи обикновено д а в а т
лъчение с предимно линеен с п е к т ъ р , харак­
т е р е н за газа или п а р и т е , изпълващи лам­
пата.
В микроскопите се използват живачно-
кварцови и ксенонови газоразрядни лампи
със свръхвисоко налягане. Излъчването на
ж и в а ч н и т е лампи е съсредоточено предим­
но в у л т р а в и о л е т о в а т а и синьовиолетова-
т а о б л а с т н а с п е к т ъ р а , а на ксеноновите -
във в и д и м а т а и инфрачервената област.
У в е л и ч е н и е п а м и к р о с к о п а . Увеличение­
т о н а микроскопа се определя о т отноше­
н и е т о между размера на образа на о б е к т а ,
създаден в р е т и н а т а н а о к о т о при наблю­
дение с микроскоп и размера на образа на
същия о б е к т , получен в р е т и н а т а при наб­
людение с невъоръжено око. Общото увели­
чение на микроскопа е равно на произведе­
н и е т о о т увеличението на обектива (No6) и
увеличението на окуляра (Nok):
N = NO6NOU (1)
Увеличението на о б е к т и в а е:
No6=-7— (2)
об
1 - оптическа дължина на тубуса (тръбата, ко­
я т о съединява обектива с окуляра), или раз­
стоянието между задната фокална равни­
на на обектива и предната фокална равнина
на окуляра,
ГоГ}-фокусното разстояние на обектива
Увеличението на окуляра е;
No^-jP" (3)
'ок
D - разстояние на най-добро виждане, 250 mm
f()k - фокусно разстояние на окуляра
К а т о з а м е с т и м (2) и (3) в уравнение (1) се
получава:
N
=—Цг-
^об^ок
Следователно увеличението на микроско-
309
n a е равно на отношението от произведе­
нието на оптическата дължина на тубуса
и разстоянието на най-добро виждане, към
произведението на фокусните разстояния
на обектива и окуляра.
Когато т у б у с ъ т н а микроскопа има соб­
ствено увеличение NT, о б щ о т о увеличение н а
микроскопа е N = No6 Nok NT.
Разделителна способност н а м и к р о с ­
к о п а . Р а з д е л и т е л н а т а способност н а мик­
роскопа се определя о т с п о с о б н о с т т а му да
дава разделени о б р а з и т е на два съседни еле­
м е н т а о т обекта. О т гледище на г е о м е т ­
р и ч н а т а о п т и к а може да се предполага, че
с микроскопа м о г а т да се п о л у ч а т неогра­
ничено големи увеличения. В д е й с т в и т е л ­
н о с т о т определена с т о й н о с т нагоре се уго­
лемява само размера на образа, к о й т о може
да достигне р а з м е р и т е н а голям екран, но в
образа не се в и ж д а т повече подробности.
Р а з д е л и т е л н а т а способност е ограничена
о т с в е т л и н н а т а дифракция, к о я т о се дължи
на вълновите с в о й с т в а н а с в е т л и н а т а . В
цифрово изражение р а з д е л и т е л н а т а спо­
собност на микроскопа зависи о т дължина­
т а на с в е т л и н а т а X, с к о я т о се извършва
наблюдението и о т величината на числена­
т а а п е р т у р а н а обектива.
При микроскопските обективи е у с т а н о ­
вено, че най-малкото р а з с т о я н и е ö между
две т о ч к и о т о б е к т а , к о и т о все още м о г а т
да се в и ж д а т разделено е:
н а т а на в ъ л н а т а на светлината, с к о я т о
се и з в ъ р ш в а н а б л ю д е н и е т о . Ч и с л е н а т а
а п е р т у р а зависи о т к о е ф и ц и е н т а п и о т
ъгъла ех (фиг 15.ЗБ). Г о л е м и н а т а н а ъгъла а
н а р а с т в а с увеличаване д и а м е т ъ р а н а чел­
н а т а леща н а о б е к т и в а ( к о я т о при всички
обективи е плоскоизпъкнала с полусферич-
н а форма и е о б ъ р н а т а с п л о с к а т а си ч а с т
към о б е к т а ) и с намаляване н а фокусното
р а з с т о я н и е н а о б е к т и в а . Обикновено ъгъ­
л ъ т a д о с т и г а най-много до 70°, при к о й т о
s i n a = 0.94, Увеличаване н а ъгъла над т а з и
с т о й н о с т технически е много т р у д н о .
Ч и с л е н а т а а п е р т у р а може да се увеличи
и чрез н а р а с т в а н е н а п, к а т о п р о с т р а н с т ­
в о т о между п р е п а р а т а и ч е л н а т а леща н а
о б е к т и в а се изпълни със среда с по-голям ! !
коефициент н а пречупване. З а ц е л т а се из­
п о л з в а т т е ч н о с т и , наречени имерсии или
имерсионни т е ч н о с т и . К а т о имерсионни I

6 = 0,61 X
nsina
Х - д ъ л ж и н а т а на в ъ л н а т а
п - коефициент н а пречупване на с р е д а т а , коя­ Фиг. 15.3А. Числена а п е р т у р а , А = n s i n a
т о изпълва п р о с т р а н с т в о т о между ч е л н а т а
леща на обектива и п р е п а р а т а
а - апертурния ъгъл ( ъ г ъ л ъ т между о п т и ч н а т а
ос на обектива и к р а й н и т е лъчи, к о и т о вли­
з а т в него)

Произведението n s i n a = А се нарича чис­

лена а п е р т у р а на обектива (фиг. 15.3А). При­
е т о е р а з д е л и т е л н а т а способност D да се
измерва с реципрочната с т о й н о с т н а ö:

D=
0.61Л.

О т г о р н а т а формула се вижда, че разде­

л и т е л н а т а способност на микроскопа може
да се увеличи, к а т о се увеличава ч и с л е н а т а Фиг. 15.3Б. Ход н а л ъ ч и т е при обективи
а п е р т ура н а обектива и се намалява дължи- е различна а п е р т у р а
310
т е ч н о с т и се използват кедрово масло, гли-
иерин, вода и др. Особено значение сред т я х
и м а т хомогенните имерсии, при които ко-
ефиииентите на пречупване на имерсион-
н а т а т е ч н о с т , на челната леща и на пок­
ривното стъкло са еднакви (напр. за челна
леща о т стъкло с п = 1.515, хомогенна имер-
сия е кедровото масло). На фиг. 15.4 е пока­
зан х о д ъ т на лъчите в сух и в имерсионен
обектив. Колкото по-голямо е увеличението
на един обектив, толкова по-късо е фокус­
н о т о му разстояние. Вследствие на т о в а ,
толкова по-близо до обектива се поставя
о б е к т а по време на наблюдение. Заедно с
т о в а , к о л к о т о по-близо е о б е к т ъ т д о
обектива, толкова по-бързо, с отдалечава­
не в страни о т о п т и ч н а т а ос, н а р а с т в а т
ъглите на падане на лъчите върху челната
леща на обектива. П р о ц е н т ъ т на отразе­
н а т а светлина нараства бързо за с м е т к а
на попадналата в обектива, к а т о след оп­
ределена граница падащите лъчи т ъ р п я т
пълно вътрешно отражение о т гранични­
т е повърхности и се връщат обратно в пре­
парата. Поради т о в а колкото по-голямо е
увеличението на обектива, толкова по-мал­
ка ч а с т о т с в е т л и н а т а прониква в челна­
т а леща. При употреба на имерсия разли­
к и т е между коефициентите на пречупване
и ъглите на падане намаляват, и с ъ о т в е т ­
но намалява п р о ц е н т ъ т на о т р а з е н а т а
светлина. У п о т р е б а т а на имерсия увелича­
ва не само разделителната способност на
микроскопа п п ъ т и ( с т о й н о с т т а на коефи­
ц и е н т а на пречупване на имерсионната
т е ч н о с т ) , но и количеството на премина­
л а т а през обектива светлина, т . е . увелича­
ва се светлосилата на обектива. С т о в а
нараства с в е т л о с т т а на образа, което е о т
особена важност при големите увеличения.
п(,= 1.515
1.0
п,, = 1.515
Фиг. 15.4. Ход на лъчите при сух и при имерсионен обектив
Когато се използват кондензори с числе­
на апертура > 0.9, при наблюдение с имер­
сионен обектив, е полезно да се постави
имерсионна т е ч н о с т не само между покрив­
н о т о стъкло и обектива, но също и между
челната леща на кондензора и долната по­
върхност на предметното стъкло на пре­
парата. С т о в а значително се увеличава
п р о ц е н т ъ т на с в е т л и н а т а , преминала в
препарата, с ъ о т в е т н о - в обектива, т . е .
увеличава се ефективната светлосила на
обектива.
О т с т о й н о с т т а на числената апертура
м о г а т да се изведат още две важни харак­
теристики на обектива - относителният
интезитет на светлината, която може да
премине през обектива и фокусната дълбо­
чина.
О т н о с и т е л н и я т и н т е н з и т е т на преми­
налата светлина е пропорционален на сече­
н и е т о (S) на челната леща на обектива -
S = яг2. Когато средата между челната ле­
ща и покривното стъкло не е въздух, а има
к о е ф и ц и е н т на пречупване п, т о г а в а
S2 = kn 2 sina 2 = кЛ2, където к = я. Следовател­
но о т н о с и т е л н и я т и н т е н з и т е т на свет­
лината, която може да влезе в обектива е
пропорционален на квадрата на числената
му апертура (напр. в обектив с два п ъ т и
по-голяма апертура може да влезе четири
п ъ т и повече светлина).
Фокусната дълбочина представлява дебе­
лината на пласта о т препарата, к о я т о
едновременно се вижда достатъчно ясно. С
увеличаване на числената апертура фокус­
н а т а дълбочина намалява.
Увеличение разделителната способност
на микроскопа, к а т о се използва светлина с
по-малка дължина на вълната, може да се
постигне с помощта на ултравиолетови
= п,, = 1.515
311
лъчи. У п о т р е б а т а на ултравиолетови лъчи
обаче изисква специална (кварцова) о п т и к а ,
к о я т о е прозрачна за т е з и лъчи, к а к т о и
средства за регистриране на невидимия з а
човешкото око ултравиолетов образ, к а т о
напр. фотографски плаки.
Полезно у в е л и ч е н и е н а м и к р о с к о п а . За
оптимално използване ограничената разде­
лителна способност на о б е к т и в а е необхо­
димо да има с ъ о т в е т с т в и е между всички­
т е с и с т е м и на микроскопа. Увеличението
на окуляра т р я б в а да е д о с т а т ъ ч н о голямо
и да е съобразено с р а з д е л и т е л н а т а способ­
н о с т на окото. При м а к с и м а л н а т а ъглова
разделителна способност н а о к о т о о т Г, две
т о ч к и м о г а т да б ъ д а т видяни разделено,
к о г а т о лъчите, к о и т о и д в а т о т т я х сключ­
в а т ъгъл най-малко Г. Въз основа н а т о в а е
изчислено, че за да се използва напълно раз­
д е л и т е л н а т а способност н а о б е к т и в а , е
необходим окуляр с увеличение:
Nok= кА
NОб
Nok" увеличение на окуляра
No6 - увеличение на обектива
А - числена апертура на обектива
к - коефиииент, който има стойност о т 500
до 1000
О т г о р н а т а формула следва N o6 N ok =kA,
т . е . общото полезно увеличение н а микрос­
копа не т р я б в а да надхвърля 500-1000 п ъ т и
с т о й н о с т т а н а ч и с л е н а т а а п е р т у р а . Тази
зависимост се използва за правилен подбор
на окуляра при определен обектив. Напри­
мер при у п о т р е б а н а обектив 40х, А = 0.65,
полезното увеличение н а микроскопа щ е
бъде: 40 х Nok = 0.65 х 500 = 325 до 0.65 х 1000 = 650,
или:
NoU= 3 2 5 = 8.125, с ъ о т в е т н о
40
N
o k = - ^ - = 16.25
40
Следователно, за оптимално използване
разделителната способност на микроскопа
в границите на неговото полезно увеличе­
ние, при р а б о т а с посочения о б е к т и в 40х,
А = 0.65, т р я б в а да се избере окуляр с увели­
чение 8х- 16х. Ако о к у л я р ъ т е с по-малко уве­
личение (No6Nok < 500А), не се използва напъл­
но р а з д е л и т е л н а т а способност н а обекти­
ва и не се в и ж д а т всички детайли, к о и т о
биха могли да се в и д я т в обекта. Ако се из-
312
ползва окуляр с по-голямо увеличение о т из­
ч и с л е н и т е граници (N o6 N ok > 1000А), ще се
получи само по-голям образ, но без повече
подробности в него. Н а п р о т и в , при много
големи увеличения к а ч е с т в о т о н а образа се
влошава поради н а м а л я в а н е н а н е г о в а т а
светлост.
МИКРОСКОИИЯ С ДОПЪЛНИТЕЛНИ
ОПТИЧЕСКИ СРЕДСТВА
Обикновената микроскопия се основава н а
способността на различните участъци на
п р е п а р а т а да а б с о р б и р а т в различна с т е ­
пен с в е т л и н а т а . В п р и р о д а т а с ъ щ е с т в у в а т
редица други физически явления, к о и т о мо­
г а т да б ъ д а т използвани при микроскопия-
т а . С т о в а значително се р а з ш и р я в а т въз­
м о ж н о с т и т е з а получаване н а информация 1
за микросвета.
Mernocj с ф а з о б к о н т р а с т
Обикновенният светл и н ен микроскоп дава j
в ъ з м о ж н о с т да се и зсл ед ват главно к о н т ­
р а с т н и о б е к т и . В к о н т р а с т н и т е прозрач­
ни о б е к т и к о е ф и ц и е н т и т е н а преминаваща­
т а светлина на отделните структурни • 1
е л е м е н т и се р а з л и ч а в а т помежду си. При не­
прозрачните о б е к т и с т р у к т у р н и т е елемен­
т и се р а з л и ч а в а т по п о к а з а т е л я си на о т ­
ражение. Това води до с ъ о т в е т н о изменение
на и н т е н з и в н о с т т а н а с в е т л и н а т а , преми­
нала (или о т р а з е н а ) в различните у ч а с т ъ ц и
н а о б е к т а . По т о з и начин се създава к о н т ­
р а с т е н образ. Единствено образи, в к о и т о
о с в е т е н о с т т а на отделните участъци е
различна, м о г а т да се р е г и с т р и р а т о т око­
т о , о т ф о т о е л е м е н т и други приемници н а
с в е т л и н н о т о излъчване. В графичен смисъл,
п р и е м н и к ъ т н а с в е т л и н н о т о излъчване въз­
приема излъчването само в случай, к о г а т о
с в е т л и н н а т а вълна при преминаването си
през о б е к т а е променила а м п л и т у д а т а си,
придобила е нов а м п л и т у д е н релеф, с ъ о т ­
в е т н о н а а б с о р б ц и о н н а т а способност н а
обекта.
В п р а к т и к а т а ч е с т о се с р е щ а т безцвет­
ни и прозрачни п р е п а р а т и , к о и т о са п о ч т и
невидими при обикновените м е т о д и на мик­
роскопия. О т д е л н и т е у ч а с т ъ ц и в с т р у к т у -
pama на такива препарати се отличават
о т околната среда по показателя на пре­
чупване на светлината. В р е з у л т а т на т о в а
преминаващата през т я х светлина се про­
меня по фаза в размер:
5=-y-(n 0 -n c )h
п0 и пс - показатели на пречупването на обекта
и на средата
h - дебелината на обекта
"к - дължината на вълната на светлината
Светлинната вълна, преминала през пре­
п а р а т а претърпява различни промени по
фаза. Получава се т.нар. фазов релеф. Око­
т о , к а т о приемник на с в е т л и н а т а не е в
състояние да възприеме фазовите промени.
Принципът на м е т о д а фазов к о н т р а с т се
състои в т о в а , фазовите промени на с в е т ­
лината да се превърнат в амплитудни, т . е .
фазовият релеф да се замени с амплитуден
релеф. В р е з у л т а т се получава видим фазо-
воконтрастен образ на обекта, в който раз­
пределението на о с в е т е н о с т т а с ъ о т в е т с ­
т в а до известна с т е п е н на разпределение­
т о на фазите. Това се постига посредст­
вом разделяне на пряката и на дифракти-
р а н а т а светлина и т я х н а т а последваща
интерференция. Когато недифрактирана-
т а светлина изпреварва по фаза с я/2 е на­
лице положителен фазов к о н т р а с т . При по­
ложителен фазов к о н т р а с т о б е к т и т е се
виждат по-тъмни о т фона. Когато дифрак-
т и р а н а т а светлина се забавя по фаза с л / 2
фазовият к о н т р а с т е отрицателен. При
него о б е к т и т е се в и ж д а т по-светли о т
фона.
Практически м е т о д ъ т за фазов к о н т ­
р а с т се осъществява по следния начин. В
предната фокална равнина на кондензора
вместо ирисова диафрагма се поставя пръс­
теновидна диафрагма. Образът на пръсте­
новидната диафрагма се прехвърля о т кон­
дензора и о т обектива близо до задния фо­
кус на обектива. На т о в а м я с т о е поставе­
на пластинка с фазов пръстен. Размерите
на пръстена са еднакви с размерите на об­
раза на пръстеновидната диафрагма на кон­
дензора. По т о з и начин фазовият пръстен
закрива цялата светлина, к о я т о е преми­
нала през препарата. Фазовата пластинка
осъществява промяна във ф а з а т а и ампли­
т у д а т а на нулевия максимум, има опреде­
лена форма и характеристики - коефициент
на преминаване (т)и промяна на фазата (в).
Действието на фазовия пръстен се състои
в поглъщане на значителна ч а с т о т пряко
преминалата светлина, к а т о за ц е л т а в
него е нанесен полупрозрачен метален слой,
както и да премества фа за та на светлин­
н и т е колебания приблизително с я/2. Задни­
я т фокус на средните и силните обективи
е разположен вътре в оптическата систе­
ма, поради което фазовата пластинка се
поставя между лещите на обектива. Зато­
ва за извършване на наблюдение с фазов кон­
т р а с т се използват специални обективи с
фазови пръстени.
Ф а з о в о - к о н т р а с т н а т а микроскопия е
надежден м е т о д за изследване. Разделител­
н а т а способност на микроскоп с фазов кон­
т р а с т практически не се различава о т раз­
д е л и т е л н а т а способност на обикновения
микроскоп. Ч у в с т в и т е л н о с т т а на м е т о д а
е д о с т а т ъ ч н о висока, което се определя о т
минимално установимия к о н т р а с т . Тъй
к а т о о б е к т ъ т не поглъща светлина, т о
цялата светлинна енергия, която премина­
ва през него участва в създаването на обра­
за. Появата на тъмни участъци в образа се
съпровожда с увеличена осветеност в съсед­
н и т е участъци, и обратно. В р е з у л т а т на
т о в а при положителен фазов к о н т р а с т
т ъ м н и т е образи в с т р у к т у р а т а на обекта
са оградени със светли ореоли. При отрица­
телния фазов к о н т р а с т - с в е т л и т е образи
са оградени о т тъмни ореоли. Този недос­
т а т ъ к на м е т о д а може да се ограничи до
известна степен чрез намаляване диаметъ­
ра на фазовия пръстен. Това обаче о т своя
с т р а н а намалява о с в е т е н о с т т а на образа,
което е нежелателно.
Фазово-контрастната микроскопия на­
мира широко приложение при изследване на
нативни препарати о т кръвни клетки, се­
димент на урина, гръбначно-мозъчна т е ч ­
ност, влагалищен секрет, семенна т е ч н о с т ,
стомашно съдържимо.
Поляризационна микроскопия
11оляризациоииапга микроскопия е метод за из­
следване па апизопгроппи обекти, т.е. обекти
при които оптическите свойства в различните
им направления не са еднакви. Анизотропията
313
бива естествена и изкуствена. Познанията за
анизотропията на обекта дават възможност
за изясняване на неговата с т р у к т у р а и н а
физико-химичните м у свойства. Анизотро­
пията се проявява в поляризована светлина.
Принципно поляризационният микроскоп е
подобен на обикновения светлинен микроскоп.
Различава се от него по наличието на поляри-
затор, с помощта на който от естествената
светлина се получава поляризована, и анализа­
тор, чрез който поляризованата светлина се
различава от естествената. Поляризаторът е
поставен под кондензора на микроскопа. Анали­
заторът е разположен между обекта и окуляра.
Светлината от светлинния източник преми­
нава през поляризатора и се превръща в линей­
но поляризована. Тази светлина осветява наб­
людавания обект. Анализаторът е поставен
така, че неговата равнина на поляризация е
кръстосана с равнината на поляризация на по­
ляризатора (т.е. те се завъртат на ъгъл я / 2
един спрямо друг около общата им оптична ос).
При това взаимно разположение и при липса на
обект, или когато обектът е изотропен, поля­
ризованата светлина, получена от поляризато­
ра не може д а премине през анализатора и
зрителното поле остава тъмно. Ако се изслед­
ва анизотропен обект, той променя състояни­
ето на преминаващата поляризована светли­
на и светлината не се погасява напълно при пре­
минаването си през а)1ализатора. В зрително­
то поле анизотропната структура ще се виж­
да светла на тъмен фон.
Поляризационните оптични елементи обик­
новено се изработват от кристален кварц, кал-
цит или слюда.
Изследвания в поляризована светлина се при­
лагат най-често в минералогията, петрографи-
я т а , кристалографията и биологията.
Интерфереитна микроскопия
Интерферентната микроскопия се основава на
разделяне на сноп кохерентни лъчи на два или
повече лъча и повторното им сливане в един, след
като всеки о т т я х е преминал определен п ъ т .
Единият о т лъчите, получен при разделянето,
който преминава през изследвания обект се оз­
начава като работен лъч. Другият лъч преми­
нава през средата в която се намира о б е к т ъ т
и се нарича лъч за сравнение. Фазовите колебания
на двата лъча - падащият върху обекта и върху
средата около него са еднакви. След премиване-
т о си през обекта р а б о т н и я т лъч се забавя по
фаза. Размерът на т о в а забавяне зависи о т по­
казателя на пречупване и дебелината на обек­
т а . По т о з и начин преминалите през препара-
314
т а лъчи получават разлика в хода си и при пов­
т о р н о т о си сливане м о г а т да интерферират.
Човешкото око не е в състояние да установи
получената разлика в хода на лъчите и за визуал­
но наблюдение на о б е к т а е необходимо т а з и
разлика да се превърне в амплитудна. Въз основа
на определяне разликата в хода на лъчите може
да се определи показателя на пречупване на наб­
людавания обект, неговата дебелина и сухото
тегло. В биологията интерферентната микрос­
копия намира широко приложение при измерване
дебелината на клетките, показателя на пречуп­
ване, т е г л о т о и концентрацията на сухото ве­
щество. К а т о се има пред вид, че основната ч а с т
о т сухото вещество в клетките са белтъците, с
помощта на и н т е р ф е р е н т н а т а микроскопия е
възможно да се измери съдържанието на белтъ­
ц и т е в живи и във фиксирани клетки.
Флуоресцентна микроскопия
Свойството на някои вещества да с в е т я т ,
когато се възбуждат при обикновена или не
много висока т е м п е р а т у р а , се нарича луми-
несценция, иди студено светене. Луминес-
ценцията е р е з у л т а т о т прехода на а т о ­
м и т е и молекулите на в е щ е с т в а т а о т по-
високи енергетични нива на по-ниски, при
което се отделя квант енергия. Луминесцен-
ц и я т а предполага предварително възбужда­
не на а т о м и т е и молекулите на вещества­
т а . В зависимост о т начина на възбужда­
не, луминесценцията се дели на няколко
вида:
• фотолуминесценция - луминесценцията
се предизвиква о т светлинни кванти в ул­
т р а в и о л е т о в а т а и видимата област,
• рентгенолуминесценция - луминесценци­
я т а се предизвиква о т рентгенови лъчи,
• радиолуминесценция - възбужда се о т ра­
диоактивно лъчение - сх, ß и у- лъчи,
• електролуминесценция - възбужда се о т
електрично натоварени частици - елект­
рони, йони,
• химилуминесценция - възбужда се о т
енергия, отделена при химически реакции.
В някои случаи луминесценцията продъл­
жава д о к а т о д е й с т в а възбуждането, или
когато луминесценцията е с време на за­
тихване не по-голямо о т 10'8 s. В такива
случаи луминесценцията се нарича флуорес­
ценция. Когато с в е т е н е т о продължава ми-
н у т и , д а ж е часове след к а т о е п р е к р а т е н о
д е й с т в и е т о н а в ъ з б у д и т е л я , се говори з а
фосфоресценция. Дали в е щ е с т в а т а щ е флуо­
р е с ц и р а т или щ е фосфоресцират, зависи о т
механизма н а в ъ з б у ж д а н е т о .
С п е к т ъ р ъ т на флуоресцентното излъчване на
в е щ е с т в а т а и неговият максимум са изместени
към с т р а н а т а на по-дългите светлинни вълни
спрямо спектъра, който го възбужда (закон на
Стокс). Това означава, че в е щ е с т в а т а , к о и т о
абсорбират ултравиолетова светлина м о г а т да
излъчват луминесцентна светлина в ц я л а т а ви­
дима област. О б р а т н о т о е невъзможно - ако аб­
сорбираната светлина е синя, в е щ е с т в а т а не
м о г а т да излъчват виолетова. Законът на Стокс
е граничен - валиден е в определени граници о т
условия. С п е к т ъ р ъ т на флуоресценция о с т а в а
неизменен при различни дължини на възбуждащо­
т о излъчване. Благодарение на т а з и независимост
на флуоресцентния спектър, може да се съди за
е с т е с т в о т о на флуоресциращите вещества.
Важна закономерност при луминесценцията
е отношението между енергията на възбужда­
щ о т о и енергията на луминесцентното лъчение.
Това отношение дава т ъ й нар. луминесцентен
добив (закон на Вавилов).
Луминесцентният добив се изразява и чрез
квантовия добив, който е равен на отношение­
т о между броя на излъчените и броя на погълна­
т и т е кванти.
Отношението между енергията на луминес­
ц е н т н о т о и енергията на възбуждащото лъче­
ние дава енергетичния добив. Съгласно закона на
Вавилов, с увеличение дължината на светлинна­
т а вълна енергетичният добив нараства линей­
но до известен предел, след което добивът рязко
намалява до нула. Смисълът на закона на Вави­
лов е, че за всяко вещество, което луминесцира
при дадени условия, има предел към по-дългите
светлинни вълни, о т които н а т а т ъ к интензив­
н о с т т а на л у м и н е с ц е н т н а т а светлина бързо
намалява. Максимален квантов добив има то га­
ва, когато всички частици, погълнали светлинни
кванти ги излъчват к а т о кванти луминесцент­
на светлина. В т а к ъ в случай к в а н т о в и я т добив е
1, съответно 100%. В много случаи при луминес-
ценция к в а н т о в и я т добив е по-малък о т 1,
съответно о т 100%. Намаляването на добива се
нарича гасене на луминесценцията. Причините
за т о в а са различни.
Самогассис. Наблюдава се при флуоресцира­
щи разтвори. С увеличаване концентрацията н а
разтвореното вещество, отначало се наблюда­
ва засилване на флуоресценцията. След т о в а флу­
оресценцията започва да отслабва и при много
високи концентрации изгасва. Това самогасене
или концентрационно гасене може да се обясни
с предаване на енергията о т възбудените моле­
кули върху невъзбудените молекули о т същото
вещество (Вавилов). Възможно е да съществува
и
друг механизъм за самогасене. С увеличаване
к о н ц е н т р а ц и я т а на разтвора, ч а с т о т луми-
несциращите частици м о г а т да променят със­
т о я н и е т о си - например йоните да се асоциират
в молекули, молекулите - в димери, тримери, по­
лимери, които не луминесцират.
/ асене, предизвикано от наличието на чужди
вещества. Някои вещества, внесени в разтвори
на флуоресциращи вещества предизвикват из-
гасване на флуоресценцията. Механизмът на га­
сене може да бъде различен - поради абсорбция
на флуоресцентното лъчение о т чуждите вещес­
т в а , или в р е з у л т а т на удари между молекулите
на флуоресциращото вещество и гасителя, при
което енергията на възбуждане на едните мо­
лекули се превръща в кинетична енергия на дру­
г и т е молекули.
Температурно гасене. Температурата може
да повлияе луминесцентното лъчение. При по­
вишаване на т е м п е р а т у р а т а , с в е т е н е т о нама­
лява, и при високи т е м п е р а т у р и - няколко с т о -
т и н градуса по Целзий - с в е т е н е т о може да из­
гасне. С понижаване на т е м п е р а т у р а т а луми­
несценцията на някои вещества се засилва.
С п о с о б н о с т т а н а едно в е щ е с т в о д а луми­
несцира, к а к т о и с т е п е н т а н а луминесцен­
ц и я т а з а в и с и о т н е г о в и я а т о м е н или
молекулен с т р о е ж и у с л о в и я т а при к о и т о
се н а м и р а - а г р е г а т н о с ъ с т о я н и е , под фор­
м а т а н а цели молекули, дисоциирани йони,
асоциирани в димери, т р и м е р и , pH н а сре­
д а т а и пр. Редица неорганични и органични
в е щ е с т в а п р и т е ж а в а т първична флуорес­
ценция, т . е . с ъ д ъ р ж а т е с т е с т в е н о флуорес­
ц и р а щ и с т р у к т у р и . И з в е с т н и с а повече о т
20 000 в е щ е с т в а , к о и т о облъчени с у л т р а в и ­
о л е т о в а с в е т л и н а флуоресцират. О т неор­
г а н и ч н и т е вещества първична флуоресцен­
ц и я п р и т е ж а в а т е л е м е н т и т е о т редкозем-
н а т а група - церий, т е р б и й ; ZnS; AgC^. Сред
органичните вещества флуоресцират
предимно т е з и , к о и т о и м а т с п р е г н а т и
двойни връзки, а р о м а т н и карбоциклени и
х е т е р о ц и к л е н и съединения. Б е л т ъ ц и т е , ко­
и т о в л и з а т в с ъ с т а в а н а нуклеопротеини-
т е г у б я т с п о с о б н о с т т а си д а флуоресцират
и о б р а т н о - при р а з г р а ж д а н е н а комплекса,
б е л т ъ ц и т е о т н о в о с в е т я т . Липопротеино-
в и т е комплекси също флуоресцират. Мър­
т в и т е к л е т к и ф л у о р е с ц и р а т силно поради
р а з г р а ж д а н е т о н а к о м п л е к с а нуклеинова
киселипа-белтък и освобождаване флуорес-
315
ценцияггш hü белтъка. Нуклеинобите кисе­
лини, к о и т о силно п о г л ъ щ а т късобълноби-
т е лъчи, о т с л а б в а т флуоресценцията пора­
ди екраниращото си действие. Флуоресци­
р а т багрила, к а т о еозини, флуоресцеини,
родамини; алкалоиди - хинин, стрихнин; ви­
т а м и н и - А, В!, Вг; порфирини; някои а н т и ­
биотици и пр.
Първичната флуоресценция н а биологич­
н и т е обекти обикновено е много слаба. По­
ради т о в а широко приложение н а м и р а т из­
следванията основани на вторична флуорес­
ценция. За ц е л т а се използват силно флуо­
ресциращи в е щ е с т в а - флуорохроми, луми-
нофори, к о и т о о б р а з у в а т комплекси с изс­
ледваните вещества. Възникналата флуо­
ресценция служи к а т о източник за инфор­
мация на процесите п р о т и ч а щ и в молеку­
л и т е на т о з и комплекс. Флуорохромите се
използват в незначителни концентрации и
т е се с в ъ р з в а т с молекулите в к л е т к и т е и
т ъ к а н и т е без да предизвикват промени в
техния състав и структура.
О т гледище на г е о м е т р и ч н а т а о п т и к а
флуоресцентният микроскоп не се о т л и ч а ­
ва о т обикновения с в е т л и н е н микроскоп,
освен по д в а т а допълнителни филтъра. Еди­
н и я т филтъ р се п о с т а в я в о с в е т и т е л н а т а
с и с т е м а на микроскопа и т о й о т д е л я и про­
пуска само в ъ з б у ж д а щ о т о излъчване о т
светлинния източник, к о е т о попада върху
обекта. В т о р и я т ф и л т ъ р се намира в наб­
л ю д а т е л н а т а с и с т е м а н а микроскопа. Пред­
назначението н а т о з и ф и л т ъ р е да задържа
възбуждащата светлина. В р е з у л т а т на
т о в а обектът се виЖда в светлината н а
собствената си предизвикана флуоресцен­
ция.
Е н е р г е т и ч н и я т добив при фотолуминес-
ц и н ц и я т а е малък. Поради т о в а във флуо­
р е с ц е н т н и т е микроскопи се използват мощ­
ни светлинни източници - живачни и ксено-
нови лампи със свръхвисоко налягане, висо-
коапертурни обективи и оптически с и с т е ­
ми с минимални загуби. Специфични за флу­
оресцентните микроскопи са следните изис­
квания:
• взаимно разположение н а ф и л т р и т е , при
к о е т о в з р и т е л н о т о поле да н я м а светли­
на, ако о б е к т ъ т не флуоресцира;
• липса на флуоресценция на п р е д м е т н и т е
и покривните с т ъ к л а , н а в е щ е с т в а т а ,
използвани за слепване н а о п т и ч е с к а т а
316
с и с т е м а , н а имерсионните масла;
• в микроскопите, предназначени за биоло­
гични изследвания, з а предизвикване н а
флуоресценция най-често се използва ул­
т р а в и о л е т о в а светлина. З а т о в а оптичес­
к и т е е л е м е н т и н а т е з и микроскопи се
п р и г о т в я т о т прозрачни з а ултравиоле­
т о в а т а с в е т л и н а м а т е р и а л и - кварц, флу-
орит.
ф л у о р е с ц е н т н и т е м е т о д и за цитологич-
ни изследвания н а м и р а т широко приложе­
ние. С т я х н а помощ м о г а т д а се диференци­
р а т различни кръвни к л е т к и , да се оцени
т я х н а т а в и т а л н о с т , определя се интензив­
н о с т т а н а с и н т е з н а б е л т ъ ц и т е в к л етк и ­
т е , а също и доказване н а бързо пролифери-
ращи к л е т к и по с ъ д ъ р ж а н и е т о н а РНК и пр.
При имунофлуоресцентните м е т о д и се пос­
т и г а висока специфичност, н а б а з а т а н а
р е а к ц и я т а а н т и г е н - а н т и т я л о , к а к т о и кле­
т ъ ч н а т а и т ъ к а н н а т а локализация н а
с т р у к т у р и и процеси.
ЮСТИРОВКЛ И ПОДДЪРЖАНЕ
НА МИКРОСКОПИТЕ
ЮсшироВка н а о б и к н о б е н
светлинен микроскоп
За да се получи ясен и к о н т р а с т е н образ с
микроскопа, н а б л ю д а в а н и я т о б е к т т р я б в а
да бъде о с в е т е н правилно. Технически е не­
приемливо с в е т л и н н и я т и з т о ч н и к да осве­
т я в а д и р е к т н о о б е к т а о т непосредствена
близост. Поради т о в а н а б л ю д а в а н и я т
о б е к т т р я б в а да бъде о с в е т е н о т светли­
н а т а н а образа н а с в е т л и н н и я и з т о ч н и к .
Това се п о с т и г а с п о м о щ т а н а п р а в и л а т а
н а Köhler и п р а к т и ч е с к и означава образът
на светлинния източник д а бъде проециран
и препратен възможно най-ясен и рязко очер­
т а н в р а в н и н а т а на наблюдавания препа­
рат. Ю с т и р о в к а т а н а микроскопа по Köhler
се извършва в с л е д н а т а последователност:
Първи етап. Ц е н т р и р а н е и ф о к у с и р а н е
образа н а Жичката н а електрическа­
т а лалта:
> н а п р е д м е т н а т а масичка се п о с т а в я пре­
п а р а т за наблюдение, включва се един о т
м а л к и т е о б ек ти ви -10х -20х, фокусира се
полето с макро- и микровинта, к а к т о при
 наблюдение
>> о т с т р а н я в а т се о т хода н а с в е т л и н н и я
лъч всички ф и л т р и - м а т о в и и и в е т н и
> з а т в а р я се п о ч т и напълно и р и с о в а т а
полева диафрагма пред о с в е т и т е л н а т а
лампа
> кондензорът (ако м и к р о с к о п ъ т е с кон-
дензор на Abbe) се вдига в горно крайно
положение
>• л е щ а т а н а кондензора се о т с т р а н я в а о т
хода н а с в е т л и н н и я лъч
>• к о н д е н з о р н а т а д и а ф р а г м а се з а т в а р я
п о ч т и напълно
> о с в е т и т е л н а т а л а м п а се придвижва в
г н е з д о т о си напред или назад, д о к а т о
т о ч н о в с р е д а т а н а д о л н а т а повърхност
н а з а т в о р е н а т а кондензорна диафрагма
се о ч е р т а е ясно о б р а з ъ т на ж и ч к а т а .
Втори етап. Ц е н т р и р а н е н а к о н д е н з о ­
ра:
> чрез ограничено по размер придвижване
на кондензора нагоре или надолу, о б р а з ъ т
на и р и с о в а т а полева диафрагма се нагла­
с я в а д а бъде о ч е р т а н възможно рязко.
Този образ, к о й т о е във вид н а кръгче, се
п о с т а в я т о ч н о в ц е н т ъ р а н а зрително­
т о поле с п о м о щ т а н а ц е н т р о в ъ ч н и т е
ключове (щифтове) н а кондензора. Ирисо­
в а т а д и а ф р а г м а н а п о л е т о се о т в а р я
постепеннно, д о к а т о д о с т и г н е граница­
т а на з р и т е л н о т о поле и малко след т о в а .
В т а з и с т е п е н на о т в а р я н е полевата
д и а ф р а г м а се о с т а в я з а наблюдение с
включения о б е к т и в .
В т о р и я т е т а п се п о в т а р я с всеки след­
ващ, по-голям о б е к т и в , вкл. с имерсионния.
Трети етап. Ц е н т р и р а н е и с т е п е н н а
отваряне н а ирисовата (/иафраглш н а
кондензора:
> кондензорната диафрагма се вижда, ко­
г а т о се о т с т р а н и о к у л я р ъ т и се поглед­
не в т у б у с а .
При кондензори, к о и т о с а снабдени с цен-
т р о в ъ ч н и ключове з а к о н д е н з о р н а т а си ди­
а ф р а г м а ( к а к т о е при п а н к р а т и ч н и т е ) с
т я х н а помощ о т в о р ъ т н а д и а ф р а г м а т а се
п о с т а в н я т о ч н о в ц е н т ъ р а н а наблюдава­
н о т о в т у б у с а поле.
За да се получи о п т и м а л н о о с в е т е н образ.
кондензорната диафрагма т р я б в а да бъде
леко притворена, к а т о о т в о р ъ т ü да е около
2/3 о т д и а м е т ъ р а н а полето.
Елекрическата светлина, к о я т о най-чес-
т о се използва при съвременните микрос­
копи ч е с т о е т в ъ р д е силна и бързо изморява
о ч и т е . З а получаване н а равномерно и
недразнещо о ч и т е осветление, се използват
м а т о в и и сини ф и л тр и .
При р а б о т а с бинокулярен микроскоп
т р я б в а да се гледа с д в е т е очи едновремен­
но, к а т о окулярите се р а з п о л а г а т съобраз­
но междузеничното разстояние. Тъй к а т о
рефракционните възможности на д в е т е очи
п о ч т и никога не са еднакви, е необходимо
нагласяване на подвижния п р ъ с т е н на еди­
ния т у б у с т а к а , че д в е т е очи да б ъ д а т пос­
т а в е н и във възможно еднакви условия за
наблюдение. За ц е л т а о к у л я р ъ т н а т у б у с а с
подвижен п р ъ с т е н се о т с т р а н я в а и при
з а т в о р е н о с ъ о т в е т н о око, с д р у г о то око,
през о с т а в е н и я окуляр, се фокусира до най-
добро виждане на наблюдавания обект. След
т о в а о к у л я р ъ т се п о с т а в я о б р а т н о в т у б у ­
са и се о т с т р а н я в а в т о р и я окуляр. Без да се
променя положението на макро- и микровин-
т а , чрез в ъ р т е н е наляво или надясно н а
подвижния п р ъ с т е н н а тубуса, о б р а з ъ т на
наблюдавания о б е к т се довежда до най-доб­
ро възможно виждане за с ъ о т в е т н о т о око
Микроскопското изследване обикновено
започва с о б е к т и в с малко увеличение - 10х
- 20х. Ако е необходимо, след т о в а се използ­
в а т обективи с по-голямо увеличение - 40х
- ЮОх. Ако имерсионният обектив има ири-
сова диафрагма, при обикновена светлинна
микроскопия т я т р я б в а да е отворена мак­
симално. К о г а т о се използват обективи с
малки увеличения и микроскопът е снабден
с обикновен кондензор на Abbe, кондензорът
се п о с т а в я в долно крайно положение и вклю­
чена леща. При р а б о т а с обективи с големи
увеличения, кондензорът се издига с ъ о т в е т ­
но нагоре и л е щ а т а се о т с т р а н я в а . Ако мик­
р о с к о п ъ т има панкратичен кондензор, про­
меня се ч и с л е н а т а а п е р т у р а на кондензора
за да с ъ о т в е т с т в а н а а п е р т у р а т а н а обек­
т и в а , с к о й т о се извършва наблюдението.
317
ЮстироВка на микроскоп
с фазобо-контрастно устройство
Извършват се следните д е й с т в и я :
> микроскопът се ю с т и р а по Kuhler
>• кондензорът се вдига в горно крайно по­
ложение
>• л е щ а т а на кондензора се включва в хода
на л ъ ч и т е
>• включва се зелен ф и л т ъ р н а фазово-конт-
растното устройство
> включва се м а т о в ф и л т ъ р
>• увеличението на револвера н а фазово-кон-
т р а с т н о т о у с т р о й с т в о да с ъ о т в е т с т ­
ва на увеличението н а о б е к т и в а
> н а п р е д м е т н а т а м а с и ч к а се п о с т а в я
о б е к т за наблюдение и се фокусира как­
т о при наблюдение
>• един о т окулярите се заменя със специа­
лен окуляр с подвижна ч а с т ( т ъ й нар.
помощен микроскоп). Посредством про­
меняне в и с о ч и н а т а н а подвижния еле­
м е н т н а помощния микроскоп се фокуси­
р а т к р ъ г ч е т а т а н а о б е к т и в а и н а револ-
в е р н а т а пластинка. К р ъ г ч е т а т а т р я б ­
ва да са с т р о г о концентрично разположе­
ни. Ако не са концентрични, с п о м о щ т а
на д в е т е к л ю ч е т а за променяне положе­
н и е т о н а п л а с т и н к а т а н а револвера,
к р ъ г ч е т а т а се д о в е ж д а т в необходимо­
т о положение.
В т о р и я т окуляр се проверява по същия
начин.
Поддържане и съхранение
на микроскопа
Микроскопът т р я б в а да се п о с т а в и н а со­
лидна маса, к ъ д е т о н я м а вибрации, изпаре­
ние на корозивни вещества, далече о т пря­
ка слънчева светлина. И з с л е д о в а т е л я т да
използва удобен с т о л , съобразен с височина­
т а на м а с а т а и н а микроскопа. П р и п р а -
Вилно с ъ х р а н е н и е и п о д д ъ р ж а н е н а
микроскопа, т о й м о ж е д а бъде използ­
ван В продължение н а няколко д е с е т и ­
летия.
Помещението, к ъ д е т о се р а б о т и с мик­
роскопа или се съхранява, к о г а т о не се из­
ползва, т р я б в а да е светло, сухо, с от н оси­
318
т е л н а в л а ж н о с т н а въздуха по в ъ з м о ж н о с т
по-ниска о т 65% и в никакъв случай за про­
дължителен период о т време - по-висока о т п
70%. В и с о к а т а в л а ж н о с т и л и п с а т а на цир- q
кулация н а въздуха з а с т р а ш а в а т оптичес­
к и т е с и с т е м и н а микроскопа о т р а з в и т и е
н а плесен. Трябва да се има пред вид, че все­
ки оптически прибор е з а с т р а ш е н о т раз­
в и т и е н а плесен при:
• о т н о с и т е л н а в л а ж н о с т н а въздуха над
75% в продължение н а повече о т т р и де­
нонощия,
• съхраняване в т ъ м н о помещение без цир­
кулация н а въздуха,
• наличие н а о т п е ч а т ъ ц и о т п р ъ с т и върху
оптическите системи,
• съхраняване дълго време в дървена к у т и я
или кожен калъф,
• т е м п е р а т у р а н а въздуха превишаваща
обичайната с т а й н а т е м п е р а т у р а .
К о г а т о не се р а б о т и с микроскопа, т о й
винаги т р я б в а да е п о к р и т с въздухонепро-
ницаем калъф з а предпазване о т прах и дру­
ги неблагоприятни въздействия.
Почистване н а оптическите
повърхност и
Почистване на обективи. Ч е л н а т а леща н а
о б е к т и в а може да се п о ч и с т в а с п о м о щ т а
н а ч и с т а и суха въздушна с т р у я , с ч и с т а ,
обезмаслена ч е т ч и ц а , с мека и ч и с т а кърпа
(за да не о т д е л я власинки, к ъ р п а т а предва­
р и т е л н о се изпира), с кърпичка за п о чи ст­
ване н а очила.
И м е р с и о н н а т а т е ч н о с т о т о б е к т и в а се у
о т с т р а н я в а с п о м о щ т а н а ч и с т а кърпа или и
кърпичка за п о ч и с т в а н е н а очила. Органич­
н и т е р а з т в о р и т е л и к а т о бензин, бензол,
ксилол р а з т в а р я т с м о л и т е , с к о и т о са за­
лепени л е щ и т е и при у п о т р е б а за п о чи ст­
ване, м о г а т да у в р е д я т о п т и к а т а н а мик­
роскопа н е о б р а т и м о . Ако и м е р с и о н н а т а
т е ч н о с т е засъхнала и в т в ъ р д е н а върху
обектива, в краен случай, т я се о т с т р а н я ­
ва посредством к р а т к о и з т р и в а н е с навлаж­
нена с ксилол кърпа, незабавно последвано
о т избърсване с друга суха и ч и с т а кърпа.
П о ч и с т в а н е т о н а л е щ и т е т р я б в а да се из­
вършва с напречни, а не с кръгови движения
на р ъ к а т а .
Почистване на окуляри. В ъ н ш н а т а повърх­
н о с т на г о р н а т а леща на окуляра се почис­
т в а с чиста , мека и суха кърпа. Външната
повърхност на в т о р а т а леща, в тубуса, се
почиства с обезмаслена и суха четчица. Ако
в ъ т р е в окуляра е попаднал прах, е д н а т а
леща се развива и п о ч и с т в а н е т о се извърш­
ва с въздушна с т р у я или с четчица. Вместо
т е к с т и л н и т ъ к а н и , посочени по-горе, за
почистване на о п т и ч е с к и т е повърхности
може да се използва специално обработена
кожа о т животни.
КНИГОПИС
Врански В. Медицинска физика. II. С., Наука и Изкуство,
1955.
Карабашев Н, Д и м о в Г, Казанджиев К. Медицинска физика.
С., М е д и физк, 1970.
Йорданов Н, Шейтанов Хр. Физични методи на аналитична­
та химия. С., Техника, 1969.
Пандов X. Основи на микроскопията. В: Каракашов А, Пан-
Кондензорът се почиства к а к т о обектива.
Огледалцето се почиства с кърпа навлажне­
на с етанол.
Никелираните и лакирани части на меха­
н и ч н а т а система на микроскопа т р я б в а да
се п о ч и с т в а т само със суха и ч и с т а кърпа.
Допустимо е да се използва кърпа, навлаж­
нена с т е ч е н парафин и последващо о т с т ­
раняване на парафина със суха кърпа. Не
т р я б в а се използват за почистване на т е з и
повърхности с п и р т , е т е р , ксилол и други
органични разтворители, защото т е лесно
р а з т в а р я т лака.
д о в X (ред). Клинична лаборатория. С., Мед и физк, 1970,
74-91.
Панов ВЛ, Андреев ЛН. Оптика микроскопов. Ленинградс-
кое отделение, Машиностроение. 1970.
Скворцов ГЕ, Панов ВА, Поляков НИ, Федин ЛА. Микрос-
копм. Ленинград, Машиностроение, 1969.
Тягуненко Ю. Микроскопи. Непубликувани записки.
319
 Д и а г н о с т и ч е н ДНК а н а л и з
И. Крельенски
В последните години д и а г н о с т и ч н и я т ДНК
анализ навлезе във всички медицински дис­
циплини, к о е т о п о с т а в и редица сериозни
проблеми о т морално-етично и юридическо
естество. Отчитайки т е з и обстоятелст­
ва и независимо о т използваните аналитич­
ни м е т о д и А м е р и к а н с к а т а асоциация по
клинична лаборатория разграничи лабора­
т о р н и т е изследвания н а две основни групи
- н е - г е н с т и ч н и - микробиология, сероло-
гия, клинична химия, хематология, имуно-
хематология, п а т о л о г и я , радиобиология,
тъканна съвместимост и цитогенетика и
г е н е т и ч н и - молекулна генетика, молекул­
на ц и т о г е н е т и к а и биохимична г е н е т и к а .
Основният критерий за разделяне н а две­
т е групи изследвания се определя о т корен­
но различния х а р а к т е р н а получената о т
т я х информация. Например, в микробиоло­
г и я т а и вирусологията широко се използва
ДНК анализ, но при доказване н а б о л е с т о т -
ворни причинители не се взема и не се изс­
ледва ДНК/РНК н а индивида и не се получа­
ва информация за генетичния му с т а т у с .
В случаите с провеждане н а ДНК анализ в
онко-хематологията се изследват к л е т к и
о т индивида и би могло да се получи инфор­
мация за неговия генетичен с т а т у с . Тех­
нологично с ъ щ и я т к а к т о при негенетични-
т е изследвания ДНК анализ дава коренно
различна информация при г е н е т и ч н и т е из­
следвания. При т я х се получава информа­
ция не само за генетичния с т а т у с н а изс­
ледвания индивид, но и з а г е н е т и ч н и я
с т а т у с н а негови родственици в няколко
поколения, дори в случаите к о г а т о т е не са
изследвани и н я м а в ъ з м о ж н о с т да д а д а т
своето информирано съгласие (малолетни,
починали, не са още родени и т . н . ) Във връз­
ка с т о в а , освен всички изисквания за на­
деждност на р е з у л т а т и т е , пред генетич­
н и т е изследвания бяха поставени допълни­
телни с т р о г и k p u m e p u w . кой може да наз­
320
начава, кой и при каква условия може да
извършва, кои, как и на кого може да съоб­
щава резултатите от генетичните изс­
ледвания.
ОЬЕКТ НА ДИАГНОСТИЧНИЯ
ДНК АНАЛИЗ
В о с н о в а т а н а принципа н а м е т о д и т е з а
диагностичен ДНК анализи с а някои харак­
т е р н и особености н а о б е к т а н а изследване
- молекулата н а ДНК или информационна­
т а РНК (иРНК). ДНК се намира в хромозо-
м и т е (ядрена) и в м и т о х о н д р и и т е
Я д р е н а т а м о л е к у л а н а ДНК е двойнове-
рижна. Всяка верига е изградена о т редува­
щи се о с т а т ъ к о т фосфорна киселина и де-
зоксирибоза (монозахарид). Към всяка дезок-
сирибоза е прикрепена една о т ч е т и р и т е
бази - аденин (А), гуанин (G), ц и т о з и н (С) и
т и м и н (Т). О т д е л н а т а верига се поддържа
о т здрави к о в а л е н т н и връзки, к о е т о прави
молекулата изключително устойчива н а
външни въздействия и съхранима за продъл­
ж и т е л е н период след изолирането й. Това
свойство н а ДНК я прави удобен м а т е р и а л
за анализ и създава в ъ з м о ж н о с т за изолира­
н е т о ü о т сухи п е т н а (кръв, сперма), раз­
лични т ъ к а н и в а у т о п с и о н н и парафинови
блокчета, косъм, мумифицирани т ъ к а н и и
к о с т и с многогодишна д а в н о с т .
Д в о й н а т а верига се образува благодаре­
ние н а с в о й с т в о т о закономерно да се свър­
з в а т със слаби водородни връзки б а з и т е н а
срещуположните вериги (2 между А и Т и 3
при G и С). Това явление се нарича компле-
ментерност н а ДНК веригите. Комплемен-
т е р н о с т т а е в о с н о в а т а н а всички хибри-
дизационни т е х н и к и (образуване н а двойна
верига между две комплементерни вериги,
о т к о и т о е д н а т а е о т друг произход), рее-
п е к т и в н о н а ДНК анализа. Очевидно преоб­
л а д а в а н е т о н а А = Т или G=C в у ч а с т ъ ц и н а
изследваната ДНК п о с л е д о в а т е л н о с т опре­
деля к о н к р е т н и т е а н а л и т и ч н и условия
к а т о : денатурация, хибридизация, синтез,
конформация на Д Н Кмолекулата и т . н . при
един и същ ДНК м е т о д .
Всяка двойновережна молекула човешка
ДНК съдържа над 6.6 милиарда двойки бази.
Това е н а й - г о л я м а т а човешка молекула - дъл­
га над 2 м е т р а . ДНК е опакована с помощ­
т а н а б е л т ъ ц и под ф о р м а т а н а хроматин,
к о й т о по време н а деление н а к л е т к а т а се
организира в 22 ч и ф т а (хомоложни) сома­
т и ч н и и 1 двойка полови хромозоми (X и У).
Б е л т ъ ц и т е (хистонови и нехистонови) са
здраво свързани със специфични м е с т а н а
ДНК и о т с т р а н я в а н е т о им изисква специ­
ални процедури. Особено здрави са взаимо­
д е й с т в и я т а Д Н К / б е л т ъ к в т ъ к а н и , фикси­
рана в парафинови б л о к ч е т а .
По малко о т 10% о т м о л е к у л а т а на ДНК
се заема о т 80 000 - 100 000 гени. Г о л я м а т а
ч а с т о т н е к о д и р а щ а т а (в някои случаи и
к о д и р а щ а т а ) ДНК при човека са м н о г о к р а т ­
но п о в т о р е н и базови п о с л е д о в а т е л н о с т и .
Генът е у ч а с т ъ к о т ДНК (последователност
о т бази), к о й т о кодира една информацион­
н а РНК (иРНК). По големина г е н и т е в а р и р а т
о т 1.5 х и л я д и б а з и при бета-глобиновия
ген ( з а с е г н а т при б е т а - т а л а с е м и я т а ) до 2.4
л г и л и о и а б а з и при д и с т р о ф и н о в и я ген
(мускулна д и с т р о ф и я Дюшен/Бекер). При
е у к а р и о т н и т е (ядрените) организми г е н и т е
съдържат белтък-кодиращи участъци
наречени екзони{Ъ случая с д и с т р о ф и н а - 78
екзона, включващи само 0,6% о т в с и ч к и т е
бази н а гена) и огромни некодиращи
у ч а с т ъ ц и - интрони (понякога съдържащи
други гени). Последните се и з р я з в а т и не
п р и с ъ с т в а т в з р я л а т а иРНК. Кодирането
на една аминокиселина в б е л т ъ ч н а т а
молекула с т а в а с 3 последователни бази {ко-
дон) в е к з о н и т е .
М и т о х о п я р и а л и а т а Д Н К ( м т Д И К ) носи
27 гени, к о и т о не с ъ д ъ р ж а т и н т р о н и . Те
к о д и р а т 13 жизнено важни б е л т ъ ц и (ензи­
ми) на д и х а т е л н и т е вериги. Всяка митохон-
дрия съдържа до 10 копия на двойноверижни
кръгови ДНК молекули. Всяка к л е т к а н а чо­
века съдържа о т 5 000 до 10 000 митохонд-
рии. М и т о х о н д р и а л н а т а Д1Ж е около 0.1%
о т ц я л а т а к л е т ъ ч н а ДНК, к о е т о з а т р у д н я ­
ва изолирането ü за ДНК анализ. Митохон­
д р и а л н а т а ДНК се предава само по майчина
линия ( м и т о х о н д р и и т е н а сперматозоида
о с т а в а т извън о п л о д е н а т а я й ц е к л е т к а ) .
Това я прави много подходяща за популаци-
онни проучвания, идентификация н а родс­
т в е н и индивиди, к а к ъ в т о е случая с иден­
т и ф и ц и р а н е к о с т и т е н а Р у с к о т о царско
с е м е й с т в о през 1995г. ДНК а н а л и з ъ т н а
м т Д Н К се използва за доказване н а извест­
н и т е днес д е с е т к и митохондриални болес­
ти.
СЪЩНОСТ НА ДИАГНОСТИЧНИЯ
ДНК АНААИЗ
Ц е л т а на диагностичния ДНК анализ е о т к ­
риване на маркерни базови последователнос­
т и (секвенции) в молекулата на ДНК. Тези
ДНК генетични маркери условно се разделят
н а две групи; болестотворни м у т а ц и и и
полиморфизми. При човека всички ДНК
маркери са възникнали на б а з а т а на два про­
цеса; рекомбинация по време на половото
деление и м у т а г е н е з а .
Рекомбинация н а хромозоми
Х о м о л о ж н и т е хромозоми о т даден ч и ф т
с ъ д ъ р ж а т едни и същи гени, но поради раз­
личния си произход (по една хромозома о т
всеки родител) и м а т множество различни
базови последователности в едни и същи
локуси (места). По време н а м е й о з а т а (деле­
ние н а п о л о в и т е к л е т к и ) х о м о л о ж н и т е
хромозоми си о б м е н я т у ч а с т ъ ц и о т ДНК и
рекомбинират. В р е з у л т а т на рекомбина-
ц и я т а едни и същи хромозоми са различни в
родителя и п о т о м с т в о т о . Това събитие е
изключително важно при и н т е р п р е т а ц и я ­
т а на р е з у л т а т и т е при т . н . „ и н д и р е к т е н
Д Н К а н а л и # . При него, изследвайки разли­
к и т е (ДНК маркери) е възможно да се разг­
р а н и ч а т и се проследи унаследяването на 2
хомоложни хромозоми в с е м е й с т в о т о . Не
о т ч и т а й к и в ъ з м о ж н о с т т а за рекомбинации
по време на м е й о з а т а м о г а т да се допуснат
груби грешки, т ъ й к а т о два ДНК маркера
м о г а т да се н а м и р а т у родителя на отдел­
ни хомоложни хромозоми, а у п о т о м с т в о т о
на една и съща.
„ У х р о м о з о л г а т а няма хомоложна. При
321
нея не се наблюдава явлението рекомбина-
ция. О т т у к следва, че всички „У" хромозо-
ми при родствено свързани мъже са едни и
същи. Това о б с т о я т е л с т в о широко се изпол­
зва в случаите за идентификация н а инди­
вида, доказване на бащинство и доказване
на родствени връзки между отделни групи
о т популацията.
Мутагенеза
Мутациите к а т о източник
на нормални В а р и а н т и и г е н е т и ч н и
болести
М у т а ц и и т е са стабилни промени в струк­
турата на ДНК. По големина м у т а ц и и т е
м о г а т да о б х в а щ а т о т единични до милио­
ни бази о т молекулата н а ДНК. К о г а т о му­
т а ц и и т е з а с я г а т хромозоми в п о л о в и т е
клетки т е се унаследяват в поколенията.
Много важно е да се отбележи, че м у т а ц и и ­
т е , водещи до промени ( с т р у к т у р а или фун­
кция) в екзоните н а половите к л е т к и са в
основата на еволюцията. О т т у к следва, че
о п и т и т е за генна т е р а п и я чрез корекции на
молекулата н а ДНК в половите к л е т к и по
същество е о п и т за корекции в ч о в е ш к а т а
еволюция с всички последствия о т т о в а .
М у т а ц и и т е в ъ з н и к в а т непрекъснато в ек­
зоните, и н т р о н и т е и извънгенни ДНК базо­
ви п о с л е д о в а т е л н о с т и . В б о л ш и н с т в о т о
случаи м у т а ц и и т е не в о д я т до б о л е с т е н
фенотип (клинична изява) и се н а р и ч а т „не­
утрални". Това са най-вече м у т а ц и и в неко-
диращите у ч а с т ъ ц и и т а к и в а в екзоните,
к о и т о не в о д я т до промяна в смисъла н а
генетичния код (една аминокиселина може
да се кодира о т повече кодони) или промя­
н а т а не засяга ф у н к ц и я т а н а белтъка. Тъй
к а т о м у т а ц и и т е в некодиращите у ч а с т ъ ­
ци в болшинството случаи н я м а т фенотип-
на изява т е не са под влияние н а е с т е с т в е ­
ния подбор и се з а к р е п в а т в поколенията.
1ова ги прави удобен маркер за проследява­
не унаследяването конкретни ДНК фрагмен­
т и (хромозоми) в поколението н а к о н к р е т ­
но семейство - индиректен ДНК анализ.
К а к т о беше отбелязано хромозомите в
с о м а т и ч н и т е к л е т к и са двойни ( о т баща­
т а и о т м а й к а т а ) . Това означава, че всички
м е с т а (включително гените) в хромозоми­
т е са представени в 2 форми. Тези а л т е р н а -
форм11 н а г е н и г е н н
' и и извънгенни
ДНК фрагменти се н а р и ч а т алели. Комби-
322
н а ц и я т а о т двойки алели в един и същ хрс
мозомен локус н а две хомоложни хромозом
се нарича генотип. К о м б и н а ц и я т а о т скг
чени (унаследяващи се заедно) полиморфн
ДНК маркери върху една хромозома се нари !
ча х а п л о т и п . Възникването н а м у т а ц и и т
в дадено м я с т о о т ДНК (хромозомата) ßogi
до п о я в а т а н а различни по с т р у к т у р а алел
ни форми в р а з л и ч н и т е индивиди о т дадеш
популацията. К о г а т о в даден локус една on
ал ел н и те форми се среща по-често о т 1% \
поне в 2% о т п о п у л а ц и я т а локуса е в х е т е
розиготно с ъ с т о я н и е (съдържа 2 различш
алела) м я с т о т о върху х р о м о з о м а т а се на
рича - полиморфно, а о т д е л н и т е алелни фор
ми - полиморфизми. Тъй к а т о в болшинст
в о т о случаи полиморфизмът не води до фе-
н о т и п н а изява т е р м и н ъ т широко се изпол­
зва за означаване н а н е у т р а л н и т е м у т а ц и и п
а т е р м и н ъ т „ м у т а ц и я " е в ъ з п р и е т зг
т р а й н и т е промени в ДНК, к о и т о в о д я т дс (]
ф е н о т и п н а изява.
К о г а т о дадена ДНК последователност е
п р е д с т а в е н а к а т о г е н о т и п с 2 еднакви але­
ла (едно и също м я с т о н а б а щ и н а т а и май­
чина хромозома е с идентичен базов с ъ с т а в )
се говори за хомозиготно с ъ с т о я н и е н а але-
л и т е , а в с л у ч а и т е н а 2 различни алела - за
хетерозиготно с ъ с т о я н и е .
Полиморфнитеместа (полиморфизмите г
полиморфнитемаркери)ca. р а з п р ъ с н а т и по
ц я л а т а дължина н а ДНК в е р и г а т а . З а цели­
т е н а и н д и р е к т н и я ДНК анализ т е и м а т !
диагностична с т о й н о с т само в к о н к р е т н о I
с е м е й с т в о и са информативни (различими)
само в х е т е р о з и г о т н о с ъ с т о я н и е ( д в а т а
алела са различни). Основно полимофните
маркери се р а з д е л я т н а 2 вида:
• R F L P {Restriction f r a g m e n t length
polymorphism)- полиморфизмите в дължина­
т а н а р е с т р и к ц и о н н и т е ф р а г м е н т и са ДНК
маркери, к о и т о се о п р е д е л я т о т наличие­
т о или л и п с а т а н а н е п о с т о я н н о м я с т о
между две п о с т о я н н и м е с т а , к о и т о се раз­
п о з н а в а т о т р е с т р и к т а з и . Последните са
бактериални ендонуклеази (ДНК-ази), к о и т о
р а з к ъ с в а т (хидролизират) двойноверижна-
т а ДНК н а специфични м е с т а , съдържащи
последователност о т 5-6 определени бази.
Такива полиморфни м е с т а се с р е щ а т н а все­
ки 400-500 бази о т м о л е к у л а т а н а ДНК. Тъй
к а т о т е са двуалелни (по един алел н а хомо­
ложни хромозоми) т я х н о т о с ъ с т о я н и е на
х е ш е р о з и г о т н о с т (един алел и м а / другия
н я м а р е с т р и к т а з н о м я с т о ) може да достиг­
не о т 2% до максимално 6 50% о т дадена
популация. Това прави RFLP м а р к е р и т е нис­
ко информативни. Алелните в а р и а н т и н а
RFLP полиморфизмите се д о к а з в а т най-чес-
т о е л е к т р о ф о р е т и ч н о по д ъ л ж и н а т а н а
получените PCR п р о д у к т и след хидролизи-
ране с подходящи р е с т р и к т а з и .
• VNTR (Variable n u m b e r o f t a n d e m
repeats) - високо п о л и м о р ф н и т е т а н д е м н и
п о в т о р и са ДНК маркери, изградени о т раз­
личен брой еднакви или близки по с т р у к т у ­
р а базови последователности (с дължина о т
2 до 100 бази), к о и т о м о г а т да се с р е щ а т в
различен брой копия ( о т 2 до хиляди т а н ­
демни п о в т о р и ) в определено м я с т о (едно-
локусни) или на много м е с т а (многолокусни)
в молекулата н а ДНК. Тези с в о й с т в а на т а н -
д е м н и т е п о в т о р и о п р е д е л я т изключително
в и с о к а т а в ъ з м о ж н о с т з а вариации в конк­
р е т н а популация о т индивиди. Ч е с т о т а т а
н а х е т е р о з и г о т н о с ъ с т о я н и е д о с т и г а до
98% в дадена популация. Особен и н т е р е с
п р е д с т а в л я в а т STR (Short t a n d e m repeats) -
м и к р о с а т е л и т и т е (къси т а н д е м н и п о в т о ­
ри) о т ди-, т р и - и т е т р а н у к л е о т и д н и пов­
т о р и . Те се с р е щ а т в повече о т 50 000 копия
в м о л е к у л а т а н а ч о в е ш к а т а ДНК. Най-чес­
т и о т т я х с а (СА)п п о в т о р и т е . Освен в из-
вънгенните базови последователности мик­
р о с а т е л и т и т е се н а б л ю д а в а т вът рег е н н о.
В някои случаи м у т а н т н о увеличеният им
брой над дадени с т о й н о с т и в определени
гени е причина з а над 15 о т д е л н и заболява­
ния (чуплива X, м и о т о н и ч н а дистрофия, хо-
р е я т а на Х ъ н т и н г т о н и др.)
Р а з л и ч н а т а дължина и конформация н а
ДНК ф р а г м е н т и т е , получени в з а в и с и м о с т
о т наличието на даден полиморфен маркер
позволява л е с н о т о им доказване чрез е л е к т ­
рофореза.
Генетични болести
В о с н о в а т а н а г е н е т и ч н и т е болести са бо-
лестотворните мутации. О т генетични
болести с т р а д а т 5% о т всички новородени
и около 35% о т х о с п и т а л и з и р а н и т е болни
във всички в ъ з р а с т о в и групи. Г е н е т и ч н и т е
б о л е с т и с а т р и големи групи; м о н о г е н н и
(наследствени), полигенни и хромозомни.
Освен н е у т р а л н и т е промени (полимор-
физми) в молекулата н а ДНК се н а м и р а т и
м н о ж е с т в о други промени, к о и т о в о д я т до
болестна ф е н о т и п н а изява. Най-често т е з и
м у т а ц и и възникват в екзоните и регулатор­
н и т е региони на г е н и т е , но т е м о г а т да се
н а м е р я т в и н т р о н и т е и извънгенните
пространства.
М у т а ц и и т е са причина за над 10 000 нас­
л е д с т в е н и моногенни м о л е к у л н и болести
о т к р и т и до 1999 г. За т я х е характерно, че
независимо о т влиянието н а о к о л н а т а сре­
д а ( х е т е р о з и г о т е н н о си тел при автозомно
д о м и н а н т н и т е болести, м ъ ж носител при
Х-свързаните и хомозиготен носител на
б о л е с т н а м у т а ц и я при автозомно-рецесив-
н и т е болести) винаги проявява заболяване­
т о . В ер о я тн о т е з и болести са много пове­
че, к а т о се има предвид, че о ч а к в а н и я т брой
н а г е н и т е при човека е около 100 000. Към
моногенните заболявания с п а д а т около 10%
от м а л и г н е н и т е състояния (рак на гърда­
та, колона и др.).
М у т а ц и и т е са в о с н о в а т а и на т . н . „мул-
тифакторни и или „полигенни" За
т я х е характерно, че н о си тел на м у т а н т -
ни гени е предразположен и в зависимост о т
в л и я н и е т о н а о к о л н а т а среда в различна
с т е п е н е з а с т р а ш е н да развие заболяване­
т о . Към т е з и заболявания с п а д а т болшинс­
т в о т о о т и з в е с т н и т е днес социално-значи-
ми болести к а т о : артериална хипертония,
двете форми на диабет, ранна атеросклеро­
за, болестта на Алцхаймер, шизофрения,
афективните разстройства, 90% от малиг­
нените заболявания, болшинството от вро­
дените малформативни синдроми и др.
ПОДХОДИ ЗА ПРОВЕЖДАНЕ
ПА ДИАГНОСТИЧЕН ДПК АПААИЗ
ПРИ ГЕНЕТИЧНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ
По принцип всички описани ДНК м е т о д и
м о г а т да се използват за генетични и неге-
н е т и ч н и изследвания (болести). Подходите
обаче при д в е т е групи са коренно различе­
ни. Например при н е г е н е т и ч н и т е изследва­
ния подходът винаги е директно т ъ р с е н е
н а м у т а ц и и или полиморфизми.
Ще се спрем по-подробно на ДНК анализа
при г е н е т и ч н и т е изследвания, т ъ й к а т о в
м о м е н т а т о й намира най-широко приложе
ние, а и к а к т о беше отбелязано към гене­
т и ч н и т е изследвания има особени изисква
323

ния и критерии.
Всички ДНК методи, описани по-долу мо­
г а т да се използват за откриване на извес­
т н и увредени гени чрез: директно доказва­
не на болестни мутации в т я х или индирек­
тно - чрез изследване на ДНК полиморфни
маркери (полиморфизми) в гените или око-
логенни скачени (унаследяват се заедно) с
гените.
Д и р е к т е н ( м у т а ц и о н е н ) ДНК а н а л и з
Основно предимство на директния диагнос­
тичен подход е в ъ з м о ж н о с т т а да се докаже
носителство на м у т а ц и я в конкретен
индивид, без необходимостта да б ъ д а т изс­
ледвани други близки родственици. Същес­
твено ограничение на подхода е, че т о й е
приложим само при изследване на известни,
клонирани гени с краен брой мутации, пора­
ди което всяка диагностична ДНК лабора­
тория трябва да има възможност за ком­
бинирано прилагане на директен и индирек­
тен ДНК подход. Д и р е к т н и я т подход в ре­
дица случаи може да се окаже неефективен
поради изключително високия брой и разно­
образие на м у т а ц и и т е при болшинството
заболявания и необходимостта о т използ­
ване на много методи.
Индиректен (полиморфен)
ДНК а н а л и з
При т о з и подход доказването на болестния
ген ( м у т а ц и я т а ) се извършва к а т о в конк­
ретно родословие (често в няколко поколе­
ния на фамилията) се проследява унаследя-
ването на вътрегенни или скачени с гена
ДНК маркери (RFLP, VNTR и STR.). Предилгс-
тво на т о з и вид подход е, че д и а г н о з а в
конкретно с е м е й с т в о люЖе д а с е пос­
т а в и д о р и в с л у ч а и т е , к о г а т о търсе­
н а т а л г у т а ц и я и г е н ъ т н е с а извсст-
ни. Друго предимство на индиректния под­
ход е в и с о к а т а м у ефективност. С изс­
ледването на няколко информативни поли­
морфни маркери се д о с т и г а до решаване
диагностичните проблеми на почти 90% ощ
рисковите семейства. Съществени ограни­
чения на индиректния ДНК анализ са задъл­
жителните условия:
• възможност да се изследва индексния па­
циент (болен),
• възможност да се изследват д о с т а т ъ ч е н
324
брой членове на фамилията,
• изследваните ДНК маркери да са инфо
м а т и в н и (при различните членове на ф
м и л и я т а са в хетерозиготно състоянш
И н д и р е к т н и я т ДНК анализ е силно заг.
руднен при наличието на друг биологиче
баида-
И н д и р е к т н и я т ДНК анализ никога ь
дава 100% надеждност, т ъ й к а т о винаг
съществува риск о т рекомбинация - по вр»
ме на мейоза размяна на м у т а ц и я т а (геш
и маркера между хомоложните хромозом1
Комбинирането на директен и индире!
т е н подход решава диагностичния пробле
в п о ч т и 100% о т българските семейства
бета-таласемия, муковисцидоза, мускулн
дистрофия Дюшен/Бекер (МДД/МДБ), cm
нална мускулна а т р о ф и я (СМА), хемофили
А, болест на Wilson, доминантна бъбречн
поликистоза (ДБП), фенилкетонурия (ФЮу
и т ъ й нар. „Ломска болест".
Важно е да се отбележи, че доказванет
на полиморфни маркери при негенетичн
изследвания (микробиология, вирусология)
принципно директен ДНК анализ.
ОСНОВНИ АНАЛИТИЧНИ Д Н К
МЕТОДИ ЗА ПРОВЕЖДАНЕ
НА ДИРЕКТЕН И ИНДИРЕКТЕН
Д Н К АНАЛИЗ
О т аналитична гледна т о ч к а е изключител
но важно да се отбележи, че изборът на ди
агностичен ДНК подход и методи се опре
деля о т молекулната основа и характерис
т и к а на конкретното заболяване в конкрет
н а т а популация и о т генетичния с т а т у с
на к о н к р е т н о т о семейство:
• в природата съществува огромно разно
образие о т видове м у т а ц и и и полиморфиз
ми. Някои включват големи промени (ми
лиони базови двойки), но по-често се зася
г а т о т 1 до няколко базщ
• м у т а ц и и т е м о г а т да възникват навсякъ
де в молекулата на ДНК, въпреки че съ
щ е с т в у в а т „предпочитани" (горещи) мес
та;
• едно и също заболяване може да се причи
нява о т множество различни по вид му
тации. Например, при муковисцидозапи
са описани над 800 различни мутации, oir
 koumo 28 се н а б л ю д а в а т при българи (11
о т т я х са описани з а първи п ъ т при бъл­
гарски п а ц и е н т и ) ;
независимо о т в ъ з м о ж н и я неограничен
брой, при някои заболявания се наблюдава
преобладаваща м у т а ц и я . Например, при
д е ф е к т а в б е т а - о к и с л е н и е т о н а среднове-
р и ж н и т е м а с т н и киселини (MCAD) при
90% о т б о л н и т е в Европа се наблюдава
една и съща м у т а ц и я . При б ъ л г а р с к и т е
цигани, болни о т м у к о в и с ц и д о з а с е
наблюдава също само една м у т а ц и я
(delF508). При б о л ш и н с т в о т о други забо­
лявания, к а к в о т о е Хемофилия А - при вся­
ко с е м е й с т в о м у т а ц и я т а е различна.
О т и з т ъ к н а т и т е по-горе о б с т о я т е л с т -
а с т а в а очевидно, че п р а к т и ч е с к и не е въз-
ожно с един-единствен ДНК м е т о д да се
т к р и в а т всички м у т а ц и и и да се диагнос-
ш ц и р а т всички болни о т определено забо-
нване. Това налага д и а г н о с т и ч н а т а ДНК
аборатория да разполага с няколко различ-
и м е т о д и з а д и а г н о с т и к а н а едно заболя-
ане и о т к р и в а н е н а една м у т а ц и я .
П о ч т и всички а н а л и т и ч н и т е х н и к и з а
ровеждане н а диагностичен ДНК анализ се
а з и р а т н а с л е д н а т а последователност:
Изолиране н а ДНК/РНК.
Намножаване на определени ДНК фрагмен­
т и с PCR.
Получаване н а двойноверижни комплекси
чрез хибридизиране н а две комплементер-
ни ДНК последователности (вериги), о т
к о и т о е д н а т а е и з в е с т н а ( к а т о секвенция
или че е свързана с болест). В з а в и с и м о с т
о т к о н к р е т н а т а задача, известната ве­
рига (ДНК последователност) се нарича
„сонда" (при Southern или dot blot анализ)
или п р а й м е р ( з а р о д и ш ) п р и PCR или
д и р е к т н о секвениране
Разделяне н а свободните единични вериги
и п о л у ч е н и т е хибридни ДНК молекули
(известна-неизвестна, известна-известна
и неизвестна-неизвестна) най-често чрез
електрофореза (включително капилярна)
или по-рядко с някакъв вид колонна хро-
м а т о г р а ф и я . В з а в и с и м о с т о т белега н а
и з в е с т н а т а ДНК п о с л е д о в а т е л н о с т
к р а й н о т о о т ч и т а н е може да бъде
радиоизотопно, флуоресцентно, л у м и н е с ­
центно, цветна реа кция (най-често със
сребро), мас-спектрометрично и др.
В м о м е н т а всички и з в е с т н и т е х н и к и и
е т а п и на ДНК анализ се п р е д л а г а т н а паза­
р а п о л у а в т о м а т и з и р а н и или напълно а в т о ­
м а т и з и р а н и . На н а с т о я щ и я е т а п а в т о м а ­
т и ч н и т е анализатори са изключително скъ­
пи и са д о с т ъ п н и за ограничен брой лабора­
т о р и и , к а т о се използват за ограничен брой
болести. К а т о аналитичен модел (подава се
м а т е р и а л - получава се р е з у л т а т ) т е не се
о т л и ч а в а т о т т р а д и ц и о н н и т е клинично-
химични анализатори.
Важно е да се отбележи, че с малки изк­
лючения всички ДНК м е т о д и за диагности­
чен ДНК анализ са качествени.
Д и р е к т н о т о Д Н К - с е к в е н и р а н е (опреде­
ляне н а б а з о в а т а последователност) е ре-
ф е р е н т е н м е т о д за о т к р и в а н е н а м у т а ц и и
и полиморфизми, дори в случаите к о г а т о т е
са неизвестни до т о з и м о м е н т . М е т о д ъ т
може да се извършва ръчно на високо вол­
т о в а полиакриламидна електрофореза. За
предпочитане са а в т о м а т и ч н и т е секвена-
т о р и . В зависимост о т с т е п е н т а на а в т о ­
м а т и з а ц и я и к а п а ц и т е т един секвенатор
с т р у в а о т 40 000 до 1 милион DM. Последни­
т е м о г а т да р а б о т я т на принципа на обик­
новена полиакриламидна електрофореза, ка­
пилярна електрофореза или ,ДНК-чипове".
А в т о л г а т и ч н и т е а н а л и з а т о р и н а ба­
з а т а н а Д Н К ч и п о в е са изградени на т р и
основни функционални принципа. П ъ р в и т е
с ъ д ъ р ж а т хиляди различни олигонуклеотид-
ни ДНК сонди (17-22 бази) имобилизирани на
т в ъ р д а м а т р и ц а с миниатюрни размери. На
б а з а т а на хибридизационен анализ т е извър­
ш в а т секвениране. В т о р и я т т и п чипове се
използва за диференциране експресията на
едни и същи гени в различни к л е т к и (напри­
мер, ракови и здрави). Т р е т и я т т и п чипове
са конструирани н а б а з а т а на микрофлуид-
на система, в к о я т о са автоматизирани
всички лабораторни процедури (подава се
м а т е р и а л - получава се р е з у л т а т ) . За диаг­
н о с т и ч н и цели в м о м е н т а се предлагаш
ДНК-чипове о т първия т и п . Те предлагат
т р и възможности за откриване н а м у т а ­
ции: 1. секвениране; 2. изследване н а единич­
н а проба ДНК з а хиляди известни м у т а ц и и
( в а р и а н т на секвениране) и 3. за една извес-
325
т н а м у т а ц и я се изследват хиляди пациен­
ти.
Очевидно в диагностичните лаборатории
горепосочените м е т о д и и технологии и м а т
едно основно ограничение - в н а с т о я щ и я
е т а п т е са приложими преди всичко при „из­
вестни ДНК" последователности и са т в ъ р ­
де скъпи.
Д и р е к т н о т о секвениране е задължителен
п о т в ъ р ж д а в а щ е т а п след изследване с
т . н а р . „сканиращи методи" SSCA, DGGE и
др. (вж. т а б л . 16.1).
S o u t h e r n b l o t а н а л и з ъ т е класическа т е х ­
нология за откриване в смеси о т хиляди (105
до 106) ДНК фрагменти на единични гени или
ч а с т и о т гени независимо о т броя на копи­
я т а им в молекулата на ДНК. П р и н ц и п ъ т
на м е т о д а се изразява в:
изолиране на ДНК
Т или н е р а д и о и з о т о п н о ) олигонуклеотидна
нарязване на огромната молекулата с
подходяща рестриктаза/и на хиляди
двуверижни фрагменти
Т с т и к с о в е т е з а урина) са имобилизирани спе­
електрофоретично разделяне на фрагментите
в зависимост о т дължината им
Т цип е залегнал и в т ъ й нар. ДНК чипове. При
денатуриране на двуверижните фрагменти
до едноверижни
Т закрепени милиони ДПК сонди, к о е т о мул­
пренасяне на едноверижните фрагменти
върху целулозни или найлонови филтри
Т
хибридизиране върху филтрите
с белязана комплементерна
на търсения ДНК фрагмент сонда
Т
визуализиране на получените двойноверижни
хибриди в зависимост о т белега на сондата
(авторадиография, цветна реакция,
флуоресценция или луминисценция).
Southern blot м е т о д ъ т дава т р и вида ин­
формация:
1. присъствие или о т с ъ с т в и е н а даден ген
или ф р а г м е н т о т него;
2. големината н а о т к р и т и я ф р а г м е н т поз­
волява „физично" к а р т и р а н е н а региона
(определяне броя бази между два марке­
ра);
3. доказва броя копия н а о т к р и т и я фраг­
мент.
Анализът има сравнително ограничено
326
приложение в д н е ш н и т е диагностични ла- I
боратории, но о с т а в а незаменим при о т к ­
риване н а големи пренареждания в ДНК. За
диагностични цели днес се прилага при ня­
кои наследствени болести к а т о : Хемофилия
А (инверсии), Миотонична дистрофия и Чуп­
лива Х-хромозома (големи т р и н у к л е о т и д н и
повтори).
Dot хибридизацията е модификация на
Southern Blot, при к о я т о липсва е т а п ъ т н а
е л е к т р о ф о р е з а т а . Поради т о в а т ъ р с е н и я т
ф р а г м е н т се идентифицира к а т о единично
копие (не м о г а т да се р а з г р а н и ч а т броя ко­
пия о т и з с л е д в а н а т а ДПК последовател­
н о с т в случай, че т я е п р е д с т а в е н а в мно­
ж е с т в о копия). Извършва се алелоспецифич-
н а (ASO) хибридизация върху найлонови мем­
брани (вж. т а б л . 16.1). За ц е л т а се накапва в
т о ч к а (dot) предварително амплифицирана
ДНК и предварително белязана (изотопно
ДПК сонда. Па пазара и м а модификации „об­
р а т е н dot blot". Върху л е н т и (подобно н а
цифични олигонуклеотидни сонди, к о и т о се
п о т а п я т в р а з т в о р н а ДПК. С ъ щ и я т прин­
т я х (по аналогия с к о м п ю т ъ р н и т е чипове)
н а ограничено п р о с т р а н с т в о о т 1 cm 2 са
т и п л и ц и р а хиляди п ъ т и изследването. Dot
blot хибридизацията днес широко се използ­
ва за о т к р и в а н е н а и з в е с т н и еднокопийни
ДНК последователности (точкови м у т а ц и и
и полиморфни маркери - STR).
IIо л и л г е р а зн о - в е р и Ж н а т а р е а к ц и я
(PCR) е технология, чрез к о я т о in vitro (в
е п р у в е т к а ) или in situ (върху микроскопски
п р е п а р а т ) се н а м н о ж а в а т (клонират) и н т е ­
ресуващи ни ДПК ф р а г м е н т и . В над 90% о т
случаите PCR е предварителен е т а п за по­
лучаване н а д о с т а т ъ ч н о м а т е р и а л за по­
н а т а т ъ ш н о изследване с различни т е х н и к и
(вж. т а б л . 16.1). В т о з и смисъл ш и р о к а т а
у п о т р е б а н а т е р м и н а „PCR-метод" очевид­
но е н е т о ч н а . PCR по нищо не се о т л и ч а в а
о т и з в е с т н и т е в к л и н и ч н а т а химия ензим­
ни определяния. К а т о субстрат с л у ж а т -
Д Н К м а т р и ц а ( м о ж е в единично копие -
клетка), подходяща двойка праймери (син­
т е з и р а н и 17-21 ДНК базови зародиши) с из-
в е с т н а п о с л е д о в а т е л н о с т , ограничаващи
интересуващия ни ДНК ф р а г м е н т и ч е т и ­
р и т е дезоксинуклеотида (дАТФ, дГТф, дЦТф
и дТТФ). К а т о ензим се използва т е р м о с т а -
билна Taq ДНК полимераза. Н а п а з а р а се
п р е д л а г а т десетки видове Taq полимераза.
В б о л ш и н с т в о т о случаи се п о с т и г а т м н о г о
добри р е з у л т а т и с българската рекомби-
н а н т н а Taq полимераза, която е от 3 до 10
п ъ т и по-евтина.
К а к т о при всяка ензимна реакция и т у к
е необходим подходящ буфер и о п т и м а л н а
к о н ц е н т р а ц и я н а а к т и в а т о р и (в случая
Mg 2 "). Буферите се предлагат заедно с Taq
полимеразата.
Чу в с т в ит елност т а н а PCR е изключи­
т е л н о висока. Теоретич н о о т едно копие н а
ДНК ф р а г м е н т след 25 т р и е т а п н и цикъла
( д е н а т у р а ц и я -»• свързване н а п р а й м е р и т е с
ДНК -> удължаване н а п р а й м е р и т е и с и н т е ­
зиране н а нови ДНК вериги) в р а м к и т е н а 1-
1.5 часа м о г а т д а се п о л у ч а т 1 милион ко­
пия на желан ДНК ф р а г м е н т . О т т у к и мно­
го високия риск о т замърсявания, к о и т о най-
ч е с т о с а о с т а т ъ ц и PCR п р о д у к т и о т
предишни реакции. Това налага винаги изпол­
зване н а с т е р и л н и к о н с у м а т и в и за еднок­
р а т н а употреба и провеждане н а реакиия-
т а в отделна за и е л т а с т а я .
При с т а н д а р т и з и р а н и условия аналитич­
н а т а спеиифичност н а PCR е по-висока о т
и з в е с т н и т е ни при имунологичните и ензим­
н и т е м е т о д и . В и с о к а т а специфичност се
определя о т всички описани по-горе пара­
м е т р и н а р е а к ц и я т а . Особено решаващи са:
б а з о в о т о съдържание н а ДНК м а т р и ц а т а
(CG б о г а т и т е м а т р и ц и з а т р у д н я в а т PCR)
и подбора на п р а й м е р и т е . Той се извършва
по л и т е р а т у р н и д а н н и или в специални
к о м п ю т ъ р н и бази данни по И н т е р н е т .
Р е а к ц и я т а се провежда в специални „PCR
- машини" (термосайкъл). В з а в и с и м о с т о т
к а п а ц и т е т а н а а п а р а т а ц е н а т а му се дви­
жи между 5000 и 20000 DM.
RT-PCR е в а р и а н т на к л а с и ч е с к а т а PCR. В
случая с п о м о щ т а н а о б р а т н а т р а с к р и п т а -
за (RT - Reverse transcriptase) - РНК зависи­
м а ДНК полимераза - върху м а т р и ц а инфор­
мационна РНК се с и н т е з и р а комплементер-
на (кДНК). П о с л е д н а т а служи к а т о м а т р и ­
ца в последваща PCR. Технологията е осно­
вен м е т о д при д и а г н о с т и к а на РНК вируси­
т е ( х е п а т и т С, СПИН и др.).
По принцип всеки предварително описан
протокол н а провеждане н а PCR изисква ек­
спериментално о п т и м и з и р а н е и с т а н д а р ­
т и з и р а н е при к о н к р е т н и т е условия на ра­
б о т а (PCR машина, епруветки и др.).
PCR/RT-PCR и м а т количествени а в т о м а ­
т и з и р а н и в а р и а н т и , к о и т о се п р и л а г а т при
диагностика и контрол на лечението на
инфекциозни причинители. Подходът е осо­
бено перспективен за доказване н а т р и з о -
мии 21 ( т р и 21-ви хромозоми при б о л е с т т а
н а Down), 18, 13 и др.
МОЛЕКУЛНИ СТРАТЕГИИ
ЗА АНАЛИЗ НА МУТАЦИИ
Доказването на определени м у т а ц и и е край­
н а цел на всяка диагностична ДНК лабора­
т о р и я . И з т ъ к н а т о т о изключително разно­
образие о т м у т а ц и и и о г р а н и ч е н и я т а н а
гореописаните класически технологии нало­
жи р а з р а б о т в а н е т о на д е с е т к и м е т о д и в
с т о т и ц и модификации за доказване на му­
тации.
Условно м е т о д и т е за о т к р и в а н е на му­
т а ц и и м о г а т да се р а з д е л я т на „сканира­
щи" или откриващи) и „потвърждаващи" или
диагностични (табл. 16.1).
Сканиращите м е т о д и (хетеродуплексен
анализ, SSCA и DGGE) о т к р и в а т промяна в
молекулата н а ДНК без да у т о ч н я в а т не­
йния х а р а к т е р , поради к о е т о т е винаги се
н у ж д а я т о т потвърждаващо изследване.
Основното предимство н а с к а н и р а щ и т е
м е т о д и е, че т е м о г а т да б ъ д а т с т а н д а р ­
т и з и р а н и к а т о д о с т ъ п н и модификации.
Например с н а ш а т а модификация на SSCA
м о г а т в една процедура да се о т к р и в а т ед­
новременно повече о т 100 различни м у т а ­
ции в гена, отговорен з а муковисцидозата.
Особен и н т е р е с п р е д с т а в л я в а т хетеродуп-
лексния а н а л и з и SSCA м е т о д и т е , поради
п р о с т о т а т а н а изпълнение. DGGE по прин­
цип се с м я т а за по-чувствителен м е т о д , но
поради н е о б х о д и м о с т т а о т у п о т р е б а т а на
скъпи, специални електрофоретични вани и
скъпи праймери намира по-ограничено при­
ложение.
Потвърждаващите м е т о д и м о г а т да се
използват с а м о с т о я т е л н о за диагностика
и масов скрининг. С изключение на мултип-
327
Таблица 16.1. Haü-често използваните диагностични ДНК м е т о д и за доказване на мутации
(всички посочени методи са качествени)
МЕТОД ПРИНЦИП (при всички с е използва PCR)

Секвениране* ензимен, химичен, ДНК-чип

Алел-специфична м у т а н т н а ДНК не хибридизира с "нормална" олигонуклеотидна
хибридизация (ASO)* ДНК сонда и обратно
Алел-специфичен PCR м у т а н т н а ДНК не се амплифицира с една конкретна двойка
(PASA)* "нормални" праймери
Мултиплексен PCR* в а р и а н т на PASA с много двойки праймери в една реакция
Лигазо-полимеразна м у т а н т н а ДНК не се лигира в присъствие на 2 двойки праймери.
реакция (LCR)* комбинира се с PCR
Директна м у т а ц и я т а е довела до поява или липса на рестрикционно м я с т о
рестрикция*
Създава рестрик- един о т праймерите съдържа рестрикционно м я с т о
ционно м я с т о (СРМ)*
РНК-аза или химично ДНК се реже в н е с ъ о т в е т с т в и е т о между д в е т е вериги, причинено
рязане* о т мутация
Хетеродуплексен поява на бавни хетеродуплекси ( м у т а н т н а - н е м у т а н т н а верига) в
анализ (HAD)* неденатуриращ гел

SSCA** конформационно различни м у т а н т н и т е единични вериги п ъ т у в а т

различно в неденатуриращ гел

DGGE*** м у т а н т н а двойно-верижна ДНК п ъ т у в а различно в денатуриращ

гел

FISHAPSR-FISH)**** хибридизация (и PCR) с ДНК сонди директно върху микроскопски

препарат
* потвърждаващи методи
** SSCA - анализ на конформацията на едноверижни ДНК/РНК фрагменти
***DGGE - електрофореза в денатуриращ градиент
**** FISH - флуресцентна in-situ хибридизация. Използва се при откриване на големи мутации.

лексния PCR и д и р е к т н о т о секвениране ос­ (хаплотип) м о г а т д а б ъ д а т скачени с конк­

т а н а л и т е потвърждаващи методи откри­
в а т в една процедура с а м о единични м у т а ­
ции.
МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ
НА НОЛИМОРФИЗМИ
Полиморфните маркери с а „нормални" про­
мени в м о л е к у л а т а н а ДНК, поради к о е т о
н а м и р а н е т о н а едни и с ъ щ и полиморфни
маркери при различни н е р о д с т в е н и индиви­
ди н я м а никаква д и а г н о с т и ч н а с т о й н о с т
при г е н е т и ч н и т е изследвания. Друг е случая
при някои н е г е н е т и ч н и изследвания (микро­
биология и вирусология), к ъ д е т о т е м о г а т
д а б ъ д а т основен м а р к е р з а д и р е к т н о
доказване н а б о л е с т н и я п р и ч и н и т е л . П р и
г е н е т и ч н и т е изследвания в много редки слу­
чаи няколко скачени полиморфни м а р к е р а
328
р е т н а м у т а ц и я , к о е т о позволява използва­
н е т о и м з а д и р е к т н о доказване н а неизвес­
т н и т е м у т а ц и и . Т а к ъ в беше случая с диаг­
н о с т и к а т а н а н а с л е д с т в е н а т а периферна
н е в р о п а т и я при ц и г а н и т е , и з в е с т н а к а т о
„ Л о м с к а т а б о л е с т " до о т к р и в а н е н а специ­
фичната мутация.
Високата диагностична с т о й н о с т на
полиморфния и н д и р е к т е н ДНК анализ м о ж е
д а се реализира с а м о при рискови с е м е й с т ­
в а о т г е н е т и ч н о заболяване с ж и в болен ин­
дивид.
Тъй к а т о м е х а н и з м ъ т н а възникване н а
п о л и м о р ф и з м и т е е с ъ щ и я т к а к т о при му­
т а ц и и т е , принципно з а о т к р и в а н е т о им
м о г а т д а се и з п о л з в а т всички посочени в
т а б л . 16.1 м е т о д и . Н а п р а к т и к а широко се
и з п о л з в а т две групи м е т о д и :
РСН-рестрикция-електрофореза
(PCR-RFLP/VNTR ). При всеки RFLP или VNTR
маркер PCR р е а к ц и я т а се извършва със спе­
цифични праймери и специфична рестрик-
т а з а по индивидуален протокол на проце­
д у р а т а на електрофореза;
Р С Н - е л е к т р о ф о р е з а { Р С Ъ - Ъ Т Ъ или PCR-
VNTR) при доказване на VNTR и STR поли-
морфни маркери. И т у к при всеки отделен
полиморфен маркер се използват специфич­
ни праймери.
СИСТЕМЕН АНАЛИТИЧЕН ХОД
ЗА ДИАГНОСТИКА (НОСТНАТААНА
И ПРЕНАТААНА) НА НАСЛЕДСТВЕНИ
БОЛЕСТИ
К а к т о беше отбелязано, в зависимост о т
молекулните основи и х а р а к т е р и с т и к и на
заболяванията в к о н к р е т н и т е популации и
в зависимост о т в ъ з м о ж н о с т т а да се изс­
ледват д о с т а т ъ ч е н брой индивиди (болни и
здрави) о т конкретно семейство се прила­
г а т различни аналитични методи в т о ч н о
определена по с л е д о в а т е л н о с т „системен
аналитичен ход" (табл. 16.2).
В някои конкретни случаи (семейства)
посочената последователност не е задължи­
телна. Например, ако не е достъпна ДНК о т
индексния п а ц и е н т (болен) не е възможно
провеждане на индиректен ДНК анализ. При
малки гени, какъвто е случая с бета-глоби-
новия ген (бета-таласемия) и липса на ин­
дексен пациент се преминава към директ­
но секвениране (PCR -* директоно секвени-
ране) оиде на първия е т а п .
О т показаните на т а б л . 16.2 различни
набори о т аналитични ДНК методи за ди­
агностика на конкретни моногенни заболя­
вания у нас се вижда, че:
• всеки м е т о д изисква предварително про­
веждане на PCR със специфични праймери
при конкретни аналитични условия. В
т о з и смисъл всеки о т посочените в т а б л .
16.1 и16.2 методи всъидност е група о т ме­
тоди. Например, за провеждане на SSCA
при мускулна дистрофия Дюшен/Бекер се
провеждат за всеки о т 79-те екзона спе­
цифична PCR реакция и отделен за всеки
екзон SSCA метод.
• н а д е ж д н а т а ДНК диагностика изисква
използването на много методи (базирани

Т а б л и ц а 16.2. Приложение на о с н о в н и т е м е т о д и за диагностичен ДНК анализ при н а й - ч е с т и т е

наследствени (моногенни) б о л е с т и в България

Заболяване Системен аналитичен ход о т м е т о д и

Муковисцидоза PCR-HAD > PCR-SSCA >• PCR-STR* > PCR-секвениране
бета-Таласемия PCR-RFLP(STR)** >• PCR-SSCA >• PCR-секвениране
Хемофилия А Southern blot >• PCR-STR > PCR-SSCA > PCR-секвениране
Фенилкетонурия CPM > PCR-STR
Ф
МСАЕ) ^ PCR-CPM >• рестрикция
ДБП**** PCR- RFLP(STR)
Мускулна д и с т р о ф и я Мултиплексен PCR ^ PCR-STR ^ PCR-SSCA ^ PCR-секвениране
Дюшен/Бекер
Спинална мускулна CPM >• PCR-директна рестрикция (PCR-SSCA) > PCR-STR
атрофия
Мускулна д и с т р о ф и я PCR-SSCA >• PCR-дирсктна рестрикция >• PCR-секвениране
"Пояс крайник"
Миотонична д и с т р о ф и я Southern blot >- PCR-STR
Б ол е ст на Wilson PCR-STR >• PCR-SSCA >• PCR-секвениране

Болест на Gaucher PCR-директна рестрикция

* PCR-STR - индиректен анализ, определяне на STR полиморфизъм след I CR
ф
* PCR-RFLP - индиректен анализ, определяне на RFLP полиморфизъм след PCR
MCAD - д е ф и ц и т на АцКоЛ дехидрогеназата на средно верижните м а с т н и киселини
***• ДБП - д о м и н а н т н а бъбречна поликистоза
329
 н а различен принцип) з а едно и също забо­
ляване.
ДИАГНОСТИЧЕН ДНК АНАЛИЗ
ПРИ ДРУГИ ГЕНЕТИЧНИ БОЛЕСТИ
И ПРЕДРАЗПОЛОЖЕНИЯ
ХРОМОЗОМНИ И МУЛТИФАКТОРНИ
БОЛЕСТИ
Синдромът н а Down ( т р и з о м и я 21) е н а й -
ч е с т а т а хромозомна б о л е с т (50% о т всич­
ки случай с хромозомна аномалия). Той е и
н а й - ч е с т о т о показание з а п р е н а т а л н а д и ­
агностика (от 50 до 70% о т в с и ч к и случаи).
Р е ф е р е н т е н м е т о д з а доказване н а Down е
ц и т о г е н е т и ч н и я анализ ( к а р и о т и п и р а н е ) .
Основно ограничение н а последния особено
в случаите за п р е н а т а л н а диагностика е
в и с о к а т а цена (400 DM) и п р о д ъ л ж и т е л н о ­
т о м ъ ч и т е л н о чакане н а р е з у л т а т а 3-4 сед­
мици. З а преодоляване н а т е з и с ъ щ е с т в е н и
ограничения, в л а б о р а т о р и я т а по молеку­
лярна п а т о л о г и я - ДУБ „Майчин дом" - Со­
фия въведохме количествен а в т о м а т и з и р а н
PCR-STR м е т о д н а 3 високополиморфни STR
маркери о т 21 хромозома. М е т о д ъ т позво­
лява п о с т а в я н е н а д и а г н о з а т а з а 24 ч а с а при
99-100% д и а г н о с т и ч н а ч у в с т в и т е л н о с т и
специфичност н а с т о й н о с т не повече о т 10
DM. При използване н а м у л т и п л е к с е н PCR с
праймери, специфични з а STR полиморфиз-
ми о т 13"та и 18 т а , X и Y х р о м о з о м и т е м о ж е
д а се покрие д и а г н о с т и к а т а н а 95% о т хро-
м о з о м н и т е аномалии. С ъ щ и я т р е з у л т а т
може д а се п о с т и г н е при използване н а FISH
или FISH/PCR, но поради в и с о к а т а с т о й ­
н о с т н а изследването (600-1000 DM) м е т о ­
д и т е все още не н а м и р а т приложение в ру­
т и н н а т а п р а к т и к а . PCR б а з и р а н и т е м е т о ­
ди и FISH/PCR се и з п о л з в а т успешно в слу­
ч а и т е за преимплантационна диагностика
в единична к л е т к а при т е х н о л о г и и т е „бебе
в епруветка". И т у к поради в и с о к а т а ц е н а
н а FISH ние п р е д п о ч и т а м е PCR м е т о д и т е .
Многофакторните (полигенните)
заболявания, к о и т о в к л ю ч в а т всички соци-
ално-значими б о л е с т и днес п р е д с т а в л я в а т
изключителен и н т е р е с з а м о л е к у л я р н а т а
патология, ф а р м а ц е в т и ч н а т а и н д у с т р и я и
производителите н а к и т о в е и а п а р а т и з а
ДНК анализ. Независимо, че з а р ешав ане н а
проблемите с а а н г а ж и р а н и огромни консор-
330
циуми о т и з с л е д о в а т е л и и се в л а г а т коло­
сални с р е д с т в а следва д а се о т б е л е ж и , че:
• в м о м е н т а н я м а м у л т и ф а к т о р н о заболя­
ване, при к о е т о д а с а и з в е с т н и всички или
поне о с н о в н и т е а н г а ж и р а н и гени и алели;
• с ъ в р е м е н н и т е ДНК м е т о д и н е с а в с ъ с т о ­
я н и е д а о т к р и в а т всички и з в е с т н и алели,
и м а щ и о т н о ш е н и е к ъ м дадено заболява­
не;
• не е и з в е с т е н ДНК м е т о д , к о й т о д а о т ч и ­
т а к о м б и н и р а н и я е ф е к т о т взаимодейс­
т в и е т о н а няколко г е н а и няколко ф а к т о ­
р а н а о к о л н а т а среда.
Едно о т м а л к о т о м у л т и ф а к т о р н и забо­
ля ва н и я , з а к о е т о днес се прилага прогнос­
т и ч е н ДНК анализ е и н с у л и н з а в и с и м и я д и ­
абет. С п о м о щ т а н а д и р е к т н а PCR-ASO (але-
лоспецифична) d o t blot хибридизация м о г а т
д а се д о к а ж а т специфични алели (DQA1 и
DQB1) н а HLA клас II г е н и т е . В з а в и с и м о с т
о т н а м е р е н и т е алели м о ж е д а се изчисли
р и с к ъ т з а заболяване при к о н к р е т е н инди­
вид. Т р я б в а д а се п о д ч е р т а е , че н а м и р а н е т о
н а висок риск в н и к а к ъ в случай н е означава,
че и н д и в и д ъ т непременно щ е развие д и а б е т .
В етиологията на заболяването са
а н г а ж и р а н и н а д 15 други гени и редица из-
вънгенни ф а к т о р и . Подобен е с л у ч а я т с бо­
л е с т т а н а А л и х а й м е р , к о я т о се свързваше
с гена з а АроЕ. Днес се знае, че н а м и р а н е т о
н а рисковия алел АроЕ4 н е е свързан пряко с
е т и о л о г и я т а н а з а б о л я в а н е т о , а д а в а извес­
т н а информация, к о г а един предразположен
индивид (наличие н а м у т а ц и и в редица дру­
ги гени) щ е р а з в и е з а б о л я в а н е т о .
ДИАГНОСТИЧЕН Д Н К АНАЛИЗ
П Р И НЕГЕНЕТИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ
И н ф е к ц и о з н и т е п р и ч и н и т е л и с а пред­
м е т н а д и а г н о с т и ч е н ДНК анализ в послед-
н т е 10 години. Днес широко се п р и л а г а т н а д
100 PCR п р о т о к о л и з а амплификация н а спе­
цифични Д Н К / Р Н К н у к л е о т и д н и последова­
т е л н о с т и д и р е к т н о в клинични м а т е р и а л и
при: над 15 б а к т е р и и {Chlamidia trachomatis,
My c o b a c t e r i u m tubercolosis complex, Neiseria
gonorrhoeae и gp); н а д 16 вируси (HIVI, HFVII,
Hepatitis А, В, C, H u m a n papillomavirusu gp.);
няколко гъбични и п р о т о з о й н и п р и ч и н и т е ­
ли и п а р а з и т и . Основно п р е д и м с т в о н а ДНК
м е т о д и т е е изключително висока ч у в с т в и ­
т е л н о с т (99%), спеиифичност (99 - 100%) и
е ф е к т и в н о с т (около 100%). Безспорно пре­
д и м с т в о н а ДНК м е т о д и т е е б ъ р з и н а т а , с
к о я т о се п о л у ч а в а т р е з у л т а т и т е о т 24 до
36 часа срещу 2-3 седмиии при т р а д и ц и о н ­
н и т е микробиологични и вирусологични т е х ­
ники и и з п о л з в а н е т о н а микроколичества
биологичен м а т е р и а л (кръв, плазма и др.).
Основно ограничение при д и а г н о с т и ч н и т е
ДНК м е т о д и е з а т р у д н е н а т а и н т е р п р е т а ­
ция, свързана с изключително в и с о к а т а чув­
с т в и т е л н о с т и т р у д н о т о разграничаване
на ДНК ф р а г м е н т и о т разрушени живи или
вече у б и т и инфекциозни причинители.
В д и а г н о с т и к а т а н а инфекциозни причи­
н и т е л и се п р и л а г а т всички ДНК м е т о д и за
к а ч е с т в е н ДНК анализ, описани при гене­
т и ч н и т е изследвания (вж. т а б л . 16.1). Тук
се използва само д и р е к т е н ДНК анализ, к а т о
най-често о б е к т н а изследване са специфич­
ни полиморфни маркери (RFLP, VNTR и STR
точкови замени). И з в е с т н и са д е с е т к и не-
а в т о м а т и з и р а н и процедури н а д о с т ъ п н и
цени (под 5 DM за анализ).
Особен и н т е р е с п р е д с т а в л я в а т техноло­
г и и т е н а б а з а т а н а количествен PCR. Чрез
т я х е възможно п о с т а в я н е н а т о ч н а диаг­
ноза, о т ч и т а н е с т а д и я н а б о л е с т н и я про­
цес и е ф е к т и в н о к о н т р о л и р а н е н а лечение­
т о . Поради н е о б х о д и м о с т т а о т контроли­
ране н а редица е т а п и и п а р а м е т р и н а PCR,
респ. RT-PCR в у л т р а м и к р о а н а л и т и ч н и сис­
т е м и успешен количествен PCR е възможен
само в а в т о м а т и з и р а н в а р и а н т ( с и с т е м и ­
т е н а Roche, Chiron и др.). К а к т о при всички
а в т о м а т и з и р а н и с и с т е м и и т у к ос н овн от о
ограничение е н е д о с т ъ п н а т а цена н а
анализа (над 50 DM з а анализ о т консума­
т и в и и над 70 000 DM з а а п а р а т у р а ) .
ИЗОЛИРАНЕ И СЪХРАНЯВАНЕ НА Д Н К
Мол е к у л а та н а Д Н К е една и съща във всич­
к и ядрени к л е т к и н а даден индивид, к о е т о
определя в ъ з м о ж н о с т т а з а провеждане н а
ЦИК анализ в к о я т о и д а е о т т я х (левко­
ц и т , кожна, мускулна, мозъчна, с п е р м а т о ­
зоид и т.н.). В и с о к а т а ч у в с т в и т е л н о с т н а
PCR т е х н о л о г и я т а позволява изследване н а
ЦИК/РНК молекули о т разградени инфекци­
озни причинители в серум или плазма.
Изолирането н а ДНК/РНК е ключова пре-
д а н а л и т и ч н а процедура, к о я т о определя
в ъ з м о ж н о с т т а или н е в ъ з м о ж н о с т т а за про­
веждане н а к а ч е с т в е н ДНК анализ. Апара­
т у р а т а , к о я т о е необходима з а извършва­
н е т о н а т о з и важен е т а п изисква специал­
но помешение и включва: камина, в а к у у м
помпа, 2-3 водни бани, лабораторна цент­
рофуга до 3000 д {we е задължително хладил­
на), микроцентрофуга до 14000 д, вортекс
миксер, UVспектрофотометър (260-280 пт),
м а л к а електрофоретична вана, UV транс-
луминатор, документационна система
(Polaroid, обикновен ф о т о а п а р а т , дигитален
ф о т о а п а р а т или видеокамера с компютър),
х л а д и л н и к и минусовхладилник{nowe -20 о С).
Независимо, че процедурата по изолиране­
т о на ДНК е п р о с т а , н е о б х о д и м о с т т а о т
п о д д ъ р ж а н е н а и з к л ю ч и т е л н о високи
с т а н д а р т и на к а ч е с т в о т о на р а б о т а и
р е д и ц а т а допълнителни изисквания,
свързани с вземане на м а т е р и а л а п р а в я т
неефективен и опасен подхода д а се
в ъ з л а г а н а нсДНК л а б о р а т о р и и т о з и
вид дейност.
За изолиране н а ДНК принципно се изпол­
з в а т различни подходи и модификации. При
пълна кръв (най-често използвания м а т е р и ­
ал за изолиране н а ДНК/РНК) първо се лизи-
р а т е р и т р о ц и т и т е и се о т с т р а н я в а т за­
едно с п л а з м а т а . У т а й к а т а с ядрени к л е т ­
ки се промива и т е се лизират. Б е л т ъ ц и т е
се хидролизират с ензима протеиназа К и
се о т с т р а н я в а т с фенол или н а с и т е н NaCL.
Прибавя се хлороформ, за да се о т с т р а н и
фенола (внимание! фенолът е силен инхиби-
тор на Taq полимеразата и рестриктази-
те). Ф е н о л ъ т т р я б в а да бъде с pH над 7.8. В
п р о т и в е н случай при ниско pH, ДНК ще по­
падне в о р г а н и ч н а т а фаза. В п о с л е д н а т а
фаза ДНК се у т а я в а с алкохол. В м е с т о фе­
нол ч е с т о се използва н а с и т е н н а т р и е в хло­
рид. С о л е в а т а е к с т р а к ц и я е безвредна за
о п е р а т о р а , но е подходяща само за прясна
кръв. При предварително замразена кръв за
предпочитане е ф е н о л н а т а екстракция.
В м о м е н т а на пазара се предлагат мно­
ж е с т в о к и т о в е за изолиране н а ДНК и РНК
о т различни к л е т к и .
И з к л ю ч и т е л н о удобни с а б ъ л г а р с к и т е
к и т о в е на фирма STS (Scientific Technological
Service). При т я х нуклеиновите киселини се
имобилизират н а прйнципа н а а ф и н и т е т -
331
н а и йонообменна х р о м а т о г р а ф и я . Изолира­ Принципно с е р у м ъ т / п л а з м а т а не с а под­
н е т о се извършва в р а м к и т е н а 1 час. С т я х ходящ м а т е р и а л з а ДНК анализ при г е н е т и ч ­
може да се изолира ДНК о т п р я с н а кръв ( о т н и т е и б о л ш и н с т в о т о н е г е н е т и ч н и изслед­
0.2 до 5 ml) при с т о й н о с т з а проба 1.5 DM. вания. При и з п о л з в а н е т о и м се р а з ч и т а н а
И з о л и р а н а т а ДНК м о ж е д а се с ъ х р а н я в а ДНК молекули в р е з у л т а т н а к л е т ъ ч е н раз­
под е т а н о л няколко години при -20 С. З а це­ пад. При н е г е н е т и ч н и изследвания (вирусо­
л и т е н а ДНК б а н к а е з а п р е д п о ч и т а н е съх­ логия) п л а з м а т а ( а н т и к о а г у л а н т EDTA) е
раняване при -70оС. п р е д п о ч и т а н а пред с е р у м а к а т о и з т о ч н и к
за диагностика.
Източници з а изолиране К а т о и з т о ч н и к з а ДНК, особен и н т е р е с
н а ДНК/РНК п р е д с т а в л я в а т с у х и т е п е т н а к р ъ в върху
ф и л т ъ р н и бланки, н а к о и т о се п р о в е ж д а т
К а к т о беше о т б е л я з а н о к а т о и з т о ч н и к н а м а с о в и т е г е н е т и ч н и , н е о н а т а л н и , скринин-
ДНК може д а се използва в с я к а я д р е н а чо­
гови програми (Schleicher & Schuli № 909, 2992
вешка к л е т к а ( т а б л . 16.3).
или W a t h m a n 180). С ъ щ и т е фирми п р е д л а г а т
Т а б л и ц а 16.3. Най-често използваните източ­ специални ф и л т ъ р н и х а р т и и , импрегнира­
ници и възможните количества за изолиране на ни с и н х и б и т о р и н а Д Н К / Р Н К - а з и и фикси­
ДНК р а щ и върху целулозния м а т р и к с нуклеино­
Източник В един ДНК p g в и т е киселини. И з с л е д в а н и я т а се извърш­
в а т с ДНК, е к с т р а х и р а н а със специален раз­
Кръв (EDTA) - о т 4 до
ml 40000000 т в о р или д и р е к т н о върху ф и л т ъ р н а т а хар­
11 000 000 левкоцити
т и я след е к с т р а к ц и я със специален р а з т ­
Кръв сухо п е т н о н а фил­
mm 2 10000 вор н а д р у г и т е к о м п о н е н т и (например, ин-
т ъ р н а бланка (180g/m 2 )
т е р ф е р и р а щ и я хемоглобин, нискомолекулни
Левкоцит брой 6
и н х и б и т о р и н а T a q п о л и м е р а з а т а и др.).
Хорионни въси mg 8000000 Пие препоръчваме д и р е к т н о амплифици-
Амниотична т е ч н о с т - р а н е н а ДНК върху с т а н д а р т н и т е ф и л т ъ р ­
1х104 к л е т к и в 16 ml 65000 ни бланки (Schleicher & Schull 2992), к а т о з а
гестационна седмица
ц е л т а в PCR и н к у б а ц и о н н а т а смес се при­
Фибробластна култура - Т25 б а в я говежди серумен албумин. П о с л е д н и я т
1х106 к л е т к и 6500000
петри елиминира е ф е к т а н а и н т е р ф е р и р а щ и т е
Луковица о т косъм брой 250000 компоненти.
Черен дроб mg 15000000 Кръв върху с п е ц и а лн а ф и л т ъ р н а х а р т и я
Мускул
е н а й - д о с т ъ п н и я и з т о ч н и к з а поддържане н а
mg 3000000
ДНК б а н к а .
Кожа mg 3000000
Сперматозоид брой 3
ОРГАНИЗАЦИЯ НА ДИАГНОСТИЧНА
Най-често и з п о л з в а н и я т и з т о ч н и к з а изо­ Д Н К ЛАБОРАТОРИЯ
лиране н а ДНК с а к р ъ в н и т е л е в к о ц и т и , по­
лучени о т венозна кръв, в з е т а в п л а с т м а с о ­ Т е о р е т и ч н о в с я к а клинична, микробиологич­
ва е п р у в е т к а с а н т и к о а г у л а н т EDTA. Хепа- на, вирусологична, х е м а т о л о г и ч н а , парази-
р и н ъ т не е подходящ, т ъ й к а т о инхибира т о л о г и ч н а или друг вид д и а г н о с т и ч н а лабо­
Taq п о л и м е р а з а т а и редица р е с т р и к т а з и . З а р а т о р и я м о ж е д а бъде снабдена с а в т о м а ­
предпочитане е к р ъ в т а д а се взема 1 час след тизирана апаратура с готови китове и да
нахранване (по-висок добив н а к л е т к и ) . До извършва изследвания н а б а з а т а н а ДНК
изолиране н а ДНК к р ъ в н и т е проби м о г а т д а анализа. Това н е п р о м е н я по с ъ щ е с т в о пре­
се с ъ х р а н я в а т н я к о л к о ч а с а н а с т а й н а д и ш н и я ü п р е д м е т н а д е й н о с т и не я прев­
т е м п е р а т у р а , 48 часа при 40С и няколко ме­ р ъ щ а в „ДНК л а б о р а т о р и я " , т ъ й к а т о т я
сеца н а -20оС. П р е д л а г а т се и специални еп­ н я м а право д а и з в ъ р ш в а г е н е т и ч н и изслед­
р у в е т к и н а Becton Dickenson, к о и т о позво­ вания. Във всеки случай, преди въвеждане н а
л я в а т съхранение и т р а н с п о р т до 72 часа ДНК анализ з а р у т и н н а д и а г н о с т и к а , т р я б ­
при с т а й н а т е м п е р а т у р а . в а д а бъде изградена служба, к о я т о д а м о ж е
332
а д е к в а т н о да и н т е р п р е т и р а р е з у л т а т и т е
и консултира п а ц и е н т и т е .
Въвеждането н а ДНК м е т о д и т е е лесно
решим технологичен проблем (особено с ки­
тове), ако ДНК л а б о р а т о р и я т а се разкрие
към добре р а б о т е щ а биохимична л а б о р а т о ­
рия. По с ъ щ е с т в о д в е т е лаборатории о с т а ­
в а т отделни. Те не бива д а с ъ в м е с т я в а т
дейности, т ъ й к а т о и м а т различен подход
към о б е к т а н а изследване и различен д о с т ъ п
до информация за индивида.
Персонал
Разкриването н а ДНК л а б о р а т о р и я предпо­
лага н а л и ч и е т о н а високо квалифицирани
кадри в о б л а с т т а н а м о л е к у л я р н а т а п а т о ­
логия (генетика), к о и т о в з а в и с и м о с т о т
о б е к т а на диагностика т р я б в а да м о г а т
а д е к в а т н о да и н т е р п р е т и р а т р е з у л т а т и ­
т е . При г е н е т и ч н и т е изследвания т р я б в а
да бъде осигурена г е н е т и ч н а консултация
преди, по време и след завърщване н а анали­
зите.
Освен завеждащ, д и а г н о с т и ч н а т а ДНК
л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да разполага непре­
к ъ с н а т о с минимум двама молекулярни би­
олози. И з и с к в а н и я т а към завеждащ лабора­
т о р и я т а и о с т а н а л и я персонал са дефини­
рани ясно о т А м е р и к а н с к а т а комисия по
клинична лаборатория, С1ЛА,1999. Завеждащ
л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да може не само да
вз?ма професионални решения на всеки е т а п
о т а н а л и т и ч н и я процес, но поради изклю­
чително динамичния х а р а к т е р на техноло­
г и и т е да може да определя безперспектив-
ността и спирането на дадени методи и
перспективността и въвеждането на нови.
Р а б о т е щ и т е в ДНК д и а г н о с т и ч н а лабора­
т о р и я т р я б в а да б ъ д а т силно м о т и в и р а н и ,
комуникативни. Д е й н о с т т а в ДНК лабора­
т о р и я т а е и з к л ю ч и т е л н о екипна. В ДНК
л а б о р а т о р и я т а н я м а м я с т о за с ъ т р у д н и ­
ци, к о и т о не са търпеливи, и н а к о и т о им
липсва и н и ц и а т и в а т а да о п и т в а т о т н о в о
до решаване на т е к у щ и т е технически проб­
леми.
Независимо о т диагностичния х а р а к т е р
н а р а з г л е ж д а н а т а в т о з и т е к с т ДНК лабо­
р а т о р и я т р я б в а д а се подчертае, че всяка
ДНК лаборатория, независимо о т з а д а ч и т е
ü т р я б в а да поддържа а д е к в а т н а научна
т е м а т и к а . В п р о т и в е н случай персоналът
на л а б о р а т о р и я т а се д е м о т и в и р а бързо и
качеството на диагностичните р е з у л т а т и
спада под необходимите с т а н д а р т и . О т
друга с т р а н а , въвеждането н а диагностич­
ни м е т о д и за всяко генетично заболяване
предполага задължително предварително
проучване н а молекулните х а р а к т е р и с т и ­
ки н а т о в а заболяване при к о н к р е т н а т а
популация.
Документация
ДНК л а б о р а т о р и я т а за генетични изследва­
ния използва специализирана документация
за: информирано съгласие от пациента за
вземане на материал за изследване; доку­
мент, придружаващ материала, съдържащ
подробна паспортна, клинична, генеалогич­
на и др. информация; специално разработе­
ни документи за съобщаване на резултати­
т е в р а з б и р а е м за п о т р е б и т е л я вид,
специален документ за генетична консул­
тация и др. Д о с т ъ п ъ т до т а з и документа­
ция е ограничен, с оглед запазване н а п ъ л ­
н а тайна з а генетичния статус н а
конкретен индивид и семейство.
О б о р у д в а не н а ДНК л а б о р а т о р и я
На т а б л . 16.4 са посочени необходимите апа­
р а т и , с к о и т о т р я б в а да разполага или може
да ползва (намиращи се в друга биохимична
лаборатория в непосредствена близост)
една съвременна диагностична ДНК лабора­
т о р и я . В т а б л и ц а т а ДНК с е к в е н а т о р ъ т е
п о с т а в е н на последно м я с т о к а т о незадъл­
ж и т е л е н а п а р а т , т ъ й к а т о в случая се има
предвид р у т и н н а диагностична ДНК лабо­
р а т о р и я , к о я т о не извършва масов скрининг
на с т о т и ц и пациенти дневно. Наличието на
секвенатор в дадена ДНК лаборатория може
д а повиши нейния с т а н д а р т само в
с ъ ч е т а н и е с наличието на квалифицирани
сътрудници, разработващи научна програ­
м а в с ъ о т в е т с т в и е с международните
стандарти.
За да бъде е ф е к т и в н а д и а г н о с т и ч н а т а
ДНК лаборатория т р я б в а да бъде осигуре­
на с годишен разход н а консумативи, хими­
кали и р е а к т и в и минимум 8-10 000 DM н а из­
пълнител.
Помещения
Д и а г н о с т и ч н а т а ДНК лаборатория т р я б в а
да разполага със следните отделни р а б о т -
333
Т а б л и ц а 16.4. Необходимо оборудване н а ДНК л а б о р а т о р и я с 2 р а б о т н и м е с т а

брой Апарат брой

Апарат
2 Микровълнова п е ч к а 1
Компютър с И н т е р н е т
1 Р о т а т о р на епруветки 1
К ам ина
2 Гел-изсушител 1
Водни бани
Ц е н т р о ф у г а до 3000 g 1 Вакуумпомпа 1

Микроцентрофуга 14000 g 1 Н и в ели ран а м а с а 1

о
Вортекс миксер 2 Т е р м о с т а т и р а н с т а т и в до 100 С 2

UV с п е к т р о ф о т о м е т ъ р 1* А в т о м а т и ч н а п и п е т а 0-20 ц! 2

Електрофореза м и н и в а н а 1 А в т о м а т и ч н а п и п е т а 0-200 ц1 2

Електрофореза м а к с и в а н а 1 А в т о м а т и ч н а п и п е т а 0-1000 ц.1 2

Електрофореза секвенционна 1 К о н т р о л е н г а м а брояч 1

Токоизправител 500 V 2 Автоклавируеми с т а т и в и :

Токоизправител н а д 2000 V 1 - п и п е т н и в р ъ х ч е т а 0-20 jxl 20

UV т р а н с л у м и н а т о р (316 п т ) 1 - п и п е т н и в р ъ х ч е т а 0-200 ^il 10

Гел-документационна с и с т е м а 1 - п и п е т н и в р ъ х ч е т а 0-2000 |,il 5

Хладилник 2 Rö-kacemu с у с и л в а щ е к р а н 8
Хладилна к а м е р а -20 С о
2 Концентратор - центрофужен 1*
Хладилна к а м е р а -70оС 1* Аедогенератор 1*
Техническа везна ( в т о р и з н а к ) 1 PCR - м а ш и н а ( т е р м о с а й к л е р ) 2
pH - м е т ъ р 1* Аналитична везна " ч е т в ъ р т и знак" 1*
Дестилатор/дейонизатор 1* Автоклав 1*
Хибридизационна к а м е р а 1 А п а р а т з а ДНК е л е к т р о п р е н о с 1
Сух т е р м о с т а т 1 ДНК с е к в е н а т о р
* а п а р а т ъ т е необходим, но м о ж е д а се ползва т а к ъ в о т д р у г а л а б о р а т о р и я в н е п о с р е д с т в е н а
близост
** а п а р а т ъ т не е необходим - р а з ш и р я в а с а м о к а п а ц и т е т н и т е в ъ з м о ж н о с т и н а л а б о р а т о р и я т а

ни помещения: м а н и п у л а ц и о н н а за вземане НАДЕЖДНОСТ НА РЕЗУЛТАТИТЕ И КА

и получаване на кръвни проби; за изолиране
на ДНК/РНК (желателно със стерилна ла-
минарна маса); миална\ работно помещение
о т минимум 40 т 2 , в което са разположени
всички апарати и са разкрити 2 работни
м е с т а с минимум 2 т 2 всяко; и з о т о п н а ,
тъмна стая за фото документация, с т а я
за разговор и консултиране н а пациентите.
Всеки работещ в ДНК лаборатория т р я б -
6а да разполага с м я с т о извън аналитични­
т е работни помещения, в което да има дос­
т ъ п до компютър, съвременна информация
(Интернет), и където да може спокойно да
планира всеки експеримент и анализира ре­
зултатите.
ЧЕСТВЕН КОНТРОЛ НРИ ДНК АНАЛИЗА
Всички изисквания към качеството на ре­
з у л т а т и т е утвърдени в клиничната лабо­
ратория са валидни и при ДНК анализа.
Качсствститг контрол в предана-
л и т и ч н и л с т а д и и е ключов м о м е н т за
осигуряване висока надеждност на резулта­
т и т е при ДНК анализа за генетичните изс­
ледвани. Към ДНК анализ за генетични изс­
ледвания се п о с т а в я т допълнителни изиск­
вания (CLIA, 1999):
• пробите за ДНК анализ не се изхвърлят, а
трябва да се съхраняват до момента, ко­
г а т о се получи релевантна клинична ин­
формация за всички членове на семейст­
вото;
• необходимата информация преди започва­
не н а л а б о р а т о р н и т е изследвания т р я б ­
ва да дава в ъ з м о ж н о с т за уникална иден­
т и ф и к а ц и я н а п а ц и е н т а , включваща: по­
казание з а изследването; т р и т е имена;
д а т а н а раждане; е т н и ч е с к и произход; ад­
рес; в е р о я т н а диагноза; клинична инфор­
мация, а р г у м е н т и р а щ а п о к а з а н и е т о / д и ­
а г н о з а т а ; избора н а ДНК м е т о д и и и н т е р ­
п р е т а ц и я н а р е з у л т а т и т е ; и м е т о н а на­
сочващия лекар; адрес и име н а получате­
ля н а р е з у л т а т и т е ; име н а л и ц е т о взело
м а т е р и а л а ; и з т о ч н и к и вид н а м а т е р и а ­
ла;
• условия н а съхраняване и т р а н с п о р т н а
м а т е р и а л а ; д а т а и час н а вземане и полу­
чаване н а м а т е р и а л а ;
• д о п ъ л н и т е л н а информация, улесняваща
изследването.
Ц я л а т а информация се получава в писмен
вид н а специален д о к у м е н т - „Поръчка з а
ДНК анализ".
Зсимърсяване на проб и т е е н а й - ч е с т а т а
причина за компрометиране на р е з у л т а т и ­
т е в а н а л и т и ч н и я с т а д и й . Най-често
з а м ъ р с я в а н е т о е в ъ т р е л а б о р а т о р н о и се
получава о т PCR п р о д у к т на предишно изс­
ледване. Тук т р я б в а с т р о г о да се с п а з в а т
и з и с к в а н и я т а з а използване н а с т е р и л н и
консумативи за е д н о к р а т н а у п о т р е б а и раз­
делно извършване н а различните е т а п и о т
аналитичния протокол в отделни помещения.
В ъ н ш н а т а о ц е н к а н а качсстМото
н а р е з у л т а т и т е а гаранция за необходи­
м и я висок с т а н д а р т н а д и а г н о с т и ч н а т а
лаборатория. В м о м е н т а се п р о в е ж д а т ня­
колко международни програми за най-чести­
т е н а с л е д с т в е н и заболявания. На п ри ме р
европейската програма з а к а ч е с т в е н к о н т ­
рол н а ДНК анализа при муковисцидозата
включва 143 д и а г н о с т и ч н и л а б о р а т о р и и ,
к о и т о п о л у ч а в а т два п ъ т и годишно по 6
контролни ДНК проби с различен г е н о т и п
(нормален, х е т е р о з и г о т и , двойни хетерози-
г о т и и хомозиготи з а различни м у т а ц и и ) .
Изключително в и с о к а т а ч у в с т в и т е л ­
н о с т на ДНК анализа, п о с т и г а н а чрез PCR
прави задължителен вътрешпо-лаборатор-
ния контрол за качество н а р е з у л т а т и т е .
Всяко изследване з а д ъ л ж и т е л н о се про­
вежда в 2-3 успоредни проби. Винаги в една
серия (гел) се изследват всички членове на
с е м е й с т в о т о . Задължително в същия гел се
п у с к а т няколко вида „о тр и ц ател н и " к о н т ­
роли, г а р а н т и р а щ и ч и с т о т а т а н а всеки
к о м п о н е н т в инкубационната смес (във вся­
к а к о н т р о л а липсва някои о т компоненти­
т е - Taq полимераза, праймери, ДНК и т . н . ) .
Задължително в същия гел п р и с ъ с т в а т по­
ложителни контроли (проби о т болни с раз­
лични м у т а ц и и о т други семейства) и о т ­
р и ц а т е л н и контроли (здрави индивиди о т
друго семейство.
За да се изключи майчина контаминация
при изследване н а хорионни въси и амнио-
т и ч н и к л е т к и при женски пол н а ф е т у с а
задължително се п у с к а т маркери за доказ­
ване на пола (включително т а к и в а , използ­
вани в съдебно-медицинската п р а к т и к а за
доказване на бащинство). За предпочитане
е п р о б и т е за б а щ и н с т в о да се и з в ъ р ш в а т
о т сътрудник-жена, к о я т о е генотипирана
предварително за с ъ щ и т е маркери.
Съобщаването н а р е з у л т а т и т е е
изключително важен, заключителен е т а п
при диагностичния ДНК анализ за генетич­
ни изследвания. Р е з у л т а т и т е се с ъ о б щ а в а т
само в писмен вид, само на изследваните
лица и винаги придружени с генетично кон­
султиране. С разрешение н а п а ц и е н т и т е
р е з у л т а т и т е м о г а т да б ъ д а т съобщавани
на доверен лекар. Всеки р е з у л т а т съдържа
(CLIA, 1999): описание, интерпретация, ко­
ментари, препоръки за допълнителни кли­
нични или лабораторни изследвания, крат­
ко описание на метода и неговите ограни­
чения.
Р е з у л т а т и т е т р я б в а да с ъ д ъ р ж а т родос­
ловно дърво с т о ч н о обозначени всички
изследвани членове на с е м е й с т в о т о .
Р е з у л т а т и т е задължително се подпис­
в а т о т завеждащ л а б о р а т о р и я т а и съдър­
ж а т координати з а бърза връзка с него.
В р е з у л т а т и т е се посочват всички изслед­
вани м у т а н т н и алели и ч е с т о т а т а им в
к о н к р е т н а т а популация. В зависимост о т
доказаните и изключените м у т а н т н и алели
се посочва ревизирания риск за носителство
на патологични алели в конкретния случай.
Трябва да б ъ д а т посочени всички ф а к т о ­
ри о т технологично, етническо и друго ес­
т е с т в о ( ч е с т о т а н а вътрегенни рекомби-
нации, ч е с т о т а н а de novo м у т а ц и и , полов
мозаицизъм и т. н . ), к о и т о ограничават ин­
т е р п р е т а ц и я т а на р е з у л т а т и т е .
335
 Дългосрочното (на практика докато мо­ н и т е средства.
гат да се изследват пробите) съхраняване н а За болшинството о т моногенните заболя­
пробите и изграждане на Д Н К банка е задъл­ вания ще се з а п а з я т полуавтоматизирани-
жителен елемент н а диагностичния Д Н К т е и ръчни технологии, т ъ й к а т о заболява­
анализ, Съхранявшдето на пробите след пос­ н и я т а са много редки. До т о з и м о м е н т са из­
т а в я н е на диагнозата е продиктувано о т ре­ в е с т н и над 10 000 моногенни заболявания, а в
дица съображения к а т о : близките 5 - 1 0 години вероятно ще б ъ д а т 50
- 60 000.
• потвърждаване на диагнозата с нововъве­
дени методи;
И д е н т и ф и ц и р а н е т о н а н о в и г е н и ще
• използване на пробите за вътрешно-лабо- продължи с високи темпове. До н а с т о я щ и я
раторен качествен контрол или при въвеж­ м о м е н т са идентифицирани около 30 000 ге­
дане на нови методи; ни. По-малко о т 10 000 се с в ъ р з в а т с болес­
• за обучение. т е н фенотип и при няколко хиляди е охарак­
Използването на анонимни проби не изис­ теризиран кодирания белтък. Това означава,
ква информирано съгласие на пациента. че към 2 005 година, к о г а т о се очаква да бъ­
д а т о т к р и т и всичките 7 0 - 100 000 гени при
човека, пред клиничната генетика ще продъл­
ПЕРСПЕКТИВИ Н А ДИАГНОСТИЧНИЯ жи да има много повече въпроси, о т к о л к о т о о
Д Н К АНААИЗ отговори.
По отношение на клиничната лаборатория
Диагностичният ДНК анализ ще се развива в т р я б в а да се подчертае, че схващането за „за­
две основни направления: м е с т в а н е н а редица м е т а б о л и т н и , ензимни
и др. диагностични показатели с ДНК - мар­
Непрекъснато въвеждане н а нови тех­ кери" е напълно необосновано. Напротив, ДНК
нологии, к о е т о ще продължи да изпреварва а н а л и з ъ т ще стимулира въвеждането н а но­
клиничното мислене, о б щ а т а медицинска под­ ви неДНК показатели. Тепърва предстои ог­
готовка на лекарите и изискванията към вза­ ромна р а б о т а , свързана с изясняване на фун­
имоотношенията лекар-пациент. Ще се на­ к ц и я т а н а х и л я д и т е н о в о о т к р и т и гени и
ложи т е н д е н ц и я т а за все по-широко използ­ сложните взаимоотношения ген/ген; ген/из-
ване на автоматизирани системи, р а б о т е ­ вънгенна ДНК последователност; ген/околна
щи с готови набори, к а к т о и за изследване н а среда (ген/белтък, г е н / м е т а б о л и т ) и корела­
новооткрити гени и свързани с т я х ДНК мар­ ц и я т а генотип/фенотип.
кери. Това развитие ще се о т р а з и най-вече при Съвременните ДНК лаборатории все по-
негенетичните изследвания (вирусология и ч е с т о ще з а п о ч н а т да се о б р ъ щ а т към бел­
микробиология) и при г е н е т и ч н и т е изследва­ т ъ ч н и я и м е т а б о л и т е н анализ.
ния на ч е с т и м у т а ц и и при н а й - ч е с т и т е ге­
нетични заболявания. С времето все повече В клиниката ще започне д а навлиза
ще на р аства броя на г е н е т и ч н и т е изследва­ т ъ й нар. люлекулярно-биологичното
ния при многофакторните заболявания. С по­ лгислене. Това неминуемо ще подобри клинич­
лучаваната о т т е з и изследвания информация н о т о мислене и взаимоотношенията лекар/
ще може предклинично QÜ. се оценява риска о т пациент/популация. Л е к а р я т и о б щ е с т в о т о
възникване на заболяване; диагноза на н а с т о ­ ще се и з п р а в я т пред неподозирани психоло­
ящо заболяване; прогноза, индивидуално гене­ гически, морално-етични и юридически проб­
тично аргументирано лечение с традицион­ леми.

КНИГОПИС

М е д и ц и н с к а генетика, Т о н ч е в а Д , Л а л ч е в С ( р е д ) С о ф и я p r o v e m e n t a m e n d m e n t s o f 1988: present and future. Clinical

С И Е Л А , 1999.
H i e i m R A , Silverman LM. M o l e c u l a r pathology. A p p r o a c h e s t o
•agnostic human d i s e a se in the clinical laboratory. Carolina
A c a d e m i c Press, 1 9 9 4 .
Schwartz M K . G e n e t i c testing and the clinical laboratory i m -
336
Chemistry 45, 1999, 5, 739-745.
S c r i v e r C R e t al. T h e m e t a b o l i c and m o l e c u l a r b a s e s o f inherited
disease. S e v e n edition. McGraw-Hill, 1995.
Trent RJ. M o l e c u l a r m e d i c i n e . A n introductory text for students.
Churchill L i v i n g s t o n e , 1 9 9 3 .
 Цшпохимичен анализ
ЦИТОХИМИЯ и х и с т о х и м и я
СЪЩНОСТ НА АНАЛИЗА
М. П е н е в
Цшпохимията представлява микрохимичен
анализ на клетките и има задачата да иден­
тифицира и локализира т е х н и т е химичес­
ки съставки. В методично отношение ци-
т о х и м и я т а е комбинация о т химически и
биохимични методи, и микроскопия. Пора­
ди т о в а нейното развитие и практическо
приложение зависи о т р а з в и т и е т о на хими­
я т а и биохимията. Цитохимичните м е т о ­
ди обикновено завършват с цветна реакция,
к а т о промените на к л е т к и т е и т я х н о т о
Згвреждане в хода на лабораторната проце­
дура не трябва да д о с т и г а т степен, коя­
т о да затруднява идентифицирането на
клетките. Терминът ципюхтмшюпфеце-
ля к а т о о б е к т на изследванията клетки­
т е , за разлика о т хиетохимоята, при ко­
я т о о б е кт на изследването са т ъ к а н и т е
и клетките.
ИСТОРИЧЕСКИ БЕЛЕЖКИ
Исторически х и с т о х и м и я т а к а т о научно-при­
ложна дисциплина се е развила значително по-
рано о т ц и т о х и м и я т а . През периода н а с в о е т о
възникване х и с т о х и м и я т а е била предимно бо­
т а н и ч е с к а наука. На б а з а т а н а подробен ана­
лиз на публикуваните р а б о т и по хистохимия И.
Harms (1931-1932) посочва, че основоположник н а
х и с т о х и м и я т а к а т о наука е ф р е н с к и я т фарма­
ц е в т , б о т а н и к и микроскопист Francois-Vincent
Raspai (1794-1878), к о й т о през 1825 г. първи съ­
общава за приложение н а химически реакции в
т ъ к а н и , наблюдавани с микроскоп. Това мнение
на Н. Harms се подкрепя и о т други изследова­
т е л и . J. R. Baker п о д ч е р т а в а , че п ъ р в о т о ясно
проявено разбиране и оценка н а микроскопски
наблюдавана химия н а т ъ к а н и т е е предложено
о т F.-V.Raspai. Проучвания върху хистохимия­
т а на т ъ к а н и о т ж и в о т н и се о с ъ щ е с т в я в а т в
периода 1856-1871 г. През 1867 г. М. Perls доказва
желязо в т ъ к а н и т е с п о м о щ т а н а реакция с
пруско синьо. L. Daddi през 1896 г. е разработил
м е т о д за о ц в е т я в а н е н а липиди със Sudan III.
М е т о д за о т к р и в а н е н а калций в т ъ к а н и е съ­
общил J.von Kossa през 1901 г. Ц и т о х и м и ч н и т е
м е т о д и се п р и л а г а т о т началото н а 20. век за
изследване а к т и в н о с т т а на протеолитични ен­
зими в неутрофили о т е к с у д а т (E.L.Opie, 1905,
1906 г.), последвани о т п р о у ч в а н и я т а н а F.
Winkler (1907 г.) върху оксидаза н а левкоцити в
кръвна н а т р и в к а . През 1927 г. Е. Sehrt прилага
Sudan III и Nile blue sulphate за оцветяване на
левкоцити в кръвна н а т р и в к а и о т к р и в а и н т е н ­
зивно о ц в е т я в а н е н а н е у т р о ф и л н и т е гранули.
Той у с т а н о в я в а и с х о д с т в о т о между липидно-
т о съдържание на к л е т к и т е и т я х н а т а окси-
д а з н а реакция. Ф о с ф а т а з н а т а а к т и в н о с т в
плазма, левкоцити и е р и т р о ц и т и проучват Н.
D. Kay (1930), М. Unemo (1931) и J. Roche (1932).
L. J. Soffer и М. Wintrobe (1932) и з у ч а в а т м е т а ­
болизма на л е в к о ц и т и т е при здрави и болни о т
левкемия и о т к р и в а т , че м е т а б о л и т н а т а ак­
т и в н о с т на г р а н у л о ц и т и т е е сходна с т а з и на
з л о к а ч е с т в е н и т е к л е т к и и че консумацията на
кислород и г л и к о л и т и ч н а т а а к т и в н о с т на т е ­
зи к л е т к и е по-висока о т к о л к о т о при лимфоци-
т и т е . J. М. Barnes (1940) доказа в левкоцити на
зайци а к т и в н о с т на голям брой ензими - к а т е п -
син, нуклеаза, амилаза, липаза, лизозим и адено-
зиназа.
С ъ щ е с т в е н принос в р а з в и т и е т о на ц и т о ­
х и м и я т а н а к р ъ в н и т е к л е т к и и м а G. Gomori
(1939, 1952). G. Gomori и независимо о т него
H.Takamatsu са разработили м е т о д за цитохи-
мично доказване а к т и в н о с т т а на фосфатази,
к о й т о м е т о д след подходящи модификации мо­
ж е да се приложи за определяне на много други
ензими.
М. L. Menten и с ъ т р . (1944) р а з р а б о т в а т ме­
т о д и за цитохимично изследване на фосфатази
с азо-бои, при к о е т о н а ф т о л ъ т , к о й т о е н з и м ъ т
освобождава о т a-naphthyl phosphate се свързва
о т диазониева сол и се образува ярко о ц в е т е н
комплекс.
Следващ, много важен е т а п в р а з в и т и е т о н а
е н з и м н а т а ц и т о х и м и я ß х е м а т о л о г и я т а о из-
337
ползването на тетразолиеви съставки к а т о ак-
цептори на кислорода при изследване на дехид-
рогеназите (A. М. Seligman и сътр., 1949).
ФАЗИ НА ЦИТОХИМИЧНИТЕ
ИЗСЛЕДВАНИЯ
1. М а т е р и а л з а и з с л е д В а н е . Ц и т о х и м и ч -
нише изследвания 6 хемашолозияша се избър-
ш в а т обикновено е м а т е р и а л о т пълна кръв,
левкоиитен к о н ц е н т р а т , к о г а т о о б щ и я т
брой н а л е в к о ц и т и т е в к р ъ в т а е по-нисък
о т 5Х109/1, к о с т е н мозък, п у н к т а т о т лим­
фен възел и ц и т о л о г и ч н и о т п е ч а т ъ ц и о т
с р е з н а т а п о в ъ р х н о с т н а лимфен възел полу­
чен с биопсия.
2. П р и г о т В я н е н а н а т р и В к и . И з п о л з в а т
се ч и с т и и обезмаслени п р е д м е т н и с т ъ к л а
със с т а н д а р т н и размери. Ж е л а т е л н о е н а т ­
р и в к и т е да се п р и г о т в я т о т биологичния
м а т е р и а л без д а се и з п о л з в а т а н т и к о а г у л а н -
т и . К о г а т о т о в а е т р у д н о изпълнимо или е
невъзможно, к а т о а н т и к о а г у л а н т се препо­
ръчва K2EDTA, к о й т о н е п р о м е н я в и д и м о
морфологията н а к р ъ в н и т е к л е т к и . Хепари-
н ъ т (1:10) също не променя с ъ щ е с т в е н о мор­
ф о л о г и я т а н а л е в к о ц и т и т е и м о ж е д а се из­
ползва к а т о а н т и к о а г у л а н т , к о г а т о о б е к т
н а ц и т о х и м и ч н и т е и з с л е д в а н и я т а с а левко­
ц и т и т е . Р а з с т и л а н е т о н а м а т е р и а л а след­
ва да се направи н а много т ъ н ъ к слой.
Н а т р и в к и т е се о с т а в я т д а и з с ъ х н а т н а
с т а й н а т е м п е р а т у р а з а 2 h, 24 h до 48 h пре­
ди д а б ъ д а т фиксирани. По-бързо изсушава­
не може д а се п о с т и г н е с п о м о щ т а н а не-
т о п л а въздушна с т р у я о т сешоар или чрез
енергично движение с ръка. Не се препоръч­
ва изсушаване н а н а т р и в к и при висока т е м ­
п е р а т у р а . Б ъ р з о т о изсушаване п р е д о т в р а ­
т я в а п о я в а т а н а „сбръчкани", п и к н о т и ч н и
к л е т к и и осигурява у с т о й ч и в о с т н а н а т р и в ­
к и т е при с л е д в а щ и т е процедури.
3. Ф и к с и р а н е . Ф и к с а т о р и т е , к о и т о се из­
ползват в ц и т о х и м и я т а т р я б в а да отгова­
р я т н а няколко важни изисквания:
• 9^ ф и к с и р а т ефикасно;
• д а не р а з р у ш а в а т или и н а к т и в и р а т ве­
щ е с т в а т а , които са обект на цитохи-
м и ч н о т о изследване;
• да не с ъ з д а в а т а р т е ф а к т и .
По-голяма ч а с т о т и з п о л з в а н и т е понас­
т о я щ е м ф и к с а т о р и с а о т к р и т и емпирич-
338
но. В з а в и с и м о с т о т п р и р о д а т а н а изслед­
в а н о т о в е щ е с т в о - с у б с т р а т , ензим или дру­
ги се и з п о л з в а т различни фиксиращи вещес­
т в а . Н а й - ч е с т о се п р и л а г а т : формалинови
пари; р а з т в о р н а ф о р м а л и н - е т а н о л (1 ч а с т
40% формалин + 9 ч а с т и а б с о л ю т е н е т а -
нол); 70% е т а н о л ; а ц е т о н ; поливинилпироли-
дон; соли н а т е ж к и м е т а л и - OSO4 з а е л е к т ­
р о н н а ц и т о х и м и я . ф и к с и р а н е т о с формали­
нови п а р и се п р о в е ж д а в п л ъ т н о з а т в о р е н а
хелендалова к ю в е т а . Н а д ъ н о т о се п о с т а в я
п а м у к или м а р л я , н а в л а ж н е н и с формалинов
р а з т в о р с определена к о н ц е н т р а ц и я и pH.
4. Т р е т и р а н е с ъ с с у б с т р а т .
5. Ц В е т н а р е а к ц и я .
6. „ О б е з ц В е т я В а н е " - з а о т с т р а н я в а н е н а
артефакти.
7. К о н т р а с т н а о ц В е т к а , при к о я т о обик­
новено се о ц в е т я в а т я д р а т а н а к л е т к и т е .
Тази ф а з а е много в а ж н а з а и д е н т и ф и ц и р а ­
не н а к л е т к и т е при наблюдение н а препа­
рата.
П р о ц е д у р и т е н а измиване с ч е ш м я н а во­
д а се о с ъ щ е с т в я в а т с ъ щ о в хелендалова кю­
в е т а , к а т о по с т е н и т е н а к ю в е т а т а се ос­
т а в я д а т е ч е слаба с т р у я вода.
8. О т ч и т а н е н а р е з у л т а т а . О т ч и т а н е ­
т о н а р е з у л т а т и т е м о ж е д а се извърши по
д в а начина, в з а в и с и м о с т о т т и п а н а ц и т о -
х и м и ч н о т о изследване и о т т е х н и ч е с к и т е
възможности н а лабораторията:
• С у б е к т и в н о - визуално-микроскопско, при
к о е т о се и з в ъ р ш в а :
- к а ч е с т в е н а оценка: ( + ) или (-),
- п о л у к о л и ч е с т в е н а оценка: ( + ) , ( + + ) и
т . н . , или с цифрови означения - 1., 2., 3.,
и т . н . с т е п е н н а и н т е н з и в н о с т н а ре­
акцията.
Субективното о т ч и т а н е на резултати­
т е се и з в ъ р ш в а с обикновен с в е т л и н е н мик­
роскоп при увеличение 100x10.
• Обективно - с а п а р а т и , к о и т о о т ч и т а т
ц и т о х и м и ч н и реакции.
9. К о н т р о л . З а изключване н а неспецифич­
н а р е а к ц и я при е н з и м и т е , к о н т р о л н и н а т ­
ривки се и н к у б и р а т при с ъ щ и т е условия, но
в среда без с у б с т р а т или след и н а к т и в и р а -
н е н а е н з и м и т е (5 m i n във в р я щ а д е с т и л и ­
р а н а вода след фиксиране н а н а т р и в к и т е ) .
При PAS р е а к ц и я т а к о н т р о л а т а се о б р а б о т ­
в а с амилазен р а з т в о р (или слюнка).
Материали, уреди и апарати,
необходими з а изВършВаие
на цитохимични реакции
1. П р е д м е т н и с т ъ к л а - п о ч и с т е н и и обез­
маслени;
2. П и п е т и , с т ъ к л е н и чаши, колби;
3. Ваничка с н о с и т е л и з а н а т р и в к и и кюве-
т и (хелендалови);
4. А н а л и т и ч н а в е з н а ;
5. П е х а м е т ъ р ;
6. Обикновен с в е т л и н е н микроскоп.
З а б е л с Л к а . в разделите „Реактиви" на вся­
ка иитохимична реакция от следващото из­
ложение, част от реактивите ще бъдат из­
писани на латиница.
ЦИТОХИМИЧНИ МЕТОДИ
ЗА ДОКАЗВАНЕ НА
ПЕРОКСИДАЗА, ФОСФАТАЗИ
И ЕСТЕРАЗИ
М. П е н е в
II. Д ук о в а - П е н е в а
ПЕРОКСИДАЗА
Принцип. К л е т ъ ч н и т е пероксидази с а ен­
зими, к о и т о в п р и с ъ с т в и е т о н а водороден
прекис к а т а л и з и р а т о к и с л е н и е т о н а специ­
фични с у б с т р а т и . П е р о к с и д а з и т е к а т а л и ­
з и р а т п р е н о с а н а д в а е л е к т р о н а о т суб­
с т р а т а к ъ м водородния прекис, при к о е т о
се о б р а з у в а т окислен с у б с т р а т и вода. Про­
т и ч а с л е д н а т а реакция:
АН2 + Н 2 0 2 —• А + 2 Н 2 0
Окисленият с у б с т р а т преципитира на
м е с т а т а с пероксидазна а к т и в н о с т във вид
н а ц в е т н и гранули. Ц в е т ъ т н а г р а н у л и т е
зависи о т използвания с у б с т р а т ,
М и е л о п е р о к с и д а з а т а е лизозомен ензим,
к о й т о се н а м и р а в а з у р о ф и л н и т е гранули н а
г р а н у л о ц и т и т е и м о н о ц и т и т е . В лимфоци-
т и т е миелопероксидаза н е се у с т а н о в я в а .
М е т о д н а G. G r a h a m - W. K n o l l
Реактиви
1. Фиксатор:
• 10% (v/v) формалин-етанолов р а з т в о р : 10
ml 40% (v/v) формол се смесва с 90 ml 96%
(v/v) е т а н о л или
• формалинови пари.
2. Инкубационна смес. В м е р и т е л е н цилин­
дър се с м е с в а т : benzidine - „на върха н а но­
жа", около 250 mg, к о й т о се р а з т в а р я в 6 ml
е т а н о л . П о л у ч е н а т а смес се р а з р е ж д а с 4 ml
д е с т и л и р а н а вода. П р и б а в я се 0.02 ml 3%
(v/v) водороден прекис. (Внимание: р а з т в о ­
р ъ т н а водородния прекис следва д а се при­
г о т в я в д е н я н а провеждане н а т е с т а . При
п р е с т о й п о с т е п е н н о „ о т с ла б в а " и реакция­
т а з а пероксидаза е слаба или н е г а т и в н а . Ко­
л и ч е с т в о т о м у в с у б с т р а т а не бива да над­
в и ш а в а о п р е д е л е н о т о , т ъ й к а т о миелопе­
р о к с и д а з а т а се и н а к т и в и р а и не се п о з и т и -
вира р е а к ц и я т а ) .
3. Боя на Ром а /iовск и ü -Giemsa.
Техника
1. Изсушени н а въздуха н а т р и в к и се фикси­
р а т с формалин-етанолов р а з т в о р - 30 s, или
във формалинови п а р и - 15 min. Фиксиране­
т о във формалинови пари се о с ъ ш е с т в я в а ,
к а т о н а д ъ н о т о н а хелендалова к ю в е т а се
п о с т а в и памук, напоен с формалин и кюве-
т а т а п л ъ т н о се з а т в о р и . 2. ф и к с и р а н и т е
н а т р и в к и се и з м и в а т с т е ч а ш а вода -15 min.
И з с у ш а в а т се. 3. Н а т р и в к и т е се з а л и в а т с
и н к у б а ц и о н н а т а смес з а 10 min н а с т а й н а
т е м п е р а т у р а . 4. И з м и в а т се с т е ч а ш а вода
2 min. И з с у ш а в а т се. 5. О ц в е т я в а т се с ра­
б о т е н р а з т в о р н а Романовский-Giemsa - 20-
40 min. И з м и в а т се с вода и се и з с у ш а в а т . 6.
Микроскопиране.
Отчитане н а резултатите
и интерпрета цип
При м е т о д а н а G.Graham - W. Knoll със суб­
с т р а т бензидин, миелопероксидаза-положи-
т е л н и т е гранули с а о ц в е т е н и ж ъ л т о з е л е н о
до кафяво.
П о л о ж и т е л н а реакция се наблюдава в ци-
т о п л а з м а т а н а к л е т к и т е о т неутрофилна-
т а и е о з и н о ф и л н а т а к л е т ъ ч н а линия в с т а ­
д и и т е о т п р о м и е л о ц и т до с е г м е н т о я д р е н а
339
к л е т к а . С ъ щ е с т в у в а т два различни т и п а
миелопероксидаза - н е у т р о ф и л н а и е о з и -
нофилпа, к а т о еозинофилната е резистен­
т н а н а цианиди. Миелопероксидазна а к т и в ­
н о с т моЛе д а се наблюдава в м и е л о б л а с т и ,
к о и т о н я м а т гранули в ц и т о п л а з м а т а си.
В базофилната линия силно п о л о ж и т е л н а ак­
т и в н о с т се н а м и р а в с т а д и и т е промиело-
ц и т и и миелоцити. При б а з о ф и л н и т е м е т а -
м и е л о ц и т и а к т и в н о с т т а н а е н з и м а е по-
слаба, к а т о в с е г м е н т о я д р е н и т е базофили
п о ч т и липсва. В м о н о ц и т н а т а линия мие-
лопероксидазата и м а по-слаба а к т и в н о с т ,
п р е д с т а в е н а о т по-малко н а брой и разпръс­
н а т и гранули в ц и т о п л а з м а т а . П о - р а н н и т е
форми н а м о н о ц и т н а т а линия, в к л ю ч и т е л ­
но п р о м о н о ц и т и т е и н е д и ф е р е н ц и р а н и т е
мон об ласти не с ъ д ъ р ж а т пероксидазна ак­
тивност. Лимфоцитите, мегакариоцитите
и е р и т р о ц и т и т е с а миелопероксидазанега-
тивни.
Активност на ензима се наблюдава в подгру­
п и т е М,, М2, Мд, М4 и М5 ( + /-) на о с т р а т а не-
лимфобластна левкемия (ANLL). Пръчиците на
Auer са миелопероксидаза-положителни. А т и -
пичните бласти при о с т р а т а лимфобластна
левкемия (ALL) не съдържат а к т и в н о с т на мие­
лопероксидаза. Налице е успоредност между ми-
елопероксидазната а к т и в н о с т и суданофилия-
т а на к л е т к и т е при голяма ч а с т о т случаите
на о с т р а левкемия, но често се наблюдават слу­
чаи на М!, М2 или М4 с бласти, позитивни само
на миелопероксидаза или само на липиди (хими­
ческа анаплазия). Счита се, че доказването на
липиди е по-чувствителен цитохимичен маркер
за миелобластния т и п левкемии.
Аипса на миелопероксидазна а к т и в н о с т в не-
утрофшште може да се наблюдава при вроден
недоимък на пероксидаза и при някои форми на
миелодиспластичен синдром.
Специфична т р о м б о ц и т н а пероксидаза се
наблюдава в мегакариобластите и при о с т р а ме-
гакариобластна левкемия (М7),
Saöcjiejkhci. Б е н з и д и н ъ т , някои негови про­
изводни, к а т о benzidine hydrochloride, а л т е р ­
н а т и в н и с у б с т р а т и (o-tolidine), с а канцеро­
генни. Поради т о в а з а изследване н а миело-
п е роксидаз ната а к т и в н о с т се п р е п о р ъ ч в а т
с у б с т р а т и с по-малък здравен риск, к а т о 4-
chloro-1-naphthol, к о й т о д а в а надеждни ре­
з у л т а т и и н я м а доказана в р е д н о с т з а рабо­
т е щ и т е в л а б о р а т о р и я т а . При т о з и м е т о д
г р а н у л и т е с миелопероксидазна а к т и в н о с т
са о ц в е т е н и с и н ь о - ч е р и о .
340
ФОСФАТАЗИ
А л к а л н и т е и к и с е л и т е ф о с ф а т а з и с а широ­
ко р а з п р о с т р а н е н и ензими в к л е т к и т е и т ъ ­
к а н и т е . Т я х н о т о основно с в о й с т в о е при ал­
кални или кисели с т о й н о с т и н а pH д а осво­
б о ж д а в а т неорганичен ф о с ф а т о т редица
алкохолни или фенолови ф о с ф о м о н о е с т е р и .
Алкална ф о с ф а т а з а
6 неутрофилните гранулоцити
М е т о д n a Н. M e r k e r и L. H e i l m e y e r
П р и н ц и п . А л к а л н а т а ф о с ф а т а з а се н а м и ­
р а във в т о р и ч н и т е гранули н а н е у т р о ф и л ­
н и т е л е в к о ц и т и . Е н з и м ъ т хидролизира п р и
алкално pH с у б с т р а т а н а т р и е в а - н а ф т и л -
ф о с ф а т . О с в о б о д е н и я т при х и д р о л и з а т а а -
н а ф т о л се свързва с диазониева сол и обра­
зува н е р а з т в о р и м ц в е т е н комплакс о т азо-
боя. О б р а з у в а н и т е ц в е т н и комплекси пре-
ц и п и т и р а т н а м я с т о т о н а хидролизата н а
субстрата.
Реактиви
1. Фиксатор: н е у т р а л е н формалин - 40%.
2. Инкубационна смес. В хелендалова кюве-
т а се с м е с в а т : 2% р а з т в о р н а веронал н а т ­
рий - 70 ml; sodium a - n a p h t h y l p h o s p h a t e - 35
mg; Variamine blue В сопс - 70 mg. Диазоние-
в а т а сол се р а з т в а р я п р е д в а р и т е л н о в ч а с т
о т буфера, ф и л т р и р а се и се с м е с ва със суб­
с т р а т а , който е разтворен в останалата
ч а с т о т буфера.
3. Воден разтвор на х е м а л а у н - 1%.
Техника
1. Изсушени н а въздуха пресни н а т р и в к и (до
2-4 h о т в з е м а н е т о н а м а т е р и а л а ) се фикси­
р а т във формалинови п а р и - 15 m i n н а с т а й ­
н а т е м п е р а т у р а . 2. ф и к с и р а н и т е н а т р и в ­
ки се и з м и в а т с т е ч а щ а вода - 15 min. Изсу­
ш а в а т се. 3. Н а т р и в к и т е се п о с т а в я т в хе­
лендалова к ю в е т а с инкубационен р а з т в о р
з а 60 m i n при т е м п е р а т у р а 40С. 4. Н а т р и в ­
к и т е се и з м и в а т в н и м а т е л н о с т е ч а щ а во­
да. И з с у ш а в а т се. 5. К о н т р а с т н о о ц в е т я ­
ва н е с хемалаун - 8 min. И з м и в а т се с вода и
се и з с у ш а в а т . 6. Микроскопиране.
Отчитане н а р е з у л т а т и т е
и интерпретация
К л е т ъ ч н и т е у ч а с т ъ ц и , к о и т о с ъ д ъ р ж а т ал­
кална ф о с ф а т а з а се о ц в е т я в а т дифузно или
н а гранули в сепия кафяво до черно.
А к т и в н о с т н а алкална ф о с ф а т а з а в кръв­
ни к л е т к и се у с т а н о в я в а и о т ч и т а в зрели­
т е неутрофилни гранулоцити - пръчкоядре-
н и т е и с е г м е н т о я д р е н и т е неутрофили.
Еозинофилни и базофилни гранулоцити, мо-
н о ц и т и , лимфоцити, т р о м б о ц и т и и е р и т -
р о бла с ти не с ъ д ъ р ж а т ф о с ф а т а з н а а к т и в ­
ност.
А к т и в н о с т т а на алкалната фосфатаза
се определя чрез сбора о т а к т и в н о с т т а н а
пръчкоядрените или с е г м е н т о я д р е н и т е не­
утрофилни гранулоцити. В з а в и с и м о с т о т
и н т е н з и в н о с т т а н а о ц в е т я в а н е и броя н а
о ц в е т е н и т е гранули, к л е т к и т е се разпре­
д е л я т в 6 групи:
0. - к л е т к и т е не с ъ д ъ р ж а т ф о с ф а т а з н а ак­
тивност,
1. - слаба дифузна а к т и в н о с т с единични гра­
нули, разположени в ц е н т р а л н а т а ч а с т
на ц и т о п л а з м а т а ,
2. - а к т и в н о с т т а и г р а н у л и т е о б х в а щ а т по-
голяма ч а с т о т ц и т о п л а з м а т а , но разп­
р о с т р а н е н и е т о не е равномерно, и м а
у ч а с т ъ ц и без а к т и в н о с т ,
3. - дифузна равномерно р а з п р о с т р а н е н а ак­
тивност в цитоплазмата,
4. - в ч а с т о т п о в ъ р х н о с т т а н а к л е т к а т а
п о з и т и в н и т е гранули се с л и в а т в и н т е н ­
зивно т ъ м н а о ц в е т к а и п о к р и в а т о т ч а с ­
т и ядрото.
5. - и н т е н з и в н а п о з и т и в н а о ц в е т к а , к а т о
г р а н у л и т е се с л и в а т , заемайки ц я л а т а
повъхност н а к л е т к а т а и ч е с т о покри­
в а т ядрото.
О ц е н я в а т се 100 пръчкоядрени или сегмен-
т о я д р е н и неутрофила и се разпределят в съ­
о т в е т н и т е групи въз основа н а и н т ен зи в­
н о с т т а и вида н а о ц в е т к а т а . Б р о я т н а
к л е т к и т е о т всяка група се умножава по но­
мера на г р у п а т а - 0, 1, 2, 3, 4, 5. Произведе­
н и я т а о т всички групи се с у м и р а т и обра­
з у в а т сбора, с к о й т о се означава а к т и в н о с т ­
т а на а л к а л н а т а ф о с ф а т а з а . Този сбор т е о ­
р е т и ч н о може да бъде в г р а н и ц и т е о т 0 до
500.
О ц е н к а т а н а а л к а л н а т а ф о с ф а т а з а е су­
бективна. Н а й - ч е с т и я т и з т о ч н и к н а греш­
ки е неидентифицирането н а неутрофили с
нулева а к т и в н о с т поради н е д о с т а т ъ ч н о
добро о ц в е т я в а н е я д р о т о н а к л е т к а т а . За
намаляване размера на с у б е к т и в н и т е греш­
ки се препоръчва два п р е п а р а т а о т изслед­
вания п а ц и е н т да се изследват о т двама
специалисти. Р е з у л т а т и т е са приемливи,
ако р а з л и к а т а между д в е т е с т о й н о с т и е под
10%, При по-голяма разлика се препоръчва
изследване н а т р е т а н а т р и в к а .
За референтни граници на алкалната фос­
ф а т а з а в н е у т р о ф и л и т е в л и т е р а т у р а т а се
посочват най-често с т о й н о с т и 20-80. Пред­
вид възможните източници на грешки, е пре­
поръчително всяка лаборатория да създаде
свои референтни граници.
Алкалната ф о с ф а т а з а в л е в к о ц и т и т е се из­
следва най-често при диференциална диагноза на
хронична гранулоцитна левкемия (CGL) и нелев-
кемични миелопролиферативни заболявания с
левкемоидна реакция о т гранулоцитен т и п . Ал­
к а л н а т а ф о с ф а т а з а е с нормална или повишена
а к т и в н о с т при и с т и н с к а полицитемия, миело-
фиброза, есенциална т р о м б о ц и т е м и я , а к т и в н а
фаза на б о л е с т т а н а Hodgkin, апластична ане­
мия, бактериални инфекции, приложение на кор-
т и к о с т е р о и д и , бременност.
Намалена а к т и в н о с т на а л к а л н а т а фосфата­
за в л е в к о ц и т и т е се наблюдава при CGL, парок-
сизмална нощна хемоглобинурия, фамилна хипо-
ф о с ф а т е м и я , сидеробластна анемия, сърпови-
доклетъчна анемия. Ниски с т о й н о с т и на ензи­
м а се н а м и р а т при о с т р и нелимфобластни лев-
кемии, а с т о й н о с т и в референтни граници или
повишена а к т и в н о с т се наблюдават при о с т р и
лимфобластни левкемии. Тези данни и м а т огра­
ничена с т о й н о с т поради т р у д н о т о намиране на
д о с т а т ъ ч е н брой зрели неутрофилни гранулоци­
т и за оценяване а к т и в н о с т т а на ензима. Ос­
вен в н е у т р о ф и л и т е , в изключително редки слу­
чаи к л е т ъ ч н а алкална фосфатаза може да се наб­
людава в б л а с т н и т е к л е т к и при ANLL и в к л е т ­
к и т е при лимфопролиферативни болести.
ЕСТЕРАЗИ
Е с т е р а з и т е са лизозомни ензими и хидроли­
з и р а т алифатни и а р о м а т н и естери. Номен­
к л а т у р а т а н а е с т е р а з и т е не е напълно
у т о ч н е н а и съдържа някои противоречия. В
ц и т о х и м и я т а с т е р м и н а естерази или нес­
пецифични еспгерази обикновено се означа­
в а т ензими, к о и т о м о г а т да хидролизират
по-прости е с т е р и на несъдържащи а з о т ал­
кохоли и органични киселини.
341
 Ензимите, к о и т о хидролизират е с т е р и
на холина се н а р и ч а т със специфични имена
- ацешилхолинесшераза и холинесшераза. е-
зи ензими се и н х и б и р а т о т езерин и фос-
форорганични с ъ с т а в к и .
В х е м а т о л о г и я т а за изследване а к т и в ­
н о с т т а на е с т е р а з и т е се използват различ­
ни с у б с т р а т и (нетипични за организма), ка­
т о названието на с у б с т р а т а у ч а с т в а в об­
разуване н а и м е т о н а ензима. Използвани­
т е с у б с т р а т и са с различна сложност и т о ­
ва е предпоставка за разли ки т е в т е р м и н о ­
л о г и я т а на т е з и ензими, срещани в л и т е р а ­
т у р а т а . Всички изследователи в к л ю ч в а т в
г р у п а т а на н е с п е ц и ф и ч н и т е е е т е р а з и
и-нафтил-ацетат естераза (и а-нафтил-бу-
тират естераза), но някои а в т о р и (Н. Stob-
be, Goasguen и Bennet) определят к а т о „нес­
пецифична" и нафтол-А8-ацетат естераза-
та, с ъ о т в е т н о нафтол-АЗО-ацетат есте-
розата. Голяма ч а с т о т и зсле д оват ели т е
приемат, че поради в и с о к а т а си с у б с т р а т -
на специфичност нафтол-АЗ-О-хлорацетат
естеразата е специфична гранулоцитна и
следователно условно не се причислява към
неспецифичните еетерази. Това не изключ­
ва о б е д и н я в а щ и я т е р м и и е е т е р а з и за
т р и т е с п о м е н а т и по-горе ензима- а-наф-
тил-ацетат естераза, нафтол-А8-ацетат
естераза и нафтол-АЗ-О-хлорацетат есте­
раза.
Цитохимичното изследване а к т и в н о с т ­
т а на е с т е р а з и т е се извършва по един общ
принцип. К а т о с у б с т р а т и се използват раз­
лични а ц е т а т н и е с т е р и , к о и т о се разграж­
д а т о т с ъ о т в е т н и т е еетерази. Отделени­
я т при определено pH и т е м п е р а т у р а наф-
тол се свързва с диазониева сол, при к о е т о
се образува неразтворима азо-боя с висока
и н т е н з и в н о с т на ц в е т а . Локализацията в
к л е т к а т а н а образувания ц в е т е н п р о д у к т
с ъ о т в е т с т в а на м я с т о т о н а п р о т и ч а н е н а
е н з и м н а т а реакция.
а-нафтил-ацетат сстераза
М е т о д н а Н. Löffler
П р и н ц и п . Е с т е р а з а т а разгражда и-наф-
т и л - а ц е т а т , к а т о о т д е л е н и я т н а ф т о л се
свързва с диазониевата сол парарозанилин
Образуваните ц в е т н и комплекси преципи-
т и р а т на м я с т о т о н а хидролизата н а суб-
342
страта.
Реактиви
1. Sodium nitrite, 4% р а з т в о р в дестилирана
вода.
2. Pararosaniline, р а з т в о р - 2g pararosaniline
се р а з т в а р я т в 50 ml 2 mol/1 HCl посредс­
т в о м леко загряване. След к а т о и зсти н е,
р а з т в о р ъ т се ф и л т р и р а .
3. Д в а т а р а з т в о р а (1 и 2) се с ъ х р а н я в а т в
кафяви с т ъ к л е н и контейнери, в хладил­
ник. Р а з т в о р и т е са т р а й н и няколко ме­
сеца.
4. a-Naphthyl Acetate.
Техника
1. Фиксиране. Тънка кръвна н а т р и в к а , изсу­
шена н а въздух (може да се съхранява до 3
дни в среда без запрашване) се фиксира н а
формалинови пари - 4 min. 2. Промива са н а
т е ч а щ а вода - 15 min. Изсушава се н а въз­
дух. Н а т р и в к и о т к о с т е н мозък предвари­
т е л н о се о б е з м а с л я в а т с е т е р за 30-60 s. 3.
Н а т р и в к и т е се п о с т а в я т з а 60 min в инку­
бационен р а з т в о р , винаги прясно приготвен
по следния начин: 3.1. С м е с в а т се: 0.05 ml (1
капка) воден р а з т в о р н а sodium nitrite и 0.05
ml (1 капка) воден р а з т в о р н а pararosaniline.
Р а з м е с в а т се в продължение н а 1 min. Р а з т ­
в а р я т се в 5 ml 0.2 mol/1 ф о с ф а т е н буфер, с
pH 7.0-7.1 10.13 mol/1 Na 2 HP0 4 .2H 2 0 (23.14 g),
0.07.mol/1 NaH 2 P0 4 .2H 2 0 (10.02 g), дестили­
р а н а вода до 1000 mlj. 3.2. Р а з т в а р я т се 10
m g (x-Naphthyl Acetate в 0.2-0.3 ml химически
ч и с т а ц е т о н . П р и б а в я т се при енергично
разбъркване 20 ml 0.2 mol/1 ф о с ф а т е н буфер,
pH 7.0-7.1. 3.3. Д в а т а р а з т в о р а се с м е с в а т и
се ф и л т р и р а т в к ю в е т и . 4. Н а т р и в к и т е се
и з м и в а т с т е ч а щ а вода з а 1 min. Изсуша­
в а т се н а въздух. 5. О ц в е т я в а т се с хемала-
ун за 8 min. в. П о т о п я в а т се в чешмяна вода
з а 15 min. И з с у ш а в а т се н а въздух. 7. Мик-
роскопиране.
Методи з а контрол
1. Приготвяне н а инкубационен р а з т в о р без
cx-Naphthyl Acetate.
2. Паралелно инкубиране и о ц в е т я в а н е н а
н а т р и в к и и о т здрави лица.
3. И н а к т и в и р а н е н а ензима чрез загряване
н а ф и к с и р а н а т а н а т р и в к а в гореща вода.
Отчитане л а резултатите
и интерпретацил
Е с т е р а з н а т а а к т и в н о с т се проявява к а т о
кафяв п р о д у к т в хомогенен или гранулиран
вид.
Най-висока а к т и в н о с т н а ензима се наб­
людава в м о н о ц и т и и промоноцити. Поради
т о в а н а х о д к а т а е много с ъ щ е с т в е н а при ди­
ференциране н а о с т р и левкемии о т моно-
ц и т н и я ред. А к т и в н о с т н а ензима се нами­
р а също в м егакариоц и т и , т р о м б о ц и т и и в
по-слаба с т е п е н - в е р и т р о б л а с т и , промие-
лоцити, миелоцити, п л а з м а т и ч н и к л е т к и и
лимфоцити, и лимфобласти.
Полуколичествена оценка н а а к т и в н о с т ­
т а н а а - н а ф т и л - а ц е т а т е с т е р а з а т а може
д а се извърши п о с р е д с т в о м групиране н а
к л е т к и т е по следния начин:
Степен 1. Малко гранули в ц и т о п л а з м а т а
н а единични к л е т к и .
Степен 2. Единични гранули в ц и т о п л а з м а ­
т а н а п о ч т и всички к л е т к и .
Степен 3. Голям брой груби гранули в ц и т о п ­
л а з м а т а н а всички к л е т к и .
Степен 4. Дифузни груби гранули и з п ъ л в а т
почти ц я л а т а цитоплазма, ч е с т о покриват
ядрото.
В и с о к а т а а к т и в н о с т н а а - н а ф т и л аце-
т а т е с т е р а з а т а в м о н о ц и т и т е може да се
инхибира с н а т р и е в флуорид. К л е т к и т е о т
г р а н у л о ц и т н а т а и л и м ф о и д н а т а линия
обикновено не с ъ д ъ р ж а т а к т и в н о с т на т о ­
зи ензим.
Инхибирапс на а - н а ф т и л - а ц е т а т
естераза
Метен] н а R. F i s c h e r u F. S c h m a l z !
Реактиви
1. Към с у б с т р а т н о - б у ф е р н и я р а з т в о р се
прибавя 1.5 m g NaF н а 1 ml с у б с т р а т н о -
буферен р а з т в о р .
2. Всички други р е а к т и в и са к а к т о при изс­
ледване н а а - н а ф т и л а ц е т а т е с т е р а з а .
Отчитане н а резултатите
и интерпретация
Положителна а к т и в н о с т на а-нафтил-аце­
т а т е с т е р а з а т а се проявява във вид н а ка­
фяви гранули в ц и т о п л а з м а т а на к л е т к и т е .
Прибавянето н а NaF в инкубационната
смес инхибира избирателно е с т е р а з н а т а ак­
т и в н о с т в м о н о ц и т и т е и т е изглеждат о т ­
р и ц а т е л н и или много слабо положителни.
Инхибирането н а е с т е р а з н а т а а к т и в н о с т
е важен к р и т е р и й при идентифицирането
на м о н о ц и т и и промоноцити в к р ъ в т а и в
к о с т н и я мозък, к а к т о и за диференциране­
т о н а левкемии о т м о н о ц и т н и я ред.
Заедно или вместо а-нафтил-ацетат есте­
раза, може да се изследва и-нафтил-бутират ес­
тераза, която е положителна при моноцитите
и обикновено е отрицателна при неутрофили-
т е и лимфоцитите. а-нафтил-бутират естера­
з а т а е по-малко чувствителна о т а-нафтил-аце­
т а т естеразата, но е по-спицифична.
Нафтол-А8-ацетат естераза
Memocj н а Н. Löffler
П р и н ц и п . Е с т е р а з а т а разгражда нафтол-
A S - а ц е т а т , к а т о о т д е л е н и я т н а ф т о л се
свързва с диазониевата сол Fast red violet LB
salt. Образуваните ц в е т н и комплекси пре-
ц и п и т и р а т на м я с т о т о на е н з и м н а т а ре­
акция.
Реактиви
1. фиксатор. 40% (v/v) формол в к ю в е т а за
фиксиране на формалинови пари.
2. Инкубационен разтвор. 8 mg Naphthol-AS-
Acetate (0.1 mg/ml инкубационен разтвор)
се р а з т в а р я в 1 ml а ц е т о н и при енергич­
но размесване се прибавя н а капки към 80
ml 0.1 mol/1 ф о с ф а т е н буфер с pH 6.8-7.0.
Р а з т в о р ъ т п о м ъ т н я в а независимо о т
размесването. П р и б а в я т се 160 mg Fast
red violet LB salt (2 mg/ml). Р а з т в о р ъ т се
филтрира в кювета.
3. Кисел х е м а л а у н no Mayer.
Техника
1. Изсушена на въздуха за 1-3 h н а т р и в к а се
фиксира във формалинови пари - 5 min. 2. Из­
мива се с дестилирана вода. 3. Н а т р и в к а т а
се п о с т а в я в инкубационния р а з т в о р н а
с т а й н а т е м п е р а т у р а , при възможност на
т ъ м н о - за 70 min. 4. Измива се к р а т к о с т е ­
чаща вода. 5. К о н т р а с т н а о ц в е т к а с кисел
хемалаун no Mayer - 8 min. 6. Н а т р и в к а т а
343
се измива с т е ч а щ а вода. Изсушава се и се
наблюдава. 7. Микроскопиране.
Ошчишале н а р е з у л т а т и т е
Продуктът о т реакцията за активност на
нафтол-А8-ацетат естераза преципитира
във вид н а червено о ц в е т е н и гранули или к а ­
т о хомогенно о ц в е т я в а н е . А к т и в н о с т т а н а
ензима в р а з л и ч н и т е к л е т ъ ч н и линии е по­
добна н а н а б л ю д а в а н о т о при а - н а ф т и л аце-
т а т естераза.
Нафтол-А8-0-хлорацетат е с т е р а з а
Принцип. Е с т е р а з а т а разгражда н а ф т о л -
ASD-хлороацетат. О т д е л е н и я т н а ф т о л с е
свързва с д и а з о н и е в а т а сол парарозанилин,
при к о е т о се образува н е р а з т в о р и м а азо-боя.
Образуваните ц в е т н и комплекси преципи-
т и р а т на м я с т о т о н а е н з и м н а т а реакция.
Реактиви
1. Факсатор. Метанол-формалинов р а з т в о р
(1:9).
2. Инкубационен разтвор. Разтвор А: 3 к а п ­
ки 4% pararosaniline в 2 mol/1 HCl, 3 к а п к и
4% воден р а з т в о р н а н а т р и е в н и т р и т .
С м е с в а т се в продължение н а 1 min. При­
б а в я т се 60 ml 0.1 mol/1 веронал/HCl бу­
ферен р а з т в о р с pH 7.6 (pH н а р а з т в о р а
се довежда до 6.3 с 2 mol/1 HCL). Разтвор
Б: Р а з т в а р я т се 20 m g Naphthol-AS-D-
Chloroacetate в 2 ml d i m e t h y l f o r m a m i d e .
Разтворите А и Б се с м е с в а т и се ф и л т ­
р и р а т . Н а т р и в к а т а се инкубира в полу­
ч е н а т а смес з а 30 m i n н а с т а й н а т е м п е ­
ратура.
3. Хемалаун no Mayer.
Техника
1. Изсушена на въздуха прясна натривка се
фиксира - 30 s при 40С. 2. Измива се с т е ч а ­
ща вода. Изсушава се. 3. Поставя се в инку­
бационния разтвор на стайна т е м п е р а т у ­
ра - 30 min. 4. Измива се с течаищ вода. 5.
Кон-трастна оцветка с кисел хемалаун по
Mayer - 8 min. 6. Натривката се измива с
течаша вода - 10 min. 7. Натривката се из­
сушава. 8. Микроскопиране.
344
Отчитане н а резултатите
и интерпретация
П р о д у к т ъ т о т р е а к ц и я т а за нафтол-AS-D-
х л о р а ц е т а т е с т е р а з а се проявява във вид
на червено оцветени гранули.
Разпространението на а к т и в н о с т т а на наф-
тол-А8-0-хлорацетат естераза в различните ре­
дове клетки и степени на зрелост е много близ­
ка до находката при миелопероксидазата и на
липидите, изследвани със Sudan Black. Наблюда­
ва се тенденция към по-слаба а к т и в н о с т при
недиференцираните клетки. Нафтол-А8-В-хло-
р а ц е т а т е с т е р а з а се намира в гранулоцитна-
т а клетъчна линия, включително в първичните
гранули на неутрофилите, к а т о а к т и в н о с т т а
се увеличава със съзряването на клетките. Еози-
нофилните клетки са негативни. Моноцитите
са негативни или с ъ д ъ р ж а т слаба а к т и в н о с т .
Е с т е р а з и т е м о г а т да се използват за дифе­
ренциране на гранулоцитния т и п остри левке-
мии {М!, Мг, Мд) о т моноцитния т и п (М5). Лев-
кемичните миелобласти обикновено съдържат
а к т и в н о с т на нафтол-АЗ-О-хлорацетат е с т е ­
раза. Пръчиците на Auer също са положителни
за т о з и ензим. О с т р а т а нелимфоцитна левке­
мия М4 при к о я т о са налице клетки о т грануло­
ц и т н и я и о т моноцитния ред, се проявява с по­
ложителна а к т и в н о с т к а к т о за нафтол-А8-В-
х л о р а ц е т а т естераза, т а к а и за а-нафтил аце-
т а т е с т е р а з а или а - н а ф т и л - б у т и р а т естера­
за.
УЕДНАКВЕНА ТЕХНИКА ЗА
ОПРЕДЕЛЯНЕ АКТИВНОСТТА
НА НЕСПЕЦИФИЧНИ
ЕСТЕРАЗИ
ОПТИМИЗИРАН МЕТОД ЗА
ДОКАЗВАНЕ НА НАФТОЛ-А8-В
ХАОРАЦЕТАТ ЕСТЕРАЗА
Т. Ц в е т к о в а
АКТИВНОСТ НА НЕСПЕЦИФИЧНИ
ЕСТЕРАЗИ
М е т о д н а М. W a c h s t e i n - G. Wo!f
В м о д и ф и к а ц и я и а Т. Ц б е т к о В а
Модификацията дава възможност за прила­
гане на уеднаквени условия и реактиви (ед­
накъв фиксатор, буфер, диазониево съедине-
ние, багрило з а к о н т р а с т н о о ц в е т я в а н е ) ка­
т о т е х н и к а т а н а провеждане н а реакция­
т а е еднаква за о т д е л н и т е е с т е р а з и и се раз­
личава само по включения в инкубационния
разтвор субстрат.
П р и н ц и п . В р е з у л т а т н а ензимна хидроли­
за н а с т ъ п в а в ъ т р е к л е т ъ ч н о разграждане н а
използвания с у б с т р а т с о т д е л я н е н а a-naph-
thol, naphthol-AS- или naphthol-AS-D-, к о и т о
с д и а з о н и е в а т а сол F a s t Blue ВВ Salt образу­
в а т н е р а з т в о р и м о във вода азобагрило, кое­
т о се о т л а г а в ц и т о п л а з м а т а .
Реактиви
1. Фиксатор. 10% формалинов р а з т в о р с pH
7.0.
2. А ц е т о н
3. 0.1 mol/1 ф о с ф а т е н б у ф е р ( N a 2 H P 0 4 /
КагНгРС^) с pH 6.9
4. Propylenglykol - 1.2 (puriss, p.a.)
5. С у б с т р а т и ; 0.67 mmol/1 a-naphthylacetate
pure, 0.40 mmol/1 Naphthol-AS-acetate, 0.39
mmol/1 Naphthol-AS-D-acetate.
6. 4.2 mmol/1 F a s t Blue BB Salt.
7. Инкубационен разтвор. П р и г о т в я се е х
tempore'. 70 m g F a s t Blue BB се р а з т в а р я т
в 40 ml буфер. Р а з т в о р ъ т се ф и л т р у в а и
към ф и л т р а т а се п р и б а в я т 5 m g о т съ­
о т в е т н и я с у б с т р а т , р а з т в о р е н в 0.5 ml
а ц е т о н и н а к р а я 0.02 ml пропиленгликол.
8. Хематоксилинов р а з т в о р no Mayer.
Техника
1. Фиксиране н а прясно п р и г о т в е н и и изсу­
шени н а т р и в к и в продължение на 4 min във
формалинови пари. 2. Т р и к р а т н о измиване
н а н а т р и в к и т е с д е с т и л и р а н а вода, изсуша­
ване. 3. Инкубиране в р а з т в о р 7 з а 1 h н а
т ъ м н о , при с т а й н а т е м п е р а т у р а . 4. Трик­
р а т н о измиване с д е с т и л и р а н а вода, суше­
не. 5. К о н т р а с т н о о ц в е т я в а н е с р а з т в о р 8
з а 10 min. в. И з м и в а н е с ч е ш м я н а вода.
7. Микроскопиране.
П р о д у к т ъ т о т р е а к ц и я т а се о т л а г а в
м е с т а т а с ензимна а к т и в н о с т , предимно
на гранули или дифузия със синьо-зелен до
черен ц в я т при а - н а ф т о л - а ц е т а т или т ъ м ­
носин ц в я т при о с т а н а л и т е с у б с т р а т и .
О т ч и т а н е т о на р е з у л т а т и т е е к а к т о
при д р у г и т е цитохимични реакции - ч е т и -
ристепенно ( + , + + , + + + , + + + +), спо­
ред и н т е н з и т е т а н а оцветяване.
Уеднаквената т е х н и к а за доказване ак­
т и в н о с т т а н а неспецифични е с т е р а з и в
к л е т к и т е е удобна за п р а к т и к а т а , п е с т и
време, р е а к т и в и и създава условия за по-доб­
р а с р а в н и м о с т н а р е з у л т а т и т е , зависещи
единствено о т с у б с т р а т а , т . е . о т хетеро-
г е н н о с т т а н а г р у п а т а неспецифични е с т е ­
рази. За б л а с т и т е при М5 е х а р а к т е р н а по-
силно изразена ензимна специфичност към
нaфmoл-AS-aцemam при същевременно висо­
к а а к т и в н о с т и с д р у г и т е два с у б с т р а т а .
В л а с т н и т е к л е т к и при М2 и особено при
лимфобластния т и п се х а р а к т е р и з и р а т с
ниска, до липсваща а к т и в н о с т н а неспеци­
фичните естерази със с у б с т р а т нафтол-AS-
а ц е т а т и н а ф т о л - А 8 - 0 - а ц е т а т и слаба до
умерена - със с у б с т р а т с х - н а ф т и л а ц е т а т ,
к о я т о а к т и в н о с т не се п о т и с к а о т NaF. Ак­
т и в н о с т т а на неспецифичните е с т е р а з и в
б л а с т и т е при М5 и М4 (монобластния клон)
се п о т и с к а след внасяне на NaF към су б ст-
р а т н а т а смес.
Реакция с инхибиране активността на неспе­
цифични естерази. Провежда се по описания по-
горе начин, но с прибавяне към инкубационния
р а з т в о р на 0.03 mol/1 NaF (1.5 mg/ml). Реакция­
т а се н е г а т и в и р а избирателно в к л е т к и т е о т
м о н о ц и т н и я ред (в кръв и к о с т е н мозък), пора­
ди и з б и р а т е л н о т о п о т и с к а н е а к т и в н о с т т а на
к л е т ъ ч н и т е е с т е р а з и о т NaF.
АКТИВНОСТ НА НАФТОЛ AS-D-XAOPAIJE-
ТАТ ECTEFA3A
М о д и ф и ц и р а н м е т о д н а Т. Ц В е ш к о В а
П р и н ц и п . Образуване н а азобагрило между
нафтол-AS-D- и ф а с т блу ВВ след ензимна
хидролиза на нафтол-А8-0-хлорацетат. Не­
р а з т в о р и м о т о азобагрило се о т л а г а в ци­
т о п л а з м а т а н а к л е т к и с ензимна а к т и в ­
н о с т . Предимство на м е т о д а са достъпни­
т е реактиви и улеснената техника.
Реактиви
1. фиксатор. 36-38% формалинов р а з т в о р
2. 2.75 mmol/1 Naphthol-AS-D-chloracetate
345
3. 2.34 mmol/1 Fast Blue BB Salt
4. NN'-dimethylformamid
5. Работен р а з т в о р на буфер на Michaelis с
pH 7.4: Основен р а з т в о р (буфер н а Michae­
lis) 50.0 ml + 20 ml 8.5% NaCl + 52 ml
0.1 mol/1 HCl + 128 ml дестилирана вода.
6. Инкубационен разтвор. П р и г о т в я се е х
tempore. 40 mg нафтол-Ав-О-хлораиетат
се р а з т в а р я т в 1 ml NN'-диметилформа-
мид, п р и б а в я т се 20 ml буфер и 20 ml дес­
тилирана вода. Веднага след прибавяне н а
водата, т . е . в продължение н а 30 s се раз­
т в а р я т 40 mg ф а с т блу ВВ. Следва ф и л т ­
риране на р а з т в о р а в к ю в е т а т а з а инку­
бация.
7. Хематоксилинов р а з т в о р no Mayer.
Техника
1. Фиксиране на н а т р и в к и т е в р а з т в о р 1 з а
10 min. 2. Трикратно измиване с физиологи­
чен разтвор, изсушаване. 3. П о т а п я н е н а
н а т р и в к и т е в р а з т в о р 6 в продължение н а
30 min на т ъ м н о , при с т а й н а т е м п е р а т у ­
ра. 4. Трикратно измиване с дестилирана во­
да. 5. К о н т р а с т н о о ц в е т я в а н е в р а з т в о р 7
за 8 min. 6. Измиване с чешмяна вода и изсу­
шаване. 7. Микроскопиране.
Отчитане н а р е з у л т а т и т е
П р о д у к т ъ т о т р е а к ц и я т а се о т л а г а в учас­
т ъ ц и т е с ензимна а к т и в н о с т под форма­
т а на тъмносини гранули. Силно п о з и т и в ­
ни са к л е т к и т е о т всички м а т у р а ц и о н н и
форми на г р а н у л о ц и т н а т а серия, вкл. блас-
т и т е при М^ Mg, Мд, М4 (миелобластите),
М6 (миелобластите), поради к о е т о в л и т е -
р а т у р а т а т о з и ензим условно се обознача­
ва к а т о специфична е с т е р а з а .
346
ЦМТОХМММЧНИ МЕТОДИ
ЗА ДОКАЗВАНЕ НА ГАМКОГЕН,
АИПМДМ, КИСЕЛА ФОСФАТАЗА
И Ф ЕР И ТИ Н
М. П е н е в
TL Д ук о в а - П е н е в а
ГЛИКОГЕН
PAS р е а к ц и я n o J. M c M a n u s
и R. H o t c h k i s s
Гликогенът в к л е т к и т е се намира е д и н с т ­
вено в ц и т о п л а з м а т а , дифузно или във вид
н а гранули. У с т а н о в я в а се в гранулоцити-
т е , к а т о к о л и ч е с т в о т о м у се увеличава
прогресивно със с ъ з р я в а н е т о н а к л е т к и т е .
Д и м ф о ц и т и т е с ъ д ъ р ж а т по-малко гликоген.
Е р и т р о б л а с т и т е и е р и т р о ц и т и т е нормал­
но не с ъ д ъ р ж а т гликоген. Мегакариоцити-
т е и т р о м б о ц и т и т е с ъ д ъ р ж а т гликоген.
П р и н ц и п н а PAS (Periodic A c i d Schiff)
реакцията
Перйодната киселина (HIOJ окислява 1-2 гли-
колеви групи (СНОН-СПОП) или т е х н и т е
амино- или алкиламино-производни до обра­
зуване н а свободни алдехидни групи. Получе­
н и т е алдехиди р е а г и р а т с б езц ветн и я раз­
т в о р н а фуксин-серниста киселина ( р е а к т и в
н а Schiff) к а т о се получава цикламено-чер-
вено оцветяване. И н т е н з и в н о с т т а на ц в е т ­
ния п р о д у к т зависи о т к о л и ч е с т в о т о н а ал-
дехидните групи, получени при окисляване
с перйодна киселина.
Положителна реакция може да се получи
при наличие н а няколко групи въглеводоро­
ди, включително монозахариди, полизахара-
ди, гликопротеини и мукопротеини, фосфо-
рилирани захари, производни н а инозитола
и цереброзиди.
Гликогенът може да се разграничи о т дру­
г и т е субстанции, к о и т о р е а г и р а т положи­
т е л н о с PAS реакция посредством проба с
амилаза. А м и л а з а т а разгражда напълно гли-
когена в к л е т к и т е и след т р е т и р а н е на н а т ­
ривка с ензима, ц в е т е н п р о д у к т не се полу­
чава. О с т а н а л и т е въглехидрати са резис­
т е н т н и към а м и л а з а т а .
Реактиви
1. Фиксатор. Р а з т в о р н а формол - 40% (v/v)
в к ю в е т а з а фиксиране н а формалинови
пари.
2. Воден разтвор на перйодна киселина -1%.
3. Реактив на Schiff. 1 g основен фуксин се
залива с 200 ml к и п я щ а д е с т и л и р а н а вода
и при п о с т о я н н о размесване се о с т а в я
още 5 min. И з с т у д я в а се до 50оС и се фил­
т р и р а през W h a t m a n № 1. П р и б а в я т се
20 ml 1 mol/1 HCl и се охлажда до 25 0 С.
Прибавя се 1 g NaHSOa. Р а з т в о р ъ т се ос­
т а в я в п л ъ т н о з а т в о р е н съд н а т ъ м н о
да п р е с т о и 24 h. В конична колба се при­
б а в я т 2 g а к т и в е н въглен, разбърква се и
след 1 min се ф и л т р и р а . Ф и л т р а т ъ т се
п о с т а в я се в т ъ м н о сухо шише. Съхраня­
ва се н а 40С. Преди у п о т р е б а се т е м п е р и -
р а до с т а й н а т е м п е р а т у р а .
4. Сулфитна вода: към 200 ml д е с т и л и р а н а
вода се п р и б а в я т 20 ml 10% н а т р и е в би-
с у л ф и т и 10 ml 1 mol/1 HCl.
5. Воден разтвор на х е м а т о к с и л и н - 1%.
Техника
1. Н а т р и в к а , изсушена н а въздуха се фикси­
р а във формалинови пари - 10 min. 2. Измива
се с т е ч а щ а вода - 15 min. Изсушава се. 3.
Залива се с р а з т в о р н а перйодна киселина -
10 min. (Внимание: изисква се с т р о г о спаз­
ване в р е м е т о н а въздействие н а перйодна-
т а киселина; при по-дълъг п р е с т о й (15-20
min) т я окислява и алдехидните групи, с ко­
е т о се фалшифицира н е г а т и в е н р е з у л т а т
или понижено гликогеново ниво в к л е т к и т е . )
4. Измива се с т е ч а щ а вода - 15 min. Изсуша­
ва се. 5. Залива се с р е а к т и в а на Schiff н а
с т а й н а т е м п е р а т у р а - 45 min (редица фак­
т о р и - надписи върху н а т р и в к и т е с различ­
ни моливи, левкопласт и др. п р о м е н я т оцве­
т и т е л н а т а способност на разтвора на
SchifT и м о г а т да д о в е д а т до погрешни зак-
лючния).6. Р е а к т и в ъ т се о т л и в а и препара­
т ъ т се п о т а п я в прясно п р и г о т в е н а сул­
ф и т н а вода за 3-5 min. 7. К о н т р а с т н а оц-
в е т к а : в к ю в е т а с хематоксилин препара­
т ъ т се п о т а п я по н а д л ъ ж н а т а си ос т а к а ,
че половината о т н а т р и в к а т а д а бъде над
б о я т а и да о с т а н е н е о ц в е т е н а - 2-3 min. 8.
Н а т р и в к а т а се измива с т е ч а щ а вода и се
изсушава. 9. Микроскопиране.
Проба с д и а с т а з а
П р и н ц и п . След фиксиране н а н а т р и в к а т а
и преди окислението с перйодна киселина,
н а т р и в к а т а се т р е т и р а с д и а с т а з а .
Реактиви
1. Р а з т в о р на д и а с т а з а : 1 g д и а с т а з а се раз­
т в а р я в 1 1 о т 9 g/1 NaCl.
2. Всички р е а к т и в и , необходими за цитохи-
мично доказване н а гликоген в к л е т к и т е .
Техника
1. Н а т р и в к а изсушена н а въздуха се фикси­
р а на формалинови пари - 10 min. 2. Измива
се с т е ч а щ а вода - 15 min. Изсушава се. 3.
Н а т р и в к а т а се п о с т а в я в пресен, филтри­
ран р а з т в о р на д и а с т а з а - 60 min. 4. Измива
се с дестилирана вода. Изсушава се. 5. След­
в а т т о ч к и о т 3 до 8 (вж. по-горе).
Ако в ъ г л е х и д р а т и т е в п ъ р в а т а н а т р и в ­
к а са гликоген, т о в н а т р и в к а т а т р е т и р а ­
н а с д и а с т а з а , о ц в е т к а т а ще липсва.
Отчитане н а резултатите
и интерпретация
К л е т к и т е о т г р а н у л о ц и т н а т а редица нор­
мално с ъ д ъ р ж а т гликоген, к а т о съдържани­
е т о му се увеличава със съзряване н а к л е т ­
ките. Миелобластите и промиелоцитите
обикновено п о к а з в а т слаба дифузна о ц в е т -
к а в ц и т о п л а з м а т а , к о я т о в някои случаи е
по-изразена, с т е н д е н ц и я за образуване на
гранули, к а к в и т о се наблюдават в миелоци-
т и т е . Н е у т р о ф и л н и т е миелоцити и м е т а -
м и е л о ц и т и с ъ д ъ р ж а т много гликогенови
гранули, но т е са по-малко о т к о л к о т о в зре­
л и т е гранулоцити. В г р а н у л о ц и т н а т а кле­
т ъ ч н а линия съд ър ж ан и ето н а гликоген е
най-голямо в пръчкоядрените и сегменто-
я д р е н и т е неутрофили. Гранулите п о к а з в а т
разнообразие в размера, количеството и под­
р е ж д а н е т о си. В едни случаи т е са сравни­
т е л н о малко и груби, в други са многоброй­
ни и фини. Съдържанието н а гликоген в не­
у т р о ф и л н и т е к л е т к и е паралелно с а к т и в ­
н о с т т а н а а л к а л н а т а ф о с ф а т а з а в неутро-
филите. Еозинофилните гранулоцити показ­
в а т ясно разграничима о ц в е т к а при PAS ре­
а к ц и я т а - големите еозинофилни гранули ос­
т а в а т неоцветени и ясно се о т л и ч а в а т о т
347
п о л о ж и т е л н а т а о ц б е т к а н а междугранулар-
н а т а ц и т о п л а з м а . М о н о ц и т и т е и м а т фи­
ни, р а з п р ъ с н а т и положителни гранули. Лим
ф о и и т и т е с ъ д ъ р ж а т малко, разграничими
гранули 6 10-40% о т к л е т к и т е , к а т о 6 1-2%
о т к л е т к и т е PAS п о л о ж и т е л н и т е с у б с т а н ­
ции се с л и б а т 6 по-вруби образувания. Е р и т
робластите са негативни. Мегакариоцити-
т е с ъ д ъ р ж а т дифузна и във вид н а разпръс­
н а т и гранули PAS п о л о ж и т е л н а с у б с т а н ц и я .
Т р о м б о ц и т и т е с а силно п о л о ж и т е л н и .
При възпалителни заболявания, особено про­
т и ч а щ и т е с левкоцитоза, съдържанието на гли-
коген в неутрофилите се увеличава. При с т и х -
ване на процеса гликогенът се нормализира.
Особен интерес представляват хематологич-
н и т е заболявания, при които количеството на
PAS положителните субстанции и т я х н о т о раз­
положение в к л е т к и т е може да е твърде различ­
но. Дифузна оцветка може да се наблюдава при
умерено и т е ж к о изразена желязо-недоимъчна
анемия, таласемия, сидеробластна анемия, пер-
нициозна анемия, миелофиброза. В г р у п а т а на
нелимфобластните остри левкемии PAS о т р и ­
цателни са п о д т и п о в е т е М0, М,, Мг, Мд, М4
(миеломоноцитна) и М5Ь. П о д т и п о в е т е М 4Е
(с еозинофилия), М5а и Mfi са PAS положителни,
к а т о в М6 реакцията е силно положителна, за
разлика о т липсата на гликоген в нормалните
еритробласти. О с т р а т а мегакариобластна лев­
кемия може да се прояви с или без наличие на
гликоген.
При о с т р и т е лимфобластни левкемии се наб­
людават различни находки; фина дифузна гра-
нулираност или груби, конфлуиращи формации,
или комбинация о т двете форми. Атипичните
лимфобласти може да са негативни, особено при
подтип Lg на ALL (лимфома на Burkitt). Хронич­
ните лимфопролиферативни заболявания проти­
ч а т с PAS положителни гранули в по-голяма ч а с т
о т лимфоидите на B-CLL, докато само малък
брой положителни клетки м о г а т да се наблюда­
в а т при значително по-рядката T-CLL.
ЛИПИДИ
М е т о д н а H.Sheehan и G.Storey
Принцип. Sudan black В е и н е р т н а диазо боя
с а ф и н и т е т к ъ м липиди и в е щ е с т в а , к а т о
стероли, н е у т р а л н и м а с т и и фосфолипиди.
Тази боя е м а с т н о р а з т в о р и м а и л и п и д и т е
се о ц в е т я в а т поради р а з т в а р я н е т о и о т
м а с т н и т е ч а с т и ц и . Л и п и д и т е , к о и т о се оц-
е т я в а т о т Sudan black В се н а м и р а т в пър­
в и ч н и т е и в т о р и ч н и т е гранули н а н е у т р о -
348
ф и л и т е и в л и з о з о м н и т е гранули н а моноци­
тите.
О ц в е т я в а н е з а липиди в к р ъ в н и т е к л е т ­
ки се използва з а диференциране н а ANLL о т
ALL. Р е з у л т а т и т е о т ц и т о х и м и ч н о т о изс­
ледване н а липиди в к р ъ в н и т е к л е т к и с а по­
добни н а р е з у л т а т и т е о т миелопероксида-
з а т а . И м а данни, че р е а к ц и я т а със S u d a n
black В е малко п о - ч у в с т в и т е л н а при ранни­
т е стадии на гранулоцитите.
Реактиви
1. фиксатор. Р а з т в о р н а формол - 40% (v/v)
в к ю в е т а з а фиксиране н а формалинови
пари.
2. S u d a n black 5 - 0.3 g в 100 ml а б с о л ю т е н
етанол.
3. Буфер: 16 g к р и с т а л е н фенол се р а з т в а ­
р я т в 30 m l а б с о л ю т е н е т а н о л ; 0.3 g
Na 2 HP0 4 .12H 2 0 се р а з т в а р я т в 100 ml дес­
т и л и р а н а вода; д в а т а р а з т в о р а се смес­
ват.
4. Работен разтвор: 40 ml буфер; 60 ml раз­
т в о р н а S u d a n black В; д в а т а р а з т в о р а
се с м е с в а т и се ф и л т р и р а т с п о м о щ т а
н а водна п о м п а (или друг и з т о ч н и к н а зас­
мукване). Р а б о т н и я т р а з т в о р е годен 2-3
м е с е ц а при съхранение в хладилник. Раз­
т в о р ъ т м о ж е д а се използва охладен.
Техника
1. Н а т р и в к а изсушена н а въздуха се фикси­
р а н а формалинови п а р и - 10min. 2. И з м и в а
се к р а т к о с т е ч а щ а вода. Изсушава се. 3. По­
т а п я се в р а б о т н и я р а з т в о р - 60 min. 4. Ос­
т а т ъ ц и т е о т боя се о т м и в а т ( о б е з ц в е т я ­
ване) чрез п р о п ла к ва н е със 70% е т а н о л . 5.
К о н т р а с т н о о ц в е т я в а н е с боя н а Романов-
ckuü-Giemsa или х е м а л а у н - 10 m i n .
Отчитане н а резултатите
и интерпретации
Л и п и д и т е се п р о я в я в а т в ц и т о п л а з м а т а н а
к л е т к и т е к а т о к а ф я в о до черно о ц в е т е н и
гранули.
Нормално к л е т к и т е о т г р а н у л о ц и т н а т а
линия п о к а з в а т в процеса н а с в о е т о съзря­
в а н е у в е л и ч а в а щ о с е к о л и ч е с т в о липиди -
р е з у л т а т н а увеличаващия се брой н а пър­
в и ч н и т е и в т о р и ч н и гранули. Миелобласти-
т е м о г а т д а с а о т р и ц а т е л н и з а липиди или
да с ъ д ъ р ж а т малък брой гранули, разполо­
жени около я д р о т о . В п р о м и е л о ц и т и т е се
н а м и р а т повече и по-груби суданофилни гра­
нули. В м и е л о ц и т и т е и м е т а м и е л о ц и т и т е
т е х н и я т брой е з начит елн о по-голям. Пръч-
коядрените и с е г м е н т о я д р е н и т е неутрофи-
ли с ъ д ъ р ж а т много суданофилни гранули, ко­
и т о изпълват ц я л а т а цитоплазма и често
п о к р и в а т ч а с т и о т я д р о т о . Еозинофилни-
т е к л е т к и о т всички с т е п е н и на з р е л о с т
п о к а з в а т висока с т е п е н н а положителна ре­
акция в о б в и в к а т а (периферията) н а специ­
ф и ч н и т е гранули и о т р и ц а т е л н а реакция с
просветляване на ц е н т р а л н а т а ч а с т на гра­
нулите. Суданофилията в базофилните
к л е т к и е променлива, к а т о положителна ре­
а к ц и я се н а м и р а в п о - р а н н и т е к л е т ъ ч н и
с т а д и и , с т е н д е н ц и я към намаление при съз­
ряването на к л е т к и т е . Ц в е т н и я т продукт
при базофилните гранулоцити може да бъ­
де с червеникав м е т а х р о м а т и ч е н о т т е н ъ к ,
особено при патологични с ъ с т о я н и я , п р о т и ­
чащи с базофилия.
Моноцитите и промоноцитите м о г а т в
някои случаи да б ъ д а т напълно о т р и ц а т е л ­
ни за липиди, но ч е с т о п о к а з в а т променлив
брой фини или умерено груби гранули, раз­
п р ъ с н а т и в ц и т о п л а з м а т а на к л е т к а т а , с
лека т е н д е н ц и я з а групиране в паранукле-
а р н а т а зона или по п е р и ф е р и я т а на к л е т ­
к а т а . Тази форма н а разпространение на су-
данофилните гранули е много х а р а к т е р н а за
к л е т к и т е о т м о н о ц и т н а т а линия и е съвър-
шенно различна о т ф о р м а т а н а разпрос­
т р а н е н и е на миелопероксидазната а к т и в ­
н о с т в същите клетки.
К л е т к и т е о т л и м ф о ц и т н а т а линия с а
о т р и ц а т е л н и за липиди. Много рядко в пре­
п а р а т и , к о и т о не с а к о н т р а с т н о о ц в е т е ­
ни, парануклеарно в л и м ф о б л а с т и т е м о г а т
да се н а б л ю д а в а т много фини пръчици или
точковидни суданофилни гранули. На добре
приготвени и к о н т р а с т н о о ц в е т е н и препа­
р а т и л и м ф о б л а с т и т е винаги са о т р и ц а т е л ­
ни.
Е р и т р о б л а с т и т е и е р и т р о ц и т и т е са
о т р и ц а т е л н и за липиди. М е г а к а р и о ц и т и т е
обикновено са о т р и ц а т е л н и . Много рядко в
ц и т о п л а з м а т а им се наблюдава дифузно оц­
в е т я в а н е с много фини суданофилни грану­
ли, разпръснати в ц и т о п л а з м а т а и върху яд­
р о т о . Т р о м б о ц и т и т е обикновено са о т р и ­
цателни.
Положителна реакция със Sudan black В при
о с т р и нелимфобластни левкемии се наблюдава
в п о д т и п о в е т е М0, М,, Mg, М3, М4 и е слабо поло­
ж и т е л н а при М5а. Пръчиците н а Auer са поло­
жителни, дори к о г а т о не са ясно видими при оц­
в е т я в а н е по Романовский-Giemsa.
А т и п и ч н и т е клетки при о с т р и т е лимфоблас-
т н и левкемии обикновено са о т р и ц а т е л н и ( о т -
р и и а т е л н а е и и т о х и м и ч н а т а реакция, въпреки
че биохимично в лимфните к л е т к и се у с т а н о в я ­
в а т липиди). Според някои а в т о р и (J.Bailey и
K.John) при ALL суданофилна о ц в е т к а може да
се наблюдава в по-малко о т 3% о т а т и п и ч н и т е
бласти.
КИСЕЛА ФОСФАТАЗА
Е н з и м ъ т кисела ф о с ф а т а з а се съдържа в ли-
з о з о м и т е на к л е т к и т е и се у с т а н о в я в а във
всички хемопоетични клетки. Посредством
акриламидна електрофореза и йонообменна
хроматография на е к с т р а к т о т левкоцити
са фракционирани седем изоензима на кисе­
л а т а фосфатаза, означени к а т о 0, 1, 2, 3, ЗЬ,
4 и 5. С ъ щ е с т в у в а т данни за специфично раз­
пространение на изоензимите в различни­
т е т и п о в е клетки. В н е у т р о ф и л и т е преоб­
л а д а в а т изоензимите 1, 2 и 4, в моноцити­
т е 1 и 4, в л и м ф о ц и т и т е и т р о м б о ц и т и т е
3, в м и е л о б л а с т и т е ЗЬ, в е к с т р а к т о т к л е т ­
ки на Gaucher изоензим 0. Изоензим 5 се син­
т е з и р а в значително количество о т атипич­
н и т е к л е т к и на трихолевкемия. А к т и в н о с т
н а кисела ф о с ф а т а з а се намира в цитоплаз-
м е н и т е гранули на е р и т р о б л а с т и т е и ре-
т и к у л о ц и т и т е . Е р и т р о и д н и я т ензим, по­
добно на изоензими 0 и 5, е р е з и с т е н т е н към
т а р т а р а т и се предполага, че съществува
в т р и изоензима.
McmcKj п а С. Li, L. Yam и U. L a m
П р и н ц и п . К и сел ата ф о с ф а т а з а хидролизи­
ра naphthol AS-BI phosphate при pH 5.0 и ос­
вободеният naphthol се свързва с pararosa-
niline до образуване на червено-кафяви пре-
ципитати.
Реактиви
1. фиксатор'. Абсолютен м е т а н о л - 10 ml,
Ацетон - 60 ml; Ц и т р а т е н буфер - 40 ml.
Р а з т в о р и т е се с м е с в а т . Съхранение при
349

40C.
П р и г о т в я н е н а ц и т р а т е н буфер, 0.03
m o l / l pH 5.4: лимонена киселина - 21 g в
200 ml 1 mol/l NaOH се долива до 1 1 с дес­
тилирана вода. О т т о з и р а з т в о р 75 ml
се смесва с 23.5 ml 0.1 mol/l NaOH и се до­
лива до 300 ml с дестилирана вода.
2. Буфер на Михаелис, pH 5.0: Н а т р и е в аце-
т а т т р и х и д р а т - 9.714 g (или 5.85 g без­
водна сол); Н а т р и е в д и е т и л б а р б и т у р а т
- 14.714 g. Д в а т а р а з т в о р а се с м е с в а т и
о б щ и я т обем се довежда до 500 ml с дес­
тилирана вода. Съхранява се при 40С.
3. Субстратен разтвор-, naphthol AS-BI phos­
phate - 30 mg се р а з т в а р я в 3 ml N,N'-
dimethylformamide.
4. Pararosaniline - основен р а з т в о р : Pararo-
saniline hydrochloride - 1 g се р а з т в а р я в
20 ml дестилирана вода и се прибавя 5 ml
к о н ц е н т р и р а н а HCl. С ъ х р а н я в а се н а
т ъ м н о при 40С.
5. Разтвор на натриев нитрат: 40 g/1 пряс­
но приготвен.
6. Разтвор за контрастна оцветка: Methyl
green - 10 g/1, или хематоксилин no Har­
ris.
7. Работен разтвор - п р и г о т в я се непосред­
ствено преди употреба. Разтвор /: 15 ml
буфер на Михаелис + 36 ml дестилирана
вода + 3 ml с у б с т р а т е н р а з т в о р ; Разт­
вор П: 2.4 ml основен р а з т в о р н а pararo­
saniline + 2.4 ml прясно приготвен р а з т ­
вор на н а т р и е в н и т р и т , к а т о се изчаква
1 min. Разтвори I и I I се с м е с в а т и полу­
ч е н и я т р а б о т е н р а з т в о р се довежда до
pH 5 с 1 mol/l NaOH, ако е необходимо.
8. Работен разтвор с винена киселина: при­
бавя се L( + )-tartaric acid - 2 mg/ml рабо­
т е н разтвор. Довежда до pH 5 с 1 mol/l
NaOH, ако е необходимо.
Техника
1. Н а т р и в к а изсушена н а въздуха се фикси­
ра за 30 s при 40С. 2. Измива се с вода и се
изсушава. 3. Н а т р и в к а т а се инкубира в ра­
б о т н и я р а з т в о р за 60 min при 370С. 4. Изми­
ва се с вода. Изсушава се. 5. К о н т р а с т н а оц-
в е т к а - 10 min. 6. Микроскопиране.
350
Отчитане н а резултатите
и интерпретации
А к т и в н о с т т а н а к и с е л а т а ф о с ф а т а з а се
проявява к а т о червено-кафяви преципита-
т и в ц и т о п л а з м а т а , разположени хомоген­
но или във вид н а гранули.
По-голяма ч а с т о т н о р м а л н и т е кръвни
к л е т к и в н а т р и в к а о т периферна кръв и в
к о с т н и я мозък п о к а з в а т а к т и в н о с т на ки­
села ф о с ф а т а з а .
Миеломните клетки съдържат значително
по-висока активност на ензима в сравнение с
нормалните плазматични клетки. Клетките на
Gaucher също са силно положителни. Атипич-
ните клетки при трихолевкемия са силно поло­
жителни. Тези клетки съдържат изоензим 5, кой­
т о е резистентен към инхибиране с т а р т а р а т .
Т а р т а р а т - р е з и с т е н т н а т а кисела фосфатаза е
надежден лабораторен показател за потвърж­
даване на диагнозата трихолевкемия.
НЕХЕМОГЛОЬИНОВО ЖЕЛЯЗО
(ФЕРИТИН)
М е т о д н а М.Perls с п р у с к о
(берлинско) с и н ь о
Молекулата н а ф е р и т и н а се с ъ с т о и о т апо-
ф е р и т и н , свързан с т р и в а л е н т н о желязо.
Ж е л я з о т о се о т л а г а в к л е т к и т е под форма­
т а н а ф е р и т и н , з а да се п р е д о т в р а т и окис­
л и т е л н о т о увреждане н а к л е т к и т е о т же­
л е з н и т е йони.
Ф е р и т и н ъ т е основна форма н а резерв­
н о т о желязо в организма н а човека. Желязо­
т о във ф е р и т и н а с ъ с т а в л я в а 25-30% о т об­
щ о т о съдържание н а желязо у в ъ з р а с т н и хо­
ра. Х е м о с и д е р и н ъ т според някои а в т о р и
п р е д с т а в л я в а ч а с т и ч н о разграден и преци-
питирал феритин.
Ф е р и т и н ъ т и хемосидеринът, к а т о ре­
зервни форми н а желязо в организма се на­
м и р а т в черния дроб, к о с т н и я мозък и слез-
к а т а , к а т о най-големи количества има в чер­
ния дроб.
П р и н ц и п . Т р и в а л е т н т о т о желязо реагира
с подкислен калиев фероцианид до образува­
не н а х а р а к т е р н и комплекси пруско (берлин­
ско) синьо о т ферифероцианид.
Реактиви
1. Фиксатор: А б с о л ю т е н м е т а н о л .
2. Работен разтвор: 10 g калиев фероцианид
се р а з т в а р я т във 1 1 0.1 mol/1 HCl.
3. Воден разтвор на сафранин (или еозин) -
0.1%.
Техника
1. Н а т р и в к а , изсушена н а въздуха се фикси­
р а з а 30 min. 2. И з м и в а се с т е ч а щ а вода 15
min. И з с у ш а в а се. 3. П р я с н о п р и г о т в е н р а ­
б о т е н р а з т в о р в хелендалова к ю в е т а се т е м -
п е р и р а в т е р м о с т а т н а 37 0 С. Н а т р и в к а т а
се п о т а п я в р а б о т н и я р а з т в о р з а 20 min п р и
370С. 4. И з м и в а се с т е ч а щ а вода 15 min. Из­
с у ш а в а се. 5. К о н т р а с т н а о ц в е т к а с воден
р а з т в о р н а с а ф р а н и н з а 20-30 s. 6. И з м и в а с е
с т е ч а щ а вода 15 min. И з с у ш а в а се. Нреоц-
в е т я в а н е т о н а п р е п а р а т и т е т р я б в а да се
избягва. 7. Микроскопиране.
Отчитане н а резултатите
и интерпретация
Т р и в а л е н т н о т о желязо се проявява к а т о
добре обособени т ъ м н о сини гранули.
В к о с т н и я м о з ъ к се наблюдава к а к т о ек-
страцелуларно, т а к а и интрацелуларно в
макрофагите и в no-зрелите и пикнотични
еритробласти. Желязо-съдържащите е р и т -
р о б л а с т и се н а р и ч а т сидеробласти. При
оиенката на желязото в еритробластите
се в з е м а предвид броя е р и т р о б л а с т и съдър­
ж а щ и желязо, к о л и ч е с т в о т о и разположени­
е т о на гранулите в т я х . ^ а н у л и т е в цитоп-
л а з м а т а н а нормални е р и т р о б л а с т и с а мал­
ко н а брой, фини, р а з п р ъ с н а т и , п о н я к о г а
т р у д н о се в и ж д а т .
При железен недоимък намалява съдържани­
е т о на желязо в макрофагите, к а к т о и б р о я т
на желязо-съдържащите макрофаги. Сидероблас-
т и т е намаляват или липсват.
Намаленото резервно желязо в костния мо­
зък е надежден показател за доказване на желя-
зонедоимъчно състояние. При излишък на желя­
зо в организма, к а к т о при хемохроматоза, се по­
я в я в а т по-груби и многобройни гранули. Резерв­
н о т о желязо в костния мозък може да бъде пре­
ходно увеличено след кръвопреливане.
Важна находка представляват „пръстеновид­
ните" сидеробласти, при к о и т о о ц в е т е н и т е же­
лезни гранули са разположени перинуклеарно.
Пръстеновидните сидеробласти са р е з у л т а т о т
отлагане на желязо в митохондриите на ерит­
робластите. Тези клетки са обединяващ приз­
нак на хетерогенната група сидеробластни ане­
мии, при които е увредена с и н т е з а т а на хема.
ЦИТОХМММЧНО
ДОКАЗВАНЕ НА КЛЕТЪЧНИ
НУКЛЕОПРОТЕИНИ И НЯКОИ
КАТИОННИ ПРОТЕИНИ
Т.Цветкова
ЕДНОВРЕМЕННО ДОКАЗВАНЕ
НА КЛЕТЪЧНИ НУКЛЕОПРОТЕИНИ
И НЯКОИ КАТИОННИ ПРОТЕИНИ
MemcKj н а Е. Ц б е т к о б а
П р и н ц и п н а м е т о д а . Касае се з а ч а с т и ч ­
н а я е з о к с и р и б о н у к л е о п р о т е и н о Н а cje-
н а т у р а ц и я , включваща т е м п е р а т у р н о
в ъ з д е й с т в и е върху н а т р и в к и т е - з а м р а з я ­
ване и размразяване, последвано о т нагрява­
не и прилагане н а горещи формалинови па­
ри. О ц в е т я в а н е т о се извършва със смеси о т
алкално и кисело багрило в ниски к о н ц е н т ­
рации. К о м б и н а ц и я т а м е т и л е н о в о - с и н ь о /
ф а с т гриин по в а р и а н т а без хидролиза оц­
в е т я в а едновременно рибонуклеопротеини
(РНП) и дезоксирибонуклеопротеини (ДНП).
Т о п о х и м и ч н о т о съхранение н а рибонуклеоп-
р о т е и н и т е е обусловено о т п р е д в а р и т е л н а ­
т а о б р а б о т к а и в ъ з д е й с т в и е т о с формалин,
к о и т о н а й - в е р о я т н о с т а б и л и з и р а т РПК
ч р е з м о д и ф и ц и р а н е н а а з о т н и т е ü бази.
Е л е к т р о с т а т и ч н о т о свързване н а м е т и л е -
н о в о т о синьо с РПК се обуславя не само о т
доказания а ф и н и т е т н а о с н о в н и т е ( т и а з и -
нови) багрила к ъ м нуклеиновите киселини,
но най-вече о т у ч а с т и е т о н а к и с е л и т е баг­
рила: еозин или ф а с т гриин в ниски концен­
т р а ц и и . К и с е л и т е багрила се с в ъ р з в а т с не-
х и с т о н о в и т е базични п р о т е и н и в с ъ с т а в а
на РНП и редуцират к о м п е т и т и в н и я им
е ф е к т , с к о е т о у л е с н я в а т в р ъ з к а т а н а ос­
н о в н о т о багрило с РПК. В а р и а н т ъ т без хид­
ролиза допринася и з а усилване н а т и н к ц и -
о н н и т е разлики н а ядрения х р о м а т и н . Кон­
д е н з и р а н и я т х р о м а т и н се о ц в е т я в а |VMe-
т а х р о м а т и ч н о -тъмносиньо-виолетово и
351
нехомогенно, а диспергираният е хомогенен,
бледосиньо-розоб. Б е т а - м е т а х р о м а т и ч н о т о
оцветяване на я д р е н и т е и нуклеоларни РНП
се различава о т о ц в е т я в а н е т о за ДНП след
прилагане на с т у д е н а хидролиза.
В р е з у л т а т на х и д р о л и з а т а с е п о с т и ­
га е к с т р а к ц и я н а РНК и нуклеолите се
визуализират к а т о окръглени, о п т и ч е с к и
празни зони. Вследствие н а киселинната ек­
стракция на РНК и н е х и с т о н о в и т е п р о т е ­
ини се постига цялостно диференцирано оц­
ветяване на ДНП, к о е т о дава в ъ з м о ж н о с т
да се о т ч и т а т малки промени в с т е п е н т а
на кондензация или дисперсия н а х р о м а т и -
на, к а к т о и подробности в разпределение­
т о му.
Едновременно приложеното к и с е л о баг­
рило ф а с т гриин, на б а з а т а н а електрос­
т а т и ч н о свързване, о ц в е т я в а в зелено ня­
кои катионни (аргинин, лизин и хистидин съ­
държащи) п р о т е и н и в ц и т о п л а з м а т а н а
е р и т р о ц и т и и в гранулите н а неутрофилни
и еозинофилни левкоцити. Гранулите н а ба-
зофилншпе сегментоядрени левкоцити се оц­
в е т я в а т червено-виолетово {у-метахрома-
тично). Едновременно с червените гранули
се наблюдават и единични синьовиолетови
{^-метахроматично) оц ве т е н и гранули* . В
базофилните гранули се о ц в е т я в а т муко-
полизахаридните (кисели) съставки. Оцве­
т я в а н е т о е р е з у л т а т о т взаимодействие­
т о на метиленов ото синьо (- NH3 г р у п а т а
на багрилото) с - SO3 г р у п и т е н а мукопо-
лизахаридите.
М е т о д ъ т се прилага в два в а р и а н т а :
1. О ц в е т я в а н е с м е т и л е н о в о - с и н ь о / ф а с т
гриин.
2. О ц в е т я в а н е с м е т и л е н о в о - с и н ь о / ф а с т
гриин след с т у д е н а хидролиза с 5 mol/1
HCl.
Реактиви
1. Фосфатен буфер с pH 7.24
(Na 2 HP0 4 .12H 2 0/KH 2 P0 4 )
2. 0.20% р а з т в о р н а Methylenblau във фосфа­
т е н буфер с pH 7.24.
* Метахромазия - при ц и т о х и м и ч н а т а реакция се
п о л у ч а в а т п р о д у к т и , ч и и т о ц в я т се о т л и ч а в а о т
Ц в е т а н а с а м о т о багрило и се и з м е с т в а в е д н а или
друга с т е п е н в ч е р в е н а т а ч а с т н а с п е к т ъ р а
352
3. 0.20% р а з т в о р н а Fast green във фосфатен
буфер с pH 7,24.
4. О ц в е т и т е л н а смес - п р и г о т в я се непос­
р е д с т в е н о преди у п о т р е б а чрез смесване
н а 0.20% р а з т в о р н а метиленово-синьо,
0.20% р а з т в о р н а ф а с т гриин и буфер:
1 + 1 + 3.
5. 5 mol/1 HCl.
6. Formaldehyde - 36-38%, корекция до pH 4.0
с 1 mol/1 HCl.
7. Oleum Kodri (имерсионно масло)
Г
Техника
ДНП-денатурация: \ . Замразяване при т е м ­
п е р а т у р а о т -20 до -22 0С в продължение н а
2 часа н а и з с у ш е н и т е н а въздух, нефиксира­
ни кръвни н а т р и в к и . З а ц е л т а н а т р и в к и т е
се п о д р е ж д а т в хелендалови к ю в е т и , к о и т о
добре з а т в о р е н и и у п л ъ т н е н и с левкопласт,
се п о с т а в я т в к р и о с т а т или камера на хла­
дилник, осигуряваща необходимата т е м п е ­
р а т у р а . 2. Размразяване и изсушаване: н а т ­
р и в к и т е се и з в а ж д а т о т к ю в е т и т е и вед­
нага се о б р ъ щ а т с м а т е р и а л а върху филтър­
н а х а р т и я (за п р е д о т в р а т я в а н е н а е в е н т у ­
ална хемолиза) и се о с т а в я т 10 min н а с т а й ­
н а т е м п е р а т у р а . 3. Постепенно нагряване
н а н а т р и в к и т е в продължение н а 2 min до
55-60 0С. Н а г р я в а н е т о се о с ъ щ е с т в я в а вър­
ху плоча н а електрически к о т л о н с а з б е с т о ­
ва м р е ж а . 4. Фиксиране н а още т о п л и т е
н а т р и в к и с горещи пари о т формалин с pH
4.0 в продължение н а 12 min. Ф и к с а ц и я т а се
извършва в з а т в о р е н о п е т р и , в к о е т о се вна­
с я т топлинно-денатурираните натривки и
з а г р я т до о т д е л я н е н а м е х у р ч е т а формалин
в малък съд с д и а м е т ъ р 1/3 о т т о з и н а п е т -
р и т о . Г о р е щ и т е формалинови пари допри­
н а с я т з а запазване н а п о л у ч е н а т а д е н а т у -
рацш!.
Оцветяване. След ф и к с и р а н е т о , без да се
п р о м и в а т , н а т р и в к и т е се и з с у ш а в а т за 5
min н а с т а й н а т е м п е р а т у р а . Веднага след
т о в а е д н а т а се залива направо с прясно при­
г о т в е н а т а о ц в е т и т е л н а смес в продълже­
ние н а 55 min. В т о р а т а се о ц в е т я в а по съ­
щ и я начин, но след прилагане н а с т у д е н а
хидролиза. П о с л е д н а т а се о с ъ щ е с т в я в а н а
с т а й н а т е м п е р а т у р а чрез накапване върху
н а т р и в к а т а н а 5 mol/1 HCl в продължение
н а 22 min, след к о е т о м н о г о к р а т н о се про-
миба c 0.15 mol/1 ф о с ф а т е н буфер (pH 7.24).
След о ц в е т я в а н е т о д в е т е н а т р и в к и се из­
м и в а т обилно с буферния р а з т в о р и изсуша­
в а т н а въздух. 5. Просветляване. Н а т р и в ­
к и т е се п о т а п я т в хелендалова к ю в е т а с
ксилол за 5 min. 6. Включване в имерсионно
масло. 7. Микроскопиране.
Отчитане н а резултатите
и интерпретация
Оцветителен в а р и а н т без хидролиза.
О ц в е т и т е л н а т а смес м е т и л е н о в о синьо/
ф а с т гриин, приложена по в а р и а н т а без хид­
ролиза, багри едновременно ДНП, РНП в лим-
фоцити, м о н о ц и т и , б л а с т и , к а к т о и свобод­
н и т е КП и я д р е н и т е ДНП в гранулоцити.
Ядрените Д Н П Ъ о т д е л н и т е видове кръв­
ни к л е т к и се о ц в е т я в а т о т м е т и л е н о в о т о
синьо с вариращ и н т е н з и т е т , в з а в и с и м о с т
о т с ъ с т о я н и е т о н а х р о м а т и н а - кондензи­
рано или диспергирано. Кондензираният хро-
м а т и н в з р е л и т е л и м ф о ц и т и и гранулоци­
т и се багри тъмносиньо-виолетово и нехо-
могенно, а д и с п е р г и р а н и я т х р о м а т и н в по-
ранни или а к т и в и р а н и лимфоцити, в пове­
ч е т о о т м о н о ц и т и т е , в н е з р е л и т е грануло­
ц и т и и в б л а с т и т е се о ц в е т я в а з н а ч и т е л н о
по-хомогенно и бледо (светлосиньо-розово
или бледо-виолетово). Р а з л и к и т е в о ц в е т я ­
в а н е т о на ДНП о т х р о м а т и н а са много по-
о т ч е т л и в и след прилагане н а в а р и а н т а с
хидролиза с 5 mol/1 HCl.
Оцветяване н а ц и т о п л а з м е н и т е РНП. О т ­
д е л н и т е видове к л е т к и (лимфоцити, моно­
ц и т и , б л а с т и ) з н а ч и т е л н о се р а з л и ч а в а т по
о ц в е т и т е л н и т е х а р а к т е р и с т и к и на ц и т о ­
п л а з м е н и т е РНП. Топохимичното съхране­
ние на РНП и с п е ц и ф и ч н а т а им агрегация -
дифузно или под ф о р м а т а н а гранули, е обус­
ловено о т п р е д в а р и т е л н а т а о б р а б о т к а на
н а т р и в к и т е и в ъ з д е й с т в и е т о н а формали-
н о в и т е пари, к о и т о с т а б и л и з и р а т РНК чрез
модифициране н а а з о т н и т е ü бази. Фикси­
р а н е т о с формалинови пари при много нис­
ко pH в е р о я т н о допринася з а с т р у п в а н е т о
н а рибозомните и полирибозомните с т р у к ­
т у р и в по-едри а г л о м е р а т и , образуващи ок-
ръглени гранули. В р ъ з к а т а н а метиленово­
т о синьо с РНК се улеснява и о т свързване­
т о на н е х и с т о н о в и т е базични протеини ( о т
с ъ с т а в а на РНП) с киселото багрило, с кое­
т о се редуцира к о м п е т и т и в н и я т им е ф е к т .
Н е х и с т о н о в и т е базични протеини (КП) съ­
що у ч а с т в а т в п р е ц и п и т а ц и я т а на ц и т о ­
п л а з м е н и т е РНП - дифузно или под форма­
т а н а гранули. По в а р и а н т а без хидролиза,
ц и т о п л а з м е н и т е РНП в преобладаващата
ч а с т о т л и м ф о ц и т и т е (около 90%) се оцве­
т я в а т под ф о р м а т а н а синьо-виолетови
гранули, равномерно разпределени в ц и т о -
п л а з м а т а . В малък п р о ц е н т о т лимфоцити­
т е - предимно средни и големи, се у с т а н о ­
вява дифузно-грануларно багрене з а РНП.
Най-вероятно т о в а са к л е т к и с по-усилен
РНП с и н т е з . Увеличен п р о ц е н т на лимфоци­
т и с дифузно о ц в е т е н а за РНП цитоплазма
се у с т а н о в я в а при вирусни инфекции, рев-
м а т о и д е н а р т р и т , някои алергични с ъ с т о ­
яния.
М о н о ц и т н а т а ц и т о п л а з м а е светловио-
л е т о в о о ц в е т е н а , с нарядко разположени
гранули. При вирусни или бактериални ин­
фекции се наблюдават и по-обилни, т ъ м н о ­
сини гранули.
Оцветяване на цитоплазмените КП. Кисе­
л о т о багрило ф а с т гриин по в а р и а н т а без
хидролиза о ц в е т я в а в зелено свободните,
несвързани с нуклеиновите киселини или дру­
ги биополимери КП в з р е л и т е неутрофили
(пръчкоядрени и сегментоядрени). Ц и т о ­
п л а з м е н и т е гранули в т я х са п о ч т и еднак­
ви по форма, с малки размери и хомогенно
зелено оцветени. Преобладават к л е т к и т е
(около 80%) о т т р е т а с т е п е н ( + + + ) ин­
т е н з и в н о с т на ц и т о х и м и ч н а т а реакция -
множествени, интензивно оцветени, нагъс­
т о и равномерно разпределени в цитоплаз-
м а т а или наличие на зелена дифузия с или
без гранули. М е т о д ъ т дава възможност да
се определи съдържанието на КП в зрелите
неутрофилни гранулоцити чрез изчислява­
не на среден цитохимичен показател.
Гранулите в еозинофилите са едри, блес­
т я щ о зелено оцветени, с просветлена цен­
т р а л н а и интензивно о ц в е т е н а периферна
ч а с т , поради високото съдържание на арги-
нин в периферната зона и наличие на крис-
талоидни с ъ с т а в к и в ц е н т р а л н а т а ч а с т .
Гранулите в базофилните гранулоцити се
о ц в е т я в а т червено - у м е т а х р о м а т и ч н о , и
синьо-виолетово, т . е . (Уметахроматично.
Изключително рядко при здрави лица наред
с о п и с а н и т е се наблюдават и 2-5 зелено оц­
в е т е н и гранули.
353
 Е р и т р о ц и т и т е се о ц в е т я в а т зелено о т
б а г р и л о т о ф а с т гриин. Ц и т о п л а з м а т а н а
оксифилните е р и т р о б л а с т и се о ц в е т я в а съ­
щ о зелено, а н а п о л и х р о м а т о ф и л н и т е и б а -
з о ф и л н и т е е р и т р о б л а с т и - синьозелено g o
синьо.
Оцветителен в а р и а н т след п р и л а г а ­
не н а студена х и д р о л и з а с 5 m o l A HCl.
Вследствие н а к и с е л и н н а т а е к с т р а к ц и я н а
ядрените РНК и н а нехистоновите п р о т е ­
ини с т а в а в ъ з м о ж н о о т ч и т а н е т о н а м а л к и
промени в с т е п е н т а н а к о н д е н з а ц и я и дис­
персия н а х р о м а т и н а . След х и д р о л и з а м н о г о
добре л и ч а т : р а з п о л о ж е н и е т о , ф о р м а т а , го­
л е м и н а т а и броя н а нуклеолите, к а к т о и на­
л и ч и е т о н а м и н и м а л н и по п л о щ к о н д е н з и р а ­
н и ДНП зони в я д р а т а с д и с п е р г и р а н х р о м а -
т и н ( п е р и н у к л е а р н и , перинуклеоларни). Кон­
д е н з и р а н и я т х р о м а т и н се багри о т т ъ м н о -
синьо-виолетово до с и н ь о - в и о л е т о в о и е н а
по-едри или по-дребни к у п ч и н к и , п е т н и с т о
или и в и ц и с т о - п е т н и с т о р а з п о л о ж е н . Д и с -
п е р г и р а н и я т х р о м а т и н се багри о т с в е т -
лосиньо-виолетово go розово-виолетово; т о й
е ф и н о з ъ р н е с т или х о м о г е н е н (дифузен), без-
с т р у к т у р е н . Между к у п ч и н к и т е н а конден­
з и р а н и я х р о м а т и н с е н а б л ю д а в а зелено о ц ­
в е т я в а н е о т ф а с т гриина.
Я д р е н и я т х р о м а т и н в б а з о ф и л н и т е и по­
лихроматофилните еритробласти е т ъ м н о -
синьо-виолетово о ц в е т е н , к о м п а к т е н и плъ­
т е н , а в о к с и ф и л н и т е - т о й е под ф о р м а т а
н а по-дребни, т ъ м н о с и н и у п л ъ т н е н и я и зе­
ленеещи п р о с в е т л я в а н и я м е ж д у т я х
В р е з у л т а т н а екстрахирането н а РНК в
цитоплазмата н а лимфоцити, моноцити и
б л а с т и се и з я в я в а т б а з и ч н и т е п р о т е и н и о т
РНП, т . е . к а т и о н н и п р о т е и н и , с в ъ р з а н и в
р и б о з о м н и т е комплекси. В л и м ф о ц и т н а т а
ц и т о п л а з м а т е с а дифузни и зелено о б а г р е ­
ни, с различен и н т е н з и т е т . В м о н о ц и т и т е
ц и т о п л а з м а т а се о ц в е т я в а светлозелено и
дифузно. Н е се у с т а н о в я в а т з е л е н о о ц в е т е -
н и гранули в ц и т о п л а з м а т а к а к т о н а м о н о ­
цитите, т а к а и на лимфоцитите.
О ц в е т я в а н е т о н а е р и т р о ц и т и и оксифил-
ни е р и т р о б л а с т и н е се п р о м е н я след хидро­
лиза, а п о л и х р о м а т о ф и л н и т е и базофилни­
т е - се о ц в е т я в а т и н т е н з и в н о зелено. М е ­
т о д ъ т дава възможност з а отдиференци-
ране н а по-младите п р е д с т а в и т е л и н а
е р и т р о б л а с т и т е , с ъ д ъ р ж а щ и по-големи ко­
354
л и ч е с т в а Р Н К . В т е з и случаи ц и т о п л а з м а ­
т а е т ъ м н о с и н ь о о ц в е т е н а , а след хидроли­
з а в р е з у л т а т н а и з в л и ч а н е т о н а Р Н К с е оц­
в е т я в а и н т е н з и в н о зелено.
Прилагането н а д в а т а в а р и а н т а на м е т о д а
з а едновременно о ц в е т я в а н е н а РНП, ДНП и КП
и к о м п л е к с н а т а оценка на о ц в е т и т е л н и т е ха­
р а к т е р и с т и к и н а посочените клетъчни компо­
н е н т и допринася за по-сигурното идентифици­
ране и разграничаване н а паралевкобластите о т
о с т а н а л и т е , сходни по площ и с т р у к т у р а на яд­
р о т о клетки. Освен т о в а улеснява и т я х н о т о
типизиране. Морфологичният образ на патоло­
гичните бласти, по двата варианта на мето­
да, е доста характерен', по в а р и а н т а без хидро­
лиза п а р а л е в к о б л а с т и т е с а със синьо-виолето-
во до тъмносиньо-виолетово, предимно дифуз­
но или дифузно-грануларно, най-често неравно­
мерно о ц в е т е н а ц и т о п л а з м а и бледи, хомогенни
ядра, а след хидролиза са с диспергиран ядрен
х р о м а т и н - фино-зърнест или напълно хомоге­
нен и ясно личащи нуклеоли. Това позволява о т ­
ч е т л и в о т о разграничаване н а микромие-
л о б л а е т н и т е и л и м ф о б л а с т н и т е паралев-
кобласти о т лимфоцитите.
Стабилен цитохимичен к р и т е р и й е положи­
т е л н а т а реакция за КП. П о л о ж и т е л н а т а ре­
акция преди хидролиза и грануларната
или д и ф у з н о - г р а н у л а р н а ф о р м а с л е д хид­
ролиза о т д е л я със с и г у р н о с т в л а с т и т е
п р и М,, Мг, М3 и М4. Г р а н у л а р н а т а форма н а
о ц в е т я в а н е н а КП след хидролиза в т е з и случаи
е указание за наличието в б л а с т и т е н а свобод­
ни КП.
В а р и а н т ъ т с хидролиза значително
допринася за повишаване чувствител­
н о с т т а н а р е а к ц и я т а з а КП: п о в и ш а в а с е
процентът на паралевкобластите с
Ауерови т е л ц а в с р а в н е н и е с п а н о п т и ч н о -
т о оцветяване.
Прилагането н а в а р и а н т а без хидролиза доп­
ринася да се у с т а н о в я т редица особености в оц­
в е т я в а н е т о н а КП в г р а н у л о ц и т и т е н а болни с
хронична миелоза, к о и т о ги о т л и ч а в а т о т лев­
к о ц и т и т е н а здрави и н а болни с левкемоидна
реакция. С ъ д ъ р ж а н и е т о н а КП в сегментоядре-
н и т е неутрофили при хронична миелоза е силно
понижено.
При хронична миелоза в базофилните грану-
лоцити, се н а б л ю д а в а т е д р и , е о з и п о ф г и ю п о -
добни, з е л е н о о ц в е т е н и г р а н у л и , самостоя- !
т е л н о или наред с т а к и в а , к о и т о са у и ß-ме-
т а х р о м а т и ч н о оцветени. П о я в а т а н а т е з и зе­
лено о ц в е т е н и гранули показва, че к л е т к и т е са
незрели. Това о ц в е т я в а н е се свързва с наличие- •
т о н а устойчива н а формалиновите пари и пред­
в а р и т е л н и т е процедури фракция, х а р а к т е р н а за
незрелите базофили и даваща положителна ре­
акция за КП. Възможно е и друго обяснение - бло­
киране н а р е а к т и в о с п о с о б н и т е групи н а кисе- !
 л и т е мукополизахариди о т п е п т и д и / б е л т ъ ц и ,
калций, к а т о д е н а т у р а ц и о н н и т е процедури най-
в е р о я т н о д о п р и н а с я т з а освобождаването им и
о т т а м за проява н а м е т а х р о м а з и я .
ЕДНОВРЕМЕННО ДОКАЗВАНЕ
НА НЕРОКСИДАЗА И КАТИОННИ
ПРОТЕИНИ В АЕВКОЦИТИТЕ
М о д и ф и ц и р а й м е т о д н а Т. Ц б е т к о В а
П р и н ц и п , Р е а к ц и я т а се базира н а окисле­
н и е т о н а орто-дианизидин 6 п ри с ъс т ви е н а
миелопероксидаза и водороден прекис. Обра­
зува се неразтворимо съединение с ярко жъл­
т о - к а ф я в ц в я т , к о е т о се о т л а г а в м е с т а ­
т а с ензимна а к т и в н о с т . Киселото багрило
фаст-гриин, н а б а з а т а н а е л е к т р о с т а т и ч ­
н о т о свързване, о ц в е т я в а в зелено някои (ар-
гинин, лизин и х и с т и д и н съдържащи) к а т и -
онни п р о т е и н и .
L Реактиви
t 1. Фиксатор. Смес о т 36-38% формалин и
96% С2Н5ОН (1 + 19).
2. О ц в е т и т е л е н р а з т в о р А; 0.02 m o l / 1
o-Dianisidin. В 10 ml д е с т и л и р а н а вода се
р а з т в а р я т 50 m g o-Dianisidin. Непосред­
с т в е н о преди заливане н а н а т р и в к и т е се
прибавя 0.8 ml 3% Н2О2 . Р а з т в о р ъ т се при­
г о т в я ех tempore и т р я б в а да бъде без­
цв е т ен. На въздух о р т о - д и а н и з и д и н ъ т се
окислява бързо (Внимание: да се ползва са­
мо, ако к р и с т а л и т е са бели до леко жъл­
теникави).
3. 0.067 mol/1 ф о с ф а т е н (Na 2 HP0 4 /КН 2 Р0 4 )
буфер с pH 8.2.
4. О ц в е т и т е л е н р а з т в о р Б: 2.0 mol/1 Fast
green FCF. В 100 ml смес н а м е т а н о л и бу­
фер (20 ml СН3ОН и 80 ml р а з т в о р 3) се
р а з т в а р я т 100 m g фаст-гриин. Р а з т в о ­
р ъ т е т р а е н до две седмици н а т ъ м н о ,
при с т а й н а т е м п е р а т у р а .
5. Хематоксилинов р а з т в о р .
Техника
1. Фиксиране на н а т р и в к и т е в р а з т в о р 1 з а
12 s. 2. Измиване с т е ч а щ а вода в продълже­
ние на 2 min и измиване в д е с т и л и р а н а вода.
3. Заливане на н а т р и в к и т е с о ц в е т и т е л е н
р а з т в о р 2. 4. Т р и к р а т н о измиване н а н а т ­
р и в к и т е с дестилирана вода. 5. П о т а п я н е
н а н а т р и в к и т е в р а з т в о р 3 за 3 min. 6. Оц­
в е т я в а н е с р а з т в о р 4 за 20 min. 7. Двукрат­
но измиване с дестилирана вода, изсушава­
не. 8. К о н т р а с т н о о ц в е т я в а н е с р а з т в о р 5
з а 8 min. 9. Микроскопиране.
М е т о д ъ т се прилага при типизиране на
левкемиите - за бързо определяне н а т и п а
на б л а с т и т е - доказване н а нелимфобласт-
н и т е о с т р и левкемии (M^Mg), т ъ й к а т о вър­
ху една н а т р и в к а едновременно се визуали­
з и р а т б л а с т и т е с положителна реакция за
МНО или КП, или за д в а т а компонента. В
случаи с нелимфобластни левкемии при о т ­
р и ц а т е л н а реакция на МНО и Л, положител­
н а т а реакция за КП о т н а с я б л а с т и т е към
миелобластен т и п .
Заключение. Цитохимичните методи
и м а т определена сфера н а приложение и
т я х н о т о използване в ц и т о д и а г н о с т и к а т а
не бива да бъде надценявано. През последни­
т е години получиха р а з в и т и е м е т о д и т е за
а в т о м а т и ч е н анализ на к л е т к и т е с т о ч н о
количествено определяне на редица в ъ т р е к ­
л е т ъ ч н и съставки. О т к л о н е н и я т а в ензим­
н а т а а к т и в н о с т и в съдържанието на оп­
ределени с у б с т р а т и в л е в к о ц и т и т е се наб­
л ю д а в а т не само при левкемии но и при ре­
дица реактивни състояния. Въпреки че е т и ­
о л о г и я т а и п а т о г е н е з а т а им се о т л и ч а в а т
о т т е з и при левкемиите, в повечето о т слу­
ч а и т е ц и т о х и м и ч н и т е промени в левкоци­
т и т е са сходни - к а к т о при функционално
изменена к л е т ъ ч н а а к т и в н о с т , т а к а и при
л е в к е м и ч н а т а т р а н с ф о р м а ц и я . Задължи­
т е л н о е с п а з в а н е т о на два основни принци­
па:
1. Ц и т о х и м и ч н и я т анализ се провежда след
морфологично изследване на левкоцити­
те.
2. Обсъждането на р е з у л т а т и т е о т ц и т о -
химичното изследване се прави в с ъ ч е т а ­
ние с клиничните и основните цитологич-
ни данни.
Използването н а цитохимични техники
заедно с имунофенотипизирането н а к л е т ­
к и т е о т к р и в а широки възможности за про­
учвания върху к л е т ъ ч н и я цикъл и броя н а
к л е т ъ ч н и т е линии, за разпознаване на ма-
лигнените клетки, к а к т о и за проследяване
на е ф е к т а о т химиотерапията.
355
Книгопис
Златарев О. Цитохимични изследвания на кръвните клетки.
В; Клинична лаборатория. Каракашов Л, Пандов X (ред).
С., Мед и физк, 1970.
Пирс Е. Гиетохимия. Москва, 1962.
Цветкова ТЗ. Цитохимично изследване на левкоцитите. В;
Дочев Д, Шипков Т (ред). Лабораторна диагностика. Хе-
матологични изследвания. С., Мед и физк, 1988, 80-93.
Bailey J, John Е. Cytochemistry and immunohislochemistry. In:
Kodak Ä (ed). Diagnostic Hematology. Philadelphia etc, W
В Saunders company, 1995, 307-322.
Begemann H, Kastetter J. Atlas of Clinical Hematology. Fourth
Edition. Berlin etc. Springer-Verlag 1989.
Coleman M. Hemoglobin and iron metabolism. In: Kodak В (ed).
Diagnostic hematology. Philadelphia etc, W В Saunders
comp., 1995, 91-100.
Elis J M. A rapid sensitive myeloperoxidase stain using 4-chloro-
1-naphthol. Amer J Clin Pathol, 73, 1982, 797-799.
Goasguen J, Bennet JM. The acute myeloid leukemias: morphol­
ogy and cytochemistry. In: Bick KL (ed). Hematology, St.Louis
etc, Mosby comp., 1993, 1195-1224.
Hall K, Malia KG. Medical Laboratory Haematology. London-
Boston etc, Butterworths. 1984.
356
Koike J. Hematological cytochemistry: Current status. Acta
Haematologica Japonica, 50, 1987, 8, 1519-1530.
Saunders Manual o f Clinical Laboratory Science. Lehman C A
(ed). W В Philadelphia etc, Saunders comp., 1998.
Shibata A, Bennett JM, Castoldi GL, Catowsky D el al. Kecom-
mended methods for cytological procedures in haematology.
Clin Lab Haematol, 7, 1985, 55-74.
Tzvetkova T, Popivanova N. Cytochemical investigation o f leu­
kocytic cathionic proteins in patients with viral hepatitis con­
ducted in the courses o f the disease. Folia medica, 26, 1984,
1, 11-15.
Tzvetkova T, Zvetkova E. Cytochemical aspects o f the leuko­
cytes in leukemia and chronic myelosis. In: Mauri C, Kizzo
SC, Kicevuti G (eds). The biology o f phagocytes in health
and disease. Chur - London - Paris - New York, Harwood
Academic Publ., 1986, 1, 129-333.
Zvetkova EB, Zvetkov IB. A cytological method for the simulta­
neous staining o f nucleoproteids and some cathionic proteins.
Acta histochem., 57, 1976, 1, 1-13.
Zvetkova EB, Hadjioloff AI, Tzvetkova TZ. Cytochemistry of
nucleoproteids (KNP and DNP) and some cathionic proteins
in leukocytes o f leukaemic patients. Folia Haematol (Lpg),
106, 1979, 1-13.
 Цитокини и цитокиноби
рецептори - диагностичен
анализ
Cm. Д ане в
ОБЩИ ДАННИ
Ц и т о к и н и т е се о б р а з у в а т о т я д р е н и т е
к л е т к и на човека и заедно с хормоните и нев-
р о м е д и а т о р и т е и з г р а ж д а т съвършена ко­
муникационна мрежа, чрез к о я т о се поддър­
ж а п о с т о я н н и я т к о н т а к т и диалог между
отделните клетки.
Химически ц и т о к и н и т е п р е д с т а в л я в а т
б е л т ъ ц и или гликопротеини с мол. м а с а о т
6 до 70 kDa. Подобно н а х о р м о н и т е т е се
н а м и р а т в к р ъ в т а в свободно с ъ с т о я н и е или
свързани с различни б е л т ъ ц и - главно алфа-
2-макроглобулин. Д е й с т в и е т о им върху
к л е т к а т а се о с ъ щ е с т в я в а чрез свързване
със специфични мембранни р е ц е п т о р и или
след проникване в к л е т к а т а , респ. в нейно­
т о ядро.
Ц и т о к и н и т е а к т и в и р а т сложни каска­
ди о т в ъ т р е к л е т ъ ч н и сигнали, в к о и т о важ­
н а роля и з п ъ л н я в а т различни реакции н а
фосфорилиране, к а т а л и з и р а н и о т с ъ о т в е т ­
н и т е кинази. Голяма ч а с т о т ц и т о к и н и т е
у п р а ж н я в а т крайния си е ф е к т с п о м о щ т а
н а т р и ф а к т о р а в к л е т ъ ч н о т о ядро:
>- NFkB {nuclearfactor kB) - особено важен
ядрен ф а к т о р , к о й т о з а д е й с т в а в различ­
н и т е к л е т к и реакции н а а к т и в и р а н е и
пролиферация или реакция на програми­
рана к л е т ъ ч н а с м ъ р т (апоптоза).
>• PPAR {peroxisome proliferator activated
receptor) - д е й с т в а к а т о а н т а г о н и с т н а
NFkB и има важно д е й с т в и е к а т о п р о т и ­
вовъзпалителен ф а к т о р , к о й т о в присъс­
т в и е на някои а к т и в а т о р и има и подчер­
т а н лечебен е ф е к т при дислипопротеи-
немия, хипертония, д и а б е т , злокачест­
вени т у м о р и и пр.
> Л е п т и и и - и д е н т и ф и ц и р а т се още с IL-
11. Д е й с т в а т к а т о синергисти н а NFkB
и а н т а г о н и с т и н а PPAR. Л е п т и н и т е се
о б р а з у в а т о т м а с т н и т е к л е т к и (адипо-
ц и т и т е ) в л и мф н и те фоликули и осигу­
р я в а т п о с т о я н н а връзка между три сис­
теми: невроендокринна, имунна и маст­
на тъкан. За правилното протичане на
диалога между т я х са отговорни с и н т е ­
з и р а щ и т е ги гени - Ob, т е х н и т е рецеп­
т о р и - ObRb и к р и т и ч н а т а маса н а пе-
рифоликуларната м а с т н а т ъ к а н . При на­
рушаване н а т а з и маса в посока на силна
загуба (над 30%), напр. при анорексия или
силно наддаване н а т е г л о (с повече о т 40-
50%) - при генетични д е ф е к т и на Ob и
ObRb, свързани с изразено з а т л ъ с т я в а ­
не, т о з и диалог се нарушава в една и съ­
щ а посока, т . е . н а с т ъ п в а шмупсп и
х о р м о н а л е н д е ф и ц и т . С повишаване
на посочените по-горе ядрени ф а к т о р и
се с в ъ р з в а т определени промотерни сег­
м е н т и на ДНК с отключване д е й н о с т т а
на с ъ о т в е т н и т е гени. Д е й с т в и е т о на ци­
т о к и н и т е може да бъде насочено върху
с а м а т а к л е т к а - автокринно, върху съ­
седни к л е т к и - п а р а к р и п н о или върху
целия организъм - ендокринно. В резул­
т а т на т я х н о т о действие се а к т и в и р а т
различни процеси - плейтропил, к о и т о
взаимно м о г а т да се з а с т ъ п в а т в различ­
на с т е п е н ; на п р а к т и к а повечето ц и т о ­
кини и м а т неспецифично действие, кое­
т о може да варира в о т д е л н и т е т ъ к а н и ,
особено к о г а т о се осъществява с помощ­
т а на бифуркационни фактори, к а т о
напр. NFkB. О т друга с т р а н а при обра­
зуване на повечето цитокини се ангажи­
р а т голям брой различни клетки, к о и т о
обуславят друга т я х н а особеност - мно-
ж е с т в е н о с т {redundancy) н а синтезира­
щ и т е клетки.
357
ПРОЦЕСИ ПРИ АКТИВИРАН Е
НА ЦИТОКИНИТЕ
Основните процеси, свързани с а к т и в и р а н е
о т ц и т о к и н и т е се о б е д и н я в а т в няколко
групи:
1. У с и л в а н е н а к л е т ъ ч н о т о д е л е н и е .
Например IL-2 с т и м у л и р а пролиферация-
т а на Т-лимфоцитите, д о к а т о р а с т е ж ­
н и т е ф а к т о р и с т и м у л и р а т пролифераци-
я т а н а с ъ е д и н и т е л н а т а т ъ к а н (TGF^) и
н а различни кръвни к л е т к и (M-CSF, GM-
CSF, PDGF).
2. П р о г р а м и р а н а к л е т ъ ч н а с м ъ р т
( а н о п т о з а ) . Например а к т и в и р а н е т о и
под влияние н а т у м о р н е к р о т и ч н и я фак­
т о р (TNF-cx) и др.
3. К л е т ъ ч н а д и ф е р е н ц и а ц и и . О т особе-
но голямо значение с а два вида диферен­
циация с ключова роля при в ъ з п а л е н и е т о
и имунната защита:
а) Диференциране н а х е л п е р н и т е лимфо-
ц и т и (Th 0 ) в две подгрупи - T h , и ТЬз . T h , с а
носители н а к л е т ъ ч н и я и м у н и т е т , респ. ре­
акциите на свръхчувствителност о т бавен
тип. О б р а з у в а т се под влияние н а д в а ци-
т о к и н а - IL-12 и IL-18. T h , л и м ф о ц и т и т е
с и н т е з и р а т о т своя с т р а н а IL-2 и помощ­
ния а к т и в а т о р н а м а к р о ф а г и т е - у - и н т е р -
ферон. ТЬзСа н о с и т е л и н а хуморалния иму­
н и т е т , респ. р е а к ц и и т е н а с в р ъ х ч у в с т в и ­
т е л н о с т о т б ъ р з т и п , вкл. а п а ф и л а к с и -
я т а . ТЬз с т и м у л и р а т В - л и м ф о ц и т и т е с по­
м о щ т а н а л и м ф о к и н и т е IL-4 и IL-5 м а т у р а -
ц и я т а им до к л е т к и , с и н т е з и р а щ и IgE и дру­
ги имуноглобулини; о т друга с т р а н а т е з и
к л е т к и о т д е л я т основния а н т а г о н и с т н а
у-интерферона - IL-10.
Th! и ТЬз к л е т к и т е се н а м и р а т в динамич­
но равновесие, к о е т о се подпомага о т общи­
т е цитокини - IL-2 и IL-18. При нарушаване
на т о в а равновесие н а с т ъ п в а т отклонения,
к о и т о са особено изразени при възпаления и
с ъ с т о я н и я н а имунна н е д о с т а т ъ ч н о с т .
б) Диференциране н а м о н о ц и т и т е до м а к -
рофаги под влияние н а м о н о ц и т е н х е м о а т -
р а к т а н т (monocyte chemotaxic protein,
MCF), р а с т е ж е н ф а к т о р , к о н т а к т н и б е л т ъ ­
ци ( с е л е к т и н и , и н т е г р и н и , VcAM, IcAM и
др.), IL-1 и TNF-a. О т своя с т р а н а макрофа­
г и т е се а к т и в и р а т чрез верижна а в т о к а т а -
л и т и ч н а реакция с образуване н а големи ко-
358
л и ч е с т в а IL-1, TNF-a, IL-6 и др. Особено в а ж ­
н а роля при т о в а а к т и в и р а н е и м а IL-6, кой­
т о се с и н т е з и р а в 10 до 100 п ъ т и по-високи
концентрации о т о с т а н а л и т е цитокини,
к а т о с т и м у л и р а о т своя с т р а н а две реак­
ции:
• образуване о т ч е р н и я дроб н а б е л т ъ ц и н а
о с т р а т а фаза и
• с т и м у л и р а н е с и н т е з а н а IL-8 - м о щ е н хе-
м о а т р а к т а н т н а н е у т р о ф и л н и т е грану-
л о ц и т и , к о и т о у в р е ж д а т съдовия е н д о т е л
чрез освобождаване н а свободни радикали,
левкотриени и токсични белтъци, к а т о
HMGP (high mobility group I proteins).
А к т и в и р а н е т о н а п о с о ч е н и т е имунни и
в ъ з п а л и т е л н и к а с к а д и е причина з а н а с т ъ п ­
ва н е н а м у л т и о р г а н н о у в р е ж д а н е (сърдечно­
съдова с и с т е м а , бял дроб, б ъ б р е ц и т е и че­
р е н дроб), к о е т о п р о т и ч а в няколко фази:
SIRS (s y s t e m i c i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e syn­
d r o m e -+ с е п с и с (обикновено г р а м - о т р и ц а ­
т е л е н ) -+ е н д о т о к с и ч е н ш о к .
Р о л я т а н а ц и т о к и н и т е във в ъ з п а л и т е л ­
н и т е и и м у н н и р е а к ц и и е п о к а з а н а схема­
т и ч н о н а фиг. 18. 1.
4. Х о м е о с т а з а н а с ъ е д и н и т е л л а т а т ъ ­
к а н . С п о м о щ т а н а IL-1 се а к т и в и р а т м а т -
р и к с н и т е п р о т е а з и , разграждащи колагена;
т о з и процес е п а т о ло г и ч н о усилен при въз­
паления н а с ъ е д и н и т е л н а т а т ъ к а н (ревма-
т о и д е н а р т р и т ) , остеопороза, остеолиза
и пр. О б р а т н и т е процеси, усилващи с и н т е ­
з а н а колагена се о с ъ щ е с т в я в а т с помощ­
т а н а т р а н с ф о р м и р а щ и я р а с т е ж е н фак­
т о р (TGF-^), к о с т н и я морфогенен п р о т е и н
(BMP) и др.; при патологично усилване н а
т е з и процеси н а с т ъ п в а усилена остеогене-
за. А к т и в и р а н е т о н а TGF-ß и м а ключова ро­
ля при патологична фиброза и цироза н а чер­
ния дроб, склеродермия, атеросклероза и др.
5. А н г и о г е н е з а . При хипоксия н а м и о к а р д а
и други т ъ к а н и се а к т и в и р а т последова­
т е л н о няколко ц и т о к и н и , с т и м у л и р а щ и
ангиогенезата с изграждане н а колатера-
ли около о б т у р и р а н и я кръвоносен съд:
• в п ъ р в и т е 4-6 h след х и п о к с и я т а се ин-
дуцира я д р е н и я ф а к т о р HIF-I {hypoxia
inducible f a c t o r I). С ъ щ и я т е с в р ъ х р а -
п е н м а р к е р п а ИБС.
• след 24 h HIF индуцира с и н т е з а т а н а
съдовия ангиогенен ф а к т о р VEGF
{vascular endothelial g r o w t h factor)
 | р а м (-)
бактерии

мултиоргамна недостатъчност (SIRS)

Фиг. 18.1. Схематично представяне ролята на цитокините във възпалителните и имунни реак­
ции (обяснението в текста)
• активираме
"> подтискане

• след около 36-48 h о т н а с т ъ п в а н е т о на 6. Р а з В и т и е п а з л о к а ч е с т в е н и т у м о р и .

х и п о к с и я т а се индуцира с и н т е з а т а на
TGF-() и TNF-a, к о и т о п о д п о м а г а т до­
изграждането н а новообразуваните съ­
дови колатерали.
За а к т и в и р а н е на ангиогенезата при ИБС
се п р и л а г а т индуктори на HIFI и VEGF. При
злокачествени новообразувания ангиогенеза­
т а може да бъде патологично усилена; с ус­
п о р е д н о т о а к т и в и р а н е н а някои м е т а л о -
протеинази т я б л а г о п р и я т с т в а р а з в и т и е ­
т о н а м е т а с т а з и . Напоследък се п р и л а г а т
о п и т и с генна т е р а п и я и моноклонални ан­
т и т е л а за подтискане на ангиогенезата
при раково болни.
Р о л я т а н а ц и т о к и н и т е при ракови забо­
лявания е постулирана през 1891 г. в Ра­
ковия и н с т и т у т Sloan Kettering (СЛЩ) въз
основа на доказания временен о н к о с т а т и -
чен е ф е к т на е к с т р а к т о т грам-отрица­
т е л н и б а к т е р и и при болни със саркоми.
Осемдесет години по-късно в същия Ин­
с т и т у т се доказва, че в о с н о в а т а на т о ­
зи е ф е к т с т о и хеморагична некроза на т у ­
мора, индуцирана о т ф а к т о р , идентифи­
циран к а т о TNF-(x. Р а з в и т и е т о на злока­
ч е с т в е н и т е т у м о р и се основава на слож­
н а мрежа о т цитокини, н а т е х н и рецеп­
т о р и и инхибитори, кодирани о т опреде-
359
 лени (прошо) онкозени. Услобно шези ци-
токини се подразделят н а две групи:
а) Цитокини, с т и м у л и р а щ и т у м о р н и я
растеж: IL-6, IL-5, IL-3, GM-CSF, G-CSF, и-ин-
терферон, ангиогенни иитокини.
б) Цитокини, подтискащи туморния раз-
теж: у-интерферон, а к т и в а т о р и н а и и т о -
токсичните к л е т к и - 1L-2 (получават се LAK
(lymphocyte activated killers), прилагани за ле­
чение на меланоми и бъбречни карциноми,
IL-12 (индуиира образуването н а Thi к л е т к и
и сх-интерферон).
Основен "балансьор" между д в е т е групи
и и т о к и н и е TNF-ot - чрез NFkB moü отключ­
ва в някои к л е т к и т у м о р е н р а с т е ж , а в дру­
ги - а п о п т о з а . Потенциален а к т и в а т о р на
а п о п т о з а т а н а т у м о р н и т е к л е т к и е PPAR
к а т о инхибитор н а TNF-a респ. н а NFkB.
КЛАСИФИКАЦИЯ НА ЦИТОКИНИТЕ
Класификацията н а ц и т о к и н и т е е условна,
т ъ й к а т о много ц и т о к и н и и м а т две и пове­
че различни функции ( т а б л . 18. 1).
На т а б л . 18. 2 е дадена х а р а к т е р и с т и к а -

Т а б л и ц а 18.1. Основни ц и т о к и н о в и фамилии

фамилия Представители
1. Интерлевкини (IL) о т IL-I go IL-18
2. И н т е р ф е р о н и « , ß, У
3. Тумор-некротични ф а к т о р и (TNF) TNF-a, TNF-ß, СЕ)-40-лиганд, FAS-лиганд
4. Трансформиращи TGF-a, TGF-ßl-З, а к т и в и н , инхибин,
р а с т е ж н и ф а к т о р и (TGF) BMP (bone morphogenic protein)
5. Р а с т е ж н и ф а к т о р и (GF) т р о м б о ц и т е н (PDGF), ф и б р о б л а с т е н (FGF),
инсулиноподобен (I-like), е н д о т е л е н (VEGF)
6. Хемотаксични ф а к т о р и (CP) м о н о ц и т е н (MCP), IL-8, е о т а к с и н , л и м ф о т а к с и н
7. Колонии-стимулиращи з а макрофаги (M-CSF), г р а н у л о ц и т и / м а к р о ф а г и (GM-CSF),
ф а к т о р и (CSF) г р а н у л о ц и т и (G-CSF), е р и т р о п о е т и н

Т а б л и ц а 18.2. Х а р а к т е р и с т и к а н а и н т е р л е в к и н и т е

IL Маса Прицелни
Синоним (функции) Произход
(küa) клетки
IL-1 Th0 - а к т и в а т о р , пироген 17 Е,Ф,Г,М В,Т,Г,М
IL-2 Th2 - р а с т е ж е н ф а к т о р 15 Т Th0,TNK,B,M
IL-3 М а с т о ц и т е н р а с т е ж е н ф-р 15-30 Т, Мц стволови КМ
IL-4 B-клетъчен с т и м у л а т о р 15-19 Т,М,Баз,Мц В,Ф,Т,ТКК,Баз
IL-5 B-клетъчна диференциация, еозинофилен диференциращ ф-р 40-45 Т, Мц Ео, Баз, В
IL-5 Фактор, стимулиращ В к л е т к и т е и х е п а т о ц и т и т е , Е,Ф,Т,Г,М в,м,т,
тромбопоетин 20-30
хепатоцити
IL-7 Лимфопоетин I, р а с т е ж е н ф-р за пре-В-клетките 17 Т, тимус-Е В,М,Т
IL-8 Х е м о а т р а к т а н т за неутрофили и моноцити, п о д т и с к а Ф,М,Т,Ендо Н (Т)
л е в к о ц и т н а т а адхезия 10
IL-9 Растежен ф а к т о р н а Т - к л е т к и т е и м а с т о ц и т и т е Т стволови КМ
40
IL-10 Инхибитор на у-интерферон и други цитокини М,Т,В,Е В,М,Т
39
IL-11 Лептин
23 м а с т н и кл. T^h,
IL-12 Стимулатор на Т КК -клетки
35 М,В,Е T ' TN K
IL-13 Р600
17 Т в,м
IL-14 Високомолекулен р а с т е ж е н ф а к т о р на В - к л е т к и т е
60 Т,В в
IL-15 Неизяснена функция
15 Е,М т,т
IL-16 Химиотаксичен ф а к т о р за л и м ф о ц и т и т е
56 Т,Мц,Ео,Ф т
IL-17 Неизяснена функция
17 Т,Ф ф,Е,Ендо
IL-18 Ин дук т о р н а у-интерферон, диференциране н а Th к л е т к и т е
0 18 М,Остеобл Т »Th 0 'Т N K
1 A , 1

г ан ло ити
М - моноиипг Ф - ЛпйгюйлаХг. . лл ' ' Р У ^ ; Н - неутрофили; Баз - базофили; Ео - еозинофили;
Th - хелперни Т-лимфоцити; КМ - ^ с т н о Т ш ъ ч н и ^ 1 ' " к и А Ъ р н и Т - л и м Ф о ц и т и ; Е - епител; Ендо - ендотел;
360
ma на интерлевкините. Поради взаимното
застъпване на функциите им т я също е ус­
ловна.
ЦИТОКИНОВИ РЕЦЕПТОРИ
Р е ц е п т о р и т е за ц и т о к и н и т е изпълняват
важна роля в регулацията на т я х н а т а ак­
т и в н о с т . На фиг. 18.2 е представена схема­
т и ч н о регулацията на IL-1:
• под влияние на външен с т и м у л (LPS-липо-
полизахарид) се а к т и в и р а ядрен ф а к т о р
на с ъ о т в е т е н макрофаг (NFkB), респ. съ­
о т в е т н и я IL-1 ген, к а т о NFkB се свързва
с промотера му (Prom).
• в р е з у л т а т се а к т и в и р а IL-1-конверти-
ращ ензим (IL-1-CE), к о й т о о т д е л я сигна­
лен пепт ид (SP) о т неактивния про-ин-
терлевкин.
• освободеният IL-1 се о т д е л я в кръвообръ-
щението к а т о се улавя о т два вида рецеп­
тори:
- м с л ^ р а н н о - с в ъ р з а н и IL-1 р е ц е п т о ­
р и , к о и т о о т своя с т р а н а са т и п I ( т -
IL-1-R-I) - а к т и в и р а т с ъ о т в е т н и я Т-лим-
фоцит к а т о с т и м у л и р а т секрециата на
IL-6 и т и п II (m-IL-1-R-II) - блокират т а ­
IL-1-CE
NFkB
' ö ö ö ö ö - TOO
I V { Л • IL-1
- Н 1
Фиг. 18.2. С х е м а т и ч н о п р е д с т а в я н е регулацията н а IL-1 {обяснението в текста)
( + ) - активира; (-) - блокира (инактивира)
зи секреция.
• разтворими рецептори (s-IL-R), к о и т о
у л а в я т IL-1 к а т о го и н а к т и в и р а т .
Видно е, че при образуването н а IL-1 преобла­
д а в а т з а д ъ р ж а щ и т е механизми, в р е з у л т а т н а
к о е т о ц и т о к и н ъ т luxia н и с к а а к т и в н о с т .
Това се о т н а с я до по-голямата ч а с т о т о с т а ­
н а л и т е ц и т о к и н и . И з к л ю ч е н и е п р а в и IL-6,
к о й т о е а к т и в е н при свързването си к а к т о с
м е м б р а н и т е , т а к а и с р а з т в о р и м и т е рецепто­
ри. Освобождаването н а ц и т о к и н и т е и т е х н и ­
т е рецептори се катализира о т специфични кон­
в е р т и р а щ и ензими (СЕ). К о н в е р т и р а щ и т е ензи­
ми за о т д е л я н е на р е ц е п т о р и т е на IL-6 (IL-6-CE)
се с ъ д ъ р ж а т в п а т о г е н н и бактерии и се а к т и ­
в и р а т о т б е л т ъ ц и т е на о с т р а т а фаза. С т о в а
се обяснява с т о т и ц и п ъ т и по-високата а к т и в ­
н о с т на IL-6 в сравнение с о с т а н а л и т е ц и т о к и ­
ни.
Прилагането на с и н те ти ч н и разтвори­
ми (s-IL-R) или мембранни (m-IL-R) о т т и п
II рецептори, к а к т о и на специфични инхи-
битори на с ъ о т в е т н и т е конвертиращи ен­
зими, предоставя големи перспективи във
фармакотерапията на редица възпалител­
ни заболявания (сепсис, SIRS, ревматоиден
а р т р и т , системен лупус еритематодес и
др.), злокачествени тумори, алергични със­
т о я н и я и пр.
m-IL-1-R-Il
361
МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ
НА ЦИТОКИНИТЕ
Редица фактори з а т р у д н я в а т изследването
на ц и т о к и н и т е :
> Много ниска концентрация, к о я т о е чес­
т о под пределната граница на чувстви­
т е л н о с т т а на м е т о д а (под 10 pg/ml).
> Наличие на молекулни в а р и а н т и и изофор-
ми на ц и т о к и н и т е : напр. IL-6 има 6 изо-
форми (23-30 kDa), IL-1 и м а два прекурсо-
ра, о т к о и т о е д и н и я т (IL-la) е биологич­
но а к т и в е н за разлика о т IL-lß; TNF е ак­
т и в е н само във вид н а т р и м е р , д о к а т о
неговите димери и мономер са н е а к т и в ­
ни. Върху а к т и в н о с т т а н а ц и т о к и н и т е
оказва влияние и с т е п е н т а н а гликозили-
ране, наличието н а разградни п р о д у к т и
и пр.
> Наличие на разнородни инхибитори н а ци­
т о к и н и т е , к о и т о п о н и ж а в а т измерени­
т е с т о й н о с т и : автоантитела, разтво­
р и м и рецептори, антагонисти на цито-
кинови рецептори (напр. IL-1-RA), инак-
тивиране от алфа-2макроглобулин и др.
>- Изключително к р а т ъ к полуживот (сред­
но 10 min).
>• Изразени циркадианни р и т м и (IL-6 и м а
сутрешни пикове).
Тези т р у д н о с т и н а л а г а т с т р и к т н о т о
спазване на определени п р е д а н а л и т и ч н и
изисквания:
1. За имунотестуванектръЪшз. т р я б в а да
се събира в стерилни ЕДТА-съдържащи еп­
руветки (да не се ползва хепарин к а т о ан-
т и к о а г у л а н т , т ъ й к а т о т о й ч е с т о е за­
мърсен с ендотоксини, к о и т о са силни ин-
дуктори на с и н т е з а н а цитокини.
2. За б и о т е с т у в а н е тфяЪЪа. да се използва
серум (ЕДТА блокира реакцията), в з е т при
строго стерилни условия.
3. П л а з м а т а / с е р у м ъ т т р я б в а да се о т д е л я т
много бързо (30-60 min след венепункция-
т а ) и да се с ъ х р а н я в а т в минусов хладил­
ник (-80оС).
4. При изследване н а ликвор, урина, бронхи­
ална т е ч н о с т , синовиална т е ч н о с т и др.
се прилага предварително центрофугира­
не при ниски обороти.
362
ИмунотестуВане
Поради п о - г о л я м а т а си д о с т ъ п н о с т и на­
д е ж д н о с т т е з и м е т о д и н а в л и з а т бързо в
клиничните лаборатории. С п о м о щ т а на мо-
ноклонални а н т и т е л а са разработени висо-
коспецифични м е т о д и , к о и т о м о г а т да раз­
г р а н и ч а в а т ц и т о к и н и с еднаква биологична
а к т и в н о с т , напр. разграничаване на IL-la
о т IL-lß. Обикновено се използват две ан­
т и т е л а : а н а л и т и ч н о (моноклонално) и ин­
директно {ълопо- или поликлонално). Предпо­
ч и т а т се нерадиоизотопни и м у н о т е с т у в а -
щи м е т о д и (най-често ELISA), на ч и я т о ос­
нова са р а з р а б о т е н и г о т о в и набори за изс­
ледване н а IL-1, IL-6, IL-8, TNF, IL-2R и др.
за средно 90 min. П р е д е л ъ т н а ч у в с т в и т е л ­
н о с т н а т е з и м е т о д и е сравнително висок
(5 pg/ml). С цел да се п о с т и г н е по-висока чув­
с т в и т е л н о с т се п р и л а г а т м е т о д и с флуо­
р е с ц е н т н о белязани а н т и т е л а върху т в ъ р ­
да фаза (полистеренови микросфери) и с флоу-
ц и т о м е т р и ч н о измерване (flowmetrix TM,
Quantiflow TM). Тези м е т о д и се о т л и ч а в а т
с висока ч у в с т в и т е л н о с т ( < 100 fg/ml), го­
лям к а п а ц и т е т (в проба о т 50 |il се изслед­
в а т 64 различни ц и т о к и н и и с голяма бързи­
н а (под 1 h).
М е т о д и т е на имунотестуване поста­
в я т няколко нерешени въпроса:
а ) С т а н д а р т и з а ц и я с помогщпа на междуна­
родно п р и з н а т и калибратори, синтезира­
ни чрез р е к о л г б и н а н т н а т е х н и к а - за­
сега с а д о с т ъ п н и к а л и б р а т о р и само за
TNF-a, IL-6 и IL-2.
о) Уеднаквен начин на изразяване на резулта­
т и т е - понастоящем за един и същ ц и т о -
кин се п р и л а г а т 3 начина - pg/ml, pmol/I и
Международни единици. Повечето ф а к т о ­
ри за преизчисляване са неточни.
В) Интерференция на разтворими рецептори.
г) С ъ щ е с т в е н н е д о с т а т ъ к н а и м у н о т е с т у -
в а н е т о е, че не се измерва а к т и в н о с т т а
н а ц и т о к и н а , а н е г о в а т а концентрация.
БиотестуВане
Извършва се върху ч у в с т в и т е л н а к л е т ъ ч н а
л и н и я при з а д ъ л ж и т е л н о използване н а
с т а н д а р т е н ц и то к и н о в п р е п а р а т , при кое­
т о м о г а т да се и зсл ед ват различни биоло-
гични реакции: ц и т и . Напоследък се п р и л а г а т опростени
• п р о л и ф е р а ц и л н а миши т и м о ц и т и (за техники с пълна кръв, к о я т о се инкубира с
IL-1), В9-хибридомни к л е т к и (за IL-6) и др.; различни с т и м у л а т о р и - липополизахариди
• ц и т о т о к с и ч л о с т към определени кле­ (LPS), фитохемаглутин11н{\*\\\), форбол-ми-
т ъ ч н и лиинии (TNF-a и ß); ристинов ацетапг (РМА) и др. Разработени
• а н т и в и р у с н о д е й с т в и е , напр. ограни­ са ELISA методи за определяне на възпалител­
чаване на ц и т о п а т и ч е н е ф е к т под влия­ ни цитокини (IL-1, IL-6, IL-8, TNK и др.) и на
ние н а гама-интерферон; Th 1 /Th 2 цитокини (у-интерферон и IL-10). С по­
• и н д у к ц и я н а м о л е к у л и върху к л е т ъ ч ­ м о щ т а на а н т и т е л а , имобилизирани върху
н а т а п о в ъ р х н о с т (напр. експ рес и я н а т в ъ р д а фаза ч у в с т в и т е л н о с т т а се повиша­
МСНС клас II под влияние н а интерферон); ва значително, напр. при ELISPOT (enzyme-
• п о д т и с к а н е сскрсцилта на цитокини linked immuno-spot assay). С т и м у л и р а н а т а
(напр. IL-10, у-интерферон). клетъчна суспенсия се инкубира върху мик-
роплака с имобилизирано а н т и т я л о ; след про­
Съществен н е д о с т а т ъ к на т е з и методи миване свързаният цитокин се визуализира с
е м а л к а т а им специфичност, т ъ й к а т о ня­ п о м о щ т а на в т о р о а н т и т я л о и хромогенна
колко ц и т о к и н и м о г а т д а и м а т сходен реакция. М е т о д ъ т е 100 п ъ т и по-чувствите­
е ф е к т . С п о м о щ т а н а моноклонални а н т и ­ лен о т ELISA, улавя т р и цитокин-синтези-
т е л а се п о д т и с к а т и н т е р ф е р и р а щ и т е ци­ ращи о т 100 000 клетки и може да се приложи
т о к и н и за с м е т к а н а много по-високата це­ без предварително стимулиране.
н а н а изследването. Освен т о в а т е з и м е т о ­ 2. О п р е д е л я н е н а ц и т о к и н и т е i n situ. To
ди са т р у д о е м к и (24-96 h) и с ниска възпро- е наложително, т ъ й к а т о нивото на цитоки­
изводимост (CV 20-100%). н и т е в к р ъ в т а и другите телесни т е ч н о с т и
На т а б л и ц а 18.3 са съпоставени х а р а к т е ­ е много ниско. Прилагат се два подхода:
р и с т и к и т е н а р а з г л е д а н и т е две групи ме­
• Определяне на клетъчно-свързаните ци­
тоди.
т о к и н и к а т о б е л т ъ ц и САед добавяне на
Таблица 18.3. Сравнителна характеристика на специфични а н т и т е л а . В миналото се при­
методите за определяне на цитокини лагаха предимно и м у н о ц и т о х и л г и ч н и
Ьио- Пмуно- м е т о д и с т р и е т а п а на изследване: фик­
Показател
тестуВапе тсстуВаис сиране, импрегниране (напр. с парафор-
Чубстви- по-малка малдехид-сапонин) и визуализиране. Тези
висока (1 pg/ml)
телност (5 pg/ml)
м е т о д и и м а т сравнително малка чувст­
Специфичност ограничена висока
в и т е л н о с т и д а в а т неспецифичен фон на
концентрация
Измерва активност на а н т и г е н и оцветяване, особено в некротични т ъ к а ­
Аналитичен ни. По-надеждна е ф л о у ц и т о л ю т р и л -
тесен широк
обхват т а с п о м о щ т а на белязани с флуоресцен­
Трудоемкост голяма (2-4 дни) малка (1 h) т н и багрила а н т и т е л а , след предварител­
Иевъзпроизводи- голяма малка но блокиране на с е к р е ц и я т а и транспор­
мост (CV до 100%) (CV 5-10%)
т а на ц и т о к и н и т е с п о м о щ т а на белтъ­
Лекарствена кортикоиди,
интерфе- циклоспорин няма ци (monensin или brefeldin А), к о и т о пре­
ренция и др. дизвикват н а т р у п в а н е т о им в а п а р а т а
Висока цена на т р у д а на р е а к т и в и т е н а Golgi. За повишаване ч у в с т в и т е л н о с т ­
т а на м е т о д а се прилага предварително
стимулиране с РМА, подпомагащо изслед­
Високоспециализирани м е т о д и ване на баланса между T h ^ u ТЬг-клетки.
Ч у в с т в и т е л н о с т т а на флоуцитометрич-
Високоспециализираните м е т о д и са много н о т о диференциране н а T h - к л е т к и т е се
перспективни, но засега са малко д о с т ъ п н и повишава посредством специфични фено-
за р у т и н н а т а п р а к т и к а . Те м о г а т да бъ­ т и п н и маркери н а Thj (CCR5 и CXCR4) и
д а т обособени в няколко групи: Th2 (CCR4 и CCR7). При т я х н о т о използ­
1. О п р е д е л я н е к а п а ц и т е т а н а к л е т к и ­ ване о т п а д а н е о б х о д и м о с т т а о т с т и м у ­
т е д а с и н т е з и р а т ц и т о к и н и . Най-често лиране с РМА.
се използват предварително изолирани левко­
363
• Молекулярно-биологично определлне
н а инфорлшционната РНК н а цито­
к и н и т е . Тези м е т о д и д о п ъ л в а т имуно-
хистохимичните, к а т о и м а т по-висока
ч у в с т в и т е л н о с т (особено при прилагане
в съчетание с ПВР: след превръщане н а
иРНК в кДНК посредством о б р а т н а т р а н -
скриптаза. Последната се амплифицира
с ПВР или ЛВР. С п о м о щ т а н а т е з и м е т о ­
ди може да се у т о ч н и в ъ т р е к л е т ъ ч н а т а
локализащш и "миграцията" н а ц и т о к и ­
н и т е о т м о м е н т а н а с и н т е з а до т я х н о ­
т о интернализиране.
Н е д о с т а т ъ ц и на Д Н К - м е т о д и т е са т я х ­
н а т а висока цена, т р у д о е м к о с т , необходи­
м о с т о т ч е с т а калибрация и т . н .
КЛИНИЧНО ЗНАЧЕНИЕ
НА ЦИТОКИНИТЕ
Независимо о т ограничената си специфич­
н о с т и някои методични т р у д н о с т и , изс­
ледването н а ц и т о к и н и т е намира все по-
широко приложение в м е д и ц и н а т а при:
1. О с т р и и н ф е к ц и и и Възпаления. Харак­
т е р н о е повишението н а TNF-cx, IL-6 и IL-L
То н а с т ъ п в а в п ъ р в и т е часове н а заболява­
н е т о и изпреварва поне с 24 часа повишени­
е т о на БОФ. О т решаващо значение з а изхо­
да на заболяването е равновесието между
д в е т е групи цитокини;
Ц и т о к и н и н а в ъ з п а л е н и е т о : TNF-cx,
IL-6, IL-8, IL-1, IL-12, у-интерферон.
П р о т и в о в ъ з п а л и т е л н и ц и т о к и н и : IL­
IO, разтворими рецептори на TNF и IL-1. При
надделяване на п ъ р в а т а група цитокини мо­
же да се отключи следната патологична кас­
када: SIRS -+ с п е с и с -> ш о к -> л е т а л е н из-
хо
9 Особено неблагоприятни промени са сил­
н о т о повишение на TFN-a (над 1 ng/ml) и IL-6
(над 5000 U/ml). Повишения над т е з и с т о й ­
ности, к а к т о и поява н а HMGPI с надхвърля-
не на " к р и т и ч н а т а точка" о т 80 mg/ml со­
ч а т за летален изход на заболяването.
При превес на противовъзпалителните ци­
токини може да се установи временна ком­
пенсация - CARS (compensated antiinflam­
matory response syndr.), при к о я т о се устано­
вява деликатно равновесие. Особено нестабил­
но е т о в а равновесие при новородени недоно­
364
сени и при кърмачета. Под влияние на масив­
н о т о лечение на п а ц и е н т и о т всички възрас­
т и , изчерпването н а възпалителните ц и т о ­
кини и с ъ п ъ т с т в а щ и заболявания, везните
м о г а т да се н а к л о н я т в о б р а т н а т а посока с
отключвано на не по-малко о п а с н а т а каска­
да: и м у н н а п а р е з а и м у н н а п а р а л и з а
л е т а л е н и з х о д . Неблагоприятни промени,
показващи за н а с т ъ п в а щ а имунна парализа
са: изместване на ТЬц/ТЬ^равновесието в пол­
за н а ТЬз-цитокините, н а р а с т в а н е на IL-10 и
особено н а индекса IL-10/TNF над 7.0, намаля­
ване н а възпалителните цитокини и на фаго­
ц и т о з а т а с промяна на HLA-DR-експресията
о т м о н о ц и т и т е . Чрез флоуцитометрия мо­
же да се у стан о ви и характерно повишение
на р а з т в о р и м и т е TNF-рецептори (sTNF-R II).
2. З л о к а ч е с т в е н и т у м о р и . При изследва­
не н а ц и т о к и н и т е у болни със злокачестве­
ни т у м о р и т р я б в а д а се и м а т предвид след­
н и т е особености:
• поради ограничената си специфичност ци­
т о к и н и т е не м о г а т да се изследват к а т о
т у м о р н и маркери;
• изследването н а "баланса" между цитоки­
н и т е , стимулиращи т у м о р н и я р а с т е ж (IL-
6, IL-5, IL-3, някои CSF, ангиогенни цитоки­
ни, а-интерферон) и ц и т о к и н и т е , подтис­
кащи същия (IL-2, IL-12 и у-интерферон) мо­
ж е да ни о р и е н т и р а о т н о с н о определени
тенденции. Например успоредното нарас­
т в а н е н а M-CSF и Са 125 сочи за рецидив на
овариален карцином, н а р а с т в а н е т о на раз­
т в о р и м и т е рецептори н а IL-2 (S-IL-2R) при
солидни т у м о р и и левкемии показва реми-
сия и/или успешно лечение и др.
• някои паранеопластични явления са т я с ­
но свързани с определени цитокини, напр.
висока т е м п е р а т у р а (IL-6, IL-1, TNF-a),
анемия (TNF-a), т р о м б о ц и т о з а (IL-6), ка-
хексия (THF-cx, у-интерферон), к о с т н а ре­
зорбция и хиперкалциемия (IL-1, IL-6).
3. Т р а н с п л а н т а ц и и н а органи. При о т ­
хвърляне на т р а н с п л а н т и р а н бъбрек, черен
дроб или сърце обикновено н а с т ъ п в а повише­
ние на IL-6, IL-1 или TNF-a. Н а р а с т в а н е т о на
IL-2 или S-IL-2R е ранен маркер за настъпва­
щ а р е ф р а к т е р н о с т на Th к л е т к и т е към цик-
лоспорина. За изследване на ц и т о к и н и т е in
situ се п р и л а г а т техники ELISPOT, чрез кои­
т о се проследява ф и н и я т баланс между прие­
м а н е т о и о т х в ъ р л я н е т о н а органен т р а н с п -
Таблица 18.4. Цитокини - диагностично значение
Цитокин/цитокиноЬ Заболяване Клинично з н а ч е н и е
рецептор
IL-6
EDTA - плазма/серум инфекции о т к р и в а н е на н е о н а т а л н а инфекция,
референтни граници мониториране на лечението
< 10 p g / m l
сепсис/шок прогностичен х а р а к т е р
СПИН маркер з а т е ж е с т на СПИН
ревмат. а р т р и т маркер на а к т и в н о с т т а
б о л е с т на Crohn маркер на а к т и в н о с т т а
лимфоми прогностичен маркер
меланома
ренален карцином

урина ренотрансплантация отхвърляне/инфекция

амниот. т е ч н о с т инфекция у бременни ранна диагноза
бронхиален смив бял дроб - инфекция маркер на ARDS
синовиална т е ч н о с т ревматоиден а р т р и т маркер на а к т и в н о с т т а
IL-8
ЕДТА-плазма/серум б а к т е р и а л н а инфекция ранно о т к р и в а н е у новородени
сепсис/шок прогностичен маркер
бронхиален смив бял яроб - инфекция маркер на ARDS

ILIO
ЕДТА-плазма/серум п о л и т р а в м а , инфекция преценка на имуносупресията;
IL-10/TNF - прогностичен маркер

TNF-a
ЕДТА-плазма/серум б а к т е р и а л н а инфекция ранна диагноза у новор.
референтни граници сепсис прогноза, особено при м е и н г и т
20 mg/ml общ, 5 m g / m l с purpura fulminans
биоактивен лайшманиоза маркер на а к т и в н о с т т а
малария церебрална малария
нехо^жкинов лимфом прогностичен маркер
органна т р а н с п л а н т а ц и я маркер на GVH

Р а з т В о р и м и TNF-R
( р 55, р75)
ЕДТА-плазма/серум сепсис, шок прогностичен маркер
синовиална т е ч н о с т ревматоиден а р т р и т маркер на а к т и в н о с т т а

Р а з т в о р и м IL-2-K
ЕДТА-плазма/серум сепсис, шок прогностичен маркер
референтни граници ОАА прогностичен маркер, рецидив
100 U/ml белодробен рак прогностичен маркер
саркоидоза маркер на а к т и в н о с т т а
трансплантант отхвърляне/инфекция

урина трансплантант отхвърляне/инфекция

Интерферон алфа
ЕДТА-плазма/серум вирусна инфекция диагноза на вирусна инф.
ликвор вирусна инфекция диагноза на вирусна инф.

M-CSF
ЕДТА-плазма/серум овариален карцином диагноза и мониторинг
(заедно с Са-125)
ARDS - Acute Respiratory Distress Syndrome
GVH - Graft Versus Host disease

л а н т а н т ; особено надеждни се о к а з в а т дан­ о с т р и т е възпалителни заболявания и инфек­

н и т е о т т о в а изследване нау-интерферон, IL­
IO и IL-6, к а к т о и на б е л т ъ ц и т е на о с т р а т а
фаза.
4. Л Н т о и м у п п и з а б о л я б а н и л . Подобно на
ции се н аб л ю д ават нарушения на баланса
между възпалителни и противовъзпалител­
ни цитокини. При повечето автоимунни за­
болявания ( д и а б е т т и п I, мултиплена скле-
365
роза, ребматоиден а р т р и т ) н а с т ъ п в а на­ тоимунни заболявания и др.
растване на Thj к л е т к и т е и на TNF-cx. При Определянето на ц и т о к и н и т е е о т особе­
системен лупус е р и т е м а т о д е с обаче се за­ но голямо значение на л ю н и т о р и н г н а илгу-
пазва равновесието Th^/ lh2 при е к с т р е м н и н о т е р а п и л т а . В следващите 10-20 години
повишения на два противоположно д е й с т ­ се очаква р а з р а б о т в а н е т о на експресни ме­
ващи цитокина - IL-6 и IL-10. тоди при леглото н а болния с все по-широко
прилагане и на специализирани изследвания на
5. Алергични заболяВаиия. Ха ра кт ерн о е ц и т о к и н и т е в определени биологични течнос­
рязкото нарушаване н а баланса на 1 h к л е т ­ т и (ликвор, бронхоалвеоларна т е ч н о с т ) и in
к и т е за с м е т к а на ТЬг и с е к р е т и р а н и т е о т s i t u с п о м о щ т а н а ф л о у ц и т о м е т р и я ,
т я х цитокини - IL-4, IL-5 и IL-10. При пове­ ELISPOT-методи, иРПК и ДНК м е т о д и с ПВР
ч е т о болни с екзогенни алергични заболява­ (ЛВР) амплификация. Тези м е т о д и се очаква
ния ( а с т м а , сенна хрема и др.) успоредно с
да б ъ д а т no-бързи, икономични и лесно а в т о -
т о в а н а р а с т в а т с т о й н о с т и т е н а IgE; за­
матизируеми. С т я х н а помощ ще се разкри­
боляването обикновено н а с т ъ п в а в д е т с к а
я т нови възможности за ранна диагноза и ле­
в ъ з р а с т и преминава след п у б е р т е т а . При
чение на разширен с п е к т ъ р о т заболявания,
ендогенно обусловена а с т м а с бронхиална хи-
вкл. редица хронични заболявания.
п е р а к т и в н о с т IgE не се п ови шават , к а т о
О т особен и н т е р е с е о т с я в а н е т о с по­
заболяването се наблюдава предимно при
м о щ т а н а т е з и м е т о д и н а генетични му­
възрастни. Освен в к р ъ в т а ТЬг, IgE и т е х ­
т а ц и и на ц и т о к и н и т е и т е х н и т е рецепто­
н и т е рецептори (FceRII/CD-23) т р я б в а да се
ри, к о и т о п р и д а в а т по-голяма у с т о й ч и в о с т
изследват в бронхоалвеоларен смив.
към дадени заболявания (напр. м у т а ц и и на
На т а б л и ц а 18. 4 е обобщено клиничното
ТЬз-лимфоцитите, CCR5 + А32 и CCR2-V64I
значение на най-често изследваните ц и т о ­
п р и д а в а т н а з а р а з е н и т е с HIV вируса у с т о й ­
кини.
ч и в о с т към р а з в и т и е н а СПИП. Установе­
но е, че над 17% о т всички заразени са носи­
БЪДЕЩИ ПЕРСПЕКТИВИ т е л и н а т е з и м у т а ц и и , респ. и м а т по-голя-
м а п о д а т л и в о с т к ъ м други заболявания,
Понастоящем по-масовото изследване н а напр. при м у т а ц и и н а р е ц е п т о р и т е за у-ин-
ц и т о к и н и т е в клинично-лабораторната терферон н а р а с т в а драстично рискът о т
п р а к т и к а се ограничава о т т р и ф а к т о р а : р а з в и т и е т о н а милиарна туберкулоза; при
о г р а н и ч е н а д и а г н о с т и ч н а с п е ц и ф и ч ­ м у т а ц и я н а р а з т в о р и м и т е TNF-R н а р а с т ­
ност, в и с о к а цена, т р у д н а с т а н д а т - ва р и с к ъ т о т с е п т и ч н и усложнения, цереб­
р и з а ц и я н а м е т о д и т е . Поради т о в а т е рална малария, менингококов м е н и н г и т и
се изследват CUJMO п р и о п р е д е л е н и болес­ др.; при м у т а ц и и н а TGF-ß н а р а с т в а склон­
т н и с ъ с т о я н и я , и з и с к в а щ и н е з а б а в н а н о с т т а към чернодробна цироза и белодроб­
и н т е р в е н ц и я на лекуващия екип при ак­ н а фиброза, при м у т а ц и и н а п р о м о т е р а н а
т и в н о у ч а с т и е на лабораторния лекар: сеп­ IL-10, а в т о и м у н н и т е заболявания п р о т и ч а т
сис на новороденото, неопластични заболя­ много по-агресивно и др.
вания, вкл. остри левкемии и лимфоми, ав-

КНИГОПИС

Bergers G , Coussens L. Extrinsic regulators o f epithelial t u m o r M u l l b e r g J, A l t h o f f К, J o s t o c k T h , R o s e - J o h n S. T h e importance

progression: metalloproteinases. Current Opinion in G e n e t i c s o f s h e d d i n g o f m e m b r a n e proteins for cytokine biology. Eur
and Development, 10, 2000, 120-127.
C y t o k i n e Netw, 10, 2 0 0 0 , 2 7 - 3 7 .
Bienvenu J, Monneret G , Fabien N , Revillard JP. T h e clinical Vamccq J, Latruffe N. P e r o x i s o m e proliterator-activated receptors ;
usefulness o f the measurement o f cytokines. Clin C h e m L a b ( P P A R S ) a n d their implication in diseases. Current Opinion
Med, 38, 2000, 267-285.
in D i a b e t e s a n d Endocrinology, 7, 2 0 0 0 , 8-18.
Lee S, Wplf i , Escufero et al. Early expression o f a n g i o g e n e s i s Volk H , K e y s s e r G , B u r m e s t e r G . Z y t o k i n e u n d Z y t o k i n - i
tactors in acute myocardial ischemia and infarction. N e w Entil Rezeptoren. In: T h o m a s L ( e d ) . L a b o r und Diagnose, Frankfurt, ;
J Med, 342, 2000, 626-632.
T h - B o o k s , 1998, 7 8 2 - 7 9 1 .
Matarese G. Leptin a n d the i m m u n e system: h o w nutritional
Yuan C h i u - C h i n , P e t e r s o n R, W a n g C h e n Dian, G o o d s a i d F, |
t h e i m m u n c rc8
Г Ж Г Ponse- E u r
Cytokine Netw, Waters D. 5 - N u c l c a s c a s s a y s for the loci C C R 5 - + D32, C C R 2 - |
V641 a n d S D F - G 8 0 1 A related lo p a t h o g e n e s i s o f AIDS. Clin
Chem, 46, 2000, 24-30.
366
ЧАСТ

АВТОМАТИЗАЦИЯ
НА КАИНИЧНО-ААБОРАТОРНАТА
ДЕЙНОСТ
 Автоматизация 6
клиничната лаборатория
ОСНОВНИ КОНЦЕПЦИИ,
ПОДХОДИ, ТЕНДЕНЦИИ
С Т. Ц в е т к о в а
Cm. Д а н с в
к : А в т о м а т и з а ц и я т а в клиничната лаборатория
започва о т средата на миналия век. Революцион­
на роля за а в т о м а т и з а ц и я т а има създаденият
о т L. Skeggs през 1957 г. а в т о м а т и ч е н проточен
анализатор Technicon. В следващите две десети­
летия неговото изобретение дава тласък за внед­
ряване на редица no-усъвършенствани проточни
анализатори. Такива са SMA (симултанни мул-
т и п л е н и а н а л и з а т о р и ) , ч и й т о номер с ъ о т ­
в е т с т в а на броя на каналите, респ. броя на па­
р а м е т р и т е (за хематологичните): SMA 7, SMA
12, SMA 18 и т . н .
У нас през 1974 г. бяха въведени анализатори­
т е SMA 7 (хематологичен) и SMA 12 (клинично-
химичен). SMA анализаторите са неселективпи,
използват големи обеми реактиви и серум (кръв),
и са натоварени с много голям carryover и driß,
които налагат много честа калибрация. След­
ващите версии SMA С (С - компютъризиран) са с
30 и повече канала, ч и й т о компютър коригира
ч а с т о т посочените н е д о с т а т ъ ц и на SMA 12,
SMA 18 и пр. и дава възможност за: качествен
анализ; а в т о м а т и ч н а корекция на carryover и
b drift, с което се намалява многократно ч е с т о т а ­
т а на калибрациите; а в т о м а т и ч н а разпечатка
на р е з у л т а т и т е . При Chem one - голям микро-
капсулен проточен анализатор са налице следни­
т е нововъведения; селективност; намаляване на
carryover-a с помощта на немокреща (random ac­
cess, RA) т е ч н о с т и корекция на същия и на drift-
а чрез компютър; възможности за автоконтрол
и самокорекция.
Поради високата си цена SMA С и Chem one не
бяха внедрени в повечето европейски страни и у
нас и към 80-те години бяха изоставени. Незави­
симо о т съществените недостатъци проточни-
т е анализатори Technicon изиграха огромна ро­
ля за началната автоматизация на клиничните
лаборатории. През 60-те години само 20-30% о т
анализите бяха автоматизирани, а към 80-те -
делът на а в т о м а т и з и р а н и т е анализи нараства
на 60-80%.
К р а т к и данни з а и с т о р и ч е с к о т о разви­
т и е н а о с н о в н и т е видове а н а л и з а т о р и с а
п р е д с т а в е н и к ъ м с ъ о т в е т н и т е глави.
СЪЩНОСТ НЛ АВТОМАТИЗАЦИЯТА
В з а в и с и м о с т о т и з п ъ л н е н и е т о н а анали­
з и т е , п р о и з в о д с т в е н и т е процеси в клинич­
н а т а лаборатория са мануални, механизи­
р а н и и а в т о м а т и з и р а н и . При л ш и у с и г н и -
т с а н а л и з и всички процеси н а изследва­
н е т о - помощни и основни се и з п ъ л н я в а т
ръчно. При л ю х а п и з и р а п и т с п р о ц е с и -
т р у д о е м к и т е , еднообразни и п о в т а р я щ и се
операции при определени анализи се изпъл­
н я в а т с п о м о щ т а н а механизация, направ­
л я в а н а о т о п е р а т о р а : миксери з а размесва-
не, т е х н и ч е с к и с р е д с т в а з а дозиране и пи-
п е т и р а н е н а р а з т в о р и или биологичен м а ­
т е р и а л , и з м е р в а щ и уреди - к о л о р и м е т р и ,
спектрофотометри, спектрофлуоримет-
ри, д е н з и т о м е т р и , пламъкови ф о т о м е т р и
и др. Чрез м е х а и и з а ц и л т а в к л и н и ч н а ­
т а л а б о р а т о р и л се подобрява качес­
твото н а анализите, пестят се реак­
т и в и и ч о в е ш к и т р у д . Механизация се
препоръчва при малки серии (20-30 проби) з а
о т д е л н и т е клинично-лабораторни показа­
т е л и . З а разлика о т т а з и ч а с т и ч н а Jiie-
ханизацим, комплексната механиза­
ц и я се използва при големи серии н а о т д е л ­
н и т е анализи. Т я п р е д с т а в л я в а к о м п л е к с
о т самостоятелни модули, които
осигуряват извършването н а отдел­
н и процеси о т определен лабораторен
а н а л и з и л и н а о п р е д е л е н е т а п о т не­
го, и л и н а ц е л и я цикъл. При определен
м а к с и м у м о т анализи в с е р и и т е з а о т д е л ­
н и т е клинично-лабораторни показатели,
т я х н о т о изпълнение с а м о с мануални ме­
т о д и и/или комплексна механизация е з а т ­
руднено, дори невъзможно без компромис в
369
к а ч е с т в о т о на р е з у л т а т и т е . Това н а л а ­
г а използването н а а в т о м а т и ч н и
анализатори.
А в т о м а т и з а ц и я . Според определението
на ШРАС а в т о м а т и з а ц и я т а се изразява в
з а м я н а т а на човешкия модулен т р у д с ме­
ханични прибори и приспособления, к о и т о
са свързани помежду си и се к о н т р о л и р а т
на принципа на саморегулацията чрез „об­
р а т н а връзка" на и н ф о р м а ц и я т а .
Понастоящем а в т о м а т и з а ц и я т а
с т а в а все по-сложна и необходима за ефек­
т и в н а т а р а б о т а н а л а б о р а т о р и я т а . Тя се
постига чрез а п а р а т у р а , к о я т о заменя ця­
л а т а ръчна и механизирана р а б о т а в даден
анализ или процедура. А в т о м а т и з а ц и я т а в
клиничната химия започва с а п а р а т и к а т о
а н а л и з а т о р и т е н а Technicon, а в х е м а т о л о ­
г и я т а - с р а н н и т е версии н а б р о я ч и т е
Coulter. През последните д е с е т и л е т и я т е ­
зи основни сектори в к л и н и ч н а т а лаборато­
рия се промениха значително благодарение
на н е п р е к ъ с н а т о т о обновяване и осъвреме­
няване н а а п а р а т у р а т а о т производителя.
През последните години от д е лн и произво­
дители успяха да а в т о м а т и з и р а т някои
микробиологични анализи, к а к т о и да раз­
р а б о т я т моноклонални а н т и т е л а , с к о и т о
а в т о м а т и з а ц и я т а на и м у н о х и м и я т а с т а ­
на реалност. Д в и ж е щ и т е сили при а в т о м а ­
т и з а ц и я т а са многостранни:
• Производителите се с т р е м я т да о т г о в а ­
р я т на желанието на л е к а р и т е д а п р и б ­
лижат максимално лабораторни­
т е и з с л е д в а н и я д о п а ц и е н т а , вмес­
т о т р а д и ц и о н н а т а с и с т е м а , при к о я т о
п а ц и е н т ъ т идва в л а б о р а т о р и я т а . При­
с ъ с т в и е т о на л а б о р а т о р и я т а в лекарски­
т е кабинети се увеличава с в ъ в е ж д а н е т о
н а малки, лесни за ползване „настолни"
анализатори. Хирургическите и спешни­
т е звена и з и с к в а т незабавни лаборатор­
ни р е з у л т а т и , особено в рискови за паци­
е н т а ситуации. Н е о б х о д и м о с т т а о т из­
следвания в дома също н а р а с т в а и с т а н а
възможно с р а з в и т и е т о н а п о р т а т и в н а ­
т а а п а р а т у р а и/или р а з р а б о т в а н е т о н а
електродни системи, к о и т о м о г а т дирек­
т н о да с л е д я т с ъ с т о я н и е т о н а пациен­
т а . Всичко т о в а променя традиционна­
т а представ а за клиничната лаборато-
Р и я - Д о б р а т а c n i p a t i a е, че р е з у л т а т и -
370
т е са н а разположение незабавно и може
бързо да се реагира в заплашващи живо­
т а ситуации. О т р и ц а т е л н и я т е ф е к т
е в пониженото качество на р е з у л т а т и ­
т е , т ъ й к а т о н е л а б о р а т о р н и я т специа­
л и с т ч е с т о не оценява концепциите за ка­
ч е с т в е н и я к о н т р о л и неговото задължи­
т е л н о приложение.
• Друга движеща сила при л а б о р а т о р н а т а
автоматизация е контролът върху все
по-голелште разходи в здравеопазва­
н е т о . Р ъ к о в о д и т е л и т е н а болници са из­
правени пред з а д а ч а т а да н а м а л я т най-
напред р а з х о д и т е з а т р у д . Някога с ч и т а ­
ни з а печеливши звена, днес лаборатории­
т е са предимно и з т о ч н и к н а разходи и са
принудени да с ъ к р а щ а в а т персонал. Един­
с т в е н и я т начин да се и з в ъ р ш а т необхо­
д и м и т е анализи при т е з и условия, без да
се повлияе н а к а ч е с т в о т о н а лаборатор­
ния т р у д , е у в е л и ч а в а н е н а п р о и з в о ­
д и т е л н о с т т а чрез автольатиза-
ц и л . А в т о м а т и з а ц и я т а з а м е н я ръчни,
п о в т а р я щ и се и о т н е м а щ и време с т ъ п ­
ки, к о и т о з а е м а т з н а ч и т е л н а ч а с т о т
в р е м е т о на с п е ц и а л и с т а и посредством
подходящ с о ф т у е р извършва анализи (чес­
т о със сложна технология) и п р е д о с т а в я
крайния р е з у л т а т , с ъ о т в е т н о маркиран
за отклонения о т р е ф е р е н т н и я интервал,
а ч е с т о и придружен с т е к с т у а л н о зак­
лючение (напр. при х е м а т о л о г и ч н и т е ана­
лизатори). Тя освобождава време н а спе­
ц и а л и с т а з а извършване н а други дейнос­
т и , например оценка на р е з у л т а т и т е или
изпълнение н а анализи, к о и т о не са а в т о ­
матизирани.
И м у н о л о г и ч н и т е процедури у л е с н я в а т
а в т о м а т и з а ц и я т а и н а о б л а с т и о т лабо­
р а т о р н а т а п р а к т и к а , к о и т о до скоро не се
поддаваха н а т а к а в а . Много радиоимунни
м е т о д и вече се замениха и се з а м е н я т с мно­
ж е с т в о нерадиоизотопни м е т о д и . Сероло-
г и ч н и т е т е с т о в е м о г а т да се и з м е р в а т с
м е т о д и , к а т о напр. нефелометрия. Ч у в с т ­
в и т е л н о с т т а и с п е ц и ф и ч н о с т т а на т е з и
а н т и г е н - а н т и т я л о реакции доведе до раз­
р а б о т в а н е т о н а нови т е с т о в е за някои за­
болявания, к о и т о преди можеха да се изс­
л е д в а т само чрез наблюдение о т лекаря н а
отговора н а п а ц и е н т а към лечението (напр.
в и т . В12, ф о л а т и др.). Н о в и т е технологии
позволиха а в т о м а т и з и р а н е н а голяма ч а с т
о т имунологичните реакции.
П о в е ч е т о а н а л и з а т о р и и особено т е з и ,
внедрени у нас, н а п р а к т и к а не о т г о в а р я т
н а с т р о г а т а дефиниция н а ШРАС за а в т о ­
м а т и з а ц и я . Някои о т по-големите дискрет­
ни анализатори обаче, респ. т я х н о т о включ­
ване в к о н с о л и д и р а н и и и н т е г р и р а н и
с и с т е м и п р е в р ъ щ а т п о с т е п е н н о дефини­
ц и я т а н а ШРАС о т у т о п и я в р е а л н о с т .
К о н с о л и д а ц и я . Консолидацията (К) н а ав­
т о м а т и ч н и я клинично-лабораторен анализ
се свежда до два процеса:
• разширяване м е н ю т о н а а н а л и з а т о р а и
• обединяване д е й н о с т т а н а а н а л и з а т о р и
з а клинично-химични, х е м а т о л о г и ч н и и
имунологични, к а к т о и н а някои микро­
биологични, серологични и ДНК анализи с
п о м о щ т а н а механични приспособления
(напр. конвейерен т р а н с п о р т н а п р о б и т е
о т един а н а л и з а т о р до друг) и електрон-
но-изчислителна т е х н и к а .
В р е з у л т а т н а консолидацията се п о с т и ­
га огромно повишаване производителност­
т а н а т р у д а н а един о п е р а т о р - над 100 пъ­
т и в сравнение с а в т о м а т и ч н и т е неконсо-
лидирани а н а л и з а т о р и и 1 000 до 10 000 пъ­
т и в сравнение с м а н у а л н и т е и механизи­
рани ла б оратории.
И н т е г р а ц и я . И н т е г р а ц и я т а (И) е още по-
висш е т а п н а а в т о м а т и з а ц и я т а . Тя се
свежда до обединяване н а т р и т е е т а п а н а
изследването след т я х н о т о а в т о м а т и з и р а ­
не:
>• I l p c f j а н а л и т и ч е н е т а п - чрез механи­
зиране н а т р а н с п о р т а н а п р о б и т е (кон-
вейерни л е н т и , п н е в м а т и ч н а поща) до ла­
б о р а т о р и я т а и н а о т д е л н и преданали-
т и ч н и операции (центрофугиране, разп­
ределение н а п р о б и т е , кодиране и пр.) с
п о м о щ т а на роботи.
> А н а л и т и ч е н е т а п - с п о м о щ т а н а ав­
т о м а т и з а ц и я , респ.консолидиране на ав­
т о м а т и ч н и я клинично-лабораторен ана­
лиз.
> Слеуаналитичен е т а п - с помощта
на електронно-изчислителна т е х н и к а и
изграждане на л а б о р а т о р н и информаци­
онни с и с т е м и (ЛИС).
С ъ щ и т е се с в ъ р з в а т с болничната инфор­
мационна с и с т е м а (БИС) в информационна
мрежа. С п о м о щ т а н а Internet т а з и мрежа
се разширява с включване н а ЛИС и БИС о т
голям брой диагностични и болнични звена.
Тотална лабораторна автоматизация
(ТЛА). Представлява най-високото ниво на
централизация на клиничните лаборатории.
Тя се свежда до изграждане на големи лабора­
т о р н и диагностични центрове, к о и т о обик­
новено р а б о т я т денонощно и обслужват мно­
го големи к о н т и н г е н т и о т болнични легла и
амбулаторни пациенти: ТЛА = К + И.
ТЛА се внедрява в САЩ, Япония, И т а л и я
(Hospedale Maggiore - Милано), Германия,
скандинавските с т р а н и и някои други дър­
жави с високо р а з в и т а клинична лаборато­
рия. В л а б о р а т о р и и т е с ТЛА у ч а с т в а апа­
р а т у р а о т много ограничен брой (не повече
о т 7-8) световно известни фирми. Очаква
се в бъдеще т о в а число да падне до 5 и още
по-ниско.
ф и г . 19.1. Схема н а у с т р о й с т в о т о н а лаборато­
рия с т о т а л н а л а б о р а т о р н а а в т о м а т и з а ц и я
ПЛЕ (л) - преданалитичеи е т а п в лабораторията
ПЛЕ (б) - предлаборатореп е т а п в болницата
4 ^ Консолидация
• Интеграция
У с т р о й с т в о т о н а лаборатория с ТЛА е
представено н а фиг. 19.1. О т с х е м а т а се
вижда, че о с н о в н а т а комуникативна връз­
к а между здравното заведение (стационар,
диспансер, ч а с т е н к а б и н е т ) и лаборатори­
я т а , а също т а к а между преданалитичния
е т а п в л а б о р а т о р и я т а и следаналитичния
е т а п до изпращане на с ъ о т в е т е н р е з у л т а т
до възложителя се осъществява чрез ЛИС.
О т друга с т р а н а о т д е л н и т е консолидира­
ни анализатори са свързани чрез конвейери
371
{двойни стрелки) д и р е к т н о п о м е ж д у си и
чрез е л е к т р о н н и линии { е д и н и ч н и с т р е л к и )
и н д и р е к т н о с п о м о щ т а н а ЛИС.
Централизация или д е ц е н т р а л и з а ц и я .
Това са две п р о т и в о п о л о ж н и т е н д е н ц и и в
с ъ в р е м е н н а т а клинична л а б о р а т о р и я , кои­
т о се н а м и р а т в динамично и бързо проме­
нящо се равновесие (фиг 19.2).
Ц е н т р а л и з а ц и я т а и м а в а ж н и предим­
с т в а : т я е икономически по-изгодна, осигу­
рява много по-висока п р о и з в о д и т е л н о с т и
по-висока а н а л и т и ч н а н а д е ж д н о с т н а резул­
т а т и т е . Въпреки м н о г о т о к р и т и ч н и бележ­
ки, че ц е н т р а л и з и р а н и т е анализи с а по-бав­
ни и по-непригодни з а ц е л и т е н а с п е ш н и т е
изследвания, с в е т о в н а т а п р а к т и к а показ­
ва, че п осл едните с а р а в н о с т о й н и по бързи­
на и качество н а децентрализираните т а ­
кива.
Д е ц е н т р а л и з а ц и я т ае предназначена
з а обслужване н а з н а ч и т е л н о по-малки кон­
т и н г е н т и , главно при к р и т и ч н и с ъ с т о я н и я ,
налагащи ч е с т и спешни изследвания при лег­
л о т о н а болния (point o f c a r e testing, POC).
За ц е л т а се п р и л а г а т малки а н а л и з а т о р и и
прибори, к о и т о м о г а т д а се о б с л у ж в а т и о т
н ела б ораторен персонал и о с и г у р я в а т по-
бързо съобщаване н а р е з у л т а т а о т изслед­
в а н е т о . Те п о к а з в а т с ъ щ е с т в е н и неудобс­
тва:
1 Разумна
Тек ущ
к о т рол
г
Портативни
уреди
•2. Схематично представяне на двете основни тенденции - централизация и
децентрализация
POC - p o i n t o f c a r e t e s t i n g
372
- по-висока ц е н а - независимо о т т о в а , че
се с п е с т я в а т с р е д с т в а з а з а п л а щ а н е н а
обучен персонал, р а з х о д и т е з а к о н с у м а т и ­
ви с а много по-високи;
- ч е с т а калибрация, к о я т о н а л а г а допълни­
т е л н и з н а ч и т е л н и разходи.
П о н а с т о я щ е м с п о р ъ т се р е ш а в а в п о л ­
з а н а разултата централизация
п р е д в и д н а това, ч е с ъ щ а т а е иконо-
л т ч е с к и по-изгодна и с най-голял1а
аналитична надеждност н а резулта­
т и т е . В с л е д в а щ и т е години се о ч а к в а т д в а
процеса:
> По н а т а т ъ ш н а децентрализация,
р а з р а б о т в а н е н а п о - е ф е к т и в н и , бързи и
икономични Р О С - м е т о д и при л е г л о т о н а
болния, к о и т о щ е у в е л и ч а т своя дял.
О ч а к в а се обаче д а се з а п а з и в р ъ з к а т а с
ц е н т р а л н и т е лаборатории за надеждна
п о м о щ н а к а л и б р а ц и я т а , осигуряване н а
високо к а ч е с т в о и с р а в н и м о с т н а резул­
т а т и т е . В по-далечен п л а н (след 10-15 го­
дини) се о ч а к в а и н т е н з и в н о р а з в и т и е н а
неинвазивни м е т о д и с п о р т а т и в н и уре­
ди, с к о и т о б о л н и я т д а се с а м о т е с т у в а
(вкл. глюкоза),
>• П о н а т а т ъ ш н а ц е н т р а л и з а ц и я с из­
г р а ж д а н е н а големи т о т а л н о а в т о м а т и ­
зирани с и с т е м и и включване н а с ъ щ и т е
в с ъ о т в е т н и к о м п ю т ъ р н и мрежи.
Централизация
Малка Частична Голяма
•- Л• - -
Средноголеми Консолидация Интеграция
и малки
ч
ч
ч
'
Тотална лабораторна
централизация автоматизация
АВТОМАТИЗАЦИЯ
НА ПРЕДАНАЛИТИЧНИЯ ЕТАП
К о н ц е п ц и я т а за к а ч е с т в е н и я к о н т р о л раз­
деля п р о в е ж д а н е т о н а а н а л и з и т е в клинич­
н а т а лаборатория на т р и е с т е с т в е н и е т а ­
па; п р е д а п а л и т и ч с н , а н а л и т и ч е н и
с л е д а н а л и пг и чен.
П р е д а н а л и т и ч н и я т е т а п включва всич­
ки с т ъ п к и , необходими з а осигуряването н а
проба о т п а ц и е н т а з а изследване. Анали­
т и ч н и я т е т а п е с ъ щ и н с к о т о изследване н а
п р о б а т а . С л е д а н а л и т и ч н и я т е т а п обхваща
м н о ж е с т в о процедури, свързани с р е з у л т а ­
т и т е на п а ц и е н т а . К а ч е с т в е н и я т к о н т р о л
в з д р а в н и т е заведения т р я б в а да следи всич­
ки процедури о т п о с т ъ п в а н е до изписване
на пациента. У ч а с т и е т о на лаборатория­
т а в т о з и к о н т р о л започва с н а р е ж д а н е т о
н а лекаря за изследване, продължава с ана­
лиза и включва дори т о в а , как да д о с т и г н а т
р е з у л т а т и т е до лекуващия лекар.
А в т о м а т и з а ц и я т а изпълнява важна ро­
ля в целия т о з и процес, к а т о допринася за
намаляване н а ч о в е ш к и т е грешки, за увели­
чаване б ъ р з и н а т а н а получаване н а резул­
т а т и т е и з а осигуряване н а т я х н а т а ана­
литична надеждност.
П р е д а н а л и т и ч н и я т е т а п о т анали­
за ч е с т о се подценява о т нелабораторни-
т е специалисти, но е е д и н о т н а й ffаЛ-
н и т е а с п е к т и н а и з с л е д в а н и я т а . Нап­
ример, ако м а т е р и а л з а дадено изследване
не се вземе о т подходящо подготвен паци­
е н т или е под съмнение ц е л о с т т а н а проба­
т а , н я м а т никакво значение и с к о р о с т т а ,
и т о ч н о с т т а на резултатите. Автомати­
з а ц и я т а на т о з и е т а п н е е традицион­
на, но р о л я т а ü за к а ч е с т в о т о н а анализа е
т в ъ р д е голяма и показва колко успешно мо­
же да е н е й н о т о прилагане. На фиг, 19.3 са
о ч е р т а н и основните с т ъ п к и при изследва­
не на п а ц и е н т а .
Л а б о р а т о р н и т е изследвания не биха съ­
ществували без п ъ р в а т а с т ъ п к а о т преда-
н а л и т и ч н и я е т а п . Много о т проблемите
п р о и з т и ч а т именно о т т у к . Л е к а р я т мо­
ж е да поръча неподходящ тест, да пропус­
не необходим тест, да поръча изследване в
неподходящо феже(лечение с м е д и к а м е н т и
със силна интерференция върху т е с т а , нес­
пазване на биологичните р и т м и ) , или как­
т о ч е с т о се случва да поръча повече анали­
зи от необходимото. Това с а все с к ъ п и
грешки.
К о м п ю т ъ р и з а ц и я т а играе в а ж н а роля
през целия процес на изследване и позволява
голяма ч а с т о т д н е ш н а т а а в т о м а т и з а ц и я .
Тя подпомага анализа още о т т о з и преда-
налитичен е т а п . К о м п ю т ъ р н а т а система
с ъ х р а н я в а н е о б х о д и м а т а информация з а
т е с т о в е т е (вкл. и т я х н а т а цена), улеснява
получаването на р е з у л т а т а о т изследвани­
я т а в реално време, маркира абнормни ре­
з у л т а т и , с к о е т о подпомага диагнозата или
лечението на п а ц и е н т а . К о м п ю т ъ р ъ т (при

Вземане на Транспортиране Предаиали шчен

Назначаваме Заявка до на материала
биологичен етап
на анализ лабораторията до лабораторията
материал

11редварителна
Предоставяне на пробата обработка на
Съхраняване
в лабораторията пробата

Поддръжка на Аналитичен етан

анализаторите I -

L- <-• i i Я
к ч
Преглед па Изпращане до Следаналнгичен
Постоянна
.
Сигурност при
4 квалификация резултатите лекуващия лекар етан
анализа i г
Фиг. 19.3. Основни е т а п и и с т р у к т у р а т а и м при изслеуване н а п а ц и е н т а
373
изградена болнична информаиионна с и с т е ­ н а м а р ш р у т а .
ма) е п ъ р в а т а с т ъ п к а в у в е д о м я в а н е т о н а След д о с т а в я н е н а п р о б и т е в л аб о р ато ­
л а б о р а т о р и я т а за наличие н а заявени ана­ р и я т а т е п о д л е ж а т н а предварителна под­
лизи. Тези назначения м о г а т да б ъ д а т изп­ г о т о в к а з а анализ. При анализи, с използва­
р а т е н и д и р е к т н о до л а б о р а т о р и я т а пос­ не н а пълна кръв, т а з и подготовка е мини­
редством интерфейсна връзка между бол­ мална. Обикновено е п р у в е т к и т е с к р ъ в т а
ничните и л а б о р а т о р н и т е к о м п ю т р и , мо­ се п о с т а в я т д и р е к т н о в а н а л и з а т о р и т е
же да се осъществи п р и н т и р а н е н а е т и к е ­ (отворени или з а т в о р е н и при а н а л и з а т о р и
т и т е и означаване н а п р о б и т е със с ъ о т в е ­ с тапопробивач). При анализи н а серум или
т е н номер. Този директен трансфер н а ин­ плазма, о с н о в н а т а ч а с т о т т а з и предана-
формация намалява броя н а неправилно наз­ л и т и ч н а д е й н о с т се извършва ръчно. Във все
начените анализи и осигурява съобщение з а още ограничен брой лаборатории с ъ щ е с т ­
флеботомиста, че трябва да бъде взета про­ в у в а т р о б о т и з и р а н и систелги з а отде­
ба от пациента; операторът може д а про­ л я н е н а с с р у л г / п л а з л г а и т е са о б е к т н а
вери за постъпили заявки з а редки изслед­ увеличаващ се и н т е р е с , най-вече з а осигуря­
вания, които се правят няколко п ъ т и сед­ ване н а безопасна р а б о т а .
мично и да забави серията, за да изчака но­ Р о б о т и з а ц и я т а използва уреди за извър­
вите проби; е л и м и н и р а се извършването н а шване н а специфични п о в т а р я щ и се прог­
дублирани анализи на определен п а ц и е н т , рамирани движения, к о и т о са под електро­
когато т е са назначени от няколко специа­ нен ( к о м п ю т ъ р е н , ЛИС) контрол. Тя и м а за
листа. Такъв преглед н а з а я в к и т е помага цел а в т о м а т и з и р а н е н а преданалитичния
за п р е д варителнат а подготовка н а р а б о т а ­ е т а п , особено н а м а н и п у л а ц и и т е след вене-
т а и в лаборатории, к о и т о п о л у ч а в а т взе­ п у н к ц и я т а ( т р а н с п о р т до л а б о р а т о р и я т а ,
т и я о т медицинските с е с т р и в отделение­ кодиране, разливане, центрофугиране и др.).
т о / к л и н и к и т е биологичен м а т е р и а л . С ъ щ е с т в у в а т р о б о т и с различна с л о ж н о с т
След вземане н а к р ъ в т а , най-неефектив- (фиг. 19.4):
н и я т начин за т р а н с п о р т и р а н е до лабора­
картезианскн робот
т о р и я т а е д о н а с я н е т о ü о т персонал н а
клиниките. Ако т е з и проби се н о с я т о т взе­
мащия к р ъ в т а л а б о р а н т , ч е с т о т е х н и я т
т р а н с п о р т се забавя особено при голям брой
проби.
П н е в м а т и ч н и т е систельи са меха­
нично средство за изпращане н а биологич­ цилиндричен робот
ния м а т е р и а л - т е са бързи и п озволяват П *
п о - н а т а т ъ ш н о т о вземане н а проби без да
се забавя д о с т а в я н е т о н а в з е т и т е до т о з и А
с JJ
момент. Те не са подходящи з а м а т е р и а л ,
съдържащ инфекциозни причинители, ако е
в неподходящи контейнери (напр. с т ъ к л е ­
ни или не добре затворени), т ъ й к а т о при
счупване или о т в а р я н е и м а о п а с н о с т о т за­ ставно-свързан робот
мърсяване н а с и с т е м а т а . Друго неудобст­
во е, че не може да се сменя м а р ш р у т а без
основна реконструкция н а с г р а д а т а .
Друг съвременен начин на т р а н с п о р т и ­
ране на биологичния м а т е р и а л е роботи-
Фиг. 19.4. Р о б о т и с различна с т е п е н на гъвка­
з и р а н а систелга с к о л т ю т ъ р н о прог-
в о с т (no W. Guderet al.)
рсимиране, движеща се по м а г н и т н и лен­
т и на пода. Тя позволява т р а н с п о р т и р а н е а) с три степени н а движение - к а р т е з и ­
на голям брой проби, к а к т о и на контейне­ анскн, напр. за а в т о м а т и ч н о с о р т и р а н е
ри с голям обем (напр. урина о т 24 h). Този на пробите;
вид позволява сравнително лесна промяна
б) с четири степени н а движение (цилин-
374
 дрични р о б о т и ) , напр. з а определяне н а
кръвни групи и з а м н о г о е т а п н и процеду­
ри ( е к с т р а к ц и я , разделяне н а органична
о т водна фаза, и н ж е к т и р а н е н а проби при
HPLC и др.);
в) р о б о т и с пет степени н а п о д в и ж н о с т -
с т а в п о - с в ъ р з а и и р о б о т и , к о и т о по
г ъ в к а в о с т и м н о г о с т р а н н о с т се доближа­
в а т до ч о в е ш к а т а ръка, напр. за нанася­
не н а щрих-код, з а п о д г о т о в к а и провеж­
дане н а конвейерния т р а н с п о р т на про­
б и т е или з а консолидация между о т д е л ­
н и т е анализатори.
Един о т п и о н е р и т е н а р о б о т и з а ц и я т а -
М. Sasaki е използвал с ъ щ а т а за провежда­
не н а проби з а НГ/, хормонален анализ, т и ­
пизиране ABO, Rh и HLA групи, л е к а р с т в е н
анализ, токсикология и др.
Неудобства н а роботизацилта:
• висока цена н а а п а р а т у р а т а ;
• необходимост о т много с т а б и л н о е л е к т ­
рическо захранване (малки колебания във
волтажа м о г а т да причинят хаотични
движения, особено н а комплексните робо­
ти);
• висока социална цена - р о б о т и з и р а н е т о
н а една л а б о р а т о р и я лишава о т р а б о т а
50-70% о т персонала й.
Използването н а б а р к о у (щрих-код) ка­
т о средство за идентификация на пробите
с т а в а все по-популярно. Щрих-кодът е сред­
с т в о за кодиране н а информация в ивици с
различен и н т е н з и т е т н а ц в е т а и различна
ширина. О с н о в н и т е данни, к о и т о включва
са и д е н т и ф и к а ц и о н е н н о м е р д а д е н о т
колгпютър, к а к т о и теет-занвка. И
идеалния случай баркода се създава
п р и п а ц и е н т а , к а т о с е с к с н и р а ЕГН,
което е у н и к а л н а идентификация и
елилгинира г р е ш к а т а о т р а з л и т а н а
б и о л о г и ч е н л ь а т е р и а л . В т е з и случаи
баркод се създава в м о м е н т а н а о б р а б о т в а ­
не на п р о б а т а и веднага се залепя върху кон­
тейнерите.
А в т о м а т и з и р а н е т о в преданалитичния
е т а п у нас засега се ограничава до наличие
на к о м пю тъ ризация в з д р а в н о т о заведение.
С р а з в и т и е т о н а р о б о т и к а т а , много о т
п о г л ъ щ а щ и т е време с т ъ п к и в преданали­
т и ч н и я е т а п ще се р о б о т и з и р а т , освобож­
давайки персонал за извършването н а ана­
лизи.
АВТОМАТИЗАЦИЯ НА АНАЛИТИЧНИЯ
ПРОЦЕС В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ
А н а л и т и ч н а т а ч а с т о т изследването н а
п р о б и т е се поддава най-лесно н а а в т о м а т и ­
зация. А в т о м а т и з а ц и я т а в клиничната ла­
б о р а т о р и я с т а в а все по-сложна, включва
а п а р а т и с все по-голям брой показатели и с
в ъ з м о ж н о с т да о б р а б о т в а т все по-голям
брой проби. Благодарение н а н о в и т е т е х н о ­
логии непрекъснато се увеличава броя на ав­
томатизираните тестове, които заменят
м а н у а л н и т е анализи. В м и н а л о т о а в т о м а ­
т и з а ц и я т а бе ограничена до клиничнохи-
м и ч н а т а и х е м а т о л о г и ч н а т а лаборатории.
П о н а с т о я щ е м п о ч т и за всички лаборатор­
ни с е к т о р и се предлага а в т о м а т и з и р а н о
оборудване.
По-долу ще б ъ д а т изложени основните ха­
рактеристики на а п а р а т у р а т а , с които
най-често, а с някои о т т я х , дори задължи­
т е л н о т р я б в а да се съобразява ръководст­
в о т о на л а б о р а т о р и я т а за осъществяване
н а правилния избор при закупуване. Най-об-
що х а р а к т е р и с т и к и т е на а п а р а т у р а т а мо­
г а т да се г р у п и р а т в т р и групи - и з к л ю ­
ч и т е л н о с ъ щ е с т в е н и , в а Ж н и и б е з съ­
щ е с т в е н о з н а ч е н и е по отношение на кон­
к р е т н и т е условия в определена лаборато­
рия. Х а р а к т е р и с т и к и т е на всеки анализа­
т о р м о г а т да се п о л у ч а т о т производите­
ля. Н е о б х о д и м о с т т а о т а в т о м а т и з а ц и я се
оценява чрез следните ф а к т о р и :
> фактори, отнасящи се д о характе­
р а н а р а б о тн и я п р о ц е с в л а б о р а т о ­
р и я т а , напр. т е с т - м е н ю , н а т о в а р е ­
н о с т , начин на извършване н а анализи­
т е (незабавно, в големи серии и пр.), walk­
away възможности.
> фактори, отнасящи с е д о експлоа­
тационните характеристики п а
а п а р а т и т е , напр. способност да се ра­
б о т и с баркод, р а б о т а със з а т в о р е н а сис­
т е м а за вземане н а биологичен м а т е р и ­
ал; х а р а к т е р и с т и к а на о б р а б о т к а т а на
п р о б и т е (профили, произволен д о с т ъ п ,
дискретно, непрекъснат поток), у с т ­
р о й с т в а т а з а измерване; м е т о д и н а раз-
месване н а п р о б и те.
375
>• ф а к т о р и , о т н а с я щ и с е д о а н а л и ­ т о а р н а к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я или
т и ч н а т а надеждност н а резулта­ т е с т - м е н ю . То п р е д с т а в л я в а списък о т по­
тите: специфичност, ч у в с т в и т е л н о с т , к а з а т е л и ( т е с т о в е ) , к о и т о една лаборато­
невъзпроизводимост, т о ч н о с т , линей­ рия иска да осигури с даден анализатор. В
н о с т , с т а б и л н о с т , пренасяне и пр, една хематологична лаборатория т е с т - м е -
н ю т о може д а включва пълна кръвна кар­
>• И к о н о м и ч е с к и п а р а л г е т р и - ц е н а ,
т и н а , пълна кръвна к а р т и н а + диференци­
разходи и др. ално броене или пълна кръвна к а р т и н а + ди­
> Д р у г и критерии, напр. помещения, сер­ ференциално броене + р е т и к у л о ц и т е н брой
виз, условия за безопасна р а б о т а , обуче­ и т . н . В имунологията, т е с т о в о т о меню
ние на персонала и др. може да включва С-р^ а к т и в е н протеин, рев-
м а т о и д е н ф а к т о р или а н т и т и р е о и д н и ан­
т и т е л а и др. В по-големи здравни заведения,
I. ф а к т о р и о т и а с я щ и с е
в к о и т о о т д е л н и т е лаборатории са самос­
до характера н а работния процес
т о я т е л н и единици, т е с т - м е н ю т о зависи
Влабораторията
о т разпределението н а различните видове
Най-важната концепция за а в т о м а т и з а ц и ­ анализи. Например изследването з а хепа­
я т а на клиничната лаборатория, к о я т о би т и т може да се извърши в с е к т о р имуноло­
могло да се приеме е, че в с я к а л а б о р а т о ­ гия, клинична л а б о р а т о р и я или имунохема-
р и я е у н и к а л н а и н я м а и д е а л н о обо­ тология. В п о - м а л к и т е заведения, к а б и н е т ­
р у д в а н е . Всяка лаборатория т р я б в а да оце­ н и т е или с а т е л и т н и лаборатории, апара­
ни с о б с т в е н и т е си нужди, т е з и на лекари­ т и т е т р я б в а да п о д д ъ р ж а т значително по-
т е о т лечебните звена, квалификацията н а р а з н о о б р а з н о т е с т - м е н ю , п р е к р а ч в а й к и
с п е ц и а л и с т и т е си, р а б о т н и я п о т о к и на­ т р а д и ц и о н н и т е л а б о р а т о р н и граници.
т о в а р е н о с т т а - преди и о ч а к в а н а т а след При обсъждане н а т е с т - м е н ю т о , лабора­
придобиване на даден а п а р а т . Ясно е, че ав­ т о р н и я т с п е ц и а л и с т т р я б в а д а прецени не
т о м а т и з а ц и я т а не може да е е ф е к т и в е н само с е г а ш н и т е , но и б ъ д е щ и т е нужди о т
отговор на всички нужди и изисквания в ла­ т е с т о в е . Може да м и н а т година или две, до­
бо р а т о риите. Винаги ще е необходимо ав­ к а т о определен т е с т с т а н е приложим при
т о м а т и з и р а н и т е с и с т е м и т а к а да се из­ даден а п а р а т . П р о и з в о д и т е л и т е обикнове­
б и р а т , че д а с ъ о т в е т с т в а т н а о п т и - но п р е д с т а в я т списък с а д а п т и р а н и в мо­
л г а л н а т а з а в и д а и о б е м а н а и з в ъ р ш ­ м е н т а и очаквани в близко бъдеще т е с т о ­
в а н а т а р а б о т а в с ъ о т в е т н а т а л а б о ­ ве. Да не се забравя, че в някои случаи изпол­
р а т о р и я к о м б и н а ц и я о т а в т о л ш т и - з в а н а т а при даден а п а р а т технология ог­
з и р а н и , п о л у а в т о м а т и з и р а н и и р ъ ч ­ раничава т е с т о в о т о меню и о т т у к въз­
ни методи н а анализ. м о ж н о с т и т е з а развитие. В м о м е н т а а в т о ­
Необходимо е да се направи подробен ана­ м а т и ч н и т е имунологични а н а л и з а т о р и са
лиз на р о л я т а на а в т о м а т и з и р а н а т а сис­ с най-бързо развиващи се т е с т - м е н ю т а . За
т е м а или а п а р а т в р а б о т н и я п о т о к н а кли­ т я х вече са р а з р а б о т е н и т е с т о в е , к о и т о
н и ч н а т а лаборатория. О т т о в а следва, че доскоро бяха п р е д м е т н а радиоимунология-
т р я б в а да се п о з н а в а т основните к а ч е с т ­ т а . Ако една л а б о р а т о р и я обслужва и аку-
ва и характеристики на а н а л и з а т о р и т е , ко­ шеро-гинекологична клиника наличието на
и т о да се и м а т предвид при избор на апа­ хормони е решаващо з а п о к у п к а т а н а апа­
р а т , независимо о т вида н а лаборатория­ р а т . З а г о л е м и т е онкологични ц е н т р о в е е
т а . Някои о т т е з и х а р а к т е р и с т и к и , с кои­ о т значение н а л и ч и е т о н а т е с т о в е за т у -
т о л а б о р а т о р н и я т ръководител следва да морни маркери и в ъ з м о ж н о с т т а н а произ­
се съобрази при покупка н а а п а р а т включ­ водителя да внедрява нови маркери възмож­
в а т : желаното т е с т - м е н ю , н а т о в а р е н о с т ­ но най-скоро след о т к р и в а н е т о им.
т а и р а б о т н и я п о т о к в л а б о р а т о р и я т а , не­
обходимост о т walk-away възможности. Н а т о В а р е н о е т . С л ед ващи я т ф а к т о р , кой­
т о т р я б в а да се има предвид е н а т о в а р е ­
Г е с т - м е н ю . Едно о т п ъ р в и т е решения, ко­ н о с т т а н а л а б о р а т о р и я т а (брой анализи,
и т о т р я б в а да се в з е м а т е т ъ й нар. репер- извършени за определен период о т време).
376
Лабораторни сектори, к о и т о основно извър­
ш в а т специализирани анализи, напр. к а т о
хормони и м а т м а л к а н а т о в а р е н о с т . Кли-
нично-химичните и х е м а т о л о г и ч н и т е лабо­
р а т о р и и и м а т голяма н а т о в а р е н о с т пора­
ди пробите, к о и т о се н а з н а ч а в а т най-чес­
т о - глюкоза, б е л т ъ ч н и и липидни фракции,
ензимни и е л е к т р о л и т н и профили. Повече­
т о л а бо р атории н а й - ч е с т о и м а т комбина­
ция о т проби с малък и с голям обем. Това
разнообразие о т проби, к о и т о една лабора­
т о р и я извършва се нарича т с с т о в л т к с .
Н а т о в а р е н о с т т а н а един а в т о м а т и ч е н
анализатор се определя о т броя н а извърше­
н и т е анализи за един час. Производителност­
т а на големите клинично-химични анализато­
ри до с тига 500-700, а вече и над 2000 резулта­
т а за час, а н а хематологичните анализато­
ри - до 120 на час. Имунологичните анализа­
т о р и м о г а т да и з в ъ р ш в а т само до 100-150
т е с т а за час, но т е съидо се с ч и т а т за висо­
копроизводителни.
Р а б о т е н п о т о к . Това е огце един ф а к т о р ,
к о й т о подлежи н а оценка. Р а б о т н и я т п о т о к
е начинът, по к о й т о се извършват лаборатор­
н и т е анализи. Например една лаборатория в
спешно отделение извършва изследванията
н е з а б а в н о . На другия край на с п е к т ъ р а е ре-
ф е р е н т н а т а лаборатория, к о я т о извършва
повечето анализи веднъж на ден в големи се­
рии. Повечето лаборатории и м а т смесен ра­
б о т е н п о т о к - малка група спешни проби, ко­
и т о се изпълняват веднага след получаване­
т о им и р у т и н н и проби, к о и т о се п у с к а т или
на големи серии, или според т я х н о т о п ост ъп ­
ване в л а б о р а т о р и я т а . В последния случай ла­
б о р а т о р и я т а т р я б в а да прецени дали един и
съш а п а р а т ше поеме и р у т и н н и т е , и спеш­
н и т е изследвания. Ако се п р е д п о ч е т а т раз­
лични а п а р а т и , т о т р я б в а да се осигури съв­
м е с т и м о с т между м е т о д и к и т е . Л и п с а т а на
т а к а в а може да се яви ограничение за налич­
н а т а апаратура.
Walk-away В ъ з м о ж н о с т . Това е възмож­
н о с т т а на о п е р а т о р а да програмира апара­
т а и да може да го о с т а в и да извършва анали­
з и т е , д о к а т о с а м и я т т о й изпълнява други за­
дачи. То е следвашия а с п е к т при обсъждане
на а в т о м а т и з а ц и я т а . Тук влияние о к а з в а т
два ф а к т о р а - к а п а ц и т е т ъ т л а а п а р а ­
т а з а р е а к т и в и и проби, и ч и с л е н о с т ­
т а н а персонала.
К а п а ц и т е т ъ т за реактиви е броя на ви­
довете реактиви, к о и т о м о г а т да се съхра­
н я в а т едновременно в а п а р а т а . Определя се
о т наличните позиции за реактиви, о т с т а ­
б и л н о с т т а на р е а к т и в и т е след зареждане на
а п а р а т а и о т изискванията по съхраняване­
т о им (напр. хладилен режим). Анализатори,
к о и т о и м а т малък к а п а ц и т е т или използват
реактиви, к о и т о не м о г а т да се съхраняват
след зареждането им до изтичане срока на
годност изискват по-честа операторска на­
меса, т ъ й к а т о т е т р я б в а да се изваждат
или с м е н я т в края на всеки работен цикъл.
З а предпочитане с а апарати, които
о с и г у р я в а т необхоуилгите условия з а
с ъ х р а н я в а й н а реактивите.
В лаборатории с голям обем на видовете
анализи, к а п а ц и т е т ъ т на а п а р а т а за проби
съшо определя walk-away възможността. По­
вечето големи а в т о м а т и м о г а т да съхраня­
в а т едновременно голям брой реактиви и са
ограничени само о т броя на пробите, к о и т о
се п о с т а в я т в а п а р а т а . Специалните с т ъ п ­
ки по подготовка на даден анализ, напр. к а т о
ХДЛ, ЖСК съшо ограничават времето, през
к о е т о о п е р а т о р ъ т е отделен о т а в т о м а т а .
Друга допълнителна с т ъ п к а о т приготвяне­
т о на п р о б а т а е нейното разреждане. То е
необходимо к о г а т о се превишава обхвата на
линейност, к а к т о ч е с т о се случва при ензи­
мите. З а предпочитане с а автолшти,
к о и т о л ш г а т а в т о л ш т и ч н о д а извър­
ш в а т р а з р е Ж д а н е п р и з а д а д е н а п р о гр а ­
м а и л и пък и м а т увеличени обхвати
н а лши?йност.
Б р о я т на персонала в л аб о р ато р и я та съ-
шо определя н е о б х о д и м о с т т а о т т а к и в а
walk-away свойства. Колкото по-малоброен е
персоналът, толкова по-голяма е необходи­
м о с т т а да се управляват и следят повече о т
един а п а р а т и следователно о т свободно опе­
раторско време.
II. ф а к т о р и , о т н а с я щ и с е
до експлоатационните
характеристики на а п а р а т и т е
Ьаркос). Кодирането с т а в а все по-важно за
осигуряване идентификацията на пробите,
особено ако е налице оше о т р а н н и т е е т а п и
на събиране на биологичния материал. Проба
377
на пациент, к о я т о има щрих-код, позволява
на а п а р а т а да разпознае назначените пока­
затели. Това намалява грешките о т пропус­
ки при задаването им, к о и т о биха довели до
увеличаване времето за получаване на резул­
т а т и т е . Спестяв а се операторско време.
Щрих-кодове се п о с т а в я т и върху опаковки­
т е с реактиви. Така а н а л и з а т о р и т е разпоз­
н а в а т реактива, к о й т о се зарежда, п а р т и д ­
ния номер, срока му на годност и н у ж н а т а
калибрационна крива. Д о б р а т а лабораторна
практика изисква всяка нова п а р т и д а реак­
т и в и да се провери преди работа. Баркодове-
т е са средство, чрез к о е т о оператора се пре­
дупреждава за необходимостта о т калибра-
ция преди извършване на анализите, к а к т о и
за изтекъл срок на годност.
Предлагат се м н о ж е с т в о видове баркод:
Codabar, Code 19, Code 35 и др. Някои анали­
з а т о р и м о г а т да п о л з в а т само един вид бар-
код, и ако к о м п ю т ъ р н а т а с и с т е м а н а лабо­
р а т о р и я т а не може да о т п е ч а т а нужния
баркод, т о г а в а е необходим отделен баркод-
принтер. Това увеличава п о к у п н а т а цена н а
а п а р а т а и добавя нова с т ъ п к а в процедура­
т а . Някои а п а р а т и (Beckman Synchrom СХ7)
ч е т а т множество т и п о в е баркодове, осо­
бено полезно за лаборатории с голям обем
референтни изследвания и к о и т о получават
разнообразно кодирани проби. Някои о т по-
м а л к и т е анализатори не м о г а т да ч е т а т
баркодове. Повечето о т т я х м о г а т да се
с н а б д я т с баркод скенер ( к а т о опция), кой­
т о идентифицира п р о б и т е и п р е д о с т а в я
списък о т предварително скенирани реак­
тиви.
Наличието н а баркод ускорява процеду­
р а т а по обработка н а пробите, прави я по-
ефективна, намалява г р е ш к и т е и при иден­
т и ф и к а ц и я т а , и при анализа. Увеличава се
л а б о р а т о р н а т а производителност, к а т о се
намалява в р е м е т о за намеса н а о п е р а т о р а
и се увеличава walk-away в р е м е т о .
З а т б о р е н и с и с т е м и з а биологичеи ма­
т е р и а л . Друг а с п е к т при о б р а б о т к а т а н а
пробите е н а ч и н ъ т , по к о й т о п р о б а т а се
въвежда за изследване в анализатора. Съоб­
разно м е р к и т е за п р е д о т в р а т я в а н е преда­
в а н е т о н а СПИН, х е п а т и т и др., идеални­
я т а п а р а т би т р я б в а л о да п р и г о т в я про­
б а т а директно о т п ъ р в и ч н а т а е п р у в е т к а
без сваляне на запушалката. О т друга с т р а ­
378
на т о в а помага за п р о и з в о д и т е л н о с т т а , ка­
т о премахва н е о б х о д и м о с т т а о т прехвър­
ляне н а биологичния м а т е р и а л в с ъ д ч е т а -
т а за проби н а а п а р а т а . Х е м а т о л о г и ч н и т е
анализатори, вкл. и коагулометри първи въ­
ведоха т а з и възможност, к о я т о засега е по-
малко з а с т ъ п е н а при биохимичните анали­
з а т о р и (Baxter Paramax), но е налице вече и
т а з и т е н д е н ц и я . А п а р а т и т е т р я б в а да се
о ц е н я в а т и по размера н а е п р у в е т к и т е , ко­
и т о п р и е м а т и по с п о с о б н о с т т а им да поз­
н а в а т негодна проба.
Много важно п р е д и м с т в о н а затворени­
т е с и с т е м и , к о г а т о с а комбинирани с бар-
код е в ъ з м о ж н о с т т а да се з а р е д я т проби­
т е в а н а л и з а т о р а и да се о с т а в я т за ана­
лиз, к а т о о п е р а т о р ъ т се освобождава за
други задачи. Б р о я т н а видовете размери н а
е п р у в е т к а т а , к о и т о а п а р а т ъ т може д а
приеме без допълнителна процедура или без
да се сваля з а п у ш а л к а т а , може да се окаже
ограничители ф а к т о р . Това е особено важ­
но за болници с големи педиатрични или не-
о н а т а л н и отделения, изискваши по-малък
обем кръв. С п е ц и а л н а т а о б р а б о т к а н а про­
б и т е с по-малък обем намалява продуктив­
ността.
В т о р и я т аспект е възможността на
а н а л и з а т о р а д а р а з п о з н а в а неприемливи
проби. З а х е м а т о л о г и ч н и т е а н а л и з а т о р и ,
к о и т о и з и с к в а т п ъ л н а кръв, а п а р а т ъ т
т р я б в а д а може да предупреждава з а час­
т и ч н о съсирени проби. При а н а л и з а т о р и т е ,
к о и т о и з и с к в а т серум п р и с ъ с т в и е т о н а
фибрин може да доведе до проблеми. Надеж­
д н о с т т а н а р е з у л т а т и т е и в д в а т а случая
ше п о с т р а д а или р е з у л т а т и т е ше се заба­
в я т , ако о п е р а т о р ъ т не е предупреден, че
п р о б а т а е неприемлива.
О б р а б о т к а и а п р о б а т а . Следващият ас­
п е к т е н ачи н ът, по к о й т о а п а р а т ъ т обра­
б о т в а пробите. В т о в а отношение се офор­
м я т ч е т и р и основни концепции: 1. в серии о т
определени показатели (профили/панели); 2.
произволен д о с т ъ п - селективен анализ; 3. ди­
р е к т н а обработка и 4. непрекъснат поток.
Първите две о п и с в а т начина за програмира­
не на т е с т - з а я в к и т е . Анализаторите с про-
ф и л н а о б р а б о т к а р а б о т я т по постоянна,
фиксирана т в ъ р д а програма и и з в ъ р ш в а т
един и съш т е с т / т е с т о в е на всички проби в
с е р и я т а . Анализатор със с е л е к т и В е и иа-
 ч и н н а о б р а б о т к а позволява н а оператора
да избере т е с т о в е т е за една проба, независи­
9 мо о т другите. Тези анализатори м о г а т да
) б ъ д а т т е с т о в о о р и е н т и р а н и (напр.
I Konelab) или п а ц и е н т н о о р и е н т и р а н и
)i (напр. Shimadzu). При първите, изработване­
т о н а пробите о т определен т е с т с т а в а съ­
образно п о с т и г а н е т о н а максимална ефек­
т и в н о с т по отношение н а накапване на ре­
активи, инкубационно време, о т ч и т а н е на ре­
з у л т а т а и т . н . К р а й н и я т р е з у л т а т о т всич­
ки назначени т е с т о в е н а определен п а ц и е н т
се о т п е ч а т в а едва след т я х н о т о изработва­
не. При необходимост е възможно поискване
о т п е ч а т в а н е т о н а и з р а б о т е н и т е до момен­
т а т е с т о в е . При в т о р и т е - пациентно ори­
ентирани, и з р а б о т в а н е т о на о т д е л н и т е т е с ­
т о в е за даден п а ц и е н т с т а в а последовател­
но - всички т е с т о в е н а п а ц и е н т №1, след т о ­
ва №2 и т . н . С к о р о с т т а (брой анализи/час)
не зависи о т назначените т е с т о в е на един
п а ц и е н т ( т я е фиксирана), д о к а т о при т е с т -
ориентираните анализатори пропускливост-
т а е по-висока при еднакви т е с т о в е на о т ­
делните пациенти. П р е д п о ч и т а н е т о на еди­
ния или другия вид зависи о т броя на обра­
б о т в а н и т е проби, броя на различните т е с ­
тов е , к о и т о се и з в ъ р ш в а т в л а б о р а т о р и я т а ,
к а к т о и о т т о в а дали се предпочита у п о т ­
р е б а т а на панели о т т е с т о в е . Анализатори
о т профилен т и п са по-удобни за диспансери,
профилактични кабинети и др., но не и за с т а ­
ционари с различна патология. Лко определе­
на комбинация о т т е с т о в е се назначава за
всеки пациент, т о г а в а а н а л и з а т о р ъ т би из­
вършил множество ненужни т е с т о в е , с кое­
т о се оскъпява изследването.
Анализаторите о т селективен т и п са мно­
го по-гъвкави, но и з и с к в а т операторско вре­
ме за програмиране на пробите, т ъ й к а т о за­
я в к и т е за всяка проба се програмират о т ­
делно. Проблемът се решава чрез шрих-код.
Някои анализатори предлагат възможност­
т а да р а б о т я т к а к т о к а т о профилни, т а к а
и к а т о т а к и в а с произволен достъп. Много
о т големите лаборатории и м а т анализатор
за анализи с определен профил и друг - селек­
т и в е н за с п е ш н и т е проби и р у т и н н и т е изс­
ледвания. Р ъ к о в о д и т е л я т на л а б о р а т о р и я т а
в т а к ъ в случай т р я б в а да се увери в с ъ в м е с ­
т и м о с т т а tu i р е з у л т а т и т е о т ( / в а т а
анализатора и във възлюЖността з а
уеднаквяване техните резултати.
Др у г и те две концепции - д и с к р е т н а и
п о с л е д о в а т е л н а о б р а б о т к а се о т н а с я т
до реакционната среда н а т е с т а . Дискрет­
н и я т анализатор извършва дадена реакция в
с е
Р да, независима о т т а з и на другите т е с ­
тове. Тези анализатори и м а т множество съд-
ч е т а , в к о и т о п р о б а т а и р е а к т и в и т е се смес­
в а т и се о с ъ ш е с т в я в а т реакциите. Повече­
т о използват кювети, а някои предлагат соб­
с т в е н и контейнери за р е а к ц и я т а (сух филм
при Kodak Ektachem, 12-гнездни кюветки при
Konelab, лодка при РВ Diagnostics Opus, плик
при Dupont АСА). Някои о т т е з и контейнери
с ъ д ъ р ж а т реактиви и само т р я б в а да се до­
бави пробата. Други прибавят и пробата, и
р е а к т и в и т е (Konelab, IL и др.).
Анализаторите с непрекъснат п о т о к ас­
пирират реактиви непрекъснато и въвеждат
проби през равни интервали о т време, к а т о
с е г м е н т и р а т потока, за да се раздели едно
изследване о т друго (Technicon). Тези анали­
з а т о р и са най-добри к а т о профилни, изпъл­
нявайки едни и съши т е с т о в е върху всички
проби, въпреки че м о г а т да р а б о т я т и селек­
ти вн о .
У с т р о й с т Н а з а измерИане н а химичес­
к и т е р е а к ц и и . Друга х а р а к т е р и с т и к а на
а в т о м а т и з и р а н и т е а п а р а т и е измервашото
у стр о й ство , к о е т о т е ползват. М е т о д и т е
за измерване се б а з и р а т на различни принци­
пи: спсктрофотометрия, флуориметрия, хе-
милуминесценция, рефлектометрия, нефело-
метрия и електрохимичен принцип. Принци­
п ъ т на измерване оказва силно влияние върху
р а б о т а т а на а п а р а т а . Някои методи се пов­
л и я в а т о т интерферираши вешества, зася-
гагци ч у в с т в и т е л н о с т т а или линейния обх­
в а т на а п а р а т а . С п е к т р о ф о т о м е т р и я т а
според избраните дължини на в ъ л н а т а силно
се влияе о т хемолиза или липемия. Някои апа­
р а т и използват различни дължини на вълна­
т а (диференцирана спектрофотометрия), за
да о т с т р а н я т интерференциите. Много о т
традиционните радиоизотопни технологии
(РИА) все оше не са заменени с нерадиоизотоп-
ни, з а ш о т о по-ранните нерадиоизотопни ме­
тодики не осигуряваха д о с т а т ъ ч н а чувстви­
т е л н о с т . По-новите методи, напр. хемилуми-
несценция са с д о с т а т ъ ч н а чувствителност.
Метос|и з а размесВане н а реакциошш-
т а с м е с . След к а т о са прибавени реактиви-
379
me u пробата е необходимо т е да се разме­
с я т , за да се извършат реакциите и да се оси­
гури хомогенност при измерването. Използ­
в а т се множество методи: механична вибра­
ция (Dupond АСА, Konelab), центробежна си­
ла (IL), инверсия чрез спирали (Technicon) и др.
Въпреки, че м е т о д ъ т за размесване не е оп­
ределящ при избора на анализатор, а п а р а т ,
който не осигурява адекватно размесване, ще
произвежда невъзпроизводими р е з у л т а т и и не
т р я б в а да бъде предпочетен.
III. Ф а к т о р и , о т н а с я щ и с е
до аналитични х а р а к т е р и с т и к и
на а п а р а т и т е
Х а р а к т е р и с т и к и т е на а п а р а т и т е , изброе­
ни по-горе, м о г а т силно да с т е с н я т разно­
образието о т а п а р а т у р а до т а к а в а , к о я т о
да отговори на н у ж д и т е на лаборатория­
т а . Следващата с т ъ п к а е да се о ц е н я т ана­
л и т и ч н и т е х а р а к т е р и с т и к и н а всеки апа­
р а т . При оценка н а а н а л и з а т о р и т е о т зна­
чение са следните аналитични качества: л и ­
нейност, чувствителност, специфичност,
точност, възпроизводимост, стабилност,
carryover (пренасяне) и др. (глава 20).
Производителите п р е д о с т а в я т анали­
т и ч н и т е х а р а к т е р и с т и к и на а п а р а т и т е ,
но т е т р я б в а д а с е п р о в е р я т в р е ф е р е п -
т н а лаборатория и л и в салгата лабо­
р а т о р и я(папр. през г р а т и с е н период) с по­
пулацията, к о я т о л а б о р а т о р и я т а обслуж­
ва. Верификацията н а х а р а к т е р и с т и к и т е
е процес, о т н е м а щ време особено при ана­
лизатори с големи т е с т о в и м е н ю т а . Доб­
р а т а лабораторна п р а к т и к а винаги е дик­
т у в а л а разбирането з а в ъ з м о ж н о с т и т е и
ограниченията н а даден т е с т - м е т о д .
Iv
- Други ф а к т о р и
О т значение при избор за покупка н а лабо­
р а т о р н о оборудване са и някои други фак­
тори:
Помещения. П о м е щ е н и я т а в дадена лабо­
р а т о р и я м о г а т да са ограничения при по­
купка на а п а р а т , ако м о н т а ж ъ т му ще изис­
ква с т р о и т е л н и дейности (разширяване н а
вход, събаряне н а п л о т , осигуряване н а дре-
380
н а ж и пр.). П р о с т р а н с т в е н и т е ограничения
понякога о п р е д е л я т дали а п а р а т ъ т ще е
н а с т о л е н модел {benchtop). В т е з и случаи
т р я б в а да се предвиди п л о т , разположен в
с р е д а т а н а помещението, за да има т е х н и ­
чески д о с т ъ п к ъ м о б р а т н а т а с т р а н а н а
а п а р а т а при р е м о н т и или с м я н а н а захран­
в а щ и т е шлаухи (напр. при някои хематоло-
гични анализатори). Трябва да се предвиди
е в е н т у а л н а т а нужда о т а д е к в а т н о захран­
ване с вода и дренаж (напр. Chimadzu),
Повечето а н а л и з а т о р и и м а т изисквания
з а т е м п е р а т у р е н диапазон или в л а ж н о с т ,
к о и т о се о с и г у р я в а т с к л и м а т и к . Електри­
ч е с к и т е изисквания също т р я б в а да се оце­
н я в а т . Повечето а п а р а т и , особено к о н т р о ­
л и р а н и т е о т к о м п ю т ъ р и з и с к в а т стабили­
з а т о р н а е л е к т р и ч е с к о т о напрежение.
П о д д р ъ ж к а / с е р В и з . Друг ф а к т о р е под­
д р ъ ж к а т а н а а п а р а т а и в р е м е т о н а прину­
д и т е л е н п р е с т о й . Най-лесно т о в а се у с т а ­
новява чрез к о н т а к т с лаборатория, к о я т о
и м а т а к ъ в а п а р а т и е с подобна н а т о в а р е ­
ност.
В р е м е н а поддръЖка. Ежедневната и
с е д м и ч н а т а поддръжка у в е л и ч а в а т значи­
т е л н о в р е м е т о , през к о е т о о п е р а т о р ъ т не
може да о б р а б о т в а проби н а п а ц и е н т и . Ако
е налице с а м о един а н а л и з а т о р и голяма
ч а с т о т п р о б и т е с а спешни (напр. в лабо­
р а т о р и и к ъ м и н т е н з и в н и и хирургически
клиники), т о и з и с к в а н и я т а з а поддръжка
т р я б в а да са минимални. Е ж е м е с е ч н а т а и
т р и м е с е ч н а п р о ф и л а к т и к а също о т н е м а
з н а ч и т е л н о време, особено ако а п а р а т ъ т
и м а широка м р е ж а о т т р ъ б и ч к и или голя­
м а водна баня.
В р ел ге н а п р и н у д и т е л е н п р е с т о й е
в р е м е т о , през к о е т о а п а р а т ъ т не се полз­
ва заради извършване н а процедури по под­
д р ъ ж к а т а или сервизни проблеми. Поддръж­
к а т а обикновено подлежи н а планиране и мо­
ж е да се съобрази с д н е в н а т а н а т о в а р е н о с т .
О т с т р а н я в а н е т о н а проблеми не е плани­
рано и може д а съвпадне с най-натоварени­
т е м о м е н т и . В т о з и случай м о г а т да по­
м о г н а т к о н т а к т и т е с лаборатории, к о и т о
п р и т е ж а в а т т а к ъ в а п а р а т . Полезно е да се
п о т ъ р с и л аб о р ато р и я , к о я т о вече не рабо­
т и с дадения а н а л и з а т о р и да се и з я с н я т
причините за т о в а .
О т с т р а н я в а н е т о н а проблемите и под-
 д р ъ ж к а т а с а т я с н о свързани със сервиза.
Часовете, през к о и т о с е р в и з н и я т персонал
е д о с т ъ п е н , к а ч е с т в о т о н а сервиза, ско­
р о с т т а н а о т г о в о р при поява н а проблем,
ц е н а т а н а сервиза чрез договор или повик­
ване, сервизното обучение н а л а б о р а т о р е н
персонал са важни а с п е к т и . Всеки п ъ т , ко­
г а т о един а п а р а т с неизправен, т о в а
с е о т р а з я в а в ъ р х у к а ч е с т в о т о и вре­
мето за получаване н а резултатите.
Това е особено к р и т и ч н о , к о г а т о т и м а
резервен ана^ьизатор.
Б е з о п а с н о с т п р и р а б о т а . Важно при из­
бора н а а н а л и з а т о р е да се проучи н е г о в а т а
безопасност: електрическа, механична, би­
ологична (напр. при х е м а т о л о г и ч н и т е ана­
л и з а т о р и м о г а т д а се о б р а з у в а т аерозоли),
микробиологична или химическа. Трябва да
се прецени а д е к в а т н и ли с а а л а р м и т е и ин­
струкциите.
К а ч е с т В е п к о н т р о л . В ъ з м о ж н о с т т а да
се с ъ х р а н я в а т и и з ч и с л я в а т р е з у л т а т и т е
о т к а ч е с т в е н и я к о н т р о л е също о т голямо
Е - значение. Процедурите о т качествения кон­
т р о л с т а в а т все по- ст рог и и о т н е м а т зна­
F ч и т е л н о време. Анализатор, к о й т о сигнали­
зира з а и з л и з а н е т о н а к о н т р о л н и т е с т о й ­
н о с т и о т о б х в а т е особено полезен, ако т е с ­
т в а н е т о се извършва о т по-малко о п и т е н
П* персонал. Дори и при екип с голям о п и т вре­
MI j: м е т о з а д о к у м е н т и р а н е н а к а ч е с т в е н и я
я к о н т р о л може да е значително, особено при
а н а л и з а т о р и с големи т е с т - м е н ю т а . Пове­
ч е т о а п а р а т и м о г а т д а с ъ х р а н я в а т и из­
числяват: средна а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т ,
с т а н д а р т н о отклонение, коефициент на ва­
риация и др. Някои ч е р т а я т г р а ф и к и т е н а
Levey-Jennings или други за визуализация н а
отклоненията и тенденциите. Времето,
' к о е т о а п а р а т ъ т с п е с т я в а по о т н о ш е н и е
Я очаква да обучи о с т а н а л и т е , да напише ука­
н н а ц я л а т а програма по к а ч е с т в е н к о н т р о л
| оценка на д е й н о с т т а му. Това може да се
съшо е о т значение.
ц Ц е н а и р а з х о д и . Ц е н а т а (включително и
[О о т с т ъ п к а т а ) н а даден а н а л и з а т о р съшо се
обсъжда к а т о важен ф а к т о р при избор на
[В а п а р а т у р а . П о - н и с к а т а ц е н а може да се
[ предпочете само при равни условия в харак­
П о к а Л е р е ш а в а щ ф а к т о р з а избор, п р и
т е р и с т и к а т а на сравняваните анализато­
ри. Да не се забравя, че п о - н и с к а т а п о к у п ­
N н а цена често се колтенсира с висока
ц е н а н а к о н с у м а т и в и , с к ъ п а поддръж­
к а н а а п а р а т у р а т а и л и по-големия
р а з х о д н а р е а к т и в и . Внимателно т р я б ­
ва да се о т ч е т а т и разходите за закупува­
не н а необходимите р е а к т и в и - о т в о р е н а
или з а т в о р е н а (реактиви само на произво­
д и т е л я ) с и с т е м а ли е?
11ри п о к у п к а т а т р я б в а да се осигури с до­
говор преференциална цена н а о с н о в н и т е
консумативи и особено н а кювети, дискове,
съдчета и т . н . Твърде голялг колтролгис
с качеството н а р е з у л т а т и т ее д а се
п р а в я т о п и т и з а с о б с т в е н о р ъ ч н о из-
лгиване и лиюгократна употреба н а
р е а к ц и о н н и т е съдове, ф а б р и ч н о п р е д ­
назначени з а еднократна употреба.
Доскорошното увлечение н а всяка цена да
се осигури м н о г о к р а т н о т о им използване
с л е д в а д а с е п р ео до лее. П о е в т и н я в а н е т о
в т о з и случай е привидно и е за с м е т к а на
а н а л и т и ч н а т а надеждност на р е з у л т а т и ­
те.
Да не се забравя, че разходите винаги са
по-високи о т к о л к о т о се т в ъ р д и о т произ­
водителя. Те м о г а т да се п о в и ш а т поради
ч е с т о налагашо се изхвърляне на нестабил­
ни реактиви, ако много ч е с т о се налага ка-
либрация на а п а р а т а или пък разходите за­
в и с я т о т н а т о в а р в а н е т о на а п а р а т а .
Обучение н а персонала. Изискванията за
професионална ср ъчн о ст т р я б в а да б ъ д а т
обсъдени предварително - колко хора са не­
обходими за р а б о т а с анализатора, за да се
реализира в ъ з м о ж н а т а е ф е к т и в н о с т , как­
т о и необходим ли е предварителен о п и т .
О т значение е и обучението, к о е т о произ­
в о д и т е л я т осигурява по време на инстали­
р а н е т о и след т о в а . Повечето фирми обуча­
в а т във фирмени учебни центрове само един
о п е р а т о р преди и н с т а л а ц и я т а . О т него се
зания за процедурите , к а к т о и да извърши
окаже огромна р а б о т а за един човек и ня­
кои производители н а м я с т о о с и г у р я в а т
технически персонал, за да п о м о г н а т при
т е з и инсталационни с т ъ п к и . У с п е ш н а т а
подготовка н а персонала моЖе д а се
н а л и ч и е н а анализатори с подобни
характеристики в големите лабора­
т о р и и , о т к о и т о в и н а г и м о Ж е д а с е по-
381
 ПОДХОДИ ПРИ ИЗБОР НА АПАРАТУРА
л у ч и полющ.
Основният м о м е н т при вземане н а решение
СЪОБРАЖЕНИЯ з а закупуване н а а п а р а т у р а е да се охарак­
ЗА АВТОМАТИЗАЦИЯТА т е р и з и р а т подробно и с т е п е н у в а т нужди­
В САЕДАНАЛИТИЧНИЯ ЕТАП т е н а л а б о р а т о р и я т а . След т о ч н о т о опре­
деляне н а т е з и нужди, с л е д в а щ а т а с т ъ п к а
След к а т о а н а л и з а т о р ъ т генерира р е з у л т а ­ е да се проучи а п а р а т у р а т а , к о я т о се пред­
т и т е , л а б о р а т о р и я т а т р я б в а да направи лага н а пазара и д а се избере най-добре о т ­
необходимото, за да д о с т и г н а т т е до въз­ г о в а р я щ а т а н а т е з и нужди. Трябва да се
ложителя. А в т о м а т и з а ц и я т а е свързана ос­ помни, че п о к у п к а т а п а а п а р а т о з н а ч а -
новно с наличното ниво н а к о м п ю т ъ р и з а - Ва п р е д и Всичко р е ш а в а н е (а н е п о с т а -
ция. Декарите м о г а т да п о л у ч а т г о т о в и т е б я н е ) п а п р о б л е м и . Д о п у с н а т и т е грешки
р е з у л т а т и по няколко начина: о т екрана н а при избора н а а п а р а т у р а ще се и з я в я т и оце­
компютъра (терминал в болничните с т а и ) , н я т след продължителен период о т време.
чрез разпечатка, по телефон/факс или с ком­ П о н а с т о я щ е м н я м а унифицирани или
бинация о т горните. Най-бърза е компю­ с т а н д а р т н и подходи з а избор на необходи­
т ъ р н а т а връзка. В много лаборатории ре­ м а т а за дадена л а б о р а т о р и я а п а р а т у р а или
з у л т а т и т е на п а ц и е н т и т е м о г а т да б ъ д а т с и с т е м а о т о т д е л н и а н а л и т и ч н и модули. В
прехвърлени д и р е к т н о о т а п а р а т а към ин­ различни източници са публикувани пример­
формационната с и с т е м а н а лаборатория­ ни схеми - т а б л и ц и , диаграми и др., к о и т о
т а и о т т а м към к о м п ю т ъ р н а т а с и с т е м а м о г а т да п о д п о м о г н а т лабораторния лекар
на болницата (процес наречен uploading). в оценъчния процес. Най-често се предлага
Освен с к о р о с т т а , друго предимство е на­ модел, включващ две фази: п р е з п ъ р в а т а
маляване н а грешките, д о п у с н а т и о т пре­ ф а з а с е п р а в и п р е с я в а н е и л и о т д е л я ­
писване н а р е з у л т а т и т е на ръка о т опера­ н е н а п о д х о д я щ и т е а н а л и т и ч н и сис-
т о р а . Л а б о р а т о р и я т а може да изисква сис­ т е л ш , а п р е з в т о р а т а - с л е д к а т о с е
т е м а , к о я т о директно да получава т е с т о ­ с т е с н и о б х в а т а з а избор, с е и з в ъ р ш в а
в и т е заявки о т клиниките, операционните д е т а й л н а оцен к а, к о я т о с л е д в а д а ре­
и т . н . (процес наречен downloading). О т зна­ ш и избора.
чение при избора н а а н а л и з а т о р е възмож­ Всеки и з т о ч н и к з а получаване н а инфор­
н о с т т а (едно- или двупосочно) да се свърз­ мация, вкл. п р о с п е к т и т е н а производите­
ва към интерфейса на л а б о р а т о р н а т а и/или ля, т р я б в а да се използва. Това предварител­
към болничната информационна с и с т е м а . но проучване м о ж е д а се о с ъ щ е с т в и чрез
Освен за начина, по к о й т о една лабора­ с т а т и и о т специализирани издания, рекла­
т о р и я изпраща р е з у л т а т и т е , т я т р я б в а ми, изложби, учебници и о п и т н а други ла­
да се грижи и за уведомяване н а л е к а р и т е боратории. Н а г л е д н и т е демонстрации, по­
при к р и т и ч н и или рязко о т к л о н я в а щ и се сещения в л а б о р а т о р и и т е , използващи т е ­
с т о й н о с т и н а отделни п а р а м е т р и . Повече­ зи с и с т е м и , разговори с колеги, запознаване
т о лаборатории и з в е с т я в а т л е к а р и т е з а с а п а р а т и т е н а професионални срещи и др.
т а к и в а р е з у л т а т и по т е лефон а - процеду­ д а в а т допълнителни в ъ з м о ж н о с т и з а оси­
ра, о т н е м а щ а време и с риск за грешки, и гуряване н а информация. П р и о р и т е т и т е ,
ч е с т о ненадеждна в извънработно време. к о и т о се о б с ъ ж д а т във ф а з а т а н а пресява­
К о м п ю т ъ р н и т е с и с т е м и , к о и т о препра­ не, по реда н а т я х н а т а з н а ч и м о с т са: ана­
щ а т р е з у л т а т и т е към т е р м и н а л и в клини­ л и з на ролята на автоматизираната сис­
к и т е , или предупреждават звуково м о г а т тема (апарата) в работния поток; детай­
да з а м е н я т о п о в е с т я в а н е т о по телефона. лен анализ на ценовата ефективност на все­
В някои здравни заведения се ползват и факс- ки апарат; оценка на обслужването на апа­
машини за съобщаване н а спешни или кри­ ратурата от потребителя, т.е. как ще се
т и ч н и р е з у л т а т и , к о е т о е по-евтин и сигу­ приеме, "приветлива"ли е към него;харак­
рен начин, ако н я м а изградена болнична ин­ теристика на аналитичните качества на
формационна с и с т е м а .
апарата. На т о з и е т а п и н ф о р м а ц и я т а о т
производителя обикновено се приема. Във
382
Таблица 19,1. IIpGcjBcipumGAHci оценка на абшомашичвн анализатор
Обозначение К а т е г о р и и за оценка* Общ с б о р
на апарата 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 точки
А
В
с
D
Е
F
G
Н
I
J
К
• К а т е г о р и и : 1) к а п а ц и т е т (проби/час); 2) бързина на получаване на р е з у л т а т а ; 3) методология; 4) т о ч н о с т
и прецизност; 5) разход на биологичен материал; 6) разход на реактиви за 1 т е с т ; 7) изисквания за участие на
персонал; 8) изисквания з а квалификация на персонала; 9) к о м п ю т ъ р н а с ъ в м е с т и м о с т ; 10) възможност за
самодиагностика при повреда н а а п а р а т а ; 11) а в т о м а т и ч н а депротеинизация; 12) с и с т е м а за идентифика­
ция на пробата; 13) избираеми т е с т о в е за с ъ с т а в я н е на профили.

ф а з а т а н а оценка п р ц о р ц т е т ц т е са в обра­ престой (принудително бездействие) за пе­

т е н ред н а з н а ч и м о с т .
Всеки ръководител н а лаборатория т р я б ­
ва предварително д а у т о ч н и к р и т е р и и за
п о к у п к а т а н а определен а п а р а т . Тези кри­
т е р и и най-често включват тсхпичсски,
е к с п л о а т а ц и о н н и и фииапсови слс-
л ю н т и . Те се п о д р е ж д а т в т а б л и ц а , в коя­
т о н а всеки един о т т я х се п о с т а в я оценка
- индивидуална и л и к о н с е н с у с н а 1 9 . 1 ) .
О ц е н к и т е с а въз основа н а условна скала,
напр. о т нула до две (или друга номерация),
к о я т о разкрива с р а в н и т е л н а т а з н а ч и м о с т
н а всеки един п а р а м е т ъ р . При т а к ъ в под­
ход всеки о т п р е с я в а н и т е а п а р а т и получа­
ва полуколичествена сборна оценка на изпъл­
нението на поставените о т потребителя
цели. По т о з и механизъм се п о с т и г а пър­
вична оценка н а н а й - с и л н и т е к а н д и д а т и
между к о н к у р и р а щ и т е се а п а р а т и .
След к а т о о б х в а т ъ т з а избор се с т е с н и ,
се и з и с к в а т д е т а й л н и сведения за разходи­
т е - и за покупка (или лизинг), и за използва­
не н а а п а р а т у р а т а . Такива икономически
въпроси, к о и т о п о з в о л я в а т финансови съ­
п о с т а в к и са: годишна натовареност, пла­
нирана з а даден т е с т / т е с т о в е през опре­
деления период на амортизация н а апара­
та; разходи за човешка сила (годишно) за да­
ден тест/тестове з а периода н а аморти­
зация на а п а р а т а ; разходи з а поддръжка з а
даден тест/тестове за периода на аморти­
зация; г о д и ш н и разходи з а а п а р а т а п р и
риода на амортизация; разходи за реакти­
ви за даден т е с т / т е с т о в е з а периода н а
амортизация на апарата; разходи за дого­
ворен сервиз (годишно, ако и м а такъв); раз­
ходи за а п а р а т а (годишно), съобразени към
л и х в и т е за периода на амортизация; общи
преки разходи за даден тест/тестове за пе­
риода на амортизация; обши непреки раз­
ходи за определен тест/тестове през пери­
ода на амортизация; общи икономически
разходи (сума от общите преки и непреки
разходи) з а даден тест/тестове през пери­
ода на амортизация на а п а р а т а и др. Об­
щ и я т икономически разход т р я б в а да се
сравни за амортизационния период н а апа­
р а т а с подобен общ разход, получен о т ико­
н о м и ч е с к а т а оценка на разхода при реална­
т а л аб о р ато р н а д е й н о с т по отношение на
определяните т е с т о в е .
Ц е н а т а п а п р и д о б и в а н е т р я б в а да се
разглежда в р а м к и т е н а възмо ж н и те опции
за к а п и т а л н о вложение - покупка, лизинг или
наем. В случай н а покупка, о т основно зна­
чение са а м о р т и з а ц и я т а и особено ц е н а т а ,
при к о я т о се извършва покупката. В случай
на някои о т д р у г и т е опции, в р е м е в и я т пе­
риод и д р у г и т е величини на договорените
задължения и з и с к в а т оценка, съобразена
к а к т о с разходите, т а к а и с о ч а к в а н и т е
приходи. Във всеки ценови анализ т р я б в а да
се о ц е н я в а т к а к т о п о с т о я н н и т е , т а к а и
променливите разходи.
383
 Оператибнише разходи с а дру2 а с п е к т н а
обсъждането. Определящи ф а к т о р и са: не­
обходимият човешки труд от гледна точ­
ка както на експлоатацията на апарата,
така и на неговата поддръжка; разходите
за непреки консумативи (вода, ток и др.),
които са функция на извършваната рабо­
та и естеството на анализ на системата,
изисквания за поддръжка (сервиз), която мо­
же да се извършва на място или според до­
говор. С и с т е л ш с а т р а к т и в н о п и с к а
цена н а е д и н т е с т м о г а т д а и м а т не-
а т р а к т и в н и общи о п е р а ц и о н н и р а з ­
ходи, а к о т я х н о т о и з п о л з в а н е е свър­
з а н о с л т о г о човешки т р у д , и л и а к о с а
високи р а з х о д и т е з а п о д д р ъ Ж к а .
Успехът н а много о т а в т о м а т и ч н и т е
системи зависи силно о т в р ъ з к а т а им с опе­
р а т о р а . С и с т е м и т е , с ч и т а н и за "приятел­
ски" настроени към п о т р е б и т е л я се прие­
м а т най-лесно о т р а б о т е щ и т е в л а б о р а т о ­
р и я т а , к о е т о води о т своя с т р а н а з а по-
бързо и гладко, без сътресения въвеждане на
с и с т е м а т а в р а б о т н и я п о т о к . Препоръчи­
те л н о е л а б о р а н т и т е / с п е ц и а л и с т и т е , ко­
и т о ще използват р а з г л е ж д а н а т а а п а р а т у ­
ра, да р а б о т я т с нея известно време в дру­
ги лаборатории или по време н а предвари­
те л н о изпитване на а п а р а т а . По време н а
пробния период не се препоръчва да се пра­
ви детайлна оценка н а д е й с т в и е т о н а апа­
рата.
Полезен подход, к о й т о подпомага край­
ния избор е и з п р а щ а н е т о н а еднородни въп­
росници до различни производители. Полу­
ч е н а т а о т т я х информация е важна за ико­
номическия анализ, а също т а к а и за у с т а ­
новяване н а сведения о т производителя за
д е й с т в и е т о н а а п а р а т а и р а б о т а т а с не­
го.
След доставяне н а анализатора, посред­
с т в о м анализ н а р а б о т а т а н а а п а р а т а ,
т р я б в а да се у с т а н о в и дали чувствител­
н о с т т а , линейността, т о ч н о с т т а и
възпроизбодимостта, обявени о т произ­
водителя са д о с т и г н а т и . Логично е да се
с м я т а , че би т р я б в а л о да се п о с т и г н е съ­
о т в е т с т в и е между т в ъ р д е н и я т а н а произ­
водителя и у с т а н о в е н о т о о т п о т р е б и т е ­
ля на а п а р а т а . Използването на т а к и в а оце­
нъчни протоколи обаче, н я м а да доведе до
идентифициране на специфични проблеми и
на ефекти о т различните п а р т и д и калиб-
384
рационни м а т е р и а л и , н и т о пък ще разкрие
р а з л и к а т а в у м е н и я т а н а о п е р а т о р а , пре-
д а н а л и т и ч н и т е грешки или условията на за­
о б и к а л я щ а т а среда.
О п е р а т о р и т е н а а п а р а т а т р я б в а да бъ­
д а т д о с т а т ъ ч н о добре обучени, з а да мо­
г а т д а о т к р и в а т сами някои обикновени
повреди н а а п а р а т а и да и з в ъ р ш в а т поправ­
ки н а м я с т о . Микропроцесорната техноло­
гия намалява до минимум з а в и с и м о с т т а о т
сервизните инженери н а производителя, за­
нимаващи се с поддръжка. Това се п о с т и г а
или чрез включването н а диагностична ру­
т и н н а проверка н а с о ф т у е р а и/или чрез т е ­
лефонни консултации.
Заключение. Разгледани с а основните кон­
цепции н а л а б о р а т о р н а т а а в т о м а т и з а ц и я .
В сл ед ващи те глави се о п и с в а т с подробнос­
т и специфичните а н а л и з а т о р и в отделни­
т е л а б о р а т о р н и с е к т о р и . Всяка л аб о р ато ­
рия е уникална, и ако ц е л т а н а а в т о м а т и ­
з а ц и я т а е да увеличи с к о р о с т т а и надежд­
н о с т т а н а изследванията, да намали раз­
х о д и т е и да оползотвори по-добре оператор­
с к о т о време, т о н е й н и т е нужди т р я б в а доб­
р е д а се р а з б е р а т . П р о и з в о д и т е л и т е се
с т р е м я т да о т г о в о р я т н а т е з и очаквания.
При избор н а а н а л и з а т о р т р я б в а да се оце­
н я т гореизброените а с п е к т и н а а в т о м а т и ­
з а ц и я т а и с ъ щ е с т в у в а щ и т е указания и на­
редби. Г р а н и ц и т е н а л а б о р а т о р н а т а дей­
н о с т се п р о м е н я т , п о я в я в а т се нови т е х ­
нологии. А в т о м а т и з а ц и я т а започва да из­
лиза о т т е р и т о р и я т а н а обикновеното из­
следване н а проби н а п а ц и е н т и и обхваща
целия процес - о т з а я в к а т а з а изследване до
и з п р а щ а н е т о н а получения р е з у л т а т . Вся­
к а л а б о р а т о р и я следва с а м а да определи не­
о б х о д и м а т а ü а п а р а т у р а и в н и м а т е л н о да
подбере производителя, к о е т о е изключи­
т е л н о о т г о в о р н а задача. Ц е л т а е да се усъ­
в ъ р ш е н с т в а и поддържа к а ч е с т в о т о на кли-
нично-лабораторната д е й н о с т и н а крайния
е ф е к т - к а ч е с т в о т о н а здравеопазването.
ТЕХНИЧЕСКИТЕ
КАДРИ И ПОДДЪРЖАНЕТО
НА СЪВРЕМЕННАТА
КАИНИЧНО ЛАБОРАТОРНА
ТЕХНИКА
II. Р а ш к о в
Р. Н и к о л о в
Понастоящем бъз основа на широкото при­
ложение на микропроцесорите, на клинична­
т а лаборатория се предлага високопроизво­
дителна, разнообразна по функции и възмож­
ности, сложна и скъпа техника. Една съвре­
менна клинична лаборатория не може без нея,
а окомплектовката, д о с т а в к а т а и експлоа­
т а ц и я т а на т а з и т е х н и к а с т р у в а с т о т и ц и
хиляди долари. В ъ з в р ъ щ а е м о с т т а на вложе­
н и т е средства, печалбата и о п т и м а л н о т о из­
ползване на а п а р а т у р а т а зависи не само о т
обслужващия я медицински персонал, но и о т
к о м п е т е н т н о с т т а и б ъ р з а т а ежедневна на­
меса на технически персонал - к^тпичеи ин­
женер (с профил медицинска апаратура). За
съжаление у нас не е д о с т а т ъ ч н о о с ъ з н а т а
необходимостта и оценена р о л я т а на т е х ­
ническите кадри за о п т и м а л н о т о ползване на
клинично-лабораторна т е х н и к а .
З а г о л е м и т е здравни заведения е иконо­
мически оправдано д а и м а т щ а т н а длъж­
ност т и к с п е р " . Toü следва ак­
т и в н о да у ч а с т в а в ц я л о с т н и я процес на ек­
с п л о а т а ц и я н а а п а р а т у р а т а , вкл. и в избо­
р а при з а к у п у в а н е т о й. Ако н я м а т а к а в а
щ а т н а д л ъ ж н о с т препоръчително е д а се
т ъ р с и к о н с у л т а ц и я о т други сходни звена.
ТЕХНИЧЕСКО ПРОУЧВАНЕ
НА ПРЕДЛАГАНИТЕ ОФЕРТИ
Клиничният инженер следва д а се запознае
и направи преценка за т е х н и ч е с к и т е харак­
т е р и с т и к и и к а ч е с т в а н а предлаганите о т
различни фирми анализатори. Toü т р я б в а да
предложи на р ъ к о в о д с т в о т о н а з д р а в н о т о
заведение ( клиничнат а лаборатория) аргу­
м е н т и р а н избор въз основа на:
• з а л о ж е н и т е в а п а р а т у р а т а технически
принципи, решения и т я х н о т о ниво;
• е к с п л о а т а ц и о н н и т е и д о с т о й н с т в а , пре­
имущества и недостатъци;
• технико-икономически анализ на ц е н а т а ,
облекченията или затр у д н ен и я та, свърза­
ни с експлоатационното и техническо под­
държане, амортизация и подмяна на час­
т и , възможност за доставка на консума­
т и в и о т производителя и о т други фирми.
УТОЧНЯВАНЕ НА ОПТИМАЛНИТЕ
УСЛОВИЯ ЗА РАЗПОЛАГАНЕ
НА АПАРАТУРАТА
Важно условие за безпроблемна р а б о т а на но­
возакупената а п а р а т у р а е предварителното
уточняване и осигуряване на необходимите
условия за разположението й. В т о в а о т н о ­
шение клиничният инженер следва да:
• съдейства за определяне на подходящо по­
мещение, съобразно р а з м е р и т е на д о с т а ­
в я н а т а а п а р а т у р а , оборудването му и
осигуряване на специфичните изисквания
на фирмата-производител;
• подбира месторазположение на а п а р а т а ,
к о е т о г а р а н т и р а добър д о с т ъ п и манев­
р е н о с т на обслужващия персонал, без да
се пречи на е к с п л о а т а ц и я т а н а д р у г а т а
т е х н и к а в помещението;
• у т о ч н я в а с ъ с т о я н и е т о на силовата инс­
т а л а ц и я и осигурява необходимото т о к о -
захранване по напрежение и мощност, оп­
ределя местоположението и количество­
т о на необходимите к о н т а к т и , при не­
обходимост у т о ч н я в а т е х н и ч е с к и т е ха­
р а к т е р и с т и к и , вида и ф и р м а т а за дос­
т а в к а на подходящи с т а б и л и з а т о р и на
м р е ж о в о т о напрежение, или а в т о н о м н о
захранване с UPS;
• взема мерки, осигуряващи електро и дру­
га б е з о п а с н о с т при р а б о т а с а п а р а т а ,
предвижда и о т с т р а н я в а влиянието на
ф а к т о р и , смущаващи н е г о в а т а р а б о т а ­
т а : източници на с т а т и ч н о електричес­
т в о , м а г н и т н о поле, зануляване на апа­
р а т у р а т а , екранировка на детайли;
• осигурява при специално поставени изис­
квания о т фирмата-производител клима­
т и ч е н к о м ф о р т на а п а р а т а в помещени­
е т о и у т о ч н я в а н а й - п о д х о д я щ а т а за цел­
т а климатична инсталация;
• определя и осигурява ергономично о с в е т ­
ление.
385
ПОДГОТОВКА НА АПАРАТА
ЗА ЕКСПЛОАТАЦИЯ
Събременнаша клинично-лаборашорна техника
изисква компетентна експлоатация и непрекъс­
н а т о поддържане. При взето вече решение за дос­
тавка на определен анализатор, особено ако т о й
е един о т първите за с т р а н а т а е препоръчител­
но съгласно включена в договора клауза, техни­
ческият специалист да проведе изпреварващо
обучение във фирмата-производител. Задълже­
н и я т а на клиничния инженер и специалистите
о т фирмата- производител включват:
> Да запознае медицинския персонал с:
• т е х н и ч е с к и т е особености и изисквания з а
р а б о т а с а п а р а т а , без и н ц и д е н т и ;
• пускането на а п а р а т а и п о д г о т о в к а т а му
з а е к с п л о а т а ц и я , проверка и з а р е ж д а н е с
к о н с у м а т и в и и проби;
• калибровка и проверка н а и з п р а в н о с т т а
м у с к о н т р о л н и проби, п о ч и с т в а н е и про­
миване н а а п а р а т у р а т а след приключва­
не н а р а б о т а .
Предварителното запознаване н а обслуж­
ващия персонал с т е з и процедури води до пре­
д о т в р а т я в а н е н а елементарни грегики при ек­
с п л о а т а ц и я т а , к о и т о с п и р а т изследванията
и м о г а т да о п о р о ч а т получените р е з у л т а т и .
>• Д а с ъ д е й с т в а н а медицинския персонал
при включване н а различни опции, к о и т о
с а във в ъ з м о ж н о с т и т е н а а п а р а т а .
>• Да у с т а н о в и д е ф е к т и , причинени о т :
• неадекватна р а б о т а с а п а р а т а и вземе
мерки з а и з б я г в а н е т о им;
• мрежовото напрежение и неговите недопус­
т и м и колебания в процеса н а р а б о т а и д а
съдейства з а о п т и м и з и р а н е т о му; да у т о ч ­
ни о п т и м а л н а т а т е м п е р а т у р а в помеще­
н и е т о и изисква н е й н о т о осигуряване;
• 9 а установи наличието и да о т с т р а н и
в л и я н и е т о н а с м у щ а в а щ и ф а к т о р и : елек­
т р о с т а т и ч н и , електромагнитни и маг­
нитни полета.
ТЕХНИЧЕСКО ОБСЛУЖВАНЕ,
ПРОФИЛАКТИКА И НАСТРОЙКА
НА КЛИНИЧНО-ЛАБОРАТОРНАТА
ТЕХНИКА
Основно задължение на клиничния инженер е да
извършва ремонта и поддържането на поверена­
т а му апаратура, с оглед нейната безотказна ра­
386
бота. Клинично-лабораторната техника е про­
д у к т на интердисциплинарни специалности: елек­
троника, компютърна техника, химия, физика,
фина механика, оптика, програмиране. Инжене­
р ъ т , който поддържа т а з и апаратура, трябва
да има познания о т всички т е з и области на т е х ­
никата, за да се справи с възникналите при рабо­
т а дефекти. Д е й н о с т т а му се изразява в:
• о т к р и в а н е н а д е ф е к т и , водещи до спира­
не р а б о т а т а н а а п а р а т а и т я х н о т о о т с ­
траняване;
• периодична п р о ф и л а к т и ч н а проверка, съг­
ласно ф и р м е н и т е препоръки и подмяна н а
износени ч а с т и , съобразно експлоатацион­
н и т е изисквания н а фирмата-производител
(лампи, к и т о в е , б у т а л н и д о з а т о р и и др.);
• оценка н а с ъ с т о я н и е т о и г о д н о с т т а н а
п о д л е ж а щ и т е з а п о д м я н а ч а с т и и възмож­
н о с т т а з а с л е д с р о ч н о т о и м ползване.
Д е ф е к т и т е , к о и т о в ъ з н и к в а т , и м а т раз­
личен х а р а к т е р . Те с а :
Е к с п л о а т а ц и о н н и - получават се при рутин­
на работа и следва да се познават и о т обслужва-
шия медицински персонал (запушване на игли,
кристализация на реактиви, некачествен проми­
ваш разтвор, неспазване на финалните процеду­
ри по почистване на а п а р а т у р а т а и подготовка­
т а ü за работа през следваищя ден и др.).
О т т е х н и ч е с к о e c m e c m ß o . Най общо т е
с а т р и вида:
• д е ф е к т и в е л е к т р и ч е с к а т а силова ч а с т и
електрониката на а п а р а т а - инженерът
т р я б в а д а о т с т р а н и д е ф е к т а или д а о т ­
крие д е ф е к т и р а л а т а п л а т к а и д а я изп­
р а т и за р е м о н т и подмяна о т ф и р м а т а -
производител.
• д е ф е к т и в м е х а н и к а т а н а а п а р а т а - слож­
н а т а механична к о н с т р у к ц и я н а съвреме-
н и т е а п а р а т и и д и н а м и ч н и я т и м режим
н а р а б о т а е причина з а с и с т е м н и д е ф е к т и
и налагащи се р е м о н т и (помпи, т р а н с м и ­
сионни с и с т е м и , дилуторни, диспенсорни,
охладителни, т р а н с п о р т н и и други възли).
• д е ф е к т и в о п т и к а т а - лампи, п р о м я н а в
е м и с и о н н а т а и м х а р а к т е р и с т и к а , зацап­
вания, о п т и ч н о д е ц е н т р и р а н е ( р а з с т р о й -
ка) о т различно е с т е с т в о , д е ф е к т и в на­
късването на светлинния поток, в свето-
води и др.
При по-висока квалификация и к о м п е т е н ­
т н о с т н а о б с л у ж в а щ и т е т е х н и ч е с к и лица
u npu наличие н а подходяща база е възмож­
но да се и з в ъ р ш в а т д е й н о с т и , к о и т о пес­
т я т значителни средства н а здрав­
н о т о з а в е д е н и е . Такива са:
• рециклиране н а износени и дефектирали
ч а с т и или възли н а а п а р а т а (предимно ме­
ханични и о п т и ч н и ) ;
• ремонт на м я с т о на дефектни платки
или други възли о т е л е к т р о н н а т а ч а с т ;
• и з р а б о т в а н е и подмяна н а повредени или
износени ч а с т и о т м е х а н и к а т а и о п т и ­
к а т а на а п а р а т а .
РЕШЕНИЯ ЗА БРАКУВАНЕ
След цялостна техническа проверка на апа­
р а т а , оценка за неговото морално о с т а р я в а ­
не, физическа амортизация и икономическа не­
целесъобразност о т поддържането и експло­
а т а ц и я т а му, клиничният инженер дава ар­
гументирано с т а н о в и щ е за бракуването му.
ТЕХНИКО ИКОНОМИЧЕСКА
ОБОСНОВКА НА НЕОБХОДИМОСТТА
ОТ СОБСТВЕНИ ТЕХНИЧЕСКИ
КАДРИ В ПО КРУПНИТЕ
КЛИНИЧНО ЛАБОРАТОРНИ ЗВЕНА
С ъ в р е м е н н а т а клинично-лабораторна апа­
р а т у р а е сложна, специализирана, е ф е к т и в ­
н а и скъпа. Икономическо изискване е т я да
бъде н а т о в а р в а н а максимално, а р а б о т а т а
ü да бъде прецизна, безаварийна и без прес­
т о и . Обикновена п р а к т и к а е р е м о н т ъ т ,
п о д д ъ р ж а н е т о и п р о ф и л а к т и к а т а ü да се
п р е д о с т а в я н а специализиран сервиз. Цена­
т а н а а б о н а м е н т н о т о поддържане или н а
повиканите при нужда сервизни инженери е
висока, а о т з о в а в а н е т о им н а повикване -
сравнително бавно.
Един е л е м е н т а р е н анализ показва, че е
икономически целесъобразно клиничните ла­
боратории, п р и т е ж а в а щ и т е х н и к а на с т о й ­
н о с т над USD 400 000, д а и м а т с о б с т в е н
щ а т за инженер. Г о д и ш н и я т а б о н а м е н т за
т а з и а п а р а т у р а , изчислена дори на база н а
невероятно малкия 1% о т с т о й н о с т т а й,
значително превишава с е г а ш н а т а годишна
з а п л а т а на един инженер.
ТЕНДЕНЦИИ И НЕРСНЕКТИВИ
В РАЗВИТИЕТО НА
КАИНИЧНО-ЛАБОРАТОРНИТЕ
АНАЛИЗАТОРИ
Т . Ц в ет к о в а
Ст.Данев
Ирез последните няколко години р а з в и т и е т о
на а в т о м а т и з а ц и я т а в клиничната лабора­
т о р и я се развива ускорено в няколко насоки:
1. Ч а с т и ч н а д е ц е н т р а л и з а ц и я с помощ­
т а на лесно преносими анализатори при лег­
л о т о на болния (РОС), к о и т о лесно се обслуж­
в а т о т нелабораторен персонал и осигуряват
надеждни р е з у л т а т и за с м е т к а на по-висо­
к а т а си цена. В по-далечно бъдеще се очаква
РОС а н а л и з а т о р и т е да се усъвършенстват в
няколко насоки:
• миниатюризация до с т е п е н позволяваща
т я х н о т о имплантиране в п а ц и е н т а с ог­
лед мониторинг на критични отклонения,
с а м о т е с т у в а н е на хронични заболявания
- д и а б е т , бъбречна н е д о с т а т ъ ч н о с т , ИБС
u др. u самокорекция (напр. инсулинова
помпа при д и аб ет);
• намаляване на ц е н а т а ;
• разширяване н а м е н ю т о с допълнителни
аналитични принципи (ДНК м е т о д и , иму-
н о т е с т у в а н е и др.).
2. О к р у п н я в а н е с изграждане н а големи
ц е н т р а л н и лаборатории (core Laboratories).
Доказано е, че т е з и лаборатории са иконо­
мически много по-изгодни о т м а л к и т е и де­
централизирани лаборатории. Очаква се в
с л е д в а щ а т а генерация о т а в т о м а т и да се
възпроизвежда все повече Японския феномен
н а лаборатории т и п „черна кутия11, к о я т о
има два края - о т единия край п о с т ъ п в а т
пробите, о т другия и з л и з а т г о т о в и т е ре­
з у л т а т и . В р е з у л т а т се получава т о т а л н а
лабораторна а в т о м а т и з а ц и я (ТЛА). До края
на 1996 г. в Япония и САЩ бяха изградени 40
ц е н т р о в е с ТЛА. През 2000 г. се очаква т о з и
брой да надвиши 100 к а т о се включат и ре­
дица европейски с т р а н и . В следващите 10-
20 години се очаква удвояване на т о з и брой.
3. А в т о м а т и з и р а н е н а п р е д а п а л и т и ч
н и я е т а п . Засега има съществено изоста­
ване в а в т о м а т и з и р а н е т о на преданалитич-
ния е т а п , к о й т о е критичен и е източник на
387
висок проиент о т грешките (40 go 60%). За т о р и т е и ЛИС. Тези модули о си г у р я ват
преодоляване на т о в а изоставане решител­ а в т о м а т и ч н о провеждане н а качествения
на роля има роботизаиията. През 1993 г. в Ме­ к о н т р о л въз основа н а предварително де­
дицинския университет Kosni беше създаде­ финирани к р и т е р и и , к а к т о и за анализ и
на п ъ р в а т а роботизирана лаборатория о т р е д а к т и р а н е н а р е з у л т а т и т е с добавяне
Sasaki. В следваиште години бяха роботизи- н а полезни з а к л и н и ц и с т а / п о т р е б и т е л я
рани по сходен образец клиничните лаборато­ данни о т н о с н о р е ф е р е н т н и граници, екс­
рии на у н и в е р с и т е т и т е на Небраска и Вирд­ т р е м н и и панически с т о й н о с т и , плаузи-
жиния (САЩ), а т а к а съшо и в Италия, Гер­ б и л и т е т е н к о н т р о л (delta check), сравни­
мания, Швеция, Финландия и др. За а в т о м а ­ т е л н и данни з а к а ч е с т в е н контрол, ана­
тизиране на преданалитичния е т а п , респ. ра- лиз н а определени а л г о р и т м и и определе­
ботизирането му особено допринесоха разра­ ни т е н д е н ц и и ;
б о т к и т е на няколко фирми, произвеждаиш го­ • изграждане на все по-съвършени програ­
леми анализатори - Coulter, Abbott, Johnson & ми (софтуер) з а м о н и т о р и н г н а операци­
Johnson, Ektachem, Roche, Ciba C o r n i n g , и т е на анализатора.
Beckman и Dade. 6. М и н и а т ю р и з а ц и п до с т е п е н н а микро-
4. У с ъ в ъ р ш е н с т в а н е н а а н а л и т и ч н и м чипови технологии, позволяващи а в т о м а т и ­
eman{Qik. следваидите глави). з и р а н е т о н а м е т о д и , базирани н а ПВР н а
5. Усъвършенстване н а с л е д а н а л и т и ч ­ ДНК и на и м у н о т е с т у в а н и я с висока произ­
н и я етап, т ъ й нар. с и с т е м а н а з а д н а т а в о д и т е л н о с т и специфичност.
линия (back line system) чрез:
• двупосочна комуникация между анализато­ З а к л ю ч е н и е . Изхождайки о т дългогодиш­
р а / и т е и централния компютър или ЛИС, ния си о п и т по р е м о н т а и п о д д ъ р ж а н е т о
осигуряваща ефективното поръчване на из­ н а медицинска а п а р а т у р а с ч и т а м е , че кли­
следванията, въвеждане на д а н н и т е за па­ н и ч н и т е л а б о р а т о р и и н а к р у п н и т е меди­
ц и е н т а и трансфер на информацията до цински з а в е д е н и я в с т р а н а т а следва д а
анализатора/ите и досието на п а ц и е н т а ; и м а т щ а т н а бройка з а клиничен инженер.
• изграждане на модули н а о с н о в а т а н а пер­ Н е г о в а т а з а п л а т а е м н о г о к р а т н о по-малка
сонални компютри, к о и т о се в м е с т в а т с о т с т о й н о с т т а н а поддържането, извър­
п о м о щ т а н а интерфейс между анализа- швано о т външни организации.

КНИГОПИС

A m e r i c a n s o c i e t y for t e s t i n g and materials: s p e c i f i c a t i o n for M a n s f i e l d Р, B o o t h e r J. A c o s t - e f f e c t i v e alternative for m a n a g ­

barkodes in clinical laboratory s p e c i m e n m a n a g e m e n t . Е 1 4 6 6
- 9 2 . Philadelphia, PA, 1 9 9 2 .
B o w i e U . Selection o f laboratory instruments. In: S c h o e f f L E ,
Williams R H (eds). Laboratory instruments. S t L o u i s -
Baltimore-Boston-Chicago-London-Philadelphia-Sydney-
Toronto, 1 9 9 3 , 2 6 2 - 2 7 3 .
Burtis C A . Factors i n f l u e n c in g evaporation from s a m p l e c u p s
and assessment o f their e f f e c t o n analytical error. Clin C h e m
2 7 , 1975, 1 9 0 7 - 1 9 1 7 .
Columbus RL, Paliner AJ. T h e integrated b l o o d - c o l l e c t i n g s y s t e m
as a v e h i c l e into c o m p l e t e clinical laboratory automation. Clin
Chem 37, 1991, 1548-1556.
Coulter O p t i c h e m 1 8 0 procedure manual. C o u l t e r e l e c t r o n i c s
incorporated, Hialeah, Fl, 1 9 9 1 .
Godolphin W, Bodtker K, U y e n o D et al. Automated b l o o d - s a m p l e
handling in clinical laboratory. Clin C h e m , 3 6 , 1 9 9 0 , 1 5 5 1 -
1554.
Huscher C. Automation - o n e step at a time. Eur Clin Lab Febr
1999, 1 2 - 1 5 .
Lyttle T. A m o d e university an alysis and instrumentation facility
(guest editorial). International laboratory, 3 0 , 2 0 0 0 , 1 4 - 8
388
i n g laboratory information. International laboratory, 3 0 , 2 0 0 0 ,
1, 16-18.
M c C l a t c h e m K D (ed). Clinical laboratory m e d i c i n e : Laboratory
m a n a g e m e n t . B a l t i m o r e etc. A . W a v e r l y c o m p . , 1 9 9 4 , 2 3 - 5 3 .
O ' K e l l RT. M a n a g i n g the clinical laboratory for the future. JIFCC,
1994, 4 , 140-148.
Qual M. A u t o m a t i o n in the c l i n i c a l laboratory - c o n c e p t s and
a p p r o a c h e s . In: S c h o e f f L E , W i l l i a m s R H . S t . L o u i s -
Baltimore - B o s t o n - C h i c a g o - L o n d o n - Philadelphia -
S y d n e y - Toronto, 1 9 9 3 , 4 2 6 - 4 3 9 .
* * *
Рашков П , НИКОЛОВ P. H o някои в ъ п р о с и на техн и к ата и т е х ­
ническото о б с л у ж в а н е на х и м и ч е с к и анализатор " D Y ­
N A M I C " , С и м п о з и у м н а т е м а "Някои а с п е к т и н а с ъ в р е ­
мен н ата к л и н и ч н а л а б о р а т о р и я " , о р г а н и з и р а н о т "KONE",
г р . П л о в д н в , 4 - 5 . X I . I 9 9 3 г.
Рашков П , Н и к о л о в Р Н а ш и я т о п и т п о т е х н и ч е с к о т о о б е з п е ­
чаване и п о д д р ъ ж к а н а с ъ в р е м е н н а т а к л и н и ч н о - л а б о р а -
т о р н а техника; V I Н а ц и о н а л е н к о н г р е с п о к л и н и ч н а л а б о ­
ратория, 1 9 - 2 0 с е п т е м в р и 1 9 9 7 г. С о ф и я 1 9 9 7 , Р е з ю м е ; а,
48-49.
 Автоматизация
6 клиничната х и м и я
АВТОМАТИЧНИ АНАЛИЗАТОРИ
Cm. Д а н с в
Т. Ц в е т к о в а
През 6 0 - т е години н а 20. век в п р а к т и к а т а
н а в л и з а т д и с к р е т н и т е а н а л и з а т о р и , кои­
т о постепенно и з м е с т в а т п р о т о ч н и т е по­
ради ред п р е д и м с т в а :
• з н а ч и т е л н о по-ограничен carryover (пре­
насяне) и drift ( о т м е с т в а н е ) , к о е т о на­
м а л я в а н е о б х о д и м о с т т а о т ч е с т а ка-
либрация; прилагане н а немокрещи кон­
с у м а т и в и (с т а к и в а с а д и с к р е т н и т е RA
а н а л и з а т о р и , к о и т о Technicon внедря­
ва к ъ м 1980 г.);
• възможност за селективност;
• голяма бързина и в ъ з м о ж н о с т за спешен
i s t a t ) анализ;
• разширяващо се меню, включваидо 40, 50
go 100 различни п о к а з а т е л я ;
• разширяваш се с п е к т ъ р о т физикохимич­
ни а н а л и т и ч н и принципи, включваши на­
ред със с п е к т р о ф о т о м е т р и я , с п е к т р о -
ф л у о р и м е т р и я , йон-селективен анализ,
имуноанализ с усилване на сигнала с по­
м о щ т а н а ензими, имунофлуоресценция,
имунолуминесценция, имунотурбидимет-
рия, и м у н о н е ф е л о м е т р и я , йон-обменна
х р о м а т о г р а ф и я и др.;
• рязко намаляване обема на р е а к т и в и т е (до
и под 100 ц!) и на серума (до и под 15 |xl);
• силно увеличена производителност (вече
над 2000 анализа/h);
• силно увеличени възможности за обработ­
ка на д а н н и т е с п о м о щ т а на микропро­
цесор или к о м п ю т ъ р включващи;
- а в т о м а т и ч н а сигнализация за д е ф е к т и
в а п а р а т а или от клон ен и я в о п т и м а л ­
н о т о ниво на р е а к т и в и т е , т е м п е р а т у ­
р а т а и пр;
- а в т о м а т и ч н а корекция на голяма ч а с т
о т потенциално грешни анализи чрез
а в т о м а т и ч е н повторен анализ (re-run),
а в т о м а т и ч н о разреждане (autodilution)
на серум с високи концентрации или ак­
т и в н о с т и , с т а т и с т и ч е с к а обработка
н а д а н н и т е , к ачествен к о н т р о л и пр;
- в ъ з м о ж н о с т за д и р е к т н о включване в
лабораторна информационна с и с т е м а
(ЛИС);
- възмо ж н о ст за свързване (механично и
електронно) с други анализатори, т . е .
за консолидиране;
- в ъ з м о ж н о с т и з а и н т е г р а ц и я , т . е . за
свързване на аналитичния с пред- и сле-
даналитичните етапи.
За р а з в и т и е т о на дискретен а в т о м а т и ­
чен анализ допринесоха следните принцип­
ни нововъведения:
>• Ц е н т р о ф у ж е н анализ. Въведен е през
1969 г. о т Anderson (неговото р а з в и т и е е
т я с н о свързано с а с т р о н а в т и к а т а и кос­
м о н а в т и к а т а , к а т о за н у ж д и т е на кос­
мическия кораб Gemini беше създаден цен-
трофужнния п о р т а т и в е н анализатор
Gem Saec).
По-късно се с ъ з д а в а т ц е н т р о ф у ж н и т е
анализатори Multistat (IL), к о и т о се внед­
р я в а т и в н а ш а т а с т р а н а през 1978-1981 г.,
к а к т о и други модели изпробвани у нас
(Baker), селективния центрофужен анализа­
т о р Monarch и пр. Тези анализатори показ­
в а т ред предимства: възможност за сери­
ен паралелен анализ, голяма бързина и висо­
ка а н а л и т и ч н а надеждност.
У нас и в други с т р а н и т о з и т и п анали­
з а т о р и бяха изоставени във връзка с висо­
к а т а цена н а к о н с у м а т и в и т е (особено на
р о т о р н и т е дискове, к о и т о са за еднократ­
на употреба) и т р у д н а т а поддръжка на ана­
лизатора, особено н а к о м п ю т ъ р а .
389
>- Д и с к р е т н и с е л е к т и в н и а н а л и з а т о ­
ри. Понастоящем т е з а е м а т над 80% о т
а в т о м а т и ч н и т е клинично-химични ана­
лизатори. Особено много з а р а з в и т и е т о
на клиничната химия у нас допринесоха
селективните (random access) анализато­
ри на ф и р м а т а Technicon; RA-1000, RA-
2000, R-XT и пр. О т т е з и анализатори над
60 (RA-1000, RA-500, RA-XT) бяха масово
внедрени у нас през 80-те години. Те и з и г ­
раха много ваЖпа роля з а автома­
тизирането н а /слинично-хилтч-
ния анализ в следните насоки.
• въвеждане на с и с т е м а о т унифицирани
аналитични принципи, осигуряващи по-
добра сравнимост н а р е з у л т а т и т е ;
• подобряване н а д е ж д н о с т т а н а р е з у л т а ­
т и т е с въвеждане н а с и с т е м а за в ъ т р е -
и междулабораторно осигуряване н а ка­
чеството;
• възможности за STAT-анализ;
• възможности за електронна с т а т и с т и ­
ческа обработка на д а н н и т е ;
• гъвкавост с възможност за а д а п т и р а н е
на м е т о д и със собствени р е а к т и в и , коя­
т о беше рационално използвана о т реди­
ца български колективи в София, Пловдив,
Плевен, Варна, С т а р а Загора и др.
Понастоящем т е з и анализатори п о с т е ­
пенно се и з о с т а в я т поради някои с ъ щ е с т ­
вени неудобства: в и с о к а ц е н а н а к о н с у -
л ш т и в и т е (само р а з х о д ъ т н а немокреща
RA т е ч н о с т покрива 10% о т с е б е с т о й н о с т ­
т а н а изследванията); н е с т а б и л н о с т н а
някои л ю д у л и н а а п а р а т а , к о и т о скъ­
сяват Живота лгу и з а т р у д н я в а т п о д
д р ъ Ж к а т а л ъ у {пзщ). филтров карусел, фо­
т о м е т ъ р , п р и н т е р и пр.); с р а в н и т е л н о
лъалък л т к р о п р о ц е с о р , к о е т о о г р а н и ­
чава възлюЖностите з а автолттич-
н а с и г н а л и з а ц и я и н е д а в а възлюЖ-
ност з а салюкорекция и автолгати-
чен качествен контрол.
На м я с т о т о н а с е л е к т и в н и т е д и с к р е т ­
ни анализатори Technicon се н а л а г а т все по-
съвършени модели, о т к о и т о о т 8 0 - т е го­
дини досега у нас се внедряват: Hitachi 704,
705, 911, 912, 917 и др.; Prisma (Abbott); Op­
tima, Konelab 20, Konelab 30, Konelab 60
(Kone), Alliance-Shimadzu (Corning); Synchrons
XT (Beckman); Cobas (Roche) и др.
390
За л а б о р а т о р и и т е , извърващи голям брой
спешни анализи у нас бяха внедрени две з а т ­
ворени с и с т е м и :
- Dimension AR (Dade Behring)
- н а принципа н а с у х а т а филмова химия,
к о я т о получи голям т л а с ъ к с р а з в и т и е ­
т о н а ц в е т н а т а фотография о т фирма­
т а Kodak - Ektachem.
Повечето о т т е з и анализатори, и з п и т а ­
ни у нас п о к а з в а т редица п р е д и м с т в а пред
п р е д и ш н и т е генерации н а п р о то чн и анали­
затори и дискретните анализатори
Technicon, поради к о е т о по-долу ще б ъ д а т
разгледани заедно с някои сродни модели.
ОСНОВНИ ПОНЯТИЯ
С е р и е н а н а л и з {batch analysis). Серийни­
я т анализ се с ъ с т о и в изследването н а един
и същ п о к а з а т е л в серия о т проби н а болни.
З а ц е л т а се и з п о л з в а т т р и вида а н а л и з а т о ­
ри:
• Тясно с п е ц и а л и з и р а н и а н а л и з а т о ­
р и , извършващи с т р о г о определени кли­
нично-химични показатели - е л е к т р о л и т и
(йон-селективен анализатор), кръвни га­
зове, глюкоза (глюкозоанализатор), амино­
киселини (аминоанализатор) и др. Удобни
са з а спешни и специализирани лаборато­
рии.
• П о с л е д о в а т е л н и а н а л и з а т о р и , кои­
т о м о г а т да и з с л е д в а т последователно
различни п о к а з а т е л и - серия о т ензими,
последвана о т серия липиди, б е л т ъ ц и и
т . н . Удобни с а за по-малки лаборатории.
• П а р а л е л н и а н а л и з а т о р и , к о и т о изс­
л е д в а т едновременно две или повече серии
о т п о к а з а т е л и (профилна о б р а б о т к а н а
пробите - чрез панели). Предимство на т е ­
зи анализатори е осигуряване пълна еднак­
в о с т н а у с л о в и я т а н а изследване. Провеж­
да се о т ц ен тр о ф у ж н и анализатори, о т
к о и т о по-големите модели (Monarch, IL)
о с и г у р я в а т и с е л е к т и в н о с т н а изследва­
н е т о , д о к а т о п о - м а л к и т е (Multistat, IL,
Baker и др.) с а неселективни.
Проточни анализатори. Проточните
{непрекъснати) ан ал и зато р и п р о в е ж д а т из­
следването през н е п р е к ъ с н а т а с и с т е м а о т
т р ъ б и . Последните п р е д с т а в л я в а т гъвка­
ви п л а с т м а с о в и шлаухи, ч и е т о съдържимо
(серумни проби, р е а к т и в и ) се придвижва с
п о м о щ т а н а п е р и с т а л т и ч н а помпа. Про-
т о ч н и т е а н а л и з а т о р и с а два вида:
а) в ъ з д у ш п о - с с г л ю н п г и р а п и (инкохе-
рентни), в к о и т о з а намаляване н а пренася­
н е т о о т д е л н и т е проби н а б о л н и т е се о т д е ­
л я т една о т друга чрез въздушни мехурче­
т а . По т а к ъ в начин всяка проба се оформя
к а т о капка, о т д е л е н а о т о с т а н а л и т е про­
би с въздух:
ОПППЕЮ
б) несегл1ептирани{кохерентни), в ко­
и т о о т д е л н и т е проби не се о т д е л я т една
о т друга. П р и л а г а т се по-рядко, за някои
специализирани изследвания (напр. п о - с т а -
ри модели аминоанализатори).
П р о т о ч н и т е а н а л и з а т о р и п о к а з в а т ред
недостатъци.
- пренасяне (саr/4/over);
- н е с т а б и л н а нула { d r i f t ) \
- неселективност;
- н е с т а н д а р т н о с т на шлаухите - с тече­
ние н а в р е м е т о т е х н и т е размери (диаме­
т ъ р , дължина) бързо се п р о м е н я т . Живо­
т ъ т н а ш л а у х и т е се скъсява особено бър­
зо при прилагане н а п о - а к т и в н и р е а к т и ­
ви. Това налага о т една с т р а н а ч е с т а т а
им подмяна, а о т друга - много ч е с т а ка-
либрация (един п ъ т н а всеки 10-20 опреде­
ляния);
- разход н а големи количества р е а к т и в и .
Ч а с т о т посочените н е д о с т а т ъ ц и са о т ­
с т р а н е н и в а н а л и з а т о р и т е SMAC и Chem
One, к о е т о е за с м е т к а н а неприемливо ви­
соки цени в сравнение с д и с к р е т н и т е ана­
лизатори.
Понастоящем п р о т о ч п и м т а н а л и з с
изоставен к а т о аналитичен прин­
цип. Елементи о т п р о т о ч н о с т се з а п а з в а т
обаче в много о т сега с ъ щ е с т в у в а щ и т е дис­
к р е т н и анализатори, напр. обща проточна
линия на отчитащото им устройство - про-
точни фотометри и др.
Д и с к р е т н и а н а л и з а т о р и . Дискретни
(прекъснати) а н а л и з а т о р и п р о в е ж д а т изс­
ледването на о т д е л н и т е проби в отделени
едно о т друго п р о с т р а н с т в а (кювети, еп­
р у в е т к и , гнезда, филмови гелове и пр.). В
сравнение с п р о т о ч н и т е анализатори (с из­
ключение н а SMAC и Chem One) т е и м а т по-
голяма електронна ч а с т , респ. по-висока це­
на.
I I р е ди л г е т в а :
- ограничен до липсващ carryover и drift;
- аналитични п р о с т р а н с т в а със с т а н д а р ­
т и з и р а н и и т р а й н и размери и прозрач­
н о с т , к о е т о значително н а м а л я в а т необ­
х о д и м о с т т а о т калибрация;
- възможности за микроанализ;
- в ъ з м о ж н о с т за с е л е к т и в н о с т ;
- с п о м о щ т а н а вграден к о м п ю т ъ р се съз­
д а в а т значително по-големи възможности
за самоконтрол;
- самокорекция, а в т о м а т и ч н а калибрация и
рекалибрация, а в т о м а т и ч н о повтаряне на
анализа (re-run), подобрено документира­
не на информацията, възможност за лес­
но свързване с ЛИС, с други анализатори,
респ. за консолидация и т . н . ;
- значително повишена производителност
в сравнение с п р о т о ч н и т е анализи (10 до
100 п ъ т и ) ;
- значително по-висока ан ал и ти чн а надеж­
дност;
- значително по-ниска с е б е с т о й н о с т на из­
с л е д в а н и я т а независимо о т по-високата
цена на дискретния анализатор.
О т посочените данни се вижда, че спо­
р ъ т о т н о с н о проточни или дискретни ана­
л и з а т о р и се решава определено в полза н а
последните.
О т в о р е н и или з а т в о р е н и с и с т е м и
О т в о р е н и с и с т е м и . Този т и п а в т о м а ­
т и ч н и анализатори са пригодени за р а б о т а
с реактиви, доставени о т различни фирми
или приготвени в л а б о р а т о р и я т а . Те пре­
д о с т а в я т по-големи творчески възможнос­
т и на лабораторния специалист и и м а т по-
голяма гъвкавост. С т я х н а помощ се улес­
нява актуализирането на м е н ю т о с нови ме­
т о д и . Повечето съвременни дискретни се­
л е к т и в н и а н а л и з а т о р и и м а т специално
прадназначени канали за разработване на
нови м е т о д и , респ. изследване на нови лабо­
р а т о р н и показатели.
391
З а т в о р е н и систелги. А н а л и з а т о р и т е о т
т о з и т и п използват само р е а к т и в и т е н а
фирмата-производител, к о и т о м о г а т да бъ­
д а т в различно а г р е г а т н о състояние:
• течни реактиви - при повечето анализа­
т о р и за имунотестуване, е л е к т р о л и т и ,
кръвни газове и други високоспециализи­
рани изследвания. С т е ч н и реактиви, з а т ­
ворени в запечатени к а с е т и т и п черна ку­
т и я р а б о т я т р у т и н н и т е биохимични
анализатори Cobas Integra (Roche); т е ч н и
са р е а к т и в и т е и н а а н а л и з а т о р и т е Mon­
arch, Synchron и Dimension ( ч а с т о т ка­
н а л и т е на последния а н а л и з а т о р м о г а т
да се о т в о р я т )
• сухи реактиви - с ъ щ и т е са в т а б л е т и р а -
на форма. За с м е т к а на в и с о к а т а си цена
т е и м а т по-дълъг срок н а годност. В ана­
л и з а т о р и т е АСА IV (Dupont) и Р а г а т а х се
използват прозрачни р е а к т и в н и пликове,
в к о и т о р е а к ц и я т а се с т а р т и р а с доба­
вяне на разреден серум и р а з т в а р я н е н а
р е а к т и в н и т е т а б л е т к и , и преформиране
на пликовете в аналитични к ю в е т и .
• многослойни гелове - т е х н и к а т а н а мно­
гослойните гелове е р а з р а б о т е н а н а прин­
ципа на ц в е т н а т а фотография Kodak. Съ­
щ и я т се прилага п о н а с т о я щ е м най-широ­
ко о т а н а л и з а т о р и т е Ektachem, к о и т о из­
ползват за всеки анализ прозрачни квад­
р а т н и пластинки (слайдове), съдържаща
т р и основни слоя - разпределителен (за ди-
фундиране н а серума и евентуално пре­
махване на формените кръвни елементи),
реактивен (за провеждане н а ц в е т н а т а
реакция) и носещ слой, през к о й т о с т а в а
измерването на ц в е т н и я п р о д у к т .
Прилагането н а анализи т и п з а т в о р е н а
с и с т е м а е належащо при а в т о м а т и з и р а н е
на високоспециализирани изследвания - иму-
н о т е с т у в а н и я , определяне на е л е к т р о л и т и
с йон-селективен анализ, кръвногазов анализ
и др. За целите н а спешния анализ и РОС из­
ползването н а анализатори н а принципа н а
з а т в о р е н и т е с и с т е м и е особено удобно, т ъ й
к а т о с т я х се осигуряват надеждни резул­
т а т и независимо о т големината н а серия­
т а . Тези анализатори п о с т а в я т и по-малки
изисквания към квалификацията н а опера­
т о р а , к а т о някои м о г а т да се обслужват и
о т нелабораторен персонал.
З а останалите видове неспешни и
392
рутинни изследвания прилагането
н а затворени систелги н е е оправда­
но, о с о б е н о в н а ш и я р е г и о н .
С е л е к т и В е н или и е с е л е к т и И е н аиализ.
Използваните в м и н а л о т о п р о т о ч н и анали­
з а т о р и (Technicon) са неселективни. Несе-
л е к т и в н и я т анализ значително оскъпява из­
следването. Изоставено е и прилагането му
з а поголовен недискриминиран скрининг н а
някои патологични отклонения.
П о н а с т о я щ е м п о ч т и всички съвременни
клинично-химични анализатори р а б о т я т н а
селективен принцип, при к о й т о о т д е л н и т е
показатели, назначени о т лекуващия лекар,
се и з б и р а т о т о п е р а т о р а .
Л м п л и ф и к а ц и я (усилване). Амплификаци-
я т а повишава ч у в с т в и т е л н о с т т а н а м е т о ­
д и т е и и м а особено голямо значенние за изс­
ледване н а в е щ е с т в а с много ниски концен­
т р а ц и и в биологичните т е ч н о с т и (ДПК, хор­
мони, олигоелементи, м е д и к а м е н т и , някои
ензими и др.).
Амплификацията се п о с т и г а по различ­
ни начини, п о в е ч е т о о т к о и т о се а в т о м а ­
тизират:
а) ч р е з у в е л и ч а в а н е к о л и ч е с т в о т о
н а и з с л е д в а н о т о вещество. В т о в а о т ­
ношение огромно значение и м а т полимераз-
н и т е верижни реакции (PCR), чрез к о и т о ко­
л и ч е с т в о т о н а и з с л е д в а н а т а ДПК се увели­
чава 106 до 109 п ъ т и . З а определяне н а някои
NAD и NADP-зависими ензими се п р и л а г а т
реакции н а рециклиране, чрез к о и т о ч у в с т ­
в и т е л н о с т т а с т а в а 10° до 106 п ъ т и по-ви­
сока, в сравнение с о п т и ч н и я т е с т ;
б) ч р е з у с и л в а н е н а с и г н а л а , и з л ъ ч ­
ван от изследваната молекула
- при и м у н о а н а л и з и т е с нерадиоизотопни
маркери н а а н т и т я л о т о се п о с т и г а пови­
шаване н а ч у в с т в и т е л н о с т т а в сравнение
с д и р е к т н и т е EIA - 10'' до 10!1 (LIA) п ъ т и .
Ч у в с т в и т е л н о с т т а на т е з и м е т о д и се по­
вишава още повече при допълнителна ам-
плификация н а сигнала чрез ензимно рецик­
лиране (напр. АФ к а т о маркер н а а н т и т я ­
л о т о може д а се амплифицира 60 000 пъ­
ти);
- при изследване н а олигоелементи чрез ААС
с п о м о щ т а н а Зееманова корекция ч у в с т ­
в и т е л н о с т т а н а д е т е к т о р а н а р а с т в а 101
пъти
 6) чрез с ъ ч е т а в а н с л а а л г п л и ф и к а -
цията на измерваната молекула с
ф л у о р е е ц е н т н о м а р к и р а н е , напр. съче­
т а н и е т о на ПВР с флуоресцентна in situ хиб­
ридизация (FISH) позволява визуализиране на
отделни гени и т е х н и фрагменти в клетка-
г та;
г) с п о м о щ т а н а т ъ й н а р . т а н д е м -
н и Aiemogu, при к о и т о се съчетава висо-
коразделителна т е х н и к а (HPLC, капилярна
електрофореза, газова хроматография и др.)
1 с високочувствителна детекция (масс-спек-
т р о м е т р и я или още п о - ч у в с т в и т е л н а т а
масс-масс-спектрометрия).
КЛАСИФИКАЦИЯ
НА КЛИНИЧНО ХИМИЧНИТК
АНАЛИЗАТОРИ
Н р о т о ч н и ш е а н а л и з а т о р и и м а т важно
значение за началното а в т о м а т и з и р а н е на
клиничната лаборатория. Поради редица не­
д о с т а т ъ ц и , к о и т о бяха вече посочени, т е
са напълно изоставени. З а т о в а ще се огра­
ничим само върху т я х н а т а опростена кла­
сификация (фиг. 20,1).
ППОТОЧНИ АНАЛИЗАТОРИ
| неселсктивни • I сслективми •
Фиг. 20.1. Класификация на п р о т о ч н и т е клинич-
но-химични анализатори
ДИСКРЕТИИ АНАЛИЗАТОРИ
ф и г . 20.2. Класификация на д и с к р е т н и т е клинично-химични анализатори
Д и с к р е т и и т е а н а л и з а т о р и се подразде­
л я т на две основни групи (фиг. 20.2):
А н а л и з а т о р и е ф и к с и р а н а лгетодо-
л о г и я - извършват определянето на един
или повече показатели само с помощта на
строго определена техника (напр. анали­
з а т о р и т е на електролити на принципа на
йон-селективния анализ или пламъкова фо­
т о м е т р и я , глюкозоанализатори, анализа­
т о р и на pH и кръвни газове и др.). Тези ана­
лизатори често се използват и при легло­
т о на болния (РОС). Означават се още ка­
т о dedicated (посветени) анализатори.
2. А н а л и з а т о р и с пролгенлива лгетодо-
логим - извършват определяния на раз­
лични показатели в серия (последовател­
на или паралелна) или селективно. Серий­
н и т е (batch) анализатори по принцип са
по-малки о т селективните и са пригоде­
ни за малки лаборатории. С т я х н а помощ
м о г а т да се изследват голям брой проби
за последователно променящи се показа­
тели, което има определен икономически
ефект. Особено подходящи за ц е л т а са
последователните анализатори и ц е н т -
рофужните анализатори (IL, Baker). Те не
са пригодени за селективно изследване на
различни показатели в една и съща проба.
Изключение прави центрофужният анали­
з а т о р Monarch, който е селективен.
В противовес на серийните анализатори
селективните разполагат с възможността
за едновременно изследване на голям брой
различни показатели в серума на даден бо­
лен.
За нуждите на средно големите и голе­
м и т е клинични лаборатории о т изключи-
393
телно значение са селективните отворени
системи. Същите и м а т широко меню, про­
изводителност, к о я т о варира в широки гра­
ници в зависимост о т големината на лабо­
р а т о р и я т а ( о т 150 до 900 и повече изследва­
ния на час), к а к т о и голяма гъвкавост и опе­
ративност благодарение на вградени мик­
ропроцесори и компютърно управление.
Селективните затворени системи са два
основни вида:
а) з а р у т и н н и изслсдНаним н а п р и н ­
ципа н а многослойната техника
(напр. Kodak Ektachem), с у х и р е а к т и в и
(АСА), т е ч н и р е а к т и в и или п р е ф о р м и -
р а н и а н а л и т и ч н и к а с е т и (Cobas Inte­
gra). Тези анализатори осигуряват надежд­
ни резултати независимо о т големината на
серията и са особено подходящи за целите
на спешния и неотложен анализ, за монито­
ринг на критично болни при леглото (РОС).
Основно неудобство е високата им цена и
липсващите възможности за разработки о т
страна на лабораторния специалист. Извес­
т н о изключение п р а в я т анализаторите Di­
mension, които п р е д о с т а в я т в ъ з м о ж т о с т
за отваряне ч а с т о т каналите;
б) з а високо с п е ц и а л и з и р а н и изслед­
вания. На първо м я с т о т у к с п а д а т анали­
з а т о р и т е за нерадиоизотопен имуноанализ,
които са обект на отделна глава. Тези ана­
лизатори също се о т л и ч а в а т с все по-голя­
мо меню, висока производителност и гъв­
кавост.
ОСНОВНИ ЕТАПИ В ДЕЙНОСТТА
НА АНАЛИЗА
Повечето съвременни анализатори, особено
работещите на принципа на многокомпо­
нентния селективен анализ, провеждат из­
следването в 10 последователни е т а п а : 1)
идентификация на пробите; 2) подготовка
на пробите; 3) т р а н с п о р т и съхранение на
пробите; 4) отстраняване на белтъци и дру­
ги интерфериращи вещества; 5) т р а н с п о р т
и разпределение на обработените проби; 6)
подготовка и съхранение на реактивите; 7)
добавяне на реактивите; 8) химична реак­
ция; 9) измерителен е т а п ; 10) обработка на
сигналите и на информацията.
>• Индешпификация н а п р о б и т е . Извър­
шва се чрез мануално внасяне на иденти-
394
фикационния номер (код) на п р о б а т а в
анализатора при същевременно внасяне
на показателите, к о и т о следва да се ана­
лизират. Съвременните анализатори
идентифицират п р о б а т а чрез баркод.
>• Н о д г о т о Н к а н а п р о б и т е . За опростя­
ване п о д г о т о в к а т а на пробите се пред- -|
п о ч и т а т все повече методи, при к о и т о
се р а б о т и с пълна кръв, чрез о т с т р а н я ­
ване на формените елементи посредст­
вом различни способи (напр. при Ektachem
- чрез дифузия през горния, разпределите­
лен гел кръвните клетки се о т с т р а н я в а т
а в т о м а т и ч н о ; при други анализатори
п ъ л н а т а кръв се пропуска през ултрафил-
т ъ р , т а к а че за 60 s се получава нехемо-
лизирана плазма). В лабораториите с ТЛА
т е з и процеси се усъвършенстват още по­
вече с п о м о щ т а на роботи.
>- Т р а н с п о р т и с ъ х р а н е н и е н а пр о б и­
т е . Пробите (обикновено серум) се вна­
с я т в анализатора или чрез епруветка
(моновета), к о е т о е за предпочитане, или
чрез индивидуални миниконтейнери, ко­
и т о т р я б в а да о т г о в а р я т на няколко ус­
ловия:
- минимален м ъ р т ъ в обем, за да се ико­
номисва серум;
- да са изработени о т инертен м а т е р и ­
ал, к о й т о не интерферира - за предпо­
ч и т а н е е да бъде о т полистирен, поли-
винил и по-рядко стъкло; някои полис-
тиренови кювети адсорбират калций,
к о е т о е причина за фалшиво по-ниски
с т о й н о с т и на калция;
- контейнерите т р я б в а да се ползват ед­
нократно;
- да и м а т форма, к о я т о ограничава из­
парението (за 4 h може да се изпари до
50% о т серума особено при определени |J
условия на т е м п е р а т у р а , влажност и .i
вентилация). Контейнерите т р я б в а да
и м а т т я с н о гърло и да б ъ д а т пригоде- j
ни за покриване с капачки или парафилм р
(при анализатори, разполагащи с вгра- j
дено охлаждане на р о т о р а с пробите
т о в а не се налага);
- за предпазване о т фоторазграждане на
светочувствителни проби (билирубин) - t
специални контейнери с м а т о в и или
цветни стени, непропускащи ултравио- j
летови лъчи;
 - npu изследване н а термолабилни вещес­
т в а - съхраняване н а п р о б и т е в охладе­
но с ъ с т о я н и е .
Т р а н с п о р т ъ т н а п р о б и т е се о с ъ щ е с т в я ­
ва с п о м о щ т а н а подвижни с т а т и в и с раз­
лична {кръгли ротиращи - Hitachi, RA-
1000, Konelab и др.; касети с различен брой
гнезда - Shimadzu; серпентинна конвейерна
верига - Demand и др.). В с ъ в р е м е н и т е вер­
сии р о т о р и т е са подходящо изработени, т а ­
к а че в т я х да п о д р е ж д а т е п р у в е т к и т е о т
з а т в о р е н а т а с и с т е м а з а кръв. П р е д л а г а т
се и анализатори, при к о и т о биологичният
м а т е р и а л (серум) д и р е к т н о се аспирира с иг­
ла през з а п у ш а л к а т а им (аутосемплери с
тапопробивач).
>- Д е п р о т е и п и з а ц и я . Н е о б х о д и м о с т т а
о т т а к а в а се налага все по-рядко. Пове­
ч е т о селективни о т в о р е н и с и с т е м и из­
п о л з в а т д и р е к т н и м е т о д и без обезбелтъ-
ч а в а н е ч р е з р а з п р е д е л и т е л н и я гел
(Ektachem) или колонно-хроматографска
к а с е т а (АСА, Dade).
>> Т р а н с п о р т и р а з п р е д е л е н и е н а обра­
б о т е н и т е п р о б и . При п р о т о ч н и т е ана­
л и з а т о р и т р а н с п о р т ъ т н а п р о б и т е се
извършва през шлаухи (пластмасови т р ъ ­
бички) с п о м о щ т а н а п е р и с т а л т и ч н а
помпа. Решаваща роля з а осигуряване н а
еднакви обеми проба, к а л и б р а т о р и раз­
делителни въздушни м е х у р ч е т а и м а т два
фактора: в р с л ю н а а с п и р а ц и я т а и
постояпсп д и а м е т ъ р и а тръбичка­
т а . Основният н е д о с т а т ъ к на т е з и ана­
л и з а т о р и - carryover се дължи на ф а к т а ,
че придвижването на п р о б а т а в ц е н т ъ ­
р а н а п р о т о к а е по-бързо о т к о л к о т о в пе­
р и ф е р и я т а му, к ъ д е т о т я се допира да
с т е н и т е н а шлауха. Р а з р е ж д а н е т о с во­
да и р е а к т и в и с т а в а по същия начин, но
в о тде л ни канали, к о и т о в даден м о м е н т
се с м е с в а т с п р о б и т е , с к о е т о се с т а р ­
т и р а химична реакция.
При д и с к р е т н и т е а н а л и з а т о р и п р о б и т е
се прехвърлят с п о м о щ т а н а а в т о м а т и ч н и
дилутори с фиксиран или вариращ обем в ре­
акционните к ю в е т и . При т я х р а з м е р ъ т на
carryover е по-малък (обикновено под V/o). З а
ограничаването му в а н а л и з а т о р и т е RA -
Technicon (RA-500, RA-1000, RA-2000, RA-XT)
се прилага немокреща полифлуоркарбонова
т е ч н о с т (RAF), к о я т о може ч а с т и ч н о да се
рециклира, но въпреки т о в а е прекалено скъ­
па. В а н а л и з а т о р и т е Ektachem се използват
индивидуални вр ъх чета за пипетиране на се­
рум върху о т д е л н и т е аналитични гел-съдър-
жащи слайдове. Специални мерки (допълни­
т е л н о промиване) за ограничаване на
carryover се прилага при а в т о м а т и ч н и т е
с и с т е м и за и м у н о т е с т у в а н е .
>• П о д г о т о В к а и с ъ х р а н е н и е н а реак-
т и В и т е . Повечето а в т о м а т и ч н и анали­
з а т о р и използват т е ч н и реактиви в плас­
т м а с о в и или стъклени съдове с обем до
1000 ml. Някои затворени селективни ана­
лизатори, напр. Р а г а т а х използват т а б -
летирани, а други - включени в гелове ре­
а к т и в и (Ektachem). За съхранение н а нес­
т а б и л н и т е р е а к т и в и се използва вграде­
но охлаждане, осигуряващо т е м п е р а т у ­
р а о т 4 до 8 0С.
Повечето дискретни анализатори и м а т
с и с т е м и за контрол на минималния обем ре­
а к т и в и в съдовете; с ъ щ и т е п о д а в а т сигнал
к о г а т о о б е м ъ т с п а д н е под г р а н и ч н а т а
с т о й н о с т . С ъ щ е с т в у в а т и по-съвършени
си стеми , к о и т о сигнализират и за годност­
т а , респ. и з т и ч а н е срока на годност на оп­
ределен р е а к т и в .
В съвременните анализатори се осигуря­
ва идентифициране и мониториране на ре­
а к т и в и т е с п о м о щ т а на щрих-код, съдър­
ж а щ данни за названието, серийния номер,
срока н а съхранение, обема и т . н . К о д ъ т се
нанася върху е т и к е т а на контейнера с ре­
а к т и в и и се р а з ч и т а о т с ъ о т в е т н и я ридер.
С щрих-код се о з н а ч а в а т и съдовете съдър­
жащи калибратори.
Някои а н а л и з а т о р и с ъ з д а в а т възмож­
н о с т за многократно използване на един ре­
а к т и в , напр. при ензимното определяне на
глюкоза ХК и ГбФ-дехидрогеназа м о г а т да
се използват до няколко хиляди п ъ т и в т е ­
чение на един месец чрез имобилизирането
им в гел или върху с т е н а т а на реактивен
шлаух (напр. SMAC); ГОД върху мембрана­
т а на ензимния електрод на глюкозоанали-
з а т о р (напр. 2300 STAT) позволява изследва­
н е т о н а глюкоза и л а к т а т в 4000 серума с
една мембрана.
> Д о б а в я н е н а р е а к т и В и т е . В дискрет­
н и т е а н а л и з а т о р и добавянето с т а в а с
п о м о щ т а на а в т о м а т и ч н и пипети. Ко­
г а т о т р я б в а да се д о б а в я т едновремен-
395
 но няколко р е а к т и в а се п р и л а г а т а в т о ­
м а т и ч н и диспенсори. З а намаляване н а
carryover ме^кду един или повече р е а к т и ­
ви след всяко добавяне се извършва про­
миване на с ъ о т в е т н и я п и п е т о р (диспен-
сор).
>• Х и м и ч н а р е а к ц и я . К р и т и ч н и т е усло­
вия за протичане н а х и м и ч н а т а реакция
са: вид на контейнера, в който става ре­
акцията, транспорт на реактивите,
размесване, термостатиране, спазване
точното времетраене на реакцията и из­
мерване на реакцията.
Р е а к ц и о н н и т е к о н т е й н е р и , използва­
ни о т д и с к р е т н и т е анализатори са инди­
видуални или общи стационарни контейне­
ри. Индивидуалните м о г а т да са з а еднок­
ратна употреба^ пластмасови дискове или
ракове) и за многократна употреба(в с т ъ к ­
лени или кварцови дискове или ракове) със съ­
о т в е т н а с и с т е м а за миене с дейонизирана
вода. Към индивидуалните контейнери спа­
д а т т е з и на повечето съвременни д и с к р е т ­
ни селективни а в т о а н а л и з а т о р и - Hitachi,
Cobas, RA, Konelab и gp. (фиг. 20.3), Общи с т а ­
ционарни к о н т е й н е р и се и з п о л з в а т о т
Synchron СХЗ, Весктап/и др. При т е з и кон­
тейнери се п о с т а в я т особено високи изиск­
вания към измиването им за избягване н а
carryover. Съдовете з а е д н о к р а т н а у п о т р е ­
ба са о т п л а с т м а с а (поливинилхлорид, ак-
рилат, полистирен и др.), пропускаща с в е т ­
лина. Някои о т т я х м о г а т да се и зп олзва т
многократно, к а т о у нас бяха създадени ра­
ционални у с т р о й с т в а за миене на реакци­
о н н и т е дискове н а RA-1000, р о т о р и т е н а
ц е н т р о ф у ж н и т е Multistat III и др. Съдове­
т е за многократна у п о т р е б а м о г а т да бъ­
д а т о т п л а с т м а с а (RA-2000, Hitachi и др.) с
Колориметър
Реакционен диск
Фиг. 20.3. Схематично представяне на RA-1000,
ползващ пластмасов реакционен диск със 100 кю-
в е т и (no Tietz)
396
използваемост до 1 месец или о т пирексово
с т ъ к л о (Shimadzu) с използваемост до 2 год.
Ц и к ъ л ъ т з а измиване н а с ъ д о в е т е включва:
м и е н е с детергент, основа и л и киселина,
проплакване с дейонизирана вода и изсуша­
ване с въздух или вакуум. Повечето анали­
з а т о р и р а з п о л а г а т с възможност (монитор)
з а проверка на ч и с т о т а т а н а контейнери­
т е и о т с т р а н я в а н е н а негодните т а к и в а .
Основно неудобство при а н а л и з а т о р и т е с
миещи се контейнери е н е о б х о д и м о с т т а о т
у с т а н о в к а з а дейонизирана вода с капаци­
т е т над 100 1/дневно. До п ъл н и тел н о неу­
добство на т е з и анализатори е високата
ц е н а н а м и е щ и т е , изсушаващи и м о н и т о -
риращи у с т р о й с т в а , и р и с к ъ т о т погреш­
ни р е з у л т а т и при непрецизен или липсващ
монитор.
Р а з м е с в а н е т о е един о т най-трудно ав-
т о м а т и з и р у е м и т е процеси. То се п о с т и г а
чрез различни подходи: струйно вливане па.
р а з р е д е н а т а р е а к т и в н а смес (Nucleus, 550 :(
E x p r e s s и д р . ), м а г н и т н о р а з м е с в а н е
(Synchron СХЗ), силно р о т и р а н е или странич­
но придвижване (Hitachi 917, RA 1000, Dax и
др.), у л т р а з в у к (Dimension), размесване с по­
м о щ т а н а накапваща сонда (Копе) и др. При I
т е х н и к и т е н а о с н о в а т а н а с у х а т а химия
(напр. Stratus Ektachem и др.) р а з м е с в а н е т о
с т а в а при дифузия през гела.
Т е р л ю с т а т и р а н е т о се о с ъ щ е с т в я в а
чрез о п т и м а л н о подаване н а т о п л и н а о т I
о к о л н а т а среда към р е а к ц и о н н а т а смес. За
ц е л т а се прилага въздушна б а н я н а 37 0 С
(АСА), водна баня н а 370С (Hitachi), т е м п е -
рирана м е т а л н а п о д с т а в к а з а реактивни­
т е гел-съдържащи п л а с т и н к и (Ektachem) и
др.
Оригинално решение н а р а з м е с в а н е т о ,
т е р м о с т а т и р а н е т о и измерване н а ц в е т ­
ния п р о д у к т п р е д с т а в л я в а т р о т о р и т е н а
ц е н т р о ф у ж н и т е анализатори (фиг. 20.4). Об­
разно с ъ щ и т е н а п о д о б я в а т прозрачна т о р ­
т а , с ъ с т а в е н а о т т о л к о в а с е г м е н т а (резе­
на), к о л к о т о серуми м о г а т да се изследват
в една паралелна серия. Всеки с е г м е н т (ре­
зен) е разделен о т своя с т р а н а н а т р и гнез-
дна: вътрешно гнездо- за серума, средно гнез­
до - за р е а к т и в а и външно гнездо - за размес­
ване, инкубация н а получената смес и измер
ване н а ц в е т н и я п р о д у к т. Р а з м е с в а н е т о се
подпомага допълнително о т е ф е к т а на „вне­
з а п н о т о спиране" при в ъ р т е н е 2000 об/min
 Стационарен
източник на
светлина
Въртящ се диск
с кювети
| — Фотодетектор
Фиг. 20.4. Схематично представяне на дейст­
вието на центрофужен анализатор
и о т спъване \\з. серумно р е а к т и в н а т а смес
о т п р а г ч е т о между с р е д н о т о и в ъ н ш н о т о
гнездо, последвано о т ново ускорение. През
кварцово прозорче във в ъ н ш н о т о гнездо се
измерва н а всеки 100 ms п р о м я н а т а в абсор-
б ц и я т а с п о м о щ т а н а с ъ о т в е т е н компю-
т ъ р н о - к о н т р о л и р а н двувълнов ф о т о м е т ъ р ,
при забавяне н а р о т о р а до 600 o6opoma/min.
Т е р м о с т а т и р а се с въздух з а г р я т н а 3 7 0 С .
>• И з м е р и т е л е н е т а п . Повечето а в т о а -
нализатори използват к а т о о т ч и т а щ
принцип а б с о р б ц и о н н а т а ф о т о м е т р и я
или с п е к т р о ф о т о м е т р и я .
А л т е р н а т и в н и подходи са: о т р а ж а т е л н а ­
т а ф о т о м е т р и я (Ektachem), йон-селективен
анализ със с ъ о т в е т н а н а с т а в к а з а измер­
ване на е л е к т р о л и т и към голям брой диск­
р е т н и анализатори. При з а т в о р е н и т е сис­
т е м и з а н е р а д и о а к т и в е н имуноанализ се
п р и л а г а т различни а н а л и т и ч н и принципи
(флуоресцентен, хемилуминесцентен, ензи-
моимунен и др.).
М е т о д и т е на о с н о в а т а на абсорбционна­
т а ф о т о м е т р и я и з п о л з в а т различни и з т о ч ­
ници н а с в е т л и н а (лампи с волфрамова ниш­
ка, халогенни, деутериеви, живачни и ксено-
нови лампи, а т а к а също и лазер). Изолира­
н е т о на определена дължина на с п е к т ъ р а
с т а в а най-често с п о м о щ т а н а интерферен-
т н и филтри, м о н т и р а н и върху в ъ р т я щ се
карусел. Някои а н а л и з а т о р и (Synchron, СХ4.
Esspress, Spectrum и др.) използват за ц е л т а
монохроматори,
Ф о т о д е т е к ц и я т а се извършва с фотоди-
оди, ф о т о м н о ж и т е л и или ф и б р о о п т и ч н и
светловоди.
Голяма ч а с т о т и з м е р в а н и я т а се извър­
ш в а т при две дължини на в ъ л н а т а , с к о е т о
се осигурява по-голяма а н а л и т и ч н а специ­
фичност на р е з у л т а т и т е .
>• О б р а б о т к а н а с и г н а л и т е и н а инфор­
м а ц и я т а . С п о м о щ т а н а аналогово-диги-
т а л н и преобразователи аналоговите сигна­
ли о т д е т е к т о р и т е се п р е в р ъ щ а т бързо, за
1 до 10 1 ms в цифрови (дигитални). Чрез ком­
п ю т ъ р последните се п р е в р ъ щ а т с помощ­
т а на с ъ о т в е т н и а л г о р и т м и в полезна ин­
формация. С п о м о щ т а н а микропроцесори в
реално време м о г а т да се п р о в е ж д а т редица
контролни и измервателни операции: к о н т ­
рол на л и н е й н о с т т а , н а правдоподобността,
а в т о м а т и ч н а корекция н а някои дефекти на
а н а л и з а т о р а без намеса на оператора, а в т о ­
м а т и ч н о разреждане и изследване на проби с
прекомерно високи с т о й н о с т и или ензимни
а к т и в н о с т и , мониториране с ъ с т о я н и е т о н а
р е а к т и в и т е (изтекъл срок) и серума (интер-
фериращи ф а к т о р и к а т о хемолиза, и к т е р и
др.), к о н т р о л н а к а ч е с т в о т о на р е з у л т а т и ­
т е , с т а т и с т и ч е с к а о б р а б о т к а на с ъ щ и т е ,
т р а н с ф е р на р е з у л т а т и т е до с т а ц и о н а р а ,
респ. б о л н и ч н а т а информационна с и с т е м а
(БИС) със с ъ о т в е т н а и н т е р п р е т а ц и я на дан­
н и т е с вариращи по с т е п е н сложност и пр.
Микропроцесорът осигурява к о м а н д и т е и
контрола н а електромеханичните операции
на а п а р а т а , т а к а че т е да се и з в ъ р ш в а т по
унифициран начин, с к о р е к т н а последовател­
н о с т и п о в т о р я е м о с т . Освен т о в а микроп­
роцесорите и з в ъ р ш в а т непрекъснат надзор
и м о н и т о р и н г на ц я л о с т н а т а д е й н о с т н а
а н а л и з а т о р а и осигуряват получаване на ре­
з у л т а т и с по-висока а н а л и т и ч н а надежд­
н о с т . Благодарение на т е з и свойства микроп­
роцесорът позволява използването на по-мал­
ко обучени оператори. Микропоцесорите по­
лучават, проверяват, о б р а б о т в а т и съхраня­
в а т операционни данни о т а н а л и з а т о р а .
Много о т т я х включват вградено в анализа­
т о р а т е с т - о б о р у д в а н е (Built-In-Test-Equip-
m e n t - BITE) за мониторинг и за отключване
на евентуални с а м о т е с т у в а щ и и самокори-
гиращи команди.
С п о м о щ т а на микропроцесори се осъщест­
вява диалогът и взаимодействието между опе­
р а т о р и анализатор. Цифрови сигнали върху дис­
плея на к а т о д н а т а лампа и т я х н а т а р а з п е ч а т ­
ка н а с о ч в а т о п е р а т о р а да извърши необходими
операции (допълване на р е а к т и в и в съотв. кон­
т е й н е р , о т с т р а н я в а н е на грешки, повторно из­
следване на проби с екстремни с т о й н о с т и , инс­
т р у к ц и и за о т с т р а н я в а н е на различни по голе­
мина д е ф е к т и с насочване към сервизния ману-
ал на оператора). Микропроцесорите осигуря­
в а т и в р ъ з к а т а , респ. диалога с централния ком-
397
п ю т ъ р - директно или с п о м о щ т а н а интерфейс
по различни способи.
АНАЛИТИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Линейност. Линейният о б х б а т н а м е т о ­
д и т е за п о к а з а т е л и т е , к о и т о се оп ред е лят
с даден анализатор се дефинира о т с т о й ­
н о с т и т е на най-ниския и най-бисокия резул­
т а т върху калибрационната крива при да­
дения а п а р а т . Този линеен о б х в а т п е р и о ­
д и ч н о т р я б в а д а с е п р о в е р я в а , обикно­
вено веднъж годишно. По-голям линеен обх­
в а т означава по-малко разреждания н а про­
б и т е и следователно п е с т и време и осигу­
рява по-бързо р е з у л т а т и т е . Проблемът при
по-големия линеен о б х в а т е, че о ц е н к а т а н а
г о р н а т а ч а с т на о б х в а т а налага периодич­
но използване н а контролен м а т е р и а л с ви­
сока к о н ц е н т р а ц и я за п о т в ъ р ж д а в а н е н а
т о з и обхват, к о е т о увеличава ц е н а т а н а
теста.
Чувствителност. Ч у в с т в и т е л н о с т т а
изразява с п о с о б н о с т т а на мет од а /а н али за ­
т о р а да променя р е з у л т а т и т е а д е к в а т н о
на промените в к о н ц е н т р а ц и я т а н а измер­
в а н о т о вещество. За повечето общи биохи­
мични т е с т о в е , т о в а не е особено важен па­
раметър, т ъ й к а т о к о н ц е н т р а ц и я т а н а из­
следваните п а р а м е т р и в серум е д о с т а т ъ ч ­
но висока. За с ъ с т а в к и , к о и т о са в много
малки количества, напр. хормони, чувстви­
т е л н о с т т а н а използвания м е т о д е реша­
ващ ф а к т о р при избора н а а п а р а т ( т е х н о ­
логия). Ч у в с т в и т е л н о с т т а е о т особено
важно значение, к о г а т о н и с к и т е с т о й ­
н о с т и са о т диагностично значение,
напр. ниските нива н а hCG са показателни
за е к т о п т и ч н а бременност, а н и с к и т е
с т о й н о с т и н а TSH - за хипертиреоидизъм.
С п е ц и ф и ч н о с т . Сп ец и фи ч н ос т т а е свойс­
т в о т о да се измерва само определен пара­
м е т ъ р , При някои м е т о д и се измерва не са­
мо т ъ р с е н о т о вещество, но и други, к о и т о
реагират с използваните реактиви. Това мо­
же да доведе до н е т о ч н а диагноза, породена
о т фалшиво завишен р е з у л т а т . Един ч е с т о
даван пример за неспецифичен т е с т е ме­
т о д а за измерване н а к р е а т и н и н с алкален
пикрат. Въпреки м н о г о т о интерференции
398
върху т о з и м е т о д , т о й се използва при по­
в е ч е т о анализатори. Някои се о п и т в а т да
намалят ефекта о т интерференцията с
увеличаване н а т е м п е р а т у р а т а по време н а
р е а к ц и я т а . При ензимния м е т о д за анализ
н а к р е а т и н и н се е л и м и н и р а т описаните ин­
терференции (Kodak Ektachem анализатори­
т е ) , но възниква п р о б л е м ъ т за преоценка н а
р е ф е р е н т н и я и н т е р в а л н а креатининовия
клирънс.
К о г а т о се оценява един а п а р а т следва
внимателно да се п р о у ч а т м е т о д и т е и т я х ­
н а т а специфичност. Въпреки че даден ана­
л и з а т о р не т р я б в а да се о т х в ъ р л я заради
един или друг неспецифичен м е т о д , лабора­
т о р и я т а т р я б в а д а е наясно с ограничени­
я т а н а определени м е т о д и , з а да подпомага
по-добре л е к а р и т е при оценка н а резулта­
т и , к о и т о не са в с ъ о т в е т с т в и е с опреде­
лена диагноза.
Точност и възнроизводимост. Точност­
т а н а даден м е т о д е с п о с о б н о с т т а му да
определи и с т и н с к а т а / д е й с т в и т е л н а т а
с т о й н о с т н а даден показател. С т а н д а р т и ­
т е , к о и т о се използват, т р я б в а да са приз­
н а т и о т с ъ о т в е т н и т е к о м п е т е н т н и орга­
низации. Много по-лесно е д а се п о л у ч а т чис­
т и с т а н д а р т и за неорганични съединения,
о т к о л к о т о за биологични и особено з а хор­
мони. Използваните о т един а п а р а т м е т о ­
ди т р я б в а да се с р а в н я в а т с референтни т а ­
кива. Някои р е ф е р е н т н и м е т о д и лесно се ав­
т о м а т и з и р а т (напр. з а глюкоза), а други -
не (напр. Abell-Kendall за холестерол). Пре­
ц и з н о с т т а е с т е п е н т а н а невъзпроизводи-
м о с т н а даден м е т о д . Тя се о т р а з я в а с кое­
ф и ц и е н т н а вариация н а м е т о д а (CV). Колко­
т о е по-малък т о й , т о л к о в а по-добър е ме­
т о д а (анализатора). Това е важно, т ъ й ка­
т о позволява определяне н а промяна в с т о й ­
н о с т и т е при даден п а ц и е н т .
Друг начин з а оценка н а т о ч н о с т т а и въз-
п р о и з в о д и м о с т т а при верификация н а ха­
р а к т е р и с т и к и т е н а един а п а р а т е чрез CAP
т а б л и ц и т е . Това са с р е д н и т е а р и т м е т и ч ­
ни с т о й н о с т и , с т а н д а р т н и т е отклонения
и к о е ф и ц и е н т и т е н а вариация за повечето
анализатори и анализираните т е с т о в е в
т а б л и ч н а форма. Те с ъ д ъ р ж а т и целеви
с т о й н о с т и з а р а з л и ч н и т е клинично-лабора-
т о р н и показатели. П р о б л е м ъ т при CAP про­
б и т е е, че т е с а лиофилизирани и м о г а т да
 п р о я в я т м а т р и ч е н е ф е к т при някои анали­
з а т о р и (Kodak Ektachem 400 или 700). Тези
ефекти п р е д с т а в я т а п а р а т а к а т о неточен
по о т н о ш е н и е н а ц е л е в а т а с т о й н о с т , без
т о й да е т а к ъ в .
С т а б и л н о с т . С т а б и л н о с т т а н а всички
к о м п о н е н т и н а една а в т о м а т и ч н а с и с т е ­
м а включва: р е а к т и в и преди у п о т р е б а , ре­
а к т и в и в процес н а у п о т р е б а , калибрацион-
н ни криви, с т а б и л н о с т н а анализирания по­
к а з а т е л . Т р а й н о с т т а н а р е а к т и в а опреде­
ля с т а б и л н о с т т а м у преди у п о т р е б а и мо­
ж е да бъде о т един месец до над една годи-
н на. По-дългият срок н а г о д н о с т е ж е л а т е ­
лен, т ъ й к а т о в с я к а н о в а п а р т и д а т р я б ­
в а д а с е о ц е н я в а спря*мо с т а р а т а . То­
з и процес н а оценка оскъпява д а д е н
т е с т , к о г а т о с р о к ъ т е по-къс. Н о в и т е
партиди трябва д а се калибрират и
д а се у т в ъ р д я тс качествен контрол.
След о т в а р я н е н а р е а к т и в и т е и п о с т а ­
в я н е т о им в а н а л и з а т о р а , с т а б и л н о с т т а
обикновено намалява, понякога значително.
Някои р е а к т и в и и з и с к в а т хладилен режим
за по-дълга с т а б и л н о с т , а някои а п а р а т и не
п о д д ъ р ж а т т а к ъ в . Други р е а к т и в и са със­
т а в е н и о т два к о м п о н е н т а , к о и т о се смес­
в а т и след комбинирането им т я х н а т а с т а ­
билност намалява. И з п а р е н и е т о или замър­
с я в а н е т о също н а м а л я в а т с т а б и л н о с т т а
на р е а к т и в и т е , поставени в анализатора.
Изхвърлянето н а реактиви преди
окончателното и м използване, което
с е н а л а г а п р и м а л к и серии, оскъпява
изследванията.
С т а б и л н о с т т а на калибрационните кри­
ви също касае ц е н а т а , к о г а т о се обсъжда за­
купуване на а н а л и з а т о р . К а л и б р а т о р и т е и
следващите ги к о н т р о л и у в е л и ч а в а т непа-
ц и е н т н и т е анализи и т е т р я б в а да се при­
б а в я т към ц е н а т а на т е с т а . С и с т е м а т а
а н а л и з а т о р / р е а к т и в се нуждае о т различи
срок на калибрация - о т няколко п ъ т и на ден
до веднъж н а 6 месеца.
Някои о т изследваните в е щ е с т в а са по-
М д а т л и в и на т е м п е р а т у р н и влияния и изис­
к в а т охлаждащи о т д е л е н и я за пробите, осо­
бено в големи серии. При с е г а ш н а т а т е н д е н ­
ция за малък обем н а п р о б а т а , проблем мо­
же да бъде н е й н о т о изпарение. Този въпрос
е решен при анализатори, при к о и т о серу­
м и т е са в отделение, п о к р и т о с капак с вгра­
дени е л е м е н т и Пелтие, к о е т о осигурява ох­
лаждане, п р е д о т в р а т я в а щ о изпарение и
к о н ц е н т р и р а н е н а биологичния м а т е р и а л
(Konelab).
Ca rry o v er. Пренасяне се появява к о г а т о
предишна проба, р е а к т и в или промивна во­
да повлиява следващите т е с т о в е о т една
серия. Това води до погрешно висок или ни­
сък р е з у л т а т . Най-забелижимо е, ако ана­
л и з и р а н а т а с ъ с т а в к а е в особено големи ко­
личества, к а т о напр. hCG н и в а т а по време
на бременност, к а к т о и силно оцветени ре­
а к т и в и (пикрат). Carryover при реактиви­
т е се появява и при с и с т е м и , ползващи ми­
ещи се кювети, к о г а т о последните не са доб­
ре и з м и т и след всяко о т ч и т а н е .
Наличието на пренасяне повишава невъз-
п р о и з в о д и м о с т т а на р е з у л т а т и т е . Измер­
в а н е т о му не е оправдано при приемливи дан­
ни за възпроизводимост. При необходимост
измерването на пренасянето може да се осъ­
щ е с т в и по два начина:
1. И м а л и п р е н а с я н е н а б и о л о г и ч е н льа-
т е р и а л ? Изследва се д в у к р а т н о серум с ви­
сока к о н ц ен тр ац и я (Hj и Нз), последвано о т
други две изследвания н а серум с ниска кон­
ц е н т р а ц и я ( Ц и Ьз). Пренасянето (К) се из­
числява в п р о ц е н т по формулата:
К% = L, - L2 100
h2-L2
К (%) т р я б в а да бъде < 1 -1.5%. При К > 5%,
п р е н а с я н е т о е значително.
2. И м а л и п р е н а с я н е н а р е а к т и в а ? С два
р е а к т и в а Р и С се изследва един и същ се­
рум, к а т о р е з у л т а т и т е са с ъ о т в е т н о Pj,
Рг» Ci, С2, Р3, Р4. Г р е ш к а т а в изследването
(К%) с р е а к т и в С, дължаща се на пренасяне
н а р е а к т и в Р се изчислява по формулата:
К% = С | " С 2 1 0 0
^2
Г р е ш к а т а в изследването (К%) с р е а к т и в
Р (анализ Р3) дължаща се н а пренасяне на ре­
а к т и в С се изчислява, к а к т о следва:
К% = • v *
Р4
П р о в е р к а т а се прави с биологичен м а т е ­
риал в о б л а с т т а н а р е ф е р е н т н и т е граници
и се п о в т а р я двукратно. Г р е ш к а т а може да
бъде положителна или негативна: о т н а с я се
до с ъ о т в е т н и т е два р е а к т и в а и може да се
399
onuma нейното о т с т р а н я в а н е (при някои соки;
анализатори), ако се промени подреждане­ • все по-малък обем н а п р о б и т е и р е а к т и ­
т о на р е а к т и в и т е в а п а р а т а . Г р е ш к а т а не вите;
бива да надхвърля 1.5%. • разширяване н а м е н ю т о особено за с м е т ­
к а н а лекарствени в е щ е с т в а , хормони и
Drift ( о т м е с т в а н е ) . О т м е с т в а н е т о мо­ имунологични маркери;
же съществено да повлияе разпределението
• н а м а л я в а н е н а в р е м е т о з а изследване,
на р е з у л т а т и т е в едно или две направления
респ. повишаване н а производителност­
(бидирекционална флуктоация). То се изчис­
та;
лява о т ц я л а т а с и с т е м а - анализатор + ре­
а к т и в и (оригинални) с т р и контролни м а ­ • по-висока разделителна о п т и к а с помощ­
териала, измерени 10 п ъ т и в продължение т а н а р е ш е т к о в и монохроматори и диод-
на един р а б о т е н ден, н а равни интервали. ни редове с полихроматичен анализ;
Мерило са еднопосочните (и за т р и т е ма­ • усъвършенствани п р о т о ч н и електроди;
териала) измервания. • подобрен с о ф т у е р , позволяващ по-добър
диалог с о п е р а т о р а по о тн о шен и е осигу­
ряване к а ч е с т в о т о , поддържане и диаг­
ТЕНДЕНЦИИ И ПЕРСПЕКТИВИ ностика;
В РАЗВИТИЕТО
• интегрирани модули з а а в т о м а т и ч н о о т ­
НА КЛИНИЧНО ХИМИЧНИТЕ
страняване на дефекти;
АНАЛИЗАТОРИ
• с и с т е м и за о б р а б о т к а н а д а н н и т е свър­
През последните години р а з в и т и е т о на кли- зани чрез и н тер ф ей с с ЛИС;
нично-химичните а н а л и з а т о р и включва • а в т о м а т и ч н и модули з а калибрация, раз­
т я х н о т о усъвършенстване в следните на­ реждане, п о в т о р н о изследване, поддържа-
Таблица 20.1. Експлоатационни възможности на някои клинично химични а н а л и з а т о р и
Анализатор H i t a c h i 911 S y n c h r o n СХ7 D i m e n s i o n R x L V i t r o s 950 K o n e l a b 60
Тестове/час 720 900 740-920 900 780
Меню 70 80 57 43 96
Методи върху борда 41 22 48 48 45 + 45
Отворени канали 41 24 10 45
Спешно внасяне на не да да след неограничен брой
проби пипетиране по всяко време
Проба (|л1) 2-35 3-69 3-35 10 2-15
Стабилност на 8 h до 30 дни 8 h до 30 дни 30 дни 7 до 30 дни 4 h до 30 дни
реактивите
Проби о т затво­ да не да не да
рени системи
Стабилност на 17 до 30 дни 8 h до 42 дни 3 месеца 3 до 6 месеца до 30 дни
калибрацията
Автокалибраиия да да
Ч е с т о т а на кач. 8h 8h 24 h
контрол 24 h по избор*
Автодилуция да да да не да
А в т о м а т , броене да да да не да
Кювети миещи се миещи се еднократни не еднократни
Оптика халоген с мо- ксенон с халоген с халоген с фил- халоген с
нохроматор монохроматор филтров карусел т р о в карусел филтров карусел
Интерфейс за CLAS
работа AccelNat LabTrack 950 АТ RS-232 или
Система за обра- Ethernet**
в разработка Qvantum IV Data Fusion Ektanet Workstation
ботка на д а н н и т е
Windows5" NT
^ на всеки 12-24 анализа или н а 12-24 h
бидирекционален подход
400
 не u сервиз;
• подобрения в е р г о н о м и я т а и дизайна, улес­
няващи р а б о т а т а н а о п е р а т о р а ;
• сливане н а големи фирми, произвеждащи
автоанализатори.
Н а й - р а з п р о с т р а н е н и клинично-химични
а н а л и з а т о р и с а с и с т е м и т е Hitachi (Roche),
Ektachem, Vitros, Synchron (Beckman),
Schimadzu (Corning), D i m e n s i o n (Dade) и
Paramax (Dade). П о в е ч е т о о т т е з и с и с т е ­
ми и м а т в ъ з м о ж н о с т з а ТЛА, р а з п о л а г а т с
интерфейс за роботизаиия, к а т о някои мо­
дели п р и т е ж а в а т и с и с т е м а з а о б р а б о т к а
н а и н ф о р м а ц и я т а ( т а б л . 20.1). О т т а б л и ц а ­
т а се вижда, че някои а н а л з а т о р и , к а т о
Konelab 60 не о т с т ъ п в а т н а посочените во­
дещи анализатори по отношение н а разглеж­
даните критерии.
ИЗЧИСЛЕНИЕ НА РЕЗУЛТАТА
ПРИ КЛИНИЧНО ХИМИЧНИ
АНАЛИЗАТОРИ
Н. А т а н а с о в
Много малко в е щ е с т в а в биологичните т е ч ­
н о с т и м о г а т д и р е к т н о да б ъ д а т измерени.
Повечето и з и с к в а т специфично химическо
модифициране, с к о е т о д а б ъ д а т превърна­
т и във в е щ е с т в а , ч и я т о абсорбция (и с ъ о т ­
в е т н о , к о н ц е н т р а ц и я ) може да се измери с
клинично-химичен а н а л и з а т о р чрез спектро-
фотометрия, колор име трия, турбидимет-
рия, нефелометрия и т . н . К о г а т о химичес­
к о т о модифициране се извършва бързо и хи­
м и ч н а т а реакция се и з т е г л я изцяло в дясно,
и з м е р в а н е т о не създава особени проблеми.
К о г а т о е необходимо повече време за прев­
ръщане н а и н т е р е с у в а щ о т о ни в е щ е с т в о в
удобна за измерване форма, к и н е т и к а т а н а
к о н к р е т н а т а х и м и ч н а р е а к ц и я определя
най-подходящото време з а измерване н а аб-
с о р б ц и я т а и изчисление к о н ц е н т р а ц и я т а на
в е щ е с т в о т о . С други думи, изчислението на
р е з у л т а т а зависи о т порядъка н а к и н е т и ­
к а т а на х и м и ч н а т а реакция. Въпреки че из­
числението н а р е з у л т а т а се извършва ав­
т о м а т и ч н о , п а р а м е т р и т е , к о и т о клинич-
но-химичният а н а л и з а т о р използва за кон­
т р о л над х и м и ч н а т а реакция следва добре
да се п о з н а в а т . Това ще позволи на лабора­
т о р н и я специалист да подобри измерване­
т о н а п о з н а т п о к а з а т е л или да създаде но­
ва а н а л и т и ч н а програма.
СКОРОСТ НА ХИМИЧНАТА РЕАКЦИЯ
С к о р о с т т а н а х и м и ч н а т а реакция се опре­
деля о т е н е р г и я т а н а а к т и в а ц и я , телг-
пература, присъствие н а активато­
р и и инхибитори в лштрикса и най-
вече, о т к о н ц е н т р а ц и я т а н а у ч а с т в а ­
щ и т е в е щ е с т в а . Следователно, при добре
дефинирани условия, с к о р о с т т а н а химич­
н а т а реакция може да служи за измерване
на к о н ц е н т р а ц и я т а на и н т е р е с у в а щ о т о ни
вещество. С к о р о с т т а на х и м и ч н а т а реак­
ция (v) се измерва чрез п р о м я н а т а (А - дел­
та) в к о н ц е н т р а ц и я т а (сопс), т . е . промя­
н а т а в аб со р б ц и я та на п р о д у к т а (продук­
т и т е или р е а г и р а щ и т е вещества), за опре­
делен о т р я з ъ к о т време (t):
V = Дсопс/At
Различните химични реакции не п р о т и ­
ч а т с еднаква скорост. Освен т о в а , в много
случаи с к о р о с т т а по време н а една и съща
химична реакция може да се променя с т е ­
чение на в р е м е т о и з а в и с и м о с т т а между
продукт (абсорбция) и време да описва слож­
н а крива. М а т е л г а т и ч е с к и я т а н а л и з
н а т а к и в а криви и тяхното графич­
н о п р е д с т а в я н е л ю Ж е д а д а д е н а спе­
циалиста ценна инфорлшция з а най-
подходящото в р е м е з а излгерване н а
абсорбцията, т а к а че д а се осигури
адекватно изчисление н а резултата.
АНАЛИТИЧЕН ХОД НА К Р И В И Т Е
В ЗАВИСИМОСТ ОТ КИНЕТИКАТА
НА ХИМИЧНАТА РЕАКЦИЯ
Измерване чрез крайно о т ч и т а н е
(endpoini)
Измерване чрез крайно о т ч и т а н е се прила­
га в случаите, к о г а т о химическата модифи­
кация на и н т е р е с у в а щ о т о ни вещество се
401
 -4 Инкубация

Време (t)
фиг. 20.5. Измерване чрез крайно о т ч и т а н е {no Technicon)
Две измервания (1, 2) определят абсорбцията на реактива. Прибавянето на серум (Ф) с т а р т и р а химичната
реакция, която за кратко време превръща цялото количество измервано вещество в продукт. Нови две
измервания (3, 4) потвърждават, че платовидната ч а с т о т кривата е д о с т и г н а т а {реакцията е изтеглена
в дясно). Промяната в абсорбцията (на ордината) за даден инкубационен период {време - на абсцисата) се
използва за изчисление на р е з у л т а т а с помощта на калибрационен фактор и уравнение, които са заложени
в микропроцесора на анализатора.

\ проба

ДЛ проба

ю
а
с.
оо
ю
<

Л "празна проба'

Време (t)
Фиг. 20.6. Измерване чрез крайно о т ч и т а н е е „празна проба" {no Technicon)
Две измервания (1, 2) определят абсорбцията на реактива. Прибавянето на серум (Ф) променя абсорбцията.
Две измервания (3, 6) показват абсорбцията на „празната проба". Крайната абсорбция се измерва с две
отчитания (4, 5). ДА, к о я т о служи за изчисление на р е з у л т а т а с п о м о щ т а на калибрационен фактор, е
разликата между крайната абсорбция и абсорбцията на „празната проба".

извършва бързо и р е а к ц и я т а изцяло се из­ с прибавения серум, а след т о в а к р а й н а т а аб­

т е г л я в дясно. Ако прибавянето н а серум не
променя значимо о п т и ч н а т а п л ъ т н о с т , из­
числението на р е з у л т а т а с т а в а о т измер­
ване н а а б с о р б ц и я т а н а р е а к т и в а преди
добавяне на серума и на к р а й н а т а абсорбция,
след завършване на модификацията (фиг. 20.5).
Ако прибавянето н а серум към р е а к т и в а
променя абсорбцията, наложително е изпол­
зването на „празна npoöd1, т . е . първо се о т ­
ч и т а абсорбцията н а р е а к т и в а и след т о в а
се о т ч и т а абсорбцията на реактива заедно
402
сорбция (двуточково о т ч и т а н е ) - фиг. 20.6.
Използването н а „празна проба" може да
се замени с бихроматично о т ч и т а н е . Изчис­
л я в а н е т о н а р е з у л т а т а се извършва по схо­
ден начин, к а т о в м е с т о а б с о р б ц и я т а н а
„празната проба" се о т ч и т а абсорбцията
при втората дължина на в ъ л н а т а и с ъ о т ­
в е т н и я бихроматичен ф а к т о р .
Ако химическото модифициране изисква
два реактива, к р и в а т а се оказва стъпаловид­
на, с т р и инкубационни периода (фиг. 20.7).
 6 7

3
-

ю
о—

II Иикубакин III Иикубацня

Време (t)

20.7. Измерване чрез крайно от ч и тан е с два реактива {no Technicon)

Две измервания (1, 2) определят абсорбцията на първия реактив. Прибавянето на серум (Ф) променя абсорбци­
я т а . Две измервания (3, 4) показват абсорбцията в края на първия инкубационен период. Абсорбцията след
прибавяне на втория реактив (5) отразява края на в т о р а т а инкубация. Две отчитания (6, 7) измерват край­
н а т а абсорбция след т р е т а т а инкубация. ЛА, която служи за изчисление на резултата с помоща на калибра-
ционен фактор, е разликата между крайната абсорбция (отчитане 6, 7) и абсорбцията при о т ч и т а н е 5.

ИзмерВане kuiiemuka о т нулев порядък кой о т р я з ъ к о т време. Именно т о й се из­

^zero-order)
Посочените до сега примери се о т н а с я т до
химични реакиии, при к о и т о и е л и я т про­
д у к т се модифицира д о с т ъ ч н о бързо, реак­
ц и я т а о т и в а до край и а в т о м а т и ч н о т о о т ­
ч и т а н е не създава проблеми. При измерване
н а ензимна а к т и в н о с т обаче, х и м и ч н а т а ре­
акция не о т и в а до край поради инхибиране-
т о ü о т н а т р у п а н и я п р о д у к т , или поради
изчерпване н а с у б с т р а т а . При други реак­
ции, к о и т о п р о т и ч а т много бавно се изиск­
ва друг подход, з а да се направи измерване­
т о подходящо з а а в т о м а т и з и р а н е . При
ч а с т о т т е з и случаи, скоростта на превръ­
щане на в е щ е с т в о т о може да послужи за из­
мерване н а концентрация или активност.
Лко за всеки еднакъв о т р я з ъ к о т време
се получава еднакво к о л и ч е с т в о п р о д у к т
( о т ч е т е н по абсорбцията), з а в и с и м о с т т а
между време и п р о д у к т , т . е . с к о р о с т т а ,
описва п р а в а л и и и н . В т е з и случаи ско­
р о с т т а (Дсопс/Л1) е п о с т о я н н а величина
( п р о м я н а т а в с к о р о с т т а е нула), а к и н е т и -
к а т а на х и м и ч н а т а реакция е о т н у л е в по­
рядък. При повечето химични реакции ки-
н е т и к а т а е о т нулев порядък само през ня­
ползва при съвременните анализатори за ки­
н е т и ч н о о т ч и т а н е , т ъ й к а т о т о г а в а ско­
р о с т т а е пропорционална н а концентрация
или а к т и в н о с т . Например, а к т и в н о с т т а на
много ензими се измерва по „началната ско­
рост", т . е . в праволинейния у ч а с т ъ к на кри­
в а т а , к о г а т о к и н е т и к а т а е о т нулев поря­
дък, а не к о г а т о с к о р о с т т а намалее и кри­
в а т а с т а н е платовидна (фиг. 20.8).
К а р т и н а т а е малко по-различна при ен­
зими, ч и я т о а к т и в н о с т се определя по ско­
р о с т т а на окисление на редуциран никоти-
намид аденин динуклеотид или тринуклео-
mug (NADIP и NADPn + ), при к о е т о абсорб­
ц и я т а при 340 п т намалява. Колкото по-ви-
сока е а к т и в н о с т т а , т о л к о в а по-стръмно
спада о п т и ч н а т а п л ъ т н о с т . При много ви­
сока а к т и в н о с т на ензима, с у б с т р а т ъ т мо­
же да се изчери още в началото н а измерва­
н е т о , след к о е т о с к о р о с т т а може рязко да
се намали. Тогава осреднената с т о й н о с т на
ДА/min би се оказала много ниска. Следова­
т е л н о , последицата от бързото изчерпване
на субстрата е фалшиво нисък резултат
за проба, която има много висока актив­
ност. За п р е д о т в р а т я в а н е н а подобни слу­
чаи може да се предвиди една граница с ми-
403
 Преиику- Време иа измерване
бация

Време (t)

Фиг. 20.8. Kimemuka о т нулев порядък - изчисление на резултат о т колориметрично измерване

на ензимна активност {алкална фосфатаза, g-глутамилтрансфераза), no Technicon
Три измервания на абсорбцията на реактива (1, 2, 3) о т ч и т а т у ч а с т и е т о на неспецифична хидролиза на
субстрата, която се изключва о т изчислението. Прибавянето на серум (Ф) с т а р т и р а ензимната хидролиза
на субстрата. След кратко изчакване {0.5-2 min за определяне на ензимна активност с клинична значимост)
скоростта с т а в а постоянна и промяната на абсорбцията за м и н у т а (AA/min) се изчислява о т няколко
измервания {4-12) през равни интервали {15-30 sec). Промяната в абсорбцията (ордината) спрямо единица
време (абсциса) очертават участък о т права линия, който се използва за измерване на ензимната акт ивнос т
съгласно уравнението заложено в микропроцесора на анализатора.
А - серум с висока ензимна а к т и в н о с т
Б - серум с ниска ензимна а к ти вн о ст
В - неспецифична хидролиза на с у б с т р а т а

нимално допустима концентрация на субс­ прогресивно намалява, т . е . с к о р о с т т а по

т р а т а {граница на изчерпване на субстра­
та). Ако о п т и ч н а т а п л ъ т н о с т спадне под
т а з и граница в предвиденото за измерване
време, р е з у л т а т не се изчислява и операто­
р ъ т следва да направи ръчна или автома­
тична разредка на т а з и проба (фиг. 20.9).
В действителност кинетиката на мно­
го ензимни, антиген-антитяло и други ре­
акции не е о т нулев порядък, но времето за
измерване т а к а се подбира, че т о да се из­
върши само в праволинейния участък.
Измерване к и н е т и к а
о т първи п о р я д ъ к
Скоростта на някои химични реакции е т а ­
кава, че очертаната крива изобщо няма пра­
волинеен участък. Когато за всеки еднакъв
отрязък о т време, образуваният продукт
404
време на една и съща химична реакция неп­
рекъснато намалява, се очертава крива на
кинетика от първи порядък. Общият прин­
цип на измерване е привидно разделяне на
кривата на множество малки отрязъци о т
време, в които с к о р о с т т а се апроксимира
към постоянна. Микропроцесорът на ана­
лизатора извършва изчисленията к а т о ос­
реднява с к о р о с т т а о т м н о ж е с т в о т о отря­
зъци о т време (фиг. 20.10).
Получаването на надеждни р е з у л т а т и
при кинетика о т първи порядък изисква за­
дължително използване на калибратор с ви­
сока концентрация. Именно т а з и концент­
рация показва д о п у с т и м а т а горна граница
за измерване. Над неговата концентрация
измерването не може да се с ч и т а за надеж­
дно (фиг. 20.11).
 Време (t)
Ф и г . 20.9. К и н е т и к а о т нулев порядък (лактатдехидрогеназа, глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа) с
к о н т р о л над изчерпването на с у б с т р а т а ( о т ч и т а н е на 340 пт, бихроматична корек­
ция н а 380 пт), no Technicon
Едно измерване н а 340 п т (1) о т ч и т а н а ч а л н а т а к о н ц е н т р а ц и я на NADH* (или NADPH *). Две измервания на
а б с о р б ц и я т а на р е а к т и в а (2, 3) о т ч и т а т у ч а с т и е т о на неспецифичната хидролиза на с у б с т р а т а , к о я т о се
изключва о т изчислението. П р и б а в я н е т о на серум (Ф) с т а р т и р а е н з и м н а т а хидролиза на с у б с т р а т а . След
к р а т к о изчакване (0.5 - 2 min за определяне на ензимна активност с клинична значимост) с к о р о с т т а с т а в а
п о с т о я н н а и п р о м я н а т а на а б с о р б ц и я т а з а м и н у т а (ЛА/min) се изчислява о т определен брой измервания {в
случая - 9) през равни и н т е р в а л и (15-30 sec). Консумираният с у б с т р а т се изчислява о т абсорбцията о т ч е ­
т е н а в т о ч к а 3 - о т ч е т е н о т о в т о ч к а 1 + бихроматичен ф а к т о р ( о т ч е т е н о в т о ч к а 4 - о т ч е т е н о т о в т о ч к а
1). Той т р я б в а д а е по-малък о т з а д а д е н а т а с т о й н о с т за граница на изчерпване. В п р о т и в е н случай резул­
т а т не се о т п е ч а т в а . Абсорбцията на 340 п т (А340) о т р а з я в а е н з и м н а т а а к т и в н о с т , а абсорбцията при 380
п т (AJg0) служи з а изчисляване на бихроматичния ф а к т о р .

ДЛ калиОра юр
АД калибратор

з
ю ДЛ проба
о,
оо
ю
<

ДЛ реактив

Концентрация
Време (t)
Ф и г . 20.10. К и н е т и к а о т първи порядък ( п о ф и г . 20.11. Зависимост между ДА на „празна"
Technicon) (blank), ДА на проба и ДА на калибратор при из­
Две измервания (1, 2) с л у ж а т за изчисление промяна­ мерване на к и н е т и к а о т първи порядък ( п о
т а (доколкото я има) в абсорбцията на р е а к т и в а (АЛ Technicon)
на „празната"за реактив). Прибавянето на серум (Ф) ЛА на п р о б а т а т р я б в а винаги да е по-малка о т ЛА
с т а р т и р а п ъ р в а т а инкубация з а стабилизиране на на калибратора.
с к о р о с т т а (0.5-2 min). Две измервания (3, 4) опреде­
л я т началния наклон на к р и в а т а и още две (5, 6) в края
на в т о р а т а инкубация. За изчисление на р е з у л т а т а
се използва р а з л и к а т а между ЛА на п р о б а т а и ЛА на
р е а к т и в а о т н е с е н а спрямо ЛА на калибратора.
405
К б а д р а т и ч н а к и н е т и к а (quadratic)

Кбадратична кинетика и м а т някои реакщш

на свързване на антиген е антитяло при иму-
нометричните анализи. В т е з и случаи, ско
р о с т т а на реакцията е особено чувствител­
на към оптимално съотношение между кон-
центраииите на антиген и антитела. При
нефелометрично измерване, скоростта на об­
разуване комплексите антиген-антитяло мо­
же да е ниска както при излишък на антиген,
така и при излишък на антитела, което е
чест източник на фалшиви резултати.
Квадратичната кинетика се характери­
зира с нарастваищ с времето скорост при
ниски концентрации и с прогресивно намаля­
ване на скоростта при високи концентрации
на интересувашото ни вешество {конкавна
крива при ниски концентраиии и конвексна - •
Време (t)
при високи). Изчисление на резултати о т по­
добна кинетика изисква поне 9 измервания, Фиг. 20.12. Кбадратична кинетика (no Technicon)
Аналитичният вид на з а в и с и м о с т т а се добива о т
за да се очертае аналитичния вид на крива­
поне 9 измервания. Показани са криви о т различни кон-
т а (фиг. 20.12). иентраиии на определяното вещество: А - ниска кон-
центраиия, В - еквивалентна кониентраиия, Е - висо­
Заключение. На практика рядко се налага ка кониентраиия.
лабораторният специалист да проучва пара­
метрите за контрол над химичната реакция, тел, л а б о р а т о р н и я т с п е ц и а л и с т след­
които неговият анализатор предоставя и ко­ в а д а п р о у ч и к р и в а т а , п о л у ч е н а о т из­
и т о са описани във фирменото ръководство. м е р в а н е т о н а м е Ж д и н н и т е абсорбции
При неудачи, внедряване н а набори о т и с л е д т о в а д а прецен и необходимост­
д р у г а фирма, основани н а д р у г п р и н ц и п т а от корекции в зададените пара-
или създаване п р о г р а м а з а н о в показа- Aiempu н а а н а л и з а т о р а .

КНИГОПИС

Burtis СА, Painter CP. Analytical Systems for the clinical
laboratory. Am Clin lab, 8, 1989, 2, 14-19.
Burtis CA, Painter CP. Analytical Systems. Am Clin Lab 8 1989
3, 43-49.
DuPont АСА IV product brochure, DuPont EI de Nemours and
company, Incorporated, Wilmington, 1990.
Maggiore JA, Williams RH. Automation in the c h e m i s t r y
laboratory. In: Schoeff LE, Williams RH (eds). Laboratory
instruments. St. Louis - Baltimore - Boston - Chicago -
London - Philadelphia - Sydney - Toronto, Mosby - Year
Book Inc, 1993, 275-335.
Technicon Dax product brochure. Technicon Instruments
corporation, a subsidiary o f Miles Inc, NY, Tarrytown, 1 9 9 0 .
Williams RH, Maggiore JA. Automation in immunochemistry.
In: Schoeff LE. Williams R H (eds). Laboratory instruments.
St. Louis-Baltimore-Boston-Chicago-London-Philadelphia-
Sydney-Toronto, Mosby-Year Book, Inc, 1 9 9 3 , 3 1 4 - 3 3 5 .
Willis B. Analytical chemistry instrumentation and systems: A
view to the future. International Laboratory, 1 2 , 1 9 9 5 , 1 1 - 1 6 .
• • •
Цонев Д (ред). ХИМИЯ, София, 1 9 8 7 , Наука и изкуство, 7 4 - 9 1 .

Suddendorf L. Automated techniques. In: Bishop ML, Duben- Bresnick S. General Chemistry. Baltimore-Philadelphia etc,
Engclkirk JL, Fody EP (eds). Clinical chemistry (2 nd ed). Williams & Wilkins, 1 9 9 6 , 8 1 - 8 6 .
Philadelphia, Lippincott comp., 1993, 134-150. Reference Manual, Technicon R A - 1 0 0 0 ™ System. Technical
Publications, 1985.

406
 АВТОМАТИЗАЦИЯ
НА БЕЛЯЗАНИТЕ
С НЕРАДИОИЗОТОПНИ МАРКЕРИ
ИМУНОХИМИЧНИ МЕТОДИ
А. Ц о н ч е в а
Една о т п о с л е д н и т е о б л а с т и 6 клинична­
т а л а б о р а т о р и я , к о я т о беше а в т о м а т и ­
з и р а н а е и м у н о л о г и я т а . След 7 0 - т е години,
к о г а т о се р а з в и в а н е р а д и о и з о т о п н а т а
имунохимична т е х н и к а , з а п о ч в а п о с т е п е н ­
н о т о а в т о м а т и з и р а н е п ъ р в о н а имуноен-
з и м н и т е м е т о д и . През 8 0 - т е години започ­
на а в т о м а т и з и р а н е т о н а нерадиоизотоп-
ни т е х н и к и с ф л у о р е с ц е н т н а д е т е к ц и я .
П о с л е д н о т о д е с е т и л е т и е н а 20. век щ е ос­
т а н е в историята на лабораторната тех­
ника к а т о най-големия бум в р а з в и т и е т о
н а имунохимичния анализ, с п о я в а т а н а
високоефективни и ч у в с т в и т е л н и , нови,
силно кон к уриращи с е т е х н о л о г и и , включе­
ни в н а й - с ъ в р е м е н н и а н а л и з а т о р и . Т а з и
н а д п р е в а р а беше п р е д и з в и к а н а о т необхо­
д и м о с т т а з а бързи, с висока ч у в с т в и т е л ­
н о с т и ефективност апарати, к о и т о да
о т г о в а р я т на изискванията на високите
т е х н о л о г и и , н а р о б о т и з и р а н е т о н а лабора­
т о р н а т а д е й н о с т и н а в н е д р я в а н е т о н а ла­
б о р а т о р н и информационни с и с т е м и . Ня­
колко п у н к т а т р я б в а ш е д а се п р е о д о л е я т
при а в т о м а т и з и р а н е т о н а белязаната
имунохимична т е х н и к а :
1. Д а се прецени дали х о м о г е н н и я т принцип
е п о - е ф е к т и в е н з а а в т о м а т и з а ц и я . Оче­
видно е, че т о й беше по-лесен при с т а р и ­
т е технологии н а използваните н а т о в а ­
рени с а н т и т е л а п о в ъ р х н о с т и . Навлиза­
н е т о н а м и к р о ч а с т и ц и т е о т различен
вид и в ъ з м о ж н о с т т а з а с е п а р и р а н е и про­
м и в а н е з а време, о т п о р я д ъ к а н а секунди
показа, че х е т е р о г е н н и я т а н а л и з с ъ щ о
много успешно м о ж е д а бъде а в т о м а т и ­
зиран.
2. Н а д п р е в а р а и м а ш е във в и д о в е т е м а р к е ­
ри - е н з и м и , със с в о и т е н е д о с т а т ъ ц и ,
лантаниди и други лумипофори с
големите предимства, к о м б и н а ц и и о т
ензимно с т и м у л и р а н и флуоресцен­
ц и и и хелгилулшнесценции.
3. Избор н а о т ч и т а щ и с и с т е м и в зависи­
м о с т о т принципите.
4. Начин н а калибрация и к о н т р о л - изклю­
ч и т е л н о в а ж е н м о м е н т о т гледна т о ч к а
на ефективност и качество.
5. Р а з в и т и е т о н а к о м п ю т ъ р н и т е т е х н о ­
логии позволи използване н а много с т а ­
билни к о н т р о л и р а щ и и коригиращи про­
г р а м и н а всяко с т ъ п а л о н а а в т о м а т и ч ­
н а т а т е х н и к а , к о е т о доведе до непре­
с т а н е н напредък.
6. Н а й - т р у д н и я т м о м е н т се о к а з а с к о р о с т ­
т а н а определяне поради н е о б х о д и м о с т
о т и н к у б а ц и я з а и м у н о л о г и ч н и т е реак­
ции. Но и т о з и м о м е н т беше преодолян,
все още при м а л ъ к брой (за сега) анализа­
тори.
При разглеждане п р и н ц и п и т е н а имуно-
х и м и ч н и т е анализи (виж. гл.13) с а посоче­
ни х а р а к т е р и с т и к и т е н а о с н о в н и т е гру­
пи м е т о д и . Поради г о л е м и я т брой имуно-
химични а н а л и з а т о р и н а най-различни про­
изводители, щ е се о п и т а м е д а с и с т е м а т и ­
з и р а м е и н ф о р м а ц и я т а к а т о разгледаме ос­
новни групи а п а р а т и , разделени по о т н о ­
шение н а м а р к и р а н е т о и д е т е к ц и я т а - ен­
зимно маркиране, ф л у о р е с ц е н т н а д е т е к ц и я
( и н д и р е к т н а и д и р е к т н а ) , хемилуминесцен-
ция (индиректна и директна), електрохе-
милуминесценция. О с н о в н и т е и а к т у а л н и
в м о м е н т а а в т о м а т и ще б ъ д а т характе­
ризирани по 19 п у н к т а , д а в а щ и п р е д с т а в а
з а т е х н и т е к а ч е с т в а . К ъ м всяка група с а
добавени и други а п а р а т и с подобна т е х ­
нология, о т различни производители. На­
пълно а в т о м а т и з и р а н и т е а н а л и з а т о р и с а
о т т и п а „ з а т в о р е н а с и с т е м а " , т . е . реак­
т и в и т е се п р е д л а г а т в п а к е т или п о о т д е л ­
но с а м о з а с ъ о т в е т н и я а п а р а т . Това пред­
полага г а р а н т и р а н о к а ч е с т в о н а р е а к т и -
407
6ume u с ъ о т в е т н о висока а н а л и т и ч н а н а -
ge^kg^0^1^1 методите.
О х а р а к т е р и з и р а н о т о н а о т д е л н и т е гру­
пи и м у н о а н а л и з а т о р и в к л ю ч в а с л е д н и т е
к р и т е р и и : принцип н а имунохимичния
анализ, вкл. и няк о и д о п ъ л н и т е л н и х а р а к ­
т е р и с т и к и ; т в ъ р д а фаза; маркер; к ю в е т и ,
т е м п е р и р а н е ; сепарация; д е т е к ц и я ; селек-
т и в н о с т ; ч у в с т в и т е л н о с т ; калибрация;
брой т е с т о в е н а диска и начин н а съхране­
ние - с или без охлаждане; брой проби н а дис­
ка; време з а инкубация и н а получаване н а
р е з у л т а т ; съхранение н а данни; възмож­
н о с т з а спешни проби; т е с т о в о меню; пре­
д и м с т в а ; н е д о с т а т ъ ц и и други.
АНАЛИЗАТОРИ
НА ИМУНОЕНЗИМЕН ПРИНЦИП
B o e h r i n g e r M a n n h e i m E S 300 и 600
S y s t e m ( R o c h e D i a g n o s t i c s ) , 1991 г.
Принцип. Автоматизиран хетерогенен
имуноензимен анализ, н а к о н к у р е н т е н и не­
к о н к у р е н т е н принцип.
Т в ъ р д а т а ф а з а е п о к р и т и със с т р е п т а -
видин е п р у в е т к и и б и о т и н и з и р а н и а н т и ­
тела.
Маркер. Използва се пероксидаза със субс­
т р а т ABTS.
Кювети. О т ч и т а н е т о с т а в а в работни­
т е кювети, които са еднократни.
Т е м п е р и р а н е т о е с а м о в инкубационния
блок.
С е п а р а ц и я . П р о м и в а т се ф и к с и р а н и т е
комплекси по с т е н а т а н а е п р у в е т к и т е .
О т ч и т а н е . О т ч и т а се к о л о р и м е т р и ч н а
р е а к ц и я при К = 433 п т с и н т е р ф е р е н т е н
ф и л т ъ р н а т е м п е р а т у р н о к о н т р о л и р а н фо­
тометър.
С е л е к т и в н о е т . А н а л и з а т о р ъ т е о т селек­
тивен т ип.
Ч у в с т в и т е л н о с т т а е к а к т о при имуно-
е н з и м н и т е реакции
К а л и б р а ц и я . О с ъ щ е с т в я в а се с пълна кри­
ва при всяка серия.
Брой т е с т о в е . На реактивния р о т о р има
12 позиции з а т е с т о в е и 3 д о п ъ л н и т е л н и -
2 з а с у б с т р а т и един з а п о ч и с т в а щ р а з т -
408
вор. Н я м а о х л а д и т е л н а с и с т е м а .
Брой п р о б и н а диска. Инкубационният
р о т о р и м а 160 м е с т а з а с т р е п т а в и д и н о в и
епруветки.
В р е м е з а инкубация. Инкубацията е о т
30 до 90 m i n в з а в и с и м о с т о т вида н а т е с ­
товете.
С ъ х р а н е н и е н а д а н н и . К о н т р о л и р а се о т
компютърна външна система.
В ъ з м о ж н о с т з а с п е ш н и п р о б и . Не при­
т е ж а в а т а к а в а възможност.
Т е с т о в о т о м е н ю се с ъ с т о и в определяне
н а хормони о т щ и т о в и д н а т а жлеза, а н т и -
т и р е о и д н и а н т и т е л а , р е п р о д у к т и в н и хор­
мони, ф е р и т и н , т у м о р н и м а р к е р и и доказ­
в а н е н а н я к о и инфекции.
П р е д и м с т в а . В н а с т о я щ и я м о м е н т ня­
м а т а к и в а . Ф и р м а т а и м а н о в а версия н а
съвременен принцип.
Н е д о с т а т ъ ц и т е с а в т е х н о л о г и я т а (мал­
к а ч у в с т в и т е л н о с т ) , х е т е р о г е н н и я анализ
и в р е м е т о з а инкубиране, м а к р о к о л и ч е с т -
ва на реактивите.
Други. П р е д с т о и спиране п р о и з в о д с т в о т о
на реактиви за т о з и анализатор.
Н а и м у н о е н з и м е н п р и н ц и п с а и следни­
т е анализатори:
• IMMUNO I н а BAYER D i a g n o s t i c s (ех
T E C H N I C O N ) (1993 г.) - А в т о м а т и ч е н ,
флексибилен е н з и м е н а н а л и з а т о р о т най-
висока класа. При него се и з п о л з в а т м а г ­
нитни частици, натоварени с а н т и т е ­
л а и АФ к а т о у н и в е р с а л е н м а р к е р . И м а
в ъ з м о ж н о с т з а а д а п т и р а н е н а 50 различ­
ни с у б с т р а т а н а АФ и к о л о р и м е т р и ч н а
д е т е к ц и я . Също т а к а и м а а д а п т и р а н и
методи с латекс аглутинация и турби-
д и м е т р и я . С ч и т а се з а п р е д и м с т в о са-
м о п р о м и в а н е т о н а к ю в е т и т е н а диска и
м н о г о к р а т н о т о и м ползване.
• C o b a s Core, t h e R o c h e I m m u n o a s s a y
S y s t e m . Този а в т о м а т и ч е н а н а л и з а т о р
е п о з н а т о т 1992 г. Висока т е х н о л о г и я с
а к т у а л е н з а в р е м е т о си принцип - н а т о ­
варени с а н т и т е л а п л а с т м а с о в и т о п ч е ­
т а , пероксидаза к а т о м а р к е р и с у б с т р а т
т е т р а м е т и л б е н з и д и н (ТМВ), к о л о р и м е т ­
рична д е т е к ц и я .
• Becton Dickinson Affinity Immuno-
 a s s a y S y s t e m (1991 г.) И м у н о е н з и м е н
а н а л и з а т о р , к о н с т р у и р а н н а имуноензи­
мен принцип, използва т е т р а м е т и л б е н -
зидин и водороден прекис к а т о с у б с т р а т
н а пероксидазна реакция. Колориметрич-
н а д е т е к ц и я при 450 п т .
• B i o t r o l S y s t e m 7000(1991 г.) А в т о м а т и ­
чен а н а л и з а т о р н а принципа н а ELISA с
използване н а м а г н и т н и ч а с т и ц и , н а т о ­
варени с а н т и т е л а , АФ к а т о м а р к и р а щ
ензим и п а р а н и т р о ф е н и л ф о с ф а т к а т о
с у б с т р а т , с колориметрична д е т е к ц и я .
• MAGIA 7000 I m m u n o a n a l y z e r п а ф и р -
л ш т а M E R C K (1994 г.) Р а з р а б о т е н е н а
принципа н а ензим-зависим имуноанализ
с АФ к а т о м а р к и р а щ ензим и p-NPP к а т о
с у б с т р а т . Осигурено е а в т о м а т и ч н о из­
мерване н а т р и дължини (405, 450 и 605
п т ) з а изключване н а интерференция.
• D a g e B e h r i n g предлага хетерогенен
имуноензимен а н а л и т и ч е н л ю д у л
к ъ м D i m e n s i o n ILvL клинично-химичен
анализатор. Касае се з а нов подход - ин­
т е г р и р а н е н а имунохимични м е т о д и към
клинично-химични с и с т е м и з а р у т и н н а
диагностика. Технологията на имунохи-
мичния анализ е р а з р а б о т е н а на принцип
о т 1987 г., при к о й т о се и з п о л з в а т маг­
н и т н и ч а с т и ц и о т хромиев двуокис
(СгОг) с д и а м е т ъ р о т около 5 ц т , н а т о ­
варени с а н т и т е л а . Приложението на т а ­
зи т е х н о л о г и я е о с ъ щ е с т в е н о през 1999
г. с р а з р а б о т в а н е т о н а новия модул кли­
нично химичен а н а л и з а т о р , посочен по-
горе. К а т о маркери се и з п о л з в а т б е т а -
г а л а к т о з и д а з а или АФ със с у б с т р а т и ,
развиващи ц в е т н а реакция. Използва се
ф о т о м е т р и ч н а т а с и с т е м а н а анализа­
т о р а за д е т е к ц и я и н а имунологичните
анализи.
Всички посочени а п а р а т и и м а т близки
по вид т е с т - н а б о р и - з а тиреоидни и реп­
р о д у к т и в н и хормони, т у м о р н и м а р к е р и ,
зърдечни маркери, различни инфекции (най-
4 е с т о х е п а т и т ) и някои л е к а р с т в а (дигок-
зин).
ИМУНОХИМИЧНИ АНАЛИЗАТОРИ
НА ИМУНОФАУОРЕСЦЕНТЕН
ПРИНЦИП
A b b o t t AxSYM (Abbott Labs. North Chi-
e a g o , IL), 1993 г. Напълно а в т о м а т и з и р а н
селективен имунохимичен а н а л и з а т о р .
Принцип. А н а л и з а т о р ъ т е конструиран на
б а з а т а на т р и технологични принципа - хе­
терогенен микрочастичков ензимен имуно­
анализ (MEIA), йон-свързана имуноанали-
тична технология (ICIA), к а к т о и хомоге­
нен флуоресиентно поляризационен имуно­
анализ (FPIA). Два о т посочените т е х н о ­
логични принципа (MEIA) - за анализ на го­
леми молекули в ниски концентрации и FPIA
- за анализ на к о мп о н ен ти с ниска молекул­
н а маса) са използвани при м а л к и т е серий­
ни анализатори на ф и р м а т а Abbott - IMx,
TDx и TDxFLx System.
TB'bpcja ф а з а . При MEIA принципа а н т и ­
т е л а т а са фиксирани върху микрочастици.
Използва се р а з т в о р о т суспендирани ла-
т е к с ч а с т и ц и с размери под 1 микрон. Те са
о б в и т и о т с в ъ р з в а щ и т е молекули, специ­
фични за показателя, ч и я т о концентрация
ще се о т ч и т а . Е ф е к т и в н а т а повърхност­
на площ н а м и к р о ч а с т и ц и т е повишава ки-
н е т и к а т а н а анализа и намалява инкуба­
ционното време. При флуоресцентно поля-
ризационния анализ не се използва т в ъ р д а
фаза за фиксиране н а а н т и т е л а т а (вж. гла­
ва 13).
М а р к е р и - алкална ф о с ф а т а з а при т р и т е
вида технологии със с у б с т р а т 4-метилум-
белиферил ф о с ф а т (4MUP).
К ю в е т и - използват се специални п л а с т ­
масови реакционни с ъ д ч е т а , разположени
върху карусел с к а п а ц и т е т 90 броя. Всяко
реакционно съдче е за е д н о к р а т н а у п о т р е ­
ба. Н а к а п в а н е т о н а р е а к т и в и т е и проба­
т а се извършва в отделни гнезда н а съдче-
т о , след к о е т о с него се процедира индиви­
дуално, според специфичния за анализа про­
токол, к о е т о г а р а н т и р а к а ч е с т в о т о на ре­
зултатите.
Т е м п е р и р а и е - вградено регулиращо у с т ­
р о й с т в о контролира и наглася т е м п е р а т у ­
р а т а н а инкубационния блок, н а разтвори­
т е и ф о т о м у л т и п л е т н а т а т р ъ б а ; поддър­
ж а се средно 33.97 0С в а п а р а т а и 37 0С в
409
инкубационния блок.
С е п а р а ц и я - за сепариране н а т е ч н а т а фа­
за се използват специални к ю б е т и съдър­
жащи м а т р и к с о т с т ъ к л е н и фибри. Реак­
ционната смес се прехвърля бърху и н е р т ­
н и т е с т ъ к л е н и фибри н а м а т р и к с а . Осъ­
щ е с т в я в а се необратимо свързване н а мик-
р о ч а с т и ц и т е и образуваните имунни ком­
плекси се з а д ъ р ж а т о т с т ъ к л е н и т е фибри,
д о к а т о реакционната смес преминава бър­
зо през широките пори н а м а т р и к с а . При
йон свързания имунен анализ (ICIA) се из­
ползват йонни взаимодействия между о т ­
рицателно н а т о в а р е н р е а к т и в и положи­
те л н о н а т о в а р е н м а т р и к с .
Д е т е к ц и я - при MEIA и 1С1Л се о т ч и т а флу­
оресценция н а флуорогенния 4MUP. Възбуж­
д а н е т о с т а в а при 365 п т , а емисия - при
448 п т на фотодиоден д е т е к т о р след фил­
т р и р а н е на р а з с е я н а т а светлина. При FPIA
се о т ч и т а флуоресцентна поляризация. Тук
има специална о п т и ч н а с и с т е м а за улавя­
не само н а поляризованата с в е т л и н а .
С е л е к т и в н о с т . А н а л и з а т о р ъ т е селекти­
вен и флексибилен. Има в ъ з м о ж н о с т з а ав­
т о м а т и ч н о разреждане и п о в т о р е н анализ
на пробите. Р а з р е д к а т а може да бъде изб­
рана предварително според очакваните кон­
центрации.
Чувствителност. Чувствителността
(10"9ng) е д о с т а т ъ ч н о висока з а диагнос­
т и ч н и цели, макар и по-ниска спрямо хеми-
л у м и н е с ц е н т н и т е технологии.
Калибрация. А н а л и з а т о р ъ т има т р и въз­
можности за калибрация - модул з а пълна
крива о т 6 т о ч к и , модул за едноточкова ка­
либрация н а база фиксирани о т ф и р м а т а
с т о й н о с т и н а к р и в а т а в п а м е т т а и изпол­
зване на фиксиранат а калибрационна кри­
ва в п а м е т т а н а а п а р а т а . Калибрационни-
т е криви са стабилни в продължение н а ня­
колко месеца. При т е с т - р е а к т и в и о т нова
фабрична серия к а л и б р а ц и я т а е задължи­
телна. В по-новото производство (данни о т
1995 г.) има двуточкова калибрация при фик­
сирани калибрационни криви.
Брой т е с т о в е н а д и с к а . Р е а к т и в н и я т
диск има к а п а ц и т е т за 20 т е с т - р е а к т и в а .
По време на пауза (след накапване н а проби и
реактиви), т е с т - р е а к т и в и т е м о г а т да бъ­
д а т заменени с други, к о е т о значително уве­
410
личава п р о п у с к л и в о с т т а н а а н а л и з а т о р а .
Няма охладителна система. Т р г ш н о с т т а н а
т е с т р е а к т и в и т е е 112 часа н а диска, т . е .
14 дни по 8 часа. Осигурено е а в т о м а т и ч н о
размесване на р е а к т и в и т е за фиксирано вре­
ме и а в т о м а т и ч н о отваряне, чрез к о е т о се
избягва замърсяване, разливане и изпарение.
Б р о й п р о б и н а д и с к а . Д и с к ъ т за п р о б и т е
и м а 90 гнезда за р а б о т н и кювети. На дис­
к а м о г а т да б ъ д а т заредени ч е т и р и различ­
ни т и п а с е г м е н т и з а проби, к о е т о позво­
лява а д а п т и р а н е към различни видове сис­
т е м и за вземане н а биологичен м а т е р и а л
при о т д е л н и т е лаборатории. Има лазерен
ч е т е ц н а бар-кодовете н а т е с т - р е а к т и в и ­
т е , н а п р о б и т е и сензор за н и в о т о на био­
логичния м а т е р и а л .
В р е м е т о з а п о д г о т о в к а и излизане н а
п ъ р в и я т р е з у л т а т е о т 8 до 30 min. Ка­
п а ц и т е т ъ т н а а н а л и з а т о р а е 80 до 120 про-
би/h.
С ъ х р а н е н и е н а д а н н и - и м а добра с о ф т у ­
ерна с и с т е м а с о т д е л е н м о н и т о р и възмож­
н о с т и з а запазване н а данни (ASTM-compat-
ible bi-directional interface) - с ъ х р а н я в а т се
до 1 500 р е з у л т а т а о т п а ц и е н т н и проби и
1 500 р е з у л т а т а о т к а ч е с т в е н к о н т р о л
С ъ х р а н я в а т се и д а н н и т е о т съобщения за
грешки.
В ъ з м о ж н о с т з а с п е ш н и п р о б и . И м а въз­
м о ж н о с т (STAT програма) з а изследване н а
спешни проби, к о и т о м о г а т да се з а л о ж а т
в режим н а р а б о т а , без необходимост о т
допълнителни манипулации.
Т е с т о в о м е н ю - включва т е с т о в е за из­
следване н а хормони н а щ и т о в и д н а т а жле­
за, р е п р о д у к т и в н а т а с и с т е м а , панкреас
(ниво н а инсулин), т у м о р н и маркери, хепа
т и т н и маркери, сърдечни маркери, лекарс
т в а , над 10 н а р к о т и ч н и в е щ е с т в а , в и т а ­
мини ( в и т . Bjg и фолат), индивидуални про­
т е и н и (феритин).
П р е д и м с т в а - лесно управляем софтуер;
две в ъ з м о ж н о с т и з а командване: с клавиа­
т у р а и к о н т а к т н о чрез м о н и т о р а ; с о ф т у
е р ъ т позволява създаване н а панели о т ана­
лизи по зададен а л г о р и т ъ м ; максимален ка­
п а ц и т е т на контейнерите за отпадъци
(разделени н а т в ъ р д и и течн и ), к о е т о поз­
волява н е п р е к ъ с н а т режим н а р а б о т а ; о т ­
ч и т а н е т о н а сляпа проба при FPIA о т с т -
р а няв а и н т е р ф е р е н ц и я т а ; при о т ч и т а н е ­
т о н а е с т р а д и о л е елиминирано в л и я н и е т о
н а Primarin (широко използван п р е п а р а т в
з а м е с т и т е л н а т а терапия); непрекъснат
д о с т ъ п - проби и р е а к т и в и м о г а т да б ъ д а т
подавани в процес н а анализ н а а п а р а т а ;
п р о б и т е м о г а т д а б ъ д а т подавани във вся­
какъв ред, вкл. и н а цели панели; т е с т в а н е ­
т о чрез STAT програма не прекъсва анализа
и р е з у л т а т ъ т се д а в а в г р а н и ц и т е н а 15
м и н у т и ; г о т о в и з а използване (не изисква­
щи п р е д в а р и т е л н а п о д г о т о в к а ) р е а к т и в и ,
калибратори и контрили ; а в т о м а т и ч н о из­
числяване и изписване н а екрана обема н а
п р о б а т а , необходим з а изпълнение н а зада­
дените т е с т о в е ; дизайнът на сондите и
п р о м и в а н е т о о т в ъ н и о т в ъ т р е след всяко
накапване елиминира carryover ( < 0,5 р р т ) ;
в ъ з м о ж н о с т з а флагиране н а т е с т резул­
т а т и и контроли; п р е д с т а в я н е н а данни­
т е о т к а ч е с т в е н и я к о н т р о л и н а екрана, и
чрез х ис т ограми, всяка о т к о и т о съдържа
р е з у л т а т и о т к а ч е с т в е н и я к о н т р о л за 31
дни.
Н е д о с т а т ъ ц и - обемен дизайн, по-ниска
производителност поради к о м б и н и р а н а т а
технология, н е д о с т а т ъ ч н о т е с т о в о меню
з а пълен набор р у т и н н и изследвания, лип­
са на охладителна с и с т е м а з а р е а к т и в н и я
диск, липса н а в ъ з м о ж н о с т з а д е т е к ц и я н а
флокули в п р о б и т е . П о н а с т о я щ е м н е д о с т а ­
Капачка Двустрапси
от ф о л и о 1ЕМЛ
Lot №
Имунна
реакция
Е Н З И М Н О маркирано
антитяло/антиген
Имобилизирани
антитела
Памагнстсни
Тсст-
парамагнитни
епруветка
сфери 9
Конкурентен
EIA
Ф и г . 21.1. Реакционна схема на а н а л и з а т о р н а т а с и с т е м а Eurogenetics-Tosoh AIA (no Tosoh Medics, Inc.)
т ъ ц и т е са преодолени с р а з р а б о т е н и я нов
и м у н о х и м и ч е н а н а л и з а т о р ARCHITECT
12000.
Други. A b b o t t ARCHITECT (1996 г.) е
н о в а т а технология н а ф и р м а т а , к о я т о се
базира н а принципа н а д и р е к т н а хемилуми-
несценция с използване н а акридинов е с т е р
к а т о маркер. А н а л и з а т о р ъ т е о т к л а с а т а
н а най-високите технологии, характеризи­
р а щ се с флексибилност, хомогенен имуно­
химичен принцип, съвременна програмна
осигуреност, п р е д с т а в и т е л е н дизайн, въз­
м о ж н о с т з а комплектуване в ЛИС. Капаци­
т е т ъ т на а н а л и з а т о р а е до 200 проби/h, с
начало з а първа проба 2 9 - т а min. Тестово­
т о меню е о т 27 п а р а м е т ъ р а засега и пред­
с т о и усилено р а з р а б о т в а н е н а нови пока­
з а т е л и . Всички н е д о с т а т ъ ц и н а предишни­
т е флуориметрични версии са избегнати.
Други ан ал и зато р и н а принципа н а иму-
нофлуоресценция:
• EUROGENETICS / TOSOH - Л1Л-21 (1997
г.) - най-новият модел н а цяла поредица
о т т о з и т и п . Високочувствителен иму-
ноензимен а н а л и з а т о р н а х е т е р о г е н е н
принцип. Маркер Аф и с у б с т р а т 4MUP.
Твърда фаза са п о к р и т и с ф е р и т м а г н и т ­
ни ч а с т и ц и , н е с т а н д а р т е н вид н а кюве-
т и т е . К а п а ц и т е т 120 проби/h с 40 ми­
н у т н а инкубация (фиг. 21.1).
Ензимна реакция
Сепарация Флуориметрия
С 4MU1' )
'
• ^ •
411
• VIDAS - b i o - M e m ? u x (1992-1993 г). Това
е наименованието н а в а р и а н т и имуно-
химични а н а л и з а т о р и н а пр инципа н а ен-
зимнозависим флуоресцентен анализ
(ELFA). Маркер АФ и с у б с т р а т 4MUP.
• BAXTER STRATUS I m m u n o a s s a y
s y s t e m s п о з н а т о т 1983 г. Р а з р а б о т е н е
н а принцип н а радиално-разделителен
имуноанализ, к о й т о е к о м б и н а ц и я о т
х о р т и е н а х р о м а т о г р а ф и я и имуноензим-
н а т е х н и к а . След у с ъ в ъ р ш е н с т в а н е с нов
и н т е р ф е й с през 1992 г. беше п р е д с т а в е н
модел S t r a t u s I n t e l l e c t . При и м у н о а н а -
л и з и т е се и з п о л з в а т послойно разположе­
ни ф и л т ъ р н и х а р т и й к и с ъ с з а к р е п е н и
с т ъ к л е н и фибри, к о и т о с л у ж а т з а т в ъ р ­
д а ф а з а н а а н т и т е л а и с а подредени в
пластмасови блокчета. Технологията
може д а се причисли к ъ м т ъ й нар. суха
химия. К а т о м а р к е р се използва АФ, суб­
с т р а т ъ т е 4MUP, а о п р е д е л я н е т о е чрез
флуор есцентна д е т е к ц и я .
• С е р и л OPUS н а ф и р м а т а B e h r i n g с но­
в а т а версия M A G N U M о т 1993 г. Анализа­
т о р о т висока класа по технологична раз­
ра б отк а. Използва се мултислоен филм н а
принципа н а флуорогенен имуносорбентен
ензимен анализ. Р а б о т н а т а ф а з а предс­
т а в л я в а сух филм-модул о т п е т слоя в кап­
сула с фибро-матрикс. Маркер АФ, с у б с т ­
р а т - 4MUP и флуоресцентна д е т е к ц и я . Ка­
п а ц и т е т ъ т е 190 проби/h при инкубация
6 до 30 min и 40 т е с т о в модул.
• DELFIA S y s t e m VVALLAC, 1992 (вж. гл.
13). Д и р е к т н а иму но ф л у о р есцентна т е х ­
ника с използване н а л а н т а н и д и к а т о
маркери (Еи, Sa), А в т о м а т и ч и я т в а р и ­
а н т е с висока п р о и з в о д и т е л н о с т и доб­
р а а н а л и т и ч н а н а д е ж д н о с т . И м а специ­
ална с и с т е м а з а д е т е к ц и я н а д в а м а р к е ­
р а едновременно. Предлага п р о г р а м н и
п р о д у к т и з а масов скрининг н а вродени
д е ф е к т и , х и п о т и р е о з и и др.
• KRYPTOR н а фирлгата CIS b i o
i n t e r n a t i o n a l (1997 г). А в т о м а т и ч е н
имунохимичен а н а л и з а т о р , к о й т о изпол­
зва ф луоресцентн а т е х н о л о г и я н а много
необичаен принцип - TRACE - Time-Resolved
Amplified Criptate Emission (вж. гл. 13). П р и
него се използва европиев к р и п т а т к а т о
маркер и флуорофор с т р а н с ф е р н а енер­
гия след лазерно възбуждане, б и х р о м а т и ч -
412
н а флуоресцентна детекция на директ­
н а флуоресценция. Т е х н о л о г и я т а е н а но­
в и я век, с извънредно големи възможнос­
т и за широкоспектърна диагностика.
АНАЛИЗАТОРИ НА П Р И Н Ц И П
НА ДИРЕКТНА ХЕМИАУМИНЕСЦЕНЦИЯ
CIBA C O R N I N G ACS:ISO ( N o w B A Y E R
DIAGNISTICS) Напълно а в т о м а т и з и р а н се­
л е к т и в е н имунохимичен а н а л и з а т о р (1994 г).
П р и н ц и п н а а н а л и з а - хомогенен имуно-
м е т р и ч е н к о н к у р е н т е н или н е к о н к у р е н т е н
а н а л и з н а б а з а т а н а д и р е к т н а хемилуми-
несценция, т е х н о л о г и я с н а й - в и с о к а т а чув­
с т в и т е л н о с т о т н е р а д и о и з о т о п н и т е ме­
тоди.
Т в ъ р д а ф а з а . И з п о л з в а т се п а р а м а г н и т -
ни м и к р о ч а с т и ц и с п о к р и т и е о т железен
окис, н а т о в а р е н и със с ъ о т в е т н и а н т и т е ­
ла. Тези ч а с т и ц и о с и г у р я в а т м а к с и м а л н а
п о в ъ р х н о с т з а к о н т а к т при образуване н а
и м у н н и т е комплекси до 50 п ъ т и по-голяма
о т т а з и по с т е н и т е н а м и к р о к ю в е т и , оси­
г у р я в а т бързо м а г н и т н о с е п а р и р а н е вмес­
т о у т а я в а н е или ц е н т р о ф у г и р а н е и мини­
м у м неспецифично с в ъ р з ва н е .
М а р к е р . Използва се акридинов е с т е р (АЕ),
след окисление с р е а к т и в н а смес о т реак­
т и в 1 (0.5% в о д о р о д е н п р е к и с в 0.1 m o l / 1
HNO3 ) и р е а к т и в 2 (0.25 mol/1 NaOH). Този
м а р к е р и м а м н о г о п р е д и м с т в а - к а т о хи­
мическо съединение е много с т а б и л е н , с дъл­
г о т р а е н полуразпад; п р и възбуждане се по­
л у ч а в а висок с в е т л и н е н добив и добра ли­
н е й н о с т , с нисък фон, к о е т о позволява м а к ­
симална ч у в с т в и т е л н о с т ; свързването с
други о р г а н и ч н и молекули н е влияе н а из­
лъчването на светлина.
К ю В е т и . Р е а к т и в и т е и п р о б и т е се смес­
в а т в дискретни еднократни пластмасо­
ви плоски к ю в е т и . Те се п о д р е ж д а т а в т о ­
м а т и ч н о о т уникална механична с и с т е м а
и попадат в кюветен п ъ т с възможност
з а п р и д в и ж в а н е о т ляво н а дясно с и н т е р ­
вал о т 20 s. К ю в е т и м о г а т д а се д о б а в я т
през целия р а б о т е н процес, без д а се нару­
шава р и т ъ м а на а в т о м а т и з а ц и я т а .
Т е м п е р а т у р а т а н а р е а к т и в н и я процес се
контролира о т термо-система, к о я т о
предварително з а т о п л я сондите, кювети-
т е и р е а к т и в и т е , преди т е д а б ъ д а т н а к а -
пани в с м е с т а и поддържа т е м п е р а т у р а о т
37 0С през и я л о т о в р е м е н а и н к у б а ц и я т а .
С е п а р и р а н е и промивка. След приключване
н а инкубационното време к ю в е т и т е се
п р и д в и ж в а т к ъ м м я с т о , к ъ д е т о с а разполо­
ж е н и м а г н и т н и с е п а р а т о р и о т с т р а н и по хо­
ризонталата. Постоянните магнити са
произведени о т неодинов борон и много бър­
зо з а л е п в а т п а р а м а г н и т н и т е ч а с т и ц и н а ед­
н а т а с т е н а н а к ю в е т а т а . Т е ч н о с т т а се ас­
пирира о т в а к у у м н а сонда, к о я т о д о с т и г а
до д ъ н о т о н а к ю в е т а т а . След т о в а ч а с т и ­
ц и т е се д и с п е р г и р а т в дейонизирана вода,
о т н о в о се с е п а р и р а т и се изсмуква в о д а т а .
Тази процедура се п о в т а р я д в у к р а т н о , кое­
т о осигурява неспецифично свързване <
0.05%. След приключване н а промивния ци­
къл ч а с т и ц и т е се р е с у с п е н д и р а т в 300 ml о т
с в е т л и н е н р е а г е н т 1, к о й т о п о д г о т в я мар­
кера з а е м и с и о н н а т а с т ъ п к а , к о я т о се осъ­
ществява в к а м е р а т а на луминометъра.
Д е т е к ц и я . И з в ъ р ш в а се о т л у м и н о м е т ъ р .
Л у м и н о м е т ъ р н а т а к а м е р а е в ъ р т я щ о се
пространство с ш е с т стени. Д е т е к т о р ъ т
н а ф о т о м н о ж и т е л я е м о н т и р а н срещу т р е ­
т а т а стена. Когато к ю в е т а т а застане на
с т е н а т а т о ч н о срещу ф о т о м н о ж и т е л я т о ­
г а в а се н а к а п в а с в е т л и н е н р е а г е н т 2, кое­
т о предизвиква окисление н а а к р и д ш ю в и я
е с т е р и к а т о р е з у л т а т о т т о в а - емисия
о т с в е т л и н н и ф о т о н и (430 п т ) . Е м и с и я т а
д а в а м а к с и м у м в р а м к и т е н а 1 s. О б щ а
т р а й н о с т до пълно з а г а с в а н е - 3-4 s. Т а к а
и н т е н з и т е т ъ т н а е м и с и я т а се и з м е р в а н а
и н т е р в а л и о т около 5 s о т с ъ о т в е т н и я де­
т е к т о р , к о й т о р а б о т и н а п р и н ц и п а н а бро­
ене н а ф о т о н и .
С е л е к т и В и о е т . Анализаторът е селекти­
вен, с в ъ з м о ж н о с т и з а д е т е к ц и я н а всички
нива, в т о в а число и н а п р о т е и н о в и ко м­
плекси в серума. И м а в ъ з м о ж н о с т з а а в т о ­
м а т и ч н о р а з р е ж д а н е при е к с т р е м н и с т о й ­
ности.
Ч у В с т В и т е л н о е т . С ъ о т в е т н а н а хеми-
л у м и н е с ц е н т н и т е м е т о д и . З а о пр едел яне
н а ТТН , свободен т и р о к с и н , е с т р а д и о л и
др. ч у в с т в и т е л н о с т т а е о т т а к а нар. т р е ­
т а генерация.
К а л и б р а ц и я . Основна с т а н д а р т н а крива
със с ъ о т в е т н и с т о й н о с т и з а всеки по ка­
з а т е л е вградена в п а м е т т а н а а п а р а т а и
т е с т у в а н а о т ф и р м а т а . Това позволява пе­
риодична д в у т о ч к о в а калибрация в зависи­
м о с т о т вида н а т е с т а ( о т 7 до 28 дни).
П р о г р а м а т а н а а п а р а т а следи с т р и к т н о
т е з и периоди и не п р и е м а о т ч и т а н е без по­
р е д н а калибарация.
Брой т е с т о В е п а диска. Реактивната
с и с т е м а - носача з а р е а к т и в и и м а 26 гнез­
д а з а 13 вида т е с т о в е . Р е а к т и в н и т е ши­
ш е т а се п о к р и в а т със с е п т и р а н и п л а с т м а ­
сови к а п а ч к и з а н а м а л я в а н е н а в ъ з м о ж ­
н о с т т а з а изпаряване н а съдържимото.
Външния диск е з а р е а к т и в с м а г н и т н и т е
ч а с т и ц и и и м а м е х а н и з ъ м з а п о с т о я н н о за­
в ъ р т в а н е около о с т а н а ш и ш е т а т а з а хо­
могенизиране н а с у с п е н с и я т а . Поради лип­
с а н а хладилна с и с т е м а , ц е л и я т р е а к т и в е н
диск се пази в хладилник и преди с т а р т се
п о с т а в я н а м я с т о без п р е д в а р и т е л н о т е м -
периране, поради с т а б и л н а т а т е м п е р и р а -
ща система.
Брой проби н а диск. Лвтосемплерът е
двуреден кръгов диск с 60 гнезда з а проби,
к а л и б р а т о р и , к о н т р о л и и д и л у е н т и . В сис­
т е м а т а з а н а к а п в а н е н а п р о б и т е се включ­
в а и лазерен ч е т е ц н а баркод и д е т е к т о р з а
р а з р е ж д а н е . Н а к а п в а щ а т а п р о б и т е сонда
и м а сензор з а н и в о т о н а п р о б и т е в епру­
в е т к и т е . В ъ з м о ж н о с т т а з а т а к о в а пред­
варително т е с т у в а н е на количеството и
к а ч е с т в о т о н а биологичния м а т е р и а л пред­
п а з в а с е р и я т а о т пропуски в н а к а п в а н е т о .
В р е м е т о з а и н к у б а ц и я и получаВане на
първия р е з у л т а т след пускане н а с е р и я т а
е 15 min. Н а к а п в а н е т о н а р е а к т и в и т е с т а ­
в а с т р и сонди, програмирани във в р е м е т о
- н а 0, 2.5 и/или н а 5 min., т а к а че о б щ о т о
инкубационно време д а е 7.5 min. Всеки ре­
з у л т а т след 1 5 - т а м и н у т а излиза н а 20 s.
След всяко н а к а п в а н е с о н д и т е се п р о м и в а т
а в т о м а т и ч н о о т в ъ н и о т в ъ т р е с дейони­
з и р а н а вода.
С ъ х р а н е н и е н а д а н н и . С о ф т у е р н а т а сис­
т е м а запазва данни з а 10 различни к о н т р о ­
ли з а всеки т е с т . Всички данни се з а п а з в а т
в т е ч е н и е н а 45 дни и м о г а т д а б ъ д а т пред­
с т а в е н и в т а б л и ч е н вид. Освен т о в а месеч­
н и т е калкулации з а всеки к о н т р о л до 12 ме­
сеца м о г а т д а б ъ д а т извадени н а дисплея или
о т п е ч а т а н и . До 10 000 р е з у л т а т и н а паци­
е н т и се а р х и в и р а т и до 2000 р е з у л т а т а мо-
413
г а т да се п р е д с т а в я т к а т о хистограми. Бар-
кодов контрол н а всички нива.
В ъ з м о ж н о с т з а с п е ш н и п р о б и . Анализа­
т о р ъ т и м а с и с т е м а з а включване н а спеш­
н а проба по време н а р а б о т а .
Т е с т о в о т о м е н ю включва широк набор о т
т е с т о в е за изследване н а шшповидна Жлеза,
репродуктивна функция, анемия, т у м о р н и
и сърдечни маркери, л е к а р с т в а и др.
П р е д и м с т в а - използва най-високочувст­
в и т е л н а т е х н о л о г и я н а д и р е к т н а хемилу-
минесценция и з а сега най-бързия анализа­
т о р о т т о з и клас.
Н е д о с т а т ъ ц и - липса н а модерен с о ф т у ­
ер и о т т а м м а л к а диалогова в ъ з м о ж н о с т
и малка п а м е т . Този н е д о с т а т ъ к е избег­
н а т с по-новия в а р и а н т ADVIA ACS: 180 SE
(използва Windows NT ) с ц в е т е н м о н и т о р ,
к л а в и а т у р а , висока с к о р о с т и лесно управ­
ляем софтуер. Друг н е д о с т а т ъ к е л и п с а т а
н а хладилно у с т р о й с т в о з а р е а к т и в и т е ,
к о е т о изисква следене н а в р е м е т о з а прес­
т о й н а с т а й н а т е м п е р а т у р а (до 40 h).
Д р у г и . Н а с ъ ш и я имунохимичен принцип е
р а з р а б о т е н а н а л и з а т о р о т най-висока кла­
са B a y e r ADVIA C e n t a u r (1997), предназ­
начен з а големи л а б о р а т о р и и - в ъ з м о ж н о с т
з а получаване н а 240 р е з у л т а т а н а час о т
180 проби н а п а ц и е н т и . П р о б и т е се прид­
в и ж в а т н а блокове и р а б о т а т а е без спира­
не з а к а к в а т о и д а е манипулация. Ц е л и я т
набор р е а к т и в и се разполага в хладилна ка­
м е р а н а диск з а 36 вида т е с т о в е . Т е с т о в и ­
я т набор е разширен с а н т и т и р е о и д н и а н ­
т и т е л а и и м а серия з а т е с т у в а н е н а раз­
лични инфекции с о т д е л е н к а н а л з а о т п а д ­
на т е ч н о с т .
Други а в т о м а т и ч н и а н а л и з а т о р и н а
т о з и принцип:
• Nichols Advantage Chemiluniines-
сепсе S y s t e m (Nichols Institute Diag­
n o s t i c s , The N e t h e r l a n d s ) 1997- н а п ъ л н о
а в т о м а т и з и р а н , флексибилен имунохи­
мичен а н а л и з а т о р . Използва п о к р и т и със
стрептавидин лгагпитпи частици
к а т о т в ъ р д а фаза и б и о т и н и з и р а н и а н ­
т и т е л а . Маркер е ч у в с т в и т е л е н акриди-
нов е с т е р . Използва х е т е р о г е н е н принцип
н а имунохимичния анализ с д в у с т ъ п а л -
н а и н к у б а ц и я след п р о м и в к а . П ъ р в и я т
р е з у л т а т излиза н а 37 min. К а п а ц и т е т
414
90 до 170 проби н а ч а с Р е а к т и в е н диск с
к а п а ц и т е т 15 т е с т а в охладена к а м е р а ,
р а б о т е н диск с к а п а ц и т е т 120 т е с т - е п -
р у в е т к и и 720 к ю в е т и . Н а й - в п е ч а т л я в а -
идо е т е с т о в о т о м е н ю - в ъ з м о ж н о с т з а
определяне н а АСТН, РТН, ренин, оспгео-
калцин, випг.Д и калцитонин.
• LIAISON B Y K (1996). П р и н ц и п ъ т
е хемилуминесцентен с м а г н и т н и ч а с т и ­
ци к а т о т в ъ р д а ф а з а и л а н т а н и д и к а т о
луминесцираиш маркери. А н а л и з а т о р ъ т е
о т висока класа с големи в ъ з м о ж н о с т и и
много семпъл и к о м п а к т е н дизаин. Някои
о т х а р а к т е р и с т и к и т е са: в ъ з м о ж н о с т з а
и з р а б о т в а н е до 180 проби н а час, при пър­
ви р е з у л т а т н а 17 min, д в у т о ч к о в а калиб-
рация, в ъ з м о ж н о с т з а спешни проби, бар-
код и д е т е к ц и я н а всички манипулации,
модерна к о м п ю т ъ р н а о с и г у р е н о с т с а т ­
р а к т и в н о т е с т о в о меню.
АНАЛИЗАТОРИ НА ПРИНЦИПА
НА ЕНЗИМНО УСИЛЕНА
ХЕМИЛУМИНЕСЦЕНТНА ТЕХНОЛОГИЯ
DPC (Diagnostic Products Corporation)
I M M U L I T E 2000, (1997 г). Флексибилен ви­
с о к о п р о д у к т и в е н , напълно а в т о м а т и з и р а н
имунохимичен а н а л и з а т о р .
П р и н ц и п . Д в а т а модела н а DPC IMMULITE
(м а лъ к и голям) с а р а з р а б о т е н и н а комби­
н и р а н принцип о т ензимно м а р к и р а н е и хе-
милуминесцентна детекция.
Т в ъ р д а ф а з а . И з п о л з в а т се 0.25-инчови по-
л и с т и р е н о в и т о п ч е т а , п о с т а в е н и в специ­
ални р а б о т н и к ю в е т и .
М а р к е р . Използва с е а л к а л н а ф о с ф а т а з а .
К а т о с в р ъ х ч у в с т в и т е л е н хемилуминесцен­
т е н с у б с т р а т се използва а д а м а н т и л ди-
о к с е т а н , к о й т о се превръида в н е с т а б и л е н
д и о к с е т а н о в анион, излъчваш светлинен
с и г н а л (фиг. 21.2). П о с л е д н и я т модел 2000
има възможност за адаптиране на т е с т о ­
ве с м а р к е р акридинов е с т е р з а д и р е к т н а
хемилуминесценция.
К ю в е т и Приложени с а индивидуални спе­
циални к ю в е т и . З а всеки вид т е с т и м а опа­
ковки по 200 проби и с ъ о т в е т н о т о л к о в а
кювети с топче.
Т е м п е р и р а н е . И м а осигурена п о с т о я н н а

HPO
Адамаптил диоксиетап
фосфат
(стабилно съсдипспие)
Ф и г . 21.2. Ензимно с т и м у л и р а н а хемилуминесценция при анализатори т и п DPC IMMULITE
(по фирмени м а т е р и а л и )
т е м п е р а т у р а о т 37 0С за т е м п е р и р а н е н а
н а к а п а н и т е р е а к т и в и и з а инкубация.
С е п а р а ц и я н а с в ъ р з а н и т е комплекси. Из­
вършва се чрез промивка н а т о п ч е т а т а , ко­
я т о се о с ъ щ е с т в я в а с изсмукване н а т е ч ­
н о с т т а след и н к у б а ц и я т а и прибавяне н а
вода и бързо з а в ъ р т а н е н а к ю в е т к а т а по
д ъ л г а т а ос н а ц е н т р о ф у ж е н принцип със
с к о р о с т 10 000 o6opoma/min (фиг. 21.3).
гтОг
о Microsoft Windows NT. Баркод за контрол на
Ф и г . 21.3. Схема на хомогенен имунохимичен ана­
лиз при а н а л и з а т о р и т и п DPC IMMULITE System
(по фирмени м а т е р и а л и )
1. Проба и реактив се н а к а п в а т а в т о м а т и ч н о в гпест-
е п р у в е т к а т а . Инкубира се при 37 "С, к а т о се разкла­
ща на всеки 10 s.
2. По време на м и е н е т о , е п р у в е т к а т а се завършва с го­
ляма скорост около в е р т и к а л н а т а ос.
3. О т с т р а н е н а т а т е ч н о с т напьлно се улавя във водос­
б о р н а т а камера.
4. Първият хемилуминесцентен р е з у л т а т е г о т о в 40
min след с т а р т и р а н е на анализа.
Д е т е к ц и я . О т ч и т а се хемилуминесцен­
ция с ф о т о м н о ж и т е л н а принципа на фо­
т о н н о броене.
С е л е к т и в и о с т . Селе кт и ве н а н а л и з а т о р
с а в т о м а т и ч н о разреждане.
Ч у В с т В и т е л н о с т . С ъ о т в е т н а н а прин­
ципа, за сега най-висока о т нерадиоизотоп-
н и т е методи.
Калибрация. Фиксирана 6 п а м е т т а калиб-
^ Свет.
Адамаптил диоксистаиов
йон
(нестабилно съсдиисиис)
рационна крива и месечна двуточкова ка­
либрация за всеки п а р а м е т ъ р .
Ьрой т е с т о в е н а диска. Реактивният
носач се зарежда с 24 различни т е с т а , раз­
положени в хладилна камера.
Ьрой п р о б и н а д и с к а . К а п а ц и т е т ъ т на
пробния носач е 6 с т а т и в а с по 15 епрувет­
ки, к о и т о а в т о м а т и ч н о се з а м е н я т о т до­
бавена роботизирана с и с т е м а .
В р е м е з а и н к у б а ц и я . К а п а ц и т е т ъ т на
а н а л и з а т о р а е 200 проби/h (при по-малкия
в а р и а н т е 120 проби/h) след 45 до 75 min
инкубационен период.
С ъ х р а н е н и е н а д а н н и . В а р и а н т 2000 има
добра о п е р а т и в н а с и с т е м а на база
р е а к т и в и и проби.
Иъзмо>кност з а с п е ш н и проби. Такава
има само в а р и а н т 2000.
Т е с т о в о м е н ю - 35 вида изследвания, включ­
ващи диагностика на алергии, диабет, хепа­
т и т и други инфекции, цитокини.
П р е д и м с т в а - висока технология с широ­
ка г а м а н а т е с т о в е за диагностика.
Н е д о с т а т ъ ц и . С т а р и т е версии и м а т не­
д о с т а т ъ ц и по о т н о ш е н и е на различните
възможности за детекции и по-бавната ин­
кубация на е н з и м н а т а реакция. По отноше­
ние на д е т е к ц и и т е и а в т о м а т и ч н и т е про­
цедури в а р и а н т 2000 е без н е д о с т а т ъ ц и о т
т о з и характер. Дълъг инкубационен период
поради ензимното маркиране.
Други. Н о в а т а версия 2000 е о т г р у п а т а на
най-високите технологии в м о м е н т а .
Други анализатори на т о з и принцип:
• VITROS ЕСХ - ORTHO (Johnson&John­
s o n ) C l i n i c a l D i a g n o s t i c s (1996 г). Това
415
 наименобанив е поба генерация ош пърби
me модулни хемилуминесценшни анализа­
т о р и на Кодак - Амерлит (1983 г), с реак­
т и в н и набори, спрени о т производство
през м а р т 1999 г. Принципът на техноло­
г и я т а е еднаква - използва се маркер пе-
роксидаза и с у б с т р а т луминол, к о й т о след
окисление излъчва продължителен светли­
нен сигнал (вж. гл. 13). А н т и т е л а т а са фик­
сирани на микрокювети. Анализът е х е т е ­
рогенен и поради т о в а е с по-голяма про­
дължителност о т д и р е к т н и т е техноло­
гии. Има редица предимства по о т н о ш е ­
ние на с т а б и л н о с т и високо качество н а
реактивите. Много висока технология на
компютърна осигуреност.
• Access I m m u n o a s s a y S y s t e m н а ф и р м а ­
т а S a n o f i D i a g n o s t i c P a s t e u r (1994 г).
Напълно а в т о м а т и з и р а н флексибилен
имунохимичен анализатор на принципа н а
индиректна хемилуминесценция. Използ­
в а т се м а г н и т н и ч а с т и ц и к а т о т в ъ р д а
фаза, Аф к а т о маркиращ ензим и диоксе-
т а н к а т о луминесциращ с у б с т р а т . Ана­
л и з а т о р ъ т е о т висока класа по отноше­
ние на компютърна осигуреност и т е хн о­
логична разработка. Твърде впечетляващо
е менюто о т 78 вида изследвания с голяма
гама индивидуални протеини и а н т и т е ­
ла, инсулин, гликиран хемоглобин и С-пеп-
т и д за контрол на диабета.
АНАЛИЗАТОРИ НА ПРИНЦИПА
НА ЕЛЕКТРОХЕМИЛУМИНЕСЦЕНЦИЯ
E l e c s y s s y s t e m s 1010, 2010 ( B o e h r i n g e r )
R o c h e D i a g n o s t i c s (1996 г). А в т о м а т и ч е н
имунохимичен а н а л и з а т о р в два в а р и а н т а
за малки и големи лаборатории.
Принцип. Касае се за технология с уника­
лен принцип - електрохемилуминесценция
с хомогенен имуноанализ (вж гл. 13).
Твърда фаза. М а г н и т н и ч а с т и ц и , покри­
т и със с т р е п т а в и д и н .
Маркер. Използва се рутениев комплекс - ру-
тениев трисбипиридил и трипропиламид.
К ю в е т и . Индивидуални пластмасови мик­
рокювети.
I е м п е р и р а и е . В инкубационния диск се
поддържа т е м п е р а т у р а о т 37 0С.
416
С е п а р а ц и я . И з п о л з в а т се биотинизирани
а н т и т е л а без сепарация на комплексите н а
т в ъ р д а т а фаза.
Д е т е к ц и я . След химична реакция между
р у т е н и е в а т а сол и трипропиламин се из­
ползва и н т е г р а ц и я н а п о в ъ р х н о с т т а н а
платинов електрод и о т ч и т а н е на фото­
нен п о т о к , даващ светлинен сигнал мина­
в а щ през ф о т о м н о ж и т е л (вж. гл. 13).
С е л е к т и В н о с т . Модел 1010 е т е с т - с е л е к -
т и в е н , с последователно изработване н а за­
д а д е н и т е видове т е с т о в е . Модел 2010 е се­
л е к т и в е н и флексибилен.
Ч у в с т в и т е л н о с т . Това е един о т най-чув­
с т в и т е л н и т е анализатори о т висока класа.
К а л и б р а ц и я . На база калибрационна кри­
ва в п а м е т т а се прави двуточокова калиб­
рация най-често едномесечна или при смя­
н а на п а р т и д е н номер.
Б р о й т е с т о в е . Н а модел 1010 и м а 6 мес­
т а за т е с т о в е н а диска, а при 2010 - 15 т е с ­
т а н а диск.
Б р о й п р о б и н а д и с к а . Р е а к т и в н и т е мес­
т а и п р о б и т е са н а един диск. Има 66 мес­
т а з а калибратори, к о н т р о л и и проби за мо­
дел 1010. При по-големия модел реактивни­
я т диск е о тд ел ен , а за п р о б и т е може да
има диск з а 30 проби или пробни с т а т и в и
подавани п о с т о я н н о .
В р е м е з а и н к у б а ц и я . Модел 1010 е с ка­
п а ц и т е т 50 проби/h с начало н а първия ре­
з у л т а т след 20 min. Модел 2010 е с капаци­
т е т 90 проби/h.
С ъ х р а н е н и е н а д а н н и . М а л к и я т модел
и м а ограничен диалогов режим с дисплей за
о с н о в н и т е задания и запазва данни без спе­
циално задание з а з а п а м е т я в а н е с а м о 20
min. Запазва данни за к о н т р о л а и калибра-
ц и я т а с в ъ з м о ж н о с т з а графични образи.
П о - г о л е м и я т модел и м а по-добра компю­
т ъ р н а осигуреност и по-голям м о н и т о р , но
не о т висока класа. И м а т баркодов к о н т ­
рол н а всички нива.
В ъ з м о ж н о с т з а с п е ш н и проби. И м а т
о т д е л н а позиция извън к а м е р а т а н а ана­
лизатора.
Т е с т о В о м е н ю . То е с т а н д а р т н о и д о с т а ­
т ъ ч н о , без е к с т р и за 1010. При 2010 има по-
широка г а м а включваща а н т и т и р е о и д н и
антитела.
П р е д и м с т в а . Малък обем н а а п а р а т а , ле­
сен за р а б о т а и с минимална механика, ко­
е т о го освобождава о т редииа проблеми. Ви­
сокочувствителен и надежден а н а л и з а т о р
с много с т а б и л н и р е а к т и в и - 18 месеца по
л о т номер, 3 мес. след начало н а р а б о т а и 6
седмици при п р е с т о й в а п а р а т а без хладил­
н а осигуреност.
Н е д о с т а т ъ ц и . Е д и н с т в е н о в по-ниския
клас на к о м п ю т ъ р н а осигуреност и ограни­
чение на броя т е с т о в е с фиксирани в носещи
рамки р а б о т н и кювети, к о е т о не позволява
повече о т 180 min р а б о т а без прекъсване.
Други. Предполага се р а з р а б о т в а н е на нов
в а р и а н т за е в е н т у а л н о включване в голя­
м а лабораторна а в т о м а т и ч н а система.
АНАЛИЗАТОРИ Н А ПРИНЦИПА
НА СПОТ тЕхнологая
К а к т о е показано в гл. 13 при описание н а
имунохимичните м е т о д и , технология на
б ъ д е щ е т о е миниминизиране на т в ъ р д и т е
повърхности и покриване с различни по вид
КНИГОПИС
Blackburn G, Shah Н, Kenten J et al. Electrochemiluminescence
detection for development o f immunoassays and DNA probe
assays for clinical diagnostics. Clinical Chemistry, 3 7 , 1 9 9 1 , 9 ,
1534-1539.
Boland J, Carey G, Krodel E, Kwiatkowski M. 'Ilie Ciba Corning
ACS: 180™ Benchtop immunoassay analyzer. Clinical Chem­
istry, 36, 1990, 9, 1558-1601.
Costongs G, van Oers et al. Evaluation o f the Abbott automated
random, immediate and continuous access immunoassay ana­
lyzer, the AxS YM ™. Eur Clin Chem Clin Biochem 33, 1995,
2, 105-111.
Duncan T, Engelberth L, LaBrash B. The Boehringer Mannheim
ES 300 immunoassay system. J Clin Immunoassay, 14, 1991,
105-110.
Eorrest A. Chromium dioxide paves the way to integration. Europ.
Clinical Laboratory, 19, February, 2000, 8.
Freier C, Kan B, Cicquel T. Biotrol System 70(X): Automated
immunoassay analyzer. J Clin Immunoassay, 14, 1991, 2, 111-
114.
Inoue M, Hayashi II, Suzuki II, Nakamura II. Magnetic micro-
beads EIA by utilization o f fully automated random access
enzyme immunoassay analyzer, AIA-12(X)™. In; Okuda K
(ed). Automation and N e w Technology in the Clinical Labora­
tory, Blackwell Scientific Publications, 1990, 73-80.
а н т и т е л а н а малки площи. За сега имаме
оскъдна информация за първия а в т о м а т и ­
чен а н а л и з а т о р н а т о з и принцип с възмож­
н о с т за м у л т и п а р а м е т р о в анализ о т фир­
м а т а RANDOX - B i o c h i p A r r a y S y s t e m -
показан за първи п ъ т н а Конгрес н а IFCC -
Флоренция 1999 г. П р и н ц и п ъ т е н а база ен­
зимно маркиране н а а н т и т е л а т а и генери­
ране н а светлинен сигнал след прибавяне н а
с у б с т р а т . Д е т е к ц и я т а с т а в а с предста­
вяне на т р и и з м е р н а графична с и с т е м а за
всяка т о ч к а о т даден у ч а с т ъ к н а п л а к а т а .
А н а л и з а т о р ъ т има необичаен "космически"
дизайн и изисква о т д е л н о помещение със
с ъ о т в е т н и климатични условия за р а б о т а .
На края т р я б в а да споменем, че по-голя-
м а т а ч а с т о т а в т о м а т и ч н и т е анализа­
т о р и , конструирани след 1991 г. са включи­
ли или са г о т о в и да в к л ю ч а т в т е с т о в о т о
си меню ДНК анализ за клинична диагнос­
т и к а . Не напразно се с ч и т а , че имунохи-
м и ч н а т а технология има неограничено бъ­
деще, с неограничени възможности и с т е н ­
денция да и з м е с т и голяма ч а с т о т клинич-
но-химичните р у т и н н и анализи.
Jefferson R. The Becton Dickenson Affinity Immunoassay Sys­
tem. J Clin
Immunoassay, 14, 1991, 2, 89-93.
Lövgren T, Merio L, Mitrunen K et al. One-step all-in-one dry
reagent immunoassays with fluorescent europium chelate la­
bel and time-resolved fluorometry. Clinical Chemistry, 42,
1996, 8, 1196-1201.
Mathis G. Rare Earth Cryptates and Homogeneous
Fluoroimmunoassay with Human Sera. Clinical Chemistry, 39,
1993, 9, 1953-1959.
Römer M, Ilaeckel R, Capelli M, Rocipon J. The analytical per­
formance o f the Ciba Corning ACS: 180 Automated Immu­
noassay System. A Multicentre Evaluation Eur J Clin Chem
Clin Biochem 32, 1994, 395-407.
Smith J, Osikowicz G et al. Abbott AxSYM™ Random and
continuous access immunoassay system for improved workflow
in the clinical labotarory. Clinical Chemistry, 39, 1993, 10,
2063-2069.
Williams R, Maggiore J. Automation in immunochemistry. In:
Schoeff L,Williams R (eds). Laboratory instruments, Mosby,
St.Louis-Baltimore-Boston, 1993, 314-357.
White T, Browning D. Opening the black box. European Clinical
Laboratory, June 1999, 16.
417
 Автоматизация на
кръвно-газовия анализ
К. Ц а ч е в
ВЪВЕДЕНИЕ
Състоянието на киселинно алкалния обмен
(КАО) и парциалното налягане н а 02 и СОг в
а р т е р и а л н а т а кръв са о т изключително зна­
чение за лечението на болни с дихателна не­
д о с т а т ъ ч н о с т и специално н а т е з и , лежа­
щи в о т д е л е н и я т а за интензивни грижи. Из­
следването на посочените показатели за бол­
н и т е в ОАРИЛ е п о ч т и винаги спешно и се
извършва през определени интервали о т вре­
ме. Отделението за интензивни грижи мо­
же да разполага със собствен анализатор на
pH и кръвни газове или да се обслужва о т цен­
т р а л н а клинична лаборатория. И в д в а т а
случая се изисква получаване на надеждни ре­
з у л т а т и по всяко време на денонощието, ко­
е т о означава че използваният а п а р а т т р я б ­
ва по възможност да не се поврежда, респ. да
бъде дублиран и калибрирането му да с т а в а
бързо и лесно. Дори к о г а т о а п а р а т и т е о т ­
говарят напълно на т е з и изисквания, т о в а
не е д о с т а т ъ ч н о да г а р а н т и р а получаване­
т о на достоверни р е з у л т а т и . Основно з н а ­
чение з а т о в а и л ш н а ч и н а н а в з е м а н е
н а кръвта, н е й н и я т т р а н с п о р т и съх­
р а н е н и ед о м о м е н т а н а и з в ъ р ш в а н е н а
анализа.
В съвременните а п а р а т и з а pH и кръв­
ни газове са м о н т и р а н и електроди з а ди­
р е к т н о измерване на pH, рС0 2 и р0 2 , снаб­
дени със с ъ о т в е т н о у с т р о й с т в о з а т е м -
периране и е л е к т р о н н а с и с т е м а . Д о к а т о
обслужването на п о - с т а р и т е а п а р а т и
изискваше значителен о п и т о т о п е р а т о ­
ра за извършване н а калибрацията, провер­
ка с ъ с т о я н и е т о н а е л е к т р о д и т е , изследва­
не на п р о б а т а и изчисление н а р е з у л т а т а ,
т о обслужването н а съвременните анали­
з а т о р и е напълно а в т о м а т и з и р а н о и се из­
разява в подаване н а п р о б а т а и о т к ъ с в а н е
на р а з п е ч а т к а с г о т о в и я р е з у л т а т . С т е ­
зи а п а р а т и може д а р а б о т и медицински
418
персонал без л а б о р а т о р н а квалификация,
респ. да се използва при леглото н а болния
(Point of care testing). О с и г у р я в а н е т о ка­
ч е с т в о т о н а р е з у л т а т и т е (вътрелабо-
раторен качествен контрол и външна оцен­
ка на резултатите) т р я б в а д а б ъ д е по­
верено н а квалифициран лабораторен
п е р с о н а л , р е с п . н а ц е н т р а л н а т а лабо­
ратория.
ИЗМЕРВАНЕ НА pH
Стъклен електрод
О с н о в н и т е ч а с т и н а един pH м е т ъ р с а
п р е д с т а в е н и н а фиг. 22.1. В р а з т в о р а , чие
т о pH ще се измерва са п о т о п е н и два елек­
трода - и з л ь е р в а щ ( с т ъ к л е н е л е к т р о д )
и референтен електрод. Електродите
заедно с р а з т в о р а , в к о й т о с а п о т о п е н и ,
о б р а з у в а т б а т е р и я , ч и я т о електродвиже-
щ а сила (ЕДС) е пропорционална н а pH н а
р а з т в о р а . Тази б а т е р и я и м а високо в ъ т ­
решно с ъ п р о т и в л е н и е , т а к а че н е й н а т а
ЕДС т р я б в а д а се измерва с в о л т м е т ъ р .
С к а л а т а н а в о л т м е т ъ р а е разграфена в pH
единици. И з м е р в а щ и я т електрод е ч у в с т ­
в и т е л е н спрямо к о н ц е н т р а ц и я т а на водо­
р о д н и т е йони в п р о б а т а , респ. н а н е й н о т о
pH. Р е ф е р е н т н и я т ел ек тр о д служи да оси­
гури п о с т о я н е н р е ф е р е н т е н п о т е н ц и а л
спрямо к о й т о може да се о т ч е т а т проме­
н и т е в п о т е н ц и а л а н а измерващия е л е к т ­
род. В с ъ в р е м е н н и т е лабораторни pH м е т ­
ри к а т о измерващ е л е к т р о д винаги се из­
ползва с т ъ к л е н ел ек тр о д .
С т ъ к л е н и я т е л е к т р о д е мембранен елек­
т р о д , при к о й т о й о н н и я т обмен между два­
т а р а з т в о р а , разделени о т т ъ н к а с т ъ к ­
лена м е м б р а н а е предимно з а с м е т к а на
водородните к а т и о н и . С т ъ к л е н и я т е л е к т
род в единия си край е във вид на луковица
 pH метър
електрод сребро'
сребьреи хлорид
буфер'
pH чувствително
стъкло
разтвор с
« е и т н а го pH
измерващ електрод
Фиг. 22.1. Принципно устройство на pH м е т ъ р
и з р а б о т е н а о т много т ъ н к о с т ъ к л о . Луко­
в и ц а т а е напълнена с буфер с и з в е с т н о пос­
т о я н н о pH (обикновено 1.0). В буфера е по­
т о п е н а п л а т и н е н а ж и ц а или н и ш к а о т
сребро/сребърен хлорид ( в ъ т р е ш е н е л е к т ­
род), к о я т о е свързана с в о л т м е т ъ р а (pH
м е т ъ р а ) . Г о р н и я т край н а с т ъ к л е н и я елек­
т р о д е з а т в о р е н , з а д а се п р е д о т в р а т и из­
т и ч а н е н а буфера. К о г а т о с т ъ к л е н и я т
електрод се п о т о п и в р а з т в о р възниква по­
т е н ц и а л н а разлика ме жд у в ъ т р е ш н а т а и
в ъ н ш н а т а п о в ъ р х н о с т н а с т ъ к л е н а т а лу­
ковица. В ъ з н и к н а л и я т п о т е н ц и а л е пропор­
ционален н а р а з л и к а т а в к о н ц е н т р а ц и я т а
н а водородните к а т и о н и (Н + ) в буферния
разтвор в ъ т р е в електрода и в разтвора,
ч и е т о pH се измерва. Приема се, че т а з и по­
т е н ц и а л н а разлика възниква в р е з у л т а т н а
йонен обмен, извършваш се н а повърхност­
т а н а с т ъ к л е н а т а луковица, к о й т о зависи
о т к о н ц е н т р а ц и я т а н а Н + к а т и о н и във
всеки един о т р а з т в о р и т е . С т ъ к л е н а т а
с т е н а н а л у к о в и ц а т а д е й с т в а к а т о pH чув­
с т в и т е л н а мембрана. Ф о р м а т а н а мембра­
н а т а не е задъ лжител н о да бъде к а т о луко­
вица. Тя може д а бъде плоска или к а т о ка­
пилярна т р ъ б и ч к а .
Между възникналото напрежение в сис­
т е м а т а стъклен електрод/референтен
електрод и р И на измерваната проба същес­
твува л и н е й н а зависимост, ч и й т о наклон
съответства п р и б л и з и т е л н о н а 60 m V з а
промяна на p H с една единица. Н а к л о н ъ т
зависи о т а б с о л ю т н а т а т е м п е р а т у р а н а
р а з т в о р а н а п р о б а т а и н а р а с т в а с 0.34% за
1 "С. На п р а к т и к а ч у в с т в и т е л н о с т т а н а
pH електрода т р я б в а периодично д а се про­
верява със с ъ о т в е т н и буферни р а з т в о р и .
Ако ч у в с т в и т е л н о с т т а е з н а ч и т е л н о на­
малена, е л е к т р о д ъ т т р я б в а д а се регенери­
ра съгласно у к а з а н и я т а н а производителя
или да се смени. При р а б о т а с електрода след
и з в е с т н о време ч у в с т в и т е л н о с т т а му мо­
ж е да спадне и в р е м е т о н а о т г о в о р да се
удължи поради о т л а г а н е н а м е т а л н и йони
по п о в ъ р х н о с т т а н а с т ъ к л е н а т а мембра­
н а и образуване н а екран, ч а с т и ч н о покри­
в а ш а к т и в н и я слой н а с т ъ к л о т о . Този
е ф е к т е оиде по-подчертан, к о г а т о е л е к т ­
р о д ъ т се използва в р а з т в о р и съдържаши
б е л т ъ к (кръв). П о ч и с т в а н е т о н а електро­
да може ч а с т и ч н о д а възстанови чувстви­
т е л н о с т т а му. Е л е к т р о д ъ т т р я б в а добре
да се промива между о т д е л н и т е проби или
буфери, з а да се избегне к р ъсто сан о замър­
сяване.
КаломелоВ р е ф е р е н т е н е л е к т р о д
С т ъ к л е н и я т електрод обикновено се изпол­
зва с каломелов р еф ер ен тен електрод. Дол­
н и я т край н а каломеловия електрод предс­
т а в л я в а запушалка о т фиброзен м а т е р и а л
или керамика. Тя служи к а т о т е ч е н м о с т
между н а с и т е н и я р а з т в о р н а KCl. В него е
п о т о п е н цилиндър о т каломел (HgCl). Кон­
т а к т ъ т с каломела се о с ъ ш е с т в я в а о т пла­
т и н е н а жица, к о я т о е свързана с pH м е т ъ ­
ра. П о р и т е н а к е р а м и ч н а т а запушалка или
фиброзния м а т е р и а л не т р я б в а да са запу­
шени и каломеловият електрод следва да бъ­
де т е р м о с т а т и р а н , за да поддържа п о с т о ­
янен потенциал.
П о т е н ц и а л п а т е ч н а т а връзка. С т ъ к ­
л е н и я т и референтния електрод са свърза­
ни със солеви м о с т и н а м я с т о т о на връз­
к а т а н а р а з т в о р а , к о й т о се изследва и со-
левия м о с т възниква потенциал на течна­
т а връзка. При възпроизводим потенциал на
т е ч н а т а връзка и с т а б и л е н р е ф е р е н т е н
електрод е д и н с т в е н а т а променлива ЕДС е
т а з и н а с т ъ к л е н и я електрод.
О т г о в о р ъ т н а с т ъ к л е н и я електрод, кой­
т о се получава при п о т а п я н е т о му в бу­
фер, може значително да се различава о т
т о з и , к о г а т о е п о т о п е н в р а з т в о р с под­
ч е р т а н о различни физикохимични свойст­
ва, напр. пълна кръв. З а т о в а е необходимо
да се използват контролни м а т е р и а л и мак­
симално наподобяваиди изследвания м а т е ­
риал, т . е . кръв.
С цел п о с т и г а н е к о м п а к т н о с т на измер-
419
б а щ о т о у с т р о й с т в о 6 съб ре мен н и т е ана­
лизатори на pH и кръвни газове стъклени­
я т и р е ф е р е н т н и я т електрод са и н т е г р и ­
рани. Р е ф е р е н т н и я т електрод в т о з и слу­
чай се с ъ с т о и о т нишка о т сребро/среПь-
рен хлорид, п о т о п е н а в запълващ в ъ т р е ш ­
н о с т т а разтвор, к о й т о е с определена кон­
центрация на СГ,
В о л т м е т ъ р (pH м е т ъ р )
Изходящото напрежение о т д в о й к а т а
стъклен електрод/референтен електрод е
обикновено нула, к о г а т о р а з т в о р ъ т , в кой­
т о е потопена е приблизително н е у т р а л е н ,
т . е . pH е около 7.0. При кисели р а з т в о р и въз­
никва положително напрежение, к о е т о се
променя в о т р и ц а т е л н о , к о г а т о р а з т в о ­
р ъ т е алкален. В ъ т р е ш н о т о съпротивление
на стъкления електрод е о т 100 до 1000 MQ.
З а т о в а м и л и в о л т м е т ъ р а , к о й т о се изпол­
зва за измерване н а потенциала, произве­
ден о т е л е к т р о д и т е , изисква входящо съп­
ротивление о т порядъка н а 100 000 MQ, з а
да се намали н а т о в а р в а н е т о н а у с т р о й с т ­
в о т о под 1%. З а т а з и цел се и з п о л з в а т
т р а н з и с т о р и . Обичайният о б х в а т на кръв­
н и т е pH м е т р и е о т pH 6.000 до 8.000 ± 0.005
к а т о pH е л е к т р о д ъ т е т е р м о с т а т и р а н при
37 0С ± 0.15 0С. А п а р а т ъ т т р я б в а да е в със­
т о я н и е да улавя и измерва промени о т по­
рядъка на 0.001 pH единици (60 микровол-
та).
Буферни р а з т в о р и
Всяко измерване н а pH с п о м о щ т а н а с т ъ к ­
лен електрод е о т н о с и т е л н о к а т о неизвес­
т н о т о pH н а п р о б а т а се сравнява с извес­
т н и т о ч н и с т о й н о с т и н а pH н а калибра-
иионни буферни р а з т в о р и . Подходящи ка-
либрационни буферни р а з т в о р и са ф о с ф а т ­
н и т е буфери: 25 mmol/1 калиев дихидроген
фосфат - 25 mmol/1 д и н ат ри е в хидроген фос­
ф а т и 1.0 mmol/1 калиев дихидроген ф о с ф а т
- 40 mmol/1 д и н а т р и е в хидроген ф о с ф а т .
Тяхното pH е с ъ о т в е т н о 6.840 и 7.416 при
38 0С и 6.881 и 7.429 при 20 0С.
420
ИЗМЕРВАНЕ НА ПАРЦИАЛНОТО
НАЛЯГАНЕ НА ВЪГЛЕРОДНИЯ
ДВУОКИС i p C 0 2 )
Съгласно зак о н а н а Д а л т о н п а р ц и а л н о т о
налягане н а СОг в проба о т сух газ при 760
m m H g и с к о н ц е н т р а ц и я н а СО2 6% е :
(6/100)760 = 45,6 mmHg. Ако г а з ъ т е напъл­
но н а с и т е н с водни пари при 37 0С, при коя­
т о т е м п е р а т у р а налягането на п а р и т е н а
в о д а т а е 47 m m Hg, т о п ар ц и ал н о то наля­
гане н а СО2 в с м е с т а с т а в а (6/100)(760 - 47)
= 42,8 mmHg. Ако т а з и газова смес е в рав­
новесие с кръв, т о п а р ц и а л н о т о налягане
н а СО2 в г а з о в а т а смес и в к р ъ в т а е едно и
също. Референтните стойности на pCO.j ß
артериална кръв са: 4.66 - 5.99 к Р а .
Екбилибрационни м е т о у и
(Memocj н а Astrup)
Ако л о г а р и т ъ м ъ т н а РСО2 н а цяла кръв се
нанесе в к о о р д и н а т н а с и с т е м а срещу с ъ о т ­
в е т н и т е с т о й н о с т и н а pH, нанесени н а ли­
нейна скала се получава права линия, о т р а ­
з я в а щ а право п р о п о р ц и о н а л н а т а зависи­
м о с т между т я х . При измерване н а рСС^
първо се п о с т р о я в а калибрационна крива
чрез т о н о м е т р и р а н е н а порции о т к р ъ в т а
н а п а ц и е н т а с газови смеси с п о з н а т о рСС^.
Тези смеси т р я б в а д а с а с високо парциал­
но налягане, з а д а се осигури пълно насища­
не н а хемоглобина. О т и з м е р е н о т о pH н а
к р ъ в н а т а проба о т п а ц и е н т а , след т о в а
о т к а л и б р а ц и о н н а т а к р и в а се о т ч и т а
РСО2.
Електрод н а Severinghouse
(рС02 е л е к т р о д )
Със с ъ з д а в а н е т о н а РСО2 е л е к т р о д а с т а н а
възможно д и р е к т н о измерване н а РСО2. По
принцип р С 0 2 е л е к т р о д ъ т п р е д с т а в л я в а
с т ъ к л е н pH е л е к т р о д , приспособен да из­
мерва pH н а т ъ н ъ к слой о т р а з т в о р н а н а т ­
риев б и к а р б о н а т (фиг. 22.2). Р а з т в о р ъ т на
н а т р и е в б и к а р б о н а т е о т д е л е н о т кръвна­
т а проба чрез м е м б р а н а о т п о л и т е т р а ф -
луоретилен (ТеПоп), к о я т о е пропусклива за
молекулите н а СО2, но не и з а други йони
намиращи се в к р ъ в т а , к о и т о биха могли
да п р о м е н я т pH н а б и к а р б о н а т н и я р а з т ­
вор.
На п р а к т и к а , к о м б и н а ц и я т а о т с т ъ к ­
лен pH е л ектрод и р е ф е р е н т е н електрод е в
к о н т а к т с б и к а р б о н а т н и я р а з т в о р . Въгле­
р о д н и я т диоксид дифундира през мембра­
н а т а в една или друга посока в з а в и с и м о с т
о т р а з л и к а т а в п а р ц и а л н и т е му налягания
о т д в е т е с т р а н и н а м е м б р а н а т а . В резул­
т а т н а в з а и м о д е й с т в и е т о н а С0 2 с вода­
т а о т б и к а р б о н а т н и я р а з т в о р се получа­
ва въглена киселина, к о е т о променя pH н а
р а з т в о р а . Д е с е т о к р а т н о п ови ше н и е н а
рСОг води до промяна н а pH с приблизител­
но една единица. Д и ф у з и я т а н а г а з о в е т е е
бавна, и за да се получи по-бърз о т г о в о р н а
електрода е необходимо с т ъ к л е н и я т елек­
т р о д да бъде разположен максимално близо
до т е ф л о н о в а т а мембрана. Под тефлонова­
т а мембрана е п о с т а в е н а в т о р а мембра­
на. Тя служи да образува т ъ н ъ к слой о т би-
карбонатен р а з т в о р между електрода и
т е ф л о н о в а т а мембрана, к о й т о изпълнява
р о л я т а н а т е ч н а връзка между т я х . В ъ т ­
р е ш н а т а мембрана е направена обикнове­
но о т целофан. Първоначално в ъ т р е ш н а т а
м е м б р а н а се е прикрепяла к ъ м д в о й к а т а
с т ъ к л е н / р е ф е р е н т е н е л е к т р о д чрез гумен
Фиг. 22.2. Принципно у с т р о й с т в о на рС0 2 елек­
т р о д а (по LA Kaplan, Aj Pasee)
п р ъ с т е н , а в т о р и п р ъ с т е н прикрепва вън­
ш н а т а мембрана към к р а и ш а т а н а кюве-
т а т а , в к о я т о са потопени е л е к т р о д и т е .
По-късно в ъ н ш н а т а т е ф л о н о в а мембрана
се заменя о т т а к а в а , направена о т сили-
конова гума, к о е т о дава в ъ з м о ж н о с т вре­
м е т о н а измерване да се намали до 60 s.
К а л и б р а ц и я л а рС() 2 е л е к т р о д а
Със стандартни газови смеси. К о г а т о рСОз
електрода се калибрира със с т а н д а р т н и га­
зови смеси е необходимо г а з о в а т а смес пре­
ди да достигне електрода да бъде т е м п е -
рирана и овлажнена. Съшо т а к а т р я б в а да
се има предвид, че к о г а т о г а з о в а т а смес
п р о т и ч а бавно през гумени или п л а с т м а ­
сови тръбопроводи може да се загуби СО2
поради т я х н а т а пропускливост за газове.
Тъй к а т о по принцип рСОг електрода пред­
с т а в л я в а pH електрод, т о и калибрацията
му е идентична. Г а з о в а т а смес, к о я т о за­
м е с т в а к р ъ в н а т а проба обикновено съдър­
ж а 5% С0 2 , 12% Ог и 83% N2. В т о р а т а газо­
ва смес е със съдържание 10% СО2 и 90% N2.
При повечето електроди и з о е л е к т р и ч н а т а
т о ч к а е при рСС^ приблизително 35 mmHg
(5% СО2). Лко Х% е к о н ц е н т р а ц и я т а на СО2
в о в л а ж н е н а т а газова смес при 370С, т о съ­
о т в е т н о т о парциално налягане в mmHg е
(В-47)Х/100, к ъ д е т о В е б а р о м е т р и ч н о т о
налягане.
Температурна чувствителност
н а рСОо е л е к т р о д а
Комбинираното влияние н а т е м п е р а т у р а ­
т а върху рП-електрода и РСО2 в к р ъ в н а т а
проба се и з р а з я в а в обгц к о е ф и ц и е н т н а
т е м п е р а т у р н а ч у в с т в и т е л н о с т о т 8% за
1 0С. Това означава, че т е р м о с т а т и р а н е т о
т р я б в а да г а р а н т и р а най-малко ± 0 . 1 0 С .
ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПАРЦИАЛНОТО
НАЛЯГАНЕ НА КИСЛОРОДА ( р 0 2 )
С р02 се означава парциалното налягане н а
кислорода. Съгласно закона н а Д а л т о н з а
п а р ц и а л н и т е налягания, парциалното на­
лягане н а кислорода в проба о т сух газ при
421
760 mmHg u к о н ц е н т р а ц и я н а Ог 20% е
( 2 0 / 1 0 0 ) 7 6 0 = 152 mmHg. Ако г а з ъ т е напъл­
но н а с и т е н с бодни пари при 37 С, парци­
алното налягане н а кислорода 6 с м е с т а е
( 2 0 / 1 0 0 ) - (760-47)= 142,6 mmHg. Ако т а з и га­
зова смес е в равновесие с кръв, т о парциал­
н о т о налягане на О2 в к р ъ в т а е 142,6 mmHg.
Референшнише стойности в артериална
кръв за възрастни са: Ю.вв -13.33 к Р а .

Полярографични е л е к т р о д и
за определяне н а п а р ц и а л н о т о
налягане н а О2 ß к р ъ в т а
( е л е к т р о д н а Clarck)

Полярографичният електрод за измерване

на р0 2 е под постоянно поляризиращо нап­
режение о т порядъка н а 0,6 V к а т о п р о т и ­
ч а щ и я т т о к е пропорционален н а парциал­
н о т о налягане на кислорода, дифундиращ
към к а т о д а . П р о т и ч а щ и я т т о к възниква
в р е з у л т а т на р е д у к ц и я т а на кислорода н а
к а т о д н а т а повърхност съгласно реакция­
т а : 0 2 + 2Н 2 0 + 4е' = 40Н". На фиг. 22.3 е пред­
ставено принципното у с т р о й с т в о н а РО2
електрода. На поля рог рафи ч н ат а к л е т к а
с ъ с т о я щ а се о т п л а т и н е н к а т о д и сребро/
сребърен хлорид анод се подава напрежение
около 0,6 V. Анодът играе роля на референ-
т е н електрод. В най-простия случай, кога­
т о п о в ъ р х н о с т т а н а е л е к т р о д и т е е голя­
ма, п р о т и ч а щ и я т т о к се измерва с ч у в с т ­
вителен галванометър. Всяка молекула кис­
лород реагира н а к а т о д а с ч е т и р и електро­
на и п о т о к ъ т на е л е к т р о н и т е се измерва с
галванометър или по-често с усилвател н а
т о к а . Е л е к т р о н и т е з а и з в ъ р ш в а щ а т а се ре­
акция се п р е д о с т а в я т о т сребро/сребърен
хлорид електрод, при к о е т о с р е б р о т о се
окислява на анода съгласно р е а к ц и я т а : Ag +
CI = AgCl + е . По т о з и начин всяка молеку­
ла кислород достигнала до п о в ъ р х н о с т т а
на к а т о д а веднага се редуцира. Възникна­
л и я т т о к е пропорционален н а количест­
в о т о кислород д о с т и г а щ до е л е к т р о д а з а
единица време. Т о к ъ т е пропорционален н а
наличния кислород н а електрода, но не и н а
парциалното налягане в п р о б а т а . З а да бъ­
де възникналият т о к мярка з а парциално­
т о налягане на 0 2 в п р о б а т а т р я б в а кисло­
р о д ъ т да се т р а н с п о р т и р а до к а т о д а само
чрез дифузия. При правилно р а б о т е щ поля-
422
фиг. 22.3. Принципно устройство на рОг елек­
трода (по LA Kaplan, Aj Pesce)
рографичен електрод п ар ц и ал н о то наляга­
не н а О2 н а к а т о д а т р я б в а д а е нула, при
к о е т о к о л и ч е с т в о т о н а кислорода, т р а н с ­
п о р т и р а н към к а т о д а чрез дифузия ще за­
виси о т р а з л и к а т а между п а р ц и а л н и т е на-
лягания н а кислорода върху к а т о д а и в про­
б а т а , т . е . о т п а р ц и а л н о т о налягане в про­
бата.
По принцип по-лесно е използването н а
„гол" к а т о д , но н а п р а к т и к а при изследване
н а цяла кръв се налага ч е с т о почистване с
оглед о т с т р а н я в а н е н а н а т р у п а л и я се бел­
т ъ к , к о й т о „отравя" електрода. Clark пре­
одолява т о з и проблем к а т о п о с т а в я пла­
т и н е н и я к а т о д и референтния електрод
зад мембрана, к о я т о напълно о т д е л я кръв­
т а о т п р о б а т а . М е м б р а н а т а обикновено е
направена о т т е ф л о н .
К а л и б р и р а н е н а р02 е л е к т р о д а
З а калибрирането н а р02 е л е к т р о д а обик­
новено се и з п о л з в а т с ъ щ и т е две газови сме­
си, използвани з а к а л и б р и р а н е т о н а рСОг
електрода, т . е . 10% СО2 + 90% N2 и 5% СО2
+ 12% Оо + 83% N2. П ъ р в а т а се използва за
нулиране н а а п а р а т а , а в т о р а т а за калиб-
шрането му.
ШТОМАТИЗАЦИЯ НА ОПРЕДЕЛЯНЕТО
1А pH И КРЪВНИ ГАЗОВЕ
])лед въвеждане определянето на pH и кръв-
ш газове в р у т и н н а т а клинично-лабора-
порна практика години наред се използват
лануално обслужвани а п а р а т и (известни у
шс к а т о апарати на Аструп). За работа-
па с т я х се изисква значителен о п и т по
)тношение п о д г о т о в к а т а на п р о б и т е за
шализ, калибриране на електродите, про­
верка на газовите к о н с т а н т и и изчисление
ia получените р е з у л т а т и . Използването
ia т е з и апарати в о т д е л е н и я т а за интен-
швни грижи о т персонал без лабораторна
квалификация представляваше голям проб-
кем. О т друга с т р а н а р а з в и т и е т о на голя­
л а т а хирургия (сърдечни операции при из-
юлзване на екстракорпорално кръвообра-
цение и пр.) изисква контролиране на по­
казателите на КАО на ч е с т и интервали (15
nin), к о е т о на практика не може да се осъ-
ц е с т в и с а п а р а т и на еквилибрационен
•финцип или мануално обслужваните кръв-
ю-газови анализатори. Това наложи а в т о -
латизиране на аналитичния процес. Съв­
ременните анализатори на pH и кръвни га-
юве се о т л и ч а в а т с висока степен на ав­
томатизация к а т о всички функции о т по­
даването на п р о б а т а до о т п е ч а т в а н е на
КИШОПИС
S
У1ажлраков ГМ, Чарькчиси Д Д (рсл). Алкалио-киоелииио
състояние иа организма и неговите иарушсиия. Второ
преработено и допълнено юдаиис,С., М с д н ф ш к , 19X1.
\(Jams АР, Ilahn CHW. Principle and praclicc of blood-gas
analysis, Ipswich, W S Kowcll, 1979.
р е з у л т а т а са напълно автоматизирани,
включително едноточкова и двуточкова ка-
либрация, чиято ч е с т о т а се избира по же­
лание на оператора. Повечето о т т е з и ана­
лизатори и м а т вграден микрокомпютър
или се свързват с външен персонален ком­
пютър, снабдени със софтуер, който включ­
ва няколко програми - за събиране, съхра­
нение и отпечатване на данни з а пациен­
тите и резултатите от изследването, за
събиране, съхранение и отпечатване на
данни от калибрациите и за автоматичен
качествен контрол.
Данните за пациента обикновено включ­
ват: паспортни данни, данни за материа­
л а за изследване, д а т а и час на вземане и
изследване, температура на пациента, кой
е взел материала за изследване и пр.
Данните за р е з у л т а т а о т изследването
м о г а т да включват: стойностите на от­
делните изследвани показатели, техните
референтни граници, интерпретация на по­
лучения резултат, данни за резултатите
от предишни изследвания.
Програмата за автоматичен качествен
контрол осигурява запазване и съхранение
на данните о т изследването на с ъ о т в е т ­
ни контролни материали, с т а т и с т и ч е с к а
обработка на събраните данни и графично
представяне на контролните карти за съ­
о т в е т н и я месец за т р и т е директно измер­
вани показателя pH, рС02 и рОз-
Astrup Р, Scvcringhaus JW. The history o f blood gases, acids and
bases, Copenhagen, Munksgaard, 1986.
Kaplan AL, Pesce AJ. Clinical chemistry: Theory, analysis, cor­
relations (3rd ed), St. Louis, Mosby, 1996.
423
 Автоматизация
6 хематологичната
лаборатория
АВТОМАТИЧЕН
ХЕМАТОАОГИЧЕН АНАЛИЗ
М. П е н е в
IL Д у к о в а - П е п е в а
Автоматизацията в клиничната лаборато­
рия прави първите си с т ъ п к и през 50-те го­
дини на XX век. Технологичната революция
о т 1970 г. насам дава силен т л а с ъ к на т о з и
процес. Първоначално а в т о м а т и з и р а н е т о
на процесите е в отговор на увеличения брой
анализи, които е трябвало да се извършат
в лабораторията. А в т о м а т и ч н и т е анали­
затори с п е с т я в а т у м о р а т а о т повтарящи
се действия и рязко намаляват възможнос­
т и т е за субективни грешки. А в т о м а т и з а ­
ц и я т а се развива к а т о р е з у л т а т на два па­
ралелни и взаимно влияещи си процеса:
1. С т р е м е ж ъ т за подобряване на диагнос­
тичния и лечебния процес и
2. Развитието на нови технологии.
Най-важните предпоставки и очаквани
полезни р е з у л т а т и о т а в т о м а т и з а ц и я т а
са:
• Намаляване с е б е с т о й н о с т т а на лабора­
т о р н а т а диагностика. Най-големи въз­
можности за намаляване на разходите
има ограничаването на трудовия ресурс.
• Скъсяване на времето за получаване на ла­
бораторния р е з у л т а т . Това има пряк
здравен и икономически ефект.
• Повишаване а н а л и т и ч н а т а надеждност
на лабораторните р е з у л т а т и .
• С помощта на а в т о м а т и ч н и т е системи
се получава по-голямо количество инфор­
мация, особено в хематологичната лабо­
ратория. Пряко се измерват голям брой
лабораторни показатели, въз основа на
които м о г а т да се получат допълнител-
но други - производни и изчислени показа­
424
тели. А в т о м а т и з и р а н и я т анализ може да
представи л а б о р а т о р н а т а информация в
графичен вид, к о й т о се възприема и ин­
т е р п р е т и р а по-лесно. Лабораторните ре­
з у л т а т и се съпровождат със съобщения
и коментари о т а в т о м а т и ч н о т о им съ­
поставяне с референтни граници, с кри­
т и ч н и стойности* и други данни, зало­
жени в к о м п ю т ъ р н а т а програма на ав­
т о м а т и ч н и я анализатор.
През последното десетилетие с т а н а ак­
туален проблемът за а в т о м а т и з а ц и я на ла­
б о р а т о р н и т е изследвания при леглото на
болния. През периода 1950-1980 г. бяха ин­
вестирани огромни средства за а в т о м а т и ­
зиране на а н а л и т и ч н а т а фаза. Успоредно с
т о в а се развиваше к о м п ю т ъ р н а т а техни­
ка, к о я т о намира приложение и в следана-
л и т и ч н а т а фаза.
И н т е р е с ъ т към преданалитичната фа­
за, в к о я т о са съсредоточени най-голямата
ч а с т о т и з т о ч н и ц и т е на вариация на лабо­
р а т о р н и т е р е з у л т а т и , респ. източниците
на грешки, н а р а с т в а през последните годи­
ни. Предпоставки за успешни разработки в
т а з и област са добрата аналитична надеж­
д н о с т на л а б о р а т о р н и т е м е т о д и и създа­
в а н е т о на модели за изолиране и количест­
вено определяне д е й с т в и е т о на ф а к т о р и т е
на преданалитичната вариация.
Основен въпрос при а в т о м а т и з а ц и я т а е
до каква с т е п е н е възможно или е оправда­
но а в т о м а т и з и р а н е т о на л а б о р а т о р н а т а
дейност. При решаване на проблемите на
а в т о м а т и з а ц и я т а м о г а т да се в з е м а т
предвид следните съображения:
> Независимо о т големия напредък в т е х ­
нологичните решения, вероятно никога
няма да бъде възможно автоматизира-
* к р и т и ч н а стойност н а лабораторен показател е
стойност извън референтния интервал за здрави л и ­
ца, к о я т о и з и с к в а н е з а б а в н о ( т е р а п е в т и ч н о )
действие
 н е т о на всички д е й н о с т и в лаб ора т ори я­
та.
> Използването н а а н с и ш з а т о р и с л т о -
г о в и с о к а п р о и з в о д и т е л н о с т е оп­
р а в д а н ос а м о в ц е н т р а л и з и р а н и л а ­
б о р а т о р и и . Ц е н т р а л и з а и и я т а удължа­
ва и оскъпява т р а н с п о р т а , удължава вре­
м е т о з а получаване н а р е з у л т а т и т е и с
т о в а противоречи н а с т р е м е ж а з а скъ­
сяване н а в р е м е т о между з а я в е н о и з ­
следване и получен резултат.
>• В и с о к а т а с т е п е н н а а в т о м а т и з а ц и я пре­
дизвиква з н а ч и т е л н о намаляване н а лабо­
р а т о р е н персонал с различна с т е п е н н а
квалификация. Н а м а л е н и я т брой специа­
л и с т и означава no-Aicuiko и д е и и н а у ч ­
н и р а з р а б о т к и . След увлечението пре­
ди 15-20 години з а все по-голяма ц е н т р а ­
лизация н а л а б о р а т о р н а т а д и а г н о с т и к а ,
напоследък се п р е д л а г а т идеи за райони­
ране на и з с л е д в а н и я т а с цел подобряване
н а в р ъ з к а т а между з а я в и т е л я н а изслед­
в а н и я т а и лабораторията, к а к т о и за
създаване н а повече р а б о т н и м е с т а .
>- П о н а с т о я щ е м се приема, че около 90% о т
немикроскопските изследвания в лабора­
т о р н а т а х е м а т о л о г и я м о г а т д а се а в т о ­
м а т и з и р а т . С т о й н о с т т а на т е з и анали­
зи ч е с т о е много висока и в редица случаи
т е се п р е д ш е с т в а т или п о с л е д в а т о т
у ч а с т и е н а квалифициран цитолог.
>• Изследва се в р е м е т о , необходимо за въз­
с т а н о в я в а н е н а с р е д с т в а т а , изразходва­
ни з а с к ъ п о с т р у в а щ а т а а п а р а т у р а . При­
е м а се, че л г а к с ш и а л н и я т с р о к е т р и
г о д и н и . През т о з и период обаче, а в т о ­
м а т и ч н и я т модул или ц я л а т а а в т о м а ­
т и ч н а с и с т е м а м о г а т да о с т а р е я т в
технологично о т н о ш е н и е и да се наложи
т я х н о т о изоставяне.
ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ
Съвременните хематологични а н а л и з а т о р и
д а в а т л а бораторни р е з у л т а т и въз основа
на два или т р и т и п а процеси:
I. Пряко измерИапи п о к а з а т е л и : концен­
т р а ц и я н а хемоглобин, брой е р и т р о ц и т и ,
левкоцити, т р о м б о ц и т и , диференциален
брой на л е в к о ц и т и т е в п р о ц е н т н и с т о й ­
ности.
2. П р о и з в о д н и п о к а з а т е л и : к а т о произ­
водни о т х и с т о г р а м и т е н а е р и т р о ц и т и ­
т е м о г а т д а се о п р е д е л я т с т о й н о с т и т е
на MCV и IIDW, к а к т о и MPV о т х и с т о ­
г р а м и т е на т р о м б о ц и т и т е .
3. Изчислени п о к а з а т е л и : т а к и в а са хема-
т о к р и т н а т а с т о й н о с т ( H c t ) , МСН,
МСНС, "абсолютните" (xl()9/l) с т о й н о с ­
т и н а л е в к о ц и т и т е п р и диференци­
а л н о б р о е н е , " а б с о л ю т н и т е " (х109/1)
с т о й н о с т и на р е т и к у л о ц и т и т е .
К о н ц е н т р а ц и я н а хемоглобин
Хемоглобинът в пълна кръв се измерва в го­
ляма ч а с т о т а п а р а т и т е посредством хе-
миглобинцианиден (HiCN) м е т о д . Този ме­
т о д е препоръчан о т ICSH за референтен в
хемоглобинометрията. Т р а н с Ф 0 Р м и Р а 1 щ 1 я т
р е а к т и в съдържа калиев ферицианид, кали­
ев цианид, кисел калиев ф о с ф а т и нейонен
д е т е р г е н т . Ж е л я з о т о в хемоглобина
(HbFe 2 + ) се окислява о т калиевия ферициа­
нид и преминава о т двувалентна - Fe 2+ (фе-
ро) в т р и в а л е н т н а - Fe 3+ (фери) форма. Три­
в а л е н т н о т о желязо се свързва с цианидния
йон и се о б р а з у в а х е м и г л о б и н ц и а н и д
(метхемоглобинцианш)), т р а е н цветен
комплекс с червеникав ц в я т , к о й т о се фо-
т о м е т р и р а при 540 п т (560-520 п т ) . Озна­
ч е н и я т а са:
ПЬРе 2+ - мономер н а хемоглобиновата
молекула
HbFe 3+
- мономер н а хемиглобина
(метхемоглобина)
3+
I IbFe CN - мономер на хемиглобинцианида
(метхемоглобинцианида)
В някои съвременни хематологични ана­
лизатори (Cell Dyn 3500, Cell Dyn 4000, Sysmex
с е р и я т а ) к о н ц е н т р а ц и я т а н а хемоглобина
се определя с р е а к т и в , к о й т о не съдържа ци­
анид. При Cell Dyn 3500 ц и а н и д ъ т с е з а -
лгеетва с х и д р о к с и л а м и н к а т о дирек­
т е н о к и с л и т е л и к в а т е р н е р н а алгони-
е в а с о л - з а о б р а з у в а н е н а с т а б и л е н цве­
т е н 1сол1Плекс. При Sysmex хемоглобинът
се определя с н а т р и е в л а у р и л е у л ф а т ,
к о й т о тр ан сф о р ми р а хемоглобина само за
10 sec, к о е т о е особено важно при анализа­
т о р и с висока пропускливост. Освен т о в а
елиминира и н т е р ф е р е н ц и и т е , х а р а к т е р н и
425
за силно изразена лебкоцитоза и/или липе-
мия. Налице е много добра корелация с хе-
миглобинцианидния м е т о д . Тези м е т о д и о т ­
г о в а р я т на и з и с к в а н и я т а з а опазване н а
околната среда и за избягване у п о т р е б а т а
на токсични в е щ е с т в а в л а б о р а т о р н а т а ди­
агностика.
Автоматични м е т о у и
з а б р о е н е н а кръВни к л е т к и
А в т о м а т и ч н о т о броене н а кръвни к л е т к и
осигурява много добра възпроизводимост и
т о ч н о с т на р е з у л т а т и т е . Заедно с несрав­
нимо п о - г о л я м а т а си п р о и з в о д и т е л н о с т ,
в ъ з м о ж н о с т и т е н а а в т о м а т и ч н и я анализ
предопределиха п р а к т и ч е с к и п ъ л н о т о за­
м е с тв а н е на м а н у а л н и т е количествени ме­
т о д и с а в т о м а т и ч н и . Камерно броене н а
левкоцити се извършва в малки л а б о р а т о ­
рии и при дежурства, к о г а т о използването
на хематологичен а н а л и з а т о р е неоправда­
но. Камерното броене н а е р и т р о ц и т и е на­
товарено с т в ъ р д е голяма аналитична греш­
ка, поради к о е т о м е т о д ъ т н е с е препо­
р ъ ч в а з а д и а г н о с т и ч н а дейност. Кога­
т о липсва хематологичен анализатор, ин­
ф о р м а ц и я т а о т н е и з в ъ р ш е н о т о каме рн о
броене на е р и т р о ц и т и се з а м е с т в а с опре­
деляне на H b и Hct. Камерно броене на т р о м -
боцити с фазово-контрастен микроскоп се
използва к а т о п о т в ъ р д и т е л е н м е т о д при
ниски с т о й н о с т и н а т р о м б о ц и т и т е , полу­
чени с а в т о м а т и ч е н анализатор, к а к т о и
за единични изследвания в малки л а б о р а т о ­
рии и при дежурства.
А в т о л ш т и ч н о т о броене н а кръвни­
те клетки и тяхното диференциране
се осъществява н а б а з а т а н а няколко ана­
литични принципи и процедури:
• Хидродинамично фокусиране: създаване н а
изолиран (ламинарен) п о т о к о т единични
клетки, ограничен в ъ т р е в по-голям п о т о к
о т изотонична т е ч н о с т , под действие н а
малко по-голямо налягане.
• Електрично съпротивление.
• Разсейване н а с в е т л и н а т а .
• Оптично сканиране в т ъ м н о поле.
• Лазерна о п т и к а .
• Центрофугиране,
• VCS технология - Volume, Conductivity,
426
Scatter (обем, проводимост, разсейване).
• MAPSS (Multiangle Polarized Scatter Sepa­
ration) - разсейване н а поляризирана с в е т ­
лина под различни ъгли.
• В и с о к о ч е с т о т е н електричен т о к в ради­
очестотния обхват.
А в т о л ю т и ч п о т о б роен е н а к р ъ в н и
к л е т к и се извършва при използване н а два
основни принципа: принцип н а електрично-
т о съпротивление (кондуктометричен
принцип) и принцип с разсейване н а светли­
ната.
К о н с л у к т о м е т р и ч е н п р и н ц и п . Принци­
п ъ т н а електрично съпротивление з а пос­
т о я н е н т о к с ниско напрежение, е описан
о т Wallace Н. Coulter през 1956 г. Този прин­
цип се използва широко в х е м а т о л о г и ч н и т е
анализатори. В съд, разделен н а две ч а с т и ,
к о и т о се с в ъ р з в а т помежду си чрез малък
о т в о р , се п о с т а в я е л е к т р о л и т . Във всяка
ч а с т о т съда се п о т а п я по един електрод.
Между д в а т а е л е к т р о д а п р о т и ч а п о с т о я ­
нен т о к с ниско напрежение. Е л е к т р о д и т е
се с в ъ р з в а т с о м м е т ъ р , к о й т о измерва съп­
р о т и в л е н и е т о между т я х . К о г а т о през о т ­
вора, съединяващ д в е т е ч а с т и н а съда пре­
минава само е л е к т р о л и т , с ъ п р о т и в л е н и е т о
между е л е к т р о д и т е е минимално. К о г а т о
през о т в о р а премине електрически непро-
водяща м а т е р и а л н а ч а с т и ц а - п л а с т м а с о ­
ва ч а с т и ц а или кръвна к л е т к а , съпротивле­
н и е т о между е л е к т р о д и т е н а р а с т в а . Пре­
м и н а в а н е т о н а електрически непроводяща
ч а с т и ц а през о т в о р а поражда и л т у л с н а
напреЛението. Броят н а създадените
и л т у л с и е п р о п о р ц и о н а л е н н а броя н а
прелгипалите през отвора частици.
Г о л е л ш н а т а н а и л т у л с и т е е пропор­
ц и о н а л н а н а р а з л ь е р а (обельа) н а пре-
лгиналата частица. Първият прото
т и п н а о т в о р по предложения о т W.H.Coul
t e r принцип е направен с целофанова обвив
к а н а п а к е т з а цигари, с к о е т о е започнало
р а з в и т и е т о н а б р о я ч и т е Coulter.
За определяне броя н а к р ъ в н и т е клетки,
определено количество к л е т ъ ч н а суспенсия,
с п о м о щ т а н а създаден вакуум, се пропуска
през малък о т в о р , разположен между два
електрода (фиг. 23.1). Г о л е м и н а т а на посто­
янния т о к между Е! и Е 2 зависи о т напреже
н и е т о между т я х , с ъ п р о т и в л е н и е т о н а сус-
п е н с и я т а и главно о т р а з м е р и т е н а о т в о р а

Фиг. 23.1. К о н д у к т о м е т р и ч е н принцип на Coul-
з а броене на кръвни к л е т к и
X - чашка със суспенсия о т кръвни клетки
Z - стъклена тръбичка с микроотвор
D - микроотвор
5,, Ej - измерителни електроди
3j, В2 - клеми на източника на постоянен т о к
Ч], Aj - клеми на входа на електронен усилвател
Яв - баластно съпротивление
0. К о г а т о т е ч н о с т т а преминава през О, т я
увлича и суспендираните в нея ч а с т и ц и (фиг.
23.2). Тъй к а т о к л е т ъ ч н а т а м е м б р а н а н а
Зсяка биологична к л е т к а и м а добри е л е к т -
ро-изолационни с в о й с т в а , с п е ц и ф и ч н о т о
зъпротивление р н а к л е т к и т е е много по-
голямо о т р 0 н а с у с п е н с и о н н а т а среда. По­
ради т о в а , к о г а т о някоя к л е т к а минава през
з т в о р а О, т я променя з н а ч и т е л н о разпре­
делението н а и н т е н з и в н о с т т а н а електрич-
н о т о поле в о т в о р а , вследствие н а к о е т о
з ъ п р о т и в л е н и е т о между Е, и ¥,2 н а р а с т в а .
Поражда се импулс н а напрежението, кой­
т о може да се види н а екрана н а осцилоско­
па. Б р о я т на с ъ з д а д е н и т е импулси е пропор-
дионален н а броя н а п р е м и н а л и т е през о т -
Зора клетки. А м п л и т у д а т а н а всеки импулс
з пропорционална н а размера н а к л е т к а т а .
Гова дава в ъ з м о ж н о с т с п о м о щ т а н а дис-
^риминатор о т д е л н и т е видове к л е т к и да се
Фиг. 23.2. Увеличен образ на д в и ж е н и е т о на сус­
пендираните клетки през микроотвора
р а з г р а н и ч а в а т по обем и да се б р о я т п о о т ­
делно. По т о з и начин м о г а т да се б р о я т и
и з м е р в а т само т а к и в а суспендирани ч а с т и ­
ци, за к о и т о р»р0 или р«р0 (фиг. 23.3). За да
м о г а т к л е т к и т е или ч а с т и ц и т е да мина­
в а т б е з п р е п я т с т в е н о през О, т е х н и я т ди­
а м е т ъ р т р я б в а д а бъде около 10 п ъ т и по-
малък о т д и а м е т ъ р а н а о т в о р а . К о г а т о
през О преминава непроводяща ч а с т и ц а или
к л е т к а , с ъ п р о т и в л е н и е т о между Е! и Е2 се
променя с AR:
AR=0.637a 3 /r 4 C 0
a - радиус на ч а с т и ц а т а
г - радиус на о т в о р а О
С т о й н о с т и т е на г и р0 са постоянни при
всяко измерване, о т к о е т о следва, че р 0 /г 4 = к,
или AR=k.a 3 .
О т т а з и формула се вижда, че ч а с т и ц и
или к л е т к и с нееднакви радиуси предизвик­
в а т силно различаващи се промени на съп­
р о т и в л е н и е т о AR, поради к о е т о генерира­
н и т е електрични импулси са различни по го­
лемина.
Р » Ро
Фиг. 23.3. Деформация на е л е к т р и ч н о т о поле
при слабо проводяща суспендирана ч а с т и ц а или
клетка
р - специфично електрично съпротивление на клет­
ката или частицата
р0 - специфично електрично съпротивление на сус­
пенсионната среда
За определяне разпределението н а к л е т ­
к и т е по т е х н и я обем, в съвременните хе-
м а т о л о г и ч н и а н а л и з а т о р и се и з п о л з в а т
многоканални амплитудни анализатори, на
к о и т о се п о д а в а т сигнали о т електронния
усилвател. А м п л и т у д н и т е анализатори се
с ъ с т о я т о т а м п л и т у д н и дискрилгина-
т о р и . Това са електронни у с т р о й с т в а с ре-
427
гулируем праг н а ч у в с т в и т е л н о с т (праг н а
дискриминация). Във всеки дискриминатор
м о г а т да в л и з а т само т а к и в а сигнали, чия­
т о а м п литуда е по-голяма или най-малко
равна на неговия праг н а ч у в с т в и т е л н о с т .
В многоканалните амплитудни а н а л и з а т о ­
ри праговете на ч у в с т в и т е л н о с т се разпо­
л а г а т равномерно в изследвания а м п л и т у ­
ден интервал. Сигналът, подаден н а ампли­
т у д н и я анализатор влиза в т е з и дискрими-
натори, ч и й т о праг н а ч у в с т в и т е л н о с т е
по-нисък о т н е г о в а т а амплитуда. О т всич­
ки т а к и в а дискриминатори се з а д е й с т в а са­
мо един - т о з и , ч и й т о п р а г н а д и с к р и м и ­
н а ц и я е н а й - в и с о к . Поради т о в а т о з и сиг­
нал н е лгоЖе д а з а д е й с т в а с л е д в а щ и я
дискриминатор и д а бъде преброен
втори път.
Високочестотен т о к . Постоянното
електрично съпротивление може да се изпол­
зва в комбинация с р а д и о ч е с т о т е н , високо­
ч е с т о т е н електричен т о к , к о й т о п р о т и ч а
в същото време между д в а т а електрода. До­
к а т о промените в съпротивлението на пос­
т о я н н и я т о к са пропорционални н а общия
обем на к л е т к а т а , п р о м е н и т е в радиочес­
т о т н и я сигнал са пропорционални н а обе­
м а на я д р о т о н а к л е т к а т а . К л е т ъ ч н а т а
с т е н а д е й с т в а к а т о проводник н а високо­
ч е с т о т н и я т о к . При преминаването на т о ­
ка през к л е т к а т а , може да се измери о т н о ­
шението ядро/цитоплазма, п л ъ т н о с т т а н а
ядрото, да се х а р а к т е р и з и р а т гранулите и
химическия с ъ с т а в на к л е т к и т е . Промени­
т е в п о с т о я н н и я и във в и с о к о ч е с т о т н и я
т о к м о г а т да се и з м е р в а т едновременно и
отделно с п о м о щ т а на две различни е л е к т ­
рически вериги.
Д в е т е различни к а ч е с т в а н а к л е т к и т е -
съпротивлението и проводилюстта
м о г а т да се използват за създаване н а дву­
посочна цитограма. На т а з и ц и т о г р а м а раз­
личните клетъчни групи се разполагат в о т ­
делни гнезда. С п о м о щ т а н а к о м п ю т ъ р и
програма за cluster анализ може да се опре­
дели абсолютния брой н а о т д е л н и т е кле­
т ъ ч н и групи в изследваната кръв. Едновре­
менното измерване н а с ъ п р о т и в л е н и е т о и
проводимостта н а к л е т к и т е в а в т о м а т и ч ­
н и т е хематологични анализатори е в осно­
в а т а на осъществяването на п е т - т и п н о ди­
ференциране на л е в к о ц и т и т е - н а н е у т р о -
фили, лимфоцити, моноцити, еозинофили и
428
базофили.
Разсейване н а сВетлината. Оптичното
с к а н и р а н е в т ъ м н о поле е въведено о т
Technicon Instruments през 1960-те години.
През 1970-те години Ortho Diagnostics
Systems създаде а п а р а т и с лазерна о п т и к а .
П р и н ц и п ъ т с разсейване н а с в е т л и н а т а - ла­
зерна и нелазерна, се използва в редица съв­
ременни хематологични анализатори. При
системата с разсейване на светлината,
хидродинамично фокусиран поток от кле­
тъчна суспенсия насочва клетките да пре­
м и н а т поединично през кварцова проточна
кювета, в която е фокусиран светлинен из­
точник (фиг. 23.4). С в е т л и н н и я т и з т о ч н и к
обикновено е волфрамова халогенна лампа
или хелиево-неонов лазер. Л а з е р н а т а с в е т ­
лина е монохроматична, с п о с т о я н н а дъл­
ж и н а н а в ъ л н а т а . П а р а м е т р и т е на лазер­
н а т а с в е т л и н а д а в а т в ъ з м о ж н о с т за брое­
не и идентифициране н а к л е т к и т е . К о г а т о
к л е т к а премине през о с в е т е н а т а ч а с т н а
п р о т о ч н а т а к ю в е т а и пресече светлинния
лъч, с в е т л и н а т а се разсейва във всички по­
соки. Р а з с е й в а н е т о е р е з у л т а т о т процеси­
т е н а абсорбция, дифракция, пречупване и
о т р а ж е н и е . Р а з с е я н а т а под определен ъгъл
лазерна с в е т л и н а се превръща в електричес­
ки сигнали с п о м о щ т а н а фотопреобразува-
т е л и (фотодиоди и ф о т о у м н о ж и т е л и ) пос­
т а в е н и под определени ъгли. С п о м о щ т а н а
лещи и подходящи р е ш е т к и се ограничава
п о п а д а н е т о н а неразсеяна с в е т л и н а във фо-
т о п р е о б р а з у в а т е л я и се к о н ц е н т р и р а раз­
с е я н а т а светл и н а. С и с т е м а о т ф и л т р и и
огледала разграничава с в е т л и н а т а с различ­
н а дължина н а в ъ л н а т а и я насочва к ъ м
Източник на
Клетки
о
светлина
Проточна
кювета
Поток о т
отделни клетки
Детектор
Фиг. 23.4. Схема на проточна кювета
фотопреобразубаглеля. Ф о т о д и о д и т е прев­
р ъ щ а т ф о т о н и т е светлина в електрични
сигнали, ч и я т о гол ем ина е пропорционална
н а л ъ ч и с т и я п о т о к . Ф о т о у м н о ж и т е л и т е се
и з п о л з в а т з а у л а в я н е н а по-малки л ъ ч и с т и
п о т о ц и , получени п о д ъ г ъ л 9 ( f u з а многок­
р а т н о усилване н а е л е к т р и ч н и я сигнал в по-
силен, използваем сигнал. Аналогово-цифров
проеобразувател превръща е л е к т р и ч н и т е
импулси в цифрови импулси, к о и т о се обра­
б о т в а т о т компютър. А м п л и т у д а т а н а
създадения е л с к т р и ч с н и л т у л с с про-
порциона^та н а обслш н а клетката.
Б р о я т н а с ъ з д а д е н и т е е л е к т р и ч н и импулси
е пропорционален н а б р о я пр еминал и к л е т ­
ки.
Лъчистият поток на разсеяната свет­
лина п о д ъ г ъ л 0° з а в и с и о т н а п р е ч н и л
р а з м е р н а k^iemkama поради дифрак-
ц и я т а н а свепигината.
Лъчистият поток на разсеяната свет­
лина п о д ъ г ъ л 90" е р е з у л т а т о т пречупва­
н е т о и о т р а ж е н и е т о н а с в е т л и н а т а о т по-
големи с т р у к т у р и в ъ в в ъ т р е ш н о с т т а н а
к л е т к а т а и зависи о т к о м п л е к с н о с т т а н а
вътреклетъчната структура. Лъчистият
п о т о к н а р а з с е я н а т а с в е т л и н а п о д лю^гък
ъ г ъ л ( ^ - З 0 ) също зависи о т о б е м а н а
к л е т к а т а , а л ъ ч и с т и я т п о т о к н а разсея­
н а т а п о д г о л л л 1 ъ г ъ л (5-15") к о р е л и р а с
коефициента н а отраЖение 23.5).
90° I н а т а г р а н и ц а н а д и с к р и м и н а т о р а се п о с т а ­
I Детектор
/ (голям ъгъл)
•
Светлинен
лазер
Клетка! 0°
У ] Де111 е к т о р
(мзлък ъгъл)
Фие. 23.5. Идентифициране на кръвни клетки
чрез разсейване на лазерна светлина
П а р а м е т р и т е н а р а з с е я н а т а под разли­
чен ъгъл с в е т л и н а м о г а т д а се и з п о л з в а т з а
създаване н а двупосочни ц и т о г р а м и . Анали­
з ъ т н а р а з с е й в а н е т о н а с в е т л и н а т а под раз­
лични ъгли е т е х н о л о г и я , р а з р а б о т е н а о т
Abbott з а броене и диференциране н а кръв­
н и т е клетки.
А в т о м а т и ч н о т о определяне броя н а
е р и т р о ц и т и т е включва и определяне н а
т е х н и я обем. К р ъ в т а се р а з р е ж д а в и з о т о -
ничен р а з т в о р в т а к а в а с т е п е н , че е р и т р о ­
ц и т и т е п р е м и н а в а т поединично през апер-
т у р а т а , с ъ о т в е т н о през п р о т о ч н а т а кю-
в е т а з а броене.
А в т о м а т и ч н о т о определяне броя н а лев­
к о ц и т и т е и т я х н о т о диференциране се из­
в ъ р ш в а след лизиране н а е р и т р о ц и т и т е . В
някои а п а р а т и л е в к о ц и т и т е се и з б р о я в а т
п о с р е д с т в о м м е т о д а с е л е к т р и ч н о съпро­
т и в л е н и е , подобно н а б р о е н е т о н а е р и т р о -
ц и т е . В други а п а р а т и се използва р е а к т и в ,
к о й т о лизира ц и т о п л а з м а т а н а л е в к о ц и т и ­
т е с последващо броене н а я д р а т а след ли-
зирането.
А в т о м а т и ч н о т о броене н а т р о м б о ц и т и -
т е включва и определяне н а т е х н и я обем.
Н а й - ч е с т о се използва р а з р е д к а т а , в к о я т о
се определя броя н а е р и т р о ц и т и т е . О б е м ъ т
н а т р о м б о ц и т и т е обикновено е много по-
м а л ъ к о т о б е м а н а е р и т р о ц и т и т е и раз­
г р а н и ч а в а н е т о н а д в а т а т и п а к л е т к и е лес­
но о с ъ щ е с т в и м о . Това се п о с т и г а к а т о гор­
ви при 3 5 J I .
А в т о м а т и ч н и хематологични а н а л и з а т о ­
ри, произвеждани о т редица фирми (Coul­
t e r C o r p o r a t i o n * *, A b b o t t L a b o r a t o r i e s ,
Serono-Baker Diagnostics, Instrumenta­
t i o n L a b o r a t o r y , R o c h e D i a g n o s t i c Sys­
t e m s , TOA M e d i c a l E l e c t r o n i c s C o m p a n y )
и м а т общи основни с и с т е м и , к а т о х и д р а в ­
личната, пневматичната и електри­
ч е с к а т а с и с т е м а . Н а а п а р а т и с осцило-
скопски е к р а н м о г а т д а се в и ж д а т е л е к т ­
р и ч н и т е импулси в реално време при брое­
н е т о н а к л е т к и т е . Модул с екран получава
информацията о т анализатора и о т п е ч а т ­
ва р е з у л т а т и т е , хистограмите и евенту­
ално - ц и т о г р а м и т е . Д е й с т в и я т а н а опера­
т о р а при р а б о т а с х е м а т о л о г и ч н и я анали­
з а т о р с а в з а в и с и м о с т о т с т е п е н т а н а ав-
** Coulter Corporation о т 1997 г. е включена в Весктап-
Coulter
429
т о м а т и з и р а н о с т - о т дискретни анализа­
т о р и до системи, при к о и т о у ч а с т и е т о н а
оператора се изчерпва с п о с т а в я н е н а про­
б и т е за изследване и получаване н а р е з у л т а ­
т и т е (walkaway system).
Съществуват също роботизирани с и с т е ­
ми, при к о и т о последователно с а свързани
хематологичен анализатор, а н а л и з а т о р з а
а в т о м а т и ч н о определяне броя н а р е т и к у -
лоцити и а в т о м а т за п р и г о т в я н е и оцве­
т я в а н е на кръвни натривки. К о м п ю т р и т е
в съвременните хематологични а н а л и з а т о ­
ри се о т л и ч а в а т с много големи възможнос­
т и и и м а т изключително голяма роля в об­
р а б о т к а т а н а информацията, получавана
о т анализатора и н а ч и н и т е за п р е д с т а в я ­
не на р е з у л т а т и т е . К о м п ю т ъ р н и т е прог­
рами обикновено включват програми з а ка­
чествен контрол с а в т о м а т и ч е н преглед н а
д а н н и т е о т к о н т р о л а , подвижна средна
а р и т м е т и ч н а , о ч е р т а в а н е н а графики, съх­
ранение на д а н н и т е о т кач ес т вен и я к о н т ­
рол и съхранение н а р е з у л т а т и т е о т опре­
делен брой изследвани проби. Р е з у л т а т и т е
о т анализа на проби т е кръв се о т п е ч а т в а т
със съобщения (флагове) з а евентуално о т к ­
лоняване о т р е ф е р е н т н и т е граници (и по­
с о к а т а на т о в а отклонение) и за к р и т и ч н и
с т о й н о с т и . Р е ф е р е н т н и т е граници и кри­
т и ч н и т е с т о й н о с т и се в ъ в е ж д а т о т опе­
ратора.
Някои съвременни хематологични анали­
з а т о р и са програмирани да се включ ва т и
изключват а в т о м а т и ч н о и да извършват са-
моподдържане чрез в ъ т р е ш н а проверка з а
функциониране н а с и с т е м и т е .
ХЕМАТОЛОГИЧНИ АНАЛИЗАТОРИ
НА BECKMAN-COULTER
Coulter Corporation произвежда широка га­
м а о т хематологични анализатори - о т Z
с е р и я т а с една а п е р т у р а до а в т о м а т и з и ­
р а н и т е walkway с и с т е м и МАХМ, STKS и Gen
S System. А п а р а т и т е н а Coulter обикновено
и м а т два канала за директно измерване. Д и ­
ректно се определя броя н а еритроци­
тите, н а л е в к о ц и т и т е и концентра­
ц и я т а н а х е м о г л о б и н а . В някои о т апа­
р а т и т е д и р е к т н о се определя и б р о я н а
тролгбоцитите. Аспирираната проба
кръв се разделя на две ч а с т и и се смесва с
430
изотоничен р а з т в о р . П ъ р в а т а ч а с т о т про­
б а т а се насочва към е р и т р о ц и т н и я канал,
а в т о р а т а - към левкоцитния. В к а м е р а т а
н а е р и т р о ц и т н и я канал се и з б р о я в а т е р и т ­
р о ц и т и и т р о м б о ц и т и . Б р о е н е т о и диферен­
ц и р а н е т о н а к л е т к и т е се извършва чрез кон-
дуктометричен м е т о д , к а т о суспенсията
о т к л е т к и се пропуска през т р и е д н а к в и
а п о р т у р и с дисиметър 50 ц т и д ъ л Я ш н а
60 цпи Ч а с т и ц и т е с о б е м о т 2 д о 20 f l с е
броят к а т о тромбоцити. Частиците
с о б е м по-голялг о т 36 fl с е б р о я т к а т о
е р и т р о ц и т и . Към в т о р а т а разредка, за
броене н а левкоцити, се прибавя р е а к т и в ,
к о й т о лизира е р и т р о ц и т и т е . Б р о я т н а
л е в к о ц и т и т е с е определя, к а т о суспен­
с и я т а от к л е т к и се пропуска през т р и
е д н а к в и а п е р т у р и с д и а л г е т ъ р 100^т и
д ъ л ж и н а 75 ц т . След определяне броя н а
л е в к о ц и т и т е , т а з и разредка се пропуска
през х е м о г л о б и н о м е т ъ р а , к о й т о о т ч и т а
к о н ц е н т р а ц и я т а н а хемоглобина при дължи­
н а н а в ъ л н а т а 525 п т . Е л е к т р и ч н и т е им­
пулси, получени при броене н а к л е т к и т е се
п р е д а в а т н а а н а л и з а т о р , к о р и г и р а т се з а
ко-инцидентна грешка и се извършва циф
р о в а т а им т р а н с ф о р м а ц и я . Две о т т р и т е
с т о й н о с т и получени о т т р и т е а п е р т у р и за
с ъ о т в е т н и я т и п к л е т к и , т р я б в а да съвпа­
д а т помежду си в определени граници, за да
бъдат приети о т апарата. Тази техни
к а н а мноЖествено броене предпазва
о т погрешни р е з у л т а т и поради за­
п у ш в а н е н а а п е р т у р и т е з а броене и л и
о т рязко отк^юнлващи се стойности
и е предпоставка за лтого добрата
възпроизводимост н а а п а р а т и т е н а
Coulter. Анализира се в и с о ч и н а т а н а елек
т р и ч н и т е импулси о т всяка а п е р т у р а . Въз
основа н а т е з и данни се с ъ з д а в а т х и с т о ­
грами з а разпределението н а е р и т р о ц и т и
т е , л е в к о ц и т и т е и т р о м б о ц и т и т е в зави
с и м о с т о т т е х н и я обем. С р е д н и я т обем на
е р и т р о ц и т и т е (MCV) е средна с т о й н о с т
получена о т д а н н и т е за разпределението им
по обем. Х е м а т о к р и т н а т а с т о й н о с т се из­
числява о т броя н а е р и т р о ц и т и т е и MCV,
с р е д н о т о съдържание н а хемоглобин (МСИ)
се изчислява о т с т о й н о с т и т е на хемогло­
бина и броя н а е р и т р о ц и т и т е , а с р е д н а т а
концентрация н а хемоглобин в е р и т р о ц и т и ­
т е (МСНС) - о т с т о й н о с т и т е н а хемогло
бина и х е м а т о к р и т а . Ш и р и н а т а н а разпре
делението н а е р и т р о ц и т и т е (RDW) се из­
числява пряко о т х и с т о г р а м а т а . Изразява
:е к а т о к о е ф и ц и е н т н а вариация (CV) в раз­
пределението н а е р и т р о ц и т и т е по обем.
RDW е п о к а з а т е л за анизоцитоза, но т о й мо­
же д а бъде фалшиво променен, т ъ й к а т о
RDVV о т р а з я в а о т н о ш е н и е т о между с т а н ­
д а р т н о т о отклонение и MCV. При непроме­
нено с т а н д а р т н о отклонение, ако MCV е на­
малено, с т о й н о с т т а н а RDW ще бъде висо­
ка, к о е т о ще означава фалшиво увеличена и
зигнализирана а н и з о ц и т о з а .
Т р о м б о ц и т и т е се б р о я т в диапазона 2-
20 П, к а т о заедно с т о в а се дава х и с т о г р а ­
м а н а разпределението им по обем. Ако раз­
пределението н а т р о м б о ц и т и т е с ъ о т в е т ­
с т в а н а специфични к р и т е р и и , п ъ р в и ч н и т е
данни се о б р а б о т в а т с т а т и с т и ч е с к и по ме­
т о д а на най-малките к в а д р а т и и д а н н и т е
зе р а з п о л а г а т в log-нормална крива. Крива­
т а се е к с т р а п о л и р а до 70 П и окончателни­
я т брой н а т р о м б о ц и т и т е се извежда о т
нея. С т а з и процедура се елиминира и н т е р -
ф е р е н ц и я т а н а о с т а т ъ ц и о т к л е т к и при
н и с к и т е с т о й н о с т и и малки е р и т р о ц и т и -
при високите с т о й н о с т и . С р е д н и я т обем на
т р о м б о ц и т и т е (MPV) е аналог н а MCV и се
получава о т х и с т о г р а м а т а на т р о м б о ц и т и ­
те.
Редица а п а р а т и н а Coulter, к а т о S-Plus
IV, STKR, А( «Т diff 2 и з в ъ р ш в а т 3 - т и п н о ди­
ференциране н а л е в к о ц и т и т е , к а т о ги разг­
р а н и ч а в а т н а лим фоц и т и , „мононуклеарни"
к л е т к и и гранулоцити. В левкоц и т н и я ка­
нал лизиращ р е а к т и в предизвиква диферен­
цирано к о н т р а х и р а н е н а л е в к о ц и т и т е , след
к о е т о б р о я т и о б е м ъ т н а к л е т к и т е се оп­
ределя чрез к о н д у к т о м е т р и ч е н м е т о д . С по­
лучените данни се създава х и с т о г р а м а н а
л е в к о ц и т и т е . Т р и т е групи к л е т к и се разг­
р а н и ч а в а т по обем. К л е т к и с обем о т 35 до
90 П се о п р е д е л я т к а т о лимфоцити; к л е т к и
с обем о т 90 до 160 fl - к а т о „мононуклеари"
(моноцити, б л а с т и , незрели гранулоцити и
а т и п и ч н и лимфоцити) и к л е т к и с обем 160-
450 П - к а т о гранулоцити. М е т о д ъ т дава
възможност да се п о л у ч а т р е з у л т а т и в про­
ц е н т н и (%) и в абсолют н и (х109/1) стойнос­
т и за т р и т е т и п а к л е т к и . С п о м о щ т а н а
компютъризирани а л г о р и т м и е възможно
получаването н а съобщения за увеличение на
еозинофилните и /или на базофилните к л е т ­
ки, к а к т о и за аномални к л е т к и , к а т о а т и ­
пични лимфоцити и бласти. К о г а т о клетъч­
н и т е популации се п р и п о к р и ват или не се
наблюдава ясно разграничаване н а попула­
ц и и т е се появява съобщение за интерферен-
ция н а х и с т о г р а м а т а з а разпределение н а
к л е т к и т е по обем. Това може да се дължи
н а наличие напр. н а е р и т р о б л а с т и , н а агре-
гирали т р о м б о ц и т и , на нелизирани е р и т р о ­
ц и т и или н а електронен „шум".
По-нови модели а п а р а т и н а Coulter, к а т о
STKS, МАХМ и Gen S System д а в а т резулта­
т и , к а к т о посочените по-горе, но в о т д е ­
лен канал т е използват VCS т е х н о л о г и я т а
н а Coulter за анализ н а л е в к о ц и т и т е и из­
вършване н а 5 - т и п н о диференциално брое­
не. VCS анализите се извършват едновремен­
но за всяка к л е т к а . След к а т о е р и т р о ц и т и ­
т е б ъ д а т лизирани, л е в к о ц и т и т е се т р е т и ­
р а т със стабилизиращ р е а к т и в , за да б ъ д а т
съхранени в с ъ с т о я н и е близко до н ати вн о -
т о . След т о в а п р о б а т а се насочва към про-
т о ч н а т а кювета. С постоянния ток се
и з м е р в а о б е м а н а к л е т к а т а . С висо­
к о ч е с т о т н и я т о к с е и з м е р в а проводи­
м о с т т а н а к л е т к а т а , к о я т о е инди­
к а т о р н а в ъ т р е к л е т ъ ч н и я състав. Вся­
к а к л е т к а се сканира с монохроматичен ла­
зерен лъч, в р е з у л т а т н а к о е т о се получава
информация з а п о в ъ р х н о с т т а , ф о р м а т а и
с т р у к т у р а т а н а к л е т к а т а . Във всяка из­
следвана проба кръв се а н а л и з и р а т около
8 000 клетки. С к о м б и н а ц и я т а о т техноло­
г и и т е се получава три-измерна ц и т о г р а м а
н а л е в к о ц и т н и т е популации, к о и т о се ди­
ф е р е н ц и р а т о т к о м п ю т ъ р а с п о м о щ т а на
cluster анализ.
Х е м а т о л о г и ч н и я т а н а л и з а т о р Coulter
Gen S System определя и броя н а ретикуло-
ц и т и т е в к р ъ в т а . Багрилото - New Methylen
Blue се и н к у б и р а с п р о б а п ъ л н а к р ъ в
(суправитално оцветяване). Б о я т а преципи-
т и р а базофилната с у б с т а н ц и я в ретикуло-
ц и т и т е , съдържаща РНК. Хемоглобинът и
н е с в ъ р з а н а т а боя се о т с т р а н я в а т с изчис­
т в а щ реактив. В п р о б а т а кръв о с т а в а т зре­
л и т е е р и т р о ц и т и и т ъ м н о о ц в е т е н и т е ре-
т и к у л о ц и т и . Р е т и к у л о ц и т и т е се разграни­
ч а в а т о т з р е л и т е е р и т р о ц и т и и о т други
клетъчни популации н а принципа на разсей­
ване на с в е т л и н а т а , н а измерване с посто­
янен т о к и по н е п р о з р а ч н о с т т а си.
Р е ф е р е н т н и т е граници на всички изслед­
вани хематологични показатели се въвеж-
431
g a m 6 а н а л и з а т о р а , заедно с програми, кои­ ц и т н о / т р о м б о ц и т н и я се и з п о л з в а т „про­
т о с и г н а л и з и р а т при с т о й н о с т извън рефе- менливи д и с к р и м и н а т о р и " з а диференци­
р е н т н и я и н т е р в а л . Посочва се с ъ щ о посока­ р а н е н а в с я к а к л е т ъ ч н а популация.
т а н а п р о м я н а т а - повишение или н а м а л е ­ Е л е к т р и ч н и т е сигнали, к о и т о се получа­
ние н а п о л у ч е н а т а с т о й н о с т . Х е м а т о л о г и ч - в а т при п р е м и н а в а н е т о н а к л е т к и т е през
н и т е а н а л и з а т о р и STKS и C o u l t e r G e n S а п е р т у р а т а , к у м у л и р а т и се с ъ з д а в а крива
System д а в а т съобщения з а морфологични н а р а з п р е д е л е н и е т о н а к л е т к и т е по о б е м . ;
аномалии, включително з а незрели грануло- Въз основа н а т а з и к р и в а се определя о п т и ­
ц и т и , к о и т о в к л ю ч в а т пръчкоядрени к л е т ­ м а л н о т о ниво н а а в т о м а т и ч н и я дискрими-1
ки и б л а с т и , а т и п и ч н и л и м ф о ц и т и , е р и т - н а т о р н а а п а р а т а . По т о з и н а ч и н напри­
робласти, а г р е г а т и о т т р о м б о ц и т и . При мер е възможно д и с к р и м и н а т о р ъ т за т р о м ­
Coulter Gen S System с ъ о б щ е н и я т а с а разде­ б о ц и т и с м а л ъ к обем д а се у с т а н о в и м е ж д у
лени н а „съмнение за" и „ д е ф и н и т и в н и . Те­ 2 и 6 fl, а з а т р о м б о ц и т и с голям обем - м е ж ­
зи данни с а много полезни з а оценяване н а ду 12 и 30 П. Подобно н а т о в а , з а е р и т р о ц и ­
л а б о р а т о р н и т е промени и н а с о к и т е з а до­ т и с м а л ъ к и голям обем, с т о й н о с т и т е н а
пълнителни изследвания. д и с к р и м и н а т о р и т е м о г а т д а се у с т а н о в я т
м е ж д у 25 и 75 fl, респ. м е ж д у 200 и 250 П. „Про-
лгенливите дискрилшнатори" д а в а т
ХЕМАТОЛОГИЧНИ АНАЛИЗАТОРИ възлюЖност з а точно разграничаване
SYSMEX н а клетъчните популации във всяка
о т р а з л и ч н и т е п р о б и кръв, к о и т о с е
А п а р а т и т е Sysmex се п р о и з в е ж д а т о т ТОА
и з с л е д в а т е д н а с л е д д р у г а . „Прол1енли-
Medical Electronics Company и в к л ю ч в а т пъл­
в и я т дискрилшнатор" в еритроцит-
н а редица а н а л и з а т о р и - о т н а й - м а л к и т е К-
н и я кана*1 е о с о б е н о п о л е з е н з а р а з г р а ­
1000 до най-сложните, NE-8000, SR-9000, SF-
ничаване н а трольбоцитите о т лшл-
3000, к о и т о и з в ъ р ш в а т 5 - т и п н о диференци­
ките еритроцити.
ране н а л е в к о ц и т и т е . К о п ц е н т р а ц ш т г а
Х е м а т о к р и т ъ т се определя също в е р и т -
н а хелюглобипа, х е л т т о к р и т п а т а
р о ц и т н о / т р о м б о ц и т н и я к а н а л въз основа
стойност, общият брой левкоцити,
н а с ъ о т в е т с т в и е т о между височината на
е р и т р о ц и т и и т р о м б о ц и т и с е изльер-
е л е к т р и ч н и т е импулси и о б е м а н а к л е т к и ­
в а т д и р е к т н о . В а п а р а т а се и з п о л з в а т
те. Хематокритът е кумулативната
т р и хидравлични п о д с и с т е м и з а изследване
н а х е м а т о л о г и ч н и т е п о к а з а т е л и : л е в к о ц и - в и с о ч и н а н а и л т ц л е а и се о ц е н я в а к а т о
т е н к а н а л , к а н а л з а е р и т р о ц и т и и п р о ц е н т е н обем н а е р и т р о ц и т и т е с п р я м о
т р о л г б о ц и т и и о т д е л е н к а н а л з а х е ­ о б щ и я обем н а к р ъ в т а .
моглобин. Броят н а е р и т р о ц и т и т е и К о н ц е н т р а ц и я т а н а хемоглобина се оп­
л е в к о ц и т и т е с е о п р е д е л я с к о н д у к т о - ределя с хемиглобинцианидния м е т о д при
л г е т р и ч н и я м е т о д , к а т о с у с п е н с и я т а а н а л и з а т о р и о т с е р и я т а СС-180/170/150/130,
н а в с е к и о т д в а т а в и д а / с л е т к и с е а с ­ F-500/300, F-520, F-820, к а т о а б с о р б ц и я т а се
п и р и р а п р е з о т д е л н а а п е р т у р а . Е д - и з м е р в а при д ъ л ж и н а н а в ъ л н а т а 540 п т .
н о в р е л г е н н о с б р о е н е т о с е о п р е д е л я и А н а л и з а т о р и о т с е р и я т а К-800, К-1000,
обельа н а п р е л ь и н а в а щ и т е п р е з а п е р - Е-5000/4000/2500, NE-1500, NE-8000/7000/
т у р а т а / с л е т к и . К о н д у к т о м е т р и ч н и я т 5500, NE-Alpha о п р е д е л я т хемоглобина н а ба­
м е т о д при т е з и а п а р а т и е у с ъ в ъ р ш е н с т ­ з а т а и н а д в а т а принципа, по избор н а по­
в а н в д в е насоки: т р е б и т е л я - ц и а н м е т х е м о г л о б и н или с
• в канала з а е р и т р о ц и т и и т р о м б о ц и т и се н а т р и е в лаурилеулфат, а т е з и о т с е р и я т а
използва п о т о к о т единични к л е т к и посред­ К-4500, КХ-21, SF-3000, SE-9500/9000 и ХЕ-2100
с т в о м хидродинамично фокусиране, з а д а се и з в ъ р ш в а т о п р е д е л я н е т о с а м о с лаурилеул­
н а с о ч а т к л е т к и т е д а п р е м и н а т през апер- ф а т .
т у р а т а поединично. По т о з и начин се на­ Заедно с м а т е м а т и ч е с к и т е п о к а з а т е л и ,
малява к о - и н ц и д е н т н а т а грешка и нееднак- изчислени н а б а з а т а н а д и р е к т н о определя­
в о с т т а н а е л е к т р и ч н и т е импулси; н и т е и п р о и з в о д н и т е п о к а з а т е л и , се изчис­
л я в а с ъ щ о P-LCIl (Platelet Large Cell Ratio) -
• в д в а т а канала - левкоцитния и е р и т р о -
о т н о ш е н и е т о н а г о л е м и т е т р о м б о ц и т и (с
432
обем по-голям о т 12 П) к ъ м о б щ и я брой
т р о м б о ц и т и . Това о т н о ш е н и е може да бъ­
де и н д и к а т о р з а наличие н а г и г а н т с к и
т р о м б о ц и т и , а г р е г и р а н с н а трольбо-
ц и т и и л и н а к~1етъчни ф р а г л г с н т и .
Х е м а т о л о г и ч н и т е а н а л и з а т о р и SE-9000,
SE-9500 и NE-8000 и з в ъ р ш в а т 5 - т и п н о дифе-
ренииране н а л е в к о ц и т и т е посредством ди­
ференцирано к о н т р а х и р а н е и лизиране н а
к л е т к и т е , последвано о т измерване чрез
кондуктометричния м е т о д с постоянен и
с р а д и о ч е с т о т е н т о к . С помоищш н а дву­
посочна ц и т о г р а м а , н а една о т о с и т е н а ко­
я т о се н а н а с я т д а н н и т е о т р а д и о ч е с т о т ­
н и т е сигнали, а н а д р у г а т а ос - д а н н и т е о т
п о с т о я н н и я т о к , се р а з г р а н и ч а в а т лимфо-
ц и т и , м о н о ц и т и и гранулоцити. Посредст­
вом „променливите дискриминатори" се пос­
т и г а о п т и м а л н о разграничаване н а т е з и
групи к л е т к и ( а д а п т и в е н cluster анализ).
Еозинофилните и б а з о ф и л н и т е к л е т к и се
б р о я т в о т д е л н и канали, в к о и т о е р и т р о ­
ц и т и т е се л и з и р а т и всички левкоцити ос­
вен еозинофилите и базофилите се деформи­
р а т избирателно чрез т е м п е р а т у р н о въз­
д е й с т в и е и контролирани химически реак­
ции.
Х е м а т о л о г и ч н и т е а н а л и з а т о р и SE-9000, SE-
9500 и NE-8000 о п р е д е л я т и броя н а р е т и к у -
л о ц и т и т е (RET) чрез п р и с т а в к а т а КЛМ-1
посредством ф л о у ц и т о м е т р и я . Използва се
ф л у о р е с ц е н т н а т а боя Auramine-O, к о я т о
прониква в к л е т к и т е и избирателно свърз­
ва РНК. Р е т и к у л о ц и т и т е , предварително
белязани с ф л у о р е с ц е н т н о т о багрило и под­
ложени н а хидродинамично фокусиране, пре­
с и ч а т лъча н а аргонов лазер. Г е н е р и р а т се
два вида о п т и ч н и сигнали: а) и з л ъ ч е н а т а
флуоресцентна с в е т л и н а , ч и й т о и н т е н з и ­
т е т е пропорционален н а к о л и ч е с т в о т о н а
к л е т ъ ч н а т а РНК и б) р а з с е я н а т а лазерна
с в е т л и н а ( под ъгъл 20-190), ч и й т о и н т е н з и ­
т е т зависи о т размера н а к л е т к а т а . Ана­
л и з ъ т н а р е т и к у л о ц и т и т е включва:
• Брой в промили и а б с о л ю т н а с т о й н о с т .
• Двуизмерна RET ц и т о г р а м а , зависима о т
размера н а к л е т к и т е и в ъ т р е к л е т ъ ч н а ­
т а п л ъ т н о с т , с ъ о т в е т с т в а щ а н а коли­
ч е с т в о т о РНК. В RET ц и т о г р а м а т а се
р а з л и ч а в а т няколко зони: т р о м б о ц и т н и
сенки, зрели е р и т р о ц и т и и ретикулоци-
ти.
• Брой н а р е т и к у л о ц и т и т е (в % и абсолю­
т е н брой) според и н т е н з и т е т а н а флуо­
ресценцията. RET са разпределени о т съ­
о т в е т н и т е дискриминатори в т р и суб-
популации, к о и т о с ъ о т в е т с т в а т н а с т е ­
п е н т а н а т я х н а т а зрелост: LFR, MFR и
HFR (low, middle, high fluorescence ratio).
З р е л о с т т а на RET намалява о т ниска (low)
към висока (high) флуоресценция.
Тези показатели м о г а т да б ъ д а т използ­
вани за определяне з р е л о с т т а н а ретикуло­
ц и т и т е и к а т о предсказващи костномозъч-
н а регенерация при проследяване състояни­
е т о и лечението н а анемично болни. Удъл­
ж е н а RET ц и т о г р а м а се появява, к о г а т о се
визуализира флуоресцентна и н т е н з и в н о с т
след високия флуоресцентен дискримина-
т о р . Тази о б л а с т включва е р и т р о б л а с т и
или еритроцити, съдърЖащи т е л ц а
н а H o wel-Jolly. Сливането н а з о н и т е н а
т р о м б о ц и т н и т е сенки и з р е л и т е е р и т р о ­
ц и т и в р е т и к у л о ц и т н а т а ц и т о г р а м а мар­
кира наличието н а е р и т р о ц и т н и фрагмен­
ти.
ХЕМАТОЛОГИЧНИ АНАЛИЗАТОРИ
CELL DYN
Abbott Laboratories произвежда хематологич-
ни анализатори Cell-Dyn (CD) с различна с т е ­
пен на а в т о м а т и з и р а н о с т . Cell-Dyn 1300 да­
ва 8 показателя. К л е т к и т е се б р о я т на кон­
д у к т о м е т р и ч н и я принцип. Cell-Dyn 1400 е
а в т о м а т и ч н а с и с т е м а , к о я т о определя 12
показателя, включително 2-типно диферен­
циране н а л е в к о ц и т и т е . Cell-Dyn 1700 дава
18 показателя и 3-типно диференциално бро­
ене. По избор може да се използват епрувет­
ки т и п затворена система и да се получат
графични данни с т р и хистограми. Cell-Dyn
3000 има т р и отделни канала за измерване
и диференциране: 1. О п т и ч е н канал за брое­
не на левкоцити и за т я х н о т о диференци­
ране; 2. Канал за броене н а е р и т р о ц и т и и
т р о м б о ц и т и чрез к о н д у к т о м е т р и ч е н ме­
т о д ; 3. Канал за определяне н а хемоглобин.
Cell-Dyn 3500 има допълнителен канал за кон-
д у к т о м е т р и ч н о определяне броя на левко­
ц и т и т е . Този канал се използва к а т о в ъ т ­
решна контрола н а р е з у л т а т и т е о т оптич­
н о т о броене н а л е в к о ц и т и т е . Б р о я т н а
433
левкоцити, е р и т р о ц и т и , тролгбоци групи левкоцити - неутрофили, еозинофили,
т и и концентрацията п а хемоглоби­ базофили, м о н о ц и т и и лимфоцити. Cell-Dyn
н а се определнт д и р е к т н о о т а п а р а ­ 4000 е н а й - н о в и я т модел н а Abbott Labora­
та. Б р о я т u о б е м ъ т н а е р и т р о ц и т и т е и tories. В т о з и а п а р а т се използват измерва­
т р о м б о ц и т и т е се определя по к о н д у к т о ния с разсейване н а с в е т л и н а т а о т аргонов
м е т р и ч н и я м е т о д , к а т о с у с п е н с и я т а о т лазер и фокусирано к о н д у к т о м е т р и ч н о из­
клетки се пропуска през а п е р т у р а с разме­ мерване, комбинирани с д в у ц в е т н а флуорес­
ри 60x70 |лт. Клетки с обем о т 1 до 35 П се центна флоуцитометрия. С а п а р а т а се по­
в клю ч в ат към п ъ р в о н а ч а л н и т е данни з а л у ч а в а т 26 л а б р а т о р н и п о к а з а т е л я , вклю­
т р о м б о ц и т и , а по-големите о т 35 П се бро­ ч и т е л н о 5 - т и п н о диференциално броене, ав­
я т к а т о е р и т р о ц и т и . След т о в а , з а о п т и ­ т о м а т и ч е н анализ н а р е т и к у л о ц и т и посред­
мално разграничаване на т р о м б о ц и т н а т а с т в о м флуоресцентно маркиране н а РПК и
популация и о т с т р а н я в а н е н а интерферен- определяне броя н а е р и т р о б л а с т и т е чрез
ции, к а т о ч а с т и о т к л е т к и и малки е р и т ­ флуоресцентно о ц в е т я в а н е н а ДНК. Хемог­
роцити, се използват „променливи дискри- л о б и н ъ т се определя с р е а к т и в , к о й т о не съ­
минатори". MCV се получава о т д а н н и т е з а държа цианид.
разпределението на е р и т р о ц и т и т е по обем.
Хемоглобинът се определя по л ю д и ф и ц и -
р а н х е л ш г л о б и н ц и а п и д е н Aiemog, к а т о ХЕМАТОЛОГИЧНИ АНАЛИЗАТОРИ
абсорбцията се о т ч и т а при 540 п т . Хема- TECHNICON
т о к р и т ъ т , МСН и МСНС се изчисляват о т
пряко измерваните или о т производните по­ Х е м а т о л о г и ч н и т е а н а л и з а т о р и о т с е р и я т а
казатели. RDW е о т н о с и т е л н а с т о й н о с т , Technicon Н* се произвеждаха о т ф и р м а т а
к о я т о се получава о т х и с т о г р а м а т а н а Miles. П о н а с т о я щ е м т е се п р о и звеж д ат о т
е р и т р о ц и т и т е посредством 2 0 - т и и 8 0 - т и ф и р м а т а Bayer, к о я т о включи в с ъ с т а в а си
персентили. Miles. Всички а н а л и з а т о р и Technicon Н*-
Б р о я т на л е в к о ц и т и т е и диференциално­ Н*1,11*2 и Н*3 о п р е д е л я т кръвна к а р т и н а и
т о броене се определят с о п т и ч н и я канал диференциален брой н а л е в к о ц и т и т е .
посредством анализ на разсейване н а поля­ Technicon Н*2 е създаден въз основа н а
ризирана светлина под различни ъгли. П о т о к Technicon Н*1/Н*1Е и е а в т о м а т и з и р а н апа­
о т хидродинамично фокусирана проба за из­ р а т с висока п р о и з в о д и т е л н о с т и 6 - т и п н о
следване се насочва през кварцова п р о т о ч н а диференциално броене н а л е в к о ц и т и т е .
кювета, в к о я т о е фокусиран светлинен лъч Technicon Н*3 е а в т о м а т и ч е н анализа­
о т вертикално поляризиран хелиево-неонов т о р , к о й т о освен в ъ з м о ж н о с т и т е н а пре­
лазер. Р а з с е я н а т а с в е т л и н а се измерва под дишния модел, анализира също и ретикуло­
множество ъгли: цити.
• Л ъ ч и с т и я т п о т о к н а р а з с е я н а т а светли­ П р о б а т а кръв, след аспириране в апара­
на под ъгъл 0° се използва за определяне т а , се разделя в ч е т и р и о т д е л н и канала за
размера на к л е т к а т а ; изследване: 1. з а е р и т р о ц и т и / т р о м б о ц и т и ,
• Л ъ ч и с т и я т п о т о к на р а з с е я н а т а светли­ 2. за левкоцити/лобулираност н а базофили-
на под ъгъл 90° се използва за определяне т е , 3. за левкоцити-пероксидаза и 4. за хе­
на к л е т ъ ч н а т а лобулираност; моглобин.
• Л ъ ч и с т и я т п о т о к на р а з с е я н а т а светли­ Д и р е к т н о с е о п р е д е л я т хелюглобин,
на под ъгъл 10 с ъ о т в е т с т в а н а к л е т ъ ч ­ е р и т р о ц и т и , л е в к о ц и т и , трольбоци-
н а т а комплексност; ти. Хемоглобинът се определя с модифици­
• Л ъ ч и с т и я т п о т о к н а р а з с е я н а т а деполя- ран хемиглобинцианиден м е т о д , при к о й т о
ризирана светлина под ъгъл 90° се изпол­ се използва б о р а т е н буфер с pH 11.3. Абсорб­
зва за оценка н а к л е т ъ ч н а т а гранулира- ц и я т а н а ц в е т н и я п р о д у к т се измерва при
ност. 546 п т . Б р о я т н а е р и т р о ц и т и т е и тромбо­
ц и т и т е се определя чрез м е т о д а с разсей­
Различни комбинации о т т е з и ч е т и р и из­ ване н а с в е т л и н а т а . Използва се хелиево-не­
мервания се използват за диферинциране и онов лазер. П р о б а т а кръв се смесва с р а з т - '
за количествена оценка на п е т т е основни бор, к о й т о п р е в р ъ щ а е р и т р о ц и т и т е и
434
т р о м б о ц и т и т е 6 сферични к л е т к и , без да
ze променя о б е м ъ т им. К л е т ъ ч н а т а суспен­
зия се пропуска през п р о т о ч н а т а к ю б е т а .
К о г а т о к л е т к а пресече с в е т л и н н и я лъч в ос-
З е т е н а т а ч а с т н а п р о т о ч н а т а к ю в е т а , ла­
з е р н а т а с в е т л и н а се разсейва под два раз-
\ични ъгъла - малък (20-30) и голям (5°-15°).
Лъчистият п о т о к на р а з с е я н а т а светлина
под малък ъгъл зависи о т обема н а к л е т к а ­
т а . Лъчистият п о т о к на разсеяната свет-
\ и н а под голям ъгъл зависи о т комплекс-
н о с т т а на в ъ т р е к л е т ъ ч н а т а структура,
а при е р и т р о ц и т и т е - о т к о н ц е н т р а ц и я ­
т а н а хемоглобина в к л е т к а т а . Д в е т е из­
мервания се и з в ъ р ш в а т едновременно. Пос­
редством п р е в р ъ щ а н е т о н а е р и т р о ц и т и т е
3 сферични к л е т к и се о т с т р а н я в а влияние­
т о на различните к о н ц е н т р а ц и и на в ъ т р е к -
\ е т ъ ч н и я хемоглобин при определяне обема
ла е р и т р о ц и т и т е . Б р о я т н а т р о м б о ц и т и ­
т е се определя чрез разсейване н а с в е т л и ­
н а т а под голям ъгъл.
Производни п о к а з а т е л и о т хистог-
оалште п а еритроцити и тромбоци-
т и с а MCV и MPV
Изчислени п о к а з а т е л и с а хельаток-
ои т ъ т , МСН, M C HC, I W W и HDWihemo-
iflobin distribution width - ширина на разпре­
делението н а с т о й н о с т и т е н а хемоглобина
3 е р и т р о ц и т и т е ) . HDW е аналог на RDVV и
:е изчислява к а т о с т а н д а р т н о отклонение
лп х и с т о г р а м а т а на концентрациите на
хемоглобина в е р и т р о ц и т и т е . С р е д н а т а
к л е т ъ ч н а к о н ц е н т р а ц и я н а хемоглобина,
ЗНСМ, се получава о т д и р е к т н о т о измер­
ване н а хемоглобина в о т д е л н и т е е р и т р о ­
цити. СНСМ не се влияе о т интерференци-
а т е н а билирубина и л и п е м и я т а при опре­
деляне н а хемоглобина, з а разлика о т с т о й -
iocmume н а МСНС, к о и т о се п р о м е н я т о т
пези и н т е р ф е р и р а щ и в е щ е с т в а . СНСМ не
:е о т п е ч а т в а к а т о р е з у л т а т о т а п а р а т а ,
^лужи з а в ъ т р е ш н а проверка н а МСНС и мо-
ке да се ползва о т о п е р а т о р а за допълни­
телно изчисление н а хемоглобина при нали-
ше н а и н т ерфериращ и в е щ е с т в а .
Определянето н а общия брой левкоцити
1 6 - т и п н о т о диференциално броене се извър-
ива с п о м о щ т а н а цитохимични реакции и
ш т и ч н а флоуцитометрия. Измерванията
;е и з в ъ р ш в а т в два канала - п е р о к с и д а з е п
I з а лобулирапост п а базофилпите
клетки.
В пероксидазния канал п р о б а т а кръв се
смесва с р а з т в о р , к о й т о лизира еритроци­
т и т е . Л е в к о ц и т и т е се ф и к с и р а т и о ц в е т я ­
в а т за пероксидазна а к т и в н о с т . Ц в е т н и я т
п 0
Р 9 У к т в к л е т к и т е е локализиран н а мес­
т а т а с пероксидазна а к т и в н о с т . Клетъч­
н а пероксидаза с ъ д ъ р ж а т н е у т р о ф и л и т е ,
еозинофилите и в по-слаба с т е п е н - моноци-
т и т е . Базофилите, л и м ф о ц и т и т е , т р о м б о ­
ц и т и т е и големите неоцветени клетки
(Large Unstained Cells - а т и п и ч н и лимфоци-
т и и б л а с т и ) не с ъ д ъ р ж а т пероксидазна ак­
т и в н о с т . Суспенсията о т к л е т к и се про­
пуска през п р о т о ч н а к ю в е т а , в к о я т о е фо­
кусиран светлинен лъч о т волфрамова хало-
генна лампа. Измерва се абсорбцията, коя­
т о е пропорционална н а к о л и ч е с т в о т о цве­
т е н п р о д у к т в к л е т к а т а , и разсейването
н а с в е т л и н а т а , к о е т о е пропорционално н а
размера н а всяка к л е т к а . Създава се ц и т о г -
рама, на ч и я т о х-ордината се н а н а с я т ре­
з у л т а т и т е о т абсорбцията, а н а у-ордина-
т а т а - р е з у л т а т и т е о т разсейването н а
с в е т л и н а т а . О б щ и я т брой левкоцити се оп­
ределя о т о п т и ч н и т е сигнали н а т о з и ка­
нал. С п о м о щ т а н а cluster анализ се дифе­
р е н ц и р а т различните т и п о в е левкоцити.
В канала за лобулираност на базофилите
к р ъ в т а се смесва с кисел р а з т в о р , к о й т о съ­
държа нейонен с ъ р ф а к т а н т . Базофилните
к л е т к и са устойчиви н а т а з и т е м п е р а т у р ­
но контролирана реакция и з а п а з в а т ц и т о п -
л а з м е н а т а си мембрана и гранулите. Е р и т ­
р о ц и т и т е и т р о м б о ц и т и т е се л и з и р а т .
Всички левкоцити, с изключение на базофил­
н и т е к л е т к и , з а г у б в а т ц и т о п л а з м а т а си,
к а т о се з а п а з в а т само я д р а т а . Суспенсия­
т а се пропуска през п р о т о ч н а к ю в е т а с фо­
кусиран лазерен лъч, к а т о се използват съ­
щ и т е два ъгъла за разсейване н а светлина­
т а (20-30 и 50-150), к а к т о в канала за е р и т р о -
ц и т и / т р о м б о ц и т и . Б р о я т на базофилите се
определя о т л ъ ч и с т и я п о т о к н а разсеяна­
т а с в е т л и н а под малък ъгъл. Д а н н и т е се на­
н а с я т н а у - о р д и н а т а т а на ц и т о г р а м а т а .
О т д а н н и т е з а л ъ ч и с т и я п о т о к на разсея­
н а т а с в е т л и н а под голям ъгъл, о с т а н а л и т е
левкоцити се класифицират к а т о мононук-
леарни или полиморфонуклеарни. Р е з у л т а ­
т и т е се н а н а с я т н а х - о р д и н а т а т а н а ци­
т о г р а м а т а . О т н о ш е н и е т о о т светлинни­
т е сигнали на мононуклеарните и полимор-
фонуклеарните к л е т к и се означава к а т о ин-
435
gekc на лобулираност (LI). Този индекс дава
информаиия за з р е л о с т т а на левкоцитите
или за евентуално олевяване. Допълнител­
но, каналът за лобулираност на базофили-
т е дава втори общ брой на левкоцитите,
който се сравнява с общия брой левкоцити,
получен о т пероксидазния канал. При евен­
туални интерференции в пероксидазния ка­
нал, общият брой левкоцити о т канала за
лобулираност на базофилите може да бъде
съобщен о т а п а р а т а к а т о р е з у л т а т .
Въз основа на получените р е з у л т а т и за
„абсолютен" брой левкоцити и общия брой
левкоцити, а п а р а т ъ т изчислява процент­
н и т е стойности на диференциалното брое­
не.
Информацията о т пероксидазния канал
и о т канала за лобулираност на базофилите
се използва за анализ на промени в морфоло­
г и я т а на к л е т к и т е и за даване на „съобще­
ния" за наличие на атипични лимфоиди, блас-
т н и клетки, незрели гранулоцити, еритроб-
ласти, големи т р о м б о ц и т и и др.
Technicon Н*3 определя броя на ретику-
лоцитите посредством оцветяване с багри­
лото oxazine 750, което се свързва с нуклеи­
нови киселини. Получената клетъчна суспен-
сия се пропуска през проточна к ю в е т а с фо­
кусиран лазерен лъч, к а к т о при каналите за
броене на еритроцити/тромбоцити и за ло­
булираност на базофилите. Когато клетки­
т е преминават през п р о т о ч н а т а кювета,
т р и д е т е к т о р а едновременно измерват по­
т о к а разсеяна светлина под малък ъгъл (2°-
3°), п о т о к а разсеяна светлина под голям
ъгъл(50-150) и абсорбцията. Създават се т р и
цитограми: 1. п о т о к разсеяна светлина под
голям ъгъл към абсорбцията; 2. п о т о к раз­
сеяна светлина под малък ъгъл към п о т о к а
разсеяна светлина под голям ъгъл; 3. обем
на клетките към концентрацията на хемог­
лобина. Въз основа съдържанието на свър­
заното багрило в к л е т к и т е , с п о м о щ т а на
ц и т о г р а м а т а с абсорбция, м о г а т да се раз­
граничат т р и групи ретикулоцити: слабо-,
средно- и високоабсорбиращи ретикулоцити,
което с ъ о т в е т с т в а на с т е п е н т а на зре­
лост на ретикулоцитите.
Допълнително а п а р а т ъ т изчислява след­
н и т е показатели на ретикулоцитите: сре­
ден обем н а р е т и к у л о ц и т и т е - MCVr
CHCMr, RDWr, HDWr, хемоглобиново съдър­
жание на ретикулоцитите - СНг и ширина
436
на разпределението на хемоглобиновото съ­
държание в р е т и к у л о ц и т и т е - CHDWr. Тези
показатели не се съобщават в р у т и н н и т е
р е з у л т а т и , но са достъпни за оператора.
ОГРАНИЧЕНИЯ И ПРЕПОРЪКИ
ПРИ РАБОТА С АВТОМАТИЧНИ
ХЕМАТОЛОГИЧНИ АНАЛИЗАТОРИ
Р а б о т а т а с а в т о м а т и ч н и хематологични
анализатори предполага критична оценка
на м е т о д и т е , к о и т о се използват в кон­
к р е т н и я анализатор, ограниченията, кои­
т о произлизат о т т о в а и т е х н и к а т а на ра­
бота.
Задължителни изисквания са провеждане­
т о на системен вътрелабораторен качес­
т в е н контрол и външна оценка на резулта­
т и т е . С т а н д а р т и т е за коректна р а б о т а с
а п а р а т и т е означават спазване на правила­
т а за калибриране и оценка на основните
критерии за аналитична надеждност - т о ч ­
ност, възпроизводимост, линейност, чувст­
в и т е л н о с т и специфичност.
Калибрацията на хематологичния анали­
з а т о р е критично важна за получаване на
т о ч н и р е з у л т а т и . Калибрацията се извър­
шва с референтни методи, референтни ма­
териали и/или калибратори, каквито се про­
извеждат о т редица фирми. След първона­
ч а л н а т а калибрация при инсталиране на
а п а р а т а , се препоръчва периодична провер­
ка най-малко през ш е с т месеца. Всеки хема-
тологичен анализатор има методично обу­
словени ограничения, к о и т о по правило са
описани в р ъ к о в о д с т в а т а за р а б о т а с апа­
р а т а . Най-важното методично ограничение
е н е в ъ з м о ж н о с т т а а п а р а т ъ т да разграни­
чи надеждно к л е т к и о т други частици или
фрагменти о т клетки със същия размер.
Особености в пробите кръв за изследва­
не, к а т о липемия, наличие на студови аглу-
тинини, иктер, много висок брой левкоци­
т и и други, м о г а т да с ъ з д а в а т проблеми в
а н а л и т и ч н и я процес н а хематологичния
анализатор и в и н т е р п р е т а ц и я т а на резул­
т а т и т е . Дипемията влияе на о т ч и т а н е т о
на хемоглобина и на изчислените м а т е м а ­
тически показатели, в които у ч а с т в а стой­
н о с т т а на хемоглобина. Студовите аглути-
нини н а м а л я в а т фалшиво броя на еритро­
ц и т и т е , увеличават MCV и МСНС. Високи-
я т брой л евкоцити повлиява о т ч и т а н е т о
н а хемоглобина и увеличава MCV.
Важна с ъ с т а в к а н а о б щ а т а оценка н а хе-
матологичния а н а л и з а т о р е определяне кри­
т е р и и т е за д и а г н о с т и ч н а н а д е ж д н о с т н а
о т д е л н и т е п о к а з а т е л и - д и а г н о с т и ч н а чув­
с т в и т е л н о с т , диагностична специфичност,
е ф е к т и в н о с т , предсказваща положителна и
предсказваща о т р и ц а т е л н а с т о й н о с т .
НОВИ ВЪЗМОЖНОСТИ
НА МУЛТИПАРАМЕТРОВИЯ
АНААИЗ В ХЕМАТОЛОГИЯТА
Т. Ц в е т к о в а
Усъвършенстването на хематологичните
анализатори позволява разширяване на т е х ­
н и т е в ъ з м о ж н о с т и и увеличава броя н а по­
к а з а т е л и т е , к о и т о м о г а т да се о п р е д е л я т
в с ъ щ а т а кръвна проба, едновременно с ру­
т и н н и т е показатели.
ДИФЕРЕНЦИРАНЕ ИЛ КЛЕТКИ
ОТ ГРАНУЛОЦИТНАТА СЕРИЯ
А н а л и з а т о р и т е с в ъ з м о ж н о с т за диферен­
циално броене ( т р и или п е т популации) пре­
д о с т а в я т обобщена информация за грану-
л о ц и т н а т а серия - п р о ц е н т и а б с о л ю т е н
брой н а н е у т р о ф и л н и т е гранулоцити, без да
е възможно визуално разграничаване н а о т ­
д е л н и т е м а т у р а ц и о н н и форми върху ц и т о г -
рамата.
OnpecjeAjiiie н а н е з р е л и
и прогенитории клетки
В периферна кръв
А н а л и з а т о р и т е н а Sysmex п о л з в а т специ­
фична технология за лизиране н а левкоцити­
т е съобразно с т р у к т у р а т а н а к л е т ъ ч н а т а
мембрана. Тази технология, приложена при
т р и - и п е т - т и п н о диференциално броене по­
лучава най-висока с т е п е н н а усъвършенст­
ване в SE-9000, SE-9500 и ХЕ-2100, и с право е
наречена state of t h e a r t в р у т и н н и т е хема-
тологични анализатори. Специален канал,
наречен IMI {immature myeloid information
channel) определя селективно к л е т к и о т гра-
н у л о ц и т н а т а серия, к о и т о нормално не се
н а м и р а т в п е р и ф е р н а т а кръв. IMI измерва­
щ а т а с и с т е м а е предназначена за опреде­
ляне салго н а н е з р е л и (льлади) левкоци­
ти. Специалният лизиращ р е а к т и в , наре­
чен с у п е р с ъ р ф а к т а н т представлява специ­
фична комбинация о т различни д е т е р г е н т и
и съдържа: полиоксиетиленов нейонен сър-
ф а к т а н т и сяросъдържаща аминокиселина,
к о и т о и м а т и фиксиращо действие върху
к л е т ъ ч н а т а цитоплазма и мембраната, и
един анионен с ъ р ф а к т а н т за намаляване на
к л е т ъ ч н и т е о с т а т ъ ц и след лизирането им.
Увреждащото действие н а полиоксиети-
леновия нейонен с ъ р ф а к т а н т върху клетки­
т е е с различна с т е п е н в з а в и с и м о с т о т
т я х н а т а зрелост и липидното им съдържа­
ние.
Зрели г р а н у л о ц и т и и л и м ф о ц и т и .
Съдържанието на липиди в сегментоядре-
н и т е гранулоцити е около 2 п ъ т и по-високо
спрямо л и м ф о ц и т и т е (поради по-големия
к л е т ъ ч е н размер). И в д в а т а т и п а к л е т к и
липидите с ъ с т а в л я в а т около 5% о т тегло­
т о на к л е т к а т а , к а т о фосфолипидите са
около 35% о т о б щ о т о липидно съдържание,
а холестерола - около 10%.
Незрели (млади) ф о р м и н а грануло-
ц и т н и я pecj. Незрелите левкоцити и м а т
по-ниско холестеролово съдържание и по-ви-
соко на фосфолипидите, о т к о л к о т о зрели­
т е форми, к а т о фосфатидил-холинът има
релативно по-висок дял, а сфингомиелинът
- по-нисък. Левкемичните к л е т к и също по­
к а з в а т значителни рзлики в липидното съ­
държание, в сравнение със с ъ о т в е т н и т е им
нормални аналози.
К о г а т о са подложени на д е й с т в и е т о на
лизиращия р е а к т и в , з р е л и т е гранулоцити
п о к а з в а т значителни увреждания н а мемб­
р а н а т а , в р е з у л т а т н а к о е т о цитоплазме-
н о т о съдържание изтича, а о с т а т ъ ц и т е о т
м е м б р а н а т а "колабират" върху я д р а т а (зре­
л и т е левкоцити се с в и в а т ) .
М е м б р а н а т а н а м л а д и т е гранулоцити
също се уврежда о т лизиращия реактив, но
з н а ч и т е л н о по-слабо. Преди и з т и ч а н е н а
в ъ т р е к л е т ъ ч н и т е съставк и , полиоксиети-
леновия нейонен с ъ р ф а к т а н т и сяросъдър-
ж а щ а т а аминокиселина н а в л и з а т през ув-
437

висока концентрация на „о" ниска концентрация на „о ^
ниска концентрация на висока к о н ц е н т р а ц и я н а „ •
изразено действие на слабо д е и с т в и е на
ф и г . 23.6. П р и н ц и п н а л и з и р а н е н а л е в к о ц и т и ­
т е в I M I - к а н а л {по материали на Sysmex, SE-
9500)
• - аминокиселини
о - липиди: холестерол, фосфо- и гликолипиди
-» - с у п е р с ъ р ф а к т а н т
редените м е с т а к а т о фиксират к а к т о мем­
б р а н а т а , т а к а и в ъ т р е к л е т ъ ч н о т о съдър­
жимо. В т о з и процес сяросъдържащата ами­
нокиселина д е й с т в а к а т о п р о т е к т о р н а
к л е т к а т а срещу д е й с т в и е т о на сърфа кт ан -
т а . В р е з у л т а т н а т о в а , незрелите к л е т к и
се фиксират, о с т а в а т с и н т а к т н а мембра­
на и задържана в к л е т к и т е ц и т о п л а з м а .
Анионният с ъ р ф а к т а н т намалява е р и т -
р о ц и т н и т е сенки и размера н а з р е л и т е лев­
коцити, к о е т о подпомага разграничаване­
т о им о т незрелите форми. Р а з л и к а т а меж­
ду зрелите и м л а д и т е форми позволява т я х ­
н о т о бързо и сравнително е в т и н о разгра­
ничаване в IMI канала н а хематологичния
анализатор. П р и н ц и п ъ т н а лизиране на лев­
к о ц и т и т е в IMI канал е представено схема­
т и ч н о н а фиг. 23.6.
Р е з у л т а т и т е о т анализа н а диференци­
а л н а т а кръвна к а р т и н а се п р е д с т а в я т гра­
фично - 3-DIFF и IMI цитограми, и в п р о ц е н т
и абсолютен брой н а 5-DIFF. Ееозинофили и
базофили се б р о я т в о т д е л н и канали; в кана­
ла за еозинофили се добавя специфичен еози-
нофили-лизиращ р а з т в о р с алкално pH, кой­
т о при 40-50 0С сбръчква всички левкоцити
(голи ядра), а о с т а в а т само еозинофилите,
ч и я т о дегранулация о с т а в а п о д т и с н а т а за
определено време; в канала за базофили се из­
ползва базофили-специфичен лизиращ р а з т ­
вор с кисело pH (HCl), к о й т о при 40-50 0С за­
държа за известно време дегранулацията са­
мо н а базофилите, а о с т а н а л и т е к л е т к и са
с в и т и (до ядра). Б р о я т н а н е у т р о ф и л н и т е
грнулоцити се определя софтуерно, к а т о о т
общия брой гранулоцити се извади с у м а т а
о т еозинофили и базофили. На фиг. 23.7 е по­
казана с х е м а т и ч н о DIF/IMI ц и т о г р а м а н а
периферна кръв при здрави лица. Незрелите
гранулоцити и м а т определено м я с т о на IMI
ц и т о г р а м а т а съобразно с т е п е н т а н а т я х ­
н а т а м а т у р а ц и я (фиг. 23.8А): прогенитор-
ни к л е т к и / б л а с т и - най-ниско и наляво; на­
дясно и нагоре о т т я х - промиелоцити; над

Фиг. 23.7. С х е м а н а ц и т о г р а м а н а п е р и ф е р н а к р ъ в п р и з д р а в и {по материали на Sysmex, SE-9500)

еренциално броене, гранулоцити, лимфоцити, моноцити, локализирани в различно о ц в е т е н и с т р у п в а -
л е т и. Слее] отделно определяне на еозинофили и базофили, в о к о н ч а т е л н и я р е з у л т а т се д а в а т
с т о й н о с т и т е на 5-DIFF ^ j
mump ж Г 6 0 ^ л а с г " т а ' ^ к о я т о се разпределят незрели форми о т м а т у р а ц и о н н а т а редица на гранулоци-
т и т е (в случая т а к и в а ли п св ат )
DC - Direct current (прав електричен т о к )
RF • Radio frequency (високочестотен електричен т о к 6 р а д и о ч е с т о т н и я о б х в а т )
438
 I M I
RF I) I F p RF I M I
Ф и г . 23.8. IMI ц и т о г р а м а
А. Области на разпределение на незрелите грануло-
цити и на прогениторните клетки (no Sysmex)
1 - пръчкоядрени гранулоиити; 2 - метамиелоиити;
3 миелоцити; 4 - промиелоцити; 5 - миелобласти;
НРС - hematopoietic progenitor cells
Б. DIFF и IMI цитограма на кръв о т болен с хронич­
на гранулоцитна левкемия с наличие на всички ма-
турационни форми на гранулоцитната редица (по
собствен материал)
т я х - миелоцити, а в дясно и нагоре о т т я х
- м е т а м и е л о ц и т и ; над т я х и наляво - пръч-
<оядрени гранулоцити. Последните се по­
я в я в а т и к а т о удължаване на гранулоцит-
:Шя "облак" в DIFF ц и т о г р а м а т а (фиг. 23.8Б),
В IMI к а п а л а с е в и з у а л и з и р а т и п а ­
т о л о г и ч н о пролгепепи, б л а с т п и к л е т ­
ки.
IMI к а н а л ъ т може да бъде използван и за
шализ на периферни стволови к л е т к и - PBSC
peripheral blood stem cells), (фиг. 23.9). Тези
клетки са CD34 + . Б р о я т на CD34 + клет ки -
•пе в периферна кръв се използва к а т о пре-
ц ж т о р , т . е . за определяне на оптимално-
по време за т я х н о т о "извличане", и зт е г ля-
ie о т к о с т е н мозък или периферна кръв, как-
RF IМI
прогениторни
клетки
Ф и г . 23.9. Разпределение на изолирани хемопо-
етичии клетки (CD34 + ) в IMI цитограма (полш-
териали на Sysmex, SE-9500)
т о и за определяне потенциала на стволо-
в и т е / п р о г е н и т о р н и к л е т к и на хемопоезата
преди P B S C - т р а н с п л а н т а ц и я т а .
Известни са две форми на т р а н с п л а н т а ц и я -
автоложна и алогенна. В последните години се
увеличи използването на стволови клетки о т пе­
риферна кръв, к о е т о има няколко предимства:
избягване на о б щ а т а а н е с т е з и я , много бързо
присаждане и възстановяване на хемопоезата,
к о е т о води до намаляване на животоопасни ин­
фекции и други сериозни усложнения, ч е с т а по­
следица о т а к т и в н о т о лечение при някои левке-
мии/солидни т у м о р и . Изп олзван ет о на PBSC
т р а н с п л а н т а ц и я т а се благоприятства о т бър­
зия напредък в проучванията на хемопоетични-
т е клетки, т е х н и ч е с к а т а иновация в терапия­
т а с кръвни компоненти, ефективна мобилиза­
ция на родоначалните клетки на хемопоезата
към периферната кръв посредством цитокини.
Известни са т р и м е т о д а за ефикасна мобилиза­
ция на с т в о л о в и т е клетки о т костния мозък
към периферната кръв: а) т о к с и ч н а (мобили­
зиране след химиотерапия); б) ц и т о т о к с и ч н а /
ц и т о к и н о Н а л ю б и л и з а ц и я (цитокини, к а т о
G-CSF в комбинация с първия; в) ц и т о к и н о в а
л ю б и л и з а ц и я (цитокини, приложени във висо­
ки дози за няколко дни). Примерна т е р а п е в т и ч ­
на с т р а т е г и я , използваща PBSC т р а н с п л а н т а ­
ция е представена схематично на фиг. 23.10.
У с п е ш н а т а PBSC т р а н с п л а н т а ц и я изис­
ква наличието на две условия; заооляГ.аието/
малигнените к л е т к и да и м а т висока чувс-
т в и т е л н о с т към химио и/или лъчетерапия,
и да са о с т а н а л и нормални ( а в т о л о ж н и )
с т е м клетки. Различни м е т о д и са предла­
гани за определяне на о п т и м а л н о т о време
за "извличане" на с т е м клетки: на б а з а т а
на левкоцитния брой (IxlO11- 4х109/1) и/или
439
 Извличане на стем клетки,
обработване и съхраняване
/" Л
Вземане НЕ кръв
Левкемия, някои
солидни тумори
Повишаване броя
По-нататъшно повишава­
на стем клетките в
не броя на стем клетките
периферна кръв
в периферна кръв
ф и г . 23.10. Схема на примерна с т р а т е г и я за PBSC т р а н с п л а н т а ц и я
PBSC - p e r i p h e r a l blood s t e m cells
или броя на т р о м б о ц и т и т е ( > 50 х 109/1), ко­
е т о поради в а р и а ц и я т а н а левкоцитния и
т р о м б о ц и т н и я брой при и н с у ф и ц и е н т е н
костен мозък (супресиран о т т е р а п и я т а )
показва ред проблеми; изброяването н а ко-
лонии-образуващи единици (гранулоцити и
макрофаги) е много т о ч е н и възпроизводим
метод, но незадоволителен, т ъ й к а т о изис­
ква около 2 седмици за получаване н а резул­
т а т и т е ; флоуцитометричното определяне
на CD34 + к л е т к и т е показва висока корела­
ция с изброяване н а к о л о н а и - о б р а з у б а щ и т е
единици, р е з у л т а т ъ т се получава след око­
ло 3 часа, но а н а л и з ъ т е скъп. Тоа Medical
Electronics създаде усъвършенствана прог­
рама за мониториране на PBSC т р а н с п л а н -
т а ц и я т а посредством използване на инфор­
м а ц и я т а о т IMI канал н а SE с е р и я т а . Пре­
димство е к р а т к и я т срок за получаване н а
р е з у л т а т и т е (90 s), не се изисква предвари­
т е л н а обработка на к р ъ в т а (взема се пери­
ферна кръв, к а к т о за р у т и н н и я хематоло-
гичен анализ), възможно е ч е с т о вземане н а
кръв, за да се определи о п т и м а л н о т о време
за "извличане" н а PBSC, кумулативно изра­
зяване на р е з у л т а т и т е с изчисляване н а про­
ц е н т и абсолютен брой н а с т е м к л е т к и т е ,
к а к т о и т я х н о т о преизчисляване спрямо kg
телесна маса.
440
1
I
I
_ л
Инфузия на съхранените
стем клетки
(PBSC трансплантация)
С Ремисия ^
Високи дози химиотерапия
и/или лъчетерапия
Патологичните клетки
се унищожават
ЛАЗЕРНА ПРОТОЧНА
ЦИТОМЕТРИЯ
Т. Ц в е т к о в а
СЪЩНОСТ НА АНАЛИЗА
Лазерната проточна цитометрия
( ф л о у ц и т о м е т р и я т а ) е съвременен ме­
т о д за изследване н а к л е т к и или частици (го­
леми молекули, вируси, л а т е к с и др.), даващ
в ъ з м о ж н о с т з а анализ н а някои о т т е х н и ­
т е физични или биологични с в о й с т в а . Тя
представлява п р о ц е с , п р и к о й т о изслед­
в а н и т е к л е т к и п р е м и н а в а т поединич­
н о п р е з л а з е р е н лъч. Чрез специални сен­
зори се и з м е р в а т определени физични и хи­
мични х а р а к т е р и с т и к и н а всяка една о т
преминалите к л е т к и .
Ф л о у ц и т о м е т р и я т а има п о ч т и 40-годишна
история. За създаването и р а з в и т и е т о н а флоу-
ц и т о м е т р и ч н а т а т е х н и к а допринася високо­
с к о р о с т н и я т импедансен м е т о д за броене на
кръвни клетки, р а з р а б о т е н о т W. Coulter през
1956 г. Това п р о с т о у с т р о й с т в о , базиращо се на
разлики в е л е к т р и ч е с к а т а проводимост между
к л е т к и т е и р а з т в о р а , в к о й т о са суспендирани,
се с ч и т а за предшественик на съвременните ци-
т о м е т р и . По-късно с т а в а възможно измерване­
т о и на к л е т ъ ч н и я обем по а м п л и т у д а т а или
п л о щ т а на импулса (морел В на Coulter Counter).
През 1965 г. L. Kamentsky и с ъ а в т . о п и с в а т пър­
вия ф л о у ц и т о м е т ъ р - двупараметров а п а р а т за
измерване на абсорбция ( с п е к т р о ф о т о м е т р и ч -
но) u на светлинно разсейване о т неоцветени на х и б р и д о л т а т а т е х н и к а з а получа­
клетки в п о т о к при 500 клетки/s. През с ъ щ а т а в а н е н а л г о н о к л о н а л н и а н т и т е л а . По­
година М. Fulwyler разработва у с т р о й с т в о за
л у ч е н и я т огромен брой моноклонални а н т и ­
сортиране на клетки според обема им (първият
клетъчен сортер). Тези начални проучвания под­ т е л а срещу п о в ъ р х н о с т н о - м е м б р а н н и т е ан-
готвиха п о ч в а т а за развитие на нова техноло­ т и г е н н и с т р у к т у р и н а ч о в е ш к и т е левко-
гия за клетъчен анализ. През 1970 г. L. Kamentsky ц и т н и и други к л е т ъ ч н и популации с а о т
произвежда първия флоуцитометър за практи­ епохално значение при проучване н а имуно-
к а т а , използвайки хелиеово-неонов и аргонов ф е н о т и п н и т е и функционални с в о й с т в а н а
светлинен източник. Предилгство н а л а з е р ­ т е з и клетки. Въвеждането и утвърждава­
н и я и з т о ч н и к с, ч с н е г о в и л т к о х е р е н т е н н е т о н а CD (cluster o f differentiation) номен­
лъч от люнохро.иатична свстлина лссно к л а т у р а т а позволи н а в л и з а н е т о н а диагнос­
с е насочва, ф о к у с и р а и н а с т р о й в а з а точ­ т и ч н а т а флоуцитометрия в клиничните
н а д ъ л ж и н а н а въ^тата. През 1975 г. е про­ л а б о р а т о р и и и п р а к т и ч е с к о т о ü прилагане.
изведен за първи п ъ т компютъризиран флоуци­
CD о з н а ч е н и е т о със с ъ о т в е т е н номер д е ­
т о м е т ъ р , но едва през 1984 г. е предложен пър­
в и я т флоуцитометър с клинично предназначе­ финира група о т люноклонални ан­
ние. т и т е л а с еднаква специфичност п о
отношение н а биохилтчно характе­
ризираната антигенна структура.
Компютърна
Лазерна технология Моноклоналнн Няколко моноклонални а н т и т е л а о п р е д е л я т
технология антитела линейно специфични а н т и г е н и (напр. CD45,
CD2, CD3 и др.), но с а малко т е з и , к о и т о иден­
Лазерна проточна
ЦИ l O M C i p i l U
т и ф и ц и р а т с а м о функционално хомогенни
или н е о п л а с т и ч н и к л е т к и . CD н о м е н к л а т у ­
Цитохимичнн р а т а се използва и з а обозначаване н а кле-
методи тъчно-повърхностни и цитоплазмени
Подобрена мегололо! ня на
с т р у к т у р и ( а н т и г е н и ) , к о и т о "разпозна­
молекулярна!а т ъ к а н и т е кул гурн в а т " с ъ о т в е т н и т е а н т и т е л а . В т е з и слу­
био.ки пя O i кри нане на различни
факзори на распежа чаи се ползва т е р м и н ъ т С П - л ю л е к у л а и л и
C D - а н т и г е н , к о й т о носи с ъ о т в е т н и я н а
моноклоналното а н т и т я л о номер (напр.
Клетъчен аиализ CD8 моноклонални а н т и т е л а се с в ъ р з в а т с
Фиг. 23.11. Технологии и научни области, доп­ Т - л и м ф о ц и т н и я р е ц е п т о р CD8, х а р а к т е р е н
ринесли за р а з в и т и е т о на съвременната лазер­ за супресор/цитотоксичната Т-клетъчна
на проточна ц и т о м е т р и я субпопулация).

Съвременната проточна ц и т о м е т р и я е
р е з у л т а т о т приложението н а знания и ФЛОУЦИТОМЕТЪР - УСТРОЙСТВО
т е х н и к и , р а з в и т и бързо и независимо в н я ­ И ПРИНЦИП НА РАБОТА,
ПРЕДСТАВЯНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ
колко о б л а с т и (фиг. 23.11). Н а п р е д ъ к ъ т в ъ в
флоуцитолгетричната технология,
Н а фиг. 23.12 е п р е д с т а в е н а обща схема н а
подобрената методология н а тъкач­
флоуцитометър. Съвременните проточни
ните култури, откриването н а раз­
ц и т о м е т р и с а комбинация о т няколко т е х ­
лични фактори н а растежа и дости­
нологии и в к л ю ч в а т с л е д н и т е с т р у к т у р н и
женията н а люлекулярнатабиология
единици: к о л е к т о р з а п р о б а т а и с и с т е -
д а в а т възможност з а преоценка н а
л ю з а т р а н с п о р т и р а н е т о й; с и с т е м а
клетъчните функции, з а пълноценна
з а в н а с я н е н а п р о б а т а в ъ в ф л у и д е н по­
интерпретация н а резултатите о т
ток; източник н а лазерна светлина и
флоуцитометричния а н а л и з и пре­
ф о к у с и р а щ а т а я оптика; сигнал-де-
д о с т а в я т н о в и п е р с п е к т и в и в Aiegu-
т е к т о р и ; к о л т ю т ъ р н а с и с т е м а з а съ­
цинската диагностика.
биране, съхранение, представяне и
За р а з в и т и е т о на флоуцитометричния
анализ н а данните; сортиращ меха­
анализ, и з м е р в а щ в с ъ щ н о с т имунофлуорес-
ценция, с ъ щ е с т в е н о допринесе в ъ в е ж д а н е т о низъм.
441
 Л и н е й н о и логаритмично
6
11роточна
камера
фиг. 23.12. Обща схема на флоуцитометър с из­
мерване на флуоресценция на двуцветно марки­
рани моноклонални а н т и т е л а {no N.P. Carter и
Е.М. Meyer)
1 и 2 - огледала
3, 4 и 5 - специфични ф и л т р и
6 и 7 - събирателни лещи
8 - огледало, направляващо лазерния лъч
Изброените с т р у к т у р н и компоненти
о с ъ щ е с т в я в а т с л е д н и т е процеси:
1. Въвеждане н а п р о б а т а к а т о е д и н и ч н и
к л е т к и , м и н а в а щ и през лазерния лъч;
2. Оформяне, фокусиране и регулиране н а ла­
зерния лъч;
3. Събиране н а о т д е л е н и т е о т к л е т к и т е
сигнали, о т д е л я н е и разпределяне н а флу­
оресценцията о т р а з с е я н а т а лазерна
Тръбичка за пробата
S Л1антийна тсчност
* . Проточна камера
Лазерен лъч
Клетъчен поток
Фиг. 23.13. Схема на проточна камера (по М L
Hasanen et at)
442
светлина;
4. Преобразуване н а с в е т л и н н и т е сигнали в
е л е к т р и ч н и импулси, т я х н о т о усилване,
обработване и представяне.
Същността на проточната цитомет-
р и я се и з р а з я в а в д о с т а в я н е н а суспендира­
н и т е к л е т к и в з о н а т а з а измерване поеди­
н и ч н о с п о м о щ т а п а т а к а нар. ф л у и ­
д е н поток. " С ъ р ц е т о " н а ф л о у ц и т о м е т ъ -
р а е п р о т о ч н а т а к а л ю р а (фиг. 23.13).
Д е й с т в и е т о ü се б а з и р а върху п р и н ц и п и т е
н а х и д р о д и н а м и ч н о т о фокусиране. Т я изпъл­
н я в а с л е д н и т е функции: п о л у ч а в а кле­
т ъ ч н а т а с у с п е н с и л з а а н а л и з , ориен­
т и р а клетките в тесен канал, прида­
в а илI в и с о к а с к о р о с т и е д н а к в а т р а ­
е к т о р и и и г и довежда д о п р е с и ч а н е н а
с в е т л и н н и я л ъ ч з а и з м е р в а н е т о или
К л е т ъ ч н а т а суспенсия т е ч е ламинарно в
ц е н т ъ р а н а п о т о к о т бързо д в и ж е щ а се и
н е с ъ д ъ р ж а щ а к л е т к и т е ч н о с т (обвиваща,
м а н т и й н а ) . С т р о г о к о н т р о л и р а н а т а разли­
к а в н а л я г а н е т о между д в е т е т е ч н о с т и , спе­
ц и ф и ч н а т а конична ф о р м а н а к а м е р а т а и
специално и з б р а н о т о н а л я г а н е н а м а н т и й -
н а т а т е ч н о с т д в и ж а т к л е т к и т е в много
т е с е н п о т о к , в к о й т о т е се п о д р е ж д а т ед­
н а с л е д д р у г а , подобно н а броеница.
И з т о ч н и ц и н а светлина, разсейване
и флуоресценции
И з т о ч н и к н а с в е т л и н а т а е лазер (Light
A m p l i f i c a t i o n b y S t i m u l a t e d E m i s s i o n of
Radiation).
Лазерните източници са о т различен т и п - ар-
гонов лазер (488, 520 п т ) ; криптонов (520, 647 п т )
хелиево-неонов (633 п т ) ; хелиево-кадмиев (UV, 411
пт); диоден (варираща дължина на вълната) и др.
Най-често използвания източник на светлина във
флоуцитометрията е аргонов лазер с въздушно
охлаждане - самостоятелно или едновременно с
хелиево-неонов, хелиево-кадмиев и водно охлажда­
не.
П о с р е д с т в о м с и с т е м а о т лещи лазерни­
я т лъч се фокусира върху в с я к а една к л е т к а
п о о т д е л н о и независимо к а к т о о т предиш­
н а т а , т а к а и о т с л е д в а щ а т а . Всяка к л е т к а
се о с в е т я в а при еднакви условия. Този про­
цес п р о т и ч а с г о л я м а с к о р о с т - о т над 3300
к л е т к и / s (при ф л о у ц и т о м е т р и без с о р т е р )
до 25 000 к л е т к и / s (при с о р т е р и т е ) и е с ви-

шшшш
20-19° -»FS
I (размер)
Лазерен лъч
9 0 ° - SS I
(вътрешна I I флуоресценция
структура) I
Ф и г . 23.14. Параметри, к о и т о се измерват при
флоуиитометричен анализ на единичната клет­
ка
сока с т е п е н н а т о ч н о с т и ч у в с т в и т е л н о с т .
При п р е м и н а в а н е т о си п р е з л а з е р н и я лъч
в с я к а к л е т к а е и з т о ч н и к н а д в а вида сигна-
г/ ли (фиг. 23.14).
>• С и г н а л и , о б у с л о в е н и о т р а з с е й в а н е
н а с в е т л и н н и я п о т о к . Разсейването
н а с в е т л и н а т а е във всички посоки, но се
о т ч и т а т само два п а р а м е т ъ р а :
1. Р а з с е я н а т а с в е т л и н а , с ъ б р а н а по нап­
равление н а лаз ерния лъч, т . е . под много м а ­
лък ъ г ъ \ { м е Ж д у 2 ° и 19 ' спрямо оста), т а к а
нар. п р е д н о р а з с е й в а н е ( F o r w a r d S c a t t e r -
IFS). И н т е н з и т е т ъ т н а F S е ф у н к ц и я
преди-мно о т к^ьетъчните разльери.
2. Р а з с е я н а т а с в е т л и н а , с ъ б р а н а по нап­
равление, перпендикулярно н а лазерния лъч
{под ъгъл о т 90°), т а к а нар. с т р а н и ч н о
р а з с е й в а н е {Side S c a t t e r - SS). И н т е н з и ­
т е т ъ т н а SS е функция о т вътрешна­
т а с т р у к т у р а н а клетките: цитоп-
лазльени гранули, я д р е н а конфигура­
ция и плътност н а хролштина.
>• С и г н а л и , о б у с л о в е н и о т ф л у о р е с ц е н ­
ц и я . При п о д х о д я щ а д ъ л ж и н а н а вълна­
т а л а з е р н и я т лъч в ъ з б у ж д а м о л е к у л и т е
н а ф л у о р е с ц е н т н и багрила, с к о и т о с а бе­
лязани определени моноклонални а н т и т е ­
ла, свързани к ъ м с ъ о т в е т н и т е повърх-
н о с т н о - м е м б р а н н и или в ъ т р е к л е т ъ ч н и
а н т и г е н и , к а к т о и н а багрила, д и р е к т н о
свързани с Д Н К / Р Н К и индуцира емиси­
он н а с в е т л и н а . А б с о р б и р а н а т а о т б а ­
г р и л а т а високоенергийна светлина
е с по-малка дълЖина н а вълната,
а излъчената е нискоенергийна, н о
с по-голялга д ъ л Ж и н а н а в ъ л н а т а .
О т д е л н и т е флуорохроми и м а т х а р а к т е р ­
ни с п е к т р и н а с т и м у л и р а н е и емисия. Из­
п о л з в а н е т о н а две, т р и или повече багрила с
п о ч т и е д н а к ъ в в ъ з б у ж д а щ , но с различен
емисионен с п е к т ъ р позволява едновременно­
т о измерване н а няколко х а р а к т е р и с т и к и
на клетките (льногоцветна флуоресцен­
ция). Ф л у о р о х р о м и т е при и м у н о ф е н о т и п и -
зиране н а к л е т к и т е се и з п о л з в а т к а т о ко-
в а л е н т н и м а р к е р и ( и м а т подходяща специ­
ф и ч н о с т и р е а к т и в о с п о с о б н о с т - свързване
с амино- или сулфхидрилни групи). Тук се
включват:
• К с а н т е н о в и б а г р и ^ ш . Дихидроксиксан-
т е н о в о багрило е флуоресцеинът. Негови-
я т д е р и в а т fluorescein isothiocyanate
(FITC) е най-широко и з п о л з в а н и я т флуо-
рохром във ф л о у ц и т о м е т р и я т а . Тази суб­
с т а н ц и я се свързва к ъ м н е у т р а л н и ами­
нокиселини.
• Родал1ин и родальинови д е р и в а т и
(rhodamine isothiocyanate, Texas red)
с а н а й - ч е с т о използвани з а м у л т и п а р а -
м е т р о в анализ, едновременно с FITC.
• Ф и к о ф л у о р и ( R - p h y c o e r y t h r i n , B-phy-
c o e r y t h r i n , PE/RD1).)
• И з о т и о ц и а н а т н и д е р и в а т и н а ци-
а н и н о в и б а г р и л а ( c y a n i n 5.1).
• Ллгинометил-кулгаринов ацетат.
• Иеридинин-хлорофилови деривати
(peridinin chlorophyll protein reagent,
PerCP).
ф л о у ц и т о м е т р и ч н и я т ДНК анализ изпол­
з в а багрила, к о и т о и н т е р к а л и р а т м е ж д у
двойка н у к л е о т и д н и бази или в з а и м о д е й с т ­
в а т н е к о в а ле н т н о със специфична двойка ба­
зи - а д е н и н - т и м и д и н или цитозин-гуанин.
Най-често използваните са:
• ф е н а н т р и д и н и е в и б а г р и ^ ш (propidi-
и т Jodide, e t h i d i u m bromide).
• Л к р и д и н о в и багри^ьа ( a c r i d i n e o r a n g e ,
proHavine, acriflavine, quanacrine).
• Д и - б е н з о ш м и д а з о л о в и багри^ш.
• Л к т и н о л ш ц и н и ( a c t i n o m y c i n D).
• Лнтрациклини и хромомицини
( d a u n o m y c i n , m i t h r a m y c i n , adriamycin).
Оптична и детекторна система
О п т и ч н а т а система на флоуцитометъра
включва няколко вида огледала, лещи, приз­
ми, ф и л т р и (поглъщащи и ц в е т н и ) , сепара­
т о р и н а лъча.
443
 FL1
детеKi

SS
детектор

Лазарсн лъч

550 6(Х) 650

Проточиа кювета Дължина на вълната (nm)

фиг. 23.15. Детекторна система {по материали на Coulter EPICS'*' XL" ß o w cytometef)
А. Конфигурация и видове ф и л т р и
F S - д е т е к т о р , SS-gemekmop и 4 ф л у о р е с ц е н т н и д е т е к т о р а ; DL (dichroic long-pass optical filter), BK (laser- i
blocking optical filter) - ф и л т ъ р , к о й т о пропуска ф л у о р е с ц е н т н а с в е т л и н а , но не пропуска лазерна с в е т л и н а ; BF
(bans-pass optical filter) - о п т и ч е н ф и л т ъ р , к о й т о пропуска сноп о т ф л у о р е с ц е н т н а с в е т л и н а с определени дъл­
жини на в ъ л н а т а и блокира п р е м и н а в а н е т о н а с в е т л и н а с о с т а н а л и т е дължини н а в ъ л н а т а . Д и х р о и ч н и т е
о п т и ч н и ф и л т р и (под ъгъл 45° с п р я м о с в е т л и н н и я лъч) о т р а з я в а т с в е т л и н а до определена дължина н а вълна­
т а : 488 DL-филтър о т р а з я в а лазерна с в е т л и н а с д ъ л ж и н а н а в ъ л н а т а = 488 п т и пропуска с в е т л и н а т а н а д
т а з и дължина. Един 488 ВК ф и л т ъ р блокира всякакв а о с т а т ъ ч н а лазерна с в е т л и н а , пропускайки с а м о флуорес­
ц е н т н а светлина. С л е д в а щ и т е о п т и ч н и ф и л т р и о т д е л я т с в е т л и н а т а з а 4 ф л у о р е с ц е н т н и д е т е к т о р а . Един
550 DL ф и л т ъ р о т р а з я в а с в е т л и н а с дължина н а в ъ л н а т а < 550 п т к ъ м 525 BP ф и л т ъ р , к о й т о пропуска с в е т л и ­
на само между 505 и 545 п т к ъ м FL1 д е т е к т о р а . С в е т л и н а т а , к о я т о 550 DL пропуска е м е ж д у 555 и 725 п т .
Следващият дихроичен ф и л т ъ р е 600 DL. Той о т р а з я в а с в е т л и н а т а м е ж д у 555 и 600 п т к ъ м 575 BP ф и л т ъ р ,
к о й т о пропуска с в е т л и н а между 560 и 590 п т к ъ м FL2 д е т е к т о р а . Д и х р о и ч н и я т о п т и ч е н ф и л т ъ р 645 DL о т р а ­
зява с в е т л и н а с дължина н а в ъ л н а т а между 605 и 645 п т к ъ м 620 BP ф и л т ъ р , разположен пред FL3 д е т е к т о р а .
1ози 620 BP ф и л т ъ р пропуска с в е т л и н а м е ж д у 605 и 635 п т к ъ м FL3 д е т е к т о р а . Ф и л т ъ р ъ т 645 DL пропуска
флуоресцентна с в е т л и н а между 650 и 725 п т к ъ м 675 BP ф и л т ъ р , разположен пред FL4 д е т е к т о р а .

Б. Емисионен с п е к т ъ р н а ч е т и р и багрила
Багрило Възбуждане Излъчване
FITC (fluorescein isothiocyanate) 468-505 п т 504-541 п т
PE/RD1 (phycoerythrin) 486-575 п т 568-590 п т
ECD (phycoerythrin-Texas Red®-x) 486-575 п т 610-635 п т
РС5/РЕ-Су ,ч 5 (phycoerythrin-cyanin 5.1) 488-580 п т 660-680 п т

Д е т е к т о р н а т а с и с т е м а (фиг. 23.15) съ­ т е модели ф л о у ц и т о м е т р и варира о т 300-

бира р а з с е я н а т а о т к л е т к и т е с в е т л и н а и
излъчената флуоресценция, след к о е т о ги
превръща в електрични импулси с в о л т а ж , ,
пропорционален н а и н т е н з и т е т а или
О б х в а т ъ т н а д е т е к т о р и т е при различни­
444
800 п т , а при с о р т е р и т е - о т 300-800-1100
п т . Ч у в с т в и т е л н о с т т а на д е т е к т о р и т е е
висока - о т < 800 до < 200 молекули FITC или
РЕ. О т д е л я н е т о н а емисионна с в е т л и н а
т р а е микросекунди, поради к о е т о обработ-
Зането н а с и г н а л и т е е много бързо (над 10
000 импулса/з). Р а з с е я н а т а 6 права посока
зветлина (FS) се фокусира върху ф о т о д е т е к -
тюр. Л ъ ч ъ т о т р а з с е й в а н е т о при 90° се раз­
деля и фокусира в т р и , ч е т и р и , п е т , ш е с т
1AU седем ф о т о у с и л в а т е л н и т р ъ б и - ф о т о -
/ м н о ж и т е л и - Р М Т (photo multiplier tubes).
Ге п р е в р ъ щ а т с в е т л и н н а т а енергия в елек-
причен т о к и у с и л в а т с и г н а л и т е о т SS и
|)луоресцениията о т б а г р и л а т а до подходя-
д о ниво, ч и я т о с т е п е н се регулира о т опе-
з а т о р а . В о л т а ж н и т е импулси, генерирани
л п РМТ се у с и л в а т допълнително по е л е к т -
зонен п ъ т (линейно или логаритмично) чрез
:ерия о т усилватели (вж. фиг. 23.12). Следва
аналогово-иифрово преобразуване н а сигна-
\ и т е и т я х н о т о измерване. Всеки импулс се
з р е д с т а в я н а екрана или се съхранява к а т о
Зисочина н а п и к - максимума на всички
?игнали, или к а т о и н т е г р а л - общата
площ под кривата на електричния импулс.
То т о з и начин се измерва пикова или и н т е г -
зална флуоресиениия, респ. разсейване н а
с в е т л и н а т а . С иел запазване н а д а н н и т е о т
1змерване с и г н а л и т е о т анализа и за гра­
ничното им п р е д с т а в я н е , и з м е р в а н и я т а в
п р о т о ч н а т а и и т о м е т р и я не са непрекъсна­
т о вариабилни, а се р а з д е л я т н а дискретни
(крайни) единиии, наречени "канали". По вре­
ме н а получаване н а д а н н и т е , амплитуда­
т а (височината н а импулса) н а всеки измер­
ван сигнал се дигитализира и попада в съ­
о т в е т н и я канал. Тъй к а т о н о м е р ъ т на все­
ки канал е право пропориионален на големи­
н а т а н а и з м е р в а н и т е променливи, една
к л е т к а с по-ниска с т о й н о с т на измервани­
т е сигнали (напр. флуоресцентни, SS или FS)
се изброява в канал с по-нисък номер, откол­
к о т о т а к а в а с висок и н т е н з и т е т н а сигна­
лите. Точността н а флоуцитомет-
р и ч н и т е и з м е р в а н и я и най-вече р а з д е ­
л и т е л н а т а способност н а и з м е р в а н е ­
т о з а в и с и о т броя н а използваните
к а н а л и . Т е х н и я т брой обикновено е к р а т е н
н а 64 (64, 128, 256 и т . н . ) и позволява покри­
в а н е т о н а една широка о б л а с т (напр. някол­
ко хиляди п ъ т и - о т 1 до 10 000) н а флуорес­
ценция. При имунофенотипизирането се из­
ползва т а к а в а логаритмична скала, к р а т ­
н а на 64 канала. При ДНК анализа се наблю­
дава малък о б х в а т на флуоресцентния ин­
т е н з и т е т (4 до 8 п ъ т и ) , поради к о е т о се

CHAIR OF CLINICAL LABORATORY, VMI PLOVDIV

COULTER К
EPICS* Multigraph Gallery Report

2; Gated 3: Gated 4: Gated

FITC/RD1 RD1 FITC

J
1 2

с
• : I # '
В •
3 4
, LXV
1 1 -г?Пг!1г мит! 11 mihi 11 ти! I IIиlit Iмин I нит I min
.i KKX) .1 l(XK) . 1 1(ХЮ
CD3-FITC CD^RPE CD3-FITC

Ми X Mn Y PkPosX PkPosY PkCnt FPCVX FPCVY

Hist Rceion ID % Count
61.1 271.3 56.0 256.0 96 26.44 14.20
A AUTO 24.8 5000
0.243 1.94 0.102 1.69 1 69.84 34.44
2 BI В 0.20 10
3.68 6.65 3.74 46 35.17 19.75
B2* В 48.6 2428 5.71
0.174 0.118 0.102 0.102 528 63.47 32.50
ВЗ В 25.9 1294
4.92 0.121 4.99 0.102 106 37.45 36.17
В4 В 25.4 1268

Mn X Md X PkPosX PkCnt HPCV Min Max

1list Region II) % Count
3.84 3.91 61 11.05 0.887 1024
3 С С 48.8 2440 3.78
5.75 5.66 47 16.27 1.06 1024
4*• Ü Ü 73.7 3686 5.62

*Cl)3 • C
/ D4 + лимфоцити, • CD3 • лимфицити
t>ue. 23.16. Ц и т о г р а м а и х и с т о г р а м и о т определяне н а CD4 и CD3 при д в у ц в е т н а флуоресценция
по собствен материал)
Окончателните р е з у л т а т и , с л е у а в т о м а т и ч н а обработка и обобщаване н а данните, се принтирагп според
с д а д е н а т а конфигу/хщия о т тестове.
445
използбз линейна скала о т 2о6 канала.
Събраните данни о т всички к л е т к и в из­
следваната популация се с ъ х р а н я в а т и по­
к а з в а т сумарно н а дисплея. В и з у а л н а т а
оценка на броя и разпределението н а кле­
т ъ ч н и т е популации по време н а анализа,
т . е . в реално време (напр. при Соикег-флоу-
ц и т о м е т р и т е ) , се използва при вземане н а
решение за п о - н а т а т ъ ш н о изследване. Съв­
ременните ф л о у ц и т о м е т р и п р е д о с т а в я т
измерване до 3 ц в я т а флуоресценция (с еди­
ничен лазер) и 6 ц в я т а (с мултиплен лазер).
Крайният р е з у л т а т представлява серия о т
графични образи (скетерграми или ц и т о -
г р а л г и и х и с т о г р а л т ) , придружени о т
числени с т о й н о с т и (фиг. 23.16).
На фиг. 23.17 е представена схема н а фло-
у ц и т о м е т ъ р с к л е т ъ ч е н с о р т е р . Възмож­
н о с т т а на някои модели ф л о у ц и т о м е т р и ,
въз основа н а физични свойства, да разде­
л я т ( с о р т и р а т ) клетки, идентифицирани
по време на анализа, прибавя нови а с п е к т и
Проба
Към
КОМПЮТЪР
FS фото
детектор Детектори
(SS и Fls)
ч Лазерен лъч
у Зареждащ пръстен с
я / •••0 пиезоелектрнчен кристал
Високоволтажни
плочи
Отпадъчна
течност
Фиг. 23.17. Обща схема на флоуцитометър - кле­
тъчен сортер (no N.P. Carter и Е. W. Meyer)
446
в използването н а т е з и анализатори, т ъ й
к а т о т е о с и г у р я в а т специфичен клетъчен
т и п з а п о - н а т а т ъ ш е н анализ. П о в е ч е т о
а п а р а т и използват за сортиране на клет­
ки е л е к т р о с т а т и ч н о , механично отклоня­
ване н а капки. Осн о вават се н а принцип, раз­
р а б о т е н при м а с т и л е н о - с т р у й н и т е прин­
т е р и . К л е т ъ ч н и я т п о т о к при излизане о т
п р о т о ч н а т а камера попада под действие­
т о н а пиезоелектричен к р и с т а л , к о й т о при
прилагане н а определен в о л т а ж предизвик­
ва вибрации. Под д е й с т в и е н а т е з и вибра­
ции к л е т ъ ч н и я т п о т о к се накъсва на о т ­
делни капки, к о и т о п р е м и н а в а т между две
поляризирани отклонявагци плочи. На база­
т а н а предварително избрани к р и т е р и и о т ­
д е л н и т е к л е т к и , носеица позитивен или не­
г а т и в е н заряд се о т к л о н я в а т в с ъ о т в е т н и ­
т е събирателни съдове, д о к а т о о с т а н а л а ­
т а т е ч н о с т и к л е т к и се изхвърлят. При сор­
т и р а н е т о се з а р е ж д а т само к а п к и т е , съ­
държащи ж е л а н и т е клетки. З а р я д н о т о нап­
режение се прилага к а т о импулс, к о й т о е т а ­
к а синхронизиран, че да съвпадне с форми­
ране н а специфична капка с клетки, подле­
жащи н а сортиране. Синхронизирането
т р я б в а да о т ч и т а закъснението о т о т ­
к р и ван ето н а с ъ о т в е т н а т а к л е т к а при пре­
м и н а в а н е т о ü през лазерния лъч до н е й н о т о
инкапсулиране в к а п к а т а . С к о р о с т т а н а
с о р т и р а н е при различните модели с о р т е р и
е различна - о т 300 к л е т к и / s (при FACS
Calibur) до 25 000 к л е т к и / s (при EPICS ALTRA
Cell Sorter).
Друг вид к л е т ъ ч н о - с о р т и р а щ флоуцито­
м е т ъ р се х а р а к т е р и з и р а с механичен сор­
т и р а щ механизъм, при к о й т о у л а в я щ а т а
и н т е р е с у в а щ и т е ни к л е т к и т р ъ б а се нами­
р а в ъ т р е в к л е т ъ ч н и я п о т о к . Този начин не
зависи о т разделяне н а к л е т ъ ч н и я п о т о к на
капки и се извършва в з а т в о р е н а среда, на­
малявайки по т о з и начин образуването на
аерозоли и риска о т биологично замърсява­
не.
ФЛОУЦИТОМЕТРИЧЕН ДНК АНАЛИЗ
Флоуцштюметричният ДНК анализ е едно о т
п ъ р в и т е приложения на ф л о у ц и т о м е т р и я т а
и днес е разпространен анализ с висока чув­
с т в и т е л н о с т . З а измерване н а к л е т ъ ч н о т о
ДНК съдържание е използван за първи п ъ т
1рез 1965 г. Флоуцитометричното ДНК из-
иербане се основава на с п о с о б н о с т т а на оп-
зеделени ф л у о р е с ц е н т н и багрила (напр.
Dropidium Jodide) при подходящи условия да
:е свързват специфично с ДНК на клетки или
ядрени е к с т р а к т и (в монодисперсно с ъ с т о ­
яние). Багрилото интеркалира и свързва
ЦНК стехиометрично. И н т е н з и т е т ъ т на
G(k/G
* анализа се изписва графично к а т о ДНК хис­
о
С-
Q
U а на у - о с т а - б р о я т на к л е т к и т е (фиг.
i GVM
Ii ^ ЧШш>у
2N 4N
ДНК-сълържание
24 h
Фиг. 23.18. Ф л о у ц и т о м е т р и ч е н Д Н К а н а л и з { п о
материали на Coulter EPICS* XL" ß o wcy to meter)
A. Схематично п р е д с т а в я н е на ДНК-хистограма със
с ъ о т в е т н и т е фази на клетъчния иикъл
Б. Схематично п р е я с т а в я н е на ДНК-съдържанието
на клетка м е ж д у две деления: в S - ф а з а т а се с и н т е ­
зира ДНК, а в м и т о з а (М) т а з и ДНК се разделя в две
клетки
B. В р е м е т р а е н е на к л е т ъ ч н и т е фази в ед и ни чни т е
клетки ( д а н н и т е са с приблизителни с т о й н о с т и , ка­
т о м о г а т да се н а б л ю д а в а т изразени колебания, осо­
бено при т у м о р и и клетъчни култури)
флуоресцентната емисия е право пропорци­
онален на ядреното ДНК съдържание.
Флоуцитометричният ДНК анализ поз­
волява получаването на два вида информа­
ция:
• Средно ДНК съдържание на Go и Gl клетки.
• Брой клетки във всяка фаза на клетъчния
цикъл.
Ф л у о р е с ц е н т н о т о излъчване при ДНК
тограма. Последната е диаграмно изобра­
жение на клетъчния цикъл: на х-оста е пред­
ставена флуоресцентната интензивност,
2 3 . 1 8 А ) . Тъй к а т о т о т а л н о т о ДНК съдържа­
ние варира в о т д е л н и т е фази на клетъчния
цикъл, о т н о с и т е л н и я т брой клетки във вся­
ка фаза може да бъде измерен. За няколко
минути се проучват данните о т над 100 000
клетки, к о е т о прави измерването бързо,
точно и възпроизводимо.
Клетъчният цикъл включва процесите,
които н а с т ъ п в а т в к л е т к а т а в п а у з а т а
между две последователни митози. Отдел­
н и т е фази на клетъчния цикъл са п е т :
> Go - фаза на покой, непролиферираща.
> Gl - предсинтезна фаза, подготовка на
к л е т к а т а за ДНК синтез. Клетките в Go
и Gl фаза и м а т еднакво ДНК съдържание
- диплоидно (2N)*.
> S - фаза на синтез, репликация на ДНК,
водеща до удвояване на ДНК съдържание­
т о (2N -> 4N). S-фракцията е т а з и ч а с т
о т о б щ а т а популация, която се появява
в о б л а с т т а между Go/Gl и G2/M пикове­
те.
> G2 - фаза след синтез на ДНК, подготов­
ка на кл етка та за следваща митоза, ДНК
съдържанието е удвоено (4N).
>• М - фаза на митоза.
Съвпадащите с диплоидния пик при нор­
мални клетки Go и Gl фази, не м о г а т да бъ­
д а т диференцирани посредством измерва­
не на клетъчното ДНК съдържание и се о т ­
н а с я т к а т о Go/Gl. Повечето клетки (95%)
са във фаза Go/Gl.
Промяната в ДНК съдържанието и вре­
м е т р а е н е т о на о т д е л н и т е фази е показано
на фиг. 23.18Б и В.
• 1 / 2 о т пика (по д ъ л ж и н а т а му) е IN
447
 И з м е р в а н е т о на ДНК съдържанието се из­
ползва за определяне п л о и д н о с т т а на к л е т ­
ките. Нормалните клетки и м а т еуплоидно,
диплоидно (2N) съдържание. Чрез сравнява­
не на флуоресиентния и н т е н з и т е т н а из
следваната популация и т о з и на нормална
диплоидна клетъ чн а популация (Go/Gl пи­
кове на х и с т о г р а м а т а ) може да се о т к р и е
анеуплоидия и да се определи с т е п е н т а й.
Това се постига чрез изчисляване на ДНК ин­
декс (D.I.). Терминологията н а ДНК съдър­
ж а н и е т о е представена н а т а б л . 23.1.
Т а б л и ц а 23.1. Терминология на ДНК съдържа­
нието
ДНК
Плоидност Хромозоми
индекс
1.0 еуплоид/диплоид (2N) 46 хромозоми (2N)
хаплоид (N) 23 хромозоми (N)
0.5
2.0 т е т р а п л о и д (4N) 92 хромозоми (4N)
Не е 0.5, анеуплоид
1.0 или 2.0
< 1.0 хипоанеуплоид < 46 хромозоми
> 1.0 хиперанеуплоид > 46 хромозоми
ДНК индексът се изчислява к а т о ДНК съ­
държанието на Go/Gl пика (номер н а "ка­
нала") на изследваната к л е т ъ ч н а популация
се раздели на ДНК съдържанието н а Go/Gl
пика (номер на "канала") на п о з н а т а т а , дип­
лоидна популация ( к л е т ъ ч е н с т а н д а р т -
пресни или замразени лимфоцити). Съглас­
но определението ДНК индексът на нормал­
н а т а диплоидна (еуплоидна) популация е 1.0.
П а т о л о г и ч н и и л и лга^ьигнени к л е т к и
обикновено п о к а з в а т анеуги/юидност.
Д Н К и н д е к с ъ т изльерва с т е п е н т а н а
патологичното ДНК съдържание в
Д Н К а н е у п л о и д н а п о п у л а ц и я . Ид е н т и ­
фицирането на анеуплоидна кле т ъчн а попу­
лация (представена к а т о допълнителен Go/
Gl пик) в х и с т о г р а м а т а е винаги указание
за малигненост на к л е т ъ ч н а т а популация
или риск о т т у м о р е н рецидив. Анеуплоидни-
т е т у м о р и са с по-агресивен потенциал в
сравнение с диплоидните. При някои т у м о ­
ри определени химиотерапевтични медика­
м е н т и са избирателни по отношение н а ан-
еуплоиден клетъчен т и п .
Проучването на клетъчната циклична кине-
тика (вж. фиг. 23.18) се провежда чрез анализ на
разпределението на клетките в различните фа­
зи на клетъчния цикъл, по време на които ДНК
съдържанието на клетките се променя. Част-
448
т а о т клетките в Go/Gl, S и G2/M фазите на
клетъчния цикъл се определя математически
чрез разпределението на ДНК. Винаги се оценя­
ва релативния брой клетки във всеки стадий.
Процентът на клетките в S фаза (клетките с
репликация на ДНК) се използва за установява­
не на т я х н а т а пролиферативната активност.
Най-често се използват два показателя:
к л е т к и в S фаза (SPF - S-phase fraction) и про-
лиферативния индекс (PI). SPF са к л е т к и т е
в S фаза - в п р о ц е н т о т ц я л а т а популация:
SPF = х 100.
Go/G, + S + G 2 /M
PI е с у м а т а о т к л е т к и в S и G 2 /M фаза­
т а , п р е д с т а в е н а к а т о ч а с т о т о б щ а т а по­
пулация:
S + G 2 /M
PI = х 100.
Go/G, + S + G 2 /M
Д а н н и т е за п р о л и ф е р а т и в н а т а а к т и в ­
н о с т са о т значение особено при диплоид-
н о с т н а т у м о р н и т е / левкемични к л е т к и .
Задължителна за успешния ДНК анализ е соф­
т у е р н а т а ДНК интерпретация. Тя се ос­
новава на мултипараметрова и многоцелева
програма, включваща алгоритми за определяне
на процента клетки в S фаза и разширен анализ
на клетъчния цикъл. Успешно е и софтуерното
отстраняване на интерференцията о т клетъч­
ни остатъци, аглутинати, агрегирани ядра и
др. Софтуерната осигуреност улеснява откри­
ване на клонове о т клетки, които са с около 4%
разлика в ДНК съдържанието, т.е. само 1 или 2
хромозоми.
На фиг. 23.19 са представени различни ви­
дове ДНК х и с т о г р а м и .
Ключова роля за т о ч н о с т т а при извърш­
ване н а ф л о у ц и т о м е т р и ч н и я ДНК анализ
има п р е ц и з н о с т т а н а а п а р а т у р а т а . Мал­
ки разлики в к л е т ъ ч н о т о ДНК съдържание
м о г а т д а б ъ д а т значими, поради к о е т о
с т а н д а р т и з и р а н е т о и о т с т р а н я в а н е т о на
технически или а п а р а т н и вариации е край­
но необходимо.
П р а к т и ч е с к о т о значение н а ДНК флоуци­
т о м е т р и ч н и я анализ е свързано с диагноза­
т а на малигненост, оценъчна прогноза при
доказан т у м о р , мониториране н а туморно-
т о р а з в и т и е и о т г о в о р а н а т е р а п и я т а . Бе­
зусловно изискване н а ДНК анализа е т р а н с ­
формиране н а п р о б и т е в монодисперсна сус-
пенсия о т к л е т к и или ядра.
М у л т и п а р а м е т р о в и я т флоуцитометри-
чен анализ, при к о й т о количественото из-
 Лнеуплоидна популация 1
(Go/Gi фаза)

Диплондна популация
(G(i/Gi фаза)
s :1ШС
н
0^
2 Лнеуплоидна популация 2
- (Go/Gi фаза)
c
a. Лнеуплоидна популация 2
(S-фаза)

Лнеуплоидна популация 2
(G2M фаза)

50 100 150 100 150 200 250

С ъ д ъ р ж а н и е иа Д П К Съдържание иа Д Н К
В
DIPLOID C Y C L E

.1500 52».
VO
45*

5)*

1.923
I30(1

80 120

DNA Content

Ф и г . 23.19. ДНК х и с т о г р а м и
1ървият пик в показаните хистограми (cRBC) е образуван о т измерването на я д р а т а на пилешки еритро­
цити, които се използват к а т о вътрешен с т а н д а р т при ДПК анализа
А. Схематично представена хистограма на лимфоцити о т периферна кръв на здрави лица: DI = 1.00,
ZV = 0.2% (по материали на Coulter).
5. Схематично представена хистограма на клетки о т ендометриален т у м о р (по материали на
Coulter).
ioAuque на две популации с атипично ДПК съдържание: популация 1, която е хипоанеуплоидна, с DI = 0.82,
гьставлява ~ 30% о т изследваната клетъчна популация; популация 2, която е хиперанеуплоидна, с DI = 1.62,
фолиферативен индекс 23% (в Go/G, са 77%, S - 15% и G2/M - 8%). Клетките с нормално ДПК съдържание
диплоидни) са 29%.
i . ДНК хистограма (собствен материал)
Цтлоидна клетъчна популация при о с т р а левкемия с висока пролиферативна активност (в S фаза са 53.8%
• т клетките).

лерване на ДНК съдържанието и пролифе- ИЗИСКВАНИЯ К Ъ М

) а т и в н а т а а к т и в н о с т се с ъ ч е т а в а т с иму-
юфенотипни маркери, туморни антигени,
шкогенни протеини, апоптозни маркери,
фолиферативно асоциирани антигени и др.,
начително подобрява диагностичната и
фогностична с т о й н о с т на флоуцитомет-
шята.
БИОЛОГИЧНИЯ МАТЕРИАЛ
флоуцитометричният анализ изисква при­
готвяне на клетъчна суспенсия с монодис-
пергирани клетки (всяка клетка да бъде за­
обиколена о т течен матрикс, без агрегира-
не към съседни клетки).
449
 Кръв, костен мозък, лимфни възли и кле­
тъчни култури са материал, който лесно
се поддава при приготвяне на клетъчни сус-
пенсии, но нелимфоидни тъкани изискват
специална обработка с ензимни или други
агенти, които разгра^кдат междуклетъчни
т е връзки. За съжаление обработването на
такива тъкани води до получаване на кле­
тъчни частици (строма, свободна нуклео-
плазма и цитоплазма), които са нежелан ар­
т е ф а к т при анализа. В т е з и случаи елект­
ронната обработка на данните, особено при
ДНК-анализа, съществено допринася за ели­
миниране влиянието им върху крайния ре­
зултат.
флуоцитометричният анализ на проби
о т венозна кръв може да бъде извършен или
след сепариране на мононуклеарни клетки
(лимфоцити и моноцити) посредством т е ч ­
на среда, съдържаща Ficoll-Hypaque и ц е н т ­
рофугиране в градиент на плътност, или ди­
ректно в проба о т пълна кръв.
Използването на автоматични системи
за обработка на биологичния м а т е р и а л
(напр. Coulter Q-Prep-, Coulter Multi-Q-Prep-,
Coulter DNA-Prep-Work Station, Dako-Medima-
chine (за приготвяне на суспенсия), Becton
Dickinson FACS-Prep) осигуряват стандар­
т н и условия, бърз анализ и с т р и к т е н конт­
рол.
Цялостна кръв за флоуцитометричен
анализ при имунофенотипизиране се взема
в епруветки о т затворена система с ЕДТА.
Процедурите - прибавяне на моноклонално
антитяло, инкубация, обработка с Immuno-
Prep реактиви (1. лизиращ е р и т р о ц и т и т е ,
2. стабилизиращ левкоцитите и 3. фиксатор
на клетъчните мембрани) следва да се из­
вършват до 6 h след вземането на кръвта
(оптималното време е 2 h след венепункция).
Флоуцитометрията на т а к а обработена­
т а кръв може да бъде проведена веднага или
до 24 h (съхранение при 0-4 0С). Наличието
на Coulter Q-Prep-Work Station в дадена ла­
боратория, при липса на флоуцитометър
(по-евтино и оправдано), може да осигури об­
работка на кръвта, която след т о в а да бъ­
де изпратена в по-голяма лаборатория за
флоуцитометрия.
Цялостна кръв за ДНК-флоуцитометри-
чен анализ след о б р а б о т в а н е с DNA-Prep
Reagents (1. лизиращ е р и т р о ц и т и т е , 2. пер-
меабилизиращ клетъчните мембрани и 3. оц­
450
в е т и т е л за ДНК, напр. propidium Jodide в
комбинация с рибонуклеаза) се изследва до
2 h след обработването й.
Прясно в з е т а т ъ к а н за ДНК анализ се
транспортира в подходяща среда и се обра­
б о т в а веднага с помощта на Medimashine и
на DNA-Prep-Work Station или след 24 h, при
съхранение при 2-8 0С. Ако изследването се
провежда по-късно, в з е т а т а прясна тъкан
може да бъде замразена на -20 0С.
Обработването на парафинирана тъкан
за ДНК анализ преминава последователно
през няколко процедури: депарафиниране, ре-
х и д р а т и р а н е , п р и г о т в я н е на суспенсия
(Medimashine), центрофугиране, обработка
с пепсин/трипсин, центрофугиране и под­
готвяне за флоуцитометрия на DNA-Prep-
Work Station.
КАЧЕСТВЕН КОНТРОЛ
Съвременните флоуцитометри притежа­
в а т изключително развита и софтуерно оси­
гурена с и с т е м а за качествен контрол, поз­
воляваща поддържане вариацията на резул­
т а т и т е в оптимални граници. Оценката на
качествения к о н т р о л се провежда чрез
с т а н д а р т и и контроли. К а т о с т а н д а р т и
се използват устойчиви материали с опре­
делена флуоресценция и light scatter свойст­
во - флуоресцентни микросфери. Контроли­
т е са материали (контролни клетки/анти­
тела) с по-малка устойчивост, отколкото
с т а н д а р т и т е (най-често с биолоичен про­
изход) и д а в а т очакван р е з у л т а т - позити­
вен или негативен. В много случаи даден
с т а н д а р т може да се прилага и к а т о кон­
тролен материал. Съществено предимст­
во на качествения контрол във флоуцито-
метричния анализ е възможността за оп­
ростяване на процедурите посредством
осигуряване на контролни материали, вкл.
и с т а н д а р т и о т един източник (производи­
тел), анализ на т е з и материали както па-
ц и е н т н и т е проби и софтуер за подходяща
обработка, мониториране и представяне на
данните. Качественият контрол във флоу­
ц и т о м е т р и я т а включва:
• Верификация на регулирането на апара­
т а и линейност на определяне (с Flow-
Check и Immuno-Brite)
• Стандартизиране на разсейването на
с в е т л и н а т а и и н т е н з и т е т а на флуорес­
ценцията (Flow-Set)
• Осигуряване на ц в е т о в о т о компенсиране
(напр. с Cyto-Comp kits)
• Верификация на функцията на монокло-
н а л н и т е а н т и т е л а (напр. Immuno-Trol
cells - за 19 клетъчни популации), т . е . кон­
тролира се м е т о д а .
• Позитивен контрол (Cyto-Trol control).
• Определяне на директен абсолютен брой
(Flow-Count fluorospheres).
Важен м о м е н т в качествения контрол на
п р о т о ч н а т а ц и т о м е т р и я е междулабора-
т о р н о т о сравняване на р е з у л т а т и т е . Ор­
ганизациите с определено отношение и вли­
яние върху провеждането на качествения
контрол на р е з у л т а т и т е о т флоуцитомет-
ричния анализ включват: CAP (College of
American Pathologists), NCCLS (National Com­
mittee for Clinical Laboratory Standards); CDC
(Centers for Disease Control and Preventation);
ACTG (AIDS Clinical Trial Group); QASI (Quallity
Assurance and Standardization for Immunologi­
cal for Canada); GBEA (Guide de Bonne Execu­
tion des Analyses); NATA - National Association
of Testing Authorities (Australia); GIC - Gruppo
Italiano Di Citofluorimetria (Italy); ISS - Istitute
Superiore DellSanita (Rome).
Предлаганите понастоящем флоуцито-
м е т р и включват различни модели на Веск-
man-Coultcr-EPICS XL, XL-MCL, EPICS XL-
MCL c FCW (c Flow Centre High Performance
Multimedia Workstation), EPICS ALTRA Cell
Sorter, EPICS ALTRA Cell Sorter W/HyPerSort;
н а B e c t o n D i c k i n s o n - FACS Can, FACS
Calibur, FACS Vantage SE; Ortho; DAKO - Gal­
axy DNA plus. Galaxy Pro, Galaxy Cell Sorter.
Бързото навлизане на флоуцитометрия-
т а о т научните в клиничните звена поста­
вя въпроса за избор на подходящ а п а р а т . То­
зи избор зависи о т оценката на няколко фак­
тора:
- планирани области за приложение,
- цел на използване,
- квалификация на потребителя,
- вид на наличната а п а р а т у р а в лаборато­
р и я т а и др.
ПРИЛОЖЕНИЕ
НА ФЛОУЦИТОМЕТРИЯТА
Основните предимства на флоуцитомет-
ричния анализ са:
• Бърз анализ и оценка на голям брой клет­
ки (105 - 106 клетки срещу 102 - 103 клетки
при с в е т л и н н а т а микроскопия),
• Обективност и висока възпроизводимост
на р е з у т а т и т е .
• Документиране на всички данни.
• Висока чувствителност при регистрация
на флуоресцентните сигнали.
• Едновременно измерване на флуоресцен­
ция с различен ц в я т и т о ч н а количестве­
на оценка на и н т е н з и т е т а й.
• Оценка на размер и вътрешна с т р у к т у ­
ра на к л е т к и т е .
• Висока ч у в с т в и т е л н о с т при определяне
на малки субпопулации.
• Сортиране на специфични клетки.
• Възможност за реанализ на съхранените
данни, дълго след извършване на изследва­
н е т о и др.
Флоуцитометричният анализ показва и
някои ограничения: клетките трябва да са
в суспенсия, губи се информация за тъкач­
ната структура, висока цена на апарату­
рата, намоноклоналнитеантитела, на ре­
активите и контролните материали, зна­
чителни разходи за обучение на оператори­
те.
П р е д и м с т в а т а обаче п ре дос та вят въз­
можности, които далеч надхвърлят т е з и на
традиционните техники в морфологичния
и цитологичен анализ. Прилагането на про­
т о ч н а т а ц и т о м е т р и я позволява многоброй­
ни по вид анализи: определяне хетероген-
ността на дадена клетъчна популация; ко-
релиран многопараметров анализ на ниво
единична клетка;размер и вътрешна струк­
тура на клетките; доказване на определе­
ни антигени върху клетъчната повърх­
ност, в някои органели или цитоплазмата,
както и на мембранни рецептори; общо
ДНК-съдържание; Д Н К в хромозоми; общо
РНК-съдържание; общ клетъчен протеин;pH
на клетките и техните органели; мембра­
нен потенциал, редоксипотенциал на клет­
ките; продукция на кислородни радикали; из­
мерване на ензимна активност в клетки-
451
те; к л е т ъ ч н о с о р т и р а н е и др. Тези възмож­ т е р и з и р а н е н а различни популации и субпо­
ности на п р о т о ч н а т а ц и т о м е т р и я създа­ пулации н а к р ъ в н и т е к л е т к и , т а к а нар.
доха условия за нов подход към д и а г н о з а т а имунофенотипизиране. С п о м о щ т а на
и лечението на мново заболявания, к а к т о и определени панели о т моноклонални а н т и ­
перспективи за нови проучвания. Клинично­ т е л а , при имунофенотипизирането се осъ­
т о приложение н а ф л о у ц и т о м е т р и я т а щ е с т в я в а анализ к а к т о н а нормални, т а к а
включва следните по-главни направления и н а патологични к л е т к и . То включва:
(фиг. 23.20): - определяне произхода и с т а д и я н а клетъч­
>- Анализ на л и м ф о ц и т н и т е популации и н о т о диференциране при лимфоми и лев­
субпопулации. кемии,
- у с т а н о в я в а н е н а ранен рецидив при злока­
>- Анализ на к л е т к и т е при злокачествени
чествените хемопатии,
хемопатии. - мониториране при химиотерапия,
>• Определяне и количествена оценка н а не- - диагноза и мониториране н а вродени и при­
опластични клетки, д о б и т и имунодефицитни с ъ с т о я н и я ,
>• ДНК- и РНК-анализ. - диагноза и м о н и т о р и р а н е при автоимун-
>• Определяне на т р о м б о ц и т н и а н т и т е л а , ни заболявания,
>• Тромбоцитен и р е т и к у л о ц и т е н анализ, - мониториране и оценка преди и след к о с т ­
но-мозъчна или друга органна тр ан сп л ан ­
>• Определяне на имунни комплекси,
тация.
>• Анализ на клетъчни рецептори, напр, за:
естрогени, липопротеини с ниска п л ъ т ­ ДНК-анализът позволява о т к р и в а н е на
н о с т , глюкокортикоиди и др. малък брой к л е т ъ ч н и популации с анеуплои-
дия, т о ч н о измерване н а клетъчния брой във
Имунофенотипизиране всяка фаза н а к л е т ъ ч н и я цикъл (Go/Gl, S,
Диагноза на левкемии G2/M) и н а пролиферативния к а п а ц и т е т на
и лимфоми
Клетъчномем изследваната популация. Възможен е и р е т ­
Контрол при трансплантация роспективен анализ н а включени в парафин
бранни антигени
HLA-B 27- скрининг тъкани.
Клетъчно активиране Б ъ р з а т а , удобна и т о ч н а технология на
ДНК/ РНК-съдържание ф л о у ц и т о м е т р и ч н и я анализ позволява раз­
в и т и е т о и усъвършенстването на н о в и
Вътреклетъчни Клетъчна пролиферация
възлюжности за клинично приложение:
параметри Хромозомен анализ • проучване н а х и м и о т е р а п е в т и ч н и т е ме­
ч Ретикулоцитен брой ханизми (изследване е к с п р е с и я т а на по-
рН-стойности върхностно-клетъчни а н т и г е н и и на мем­
Фагоцитоза
б р а н н о т о взаимодействие, в ъ т р е к л е т ъ ч ­
н а флуоресценция, а п о п т о з а , ДНК-анализ,
Функционални Кислороден „взрив"
ядрена ДНК и п р о т е и н и , анти-ДНК моно­
параметри Флоуцитоензимология клонални а н т и т е л а , инкорпорация н а
Цитокини
Апоптоза бромдезоксиуридин, ц и т о т о к с и ч н о с т ,
X J MDR флуоресцентна поляризация, мембранен
Мембранен Калций т р а н с п о р т и др,;
транспорт • определяне н а м е д и к а м е н т о з н а т а ч у в с т ­
Медикаменти
в и т е л н о с т и р е з и с т е н т н о с т на т у м о р -
Фиг. 23.20. Приложение на флоуцитометричния ни/левкемични к л е т к и ;
анализ • изследване н а к л е т ъ ч н а т а функция - рес­
п и р а т о р е н взрив, фагоцитоза, а п о п т о з а ;
Р а з в и т и е т о на т е х н и к и т е за получава­ • определяне а к т и в н о с т т а н а клетъчни ен­
не на моноклонални а н т и т е л а и прилагане­ зими: аминопептидази, бутирил е с т е р а -
т о на последните в п р о т о ч н а т а ц и т о м е т ­ за, катепсини, колагеназа, галактозидази,
рия за определяне н а клетъчно-повърхност- пероксидаза и др,
н и т е антигени допринесе за т о ч н о т о харак-
• хромозомен анализ;
452
» изследване н а сперматозоиди;
» определяне н а някои онкогени;
» идентифиииране н а вирус-инфектирани
к л е т к и , н а някои б а к т е р и а л н и видове, н а
и н ф е к т и р а н а с маларийни плазмодии кръв
и пр.
Н е п р е к ъ с н а т о т о усъвършенстване и раз-
ииряване н а с о ф т у е р а з а о б р а б о т к а н а дан-
lume о т ф л о у и и т о м е т р и ч н и я анализ позво-
4 ява подобряване н а в ъ з м о ж н о с т и т е за т я х -
^НИГОИИС
1 р а н с к и В. Е л е к т р о м а п { и т н о п о л е . В; М е д и ц и н с к а ф ю и к а . В.
В р а н с к и (ред). С о ф и я . М е д и ф и з к у л т у р а 1978,89-92.
1сисв М Н . Г р а н и ц и н а р е ф е р е н т н а т а о б л а с т и б и о л о г и ч н и в а ­
риации н а някои хематологични лабораторни показатели.
Д и с е р т а ц и я з а п р и с ъ ж д а н е н а н а у ч н а т а с т е п е н к . м . н . , 1986,
София.
J a u e r S . In: F r o n t - E n d A u t o m a t i o n . S t r a t e g i c Directions, Jully 1 9 9 7 ,
AACC.
lornby A S . Oxford A d v a n c e d Learner's Dictionary o f Current
English. O x f o r d University Press, 1989.
C S H . Recommendations for reference method for
h a e m o g l o b i n o m e t r y in h u m a n b l o o d ( I C S H S t a n d a r d Е Р б /
2:1977) a n d specifications for international haemiglobincyanide
reference preparation ( I C S H Standard EP6/3:1977). J Clin P a t h ,
31, 1978, 2, 139-143.
CSH. R e c o m m e n d e d methods for visual measurements of
leucocytes a n d thrombocytes. W H O / L a b / 8 8 . 3 .
nternational U n i o n o f P u r e a n d A p p l i e d C h e m i s t r y : N o m e n c l a ­
ture f o r a u t o m a t e d a n d m e c h a n i z e d a n a l y s i s ( r e c o m m e n d a t i o n
1989 ). P u r e A p p l C h e m , 6 1 , 1 9 8 9 , 1 6 5 7 - 1 6 6 4 .
laboratory Medicine. A Scientific a n d managerial infobasc. D e m o
C D , P e s c e K a p l a n P u b l i s h e r s , Inc., 1 9 9 9
4iers M K , Exton M G , Daniele C. Cell-counting a n d coagulation
instrumentation. In: D i a g n o s t i c h e m a t o l o g y . K o d a k ü F ( e d ) . W B
Saunders company, Philadelphia etc, 1995, 599-631.
T i o m a s L . E r y t h r o c y t e s . In: C l i n i c a l l a b o r a t o r y d i a g n o s t i c s . T h o ­
m a s L (ed). Th-B(X)ks V e r l a g s g e s e l l s c h a f t G m b H , F r a n k f u r t /
Main, 1998, 4 7 0 - 4 7 5 .
* * *
l o u w e n В e t a). H u m a n p r o g e n i t o r cell identif ication in p a t i e n t s
undergoing s t e m cell mobilization, u s i n g a routine hematology
analyzer. L a b H e m a t o l , 3 , 1 9 9 7 , 1 6 6 - 1 6 9 .
shii T, K a m a s u m i I, M a t s u m o t o И . S E - 9 0 0 0 I M I C h a n n e l - fo­
c u s i n g o n the r o l e s a n d f u n c t i o n s o f s u r f a c t a n t . S y s m e x J Int, 7 ,
1997, 2, 1 2 5 - 1 2 8 .
l o u g i I I e t al. D e t e r m i n a t i o n o f p e r i p h e r a l b l o o d s t e m c e l l s u s i n g
a u t o m a t e d h e m a t o l o g y a n a l y z e r , SE-9(X)() I M I c h a n n e l , S y s m e x
I Int, 7 , 1 9 9 7 , 6 3 - 7 0 .
a k e k a w a K. D e t e c t i o n o f h e m a t o p o i e t i c s t e m c e l l s u s i n g a u t o ­
mated blood ccll c o u n t e r a n d flow cytometry. J p n J Clin Pathol,
9 9 , 1996, 117-122.
XJA M e d i c a l E l e c t r o n i c s C o . , L t d . T h e o u t l i n e o f s t e m cell m o n i ­
tor p r o g r a m . S y s m e x J Int, 7, 1 9 9 7 , 8 2 - 8 8 .
' a m a n e T e t al. D e t e r m i n a t i o n o f h e m a t o p o i e t i c s t e m c e l l s in p e ­
ripheral b l o o d b y a u t o m a t e d h e m a t o l o g y a n a l y z e r , SE-9(KK),
S y s m e x J Int, 7 , 1 9 9 7 , 5 7 - 6 2 .
н о т о класифиииране, п р е д с т а в я н е и оиенка
( о и е н я в а т се 8-14 и повече клетъчни пара­
метри).
Нови направления н а и и т о м е т р и ч н и я
анализ в к л е т ъ ч н а т а биология са: определя­
не на к л е т ъ ч н а т а жизнеспособност, мони-
т о р и р а н е на е ф е к т а о т силно електрично
поле върху к л е т к и т е , мониториране н а кле­
т ъ ч н а т а фузия в хибридомните техники,
мониториране н а и и то к и н и и мн. др.
Y a m a n e Т e t al. P o s s i b i l i t y o f identification o f h e m a t o p o i e t i c s t e m
c e l l s u s i n g a c o n v e n t i o n a l b l o o d cell counter. E u r J H a e m a t o l ,
55, 1995, 207-209.
Z i n i G e t al. S t e m cell P B S C s c r e e n i n g f o r transplantation in the
r o u t i n e h e m a t o l o g y laboratory. L a b H e m a t o l , 3 , 1 9 9 7 , 1 8 5 - 1 9 0 .
» * *
Цветкова T , ОГНЯНОВ M. Имунофенотипна характеристика н а
к р ъ в н и т е к л е т к и . С . , В с н е л О О Д , 1995.
A g r a w a l Yl', M a h l a m i i k i Е К , P e n t t i l ä I M . U s e o f quality control
s t a n d a r d s in clinical f l o w c y t o m e t r y . A n n M e d 2 3 , 1991, 127-
133.
B r a n d o B , S o m m a r u g a E, B u s n a c h G , Civati G etc. F l o w c y t o m e t r i c
s t u d y o f g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r in h u m a n l y m p h o c y t e s , u s i n g a
F I T C c o n j u g a t e d ligand. In: Vitale M , P a p a S , I ' e s s a n o S ( e d s ) .
A d v a n c e s in c y t o m e t r y . II. C y t o m e t r y a n d m o n o c l o n a l a n t i b o d ­
ies. M i l a n o , E d i - e r m e s , 1990, 3 5 - 4 3 .
C a r t e r N P M e a s u r e m e n t o f c e l l u l a r s u b s e t s u s i n g antibodies. I n :
O r m e r o d , M G (ed). F l o w c y t o m e t r y . A practical a p p r o a c h . O x ­
ford, N e w York, T o k y o , I R L P r e s s at O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s ,
1990, 4 5 - 6 8 .
C a r t e r NP, M e y e r EW. Introduction to the principles o f flow
c y t o m e t r y . In: O r m e r o d M G (ed). F l o w c y t o m e t r y . A practical
a p p r o a c h . O x f o r d , N e w York, T o k y o , I R L P r e s s at O x f o r d U n i ­
v e r s i t y P r e s s , 1990, 1-28.
C o l l e r B S , A n d e r s o n K , W e i s m a n HE. N e w antiplatelet a g e n t s :
platelet G p I I b / I I I a a n t a g o n i s t s . T h r o m b H a e m o s t , 7 4 , 1995, 1,
302-308.
C o s t a A , Silvestrini R. R e l e v a n c e o f ploidy in clinical practice. In:
V i t a l e M , P a p a S , P e s s a n o S . A d v a n c e s in c y t o m e t r y . II.
C y t o m e t r y a n d m o n o c l o n a l antibodies. M i l a n o , Edi-ermes, 1990.
C o u l t e r W I I . H i g h s p e e d a u t o m a t i c b l o o d cell c o u n t e r a n d cell
analyzer. Proc. Natl. E l e c C o m f . 12, 1954, 1 0 3 4 - 1 0 3 5 .
D e Lord C. Deficiency o f glycosulpho-phosphatidyl-inosital-an-
c h o r e d p r o t e i n s in p a t i e n t s w i t h aplastic a n e m i a d o e s not affect
r e s p o n s e t o i m m u n o s u p p r e s s i v e therapy. B r J H a e m a t o l , 1 0 1 ,
1998, 91-93.
Giaretti W, Vinci A D , Sciallero S , d ' A m o r e E. D N A n o w c y t o m e t r y
in s t u d y i n g h u m a n colorectal t u m o r p r o g r e s s i o n a n d p r o g n o s i s .
In Vitale M , P a p a S , P e s s a n o S (eds). A d v a n c e s in c y t o m e t r y .
II. C y t o m e t r y a n d m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . M i l a n o , E d i - e r m e s ,
1990, 7 7 - 8 3 .
G r o g a n W, C o l l i n s J M . G u i d e to f l o w c y t o m e t r y m e t h o d s . N e w
York, Basel, M a r c e l D e k k e r Inc, 1990.
H a l l S e t al. T h e u s e o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a n d f l o w c y t o m e t r y
in the d i a g n o s i s o f p a r o x y s m a l nocturnal h e m o g l o b i n u r i a . B l o o d ,
8 7 , 1996, 12, 5 3 3 2 - 5 3 4 0 .
453
Herman ChJ, Walloch J. Clinical cytometry: Image processing v s
flow cytometry. Labmedica, 6, 1989, 4, 23-26.
Jennings CD, Foon KA. Recent advances in flow cytometry: appli­
cation to the diagnosis o f hematologic malignancy. Blood, 9 0 ,
1997, 8, 2863-2892.
Kamentsky LA, Mclamed M R , D e r m a n H . Spectrophotometer:
New instrument for ultra-rapid cell analysis. Science, 1 5 0 . 1 9 6 5 ,
630-631.
Ormerod MG. Analysis o f D N A . In: O r m e r o d M G (ed). F l o w
cytometry. A practical approach. Oxford, N e w York, Tokyo, I R L
Press at Oxford University Press, 1990, 69-86.
Ormerod MG. Further applications to cell biology. In: O r m e r o d
M G (ed). Flow cytometry. A practical approach. Oxford, N e w
York, Tokyo, IRL Press at Oxford University Press, 1990, 2 6 5 -
273.
454
Rasanen M L , Hovatta O L , Penttila IM, Agrawal YP. Detection
and quantitation o f sperm-bound antibodies by flow cytometry
o f h u m a n semen. Journal o f Andrology, 13, 1992, 1, 55-64.
Riley RS, M a h i n EJ, Perfetto S. Clinical applications o f flow
cytometry. A S C P National Meeting, Fall, 1991.
Roberts GT. Current application o f flow cytometry. Lab Medica,
8, 1991, 1-2, 9 - 1 4 .
Rothe G , S c h m i t z G . C o n s e n s u s protocol for the flow cytometric
i m m u n o p h e n o t y p i n g o f hematopoietic malignancies. Leukemia,
10, 1996, 877-895.
S n o e c k HW, Lardon F, Van Bockstaele D R , Peetermans ME. Ef­
fects o f intcrleukin-4 o n myelopoiesis: studies o n highly puri­
fied C D 3 4 + hematopoietic progenitor cells. Leukemia. 7 , 1 9 9 3 ,
4, 625-629.
 Автоматизация
6 хемостазеологията
В. И в а н о в

В близкото минало, а и понастоящем в мно­ н о м е т р и р а т в р е м е т о за съсирването на цялос­

го о т клиничните лаборатории за оценка
на нарушенията в процеса на кръвосъсир-
бане и фибринолиза са се използвали и се из­
ползват методи, основаващи се на наблю­
дения върху образуването и/или разгражда­
н е т о на кръвен съсирек (време на съсирва-
не, тромбопластиново време, тромбиново
време и др.).
През последните години за о т к р и в а н е
м я с т о т о и е с т е с т в о т о на дадено хемос-
т а з н о нарушение вече се използват м е т о ­
ди базиращи се на биохимични, физиологич­
ни, радиохимични, фармакологични, имуно­
логични и др. принципи. Успоредно със съз­
даването на т е з и нови лабораторни т е х ­
нологии започва и к он с т р у и р а н е т о на мо­
дерни, частично или напълно а в т о м а т и з и ­
рани а п а р а т и , към к о и т о т е з и технологии
м о г а т да б ъ д а т адаптирани. На таблица
23.1 са представени класовете хемостазни
а п а рати, к а т о са посочени индикаторните
системи и л а б о р а т о р н и т е технологии, ко­
и т о м о г а т да б ъ д а т адаптирани към т я х .
Исторически белокки
Л а б о р а т о р н и т е изследвания н а х е м о с т а з а т а
з а п о ч в а т да се и з в ъ р ш в а т още в н а ч а л о т о на
вече о т и в а щ и я си век. П ъ р в и т е с т ъ п к и в т а з и
насока з а п о ч в а т с о п и т и т е н а л е к а р и т е да хро-
т н а кръв. По т о з и начин през д в а д е с е т т е годи­
ни на 20. век се в ъ в е ж д а т м е т о д и т е за опреде­
ляне в р е м е т о на съсирване н а ц я л о с т н а кръв, а
в последствие и м е т о д , даващ възможност да се
проследи т о з и процес и в е п р у в е т к а .
През т о з и е т а п е била о т к р и т а и т р о м б е -
л а с т о г р а ф и я т а . Конструиран е бил и т р о м б е -
л а с т о г р а ф а - уред даващ възможност да се прос­
л е д я т в динамика, з а п и ш а т и о т к р и я т проме­
н и т е в процеса н а образуване и/или разгражда­
не на кръвния съсирек. В края н а т р и д е с е т т е
години на 20 век се е н а т р у п а л а много информа­
ция за процеса на кръвосъсирване и фибриноли­
за. Анализът на т а з и информация довежда до
разкриване на много о т н е и з в е с т н и т е до т о г а ­
ва механизми на х е м о с т а з а т а . В р е з у л т а т на
т е з и о т к р и т и я в л а б о р а т о р н а т а п р а к т и к а се
внедрява е д н о е т а п н и я м е т о д за определяне на
т р о м б о п л а с т и н о в о т о време (1935 г.), м е т о д за
определяне а к т и в н о с т т а на плазмен ф а к т о р V
(1947 г.), м е т о д за определяне а к т и в н о с т т а на
плазмен ф а к т о р VII (1951 г.) и мн. др.
През п е т д е с е т т е години в много о т лабора­
т о р и и т е е бил въведен и първия аналитичен ин­
с т р у м е н т за лабораторна оценка на нарушени­
я т а в процеса на кръвосъсирване и фибринолиза
- ф и б р о м е т ъ р ъ т . Конструираният уред е първи­
я т о п и т за внасяне на по-голяма обективност при
извършване х е м о с т а з н и т е изследвания и за съз­
даване на реална възможност за сравнимост на
получените р е з у л т а т и о т различните лаборато­
рии.

Таблица 24.1. А п а р а т и за оценка на х е м о с т а з а т а според вида на д е т е к т о р а и т е х н и к а т а

Клас и н с т р у м е н т Детектор Техника на изследване

1. Коагулометри електромагнитен коагулометрия
вискозоеластичен (хронометрия)
светлинна трансмисия
2. С п е к т р о ф о т о м е т р и светлинна трансмисия хромогенен анализ
3. Имунологични а н а л и з а т о р и светлинна трансмисия ELISA
с в е т л и н н а абсорбция имунотурбодиметрия
л а т е к с аглутинация имунотурбодиметрия
t—
4. Б е т а и г а м а броячи радиоактивност RIA

455

ОЦЕНКА НА ПОКАЗАТЕЛИТЕ
НА ХЕМОСТАЗАТА С А П А Р А Т И
НА КОАГУЛОМЕТРИЧЕН П Р И Н Ц И П
В края на п е т д е с е т т е години н а н а с т о я ­
щ и я век е к о н с т р у и р а н а п о л у а в т о м а т и ч н а
с и с т е м а (Becton Dickinson) за о т к р и в а н е н а
съсирек. В к о н с т р у к т и в н а т а основа н а т о з и
уред лежи с и с т е м а о т е л е к т р о д и д а в а щ а
в ъ з м о ж н о с т за засичане к р а й н а т а т о ч к а н а
образуването н а съсирека. Н а фигура 24.1 е
п р е д с т а в е н а п р и н и и п н а с х е м а н а фибро-
Стационарен електрод
Движещ се
Движещ се електрод — електрод в горна
позиция
в долна позиция
L_ Реакционна чашка
Ниво на
течността
1,27 mm
Ф и г 24.1. П р и н ц и п н а схема н а ф и б р о м е т ъ р
м е т ъ р . През 60 г о д и н и в л а б о р а т о р и и т е з а
оценка н а н а р у ш е н и я т а в кръвосъсирване-
т о и ф и б р и н о л и з а т а се и з п о л з в а т предим­
но ф и б р о м е т р и , а о т м а н у а л н и т е т е х н и к и
т ъ й нар. „ т е х н и к а н а наклонена е п р у в е т ­
ка". Доказали с в о я т а н а д е ж д н о с т в п р а к ­
т и к а т а и във в р е м е т о т е и днес се п о л з в а т
в много лаборатории.
По-късно за н у ж д и т е н а а в т о м а т и з а ц и я т а
в х е м о с т а з е о л о г и я т а са р а з р а б о т е н и и използ­
вани о п т и ч н и д е т е к т о р и за о т к р и в а н е н а к р а й ­
н а т а т о ч к а н а съсирване. Създава се нова гене­
рация а н а л и т и ч н и и н с т р у м е н т и за о ц е н к а н а
п о к а з а т е л и т е н а кръвосъсирване и фибринолиза,
при к о и т о , к а к т о и при с п е к т р о ф о т о м е т р и т е
се използва запис н а с в е т л и н н а т р а н с м и с и я с
цел у с т а н о в я в а н е н а к р а й н а т а т о ч к а н а съсир­
ване. Тази нова г е н е р а ц и я х е м о с т а з н и анализа­
т о р и се базира н а п р и н ц и п а н а п р о м я н а т а в
светлинната трансмисия, к о г а т о плазмата
п р е м и н а в а о т т е ч н а фаза в ъ в фаза н а г е л .
Н е у д о б с т в о т о п р и т о з и т и п а н а л и з а т о р и е, ч е
п р и липемия, хемолиза и / и л и д р у г т и п а н о р м а л н и
456
р е а к ц и и м о ж е да се п о л у ч и г р е ш н а л а б о р а т о р н а
информация.
С т е ч е н и е н а в р е м е т о бяха к о н с т р у и р а ­
н и и а н а л и з а т о р и , в ч и и т о п р и н ц и п и са за­
легнали е л е к т р о м а г н и т н и , у л т р а в и о л е т о в о -
с в е т л и н н и , лазерни, р а д и о а к т и в н и и д р у г
т и п д е т е к т о р и . Н а й - п р а к т и ч н и си о с т а ­
в а т а н а л и з а т о р и т е , основаващи се н а п р и н ­
ц и п а н а засичане н а к р а й н а т а т о ч к а н а съ­
сирване, к а к т о и т е з и , п р и к о и т о се измер­
ва т р а н с м и с и я т а н а с в е т л и н а т а .
И з т о ч н и ц и н а г р е ш к и . П о п р и н ц и п за
всеки х е м о с т а з е н а н а л и з а т о р ф и р м а т а - п р о ­
и з в о д и т е л предлага и н с т р у к ц и и , определя­
щ и п р а в и л а т а за действие при р а б о т а с
а н а л и з а т о р а , к а к т о и п о в е д е н и е т о н а рабо­
т е щ и я с н е г о персонал. С ъ в р е м е н н и т е ана­
л и з а т о р и освен т е х н и ч е с к и т е о п и с а н и я
п р и т е ж а в а т и т е х н и к о - д и а г н о с т и ч н и прог­
р а м и , к о и т о д а в а т в ъ з м о ж н о с т да се „ д и а г ­
н о с т и ц и р а " възникналия т е х н и ч е с к и д е ф е к т
или д о п у с н а т а г р е ш к а и п о д с к а з в а т
п ъ т и щ а т а , п о к о и т о т е да б ъ д а т о т с т р а ­
нени. П р и р а б о т а с т о з и клас х е м о с т а з н и
а н а л и з а т о р и е в а ж н о да се знае, че:
Неточно време на съсирване се получава,
к о г а т о не са с п а з е н и т е м п е р а т у р н и т е ус­
ловия н а р а б о т а - п о - н и с к а или по-висока о т
зададената на анализатора т е м п е р а т у р а
(37 0С). Н а й - ч е с т о т е м п е р а т у р а т а се к о н ­
т р о л и р а а м т о м а т и ч н о и през целия анали­
т и ч е н цикъл н е й н и т е с т о й н о с т и м о г а т и
т р я б в а да се п р о с л е д я в а т ;
Съхранението на реактивите, с к о и т о се
р а б о т и т р я б в а да с т а в а според предписа­
н и я т а дадени о т п р о и з в о д и т е л я . Обикнове­
н о р е к о н с т и т у и р а н и р е а к т и в и се съхраня­
в а т н а й - ч е с т о п р и 4 до 8 0С в хладилник и
всяко о т к л о н е н и е о т т о з и т е м п е р а т у р е н
р е ж и м оказва в ъ з д е й с т в и е възху г о д н о с т т а
н а р е а к т и в и т е , респ. в ъ р х у н а д е ж д н о с т т а
на р е з у л т а т и т е ;
Дозировката на реактивите в о т д е л н и т е
проби се и з в ъ р ш в а със специални н а к а п в а ­
щ и а в т о м а т и ч н и у с т р о й с т в а . Те т р я б в а да
б ъ д а т к а л и б р и р а н и преди всеки анализ или
преди серия о т анализи, а п р и н е о б х о д и м о с т
и п о д м е н я н и с цел да се з а п а з и непроменено
количество о т о т д е л н и т е реактиви, к о и т о
се в к л ю ч в а т в р е а к ц и о н н а т а смес.
ЗЦЕНКА НА ПОКАЗАТЕЛИТЕ
i A ХЕМОСТАЗАТА С АПАРАТИ
1А ХРОМОГЕПЕН ПРИНЦИП
въвеждането в п р а к т и к а т а н а технологии
: хромогенни с у б с т р а т и даде в ъ з м о ж н о с т
^а се и з п о л з в а т специфични биохимични ре-
йщии, к а т о о т п а д а н е о б х о д и м о с т т а о т ус-
пановяване к р а й н а т а т о ч к а н а формиране
ш съсирека.
П р и н ц и п ъ т н а и з с л е д в а н и я т а със с и н т е -
пични хромогенни с у б с т р а т и се основава н а
тецифични е н з и м н о - с у б с т р а т н и реакции.
С и н т е т и ч н и я т хромогенен с у б с т р а т е
югична п о с л е д о в а т е л н о с т о т т р и или че-
пири аминокиселини и реално наподобява ес-
п е с т в е н и я с у б с т р а т . Х и м и ч н и т е реакции
:а специфични и в т я х не се р а з ч и т а н а мно­
гобройните „реакционни с т ъ п к и " , харак-
перни за к о а г у л а ц и о н н а т а каскада, н и т о
1ък н а х р о н о м е т р и р а н е н а к р а й н а т а т о ч к а
ш съсирване.
С и н т е т и ч н и хромогенни с у б с т р а т и са
гьздадени за много о т п л а з м е н н и т е ф а к т о -
)и н а кръвосъсирването и фибринолизата,
: а к т о и з а някои инхибитори и а к т и в а т о -
)и на т е з и процеси. Създадени са с и н т е т и ч -
ш с у б с т р а т и и за определяне на хепарин, t-
и др. С т а к и в а с у б с т р а т и може д а се
шредели всеки ензим н а кръвосъсирването
I фибринолизата. При л и п с а т а н а опреде­
лен з а даден ензим с у б с т р а т н е г о в а т а ак-
п и в н о с т може да бъде измерена и н д и р е к т -
ю. В т а к и в а случаи н е и з в е с т н и я т ензим
1грае р о л я т а на ограничаващ ф а к т о р , а друг
шзим в р е а к ц и я т а се определя количестве-
ю. При изследване с хромогенни с у б с т р а т и
ю а к ц и и т е п р о т и ч а т едностъпално (А) или
(вустъпално (Б):
тромбин
Tos-GIy-Pro-Arg-pNa •
(безцветен)
Tos-Oly-Pro-Arg + pNa
(жълто оцветен)
Търва П л а з м и н + ( i - а н т и п л а з м и и — — — •
'.тъпка „ АПАРАТИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ
Плазмии-антиплазмии
комплекс + излишък иа плазмин
Зтора H-D-Val-Leu-Lys-pNa • ХРОМОГЕНЕН ПРИНЦИП
'тъпка (излишък на п л а з м и н )
H-D-Val-Leu-Lys + pNa
Б.
) т ч и т а се и н т е н з и т е т а н а получения
ц в я т , а е н з и м н а т а а к т и в н о с т н а изследва­
ния ф а к т о р ( а к т и в а т о р или инхибитор) се
определя чрез екстраполация по с т а н д а р т ­
н а крива. З а о т ч и т а н е н а р е а к ц и и т е с хро­
могенни с у б с т р а т и м о г а т да се използват
и с п е к т р о ф о т о м е т р и с мануално изпълне­
ние или пък напълно а в т о м а т и з и р а н и ана­
л и т и ч н и си стеми . Т е с т о в е т е с хромогенни
с у б с т р а т и лесно се а д а п т и р а т към всяка­
къв вид с п е к т р о ф о т о м е т р и и лесно подле­
ж а т на а в т о м а т и з и р а н е .
И з т о ч н и ц и и а г р еш ки. При анализато­
р и т е р а б о т е щ и с хромогенни с у б с т р а т и
с ъ щ е с т в у в а т с л е д н и т е проблеми, к о и т о
т р я б в а да се п о з н а в а т о т л а б о р а т о р н и т е
специалисти:
Използването на микроколичества реакти­
ви и биологичен м а т е р и а л ч е с т о води до греш­
ки и неверни р е з у л т а т и , ако предварително
з а д а д е н и т е обеми б ъ д а т н а р у ш е н и или
вследствие на неправилно зададени обеми;
Условията на съхранение на'хромогеттте
с у б с т р а т и т р я б в а да се съблюдават, т ъ й
к а т о т е са особенно ч у в с т в и т е л н и (неен-
зимна ходролиза н а с у б с т р а т и ) ;
Е н з и м н и т е системи, к о и т о у ч а с т в а т в
т о з и т и п реакции са по-малко стабилни и
устойчиви, о т к о л к о т о при конвенционални­
т е ензимни изследвания;
Пренасянето (carryover) на р е а к т и в и и био­
логичен м а т е р и а л ч е с т о е причина за греш­
ни р е з у л т а т и . Поради т а з и причина всички
с и с т е м и на а н а л и з а т о р а т р я б в а да се по­
ч и с т в а т идеално.
И при д в а т а класа а н а л и з а т о р и важно
условие за получаване н а надеждни лабора­
т о р н и р е з у л т а т и е с п а з в а н е т о на правила­
т а за събиране и о б р а б о т к а н а биологичния
м а т е р и а л . Пробите т р я б в а да се с ъ б и р а т и
с ъ х р а н я в а т по начин, по к о й т о може да се
избегне а к т и в и р а н е т о на процесите в про­
бата.
НА ХЕМОСТАЗАТА, ВКЛЮЧВАЩИ
ХРОНОМЕТРИЧЕН И
Комбинираният т и п анализатори д а в а т
в ъ з м о ж н о с т едновременно да се о т ч и т а
к р а й н а т а т о ч к а на съсирване и да се извър-
457
ш в а т изследвания c хромогенни с у б с т р а т и , ри з а о ц е н к а н а х е м о с т а з а т а с а д а п т и р у е -
На т а б л и ц а 24.2 с а п р е д с т а в е н и а н а л и з а т о - м а към т я х методология.
Т а б л и ц а 24.2. Модели анализатори за оценка на х е м о с т а з а т а и а д а п т и р а н а т а
към т я х методология
Производител Модел Методология
BCT хронометрична
Behring хромогенен с у б с т р а т
имунологична
STA, STA Compact хронометрична
Diagnostica Stago хромогенен с у б с т р а т
имунологична
Аса хронометрична
Du Pont Coumatrak хронометрична
хромогенен с у б с т р а т
Dataclot 2 хронометрична
Helena Cascade 480 хронометрична
хромогенен с у б с т р а т
Нето Tec Hepcon/HMS хронометрична
ACL-200, ACL-1000, ACL-2000 хронометрична
IL хромогенен с у б с т р а т
Elektra 700, 750, 800, 900 хронометрична
MLA Elektra 900C, 1000C хронометрична
хромогенен с у б с т р а т
Coag-A-Mate XM, RA4 хронометрична
MDA-180 хронометрична
Organon Teknika
хромогенен с у б с т р а т
имунологична
Koagulab 16S, 32S, 60S хронометрична
Ortho Koagulab CTS хронометрична
хромогенен с у б с т р а т
Sysmex CA 1000, CA 5000, хронометрична
CA 6000 хромогенен с у б с т р а т

ИЗСЛЕДВАНЕ НА ХЕМОСТАЗАТА
С АПАРАТИ НА ИМУНОЛОГИЧЕН
ПРИНЦИП
Последните д о с т и ж е н и я в о б л а с т т а н а ла­
б о р а т о р н а т а х е м о с т а з е о л о г и я с а свързани
със с ъ з д а в а н е т о н а л а б о р а т о р н и т е х н о л о ­
гии и а н а л и з а т о р и основаващи се н а имуно­
логичен принцип. В процеса н а кръвосъсир-
ване и фибринолиза освен п л а з м е н н и т е фак­
т о р и н а кръвосъсирване, т е х н и т е а к т и в а ­
т о р и и и н х и б и т о р и с ъ щ е с т в у в а т и вещес­
т в а , к о и т о се о т д е л я т по време н а а к т и в и ­
р а н е т о н а п р о ц е с и т е н а х е м о с т а з а т а . Тези
в е щ е с т в а с а и з в е с т н и к а т о молекулни
маркери (фибринопептид А (В), ß-2-тромбог-
лобулин, п р о т р о м б и н о в ф р а г м е н т (F 1 + 2) и
др.). Те п р е д с т а в л я в а т добре дефинирани хи­
мични единици с ниско молекулно т е г л о . В
458
к р ъ в т а се с р е щ а т в м а л к и к о л и ч е с т в а и се
о с в о б о ж д а в а т п р и п р о т и ч а н е н а специфич­
ни е н з и м н и р е а к ц и и или се о т д е л я т о т ак­
тивирани клетки. Ч а с т о т т я х изпълняват
с т р о г о специфични функции в организма, а
други п р е д с т а в л я в а т м е ж д и н н и п р о д у к т и
н а определена реакция. М о л е к у л н и т е марке­
ри п р е д о с т а в я т специфична информация за
местонахождението н а процесите на акти­
в а ц и я в к о а г у л а ц и о н н а т а к а с к а д а или пък за
н а л и ч и е т о н а д е ф и ц и т н а определени със­
т а в к и в дадени е т а п и , довеждащи до хемо-
рагични или т р о м б о т и ч н и и н ц и д е н т и (напр.
п о в и ш е н о т о ниво н а м о л е к у л н и т е маркери,
с в ъ р з а н и с г е н е р и р а н е н а т р о м б и н о в а ак­
т и в н о с т или п ъ к с н а м а л е н а фибринолитич-
н а а к т и в н о с т би означавало с ъ с т о я н и е на
хиперсъсирваемост при даден пациент).
Хронометричните методи и м е т о д и т е с
хромогенни с у б с т р а т и не п р и т е ж а в а т не­
обходимата ч у в с т в и т е л н о с т , з а да д о л о в я т
т а к и в а промени. Такава информаиия може
да се получи само с ELISA и RIA методологи­
я т а . Трябва д а се знае също, че имунологич­
н и т е изследвания н а х е м о с т а з а т а не д а в а т
информация за ф у н к ц и и т е н а даден компо­
н е н т о т к о а г у л а ц и о н н а т а каскада, а само
к о н с т а т и р а т н е г о в о т о наличие и/или кон­
ц е н т р а ц и я . "Нормални" л а б о р а т о р н и резул­
т а т и получени с ELISA м е т о д о л о г и я т а мо­
г а т д а б ъ д а т съпроводени с анормални ре­
з у л т а т и получени със х р о н о м е т р и ч н и т е
или х р о м о генно- субст ра т н и м е т о д и к и .
В п р а к т и к а т а з а б е л т ъ ц и с по-голямо
молекулно т е г л о , влизащи в с ъ с т а в а н а коа­
г у л а ц и о н н а т а к а с к а д а (напр. фибриноген,
а н т и т р о м б и н III и мн. др.) м о г а т да б ъ д а т
използвани радиална имунодифузия, нефело-
м е т р и я , р а к е т н а електрофореза, двупосоч­
н а електрофореза и др. Тези м е т о д и м о г а т
да б ъ д а т ч а с т и ч н о а в т о м а т и з и р а н и , к а т о
по т о з и начин получените р е з у л т а т и са с
приемлива н а д е ж д н о с т .
В последните години бяха създадени иму­
нологични а н а л и з а т о р и , о т ч и т а щ и реакци­
я т а а н т и г е н / а н т и т я л о или л а т е к с - а г л у т и -
нация на т у р б и д и м е т р и ч е н принцип.
П о н а с т о я щ е м з а изпълнението н а ELISA
т е х н и к а т а са к о н с т р у и р а н и модерни а в т о ­
м а т и з и р а н и с и с т е м и , к о и т о п р а в я т реали­
з и р а н е т о н а и з с л е д в а н и я т а по-малко т р у ­
доемко, а р е з у л т а т и т е надеждни. При кон­
с т р у и р а н е т о н а т о з и клас и н с т р у м е н т и се
използават пълнещо/аспириращи е т а п и ,
посредством к о и т о р е а к ц и о н н и т е камери
се п ъ л н я т с а н т и г е н и , а н т и т е л а или други
р е а к т и в и , с последващи промиващи проце­
дури. Към и н с т р у м е н т а се в к л ю ч в а т про­
мивни у с т р о й с т в а и у с т р о й с т в о за о т ч и ­
т а н е н а р е а к ц и и т е . Н а к а п в а н е т о н а реак­
т и в и т е се извършва с многоканални пипе-
тиращи устройства.
М о д е р н и т е ELISA с и с т е м и с а напълно
а в т о м а т и з и р а н и и в п р о г р а м и т е им с а
включени най-малко п е т различни р а б о т н и
цикъла: промиване, размесване, накапване,
попиване к л а т е н е , о т ч и т а н е , и др. Аспира-
ц и о н н и т е процедури се и з в ъ р ш в а т о т г о р е
надолу, к а т о по т о з и начин се минимизира
преносът на материал. Ч е т я щ и т е устройс­
т в а са напълно а в т о м а т и з и р а н и и о т ч и т а ­
н е т о е на две дължини н а в ъ л н а т а (в и н т е р ­
вала о т 340-750 п т ) . Ф о т о д е т е к т о р и т е н а
с и с т е м и т е се с ъ с т о я т о т волфрам-халоген-
ни лампи. Съвременните ELISA с и с т е м и са
бързи и м о г а т да и з п ъ л н я в а т един опера­
т и в е н цикъл за около т р и м и н у т и . Обеми­
т е на промивните р а з т в о р и и б р о я т на про-
м и в н о - а с п и р а ц и о н н и т е цикли с а напълно
а в т о м а т и з и р а н и и се к о м а н д в а т о т специ­
ализирана програма. Двойните о т ч и т а н и я
о с и г у р я в а т коригиране н а вариациите, при­
чинени о т замърсявания, драскотини и др.
Волфрам-халогенната лампа излъчва с в е т ­
лина, преминаваща през две лещи вградени
в 90-градусова призма, о т к о я т о светлина­
т а се о т к л о н я в а вертикално надолу преми­
навайки през п р о б а т а и през р о т а ц и о н е н
ф и л т р о в диск. Към програмния п а к е т на
с и с т е м а т а е включена и програма за качес­
т в е н к о н т р о л . А п а р а т и т е с а снабдени с
интерфейсна връзка.
И з т о ч н и ц и п а г р е ш к и . Необходимо е да
се знае,че за да се п о л у ч а т надеждни резул­
т а т и при р а б о т а с т е з и анализатори т р я б ­
ва да се с п а з в а т следните условия:
М и е щ и т е устройства т р я б в а да се почис­
т в а т с и с т е м н о и много добре за да се из­
бегне възникването на проблеми о т меха­
нично е с т е с т в о ;
Консумативните материали - проводящи и
отводящи тръбички, кювети, съд чета и т . н .
следва да се п о ч и с т в а т добре, да се промиват
с дестилирана вода и да се подсушават;
Събирането и о бр а бо тка та н а п р о б и т е
т р я б в а да с т а в а по предварително дефини­
р а н и т е условия.
ХЕМОСТАЗНИ АНАЛИЗАТОРИ НА
КОАГУАОМЕТРИЧЕН, ИМУНОЛОГИЧЕН
И ХРОМОГЕНЕН ПРИНЦИП
През последните години бе реализирана меч­
т а т а н а л а б о р а т о р н и т е специалисти за
създаване н а напълно а в т о м а т и з и р а н и сис­
т е м и , о т ч и т а щ и н а комбиниран принцип.
Такива а н а л и з а т о р и се п р е д л а г а т о т
ORGANON TEKNIKA (MDA - 180), Diagnostica
STAGO (STA - Compact), Behring (BCT), Sigma
и др. Поради големия си к а п а ц и т е т и зна­
ч и т е л н о разнообразие о т т е с т о в е , т е з и
а п а р а т и са предназначени за високоспециа­
лизирани лаборатории.
459
АПАРАТИ ЗА ОЦЕНКА НА
ТРОМБОЦИТНИТЕ ФУНКЦИИ
Т р о м б о ц и т и т е с а важен е л е м е н т у ч а с т в а щ
в резулирането и баланса н а х е м о с т а з н а т а
система. Редица о т т е х н и т е функции м о г а т
да б ъ д а т оценени, к а т о вече е възможно д а
им се направи количествена оценка. През 1963
година R.Bom р а з р а б о т в а м е т о д и к а з а оцен­
ка н а агрегационната способност н а т р о м ­
б о ц и т и т е . М е т о д и к а т а се основава н а прин­
ципа, че т р а н с м и с и я т а н а светлина, преми­
нала през б о г а т а н а т р о м б о ц и т и плазма с е
увеличава поради с т р у п в а н е т о н а т р о м б о ц и ­
т и т е . А к т и в и р а н и т е т р о м б о ц и т и се слеп­
в а т , п р о м е н я т ф о р м а т а си и о с в о б о ж д а в а т
съдържимото н а г р а н у л и т е си. Динамично­
т о проследяване н а п р о м е н и т е в т р а н с м и с и ­
я т а н а с в е т л и н а т а дава в ъ з м о ж н о с т д а се
добие п р е д с т а в а з а д и н а м и к а т а н а п р о т и ч а ­
не на т о з и сложен процес. Н а т а б л . 3 с а пред­
ставени лабораторните апарати, с к о и т о
може да се направи оценка н а т р о м б о ц и т н и -
т е функции.
За оценка на агрегационната способност
на т р о м б о ц и т и т е най-често се използват
уреди наречени агрегометри. В п р а к т и к а т а
най-често предлаганите агрегометри са че-
тириканални, к а т о ч е т и р и т е канала са не­
зависими един о т друг. О т ч и т а н е т о на агре-
г а ц и я т а с т а в а посредством оптически ме­
ханизъм, к а т о с в е т л и н а т а преминава през
т е с т епруветки съдържащи б о г а т а на т р о м ­
боцити плазма. П р о м я н а т а в и н т е н з и т е т а
на с в е т л и н а т а се о т ч и т а о т чувствителен
д е т е к т о р . При н е а к т и в н о с ъ с т о я н и е н а
тромбоцитите б о г а т а т а на тромбоцити
плазма е полупрозрачна. След а к т и в и р а н е т о
им п л а з м а т а се избистря к а т о „дори м о г а т
да се в и д я т с а м и т е т р о м б о ц и т н и агрегати".
Р е з у л т а т и т е се р е г и с т р и р а т графично под
форма на крива наречена агрегограма. При ин­
т е р п р е т а ц и я т а на р е з у л т а т и т е се в з е м а т
под внимание: реакционното време, х а р а к т е ­
ра на агрегационната крива - едно- или дву-
вълнова, нейния наклон, максималната агре-
гация в процент и други параметри. Правил­
н а т а оценка изисква агрегация най-малко с
два индуктора.
Използват се и друг т и п агрегометри - ед-
ноканални или двуканални. При т я х принци­
п ъ т на о т ч и т а н е е регистрирането на пре­
миналата, през бедна и през б о г а т а на т р о м -
460
боцити плазма, инфрачервена светлина. Тя се
сравнява дигитално и възникналата разлика
във в о л т а ж а се амплифира и записва о т ре­
гистриращо у с т р о й с т в о . Уредът п р и т е ж а ­
ва сигнализиращо у с т р о й с т в о , ако б р о я т на
т р о м б о ц и т и т е е прекалено нисък.
През последните години бе конструиран и
агрегометър, с к о й т о освен оценка на агрега-
ц и я т а може да се добие п р ед става и за ниво­
т о н а секреция н а АТФ о т гранулите на ак­
т и в и р а н и т е т р о м б о ц и т и . У с т р о й с т в о т о на
т о з и клас агрегометър е сходно с писаното в
т е к с т а по-горе. За о т ч и т а н е на АТФ в един
о т агрегационните канали под прав ъгъл е
м о н т и р а н а фотоувеличителна тръбичка, ко­
я т о измерва луминисценцията о т луцифера-
за в п р и с ъ с т в и е т о н а АТФ. Едновременният
запис н а агрегацията и на секрецията на АТФ
е един перфектен способ за оценка н а т р о м -
б о ц и т н и т е функции, особено при проучване
о т д е л я н е т о н а серотонин. В п р а к т и к а т а за
изучаване о т д е л я н е т о н а серотонин най-чес­
т о се използват технологии с у ч а с т и е т о на
радиоактивни материали. В случая констру­
и р а н е т о на т о з и клас агрегометър е удачно
решение на проблема за избягване н а радио­
а к т и в е н м а т е р и а л при л а б о р а т о р н и т е изс­
ледвания.
Предлагат се и агрегометри, при к о и т о за
оценка на т р о м б о ц и т н и т е функции се изпол­
зва ц я л о с т н а кръв. О ц е н к а т а н а агрегация­
т а се извършва посредством о т ч и т а н е на
промените в импеданса. Непрозрачността на
проба о т ц я л о с т н а кръв прави невъзможно
ф о т о м е т р и ч н о т о о т ч и т а н е на агрегацията.
За т а з и цел се използва измерването н а елек­
трическия импеданс между два т ъ н к и елек­
т р о д а . При п о т а п я н е н а е л е к т р о д и т е в про­
ба о т ц я л о с т н а кръв, еднопластен тромбо-
ц и т е н слой о т т р о м б о ц и т и т е обвива елект­
родите. Н а т р у п в а н е т о на още т р о м б о ц и т и
върху еднопластния слой увеличава импедан­
са между електродите. П р о м я н а т а в импе­
данса може да бъде регистрирана посредст­
вом графично у с т р о й с т в о .
Вече са конструирани и агрегометри, ко­
и т о успоредно с о ц е н к а т а н а а г р е г а ц и я т а
н а т р о м б о ц и т и т е д а в а т в ъ з м о ж н о с т да се
измери и ц и т о п л а з м е н и я йонизиран калций,
к а т о при т я х aequorum луминисценцията
е м а р к е р ъ т , к о й т о се използва за измерване
н а йонизирания калций. Този т и п комбина­
ция е особено удачна при изучаване зависи-
Mocmma между йонизирания калций и про­ k a н а п о к а з а т е л и т е н а кръвосъсирването и
м я н а т а във ф о р м а т а н а т р о м б о ц и т и т е , аг- фибринолизата променя и ще продължава да
р е г а ц и о н н а т а им способност, а т а к а също променя обсега н а д ей стви е и п о л и т и к а т а
и за оценка в ъ з д е й с т в и е т о н а редица инхи- н а интереси на х е м о с т а з н и т е лаборатории.
б и т о р и върху т р о м б о ц и т н и т е функции. Този напредък не е изолиран, а е пряко свър­
Едно ново и и н т е р е с н о решение в т а з и зан с р а з в и т и е т о н а к л и н и ч н а т а химия,
о б л а с т е с ъ з д а д е н и я т наскоро о т ф и р м а т а имунологията, и м у н о х и м и я т а , биохимия­
DADE-BEHRING а н а л и з а т о р з а оценка н а т а , биотехнологиите и др. науки. Налични­
т р о м б о ц и т н и т е функции - PFA 100. Касае т е ан ал и зато р и за изследване н а х е м о с т а ­
се за к а ч е с т в е н о нов а п а р а т с много и н т е ­ з а т а о т д а в н а са надминали класа н а обик-
ресни технически решения, предназначен з а н о в е н н и т е ф о т о м е т р и . Към т я х н а т а па­
о т ч и т а н е н а в р е м е т о н а кървене „in vitro". л и т р а вече се в к л ю ч в а т а в т о м а т и ч н и дис­
К ю в е т а т а з а о т ч и т а н е е с ъ с т а в е н а о т две к р е т н и анализатори, к а к т о и мултипроб-
п р о с т р а н с т в а , разделени с е л а с т и ч н а мем­ ни анализатори п р и т е ж а в а щ и възможност­
брана, напоена с ADP Collagen, Epinephrine, т а за измерване н а различни т е с т о в и край­
Ristocetin в о п т и м а л н и количества. О т ед­ ни т о ч к и .
н а т а с т р а н а се п о с т а в я пълна ц и т р а т н а А в т о м а т и з а ц и я т а в х е м о с т а з н а т а ла­
кръв. А п а р а т ъ т пробива м е м б р а н а т а и оп­ б о р а т о р и я дава о п е р а т и в н а п р о с т о т а на
ределя а в т о м а т и ч н о в р е м е т о н а кървене, действие, използване н а микроколичества
к о е т о зависи в най-голяма с т е п е н о т броя биологичен м а т е р и а л и реактиви, рентабил­
и ф у н к ц и и т е н а Thr. Б ъ д е ш е т о ще покаже н о с т и к о м п ю т ъ р н а с ъ в м е с т и м о с т за бър­
клиничната з н а ч и м о с т на т о з и анализатор. зо и т о ч н о намаляване обема н а база данни.
С ъ щ е с т в у в а т и анализатори, к о и т о са про­
И з т о ч н и ц и п а г р е ш к и . И тук, както при е к т и р а н и за групово обработване на единич­
работа е анализатори за оценка показателите ни проби или за изпълнение н а т е с т о в и па­
на хемостазата, поддържането на константна нели о т единична п а ц и е н т о в а проба и др.
температура е о т особенно важно значение за Н а п р е д ъ к ъ т н а т о з и т и п лабораторна
получаване на надеждни резултати. Оптимална­ технология и и н т р у м е н т а р и у м вече се свър­
т а температура, при която се извършва агрега- зва с внедряването на с у х а т а химия, проточ-
ц и я т а е 37 "С. Върху надеждността на резулта­
н а т а ц и т о м е т р и я , за да се стигне до възмож­
т и т е влияние оказва чистотата на използвани­
т е консумативи както и на реакционните кюве- н о с т и за изследване в кабинета на лекуващия
т и . В повечето случаи недостоверни резултати лекар. Вече се предлагат коагулометри, по­
се получават при нарушаване правилата за съби­ добно на глюкомерите, к о и т о позволяват оп­
ране,обработка и съхраняване на биологичния ма­ ределянето на основни скринингови т е с т о в е
териал. к а т о FT и АРТТ при пациенти, подложени на
продължителна антикоагулантна т е р а п и я .
В ъ з м о ж н о с т т а за бързото изпълнение на оп­
БЪДЕЩИ ТЕНДЕНЦИИ ределен профилен панел създава условия паци­
В РАЗВИТИЕТО НА АВТОМАТИЗАЦИЯТА е н т и т е реално да б ъ д а т подсигурени срещу
НА ХЕМОСТАЗНИТЕ ЛАБОРАТОРИИ риска о т тромбоза и същевременно с т о в а и
условия за ефективен мониторинг на провеж­
Н а п р е д ъ к ъ т в л а б о р а т о р н и т е технологии д а н о т о лечение.
и к о н с т р у и р а н е т о н а а н а л и з а т о р и за оцен-

КНИГОПИС

I3ick LR. O u a l i t a l i v c ( F u n c t i o n a l ) p l a l c l c l s disorders. In: D i s o r ­
ders o f T h r o m b o s i s , U S A , A S C P Press, 1 9 9 2 , 4 9 - 6 7 .
C i v a r e l l a D . l a b o r a t o r y d i a g n o s i s and m a n a g e m e n t o f throm­
botic disorders. In: C l i n i c a l l a b o r a t o r y M e d i c i n e , Tilt on K C
( e d ) , U S A , M o s b y , Year B o o k , 1 9 9 2 , 1 0 4 5 - 1 0 5 9 .
< o l m a n KW et al. M e c h a n i s m s o f platelet aggregation. In: C o l m a n
RW (ed). Hemostasis and Thrombosis, Philadelphia, Jli
Kaplan LK. Laboratory markers o f platelet activation. In: C o l m a n
R W (ed). H e m o s t a s i s and T h r o m b o s i s , Philadelphia, J B
Lippincott C o m p a n y , 1 9 9 4 , 1 1 8 0 - 1 1 9 3 .
Miller I J . l i l o o d Platelets. In: Clinical d i a g n o s i s and m a n a g e ­
ment b y laboratory m e t h o d s , U S A , W B Saunders C o m p a n y ,
1991, 717-733.
W a l e n g a MJ. A u t o m a t i s a t i o n in h e m o s t a s i s . In: Laboratory

l.ippincott C o m p a n y , 1 9 9 4 , 5 0 8 - 5 2 1 . instruments, U S A , Mosby, 1993, 379-395.

461
 Уринен анализ -
автоматизация
В. Орбецова
Уринният анализ, доскоро извършван пре­
димно мануално, е трудоемко изследване,
натоварващо лабораторията и по време, и
по ангажираност на персонал, главно в
ч а с т т а си за микроскопското изследване на
седимента след центрофугиране.
Въвеждането на сухите проби (тест-лен-
т и ) с т я х н а т а лесна техника, висока чувс­
т в и т е л н о с т и специфичност подобри и ус­
кори уринния анализ. По отношение на хи­
мичния анализ сухите проби почти изцяло
изместиха качествените т е с т о в е с т е ч н и
реактиви и в много отношения д а в а т полу-
количествена информация. Що се касае до
формените елементи - еритроцити, левко­
цити, цилиндри, бактерии, сухите проби
и м а т предимно х а р а к т е р на пресяващи
тестове.
Визуалното о т ч и т а н е на ц в е т н и т е ре­
акции обаче е натоварено с д о с т а субектив­
ни грешки, свързани к а к т о с индивидуални­
т е особености в ц в е т н о т о виждане на о т ­
читащия, т а к а и с условията, при к о и т о
се извършва т е с т ъ т - осветление, изразе­
но оцветяване на с а м а т а урина (билируби-
немия, хематурия, някои лекарства и т.н.),
неспазване с т р и к т н о на времето за разви­
ване на ц в е т н а т а реакция при големи се­
рии о т проби.
Фотометричното о т ч и т а н е на сухите
уринни проби избягва повечето о т т е з и
проблеми и предлага по-висока т о ч н о с т о т
една страна, а о т друга - п е с т и време и ан­
гажираност на персонала, особено, к о г а т о
т о в а о т ч и т а н е се а в т о м а т и з и р а .
В последните десетина години а в т о м а ­
т и з а ц и я т а на уринния анализ има д о с т а го­
леми завоевания, засягащи първоначално хи­
мическата част, а в последно време, с адап­
тиране на флоуцитометрията, и най-тру­
д о е м к а т а ч а с т - микроскопирането на
уринния седимент. А в т о м а т и з и р а т се и
специфични уринни т е с т о в е за доказване на
462
патологични м е т а б о л и т и , лекарства, нар­
котици.
АВТОМАТИЗИРАН ХИМИЧЕН
УРИНЕН АНАЛИЗ
Редица фирми-производителки предлагат
а в т о м а т и з и р а н и анализатори на уринни
проби с т е с т - л е н т и : Miditron и Unilux
(Roch); Clinitek (Bayer, Newbury); Super Au-
tion-4220 и gp. Р е з у л т а т и т е о т няколко го­
леми сравнителни проучвания върху нови­
т е а в т о м а т и з и р а н и системи и конвенцио­
налните мануални изследвания, използващи
т е с т - л е н т и , т е ч н и реактиви и микроскоп-
ско изследване на седимента, показват пре­
д и м с т в а т а на автомазирания анализ, гра­
ниците на неговите възможности и пр. (Ев­
ропейската мултицентрова оценка на урин­
ния анализатор Super Aution SA-4220' 1998;
Проучването на North Hampshire Hospital,
NHS'1998 и gp.).
Miditron
С и с т е м а т а Miditron е една о т първите въ­
ведени в л а б о р а т о р н а т а практика за реф-
лексионен а в т о м а т и з и р а н анализ. Принци­
п и т е и т е х н и к а т а , заложени и използвани
в Miditron м о г а т да послужат за илюстра­
ция в основни линии на процеса на автома­
т и з а ц и я в химичния уринен анализ въобще.
С и с т е м а т а се с ъ с т о и о т два модула:
Miditron М и Miditron ST. Miditron М е ав­
т о м а т и ч н а с и с т е м а за полуколичествено
о т ч и т а н е на т е с т - л е н т и т е за уринен ана­
лиз. Miditron ST е специално предназначен
входен терминал за въвеждане на данните
о т микроскопското изследване на седимен­
та.
Ч р и н ц и п н а д е й с т в и е . С Miditron М се
) т ч и т а т ф о т о м е т р и ч н о т е с т - л е н т и с раз­
лични комбинации (напр. Combur 1 0 Tes t М).
С и с т е м а т а включва с е л е к т и в н и с в е т л и н н и
!мисионни g u o g u (LED), к о и т о и з л ъ ч в а т
гветлина с д ъ л ж и н а н а в ъ л н а т а , специално
юдбрана з а р е а к ц и и т е , използвани в реаген-
п н и т е зони н а т е с т - л е н т и т е и предлага из-
юр н а и з м е р и т е л н о време. Тези д в а принци-
ia п о д о б р я в а т т о ч н о с т т а н а о т ч и т а н е .
Ь п о л з в а т се две и з м е р и т е л н и в р е м е н а (48 s
I 120 s), к о е т о д а в а по-добро о т ч и т а н е по-
•ади в ъ з м о ж н о с т т а д а се р а з в и я т и по-бав-
ш т е ц в е т н и р е а к ц и и ( т а б л . 25.1). Тази т е н -
|енция се засилва о т в ъ в е ж д а н е т о н а в т о -
"аблица 25.1. Дължина на в ъ л н а т а и време за
змерване на о т д е л н и т е п а р а м е т р и при систе-
iama Miditron
Измерваща Измерваща
Параметър глава 1 глава 2
(48 s) (120 s)
Зтносително
620 п т
пегло -
зН 620 п т / 5 5 5 п т -
\евкоцити - 555 п т
-lumpumu 555 п т -
Зелтък
555 п т -
^люкоза 555 п т
-
бетони - 555 п т
/робилиноген 555 п т - не н а т а з и а б с о л ю т н а емисионна с т о й н о с т
зилирубин 555 п т - с т . н а р . и н т е р в а л н и граници ( п о с т о я н н а ве­
еритроцити - 660 п т / 5 5 5 п т
а дължина н а в ъ л н а т а . Всяка измерваща
лава включва т р и LED, р а б о т е щ и при р а з -
ични дължини н а в ъ л н а т а (фиг. 25.1). Оп-
шчно-електронното измерване п р о т и ч а
а к т о е о т р а з е н о н а фиг. 25.2; LED (1) излъч-
а с в е т л и н а с определена д ъ л ж и н а н а вълна-
ш к ъ м р е а к т и в н а т а з о н а (2) под о п т и м а -
зн ъгъл. С в е т л и н а т а , д о с т и г а щ а до повър-
н о с т т а н а т а з и з о н а р е ф л е к т и р а с разли­
ви и н т е н з и т е т в з а в и с и м о с т о т и н т е н -
i m e m a н а ц в е т а , р а з в и т в р е а к т и в н а т а зо-
а. О т р а з е н а т а с в е т л и н а е уловена о т де-
iekmop (3), разположен д и р е к т н о над т е с т -
)ната. Д е т е к т о р ъ т изпраща електронен
лгнал к ъ м а н а л о г о в о - д и г и т а л н и я преобра-
/ в а т е л (4), к о й т о п р и д а в а н а сигнала диги-
юлна с т о й н о с т . М и к р о п р о ц е с о р ъ т (5) нас-
ipoüöa д и г и т а л н а т а с т о й н о с т чрез съпос-
Оранжево Зелено
Крам за боравене
[
Червено
Фиг. 25.1. Измерваща глава 1
Детектор Л/D преобразувател
феобраз Микропроцесор
4
• • •
1
Измерена
концентрация
Фиг. 25.2. Разчитане на р е з у л т а т а (обяснение­
то в текста)
т а в я н е с в ъ т р е ш н а р е ф е р е н т н а зона и я
п р е в р ъ щ а с п р я м о калибрационен с т а н д а р т
първо в о т н о с и т е л н а , а след т о в а и в абсо­
л ю т н а емисионна с т о й н о с т . Полуколичес-
т в е н а т а к о н ц е н т р а ц и о н н а с т о й н о с т н а да­
дения п а р а м е т ъ р е получена чрез сравнява­
личина н а с п е ц и ф и ч н а т а з а дадения п а р а ­
м е т ъ р емисия, в ъ т р е ш н о заложена). Преди
всяко и з м е р в а н е се п р о в е р я в а о п т и ч н а т а
с и с т е м а з а ф л у к т у а ц и и н а LED и д е т е к т о ­
ра. Ако е необходимо се извършва с ъ о т в е т ­
н а н а с т р о й к а . С и с т е м а т а сигнализира з а
п р а в и л н о т о или п о г р е ш н о п о с т а в я н е н а
т е с т - л е н т а т а . В с и с т е м а т а Miditron е на­
лице компенсационна зона, к о я т о позволява
компенсиране н а и н т е р ф е р е н ц и я т а о т сил­
но о ц в е т е н а у р и н а а в т о м а т и ч н о чрез жус-
т и р а н е н а е м и с и и т е о т т е с т - з о н и т е спря­
м о к о м п е н с а ц и о н н а т а зона. По т о з и начин
се и з б я г в а т ф а л ш и в о - п о л о ж и т е л н и т е резул­
тати.
ф у п к ц и о п и р а и е н а с и с т е м а т а . При
включване н а а п а р а т а т о й а в т о м а т и ч н о
прави поредица о т р у т и н н и о т ч и т а н и я , по­
казвайки н а дисплея т и п а н а т е с т - л е н -
463
mama. Оптичен и звуков сигнали о б я в я в а т
г о т о в н о с т за о т ч и т а н е н а т е с т - л е н т а т а .
Л е н т а т а се п о с т а в я за около 1 s в у р и н а т а ,
осигурявайки пълно п о т а п я н е н а компенса­
ционна зона, излишъкът се и з т р ъ с к в а вър
ху ръба на съда, с к о е т о се осигурява д о с т ъ ­
па на кислород. След т о в а л е н т а т а се пос­
т а в я върху т р а н с п о р т н и я механизъм и се
отправя към о п т и ч н а т а с и с т е м а . Н а ч и н ъ т
на разпечатване н а р е з у л т а т а зависи о т из­
бора на о п е р а т о р а (веднага; след въвеждане
на д а н н и т е о т седимента; накрая н а сери­
я т а ) . О т ч е т е н и т е л е н т и се с ъ б и р а т в спе­
циален съд. К а п а ц и т е т ъ т н а Miditron М е
300 л е н т и / h к а т о р е з у л т а т и т е се запаме­
т я в а т . Има няколко начина за идентифи­
циране на п р о б а т а , к а к т о u специален ключ
за въвеждане на с п е ш н и т е (STAT) проби. О т ­
ч и т а н е т о на р е з у л т а т и т е може да с т а в а
в конвенционални, SI или условни единици.
Положителните р е з у л т а т и се о т б е л я з в а т
със звездичка.
К а л и б р и р а н е : Miditron М се д о с т а в я ка­
либриран. О п т и ч н а т а с и с т е м а а в т о м а т и ч ­
но се проверява при всяко о т ч и т а н е чрез
в ъ т р е ш н а т а р е ф е р е н т н а зона. Ако о п т и ч ­
н а т а с и с т е м а е променена, т я се рекалиб-
рира с Control-Test М - сива ивица с п о с т о ­
янни емисионни х а р а к т е р и с т и к и . Ц в е т ъ т
и м ъ т н и н а т а н а у р и н а т а се в ъ в е ж д а т чрез
командното т а б л о . А п а р а т ъ т лесно се по­
ч и с т в а и поддържа.
Ф у н к ц и о н и р а н е н а M i d i t r o n S T (седи­
м е н т е н терлгинал). Р е з у л т а т и т е о т се­
д и м е н т а се и з п р а ш а т о т Miditron ST и се
обобшават с т е з и о т т е с т л е н т а т а . Пока­
з а т е л и т е на с е д и м е н т а (до 30) и т е к с т о в и ­
т е р е з у л т а т и са свободно програмирани.
Miditron J u n i o r
Анализаторът е предназначен за малки ла­
боратории. Той е с по-малки размери, по-ев-
т и н и по-лесен за употреба. Представлява
полуавтоматичен ф о т о м е т ъ р за о т ч и т а ­
не на т е с т - л е н т и с различни комбинации на
уринните параметри. Не се нуждае о т вре­
ме за темпериране и може д а бъде използ­
ван веднага след включването му. Калибри­
ра се веднъж на 2 седмици. Miditron Junior
464
се к о н т р о л и р а с помоицпа н а 6 програмни
ключа. Аналогично н а Miditron М има с в е т ­
линен и звуков сигнали за подаване на т е с т -
л е н т а т а . К а п а ц и е т ъ т му е 100 т е с т - л е н
m u / h . А е н т и т е се и н к у б и р а т в специално
номериран с т а т и в и се п о д а в а т за о т ч и ­
т а н е н а всеки 12 s. Номерирането на проби­
т е с т а в а а в т о м а т и ч н о . К а к т о и при
Miditron М може д а се използва бар-кодова
номерация. И м а модул з а минисерии с рабо
т е н цикъл 12 s.
Urilux
Urilux е малък а н а л и з а т о р за с т а н д а р т и з и ­
рани измервания н а 10 уринни п а р а м е т ъ р а ,
използваш, Combur 10 Test UX или Combur10 Test
M т е с т - л е н т и , елиминирайки грешките при
визуалните о т ч и т а н и я . А н а л и з а т о р ъ т е по
съицество р е ф л е к т о м е т ъ р , снабден с 11 оп­
т и ч н и канала. Един о т т я х е за о т ч и т а н е
компенсационното м я с т о н а л е н т а т а - з а
ц в е т а н а у р и н а т а . И з п о л з в а т се 3 дължини
н а в ъ л н а т а - 560, 610 и 650 п т .
П р о ц е д у р а т а н а р а б о т а е много улесне­
на: след п о т о п я в а н е н а л е н т а т а в у р и н а т а
се о т в а р я входа н а а п а р а т а , л е н т и ч к а т а се
вкарва, в р а т и ч к а т а се з а т в а р я и се н а т и с ­
к а с т а р т о в и я б у т о н . След 90 s а в т о м а т и ч ­
но се о т п е ч а т в а т р е з у л т а т и т е . Патоло­
г и ч н и т е р е з у л т а т и се о т б е л я з в а т върху
р а з п е ч а т к а т а - п о я в я в а т се с червена с в е т ­
лина върху дисплея. А в т о м а т и ч н о т о о т п е ­
ч а т в а н е елиминира е в е н т у а л н и т е грешки
при ръчно н а п и с а н и т е бележки, спестявай­
ки и в р е м е т о з а писане. Urilux е много под­
ходящ, з а л а б о р а т о р и и с малка пропусква-
т е л н о с т , в к л ю ч и т е л н о к а б и н е т н а обшо
п р а к т и к у в а щ лекар, болнична с т а я , спеш­
ни отделения, шокови зали и т . н . , т ъ й к а т о
обслужването н а а н а л и з а т о р а не се нуждае
о т специално обучен лабораторен персонал:
Supertron
Supertron е напълно а в т о м а т и з и р а н а с и с т е
м а з а уринен анализ. Извършва всички е т а
пи н а уринния анализ о т п о т а п я н е т о и пое
т а в я н е т о на т е с т - л е н т и т е до о т п е ч а т в а
н е т о н а р е з у л т а т и т е . П р о б и т е се п о с т а
в я т н а карусел с м е с т а за 60 с ъ д ч е т а за ури
н а (55 обикновени и 5 спешни проби). Оп­
т и м а л н о т о намокряне с урина н а всички зо­
ни в т е с т - л е н т а т а се осигурява с помощ­
т а н а а в т о м а т и ч н о контролиране н и в о т о
н а у р и н а т а в с ъ д ч е т а т а . З а д а се избегне
у т а я в а н е т о н а н е р а з т в о р и м и т е уринни
компоненти, преди п о т а п я н е т о н а л е н т а ­
т а се извършва к р а т к о а в т о м а т и ч н о раз-
месване н а у р и н а т а . Подаването, п о т а п я ­
нето, внасянето на т е с т - л е н т и т е с т а в а
автоматично. Принципът на о т ч и т а н е е
к а к т о т о з и н а Miditron М. И з п о л з в а т се 3
дължини н а в ъ л н а т а - 550, 620 и 660 п т . О т ­
ч и т а т се 10 п а р а м е т ъ р а (Combur 10 Test S
л е н т и ) с максимум 300 проби/h. И з р а б о т ­
в а н е т о н а п р о б и т е с т а в а по реда им в ка-
русела. С използването н а бар-код се изключ­
в а т г р е ш к и т е о т р а з м я н а н а идентифици-
р а ш и т е номера.
Предимства:
• изключване н а м а н у а л н а т а р а б о т а с ури­
н а въобше;
• бързо процедиране - 55 проби з а 11 min;
• а в т о м а т и ч н о размесване и нагласяване
нивото на пробите в епруветките;
• минимизиране обема н а у р и н н а т а проба
(3 ml) з а п е д и а т р и ч н и цели;
• лесна о п е р а т о р с к а т е х н и к а с б у т о н и при
интегриран принтер;
• бидирекционен и н т е р ф е й с
• опция за бар-кодово о т ч и т а н е .
C l i n i t e k 5 0 TM, B a y e r
Clinitek 50 TM е химичен уринен а н а л и з а т о р
з а полуколичествено о т ч и т а н е н а уринни
п а р а м е т р и , използван главно з а о т ч и т а н е
н а м и к р о а л б у м и н у р и я т а (Micral II Roche
Diagnostics, Lewes).
Uriphan, L a c h e m a
Uriphan, Lachema е д о с т ъ п е н уред з а полу­
количествено или количествено изследване
на урина, използващ т е с т - л е н т и до 9 пока­
з а т е л я (глюкоза, к е т о н и , н и т р и т и , pH, би-
лирубин, уробилиноген, протеини, осмолали-
т е т , хемоглобин). И з п о л з в а т се 4 дължини
на в ъ л н а т а - 560, 610, 640 и 470 п т . Измерва­
н и я т блок включва 6 и з т о ч н и к а н а светли­
н а - селективни светлинни емисионни дио­
ди (LED): 2 з а X = 560 п т , 2 з а ^ = 610 п т , 1 за
X = 640 п т и 1 з а X = 470 п т . Р е з у л т а т ъ т се
получава бързо - след 60 s.
S u p e r A u t i o n SA-4220
Европейското м у л т и ц е н т р о в о проучване на
Super Aution уринния анализатор доказва не­
г о в и т е отлични к а ч е с т в а . Това е високо ав­
т о м а т и з и р а н а н а л и з а т о р за ф о т о м е т р и ч ­
но о т ч и т а н е н а у р и н н и т е т е с т - л е н т и с 8
п о к а з а т е л я (pH, глюкоза, белтък, к е т о н и ,
билирубин, кръв, уробилиноген и левкоцит-
н а естераза). Сравняването с количестве­
ни м е т о д и е дало много добра корелация за
повечето показатели. О т ч е т е н а е слаба ин-
терференция на някои най-често използва­
ни л е к а р с т в а .
АВТОАНААИЗАТОРИ ЗА ИЗМЕРВАНЕ
НА ЛЕКАРСТВА И ТЕХНИТЕ
МЕТАБОЛИТИ В УРИНАТА
Тези анализи и анализатори са о б е к т на ле­
к а р с т в е н о т о мониториране. Един пример
за а в т о м а т и ч е н твърдофазов конкурентен
флуориметричен и м у н о т е с т е доказване н а
бензоилекгонин в н е т р е т и р а н а урина. О т ­
ч и т а н е т о се извършва с напълно а в т о м а ­
т и з и р а н флуориметър. флуоресцеин-коню-
гиран бензоилекгонин (FL-BE) и моноклонал-
ни т е л а срещу него се използват к а т о реа­
г е н т и . Т в ъ р д а т а фаза се с ъ с т о и о т а н т и
BE а н т и т е л а , имобилизирани върху полиме-
т и л - м е т а к р и л а т н и гнезда. Свободният БЕ
в р а з т в о р а се конкурира с FL-BE и намалява
свързания в т в ъ р д а т а фаза флуоресцеин по
концентрационно-зависим начин. FL-BE не
се свързва в н е п о к р и т и т е с а н т и т е л а гнез­
да или т е з и , п о к р и т и с IgG или неспецифич­
ни протеини. Steady-state на комплекса FL-
ВЕ-анти ВЕтАЬ се п о с т и г а за няколко ми­
н у т и . Границата на ч у в с т в и т е л н о с т е 2 ng/
ml BE; при е ф е к т и в н а концентрация н а BE
1-100 ng/ml получените данни корелират о т ­
лично с данни, получени с 2 количествени
т е с т а : FOB и EMIT.
465
АВТОМАТИЗАЦИЯ
н и т е п о к а з в а т , че а в т о м а т и ч н и я т уринен
НА СЕДИМЕНТНИЯ
анализ с UF-100 уринния ф л о у ц и т о м е т ъ р
УРИНЕН АНАЛИЗ предлага з н а ч и т е л н о п е с т е н е н а време и
т р у д . Има висока корелация със с е д и м е н т ­
M u k p o c k o n c k o m o изследване н а уринния се­ н а т а микроскопия (г = 0.98 за кръвни к л е т ­
д и м е н т е най-бавното и трудоемко с т ъ п а ки) и с д а н н и т е о т бактериологичното изс­
ло на уринния анализ, изискващо специално ледване н а у р и н а т а (г = 0.88). Ч у в с т в и т е л ­
обучен персонал, време за центрофугиране н о с т т а е 65% спрямо 69% з а микроскопския
и микроскопиране. Освен т о в а по-продължи­ с е д и м е н т е н анализ; с п е ц и ф и ч н о с т т а - 66%
т е л н и я т к о н т а к т с у р и н а т а крие риск за спрямо 91%. Следователно, к о г а т о се нала­
заразяване на работещия. В последните го­ га висока ч у в с т в и т е л н о с т за о т к р и в а н е н а
дини и т у к навлезе а в т о м а т и з а ц и я т а , м а ­ ранни бъбречни увреждания, след проведения
кар доскоро т о в а да изглеждаше невъзмож­ пресяващ а в т о м а т и ч е н анализ следва да се
но. Решението дойде с използването н а фло- проведе микроскопско изследване.
у ц и т о м е т р и я т а . В п ракт и ч ес ка у п о т р е б а О т ч е т е н и я т с UF-100 а н а л и з а т о р брой
влезе а в т о м а т и ч н и я т уринен автоанализа- н а б а к т е р и и т е е по-висок при н и т р и т - п о -
т о р Sysmex UF-100 - напълно а в т о м а т и з и ­ л о ж и т е л н и т е проби. В по-дълго съхранява­
ран а п а р а т . Принцип ът на д ей с т ви е е т о ­ н и т е проби б р о я т се увеличава, д о к а т о т о ­
зи на кръвните флоуцитометри; ДПК и мем­ зи на л е в к о ц и т и т е намалява. По отношение
браните на формените елементи се о ц в е т я ­ н а цилиндрите и д р о ж д е н и т е к л е т к и (заха-
в а т в н а т и в н а урина. П р о б а т а след т о в а р о м и ц е т и ) UF-100 а н а л и з ъ т дава по-често
преминава к а т о ламинарен п о т о к през ла­ фалшиво-положителни р е з у л т а т и .
зерен лъч. Измерва се с в е т л и н н о т о разсей­ Р е з у л т а т и т е о т с р а в н и т е л н и т е проуч­
ване, флуоресценцията и импеданса. Така с а вания н а л а г а т извода, че к о м п ю т ъ р н а т а об­
о т ч и т а н и р е з у л т а т и т е о т изследване н а р а б о т к а н а д а н н и т е о т UF-100 и химичния
кръвните формени е л е м е н т и - левкоцити, т е с т - л е н т о в уринен анализ представлява
е р и т р о ц и т и (цели и лизирани), е п и т е л н и много приемлива с и с т е м а , д о с т а в я щ а полез­
клетки, бактерии и цилиндри. Получените н а информация с о т ч е т л и в о п е с т е н е н а вре­
със Sysmex с и с т е м а т а данни са с ъ п о с т а в я ­ ме. Е д и н с т в е н и я т н е д о с т а т ъ к е в и с о к а т а
ни с т е з и о т р у т и н н о т о изследване н а се­ цена н а к о м б и н а ц и я т а о т т е з и а н а л и з а т о ­
димента със светлинна или фазово-контрас- ри.
т н а микроскопия в условия н а нормални ури- В ход са и други м е т о д и ч н и подходи, це­
ни и т а к и в а с глюкозурия и протеинурия, с лящи а в т о м а т и з и р а н е н а седиментния ана­
и без използване н а консерванти и т . н . Дан­ лиз.

Книгопис

B e n E z r a J, B o r k L . M c P h e r s o n R A . E v a l u a t i o n o f t h e S y s m e x t i o n a l b a c t e r i a l c u l t u r e s . A m J C l i n P a t h o l . 112, 1 9 9 9 , 1, 2 5 -
U F - l ü ü automated urinalysis analyzer. Clin C h e m 4 4 1 9 9 8 35.
1, 9 2 - 9 5 .
Langlois M R , Delanghe JR. Steyaert S R , Everaert KC, D e
Dorizzi R M , C a p u t o M . M e a s u r e m e n t o f u r i n e r e l a t i v e d e n s i t y Buyzere M L . A u t o m a t e d flow c y to me try c o m p a r e d with an
using refractometer a n d reagent strips. Clin C h e m L a b M e d a u t o m a t e d dipstick reader for urinalysis. Clin C h e m , 4 5 , 1 9 9 9 ,
3 6 , 1998, 12, 9 2 5 - 9 2 8 .
1, 118-122.
F e m l i D , P i r o v a n o B. T h e a u t o m a t i o n o f s e d i m e n t u r i n a l y s i s u s i n g O ' C o n n e l l KP, V a l d e s J J , A z e r N L , S c h w a r t z RP, W r i g h t J .
a n e w urine n o w c y t o m e t e r ( U F - 1 0 0 ) . C l i n C h e m L a b M e d , Eldefrawi ME. Assessment o f an automated solid
3 6 , 1998, 12, 9 0 9 - 9 1 7 .
p h a s e c o m p e t i t i v e f l u o r o i m m u n o a s s a y f o r b e n z o y l e c g o n i n e in
G a l i m a n y R , A r a m b a r r i M , B i o s c a C , C e r i o t t i F, C h a p e l l e J P , u n t r e a t e d urine. J I m m u n o l M e t h o d s 2 2 5 , 1999, 1-2, 157-
o p e z R, S o u v e r i j n J H , S p a g n u o l o G , S c o p a c a s a F, A l m i r a l l 169.
^ , л и Г О р е а П m u l t i c e n l r e evaluation o f the S u p e r Aution S A - Rowell D M . Evaluation o f urine chemistry analyser. P r o f Nurse,
- u ri n a l y s i s a n a l y s e r . C l i n C h e m L a b M e d , 3 6 , 1 9 9 8 , 1 2 ,
947-958. 13, 1 9 9 8 , 8 , 5 3 3 - 5 3 4 .
Sutton A . D a w s o n H , H o f f В, Grift Е, Shoukri M . Analyte com­
Konri T T , K e k u n e n U , M a l m i n i e m i K , V u e n t o R , R o w a n R M
p a r i s o n s b e t w e e n 2 c l i n i c a l c h e m i s t r y a n a l y z e r s . C a n Vet J.
Evaluation o f S y s m e x U F - 1 0 0 urine H o w c y t o m e t e r v s c h a m ­
4 0 , 1999, 4, 2 5 5 - 2 6 0 .
er counting o f supravitally stained s p e c i m e n s a n d c o n v e n ­

466
 Компютри и
клинична л а б о р а т о р и я
Н. А т а н а с о в
К о м п ю т р и т е вече н е с а е к з о т и к а в н а ш и -
п е клинични л а б о р а т о р и и . К о м п ю т р и и
иикропроцесори с п о д х о д я щ с о ф т у е р с а не-
оазделна ч а с т о т с ъ в р е м е н н и т е лабора-
порни анализатори и мощно средство з а
ю в и и ш в а н е е ф е к т и в н о с т т а н а клинично-
\ а б о р а т о р н а т а д е й н о с т . У н а с все о щ е н е
:е и з п о л з в а т д о с т а т ъ ч н о пълноиенно ог-
з о м н и т е технологични, информационни и
комуникационни в ъ з м о ж н о с т и н а инфор-
иационната технология.
ПЕРСОНАЛЕН КОМПЮТЪР (PC)
Ч р и д о б и в а н е т о н а е л е м е н т а р н а компю­
т ъ р н а г р а м о т н о с т изисква желание, в р е м е
1 и з в е с т н и усилия. По-късно, в ъ з в р а щ а е ­
м о с т т а е многократна. Минималните
шания за „компютърна г р а м о т н о с т "
в к л ю ч в а т з а п о з н а в а н е с основни правила и
! о т о в и програми. Съгласно з а к о н а з а и н т е -
\ е к т у а л н а т а с о б с т в е н о с т всички използ­
вани п р о г р а м и следва д а с а лицензирани (да
: а законно з а к у п е н и о т официален предс-
п а в и т е л н а ф и р м а т а производител). О т
гьрва необходимост е запознаването с т е к с -
тюбработващи програми (word processors). Чес-
по ползвани са т е к с т о б р а б о т в а щ и програми
Microsoft Word, WordPerfect, Coraldraw, Claris за
Macintosh и други. Техните възможности са
гходни и позволяват професионална предпечат-
ш подготовка на т е к с т о в е . На практика, за
1епрофесионалиста е д о с т а т ъ ч н о да използва
10-40% о т в ъ з м о ж н о с т и т е на една професио-
1ална програма.
П о з н а н и я т а з а р а б о т а с база данни
databases) р а з и ш р я в а т в ъ з м о ж н о с т и т е
ш л а б о р а т о р н и я с п е ц и а л и с т . Това включ-
ia в н а с я н е н а данни, с ъ з д а в а н е н а т а б л и ц и ,
юдбор и с ъ з д а в а н е н а извадки и о б р а б о т к а
ш п о д б р а н и т е данни. Докато в т е к с т о б р а -
ю т в а щ и т е програми файловете са с фиксирано
юдреждане (layout), р а б о т а т а в база данни поз­
j
волява спецификация, импорт и експорт на дан­
ни о т други п а к е т и (spreadsheets), селекция и
реорганизация на данните, т а к а че извадките
с т а в а т достъпни за компютърен с т а т и с т и ­
чески анализ и графична обработка. Струва си
да се загуби време за усвояване на р а б о т а т а с
база данни, което е очудващо лесно и полезно.
По-висока с т е п е н н а използване компю­
т ъ р н и т е в ъ з м о ж н о с т и включва създаване
н а у ч е т н и форми, въпросници, използване
н а б и б л и о т е ч н а т а с и с т е м а Medline чрез
CD-ROM и с ъ х р а н я в а н е н а р е ф е р е н т н и дан­
ни з а н у ж д и т е н а лична или л а б о р а т о р н а
библиографска б а з а данни. Лична информаци­
онна база данни може да се създаде и с програ­
м и т е Reference Manager и Endnote, приложени
безплатно в Windows и Macintosh PC, и др.
Spreadsheets („разгънати листове") са компю­
търизирани таблици с вградени изчислителни
функции (Microsoft Excel и Lotus 123). Те са изк­
лючително подходящи за извършване на голям
брой последователни изчисления и м а т е м а т и ­
чески трансформации, особено ако са съчетани
с подходяща база данни. Например. Stuart Soft­
ware Analyse-IT за. р а б о т а с Microsoft Exel.
Графични опции или с а м о с т о я т е л н и гра­
фични програми (напр, Harvard Graphics)
п о з в о л я в а т създаване н а графики и диагра­
ми, к о и т о по-нагледно и л ю с т р и р а т цифро­
в и т е з а в и с и м о с т и . Те м о г а т да б ъ д а т дирек­
т н о разпечатани на принтер или да се превър­
н а т в диапозитивни образи. Съществуват и са­
мостоятелни могъщи професионални с т а т и с ­
тически програми с графични възможности
{SPSS, SAS, Statgraphics, StatView за Macintosh и
др.), които о б р а б о т в а т предварително внесени
или трансферирани данни о т други база данни.
Много п о - с ъ щ е с т в е н о е обаче, д а се разби
р а значението на с т а т и с т и ч е с к и т е пара
м е т р и при планиране и и н т е р п р е т а ц и я на
в с я к а к о н к р е т н а п о с т а н о в к а (инференци
а л н а с т а т и с т и к а ) , о т к о л к о т о и най-съ-
в ъ р ш е н н а т а с т а т и с т и ч е с к а „гимнасти­
к а " с несигурни д а н н и о т зле планирани
разработки.
467
 Свързването н а лабораторния PC чрез
модем с т е л е ф о н н а т а линия и с помоща н а
лицензиран доставчик (provider), позволява
достъп до електронна поща (E-mail), дирек­
т н о използване н а библиотечна с и с т е м а
{Medline) и до И н т е р н е т , една е л е к т р о н н а
мрежа обхващаща информаиия о т иял
с в я т . Internet/world wide web е п о н а с т о я ­
щем един о т най-голямите източниии н а
информаиия, знания, референтни м а т е р и ­
али, образователни и т р е н и р а щ и програми
включително и за спеииалисти о т клинич­
н а т а лаборатория. В И н т е р н е т може да се
н а м е р я т web с т р а н и и и т е за нови и н с т р у ­
м е н т и , прибори, методология, имена н а
продукти, к а т а л о з и за р е а к т и в и , данни з а
фирми доставчиии по целия с в я т и много
друга полезна информация, к о е т о води до
дълбока промяна в л а б о р а т о р н а т а органи­
зация. Ползването на И н т е р н е т разширя­
ва неимоверно много информационните
възможности н а лабораторния лекар.
ЛАБОРАТОРНА
ИНФОРМАЦИОННА СИСТЕМА (LIS)
През последните 1-2 д е с е т и л е т и я техноло­
г и ч н а т а революция оказа дълбоко влияние
върху л а б о р а т о р н а т а дейност. Д р а м а т и ч ­
но се промениха брой и вид анализи, начин
на измерване, а п а р а т у р а , квалификация и
=551
щ II
Схема н а 0
1. Л а б о р а т о р н и а н а л и з а т о о и - ^ p f r
СГШШЦия з а
дене и архивиране, администриране Пя ^ Р добавки, извадки и контрол; 3. Централен компютър за ръково-^
връзка и поддръжка на софтуера- 5 Рутер^б^С 11113 ' ' 5 а з п Р е 9 е л е и и е ' с ъ б и Р а н е данни и съобшения; 4. Модем за отдалечена
468
брой на персонала, оборотно време, комуни­
кация, п р е д с т а в я н е н а р е з у л т а т и т е и
изобщо ц я л о с т н а т а организация. При т о ­
ва, и з и с к в а н и я т а към л а б о р а т о р и я т а не­
п р е к ъ с н а т о н а р а с т в а т н а фона н а п о с т о ­
янно ограничаване н а разходите. Изход о т
т е з и о б с т о я т е л с т в а се т ъ р с и в изгражда­
не н а LIS - специфично приложение н а пред­
в а р и т е л н о планирана с и с т е м а о т процеси,
д е й н о с т и и процедури, ч а с т о т к о и т о
компютъризирани (фиг. 26.1). С и с т е м а т а
включва основен к о м п ю т ъ р с неговия хар­
дуер, периферни у с т р о й с т в а и контроли­
р а щ софтуер, но също процеси, процедури,
д о к у м е н т а ц и я и особено х о р а т а , к а т о ос­
новен ф а к т о р , к о й т о е к с п л о а т и р а с и с т е ­
мата.
К а т о т ъ р г о в с к и п р о д у к т се п р е д л а г а т
м н о ж е с т в о с и с т е м и . Те се р а з л и ч а в а т по
основно предназначение, организация, въз­
м о ж н о с т и за надграждане и др. Повечето
LIS о б е д и н я в а т с л е д н и т е модули: „ н а с т ­
ройка", „ р е г и с т р а ц и я " , „разпределе­
ние", „получаВане н а р е з у л т а т и " , „раз­
п р е д е л е н и е н а р е з у л т а т и " , „обзор" и
„съобщение" (фиг. 26.2).
Чрез модула „ н а с т р о й к а " , п о т р е б и т е ­
л я т определя п а р а м е т р и т е на периферни­
т е у с т р о й с т в а , с к о и т о е оборудвана лабо­
р а т о р и я т а (вид а н а л и з а т о р и , п р и н т е р и ,
модеми, хъбове, р у т е р и и т . н . ) . Инфраструк-
т у р н и т е компоненти на този модул осигуря-
Г
Р г анизацията на LIS (хардуер)
ъчни
 НАСТРОЙКА СЪОБЩЕНИЕ
• Периферни у с т р о й с т в а Генерирани отчети
• Форматиране р а з п е ч а т к и Контрол над потребители,
• Параметри на пациенти и назначения
качествения контрол Контрол над консумативи
• Дефинициии за база д а н н и (складово стопанство)
Контрол над разходи
Отчети за здравно
осигуителни нужди

_____
ОБЗОР
_ и.»

• Съпоставяне назначения,
р е з у л т а т и и контрол
• Двупосочна връзка
РЕГИСТРАЦИЯ лаборатория-потребител
• Назначения : р ъ ч н и ,
електронни, Я / 5
• Демографски д а н н и
• Д а н н и за л е к а р и п а ц и е н т
• Архивиране в база д а н н и
• Д о с т ъ п н а оторизирани
потребители •Ш - - - Т —

• Контрол над а н а л и т и ч н и РАЗПРЕДЕЛЕНИЕ НА

и административнипроцеси РЕЗУЛТАТИ
• Потвърждение на
резултатите
• Разпечатки
• Електронен трансфер до
потребителя

ПОЛУЧАВАНЕ НА
РАЗПРЕДЕЛЕНИЕ НА РЕЗУЛТАТИ
РАБОТАТА • Двустранна връзка
• Лист за вземане кръв оператор-прибори
• Работен л и с т • Контрол над р е з у л т а т и т е
• Разпределяне н а м а т е р и а л и • Повторни назначения
• Ррафично/таблично • Статистически
представяне качествен контрол

Фиг. 26.2. С х е м а т и ч н о п р е д с т а в я н е н а о р г а н и з а ц и я т а на LIS (софтуер)

469
6am контрол върху функционирането на систе­
м а т а на различни нива. Тази йерархична струк­
тура, която контролира отделни параметри,
анализатори, сектори, комуникация с лабора-
тории-потребители, е отворена и практически
неограничена. Чрез т о з и модул се о п р е д е л я т
форматите на разпечатки, референтни
граници в з а в и с и м о с т о т пол и в ъ з р а с т , п а ­
раметри на с т а т и с т и ч е с к и качествен
к о н т р о л над р е з у л т а т и т е , цени, м а р к и ­
ровки, кодировки и дефиниции з а б а з а т а
данни.
Модулът „регистрация" контролира
н а з н а ч а в а н е т о н а а н а л и з и т е . Това е първи­
я т с т а д и й о т р а б о т н а т а процедура, кой­
т о определя всички о с т а н а л и а н а л и т и ч н и
и а д м и н и с т р а т и в н и процеси. Назначение­
т о н а изследвания м о ж е д а се извърши о т
отдалечен п о т р е б и т е л (лекарски к а б и н е т и
или клиники), а д е м о г р а ф с к и т е д а н н и м о ­
г а т да се п р е х в ъ р л я т а в т о м а т и ч н о , н а п ­
ример о т с ъ о т в е т н а т а р е г и с т р а т у р а п о
б о л н и ч н а т а информационна с и с т е м а .
След анализа, р е з у л т а т и т е се с ъ ч е т а ­
в а т с демографските данни н а п а ц и е н т а ,
данни з а лекар, здравно заведение, диагноза
и др., и се а р х и в и р а т в б а з а данни, о т къде­
т о м о г а т д а се и з д и р я т с а м о о т о т о р и з и ­
рани п о т р е б и т е л и . Следва о т п е ч а т в а н е н а
р е з у л т а т а о т анализа, к о е т о м о ж е д а с е
извърши в с а м а т а л а б о р а т о р и я или д а с е
предаде по е л е к т р о н е н п ъ т д и р е к т н о в о т ­
далечения лекарски к а б и н е т или лечебно
заведение.
Модулът „разпределение и а р а б о т а ­
т а " е предназначен д а разпредели по о п т и ­
мален начин д н е в н а т а р а б о т а по различни­
т е р а б о т н и с т а н ц и и , а н а л и з а т о р и и сек­
т о р и . ОбикИовенно се р а з п е ч а т в а т „ л и с т
з а вземане н а к р ъ в \ предназначен з а взема-
шшпе биологичен м а т е р и а л и „работен
л и с т за о п е р а т о р и т е н а а н а л и з а т о р и т е .
М а т е р и а л и т е з а изследване се разпреде­
л я т ръчно или а в т о м а т и ч н о .
Модулът „получаване н а р е з у л т а т и "
осигурява д в у с т р а н н а връзка м е ж д у анали­
т и ч н и т е прибори и о п е р а т о р а , т а к а че по­
луче н ите р е з у л т а т и м о г а т д а се п о в и к а т
и да се в и д я т н а е к р а н а н а к о м п ю т ъ р а .
О п е р а т о р ъ т ръчно м о ж е д а приеме резул­
т а т и т е или д а назначи п о в т о р е н анализ,
а о д а н н и т е о т к а ч е с т в е н и я к о н т р о л в ре­
ално време или п л а у з и б и л и т е т н и я к о н т р о л
470
п о р о д я т с ъ м н е н и е върху д о с т о в е р н о с т т а
им.
Чрез модула „ р а з п р е д е л е н и е н а р е з у л ­
т а т и т е " , потвърдените автоматично
или ръчно р е з у л т а т и се р а з п е ч а т в а т в
подходягци ф о р м а т и . Ако съш,ествува връз­
к а н а л а б о р а т о р н и я к о м п ю т ъ р със с ъ о т в е ­
т е н интерфейс, комуникацията може да
позволи е л е к т р о н е н т р а н с ф е р н а р е з у л т а ­
т и т е до с ъ о т в е т н и я п о т р е б и т е л (чрез
т е л е ф о н н а връзка, факс, р а д и о п р е д а в а т е л ,
с а т е л и т н а в р ъ з к а или о п т и ч е н кабел). Сис­
т е м а т а позволява д а се прибави допълни­
т е л н а и н ф о р м а ц и я к ъ м доклада о т лабора­
т о р и я т а , к о я т о да направи представяне­
т о на р е з у л т а т и т е по-интерпретабилно.
М о д у л ъ т „обзор" позволява н а о т о р и з и ­
р а н и п о т р е б и т е л и д а с ъ п о с т а в я т назначе­
н и т е изследвания с п о л у ч е н и т е р е з у л т а т и ,
д а н н и т е о т к а ч е с т в е н и я к о н т р о л и други
п а р а м е т р и . Той о с и г у р я в а с п е ш н а двупо­
сочна в р ъ з к а м е ж д у л а б о р а т о р и я и п о т р е ­
б и т е л з а справки, д о п ъ л н и т е л н а информа­
ция, и з я с н я в а н е н а н а з н а ч е н и я и други ко­
ментарии.
М о д у л ъ т „ с ъ о б щ е н и е " н а т р у п в а ин­
ф о р м а ц и я върху ц я л о с т н а т а р а б о т а н а
с и с т е м а т а . Той г е н е р и р а р е д и ц а дневни,
месечни и годишни о т ч е т и върху п о т р е б и ­
т е л и , п а ц и е н т и , вид и брой назначени изс­
ледвания, к о н т р о л , д а н н и з а к о н с у м а т и в и
(складово с т о п а н с т в о ) , разходи и други
данни, к о и т о д и р е к т н о п о д п о м а г а т взема­
н е т о н а а д м и н и с т р а т и в н и и финансови ре­
шения о т р ъ к о в о д с т в о т о н а лаборатория­
та.
О р г а н и з а ц и я т а н а п р о г р а м н а т а архи­
т е к т у р а и опциите, които предоставят
т ъ р г о в с к и т е п р о д у к т и з н а ч и т е л н о се раз­
л и ч а в а т . Така, през периода 1991-96 год., проек­
т ъ т OpenLabs създаде нов подход за решаване
на проблема. Тази голяма инициатива в европейс­
к а т а лабораторна медицина има за цел да по­
добри е ф и к а с н о с т т а на клинично-лабораторни-
т е услуги чрез интегриране на LIS с база-знания
и да се предложи с т а н д а р т н о решение за елект­
ронен обмен на данни между медицински систе­
ми в единна отворена архитектура. Основните
елементи на OpenLabs са:
• п р е д а н а л и т и ч е н м о д у л , който направлява
подходящото назначение на лабораторни изс­
ледвания,
• систелш за база-знания, к о я т о подпомага
лекуващия лекар в подбора изследвания,
• усъвършенствана и н с т р у л ю п т а л н а р а ­
б о т н а с т а н ц и я , к о я т о с т а н д а р т и з и р а ин­
терфейсите на лабораторната апаратура,
о с ъ щ е с т в я в а в реално време продължителен
к а ч е с т в е н к о н т р о л , разкриване н а грешки и
к о н т р о л върху а п а р а т у р а т а ,
• с и с т е л г а з а л1енидЖл1ънт, к о я т о симули­
ра д в и ж е н и е т о н а ч о в е ш к и т е и м а т е р и а л н и
ресурси н а л а б о р а т о р и я т а ,
• с и с т е м а з а допъ~1нитслни изследвания,
к о и т о се г е н е р и р а т а в т о м а т и ч н о при индика-
иии о т и з в ъ р ш е н и т е вече изследвания,
• с л е д а н а ~ 1 и т и ч е н л ю д у л , , к о й т о информира
п о т р е б и т е л я з а р е з у л т а т и , л е к а р с т в е н а ин-
терференция,и
• модул, к о й т о подпомага и н т е р п р е т а ц и я т а
н а резултатите.
Този подход се р а з п р о с т р а н я в а бавно, защо­
т о , според Rowman "засега к л и н и ц и с т и т е се
о к а з в а т р е з и с т е н т н и н а с и с т е м н и правила, ко­
и т о т е в ъ з п р и е м а т к а т о принуда".
ЛАБОРАТОРНА СИСТЕМА
ЗА ИНФОРМАЦИИ
И УПРАВЛЕНИЕ (LIMS)
К ъ м с т а н д а р т н и т е м о д у л и н а LIS н а п о с л е ­
д ъ к се д о б а в я т в ъ з м о ж н о с т и з а к о м п ю т ъ р ­
н а регистрация н а дневната лабораторна
р а б о т а , координация, направляване и оп­
т и м а л н о разпределение н а п о т о к а назначе­
н и я . LIMS р е г и с т р и р а , н а т р у п в а и п р е д о с ­
т а в я данни о т н о с н о с ъ с т о я н и я т а н а ана­
л и з а т о р и т е , а н а л и т и ч н а възпроизводи-
м о с т и т о ч н о с т в реално време, „ д е л т а
чек", „ о м е г а чек", с ч е т о в о д н а и н ф о р м а ц и я ,
складово с т о п а н с т в о , заявки, цени, движе­
ние н а персонал, графици и други процеси
необходими з а о п т и м а л н о ръководене (ме-
наджмент) на лабораторията.
И з б о р ъ т н а L I M S н е е лесен. С п о р е д
R i c h a r d s o n , „ з а к у п у в а н е т о н а LIMS в е р о я т ­
но е н а й - к р и т и ч н о т о решение, к о е т о няко­
г а е д н а л а б о р а т о р и я в з е м а " . Всички т ъ р ­
говски п р о д у к т и с и п р и л и ч а т н а п р ъ в пог­
лед, в с и ч к и с е н а р и ч а т LIMS, но в д е й с т в и ­
т е л н о с т т в ъ р д е много се различават по
в ъ з м о ж н о с т и . Някои д а в а т добри възможнос­
т и за о б р а б о т к а н а данни, но м а л к о с п е ц и ­
ф и ч н а л а б о р а т о р н а и н ф о р м а ц и я , други н е
з а д о б о л я в а т о ч а к в а н и я т а и пу-Ждите н а
л а б о р а т о р и я т а , к о и т о се о к а з в а т по-големи
о т к о л к о т о първоначално се е предполагало, а
т р е т и н а л а г а т в и с о к и и з и с к в а н и я к ъ м не­
о б х о д и м о с т т а о т к в а л и ф и к а ц и я н а пер­
сонала. Р и с к ъ т може да се намали с добро пред­
варително запознаване с в ъ з м о ж н о с т и т е и пол­
з а т а о т в н е д р я в а н е т о н а LIMS. Тревожно е, че
„ с т р а ш н и т е и с т о р и и за у с т а н о в я в а н е на LIMS
в л а б о р а т о р и и т е с а верни и 60% о т закупените
LIMS не се и з п о л з в а т рационално". В а ж н о е
предварително д а се р а з б е р а т д а н н и т е и
информационните потоци в к о н к р е т н а т а
л а б о р а т о р и я и т о г а в а д а се о ц е н я в а т т ъ р ­
говските продукти. Следните фактори
т р я б в а в н и м а т е л н о д а се р а з г л е д а т преди
р е ш е н и е т о д а с е з а к у п и LIMS: с о ф т у е р ,
х а р д у е р , р а з х о д и т е п о в н е д р я в а н е , конфигу­
риране н а с о ф т у е р а и приспособяване к ъ м
лабораторията н а клиента, инсталиране и
обучение з а р а б о т а , п о д д р ъ ж к а и а к т у а л и ­
зиране н а с и с т е м а т а .
Ц е н а т а н а софтуера е о т н о с и т е л н о
м а л к а ч а с т о т р а з х о д и т е по в н е д р я в а н е т о
н а LIMS. М о ж е д а с е о к а ж е , ч е н я к о и добри
п р о д у к т и н е с ъ о т в е т с т в а т т о ч н о н а ин­
формационните потоци в лабораторията
н а п о т р е б и т е л я . Т ъ р г о в с к и я т п р о д у к т би
т р я б в а л о д а покрие и з и с к в а н и я т а поне в
70% и с а м о 30% д а о с т а н а т з а приспособя­
ване.
Х а р д у е р ъ т се оказва ч е с т о и з т о ч н и к з а
н е о ч а к в а н и разходи, особено а к о т о й н е съ­
о т в е т с т в а на предпочитания софтуер.
Разходите ч е с т о включват надграждане,
н о в х а р д у е р , к а б е л и з и р а н е и др. Н я к о и дос­
т а в ч и ц и едновременно п р е д л а г а т съвмес­
т и м и с о ф т у е р и хардуер.
Около е д н а т р е т а о т р а з х о д и т е п о внед­
ряване о т и в а т з а конфигуриране н а с о ф т у ­
е р а к ъ м к о н к р е т н и т е и з и с к в а н и я н а лабо­
р а т о р и я т а , и н с т а л и р а н е и обучение з а р а ­
б о т а . Това засяга и а д а п т и р а н е к ъ м и н т е р ­
фейса н а р а з л и ч н и т е л а б о р а т о р н и анализа­
т о р и ; и з в ъ р ш в а н и т е изследвания; анали­
т и ч н и т е м е т о д и ; п о п у л а ц и о н н и т е рефе-
р е н т н и данни; к а ч е с т в е н и я к о н т р о л и пр.
Б ъ д е ш и я т а д м и н и с т р а т о р н а LIMS следва
д а н а п р а в и р а з ч е т з а н у ж д и т е н а начално­
т о в н е д р я в а н е , д а ги с р а в н и с п р е д л а г а н и ­
т е в с о ф т у е р а , д а определи дали м о г а т д а
с е н а п р а в я т н е о б х о д и м и т е п р о м е н и в прог­
р а м а т а , д а определи н и в о т о н а е к с п е р т и з а
з а т е з и п р о м е н и и н а к р а я , дали м о ж е д а с е
м и н е без н а м е с а т а н а п р о и з в о д и т е л я , или
щ е и м а нужда о т допълнително заплащане.
Обикновенно п р о и з в о д и т е л и т е т в ъ р д я т ,
ч е с и с т е м и т е и м лесно м о г а т д а б ъ д а т
471
приспособени к ъ м н у ж д и т е н а к л и е н т а , н о
6 д е й с т в и т е л н о с т т е „ з а к л ю ч в а т " всичко
и п л а щ а н и я т а н а к л и е н т а никога не свър­
ш в а т . Инсталирането н а с и с т е м а т а също
е и з т о ч н и к н а разходи.
Поддръжката и а к т у а л и з а ц и я т а рядко
м о г а т да м и н а т без у ч а с т и е т о н а д о с т а в ­
чика, особено през п ъ р в а т а година и т о в а
т р я б в а да се предвиди в д о г о в а р я н е т о , к а к ­
т о и пълното с ъ о т в е т с т в и е н а доставка­
т а с д е м о н с т р а ц и о н н а т а версия. Т р я б в а
да се д о г о в о р и р а т и в ъ з м о ж н о с т и т е з а ак­
т уализиране и надгр аждане н а с и с т е м а т а ,
к о и т о т р я б в а т о ч н о и ясно д а се изброени
в договора, к а к т о и д а се и з я с н я т разходи­
т е по к р а т к о в р е м е н н а т а и дълговременна
поддръжка н а с и с т е м а т а .
СИСТЕМАТИЗАЦИЯ
НА КЛИНИЧНО ЛАБОРАТОРНАТА
ДЕЙНОСТ
„ С и с т е м а т и з а ц и я " или още „ и н т е г р а ­
ц и я н а с и с т е м и т е " е друг подход, чрез
к о й т о в напредналите с т р а н и се очаква да
се регулира н е с ъ о т в е т с т в и е т о между на­
р а с т в а щ и т е изисквания към здравеопазва­
н е т о и ограничените финансови възмож­
ности. С и с т е м а т и з а ц и я т а о з н а ч а В а
осъществяване на редица планови
мерки за опростяване на процедури и
п р о ц е с и с п о м о щ а н а р о б о т и з а ц и я , ав­
т о м а т и з а ц и я и т е х н о л о г и ч н о осъвър-
шенстване.
Роботизацията касае най-често т р а н ­
с п о р т а н а проби. В големите лаборатории
широко се използват п н е в м а т и ч н и с и с т е ­
ми, контролирани о т к о м п ю т ъ р т р а н с п о р ­
т н и л е н т и и диспенсори за д о с т а в к а на не­
обходимото количество м а т е р и а л до всеки
м у л т и п а р а м е т р о в а в т о а н а л и з а т о р в кли­
нична химия, хематология, коагулогия, з а
имунометрични, хормонални и др. анализи.
В р е з у л т а т на т о в а значително се съкра­
щава о б о р о т н о т о време, запазва се качес­
т в о т о на м а т е р и а л а и се о т с т р а н я в а т
много източници н а човешки грешки.
А в т о м а т и з а ц и я т а зависи о т репер­
т о а р а на л а б о р а т о р и я т а и о т д н е в н о т о
натоварване. За по-малки лаборатории по-
подходящо е постепенно а в т о м а т и з и р а н е
по модули и походящи обединяващи инфор-
472
мационни технологии. З а големи лаборато­
рии, някои фирми (напр. Тоа Medical
Electronics) п р е д л а г а т ц я л о с т н о решение с
модуларно а в т о м а т и з и р а н а с и с т е м а внед­
рена едновременно със с и с т е м а т и з а ц и я ­
та.
Т е х н о л о г и ч н о т о о с ъ в ъ р ш е н с т в а н е за­
д ъ л ж и т е л н о включва използване н а съвре­
м е н н а к о м у н и к а ц и о н н а т е х н о л о г и я . Прило­
ж е н а в л а б о р а т о р и я т а , т я м о ж е бързо д а
р е д у ц и р а о б о р о т н о т о в р е м е и д а подобри
к о н т р о л а върху к а ч е с т в о т о н а р е з у л т а т и ­
т е . Комуникацията предполага компютърна
връзка на LIMS е болничната администрация за
пренос на демографски данни, с т а т у с на паци­
е н т а , а също и терминали за к л и е н т и т е потре­
бители на лабораторни р е з у л т а т и (клиники,
кабинети или дома на пациента). Потребите­
л я т би трябвало да има възможност за елект­
ронно назначение на изследвания и електронно
получаване на р е з у л т а т и т е в реално време. Той
би трябвало да има в ъ з м о ж н о с т т а за оторизи­
ран д о с т ъ п до л а б о р а т о р н а т а база данни, къде­
т о се архивират демографски данни за пациен­
т а и база знания, където се п р е д о с т а в я т моду­
ли за подпомагане избора на параметри, за це­
н а т а на изследванията, за превръщане на циф­
ровите р е з у л т а т и в информация, полезна за ле­
куващия лекар.
С ъ в р е м е н н а т а информационна т е х н о ­
логия м о ж е д а т р а н с ф о р м и р а ц и ф р о в и т е
а н а л и т и ч н и д а н н и в графики и т е к с т , кои­
т о позволяват н а клинициста да о т с я в а
н е н у ж н и т е н а з н а ч е н и я и по-лесно д а възп­
риема п о л е з н а т а информация. Електрон­
н и т е поръчки п о з в о л я в а т прилагане н а
т . н . „rule-based1 и „diagnosis-based'' с и с т е ­
ми. Чрез заложени в п р о г р а м и т е „правила",
„база з н а н и я " и „база д а н н и з а п о к а з а т е л и ­
т е " , к л и н и ц и с т ъ т е п о д п о м о г н а т д а избе­
р е н а й - р а ц и о н а л н и т е изследвания, а а в т о ­
м а т и ч н а т а л а б о р а т о р и я д а извърши п р и
необходимост допълнителни потвържда­
в а щ и изследвания, без п р е д в а р и т е л н о иска­
н е о т с т р а н а н а лекуващия лекар. О п и т ъ т
д о б и т в Япония, САЩ и с т р а н и т е о т Евро­
пейския съюз показва, че най-подходяща за­
с е г а ф о р м а е и н т е г р и р а н е т о н а LIMS в бол­
н и ч н а т а и н ф о р м а ц и о н н а с и с т е м а (HIS -
Hospital I n f o r m a t i o n System), Лаборатор­
н а т а с и с т е м а на у н и в е р с и т е т с к а т а болница в
град Осака например, се състои о т т р и работ­
ни с т а н ц и и - клинично-химична, хематологична
и имунологична, които получават и обработват
3 000 - 4 000 материала дневно, доставяни с по-
 моща на транспортна л е н т а с дължина о т 141
м. В р е з у лтат на систематизацията се дости­
га намален разход на труд, по-високо качество
на р е з у л т а т и т е , по-ниски разходи на проба и
значително увеличение на дневния к а п а ц и т е т
на лабораторията. Над 80% о т дневните анали­
зи се контролират само о т 5-6 обучени лаборан­
т и , а р е з у л т а т и т е се съобщават по електро­
нен път. С и с т е м а т а с т а в а обаче неефективна,
ако обемът на материала се окаже недостатъ­
чен за всички искани изследвания.
МОЦЕНКА НА ЕФЕКТА ОТ
ВНЕДРЕНАТА ИНФОРМАЦИОННА
Г ТЕХНОЛОГИЯ (VALIDATION)
Признава се, че и най-добре н а п и с а н и т е
к о м п ю т ъ р н и програми р а з к р и в а т недос­
т а т ъ ц и , к о и т о м о г а т да се о т с т р а н я т
гдва при по-продължителна е к с п л о а т а ц и я .
За разлика о т т я х , х а р д у е р ъ т р а б о т и доб­
ре, но се а м о р т и з и р а с т е ч е н и е н а време­
т о . Ч и с т о човешки проблем е о б х в а щ а н е т о
на процесите, чрез к о и т о к о м п ю т ъ р и з и р а -
dume с и с т е м и д о к а з в а т , че н а и с т и н а вър-
л а т р а б о т а т а з а к о я т о с а закупени. Вали-
уизацията е непрекъснат процес на доказ­
ване, че системата съответства на очак-
Занията както в началото, така и при
продължителна работа.
Според Cowan e t al, в а л и д и з а ц и я т а т р я б -
За да отговори н а ч е т и р и въпроса: „Какво
чравя?. Как разбирам дали го правя добре?.
Как да убедя другите, че го правя добре?.
Как да го направя по-добре?1. П р о ц е с ъ т про­
л и ч а в т р и фази:
» ф а з а н а р а з В и т и е (запознаване, конфи­
гуриране, приспособяване н а с и с т е м а т а
към к о н к р е т н и т е нужди н а п о т р е б и т е ­
ля),
• ф а з а н а В ъ з п р и е м а н е (обучение н а
п о т р е б и т е л я и начална експлоатация),
» ф а з а н а р е т р о с п е к ц и я (оценка на екс­
плоатационните качества на система­
т а след продължителна р а б о т а - валиди-
зация).
Валидизацията е т р у д н а , продължител-
ia и скъпа р а б о т а . Тя се провежда по пред­
вар и тел ен план, к а т о всеки е т а п се доку­
м е н т и р а подробно и с ъ в м е с т н о с д о с т а в ­
чика н а с и с т е м а т а .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С т е п е н т а н а внедряване на информацион­
н а т а технология в к л и н и ч н а т а лаборато­
рия зависи о т реални нужди, финансови въз­
м о ж н о с т и и м о т и в а ц и я н а персонала. Ако
т е з и условия са налице, н а л а б о р а т о р и я т а
и предстои да направи т р у д е н избор за под­
ходящ хардуер и с о ф т у е р съобразен с конк­
р е т н и т е нужди и с м е ж д у н а р о д н а т а сис­
т е м а на и д е н т и ф и к а т о р и и кодове в меди­
ц и н а т а LOINC (Logical Observation Identi­
fier Names and Codes).
И н ф о р м а ц и о н н а т а технология с т р у в а
пари, но дава добри а д м и н и с т р а т и в н и , ана­
литични, комуникационни и и н т е р п р е т а -
т и в н и възможности. О ч а к в а н и т е ползи
в к л ю ч в а т подобрени услуги, и н т е р п р е т а -
т и в н о съобщаване на р а з у л т а т и т е , а в т о ­
м а т и з а ц и я на р е г и с т р а т о р с к а т а р а б о т а и
намален брой грешки. Максимален е ф е к т
може да се очаква при с ъ ч е т а в а н е на лабо­
р а т о р н а и клинична с и с т е м а т и з а ц и я , кое­
т о е приложимо з а големи лаборатории.
При кризисни с и т у а ц и и т а к и в а лаборато­
рии са лесно уязвими. Прекъсване доставка­
т а на електричество, газ, и вода при земетре­
сението в Кобе показва, че възстановяването на
т а з и съвършенна в технологично отношение
система изисква много време, усилия и средст­
ва. Алтернативното решение е създаване на
„пунктове за спешно тестуване" извършващи
малък брой анализи на малък брой проби с малки
апарати за суха химия, малки хематологични и
уринни анализатори, микроскоп, центрофуга и
преносим (лап-топ) компютър за електронна
връзка с медицинския център.
Въпреки т р у д н о с т и т е се очаква, че
именно в н е д р я в а н е т о н а информационни
технологии в клиничната лаборатория ще
промени н е б л а г о п р и я т н а т а к о н с т а т а ц и я ,
че п о н а с т о я щ е м около 60% о т изследвания­
т а са ненужно назначени, а само 10% о т
р е з у л т а т и т е п о вл и я ват медицинското ре­
шение.
473
Книгопис
Burtis СА. Converging technologies and their impact on the clini­
cal laboratory. Clin C h e m 42, 1996, 11, 1725-1749.
Chou D. Laboratory Information system. In: Kaplan L, P e s c e Л
(eds). Clinical Chemistry. St. Louis, etc. M o s b y , 1996, 3 2 3 -
341.
Cowan DF, Gray RZ, Campbell Б . Validation o f the laboratory
information system. Arch Pathol L a b Med, 122, 1998, 3, 2 3 9 -
244.
Forrey AW. McDonald CJ, D e M o o r G et al. Logical observation
identifier names and c o d e s ( L O I N C ) database. Clin C h e m . 4 2 .
1996, 1, 81-90.
H u f f SM, Roberto Rocha R A et al. D e v e l o p m e n t o f the L O I N C
(Logical observation identifier n a m e s a n d c o d e s ) v o c a b u l a r y .
J A m Med Inform Assoc, 5, 1998, 3, 2 7 6 - 2 9 2 .
Jones RG, Payne R B . Clinical investigation a n d statistics. In;
474
Laboratory m e d i c i n e . C a m b r i d g e . A C B Venture Publications,
1997, 174-178.
O ' M o o r e R, Borau G . T h e O p e n L a b s project. A suggested ap­
proach for m o r e effective u s e o f information technology in
clinical laboratories, J I F C C 7, 1995,1, 6 - 1 0 .
Richardson I. C h o o s i n g a L I M S : a critical decision for the labo­
ratory. Interntl L a b N e w s , 29, 1999, 1A, 2 2 - 2 3 .
R o w a n R M . W h a t is systematization? L a b M e d i c a International,
15. 1 9 9 8 , 6 , 8 - 9 .
S i n h a P. Informatics in systämatization. L a b M e d i c a International,
15, 1998, 6, 10-12.
Saltz J, R o t t m a n J. Kroll M . A n electronic clinical data reposi­
tory: H o w labs c a n a c c u m u l a t e valuable data. L a b M e d i c a In­
ternational, 16, 1999, 1, 6 - 7 .
ЧАСТ

АНАЛИТИЧНИ ПРИНЦИПИ
ПРИ ИЗСЛЕДВАНЕ
НА КЛИНИЧНО-ЛАБОРАТОРНИ
ПОКАЗАТЕЛИ
 Memogume 6 клиничната
л а б о р а т о р и я - основни
видове и к л а с и ф и к а ц и я
Л. Лсимбрсва
Основна цел н а к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я е
да осигури надеждни р е з у л т а т и , к о и т о д а
ге използват з а вземане н а е ф е к т и в н и ме­
дицински решения. За п о с т и г а н е н а т а з и цел
съвременната клинична лаборатория
използва многообразие о т м е т о д и , към ко­
и т о се п р е д я в я в а т определени изисквания
по о т н о ш е н и е н а т е х н и т е основни харак-
теристики за аналитична надеждност:
линейност, възпроизводимост, достовер­
ност, специфичност, чувствителност, ста­
билност.
О т п р а к т и ч е с к а гледна т о ч к а , във всич­
ки лабораторни дисциплини, се р а з л и ч а в а т
два основни вида м е т о д и : количествени и
качествени. Р е з у л т а т и т е о т качествени-
п е изследвания са о п и с а т е л н и - напр. мор­
фология на к л е т к и . Р е з у л т а т и т е о т коли-
ш с т в е н и т е изследвания и м а т числов израз
напр. к о н ц е н т р а ц и я н а хемоглобин, ензим-
i a а к т и в н о с т в серума, к о н ц е н т р а ц и я н а
ф е а т и н и н и др. Някои изследвания комби-
iupam о п и с а т е л н а т а и числовата информа­
ция - напр. диференциално броене н а левко­
цити в периферна кръв, диференциално бро-
ше на п у н к т а т о т к о с т е н мозък и др. По-
куколичествените изследвания о с и г у р я в а т
степенувани р е з у л т а т и , к о и т о са по-не-
почни и по-малко възпроизводими о т коли-
ш с т в е н и т е , но все оиде н а м и р а т приложе­
ше в к л и н и ч н а т а п р а к т и к а з а диагноза и
:онтрол на лечението - напр. химично изс-
1 едване н а урина с п о м о щ т а н а т е с т - л е н -
пи.
КАЧЕСТВЕНИ И
ЮЛУКОЛИЧЕСТВЕНИ МЕТОДИ
( а ч е с т Н е н и м е т о д и - т о в а са м е т о д и за
[оказване н а л и ч и е т о или о т с ъ с т в и е т о н а
•пределена с ъ с т а в к а в п р о б а т а , к о я т о се
•следва. Р е з у л т а т ъ т се изразява к а т о „по-
л о Ж и т с л е н или о т р и ц а т е л е н " . Погреш­
но е да се с ч и т а , че к а ч е с т в е н и т е м е т о д и
н я м а т и количествени с т р а н и . Възмож­
н о с т т а на м е т о д а да различава наличието
или о т с ъ с т в и е т о н а изследваната с ъ с т а в ­
к а е свързано с две негови качества: способ­
н о с т т а му да определя н а й - м а л к а т а кон­
ц е н т р а ц и я о т изследваното вещество т . е .
г р а н и ц а т а н а о т к р и в а н е ( l i m i t of
detection) и да доказва наличието на изслед­
в а н а т а с ъ с т а в к а в присъствие н а всички
останали компоненти на матрикса т . е .
а н а л и т и ч н а т а льу с п е ц и ф и ч н о с т . Ха­
р а к т е р и с т и к а т а на един качествен м е т о д
т р я б в а да съдържа данни, отговарящи на
въпроса, при какво количество на изследва­
ната съставка резултатът се променя от
„отрицател ен " в „п олож и телен" и обра т н о,
к о е т о означава, че по д е й с т в и е т о си т о й
о т г о в а р я н а един к о л и ч е с т в е н м е т о д ,
използван н а г р а н и ц а т а н а о т к р и в а н е .
Понякога, к о г а т о даден качествен м е т о д не
п о т в ъ р ж д а в а наличието на една с ъ с т а в к а ,
т о в а не о з н а ч а в а н е п р е м е н н о , че т я
о т с ъ с т в а в п р о б а т а з а изследване. О т
съществено значение е да има информация
за с ъ с т а в к и т е о т м а т р и к с а , к о и т о предиз­
в и к в а т фалшиво положителни или фалшиво
отрицателни резултати.
И о л у к о л и ч е с т в е и и м е т о д и - т е изслед­
в а т с ъ с т а в к а т а в определени концентра­
ционни и н т е р в а л и , к о и т о се и з р а з я в а т
к а т о приблизителна скала, напр. концент­
р а ц и и т е н а б е л т ъ к в урина. По принцип не
съществува линейна зависимост между кон­
ц е н т р а ц и я т а и сигнала, к а к т о при количес­
т в е н и т е методи. Макар че са удобни поради
п р о с т о т а т а на изпълнение, полуколичест-
в е н и т е м е т о д и ч е с т о не са д о с т а т ъ ч н о
ч з ; в с т в и т е л н и и специфични. Т я х н а т а
информация все още се използва при епиде­
миологични проучвания, к а к т о и в клинич-
477
нагла п рактика.
В л а б о р а т о р и и т е т р я б в а д а се обърне
необходимото внимание н а с т а н д а р т и з а ц и ­
я т а и качествения к о н т р о л н а качествени­
т е и полуколичествени м е т о д и .
дефинитивни м е т о д и . Класификацията н а
м е т о д и т е според т я х н о т о к а ч е с т в о е пред­
с т а в е н а н а т а б л . 27.1, а н а фиг. 27.1 е пока­
зана в р ъ з к а т а между р е ф е р е н т н и т е м а т е ­
риали и т р и т е вида м е т о д и .

КОЛИЧЕСТВЕНИ МЕТОДИ
К о л и ч е с т в е н и т е а н а л и т и ч н и м е т о д и се
разделят на т р и нива в зависимост о т т я х ­
н о т о качество: д е ф и н и т и в н и , референпгни
и рутинни.
При избора н а р у т и н н и т е м е т о д и се на­
л а г а т ч е с т о компромиси за с м е т к а н а ка­
ч е с т в о т о о т съображения за п р а к т и ч н о с т
(напр. по-малки икономически разходи).
Оценката на р у т и н н и т е м е т о д и се извър­
шва с референтни м е т о д и . Един р у т и н е н
м е т о д би бил сравним (traceable) с референ-
т е н метод, само к о г а т о е оценен с референ-
т е н м е т о д или к о г а т о е калибриран с в т о ­
рични с т а н д а р т и , ч и и т о с т о й н о с т и са оп­
ределени с р е ф е р е н т е н м е т о д . О т своя
с т р а н а к а ч е с т в о т о н а р е ф е р е н т н и т е ме­
т о д и може да бъде оценено с п о м о щ т а н а
Д е ф и н и т и в е н Memocj
Според определението н а WHO т о в а е Aie-
т о д о т най-висок метрологичен клас
з а к о л и ч е с т в е н о о п р е д е л я н е н а вещес­
тво с познат физико химичен състав
е н и щ о Ж н а г р е ш к а (bias). Р е з у л т а т и т е ,
получени с дефинитивен м е т о д , са най-близ­
ки до „ и с т и н с к а т а с т о й н о с т " (WHO/LAB/
98.5). Д е ф и н и т и в н и я т м е т о д с е х а р а к ­
т е р и з и р а с и з к л ю ч и т е л н о в и с о к а точ­
ност и специфичност н а резултати­
те. П р а к т и ч е с к и т о й е н е з а в и с и м о т
м а т р и к с а н а пробата.
З а изпълнението н а дефинитивни м е т о ­
ди се изисква сложна и скъпа а п а р а т у р а ,
изключително ч и с т и р е а к т и в и и висококва­
лифицирани специалисти. Ч е с т о се използ­
в а т комбинации н а сложна а п а р а т у р а и раз­
делителни т е х н и к и к а т о и з о т о п н о разреж-

Таблица 27.1. Класификация н а к л и н и ч н о - л а б о р а т о р н и т е м е т о д и

( n o Tietz - 1979 и Stamm - 1983, в модификация)

Наименование Характеристика Резултат

Дефинитивни м е т о д и н я м а т и з т о ч н и ц и н а грешки или т е с а най-близък до " и с т и н с к а ­

нищожни т а " стойност
• утвърдени
• препоръчани

Референтни м е т о д и с т о й н о с т , получена с
референтен м е т о д
Клас А
оценени с д е ф и н и т и в е н м е т о д
Клас В
не с а оценени с д е ф и н и т и в е н м е т о д ,
а със с т а н д а р т и о т много висок клас
Клас С
не е в ъ з м о ж н а оценка с д е ф и н и т и в е н
м е т о д ; п о н а с т о я щ е м не с ъ щ е с т в у в а т
с т а н д а р т и о т висок клас
с т о й н о с т , получена с
Рутинни методи р у т и н е н м е т о д ; методично
зависима с т о й н о с т
Клас А
препоръчвани м е т о д и ; п о в л и я в а н е т о
и м о т пречещи ф а к т о р и е т о ч н о
дефинирано; м е т о д и т е с а с и з в е с т н о
отклонение
Клас В
п о в л и я в а н е т о и м о т пречещи ф а к т о р и
не е дефинирано; м е т о д и т е с а с
неизвестно отклонение
478
Фиг. 27.1. Връзка между референтните материали и методите с различно качество
(no J. Wcstgard - 1995, в модификация)
ВОК - външна оценка на качеството; ВЛКК - вьтрелабораторен качествен контрол
дане с газова х р о м а т о г р а ф и я и м а с с п е к т -
рометрия. Например у т в ъ р д е н и я т о т
NCCLS дефинитивен м е т о д з а у р е я е изотоп­
но разреждане с белязан 18 0, капилярна газо­
ва х р о м а т о г р а ф и я и м а с с п е к т р о м е т р и я -
ID-GC/MS с CV < 0,2% и нищожно отклоне­
ние о т „ и с т и н с к а т а т а " с т о й н о с т .
Д е ф и н и т и в н и т е м е т о д и се ха ра кт ери зи ­
р а т с максимални изисквания по о т н о ш е ­
ние на к а л и б р а и и я т а , к о я т о се извършва с
първични с т а н д а р т и . Т е с а т в ъ р д е скъпи, за
да се и з п о л з в а т з а оиенка н а р у т и н н и т е
м е т о д и . И з п о л з в а т се преди всичко при раз­
р а б о т в а н е и оиенка н а р е ф е р е н т н и м е т о ­
ди.
Необходимо е за всички важни п о к а з а т е ­
ли в к л и н и ч н а т а химия да б ъ д а т у с т а н о в е ­
ни дефинитивни м е т о д и . Но р а з р а б о т в а н е ­
т о им изисква в з н а ч и т е л н а с т е п е н време и
големи м а т е р и а л н и разходи. Използването
им е ограничено в малък брой и е н т р о в е по
з в е т а - н а п р . NIST (Nationa l I n s t i t u t e of
Standards a n d Technology) - СЛ1Ц, INSTAND
Германия) и др. На н а с т о я щ и я е т а п за око­
ло 20 лабораторни показатели има у т в ъ р ­
дени или предложени за у т в ъ р ж д а в а н е дефи­
нитивни методи.
Р е ф е р е н т е н iviemocj
Рсфсрситси м е т о д е апа^ттичен м е ­
т о д с н а п ъ л н о п р о у ч е н а и о п и с а н а про­
ц е д у р а з а а н а л и з , е м н о г о д о б р а възп-
р о и з в о д и м о е т и т о ч н о с т , к о е т о поз­
волява използването м у з а оценка
точността н а д р у г и м е т о д и (рутин­
н и ) и л и з а о с в и д е т е л с т в у в а н е н а ре­
ф е р е н т н и м а т е р и а л и (pr EN 1992, ISO
Guide 30: 1981, 4.1).
Р е ф е р е н т н и я т м е т о д о т к л а с А е ощз-
нен с дефинитивен м е т о д и за него има на
разположение калибраиионни м а т е р и а л и ,
също оценени с дефинитивен м е т о д .
За референтен м е т о д о т к л а с В се гово­
ри т о г а в а , к о г а т о не е извършена предвари­
т е л н а оценка с дефинитивен м е т о д , но са
използвани първични с т а н д а р т и .
К а т о референтни м е т о д и к л а с С се оз-
479
н а ч а в а т т е з и , к о и т о са предназначени з а се и з п о л з у в а т з а осигуряване н а р а б о т н и
определяне на сложни, т р у д н и за дефинира­ с т а н д а р т и за р у т и н н и т е м е т о д и и за оп­
не комплекси, напр. ензими, някои хормони, ределяне н а мето д и чн о -зави си ми те с т о й ­
туморни маркери и др., за к о и т о в обозри­ н о с т и в к о н т р о л н и т е материали. Повлия­
м о т о бъдеще н я м а да има дефинитивен ме­ в а н е т о н а р у т и н н и т е м е т о д и о т интерфе-
т о д или подходящ калибрационен м а т е р и ­ риращи ф а к т о р и е т о ч н о дефинирано, т е
ал с т о ч н о дефинирани съставки. Те се ка­ с а п о з н а т и о щ е к а т о л г е т о д и с извес­
либрират със „съгласувани" с т а н д а р т и . т н о от/с^юнение. Тъй к а т о понякога де­
Референтните м е т о д и обикновено се раз­ ф и н и т и в н и т е и р е ф е р е н т н и т е м е т о д и са
р а б о т в а т при съгласувани о т научни орга­ н е д о с т ъ п н и или не са още разработени, в
низации т о ч н о определени условия н а изслед­ к а ч е с т в о т о н а м е т о д з а сравнение м о г а т
ване, напр. при определяне н а е н з и м н и да се и з п о л з в а т р у т и н н и т е м е т о д и о т клас
а к т и в н о с т и (\VHO/LAB/98.5). Референтни- А.
я т м е т о д за определяне н а урея в биологич­ При р у т и н н и т е м е т о д и о т fc^iac В пов­
ни т е ч н о с т и е основан н а д в о й н а т а ензим­ л и я в а н е т о о т интерфериращи ф а к т о р и не
на с и с т е м а urease-glutamatdeh^drogenase и е дефинирано, напр. поради с л о ж н а т а с т р у к ­
оптичния т е с т на Warburg - абсорбция при т у р а на изследваната съставка. Наричат
Х= 340 п т (NAD(P)H/NAD(P) - и н д и к а т о р н а се още A i e m o g u с н е и з в е с т н о отк^юне-
реакция). ние.
Един р у т и н е н м е т о д може да има същия
а н а л и т и ч е н принцип, к а к т о р е ф е р е н т н и я
Рутинен м е т о д
м е т о д з а определяне н а определена с ъ с т а в ­
Р у т и н е н м е т о д е лгетос/ с а н с и т т и ч - ка, но з а н е г о в о т о изпълнение се използва
н а н а д е Ж д н о с т и п р а к т и ч н о с т , к о я ­ различна а п а р а т у р а и различен начин на
т о е д о с т а т ъ ч н а з а п р е д н а з н а ч е н и е ­ подготовка н а п р о б а т а з а изследване.
т о лгу. Р а з л г е р ъ т н а с и е т е л т о т о о т ­ За п о с т и г а н е н а сравними и с по-висока
к л о н е н и е ( b i a s ) о т „ и с т и н с к а т а " а н а л и т и ч н а надеждност р е з у л т а т и с налич-
стойност т р я б в а д а бъде и з в е с т н о н и т е р у т и н н и м е т о д и , национални и
(WHO/LAB/98.5). Това са м е т о д и т е , с кои­ международни професионални организации
т о практически се и з в ъ р ш в а т клинично- п у б л и к у в а т м а т е р и а л и с п р е п о р ъ ч а н и т е
ла б о р а торните изследвания. П о н а с т о я щ е м м е т о д и ч н и принципи (NCCLS). Експертни­
в клинично-лабораторната п р а к т и к а е на­ я т с ъ в е т по клинична л а б о р а т о р и я към МЗ
лице многообразие о т м е т о д и , ч и я т о ана­ н а Република България издаде през 1999 г.
литична надеждност следва да бъде извес­ б ю л ети н с препоръчаните методични прин­
тна. ципи за н а й - ч е с т о изследваните в п р а к т и ­
Р у т и н н и т е м е т о д и о т к л а с А са оцене­ к а т а клинично-химични, хематологични и
ни с р е ф е р е н т н и м е т о д и или в т о р и ч н и х е м о с т а з н и показатели. С ъ щ и я т е основа
с т а н д а р т и със с т о й н о с т , определена с ре- н а Национален с т а н д а р т по клинична ла­
ферентен м е т о д . В т о р и ч н и т е с т а н д а р т и б о р а т о р и я - 2000 г. (МЗ).

КНИГОПИС

Passey, R B . Quality control for the clinical c h e m i s t r y laboratory.

S t a m m D . A n e w c o n c e p t for quality control o f clinical labora­
In: Kaplan L A , P e s c e AJ (eds). Clinical Chemistry. St. L o u i s ,
tory i n v e s t i g a t i o n s in the light o f clinical requirements and
etc. M o s b y c o m p a n y , 1 9 9 5 , 3 9 7 - 3 9 8 .
based o n reference m e t h o d v a l u e s . J Clin C h e m Clin B i o c h e m ,
Kohle G , S i e k m a n n L. Q u a l i t y a s s u r a n c e o f quantitative 20, 1982, 1817-1824.
determinations. In; T h o m a s L (ed). Clinical Laboratory D i -
U ldall A . Q u a l i t y A s s u r a n c e in c l i n i c a l chemistry. S c a n d J Lab
199851Гз93Р1Г394ГиГ1/Ма'П' T H
" B o o k s V e r l
Wsellchaft, Invest. 4 7 , 1 9 8 7 , S u p p l . 1 8 7 , 2 5 - 2 7 .
Westgard JO, K l e e JG. Q u a l i t y m a n a g e m e n t . In: T i e t z N (ed).
T e x t b o o k o f clinical c h e m i s t r y , 1 9 8 6 , 5 5 8 - 5 5 9 .

480
 Калибрация
на аналитичните м е т о д и
8 клиничната лаборатория
СТАНДАРТИ И КАЛИБРАТОРИ
В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ
I. Шипков
Измерването, н а к о я т о u 9 а било величина
5 невъзможно, ако и з м е р в а щ и я т не разпо-
vaaa със с р а в н и т е л н а величина, с к о я т о да
дзвърши с ъ п о с т а в я н е т о . В к л и н и ч н а т а ла­
боратория за с ъ п о с т а в я н е н а неизвестни-
пе концентрации н а с т о т и ц и в е щ е с т в а или
Зрой н а к р ъ в н и т е к л е т к и в даден обем се
ю л з в а т с т а н д а р т и или к а л и б р а т о р и . В
1ай-обща схема т о се о с ъ щ е с т в я в а по фор­
мулата:
I/"
^ _ " с т а н д а р т- _х ^
" п р rj,о б а ''npoGa
cmaiKjapm
^проба " концентрация на търсеното вещество
»биологичната проба
^стануарт " концентрация на търсеното вещес-
пво в стандартния (калибрационния) разтвор
5 проба' измерената величина (екстинкция) в би-
»логичната проба
^стандарт"измерената величина (екстинкция)
1 стандартния (калибрационния) разтвор
Ф о р м у л а т а се основава н а предпостав­
я щ а , че при а н а л и з а е спазен закона н а
jambert - Beer. Според закона н а Lambert при
феминаване н а м о н о х р о м а т и ч н а с в е т л и н а
фез хомогенна среда, н е й н и я т и н т е н з и т е т
шмалява експоненциално с д ъ л ж и н а т а н а
:ветлинния п ъ т , а според закона н а Beer
пози и н т е н з и т е т е експоненциално свър-
ан с к о н ц е н т р а ц и я т а н а абсорбираща със-
павка в с и с т е м а т а :
Ф = Ф,. х е е1С(В)
D - измерва се директно
К - е измерената величина на светлинния сноп
без наличие на търсената съставка (В)
-дължината на светлинния сноп (пласто-
ва ширина) - най-често 1 cm
Е - дава се таблично
с(В) - изчислява се
В т а б л . 28.1 са представени общовъзпри-
е т и т е определения за с т а н д а р т и и калиб­
ратори.
Организации, к о и т о са съпричастни към
к а ч е с т в о т о н а изследванията в медицина­
т а п р е д л а г а т п о - с т р и к т н и определения.
Според М е ж д у н а р о д н а т а организация з а
с т а н д а р т и з и р а н е (International Standards
Organization (ISO)), р е ф е р е и т е н м а т е р и ­
ал е вещество (или м а т е р и а л ) с д о с т а т ъ ч ­
но добре установени едно или повече физи­
чески свойства, за да може да бъде използ­
вано при калибриране на даден а п а р а т или
за оценка н а аналитичен м е т о д . Това пред­
полага, че всяка малка ч а с т на референт-
ния м а т е р и а л п р и т е ж а в а к а ч е с т в а т а , ус­
т а н о в е н и за самия м а т е р и а л в декларира­
н и т е граници. Националният к о м и т е т за
клинични лабораторни с т а н д а р т и на СЛЩ
(National Committee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS)) предлага писмен с т а н ­
д а р т (описание) за произвежданите о т него
референтни материали, ч и и т о с ъ с т а в к и са
определени с д о с т а т ъ ч н а т о ч н о с т и възп-
роизводимост, за да м о г а т да б ъ д а т полз­
вани за калибрационни цели. Според Между­
н а р о д н а т а федерация по клинична химия
(International Federation of Clinical Chemistry
(IFCC)) първичен с т а н д а р т е в е щ е с т в о с
добре изяснен химически с ъ с т а в и д о с т а ­
т ъ ч н а ч и с т о т а , за да може да бъде използ­
вано за приготвяне на първичен с т а н д а р ­
т е н разтвор.
През 7 0 - т е години на 20. век при клинич-
но-химичните изследвания практически ви­
наги се ползваха „ с т а н д а р т н и разтвори". В
ч а с т о т случаите т е бяха приготвяни за­
едно с р е а к т и в и т е в с ъ о т в е т н а т а лабора­
т о р и я , в други - включвани в с ъ с т а в а н а
т е с т - о п а к о в к а т а о т ф и р м а т а производи­
т е л . По принцип в преобладаващата ч а с т
481
Т а б л и ц а 28.1. С т а н д а р т н и м а т е р и а л и , с т а н д а р т н и р а з т в о р и и к а л и б р а т о р и
{по D. Stamm, в модификация)
С т а н д а р т и ( с т а и с| а р т н и в е щ е с т в а ) :
Вещества с известна чистота, които могат да се използват като база за сравнение на
определено вещество в дадена проба
Първичен с т а н д а р т е н р а з т в о р :
Първичен с т а н д а р т : Стандартен разтвор с позната концентра­
Определена маса от чистото вещсство, която ция, п о л у ч е н чрез п р е т е г л я н е н а п ъ р в и ч е н
може да бъде точно претеглена стандарт и разтварянето м у в подходящ чист
и л и дефиниран разтворител
Вторичен с т а н д а р т е н разтвор:
Стандартен разтвор приготвен чрез разтва­
ряне н а вторичен стандарт в определен раз-
ворител. Концентрацията м у е измерена чрез
Вторичен с т а н д а р т ;
Маса от чистото вещество, която може да химически анализ
бъде определена само непряко чрез химически Калибратор:
анализ Вторичен стандартен разтвор, който съдър­
жа с ъ щ и т е съставки, к а к т о изследваната
б и о л о г и ч н а проба. К о н ц е н т р а ц и и т е и м са
определени чрез химически анализ

о т с т а н д а р т н и т е р а з т в о р и се ползваше
к а т о р а з т в о р и т е л вода, при изследване н а
липидни с ъ с т а в к и - с ъ о т в е т н и органични
разтворители. П одб орът н а в е щ е с т в о т о ,
к о е т о се ползва к а т о с т а н д а р т , респ. него­
в а т а ч и с т о т а и други с в о й с т в а се предос­
т а в я ш е изцяло н а отговорния лабораторен
специалист, респ. н а ф и р м а т а производител
на тест-опаковки. Н е б л а г о п р и я т н и т е ре­
з у л т а т и о т провежданите външни оценки
на к а ч е с т в о т о н а л а б о р а т о р н и т е анализи
са водещ ф а к т о р при преразглеждане роля­
т а на неконтролираните официално с т а н ­
дарти.
Установено е, че при изследване н а слож­
ни разтвори, к о и т о с ъ д ъ р ж а т не само изс­
ледваното вещество напр. глюкоза или кре-
атинин, но и много други органични и неор­
ганични с ъ с т а в к и е съществено да се о т ч и ­
т а влиянието н а м а т р и к с а н а биологични­
т е материали. С п о н я т и е т о м а т р и к с се
означава с б о р ъ т о т с ъ с т а в к и и с т р у к т у ­
ри, в к о и т о е „ в м е с т е н о " в биологичния
м а т е р и а л изследваното вещество. Различи­
я т а между воден р а з т в о р и серумен м а т ­
рикс м о г а т да се д ъ л ж а т н а много причини,
напр. повърхностно напрежение, к о е т о да
предизвика разлики при п и п е т и р а н е н а про­
б а т а , взаимодействия между изследваното
вещество и белтъци, влияние на обема з а е т
в серума о т белтъци върху д е й с т в и т е л н а ­
т а концентрация н а изследваното в е щ е с т ­
482
во ( н а п р . н а т р и й ) . К о м п е н с и р а н е т о н а
м а т р и к с н и т е е ф е к т и е основен ф а к т о р за
все по-широкото използване н а к а л и б р а т о ­
р и , к о и т о и м а т м а т р и к с , подобен н а т о з и
н а изследвания серум. Друга причина, пора­
ди к о я т о все по-широко в клиничните лабо­
р а т о р и и се п р и л а г а т комплексни калибра­
т о р и за голям брой изследвани п а р а м е т р и е
използването о т една с т р а н а на селектив­
ни анализатори, а о т друга - наложилият
се подбор н а „оптимирани" м е т о д и к и с до­
к а з а н и в ъ з м о ж н о с т и . При с е л е к т и в н и т е
а н а л и з а т о р и е по-удобно и икономично из­
ползване н а един и с ъ щ к а л и б р а т о р з а всич­
ки или п о ч т и всички изследвани п а р а м е т ­
ри. За п р е о б л а д а в а щ а т а ч а с т о т клинично-
х и м и ч н и т е п а р а м е т р и се п р е д л а г а т о п т и ­
мирани или подбрани методики, за к о и т о е
добре и з в е с т е н о б с е г ъ т , в к о й т о е спазен
з а к о н ъ т н а Lambert-Beer. Лесно може да бъде
програмирано а в т о м а т и ч н о разреждане при
надвишаване н а т о з и обсег, а т о в а позволя­
ва калибриране със само един калибратор
в м е с т о с поредица о т с т а н д а р т н и разтво­
ри.
К а л и б р а т о р и т е се и з р а б о т в а т с м а т ­
рикс, по в ъ з м о ж н о с т близък до т о з и на изс­
ледваните биологични материали. Стойнос­
т и т е н а изследваните п а р а м е т р и се опре­
д е л я т в р е ф е р е н т н и лаборатории при въз­
м о ж н о с т с р е ф е р е н т н и м е т о д и . Според пре­
п о р ъ к и т е н а р а б о т н а т а група за изработ-
 бане на национално съгласие о т н о с н о рефе-
р е н т н и т е м а т е р и а л и 6 к л и н и ч н а т а химия
6 САЩ, к а л и б р а т о р и т е следва д а м о г а т да
б ъ д а т отнесени към референтни материа­
ли със с е р т и ф и к а т , к о г а т о с ъ щ е с т в у в а въз­
м о ж н о с т . Трябва д а б ъ д а т придружени о т
с в и д е т е л с т в о с данни о т н о с н о специфичния
с ъ с т а в , хомогенност, физически х а р а к т е ­
р и с т и к и , ц в я т , количествена х а р а к т е р и с ­
т и к а н а с ъ с т а в к и т е , биологични д а н н и
( о п а с н о с т о т зараза, с т е р и л н о с т ) , с т а б и л ­
н о с т и използвани консерванти, ако има т а ­
кива. Дори при грижливо определяне н а при­
ц е л н и т е с т о й н о с т и н а к а л и б р а т о р а във ви­
сококвалифицирани р е ф е р е н т н и л а б о р а т о ­
рии, в ъ з н и к в а т различия в з а в и с и м о с т о т
използвания а н а л и т и ч е н принцип ( т а б л .
28.2).
По изключение, в малки лаборатории, ко­
и т о р а б о т я т със серийни а н а л и з а т о р и мо­
г а т да б ъ д а т използвани водни р а з т в о р и
( с т а н д р а т и ) н а изследвания п а р а м е т ъ р
El (най-често фирмено производство). С оглес^
Таблица 28.2. Прицелни с т о й н о с т и за глюкоза в калибратор (по D. Stamm - 1989, със съкращения)
Показател Аналитичен принцип
Хексокиназа/Гл-6-ДХ с обезбелтъчаване
Хексокиназа/Гл-6-ДХ без обезбелтъчаване
GOD/POD/о-дианизидин с обезбелтъчаване
Глюкоза GOD/POD/о-дианизидин без обезбелтъчаване
GOD/PAP
GOD/PAP (SM A)
Глюкоаналайзер Beckman® (поларография)
КАЛИБРАЦМОННИ К Р И В И
Л. Лал1брева
З а п о с т и г а н е н а висока н а д е ж д н о с т и срав­
н и м о с т на л а б о р а т о р н и т е р е з у л т а т и се из­
п о л з в а т два подхода:
• Официална калибрация и с т а н д а р т и з а ­
ция, вкл. официална калибрация на измер­
вателната апаратура и стандартизация
на а н а л и т и ч н и т е м е т о д и ;
• Качествен к о н т р о л на р е з у л т а т и т е .
В к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я калибрация-
т а и к о н т р о л ъ т н а а н а л и з и т е са две фун­
изискванията на д о б р а т а лаборатор­
н а п р а к т и к а 6 т а к и б а случаи е нало­
ж и т е л н о проВеждане н а Вътрелабора-
т о р е н качестВен контрол е материа­
ли е д е к л а р и р а н и (прицелни) с т о й н о с ­
т и н а п а р а м е т р и т е и съо б р а зяВ а не с
е В е н т у а л н о Възникнали з н а ч и м и раз­
лики м е ж д у п р и ц е л н и т е и п о л у ч е н и т е
р е з у л т а т и за контролния материал.
В з а к л ю ч е н и е следва да се подчертае,
че н е е п р а в и л н о к о н т р о л н и м а т е р и а ­
л и с обявени прицелни стойности д а
се ползват едновременно и к а т о ка-
либратори, и к а т о контрол з а точ­
ност. Всеки а н а л и т и ч е н м е т о д следва да
п р и т е ж а в а калибрационна с и с т е м а , к о я т о
е независима о т използваната контролна
с и с т е м а . По т о з и начин се изключва прена­
сяне о т е д н а т а с и с т е м а в д р у г а т а н а евен­
т у а л н о д о п у с н а т а с и с т е м н а грешка и се
осигурява а н а л и т и ч н а т а н а д е ж д н о с т н а
резултатите.
Прицелна
с т о й н о с т (mmol/1)
4,75
4,77
4,83
4,58
4,83
5,05
4,61
д а м е н т а л н о различни дейности. С к а л и б -
рацилта се осигурява точността н а
р е з у л т а т и т е , а с п о м о щ т а н а качес­
твения контрол се проверява стабил­
ността и точността н а калибраци-
я т а , к а к т о и н а а н а л и т и ч н а т а про­
цедура к а т о цяло с различните п о
произход и х а р а к т е р грешки.
СЪЩНОСТ НЛ ПОНЯТИЕТО
К а л и б р а ц и я т а е последователност от
процедури, посредством които се определя
(при специфични условия) връзката между
измерени стойности - на инструмента или
483
системата за изследване, м а т е р и а л а з а
изследване или референтния м а т е р и а л о т
една страна, и от друга - съответните и м
стойности за изследваната съставка, с по­
мощта на стандарти.
При количествените аналитични м е т о ­
ди е необходимо да се определи количестве­
н а т а връзка между и з м е р в а н а т а величина
(Y), изследваната величина (X) и калибраии-
о н н а т а величина (С). М а т е м а т и ч е с к а т а
връзка между измерения сигнал и количест­
в о т о на изследваната с ъ с т а в к а се изразява
посредством калибрационната функция.
Y = f(X)
f - калибрационен фактор
Т и п ъ т на ф у н к ц и я т а е необходимо пред­
варително да бъде т е о р е т и ч н о обоснован
(напр. закона на Lambert-Beer за абсорбци­
о н н а т а спектрометрия). Ч е с т о се налага
обаче да се използват експериментално про­
учени калибрационни функции.
Графичното изображение на калибрацион-
н и т е функции е калибрационната крива.
УСЛОВИЯ ЗА КАЛИБРАЦИЯ
Условията за калибрация включват някол­
ко ф а к т о р а - калибрациони с т а н д а р т и , ка­
либрационни раз тв ори и т о ч н о описание н а
аналитичния м е т о д .
К а л и б р а ц и о н н и с т а н д а р т и . Идеална
концепция е т а з и , според к о я т о всички ла­
бораторни показатели се калибрират с въз­
можно най-чисти с т а н д а р т н и вещества. В
много случаи т о в а е н е п о с т и ж и м о , т ъ й
к а т о много компоненти, представляващи
клиничен интерес, поради комплексната си
природа (белтъци, ензими, изоензими, хор­
мони) не с ъ щ е с т в у в а т к а т о първични с т а н ­
да р ти, к о е т о силно з а т р у д н я в а калибраци-
я т а им.
К а т о п ъ р в и ч е н с т а н д а р т (prima ry
standard material) се приема м а т е р и а л , кой­
т о притежава най-високи метрологични ка­
ч е с т в а за специфични цели и ч и я т о декла­
рирана с т о й н о с т се приема безусловно. Най-
ч е с т о за калибрация се използват първични
с т а н д а р т и , при к о и т о к о н ц е н т р а ц и я т а н а
в е щ е с т в о т о е определена с п р е п а р а т и в н а
484
процедура, напр. по тегловен п ъ т , к а т о за
р а з т в о р и т е л се използва вода с висока хи­
мическа ч и с т о т а . Ч и с т и т е с у б с т а н ц и и ,
използвани з а ц е л т а , т р я б в а да б ъ д а т със
с е р т и ф и к а т , удостоверяващ п р и г о д н о с т т а
им з а ц е л и т е н а калибрацията. Приготвя­
нето на калибрационните разтвори тряб­
ва да се извършва с из/слючително внимание,
п р и строго спазване п р а в и л а т а на теглов­
н и я и обемен анализ. К о г а т о аналитични­
я т м е т о д позволява, т о т о з и с т а н д а р т е
оптимален/Гой може да бъде възпроизведен
по в с я к о в р е м е , н е г о в а т а с т а б и л н о с т '
практически е неограничена, определянето
н а н е г о в и т е п а р а м е т р и (напр. mmol/1) е не- I
съмнено. Използването н а подобни с т а н д а р - 1
т и в о б л а с т т а на к л и н и ч н а т а химия в мно­
го случаи обаче е невъзможно, непрактично
или нецелесъобразно. Поради т о в а изследва­
н о т о в е щ е с т в о се р а з т в а р я в даден м а т -
рикс, к о й т о повече или по-малко наподобя­
ва д е й с т в и т е л н и я м а т е р и а л з а изследване,
напр. човешки серум, урина, ликвор и др.
М а т р и к с ъ т може да бъде т о ч н о определен
р а з т в о р н а човешки албумин. Съдържащи
албумин калибрационни р а з т в о р и се използ­
в а т в случаите, к о г а т о т о в а се препоръчва
в м е т о д и ч н и т е указания за приложение на
определен м е т о д . К а т о първични с т а н д а р ­
т и се п р и е м а т и т е з и , при к о и т о концент­
р а ц и я т а н а с ъ с т а в к и т е е определена с де­
ф и н и т и в е н м е т о д , напр. ID-MS. SUM 909
п р е д с т а в л я в а лиофилизиран п р о д у к т н а ба­
з а т а на човешки серумен м а т р и к с , обяве­
н и т е с т о й н о с т и н а к о й т о са получени о т
NIST (САЩ) с дефинитивни м е т о д и .
К о г а т о не е възможно изследваната със­
т а в к а да се изолира в ч и с т вид и да се р а з т ­
вори в определен р а з т в о р и т е л , се налага
използването н а в т о р и ч н и с т а н д а р т и .
При т я х к о н ц е н т р а ц и я т а н а в е щ е с т в о т о
се определя в т о р и ч н о чрез м е т о д и с много
добра а н а л и т и ч н а н а д е ж д н о с т - референт-
ни или р у т и н н и о т клас Л. Важно условие е
обявената стойност на използвания калиб-
р а т о р д а бъде сравнена (traceability) със сер­
ти ф и ц и р а н п р о д укт и л и с международен
стандарт.
К о г а т о изследваното в е щ е с т в о е нена-
пълно описано или е налице само в лошо де­
финирана с т е п е н н а ч и с т о т а , к а к т о е при
белтъци, белтъчни хормони и т у м о р н и мар­
кери, се и з п о л з в а т калибрационни препара-
тш с условни единици. Те се п р е д о с т а в я т
л п ч а с т и о т национални или международни
)рганизации. Необходимо е изрично д а се дек­
ларира кой условен с т а н д а р т е използван
i p u калибраиията на даден метод.
б) л и н е й н о с т т а между д о л н а т а основна ка­
либрационна т о ч к а и н а ч а л о т о н а коор­
д и н а т н а т а с и с т е м а , к а т о се п р и г о т в я т
още т р и е к в и д и с т а н т н и р а з т в о р а о т
концентрирания р а з т в о р .

^алибрациоини разтНори. О т концент- Т о ч н о о п и с а н и е и и з п ъ л н е н и е н а ана­

зиран калибрационен р а з т в о р , п р и г о т в е н л и т и ч н и я м е т о д . Всички а н а л и т и ч н и
гьгласно и з и с к в а н и я т а по-горе се п р и г о т ­ процедури се о п и с в а т т о ч н о и подробно. О т
в я т определен брой е к в и д и с т а н т н и разреж­ всеки калибрационен р а з т в о р , к а к т о и о т
дания. К о н ц е н т р а ц и и т е се п о д б и р а т т а к а , п р а з н а т а проба за р е а к т и в и се п р о в е ж д а т
ie положението н а една калибрационна кри- еднакъв брой неколкократни изследвания с
5а да съвпадне с р е ф е р е н т н и т е граници и м е т о д а , подлежащ н а калибрация, при
^линично-значимите к о н ц е н т р а ц и и в п а т о ­ с т р и к т н о спазване на а н а л и т и ч н а т а про­
логичната о б л а с т н а изследвания п о к а з а т е л цедура.
1 с ч у в с т в и т е л н о с т т а н а м е т о д а . Препо-
уьчва се да се р а б о т и с 5 е к в и д и с т а н т н и
)сновни к о н ц е н т р а ц и и н а р а з т в о р а ( т а б л . ПРАВИЛА ЗА ПОСТРОЯВАНЕ И
!8.3). ПРОВЕРКА НА КАЛИБРАЦИОННА
КРИВА ЗА ФОТОМЕТРИЧНИТЕ
Габлица 28.3. Примерни концентрации на ра- АНАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
ю т н и т е калибрационни разтвори за построя-
.ане на проста калибрационна крива П р о с т а к а л и б р а ц и о н н а криНа
Осно-
Работни Построяване на проста калибрационна кри­
ÖCII
Показател калибрационни ва:
разт-
разтЦори > о т концентриран калибрационен р а з т в о р
Вор
се п р и г о т в я т 5 е к в и д и с т а н т н и основни
I II III IV V
разтвора;
Глюкоза > изследват се по т р и проби о т всеки раз­
1 000 50 100 200 300 400
mg/dl
т в о р и о т п р а з н а т а проба;
Крсатинин > и з м е р в а т се срещу вода или използвания
100 1 2 3 4 5
mg/dl
разтворител;
Урея
mg/di 800 20 40 80 120 160 > за всяко о т ш е с т е т р и к р а т н и определя­
ния се изчисляват средни а р и т м е т и ч н и
Пикочна с т о й н о с т и , о т к о и т о се изважда средна­
киселина 100 4 6 8 10 12
mg/dl т а а р и т м е т и ч н а с т о й н о с т на с л я п а т а
проба;
Общ белтък
180 30 60 90 120 150 >• коригираните средни с т о й н о с т и се нана­
g/J
с я т на г р а ф и к а т а , к а т о с т о й н о с т т а на
Серумно желязо
• основен р-р п р а з н а т а проба съвпада с н у л е в а т а т о ч ­
g/1 1.000 ка н а к о о р д и н а т н а т а с и с т е м а ;
• междинен р-р
jig/ml 100 50 100 150 200 250 > н а а б с ц и с а т а се н а н а с я т концентрации­
т е , а на о р д и н а т а т а - коригираните из­
мерени средни с т о й н о с т и .
При п о с т р о я в а н е т о н а калибрационна
Мащабът на абсцисата трябва да се из­
рива с цел оценка на а н а л и т и ч н а т а надеж-
бере по т а к ъ в начин, че концентрациите да
н о с т на даден м е т о д , допълнително т р я б -
м о г а т да се о т ч и т а т с точност, съответ­
а да се определи:
на на практическите изисквания, т.е. съ­
) л и н е й н о с т т а н а к р и в а т а над г о р н а т а образно референтните граници и чувстви­
основна калибрационна т о ч к а с п о м о щ т а телността на метода. Д е л е н и я т а н а
на допълнителни калибрационни р а з т в о ­ ординатата трябва да се направят така,
ри - толкова, колкот о е необходимо; че ъгълът на наклона на калибрационната
485
крива да е около 4 ? (tga да е приблизително н а т а с т о й н о с т на п р а з н а т а проба;
равен на 1). На табл. 28.4 u фиг. 28.1 е пред­ >• през нулевата т о ч к а на координатната :
ставен пример на калибрационна крива (раз­ с и с т е м а и т о ч к а т а н а коригираната
ширена с две допълнителни точки) при оп­ средна с т о й н о с т о т 20-кратното опре- {
ределяне на урея с уреазен/ГлДХ метод. деляне се прекарва права линия {условно i
наречена теоретична).
Т а б л и ц а 28.4. Калибрационна крива (разшире­ Основните калибрационни точки трябва
на с две допълнителни точки над 160 mg/dl) при
т а к а да б ъ д а т разположени по отношение
определяне на урея с уреазен/ГлДХ м е т о д
на т а з и права, че да не са по-далеч о т 1,2
mg/dl ЛА1 АА2 ААЗ АА SD. Ако това изискване е изпълнено, калиб-
рационната крива може да се разглежда
20 - 0.026 - 0.024 - 0.026 - 0.025
като линейна и достатъчно точна. Ако ус- :
40 - 0.047 - 0.049 - 0.049 - 0.048 ловието не е изпълнено, са възможни след­
н и т е случаи:
80 - 0.093 - 0.096 - 0.095 - 0.095
• п е т а т а или п е т а т а и ч е т в ъ р т а т а калиб­
120 - 0.145 - 0.145 - 0.145 - 0.145 рационни т о ч к и системно се отклоняваш
о т к р и в а т а . В т е з и случаи е налице
160 - 0.198 - 0.191 - 0.197 - 0.195 линейност само до ч е т в ъ р т а т а , респ.
- 0.244 - 0.242 - 0.247 - 0.244 т р е т а т а основна т о ч к а ;
200
• ако всички основни калибрационни точки
400 - 0.459 - 0.466 - 0.457 - 0.461 са разположени т а к а , че изобразяват сис­
т е м н о изкривена линия, т о ц я л а т а калиб­
АА рационна крива не е линейна;
• ако средните с т о й н о с т и на основните ка­
либрационни т о ч к и се о т к л о н я в а т о т
п р а в а т а повече о т 1,2 SD, възпроизводи-
м о с т т а на р е з у л т а т и т е , извършени за
построяване на калибрационната крива,
не е задоволителна.

С (mg%)
Фиг. 28.1. Калибрационна крива при определяне
на урея с уреазен/ГлДХ м е т о д
Проверка за точност на простата калиб­
рационна крива-.
>• извършват се 20-кратни определяния на
т р е т а т а (средна) концентрация;
> получените 20 стойности се обработват
с т а т и с т и ч е с к и за изчисляване на х и
стандартно отклонение (SD);
> средната с т о й н о с т се коригира със сред-
486
С л о ж н а ( т о ч н а ) к а л и б р а ц и о н н а крива
Правила за построяване. Първоначално се
построява п р о с т а крива, след което 5-те
основни т о ч к и се допълват с:
• т р и т о ч к и между началото на коорди­
н а т н а т а с и с т е м а и най-ниската основна
точка;
• необходимия брой т о ч к и над максимална­
т а основна т о ч к а .
Допълнителните калибрационни разтво­
ри т р я б в а да се изследват в една серия за­
едно с 5 - т е основни калибрационни разтво­
ра. Построява се крива по правилата за пос­
трояван е на п р о с т а крива и се извършва
проверка и оценка съгласно съидите прави­
ла. Ако се установи незадоволителна възп-
роизводимост на изследванията, т . е . точ­
к и т е о т с т о я т на по-голямо о т 1,2 SD разс­
т о я н и е , п о - н а т а т ъ ш н а т а обработка за
 т о ч н а крива се п р е у с т а н о в я в а .
За п о т в ъ р ж д а в а н е н а с л о ж н а т а ( т о ч н а ­
т а ) калибраиионна крива е необходимо да се
п о в т о р и н е й н о т о п о с т р о я в а н е , к а т о се из­
в ъ р ш в а т 5 - к р а т н и определяния о т всеки
калибрационен р а з т в о р , к а к т о и н а празна­
т а проба за р е а к т и в и .
Проверка на т о ч н а т а крива. Т е о р е т и ч н а т а
права линия се п о с т р о я в а по същия начин,
к а к т о з а п р о с т а крива. К о р и г и р а н и т е
средни а р и т м е т и ч н и с т о й н о с т и н а 5 - к р а т -
н и т е определяния не т р я б в а д а се о т к л о н я ­
в а т повече о т 0,9 SD о т т е о р е т и ч н а т а
права линия.
ОЦЕНКА НА
КАЛИБРАЦИОННИТЕ КРИВИ
Ii Ако т о ч н а т а крива и м а д о с т а т ъ ч н о широк
линеен диапазон, о т и з м е р е н и т е срещу вода
с т о й н о с т и н а калибрационните проби (ос­
реднени) и п р а з н а т а проба може да се из­
числи л и н е й н а регресия о т Г"и порядък. Ако
р а з л и к а т а между о т с е ч к а т а о т о р д и н а т а -
т а н а р е г р е с и о н н а т а линия и с р е д н а т а
с т о й н о с т н а с л я п а т а проба е по-малка о т
1,5 SD , т о п о к а з а т е л я т н а наклона н а рег­
р е с и о н н а т а линия е търсеният калибраии-
онен фактор, к о й т о се използва з а изчисля­
ване н а р е з у л т а т и т е о т изследванията.
При много о т м е т о д и т е не с ъ щ е с т в у в а
линейна з а в и с и м о с т между к о н и е н т р а и и я -
т а на изследваното в е щ е с т в о и инструмен­
т а л н о измерения сигнал. Едва при абсорб­
ц и о н н а т а ф о т о м е т р и я , к о я т о се използва
най-често в к л и н и ч н а т а химия, важи зако­
н а на Lambert-Beer, според к о й т о измерва­
н и я т сигнал е пропорционален н а о т р и ц а ­
телния логаритъм на концентрацията.
Трансформирането н а т а з и функция в една
права най-често с т а в а в самия а п а р а т (соф­
туерно), м а к а р че т о в а не променя неща­
т а , т ъ й к а т о в д е й с т в и т е л н о с т линейна
з а в и с и м о с т не с ъ щ е с т в у в а . З а к о н ъ т н а
Lambert-Beer с т р о г о в з е т о е валиден само в
безкрайно разредени р а з т в о р и . Колкото по-
висока е абсорбцията , т о л к о в а по-големи са
о т к л о н е н и я т а о т закона на Lambert-Beer.
Трябва да се и м а предвид също, че валид­
н о с т т а на т о з и закон предполага монохро-
м а т и ч н а светлина, к о е т о и н с т р у м е н т а л ­
но може да се реализира в най-добрия случай
само приблизително.
При п л а м ъ к о в о ф о т о м е т р и ч н и т е измер­
вания п р и в и д н а т а линейна з а в и с и м о с т е
ограничена в сравнително т е с е н и н т е р в а л
о т о б л а с т т а н а измерване. З а у с т а н о в я в а ­
не н а з а в и с и м о с т т а между г о л е м и н а т а на
измервания сигнал и к о н ц е н т р а ц и я т а на из­
следваното вещество, к о г а т о е налице ли­
нейна зависимост, е д о с т а т ъ ч н а двуточко-
ва калибрация.
Поради в с и ч к и т е т е з и н е с и г у р н о с т и ,
даже и при дадена линейна зависимост се
препоръчва използване н а по-голям брой ка-
либрационни т о ч к и , к а к т о бе посочено по-
горе при п р а в и л а т а за построяване н а прос­
т а и сложна крива.
Ако п о л у ч е н а т а калибрационна крива е
нелинейна (хипербола, сигмоидна), к а к т о е
при имунологичните т е с т о в е , са възможни
с л е д н и т е подходи за линеаризирането й:
• логаритмично-линейно нанасяне, при ко­
е т о к о н ц е н т р а ц и я т а се нанася на абсци-
с а т а в логаритмичен, а сигнала върху ор-
д и н а т а т а в линеен мащаб;
• лог-логаритмична т р а н с ф о р м а ц и я , при
к о я т о се п о с т и г а изправяне в д в а т а края
на сигмоидните криви.
ОПРЕДЕЛЯНЕ ДИАПАЗОНА
НА ИЗМЕРВАНЕ
В идеалния случай д и а п а з о н ъ т н а измерва­
не зап о чва о т г р а н и ц а т а н а о т к р и в а н е
(detection limit) н а а н а л и т и ч н и я м е т о д и се
п р о с т и р а по целия линеен диапазон на ка-
либрационната крива. За линейно трансфор­
мирана или изкривена калибрационна крива
д и а п а з о н ъ т на измерване се ограничава о т
с т е п е н т а на намаление на а н а л и т и ч н а т а
ч у в с т в и т е л н о с т . Определеният след съоб­
разяване на различни фактори действите­
л е н диапазон на измерване е важна харак­
теристика на изследвания а н а л и т и ч е н
метод.
ОБРАБОТКА НА РЕЗУЛТАТИТЕ
Т о ч н а т а крива или изчислен по нея калибра­
ционен ф а к т о р се използва при и з п и т в а н е
на а н а л и т и ч н а т а надеждност или при срав-
487
нение на а н а л и т и ч н и т е методи. При оиен-
ка н а д е ж д н о с т т а н а нови л а б о р а т о р н и
методи, о т т о ч н а т а крива се получава окон­
ч а т е л н о т о оформяне на п р о с т а т а калибра-
ционна крива, необходима за практическо­
т о изпълнение на м е т о д а .
П р о с т а т а (работна) крива и полученият
о т нея калибраиионен ф а к т о р се използват
за изчисление на р е з у л т а т и т е о т изследва­
н е т о с п о м о щ т а н а калибрирания а н а л и т и ­
чен м е т о д . Калибрационниягп фактор се
получава като средната а р и т м е т и ч н а н а
абсорбциите се раздели на съответните и м
концентрации и получените стойности се
осреднят.
Качеството на р а б о т н а т а крива може да
се провери с п о м о щ т а на 20-кратно опреде­
ляне на с р е д н а т а основна калибраиионна
т о ч к а съгласно пра ви ла т а за проверка н а
проста крива.
Предвид съвременните изисквания за на­
деждност на количествените аналитични
методи е оправдано и необходимо да се из­
вършва ежедневно с р а в н е н и е н а а н а л и ­
тичните р е з у л т а т исъс с т а н д а р т н и
проби. За т а з и иел при оиенка аналитична­
т а надеждност или при сравнение н а м е т о ­
д и т е е необходимо да се извърши сравнение
на с т а н д а р т н и т е отклонения с контролни
серуми в продължение н а 20 дни, к а т о
р е з у л т а т и т е се изчисляват по калибраии­
онна крива или въз основа н а т р и к р а т н о
ежедневно определяне на с т а н д а р т н а про­
ба. Не се препоръчва стандартната проба
да се определя еднократно и л и дори двукрат­
но, тъй като случайните грешки повлияват
калибрационната проба по същия н а ч и н ,
както и пробите на болните.
За постигане н а максимална независи­
м о с т о т различните аналитични м е т о д и ,
калибраиията т р я б в а да се извършва, кога­
т о т о в а е възможно, к а к т о бе посочено по-
горе, с добре охарактеризирани и сертифи-
иирани материали. Необходимо е т о ч н о опи­
сание на начина на приготвяне н а калибра-
щюнните разтвори на м я с т о при условия
на постоянна възпроизводимост.
М е т о д и т е , к о и т о са толкова стабилни,
че^е необходима само една единствена ка-
либрация за по-продължителен период о т
време (напр. при имунотурбидиметричния
метод за определяне н а микроалбуминурия
калибраиията е с т а б и л н а за т р и м е с е ч е н
488 —
период), са за предпочитане пред методи,
к о и т о са с н е с т а б и л н а калибраиия и е необ­
ходимо да се рекалибрират за всяка анали­
т и ч н а серия, к о е т о пък създава условия за
увеличаване н а междусерийната вариаиия и
т о за с м е т к а н а с и с т е м н а грешка.
За п о с т и г а н е н а т о ч н а калибраиия не е
д о с т а т ъ ч н о използването н а ч и с т и и доб­
ре охарактеризирани референтни м а т е р и ­
али. К а л и б р а и и я т а н а м е т о д и т е , к о и т о са
във висока с т е п е н зависими о т м а т р и к с а ,
се нуждае о т спеииални допълнителни про­
учвания. Необходими са напр., допълнител­
ни е к с п е р и м е н т и по м е т о д а н а с т а н д а р т ­
н а т а добавка. И з б о р ъ т н а подходящ м а т е ­
риал за калибраиия з а всеки отделен м е т о д
е о т к р и т и ч н о значение за размера н а сис­
т е м н и т е грешки н а а н а л и т и ч н а т а проие-
дура. Например р а з л и к а т а между евентуал­
но използвани калибратори във воден м а т -
рикс и серумния м а т р и к с може да повлияе
крайния р е з у л т а т поради следните причи­
ни: т у р б и д и т е т а н а серума; повърхностно­
т о напрежение, к о е т о би се о т р а з и л о на
п и п е т и р а н е т о ; в з а и м о д е й с т в и е т о между
анализираната съставка и белтъиите и
д р у г и т е с ъ с т а в к и н а м а т р и к с а ; е ф е к т а на
о б е м н а т а фракиия н а б е л т ъ и и т е и други
макромолекули, най-вече липопротеини вър­
ху к о н и е н т р а и и я т а н а изследваната със­
т а в к а и др.
Не се препоръчва ч е с т а с м я н а н а средст­
в а т а за калибраиия при р у т и н н а т а анали­
т и ч н а р а б о т а , т ъ й к а т о т о в а би породило
увеличаване размера н а с и с т е м н и т е греш­
ки. Следва да се осигуряват калибратори от
е д и н и същ п р о и з в о д и т е л и е д и н и същ
партиден номер поне з а 12-месечен период.
При необходимост от нов калибратор, той
трябва да бъде т е с т у в а н с цел да се уста­
нови значимо системно отклонение (bias) на
р е з у л т а т и т е п р и използване на стария и
новия калибратор. З а целта се изследват
р е з у л т а т и н а п а ц и е н т и и контролни м а ­
териали. За верификаиия н а новия калибра­
т о р може да се използва с л е д н а т а схема:
> в продължение н а 10 дни всеки ден се изс­
л е д в а т по 2 проби о т новия калибратор
к а т о н е п о з н а т и в а н а л и т и ч н а т а серия
о т проби (получават се 20 р е з у л т а т а ) ;
> изчислява се средна а р и т м е т и ч н а с т о й ­
н о с т х н а калибратора;
 - сравнява се с посочената о т производи­ с л у ж а т за у с т а н о в я в а н е на определени
т е л я с т о й н о с т и се изчислява разликата. физични или методично-технически свойс­
Ако получената разлика е > 1 SD на ме­ т в а , се означават к а т о технически калиб­
т о д а , т я е с т а т и с т и ч е с к и значима. ратори. Такива са например:
• нагласяване дължините на вълната при
Верификацията на новия калибратор
ф о т о м е т р и т е с дифракционна решетка,
зисква още изследване на т р и проби с кон-
извършващо се с помощта на стъклени
ентрации в ниската, р е ф е р е н т н а т а и ви-
филтри о т холмиев или дидимиев оксид,
ж а т а патологични области, за да се оси-
които се използват к а т о референтен ма­
/ри качеството на р е з у л т а т и т е на паци-
т е р и а л за абсорбция. Абсорбционният
rimume. Тези проби м о г а т да б ъ д а т конт-
спектър на фил тр ите о т холмиев диок-
олни серуми, калибратори или проби на па-
сид е при следните дължини на вълната;
иенти с подходяща концентрация. 241,5 п т , 279,4 п т , 333,7 п т , 360,9 п т , 453,2
Особено полезна информация за вида и п т , 536,2 п т и 637,5 п т ;
ачина на калибрация п р е д о с т а в я т систе-
и т е за външна оценка на качеството. Опи- • калибрирането на механичните микропи-
п е т и и диспенсери се извършва гравимет-
гьт о т НСВОК показва напр., че лаборато-
рично, при което актуалният обем се по­
ии, които р а б о т я т с едни и същи апара-
лучава к а т о претегленият на точна вез­
ш, методи и реактиви, но използват раз-
на обем на темперирана дестилирана
ични калибратори, са с по-голяма разлика
вода се умножава по корекционен фактор
ежду р е з у л т а т и т е , откол кото други, ко-
за барометричното налягане;
т о при същите условия използват един и
ьщ калибратор. Определено т о в а е един о т • ч и с т и я т галий се използва за установя­
ачините за постигане на по-добра между- ване р а б о т н а т а т е м п е р а т у р а при опре­
абораторна сравнимост на р е з у л т а т и т е . деляне а к т и в н о с т т а на ензими. Тъй к а т о
За получаване на надеждни резултати, ос- ч и с т и я т галий се т о п и при 29,77 0 С, т о
гн м е т о д и ч н а т а калибрация, е о т значе- т а з и е с т е с т в е н а к о н с т а н т а е подходя­
ие и техническата калибрация на апара- ща за установяване на р а б о т н а т а т е м ­
lypama и помощните средства. Техничес- пература. Ако т е р м о с т а т ъ т не показва
а т а калибрация се о т н а с я о т една с т р а н а числена с т о й н о с т 29,77 0С при т о ч к а т а
о техническите модули на м е т о д а , напр. на т о п е н е на галия, а например 31 0 С, т о ­
озатори, т е р м о с т а т и , а о т друга с т р а н а гава неговата скала се пренаглася;
до измервателно-техническите модули, • за броячите на частици м о г а т да се из­
апр. х а р а к т е р и с т и к а т а на ф и л т р и т е на ползват латекс-емулсии с позната кон­
дин ф о т о м е т ъ р . С р е д с т в а т а , к о и т о центрация на ч а с т и ц и т е .

1НИГ011ИС

o u l w c l l JH ( c d ) . Л national u n d e r s t a n d i n g for the d e v e l o p m e n t istry, B o c a Raton, C R C Press, 1 9 8 2 , 3 7 1 - 3 8 9 .

o f reference materials and m e t h o d s for c l i n i c a l c h e m i s t r y - R o s s JW. Control materials and calibration standards. In: Werner
Was hi ng to n, Л Л С С , 1 9 7 8 . M (ed). H a n d b o o k o f clinical chemistry, B o c a Raton, C R C
üitner J, Borth R, B o u t w e l l J H , B r o u g h t o n I ' M G , B o w y e r R C . Press, 1 9 8 2 , 3 5 9 - 3 6 1 .
A p p r o v e d r e c o m m e n d a t i o n o n q u a l i t y c o n t r o l in c l i n i c a l S t a m m U . Standardreferenzmaterialien, kalibriermaterialien und
chemistry. 3. Calibration and control materials. J Clin C h e m s t a n d a r d l ö s u n g e n . In: G r e i l i n g II, G r e s s n e r A M ( e d s ) .
' Clin B i o c h e m , I S , 1 9 8 0 , 8 5 5 - 8 6 0 . Lehrbuch der klinischen c h e m i e und pathobiochemie. Stutgart,
o p e l a n d B E . Calibration and calibration materials. In: Kaplan N e w York, Schattauer, 1 9 8 9 , 1 3 - 1 8 .
L A , P e s c e AJ ( e d s ) . C l i n i c a l c h e m i s t r y : T h e o r y , A n a l y s i s a n d v. B o r o v i c / e n y K - G , v. K l e i n - W i s e n b e r g A , Merten R, Reinauer
correlation, St. L o u i s - T o r o n l o - l ' r i n c c t o n , M o s b y , 1 9 8 4 , 3 1 4 - II. Einführung in der s y s t e m a t i k der qualitätssicherung. In:
:
315. v.Boroviczöny K-G, Merten R, Merten UP (eds).
c i t g e s l'W, M o h r b a c h e r RJ. R e a g e n t s , s p e c i m e n c o l l e c t i o n , Qualitätssicherung im M e d i z i n i s c h e n Laboratorium. Bcrlin-
calibrators, reference materials and standards. In: Werner M Heidelberg-Nevv York, e t c . Springer, 1 9 8 7 , 7 - 5 5 .
(ed). H a n d b o o k o f c l i n i c a l c h e m ist ry, B o c a R a t o n , C R C Press, * • •

1982, 289-335.
Buttner J, Borth R, B o u t w e l l H H , Broughton P. IFCC. A p p r o v e d
a w s o n N S , H a v e n GT. A n a l y t e stability in c o n t r o l s and refer­ r e c o m m e n d a t i o n ( 1 9 7 9 ) o n quality control in clinical c h e m ­
e n c e materials. In: Werner M (ed). H a n d b o o k o f clinical c h e m - istry. Part III. Calibration and control materials. J Clin C h e m

489

Clin Biochcm, 18, 1980, 855-860.
Dati F. Rofcrcncc materials a n d guidelines for standardization
o f methods in laboratoty medicine. In: T h o m a s L (ed). Clini­
cal l a b o r a t o r y d i a g n o s t i c s . F r a n k f u r t / M a i n , T I I - B o o k s
Verlagsgcsellchaft, 1988, 1402-1404.
Garber CC, Carey KN. Evaluation o f methods. In: Kaplan L A ,
Pesce AJ (eds). Clinical Chemistry. St. Louis-Baltimor e t c ,
Mosby Company, 1995, 409-410.
Kcller.H. Klinisch-chemische l a b o r d i a g n o s t i c f u r d i e P r a x i s .
Analyse,Befund, Interpretation. 2 aufl. G . T h i e m e , Sttutgart
№4, 1991.
Passey KB. Quality control for the clinical c h e m i s t r y laboratory.
In: Kaplan L A , Pesce A J (eds). Clinical Chemistry. St.Louis-
Baltimor, M o s b y C o m p a n y , 1995, 3 9 7 - 3 9 8 .
Uldall A. Quality a s s u r a n c e in clinical chemistry. Scand J Clin
L a b Invest, 4 7 , Suppl. 1987, 2 5 .
Westgard J Q , Klcc J G . Quality M a n a g e m e n t . In: Tietz N (ed).i
T e x t b o o k o f Clinical Chemistry, 1986, 5 5 8 - 5 5 9 .
W I I Q . Basics o f quality assurance. G e n e v a : World Health Orga­
nization, 1992, 126-127.

490
 Аналитични принципи
п р и определяне н а
хематологични показатели
Т. Ц в е т к о в а
ЗПРЕДЕЛЯНЕ НА ОСНОВНИТЕ
ХЕМАТОЛОГИЧНИ ПОКАЗАТЕЛИ
Специфични а с п е к т и
3 преданалитичния е т а п
П о д х о д я щ и я т а п т и к о а г у л а п т . Според
препоръките н а ICSH (международен коми-
п е т за с т а н д а р т и з а ц и я 6 х е м а т о л о г и я т а )
i a m o най-подходящ а н т и к о а г у л а н т при
Зземане н а кръв з а определяне броя и раз-
иера н а к р ъ в н и т е к л е т к и беше посочена
^вукалиевата сол н а ЕДТА (К2ЕДТА). Тя е
предпочетена поради п о - е о л я л г а т а й
о а з т в о р ь и п о с т в сравнение с н а т р и е в а -
п а сол. При всички соли н а ЕДТА к л е т к и т е
:е с в и в а т в различна с т е п е н , к о е т о се о т -
зазява н а ц е н т р о ф у Ж н о о п р е д е л е н и я
кематокрит (микрохематокрит).
Поради по-ниското pH н а Na2/K2EДTЛ спря­
но К3ЕДТА, к л е т к и т е се р а з д у в а т , к о е т о
компенсира о с м о л а л и т е т а , индуциращ на­
маляване н а к л е т ъ ч н и я обем. Калибриране-
тю на р а н н и т е модели (все още ползвани у
^ас) електронни броячи з а MCV посредст-
Зом м и к р о х е м а т о к р и т н и т е с т о й н о с т и ,
получени о т кръвни проби с Каз или К2ЕД-
ГА дава приемливи р е з у л т а т и в сравнение
: неприемливите с т о й н о с т и , получени о т
кръвни проби с К3ЕДТА при ползване н а
търговски контролен м а т е р и а л .
Понастоящем с р а з в и т и е т о на техни­
к и т е и с о ф т у е р а , включени в с ъ в р е м е н ­
н и т е а в т о м а т и ч н и а н а л и з а т о р и за
Зроене и осъразмеряване н а к р ъ в н и т е к л е т ­
ви, вкл. и 5 - п а р а м е т р о в о диференциално
Spoene, о т г о в о р ъ т н а в ъ п р о с а о т н о с н о
подходящия а н т и к о а г у л а н т е, ч е В с я к а
зол п а ЕДТА е а д е к в а т е н а н т и к о а г у -
\aiim з а х е м а т о л о г и ч н и анализи.
Т р о м б о ц и т и т е леко проме}1ят с в о я т а
щскоидна в сферична форма при кръв с ЕД-
ГЛ, к о е т о се о т р а з я в а при определяне н а
MPV.
В ъ з д е й с т в и е т о н а ЕДТА върху с т а б и л ­
н о с т т а н а л е в к о ц и т и т е е променлива ве­
личина ( л и м ф о ц и т и т е обикновено са о т ­
носително по-стабилни спрямо неутрофил-
ни г р а н у л о ц и т и и м о н о ц и т и ) , к о я т о е
предвидена и съобразена в софтуерния па­
к е т н а р а з л и ч н и т е а н а л и з а т о р и при гру­
пов анализ н а т е з и к л е т к и .
П о д х о д я щ о т о с ъ о т н о ш е н и е м е ж д у ан­
т и к о а г у л а н т и кръИ. О б е м ъ т н а в з е т а ­
т а кръв т р я б в а да осигури поддържането
на препоръчания концентрационен о б х в а т
за комплексоновата сол КШа)ЕДТА. Молар-
н а т а к о н ц е н т р а ц и я на ЕДТА т р я б в а да бъ­
де в г р а н и ц и т е м е ж д у 4.55±0.85 mmol/1
кръв (1.5 mg/ml). Тъй к а т о концентрация­
т а на ЕДТА повлиява морфологията на не-
у т р о ф и л н и т е гранулоцити, к а ч е с т в о т о на
к р ъ в н а т а н а т р и в к а може да бъде компро­
м е т и р а н о , ако в н и м а н и е т о не е насочено
към осигуряване на необходимото съо тн о ­
шение а н т и к о а г у л а н т / к р ъ в и към спазва­
не на д о п у с т и м и я и н т е р в а л между взема­
н е т о н а к р ъ в т а и п р и г о т в я н е т о на н а т ­
ривката.
П р и к о н ц е н т р а ц и и н а ЕДТА q o 1.50
m g / m l кръв промените в неутрофил-
н а т а морфология с а незначителни
g o I ч а с от вземането н а кръвта. При
в и с о к а к о н ц е н т р а ц и я , още през първия
час н а с т ъ п в а т д о с т а сериозни промени -
загуба на м о с т ч е т а т а между с е г м е н т и т е ,
загуба н а ц и т о п л а з м е н а т а граница и др.
П о в и ш е н а т а к о н ц е н т р а ц и я на ЕДТА е
причина за понижени с т о й н о с т и на ц е н т -
рофужния м и к р о х е м а т о к р и т , к а т о т о в а
намаление е по-силно изразено при К3ЕДТА,
о т к о л к о т о при К2ЕДТА. П р и а в т о л г а т и ч -
н и т е а н а л и з а т о р и MCV н а т р о м б о ц и ­
тите и еритроцитите не се влияе
о т к о н ц е н т р а ц и я н а К 3 ЕДТА g o 10 пъ-
491
т и н а д в ъ з п р и е т а т а с т о й н о с т . При
използване н а ВДЦТА р е з у л т а т и т е зави-
с я т о т т и п а на анализатора.
При използване н а п р е п о р ъ ч а н а т а
к о н ц е н т р а ц и я на К2ЕДТА или К3ЕД1А и
анализ, проведен Aiejkgy 1. и 4. h с л е д Изе-
м а н е н а к р ъ в т а , повечето а в т о р и н е н а -
л т р а т е и я н и ф и к а н т н а р а з л и к а льеЖ-
д у резултати, получени е д в а т а ан-
тикоагуланта.
Ва^кен м о м е н т при вземане на к р ъ в т а е
размесването ü с а н т и к о а г у л а н т а , чрез не-
колкократно (минимум 7-10 п ъ т и ) обръща­
не на е п р у в е т к а т а . В и д ъ т н а използвания
миксер ( в ъ р т я щ или к л а т е щ ) може същес­
т в е н о да повлияе върху с т е п е н т а на раз-
месване на к р ъ в т а с а н т и к о а г у л а н т а (осо­
бено ако е п р у в е т к а т а е препълнена), а о т
т о в а и върху р е з у л т а т и т е (фиг. 29.1).
V v_y
А В
1 реждение върху екрана, изискващо контрол.
Д При оценка а к т и в и р а н е т о н а т р о м б о ц и т и ­
Фиг. 29.1. Варианти на размесване на кръв е ан-
тикоагулант
А и Б - размесването е недостатъчно
В - размесването е много добро, но с риск за хемолиза
на е р и т р о ц и т и т е
Г и Д - много добро размесване
Транспорт, съхранение н а к р ъ в т а и
с т а б и л н о с т н а а н а л и з и т е . Поради раз­
ликите между а н а л и з а т о р и т е , вкл. и меж­
ду р е а к т и в и т е , се препоръчва изследване­
т о на к р ъ в т а да бъде проведено не по-къе-
н о о т 6. h след в з е м а н е т о и. К р ъ в н а т а
а т р и в к а следва да бъде направена най-доб­
ре в интервала между 1. и 2. h, (според еди-
ични автори, максимум до 3. h) след взе-
492
мане н а к р ъ в т а . В някои случаи, при необ­
ходимост, т о в а време би могло да се удъл­
ж и при съхранение н а к р ъ в т а в хладилник,
к а т о с т а б и л н о с т т а на р е з у л т а т и т е о т ­
ново зависи о т вида н а анализатора. Въп­
реки т о в а , н е с е п р е п о р ъ ч в а з а кръвни
н а т р и в к и съхраняване в хладилник повече
о т 24 h. При необходимост о т по-дълго съх­
ранение, специално н а е р и т р о ц и т и т е , се
препоръчва използване н а предназначените
за ц е л т а е п р у в е т к и о т затворената сис­
т е м а за вземане н а кръв, съдържащи лимо­
н е н а киселина + ц и т р а т + д е к с т р о з а -
ACD (acid - citrate - dextrose). ACD-епрувет-
к и т е са два вида - ACÜ-A и ACD-B и се раз­
л и ч а в а т по с ъ о т н о ш е н и е т о спрямо кръв­
т а : при ACD-A, (anhyd. cirtic acid 0. 73 g,
sodium citrate 2.2 g, dextrose 2.45 g, д е с т . H2O
- 100 ml; pH 5.05) т о е 1:5.67, a при ACD-B
(anhyd. citric acid 0.44 g sodium citrate 1.32 g,
dextrose 1.47 g, д е с т . HgO - 100 ml; pH 5.10) -
1:3. Във в з е т а в т о з и вид е п р у в е т к и кръв,
е р и т р о ц и т и т е се з а п а з в а т до 21. ден при
т е м п е р а т у р а между 1 и 6 0С.
Понякога, особено при удължен п р е с т о й
н а к р ъ в т а с а н т и к о а г у л а н т до анализа, се
наблюдава образуване н а т р о м б о ц и т н и аг-
л у т и н а т и или п о л е п в а н е т о им върху лев-
к о ц ш п н а т а п о в ъ р х н о с т . Тези промени са
причина за фалшиво повишен брой н а лев­
к о ц и т и т е и понижен - н а т р о м б о ц и т и т е .
При съмнение з а т а к и в а промени се препо­
ръчва в и з у а л е н к о н т р о л н а к р ъ в н а
н а т р и в к а о т п е р и ф е р н а кръв. При ав­
т о м а т и ч н о броене н а кръвни к л е т к и обик­
новено се п о я в я в а с ъ о т в е т н о т о предуп­
т е in vivo и определянето н а Ь-тромбогло-
булин, фибронектин, т р о м б о ц и т е н р а с т е ­
жен ф а к т о р и др. е необходимо свеждане до
минимум н а т я х н о т о а к т и в и р а н е i n vitro.
Това може да се п о с т и г н е чрез подтискане
образуването н а т р о м б о к с а н или поддър­
ж а н е н а високо ниво н а цикличния AMP в
т р о м б о ц и т и т е . З а т а з и цел се използва
специална смес с рП 5, наречена CTAD (0.11
mol/1 citric acid, 15 mmol/1 theophylline, 3.7
mmol/1 adenosine и 0.198 mmol/1 dipyridamol).
Ha т а б л и ц а 29.1. са представени гранич­
н и т е срокове, до к о и т о най-късно следва да
бъде проведено изследването н а в з е т а с ЕД-
ТА кръв.
а б л и ц а 29.1.1 р а н и ч е н с р о к з а и з в ъ р ш в а н е н а о т д е л н и т е п о к а з а т е л и във в з е т а с ЕДТА кръв при
съхранение н а с т а й н а т е м п е р а т у р а , 22-24 0 С {срокът н а с ъ х р а н е н и е з н а ч и т е л н о вари­
р а според о т д е л н и т е п р о у ч в а н и я )
Показател ПзследВането да с е При по-късно п р о в е ж д а н е н а анализа с е наблюдава
извърши най-късно д о
^УЕ 6 h* забавяне
Кематокрит 24 h* повишение
Кемоглобин 48-72 h мътнина
Брой н а Erys 6 h (24 h) понижение
Брой на Lks 24 h* понижение
Брой на Thr 24 h* (по-добре 12 h) понижение (евентуално повишение поради раздробяване)
Натривка 2h раздуване на е р и т р о ц и т и т е , фрагментиране и други
»а ДКК промени в морфологията (мембраната), дегенерация на
левкоцитите, автолиза
Ретикулоиити 24 h* понижение
върху н а т р и в к а )
При съхранение на 4 0С времето би могло да се увеличи двукратно

•ефереитни иптерВали М е т о д и з а изследВапе н а хематологич-

н и показатели
' е ф е р е н т н и т е граници на хематологични-
i e показатели ( а в т о м а т и ч е н анализ) са Брой н а форлжните е л е м е н т и
ipegcmaßenu на т а б л . 29.2. кръвта

За определяне броя на кръвните клетки се

използват два вида методи:
• А в т о м а т и ч н и м е т о д и с хематологичен
анализатор

' а б л и ц а 29.2. Р е ф е р е н т н и граници н а о с н о в н и т е х е м а т о л о г и ч н и п о к а з а т е л и ( а в т о м а т и ч е н анализ)

Референтни
граници Мерна
Показател Символ
единица
ж м

Еритроцити RBC 4.0-5.4 4.6-6.2 xlO'Vl

•Семоглобин HGB 120-160 140-180 g/1
<ематокрит HCT 0.37-0.44 0.40-0.54 1/1
Преден обем на е р и т р о ц и т а MCV 82-98 П
Предна концентрация на хемоглобин в средния е р и т р о ц и т мен 28-33 Pg
Предна концентрация на хемоглобин в е р и т р о ц и т и т е мене 300-360 g/1
Нирина на е р и т р о ц и т н о т о разпределение RDW 11.60-13.70 %
'етикулоцити: RET 24-84 xlOVl
Громбоцити PLT 140-400 xlOVl
Преден обем на т р о м б о ц и т а MPV 7.80-11.0 n
\евкоцити WBC 3.50-10.5 xlOVl
1иференциално броене:
неутрофили (St + Sg)* NF 2.20-6.50 (51-67%) xlOVl
лимфоцити LY 1.30-3.90 (22-45%) xlOVl
моноцити MO 0.10-1.00 (1-14%) xlOVl
еозинофили EO 0.0-0.50 (0-6%) xlOVl
базофили ВЛ 0.0-0.13 (0-2%) xlOVl
Микроскопски: пръчкояцрепи (St) 0.00-0.50 х 1(Г/1 (0-6%); ссглюппюядрспи (Sg) 2.10-6.40 х l ( f / I (50-60%)
493
• Камерни м е т о д и с бизуално-оптично ко­
личествено определяне
Принципът на а в т о м а т и ч н и т е м е т о д и
е изложен подробно в гл. 23. Хематологич-
н и т е анализатори са включени в основно­
т о оборудване н а клиничните лаборатории
о т всички нива здравни заведения у нас. Не­
зависимо о т т о в а к а м е р н и т е м е т о д и т р я б ­
ва да се познават. Те се използват освен з а
определяне броя на левкоцити и тромбоци-
т и в някои случаи, но и за изброяване н а
еозинофили, базофили, определяне броя н а
к л е т к и и в други биологични т е ч н о с т и -
ликвор, урина, с т а в е н п у н к т а т , плеврална
и перитонеална т е ч н о с т и др. Поради т о ­
ва ще б ъ д а т разгледани основните положе­
ния при прилагане на к а м е р н и т е м е т о д и ,
к о и т о л а б о р а т о р н и я т лекар следва добре
да познава, за да оказва необходимия кон­
трол.
Съгласно препоръките на ICSH (между­
народен к о м и т е т за с т а н д а р т и з а ц и я в хе­
м а т о л о г и я т а ) к а м е р н и я т м е т о д за избро­
яване на е р и т р о ц и т и т р я б в а да бъде изос­
т а в е н поради значителния размер н а ана­
л и т и ч н а т а грешка (определянето на хемог­
лобин и х е м а т о к р и т дава д о с т а т ъ ч н о т о ч ­
на представа за с ъ с т о я н и я на анемия или
полицитемия).
Принцип н а калгернитс Aicmoqu. Кръв­
н и т е клетки (левкоцити, еозинофилни и ба-
зофилни гранулоцити, т р о м б о ц и т и и др.)
се б р о я т в специална камера (с гравирана
мрежа) след разреждане н а к р ъ в т а с подхо­
дящи разтвори.
Необходими пособия. Тук се включват:
• Микроскоп. Брои се на малко увеличение
при с п у с н а т кондензор. З а определяне
броя н а т р о м б о ц и т и т е е необходимо
осигуряване на фазово-контрастен мик­
роскоп/приставка.
• Камера. Използват се различни камери:
камера н а Bürker, Горяев, Türk, T h a n a ,
Fuchs-Rosenthal, Neubauer и др., различа­
ващи се по вида н а г р а в и р а н а т а мрежа.
На фиг. 29. 2. са представени м р е ж и т е н а
най-често предлаганите камери (размер
и обем на к в а д р а т ч е т а т а ) . Познаването
размерите н а к в а д р а т ч е т а т а в о т д е л ­
н и т е видове мрежи и дълбочината на ка­
м е р а т а позволява да бъде изведена фор­
494
м у л а т а з а изчисляване броя н а к л етк и ­
т е в 1 |.il или 1 1.
Лабораторният лекар трябва да проверява пра­
вилността на изчисляване на резултата според
вида на квадратчетата, в които се брои, използ­
ваното разреждане, единиците на представяне и
обемът, към който се отнася клетъчният брой
(в или 1). Източник на грешка може да бъде
прилагането на формула, използвана при камера­
т а на Bürker, за изчисляване на резултата при
друг т и п камера, или несъобразяване с направе­
ното разреждане.
• Пипета. Унас все още с а разпростране­
ни с м е с и т е л н и т е п и п е т и (меланжори)
н а Thoma (за левкоцити - е бяла перла в
р а з ш и р е н и е т о и з а е р и т р о ц и т и - с чер­
в е н а перла). Съгласно п р е п о р ъ к и т е на
ICSH п и п е т и т е т и п Thoma с л е д в а д а
б ъ д а т и з о с т а в е н и п о р а д и неточ­
н о с т т а и л т о г о т о г р е ш к и п р и ра­
бота с т я х и залгенени с пипети
тип Sahli.
Грешки н а к а м е р н и я Aiemog. Камерно­
т о броене н а к р ъ в н и т е к л е т к и е обремене­
но със з н а ч и т е л е н брой грешки. Освен нис­
к а т а п р о и з в о д и т е л н о с т т е и м а т и малка
възпроизводимост н а р е з у л т а т и т е (CV е
10 - 15%). З а о т с т р а н я в а н е н а субективни­
т е грешки и м а значение квалификацията
на персонала и с т р о г о т о спазване н а пра­
в и л а т а з а р а б о т а . Н а т а б л . 29.3 са предс­
т а в е н и н а й - ч е с т и т е и з т о ч н и ц и н а греш­
ки при камерно броене. Посочени са и мер­
к и т е за т я х н о т о о т с т р а н я в а н е .
За о с ъ щ е с т в я в а н е н а р а з р е ж д а н е т о при
броене н а л е в к о ц и т и ( т р о м б о ц и т и ) се пре­
п о р ъ ч в а т п и п е т и т и п Sahli (0.02 ml), а за
р а з р е ж д а щ и я р а з т в о р - фал п и п е т и о т
0.5 ml. Р а з р е ж д а н е т о е 1:26.
Л а б о р а т о р н и я т лекар т р я б в а добре да
познава не само с у б е к т и в н и т е , но и обек­
т и в н и т е , "технически" грешки. При съм­
нение да се прави сравнително изследване
за о т с т р а н я в а н е н а някои о т т я х : фабрич­
н а н е т о ч н о с т н а п и п е т и т е ; н а дълбочина­
т а н а к а м е р а т а ; н еед н ак во ст н а гравюра­
т а н а м р е ж а т а ; "разпределителна грешка"
(капилярен е ф е к т ) - и з т е г л я н е на клетки­
т е периферно в м р е ж а т а поради възникна­
ли сили о т к а п и л я р н о т о п р о с т р а н с т в о
между к а м е р а т а и покривното стъкло;
" с т а т и с т и ч е с к а грешка" - б р о я т се някол­
ко с т о т и ц и к л е т к и , а р е з у л т а т ъ т се о т -
 1mm 0.2 m m 0.05 m m I mm 0.2 m m 0.05 m m 0.25 m m

Камера на Hürker, h = 0.1 mm (1/10 mm) Камера па Neubauer^h = 0.1 mm (1/10 mm)
Размери Размери
Дължина на Повърхност Обем Дължина на Повърхност Обем
страна ( m m ) (mm2) ( m n r = 1 ц1) страна ( m m ) (mm2) ( m n r = 1 ц1)
Цяла мрежа 3 9 0.9 Цяла мрежа 3 9 0.9
Голям квадрат 1 1 0.1
Голям квадрат 1 1 0.1
Среден квадрат в 0.25 0.0625 0.00625
Среден 0.2 0.04 0.004 4-те ъгли (1/4) (1/16) (1/160)
квадрат (1/5) (1/25) (1/250) Среден квадрат в 0.2 0.04 0.004
иентралната част (1/5) (1/25) (1/250)
Малко 0.05 0.0025 0.00025 Малко 0,05 0.0025 0.00025
квадратче (1/20) (1/400) (1/4000) квадратче (1/20) (1/400) (1/4000)

Камера па Fuchs-Rosenthal, h = 0.2 mm (1/5 mm) Камера па Горясв, h = 0.1 mm (1/10 mm)
Размери Размери
Дължина на Повърхност Обем Дължина на Повърхност Обем
страна ( m m ) (mm 2 ) ( m m 1 = 1 ц1) страна ( m m ) (mm2) ( m m 1 = 1 ц1)
Пяла мрежа 4 16 3.2 Среден 0.2 0.04 0.004
Голям квадрат 1 1 0.02 квадрат (1/5) (1/25) (1/250)
Малко 0.05 0.0025 0.00025
Итброяиансто сс извьршна в пялата камера. Клетките в 1 и' се (1/20) (1/400) (1/4000)
квадратче
изчисляват като итброеиите клетки сс делят на 3.2.

Фиг. 29.2. М р е ж а з а броене н а формени е л е м е н т и при р а з л и ч н и т е видове к а м е р и

495
Таблица 29.2. Грешки при камерно броене н а ф о р м е н и т е е л е м е н т и н а к р ъ б т а
Промени ß Мерки з а о т с т р а н я в а н е
Грешка Източник н а грешка броя к л е т к и
накапване в к а м е р а т а без намален грижливо размесване н а р а з р е д е н а т а
Наличие на к л е т к и на
размесване н а с м е с т а кръв преди накапване в б р о и т е л н о т о
купчинки поле н а к а м е р а т а
кръв/разреждаш р а з т в о р
у т а е н о багрило поради увеличен използване н а доброкачествени (след
Броене на примеси
нефилтриран или замър­ ф и л т р и р а н е ) разреждаиш р а з т в о р и
к а т о клетки
сен разреждаш р а з т в о р
А ри тмети ч н а грешка погрешно изчислен увеличен или изчисляване, съобразно вида н а
резултат намален к а м е р а т а и разреждането
"Грешка на п л о ш т а " пропускане или п о в т о р н о намален или д а се спазва и з и с к в а н е т о за последо-
броене н а к в а д р а т , с ъ о т ­ увеличен в а т е л н о броене в с ъ о т в е т н и т е
ветно клетки в мрежата к в а д р а т и и пра в ил от о н а Бюркер
Изброяване на повече наличие н а е р и т р о б л а с т и увеличен д а се направи корекция
левкоиити (не се л и з и р а т о т
разреждашия р а з т в о р )
"Неясно зрително замърсен окуляр или увеличен или грижливо поддържане н а о п т и к а т а
поле" обектив намален
Изброяване на непълна с е д и м е н т а и и я намален преди броене изчакване 1-2 min след
по-малко к л е т к и върху м р е ж а т а напълване н а к а м е р а т а
Липса на нютонови увеличена дълбочина увеличен д а се и з п о л з в а т шлифовани покривни
пръстени (обем) на к а м е р а т а с т ъ к л а и д а се следи з а нютонови
пръстени
Образуване н а съсирек включване н а к л е т к и в намален смесването на к р ъ в т а с разредителя
съсирека д а с т а в а бързо
Нарушено съотноше­ мехури при засмукване н а увеличен п и п е т а т а д а се използва съгласно
ние кръв/разредител разреждашия р а з т в о р правилата
мехури в к р ъ в т а намален в ъ р х ъ т н а п и п е т а т а (Sahü) д а се
държи п о т о п е н в к а п к а т а кръв по
време н а засмукване

нася з а милиарди к л е т к и . т в о р н а Giemsa, к о е т о допринася за разгранича­

Р а з т в о р и т е , к о и т о се и з п о л з в а т з а р а з ­
реждане н а ф о р м е н и т е е л е м е н т и н а кръв­
т а ( л е в к о ц и т и и т р о м б о ц и т и ) п р и визуал-
но-микроскопско броене обикновено с е п р и ­
г о т в я т в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я . Необ­
ходимо е т е д а о т г о в а р я т н а н я к о л к о изис­
квания:
• П р и г о т в я н е т о и м д а с т а в а о т химичес­
ки ч и с т и в е щ е с т в а . И з п о л з в а н а т а з а р а з ­
т в а р я н е т о и м вода д а не съдържа кор-
пускулярни е л е м е н т и , к о и т о б и х а повли­
яли р е з у л т а т а о т и з б р о я в а н е н а к р ъ в н и ­
т е клетки.
• Д а се п р и г о т в я т в м а л к и к о л и ч е с т в а и
д а се с ъ х р а н я в а т п р и п о д х о д я щ и у с л о в и я .
• При използване следва д а с е о т л и в а т м а л ­
ки к о л и ч е с т в а , к о и т о с е и з х в ъ р л я т след
употреба.
Разтвори за разреждане на кръвта при броене
на левкоиити. Най-използваният р а з т в о р е т о з и
на Turk: 500 mmol/1 СН3СООН glac. (20 ml/1) в
дестилирана вода. П р и б а в я т се 2-3 ml 1% р а з т ­
вор на метиленово синьо, генциан виолет или раз-
496
ване н а р а з т в о р а о т б е з ц в е т н и т а к и в а . С р о к ъ т
за съхранение е неограничен, т ъ й к а т о о ц е т н а ­
т а киселина в ъ з п р е п я т с т в а п р о р а с т в а н е н а гъ­
бички, б а к т е р и и и плесени. В к а м е р а т а левкоци­
т и т е се р а з п о з н а в а т и и з б р о я в а т лесно, т ъ й ка­
т о о ц е т н а т а киселина предизвиква хемолиза на
е р и т р о ц и т и т е . При т е з и условия еритробласти-
т е не се л и з и р а т и при е р и т р о б л а с т о з а се включ­
в а т в изброеното количество левкоцити. В т е з и
случаи, след изброяване н а е р и т р о б л а с т и т е в кръв­
н а н а т р и в к а , се прави корекция на левкоцитния
брой, о т ч е т е н в б р о и т е л н а т а камера (вж по-на­
татък).
Разреждащи разтвори за определяне броя на
тромбоцитите. Д о с т ъ п н и за л а б о р а т о р н а т а
п р а к т и к а са следните разтвори:
- р а з т в о р н а Brecher-Cronkite : 96 mmol/1 амони­
ев о к с а л а т (10 g/1) в д е с т и л и р а н а вода;
- р а з т в о р н а Lüdin: новокаинов хидрохлорид (про-
каин) - 73.3 mmol/1 (20 g/1) - във воден р а з т в о р
н а NaCl - 34.2 mmoi/1 (0.2%)
Р а з т в о р и т е , съдържащи прокаин (новокаин) са
за предпочитане, т ъ й к а т о п р о к а и н ъ т е протек­
т о р на т р о м б о ц и т и т е .
Важно изискване е съхраняването на т е з и раз-
 бори 6 хладилник (4-8 0С). О п р е д е л я н е броя н а
2 AJI
о р м е н и т е е л е м е н т и н а кръвта п р и дирек-
т о и з б р о я в а н е в б р о и т е л н а калгера. Избро-
Зането се извършва с п о м о щ т а на микроскоп в
1ределен обем на б р о и т е л н а т а камера. Основ-
jme с т ъ п к и при камерно броене са: разреждане
2 кръвта, папълвапе па броипгелнопго прострап-
тгво на камерата, изброяване на определена
i c m от кальсрата, изчисляване на резултата в
I кръв или друга биологична течност.
Покривното стъкло, ограничаващо простран-
пво о т к а м е р а т а с определен обем т р я б в а т а к а А
1 бъде поставено (чрез леко овлажняване на шли- о 0 L О

О
о 0
ованите краища на к а м е р а т а и п р и т и с к а н е т о о о

О
у към т я х ) , че да се получат п р ъ с т е н и т е н а с О о о о о
0
г
ютон, които са гаранция за спазване на с ъ о т - 0
оО О о0
о п о с
гтния обем. Е р и т р о ц и т и и т р о м б о ц и т и се бро- С 0о
о
т в 80 малки к в а д р а т ч е т а - всички малки квад- е • к • и о

, • •
а т ч е т а без едно в к а м е р а т а на Bürker, а в каме- • •
• • •

Г) •
а т а на Neubauer - 4 правоъгълника (вж. защрихо- о • • • • о
* •

•
аните полета на фиг. 29.2). Левкоцитите се бро- •
о О С 0 0 о
о
0
т в 100 средни к в а д р а т а на к а м е р а т а на Bürker

Ü
о
'
о о О о О О о о о
\и 4 големи к в а д р а т а на к а м е р а т а на Neubauer.
о о
о
З а п олучаване н а н а д е ж д н и р е з у л т а т и
о

с
о о О 10 о

о
ри определяне броя н а к л е т к и т е се препо-

о о
Ü

о о
с о о

о
ь ч в а с п а з в а н е н а с л е д н и т е изисквания: из-
1 о

о
и
С 0
\ е д в а н а т а п о в ъ р х н о с т о т к а м е р а т а д а бъ- Q ' о
О и

|
е д о с т а т ъ ч н а , з а д а се и з б р о я т най-малко О<
0
с) m
02. m •
30 л е в к о ц и т а и н а й - м а л к о 200 т р о м б о ц и -
ш. З а п ъ л н о т а щ е п р и п о м н и м д в е т е п р а -
i u i a н а Bürker, к а т о в п р а к т и к а т а се пол-
За предимно п ъ р в о т о правило:
1. Всички к л е т к и , к о и т о се д о п и р а т или
р е с и ч а т о т две съседни с т р а н и (напр. ля-
а и долна) се б р о я т , а т е з и , к о и т о се допи-
а т или се п р е с и ч а т о т д р у г и т е две (напр.
з р н а и д я с н а ) - н е се б р о я т . О т д в а ъгъла
а к в а д р а т ч е т о , разположени м е ж д у с т р а -
а, к о я т о се брои и т а к и в а , к о я т о не с е
рои с е и з б и р а е д и н и я ( н а п р . г о р н и я л я в
гъл), к а т о к л е т к и т е в него се б р о я т , а т е -
и в другия - н е се б р о я т (фиг. 29.ЗЛ и Б).
1ли н а к р а т к о - б р о я т с с в с и ч к и к л е т
,и, л с Ж а щ и ff к в а д р а т а , к а к т о и р а з -
юлоЖсиитс върху избраните страни
I ъгли нсзависилю д а л и сс пресичат
Li и с с д о п и р а т д о т п х . фиг. 29.3. Броене на к л е т к и т е в квадрадите на
2. Лко над 1/2 о т д а д е н а к л е т к а , к о я т о мрежата
е пресича о т н я к о я о т с т р а н и т е н а квад- Л. Броене в среден квадрат о т камерата на Bürker
а т ч е т о е в ъ т р е в него - т я се брои. Лко Б. Камера на Neubauer - групов квадрат о т 16 малки
овече о т 1/2 о т к л е т к а т а е извън квад- квадратчета. Ивицата, в която се извършва броене
на еритроцити е представена по-тъмно оцветена
а т ч е т о , т я не се брои. З а к л е т к и т е , пре- В.Схема за преместване на квадратите при камерно
ечени о т л и н и и т е т о ч н о наполовина, с е броене
з б и р а т две с т р а н и , при к о и т о т е се бро- • - клетките се броят
т , а при д р у г и т е две - не се б р о я т . о - клетките не се броят
497

Много у д о б н о з а п р а к т и к а т а е п р а ­
вилото, п р е д л о ж е н о о т проф. Й. Тодо­
ров, с п о р е д к о е т о в п о л о в и н а т а о т
к в а д р а т ч е т а т а , у ч а с т в а щ и в броене­
то, с е и з б р о я в а т в с и ч к и /слетки, к о и ­
т о с е д о п и р а т и л и п р е с и ч а т о т че­
т и р и т е с т р а н и и тези, к о и т о с а р а з ­
положени в ъ т р е в к в а д р а т ч е т а т а , а
в другата половина - салю клетките,
които с а в к в а д р а т ч е т а т а без д а с е
допират д о нито една о т четирите
с т р а н и . За да се избегне пропускането или
п о в т а р я н е т о н а някой к в а д р а т о т каме­
р а т а , изброяването се провежда последо­
вателно, к а к т о е показано н а фиг. 29.ЗВ.
Изчисляване на резултата. Ще приведем
няколко примера, за да се разбере л о г и к а т а
на изчисляване:
• Е р и т р о ц и т и (Erys). Не се препоръчва
камерното броене. П р и м е р ъ т да се полз­
ва само к а т о указание за изчисляване съ­
образно обема за броене:
А х 200 х 4000
Erys = = А х 10 0 0 0
(в 1 ц1) 80
А- изброени клетки в 80 малки квадратчета
200 - разреждането на кръвта
1/4000 - обем на един малък кварат (1/20 х 1/20 х
1/10). Във формулата участва реципрочната
стойност 4000/80), за да се приведе резултата
към 1 [д!
80 - броят се клетките в 80 квадратчета
иог^ А
напр. . о л : Erys
л = 480 ^ 480 х 200 х 4000 — =
80
= 4.8 х 106/|.il х 106 = 4.8 х 1012/1
• Левкоцити
Lks = —
А х 26 х 250
= А х 65
(в 1 ц1) 100
А- изброени клетки в 100 средни квадрата
26 - разреждането на кръвта
1/250 - обем на средния квадрат (1/5x1/5 х 1/10).
Във формулата участва реципрочната стойност
(250/100), за да се приведе към 1 |л1
напр., А = 175: Lks = 175 x 65 = 11375 =
= 11. 37 х 103/|л1 х 106 = 11. 37 х 109/1
• Тромбоциши. Разреждането е 1:26. След
разреждане на к р ъ в т а и накапване в бро-
и т е л н а т а камера, последната се п о с т а ­
вя във влажно п е т р и за 30 min.
498
А х 4000 х 2 6
Тромбои,11ти=- =А х 1300 х Ю^/ц! х 10Г,=
80
(в 1 ц1) =А х 1300 х 1071
А- изброени клетки в 80 малки квадратчета
26 - разреждането на кръвта
1/4000 - обем на един малък квадрат (1/20 х 1/20 х
1/10). Във формулата участва реципрочната стой­
ност 4000/80, за да се приведе резултата към 1 ul.
80 - брой изброени квадратчета
напр., А = 205:205 х 1300 х 103/(Л х 106 =
= 266 500 х 109/1
П р и н ц и п ъ т н а м е т о д и т е з а определяне
н а хемоглобин и еритроцитни индекси, са
разгледани подробно в гл. 23. Тук ще б ъ д а т
припомнени някои основни изисквания при
определяне н а х е м а т о к р и т , к а к т о и някои
особености при т ъ л к у в а н е н а р е з у л т а т и ­
т е о т е р и т р о ц и т н и т е показатели.
Определяне н а х е м а т о к р и т н а т а
стойност
Х е м а т о к р и т н а т а с т о й н о с т (Hct) о т р а з я ­
ва о б е м н о т о у ч а с т и е н а ф о р м е н и т е еле­
м е н т и (основно е р и т р о ц и т и т е ) спрямо об­
щия обем н а к р ъ в т а . Нарича се още отно­
с и т е л е н к л е т ъ ч е н обем, е р и т р о ц и т н а
обемна фракция, packed cell volume (PCV).
Ч и с л е н а т а с т о й н о с т н а х е м а т о к р и т а се
изразява к а т о д е с е т и ч н а фракция н а обем
(1/1).
Е к з а к т н о т о съдържание н а определени­
е т о х е м а т о к р и т се о т н а с я за центрофуж-
н и т е м е т о д и . Поради с в о я т а д о с т ъ п н о с т
т е с а получили най-голямо разпростране­
ние. З а определяне н а х е м а т о к р и т а са не­
обходими:
- микрохематокритна центрофуга - най-често се
използва т и п ТИ 11 - 16 000 об/min (18 000 х g),
ТИ 12 - 14 500 об/мин (15 200 х g), ТИ 21 - 12 000
об/min (15 250 х g);
- хепаринизирани, сухи стъклени капилярки с дъл­
жина 50 или 75 mm и диаметър 1 mm;
- специална "паста" (кит) за запушване или плас-
телин.
Техника
Две капилярки (двойна проба) се изпълват с кръв
до 3/4 о т дължината. Напълването с т а в а по ка-
пилярност при хоризонтално положение на тръ­
бичката - директно о т капката след убождане
на пръста или о т флакона с добре размесена ком-

Плазма
Левкоцити
Еритроцити
Фиг. 29.4. О т ч и т а н е на хемокритната с т о й н о с т
(в дадения пример Hct = 0.55)
плексонова кръв. Чрез внимателно завъртване на
т р ъ б и ч к и т е се осигурява к о н т а к т на к р ъ в т а с
хепарина. К р ъ в т а о т в ъ н ш н а т а с т р а н а на капи-
лярките се избърсва. Свободният о т кръв край се
запушва чрез дву- или т р и к р а т н о отвесно "на-
бождане" на т р ъ б и ч к а т а в к и т а . Тръбичките се
п о с т а в я т в с ъ о т в е т н и т е гнезда на ротора. Зат­
вореният к р а й сочи п е р и ф е р и я т а м у , а д р у ­
г и я т - е о р и е и т и р а и къль о с т а п а центро­
ф у г а т а . Тъй к а т о капилярките не м о г а т да се
надписват, номерацията върху р о т о р а т р я б в а
да е в с ъ о т в е т с т в и е с т е з и на пациентите. След­
ва завинтване на уплътнителния диск и з а т в а ­
ряне на капака. Продължителността на центро­
фугиране е 5 min. О т ч и т а н е т о с т а в а посредст­
вом специална изчислителна скала, т ъ й к а т о т р ъ ­
бичките не са градуирани (фиг. 29.4). Капилярка-
т а се поставя върху плъзгач, к а т о основата на
е р и троц и тния с т ъ л б е върху нулевата линия.
Чрез хоризонтално изтегляне на плъзгача капи-
л я р к а т а се придвижва до като менискът на плаз­
мения стълб достигне нивото на 100%, т . е . вър­
ху г о р н а т а ограничителна линия. Линията, коя­
т о минава през границата м е ж у у еритроцит­
н и я и л е в к о ц и т н и я с л о й (не м е ж д у л е в к о ­
ц и т и и п л а з м а ) , определя х е м а т о к р и т н а т а
стойност.
В ъ з п р о и з в о д и м о с т т а н а м е т о д а е око­
ло 1%. П р е д и м с т в о н а ц е н т р о ф у ж н и я ме­
т о д е високата т о ч н о с т и п р о с т о т а на
анализа (без р а з р е ж д а н е н а к р ъ в т а и дирек­
т н о в о л у м е т р и ч н о о т ч и т а н е ) . Измерени­
я т при ц е н т р о ф у г и р а н е х е м а т о к р и т не съ­
о т в е т с т в а н а изчисления по ф о р м у л а т а ,
т ъ й к а т о дори и при м а к с и м а л н о седимен-
т и р а н е м е ж д у е р и т р о ц и т и т е о с т а в а плаз­
м а . К о л и ч е с т в о т о н а в к л ю ч е н а т а (trapped),
о с т а т ъ ч н а плазма в е р и т р о ц и т н и я с т ъ л б
зависи силно о т м о р ф о л о г и я т а н а е р и т р о ­
ц и т и т е (фиг. 29.5). При нормално с ъ с т о я ­
ние н а к л е т к и т е т о е с а м о 2% (0.02) и не
изисква корекция. К о г а т о е р и т р о ц и т и т е
с а "ригидни" поради п р о м е н е н а морфология
- големина или ф о р м а ( с ф е р о ц и т и , сърпок-
л е т ъ ч н и е р и т р о ц и т и , м и к р о ц и т и , макро-
ц и т и и др.), м е ж д у т я х о с т а в а п о - в е ч е
п л а з м а (над 2%), к о е т о е п р и ч н а з а лъжливо
повишен х е м а т о к р и т .
А Б
Фиг. 29.5. Включена ( о с т а т ъ ч н а плазма) в е р и т ­
роцитния стълб (по Urs. Bucher)
Л - "ригифш" еритроцити и относително по-голямо
количество плазмена ч а с т Веритроцитния стълб
Б - нормални "гъвкави" еритроцити и значително по-
малко плазма в еритроцитния стълб
И з т о ч н и ц и н а грешки: 1. При неспазване н а
с ъ о т н о ш е н и е т о к р ъ в / а н т и к о а г у л а н т и из­
лишък н а ЕДТЛ, х е м а т о к р и т ъ т е с малки
с т о й н о с т и ( е р и т р о ц и т и т е се с б р ъ ч к в а т ) .
2. При н е д о с т а т ъ ч н о р а з м е с в а н е н а комп-
л е к с о н о в а т а кръв се п о л у ч а в а т грешни ре­
з у л т а т и - висок х е м а т о к р и т при вземане
н а кръв, п о - б о г а т а н а е р и т р о ц и т и или на­
мален - при вземане н а п о - б о г а т а н а плаз­
м а кръв. 3. Грешни р е з у л т а т и се о т ч и т а т
и при: н е р а в н о м е р н о с т във в ъ т р е ш н и я ди­
а м е т ъ р н а к а п и л я р к и т е (да се п о л з в а т про­
верени т р ъ б и ч к и ) , замърсени, мокри или ло­
шо з а т в о р е н и капилярки. В последния слу­
чай липсва х о р и з о н т а л н о ограничаване н а
з а т в о р е н и я к р а й или и з т и ч а т е р и т р о ц и ­
т и през к и т а . 4. Грешки с а възможни и при
н е с ъ о т в е т с т в а и ш обороти на центрофу­
г а т а или скъсено респ. удължено ц е н т р о ­
фугиране; напр. при по-ниски о б о р о т и или
н е д о с т а т ъ ч н о ц е н т р о ф у г и р а н е се получа­
в а лъжливо по-висок х е м а т о к р и т . Високи­
т е о б о р о т и или д ъ л г о т р а й н о т о ц е н т р о ф у ­
гиране в о д я т до механично или т е р м и ч н о
499

фиг. 29.6. Оптимално време за центрофугиране
при различни стойности на хематокрита (по Urs.
Bucher)
Л - нормален х е м а т о к р и т ( д о с т а т ъ ч н и са 5 min)
Б - висок х е м а т о к р и т (минимално време 8 min)
В - нисък х е м а т о к р и т ( д о с т а т ъ ч н и са 3.5 min)
увреждане на е р и т р о ц и т и т е и с т о в а до
загуба на интрацелуларна т е ч н о с т . У с т а ­
новяването на о п т и м а л н о т о време з а цен­
трофугиране с т а в а чрез изпитване на ед­
на и съща нормална кръв при различно вре­
метраене н а центрофугирането. Препоръч­
ва се с т а н д а р т н о време, к о е т о с с I m i n
повече о т пеобходплюто з а д о с т и г а ­
не п а окопчателния хематокрит п р и
п о р л ш л п а к р ъ в (фиг. 29.6). 5. При висок
е р и т р о ц и т е н брой може да се о т ч е т е лъж­
ливо по-висок х е м а т о к р и т , дори и н а висо-
кооборотна центрофуга. При х е м а т о к р и т
над 0.52 се препоръчва удължаване н а цен­
трофугирането до 8 min. 6. При н е д о с т а ­
т ъ ч н о дълбоко убождане, поради п р и т и с ­
кане на т ъ к а н и т е и постъпване н а т ъ к а н -
на т е ч н о с т с т о й н о с т и т е н а х е м а т о к р и ­
т а са по-ниски. 7. Счупването на т р ъ б и ч ­
к и т е най-често е р е з у л т а т о т в и с о к и т е
обороти. Препоръчва се първоначално за­
въртване на р о т о р а с ръка, к о е т о осигуря­
ва по-плътен к о н т а к т между периферия­
т а му и основата на т р ъ б и ч к и т е . Необхо­
димо е балансирано подреждане н а капиляр-
ките. 8. Грешки при о т ч и т а н е н а х е м а т о к ­
р и т а се получават, ако к р ъ в т а в т р ъ б и ч ­
к а т а е под 2/3 о т д ъ л ж и н а т а и, к а к т о и
при левкоцитоза. В последния случай на гра­
н и ц а т а с е р и т р о ц и т и т е се н а б л ю д а в а
ж ъ л т слой, к о й т о погрешно може да бъде
включен към е р и т р о ц и т и т е . Отчитането
500
на сритроцитния стълб е по-точно, кога­
то капилярката сс поставя срещу светли­
на. С к а л а т а да се гледа отвесно, к о е т о на­
малява г р е ш к а т а о т паралакса. 9. Проме­
н и т е в морфологията на е р и т р о ц и т и т е
може да д о в е д а т до повишен х е м а т о к р и т
поради увеличено количество н а включена­
т а плазма в е р и т р о ц и т н и я с т ъ л б .
Към и н д и р е к т н и т е м е т о д и се о т н а с я т
к о н д у к т о м е т р и ч н и я т м е т о д и изчисленият
х е м а т о к р и т . К о н д у к т о м е т р и я т а е основен
м е т о д при хематологичните броячи (вж гл.
23). Измерването на MCV и общия брой на
е р и т р о ц и т и т е позволява изчисляване н а хе­
м а т о к р и т а : Hct = MCV х Erys. Касае се за т е ­
о р е т и ч н а формула, к а т о определеният по
т о з и начин х е м а т о к р и т зависи не само о т
т о ч н о с т т а на измерването на MCV и Erys,
но и о т други интерфериращи ф а к т о р и - ос-
м о л а р и т е т и рП н а разреждащия разтвор.
О т съществено значение е и калибрирането
на а п а р а т и т е . Изчисленият, наречен ' ч и с т "
х е м а т о к р и т не включва плазма, поради кое­
т о е с около 2% по-нисък спрямо центрофуж-
н о т о определяне. При едновременно ползва­
не на центрофужни и електрони м е т о д и в
дадена лаборатория се препоръчва периодич­
но сравняване и корекция н а центрофужна-
т а с т о й н о с т чрез намаляване с 0.015 (1.5%),
а при х е м а т о к р и т над 0.50 - с 0.03 (3%).
М а те л г а т и ч е с ки п о к а з ат е л и
п а е р и т р о ц и т и т е MCV, МСН, МСНС
П р о м е н и т е в к о н ц е н т р а ц и я т а на хемогло­
бина се с ъ п р о в о ж д а т по принцип о т изме­
нения н а е р и т р о ц и т н и я брой и н а х е м а т о к ­
р и т а . Тъй к а т о при ред заболявания обе­
м ъ т н а о т д е л н и я е р и т р о ц и т или съдържа­
щ и я т се в него хемоглобин силно в а р и р а т
са възможни различни отклонения. Послед­
н и т е м о г а т да се о б х в а н а т количествено
чрез изчисляване н а определени м а т е м а т и ­
чески о т н о ш е н и я между о с н о в н и т е хема-
тологични п а р а м е т р и (фиг. 29.7), к о и т о да­
в а т сведение за: MCV (среден к л е т ъ ч е н
обем), МСН (среден к л е т ъ ч е н хемоглобин) и
МСНС (средна к л е т ъ ч н а хемоглобинова кон­
ц е н т р а ц и я ) и се в к л ю ч в а т в п о н я т и е т о
м а т е м а т и ч е с к и п о к а з а т е л и н а еритроци­
т и т е ( е р и т р о ц и т н и индекси).
 Hb
Hct
Erys
*иг. 29.7. Схема за изчисляване на м а т е м а т и -
!ските показатели на е р и т р о ц и т и т е
Met
; 2. лп.п =
Hb МСИ Hb
; а. миис =
Erys Erys MCV
'рилцип л а изчисляИапс п а м а т о м а -
тческите сритроцитли показатс-
и . И з ч и с л е н и я т а се о с н о в а в а т н а предва-
л т е л н о определени с т о й н о с т и н а хемог-
|)бин, брой н а е р и т р о ц и т и и х е м а т о к р и т .
Важно условие при изчисляване н а м а т е -
а т и ч е с к и т е п о к а з а т е л и е д а се п о л з в а т
тойпости з а еритроцити, получени
а м о е х е м а т о л о г и ч е н б р о я ч . Тъй к а -
.о и з х о д н и т е е р и т р о ц и т н и п о к а з а т е л и с а
зразени з а л и т ъ р , не е т р у д н о д и р е к т н о -
.о извеждане н а и н д е к с и т е . Най-добре т о -
i се онагледява със следния п р и м е р о т из-
\ е д в а н е н а к р ъ в н а п р о б а - H b = 150 g / 1 ,
rys = 5.0 х 1012/1 и H c t = 0.45 1/1:
Cpecjen о б е м п а е р и т р о ц и т и т е
( M e a n c o r p u s c u l a r volume, MCV);
0.45
MCV = = 0.09 x 10
5 . 0 x 1() 12
Подходяща единица за т о з и извънредно малък
»ем е фемтолитъра (П = Ю 1 !). За да се изрази гор-
ия р е з у л т а т във фемтолитър, т р я б в а да се ум-
ажи с Ю15 (0.09 х Ю"12 х 10,r, = 0.09 х 10', = 90 П).
зведена по т о з и начин формулата за изчисление
iMCVe:
Hct (1/1)
MCV (fl) =- x 10'
Erys
a Erys само мпоЖипгслн от A x 10'2 - в случал 5.0)
Cpecjjiio съдър^кание н а х е м о г л о б и и 6
ecjun ("среден") е р и т р о ц и т ( m e a n
corpuscular hemoglobin, MCH).
В горния пример 5.0 x Ю1"2 еритроцити съдържат
общо 150.0 g/1 хемоглобин, а един е р и т р о ц и т
150.0
съдържа: = 30 х 10"12
5.0 х 1012
За толкова малко количество хемоглобин, подхо­
дяща единица е пикограм (pg= lO'^g). Резулта­
т ъ т , изразен по т о з и начин е МСН = 30 pg. Общи­
я т израз на формулата за изчисление е:
H b (g/I)
МСН (pg) =
Erys
(за Erys само множителя от Ах Ю'2- в случая 5.0)
3. Cpecjna к о н ц е н т р а ц и я н а х е м о г л о ­
б и н В е р и т р о ц и т и т е ( m e a n corpuscu­
l a r h e m o g l o b i n c o n c e n t r a t i o n , М С Н С ).
П р е д с т а в л я в а х е м о г л о б и н о в а т а концен­
т р а ц и я в л и т ъ р е р и т р о ц и т н а маса.
Hct
МСНС може да се изчисли о т изходните стой­
ности за МСН и MCV:
MCH(pg)
МСНС (g/l) = х 10 ' или
MCV(fl)
„ Hb/Erys Hb (g/1) 150.0
МСНС (g/1) = — — = = =333 g/1
Hct/Erys Hct (1/1) 0.450
или формулата за изчисление на средната концен­
т р а ц и я на хемоглобина е:
Hb (g/1)
МСНС (g/1) =
Hct (1/1)
М а т е м а т и ч е с к и т е показатели на е р и т ­
р о ц и т и т е м о г а т д а се и з ч и с л я т о т резул­
т а т и , получени с п о м о щ т а н а т р и - и п е т -
п а р а м е т р о в и х е м а т о л о г и ч н и броячи (пос­
л е д н и т е и з м е р в а т и MCV). А н а л и з а т о р и с
над осем п о к а з а т е л и ги о п р е д е л я т а в т о м а ­
тично.
И з т о ч н и ц и н а г р е ш к и . При мануално из­
числяване н е т о ч н о с т т а н а к а м е р н о т о из­
б р о я в а н е н а е р и т р о ц и т и т е се о т р а з я в а
върху р е з у л т а т и т е н а е р и т р о ц и т н и т е по­
к а з а т е л и и до г о ля м а с т е п е н прави опреде­
л я н е т о им безполезно. Е д и н с т в е н о
с т о й н о с т т а н а МСНС е н е з а в и с и м а
о т е р и т р о ц и т н и л б р о й , поради к о е т о
е п о - т о ч е н п о к а з а т е л с п р я м о д р у г и т е ин­
декси. П р о м я н а т а н а МСНС е о т значение
з а д и а г н о з а т а н а х и п о х р о м н и т е анемии, но
з а съжаление н а с т ъ п в а с р а в н и т е л н о късно.
П р и ч и н а т а е, че п о н и ж е н и е т о н а МСН с е
съпровожда и о т намаление н а MCV, в ре­
з у л т а т н а к о е т о МСНС о с т а в а непроме­
нен (фиг. 29.8). Поради т о в а изчисляване-
501
 р о ц и т и т е п р е д о с т а в я т две възможности:
1. Характеризиране и разграничаване на
анемиите и 2. Контрол върху еритроцит­
ни п а р а м е т р и (Hb, Erys, Met).

мен = мен i Д и ф е р е н ц и р а н е н а а н е л т и т е . Анемии­

MCV = MCV i т е се съпровождат най-често о т промяна
мене = мене =
в обема на е р и т р о ц и т и т е и/или на хемог­
1
i
лобиновото им съдържание. Например при
нарушено образуване на хемоглобин (недо­
имък на желязо), съдържанието му в о т ­
д е л н и т е е р и т р о ц и т и намалява, а много
ч е с т о т е с т а в а т и по-малки (микроцити).
Израз на т е з и промени са намалените стой­
н о с т и на М е н и M e v (вж фиг. 29.8). Налице
мен i мен ü е микроцитна хипохромна анемия. Поява­
Mev = Mev I т а на микроцити при желязонедоимъчни
мене i мене i анемии се обяснява с едно допълнително де­
ление на еритроидните клетки. Понижени­
фиг. 29.8. Поява на микроцитни хипохромни
еритроцити при смутено хемоглобинообразува- е т о на M e v може да бъде р е з у л т а т и о т
не (по O.W. Assendelft) загуба на клетъчна т е ч н о с т при увеличе­
теглилката означава МСИ (рд) на плазмена концентрация н а общия бел­
А - Едновременно намаление на хемоглобиновото съдър­ т ъ к или глюкозата (екстремно обезводня­
жание и на клетъчния обем ване на п а ц и е н т и т е , захарен диабет), или
Б - По-нататъшно намаление на хемоглобиновото съ­
държание без промяна в клетъчния обем при промени в е р и т р о ц и т н а т а мембрана.
В - Намаление на хемоглобиновото съдържание при неп­ МСН
Формулата МСНС = = показва т я с н а т а
роменен обем на еритроиитите MCV q
Г - По-нататъшно понижение на хемоглобиновото съ­ зависимост
държание при едновременно намаление на клетъчния
между о т д е л н и т е индекси (фиг. 29.9). По­
обем

т о на мен и MCV е по-важно, но при усло­ MCV (11)

вие, че изброяването на е р и т р о ц и т и т е е м е н е (к/1) =
точно.
Грешките п р и а п а р а т н о излгерване
на математическите еритроцитни
МСН (рц) х 10
MCV (П) '

130
1ш
1 90 60
Норма
показатели e a свързани е качеството
н а ползваните разтвори. Фалшиво
н и с к и р е з у л т а т и з а MCV с е п о л у ч а ­ Хипер-
хромия
в а т п р и висок о с м о л а л и т е т респ. pH
н а разреЖдащил разтвор, а ф а л ш и в о 43 330

о
високи - п р и р а з т в о р с н и с к и о с м о л а ­ Cß
—
л и т е т и л и pH. Ф а л ш и в о в и с о к и с а ре­ Нормо-
X хромия
з у л т а т и т е з а MCV п р и с л е д и о т х и - и 30 330 500
похлорид и л и д р у г д е т е р г е н т , о с т а ­ Норма 230 Норма

Оо
нали в систелшта след почистване­
то й, а също и п р и н а л и ч и е н а с т у д о - Хипо-
ви аглутинини, слепващи еритроци­ хромия
тите. Ф а л ш и в о п о в и ш е н и с т о й н о с ­ 20 220 330
т и з а МСН се п о л у ч а в а т п р и х и п е р -
Макро- Нормо- Ммкро-
липелгия и л и л е в к о ц и т о з а ( н а д 66.0 х ЦИТ ЦНТ
ЦИТ
109/1), п о р а д и н е с п е ц и ф и ч н а а б с о р б -
ция.
Фиг. 29.9. Взаимоотношения между МСНС, MCV
Математическите показатели на е р и т - и МСН (по Urs. Bücher)
502
Зишението н а МСН (хиперхромия) е резул­ ва н а МСН н а хиперхромни, нормохромни и
т а т о т увеличен обем (макроцитоза). Уве­ хипохромни е в ъ з п р и е т о , но и м а по-огра-
л и ч е н и е т о н а М С Н С в и н а г и с е дълЛси ничено клинично значение в сравнение с
н а najiia^ieii к л е т ъ ч е н обель и н и к о г а МСНС. Диференцирането на някои анемии
не е р е з у л т а т о т абсолютно повише­ на б а з а т а на м а т е м а т и ч е с к и т е еритро-
ние н а хелюглобиновото съдържание ц и т н и показатели е представено в т а б л .
н а е р и т р о ц и т и т е . Преобладава с т а н о - 29.5.
Зището, че и з р а з ъ т хиперхромия се о т н а -
: я за с р е д н о т о съдържание н а хемоглобин Математическите еритроцитни
3 един е р и т р о и и т (МСН), а не з а хемогло- показатели к а т о средство з а конт­
З и н о в а т а к о н и е н т р а и и я (МСНС). Съобра- рол н а основните хелштологични па­
»кенията з а запазване н а израза хиперхро­ р а м е т р и . Някои случайни или с и с т е м н и
мия в п р а к т и к а т а с а две: грешки, д о п у с н а т и при вземане н а к р ъ в т а
I. Широко п о л з в а н о т о у нас и в други с т р а - (напр. дълго с т я г а н е ) или при подготовка
ли п о н я т и е "хиперхромни анемии" е в го- н а п р о б и т е ( н е д о с т а т ъ ч н о размесване н а
зеказания смисъл. В а н г л и й с к а т а л и т е р а - в з е т а т а кръв), а т а к а също и колебания­
п у р а т е р м и н ъ т "хиперхромия"се о т н а с я т а в плазмения обем, се е л и м и н и р а т при
за МСНС и в м е с т о п о н я т и е т о хиперхром- изчисляването н а индексите. Поради т о в а
^и анемии се ползва определението макро- т е з и индекси в а р и р а т по-малко в сравне­
д и т н и анемии. 2. М а к р о и и т н и т е е р и т р о - ние със с т о й н о с т и т е , о т к о и т о са били из­
д и т и на й -често с ъ д ъ р ж а т повече хемогло- числени. Най-малка е в а р и а ц и я т а на МСНС,
Зин о т к о л к о т о н о р м о и и т и т е , въпреки ос- к о е т о обуславя з н а ч е н и е т о му за к о н т р о л
н а в а щ а т а в нормални граниии хемоглоби- върху определянето н а хемоглобин и хема-
гюва к о н и е н т р а и и я (вж фиг, 29.9 ляво). В т о к р и т . Тъй к а т о МСНС се повишава по
н а т р и в к и т е т е и з г л е ж д а т хиперхромни по- изключение, при високи с т о й н о с т и е необ­
зади п о - г о л я м а т а дебелина н а к л е т к и т е . ходима проверка. Най-вероятно се касае за
лъжливо повишен хемоглобин ( м ъ т н и н и )
П р о м е н и т е в м а т е м а т и ч е с к и т е показа-
или фалшиво нисък х е м а т о к р и т ( и з т и ч а ­
пели н а е р и т р о и и т и т е в п о в е ч е т о случаи
не на кръв при непълно запушване на капи-
: ъ п р о в о ж д а т някои о т к л о н е н и я в т я х н а -
л я р к а т а ) . Намалението н а МСНС при изс­
л а морфологична х а р а к т е р и с т и к а ( т а б л .
ледване на нормална к о н т р о л н а кръв съгцо
29.4).
е сигнал за е в е н т у а л н а грешка в определя­
Г а б л и ц а 29.4. Промени в математическите по­ н е т о н а хемоглобина, т ъ й к а т о при нор­
казатели на е р и т р о и и т и т е при някои отклоне­ мален хемоглобин с т о й н о с т и т е н а МСНС
ния в морфологията им винаги са в референтни граници.
""•-•-^Показател О т друга с т р а н а , п л а у з и б и л и т е т ъ т на
MCV МСН МСНС
Erys -— м а т е м а т и ч е с к и т е е р и т р о ц и т н и индекси
Нормоцитиза -
=
- съидо м о ж е д а се провери. Те п о л у ч а в а т
Макроцитоза t Т = п р и б л и зи тел н а оценка при изследване н а
Мегалоцитоза Т Т —
е р и т р о ц и т н а т а морфология. Това позволя­
Микроцитоза -
ва ползване н а к р ъ в н и т е н а т р и в к и за кон­
i i
Микросфероцитоза =/| (слабо) т р о л върху изчислените м а т е м а т и ч е с к и
1 -/1
Елиптоцитоза - - -
показатели.
Анизоцитоза — -
Пойкилоцитоза - - -
Морфологии н а кръвните к л е т к и
Хипохромия i i -/1
Анулоцитоза i il 1 За оценка н а морфологията н а формените
Таргетни клетки -/т i 1 е л е м е н т и н а к р ъ в т а се използват два вида
Забележка: знак з а р а в е н с т в о - с т о й н о с т и в референ- методи:
ттоя интервал, с т р е л к а - промени в с ъ о т в е т н а т а
Посока, вълнообразен знак - около. >> А в т о м а т и ч н и м е т о д и . Анализира се ин­
ф о р м а ц и я т а , получена о т хематологич-
Диференцирането н а а н е м и и т е въз осно­ н и т е анализатори (вж гл. 23).
503
g T a ß l m ^ a .29.5. Диференциране н а а н е м и и т е на б а з а т а н а основните м а т е м а т и ч е с к и е р и т р о ц и т н и индекси (по Urs. Bucher в наша модификация)
Тип н а Еритроцитни Аниз о - / по йкило - Заболяване К о с т е н мозък - е р и т р о п о е з а
анемията индекси цитоза Ретикулоцити

Хипохромна МСУФ ( +) желязодефицитна анемия, нормо- до хипоплазия, ретикулоцитиФ

микроцитна МСНФ (-) анемия при хронични инфекции нормо- до хипоплазия, ретикулоцитиФ
МСНС=/Ф и неоплазии,
(+) таласемия, някои хемолитични анемии хиперп \азия. ретикулоцити'^ 4

Хиперхромна MCVt (+) мегалобластни анемии (вит. Bj, или мегалобластна хиперплазия,
макроцитна МСНФ (мегалоцити) фолатен недоимък) (неефективна еритропоеза)

мснс = (+) първична придобита сидеро- хиперплазия, ринг форми,

бластна анемия, миелодис- ретикулоцитиФ, неефективна
пластичен синдром (по-рядко) еритропоеза

Нормохромна MCV = (+) някои хемолитични анемии хиперплазия, ретикулоцити^

нормоцитна мсн = (овалоцити)
мене = (+) наследствена сидеробластна нормо- до хиперплазия, ринг ери-
(диморфизъм) анемия тробласти, ретикулоцити = /I 4
миелодиспластичен синдром хипоплазия, ретикулоцити^ 4
апластична анемия хипоплазия, ретикулоцити^

(+ + ) остеомиелофиброза (МСНФ), хиперплазия, след т о в а фиброзна

(дакроцити) ретилулоцитиФ

анемия при неоплазии и хрон. нормо- до лека хипоплазия,

инфекции инфекции ретикулоцити =
( + ) - наличие; (-) - отсъствие; ( = ) - референтен интервал
 Визуално-микроскопски методи. Микрос-
копското изследване на добре приготве­
на и оцветена кръвна н а т р и в к а може да
даде б о г а т а информация, особено при
д о с т а т ъ ч е н о п и т на лабораторния спе­
циалист. Диференциалното броене н а
левкоцитите (ДКК) е основен м е т о д в ди­
а г н о с т и к а т а на ред заболявания: инфек­
циозни, злокачествени, хематологични,
к а к т о и при токсични и др. въздейст­
вия, увреждащи к р ъ в о т в о р н а т а систе­
ма.
т
ануално п р и г о т в я н е н а к р ъ в н и н а т -
ußku. Лабораторният лекар следва да кон-
ролира с особено внимание и да има висо-
I изисквания във всички е т а п и на пригот-
ше на кръвните натривки, вкл. и по о т -
зшение к а ч е с т в о т о на използваните по-
•бия, фиксатори, о ц в е т и т е л н и бои и др.
е случайно ' кръвната натривка се възп-
ю м а като паспорт за клиничния лабо-
гнпг\ Основните е т а п и при приготвяне
i н а т р и в к и т е са т р и : р а з с т и л а н о н а
оъвта, ф и к с и р а н о и оцИотяИано. Иай-
добри р е з у л т а т и се получават при изслед­
ване на кръв, в з е т а без антикоагулант. Из­
ползва се и кръв с К З / К 2 Е Д Т Л .
Р а з с т и л а н о . Направеното по правилата
(фиг. 29.10) разстилане на капка кръв върху пред­
м е т н о т о стъкло осигурява равномерно разпре­
деление на клетките в натривката и запазване
на с т р у к т у р н и т е им особености.
Качествено направената кръвна натривка е с
по-дебела начална част, равномерно разстлана
(без вълнообразни надебелявания), изтънява пос­
тепенно, к а т о завършва четковидно; т я трябва
да обхваща около 3/4 о т дължината на предмет­
н о т о стъкло и краищата ü да о т с т о я т на около
3-4 mm о т ръбовете му.
Ф и к с и р а н о н а н а т р и в к и т е . То има за
цел денатуриране на клетъчните белтъци и при­
лепване на клетките към п р е д м е т н о т о стъкло,
което възпрепятства т я х н о т о отмиване при
следващите процедури. Максил1олиото запазва­
но на морфологията и приЛизнената структу­
ра па клетките е задължително условие при фик­
сирането. Най-добри резултати дава метиловия
алкохол. Фиксирането може да се направи чрез за­
ливане на натривките или чрез потапяне в добре
затворени кювети (хелендалови). Времето за фик-

4 5 >(
Фиг 29.10. Разстилане на кръвна натривка о т капилярна кръв
* добре почистено предметно стъкло се докосва 6 единия си край (на разстояние 10 mm о т ръба) по средната
лпя до свободно изтичаща капка кръв (първата капка се отстранява). При комплексонова кръв, капка о т нея
сд размесване се накапва върху предметното стъкло при същите условия. Предметното стъкло се поставя
•рху масата или се обхващат късите му страни между палеца и срещуположните два пръста на лявата ръка
впката е към показалеца).
-с палеца и показалеца на другата ръка се взема шлифовано и изкосено в двата края предметно стъкло. 1о се
клпавя пред капката.
3 - поставеното пред капката предметно стъкло под ъгъл 30-35" се плъзва леко назад докато се допре до капката
•ъв, при което последната се разстила по капилярност линейно по ръба му. IТосредством плавно и умерено бьрю
ижение напред кръвта се разстила върху предметното стъкло. След т о в а се оставя на въздух за изсушаване.
505

Багрилно в е щ е с т О о
pH
няпменобание Цвят
син алкално
Метиленблау
син алкално
Азур
оранжебочербен кисело
Еозин
сиране е различно при о т д е л н и т е фиксатори: м е -
т а н о л - 3 5 min; а ц е т о н - 5 min; а б с о л ю т е н
е т а н о л - 20-30 min; д е н а т у р и р а н с п и р т - 10-
15 min.
О ц в е т я в а н е . О п и т и т е да бъде предложено
подходящо багрило, к о е т о да осигури възможно
най-много морфологични подробности и м а т дъл­
га история. П ъ р в и я т удачен м е т о д е предложен
о т Ehrlich през 1880 г. - т а к а нар. "триацидна
смес". През 1891 год. Д. Л. Романовский е предло­
жил оцветителен разтвор на метиленово синьо и
еозин, к а т о по-късно се установило, че с м е с т а
о т двете бои при престой образува ново в е щ е с т ­
во - азур). Тази смес с т а в а база на различни моди­
фикации; noGiemsa, May-Griinwald, Jcnncr, Wright,
Leishman и gp. Тези модификации се о с н о в а в а т
върху прилагането н а смеси о т кисели и алкални
бои. Във воден р а з т в о р б о и т е се дисоциират и
т я х н а т а химически а к т и в н а ч а с т , в зависимост
о т p H - с т о й н о с т и т е , влиза в с т а б и л н а връзка с
клетъчни с т р у к т у р и , к о и т о и м а т противополо­
жен електрически заряд и предизвикват характер­
н о т о им оцветяване. Алкалните о ц в е т и т е л и (си­
н и - Methylgrün, Methylazur, Methylenblau или чер­
в е н и - red Руronin) се с в ъ р з в а т с клетъчни обра­
зувания, ч и я т о реакция е кисела (нуклеинови кисе­
лини). Такива с т р у к т у р и се н а р и ч а т базофи^ти.
Киселите о ц в е т и т е л и ( ч е р в е н и - Eosin, Orange
или Fuchsin), реагират с алкални или по-малко ки­
сели клетъчни структури, които се наричат а ц и -
дофилнимьхх еозинофилни, т ъ й к а т о е о з и н ъ т е
най-предпочитаната кисела боя. При употреба на
оцветителна смес о т алкални и кисели бои се по­
лучава многоцветно или п а н о п т и ч н о о ц в е т я ­
в а н е н а к л е т к и т е . Принципът н а оцветяване
на кръвните натривки е о т р а з е н в т а б л и ц а 29.6.
Багрилната смес по May-Grünwald е метиленблау-
еозинат, разтворена в м е т а н о л (1.0 g суха смес
се р а з т в а р я в 100 ml м е т а н о л при загряване до
60 0С на водна баня; д о б а в я т се 50 ml глицерин и
след охлаждане р а з т в о р ъ т се филтрира). Тази оц­
в е т и т е л н а смес едновременно фиксира и о ц в е т я ­
ва, но т ъ й к а т о морфологичните особености н а
кръвните клетки не са диференцирани ясно, не се
прилага за самостоятелно оцветяване.
О ц в е т и т е л н а т а смес по Романовский-Giemsa
включва еозин, метиленблау и азур II. Последни­
я т лесно се окислява при по дълго съприкоснове­
ние с въздух. Оцветителният разтвор се приготвя
506
ОцОетяОани ч а с т и н а к л е т к и т е
pH Клетъчии с т р у к т у р и
кисело (базофилия) РНК: ц и т о п л а з м а нуклоли
кисело ДНК: клетъчни ядра, първични,
(метахромазия) азурни гранули
алкално (оксифилия) хемоглобин, еозинофилни гранули
чрез р а з т в а р я н е н а 1.52 g суха багрилна смес по
Giemsa в 100 g глицерин. С м е с т а се о с т а в я в про­
дължение н а 3 h на водна баня при т е м п е р а т у р а
56 0С. П р и б а в я т се 100 ml м е т а н о л . След 3-5 дне­
вен п р е с т о й н а с т а й н а т е м п е р а т у р а и филтри­
ране е г о т о в за у п о т р е б а .
О ц в е т и т е л н и т е разтвори се предлагат и в го­
т о в и опаковки с различен обем.
Оцветяване на кръвни натривки по Рома­
новский-Giemsa. Ползва с е п р я с н о п р и г о т ­
вен р а б о т е н о ц в е т и т е л е н р а з т в о р : 1-2 кап­
ки р а з т в о р в 1 ml н е у т р а л н а (буферирана) дести­
лирана вода. О п т и м а л н о т о съотношение между
т я х се определя чрез и з п и т в а н е н а в с е к и ново-
доставен търговски о б р а з е ц : о т нат­
ривки се о ц в е т я в а т при различни комбинации о т
к о н ц е н т р а ц и я и време и се избира най-сполучли­
вата.
Препоръчва се багрилото да бъде между 1 и 3
капки н а 1 ml д е с т и л и р а н а вода, а продължител­
н о с т т а н а о ц в е т я в а н е - между 15 и 40 min. Добре
о ц в е т е н а т а н а т р и в к а макроскопски има т ъ м н о
малиновочервен ц в я т . М е т и л е н о в о т о синьо оц­
в е т я в а в синьо клетъчни с т р у к т у р и , съдържащи
РПК. Азур II дава м е т а х р о м а т и ч н о оцветяване и
определени клетъчни е л е м е н т и изглеждат черве-
новиолетово, въпреки че багрилото е синьо. Еози­
н ъ т о ц в е т я в а в червено у ч а с т ъ ц и в к л е т к и с ал­
кална реакция.
Техника на оцветяване: изсушени и фикси­
рани н а т р и в к и се п о т а п я т в к ю в е т и с работен
о ц в е т и т е л е н р а з т в о р по Романовский-Giemsa.
При малък брой н а т р и в к и , т е се п о д р е ж д а т вър­
ху м о с т ч е за о ц в е т я в а н е (стъклени пръчки поло­
жени върху д в а т а края н а в а н а т а ) и се заливат
внимателно капка по капка т а к а , че оцветител­
н и я т р а з т в о р да покрие п р е д м е т н о т о стъкло с
1-2 m m слой, без да и з т и ч а по ръбовете му. Боя­
т а се о т м и в а със с т р у я дестилирана вода, а н а т ­
р и в к и т е се н а р е ж д а т н а с т а т и в за сушене, след
к о е т о са г о т о в и за микроскопиране. Еритроци­
т и т е и гранулите на неутрофилните гранулоци
т и по м е т о д а н а Романовский-Giemsa са оцвете­
ни по-слабо.
Иай-доброто паноптично оцветяване
о ц в е т я в а н е т о по Pappenheim се постига
чрез комбинация н а две о т д е л н и оцвети-
Таблица 29.7. П а н о п т и ч н о о ц в е т я в а н е на кръв­
ни н а т р и в к и по Pappenheim
Кювети е Кювети е буфер
оцветителен разтвор ( д е с т . вода)
1).
May-Grünwald
(неразреден разтвор)
2 - 5 min
-
2).
May-Grunwald (разреден
е буфер или д е с т . Н 2 0)
1 - 2 min
х50 ml (I изплакване)
3)^<
Giemsa (разреден е буфер
или д е с т . И,0
10 m i n
^.2x50 ml (II изплакване)
т е л н и смеси - о ц в е т я в а н е по May-Grünwald
и Романовский-Giemsa. Предложено е през
1911 год. и п о н а с т о я щ е м е п р и з н а т о з а без­
спорно най-съвършения м е т о д з а о ц в е т я ­
ване н а кръвни н а т р и в к и .
Р е а к т и в и : 1. О ц в е т и т е л е н р а з т в о р п о
M a y - G r ü n w a l d и 2. П р я с н о п р и г о т в е н о ц в е ­
т и т е л е н р а з т в о р по Романовский-Giemsa.
При голям брой н а т р и в к и се препоръчва оцве­
т я в а н е т о да с т а в а в к ю в е т и по п р и м е р н а т а схе­
ма, представена в т а б л . 29.7. Продължителност­
т а н а о ц в е т я в а н е н а н а т р и в к и т е о т к о с т е н мо­
зък по т а з и схема е с ъ о т в е т н о 4 и 20 min. Кон­
центрацията па о т д е л н и т е разтвори и
времето на оцветяване варират твърде
много, т ъ й к а т о с и л н о з а в и с я т о т к а ч е с т ­
в о т о н а б а г р и л а т а , pH н а в о д а т а , pH н а сре­
д а т а , в к о я т о с е р а б о т и . Това н а л а г а 6 о т ­
д е л н и т е л а б о р а т о р и и п р е д в а р и т е л н о из­
п и т в а н е па о ц в е т я в а н е т о и уточняване п а
н е г о в а т а п р о д ъ л ж и т е л н о с т . В случай, че под-
\ е ж а щ и т е за о ц в е т я в а н е н а т р и в к и са единични,
т е се з а л и в а т в н и м а т е л н о с неразреден о ц в е т и ­
т е л е н р а з т в о р по May-Grünwand (0.5 ml). След 2-3
min се прибавя с ъ щ о т о количество дестилирана
Зода (неутрално pH) или подходящ буфер и чрез
Знимателно движение н а н а т р и в к а т а се размес-
За с багрилото. О с т а в я се 1-3 min. О ц в е т и т е л н и ­
я т р а з т в о р се излива и без да се и з м и в а т , н а т -
з и в к и т е се з а л и в а т с р а б о т е н р а з т в о р н а Рома-
rioöckuü-Giemsa (15-35 min). След о т м и в а н е се су-
juam във вертикално положение върху с т а т и в и .
Необходимо е с п а з в а н е т о н а две основ­
ни и з и с к в а н и я : 1. Р а з р е д е н и я т р а з т в о р н а
3 н а т р у п в а т е д н а в ъ р х у д р у г а ; В) Лко к а п к а ­
омановский-С1етза се прави ежедневно
м и с е с м е н я след о ц в е т я в а н е н а в с е к и 50
- ш т р и в к и и 2. О п т и м а л н о р П н а о ц в е т и ­
т е л н и я р а з т в о р . О ц в е т я в а н е т о не се пра­
в и в п о м е щ е н и е , в к о е т о и м а кисели или ал­
кални изпарения, к а к т о и цигарен дим. При
п о - г о л я м б р о й н а т р и в к и е по-добре използ­
ването на кювети.
При качествено о ц в е т я в а н е клетъчни­
т е к о м п о н е н т и с е б а г р я т к а к т о следва: я д ­
р а т а с а о ц в е т е н и о т червеновиолетово в
различен т о н до т ъ м н о с и н ь о (оксихрома-
т и н ъ т е о ц в е т е н по-светло, а базихрома-
т и н ъ т - п о - т ъ м н о ) , ц и т о п л а з м а т а н а лим-
фоцити и моноцити, плазматични клет­
ки и т е х н и т е по-млади предшественици,
нормални и п а т о л о г и ч н и б л а с т и , н а грану-
л о ц и т н а т а и е р и т р о ц и т н а т а редица е о т
светлосиньо до т ъ м н о с и н ь о оцветена, а
а з у р н и т е гранули в л и м ф о ц и т и и моноци­
т и с а с в е т л о - до пурпурночервени; н е у т р о -
ф и л н и т е гранули с а о ц в е т е н и светловио-
летово, еозинофилните - о т светлокереми-
дено-червено до червено, а б а з о ф и л н и т е гра­
нули - т ъ м н о в и о л е т о в о ; е р и т р о ц и т и т е с е
б а г р я т розово; п о л и х р о м а т о ф и л н и т е е р и т ­
р о ц и т и - синьо-виолетово, а т е л ц а т а н а
Hawell-Jolly - в и о л е т о в о ч е р в е н о .
Източници н а грешки. М о г а т да б ъ д а т
групирани в 4 групи:
1. Г р е ш к и о т л е к а ч е е т в е и и п р е д м е т ­
н и стъ/<ла: П е д о б р е и з м и т и и н е о б е з м а с -
лени с т ъ к л а с а причина з а лоша, неравно­
м е р н а н а т р и в к а с у ч а с т ъ ц и без п р и л е п н а ­
ла кръв (неоцветени области в к р ъ в н а т а
н а т р и в к а ) . С ъ щ и я т е ф е к т се наблюдава и
при докосване н а п о в ъ р х н о с т т а н а с т ъ к ­
л а т а с п р ъ с т и ( п р е д м е т н и т е с т ъ к л а с е дър­
ж а т само по ръбовете),
2, Грешки при приготвяне н а натрив­
к и т е : а ) П р е с т о я л а к о м п л е к с о н о в а кръв.
П р и п р е с т о й н а ЕДТЛ-кръв н а д 3 h, в ц и т о п ­
л а з м а т а н а л е в к о ц и т и т е се п о я в я в а ваку-
о л и з а ц и я . Х е п а р и н и з и р а н а или ц и т р а т н а
к р ъ в не се ползва з а н а т р и в к и , т ъ й к а т о
причинява изместване н а изоелектричния
п у н к т н а к л е т ъ ч н и т е с т р у к т у р и в кисе­
л а т а о б л а с т и у ч а с т ъ ц и , б а г р е щ и с е черве­
но, н а п р . хемоглобин, п о л у ч а в а т с и н к а в
т о н ; б ) Г о л я м а к а п к а кръв. П р и и з т е г л я н е
н а т р и в к а т а с т а в а дебела и к л е т к и т е се
т а н е се р а з с т е л и веднага след н а к а п в а н е ­
т о ü върху с т ъ к л о т о , к р ъ в т а се с г ъ с т я в а
507
 Натривката е напра­
вена но нравилата
Фиг. 29.11. Кръвни н а т р и в к и с различно к а ч е с т в о
Л - „дебела" натривка: клетките изглеждат малки и с б и т и (изтеглянето е много бързо, при ъгъл > 45°)
Б - добре направена натривка: клетките не се допират, централното просветляване е добре представено
В - натривката е много тънка: е р и т р о ц и т и т е изглеждат големи и без централно просветляване (изтегляне­
т о е много бавно, при ъгъл < 30°)
и н а т р и в к а т а с т а в а на п е т н а , г) Непра­
вилно направена натривка (фиг. 29.Ш. Лко
шлифованото стъкло е поставено зад кап­
к а т а , н а т р и в к а т а не се изтегля, а се и з т -
ласкава, в р е з у л т а т н а к о е т о к р ъ в н и т е
клетки са разкъсани и смачкани. При голям
ъгъл между шлифованото и п р е д м е т н о т о
стъкло или много бързо разстилано, н а т ­
р и в к а т а с т а в а дебела, к л е т к и т е с а една
върху друга, е р и т р о ц и т и т е са по-малки, де­
формирани и ч е с т о о б р а з у в а т м о н е т н и
стълбове. В по-дебелите у ч а с т ъ ц и се н а т ­
р у п в а т и повече ли мфоц и т и . При м а л ъ к
ъгъл или бавно изтегляне н а т р и в к а т а с т а ­
ва т ъ н к а , е р и т р о ц и т и т е са силно раздале-
чени, и з г л е ж д а т големи и без ц е н т р а л н о
просветляване. Ако н а т р и в к а т а обхване
с т р а н и ч н и т е ръбове н а с т ъ к л о т о , разпре­
делението на о т д е л н и т е видове левкоцити
е силно неравномерно, т ъ й к а т о капиляр­
н и т е сили и з м е с т в а т по-големите к л е т к и
(моноцити и гранулоцити) към перифери­
я т а , а в с р е д а т а о с т а в а т повече лимфоци­
т и . В дефектно направените натривки
(дълги и дебели, къси и дебели или т ъ н к и ,
вълнообразни или заемагци ц я л о т о пред­
м е т н о стъкло), к л е т к и т е ч е с т о са увреде­
ни и неправилно разпределени. Морфологич­
н а т а оценка н а к л е т к и т е е несигурна. Не­
равномерно и бързо направена натривкайо-
ди до формиране н а стъпаловидни ивици,
508
к а т о много ч е с т о в к р а я н а н а т р и в к а т а се
образува дебел ръб; cj) Нефиксирани натрив­
ки, оставени на открито. Може неволно да
б ъ д а т п р ъ с н а т и с вода, к о е т о води до хе-
молиза, или в случай н а мухи в помещение­
т о - до повреждане н а н а т р и в к и т е .
3. Грешки п р и н е п р а в и л н о и з с у ш с н и и
ф и к с и р а л и н а т р и в к и , а ) При недоста­
т ъ ч н о изсушена н а т р и в к а , о ц в е т и т е л н и ­
я т р а з т в о р не се поглъща изцяло о т кръв­
н и т е к л е т к и ; б) П р я с н о п р и г о т в е н и т е
н а т р и в к и се о ц в е т я в а т в р а м к и т е н а 2 h
или се ф и к с и р а т . Нефиксираните н а т р и в ­
ки, п р е с т о я л и над 24 h придобиват синьо-
сивкав т о н при о ц в е т я в а н е (въздействие
н а кисели пари). При невъзможност за оц­
в е т я в а н е н а н а т р и в к и т е се препоръчва
фиксирането им в напълно безводен м е т а -
нол.
4. Грешки п р и о ц в е т л в а н е : а ) Неправил­
но п р и г о т в е н р а з т в о р - нехомогенен или
грубо разклащан, н е ч и с т и съдове, н е т о ч н а
к о н ц е н т р а ц и я н а основния о ц в е т и т е л е н
р а з т в о р или образуване н а у т а й к а (поради
изпарение н а алкохола, при недобре з а т в о ­
рени ш и ш е т а и к ю в е т и ) , к о я т о симулира
гранулации. У т а й к а се образува при неспаз­
ване н а и з и с к в а н е т о з а накапване н а боя­
т а към в о д а т а / б у ф е р а , и при продължител­
но и интензивно разклащане; б) Неспазва-
• на о п т и м а л н о с ъ о т н о ш е н и е между оц-
т и т е л и д е с т и л и р а н а бода; 6) П р е с т о я л
новен о и в е т и т е л е н р а з т в о р - всички
е т к и , вкл. и е р и т р о и и т и т е с и н е я т ; г )
зестоял работен оцветителен разтвор
\едо оцветяване); д) При кисело pH на раз-
Зора я д р а т а са червени, ш у п л е с т и и н а т -
ißkume р о з о в е я т , а при алкално - я д р а т а
зацапани, г р а н у л и т е в н е у т р о ф и л и т е са
ьмни и н а т р и в к а т а синее. Влиянието н а
I н а о ц в е т и т е л н и я р а з т в о р е показано
е м а т и ч н о н а фиг. 29.12; е) Неспазване н а
лпималното време з а о ц в е т я в а н е : при не-
с т а т ъ ч н о - п р е п а р а т ъ т розовее, при пре-
, в е т я в а н е - синее; ж ) Различна с т а й н а
з м п е р а т у р а в сравнение с т а з и , при коя-
з е проведено т е с т у в а н е т о . з) Дебелина-
а н а н а т р и в к а т а силно повлиява о ц в е т я -
н е т о им. Т ъ н к и т е н а т р и в к и и з и с к в а т
•-кратко о ц в е т я в а н е , о т к о л к о т о дебели-
з; и) При о ц в е т я в а н е н а единични н а т -
1вки, п р е п а р а т ъ т се п о с т а в я т о ч н о хо-
з о н т а л н о , за равномерно разпределение
Оцветяване при
рИ 5.5 рИ 6.8 рИ 8.0
рИ 6.8 - H b - V r -
I
А Б В р а з с т и л а н о т о н а к р ъ в т а (равномер­
иг. 29.12. Влияние н а pH н а оцветителни51 раз-
юр върху о ц в е т я в а н е т о н а хемоглобина, чий-
) изоелектричен п у н к т е при pH 6.8 {по Urs.
xhcr)
ацидофилия, натривките са розовочервсмт (поради
jkomo pH иа оиОотителния разтвор изоелектрични-
1 пункт на хемоглобина е изместен в алкалната об-
itm)
качествено оцветяване, натривките са малиново-
)вени, е р и т р о ц и т и т е се багрят розовочервено
базофилия, натривките са сини, е р и т р о ц и т и т е са
шхроматофилни или синьо оцветени (изоелектрич-
ч т пункт на хемоглобина е в киселата област и
ü реагира базофилно). Подобен ефект се наблюдава
•д хепаринизиране на кръвта поради преместване
щзоелектричнин пункт на клетъчните структури
и киселата област.
н а о ц в е т и т е л н и я р а з т в о р . Ако количест­
в о т о н а о ц в е т и т е л н и я р а з т в о р е малко,
върху н а т р и в к а т а се п о я в я в а т у т а й к и о т
багрилото. Синьо о ц в е т я в а н е н а н а т р и в ­
к и т е ( с б и т ядрен х р о м а т и н , т ъ м н и , груби
гранули и сини е р и т р о ц и т и ) се наблюдава
при дебели н а т р и в к и , дълго оцветяване, не­
д о с т а т ъ ч н о изплакване, високо рП н а оц­
в е т и т е л я , буфера или в о д а т а , с т а р и н а т ­
ривки, к а к т о и при а н т и к о а г у л а н т хепа-
рин в м е с т о ЕДТА. Силно червено о ц в е т я ­
ване н а н а т р и в к и т е (бледо-син, недооцве-
т е н ядрен х р о м а т и н и светлочервени е р и т ­
р о ц и т и ) е р е з у л т а т о т подкисляване, напр.
въздействие н а кисели пари върху о ц вети ­
т е л н и т е р а з т в о р и или буфера. Р а з т в о р и ­
т е т р я б в а да се поднов51т и в д в а т а слу­
чая, при к о н т р о л н а pH. Блядо о ц в е т я в а н е
на я д р а т а , е р и т р о ц и т и т е и гранулите
най-често се дължи или на к р а т к о о ц в е т я ­
ване (не т о л к о в а абсолютно, а по о т н о ш е ­
ние дебелината на н а т р и в к и т е ) , или е ре­
з у л т а т о т и н т е н з и в н о измиване н а баг­
р и л о т о о т к л е т к и т е , к а т о синьо-сивото
о ц в е т я в а н е се превръща в сиво). При невъз­
м о ж н о с т за д о с т а в я н е н а неоцветена н а т ­
ривка, в случай на необходимост, може да
се направи обезцветяване чрез п о с т а в я н е
за 24 h в м е т а н о л и проплакване с дестили­
рана вода до пълно избледняване.
Изследване н а оцветените кръвни
н а т р и в к и . П ъ л н о т о използване на инфор­
м а ц и я т а о т к р ъ в н и т е н а т р и в к и изисква
и з в е с т н а последователност при т я х н а т а
оценка:
>• Макроскопски оглед. Дава п р е д с т а в а за
н о с т , д ъл ж и н а, дебелина, наличие н а
шупли, неоцветени у ч а с т ъ ц и и за оцве­
т я в а н е т о - синее или червенее н а т р и в ­
к а т а ) . П р о в е р я в а т се идентифицираши-
т е данни з а п а ц и е н т а (име, код, д а т а и
др)-
>• М и к р о с к о п и р а н е при слабо увеличение
(100-200 п ъ т и ) : Л. Намира се подходящ
у ч а с т ъ к за микроскопиране и п о - н а т а ­
т ъ ш н а оценка на к л е т к и т е при голямо
увеличение. По правило т о в а поле или
т а к а нар. "идеална" зона е в близост до
о п а ш к а т а ( ч е т ч и ц а т а ) на н а т р и в к а т а ,
т . е . в н е й н а т а в т о р а половина. Тази зо­
н а е "идеална" за морфологична оценка на
509

клетките, т ъ й к а т о 6 т о з и участък
е р и т р о ц и т и т е са разположени единич­
но, не се допират и припокриват и е въз­
можна сигурна оценка н а т я х н а т а голе­
мина. Л е в к о ц и т и т е се р а з г р а н и ч а в а т
много добре, в и ж д а т се определени де­
тайли в с т р у к т у р а т а на я д р о т о и ци-
топлазмата. Натривки, к о и т о л е
отговарят н а критериите з а к а
чествено о ц в е т я в а н е в о д я т н е с а м о
д о з а г у б а н а време, н о и л ю г а т д а
бъдат п р и ч и н а з а г р е ш н а и н т е р п ­
р е т а ц и я . Б. Отбелязва се разпределени­
е т о на е р и т р о ц и т и т е : а г р е г а т и , аглу-
т и н а т и , м о н е т и стълбове (фиг. 29.13).
Г. Може да се направи ориентировъчна
оценка за броя на л е в к о ц и т и т е и т р о м ­
б о ц и т и т е (окуляр 10х и обектив 40х): при
1-2 левкоцита на зрително поле броят им е око­
ло референтния интервал, при 3-4 - между 11-20
х 109/1, при 5-6 - 20-50 х 109/1, при 10-15 - над 50
х 109/1; при един левкоцит на две зрителни поле­
т а е налице левкопения -1-2 х 109/1; при 1 левко­
цит на 4 полета - под 1 х 109/1; при 30-60 тром-
боцита броят им е в референтната област, при
75-125 тромбоцити - над 500 х 109/1, при 10-15 -
50 х 109/1 и при 2-3 тромбоцити - под 10 х 109/1.
Фиг. 29.13. „Монетни" стълбове (А) и аглутина­
ция на еритроцити (Б) в натривка о т периферна
кръв
> Микроскопиране при голямо увеличение
(обектив ЮОх, имерсия). А. Оценка н а
е р и т р о ц и т и т е : големина (сравнява се с
MCV), форма и оцветяване - съдържание
на хемоглобин, к о е т о се сравнява с МСН
и МСНС, включвания. Прави се т е к с т у ­
ално описание и с т е п е н н а оценка. Б .
Оценка на т р о м б о ц и т и т е : разпределе­
ние ( а г р е г а т и ) , големина и форма. В.
Оценка на левкоцитите: процентно раз-
пределени0 след диференциране на 100 или
200 клетки, морфологични и количестве-
510
ни особености н а о т д е л н и т е редове, на­
личие н а п а т о л о г и ч н и к л е т к и . Поради
р а з л и ч н а т а си специфична маса, поради
сцеплението с п р е д м е т н о т о стъкло и
някои индивидуални особености при из­
т е г л я н е н а к а п к а т а кръв, о т д е л н и т е ви­
дове левкоцити се р а з п о л а г а т т в ъ р д е не­
равномерно в к р ъ в н а т а н а т р и в к а : гра-
нулоцити - по ръба н а н а т р и в к а т а , мо-
ноцити - в началото и в опашката -
" ч е т ч и ц а т а " , а лимфоцити - в с р е д н а т а
ч а с т . За р е а л н о т о диференциране на о т ­
д е л н и т е т и п о в е левкоцити и н а точно­
т о (възпроизводимо) съотношение меж­
ду т я х се препоръчва и з б р о я в а н е т о да
се извършва по к л а с и ч е с к а т а схема на
Schilling (фиг. 29.14): и з б р о я в а т се по 25
к л е т к и в 4 п о л е т а , или по 50 к л е т к и в
две успоредни ивици, обхваидаищ ц я л а т а
ширина н а н а т р и в к а т а и перпендику­
лярни н а д ъ л г а т а ü ос.
Н а й - т р у д н о е р а з г р а н и ч а в а н е т о н а ле-
костепенни патологични състояния о т
физиологичната вариация н а е р и т р о ц и т и ­
т е . При д и а г н о с т и ч н о в а ж н и находки се
провежда броене н а п а т о л о г и ч н и т е форми
Фиг. 29.14. Правила при диференциране на левко­
цитите
А -по Schilling: изброяване по 25 (50) к л е т к и в 4 полета
(4 меандри)
Б - по Schilling: изброяване в два големи меандра по 50
(100) к л е т к и
В - no Dacie: изброяване в две успоредни ивици по 50
(100) к л е т к и (избягват се с р е д а т а и к р а и щ а т а ма нат­
ривката)
 н а 500 или 1000 к л е т к и и т е х н и я т брой с е 1. Една и съща к л е т к а не се брои повторно.
изчислява в п р о и е н т или промил. По т о з и 2. Поради неравномерното разпределение на клет­
начин се улеснява о и е н к а т а з а наличие н а к и т е се брои в няколко участъка, осо бено при
б о л е с т е н проиес (напр. к о л и ч е с т в о т о н а левкоцитоза.
ф р а г м е н т о и и т и т е насо ч в а з а хемолиза о т 3. Увредените клетки не се броят. Наличие на гум-
механично увреждане н а е р и т р о и и т и т е , прехтови сенки (в голям брой т е се о т ч и т а т ) .
б р о я т н а базофилно п у н к т и р а н и т е е р и т ­ 4. Пелевкоцитните ядросъдържащи клетки (ерит­
робласти и мегакариоцитни ядра) се б р о я т о т ­
р о ц и т и - з а оловно о т р а в я н е и т . н . ) .
делно (еритробласти на 100 левкоцита).
Всички я д р о с ъ д ъ р ж а щ и н е л е в к о ц и т -
5. Всички абнормни левкоцити се р е г и с т р и р а т и
ни к л е т к и ( е р и т р о б л а с т и , м е г а л о б л а с т и ,
изразяват процентно.
м е г а к а р и о ц и т н и я д р а ) се б р о я т о т д е л н о и
се и з р а з я в а т н а 100 л е в к о ц и т а . При брой Т о ч н о с т н а д и ф е р е н ц и р а н е т о : Дифе­
н а т е з и к л е т к и н а д 5/100 л е в к о ц и т а се п р а ­ р е н ц и р а н е т о н а о т д е л н и т е к л е т к и в качес­
ви корекция н а л е в к о ц и т н и я брой, т ъ й к а ­ т в е н и и добре н а п р а в е н и н а т р и в к и по п р а ­
т о т е с а включени в него: вило н е е т р у д н о . Р а з л и к а т а в и д е н т и ф и ­
ц и р а н е т о н а определени к л е т к и м е ж д у раз­
Коригиран = левкоцити (х 109/1) ,
л и ч н и и з с л е д о в а т е л и н е н а д х в ъ р л я 1%.
[d j брой 100 + еритробласти
Е д и н с т в е н о р а з г р а н и ч а в а н е т о м е ж д у пръч-
напр. при левкоцити 9 х lOVl, 25 еритробласти при коядрените и сегментоядрените неутро-
изброяване на 100 левкоцита о т н а т р и в к а т а ко­ фили п о к а з в а н е с и г у р н о с т до 5%.
ригираният брой е: С повишаване броя на диференцираните клет­
100 ки грешката при диференциране намалява. В табл.
Lks = 9 = 7. 2 х 1071
125 29.8 е представена 95%-та област на брой клет­
ки о т даден вид в зависимост о т общия брой на
Техника н а диференциране н а левко­ диференцираните левкоцити, предложена през
цитите. Диференцирането на левкоцити­ 1959 година о т Rumke. Например при 6% о т да­
т е се п р е д с т а в я к а т о п р о ц е н т н а ч е с т о т а ден клетъчен вид, д е й с т в и т е л н и я т брой е между
2-13%, ако са изброени 100 клетки; между 3-11%
или определен и н д и р е к т н о в а б с о л ю т е н брой
) {лтого по-точен и д и а г н о с т и ч н о зна-
Т а б л и ц а 29.8. Граници на 95% област (в %) на
4 U J M ) . Предпоставка за сигурен р е з у л т а т е изб­
о т д е л н и т е левкоцити - Sg, Ly, Mo и т . н. според
рояването в участък, където разпределението им процента на диференцираните клетки (поRumke)
• е к а к т о в кръвта. Дори в натривки, направени
по всички правила на общоприетата техника, раз- Клетъчен
Общ брой диференцирани к л е т к и
пределението на левкоцитите не е развномерно Ви 9
по целия прапарат. Това изисква диференциране­ % 100 200 500 1000
т о да се прави к а к т о по ръба, т а к а и в централ­ 0 0-4 0-2 0-1 0-1
н а т а ч а с т , поради к о е т о броенето и характери­ 1 0-6 0-4 0-3 0-2
зирането на левкоцитите с т а в а чрез меандровид- 2 0-8 0-6 0-4 1-4
но ( о т р. Меандър, т . е. зигзагообразно) придвиж­ 3 0-9 1-7 1-5 2-5
ване на н а т р и в к и т е (вж фиг. 29.14). 4 1-10 1-8 2-7 2-6
При силно увеличение се брои и диферен­ 5 1-12 2-10 3-8 3-7
ц и р а всеки л е в к о ц и т по с л е д н и т е к р и т е ­ 6 2-13 3-11 5-9 4-8
рии, к о и т о се о ц е н я в а т комплексно: голе­ 7 2-14 3-12 4-10 5-9
м и на, форма, с ъ о т н о ш е н и е я д р о / ц и т о п л а з - 8 3-16 4-13 5-11 6-10
м а , форма, големина и х р о м а т и н о в а с т р у к ­ 9 4-17 5-15 6-12 7-11
т у р а н а я д р о т о , форма, големина и брой н а 10 4-18 6-16 7-14 8-13
нуклеолите, ц в я т и с т р у к т у р а н а ц и т о п - 15 8-24 10-21 12-19 12-18
л а з м а т а , наличие н а гранулации в ц и т о п - 20 12-30 14-27 16-21 17-23
л а з м а т а - ф о р м а , ц в я т и големина н а съ­ 25 16-35 19-32 21-30 22-28
щ и т е , вакуоли, в к л ю ч в а н и я , ф а г о ц и т и р а - 30 21-40 23-37 26-35 27-33
ни е л е м е н т и . И д е н т и ф и ц и р а н е т о позволя­ 35 25-46 28-43 30-40 32-44
в а разпределение н а к л е т к и т е по възприе­ 40 30-51 33-48 35-45 36-44
т и т е к а т е г о р и и или редове. Необходимо е 45 35-56 38-53 40-50 41-49
с п а з в а н е т о н а определени правила: 50 39-61 42-58 46-66 46-54

511
 Брой клетки
фиг. 29.15. Доверителен интервал (95%) н а лев-
коцитното диференциране при изброяване на 100,
200 или 1000 клетки о т сравняване на две кръвни
картини в два последователни дни (по Urs. Bucher)
Първия ден са установени 25% пръчкоядрени грануло-
иити, а на другия ден - при диференциране на 100 клет­
ки са отчетени 33% (върху ординатата). Видно е, че
отрязващият пункт е в 95%-та доверителна област за
100 охарактеризирани клетки, т.е. вероятността, че
втората стойност за пръчкоядрепите клетки е дейст­
вително различна о т първата е под 5%. Тези стойноси,
отнесени за 200 диференцирани клетки излизат извьн
съответната област и разликата се означава като ста­
тистически значима.
при 200 клетки, между 4-9% при 500 и между 4-8%
при 1000 клетки. Разсейването на р е з у л т а т и т е е
значително, особено за клетките, представени в
периферната кръв в нисък процент. При увелича­
ване броя на изброените левкоцити над 500 не се
подобрява съществено възпроизводимостта на
резултатите, което не оправдава допълнително
вложения труд.
Неточността на диференцирането на клет­
ките при сравняване на диференциалната кръвна
натривка на даден пациент в различни моменти
зависи о т броя на диференцираните клетки. Суве­
личаване броя на диференцираните левкоцити се
повишава надеждността на р е з у л т а т и т е , осо­
бено за по-малобройните типове клетки. Съот­
в е т с т в а ли разликата в разпределението на лев­
коцитите на една действителна промяна в със­
т а в а на кръвната картина? Ширината на 95%-
т а доверителна граница за две диференцирания е
толкова по-тясна, колкото по-голям е б р о я т на
диференцираните клетки (фиг. 29.15). Поради го­
лямата статистическа грешка, особено за мал­
ките клетъчни категории се препоръчва тяхно­
т о камерно броене, което е по-точно, но е въз­
можно само за еозинофилни и базофилни грануло-
512
цити. Грешката е значително по-малка при ав­
т о м а т и ч н о броене с 5 параметъра.
В р е м е т р а е н е т о н а п р о ц е д у р и т е при оц­
в е т я в а н е по P a p p e n h e i m не е удобно з а
с п е ш н а р а б о т а . П р е д л а г а т се ред т е с т о в е
з а бързо о ц в е т я в а н е н а с ъ щ и я принцип.
I I a ü - ч е с т о т е не д о с т и г а т к а ч е с т в о т о н а
о ц в е т я в а н е по P a p p e n h e i m , но с а напълно
д о с т а т ъ ч н и при с п е ш н о с т . Такива с а пред­
л а г а н и т е о т Merck т е с т о в е Hemacolor и
Sangodijf-Farbefolie (специални фолии, осиг-
р я в а щ и б ъ р з а и ч и с т а р а б о т а при п о с т о ­
я н н и условия з а о ц в е т я в а н е ) .
Освен класическия м а н у а л е н м е т о д з а оц­
в е т я в а н е н а н а т р и в к и о т периферна кръв
се п р е д л а г а т различни уреди, при к о и т о оц- •
в е т я в а н е т о е а в т о м а т и ч н о . Удобни с а з а
големи серии о т кръвни н а т р и в к и . По пра- I
вило и з и с к в а т н а й - м а л к о 50 о ц в е т я в а н и я
дневно. О ц в е т и т е л н и т е а в т о м а т и полз­
в а т р е а к т и в и n o Wrignt, един в а р и а н т н а
п а н о п т и ч н и т е о ц в е т и т е л н и р а з т в о р и , но
е в ъ з м о ж н о а д а п т и р а н е и н а други моди­
фикации. А в т о м а т и ч н о т о о ц в е т я в а н е не
се препоръчва з а н а т р и в к и о т к о с т е н мо­
зък.
С ъ и д е с т в у в а т т е х н о л о г и и (линейна и
центрофужна) за а в т о м а т и ч н о приготвя­
не н а н а т р и в к и . Н е у д о б с т в о т о при т я х е,
че и з и с к в а т голям обем кръв. При а в т о м а ­
т и ч н а т а т е х н и к а н я к о и к л е т к и , напр. мо-
н о ц и т и м о г а т д а п о к а ж а т различно разп­
ределение в сравнение с ръчно п р и г о т в е н и ­
т е , п о р а д и к о е т о н е с а получили широко
приложение.
АНАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НЛ ОСНОВНИТЕ
ПОКАЗАТЕЛИ НА ХЕМОСТАЗАТА
ОсноВни fjainiu з а х е м о с т а з а т а
Х е м о с т а з а т а е сложна, д и н а м и ч н а и само­
регулираща се с и с т е м а , к о я т о включва п е т
п о д с и с т е м и , обединени о т нервни и хумо-
рални м е х а н и з м и :
Кръвоносни съдоВе - анатомична
с т р у к т у р а , функционално състояние,
фактори, синтезирани о т ендотела.
>• Г р о м б о ц и т и - брой, функция, ф а к т о р и ,
мембранни рецептори.
>• П л а з м е н и ф а к т о р и н а кръбосъсир-
 Н а п е т о . Според включването им в про­
цеса на кръвосъсирване, т е се категори­
з и р а т в т р и групи;
външна система: ф. III, ф. VII
вътрешна система; ф. XII, високомолеку­
лен кининоген (ВМК), прекаликреин, ф. XI,
ф. IX, ф. VIII,
обш път; ф. X, ф, V, ф. II, ф. I, ф. XIII.
Според характера на у ч а с т и е т о на плаз-
е н и т е ф а к т о р и в кръвосъсирването и
lexHume химико-физични свойства, т е се
Зединяват в т р и основни групи;
К о н т а к т н а г р у п а . Обхваща к о н т а к т н и т е
ф а к т о р и н а кръвосъсирването: ф. XII, X, ВМК
и прекаликреин, к о и т о се а к т и в и р а т при свър­
зване с увредена, нефизиологична и о т р и ц а т е л ­
но н а т о в а р е н а повърхност: базални мембра­
ни, активирани т р о м б о ц и т и , фосфолипиди. Ак­
т и в и р а н е т о им инициализира в ъ т р е ш н и я п ъ т
н а кръвосъсирването. Те и м а т средно висока
молекулна м а с а (80-120 kDa) и с а о т н о с и т е л н о
стабилни. П о в р е м е н а к р ъ в о с ъ с и р в а н е т я х ­
н а т а консумация е частична.
В т а - м и н K - з а в и с и м и ф а к т о р и : ф. II, VII, IX
и X. Поради сходна физико-химична х а р а к т е ­
р и с т и к а , към т а з и група се в к л ю ч в а т още ин-
х и б и т о р н и т е протеини - протеин С (РгС) и про­
т е и н S (PrS). Касае се за б е л т ъ ц и с нискомоле­
кулна м а с а (50-70 kDa) и и з р а з е н а c m a ö i u i -
н о с т в к р ъ в н и п р о б и Б и о с и н т е з ъ т на т е з и
ш е с т п р о т е и н а се о с ъ щ е с т в я в а в черния дроб
и зависи о т в и т а м и н К, к о й т о е необходим за
р е а к ц и я т а на карбоксилиране на около 9-12 глу-
т а м и н о в и о с т а т ъ ц и в п о л и п е п т и д н а т а вери­
га и п р е в р ъ щ а н е т о им в у-карбокси-глутами-
нови о с т а т ъ ц и , к о и т о обуславят негативен за­
ряд н а б е л т ъ к а - важно условие з а свързване
към фосфолипидната повърхност посредством
Са 2 *. При недоимък н а в и т . К с и н т е з и р а н и т е
ф а к т о р и о т х е п а т о ц и т и т е са без биологична
активност.
Група н а тролгбин-чувствителните
п л а з л ь с н и ф а к т о р и . И з в е с т н а е още к а т о
фибриногенова група, т ъ й к а т о всички ф а к т о ­
ри и м а т висока молекулна маса - > 250 kDa. Тук
се включват ф. I, V, VIII и XIII. Тези ф а к т о р и с е
изчерпват в процеса н а кръвосъсирване.
При въздействие на тро мбин се а к т и в и р а т или
модифицират, след к о е т о се р а з г р а ж д а т о т
плазмин и о т а к т и в и р а н и я РгС ( ф ^ а и Villa),
поради к о е т о не се о т к р и в а т в серум.
ф а к т о р и па ф и б р и и о л и з а т а ; плазминоген
(профибринолизин) и плазмин. Тук сс включват
а к т и в а т о р и т е на плазминогена: в ъ т р е ш н и
( ф а к т о р и т е на к о н т а к т н а т а фаза - ф.ХПа,
ВМКи каликреин), #ьшшш(ЬРЛ,урокиназа, ак­
т и в а т о р и в левкоцити/моноцити, а к т и в а т о ­
ри в т у м о р н и к л е т к и и екзогенно внесени ве­
щ е с т в а ( с т р е п т о к и н а з а , урокиназа, рекомби-
н а н т е н t-PA, про-урокиназа).
>• Ф а к т о р и н а к о н т р о л н и т е м е х а н и з ­
м и - инхибитори на кръвосъсирването
и фибринолизата.
• Инхибитори н а п л а з м е н и т е факто­
р и н а к ръ в ос ъ сирв ан е то. а н т и т р о м -
бин III (ATIII), хепаринов кофактор II
(НСИ), алфа-2-макроглобулин, инхибитор
на п ъ т я на тъканния фактор (TFPI), РгС,
PrS. Най-важни са ATIII и с и с т е м а т а
PrC/S. Допълнителни инхибитори са; С!
инхибитор (инхибира ф. Х1а, ХИа, калик­
реин), алфа-1-антитрипсин (инхибира ф.
Х1а, каликреин); алфа-1-макроглобулин
(инхибира каликреин, тромбин); инхиби­
т о р и о т външния п ъ т (инхибиране на ф.
Vila).
• Инхибитори н а плазлшногенови ак­
т и в а т о р и и плазлгин: инхибитор на
плазминогеновия активатор - PAI (PAI-1,
PAI-2, PAI-3, нексин-1-протеаза), алфа-2-ан-
типлазмин, алфа-2-макроглобулин, алфа-1-
антитрипсин).
11 pecjHapu т е л н а п о д г о т о в к а
на пациента
Изключително важно е с т р и к т н о т о спаз­
ване на условията, изискванията и прави­
л а т а за вземане на венозна кръв за изслед­
ване на х е м о с т а з н и т е показатели;
• Да не се допуска травмиране на в ена та
{внимание: д а н е с е п о м п и с юмрук при
стегнат ластичен бинт/есмарх, у а н е
с е n o m y n ü a / n j i n c k a върху вената, у а
с е п р е к р а т и с т я г а н е т о веднага слеу
успешна венепункция).
• Да сс спазва с т р и к т н о р е д ъ т за накап­
ване (вж гл. 3) на епруветките; първата
епруветка след венепункция н е с е из­
п о л з в а за анализ на показателите на хе-
м о с т а з а т а . IIaü-добре е т о в а да бъде
в т о р а т а или т р е т а т а по ред епруветка
(по т о з и начин се п р е д о т в р а т я в а пос­
тъпване в кръвта на тъканен тромбоп-
л а с т и н , к о й т о оказва интерференция
върху р е з у л т а т а ) .
513

• Да не се допуска венозна с т а з а {активи­
ра "се кръвосъсирването), дори се препо­
ръчва извършване н а венепункиия без
турникет); с т я г а н е > 30 s силно повлия­
ва фактор V.
• Да не се използват игли с т е с е н лумен
(опасност о т лизиране н а е р и т р о ц и т и
и повлияване на анализите)
• Най-подходящи при вземане на кръв за по­
к а з а т е л и т е на х е м о с т а з а т а са предназ­
начените за ц е л т а епруветки о т затво­
рената система за вземане на биологи­
чен материал.
• Не се използват други а н т и к о а г у л а н т и
освен с т а н д а р т н и я а н т и к о а г у -
л а н т - ц и т р а т . Препоръчва се концен­
т р а ц и я 129 mmol/1 (3.8% терииерен нат­
риев цитрат с 2 л ю л е к у л и к р и с т а л и -
з а ц и о н н а вода), респ. 106.4 mmol/1 (3.8%
терциерен н а т р и е в ц и т р а т с 5.5 л ю л е ­
кули кристализационна вода).
NCCLS (National Committee for Clinical
Laboratory Standards, USA) препоръчва бу-
фериран 3.2% ц и т р а т е н р а з т в о р , т . е.
109 mmol/1 (3.2% терциерен н а т р и е в
цитрат с 2 молекули кристализационна
вода), респ. 89.5 mmol/1 {3.2% терциерен
натриев цитрат с 5.5 молекули криста­
лизационна вода)с p H 5.5, т ъ й к а т о pH в
с м е с т а о с т а в а около физиологичното в
сравнение с небуфериран ц и т р а т . Това
стабилизира лабилните ф а к т о р и на кръ­
восъсирването.
• Спазване на съотношението антикоагу-
лант/кръв - т о ч н о 1:9. Ако т о се пови­
ши, т . е . ако к р ъ в т а е по-малко (съотно­
шение 1:7 например), е ф е к т и в н а т а кон­
центрация на а н т и к о а г у л а н т а се пови­
шава, к о е т о ще има за последица пови­
шени с т о й н о с т и ( напр. н а аРТТ).
При х е л ш т о к р и т н а д 0.55 е з а д ъ л ж и ­
т е л н а п р о л ш н а н а с т а н д а р т н о т о съ­
отношение, т ъ й к а т о п о р а д и п о в и ш е ­
н и я х е л ш т о к р и т п л а з л г е н и я т обелг е
намален, цитратът в плазлгата ще
Таблица 29.9. Видове плазма и условия за получаване
Ц и т р а т н а плазма Относителна центро-
ф у ж н а сила, RCF ( x g )
Богата на шромбоцити 150-200
Бедна на шромбоцити
1500-2000
Безтромбоцитна 2500-3000
514
б ъ д е в и з л и ш ъ к , к о е т о щ е д о в е д е д о об­
р а з у в а н е н а к о л г п л е к с и с Са2* о т р е а к ­
т и в а п р и о п р е д е л я н е н а Р Т и аРТТ. То­
ва ще причини повишени с т о й н о с т и и на №
д в а т а п о к а з а т е л я , дължащи се н а забаве- р
ния процес н а съсирване поради недостиг
н а Са 2 + ' Например аРТТ при х е м а т о к р и т
0.40 е 35 s при 0.6 - 53 s, при 0.8 - 69 s и при
0.9 - 80 s. С ч и т а се, че ако с ъ о т н о ш е н и е т о
к р ъ в щ и т р а т е 1:19, значително се намаля­
ва е ф е к т а о т повишения х е м а т о к р и т вър­
ху р е з у л т а т и т е .
• След вземане н а к р ъ в т а , т я т р я б в а вни­
м а т е л н о да се размеси с ц и т р а т н и я раз­
т в о р чрез неколкократно внимателно об­
ръщане, без да се образува пяна. Следи се
за наличие н а е в е н т у а л е н съсирек. Ако се
у с т а н о в и т а к ъ в , в з е т а т а кръв е негод­
н а з а изследване п о к а з а т е л и т е н а хемос­
тазата.
• Д о н а с я н е т о н а ц и т р а т н а т а кръв в ла­
б о р а т о р и я т а т р я б в а да с т а н е до 1-2 h, ri
з а да се о т д е л и п л а з м а т а . За р у т и н н и т е
т е с т о в е т о в а с т а в а при с т а й н а т е м п е ­
р а т у р а (22 - 24 0С), а н е в ъ р х у л е д (вни­
мание: поради а к т и в и р а н е н а ф. VII се
скъсява РТ). РТ о с т а в а стаб и л н о до 24 h
при съхраняване н а н ео тво р ен а епрувет­
к а {от затворената система) н а с т а й ­
н а т е м п е р а т у р а . Прясно изолирана без-
т р о м б о ц и т н а плазма може да се съхра­
нява при -20 0С до няколко дни. Цялост­
н а ц и т р а т н а к р ъ в н е се съхранява в
х л а д и л н и к - н а с т ъ п в а а к т и в и р а н е на I
ф.УП, XI, XII и повлияване н а р у т и н н и т е
т е с т о в е . Проби за изследване н а лабилни
ф а к т о р и т р я б в а д а се т р а н с п о р т и р а т
до л а б о р а т о р и я т а възможно най-бързо.
• П о к а з а т е л и т е н а х е м о с т а з а т а се изслед- о
в а т в п л а з м а . К а п и л я р н а т а кръв следва
да се използва п о и з к л ю ч е н и е и т о са­
м о з а н я к о и а д а п т и р а н и м е т о д и . Из­
п о л з в а т се няколко вида плазма, съобраз­
но и з и с к в а н и я т а н а анализа (табл. 29.9).
Б о г а т а т а н а тролгбоцити плазма
Rpm със с т а н д а р т н а Време н а ц е н т р о ­
лаб. ц с н т р о ф ф у г и р а н е (min)
о к о л о 1000-1500 7
около 3000
о к о л о 3500-4000

•••••••
••••••• •••••••
••••••• •••••••
••••••• •••••••
••••••• •••••••
••••••• •••••••
* • • •••••••
• • • • •••••••
•••••••
• • •••••••
• • • •••••••
•••••••
• • •
• • • •
• • •
• • • •
••
•• ••
1 ранение н а п р о б а т а при различни т е м п е ­
Фиг. 29.16. Схематично представяне получава­
нето на богата на тромбоцити и безтромбоцит-
на плазма
1 - цялостна кръв преди центрофугиране
2 - недостатъчно центрофугиране на кръвта - ч а с т о т
т р о м б о ц и т и т е се намират в еритроцитния слой
3 - оптимално центрофугиране за получаване на богата
на тромбоцити плазма - практически всички тромбо­
ц и т и се намират в плазмата
4 - центрофугиране с висока скорост или продължител­
но време води до седиментиране на т р о м б о ц и т и т е и
получаване на безтромбоцитна полазма
н а вид е леко м ъ т н а . Т я с ъ д ъ р ж а п о ч т и
всички т р о м б о ц и т и във в з е т а т а в епру­
в е т к а т а кръв, единични левкоцити и е р и т ­
р о ц и т и . Б о г а т а н а т р о м б о ц и т и плазма е
п л а з м а т а , получена чрез с п о н т а н н а седи-
м е н т а ц и я на к р ъ в т а . Ь с з т р о м б о ц и т н а -
т а п л а з л т е прозрачна и п ра кт и че ски не
съдържа т р о м б о ц и т и (фиг. 29.16). Необхо­
димо е с т р и к т н о да се спазва RCF и време­
т о за центрофугиране. При много бързо или
продължително ц е н т р о ф у г и р а н е т р о м б о ­
ц и т и т е о с т а в а т в е р и т р о ц и т н и я седи­
м е н т , а при много бавно или к р а т к о ц е н т ­
рофугиране всички т р о м б о ц и т и премина­
в а т в плазмата.
В случай, че п о л у ч е н а т а плазма видимо е
с хемолиза т я не се изследва (възможно е
а к т и в и р а н е н а ф а к т о р и т е на съсирване).
При липемична или и к т е р и ч н а плазма не се
и з в ъ р ш в а т анализи с ф о т о о п т и ч н о измер­
ване, поради о ч а к в а н а т а интерференция.
• И де а лният срок за извършване н а анали­
за е до 2 h н а веднага о т д е л е н а т а след взе­
мане на к р ъ в т а плазма.
• При необходимост о т по-дълго съхране­
ние н а п л а з м а т а до анализа т я може д а
бъде замразена (-20 0С или -70 0С), в зави­
с и м о с т о т с т а б и л н о с т т а н а дадения
ф а к т о р ) . Напр. ф. VIII:C при -20 0С е с т а ­
билен до 2 седмици, а при -70 0С - до 1 го­
дина, Важно правило, к о е т о т р я б в а да се
спазва е: п р е д и и з в ъ р ш в а н е п а анали­
за, з а м р а з е н и т е п р о б и с е р а з м р а з я ­
в а т б ъ р з о п р и т е м п е р а т у р а 37 0 С,
след к о е т о с е р а з м е с в а т п о с р е д с т ­
в о м о б р ъ щ а н е н а е п р у в е т к и т е пре­
ди в з е м а н е н а п л а з м а з а изследване­
то.
На т а б л . 29.10 е п р е д с т а в е н срока за съх­
р а т у р н и условия.
Препоръчва се к о г а т о се взема кръв за из­
следване н а FDP към нея да се прибави с т а ­
б и л и з а т о р - смес о т 10 U т р о м б и н + 150
Ш каликреин н а 1 ml кръв. Тр о м (31шът прев­
ръща о с т а н а л и я фибриноген, с к о е т о се пре­
д о т в р а т я в а фалшиво повишение н а FDP, а
тр и п си н о ви я и н х и б и т о р предпазва in vitro
о б р а з у в а н е т о им. При м о н и т о р и р а н е н а
фибринолитична т е р а п и я ( с т р е п т о к и н а -
з а или урокиназа) към к р ъ в т а т р я б в а да се
прибави ЕДТА-апротинин, за да се инхиби-
ра плазминогеновата а к т и в а ц и я (aprotinin
- 150 KlU/ml кръв + 4.2 mmol/1 ЕДТА или 10
mmol/1 т е р ц и е р е н н а т р и е в ц и т р а т ) . За да
се инхибира in vitro д е й с т в и е т о при лече­
ние с р е к о м б и н а н т е н t-РЛ към к р ъ в т а се до­
б а в я т 5 mmol/1 D - p h e n y l a l a n i n e - p r o l i n e -
arginine-chlormethylketone к ъ м 10 mmol/1
т е р ц и е р е н н а т р и е в ц и т р а т или 4.2 mmol/
1 ЕДТА.
Източници на грешки
> Неправилно вземане, съхраняване и т р а н ­
спортиране на к р ъ в т а
>- Хепаринова в м е с т о ц и т р а т н а плазма
>• Хемолиза, и к т е р и ч н а или липемична плаз­
ма
>• Н е т о ч н о с т при о т ч и т а н е н а в р е м е т о до
образуване на ф и б р и н о в а т а нишка (при
м а н у а л н а х р о н о м е т р и я ) . Зависимостта
между концентрацията на определен фактор
на съсирването в реакционната смес и време­
т о до настъпване на съсирване in vitro не е
515
т К И,а 29 10. с р о к з а съхранение н а биологичен м а т е р и а л з а о т д е л н и т е п о к а з а т е л и н а х е м о с т а з а -
1аолица • J Q .„^игКнияппя^
т а ~
Стабилност в прясно отделена
Стабилност 0 цялостна
б е з т р о м б о ц и т н а плазма при
ц и т р а т н а кръв
Показател п р и 22 24 0 С -20 0 С 4-8 0 С 20-25 0 C
1т 14 d 7п dЛ

^00 С
Лнтитромбин III
6т 4d 8h

"4
D-димери 9 6h
7 1т
ф а к т о р II
? 1т 4h 4h
фактор V
? ? нестаб. 4h
ф а к т о р VII
9 14 d 4h 4h
ф а к т о р VIII
9 6т 7d 7d
ф а к т о р VIII-Ag
1т 9 ? 4h
ф а к т о р IX
9 1т ? 6h
фактор X
9 9 нестаб. 9Z Ь
I
ф а к т о р XI
9 1т нестаб. 2h
ф а к т о р ХИ
ф а к т о р XIII ? 1т 9 4h
Фибринови мономери 24 h 3т 24 h 24 h
Фибриноген 8h 1т 7d 7d
нестабилни 1т 24 h 9
FDP (полуживот - няколко min)
Фибринопептид А ? 9 2h ?
аРТТ 4h 1т 8h 2
РТ (Quick) 8h 1т 1d 2
Протеин С 9 1т 7d 8h
Протеин S 9 4т 4h 4h
Рептилазно време 9 1т 4h 8h
TT 2h 1т 8h 4h
h - часа; d - дни; т - месец; ? - неуточнено

линейна, а логаритмична, поради к о е т о анали­ Референтни граници и насоки

т и ч н а т а възпроизводимост, ч у в с т в и т е л н о с т
. и т о ч н о с т з а в и с я т много повече о т величина­
т а н а о т ч е т е н а т а с т о й н о с т , о т к о л к о т о при
други видове анализи. Грешка в размер н а 1 s
при о т ч и т а н е напр. н а РТ е с различна т е ж е с т
при различните о б х ва ти: в р е ф е р е н т н и я обх­
в а т при о т ч и т а н е н а 14 в м е с т о 13 s, РТ се
променя о т 100 н а 80%, а в т е р а п е в т и ч н и я
о б х в а т при о т ч и т а н е н а 23 в м е с т о н а 22 s -
т о се променя о т 29 н а 27%.
М е т о д и за изследване
на хемостазаша
Принципът на основните групи м е т о д и за
изследване на х е м о с т а з н и т е показатели са
представени на таблица 29.11.
при тълкуване на р е з у л т и т е
Скринингови т е с т о в е
Време н а кървене: 2-5 min
В н и м а н и е : не е л а б о р а т о р е н т е с т в т е с н и я
смисъл н а д у м а т а , а по-скоро функционално изс­
ледване i n vivo. О т р а з я в а у ч а с т и е т о н а т р о м б о -
ц и т и т е и с ъ д о в и т е ф а к т о р и , к а т о д а в а предс­
т а в а з а р а н н и т е фази н а х е м о с т а з н и я процес. На­
д е ж д н о с т т а н а р е з у л т а т и т е зависи о т изключи­
т е л н о с т р о г о с т а н д а р т и з и р а н е н а условията.
Т е с т ъ т Ii р у т и н н и я с и Вид н е т р я б В а д а с е
п р и л а г а , а с а м о д о б р е с т а н д а р т и з и р а н . По­
н а с т о я щ е м се п р е п о р ъ ч в а т : м е т о д н а Ivy, м е т о д
н а Willoughby ( д о п ъ л н и т е л е н м е т о д н а Ivy чрез
т о ч н о измерване н а и з т и ч а щ а т а кръв - хемора-
г о м е т р и я ) и м е т о д н а Borchgrevink (допълнен ме­
т о д н а Ivy с определяне след 24 h н а " в т о р и ч н о
кървене).

516
 Memoq Принцип ( х и м и ч е с к а р е а к ц и я ) Коментар Оценка н а м е т о д а

1. Физиологични
• хронометрия определя се времето за образуване на фибршюв р е з у л т а т и т е се изразяват във време (s) в определя се ензимната ак­
(коагулометрия) съсирек; процент ш и в g/1 след съпоставяне с резул­ т и в н о с т на индивидуални
м а н у а л и о - чрез накланяне на т е с т епруветка или с т а т . получен при провеждане на успоредно фактори, к а к т о и стойно­
"йозе" в т е р м о с т а т и р а н а вана (370С ± 0.1оС) изследване с доказано нормална плазма с т и т е на някои показате­
а в т о м а т и ч н о - електромеханично или (кашбрационна крива) ли - РТ, аРТТ, TT, фибрино-
фотометрично ген, ATIII, РгС и др. CV под
3% за а в т о м а т и ч н о и зна­
чително по-висок при
мануално о т ч и т а н е

• хромометрия използват се синтетични с у б с т р а т и ( е с т е с т в е н и т е реакцията се о т ч и т а спектрофотометрич- измерва се ензимна актив­

(колориметрия) са трудни за изолиране), свързани с хромоген (пара- но-кинетично ш и крайноточково. Реакцията н о с т и се определят някои
нитроанилин), който се отцепва под действие на протича при оптимизирани условия и полу­ показатели - ATIII, плазми-
серин-протеазни фактори чените р е з у л т а т и се п р е д с т а в я т чрез ско­ ноген, НСИ, РгС, хепарин,
р о с т т а на реакцията к а т о се преизчисля­ к а к т о и отделни фактори
в а т в UI/1 ш и 7с акти в н о с т. Хромогенните (II, V, VII, VIII, IX, XII) и др.
т е с т о в е позволяват определяне на неактив­ CV до 5% при а в т о м а т и ч е н
ни фактори на кръвосъсирването и фибрино- анализ
л и з а т а посредством предварително активи­
ране на п р о т е о л и т и ч н а т а им а к т и в н о с т ,
к а к т о и за определяне на плазмени
инхибитори

2. Имунологични определя се комплекса а н т и г е н - а н т и т я л о м е т о д и т е са специфични, чувствителни, определя се количеството

посредством: подлежат на автоматизиране; д а в а т точни на с ъ о т в е т н и я фактор ка­
- нефелометрия количествени резултати, но не доказват т о белтък (антиген), лс .• 0
- имунотурбидиметрия наличие на дисфункция* неговата а к т и в н о с т

*Това налага едновременно с количествения анашз на определен фактор да се провежда и функционално изследване. При дефицит о т I т и п р е з у л т а т и т е о т д в е т е
изследвания ще б ъ д а т с ниски стойности, а при дефицит о т II т и п - имунологичния р е з у л т а т е в референтния интервач или около него, а т о з и о т функционалния
т е с т - нисък. При дефицит о т I т и п понижението на количеството е с около 50% о т референтните с т о й н о с т и при хетерозиготи и е 0-5% при рецесивни
хомозиготи.
 новременно д о п р и н а с я т н е с а м о з а прециз
Протромбинобо бреме (РТ). н о т о т ъ л к у в а н е н а р е з у л т а т и т е , но и за
а) 11. 5-15 s р а з г р а н и ч а в а н е н а някои н а р у ш е н и я н а кръ-
б ) о т н о ш е н и е (R) 0. 9 - 1 . 1 5
6) а к т и в н о с т (по калибр. крива) 70-120 % в о с ъ с и р б а н е т о ( т а б л . 29.12).
Активирано протромбинобо време (аРТТ). Широко р а з п р о с т р а н е н о т о схваидане за
к о н т р о л н а т е р а п и я т а с и н д и р е к т н и ан­
25-37 s
Тромбиново време (TT): т и к о а г у л а н т и с а м о чрез Р Т е н е п ъ л н о и
а) 18-25 s н е т о ч н о , т ъ й к а т о не се получава инфор­
б) отношение (R) 0. 85-1.15 мация з а н а с т ъ п и л а хипосъсирваемост в
ц я л а т а с и с т е м а . К о р е л а ц и я т а м е ж д у РТ и
Терапебтична о б л а с т при лечение с а н т и - аРТТ коригира т а з и н е п ъ л н о т а и позволя­
коагуланти ва по-точно дозиране н а а н т и к о а г у л а н т -
Н а Р Т а) а к т и в н о с т 30-15% н а т а т е р а п и я ( т а б л . 29.13).
б) отношение (R) 2.5-3.0 (4.0)
в) INR 2.0-4.0 Таблица 29.13. Корелация между р е з у л т а т и т е за
РТ и аРГТ при лечение с индиректни антикоагуланри
На аРТТ: о т н о ш е н и е 1.5-2.5
аР П РТ Интерпретация
INR. Тъй к а т о тромбопластините и м а т раз­ аРТТ на = аРТТ >40% н е д о с т а т ъ ч н а доза
лична чувствителност, получените в отделните (болен) (контрола)
лаборатории резултати са твърде различни, кое­ 40-20% н я м а е ф е к т върху
т о затруднява сравнимостта при лечение с ин­ глобалната съсирва-
д и р е к т н и а н т и к о а г у л а н т и . Това налага из­ е м о с т на к р ъ в т а .
ползването на М е ж д у н а р о д н о н о р л ю л н з и р а - преоценка на лече­
но о т н о ш е н и е (INR - I n t e r n a t i o n a l N o r m a l i ­ н и е т о и т ъ р с е н е на
лекарствена интер-
z e d Ratio) - отношението между време на съсир-
ференция
ване на плазмата на пациент и на контрола, на
аРТТ= 1.5 п ъ т и аРТТ >40% в е р о я т н а аномалия
степен ISI (International Sensitivity Index). Под еги­
(болен) (контрола) на в ъ т р е ш н а т а
д а т а на СЗО се произвежда стандартен референ- система
т е н рекомбинантен тромбопластин, чийто ин­ <40% д о з а т а е ефикасна
декс на чувствителност се приема за 1. Произво­
аРТТ > 2 п ъ т и аРТТ <20% хеморагичен риск! да
дителите на тромбопластини са задължени да съ­
(болен) (контрола) се редуцира дозата!
общават индекса на чувствителност за всеки
свой препарат и всяка серия след сравняване със
стандартния референтен препарат на СЗО - ве­ Примерна схема (алгоритъм) з а контрол
че като ISI. Това позволява преизчисляване на ре­ н а л е ч е н и е т о с перорални а н т и к о а г у л а н т и
з у л т а т и т е към тези, получени с един междуна­ чрез INR е п о к а з а н а н а фиг. 29.17.
роден стандартен тромбопластин.
време н а съсирвана н а IS1
INR = п л а з м а т а на п а ц и е н т Индивидуални фактори
време н а съсирване н а
п л а з м а т а н а здрав Фибриноген (ф. I) 2.0-4.0 g/1
А к т и в н о с т т а н а ф а к т о р и т е о т II-XIII
време (s) н а съсирване н а к о н т р о л н а
ISI = " л а з м а с р а б о т е н т р о м б о п л а с т и н се и з р а з я в а в п р о ц е н т , к а т о з а 100% се при­
време (s) н а съсирване н а к о н т р о л н а
ема средната с т о й н о с т на референтната
плазма с р е ф е р е н т е н т о м б о п л а с т и н група.

А. Фактори на външната система:

Д в а т а т е с т а - Р Т и а Р Т Т , проведени eg-
ф. VII 70-130%

Ф Х11,Х1, IX, VIII

Удължено удължено ф X, IX, VII, V, II, I (недоимък н а в и т . К, чернодробно заболяване,
наличие н а инхибитори)
Реф. интервал удължено
Ф-УИ, X, V, II, I
 Фиг. 29.17. Последователност при обсъждане на р е з у л т а т и т е
за РТ при лечение с и н д и р е к т н и а н т и к о а г у л а н т и

Фактори на вътрешната система: е в з е т о з а 100%):

ф а к т о р XII 70-130% 1. cjen 30. cjen 180. cjen
ф а к т о р XI 75-130% (необходим ф.П 50 (25-70) 70 90
м и н и м у м 20%) ф.У 70 (35-110) 90 90
ф а к т о р IX 70-150% ф.УП 65 (30-105) 90 90
ф а к т о р VIII/vWF 50-150% ф.УШ 100 (50-180) 90 75
ф.1Х 50 (15-90) 50 85
5. Фактори на общия път
ф.Х 40 (20-70) 60 80
фактор X 70-140% (необходим
ф.Х! 40 (10-65) 55 85
м и н и м у м 20%)
ф.ХИ 50 (15-95) 50 75
рактор V 70-120% (необходим
ф.хт 80 (30-130) 95 100
м и н и м у м 10-15%)
AT III 65 (40-85) 80 100
Dakmop II 70-120% (необходим
РгС 35 (15-55) 45 60
м и н и м у м 40%)
PrS 35 (10-60) 65 85
ш к т о р XIII 70-120% (необходим
м и н и м у м - 15%)
А к т и в н о с т т а н а о т д е л н и т е ф а к т о р и на кръ- Специализирани аиализи
осъсирването и т е х н и т е инхибитори при ново-
•одени силно варира и д о с т и г а н и в о т о при въз- Л н т и т р о м б и н III 80-120%
•астни обикновено към края на 6. месец. Изклю- Хепаринов к о ф а к т о р II 65-145%^
ение п р а в я т фибриноген и ф. VIII, к о и т о д о с т и -
Протеин С 70-140%
а т с т о й н о с т и т е н а в ъ з р а с т н и скоро след раж-
Протеин S 70-140%
ане. При здрави, доносени новородени а к т и в -
. о с т т а (в п р о ц е н т ) н а о т д е л н и т е ф а к т о р и ва­ Плазминоген 80-120%
лира в следните граници (ниВото при Възрастни
519
 1-12 n g / m l (ELISA) п р о т а м и н с у л ф а т к ъ м п р о б а т а или д а се
t-PA ( а к т и в а т о р н а
( т ъ к а н н и я плазминоген) определи р е п т и л а з н о т о време.
>• И з в ъ р ш в а н е н а с е р и я о т последовател­
РА М (инхибитор н а 4-43 n g / m l (ELISA)
ни определяния - н е к о л к о к р а т н о през де­
плазминогенов < 10 Е (хромогенен
тест)
ня. П о с т е п е н н о т о н а м а л я в а н е к о н ­
активатор) ц е н т р а ц и я т а н а фибриногена и
80-120% (хромоге­ т р о м б о ц и т н и я б р о й е р а н е н белег
и-2-антиплазмин
нен т е с т ) з а ДИК, cjopu а к о с т о й н о с т и т е ос­
Ь-тромбоглобулин 10-40 UL/ml (ELISA) т а в а т 6 референтния интервал.
Тромбоцитен ф а к т о р 4 0-5 U L / m l (ELISA) > Р е з у л т а т и в р е ф е р е н т н а т а област на
фибринов nenmug А < 3 n g / m l (ELISA) г о р н и т е п о к а з а т е л и н е и з к л ю ч в а т по-
Фибринови мономери негативен р е з у л т а т
д о с т р о п р о т и ч а н е н а ДИК (при б а к т е р и -
D-димери < 0.5 m g / m l ( л а т е к с -
тест) е м и я напр. ф и б р и н о г е н ъ т м о ж е д а не се
< 20.0 m g / m l (ELISA) понижи поради р о л я т а м у к а т о б е л т ъ к
н а о с т р а т а фаза).
Насоки п р и т ъ л к у в а н е н а р е з у л т а т и т е при > Р а з г р а н и ч а в а н е н а в т о р и ч н а т а фибри-
Д И К - с и н д р о м . И з в е с т н и са т р у д н о с т и т е з а ран­ нолиза (ДИК-синдром) о т п ъ р в и ч н а хи-
но у с т а н о в я в а н е н а ДИК-синдром (дисеминирана перфибриногенолиза ( т а б л , 29.14).
интраваскуларна коагулопатия) - едно д р а м а т и ч ­
но нарушение н а х е м о с т а з а т а , р е з у л т а т о т оп­ Т а б л и ц а 29.14. Разграничаване н а в т о р и ч н а фиб-
ределено основно нарушение или н а друг специфи­ ринолиза при Д И К о т п ъ р в и ч н а фибринолиза
чен пусков механизъм. Н я м а специфичен т е с т , с
Първична
к о й т о д а се докаже ДИК-синдром.Това н а л а г а из­ Показател ДИК
фибринолоза
ползването н а скринираш, панел, позволяващ бър­
РТ, аРТТ, TT удължено удължено
за оценка н а започнал вече и н а п р е д в а щ ДИК, кой­
т о панел включва с л е д н и т е п о к а з а т е л и , изследва­ фибриноген понижен понижен
ни в динамика: ф. V понижен понижен
• Т р о м б о ц и т е н брой ф. VIII понижен реф. и н т е р ­
вал/понижен
• РТ
FM ( + ) пол. (-) о т р .
• аРТТ FDP повишени повишени
• TT DD ( + ) пол. (-) о т р .
• Фибриноген TAT повишение реф. интервал
• AT III плазмин-а 2 -анти- повишение повишение
• TAT плазмин
Тромбоцити понижение реф. интервал
• FM
FPA повишение реф. интервал
• FDP, DD-димери ф. XIII понижение реф. интервал
• ф. V и VII
• плазмин-а-2-антиплазмин ( т о з и комп­ В т а б л и ц а 29.15 е п р е д с т а в е н а т о ч к о в а
лекс между е н з и м и и н х и б и т о р е в а ж е н с и с т е м а з а д и а г н о з а н а ДИК-синдром, пре­
п о к а з а т е л , к о й т о сочи з а п р о д ъ л ж а в а щ а п о р ъ ч а н а о т я п о н с к а група, проучваща т о ­
а к т и в а ц и я ( ш vivo) н а ф и б р и н о и т и ч н а т а ва т е ж к о нарушение н а х е м о с т а з а т а .
с и с т е м а и се с ч и т а д и р е к т е н м а р к е р
н а Иътрееъдово о б р а з у в а н е н а п л а з - З а к л ю ч е н и е : В т о з и раздел, наред с данни
лтн. о т по-нови п р о у ч в а н и я с а п р е д с т а в е н и и
н я к о и класически, о б щ о п р и е т и п р а в и л а и
При и н т е р п р е т а ц и я н а р е з у л т а т и т е се изисквания, к о и т о следва винаги д а б ъ д а т
изисква особено внимание по о т н о ш е н и е н а
в о с н о в а т а н а д о б р а т а л а б о р а т о р н а прак­
с л е д н и т е основни положения:
т и к а в х е м а т о л о г и ч н а т а л а б о р а т о р и я . Ак-
>• Влияние върху с к р и н и р а щ и т е т е с т о в е ц е н т р и р а н о е предимно н а възможните
н а х е п а р и н о в а т а т е р а п и я , ако т а к а в а е грешки и м е р к и т е з а т я х н о т о п р е д о т в р а ­
з а п о ч н а т а . Препоръчва се прибавяне н а тяване.
520
Габлица 29. 15. Насоки з а преценка р а з в и т и е т о н а ДИК-синдром
Показател Наличие/отсъствие Брой т о ч к и
I. Основни з а б о л л в а н и я наличие 1
с висок риск з а разви- отсъствие 0
т и е н а ДИК

II. Клинични с и м п т о м и
1. Повишено кръвно наличие 1
налягане отсъствие 0
2. Исхемия н а з а с е г н а т и я орган наличие 1
отсъствие 0

III. К л и н и ч н о - л а б о р а т о р н и д а н н и
1. FDP (|.ig/ml)
40 3
< 40 и >20 2
<20 и >10 1
<10 0
2. Брой т р о м б о ц и т и (х 109/1)
<50 3
> 50 и <80 2
>80 и <120 1
> 120 0
3. Плазмен фибриноген (g/l)
1.0 2
>1.0 и <1.5 1
> 1.5 0
4. РТ (отношение)
1.67 2
<1.67 и >1.25 1
< 1.25 0

IV. К о м п л е к с н а о и е н к а
1. Пад 7 точки ДИК
6 точки съмнение за ДИК*
По-малко о т 5 точки малко в е р о я т е н ДИК
2. Болни о т левкемия или други х е м о п а т и и и п а ц и е н т и на химиотерапия
Пад 4 точки ДИК
3 т о ч к и съмнение за ДИК"
По-малко о т 2 точки малко в е р о я т е н ДИК

V. Д о п ъ л н и т е л н и к р и т е р и и
1. Положителен т е с т з а FM
2. Повишение н а D-димери
3. Повишение н а TAT
4. Повишение н а п л а з м и н - а - 2 - а н т и п л а з м и н инхибиторен комплекс
5. Повишение на т о ч к и т е при прогресиране н а заболяването (напр. бързо понижение н а
т р о м б о ц и т н и я брой и фибриногена или бързо повишение на "I DP)
6. Подобрение след а н т и к о а г у л а н т н о лечение
* Съмнителните за ДИК, които и м а т 6 или 3 точки според раздел IV, 1. и 2. може да б ъ д а т преоценени и се прие
ма, че развиНат ДИК, ако и м а т поВече о т два допълнителни критерии.

521
Книгопис
Дойчинов Л, Манчев С. Практически подходи в лечението н а
тромбоемболичните заболявания. Българска терапевтична
ш к о л а № 4 1 . С . , З н а н и е —О О Д , 1 9 9 6 .
Л и с и ч к о в Т. М е т о д и з а и з с л е д в а н е н а х с м о с т а з а т а . В; Д о б р е в а
Л , Й о р д а н о в а Ii ( р е д ) . К л и н и ч н а х е м а т о л о г и я . С , М е д и
физк, 1984,91-95.
A m i r a l J. N e w a p p r o a c h e s f o r b i o l o g i c a l d i a g n o s i s in t h r o m b o s i s
a n d h a e m o s t a s i s . E u r C l i n L a b 11, 1 9 9 2 , 2 9 - 3 4 .
A s s e n d e l f t O W . L a b o r a t o r y test in t h e d i f f e r e n t i a l d i a g n o s i s o f
anemia. Lab med, 5 , 1 9 8 6 , 1 0 - 1 1 , 2 1 - 2 7 .
Bessmann JD, Gi l m er P R , Gardiner FN. Imroved classification o f
a n e m i a s b y M C V a n d R D W . A m J C l i n P a t h o l , SO, 1 9 8 3 , 3 2 2 -
326.
B ü c h e r Urs. L a b o r m e t h o d e n in d e r h ä m a t o l o g i e . L a b o r r e i h e 5 .
Bern - Stuttgart - Toronto, Verlag H a n s Huber, 1989.
B u m s E R , W e n z B. Q u a n t i t a t i v e e v a l u a t i o n o f t h e h e m a t o p o i e t i c
s y s t e m . In: T i l t o n R C , B a l o w s A , H o h n a d e l D C , R e i s s R F
(eds). C l i n i c a l l a b o r a r o r y m e d i c i n e . S t L o u i s , M o s b y , Y e a r
B o o k , Inc, 1992, 8 5 1 - 8 7 8 .
C o r n b l e e t J. S p u r i o u s r e s u l t s f r o m a u t o m a t e d h e m a t o l o g y c e l l
c o u n t r e s . L a b M e d , 14, 1983, 5 0 9 - 5 1 4 .
D ' A n g e l o S , F e r m o I, D ' A n g e l o A . I n v e s t i g a t i o n o f c o n g e n i t a l
t h r o m b o p h i l l i a : a critical e v a l u a t i o n . I F C C , 8 , 1 9 9 6 , 3 , 1 0 2 -
110.
G o o s e n s W, V a n D u p p e n V, V e r w i l g h e n R L . 1С,- o r K , - E D T A :
T h e a n t i c o a g u l a n t o f c h o i c e in r o u t i n e h a e m a t o l o g y . C l i n L a b
H a e m a t , 13, 1 9 9 1 , 2 9 1 - 2 9 5 .
522
G u d c r W G , N a r a y a n a n S , W i s s e r H , Z a w t a B . S a m p l e s : f r o m the
patient to the laboratory. G i t Verlag G M B H , 1996.
H a l b m a y e r W M , H a u s h o f e r A , F i s c h e r M . Thrombophilie-
d i a g n o s t i k : w e i t e r f u h r e n d e l a b o r a t o r i u m s d i a g n o s t i k bei
thrombophilie. Labor aktucl, 6 , 1 9 9 3 , 1 1 - 1 4 .
H e i n s M , R c i n a u e r H . A u t o m a t i o n in c o a g u l a t i o n t e s t i n g . IFCC,
8, 1 9 9 6 , 3 , 117-122.
L o t s p e i c h - S t e i n i n g e r C A , S t i e n e - M a r t i n E A , K o e p k e J A (eds).
C l i n i c a l h e m a t o l o g y . P r i n c i p l e s , p r o c e d u r e s , correlations.
Philadelphia - N e w York - London - Hagerstown, J В
Lippincott Company, 1999.
N a t i o n a l c o m m i t t e e f o r c l i n i c a l l a b o r a t o r y s t a n d a r d s . C l i n i c a l ap-
plications o f flow cytometry; quality assurance and
i m m u n o p h e n o t y p i n g o f p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s ; tenta­
tive guideline. N C C L S d o c u m e n t H42-T. N C C L S , Villanova,
P A 12, 1 9 9 2 , 6 .
N e w diagnostic approach to the detection o f thrombophilia.
B o e h r i n g e r M a m m h e i m G M B H , M a n h e i m , G e r m a n y , 1990.
R e c o m m e n d a t i o n s o f the international council for standardization
in h a e m a t o l o g y f o r e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d
a n t i c o a g u l a t i o n o f b l o o d f o r b l o o d cell c o u n t i n g a n d sizing. Am
J Clin Pathol, 100, 1993, 3 7 1 - 3 7 2 .
Valinsky JE. F l o w cytometry a n d phenotyping o f hemopoietic
c e l l s . In: T i l t o n R C , B a l o w s A , H o h n a d e l D C , R e i s s R F (eds).
Clinical laboratory medicine. St Louis, Mosby, Year Book,
Inc, 1992, 8 7 9 - 8 9 7 .
 ш Аналитични принципи
п р и определяне н а
субстрати и метаболити
6 биологичните т е ч н о с т и

ЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ • к а т о у р е е н а з о т (BUN) - 1.3 до 4.3 mmol/1

к НЕБЕЛТЪЧНИ за мъже и жени
• у р е я в г / р ш ш 223 - 331 mmol/24 h
ЮТСЪДЪРЖАЩИ ВЕЩЕСТВА (13.4-20.0 g / 2 4 h )

Цветкова Креатинин
• Серум
б е л т ъ ч н и я т а з о т (около 14.3 m m o l / 1 )
новородени 63-125 |лто1/1
лючба а з о т а н а н е б е л т ъ ч н и т е нискомо-
к ъ р м а ч е т а до 12 м . 18-42 |дто1/1
.^улни а з о т с ъ д ъ р ж а щ и в е щ е с т в а . Това е
1-5 години 26-53 цто1/1
з т ъ т , к о й т о о с т а в а в т е ч н о с т т а след
6-12 години 18-71 f.imol/1
1страняване н а б е л т ъ ц и т е в к р ъ в н а т а
13-18 години 53-97 ц т о ! / !
оба. Т е р м и н ъ т н е б е л т ъ ч е н а з о т е о т ран-
мъже 74-134 ц т о Ш
я период н а к л и н и ч н а т а х имия, к о г а т о
жени 44-96 цто1/1
а л и т и ч н а т а методология изискваше
е д в а р и т е л н о о б е з б е л т ъ ч а в а н е н а проби- • Урина
J преди а н а л и з а . мъже 13.2 - 17.6 mmol/24 h
Небелтъчните (нискомолекулни) азотсъдьржа- (1.5 - 2.0 g/24 h )
I вещества се определят основно в кръвния се- жени 7.1 - 13.2 mmol/24 h
V I . Информативното съдържание и клиничното (0.8 - 1.5 g/24 h )
ачение на сумарната концентрация на небелтъч-
т е азотсъдържащи вещества е сравнително мал- К р е а т и н и н ъ т в серума показва и з в е с т е н
поради което общият небелтъчен азот понас- р и т ъ м в р а м к и т е н а д е н о н о щ и е т о . Макси­
шщем не се използва в съвременната клинично-
м у м ъ т н а к о н ц е н т р а ц и я т а м у в серума е
агностична лаборатория. Клинично значение
шт пет от всичките около 15 компонента на вечер, а м и н и м у м ъ т - с у т р и н . Ш и р и н а т а
белтъчния азот - уреяу k f x x i m u n u n . П и к о ч н а н а к о л е б а н и я т а д о с т и г а до 50%. Повишава­
юелшиг, альоияк и а л г и и о к а с с л и и а Нивото н е т о във в е ч е р н и т е часове е във връзка с
общия небелтъчен а з о т в пълна кръв е с около ф и з и ч е с к а т а а к т и в н о с т през д е н я , т ъ й
У
с по-високо, отколкото в плазма, дължащо се на к а т о т а к ъ в р и т ъ м не се у с т а н о в я в а при
тпатионовото съдържание в еритроцитите. болни, приковани н а легло.
Аналитичните принципи за определяне на урея, Важно з а о т б е л я з в а н е е, че р а з в и т и е т о
затинин, пикочна киселина и амоняк са предста- и п о л з в а н е т о в бъдеще н а п о - т о ч н и м е т о д и
-ш на табл. 30.1 - 30.4. з а определяне н а и с т и н с к и я серумен креа-
т и н и щ е доведе до получаване н а по-ниски
с т о й н о с т и в сравнение със с е г а ш н и т е , при­
5ФЕРЕНТНИ ГРАНИЦИ е т и з а референтни.Това ще има значим
НТЕРФЕРЕНЦИЯ е ф е к т върху р е з у л т а т и т е о т изследване н а
к р е а т и н и н о в и я клирънс, к а к т о и върху кли­
)ея. Е в р о п е й с к и т е л а б о р а т о р и и п р е д с т а - н и ч н о т о т ъ л к у в а н е н а р е з у л т а т и т е . Нис­
т у р е я т а в р е з у л т а т и т е о т изследване- к и т е к о н ц е н т р а ц и и н а серумния к р е а т и н и н
з ü к а т о ц я л а молекула, а в САЩ - к а т о (под 80 |дто1/1) в т о з и случай щ е д а д а т оче­
еен а з о т . в и д н о по-висок р е з у л т а т з а к л и р ъ н с а и
ф е я к а т о цяла м о л е к у л а - 3.2 до 8.2 mmol/1 лгоЖс д а м а с к и р а т е д н а по-слабо из­
ia м ъ ж е и 2.6 - 7.2 mmol/1 з а жени разена бъбречна дисфункция, а к о се
523
ползват настоящите реферептниин­ н ъ т (предварително тестван за наличие на
амоняк) се препоръчва к а т о антикоагуланщ
тервали.
(намалява образуването н а амоняк в проба­
Пикочна к и с е л и н а т а ) . Т о чн о то измерване н а амоняка е услож­
нено поради и з р а з е н а т а му н е с т а б и л н о с т в
• Серум биологичната проба и повсеместно замър­
новородени 150-360 [лто1/1
сяване с амоняк. Неточни са резултатите
кърмачета 60-240 |,imol/l
при използване н а недобре и з м и т а стъкла­
деца 180-340 ц т о Ш
рия (амоняк в д е т е р г е н т и т е , в о д а т а , оста­
възрастни гранични с т о й н о с т и т ъ ц и о т урина и др.), хемолиза; забавено
м. 208 - 387 цто1/1 м. 388 - 422 ц т о ! / ! о т д е л я н е н а п л а з м а т а о т ф о р м е н и т е еле­
jk. 149 - 363 |imol/l ?к. 364 - 387 [дто1/1 м е н т и ; замърсяване н а въздуха в помеще­
• Урина н и е т о , к ъ д е т о се взема или изследва кръв­
1.19 - 14.16 mmol/24 h т а - наличие н а цигарен дим; н е о т ч и т а н е
(0.2 - 0.7 g/24 h) н а с ъ с т о я н и е след т е ж к о физическо нато­
варване.
Върху с е р у м н а т а к о н ц е н т р а ц и я н а пи­ Някои м е д и к а м е н т и ( ш vivo) - амониеви
к о ч н а т а киселина в серума о к а з в а т влияние соли, б а р б и т у р а т и , е т а н о л , н а р к о т и ц и ,
тиазиди и салицилати. Тиазидните диуре- а н а л г е т и ц и (морфини), диуретици - повиша­
т и ц и п о в и ш а в а т у р а т н а т а екскреция. В в а т , а други - L-Dopa, канамицин, неомицин
ниски дози с а л и ц и л а т и т е п о н и ж а в а т екск- - н а м а л я в а т к о н ц е н т р а ц и я т а н а амоняка.
р е ц и я т а на у р а т и , а при високи - я повиша­ При т ъ л к у в а н е н а р е з у л т а т и т е о т ен­
ват. зимно определяне н а к о н ц е н т р а ц и я т а на
Намаляването н а обема на екстрацелу- амоняка, винаги т р я б в а да се взема предвид
л а р н а т а т е ч н о с т с т и м у л и р а реабсорбция- н и в о т о н а pH в к р ъ в т а , т ъ й к а т о в зависи­
т а на пикочна киселина в проксималните м о с т о т в е л и ч и н а т а му се променя концен­
тубули и по т о з и начин се понижава екскре- т р а ц и я т а н а с в о б о д н и я , т о к с и ч е н за
ц и я т а й. организма КНз. При pH в референтен интер­
При запазена гломерулна филтрация, фал­ вал т я е само около 2% о т о б щ а т а концен­
шиво повишени р е з у л т а т и се получават при т р а ц и я . След вземане на необходимата
хипертриглицеридемия, х и п е р л а к т а т е м и я кръв, епруветката следва веднага да се зат­
и к е т о н е м и я (конкуренция з а излъчване). вори плътно с пластмасова тапа и поста­
Важно изискване, преди и з с л е д в а н е т о н а вена в съд с лед се предава в лаборатория­
пикочна киселина в серум, е п а ц и е н т и т е да та. Допуска се съхраняване до 2.5-3 h в леде­
не са приемали предния ден храна б о г а т а н а н а баня н а незабавно о т д е л е н а т а след цен­
пурини ( черен дроб, б ъ б р е ц и , м о м и ц и , трофугиране плазма.
стриди и др.).
Наблюдават се индивидуални колебания
в к о н ц е н т р а ц и я т а н а п и к о ч н а т а киселина Аминокиселини
в серум, достигаши до 30 |дто1/1 о т ден в ден,
к а к т о и изразени циркадианни колебания - Н а й - ч е с т о н а р у ш е н и я т а в о б м я н а т а на
по-висока с у т р е ш н а к о н ц е н т р а ц и я и по- аминокиселините (вродени или придобити)
ниска през ноищш. в о д я т до промени в к о н ц е н т р а ц и я т а на
една или няколко аминокиселини, респ. на
Амоняк
т е х н и обменни п р о д у к т и или предшестве­
• Плазма ници в у р и н а т а .
кърмачета, деца 15 - 53 ц т о Ш
жени 1 1 - 3 1 |лто1/1 Методи за изследване. О т количествените
мъже 15 - 40.5 |лто1/1 м е т о д и за определяне н а о т д е л н и т е амино­
киселини в биологични т е ч н о с т и с най-висо­
• Урина ка а н а л и т и ч н а н а д е ж д н о с т е колонната
възрастни 20 - 70 mmol/1 хроматография, к о я т о се и з м е с т в а о т ме­
(340-1190 mg/24 h) т о д и т е н а HPLC.
Амонякът се определя в плазма. Хепари-
524
 Т а С к и и ц а 30.1. Аналитични м е т о д и з а определяне на урел
Метод
1. Ензимни - уреазни
I е т а п (уреята се разгражда
go NHj и СОг)
II е т а п (определяне на NH4')
кондуктометрично
колориметрично
с комплекса на Nessler
с реактив на Berthelot
(модификация -
салицилатен м е т о д)
спрегната ензимна реакция
кинетично (с ГлДХ, UV)
| с индикаторни бои
(бромкрезолгрюн)
• чрез определяне на НгОг
(многостъпални, съче­
т а н и ензимни реакции)
2. Д и р е к т н и м е т о д и
• с диацетилмонооксим
• с о-фталалдехид
3. IDMS (изотопна дилуция/
мас-спекшромешрия)
сл
to
сл
Принцип (химическа р е а к ц и я ) Коментар Оценка на м е т о д а
ур€а3а
H 2 N-C-NH 2 + 2Н 2 0 + Н * * (Ш 4 ) 2 СОз+ Н ^ 2 N H ; + HCOj еднаква с т ъ п к а за
NH; + O H — + й/,о уреазните м е т о д и
превръщането на нейонизираната урея до N11/ + IICO3 бърз м е т о д , влияе се застъпен в анализато­
понижава проводимостта (измерва се скорост) о т ендогенния амоняк р и т е ASTRA, NOVA и др
NH3 се определя чрез образувание на ц в е т н и съединения
NH4 + 2HgI2 + 4KI Л3 (жьлто-оранжев ц в я т ) неспецифична реакция историческо значение
натриев
NH4 + NaOCl + фенол индофенолово багрило със син ц в я т неспецифична реакция р у т и н е н - клас А
нитропрусид ' (А = 590 п т ) (влияе се о т ендогенен
вм. фенол - салицилат, вм. хипохлорид - дихлоризоцианурат амоняк и липемия)
ГлДХ
NH4 + а - к е т о г л у т а р а т + NAD.H. • г л у т а м а т + NAD + Н 2 0 специфичен и бърз; Л Д Х референтен метод;
изтегля р е а к ц и я т а на ля- (застъпен в кл. хим.
во(конкурира за NAD.HJ анализатори)
NH^ + рН-индикаторни бои промяна в ц в е т а удобен за експресни прилага се в анализато­
(крайнототочков) анализи ри,ползващи многослойни
филми (Kodak Ektachem)
или л е н т и (Reflotron)
глутамии
NH4 + 2 L - г л у т а м а т + АТР *• ADP + 2 L-глутамин предимство - спеюпрофо- 1106 метод
синтетаза т о м е т р и ч н о определяне
пируват 4
ADP + 2 фосфоенолпируват кшшза ^ + пи
РУват във видимата област
пируват + 2Н 3 Р0 4 + 2O2 + 2Н 2 0 п " р у a i n » 2 ацетилфосфат + 2СО2 + 2Н202
оксиоязд
перокси
2Н 2 0 2 + фенол + 4 аминофеназон хинон-моноиминово багрило
директна кондензация с образуване на цветен продукт
урея + диацетил-монооксим *- диазин (жълто оцветяване) токсични реактиви, историческо значение
ниска специфичност
Н*
урея + о-фталалдехид изоиндолин + не се влияе о т нивото на използва се в някои
Н* ендогенния NHj, силна анализатори
^ ( Ь н а ф т и л ) етилендиамин цветен продукт интерференция на сулфо-
медикаменти
пробата се разрежда с познато количество маркирана висока специфичност дефинитибен
урея; регистрира се индекс о т два изотопа
>
 Таблица 30.2. А н а л и т и ч н и м е т о д и з а определяне н а к р е а т и н и н
Метод Принцип (химическа ре акция) Коментар Оценка н а м е т о д а

1. М е т о д и н а п р и н ц и п а он
на реакцията на креатинин + п и к р а т комплекс на Janovski (червен)
J a f f e (1886)
• JafTe без адсорбция к р е а т и н и н ъ т в обезбелтъчен ф и л т р а т образува с п и к р а т интерференция (повишение) о т пируват, историческо
(крайноточкоб) в алкална среда оранжево червен комплекс а ц е т о а ц е т а т , ацетон, глюкоза, пикочна значение
(Ащях = 520-540 п т ) киселина, г л у т а т и о н , в и т а м и н С, цсфало-
спорини. фалшиво по-ниски р е з у л т а т и
при хипербилирубинемия и повишен хемо­
глобин в серума
Jaffe с адсорбция к р е а т и н и н ъ т в предварително обезбелтъчен ф и л т р а т се висока специфичност, липсва интерферен­ обявен за референ-
(крайноточкоб) адсорбира върху фулерова п р ъ с т , р е а к т и в на Lloyd, или в йоно- ция о т по-горе изброените вещества, но т е н преди сегашния
обменни смоли, след к о е т о образува с п и к р а т в алкална среда поради г о л я м а т а т р у д о е м к о с т и невъз­
ж ъ л т о оцветен комплекс м о ж н о с т за а в т о м а т и з и р а н е не се
прилага р у т и н н о
Jaffe - кинетичен к р е а т и н и н ъ т се определя директно в серум (без обезбезлтъча- специфичен, интерферация само о т най-широко прила­
ване) чрез с к о р о с т т а на образувания комплекс (креатинин с и -кетокиселини и цефалоспорини гания м е т о д
п и к р а т в алкална среда) (до 2 часа след приемането на с ъ о т ­ р у т и н е н - клас А
в е т н а т а доза); изисква а в т о м а т и з а ц и я
2. Е н з и м н и м е т о д и
(многостъпални) референтен
креатинин КК
• Креатининамино- креатинин креатин + АТР • креатинфосфат + Л1)г изисква по-голямо количество плазма и няма широко
хидролаза/креатинки- аминох идролаза преинкубация приложение
ПК
наза (КК) ADP + фосфоенолпируват - АТР + п и р у в а т
п и р у в а т + NAD.H2 л а к т а т + NAD
креатинин
• Креатининамино- креатинин + Н2О - креатин а в т о м а т и з и р а н за Kodak Ektachem и др. потенциален
хидролаза
хидролаза/НгОг анализатори; интерференция о т лидо- заместник на
креашиназа
креатин + Н20 — саркозин + урея каин; не се влияе о т а ц е т о а ц е т а т или Jaffe
саркозин цефалоспорин
саркозин + Н 2 0 + О2 о к с и д а з а — г л и ц и н + формалдехид +
ПОД
Н 2 0 2 + 4 аминофеназон + фенол хинон-моноиминово багрило
3 М е т о д и с йонселек- виж ч а с т 2. глава 10 а в т о м а т и з и р а н за Весктап анализатори удобен за спешни
тивни електроди анализи
ОН
4 Реакция на креатини- креатинин + DNBA- червен ц в я т а д а п т и р а н в експресните сухи т е с т о в е ; ориентировъчен
н а с 3,5 - д и н и т р о б е н - по-малка с т а б и л н о с т на ц в е т н и я продук
з о е н а к и с е л и н а (DNBA)
5. HPLC о б р а т н а фаза или к а т и о н е н обмен високоспецифичен, изисква предварителни предложен за
процедури референтен
 J Ш К Х И Ц Ч UtJ.eS. ГЛПГЬУитИЧПИ J " OllJJC^CJWlIl«. i m lluKOlllC»

Метод Принцип (химическа р е а к ц и я ) Коментар Оценка на м е т о д а

№2СОз/ОН-
1. К о л о р и м е т р и ч е н с Пик. к-на + фосфоволфрамова к-на С0 2 + неспецифичен, изисква предварител­ използва се по-рядко
фосфоволфрамоба алантоин + волфрамово синьо (А тах = 700 п т ) но обезбелтъчаване
киселина

2. Ензимни м е т о д и б а з и р а т се на начална реакция с уриказа: високоспецифичен ензим

уриказа
пик.к-на + 0 2 алантоин + С0 2 + Н 2 0 2

• измерване на измерва се понижение на абсорбцията при 293 п т , интерференция о т ксантин във ви­ кандидат за
диференцирана след разграждане на пикочната киселина сока концентрация; използва се в референтен
абсорбция някои анализатори (Du Pont)

• спрегната ензимна Н 2 0 2 + фенолови деривати (DCBS + TBI) + използва се в много анализатори; р у т и н е н - клас А
реакция (I) понижение при хипербилирубинемия
ПОД
4 аминоантипирин •хинон-моноиминово ( >50 mmol/1) и вит.С, които раз­
багрило г р а ж д а т Н 2 0 2 , а м ъ т н и н а или липе-
мия, повишават р е з у л т а т а
каталаза
• спрегната ензимна Н202 + е т а н о л • Н 2 0 + ацеталдехид лесно се автомаизира популярен м е т о д
реакция (П) алдехид
ацетлдехид + NAD.H2 • а ц е т а т + NAD
дехидрогеназа

3 HPLC използват се няколко т и п а йонобменни колони висока специфичност; предварител­ референтен

или с о б р а т н а фаза на обработка на пробите
4. IDMS и з о т о п н а п р о б а т а се разрежда с познато количество висока специфичност дефинитивен
дилуция/мас- маркирана пикочна киселина; регистрира се индекс
спектрометрия о т два изотопа

сл
ю
-3
Таблица 30.4. Аналитични методи за определяне на амоняк
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка на м е т о д а
ГлДХ
1. Ензимни NH4 + а - к е т о г л у т а р а т + NADP.H2 • определя се к о н ц е н т р а ц и я т а на р у т и н е н - клас А
г л у т а м а т + NADP + Н2О NH^NH^) - точен; възпроизводим;
може да се а в т о м а т и з и р а ; широко
използван

2. Й о н о о б м е н н о NH3 се абсорбира върху Dowex-50 смола и след елои- интерференция о т аминокиселини не се използва
usoAupane/Berthelot ране се определя с фенолхипохлорит в присъствие и хидроксиламин; продължителни
на натриев нитропрусид (А тах = 540-590 п т ) процедури

3. Й о н с е л е к т и б н и дифузията на NH3 през селективна мембрана висока ч у в с т в и т е л н о с т , добра въз- по-рядко използван
електроди причинява промяна в pH, к о я т о се измерва производимост и т о ч н о с т , проблем
потенциометрично е с т а б и л н о с т т а на мембраната,
автоматизиран

4. Микродифузия NH3 се освобождава в алкален разтвор и се определя продължителни процедури, лоша историческо значение
n o Conway т и т р и м е т р и ч н о с киселина възпроизводимост и т о ч н о с т
 ШАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
JA ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ГЛЮКОЗА
LТ.Цветкова
Определянето н а г л ю к о з а т а 6 к р ъ в т а е едно
) т най-масовите изследвания в к л и н и ч н а т а
лаборатория. В п р а к т и к а т а г р а ж д а н с т в е -
ю с т е придобило п о н я т и е т о кръвна захар.
3
ЕФЕРЕНТНИ ГРАНИЦИ
МЕТОДИ И ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ
Ja получаване н а сравними р е з у л т а т и о т
пследване н а г л ю к о з а т а се п р е д п о ч и т а из-
:ледването н а глюкоза в серум или п л а з м а
) т капилярна или венозна кръв. К о н и е н т р а -
д и я т а н а г л ю к о з а т а във венозна кръв е с 0.1-
).2 mmol/1 по-ниска в сравнение с капилярна
фъв. Глюкозата в серума ( п л а з м а т а ) е с 0.55-
L.ll mmol/1 по-висока о т т а з и в е р и т р о ц и -
т ш т е и с около 0.3-0.6 mmol/1 по-ниска о т
дивото в п л а з м а т а .
За изследване н и в о т о н а г л ю к о з а т а е пре-
ю р ъ ч и т е л н о използването н а предназначе­
н и т е за ц е л т а е п р у в е т к и ( з а т в о р е н а с и с т е -
и а з а в з е м а н е н а кръв) с и н х и б и т о р и н а
ш л к о л и з а т а в комбинация с антикоагулан-
ии: NaF (2.5 m g / m l кръв)/калиев о к с а л а т
2.0 m g / m l кръв); н а т р и е в й о д а ц е т а т (0.5
Hg/ml кръв) / хепарин (14.3 U/ml кръв) или
маноза (2 m g / m l кръв) и NaF (2 mg/ml) с ан-
тшкоагулант. Флуоридът инхибира ензима
енолаза в г л и к о л и т и ч н а т а верига, йодаце-
т а т ъ т п о т и с к а глицсролалдехид-З-фосфат-
дехидрогеназата, а м а н о з а т а - хексокина-
зата. Доказано е, че в п ъ р в и т е 3 часа след
Зземането на к р ъ в т а при здравни лица, глю­
к о з а т а намалява средно с около 15% о т из­
годното ниво, н а 4.- 5. час з а г у б а т а д о с т и г а
до 20%, а след 15.- 20. час - до 40%. При нали-
•ше н а инхибитори (NaF или й о д а ц е т а т ) н а
гликолизата к о н ц е н т р а ц и я т а на глюкозата
з с т а в а непроменена най-малко 3 дни. Мано­
з а т а има к р а т ъ к е ф е к т - само около 4 часа
:лед вземане н а к р ъ в т а , поради к о е т о се
комбинира с NaF.
В кръвни проби с висока к о н ц е н т р а ц и я на
\ е в к о цити, е р и т р о ц и т и или т р о м б о ц и т и
н а с т ъ п в а много бърза консумация на глю­
к о з а т а , преди д е й с т в и е т о на инхибитори-
т е , к о е т о т р я б в а да се има предвид при т ъ л ­
куване на р е з у л т а т и т е . Освен т о в а , ако при
новородени к р ъ в т а е в з е т а без инхибитори
н а гликолизата, може над 68% о т глюкоза­
т а (поради високия х е м а т о к р и т ) да бъде
консумирана, ако а н а л и з ъ т се проведе 3-5 ча­
са след вземане н а к р ъ в т а .
По-ниското ниво н а глюкозата в серума
се обяснява с н е й н а т а консумация по време
н а съсирване на к р ъ в т а .
Референт и и г р а н и ц и
новородени 1.1-3.3 mmol/1
деца и в ъ з р а с т н и 2.8-6.1 mmol/1
гранични с т о й н о с т и 6.2-7.8 mmol/1
М е т о д и т е за измерване концентрация­
т а н а к р ъ в н а т а глюкоза и т е х н и т е прин­
ципи са представени в т а б л . 30.5.
Върху кръвнозахарното ниво в л и я я т ре­
дица мед и к амен ти - in угоили in vitro{табь..
30.6). Биологичното въздействие (фармако­
логична интерференция) п о к а з в а т глюкокор-
пгикоиди, тиазидни диуретици, адреналин
след парентерално приложение. Бета-адре-
нергичните блокери п о т е н ц и р а т хипоглике-
м и ч н о т о д ей стви е н а а н т и д и а б е т и ч н и т е
с р е д с т в а при диабетици, т ъ й к а т о т е по­
т и с к а т чернодробната гликогенолиза. Мно­
го т е ж к и хипогликемии м о г а т да н а с т ъ п я т
у болни, получаващи бета-блокери и п о с т а ­
вени на хемодиализа. А н а л и т и ч н а т а и н т е р ­
ференция (по химичен п ъ т ) се у с т а н о в я в а
при значителен брой медикаменти. Фалши­
во по-ниски с т о й н о с т и за глюкозата се наб­
л ю д а в а т при рязко повишена концентрация
в к р ъ в т а на някои ендогенни или екзогенни
редурцираши в е щ е с т в а - пикочна киселина,
креапгинин, в и т а м и н С. Те в ъ з п р е п я т с т ­
в а т окислението н а хромогена о т Н 2 0 2 при
глюкозооксидазния м е т о д . Някои о т посо­
ч е н и т е в т а б л и ц а т а медикаменти и м а т и
фармакологична, in iwo интерференция: ко­
феинът и теофилинът увеличават черно­
д р о б н а т а гликогенолиза, а салииилапгите $
големи дози и м а т хипогликемичен е ф е к т ,
т ъ й к а т о т е с т и м у л и р а т поемането на
г л ю к о з а т а в т ъ к а н и т е и увеличават анае­
р о б н а т а гликолиза. Хепарин, NaF, EDTA и ок­
с а л а т не о к а з в а т интерференция върху ме­
т о д и т е за определяне на глюкоза.
П о д г о т о в к а т а н а п а ц и е н т а е съгласно
о б щ и т е изисквания към условията за взема­
не н а биологичен м а т е р и а л .
С т р и к т н о т р я б в а да се изисква спазва-
529
g Т а б л и ц а 30.5. А н а л и т и ч н и м е т о д и з а определяне н а глюкоза
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а

1. Ензимни
• с хексокиназа 1 хексокиназната система включва две свързани реакции висока т о ч н о с т и възпроизводимост; база за р е ф е р е н т н и я
„ хексокиназа „ „ . , а в т о м а т и ч е н анализ метод
Гл + АТР — •Гл-в-фосфат + ADP
Гл-6-фосфат
Гл-6-фосфат + NADP >>6-фосфоглюконат + NADP.H2
дехидрогеназа
(повишаване на абсорбцията, А т а х = 340 п т )

- вариант със съче­ използва се феназин-метасулфат (FMS) и йод н и т р о т е т р а з о - удобен за о т ч и т а н е във в и д и м а т а област р у т и н е н - клас А
тана индикатор­ лиум (INT), при к о е т о измерването на абсорбцията е във ви­
на реакция д и м а т а област. INT се редуцира о т NADP.H2 до образуване на
цветен продукт (А тах = 520 п т )
глюкозо
• с глюкозо- а) Гл + Ог + Н2О — - — >• глюконоба киселина + Н 2 0 2 добра възпроизводимост и висока т о ч н о с т ; р у т и н е н - клас А
оксидаза
оксидаза' пероксидаза
удобен за а в т о м а т и з и р а н е ; върху в т о р а т а ре­
б) Н 2 0 2 + 4-аминоантипирин + фенол ^-хинон- акция интерференция о к а з в а т пикочна кисели­
моноиминово багрило + Н 2 0 на, билирубин, в ит .С к а т о причиняват фалши­
во по-ниски р е з у л т а т и , т ъ й к а т о се конкури­
р а т с хромогена за НгО.,

вариант с отчи­ измерването е чрез използване на кислороден електрод, кой­ много добра т о ч н о с т , възпроизводимост и ли­ р у т и н е н - клас А
тане консумация т о определя кислородната консумация след прибавяне на нейност; без интерференция; висока корелация
на0 2 ® пробата към разтвор, съдържащ глюкозооксидаза с референтния м е т о д ; а в т о м а т и з и р а н

глюкозо
с глюкозодехид- Глюкоза + NAD дехидрогеназа
—>• глюконолактон + NAD.H.,- удобен за а в т о м а т и з и р а н е използва се по-рядко
рогеназа (повишаване на абсорбцията, А ^ = 340 п т )

. Неензимни
o-Toluidine4 o-Toluidine + ß-D-глюкоза ->-глюкозамин (цветен продукт) о-толуидина е канцероген; интерференция вече историческо
К т х = 630 п т о т галактоза, маноза, м ъ т н и н и значение

^ Х е к с о к и н а з а т а катализира фосфорилирането н а глюкозата в присъствие на АТР, к а т о се образува Гл-6-Р и ADP. В т о р и я т ензим - глюкозо-
6 - ф о с - ф а т д е х и д р о г е н а з а к а т а л и з и р а о к с и д а ц и я т а н а Гл-6-Р, при к о е т о NADP преминава в р е д у ц и р а н а т а си форма - NADP.Ho Измерва се
повишаване н а а б с о р б ц и я т а (Агпах = 340 п т ) . К о г а т о глюкозо-6-фосфатдехидрогеназата е получена о т дрожди се използва NADP, а к о г а т о
и з т о ч н и к ъ т е бактериален (Leuconostoc mesenteroides) се изисква NAD. Р е ф е р е н т н и я т м е т о д за определяне на г л ю к о з а т а се основава на
т о з и принцип, но се използва обезбелтъчен ф и л т р а т о т п р о б а т а , к о е т о е т в ъ р д е трудоемко за р у т и н н и цели. Серум или плазма м о г а т да б ъ д а т
използвани директно при наличие н а "празна!' проба за корекция на интерфериращи субстанции с Агпах = 340 п т . В много лаборатории не се
работи с "празна" проба, поради к о е т о получените с т о й н о с т и са по-високи спрямо референтния м е т о д . Повечето търговски лиофилизирани
реактиви са а д а п т и р а н и към дискретни анализатори, но следва да се знае, че хексокиназата и глюкозо-6-фосфатдехидрогеназата м о г а т да се
имобилизират върху в ъ т р е ш н а т а повърхност н а п л а с т м а с о в и т е шлаухи. Комбинираната специфичност на д в а т а ензима - хексокиназа и глюкозо-
Н рЛстпаттгъчно bucoKa Концентрация tt серума, 5а ра о к а ж а т плияние. лемоличата окачоа интер(1)ерени,ия. т ь и к а т о еритрицишншпе ^лнтши-и-
фосфатдехидрогеназа и 6-фосфоглюконатдехидрогеназа използват NADP+ к а т о с у б с т р а т . Корекцията с "празно:' проба е особено важна при
силна хемолиза, иктер или мътнина на пробите. Основната слабост на хексокиназната система е високата цена на ензимите.

^Тлюкозооксидазата е високоспецифичен ензим за ß-D-глюкоза. Воден разтвор на глюкоза съдържа около 1/3 a-D-глюкоза и 2/3 ß-D-глюкоза,
които са в равновесие. Това налага глюкозните с т а н д а р т и , ползвани за глюкозооксидазния м е т о д да се о с т а в я т поне за 2 часа за достигане на
равновесие в сместа. Тази предпазна мярка не е необходима за хексокиназния метод. При окисление на ß-глюкозата под действие на глюкозоок-
сидазата, a-глюкозата се превръща в ß-форма. Глюкозооксидазата в някои случаи съдържа ензима м у т а р о т а з а , който ускорява т о з и процес.
Глюкозната концентрация е пропорционална на продуцирания Н 2 0 2 или на консумацията на кислорода - 0 2 , които м о г а т да б ъ д а т измерени.
Пероксидазата катализира окислението на хромогенен акцептор на О^, напр. o-dianisidine до формиране на цветен продукт, който се
измерва фотометрично. Тази реакция е по-малко специфична, отколкото глюкозооксидазната реакция. Използват се и други багрила, напр. 3-
methyl-2-benzolinone hydrazone (MBTH), който окислително се свързва с N^-dimethylaniline (DMA) - т ъ й нар. реакция на Gochman. Окислителното
свързване на 4-aminophenazone ( = 4-aminoantipyrine) с phenol (или фенолови производни) е т ъ й нар. реакция на Trinder. Тези реакции са подложени
на по-малка интерференция о т високи концентрации на креатинин, пикочна киселина или хемоглобин. Ниски резултати м о г а т да бъдат полу­
чени, ако глюкозооксидазата е замърсена с катшаза, т ъ й к а т о последната разгражда Н^О^. Основното предимство на глюкозооксидазния
метод е неговата ниска цена.
Съчетаната глюкозооксидазна процедура е адаптирана за голям брой автоматични анализатори, вкл. и такива за с у х а т а химия - реактиви
под формата на ленти или филм. Kodak Ektochem с и с т е м а т а използва глюкозооксидазно покритие върху сух многослоен филм с индикаторна
система подобно на използваната в реакцията на Trinder, а о т ч и т а н е т о е чрез рефлектометрия.

^При т о з и метод се о т с т р а н я в а т интерфериращите фактори в с т ъ п к а т а с пероксидаза на глюкозооксидазния метод. Натрупаният Н202

може да бъде отстранен с етанол или йодид:
глюкозо
в-В-глюкоза + Оо ; >- глюконова киселина Н.>0,
оксидаза

каталаза „ „
Н 2 0 2 + С2Н5ОН СНзСНО + 2 Н 2 0 , или

Н 2 0 2 + 2Н+ + 2 1 >-12 + 2Н 2 0
в присъствие на м о л и б д а т
Последните две реакции са необходими, за да предпазят образуването на 0 2 о т Н 2 0 2 под действие на каталазата, която ч е с т о е замърсител на
глюкозооксидазата. Пълна кръв не се използва (живите клетки използват 0 2 ).

^Реакцията с о-толуидин се счита к а т о най-специфичната о т неензимните методи за определяне на глюкоза. Тя се осъществява между ароматен
амин и глюкоза в присъствие на оцетна киселина при загряване. Някои алдохексози или алдопентози (галактоза и маноза) реагират с о-толуидина
до поява на цветен продукт и при високи нива са източник на грешки.
н е т о н а всички общи и специфични условия
при провеждане н а пероралния г л ю к о з о т о -
л е р а н т е н ш е с т . Т я х н о т о неспазване п р а в и
и з в ъ р ш в а н е т о м у б е з п р е д м е т н о . Тези изис­
квания с а к а к т о следва:
• Една седмица преди провеждане н а т е с т а
т р я б в а д а се п р е к р а т и п р и е м а н а опреде­
лени л е к а р с т в е н и с р е д с т в а : п е р о р а л н и
контрацептивни медикаменти, естроге-
ни, т и а з и д н и д и у р е т и ц и , к о р т и з о л , алфа-
метилдопа, транквилизатори, б а р б и т у -
р а т и , с а л и ц и л а т и , ф е н и л б у т а з о н и др.;
• При жени м е н з и с ъ т д а е приключил най-
малко преди 3 дни;
• П а ц и е н т ъ т д а не е прикован н а легло и д а
Таблица 30.6. Лекарствена интерференция in vitro върху р е з у л т а т и т е о т изследване
на глюкоза в кръвта
Медикамент Ефект Върху с т о й н о с т т а
Ацетаминофен повишава
Витамин С намалява
Кофеин повишава
L-Допа намалява
Изониазид повишава
Римифон повишава
Салицилати повишават
Тетрациклини намаляват
* Глюкозооксидазен е колориметричен завършек
ПЛАЗМЕНИ ЛИПИДИ
И ЛИПОПРОТЕИНИ
АНАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
А. К и р я к о в
П л а з м е н и т е липиди ( т а б л . 30.7) с а п о л я р ­
н и (симфипатични) и н е п о л я р н и (хид­
рофобни) съединения. Полярни липиди с а
м а с т н и т е киселини (МК), ф о с ф о л и п и д и т е
(ФЛ) и свободният (неестерифициран) холес-
т е р о л (СХОЛ). Д о к а т о М К в г о л я м а т а с и
ч а с т са „молекулно" свързани с албумин (една
молекула албумин и м а 6 п о с т о я н н и м е с т а
з а с в ъ р з в а н е с д ъ л г о в е р и ж н и М К ) , ФЛ
( л е ц и т и н ъ т и сфингомиелинът) - с л у ж а т
к а т о повърхностноактивни субстанции,
улесняващи р а з т в о р и м о с т т а н а неполярни-
ш е , хидрофобни е с т е р и н а х о л е с т е р о л а
532
н е е фебрилен;
• П а ц и е н т ъ т д а не е с хипокалиемия или
хипомагнезиемия;
• Три дни преди т е с т а д а не се огранича­
в а т в ъ г л е х и д р а т и т е , т ъ й к а т о т о в а води
до н а м а л е н т о л е р а н с к ъ м г л ю к о з а т а . Ди­
е т а т а т р я б в а д а с ъ д ъ р ж а балансирана
калорийна о с и г у р е н о с т и д а включва 200-
250 g в ъ г л е х и д р а т и дневно. Много б о г а т а
н а в ъ г л е х и д р а т и д и е т а преди т е с т а води
до н и с к а в ъ г л е х и д р а т н а крива (повишен
толаранс към глюкозата);
• През п о с л е д н и т е 10-12 h преди т е с т а па­
ц и е н т ъ т не т р я б в а д а приема храна.
Лабораторен т е с т
глюкозооксидазен*
глюкозооксидазен
глюкозооксидазен
глюкозооксидазен
глюкозооксидазен
хексокиназен
хексокиназен и глюкозооксидазен
глюкозооксидазен
(ЕХОЛ) и т р и г л и ц е р и д и т е (ТГ). Тъй к а т о ФЛ
се с и н т е з и р а т във всички органи, т е с л у ж а т
в л и п о п р о т е и н и т е (ЛП) и з ц я л о к а т о
„емулгатори". Различен е с л у ч а я т с ТГ и
ХОЛ. ТГ се п о е м а т с х р а н а т а или произли­
з а т о т ч е р н и я д р о б и т р я б в а д а се т р а н с ­
п о р т и р а т д о п р и ц е л н и т е органи, к ъ д е т о
с л у ж а т к а т о и з т о ч н и к н а енергия. Холес-
т е р о л ъ т (ХОЛ) и м а х р а н и т е л е н произход
(екзогенен ХОЛ) или се с и н т е з и р а във всички
к л е т к и н а о р г а н и з м а (ендогенен ХОЛ), но
заради икономия н а енергия к л е т ъ ч н и т е
п о т р е б н о с т и се з а д о в о л я в а т предимно с
ХОЛ о т фонда н а п л а з м е н и т е ЛП и при из­
ползване н а специфични механизми. К а т о
с о б с т в е н клас н а липиди се п р и е м а т м а с т -
н о р а з т в о р и м и т е в и т а м и н и A, D, Е и К.
П р е д п о с т а в к а з а т я х н а т а резорбция и
т р а н с п о р т в с ъ с т а в а н а п л а з м е н и т е ЛП е
н а л и ч и е т о н а определени а п о л и п о п р о т е и н и
аблица iW.7. Оснобни 1сласо6е плазмени липиди
Липиди Функция
lenoi-vjipnu ( н е у т р а л н и ) л и п и д и
- глицериди (моно- ди- и триглицериди) източници на енергия
- естери на холестерол транспортна форма на холестерол
Толлрни л и п и д и
- фосфолипиди (лецитин, сфингомиелин, улесняват р а з т в о р и м о с т т а на неразтворимите
лизолецитин, фосфатидилетаноламин, липиди; повърхностни липиди
фосфатидилсерин)
- холестерол градивен елемент на клетъчните мембрани;
изходно съединение за синтез на жлъчните
киселини и стероидните хормони
свободни м а с т н и киселини градивни елементи на сложните липиди; източници
на енергия
витамини Л, D, К, Е

т о Л П ) , преди всичко а п о В . Тези б и т а м и - влияния върху концентрацията на ХОЛ, респ. ТГ

и и з п ъ л н я в а т з а щ и т н а функция с п р я м о
ф а н с п о р т и р а щ и т е ги ЛП: с л у ж а т к а т о
нтиоксиданти и възпрепятстват
б р а з у в а п е т о п а n e p o k e u f j u и свобоу-
и р а д и к а ^ т , к о и т о о т своя с т р а н а са из-
з с т н и със своя висок а т е р о г е н е н и канце-
огенен п о т е н ц и а л .
)ЛКТОРИ НЛ ВЛИЯНИЕ ВЪРХУ
[ИВОТО НА СЕРУМНИТЕ (ПЛАЗМЕНИ)
ИПИДИ И ЛИНОНРОТЕИНИ
Ьюгоброшш ф а к т о р и - ендогенни и екзоген-
и м о г а т да в л и я я т върху р е з у л т а т и т е о т
зследването н а с е р у м н и т е липиди и липоп-
отеини. Например биологичната вариация
а н и в о т о н а ХОЛ д о с т и г а до 5-10%, д о к а т о
а р и а ц и о н н и я т к о е ф и ц и е н т за определяне-
10 му т р я б в а д а бъде < 3% (реална цел при
зползване на с ъ в р е м е н н и т е а в т о м а т и з и -
ани ензимни методи) . Намаление на обща-
ш вариация може д а се о с ъ щ е с т в и чрез две
ли т р и определяния н а изследвания пока-
ател, извършени през 1 до 6 седмици, к а т о
к о п ч а т е л п и л т р е з у л т а т е оередпе-
.ата стойност.
Влиянието на г е н е т и ч н и т е фактори върху
ръвните липиди ч е с т о е трудно за количестве-
а оценка, т ъ й к а т о особено при възрастни чле-
ове на фамилиите не винаги е възможно т о да
ьде разграничено о т влиянията на околната
зеда. Малка ч а с т о т генетичните дефекти са
зяснени досега. При една голяма ч а с т са налице
олигенни причини, които допълнително изиск­
а т още екзогенни нокси, за да се проявят к а т о
арушение на липидната обмяна. Генетичните
д о с т и г а т до 45-60%. До 14% о т вариацията на
серумния ХОЛ се обяснява с разлики във феноти-
па на апоЕ. Подобна вариация на ХОЛ е резултат
о т ХЬа1-пол11морфизлга. п а гена н а апоВ, до­
к а т о около 1% е вариацията на ХОЛ вследствие
влиянието на генния дефект п р и фамилна­
т а ХХОЛ. Предизвиканите о т диета или лекарс­
т в а изменения в нивото на ХОЛ могат също или
поне частично да са определени генетично.
Противно на краткотрайните, продължител­
н и т е диетични промени оказват ясно изразени
ефекти върху серумния профил на ЛП. Бедната
на мазнини диета и намалението на теглото по­
нижават сравнително бързо ЛМПП и ЛНП. При
лица с наднормено тегло често се откриват по-
високи концентрации на ТГ, ОХОЛ и ХОЛ-ЛНП, и
no-ниски на ХОЛ-ЛВП. Алкохолът причинява
отчетливо повишение на ТГ. Тютюнопушенето
повишава също ТГ и ЛПП, но понижава ЛВП. По­
вишената консумация на нефилтрувано кафе има
хиперхолестеролемично действие. Нивото на
ХОЛ-ЛВП, особено на ХОЛ-ЛВПд, се повишава под
влияние на алкохолна консумация.
Отделните антихипертензитиви и други ме­
дикаменти причиняват различен ефект върху ли-
пидните нива в серума (табл. 30.8). Лнтиконцеп-
т и в н и т е средства съобразно състава им о т ес-
трогени и геетагени и м а т различно влияние вър­
ху профила на ЛП.
Редица ендокринни заболявания (захарен диа­
б е т , болест на щитовидната жлеза, надбъбреци-
т е , чернодробни и бъбречни заболявания, хипер­
тония и др.) могат да повлияят концентрация­
т а на серумните липиди.
Наранявания и/или стрес могат чрез ендоген­
но освобождаване на катехоламини и стероиди
да предизвикат отчетливи изменения в серумни­
т е концентрации и състава на ЛП. Намаление­
т о на нивото на ХОЛ при миокарден инфаркт
може да достигне в течение на 24 h до 40%. Въз-
533
Т а б л и ц а 30.8. Някои лекарствени интерференции върху нивото на липидите и ЛП
Медикаменти охол
Неспецифични ß-рецепторни блокери
Селективни (^-рецепторни блокери
ß-рецепторни блокери с 18Л*
Uj-рецепторни блокери
ЛСЕ**-инхибитори
Калциеви а н т а г о н и с т и
Естрогени
Гестагени
**АСЕ - ангиотензин-конвертиращ ензим
можно е хоспитализацията също да предизвика
значимо намаление на ХОЛ-ЛВП. Тези находки под­
ч е р т а в а т значението на правилния избор на вре­
ме за провеждане на изследването на липидните
показатели. К а т о п р е п о р ъ ч и т е л н о услоОие
с е приема, че д и а г н о с т и ч н и т е и з с л е д в а н и я
на л и п и д и т е и ЛП т р я б в а д а с е и з в ъ р ш в а т
най-рано е д и н м е с е ц след п р е к а р а н м и о к а р -
ден и н ф а р к т .
Серумните нива на липидите и апоЛП на жени
с НЛП или ХЛП се изменят по време на бремен­
ност и показват стойности, по-високи о т физи­
ологичните. При т о в а ТГ се повишават средно 2
до 3 пъти, ХОЛ - 1.5 до 2 пъти, докато обаче ХОЛ-
ЛВП се изменя незначително. По т а з и причина
изследването на п л а з м е н и т е (серумните)
липиди и ЛП и м а о г р а н и ч е н а д и а г н о с т и ч ­
на и н ф о р м а т и в н о с т във в т о р а т а и т р е ­
т а т а т р е т и н а на бременността.
При вземане на венозна кръв в изправено поло­
жение липидните концентрации са с 10-12% по-
високи в сравнение с венепункция в легнало поло­
жение. В з е т а т а в седнало (за около 15 минути пре­
ди венепункцията) състояние кръв има с 5-6% по-
ниски липидни нива в сравнение с кръвта, в з е т а в
изправено положение. Триминутна венозна с т а з а
може да предизвиква повишение до 10% на серум­
ното ниво на ХОЛ. Продължителната венозна
с т а з а (над 2 min) и по-продължителното отделя­
не на серума о т кръвния съсирек предизвикват
повишена концентрация на ТГ.
Преди определянето на липиди и ЛП серумът,
респ. плазмата може да се съхранява в хладилник
при 40С до четири дни, при -20оС до ш е с т месеца
(за определяне на апоЛП до четири месеца) и при
-70оС - до една година без съществени промени в
нивото им. При продължителни студии препоръ­
чително е съхранението на пробите да с т а в а в
течен азот.
534
ХОЛ ДНП ТГ ХОЛ ЛВП
~ ~ TT 1
~ Т - TT i
~ ~-(1) Т - TT - - i
~ i (0 ~
~ — —
~ ~ ~ ~
1 i т Т
Т т 1 1
( | ) - несигурно понижение | - повишение
11 - силно повишение
РЕФЕРЕНТНИ ИНТЕРВАЛИ И РИСКОВИ
ГРАНИЦИ ЗА РАЗВИТИЕ НА ИБС
К а к т о к о н ц е н т р а ц и и т е н а п о в е ч е т о кли-
ничнохимични показатели, т а к а и т е з и на
много о т л и п и д н и т е и м а т нормално (Гау-
сово) разпределение с изключение н а липоп-
р о т е и н ( а ) (Лп(а)). П о н я т и е т о референтна
о б л а с т н а л и п и д н и т е п о к а з а т е л и не допри­
нася с ъ щ е с т в е н о за оценка н а атерогенния
риск, т ъ й к а т о в патофизиологичен смисъл
много к о н ц е н т р а ц и и о т р е ф е р е н т н а т а об­
л а с т м о г а т да б ъ д а т класифицирани к а т о
патологични. По т а з и причина п р а в о т о за
ползване н а л и п и д н и т е п о к а з а т е л и за цели­
т е н а п р о ф и л а к т и ч н а т а медицина са при­
добили к о н ц е н т р а ц и о н н и т е области, свър­
зани с п и с ъ к и в и с о к а т с р о г е н е н риск,
т.с. р и с к о в и к о н ц е н т р а ц и о н н и облас­
ти. Т я х н о т о дефиниране се основава н а дан­
ни о т големи, международни епидемиологич­
ни и клинични проучвания.
Д и с л и п о п р о т е и п е м и и (ДАН)
На популационно ниво концентрациите на ли­
п и д и т е в кръвния серум и в основните ЛП-
класове са непрекъснато изменящи се величини,
имащи голяма вариация. По т а з и причина всяка
дефиниция на дислипопротеинемиите (ДЛШ е по
необходимост а р б и т р а ж н а . За диагностични
цели концентрациите на ХОЛ и ТГ в кръвния се­
рум и в главните класове на ЛП л е ж а т в основата
н а к л и н и ч н а т а класификация на ДЛП. ДЛП е
налице тогава, к о г а т о серумните концентра­
ции на т е з и показатели (понякога и с е р у м н и т е
•нцентрации н а апоВ и други апоЛП) са извън
ад или под) о п р е д е л н и к о н и е н т р а ц и о н н и
Зхвати (референтни области). Тези
з н ц е н т р а ц и и , независимо о т т о В а дали
viam н о р м а л н о и л и а с и м е т р и ч н о р а з п р е -
зление, с е о п р е д е л я т к а т о п а т о л о г и ч н и ,
з г а т о с а н а д 90.-, р е с п . 9 5 . - п е р с е н т и л (Р^,
зсп. Pgj) или п о д Р 10 , р е с п . Р 5 н а т я х н о т о
олово и в ъ з р а с т о В о р а з п р е д е л е н и е В
еферентната област на общата
з п у л а ц и я . При п о в е ч е т о моногенни болести
а л и п о п р о т е и н о в а т а о б м я н а се о т к р и в а т
о н и е н т р а и и и н а ЛП, к о и т о с ъ щ е с т в е н о се
азличават о т г р а н и ч н и т е с т о й н о с т и н а с ъ о т -
• т н и т е референтни области.
олестерол
серума 25-40% о т ХОЛ е неестерифициран ("сво-
)денИ), о с т а н а л и я т ХОЛ (60-75%) е естерифи-
лран с н е н а с и т е н и МК (С16- и С18-МК). Диферен-
л р а н е т о н а д в е т е форми н а ХОЛ обикновено не
• извършва за р у т и н н а т а диагностика. Д в е т е
орми н а й - ч е с т о се о п р е д е л я т заедно к а т о общ
ЮЛ (ОХОЛ).
Поради с в о я т а малка р а з т в о р и м о с т във вода,
ОЛ се т р а н с п о р т и р а в серума изключително
fimo комплекс с апоЛП. О с н о в н а т а ч а с т н а се-
/мния ХОЛ се о т к р и в а в ЛП с ниска п л ъ т н о с т
ШП), д о к а т о о с т а н а л а т а ч а с т - в ЛП с висока
у ь т н о с т (ЛВП) и ЛП с много ниска п л ъ т н о с т
ШНП), и само малка ч а с т - в хиломикроните
IM). Изследването се провежда със серум или
лазма. К о н и е н т р а щ ш т е н а ОХОЛ и а т е р о г е н е н
аск са п р е д с т а в е н и н а т а б л . 30.9.
1аблица 30.9. Серумни концентрации на ОХОЛ
и риск за р а з в и т и е н а ИБС
Концентрации
Атерогенен
н а ОХОЛ
риск
( m g / d l (mmol/1))*
Писък < 200 (5.17)
Гранично висок 200-239 (5.17 - 6.18)
Висок > 240 (6.20)
Умерено висок 240-289 (6.20 - 7.45)
Преизчисляване н а к о н ц е н т р а ц и и т е :
ig/dl х 0.0258 = mmol/1
П р е з 1998 г. Е в р о п е й с к и т е д р у ж е с т в а п о
ардиология, а т е р о с к л е р о з а и х и п е р т о н и я
редложиха нови прицелни серумни концен­
трации з а ОХОЛ ( < 190 m g / m l (4.91 mmol/1)),
Г ( < 180 m g / d l ( 2 . 0 5 mmol/1)) и ХОЛ-ЛВП
> 4 0 m g / d l (1.03 mmol/1)) п р и и з в ъ р ш в а н е
н а в т о р и ч н а п р о ф и л а к т и к а ( з а болни с И Б С
и е други клинични прояви н а атеросклеро­
за) и н а първична п р о ф и л а к т и к а (за лица с
висок (> 20%) а б с о л ю т е н р и с к п о о т н о ш е н и е
н а ИБС з а с л е д в а щ и т е 10 години или п р и про­
е к т и р а н е к ъ м 6 0 - г о д и ш н а в ъ з р а с т ) . Сте­
п е н т а н а р и с к а с е о ц е н л в а в ъ з основа
н а п е т п о к а з а т е л л : пол, възраст, тю­
тюнопушене, ОХОЛ и с и с т о л и ч н о кръв­
но налягане.
М е т о д и т е з а изследване н а ОХОЛ с а пред­
с т а в е н и в т а б л . 30.10.
Триглицериди
ТГ са е с т е р на глицерол с т р и о с т а т ъ к а на МК,
при т о в а в човешките м а с т н и депа се с р е щ а т
преди всичко ч е т н и , неразклонени монокарбоно-
ви киселини, изградени о т 18 или 16 С-атоми и
съдържащи (напр. олеинова киселина) или несъ­
държащи двойни връзки (напр. палмитинова ки­
селина). Поради т о в а ТГ са смес о т различни
триацилглицероли. Т я х н а т а средна о т н о с и т е л ­
н а молекулна м а с а е 875. ТГ поради т я х н а т а
т р у д н а р а з т в о р и м о с т във водни р а з т в о р и се
т р а н с п о р т и р а т в комплекс с апоЛП под форма­
т а на ЛП. Б о г а т и на ТГ ЛП (БТГЛП) са ХМ, съ­
държащи екзогенни, получени о т х р а н а т а ТГ, и
с ъ д ъ р ж а щ и т е ендогенни, синтезирани в черния
дроб ТГ ЛП с м е ж д и н н а п л ъ т н о с т (ЛМП) и
ЛМПП.
Въпреки че много болни, прекарали миокар-
ден инфаркт, и м а т повишени нива на серумните
ТГ, все още се оспорва значението на ТГ к а т о
рисков ф а к т о р . Една в е р о я т н а причина з а т о в а
е о б с т о я т е л с т в о т о , че повишението на ТГ може
да бъде р е з у л т а т о т различни нарушения на об­
м я н а т а на ЛП, к о и т о о т своя с т р а н а довеждат
до образуването на различни БТГЛП с неравнос­
т о е н атерогенен риск. Все пак, БТГЛП т р я б в а
да се р а з г л е ж д а т поне к а т о потенциално а т е -
рогенни, поради к о е т о определянето на ТГ пред­
с т а в л я в а безусловен показател за липидната ди­
агностика.
Т а б л и ц а 30.11. Серумни концентрации на ТГ и
атерогенен риск
Концентрации на
Атерогенен
ТГ (mg/dl (mmol/1 ))*
риск
Подозрителен > 150 (1.71)
Повишен > 200 (2.28)
•Преизчисляване на к о н ц е н т р а ц и и т е :
mg/dl х 0.0114 = mmol/1
Д е ф и н и ц и я т а к а к т о з а ХХОЛ, т а к а и з а
535
 Таблица 30.10. Аналитични методи за определяне на холестерол
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка на м е т о д а
1. Колоримешрични
• реакция на холестеролът реагира с оцетен анхидрид и концен­ интерференция оказва историчеко
Liebermann-Burchard трирана сярна киселина в безводна среда, при което хипербилирубинемията значение
се образуват полимерни ненаситени въглеводороди;
протича процес на дехидриране с краен продукт хо-
лестан-хексоен-моносулфонова киселина с Ад^ =
630-690 п т
no Abell & Kendall обработване на серума с алкохолен разтвор на КОН трудоемък, бавен, но специфичен референтен
за освобождаване на свободен ХОЛ и осапунване на
естерите; след екстракция с петролеев е т е р се про­
вежда реакцията на Libermann-Burchard
реакция на Salkowski образуване на цветен (червено-виолетов) комплекс ниска аналитична надеждност историческо
между холестерол, соли на желязото и сярна киселина значение

2. Ензимни м е т о д и р у т и н е н - клас А
ХОЛ
а) общи е т а п и 1. ХОЛ-естер ->-свободен ХОЛ + МК бързи; подлежат на автоматизация; висока
естераза
аналитична надеждност; интерференция на
ХОЛ Hb > 2 g/1 и билирубин > 700 umol/1 при край-
2. Свободен ХОЛ + 02" •>-холестенон + Н 2 0,
оксидаза
ноточков метод, а при кинетичните, интер­
б) определяне на образу­ редукция на NAD или друг хромоген до образуване ференция на Hb > 10 g/1 и билирубин
вания Н202 при учас­ на цветен продукт > 1700 umol/1
т и е на пероксидазна
ензимна реакция
реакция на Trinder Н202 + 4-аминоантипирин + фенол n e P o k c u ^ a i a най-често използваната реакция в предлага­ използва се и за опре-
хинон-моноиминово багрило + Н 2 0 н и т е китове. деляне на ХОЛ с Ekta-
(А тах = 510) chem ана\изаторите
флуориметрично използва се флуоресцентно багрило изисква с ъ о т в е т н а апаратура.
чрез кислороден елек­ измерва се понижението на кислородното ниво по изисква съответен анализатор и поддръжка
трод - електрохимично време на окислението на холестерола (стъпка 2) на електрода и мембраната

. Хроматографски използва се GC или HPLC висока т о ч н о с т и възпроизводимост използва се при спе­

циални изследвания

. Изотопно разреждане пробата се разрежда с познато количество марки­ скъп и трудоемък дефинитивен
с мас-спектроскопия ран ХОЛ; регистрира се индекс о т два изотопа
 O i O

Memog Принцип ( х и м и ч е с к а ре акция) Коментар Оценка н а м е т о д а

1. К о л о р и м е т р и ч н и екстракция на ТГ с изопропанол, алкална хидролиза трудоемки, бавни и з о с т а в я т се

и окисляване на глицерола до формалдехид, който об­
разува с ацетил-ацетон в слаб оцетен разтвор дихи-
дролутидин (А,^ = 410-430 п т )

2. Ензимни след ензимна хидролиза (липаза, естераза) ТГ се опре­ подлежат на автоматизация; бързи, р у т и н н и - клас А
делят по освободения глицерол. Глицеролът се измер­ специфични и точни, адаптирани са
ва по-нататък с многостъпална, бърза реакция, за експресно определяне
която включва по няколко ензима в зависимост о т (рефлектометрия)
аналитичния вариант (вж отделно във фиг.30.1)

3. ф л у о р и м е т р и ч н и к а к т о при методи 1. образувания формалдехид се определя използват се рядко

флуориметрично

4. Х р о м а т о г р а ф с к и определяне чрез тънкослойна или газова хроматогра- определят се също ди- и моно- използват се
фия, или посредством HPLC глицериди в серума по рядко - само
за специфични цели

5. И з о т о п н о разреж­ пробата се разрежда с познато количество марки­ висока аналитична надеждност, скъп дефинитивен^
дане с мас-спектро- рани триглицериди; регистрира се индекс о т два и трудоемък
скопия изотопа

Л
С
оз
<1
 / .гицсролде-
хидрогепаза
Глицерол + N A D -•Дихидроксиацстои +
NAD.H 2
+
Измерва се спсктрофо-
ATP
тометрнчно ( Л т а х = 3 4 0 п т )

Глицеролкииаза

Глицерол-1-фосфат + AD1'
+
NAD
Фосфосиолпируват
Глицеролфосфат-
оксидаза + О 2 Фосфоенол -
Глицерол • I- Фосфаш-
дехидрогенат п u р уват ки ua ю

Дмхидроксиацетоифосфат + Пируват + АТР

Дихилроксиацетом + Н2О2
NAD.H 2 +
Д-хлорфеиол Измерва се смектрофотомет - NAD.H.
+ рнчно (A m i , x =340 nm)
4-аминофсназон ( ювтиена чувствителност при
ниска концентрация на ТГ)
Лактат-
Пероксчдаза
дехидрогепаза

Цветно съсдинснис Лактат + N A D

Измерва се колометрично Намалението на NADH е пропорционално
(Лшах=510пт) на концентрацията на ТГ. Измерва се
спектрофотометрично ( А т а х = 3 4 0 п т )
( понижена чувствителност при ниска
концентрация на ТГ)

Фиг. 30.1. Аналитични в а р и а н т и за определяне н а глицерола след ензимна хидролиза н а ТГ

една хипертриглицеридемия (ХТГ) е пробле­ т е з и случаи е препоръчително да се изследва без

м а т и ч н а вследствие н а г олеми т е физиоло­
гични отклонения н а с е р у м н о т о ниво н а ТГ
при здрави лица. К о н ц е н т р а ц и и т е н а I T и
а т е р о г е н е н риск с а п р е д с т а в е н и в т а б л .
30.11. Напоследък н а р а с т в а и н т е р е с ъ т не
само към ТГ, изследвани след 12-часов глад,
но и към п о с т п р а п д и а л н а т а ХТГ. Нейно­
т о определяне п р е д о с т а в я полезна инфор­
мация за оценка н а липолитичния капаци­
т е т при лица с хипо-а-ЛН и гранично висо­
ки концентрации на изследвани на гладно ТГ.
М е т о д и т е за изследване са представени в
та б л . 30.12. и фиг. 30.1.
В серума се о т к р и в а също и известно количес­
т в о (около 10 mg/dl) глицерол в свободна форма.
Това количество т р я б в а д а бъде извадено о т об­
щ а т а концентрация на изследвания глицерол, за
да се определи само т а з и ч а с т о т общия глице­
рол, к о я т о произлиза о т ТГ. Тази корекция, т . е .
намалението с 10 mg/dl н а изследваната след хид­
ролиза концентрация н а общия глицерол е д о с т а ­
тъчна, за да се определи с необходимата т о ч н о с т
серумното ниво на ТГ на здрави лица, изследвани
на гладно. При диабетици и чернодробно болни е
възможно да се о т к р и я т значително по-високи
концентрации на свободен глицерол в к р ъ в т а . В
538
хидролиза с ъ о т в е т н а празна проба. В р е з у л т а т
на с п о н т а н н а хидролиза полученият свободен гли­
церол (напр. при по-дълъг престой н а п р о б а т а на
с т а й н а т е м п е р а т у р а ) не т р я б в а да се съобразя­
ва при изчислението на к о н ц е н т р а ц и я т а на ТГ,
т ъ й к а т о т о й произлиза о т ТГ.
Плазмени липопротсипи
Липидите, к а к т о и д р у г и т е биомолекули в орга­
низма, о с ъ щ е с т в я в а т ф у н к ц и и т е си във водна
среда. Тъй к а т о л и п и д и т е с а водно неразтвори­
ми, з а д а м о г а т д а б ъ д а т т р а н с п о р т и р а н и с
к р ъ в н а т а плазма, т е т р я б в а да с а свързани
к а т о единични молекули със специфични транс­
п о р т н и протеини ( т а к и в а са напр. стероидните
хормони) или д а о б р а з у в а т мицелни комплекси с
п р о т е и н и ( к а к т о е напр. при АП).
АП н а лица, гладували 12 h, м о г а т да б ъ д а т
разглеждани к а т о микроемулсия. О т д е л н и т е
емулсионни ч а с т и ц и с а изградени о т два слоя:
ц е н т р а л н о ядро н а липиди и обвивка. Централ­
н о т о ядро е с ъ с т а в е н о о т неполярните ЕХОЛ и
ТГ, к а к т о и о т други м а с т н о р а з т в о р и м и субс­
т а н ц и и , к а т о напр. в и т а м и н и . О б в и в к а т а се
с ъ с т о и о т п о л я р н и т е ФА, СХОА, МК и апоАП с
1 б л и ц а 30.13. Патологични липопротеини
Големина Плътност Маса
ЛП
(пт) (g/ml) (MDa)
шХ 35 1.019 - 1.063 5 - 10
шУ 30 1.019 - 1.063 3-5
шЕ 15 1.063 - 1.125 0.5 - 1
-ЛМНП 30 < 1.006 40 - 80
•глехидратни о с т а т ъ ц и . Количеството на по-
р х н о с т н и т е субстанции е в термодинамич-
• благоприятно съотношение към количество-
D на липидите о т ц е н т р а л н о т о ядро. О т т о в а
€два, че п о ч т и всички ЛП на п л а з м а т а на здра-
. лица - о т най-големите ЛП, ХМ, с д и а м е т ъ р
1 ц т , до най-малките ЛП, ЛП с много висока
. ъ т н о с т (ЛМВП), с д и а м е т ъ р < 10 п т - и м а т
•ерична с т р у к т у р а .
В много ниска плазмена концентрация се о т -
т в а т ЛП, к о и т о н я м а т сферична с т р у к т у р а
са без или с много малко липидно ядро. Те се
ш е м а т за новосинтезирани ЛП или т ъ й нар.
асцентни" ЛП. Н а с ц е н т н и т е ЛП са изградени
п двоен слой ФЛ, ч и я т о периферия е покрита
п апоЛП.
Известни са също и патологични ЛП, к о и т о
фмално о т с ъ с т в у в а т и се о т к р и в а т при раз-
1чни първични и особено ч е с т о при вторични
Ш (чернодробни и бъбречни заболявания, diabe-
s mellitus, хипотиреоидизъм, бременност и др.).
т о т р а з е н и т е на т а б л . 30.13 патологични ЛП
лшос за л а б о р а т о р н а т а диагностика на III.
ип ХЛП има доказването на ß-ЛМНП. Тяхна-
а п л ъ т н о с т е < 1.006 g/ml, поради к о е т о ß-
VIHn се причисляват към ЛМНП. ß-ЛМНП са
върде богати на ХОЛ, и м а т изменен белтъчен
астав и на електрофореграмата не се откри-
im в npe-ß-, а в (^-позиция. При т о в а т я х н а т а
.ектрофоретична ивица е широка, поради кое-
0 т е се означават съшо и к а т о „широки fi-ЛП".
З о й н и т е npe-р-ЛП с а по-слабо дефинирани
Vinn, к о и т о електрофоретично се проявяват
две ивици.
Други патологични ЛП са ЛпХ и ЛпУ. Д в а т а
1 се о т к р и в а т в много високи серумни концен-
рации при холестаза, к а к т о и при недоимък
1 ензима ЛХАТ. ЛпХ е представен о т дископо-
)бни частици, богати на ФЛ и СХОЛ, но бедни
1 белтък (6%). Б е л т ъ ч н а т а състав ка на ЛпХ е
(градена о т албумин и апоС, но не о т апоВ. По-
Jama на ЛпХ в серума или п л а з м а т а се наблю-
1ва при болни с обструктивни заболявания на
лъчните п ъ т и щ а (интра- и екстрахепатална
)лестаза). За съжаление ЛпХ не може да бъде
)казван при всички случаи на холестаза и не е
к т а т ъ ч н о информативен за диференциална­
С ъ с т а в (в % с п р я м о ЛП-маса)
Про­
теин ФЛ СХОЛ ЕХОЛ ТГ
6 61 25 5 3
27 20 8 10 35
28 46 23 2 1
12 24 6 23 35
т а диагноза на иктера. На агарозна електрофо-
реграма ЛпХ се открива между с т а р т а и р-иви-
ц а т а . Количествена оценка на концентрацията
н а ЛпХ е в ъ з м о ж н а след п р е ц и п и т а ц и я н а
другите серумни ЛП с хепарин и цинков а ц е т а т ,
след което ЛпХ се определя по неговото съдър­
жание на ХОЛ в н а д с т о я щ а т а фракция. ЛпУ се
причислява към ЛНП, но има различен о т т я х
с ъ с т а в . ЛпУ с ъ д ъ р ж а апоВ и апоС, и при
чернодробни заболявания се открива в плазма­
т а заедно с ЛпХ.
ЛВП показват ч е с т о също значими измене­
ния при чернодробни болести. Така ЛпЕ, една раз­
новидност на ЛВП, освен апоА-1 и апоЛ-И съдър­
ж а голямо количество апоЕ.
АНАЛИТИЧНО РАЗДЕЛЯНЕ
И НОМЕНКЛАТУРА
НА ЛИНОИРОТЕИНИТЕ
Р а з д е л я н е т о н а ЛП с ъ о б р а з н о т я х н а т а
п л ъ т н о с т е и з в е с т н о още о т в р е м е т о н а
Gofman (1954 г.). П о н а с т о я щ е м се и з п о л з в а т
различни м е т о д и ч н и в а р и а н т и н а а н а л и ­
т и ч н о , респ. п р е п а р а т и б н о ултрацен-
т р о ф у г и р а и е з а и з о л и р а н е н а различ­
н и т е п л ъ т н о с т н и класоВе и субкласо-
Ое н а ЛН. Въз основа н а определени с т о й ­
н о с т и н а концентрационния максимум и
м и н и м у м н а д и с к р е т н и п л ъ т н о с т и , плазме­
н и я т с п е к т ъ р н а ЛП се разделя н а ч е т и р и
главни фракции:
• хиломикрони (ХМ);
• л и п о п р о т е и н и с много ниска п л ъ т н о с т
(ЛМНП);
• л и п о п р о т е и н и с ниска п л ъ т н о с т (ЛНП) и
• л и п о п р о т е и н и с висока п л ъ т н о с т (ЛВП).
Възможно е д о п ъ л н и т е л н о субфракциони-
р а н е н а всеки главен л и п о п р о т е и н о в клас
( т а б л . 30.14).
К л а с и ф и ц и р а н е т о н а ЛП по т я х н а т а
п л ъ т н о с т е с в ъ р з а н о с о п а с н о с т т а , че в
539
Т а б л и ц а 30.14. физични свойства на човешките плазмени класове на ЛП и субкласове на ЛВП
Плътност Електрофорстична
Клас (g/ml) подвижност
0.930 о с т а в а т на с т а р т а
ХМ
0.930 - 1.006 npe-ß-ЛП
ЛМНП
1.006 - 1.019 бавни npe-ß-ЛП
ЛМП
ЛНП 1.019 - 1.063 ß-АП
лвп2 1.063 - 1.125 а-ЛП
ЛВПз 1.125 - 1.210 а-ЛП
Лп(а) 1.040 - 1.090 бавни npe-ß-ЛП
патологични серуми ч е с т о погрешно се т ъ л ­
к у в а т о т д е л н и фракции, к о и т о в с л е д с т в и е
н а изменение н а о т н о ш е н и е т о липиди/бел-
т ъ к и противно на т я х н о т о протеиново
съдържание се р а з п р е д е л я т в п л ъ т н о с т н и
области, н е т и п и ч н и з а т е з и ЛП при нормо-
липопротеинемия (НЛП). В т а к и в а случаи е
оправдано и з п о л з в а н е т о н а д о п ъ л н и т е л н и
начини з а разделяне, к о и т о се о с н о в а в а т н а
други физикохимични с в о й с т в а н а ЛП (напр.
заряд или големина н а ч а с т и ц а т а ) .
Понастоягцем „изплуването" ( ф л о т а ц и я )
н а ЛП в у с л о в и я т а н а у л т р а ц с п т р о ф у г и -
р а н е при т о ч н о определена п л ъ т н о с т н а
серума (осъш,ествявашо се с прибавяне н а
KBr/NaCL к ъ м и з с л е д в а н а т а проба) служи
к а т о референтен метод з а р а з д е л я н е н а
о т д е л н и т е класове и субкласове н а ЛП.
Принцип:
Най-напред серумът се центрофугира (условия
на центрофугиране: п л ъ т н о с т (d)=1.006g/ml,
ускорение=105 000 д и продължителност^
20 h), при което ЛМНП (и ХМ при наличност)
изплуват на повърхността на пробата. О с т а ­
налите ЛП о с т а в а т в п о д с т о я щ а т а фракция
( и н ф р а н а т а н т 1) Центрофугиране на инфра-
н а т а н т 1 при d = 1.063 g / m l и а н а л о г и ч н и н а
първото ц е н т р о ф у г и р а н е у с л о в и л предиз­
виква флотация на ЛНП, докато ЛВП заедно с
другите серумни протеини о с т а в а т в подсто­
я щ а т а фракция ( и н ф р а н а т а н т 2). Центро­
фугирането на и н ф р а н а т а н т 2 при d=1.21 g / m l ,
н а 180 000 д и з а 40 h позволява о т д е л я н е т о на
ЛВП о т останалите серумни протеини.
Освен т о в а ЛВП м о г а т да б ъ д а т разделени
на два субкласа - ЛВП2 (d = 1.125 g/ml) и ЛВП,3
(d = 1.210 g/ml).
В лабораторната практика т о в а усложнено
тройно и консумиращо много време ултрацен-
трофугиране се заменя о т к о м б и н а ц и я т а н а
еднократно у л т р а ц е н т р о ф у г и р а н е с пре-
540
Диаметър Мол. м а с а
(пт) (Da)
75 - 1200 50 - 1000 х 106
30 - 80 10 - 80 х 106
25 - 35 5 - 10 х 106
18 - 25 2.3 х 106
9 - 12 360 000
5 -9 175 000
25 - 30 - 2 . 8 х 10б
ц и п и т а ц и я . При т о в а ЛМНП (и ХМ при налич­
н о с т ) се изолират чрез ултрацентрофугиране
при описаните по-горе условия, докато ЛНП о т
п о д с т о я щ а т а фракция, съдържаща к а к т о ЛНП,
т а к а и ЛВП, се п р е ц и п и т и р а т под влияние на
полианиони и двувалентни катиони. Накрая ЛВП
о с т а в а т разтворени в к р а й н а т а надстояща
фракция.
Електрофорстичпо разделяне
н а липопротеините
Въпреки р а з н о о б р а з н и т е м е т о д и з а анали­
т и ч н о или п р е п а р а т и в н о у л т р а ц е н т р о ф у ­
гиране все о ш е „ л и п о п р о т е и н о в а т а " е л е к т ­
рофореза се я в я в а с т а н д а р т н а т е х н и к а за
разделяне н а ЛП. Т я м о ж е д а бъде извърше­
н а върху различни н о с и т е л и (агарозен гел,
п о л и а к р и л а м и д е н гел, ц е л у л о з о а ц е т а т н и
фолии и др.). П л а з м е н и т е ЛП се р а з д е л я т на
т р и основни класа:
• сх-липопротеини ( и-ЛП)
• (^-липопротеини ф - Л П )
• п р е - р - л и п о п р о т е и н и (npe-ß-ЛП).
Е л е к т р о ф о р е з а т а и м а п р е д и м с т в о т о , че
ч е с т о м а л к и разлики в с к о р о с т т а н а прид­
в и ж в а н е н а ЛП с т а в а т доловими н а е л е к т -
р о ф о р е г р а м а т а и т а к а е възможно д а се раз­
п о з н а я т п а т о л о г и ч н и изменения, респ. ге­
н е т и ч н и д е ф е к т и н а ЛП, к о и т о с други ме­
т о д и м о г а т д а о с т а н а т с к р и т и . Покрай
т р и т е основни класа н а ЛП м о ж е д а се ус­
т а н о в и наличие н а ХМ, о с т а в а ш и н а с т а р ­
т о в о т о м я с т о на електрофореграмата.
В т а к а нар. „npe-fi-област" с подходя-
и щ т е х н и к а м о г а т д а б ъ д а т диференцира­
ни поне о ш е т р и субфракции:
• пре-^-ЛП, к о й т о п р е д с т а в л я в а н а й - ч е с т о
 Лп(а);
бавни или бързи npe-ß-ЛП;
nocm-а-ЛП.
Също m a k a , (х-ЛП се п р е д с т а в я т ч е с т о с
3 ивици. Всички т е з и субфракции и м а т по-
алко д и а г н о с т и ч н о значение, с изключение
i ш и р о к а т а ß-ивица. Т я е х а р а к т е р н а з а
I. т и п ХЛП ( ф а м и л н а д и с б е т а л и п о п р о т е и -
змия) и е и д е н т и ч н а с ф л о т и р а щ и т е ß-ЛП.
ринцип:
ьрху агарозен или полиакриламиден гел, или це-
'лозоацетатни фолии и при алкално pH ЛП се
139елят в посока на анода. Възникналите про-
еинови ивици м о г а т да б ъ д а т проявени с под-
)дящи бои (напр. суданшварц или ойлрот), чрез
зето се обективизират само ЛП. Освен т о в а
DU електрофореза върху агарозен гел е възможна
оеципитация с полианиони и двувалентни ка-
иони, след к о е т о у т а е н и т е ЛП се оценяват ко-
т е с т в е н о чрез дензитометрия. Електрофорез-
а т е ивици на ЛП м о г а т също да б ъ д а т изряза-
л и отново разтворени, чрез к о е т о се създава
ьзможност за директно изследване на съдър-
а н ие т о на ХОЛ в о т д е л н и т е ЛП.
Ф р а к ц и о н и р а н е т о н а ЛП т р я б в а д а с е
звършва с пресни серуми. П л а з м а т а не е
одходяща з а Л П - е л е к т р о ф о р е з а , т ъ й к а т о
а е л е к т р о ф о р е г р а м а т а допълнително се
о я в я в а ивица н а фибриногена.
К о г а т о с а налице ясно разграничени фрак-
ии н а ЛП и м а добро съгласуване м е ж д у ре-
/ л т а т и т е о т е л е к т р о ф о р е т и ч н и я анализ
референтния м е т о д {ултрацснтрофу-
ирапе).
В ъ з п р о и з в о д и м о с т т а н а м е т о д а зависи
т а н а л и з и р а н а т а ф р а к ц и я н а ЛП, но най-
бщо CV е < 5%. Л П - е л е к т р о ф о р е з а е т в ъ р -
е подходяща з а о ц е н к а н а к а ч е с т в о т о н а
pe-ß-ЛП при определени ХТГ, з а о т к р и в а н е
а п а т о л о г и ч н и ЛП, к о и т о не м о г а т д а бъ-
а т доказани чрез у л т р а ц е н т р о ф у г и р а н е
ли чрез п р е ц и п и т а ц и о н н и м е т о д и . Освен
ю в а , о т н о ш е н и е т о ß-ЛП/а-ЛП м о ж е д а с е
зползва з а о ц е н к а н а а т е р о г е н н и я риск.
Понякога се н а б л ю д а в а п р о м я н а във фор-
ш т а н а и в и ц а т а н а сх-ЛП, к о е т о е р е з у л т а т
т н а т р у п в а н е н а свободни М К върху (х-ЛП.
в ъ р з а н о т о с т о в а повишение н а и н т е н з и -
l e m a н а а - и в и ц а т а предизвиква надценяв а-
е н а о т н о с и т е л н а т а к о н ц е н т р а ц и я н а сх-
П.
В сравнение с у т а е ч н и т е м е т о д и , коли-
е с т в е н а т а Л П - е л е к т р о ф о р е з а е скъп и ико­
номически по-неизгоден м е т о д .
Преципитационни м е т о д и
Принцип:
Бързото изолиране на ЛП, респ. отделяне о т ос­
т а н а л и т е серумни протеини може да с т а н е срав­
нително селективно чрез използване на различни
утаители. Съдържащите апоВ ЛП се преципити-
р а т о т полианиони и двувалентни катиони или
о т нейонизирани полимери. К а т о у т а и т е л и се из­
ползват хепарин/Мп 2+ , хепарин/Са 2+ , декстран-
с у л ф а т / М ^ + , фосфоволфрамова киселина/]У^2 + ,
полиетиленгликол 6 000 или 20 000 и др. Класи­
ческите разработки в т а з и област принадлежат
на Burstein. Химическите основи на преципита-
ционните методи не са изучени в подробности.
Най-общо, т е з и реактиви преципитират ЛП съ­
образно големината на т е х н и т е частици и дейс­
т в а т главно върху ЛМНП и ЛНП.
П о н а с т о я щ е м у т а е ч н и т е м е т о д и нами­
р а т широко приложение в к л и н и ч н а т а хи­
м и я з а п р е д а н а л и т и ч н о т о изолиране н а ЛВП,
респ. ЛНП, п р е д ш е с т в а щ о о п р е д е л я н е т о н а
ХОЛ-ЛВП и ХОЛ-ЛНП. Р а з д е л е н и т е по т о з и
начин класове н а ЛП не к о р е с п о н д и р а т ви­
наги н а п л ъ т н о с т н и т е класове н а ЛП при
някои п а т о л о г и ч н и проби. В т е з и случаи се
н а ла г а и з п о л з в а н е т о н а у л т р а ц е н т р о ф у г и ­
р а н е или друга т е х н и к а з а фракциониране.
П ъ л н о т о у т а я в а н е н а всички плазмени ЛП е
възможно чрез използване н а д е к с т р а н с у л -
фат/Са2 +.
Ф р а к ц и о н и р а н е т о н а ЛП т р я б в а д а се из­
в ъ р ш в а с пресни серуми.
ХОЛ-ЛВП
Около 25% о т ОХОЛ се т р а н с п о р т и р а т със
с е р у м н и т е ЛВП. П р о т и в н о н а ЛНП, ЛВП из­
глежда и м а т з а щ и т н а функция спрямо раз­
в и т и е т о н а ИБС. А н т и а т е р о г е н н о т о зна­
чение н а ЛВП е у с т а н о в е н о в м н о ж е с т в о епи­
демиологични и клинични с т у д и и . Определя­
н е т о и м е о т значение з а ранно разпознава­
не н а а т е р о г е н н и я риск (определяне н а ч а с т ­
т а н а ОХОЛ, к о я т о н я м а а т е р о г е н е н п о т е н ­
циал), к а к т о и з а м о н и т о р и р а н е н а т е р а п и ­
я т а с антидислипидемични медикаменти
(под влияние н а т а к а в а т е р а п и я т р я б в а д а
се и з б я г в а н а м а л е н и е н а н и в о т о н а ХОЛ-
ЛВП).
541
Т а б л и ц а 30.15. Серумни концентрации н а
Концентрации на
Атерогенен ХОА-АВП ( m g / d l ( m m o l / D )
риск
Мъже
Жени
Нисък >65 (1.68) >55 (1.45)
Гранично 65 - 45 55 - 35
висок (1.68 - 1.15) (1.45 - 0.90)
Висок < 45 (1.15) < 35 (0.90)
Концентрациите на ХОЛ-ЛВ11 и атероге-
нен риск са представени в табл. 30.15.
Цяла редица о т епидемиологични проучвания
през последните т р и декади у с т а н о в и с т р о г а
обратна връзка между к о н ц е н т р а ц и и т е н а ХОЛ-
ЛВП в серума и ч е с т о т а т а на ИБС сред попула­
ции о т Западна Европа и Северна Америка. Не­
зависимо о т изводите на т е з и проучвания, т о ч ­
н а т а роля н а АВП в а т е р о г е н е з а т а все още не е
окончателно изяснена. О т с ъ с т в и е т о н а пови­
шен риск за преждевременно р а з в и т и е н а ИБС у
пациенти с някои форми н а синдрома н а АВП-
недоимък дава сериозно основание да се ревизира
предполагаемата антиапгерогенна роля на ЛВП.
Възможно е, н и с к и т е серумни концентрации н а
ХОА-АВП у болни с повишен риск за ИБС да са
само израз на други атерогенни м е т а б о л и т н и
нарушения. Без о т г о в о р е и в ъ п р о с ъ т , дали
в и с о к и т е н и в а н а АВП с а с а м о с т о я т е л е н
з а щ и т е н ф а к т о р или по-скоро с а обикновен
маркер за други, много по-съществени промени
в метаболизма н а АП, к о и т о се н а б л ю д а в а т у
болни с високи нива н а ХОА-АВП.
В някои популации о т хора, привикнали
на бедна на мазнини и ХОД храна, плазмени­
Таблица 30.16. Вторични ф а к т о р и , повлияващи с е р у м н и т е нива н а ХОА-АВП
Намаление
ХТГ
Затлъстяване
Тютюнопушене
Андрогени
П у б е р т е т на м о м ч е т а т а
НИЗЗД
Намалена физическа а к т и в н о с т
Пробукол
Бедна на мазнини д и е т а
542
т е концентрации на ХОА-АВП и ХОА-АНП,
както и ч е с т о т а т а на ИБС са твърде нис­
ки. Това дава основание да се предполага, че
о б р а т н а т а корелация между ниските нива
на ХОА-АВП и високата ч е с т о т а на ИБС в
западните популации може да изисква ед­
новременното наличие на определена плаз­
мена концентрация на ХОА-АНП ( > 120 mg/
dl, респ. 3.1 mmol/1).
Намалените серумни нива на ХОА-АВП
м о г а т да са р е з у л т а т о т различни вторич­
ни фактори (табл. 30.16).
Фракционирането на ЛВП трябва да се
извършва с пресен серум или плазма. Тъй
к а т о при по-продължително съхранение
ХОЛ-АВП подлежи на изменение вследствие
на взаимодействие с другите АП, преципи-
т а ц и я т а (респ, друго изолиране на АВП)
трябва да се извърши в първите 24 h след
вземане на кръвта.
Методи з а изследване
За определяне на ХОЛ-АВП е необходимо ЛВП
да б ъ д а т изолирани о т другите АП. За тази
цел най-често използваният в лабораторна­
т а практика м е т о д е преципитацията на
съдържагците апоВ АП (ХМ, ЛМНП, ЛНП,
Лп(а)) с фосфоволфрамова киселина/М^ 2 + .
П р е д и м с т в о т о на т а з и преципитация е
о т с ъ с т в и е т о на интерференция с послед-
вашото ензимно определяне на ХОЛ-състав-
ка на ЛВП. В лабораторната практика ос­
вен м е т о д ъ т с фосфоволфрамова киселина/
Повишение
Физическа а к т и в н о с т
Консумация н а алкохол
Намаление н а т е л е с н о т о т е г л о
П р е к р а т я в а н е п у ш е н е т о н а цигари
Естрогени
Антидислипидемични л е к а р с т в а :
н и к о т и н о в а к-на и д е р и в а т и
фибрати
статини
анионобменни смоли
Фенитоин
Барбитурати
Б о г а т а н а мазнини д и е т а
I g 2 са р а з п р о с т р а н е н и и други м е т о д и ,
ри к о и т о п р е ц и п и т а ц и я т а се извършва с:
епарин/Мп 2 + , д е к с т р а н с у л ф а т / С а 2 + , поли-
тиленгликол 20 000 или полиетиленгликол 6
00.
П р е и и п и т а ц и о н н а т а т е х н и к а с полиети-
енгликол 20 000 позволява д и р е к т н о опре-
еляне н и в о т о н а ХОЛ-ЛВП;, след допълни-
1елно у т а я в а н е н а ЛВПг и и н д и р е к т н о ус-
1ановяване н и в о т о н а ХОЛ-ЛВПз. В супер-
а т а н т а след с е л е к т и в н о т о у т а я в а н е н а
ъ д ъ р ж а щ и т е апоВ ЛП е възможно изслед-
а н е т о н а ТГ- и ФЛ-съдържание н а ЛВП.
За съвременен сравнителен м е т о д за ХОЛ-
ЛШ служи п р е п о р ъ к а т а н а Lipid Research
Ilinics (LRC) в САЩ з а изследване н а ХОЛ-
Б П . Съобразно т а з и препоръка изследване-
.ю н а с е р у м н о т о н и в о н а ХОЛ-ЛВП с е
звършва в т р и е т а п а :
• в първия е т а п с е р у м ъ т се освобождава о т
ЛМНП (евентуално и о т ХМ) чрез у л т р а -
центрофугиране при d < 1.006 g / m l ;
• във втория е т а п с ъ д ъ р ж а щ и т е апоВ ЛП в
центрофужния и н ф р а н а т а н т ( ф р а к ц и я
1) се п р е ц и п и р а т и чрез обикновено (нис-
кооборотно) центрофуг и ра н е се о т д е л я т
о т с ъ д ъ р ж а щ и я ЛВП с у п е р н а т а н т
( ф р а к ц и я 2);
• в т р е т и я е т а п с п о м о щ т а н а ензимен
м е т о д се определя н и в о т о н а ХОЛ-ЛВП във
фракция 2.
Тъй к а т о по п о н я т н и причини у л т р а ц е н -
профугирането не може д а бъде използвано
: а т о р у т и н е н м е т о д в к л и н и ч н а т а лабора-
пория, п р е ц и п и т а ц и о н н и т е м е т о д и за изс­
ледване н а ХОЛ-ЛВП с а широко р а з п р о с т р а -
1ени.
В о п и с а н и т е по-горе п р е ц и п и т а ц и о н н и
детоди н е о б х о д и м о с т т а о т центрофугира-
ie з а о т д е л я н е н а ЛВП о т п р е ц и п и т а т а н а
» с т а н а л и т е ЛП е сериозно з а т р у д н е н и е за
гьлното а в т о м а т и з и р а н е н а т е з и м е т о д и .
) т с к о р о обаче в л а б о р а т о р н а т а п р а к т и к а
:а въведени различни м е т о д и за д и р е к т н о и
тецифично ензимно определяне н а ХОЛ-ЛВП
» присъствие н а ЛПП, ЛМНП и ХМ, к о и т о
ie и з и с к в а т предварителна подготовка н а
ф о б а т а , поради к о е т о е възможно т я х н о -
по включване в а в т о м а т и з и р а н и я анализ на
клиничните лаборатории. Засега т е з и м е т о -
]и използват два принципа з а изолиране н а
ЛВП о т д р у г и т е ЛП н а серума. Е д и н и я т от
т я х се основава н а а б с о р б ц и я т а н а с и н т е ­
т и ч н и полимери и полианиони върху повър­
х н о с т т а н а с е р у м н и т е ЛП, вследствие н а
к о е т о ЛПП, ЛМПП и ХМ, но не и ЛВП, се
т р а н с ф о р м и р а т в р е з и с т е н т н а към опре­
делен д е т е р г е н т форма (фиг. 30.2). В резул­
т а т на о б щ о т о д е й с т в и е н а използваните
полимери, полианиони и д е т е р г е н т о т ЛВП
се освобождава ХОЛ, к о й т о под ф о р м а т а на
мицел в комплекс с д е т е р г е н т а о с т а в а раз­
т в о р и м в п р о б а т а , д о к а т о ХОЛ в ЛПП и
ЛМПП (и в ХМ при наличност) не променя
с в о я т а и н т р а л и п о п р о т е и н о в а принадлеж­
н о с т . Вторият п р и н ц и п се основава н а иму­
нологично изолиране н а ЛВП о т д р у г и т е се­
румни ЛП. Л н т и т е л а към човешки ß-ЛП се
с в ъ р з в а т с ЛПП и ЛМНП (и с ХМ при налич­
н о с т ) к а т о о б р а з у в а т комплекси о т т и п а
„ а н т и г е н - а н т и т я л о " . Тези комплекси са
р е з и с т е н т н и спрямо д е й с т в и е т о на ензи­
м и т е , к о и т о у ч а с т в а т в колориметрично-
т о определяне н а ХОЛ. П о - н а т а т ъ к освобо­
д е н и я т ХОЛ о т ЛВП ( п ъ р в а т а група м е т о ­
ди) или ХОЛ н а о с т а н а л и т е в разтворимо
с ъ с т о я н и е ЛВП ( в т о р а т а група м е т о д и ) се
изследва с получилия популярност и описан
по-горе ензимен {ХОЛ-естераза, ХОЛ-оксида-
за и пероксидаза) колориметричен м е т о д .
С е р у м н а т а к о н ц е н т р а ц и я н а ХОЛ-ЛВП не е
съвършена м я р к а з а о б щ а т а м а с а н а ЛВП или
з а броя на Л В П - ч а с т и ц и т е , поради т я х н а т а хе-
т е р о г е н н о с т по отношение н а размер и с ъ с т а в .
Освен т о в а , ЛВП прогресивно се о б о г а т я в а т с
ТГ за с м е т к а н а ЕХОЛ в у с л о в и я т а н а ХТГ. Нис­
к и т е нива н а ХОЛ-ЛВП при повечето ХТГ о т р а ­
з я в а т главно т о з и феномен, но е възможно да
са израз к а к т о н а преобладаване н а м а л к и т е
ЛВПз-частици в серума, т а к а и на намален брой
н а Л В П - ч а с т и ц и т е . Б р о я т н а последните може
да бъде по-точно оценен чрез изследване н и в о т о
на апоЛ-I в серума.
П р и с е р у м н а к о н ц е н т р а ц и я н а ХОЛ-
ЛВП > 6 0 m g / d l (1.55 mmol/1) б р о я т н а р и с ­
к о в и т е ф а к т о р и с е намаллва с единица,
к о г а т о с е оценява а т е р о г е н н и я риск.
CV% на м е т о д а е много нисък (1-3%) при
концентрации на ТГ < 150 mg/dl (1.71 mmol/
1) и малко по-висок (3-6%) при ХТГ, к о г а т о е
възможно определянето на фалшиво повише­
ни нива на ХОЛ-ЛВП в р е з у л т а т о т непъл­
н о т о преципитиране и седиментиране н а
ЛМПП, ч а с т о т к о и т о о с т а в а във фракция­
т а н а ЛВП.
543

ХОЛ в мп цел nine
комплекси
ХОЛ-естераза
ХОЛ-оксидаза
фиг. 30.2. Схематично представяне на ензимен метод за директно определяне
на ХОЛ-ЛВП в серум, респ. плазма
При серумна к о н ц е н т р а ц и я н а ТГ > 900
mg/dl (10.26 mmol/1) п р е ц и п и т а ц и я т а н а
съдържащите апоВ ЛП е непълна {надстоя-
щата фракция е м ъ т н а ) или една ч а с т о т
п р е ц и п и т и р а н и т е ЛП изплува н а повърх­
н о с т т а на изследваната проба. При т а к и ­
ва случаи се налага разреждане н а п р о б а т а
с 0.9% N a d в съотношение 1:1 и п о в т о р н о
извършване н а п р е ц и п и т а ц и я т а . След пре-
ципитация н а д с т о я щ а т а фракция т р я б в а
да бъде винаги б и с т р а , в п р о т и в е н случай
заедно с ХОЛ-ЛВП се определя и ХОЛ-състав-
ка на съдържащите апоВ ЛП.
К о н ц е н т р а ц и я т а н а ХОЛ-ЛВП не се из­
меня съществено при съхранение н а
п л а з м а т а (серума) п ри -70 о С. В с у п е р н а -
т а н т а с л е д п р е ц и п и т а ц и я ЛВП с а
с т а б и л н и при 4 0 С поне 5 дни,
хол-лнп
ХОЛ-ЛНП е важна а т е р о г е н н а липидна със­
т а в к а на серума, но и други ЛП (ЛМПП-от-
ломки, ЛМП, Лп(а)) са атерогенни. Връзка­
т а между ИБС u повишения ХОЛ-ЛНП се ус­
т а н о в я в а и при д в а т а пола, преди всичко в
544
" • Н2О2
млада и средна в ъ з р а с т , и ч е с т о т я и м а ге­
н е т и ч н а основа.
Изследването н а ХОЛ-ЛНП е о т значение
з а ранно разпознаване н а а т е р о г е н н и я риск
(определяне н а ч а с т т а н а ОХОЛ, к о я т о има
висок а т е р о г е н е н п о тен ц и ал ) и з а монито-
риране т е р а п и я т а с антидислипидемични
медикаменти.
Методи за определяне
Доскоро за определяне на ХОЛ-ЛНП се препоръч­
ваше преципитация на ЛНП с алкрофилни поли­
мери, поливипилеулфапг или хспарии при pH 5.12.
Концентрацията на ХОЛ-ЛНП тогава обикнове­
но се изчислява к а т о разлика о т концентрация­
т а на ОХОЛ и сумарната концентрация на ХОД в
ЛМНП и ЛВП, които ЛП се намират в надстоя­
щ а т а фракция след утаяването на ЛНП-преци-
numama. С тези преципитационни техники се по­
лучават коректни резултати при нормолипиде-
мични серуми. В случаите с нормални до умерено
високи ТГ определянето на серумната концент­
рация на ХОЛ-ЛНП с преципитационни методи
не предоставя съществени предимства пред ней­
ното изчисление с формулата на Friedewald (вж.
по-долу). При високостепенна ХТГ се явяват ана­
литични проблеми, аналогични на тези при опре­
делянето на ХОЛ-ЛВП. Преципитацията на ЛНП
 епарин npu pH 5.12 моЯсе ga предизвика фалши-
побишение на концентрацията на ХОЛ-ЛНП,
,й к а т о ч а с т о т ЛМНП се преципитира еднов-
VICHHO с У\НП.
За п о - т о ч н а количествена оценка н а ХОЛ-
1П при използване н а преципитационни-
з м е т о д и се препоръчва п р о б и т е да се ос-
б о д я т най-напред о т ЛМНП (и о т ХМ, ако
налични) ч р е з у л т р а ц е н т р о ф у г и р а н е
= 1.006 g/ml). След у л т р а ц е н т р о ф у г и р а н е -
) в инфранатанта (фракция о с т а в а т
Ш и ЛВП. С последващо преципитиране на
Ш (вж. по-горе) и допълнително обикнове-
(нискооборотно) центрофугиране се изо-
р а т ЛНП о т п р о б а т а , в к о я т о о с т а в а т
и н с т в е н о ЛВП ( ф р а к ц и я 2). Чрез изслед-
не к о н ц е н т р а ц и я т а н а ХОЛ във фракция
т . е . ХОЛ-(ЛНП + ЛВП), и във фракция 2, т . е .
)Л-ЛВП, е възможно да се изчисли серумно-
d ниво н а ХОЛ-ЛНП:
ХОЛ-ЛНП = ХОЛ (ЛНИ+ЛИП) - ХОЛ ЛВП
Изчислената к а т о разлика концентрация
ХОЛ-ЛНП включва допълнително и кон-
н т р а ц и я т а н а ХОЛ-ЛМП (1.006 < d A M n <
)19 g/ml). О п р е д е л е н о т о по т о з и начин
румно ниво н а ХОЛ-ЛНП е задоволителен
алитичен р е з у л т а т , т ъ й к а т о концент-
ц и и т е н а ХОЛ-ЛНП в п л а з м а т а са многок-
т н о по-високи о т т е з и н а ХОЛ-ЛМП. При
т о л о г и ч н и с ъ с т о я н и я н и в а т а н а ЛМП
) г а т да б ъ д а т обаче много високи и т о г а -
т о з и м е т о д с т а в а н е т о ч е н . Лналогичен
юблем има при р а з д е л я н е т о н а ЛП с у л т -
центрофуга: изолираните чрез у л т р а ц е н -
зофугиране ЛНП в к л ю ч в а т малки, но сил-
• вариращи количества о т Лп(а).
Напоследък, аналогично на определянето
. с е р у м н а т а к о н ц е н т р а ц и я на ХОЛ-ЛВП, се
>едлагат н а б о р и з а в и с о к о с е л е к т и в п о ,
'.рсктно количествено изследване на ХОЛ-
//7 в серума. Един о т т е з и м е т о д и се ос-
вава н а р а з г р а ж д а н е т о н а ХОЛ-съставка
К о н ц е н т р а ц и и (m g / d l (mmol/1))*
О б щ ХОЛ
1репоръчително ниво < 200 {<5.2)
ранично високо ниво 200 - 239 (5.2 - в.2)
исоко ниво > 2 4 0 (>6.2)
мерено високо ниво 240 - 289 (6.2 - 7.5) 160 - 209 (4.1 - 5.4)
роизчисляване на концентрациите: mg/cll х 0.0258 - mmol/I
н а серумните ХМ, ЛМНП и ЛВП, д о к а т о ХОЛ
в ЛНП о с т а в а свързан към т е з и ЛП. Неразг-
р а д е н и я т ХОЛ-ЛНП се подлага на последо­
в а т е л н о т о действие на е н з и м и т е ХОЛ-ес-
тераза и ХОЛ-оксидаза в п р и с ъ с т в и е т о н а
специфичен за ЛНП д е т е р г е н т . Под к а т а -
л и т и ч н о т о влияние на пероксидаза образу­
в а н и я т Н2О2, к о л и ч е с т в о т о на к о й т о е пря­
ко пропорционално н а к о н ц е н т р а ц и я т а н а
ХОЛ-ЛНП в п р о б а т а , реагира с хромоген и
образува ц в е т н о съединение, ч и я т о концен­
т р а ц и я се измерва фотометрично. При друг
м е т о д за д и р е к т н о определяне на серумна­
т а к о н ц ен тр ац и я н а ХОЛ-ЛНП се използва
имуносепариращ р е а к т и в , к о й т о съдържа
гранули о т л а т е к с , п о к р и т и със силно пре­
ч и с т е н и кози а н т и т е л а к ъ м определени
апоЛН н а с е р у м н и т е ЛВП и ЛМНП. След
к р а т к а инкубация (10 min) и нискооборот-
но ( о т 1 200 до 12 000 g) центрофугиране н а
с т а й н а т е м п е р а т у р а за 5 min се изолират
с в ъ р з а н и т е към л а т е к с о в и т е гранула ЛВП
и ЛМНП о т о с т а н а л и т е в п р о б а т а (фрак­
ция 1) и намиращи се в свободно състо я н и е
ЛНП. П о - н а т а т ъ к к о н ц е н т р а ц и я т а на ХОЛ-
ЛНП във фракция 1 се изследва с ензимен
метод.
За изследване на ХОЛ-ЛНП се използват
серум или плазма. Препоръчва се определя­
н е т о на ХОЛ-ЛНП с д и р е к т н и я ензимен ме­
т о д да се извършва непосредствено след
получаване на п р о б а т а ; ако п р о б а т а е плаз­
ма, а н т и к о а г у л а н т и т е за нейното получа­
ване т р я б в а да с концентрации к а к т о след­
ва: ЕДТЛ-2Ш < 200 mg/dl; N a - ц и т р а т < 1 000
mg/dl; хепарин < 50 mg/dl; NaF < 2 000 mg/dl.
Ha т а б л . 30.17 са о т р а з е н и концентраци­
и т е на ХОЛ-ЛНП и атерогенен риск.
За прицелно серумно ниво на ХОЛ-ЛНП при
провеждане на в т о р и ч н а или първична про­
ф и л а к т и к а н а И ВС се предлага концентра­
ция <115 mg/dl (3.00 mmol/1).
Относителен
ХОЛ ЛНП р и с к з а ИБС
< 130 (<3.4) < 1.0
130 - 159 (3.4 - 4.1) 1.0 - 2.0
> 160 (>4.1) >2.0
2.0 - 4.0
545
 К о н ц е н т р а ц и я т а н а ХОЛ-ЛНП в п л а з м а т а е
нормално около 2/3 о т к о н ц е н т р а ц и я т а н а плаз­
мения общ ХОЛ, но к о р е л а ц и я т а между д в е т е
концентрации е т в ъ р д е слаба, з а да може да се
използва плазменото ниво н а общия ХОЛ к а т о
индекс за к о н ц е н т р а ц и я т а н а ХОЛ-ЛНП. Обик­
новено серумното ниво н а ХОЛ-ЛНП се изчислява
д о с т а т ъ ч н о т о ч н о в проби с к о н ц е н т р а ц и я н а
ТГ< 400 mg/dl (4.56 mmol/1) по ф о р м у л а т а н а
Frie-dewald:
ХОЛ-ЛНП ( m g / d l ) = ОХОЛ - ХОЛ-ЛВП - 0.2 х ТГ
или
ХОЛ-ЛНП (mmol/1) = ОХОЛ - ХОЛ-ЛВП - 0.45 х TI
Така изчислена к о н ц е н т р а ц и я т а н а ХОЛ-ЛНП
корелира сравнително добре с д и р е к т н о изслед­
вания ХОЛ-ЛНП. ф о р м у л а т а н а Friedewald е не­
приложима за болните с ДЛП, при к о и т о с ъ с т а ­
в ъ т на ЛМНП е силно изменен (фамилна дисбе-
талипопротеинемия, в и с о к о с т е п е н н а т а ХТГ и
др.). С оглед по-точно определяне н а с е р у м н а т а
концентрация н а ХОЛ-ЛНП са предложени раз­
лични модификации н а ф о р м у л а т а на Friedewald,
между к о и т о особено внимание заслужава т а з и ,
съобщена н е о т д а в н а (1998 г.):
ХОЛ ЛНП (mg/dl)=().94 х (ОХОЛ ХОЛ-ЛВП) - 0.19 х ТГ
или
ХОЛ ЛНП (mmol/11) =0.94 х(ОХОЛ ХОЛ - ЛВП) - 0.43х ТГ
П о н а с т о я щ е м обаче и м а сериозни осно­
вания з а преоценка н а а т е р о г е н н и я п о т е н ­
ц и а л н а ЛНП:
• рутинно изследваната серумна концент­
р а ц и я н а ХОЛ-ЛНП п р е д с т а в л я в а с ъ д ъ р ж а ­
н и е т о н а ХОЛ н е с а м о в ДНП, н о и т о в а в
ЛМП, к о е т о е п р и б л и з и т е л н о 10 до 15% о т
изследваната концентрация;
• ф р а к ц и я т а ЛНП + Л М П н е в к л ю ч в а в с и ч к и
серумни а т е р о г е н н и АП, к а т о н а п р . н я к о и
субкласове н а Л М Н П ;
• броят на серумните частици н а атеро­
генни ЛП о т р а з я в а п о - т о ч н о а т е р о г е н н и я
риск в сравнение с т я х н о т о с ъ д ъ р ж а н и е
н а ХОЛ;
• к о н ц е н т р а ц и я т а н а а п о В в т е з и ЛП п р е ­
д о с т а в я по-надеждна прогностична ин­
формация з а а т е р о г е н н и я риск в сравне­
ние с т я х н о т о с ъ д ъ р ж а н и е н а ХОЛ, т ъ й
к а т о е д н а ч а с т и ц а н а Л М Н П , Л М П или
ЛНП с ъ д ъ р ж а с а м о е д н а м о л е к у л а а п о В ,
независимо о т м о д и ф и к а ц и и т е н а т е х н и я
липиден с ъ с т а в ;
• с е р у м н а т а к о н ц е н т р а ц и я н а апоВ о т р а ­
з я в а о б щ и я брой н а ч а с т и ц и т е н а Л М Н П
ЛМП и ЛНП, и
546
• с ъ д ъ р ж а н и е т о н а ХОД в с у м а р н а т а ф р а к
ц и я (ДНП + Д М П + Л М Н П ) високостепенн»
к о р е л и р а с к о н ц е н т р а ц и я н а апоВ в серу
ма.
С л е д о в а т е л н о , с ъ д ъ р ж а н и е т о н а ХОД н|
с е р у м н и т е , с ъ д ъ р ж а щ и а п о В ДП или с ъ к р а
т е н о ХОД-ДП а п о В (ХОД-ДП а п о В = ХОД-ДНП+
Х О Д - Д М П + Х О Д - Д М Н П и л и ХОД-ДП а п о В =
ОХОЛ-ХОД-ДВП) о т р а з я в а п о - т о ч н о а т е р о
г е н н и я р и с к в с р а в н е н и е с н и в о т о н а ХОЛ
ДНП в с е р у м а . П р е д л о ж е н и с а с ъ щ о прицел
н и с е р у м н и к о н ц е н т р а ц и и н а ХОД-ДП апоВ зг
о ц е н к а н а а т е р о г е н н и я р и с к ( т а б л . 30.18). 1
Т а б л и ц а 30.18. Серумни концентрации н а
ХОЛ-ЛП и риск з а р а з в и т и е н а ИБС
Концентрации на
Атерогенен
ХОЛ ЛП а п о Вп
риск
( m g / d l (mmol/1 ))*
Нисък < 160 (4.13)
Гранично висок 160 - 189 (4.13 - 4.88)
Висок > 190 (4.90)
Умерено висок 190 - 239 (4.90 - 6.17)
""Преизчисляване н а к о н ц е н т р а ц и и т е :
mg/dl х 0.0258 = mmol/1
Aunonponicunia) (Лп(а))
През 1963 г. von Berg описва Лп(а) к а т о гене­
т и ч е н в а р и а н т н а ЛНП. При ултрацентро-
фугиране Лп(а) се о т д е л я в п л ъ т н о с т н а т а об­
л а с т с d = 1.050 - 1.100 g/ml. По размер Лп(а) f
малко по-голям о т ЛНП, д о к а т о л и п и д н и я т м>
с ъ с т а в е т в ъ р д е подобен н а т о з и н а ЛНП. Него­
в а т а б е л т ъ ч н а ч а с т се п р е д с т а в я главно ога
апоВ-100 и в з н а ч и т е л н о по-ниска с т е п е н - опп
н о с е щ и я с п е ц и ф и ч н а т а Лп(а)-антигеннос111
апо(а). Лпо(а) е гликопротеин, к о й т о се синте­
зира в черния дроб и е б о г а т н а невраминова
киселина. Той с ъ щ е с т в у в а в различни, генетич­
но к о н т р о л и р а н и форми с в е р о я т н и молекулни
т е г л а о т 400 до 700 kD. В р а м к и т е н а една час­
т и ц а н а Лп(а), апо(а) е свързан с апоВ чрез един
или повече дисулфидни м о с т о в е . Големият по­
лиморфизъм н а Лп(а)-гликопротеина е свързан
с г е н е т и ч н о контролирани, различни концент­
рации н а Лп(а) в серума, респ. п л а з м а т а . Данни­
т е о т фамилни проучвания п о к а з в а т , че фено-
т и п ъ т н а Лп(а), к а к т о и к о н ц е н т р а ц и я т а на
Лп(а) се о п р е д е л я т о т с т р у к т у р а т а на ЛпСа)-
г л и к о п р о т е и н а . Въпреки м н о г о т о прилики с
ЛНП, Лп(а) се о т н а с я м е т а б о л и т н о различно и
независимо о т ЛНП.
 I о л е м и я т и н т е р е с към Лп(а) се с т и м у л и р а
т изобилието н а д а н н и з а к о р е л а ц и я м е ж
у неговата серумна концентрация и н о
в а т а н а ИБС. Много епидемиологични и кли-
ични с т у д и и върху болни с коронарнографски
оказана ИБС и върху болни с мозъчносъдова бо-
е с т п о д ч е р т а в а т п а т о г е н е т и ч н а т а роля на
л(а) в а т е р о с к л е р о т и ч н и т е изменения н а ко-
о н а р н и т е , но т а к а също и н а м о з ъ ч н и т е ар-
lepuu. С т р у к т у р н и я т анализ о т к р и в а високос-
1епенна х о м о л о ж н о с т н а апо а с плазминогена,
рез к о е т о се създава в ъ з м о ж н о с т за у ч а с т и е
а Лп(а) във ф и б р и н о л и т и ч н а т а с и с т е м а . По
ю з и начин може д а се обясни, ако не напълно,
.оне ч а с т и ч н о , особено в и с о к и я т а т е р о г е н е н
.отенциал н а п о в и ш е н и т е нива н а Лп(а) в серу-
!а.
Лп(а), з а е д н о с ХОЛ и ТГ, с е п р и ч и с л я в а
;ъм н а й - в а ж н и т е а т е р о г е н н и р и с к о в и
з а к т о р и . О п р е д е л я н е т о н а н е г о в а т а серумна
о н ц е н т р а ц и я е особено н а л о ж и т е л н о във фа-
1илии, обременени с ч е с т а проява н а ИБС.
Иетоди за определяне
iußomo н а Лп(а) се определя чрез имуноло-
ично изследване н а н е г о в а т а с ъ с т а в к а
ino(a). М а т е р и а л ъ т з а изследване е серум
1ли плазма. Н а д е ж д н о т о определяне на Лп(а)
»еше дълго време проблематично, т ъ й к а т о
:ъ1цествуваше по-слабо или по-силно проя­
вена кръстосана активност на антисеру-
ните cnpjuuo плазминогена. П р и л а г а н е т о
ш високоспецифични към Лп(а) а н т и с е р у м и
ювишава д о с т о в е р н о с т т а на всички, изпол-
.вани за ц е л т а , количествени имунологични
летоди;
» електроимунодифузия (EID);
• радиална имунодифузия (RID);
» имунонефелометрия/имунотурбидимет-
рия;
• ELISA и
» радиоимунологично изследване (RIA).
З а разлика о т д р у г и т е липидни показа-
пели, Лп(а>) показва несиметрично разпре­
деление н а р е з у л т а т и т е з а с е р у м н и т е кон-
; е н т р а ц и и в о б щ а т а популация, к о е т о се
)бяснява с р а з л и ч н а т а популационна ч е с т о -
п а н а н е г о в и т е фенотипове.
Повищен а т е р о г е н е н риск има при серум-
iu концентрации на Лп(а) > 2 5 - 3 0 mg/d), при
нова в около 85% о т о б щ а т а популация се
) т к р и в а т к о н ц е н т р а ц и и <25mg/dl.
Върху к о н ц е н т р а ц и я т а н а Лп(а) о к а з в а т
Злияние р а з л и ч н и ф а к т о р и . Н е з а в и с и м о о т
м а л к о т о повишение с в ъ з р а с т т а , Лп(а) е
сравнително с т а б и л е н към в л и я н и я т а н а
х р а н а т а , т е л е с н а т а а к т и в н о с т и обикно­
в е н и т е хиполипидемични лекарства, но не­
г о в о т о серумно ниво намалява ч у в с т в и т е л ­
но при т е ж к и чернодробни увредждания.
Д о к а т о с р а д и а л н а т а и електроимуноди-
ф у з и я т а м о г а т д а се о п р е д е л я т серумни
концентрации н а Лп(а) >5 m g / d l , с ELISA и
RIA се о т к р и в а т концентрации <1 m g / d l .
А п о л и п о п р о т с и н и (апоЛП)
Б е л т ъ ч н а т а ч а с т н а АП (апоАП) придава на
л и п и д н и т е мицели допълнителна с т а б и л ­
н о с т . Освен т о в а апоАП и г р а я т решаваща
роля в о б м я н а т а на липидите к а т о :
• определят с к о р о с т т а н а л и п и д н ата об­
мя н а;
• н а с о ч в а т липидите към специфични при­
целни органи;
• у ч а с т в а т в о т л а г а н е т о на липиди в а т е -
р о м а т о з н и т е плаки.
АпоАП са п р о т е и н и или полипептиди,
к о и т о след к а т о се с в ъ р ж а т със с ъ о т в е т н и
липиди, н а п у с к а т м я с т о т о на своя синтез.
Те са разделени в различни класове (А, В, С и
т.н.), при т о в а апоА се открива главно в а -
АП, д о к а т о апоВ - в ß-АП. П о - н а т а т ъ к т я х ­
н а т а номенклатура се основава на хроноло­
г и я т а на т я х н о т о откриване (табл. 30.19).
Изследването на апоЛП к а т о индикатори за
риска о т ИБС е о б е к т на р а с т я щ интерес. Пре­
ди всичко с определянето на серумната, респ.
п л а з м е н а т а концентрация на апоА-1 и апоВ чес­
т о се прави о п и т да се получи по-достоверна
информация за риска о т ИБС в сравнение с т а з и
о т н и в а т а н а ОХОД или ХОЛ-АВП в серума. В ос­
н о в а т а н а т о з и подход лежи о б с т о я т е л с т в о т о ,
че к о н ц е н т р а ц и я т а на апоАП по-добре корелира
с наличния брой н а АП-частици в п л а з м а т а в
сравнение със съдържанието на ХОЛ в АП. Освен
т о в а , противно н а апоЛП, липидният с ъ с т а в на
АП подлежи н а големи вариации. Изследването
н а апоЛП е о т значение и за изясняване дефекти
н а апоЛП (хомозиготност на апоЕ-2 при III. т и п
ХАП, недоимък н а anoC-II при I. т и п ХАП и др.),
к а к т о и за мониториране на антидислипидемич-
на т е р а п и я .
П о в е ч е т о епидемиологични с т у д и и з а
изясняване р о л я т а н а АП к а т о рискови ин­
д и к а т о р и за ИБС се основават обаче върху
д а н н и т е о т изследвания само н а липидния
547
Т а б л и ц а 30.19. Аполипопротеини н а ч о в е ш к а т а п л а з м а
Плътностни Молекулна м а с а Концентрация
АпоЛП класове (kDa) (mg/dl)
ЛВП 28.5 120 - 140
A-I
ЛВП 17 35 - 50
А-П
ХМ, ЛВП 46 <5
A-IV
В-100 ЛМПП, ЛНП 550 70 - 90

В-48 ХМ, ß-AMHH 265 <5

C-I ХМ, Л М П П 6.5 5 -8

с-п ХМ, А М Н П 8.8 3 -7

C-III ХМ, Л М П П 8.9 10 - 12

D (A-III) АВПз 29 8 - 10

Е ХМ, Л М П П , ЛВП,, 34 3 -5

F АВП 30 <5

G ЛМПП 72 <5

Н ХМ, d > 1.21 g / m l 55 15 - 30

(а) An(a) 350 - 900 варираща
J ЛВП 2 , АВП 3 70 7 - 20

състав (ХОЛ и ТГ) на ЛП. Други пречки за ричните м е т о д и с т о я т в основата на кли-

разширеното използване на определянето на
апоЛП са т р у д н о с т и т е при с т а н д а р т и з и ­
ране на анализите, с т о я щ и т е във връзка с
т о в а големи вариации на р е з у л т а т и т е
между отделните лаборатории и необходи­
м о с т т а о т общовалидни рискови граници,
както и разнообразието на аналитични ме­
тоди. Независимо о т наличните понастоя­
щем т р у д н о с т и и най-вече след т я х н о т о
преодоляване, и з с л е у в а н с т о н а апоЛП ще
се налоЖи к а т о неза(hiсилiа с ъ с т а в н а
част о т к л и н и ч н о л а б о р а т о р н и л спек­
тъ р з а о ц е н к а н а а т е р о г е н н и л р и с к .
Метода за определяне
Концентрацията на апоЛП и т е х н и т е изо-
форми се определя в серум или плазма. Из­
ползват се следните техники:
• радиоимунологично изследване (RIA);
• радиална имунодифузия (RID);
• електроимунно изследване (EIA);
• имунонефелометрия / имунотурбидимет-
рия;
• ELISA и
• изоелектрофокусиране (IEF).
Въз основа на безспорни предимства иму-
нонефелометричните и имунотурбидимит-
548
нично-лабораторната п р а к т и к а за изслед­
ване на и м а щ и т е сравнително високи серум­
ни к о н ц е н т р а ц и и апоА-1, апоА-П и апоВ,
АпоЛП с по-ниски серумни концентрации,
к а т о напр. апоС и Е, по-често се изследват
посредством ELISA или RIA.
А п о л и п о п р о т е и н и A-I и В
(апоЛ-1 и апоН)
АпоЛ-1 е главният апоЛП на ЛВП и неговата
серумна концентрация о т р а з я в а броя на
ч а с т и ц и т е на ЛВП. Определянето му е осо­
бено полезно при доказване на ниско серум­
но ниво на ХОЛ-ЛВП. Болни с ниска концент­
рация на ХОЛ-ЛВП и ХТГ показват често не­
променено ниво на апоА-1, к о е т о е израз на
л и п с а т а на промени в броя на ч а с т и ц и т е
на ЛВП. Това състояние може да се обясни с
изменение в о т н о ш е н и е т о на б о г а т и т е на
ХОЛ ан ти а те рог ен н и ЛВП2 към бедните на
ХОЛ ЛВПзв полза на ЛВП2. При намаление на
апоА-1 и ХОЛ-ЛВП е налице редукция на броя
на ч а с т и ц и т е на ЛВП.
Пад 95% о т протеиновото съдържание
на ЛНП се представя о т апоВ100. АпоВюо е
налице във всички атерогенни ЛП-фракции
к а т о ЛМПП, АМП, ЛПП и Лп(а). Той се раз-
•чаба o m anoB^ 8 , k o ü m o се о т к р и в а с а м о в
I с чревен произход. Текущите м е т о д и за
следване на апоВ определят едновременно с
оВ,00 също и апоВ4я, ч и я т о концентрация 6 се-
ма е нормално много ниска (изключение при
III. и V. ф е н о т и п ХЛП). Определянето на
оВ,оо предоставя съществена информация за
а г н о з а т а на ф а м и л н а т а комбинирана хипер-
пидемия (хиперапобеталипопротеинемия).
рактерно е ниското отношение на ХОЛ-ЛШ!
м апоВ-ЛНП, к о е т о е индикация за наличие
малки, п л ъ т н и ЛНП-частици (ЛНПИ или фе-
т и п В на ЛНП). Такива болни м о г а т да и м а т
променени нива на серумните липиди, респ.
[ерено проявена ХХОЛ и/или ХТГ. Опшошение-
) ХОЛ-ЛНП към апоВ е повишено при фамил-
гпа ХХОЛ ( > 1.8, изследвани в mg/dl), д о к а т о
и хиперапобета-липопротеинемия (фамилна
мбинирана хиперлипидемия) т о е ниско ( < 1.5).
Аналогично н а и з ч и с л е н и е т о н а ХОЛ-ЛНП
• ф о р м у л а т а н а Friedewald е в ъ з м о ж н о д а
определи и н д и р е к т н о с е р у м н о т о ниво н а
юВ-ЛНП:
юВ-ЛНП ( m g / d l ) = апоВ - 0.09 х ОХОЛ +
0.09 х ХОЛ-ЛВП - 0.08 х ТГ
( р е ф е р е н т н а 90%-област; 40 - 90 m g / d l )
За доминиране на ЛНП„ (фенотип В на ЛНП)
серума може да се предполага при (ХОЛ-ЛНП/
юВ-ЛНП) < 1.2. При фамилния III. т и п ХЛП се
ж р и в а т ниски нива на ХОЛ-ЛНП и апоВ (апоВ
lecmo < 0.5 mg/dl). По т о з и начин едновремен-
т о изследване на ХОЛ-ЛНП и апоВ има безс-
рни предимства за диференциалната лабора-
зрна диагностика на ХЛ и за о ценката на а т е -
генния риск. Изследването на апоВ-ЛНП е о т
ачение за ранно откриване на атерогенния
ск при лица с фамилна история за преждевре-
!нни клинични прояви на атеросклероза, как-
} и за мониториране на антидислипидемична
зрапия.
Намалени нива на апоЛТ у болни с ИБС са наб-
»давани в повечето, но не във всички ретрос-
Дстивни проучвания. ЛпоЛ-I изглежда също пред-
азва риска за ИБС според данни о т проспектив-
I проучвания. Редица проучвания п о к а з в а т
тена асоциация между апоВ и ИБС. Рискът за
звитие на ИБС, оценен въз основа серумното
во на апоВ, е равностоен на този, оценен по
н ц е н т р а ц и я т а на ХОЛ-ЛНП в серума.
епгоди з а изследване
юА-1 и апоВ се о п р е д е л я т в серум с помощ-
а н а имунохимични м е т о д и . Широко при-
жение и м а т и м у н о н е ф е л о м е т р и ч н и т е и
1унотурбидиметричните методи. Неточ-
Таблица 30.20. Референтни области (Р, г - Р97 5)
на серумните концентрации (g/1) на апоА-1 и апоВ
Аполипо- Референтни Меди­
Пол
протеин граници ана
Мъже 1.05 - 1.75 1.35
ЛпоЛ-1
Жени 1.05 - 2.05 1.45
Мъже 0.60 - 1.40 1.00
ЛпоВ
Жени 0.55 - 1.30 0.90
н о с т т а е < 5% з а апоА-1 и апоВ. П о н а с т о я ­
щ е м м е т о д и т е с а с т а н д а р т и з и р а н и , след
к а т о СЗО п р е д о с т а в и р е ф е р е н т е н м а т е р и ­
ал к а к т о з а апоЛ-I, т а к а и з а апоВ. Използ­
в а н е т о н а т е з и м а т е р и а л и н а м а л я в а разли­
к и т е м е ж д у о т д е л н и т е т е с т - с и с т е м и до
около 5%. Р е ф е р е н т н и т е о б л а с т и н а апоА-1
и апоВ с а п р е д с т а в е н и н а т а б л . 30.20.
П р и л а г а н е т о н а имунохимични м е т о д и з а
изследване н и в а т а н а апоВ и апоЛ-I изисква
висока с п е ц и ф и ч н о с т н а и з п о л з в а н и т е мо-
ноклонални а н т и т е л а . Прицелни к о н ц е н т ­
рации, аналогични н а т е з и з а ОХОЛ, ХОЛ-
ЛНП и ХОЛ-ЛВП, засега не с а предложени з а
к о р е с п о н д и р а щ и т е апоЛН (апоВ и апоА-1).
Серумите м о г а т да се съхраняват за най-мал­
ко 3 дни при 40С. В присъствие на антибиотици и
антиоксиданти апоВ остава стабилен за най-
малко 6 месеца при -20оС. Замразяването при -80
е за предпочитане.
Лполипопротпеин Е (апоЕ)
ЛпоЕ к о н т р о л и р а к а т а б о л и з м а н а Х М - о т -
ломки и ЛМН11, к а к т о и н а б о г а т и т е н а апоЕ
ЛВН чрез н е г о в а т а с п о с о б н о с т д а се свърз­
в а к ъ м апоЕ- и апоВ/Е-(ЛНН-)рецепторите.
И з о ф о р м и т е апоЕ-З и апоЕ-4 и м а т норма­
лен а ф и н и т е т к ъ м т е з и р е ц е п т о р и , а т о з и
н а апоЕ-2 е о т ч е т л и в о намален.
фенотип апоЕ 3/3 има най-висока популаци-
онна ч е с т о т а (55%), а ч е с т о т а т а на апоЕ 3/4
достига до 26%. Разпространението на апоЕ 2/
2 е около 1% и е свързано с относително ниско
ниво на серумния ХОЛ, но когато са налице оп­
ределени генетични дефекти, апоЕ 2/2 се проя­
вява к а т о фамилна дисбеталипопротеинемия.
ЛпоЕ 4/4 се асоциира с високо ниво на серумния
ХОЛ. Определянето му се използва за диагноза
на III. т и п ХЛП, особено на апоЕ-2 хомозигот-
н о с т и изчисление на отношението апоЕ/апоВ,
к а к т о и за фенотипизиране или генотипизира-
не 6 к о н т е к с т а на с т у д и и т е върху б о л е с т т а
на Alzheimer понастоящем не се препоръчва.
549
Методи з а изследване
Количествено определяне н а а п о Е в с е р у м :
имунохимични мсшосщ, по-специално и м у н о
нефелометричен анализ и имунотурбиди-
метрия.
фенотипизиране н а апоЕ: и м у н о б л о т и н г
след и з о е л е к т р о ф о к у с и р а н е .
Г е н о т и п и з и р а н е н а апоЕ: Д Н К - х и б р и д и з а -
ция.
АпоЕ проявява генетичен полиморфизъм и се
среща в ш е с т изоформи (апоЕ 2/2, Е 2/3, Е 2/4, Е
3/3, Е 3/4 и Е 4/4). Свързването н а апоЕ към апоВ/
Е- и апоЕ-рецепторите е един о т основните ме­
ханизми за о т с т р а н е н и е н а б о г а т и т е н а апоЕ ЛП
(ХМ-отломки, ЛМНП, ЛМП) о т циркулацията и
за подържане на ХОЛ- и ТГ-хомеостаза. АпоЕ 2/2
и м а т много нисък а ф и н и т е т за свързване с т е з и
рецептори, поради к о е т о съдържащите апоЕ 2/2
АМНП и ЛМНП-отломки се о т с т р а н я в а т бавно
о т кръвообращението и причиняват активиране
на чернодробните апоВ/Е-рецептори. Противо­
положен е ф е к т и м а т съдържащите апоЕ 4/4 АП.
По т а з и причина апоЕ 4/4 е потенциално а т е р о -
генен, докато апоЕ 2/2 може да има п р о т е к т и -
вен е ф е к т . Все п а к с ъ ч е т а н и е т о н а апоЕ-2
хомозиготността с други нарушения на липидния
метаболизъм води до проява н а III. т и п ХАП,
чийто висок атерогенен потенциал е недвусмис­
лено доказан. О т н о ш е н и е т о н а апоЕ към апоВ
може да се използва също к а т о маркер за III. т и п
ХАП.
Повишена ч е с т о т а на апоЕ 4/4 се о т к р и в а
също при б о л е с т т а на Alzheimer. Потенциални­
т е механизми на т о з и феномен са к а к т о свърз­
ването на апоЕ-4 към амилоид Ь, т а к а и неспо­
с о б н о с т т а на апоЕ-4, за разлика о т апоЕ-2 и апоЕ-
3, да се свързва с Таи протеина, к о е т о подпомага
наблюдаваното при б о л е с т т а на Alzheimer хипер-
фосфорилиране на т о з и протеин.
Аполипопротсин С-II (апоС-П)
АпоС-П е кофактор на липопротеин-липаза-
т а (АПА). Определянето му се използва з а
диагноза на хиломикронния синдром.
Методи на одреде/ише; имунохимични м е т о ­
ди, по-специално радиална имуноаифузия
(RID).
Недоимъкът на апоС-П, заедно с т о з и на
АПА, е причината за хиломикронния синд­
ром.
550
Липолитичии ензими
Аиполитичните ензими функционират като
"избистрящи фактори" и чрез хидролиза на
б о г а т и т е на ТГ ЛП и АВП с ъ д е й с т в а т за
с н а б д я в а н е т о на т ъ к а н и т е със свободни
м а с т н и киселини (СМК).
Л и п о п р о т с и н - л и п а з а (Л11Л)
АПА е ензим с глицерил е с т е р хидролазна актив­
н о с т , к о й т о е локализиран н а е н д о т е л н а т а по­
в ъ р х н о с т н а извънчернодробните капиляри. С
п о м о щ т а на хепарин е н з и м ъ т се освобождава в
циркулацията, к ъ д е т о е н з и м н а т а активност
може да бъде определена. Н е г о в а т а физиологична
фунюдия е хидролизата н а ТГ-ХМ и ТГ-АМНП, при
к о е т о образуваните СМК се т р а н с п о р т и р а т до
т ъ к а н и т е . АПА се а к т и в и р а о т апоС-П. Разграж­
д а н е т о на ХМ и АМНП е предварително условие
за т я х н о т о о т с т р а н е н и е о т циркулацията.
АПА може да д е й с т в а също к а т о лиганд, об­
лекчавайки к а к т о свързването н а б о г а т и т е на
ТГ АП към т е х н и т е рецептори, т а к а и т я х н о т о
интернализиране.
Аиполитичните ензими - АПА и чернодробна­
т а триглицерид липаза (ЧТГА) се освобождават в
кръвообращението чрез инжектиране н а 60-100 Е
х е п а р и н / k g т е л е с н о т е г л о . О п р е д е л я н е т о на
е н з и м н а т а а к т и в н о с т с т а в а 10-15 min след ин­
ж е к т и р а н е т о . Селективното определяне на ЛИЛ
се з а т р у д н я в а о т ф а к т а , че а к т и в н о с т т а на
ЧТГА у ч а с т в а в пост-хепариновата активност
на п л а з м а т а . Тази пречка може да бъде преодоля­
на чрез инхибиране на ЧТГА с Na-додецил сулфат
(SDS) или с имунопреципитация. След инхибира­
не на ЧТГА а к т и в н о с т т а на АПА се определя по
количеството на радиобелязаните м а с т н и кисе­
лини, к о и т о се освобождават о т глицерол три-(1
14
С) о л е а т за единица време.
Вариационният коефициент на м е т о д а с SDS-
инхибиране е 2-5% при изследване в серия и 11-12%
при изследване " о т ден з а ден". Източници на
грешка при м е т о д а с SDS-инхибиране са използ­
в а н е т о на некоректни концентрация на SDS и вре­
ме н а инкубация, т ъ й к а т о при по-високи кон­
ц е н т р а ц и и н а SDS и по-дълго време на инкубация
а к т и в н о с т т а н а АПА е също п о т и с н а т а .
Чернодробна т р и г л и ц е р и д
л и п а з а (ЧТГЛ)
Е н з и м н а т а група н а чернодробните липази е със­
т а в е н а о т ЧТГА, моноглицерид-липаза и фосфо-
т а з а . ЧТГЛ е локализирана върху капилярния
1дотел на чернодробните клетки и се освобож-
ißa в циркулацията, подобно на ЛПЛ, под влия-
je на хепарин. Е н з и м ъ т не изисква кофактор.
е г оват а физиологична функция е разграждане-
о на б о г а т и т е на ТГ ЛП и на ЛВП, по-специал-
) на ЛВП2. М е т о д ъ т за определяне а к т и в н о с т -
а на ЧТГЛ е аналогичен на т о з и за ЛПЛ, но с
4хибиране на ЛПЛ чрез 1.0 mol/1 NaCl.
е ц и т и n -холсстсрол-а ц и л т р апсфсра-
а (ЛХЛТ)
ХАТ се синтезира в черния дроб. Е с т е р и т е на
ОЛ, к о и т о п р и с ъ с т в а т в човешкия серум се
ормират почти изключително (-90%) под дейс-
ißuemo на т о з и ензим. ЛХЛТ играе ключова роля
метаболизма на ЛП, особено в т о з и на ЛВП. Хро-
атографски и изотопни техники се използват
1 неговото определяне, но т е н я м а т широко при-
зжение в л а б о р а т о р н а п р а к т и к а . М е т о д за
1екушо изследване на ЛХЛТ се основава на опре-
влянето на редукцията на свободен ХОЛ чрез
зползване на ензимен метод. Пробите са с т а -
илни за 1 седмица при 40С; по-продължителното
ьхранение изисква замразяване при -20оС.
lemogu па молекулярната генетика
l e m o g u m e н а р е к о м б и н а н т н а т а генна т е х -
ология с а получили п о п у л я р н о с т с ъ щ о в
а б о р а т о р н а т а д и а г н о с т и к а н а нарушени-
т а н а липидния м е т а б о л и з ъ м . Висока ди-
гностична значимост и м а т т е з и техни-
и, к о и т о п о з в о л я в а т с р а в н и т е л н о неслож-
ю определяне н а полиморфизми. Хромозом-
ш т е локализации н а полиморфизма н а ЛНП-
• е ц е п т о р а , н а л и п о л и т и ч н и т е ензими, н а
LXAT и н а п о в е ч е т о а п о л и п о п р о т е и н и с а
1звестни. С ъ щ е с т в у в а т с ъ щ о ДНК-проби,
. а к т о и полиморфизми н а д ъ л ж и н а т а н а
1естрикционни ф р а г м е н т и .
М у т а ц и и т е на ЛНП-рецептора са т в ъ р -
(е много, но въпреки т о в а , т е п о з в о л я в а т
|а се и з в ъ р ш в а скрининг з а ф а м и л н а ХХОЛ.
Лолекулярно г е н е т и ч н и т е м е т о д и се изпол-
в а т п о н а с т о я щ е м главно з а определяне н а
е н о т и п а н а апоЕ и з а о т к р и в а н е н а фамил-
ш я д е ф е к т е н апоБюо ( р а з м я н а н а б а з а в ко-
|она з а а р г и н и н 3500), к о й т о в ъ з п р е п я т с т -
»а с в ъ р з в а н е т о н а ЛНП к ъ м с п е ц и ф и ч н и я
)ецептор.
АНАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОБЩ
БЕЛТЪК И АЛБУМИН
В СЕРУМ/ПЛАЗМА
Е. Ц в е т а н о в а
ОБЩ БЕЛТЪК
О п р е д е л я н е т о н а о б щ и я б е л т ъ к в серума е
в а ж е н п о к а з а т е л з а с ъ с т о я н и е т о н а колои-
д о о с м о т и ч н о т о налягане, с и н т е з н а т а фун­
к ц и я н а черния дроб и п л а з м а т и ч н и т е к л е т ­
ки, п е р м е а б и л и т е т а н а р а з л и ч н и т е барие­
ри (бъбречна, м о з ъ ч н а и др.), х и д р а т а ц и я и
д е х и д р а т а ц и я , п а р а п р о т е и н е м и и , анорек-
сия, кахексия и др.
В к р ъ в н а т а п л а з м а с а изолирани и охарак­
т е р и з и р а н и над 300 различни б е л т ъ ц и . Про­
т е и н о в а т а х е т е р о г е н н о с т е свързана и с го­
л я м а разлика в к о н ц е н т р а ц и я т а (напр. ал­
бумин 50 g/1, IgE 50 |.ig/l). К л а с и ф и ц и р а н е т о
н а п л а з м е н и т е п р о т е и н и е базирано н а т я х ­
н а т а физикохимична х а р а к т е р и с т и к а , елек-
т р о ф о р е т и ч н а п о д в и ж н о с т , функция (напр.
т р а н с п о р т н а , з а щ и т н а и т.н.), небелтъч-
н а с ъ с т а в к а и др. Х о м е о с т а з а т а н а п р о т е ­
и н о в а т а к о н ц е н т р а ц и я е функция н а биосин-
т е з и секреция, разпределение между в ъ т -
ресъдово и и н т е р с т и ц и а л н о п р о с т р а н с т в о ,
елиминиране (деградация, к а т а б о л и з ъ м , за­
губа), хранене, к о л и ч е с т в о и разпределение
н а в о д а т а и др. П о л у ж и в о т ъ т н а б е л т ъ ц и ­
т е е т в ъ р д е различен (напр. 15 min з а мио-
глобин и 35 дни з а IgG) и о т него зависи не­
о б х о д и м о с т т а о т м о н и т о р и р а н е н а даден
б е л т ъ к . П р о м е н и т е в общия б е л т ъ к м о г а т
д а б ъ д а т класифицирани к а т о :
• х и п е р п р о т е и н е м и я - р е л а т и в н а при де­
х и д р а т а ц и я или а б с о л ю т н а при увеличава­
не н а имуноглобулиновата концентрация,
в р е з у л т а т н а м у л т и п л е н миелом, макро-
глобулинемия, бенигнени г а м а п а т и и , ами-
лоидоза, б о л е с т н а т е ж к и т е вериги и др.;
• х и п о п р о т е и н е м и я - р е л а т и в н а при ек-
сцесивна инфузионна т е р а п и я , анурия и
олигоурия или а б с о л ю т н а при повишена
у р и н н а екскреция или д е ф е к т н а с и н т е з а ;
• д и с п р о т е и н е м и я , при к о я т о е наруше­
но к о л и ч е с т в е н о т о с ъ о т н о ш е н и е между
о т д е л н и б е л т ъ ц и с или без промени в ко­
л и ч е с т в о т о н а общия б е л т ъ к .
551
Рефсрептни граници
Изключително г о л я м а т а х е т е р о г е н н о с т н а
серумните белтъци е причина за и з б е с т н а
разлика при оценка на общия белтък. Това
правило е в сила за п о ч т и всички м е т о д и , но
изразено в различна с т е п е н . П и в о т о н а об­
щия белтък в серума се колебае в зависимост
о т използвания м е т о д . Наблюдава се извес­
т н а зависимост о т в ъ з р а с т т а и значител­
но по-слаба о т пола. Д а н н и т е в л и т е р а т у ­
р а т а п о к а з в а т по-тесни и по-широки гра­
ници. Най-широко п р и е т и т е са:
новородени 45 - 65 g/1
кърмачета 47 - 68 g/1
деца 50 - 80 g/1
възрастни 60 - 84 g/1
Изключително голям брой са модифика­
ц и и т е на основните м е т о д и з а определяне
на общия б е л т ъ к в п л а з м а т а респ. серума.
Те непрекъснато се у с ъ в ъ р ш е н с т в а т . Ме­
т о д и т е за определяне н а общ б е л т ъ к с а
представени на т а б л . 30.21.
Иитерференция при определяне
на общия б е л т ъ к
Хемолиза, липидемия и билирубинемия срав­
нително слабо в л и я я т при определяне на об­
щия белтък. Дори лека закуска с у т р и н пре­
ди вземане н а к р ъ в т а не оказва с ъ щ е с т в е н о
влияние. Желателно е в з е м а н е т о на веноз­
на кръв да с т а в а с у т р и н след 12-часов сън.
При вземане на к р ъ в т а б о л н и я т да бъде сед­
нал или легнал, т ъ й к а т о в право положение
с т о й н о с т и т е са с 10% по-високи. Турнике­
т ъ т да се държи не повече о т 1 min, в про­
т и в е н случай к о н ц е н т р а ц и я т а може да се
повиши до 20%. А к т и в н а физическа д е й н о с т
или физически упражнения м о г а т да дове­
д а т до увеличение на к о н ц е н т р а ц и я т а до
15%. О б щ и я т б е л т ъ к показва известни про­
мени във връзка с циркадния р и т ъ м .
Серумът може да се съхранява една сед­
мица при с т а й н а т е м п е р а т у р а , един месец
при 40С и една година при -18 до -20оС.
АЛБУМИН
Албуминът е основния б е л т ъ к н а к р ъ в н а т а
плазма. Той е главния б е л т ъ к за поддържа-
552
не на колоидоосмотичното налягане на в ъ т -
р е с ъ д о в а т а т е ч н о с т , за т р а н с п о р т а на ен­
догенни и екзогенни в е щ е с т в а , резервен бел­
т ъ к и бариерен маркер. П о л у ж и в о т ъ т му е
около 20 дни. С и н т е з а т а н а албумина е стро­
го и н т р а х е п а т а л н а , а р а з г р а ж д а н е т о му
с т а в а в черния дроб, стомашно-чревния п ъ т
и бъбреците. Определянето му се използва
за м о н и т о р и р а н е н а с и н т е з н а т а функция
на черния дроб. Увеличеното ниво н а албу­
мина е само р ел ати вн о , главно при дехидра-
т а ц и я , но с ъ о т н о ш е н и е т о албумин/общ бел­
т ъ к е запазено. Много по-съществено е на­
м а л е н и е т о на албумина. То може да бъде ре­
з у л т а т о т загуба на кръв, загуба през бъб­
р е ц и т е и стомашно-чревния п ъ т , к а к т о и
при лошо хранене и усвояване, повишен ка-
т а б о л и з ъ м при злокачествени заболявания,,
т и р е о т о к с и к о з а , възпаления и др.
Р е ф е р е н т н и граници
Х о м о г е н н о с т т а н а албумина е причина за
малки разлики при о ц е н к а т а му с различни
м е т о д и . Р е ф е р е н т н и т е граници н а албуми­
н а в серума се к о л е б а я т в з а в и с и м о с т о т
използвания м е т о д . Наблюдава се известна
з а в и с и м о с т о т в ъ з р а с т т а и значително по-
слаба о т пола. Д а н н и т е в л и т е р а т у р а т а по­
к а з в а т n o - т е с н и и по-широки граници. Най-
широко п р и е т и т е са:
новородени 31 - 42 g/1
кърмачета 32 - 51 g/1
деца 35 - 52 g/1
възрастни 35 - 55 g/1
Иитерференция при определяне
н а албумин
В з а в и с и м о с т о т м е т о д а , при използване­
т о на някои багрила, м о г а т да интерфери-
р а т хемолиза, липидемия и билирубинемия.
За изследване н а албумин е ж е л а т е л н о да се
взема венозна кръв, с у т р и н след 12-часов сън,
в седнало или легнало положение и турнике­
т ъ т да се з а д ъ р ж а до 1 min.
С е р у м ъ т може да се съхранява 6 дни при
с т а й н а т е м п е р а т у р а и 3 месеца при 4"С.
М е т о д и т е за определяне на албумин са
п р е д с т а в е н и н а т а б л . 30.22.
 Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а

Kieldahl определяне на б е л т ъ ц и т е по съдържанието на висока възпроизводимост и т о ч н о с т ; референтен

а з о т . к о е т о възлиза на 16% трудоемък; мануален

Рефракто­ измерване на рефрактометричния индекс мануален; различните белтъци са с различен интерференция о т

метричен** индекс; добра т о ч н о с т и възпроизводимост; бърз различни компоненти

Измерване в ултравио­ измерване абсорбцията на с в е т л и н а т а о т пептид­ мануален и полуавтоматичен; бърз; много висока т р у д н о с т и при
л е т о в а т а област*** н и т е връзки ш и а р о м а т н и аминокиселини при ч у в с т в и т е л н о с т и добра специфичност; изисква калибрацията
А ^ = 200-225 п т , респ. А ^ = 270-290 п т качествен с п е к т р о ф о т о м е т ъ р

Lowry**** колориметричен метод; т р е т и р а н е на б е л т ъ ц и т е с добра ч у в с т в и т е л н о с т , но малка специфичност; относително честа

алкален разтвор на медни йони и фенолов р е а к т и в трудоемък; мануален интерференция
на Polin и Ciocalteu; А ^ = 745-750 п т

Biuret***** биуретова реакция с аминогрупите на п е п т и д н и т е мануален и а в т о м а т и ч е н ; предпочитан м е т о д ; р у т и н е н - клас А

връзки; Ата, = 540 п т добра ч у в с т в и т е л н о с т и специфичност;
бърз и е в т и н
•Kieldahl. Н а й - с т а р и я т м е т о д за определяне на общия белтък. Основава се на съдържанието на а з о т в п р о т е и н о в а т а молекула. Серум ш и плазма (1 ml) се
изгарят със сярна киселина. Полученият а з о т се превръща в амониев сулфат, а последният след нагряване с основа образува амоняк, к о й т о се улавя с HCl или H,S0 4
с позната кониентращш. Несвързаната киселина се т и т р и р а с основа и по нейното количество се определя а з о т а , респ. общия белтък, ф а к т о р ъ т е 6.25 з а щ о т о
белтъщипе съдържат 16% а з о т . М е т о д ъ т е трудоемък и рядко се използва в р у т и н н а т а практика.Той е с висока прецизност и т о ч н о с т и п о ч т и не се влияе о т
други фактори. Дискутира се, доколко коефициентът 6.25 е един и същ за различните протеини. Проблем е и голямото количество проба.
» ^ р е ф р а к т о м е т р и я . Б е л т ъ ц и т е п о к а з в а т определен рефрактометричен индекс. Той е различен за о т д е л н и т е протеини, поради к о е т о а н а л и т и ч н а т а м у
надеждност е много по-добра в р е ф е р е н т н и т е ст о йнос т и. По отношение на т о ч н о с т т а се доближава до биуретовия м е т о д . Много биологични показатели
оказват влияние (глюкоза, билирубин, холестерол, лекарства и др.), но поради г о л я м а т а си бързина и ниска цена м е т о д ъ т продължава да се използва в някои
страни.
"""•Ултравиолетова абсорбция. Ароматни аминокиселини и пептидни връзки показват абсорбционен максимум при различна дължина на вълната, с ъ о т в е т н о
270-290 п т и 200-225 п т . Между 200 и 225 п т почти всички белтъци показват подобен абсорбционен коефициент. М е т о д ъ т е трудоемък, изисква висококачествен
спектрофотометър, голямо количество проба и не е подходягц за рутинно използване.
****Lowry. Въведен е през 1951 г. и е претърпях много модификации. В началото б е л т ъ ц и т е р е а г и р а т с алкален меден разтвор. След прибавяне на фенолов р е а к т и в
на Polin и CiKcalteu се образува ц в е т е н комплекс (редукция на фосфоволфрамовата и фосфомолибденовата киселина до молибденово синьо и волфрамовосиньо),
чийто Ата;( е о т 745 до 750 п т . Тирозинът и т р и п т о ф а н ъ т са основните аминокиселини, участвуващи в реакцията, к а т о т я х н о т о съдържание варира за различ­
ните белтъци. М е т о д ъ т е много чувствителен (100 п ъ т и по-чувствителен о т биуретовия), но с ниска специфичност. Гама-глобулините д а в а т с 23% по-силна
оцбетка о т албумина. Има интерференция и о т някои лекарства. Р е з у л т а т и т е не корелират добре с биуретовия метод. Освен т о в а м е т о д ъ т е с два реактива.
*****В1иге1. Биуретовият м е т о д е най-широко използван. Предложен е за референтен. Двувалентни медни йони в алкална среда р е а г и р а т с п е п т и д н и т е връзки на
белтъците и се получава ц в е т е н комплекс с = 540 п т . Въведен е през 1945 г. и се изпълнява в много модификации. М е т о д ъ т е автоматизиран. Той е с много
добра аналитична надеждност. Широкото му разпространение се дължи на неговата п р о с т о т а , ниска цена и с т а б и л н о с т на реактива. Предимство е сравнител­
но слабата интерференция о т липемия, хемолиза, лекарства и др. Декстрани и макродекст и н т е р ф е р и р а т с биуретовата реакция.
Преципитационни м е т о д и . При т е з и методи се променя pH на плазмата/серума при подкисляване и б е л т ъ ц и т е се определят след преципитиция. Тук м о г а т
сл да б ъ д а т отнесени и т ъ й нар. колоидостабилитетни проби, при които се използват относително селективно действащи реактиви. Това са д о с т а неспецифични
S методи (напр. тимолова проба, вече с историческо значение).
сп Т а б л и ц а 30.22. Memogu з а определяне н а албумин 6 кръвен с е р у м / п л а з м а
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
Преципитационен изсолбане мануален историческо значение
По съдържанието на т р и п т о ф а н ъ т се определя в глобулините и т е се индиректен метод; изисква определяне на т о ч н о с т т а и възпроизво-
аминокиселини* изваждат о т общия белтък, за да се получи общия белтък; трудоемък д и м о с т т а му зависят о т
с т о й н о с т т а на албумина. метода за общ белтък
Електрофоретичен* * албуминът в електрично поле пътува самостоятелно мануален или автоматичен; с или без зависи о т носителя, избрано­
последващо оцветяване т о багрило и дензитометъра
Имунологични антиген-антитяло реакция високоспецифичен; голям брой методи
методи***
1 РИД дифузия на албуминовите молекули в среда, съдържаща мануален; специфичен; трудоемък; бавен; изчакване на крайна дифузия
антиалбуминови а н т и т е л а ниска чувствителност
1 ЕИД придвижване на албуминовите молекули под действие мануален; трудоемък; чувствителен и референтен
на електрично поле в среда, съдържаща антиалбуминови специфичен
антитела
1 Турбидиметричен антиген-антитяло комплексите намаляват мануален и автоматичен; бърз; скъп; р у т и н е н - клас А
преминаването на пропус н атата светлина повече о т чувствителен и специфичен
свободния антиген
I Нефелометричен антиген-антитяло комплексите разпръскват мануален и автоматичен; бърз; скъп; р у т и н е н - клас А
пропус на та та светлина повече о т свободния антиген чувствителен и специфичен.
(албумин)
Със селективни албуминът с различни багрила в определена среда дава мануални и автоматични; бързи; широко
багрила**** комплексни цветни съединения разпространени
1 Метилоранж цветен комплекс с Xшах = 550пт мануален и автоматичен; недостатъчно
специфичен
1 НАВА (хидроксиазо комплексно цветно съединение с = 485 п т мануален и автоматичен; специфичен за влияние на много лекарства
бензоена киселина) албумина, но със слаба чувствителност
1 BCG (бромкре- албуминът се свързва с багрилото и образува комплексно мануален и автоматичен; бърз; добра р у т и н е н - клас А
золовозелено) цветно съединение с >.mai = 628 п т чув ств и телн ост и специфичност; широко
разпространен; силно зависим о т времето
$
за о т ч и т а н е
1 ВСР (бромкрезо- албуминът с багрилото образува комплексно ц в е т н о мануален и а в т о м а тичен; специфичен за р у т и н е н - клас А
лобочервено/пурпур) съединение с Хтаж = 603 п т албумина; с т а н д а р т и з а ц и я само с човешки
албумин

*Този м е т о д се основава н а р а з л и к а т а в т р и п т о ф а н а (в албумина е само 7-10% о т т о з и в глобулините). Goldenberg и Drewes изпол­

з в а т п р е д и м с т в а т а н а т а з и разлика и р а з в и в а т м е т о д с glyoxylic acid в присъствие на Са йони и кисела среда. Ц в е т н о т о съедине­
ние е с пурпурен ц в я т и А тах = 540 п т . Свободният т р и п т о ф а н не интерферира. М е т о д ъ т е а д а п т и р а н за някои анализатори. Не
е намерил широко приложение, въпреки лесното изпълнение и д о б р а т а специфичност.
 in ч т ^Vb^ujuuyuubujjj/jujjujb 1Л1ЬШииЛ ии-шилаио C
G 9ШЖ)1ЛШШЛЗЯ-
AXp CA KJ Ks CA WfcVA tA^>AlOi4«>OCAAA«A wAAw ^ w ^ ^ — - - - — ^ „

тибна и абсолютна концентрация чрез общия белтък и дензитометрия. Електрофоретичните методи по-трудно се а в т о м а т и з и ­
р а т и няма линейност при свързване на б о я т а с белтъците. За албумина се получават по-високи стойности. Ако се използва елуира-
не възпроизводимостта се повишава. Някои нови електрофоретични техники (капилярна електрофореза) позволяват много по­
точно определяне на албумина чрез вътрешен с т а н д а р т . Електрофоретичните методи за определяне на албумин се използват в
много страни, в т о в а число и САЩ.
•**Албуминът може да бъде определен чрез РИД и ЕИД, турбидиметрия и нефелометрия, к а т о се използва специфичната реакция
антиген-антитяло. При РИД и ЕИД п р е ц и п и т а т ъ т под форма на кръгче или „рогче" може да бъде фиксиран и оцветен. В някои
страни все по-широко се използват автоматизирани нефелометри, макар ц е н а т а на албуминовото изследване да е по-висока в
сравнение с другите методи.
***»Албуминът има способност да се свързва с различни органични аниони, вкл. и комплексни цветни молекули. Полученото цветно
съединение е с нов, различен о т т о з и на багрилото абсорбационен максимум, който се о т ч и т а . Това преместване на абсорбционния
максимум позволява полученият ц в я т да бъде измерван в присъствие на излишък о т багрило, което позволява всичките налични
албуминови молекули да у ч а с т в а т в реакцията. Познати са и се използват много багрила. През 1972 г. ААСС препоръчва метода с
бромкрезоловозелено, при строго определена концентрация на б о я т а (0.075 mol/1), сукцинатен буфер с pH 4.2 и о т ч и т а н е при
Х= 628 п т . За намаление на абсорбцията на празната проба и подобряване на л и н е й н о с т т а се използва д е т е р г е н т (Brij-35). Бром-
крезоловочервено се свързва само с албумин и не изисква бързо о т ч и т а н е , но интерференция оказват липиди, хемоглобин, лекарс­
т в а и др. Според някои автори добрата възпроизводимост и лесното изпълнение п р а в я т предпочитан метода с бромкрезоловочер-
вено. Особено подходящ за с т а н д а р т е човешки серумен албумин.

сслл
сл
 1

т о д (с билирубиноксидаза), използван в Япо­

АНАЛИТИЧНИ МЕТОДИ ния. Е н з и м н и я т м е т о д обаче и м а з а сега ог­
ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ раничено приложение.
НА БИЛИРУБИН

Н. А т а н а с о в РЕФЕРЕНТИ И ГРАНИЦИ МЕТОДИ

И ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Определянето п а билирубип е едпо о т най-
ч е с т и т е изследвания 6 к л и н и ч н а т а лабо­ З а р е ф е р е н т н и граници н а билирубип в кръ­
ратория. Билирубинът попада в к р ъ в т а о т вен с е р у м н а в ъ з р а с т н и л и ц а се п р и е м а т
хемоглобина н а р а з р у ш е н и т е е р и т р о и и т и , с т о й н о с т и т е определени чрез д и а з о т и р а н а
о т миоглобин и други съединения с ъ д ъ р ж а ­ сулфанилова киселина:
щи хем. В м о н о ц и т н о - м а к р о ф а г и а л н а т а сис­ - о б щ билирубип (разтворими и неразт­
т е м а х е м ъ т губи ж е л я з о т о , т е т р а п и р о л н о - ворими фракции) 3.4 - 21.0 ^tmol/l
т о ядро се р а з г р ъ щ а в линеен т е т р а п и р о л и
- д и р е к т е н б и л и р у б и п (конюгиран, глюку-
окислява в зелен биливердин. След редукция
рониран, водно р а з т в о р и м ) 0.8-8.5 |.нпо1/1
н а ц е н т р а л н а т а м е т и л е н о в а в р ъ з к а се об­
разува билирубип, к о й т о п р е м и н а в а в цир­ - и н д и р е к т е н б и л и р у б и п (неконюгиран,
к у л а ц и я т а . С т р а н и ч н и т е а л и ф а т н и вериги б е л т ъ ч н о свързан, н е р а з т в о р и м ) се изчис­
н а билирубина м о д у л и р а т к о н ф о р м а ц и я т а л я в а о т р а з л и к а т а м е ж д у общ и д и р е к т е н
н а м о л е к у л а т а и я п р а в я т хидрофобна. По билирубип.
т а з и причина, м о л е к у л а т а билирубип с е О т к р и в а н е т о н а о т к л о н е н и я о т обичайно­
транспортира в циркулацията, обратимо т о р а з в и т и е н а „ ж ъ л т е н и ц а н а новородено­
свързан с едно о т д в е т е залавни м е с т а вър­ т о " изисква д а се п о л з в а т р е ф е р е н т н и гра­
ху м о л е к у л а т а н а серумния албумин ( U H C J U - ници н а билирубип в кръвен серум, определе­
р е к т е н билирубип). Някои л е к а р с т в а мо­ ни чрез д и р е к т н а с п е к т р о ф о т о м е т р и я
г а т д а и з м е с т я т ч а с т о т билирубина о т (Табл. 30.23.).
с в ъ р з в а щ и т е м у м е с т а в албумина. В чер­
н о д р о б н а т а к л е т к а , нормално б и л и р у б и н ъ т Таблица 30.23. Референтни граници на билиру­
се свързва к о в а л е н т н о с е д н а или две моле­ бип (директна спектрофотометрия) в кръвен се­
кули глюкуронова киселина и образумо мо­ рум на недоносени и доносени новородени деца
но- и ди-глюкурониди, наречени още конюги- (по Д. Бекер)
рани форми ( д и р е к т е н билирубип). Те с а Референтни Гранична
водно р а з т в о р и м и и се и з л ъ ч в а т с жлъчка­ Възраст (сива о б л а с т )
граници
т а . При смущения в е к с к р е ц и я т а н а жлъч­ Иедоноссчш
до 150 |imol/l 151-220 цто1/1
к а т е з и форми п р е м и н а в а т в циркулация­ новородени
т а в значителни количества. Малка ч а с т би- I ювородепи 81-125 ^imol/1
до 80 ц т о Ш
н а 1 ден
лирубин о с т а в а к о в а л е н т н о с в ъ р з а н а с ал­
Новородени
бумина и се оз нач ав а к а т о „ б и л о п р о т е и н " до 130 |imol/l 131-205 цто1/1
на 2 дни
или б-билирубии и също е р а з т в о р и м а фор­ Новородени
ма. до 165 цшоШ 166-255 цто1/1
на 3 дни
Новородени 201-295 |лто1/1
до 200 |imol/l
Билирубинът е ф о т о ч у в с т в и т е л н о съедине­ на 4 дни
ние. При фотолечение н а н е к о н ю г и р а н а т а Новородени
до 200 [imol/1 201-315 Hmol/l
на 5-8 дни
хипербилирубинемия н а новородени, в цир­
Новородени
к у л а ц и я т а се п о я в я в а т различни к о н ц е н т ­ до 165 цто1/1 166-255 (ШЮ1/1
на 9-10 дни
рации ( о т 5 до 35% ) н а билирубинови ф о т о -
и з о м е р и (Ег)-циклобилирубин, (гг)-билиру- М е т о д и . По н а с т о я щ е м , най-подходящи за
бин и (гЕ)-билирубин. Това е причина, дирек­ к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я о с т а в а т диазо ме­
т н а т а с п е к т р о ф о т о м е т р и я , широко при­ т о д и т е з а определяне н а билирубип, к о и т о
лагана з а измерване н а неконюгирания би- с а д о с т а т ъ ч н о бързи и и н ф о р м а т и в н и , а и
лирубин при новородени д а показва по-нис­ подлежат н а а в т о м а т и з и р а н е . За контрол
ки с т о й н о с т и , в сравнение с е н з и м н и я м е ­ н а д „ ж ъ л т е н и ц а н а н о во р о д е н о т о " с п е к т р о -
556
Т а б л и ц а 30.24. Аналитични м е т о д и за определяне н а билирубин 6 серум и урина
Метод
1. К о л о р и м е н т р и -
чен м е т о д с диазо-
багрила (деривати
на дихлоранилин,
дихлорфенол и др.)
и сулфанилова
киселина
- Определяне на общ
билирубин
- Д и р е к т н о опре­
деляне на билирубин
2. Е н з и м е н м е т о д :
колориметрия на
ензимно превърнат
общ билирубин в
биливердин
3. Д и р е к т н а спек-
трофотометрия
на общ билирубин
Директно о т ч и т а н е
е билирубинометър
4. О т р а ж а т е л н а
к о л о р и м е т р и я на
общ билирубин
(Eastman Kodak Co.)
Принцип ( х и м и ч е с к а р е а к ц и я ) Коментар Оценка н а м е т о д а
диазобагрилото се свързва с ц е н т р а л н а т а метено- м е т о д ъ т е описан о т Ehrlich през 1938 г. модифи­ р у т и н е н клас А
ва група на билирубина и образува два дипирола (азо- циран о т Jendrassik и Grof; изисква се излишък о т
билирубина) с различна хроматографска подвиж­ диазореактив, а после излишък о т сулфанилова ки­
ност. но с еднакъв за д в е т е форми ц в я т ; при кисело селина;
pH - Атах = 500 п т (червено оцветяване), при алкално CV в серия - 7.0%
pH - A max = 600 п т (синьо оцветяване); диазотира- CV във време - 11.3%
н а т а сулфанилова киселина не е много стабилна
използва се същия химически принцип, но се включ­ определят се всички форми на билирубин (разтво­ р у т и н е н клас А
ва акцелератор (кофеин, натриев бензоат, дифилин. рими и не разтворими) и реакцията се означава
натриев додецилсулфат и др.), който освобождава к а т о общ билирубин,
неконюгирания билирубин о т албумина и го р а з т ­ подходящ за ав томати зи ран е с програма за два
варя; д и а з о т и р а т се всички форми на билирубина и реактива
се превръщат в азобилирубин - к а к т о по-горе
с диазобагрила и сулфанилова киселина реагират „ди­ конюгираният билирубин реагира до 2 min, но
ректно" разтворимите форми на билирубин - коню- ö-билирубинът изисква повече време; добра коре­
гиран билирубин и б-билирубин лация с всички разтворими билирубинови форми;
неконюгираният билирубин се изчислява о т раз­
ликата между общ и конюгиран билирубин
анийонен д е т е р г е н т освобождава неконюгирания би­ подходящ за автоматизиране; интерференцията перспективен, но се
лирубин о т албумина; на хемоглобина няма особено значение нуждае о т допълнител­
общия билирубин се окислява о т микробиална окси- има висока специфичност и чувствителност; но проучване
даза при pH 8.0 и аеробни условия в зелен биливер­ добре корелира с диазо методи;
дин, който се колориметрира (Атах = 425 п т )
абсорбцията на билирубин (Атах = 454 п т ) след ко­ подходящ само за измерване при новородени; при бърз и удобен метод за
рекция за хемоглобин (Атм = 540 п т ) е пропорционал­ възрастни интерференцията на каротени и дру­ оценка на жълтеница на
на на концентрацията в разреден с фосфатен бу­ ги пигменти е твърде висока и м е т о д ъ т не се при­ новородени деца; не из­
фер (pH 7.4) серум на новородено лага мерва концентрацията
на ö-билирубин
при буфери с алкално pH, измерването се извършва
при други стойности на абсорбционен максимум
удобен за бързо определя­
същият принцип с опростен колориметър и филтро- изисква подходящ а п а р а т не на билирубин при но­
во отчитане на билирубин с корекция за хемоглобин вородени
трислойна суха химия: в горния слой кофеин и бензо­ освен за общ билирубин, се предоставя възможност модерна технология, но
а т дисоциират билирубин о т албумин; средния гли­ за измерване на конюгиран, неконюгиран и ö-били- затворена система, коя­
церинов слой задържа серумните белтъци; в т р е т и я рубин посредством диференцирано о т ч и т а н е на т о изисква фирмени кон­
слой катийонен полимер свързва всичкия билирубин; 400 и 460 п т сумативи
gj Т а б л и ц а 30.24. А н а л и т и ч н и м е т о д и з а определяне н а билирубин 6 серум и у р и н а (продължение)
Метод Принцип (химическа р е а к ц и я ) Коментар Оценка н а м е т о д а

отражателна колориметрия при А тах = 400 п т ; има

сходни варианти и с азобагрила
Отражателно инструментално измерване при А тах = 450 п т неинвазивно измерване за нуждите без да е много точно, из­
транскутанно на ф о т о т е р а п и я т а мерването е удобно
измерване
5. Сепарационни - високоефективна т е ч н а хроматография (HPLC) изискват подходяща апаратура, предварителна неудобни з а р у т и н н а
м е т о д и за опреде­ на метил-естерни билирубинови деривати дериватизация; преципитацията на белтъците работа; и м а т ограниче­
ляне на видове - анийонообменна хроматография - удобна за ана­ понижава с т о й н о с т и т е но приложение
билирубин лиз на билирубиновите фракции изисква скъпа апаратура предимно за изследова­
- сепариране по големината на молекулите със телски цели
Sephadex; особено подходящо за определяне на
б-билирубин

Измерване на сво­ свободният билирубин се окислява о т пероксидаза, за идентифициране, след сепариране неясно клинично
боден билирубин а свързаният с албумин е защитен о т окисление значение

6. Ф л у о р е с ц е н т н о измерва се флуоресценцията на билирубина, свързан изисква специална апаратура в е т а п на проучване;

и електрохимично с белтъци или детергенти; ползва се предимно за
определяне има модификации с измерване на „гасене" на флуо­ изследователски цели
ресценцията

7. Определяне на при кисело pH, билирубинът в у р и н а т а реагира с интерференция на високи концентрации на удобна за п р а к т и к а т а
билирубин в урина 2,6-дихлорбензен-диазониев-тетрафлуороборат н и т р и т и и аскорбинова киселина к а т о пресяващ т е с т
с т е с т - л е н т и или (и други хромогени) к а т о дава розово оцветяване за билирубин в урина.
таблетки
•томртричните м е т о д и са за предпочи-
ане. Някои детайли относно м е т о д и т е за
ределяне на билирубин и фракциите му са
сочени на Табл. 30.24.
п а н д а р т и з а ц и я п а м е т о д и т е . Създа-
н е т о на подходящ материал за стандар-
лзиране на определянето на билирубин се
трудняба о т присъствието на различни
•рми в серума, с различни концентрации и
шеднаква с т а б и л н о с т . О т всички билиру-
нови фракции, единствено неконюгирани-
1 билирубин е изолиран в кристална чис-
а форма. Той обаче е т р у д н о разтворим
в вода и нестабилен, особено на светлина
окислителни агенти. Някои калибрацион-
. материали се п р и г о т в я т в серум или бел-
ьчни разтвори, к а т о билирубинът се раз-
Заря в диметил сулфоксид. Този материал
използва за първичен с т а н д а р т , но пора-
н е с т а б и л н о с т т а му, ред фирми произво-
тели го използват за вторичен с т а н д а р т .
т т р о л н и т е м а т е р и а л и и м а т същите
юблеми. Изискването към т я х е да осигу-
т контрол на концентрации в серум по-
до 120 цто1/1. За контрол над директна-
а с п е к т р о ф о т о м е т р и я се препоръчват
ипериали с концентрации 100-300 цто1/1,
1ИГОПИС
slon СА. Nonprotein nitrogenous. C o m p o u n d s and renal
fu n ction. In: A n d e r s o n S C , C o c k a y n e S (eds). Clinical
chemistry, concepts and application. Philadelphia - London -
Toronto - Montreal - Sydney - Tokyo, WI3 Saunders company,
1993, 366-383.
г FL. Clinical and laboratory assessment o f the patient with
renal disease. In: Brenner I3M, Rector F C (eds). The kidney,
Philadelphia, WÜ Saunders, 1981, 1135-1180.
;ech CL, Wu AHB. Renal function. In: Bishop ML, Duben-
Engelkirk JL, Fody EP (eds). Clinical chemistry (2"d ed).
Philadelphia - New York - London-IIagerstown, Lippincott,
1992, 453-472.
j c k e r II, S h e p h a r d M D S , Whitl G I L E v a l u a t i o n o f an
enzymatic method for determining creatinine in plasma. J C lin
Pathol, 41, 1988, 576-581.
rison NO. Carbohydrates. In: Anderson SC, Cockayne S (eds).
Clinical chemistry, concepts and applications. Philadelphia -
London - Toronto - Montreal - Sydney - Tokyo, W B Saunders
company, 1993, 134-164.
ilan A, Jach R, Opheim KE, Toivola B, Lyon AW. Clinical
chemistry, interpretation and techniques (4'h ed), Baltimore -
Philadelphia - Hong Kong - London - Munich - Sydney - lokyo,
A. Waverly company, 1995, 191-218.
ipinas F, Dupuy G, Revol F, Aubry C. Enzymic urea assay.
въпреки че реалните нужди за педиатрия­
т а надхвърлят 300 |.tmol/l.
И и т е р ф е р е н ц и и . Билирубинът е фоточув-
ствителен и при осветление бързо се окис­
лява и разгражда. Това налага материалът
за изследване (кръв и урина) да се пази на
т ъ м н о до времето за измерване. Каротени,
флавони и други цветни съединения, които
са в по-високи концентрации в серум на въз­
растни, силно интерферират със спектро-
фотометричното определяне на билирубин.
Високите концентрации на хемоглобин в се­
рума (хемолизи !), мътнини (липемия), ме­
тални йони, лекарства к а т о амикацин, кар-
бамазепин, клофибратфенитоин, орални
контрацептиви, сулфонамиди, L-допа инхи-
б и р а т диазотирането, по неизяснен меха­
низъм. Декстран, допамин, м е т о т р е к с а т ,
пропранолол и други оказват положителна
интерференция. Противоречиви са данните
за интерференцията о т а-метил допа, ас­
корбинова киселина и други медикаменти.
За намаляване на интерференциите се пре­
поръчва бланкиране (празна проба), въпреки
изразходването на двойно количество реак­
тив, или бихроматично отчитане, ако кли-
нично-химичният анализатор предоставя
т а з и възможност.
Clin chem, 35, 1989, 654-658.
McNeely MDL), Brigden ML. Urinanalysis. In: Tilton RC, Balows
A, Hohnadel DC, Reiss R (eds). Clinical laboratory medicine.
St L o u i s - B a l t i m o r e - B o s t o n - C h i c a g o - London -
Philadelphia - Sydney - Toronto, Mosby Year Book, 1992,
402-421.
Smith S. Nonprotein nitrogen. In: Bishop ML, Duben-Engelkirk
JL, Fody EP (eds). Clinical chemistry (2,И) ed). Philadelphia -
New York - London - Hagerstown, Lippincott, 1992, 435-452.
* • *
Киряков AK. Плазмени липопротеини. В: Лозанов Б (ред).
Ендокринология - Основно Ръководство. София, ТИЛ ПЯ,
2000 (под печат).
Киряков АК. Дислипоиротеинемии. В: Лозанов Б (ред). Ен­
докринология —Основно Ръководство. София, ТИЛНЯ,
2000. (под печат).
Brown MS, Goldstein JL. Hyperlipoproteinämien und andere
Störungen des fettsto ff wechseis. In: von Kurt JG Schmaizl
(eds). Harrisous innere medizin. Dt. Ausg. der 13. Aufl ,
Berlin, Wien, 1995, 2405-2415.
Hattori Y, Suzuki M, T s u s h i m a M et al. Development of
approximate formula for LDL-chol, LDL-apo В indices of
h y p c r a p o b c t a l i p o p r o t c i n e m i a and s m a l l dense LDL.
Atherosclerosis, 138, 1998, 289-299.
559
Havel KJ, Kane JP. S t r u c t u r e a n d m e t a b o l i s m o f p l a s m a
lipoproteins. In; Scrivcr ChR, Beaudet AL, Sly WS et al (eds).
The metabolic and molecular bases o f inherited disease.
McGraw-Hill, Inc. Health Professions Division, 1995, 1H41-
1853.
Illingworth DR, Duell PI3, C o n n o r WE. Disorders o f Lipid
Metabolism. In: Felig Ph, Baxter JD, Frohman LA (eds).
Endocrinology and Metabolism. McGraw-Hill, Inc. Health
Professions Division, 1995, 1315-1403.
Kane JP. Structure and function o f the plasma lipoproteins and
their receptors. In: F u s t e r V, R o s s R, To p o l EJ ( e d s ) .
Atherosclerosis and Coronary Artery Disease. Philadelphia,
Lippincott-Raven Publishers, 1996, 89-100.
Kane JP, Havel RJ. Disorders o f the biogenesis and secretion of
lipoproteins containing the В apoli poprote ins. In: Scriver ChR,
Beaudet AL, Sly WS et al (eds). The metabolic and molecular
bas es o f inherited d i s e a s e . M c G r a w - H i l l , Inc. H e a l t h
Professions Division, 1995, 1853-1874.
Kostner GM, Marz W. Zusammensetzung und stoffwechsel der
lipoproteine. handbuch der fettstoffwechselstörungen. In:
Schwandt P, Richter W O (eds). Handbuch der Fettstoff­
wechselstörungen. Stuttgart, New York, Schattauer, 1995, 3-
47.
LaRosa JC, LaRosa JH, Rifkind BM et al. Präventions- und
behandlungsstratcgien bei dyslipoproteinämien. In: Schwandt
P. Richter W O (eds). H a n d b u c h d e r F e t t s t o f f w e c h s e l ­
störungen. Stuttgart, New York, Schattauer, 1995, 520-540.
Schmitz G, Herrmann W. Labordiagnostik von hyper- und
dyslipoproteinämien. In: Schwandt P, Richter W O (eds).
560
Handbuch d e r Fettstoffwechselstörungen. Stuttgart, N e
York, Schattauer, 1995, 488-519.
Thomas L: Clinical Laboratory Diagnostics. Use and Assessme»
o f Clinical Laboratory Results, Ith ed. Frankfurt/Main, 'IT J
Books-Verl.-Ges.,1998.
Task Force. Wood D, de Backer G, Faergeman O et al. Prevenlio
o f c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e in c l i n i c a l p r a c t i c e
Recommendations o f the Second Joint Task Force o f Europe«
and other Societies on Coronary Prevention. Eur H e a r t .
19,1998, 1434-1503.
Task Force. Wood D, de Backer G, Faergeman O, et al. Preventio
o f c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e in c l i n i c a l p r a c t i c t
Recommendations o f the Second Joint Task Force o f Europea
and other Societies on Coronary Prevention. Atherosclerosif
140. 1998, 199-270
Task Force. Wood D, de Backer G, Faergeman O, et al. Prevenlio
o f c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e in c l i n i c a l practic«
Recommendations o f the Second Joint Task Force o f Europea
and other Societies on Coronary Prevention. J Hypertens, 11
1998, 1407-1414
* * *
Бекер Д. стр 300-301 в: Лабораторна диагностика. С. Мед
физк, 1991.
Westwood A. T h e analysis o f bilirubin in serum. Ann Cli
Biochem 28,1991,119-130
Itoh S, Kusaka T, Imai T, et al. Effects o f bilirubin and it
photoisomers on direct bilirubin measurement using bilirubi
oxidase. Ann Clin Biochem 37,2000,452-56.
 Аналитични принципи
п р и изследбане н а е н з и м и
Ь ЕНЗИМНА АКТИВНОСТ -
МЕХАНИЗЪМ, ФАКТОРИ,
ИЗМЕРВАНЕ
Б. Д и и и ш н о О а
МЕХАНИЗЪМ НА
2НЗИМНО Д Е Й С Т В И Е
Ензи~мите, к а к т о и д р у г и т е к а т а л и з а т о ­
ри о с т а в а т непроменени в края на ускоре-
1ия о т т я х процес. Въпреки че видимо ензи­
м и т е не у ч а с т в а т в него, т е в л и з а т в непо-
федствен к о н т а к т с реагиращите вещест-
ia. В хода н а т о з и к о н т а к т се получават
междинни съединения между ензима и уча­
с т в а щ и т е в р е а к ц и я т а в е щ е с т в а . Вещест­
в а т а , ч и я т о химична т р а н с ф о р м а ц и я се
катализира о т ензима са негови с у б с т р а ­
ти. Получените в р е з у л т а т на е н з и м н о т о
действие в е щ е с т в а са п р о д у к т и п а с п -
з и л т а т а р е а к ц и я . Междинното съедине­
ние м е ж д у е н з и м и с у б с т р а т се нарича
е п з и л т о - с у б с т р а т с п к о м п л е к с (ES). В
р а м к и т е н а т о з и комплекс с у б с т р а т ъ т ,
к о й т о преминава във възбудено с ъ с т о я н и е ,
т ъ р п и химично превръщане, при к о е т о се
получава п р о д у к т ъ т н а р е а к ц и я т а ,
Зременно свързан с ензима к а т о с п з и л т о -
п р о д у к т с п к о л ь п л с к с (ЕР). Накрая про­
д у к т ъ т се освобождава о т ензима. Послед­
н и я т о т н о в о е способен да се свърже с нова
молекула с у б с т р а т . В най-общ вид ензимно-
к а т а л и з и р а н а т а р е а к ц и я п р о т и ч а по
гледния начин:
E +S o E S o E P < » E +P
Всяка о т т р и т е с т ъ п к и на процеса
всъщност е много по-сложна и п р о т и ч а през
няколко междинни фази. Независимо колко
и какви са т е з и фази, а к т и в и р а щ а т а и м
епсргил е випаги по-писка о т тази,
която изисква пскатализирапата
р е а к ц и я , т а к а че в крайна с м е т к а а к т и ­
в и р а щ а т а енергия на катализирания о т ен­
зима процес е значително по-ниска. Благо­
дарение на ензимното действие, в условия­
т а на организма (37 0С), е възможно п р о т и ­
чане на м е т а б о л и т н и т е процеси с минимал­
на консумация н а енергия.
Еизимно-субстратен комплекс
За разбиране и н т и м н и я механизъм на една
ензимна реакция е необходимо познаване
е с т е с т в о т о на ензимно-субстратния
комплекс. П р е д с т а в а т а за образуване на
т а к ъ в комплекс с т о и в о с н о в а т а на всички
схващания о т н о с н о механизма на
ензимното действие. Изследването на т е з и
к о м п л е к с и п р е д п о л а г а преди всичко
познаване конформацията на б е л т ъ ц и т е -
ензими и произлизащите о т т а з и
конформация възможности за встъпване в
химични взаимодействия. О т друга с т р а н а ,
ES са много нестабилни съединения, поради
к о е т о т р у д н о м о г а т да б ъ д а т изолирани и
проучени. П р и л а г а н е т о н а съвременни
физико-химични м е т о д и дава напоследък
д о с т а т ъ ч н о в ъ з м о ж н о с т и за сигурното
доказване н а т а к и в а комплекси и з а
т я х н о т о с т р у к т у р н о конкретизиране.
Едни о т н а й - с т а р и т е доказателства за
образуването на ензимно-субстратен комплекс
са получени при пероксидазите. Те са двукомпо­
нентни ензими с простетична група, съдържа­
ща желязопорфирин, поради което и м а т и ха­
рактерен спектър на поглъщане във видимата
област на светлинните лъчи. Пероксидазите ка­
тализират окислението на субстрати при нали­
чие на водороден пероксид като акцептор. При
смесването му с пероксидаза, спектърът на по­
глъщане на ензима се изменя (фиг. 31.1), което е
безспорно доказателство за образуване на
комплекс между двете вещества. Подобни ком­
плекси са доказани и при други ензими: каталаза
с водороден пероксид, алкохол и лактатдехидро-
561
 80

О ^ А / \ о +Л Р

up
простет irina ES
370 400 430 460 +
група
дължима на вълната (nm)
ф т 31.1. Спектър на поглъщане на ензима (Е) I
и ензимно-субстратния комплекс (ES) апо Е
геназа с NAD, рибонуклеаза с рибонуклеинова
киселина и др. Безспорни доказателства за полу­
O A
чаване на е н з и м н о - с у б с т р а т е н комплекс с е b p
получават и по п ъ т я на рентгено-структурния
анализ. Образуването на ензимно-субстратния ф и г . 31.2. Схема на реакцията
А) Образуване на ES комплекс с помощта
комплекс ангажира само малка ч а с т о т повърх­
на ензим
н о с т т а на голямата белтъчна молекула на Б) Образуване на ES комплекс с помощта на
ензима. Тази област се нарича к а т а л и т и ч с п ензим с п р о с т е т и ч н а група или коензим
и л и а к т и в е н ц е н т ъ р . К а т а л и т и ч н и я т цен­
т ъ р съдържа различен брой аминокиселинни предлагат най-често каталитични и по-рядко
о с т а т ъ к а . При двукомпонентните ензими в контактни групи. В някои случаи нискомолекул­
неговата организация участва и п р о с т е т и ч - н и т е компоненти и з г р а ж д а т изцяло катали-
н а г р у п а , респ. к о е н з и м . Оперативни единици т и ч н а т а ч а с т на центъра, оставяйки за апоен-
на т о з и център са различни функционални гру­ зима „ к о н т а к т н а т а " функция. Съществен е
пи. Според съвременните представи групите в въпросът за е с т е с т в о т о на връзките между
каталитичния център се подразделят, макар и с у б с т р а т а и к а т а л и т и ч н и т е и контактни гру­
условно, в зависимост о т фунцията си на т р и пи на каталитичния център. Те м о г а т да б ъ д а т
вида: к а т а л и т и ч н и , к о н т а к т н и и п о л ю щ - най-разнообразни - от ковалентни до най-слаби
ни. Каталитичните групи у ч а с т в а т директно вторични взаимодействия. Особено ч е с т о уча­
в реакциите на превръщане на с у б с т р а т а в с т в а т имидазоловите групи на хистидина, сери-
продукт. К о н т а к т н и т е групи прикрепват суб­ новитехидроксилни групи, тиоловите групи на
с т р а т а към каталитичния център по т а к ъ в
начин, че а т а к у е м а т а о т ензима с у б с т р а т н а
връзка да попадне в полето на действие на ка­
талитичните групи. В случаите, когато е необ­
ходимо включването на две или повече различни
субстратни молекули, к о н т а к т н и т е групи ги
довеждат до най-благоприятната за реагиране
позиция. По т о з и начин к о н т а к т н и т е групи
допринасят най-много за високата скорост и
специфичност на е н з и м н о - к а т а л и з и р а н и т е
реакции. К а к т о ускоряването на процесите,
т а к а и специфичността е винаги по-малка, о т ­
колкото в присъствие на белтъчния катали­
затор - ензима.
Съгласно представите за наличие на катали-
тичен център в ензимната молекула и за обра­
зуване на ES комплекс, катализираната о т опре­ Фиг. 31.3. Схематично представяне на ката-
делен ензим реакция е представена схематично литичен ц е н т ъ р
на фиг. 31.2. Ако ензимът включва и простетич- • - к о н т а к т н и групи
на група или коензим, трябва да се приеме, че А - каталитични групи
т е също у ч а с т в а т със свои групи в комплекту­ • - помощни групи
ването на каталитичния център (фиг. 31.3). Те О - несъществени групи
562
\стеина u gp. К а т а л и т и ч н а т а а к т и в н о с т на
кои о т т е з и групи зависи о т с ъ с т о я н и е т о им
йонизаиия, к о е т о определя pH-зависимостта
. ензимното действие. Р о л я т а на т е з и групи
вграждане на ензимно-субстратни комплекси
преобразуването на с у б с т р а т и т е се доказва
различни начини. Успешно се използват реак-
и за свързването им със спеиифични реагенти.
^бстратна специфичност
1ензимиото действие
р е д с т а б а т а з а и н т и м н и я механизъм н а
1зимно-субстратното взаимодействие,
)ез к а т а л и т и ч н и я ц е н т ъ р н а е н з и м а ,
•яснява едно о т н а й - с ъ щ е с т в е н и т е свой-
1ва н а е н з и м и т е - в и с о к а т а i u m епзшм-
1 с п е ц и ф и ч н о с т . Т я се и з р а з я в а в две
шравления: п о о т н о ш е н и е е с т е с т в о т о
а катализираната реакция и по
пношение естеството н а субстра-
41. С п е ц и ф и ч н о с т по о т н о ш е н и е е с т е с т -
т о н а к а т а л и з и р а н а т а р е а к ц и я проявя-
т и небиологичните к а т а л и з а т о р и , но при
1зимите т я е по-добре изразена. Т а к а н а -
)имер, о т р а з л и ч н и т е в ъ з м о ж н н и превръ-
а н и я н а а м и н о к и с е л и н и т е , аминооксида-
т е у с к о р я в а т т я х н о т о дезаминиране, а
карбоксилазите - декарбоксилирането им
• амини. Много п о - с ъ щ е с т в е н а и по-харак-
ерна е с у б с т р а т н а т а специфичност на
1зимите, според к о я т о т е се о т л и ч а в а т
ш е ж д у си. С у б с т р а т ъ т т р я б в а д а бъде в
лишък и в к р а я н а е н з и м н а т а р е а к ц и я д а
; с а изразходвани повече о т 20% о т него.
ри използване н а по-малки ( с у б о п т и м а л н и )
б с т р а т н и концентрации зависимостта
зжду с к о р о с т и к о н ц е н т р а ц и я губи по-
>рзо праволинейния си ход. О п т и м а л н а т а
ш ц е н т р а ц и я н а с у б с т р а т а (С о п т . ) с е
числява по формула,
С у б с т р а н а т а с п е ц и ф и ч н о с т е израз н а
icokume изисквания н а к а т а л и т и ч н и я цен-
ър н а е н з и м а с п р я м о к о н ф и г у р а ц и я т а н а
б с т р а т а . Очевидно е, че т р я б в а д а е нали-
! много добро с ъ о т в е т с т в и е м е ж д у кон-
а к т н и т е и к а т а л и т и ч н и т е групи н а ка-
а л и т и ч н и я ц е н т ъ р , респ. р а з с т о я н и я т а
з ж д у т я х и с ъ о т в е т н и т е и м г р у п и (с
• и т о щ е си в з а и м о д е й с т в а т ) о т с у б с т р а -
а. С у б с т р а т н а т а с п е ц и ф и ч н о с т н а ензи-
j m e е различно изразена. Някои ензими с а
с много с т р о г а с п е ц и ф и ч н о с т - т е и м а т
с а м о един с у б с т р а т , а други, к о и т о с а с по-
слабо изразена с п е ц и ф и ч н о с т м о г а т д а ка­
т а л и з и р а т химични превръщания н а група
о т близки по с т р у к т у р а с у б с т р а т и .
Биологичното значение н а с у б с т р а т н а т а
специфичност н а е н з и м и т е е огромно. Благо­
дарение н а нея, измежду голямо количество
с у б с т р а т и , к о и т о биха могли д а се подло­
ж а т н а определен химичен процес, се подби­
р а само т о з и , за к о й т о н а с ъ о т в е т н о т о
м я с т о се н а м и р а специфичен ензим. Т а к а
например л а к т а т д е х и д р о г е н а з а т а , обграде­
н а о т различни подлежащи н а дехидрогени-
р а н е с у б с т р а т и к а т о л а к т а т , глицеролал-
дехид-3-фосфат, м а л а т , глюкоза и др., щ е
даде п ъ т н а дехидрогенирането е д и н с т в е н о
на л а к т а т а .
Скорост на е и з и м и и т е реакции
Ензимна к и н е т и к а
Много с ъ щ е с т в е н о с в о й с т в о н а е н з и м и т е
к а т о б и о к а т а л и з а т о р и е, че п о в л и я в а н е т о
с к о р о с т т а н а биохимичните процеси зависи
о т м н о г о и р а з н о о б р а з н и ф а к т о р и . Ско­
р о с т т а на к а т а л и з и р а н и т е о т ензими
реакции се измерва или с намалението на
субстрата за единица бреме, или с натру­
пания за единица време продукт. Пониже­
нието скоростта на реакцията с времето
м о ж е д а се обясни с най-разнообразни при­
чини: понижение концентрацията на суб­
страта, потискане на ензимната актив­
ност от продукта, частично инактивиране
на ензима и пр. Поради т о в а с к о р о с т т а н а
е н з и м н и т е реакции не е п о с т о я н н а величи­
на. При б л а г о п р и я т н и условия и при излишък
о т с у б с т р а т през по-къс или по-дълъг нача­
лен период е н з и м н а т а реакция може д а запа­
зи нулев порядък, т . е . с к о р о с т т а и д а бъде
независима о т в р е м е т о . З а т о в а , к о г а т о се
изследва с к о р о с т т а н а к а т а л и з и р а н и т е о т
ензими реакции, правилно е д а се определя
с к о р о с т т а в началния и м период, при ли­
н е й н о с т между количество п р о д у к т и време,
т . е . с к о р о с т т а е еднаква з а еднакво време
(продуктът за единица време е постоянна
величина). С т о й н о с т т а н а н а ч а л н а т а ско­
р о с т се определя с т а н г е н с а н а ъгъла, к о й т о
д о п и р а т е л н а т а к ъ м к р и в а т а сключва с
а б с ц и с н а т а ос (фиг. 31.4).
563

фиг. 31.4. Схематично предтабяне стойноста
на началната скорост (V0)
Въз основа на изложените т е о р е т и ч н и
постановки на а н а л и т и ч н и т е принципи в
ензимологията, е наложително да се р а б о т и
с оптимизирани ензимни методи в клинич­
н а т а лаборатория, съобразно основните
изисквания на IFCC.
ОСНОВНИ ИЗИСКВАНИЯ ПРИ
МЕТОДИТЕ ЗА ОИРЕДЕАЯНЕ
НА ЕНЗИМНА АКТИВНОСТ
Оптимална с у б с т р а т н а
концентрация
Влияние н а к о н ц е н т р а ц и я т а
на с у б с т р а т а
К о н с т а н т а н а Михаелис
При протичане на р е а к ц и я т а при ниска
концентрация на с у б с т р а т а с к о р о с т т а
н а р а с т в а пропорционално на концентра­
ц и я т а му, к а к т о т о в а е например при моно-
молекулните химични реакции {закон за дей­
ствие на масите), т . е . реакцията е о т пър­
в и п о р я д ъ к спрямо с у б с т р а т а . К о г а т о
к о н ц е н т р а ц и я т а на с у б с т р а т а превиши
известна стойност, с к о р о с т т а с т а в а неза­
висима о т нея и постоянна, т . е . р е а к ц и я т а
приема н у л е в порядък. З а в и с и м о с т т а има
характер на правоъгълна хипербола и клони
към определена максимална скорост. М а т е ­
матически израз на уравнението на т а з и за­
висимост е даден, благодарение усилията на
Michaelis и Menten (1913) и Golden-Brigs (1925),
които се с ч и т а т създатели на дял о т ензи­
мологията наречен „ е н з и л т а кипстика".
564
2
Фиг. 31.5. Зависимост между скоростта на ен­
зимната реакция (V) и концентрацията на суб­
с т р а т а (S)
К о н с т а н т а т а на Михаелис е равна на та­
кава с у б с т р а т н а концентрация, при коятс
(при еднакви други условия) е н зи м н ат а
а к т и в н о с т достига половината о т макси­
м а л н а т а си скорост. Това позволява опреде­
ляне на Михаелисовата к о н с т а н т а по експе­
риментален п ъ т , но само приблизително,
т ъ й к а т о о т хиперболата е трудно да се
у с т а н о в и м а к с и м а л н а т а скорост на про­
цеса, респ. онази концентрация на субстра­
т а , к о я т о отговаря на половината о т тази
максимална скорост (фиг. 31.5). Констан­
т а т а на Михаелис може да се определи точ­
но чрез предложената о т Lineweaver-Burk
двойна реципрочна трансформация на урав­
нението на Michaelis-Menten:
I Km 1
V Vm a x IIS^ JI Vm a x
T 1
V - скорост на ензимната реакция
VmaX - максимална скорост на ензимната
реакция
Km - константа на Michaelis
|S| - концентрация на субстрата
Уравнението се решава графично. Точна­
т а с т о й н о с т на 1 / К т при 1/Vmax се определя
чрез екстраполация на реципрочните стой­
н ости на скорост и с у б с т р а т н а концентра­
ция (фиг. 31.6). В клиничната ензимология се
приема, че о п т и м а л н а т а концентра­
ц и я н а с у б с т р а т с р а в н а и л и по-голя-
л т о т 20 K m .
К а т о пример може да се посочи оптими­
з и р а н и я т UV-mecm за ЛАЛТ, при който с
увеличаване на с у б с т р а т н а т а к о н ц е н т р а -
ц и я се п о л у ч а в а т 2-3 п ъ т и по-високи с т о й ­
н о с т и о т т е з и , о т ч е т е н и с д р у г и UV-
т е с т о в е . По т о з и начин м е т о д ъ т добива по-
г о л я м а ч у в с т в и т е л н о с т и възпроизводи-
мост.
Ф и г . 31.6. Графично определяне Km no уравнение­
т о на Lineweaver-Burk
Влияние н а т е м п е р а т у р а т а
Оптимална т е м п е р а т у р а
З а в и с и м о с т т а н а с к о р о с т т а на ензимните
реакции о т т е м п е р а т у р а т а е по-сложна в
сравнение със с к о р о с т т а н а о б и к н о в е н и т е
химични реакции. О т н а ч а л о с к о р о с т т а на­
р а с т в а с повишаване н а т е м п е р а т у р а т а ,
к а к т о т о в а е и при о б и к н о в е н и т е химични
реакции. О п т и м а л н а т а т е м п е р а т у р а з а ак­
т и в н о с т т а н а е н з и м и т е е функция н а вре­
м е т о . Т е м п е р а т у р н и я т о п т и м у м н а много
ензими зависи о т pH н а с р е д а т а , окси/редук-
ционния ü п о т е н ц и а л и о т наличието н а
примеси. О п т и м а л н а т а т е м п е р а т у р а н а из­
следване н а е н з и м н а т а а к т и в н о с т , възприе­
т а у нас е 370С. В няко и с т р а н и е в ъ з п р и е т а
30 о С
Всички клинично-химични а н а л и з а т о р и
о т по-ново поколение и м а т д в а т е м п е р а ­
т у р н и р е ж и м а (30оС и 370С). Т е м п е р а т у р а т а
се поддържа п о с т о я н н а до ±0.1оС със специа­
лни т е р м о с т а т и р а щ и модули. Въпреки т о ­
в а се препоръчва п о м е щ е н и я т а , в к о и т о с а
разположени а н а л и з а т о р и т е да б ъ д а т с
климатична инсталация.
Влияние н а к о н ц е н т р а ц и я т а
н а Иос|ороф1ите й о н и
О п т и м а л н о pH
К о н ц е н т р а ц и я т а н а в о д о р о д н и т е йони в
р е а к ц и о н н а т а среда се о т р а з я в а върху ско­
р о с т т а н а е н з и м н и т е реакции. р И - о п т и м у -
м и т е з а някои ензими с а различни по о т н о ­
шение н а о т д е л н и с у б с т р а т и . Освен т о в а
о п т и м а л н о т о pH може д а бъде и з м е с т е н о ,
м а к а р и не много, под влияние н а примеси в
с р е д а т а - най-често електролити.
К о н ц е н т р а ц и я т а н а в о д о р о д н и т е йони
повлиява к а к т о с р о д с т в о т о между ензима
и с у б с т р а т а , т а к а и с т а б и л н о с т т а н а ен-
з и м н о - с у б с т р а т н и я комплекс. Тези е ф е к т и
с а о б р а т и м и . Те и м а т обикновено сигмоида-
лен ход. П о д д ъ р ж а н е т о н а о п т и м а л н о pH
при п р о т и ч а н е н а е н з и м н а т а реакция нала­
г а използване н а буфери с голям к а п а ц и т е т
- аминоалкохоли, е т а н о л а м и н , д и е т а н о л а -
мин, амедиол и др.
Прилагане н а е н з и м н и а к т и В а т о р и
Е н з и м н и т е а к т и в а т о р и се използват за въз­
становяване а к т и в н о с т т а на нестабил­
н и т е in vitro ензими, з а и з т е г л я н е н а ензим­
н а т а реакция надясно, з а повишаване чув­
с т в и т е л н о с т т а на реакцията.
П и р и д о к с а л ф о с ф а т ъ т , к о й т о е коензим
н а АСАТ, е лабилно свързан с апоензима и се
добавя к а т о а к т и в а т о р при определяне ак­
т и в н о с т т а н а ензима. С т е п е н т а н а а к т и ­
виране варира о т 15 до 50%. При АЛАТ връз­
к а т а н а пиридоксалфосфата с апоензима е
п о -с т а б и лн а , о т д е л я се в по-малка с т е п е н и
з а т о в а д о б а в я н е т о м у к ъ м серума и м а по-
слаб а к т и в и р а ш е ф е к т и варира о т 10 до 20%.
При р а з р а б о т в а н е т о н а д и а г н о с т и ч н и
т е с т о в е з а КК се и з п о л з в а т т и о л о в и съеди­
нения, к о и т о с а моицш а к т и в а т о р и . М е т о ­
д ъ т з а опредяляне н а КК е о п т и м и р а н мно­
г о к р а т н о о т д р у ж е с т в а т а по клинична хи­
м и я н а различни с т р а н и и о т IFCC. В диаг­
н о с т и ч н и т е т е с т о в е з а определяне а к т и в ­
н о с т т а н а КК н а й - ч е с т о се прилага т р и -
с т ъ п а л н и я о п т и ч е н т е с т н а Oliver - Rozalki
с и н д и к а т о р е н ензим глюкозо-б-фосфатде-
хидрогеназа и крайни п р о д у к т и NADP.H2 и
6-фосфоглюконат. А к т и в н и я т ц е н т ъ р н а
КК съдържа две SH групи, к о и т о се окисля­
в а т о т серумен и н х и б и т о р до н е а к т и в н а S-
S група. Haü-подходяш и препоръчителен ак­
т и в а т о р е N - а ц е т и л ц и с т е и н , к о й т о разкъс­
в а д и с у л ф и д н а т а връзка и ензима в ъ з с т а ­
новява а к т и в н о с т т а си.
565
 Мощни а к т и в а т о р и при определяне ак­
т и в н о с т т а н а АФ са аминоалкохолните бу­
фери - диепганолсшин, трие, 2-амино-2-ме-
т и л - 1 - а м и н о п р о п а н о л (последният се препо­
ръчва о т IFCC). Тези буфери с в ъ р з в а т о т д е ­
ления о т АФ ф о с ф а т и и з т е г л я т равнове­
с и е т о на р е а к ц и я т а н а дясно.
ИзнолзВане н а с у б с т р а т и
с максимална о т н о с и т е л н а
чуВстВителност
Максимална о т н о с и т е л н а ч у в с т в и т е л н о с т
н а определени с у б с т р а т и може да се изчисли
по ф о р м у л а т а :
А= еС

Отстраняване
на ензимни и н х и б и т о р и
С к о р о с т т а н а е н з и м н и т е реакции може да
бъде понижена о т вещества, наречени инхи­
битори. Е н з и м н и т е инхибитори н а м и р а т
приложение за изследване механизма н а ен­
зимното действие, за конкретизиране и
идентифициране на групи в к а т а л и т и ч н и я
център, за изучаване на м е т а б о л и т н и т е пъ­
т и щ а . Много токсични и лечебни в е щ е с т в а
са ензимни инхибитори. Повечето ензимни
инхибитори и м а т ниско молекулно т е г л о и
т я х н о т о о т с т р а н я в а н е е възможно чрез
диализа. Най-много инхибитори има в урина­
т а . На п р а к т и к а всички ензими в у р и н а т а
с изключение на КФ, ААП, уропепсиноген и
амилаза следва да се изследват след пред­
варителна диализа на у р и н а т а . В серума се
с ъ д ъ р ж а т инхибитори н а следните ензими:
трипсин, хиалуронидаза, глюкозооксидаза,
поради к о е т о е ж е л а т е л н а п р е д в а р и т е л ­
н а т а му диализа.
А - максимална о т н о с и т е л н а ч у в с т в и т е л н о с т
Е - моларен екстинционен коефициент
С - специфичност н а с у б с т р а т а
Каталитични методи
с NAÜ(P) или NAD(P)H
Тази група м е т о д и н а м и р а т широко приложе­
ние. О с н о в а т се н а с в о й с т в о т о на NAD(P)H
(редуцираните форми) да п о г л ъ щ а т у л т р а ­
виолетови лъчи с дължина н а в ъ л н а т а 340
п т (фиг 31.7). В окислено с ъ с т о я н и е т е не
п о к а з в а т абсорбция при т а з и дължина на
вълната. Нарастването на екстинцията
при 340 п т е право пропорционално н а коли­
ч е с т в о т о образуван NAD(P)H, с ъ о т в е т н о на
а к т и в н о с т т а н а изследвания ензим. Оптич­
н и я т т е с т н а Warburg се използва при опре­
деляне а к т и в н о с т т а н а всички ензими с ко-
ензим NAD или NADP: АДХ, ГДХ, МДХ, изо-
цитратдехидрогеназа, глюкозо-6-фосфатде-

Изследване н а е н з и м н а т а а к т и В н о с т
по началната с к о р о с т

Н а ч а лната скорост н а е н з и м н и т е реакции

е право пропорционална н а а к т и в н о с т т а н а
ензима. Тази зависимост дава в ъ з м о ж н о с т
чрез измерване с к о р о с т т а н а е н з и м н и т е
реакции при п о с т о я н н и други условия да се
съди за а к т и в н о с т а н а ензима.
Изследване на ензимите по начална ско­
рост (Vq) на катализираната от т я х реак­
ция. Голяма ч а с т о т е н з и м н и т е реакции
и м а т линеен ход за к р а т ъ к период о т време,
през к о й т о т р я б в а да се извърши изследва­
н е т о . За т а з и цел най-подходящи с а кине­
т и ч н и т е методи.

Ф и г . 31.7. Абсорбционен с п е к т ъ р и о п т и м а л н а
Х за измерване на NADH (1) и NAD (2)
566
 дрогеназа u др.
За определяне а к т и в н о с т т а на ензими,
и т о коензим не е NAD(P) се прилагат мно-
:тъпални оптични т е с т о в е . П р о д у к т ъ т ,
й т о се получава на първото стъпало на
а к ц и я т а се определя чрез спрегната реак-
я, к о я т о се катализира о т помощен ензим
фисъствие на пиридинкоензим. С т ъ й нар.
у с т а п а л н а реакция се определя а к т и в -
с т т а на АСАТ, АААТ и др.
За определяне а к т и в н о с т т а на КК се из-
лзва т р и с т ъ п а л н а ензимна реакция с по-
пцни ензими. А к т и в н о с т т а на изоензи-
ime на КК може да се определи с п о м о щ т а
. най-често използвания в клиничната ла-
р а т о р и я а в т о м а т и ч е н имунологичен ме-
зд. Специфични а н т и т е л а селективно бло-
р а т е н з и м н а т а а к т и в н о с т на М-субеди-
щ и т е в МВ-изоензима и в ММ-изоензима
I КК, докато е н з и м н а т а а к т и в н о с т на ВВ-
бединиците о с т а в а и н т а к т н а . С помощ-
а на три- и четиристъпални методи мо-
т да б ъ д а т изследвани всички останали
1зими в човешкия организъм. Необходимо е
• н центра цият а на помощните ензими да
.де 10 до 100 п ъ т и по-голяма о т концен-
р а ц и я т а на изследвания ензим.
аталитични методи
зз NAD(P) или NAD(P)H
зновните методи в т а з и група са кинетич-
jme колориметрични методи. Двуточкови-
е методи са изоставени, к а т о не особено
адеждни. В диагностичните т е с т о в е най-
зсто образуваните хромофори са р-нитро-
енол и р-нитроанилид.
Съобразно изискванията на IFCC за опре-
зляне а к т и в н о с т т а на алкална фосфатаза
а т о с у б с т р а т се използва р-иитрофе-
илфосфат, а за ГГТ - Ь-у-глутамил-р-ни-
фоанилид или Ь-7-глутамил-3-карбокси-4-
итроанилид.
За определяне а к т и в н о с т т а на и-амила-
1та((х-1,4-гликан-4-гликанхидролаза)се при-
ага също кинетичен колориметричен ме-
юд със с у б с т р а т р-нитрофенил-а-О-мал-
юхептаозид.
К и н е т и ч н и т е колориметрични м е т о д и
а с висока а на л ит ич н а надеждност и се
олзват при всички дискретни анализатори.
Некаталитични м е т о д и
(директии методи)
Определя се т е г л о в н а т а концентрацията
на ензимите ( к а т о белтък), а не т я х н а т а
а к т и в н о с т . Използват се имунометрични
методи (ELISA, флуоресцентна или лазерна
техника, нефело- и турбидиметрия и др.),
к о и т о и м а т значение особено за ензими,
ч и я т о а к т и в н о с т бързо намалява в циркула­
ц и я т а , поради инхибиране и протеолиза. На­
последък се установи, че определянето на
к о н ц е н т р а ц и я т а на п р о с т а т н а т а кисела
фосфатаза, концентрацията на костна ал­
кална фосфатаза и концентрацията на МВ-
изоензим на КК к о р е л и р а т по-добре със
с ъ о т в е т н о т о тъканно увреждане (проста­
т а , кости и миокард), отколкото определя­
н е т о на т я х н а т а активност. Определяне­
т о кон ц е н тра ц и ята на някои фактори на
съсирването и фибринолизата е о т значение
при разграничаване на дефицит о т първи
или втори т и п на изследваните фактори.
ЕДИНИЦИ НА ИЗМЕРВАНЕ
НА КАТААИЧНАТА АКТИВНОСТ
Обикновено е много трудно, а понякога и
практически невъзможно да се определи ко­
личеството на ензима в тегловни единици.
Е т о защо е по-удобно количеството на ензи­
ма да се измерва според неговата актив­
н о с т в условни единици. Понастоящем к а т о
(Ш) ензим се приема т о в а количество о т
него, к о е т о катализира превръщането на 1
|.imol с у б с т р а т , или на 1 ^lEq о т атакувана­
т а химична група за 1 min. Определянето
на единиците следва да с т а в а при опти­
мално pH, оптимална с у б с т р а т н а концен­
т р а ц и я и т е м п е р а т у р а 37 0С.
През 1972 г Комисията по биохимична но­
менклатура при Международния биохими­
чен съюз предложи нова мярка за ензимно
количество - к а т а л (cat): количеството ен­
зим, което превръща 1 mol с у б с т р а т за 1 s.
К а т а л ъ т е много висока мярка за прак­
тически нужди и фактически има само под­
разделения. Един к а т а л е равен на 6x10 IU,
а една IU е равна на 16.67 нанокатала (neat).
Под специфична активност се разбират ен­
зимните единици, отнесени за 1 mg ензимен
белтък. Молекулна активност се дефинира
567
с единици н а един \хто\ ензим. Това ес­
т е с т в е н о предполага да се познава молекул­
н а т а маса на ензима. Под активност на ка-
талитичния център се разбира б р о я т н а
АНАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЕНЗИМИ
С ДИАГНОСТИЧНО ЗНАЧЕНИЕ
Н. А т а н а с о в
ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ
Измерване н а е н з и м н а а к т и В н о с т
Моларната концентрация на е н з и м и т е в би­
ологични т е ч н о с т и е т в ъ р д е ниска, но т я х ­
н а т а а к т и в н о с т е д о с т а т ъ ч н о висока, з а
да бъде измерена. Е т о защо, определянето
на ензими в биологични т е ч н о с т и в повече­
т о случаи се извършва чрез измерване н а
т я х н а т а специфична а к т и в н о с т , по обща
схема, включваща:
• осигуряване на пресен биологичен м а т е р и ­
ал без хемолиза;
• използване на химически ч и с т а стъклария,
без следи о т д е т е р г е н т и и други инхиби-
т о р и на ензимната реакция;
• среда, к о я т о осигурява оптимални условия
за извършване на специфична ензимна ре­
акция (подходящ състав, солева концент­
рация и pH на буфера, подходаща концент­
рация и вид н а а к т и в а т о р и , коензими и
т.н.);
• с у б с т р а т в подходяща концентрация, кой­
т о гарантира специфичност на реакция­
т а (когато е н з и м ъ т има широка специфич­
ност, предпочита се с у б с т р а т , к о й т о оси­
гурява най-висока скорост на катализа);
• оптимална концентрация на измервания
ензим (разреждането на м а т е р и а л а в сре­
д а т а най-често е в съотношение около 1:80
за серум; при висока а к т и в н о с т , концент­
рация на ензима следва да се намали)
• кинетично измерване с к о р о с т т а н а изчер­
пване на с у б с т р а т а (или увеличение н а
п 0
Р д у к т а ) в инкубационната среда при ус­
ловия н а реакция о т нулев порядък (пос-
568
с у б с т р а т н и т е молекули, п р е в ъ р н а т и за
една min о т един к а т а л и т и ч е н ц е н т ъ р на
ензима.
т о я н н а промяна в о п т и ч н а т а п л ъ т н о с т
за единица време) при к о н с т а н т н а т е м ­
п е р а т у р а о т 37 0С. С ъ о б р с и к с п и п т а до­
в е л и д о onpcgcAJUie п а н я к о и е п з и л ш
п а 2 5 0 С и л и 30 0 С н е с е с ч и т а т вече
з а в а л и д н и и с л е д в а д а о т п а д н а т . За
някои колориметрични набори се допуска
и двуточково измерване.
П р о и з в о д и т е л и т е на набори за определя­
не на ензимна а к т и в н о с т с а задължени за
о п и с в а т с ъ с т а в а н а използваните реакти­
ви. Това позволява да се подбере набор, кой­
т о с ъ о т в е т с т в а по к о н ц е н т р а ц и я н а със­
т а в к и т е си н а международните изисквания.
Осигуряване на о с т а н а л и т е условия е задъл­
жение на лабораторния и болничен персонал.
Определяне на м а с а
Определянето на ензьимна активност има ред
н е д о с т а т ъ ц и . А к т и в н о с т т а о т р а з я в а пра­
вилно к о н ц е н т р а ц и я т а н а ензилтата моле­
кулна лшеа само в един ограничен отрязък
о т в р е м е т о за измерване {при кинетика от
нулев порядък). Всички фактори, к о и т о биха
могли да и н т е р ф е р и р а т в а н а л и т и ч н а т а фа­
за биха нарушили корелацията между актив­
н о с т и концентрация. О т друга с т р а н а , т ъ -
к а н н и т е ензими попаднали в циркулацията в
р е з у л т а т на увреждане, и м а т различно дъ­
лъг период н а инактивация - индивидуална за
всеки ензим константа на деградация. Тя оба­
че зависи о т много фактори, к о и т о трудно
м о г а т да се к о н т р о л и р а т : и н т е н з и т е т на
п р о т е о л и т и ч н а а к т и в н о с т в серума на па­
ц и е н т а , наличието на а к т и в а т о р и , инхиби-
т о р и , ко-ензими и други преданалитични фак­
т о р и , свързани с придружаващи заболявания.
Всичко т о в а прави корелацията активност/ •
концентрация т в ъ р д е несигурна, с високи ко­
ефициенти на аналитична, и н т р а - и интер-
индивидуална вариации.
По т а з и причина, в ред случаи е за предпо­
ч и т а н е в м е с т о а к т и в н о с т , да се определи мо-
лекулншпа маса на ензима. Измербанешо на
молекулна маса на п р о с т а т н а кисела фосфа-
т а з а , костна акална фосфатаза или МВ-изо-
ензима на креатинкиназа е много по-надежд­
но и носи по-прецизна информация, 6 сравне­
ние с измерването на активност.
За измерване на маса се използват имуно-
метрични методи основани на конкурентен
принцип или на сандвичев принцип. Послед­
н и я т е за предпочитане, защото използва две
а н т и т е л а срещу различни епитопи на ензим­
н а т а молекула и с ъ о т в е т н о осигурява по-ви­
сока специфичност. При имунометричните
методи, молекулите на измервания ензим се
разпознават и улавят от специфични мар­
кирани антитела, включени в реактива. Кол­
ко висока ще бъде аналитичната специфич­
н о с т на м е т о д а зависи о т качеството на из­
ползваните а н т и т е л а и о т характерните
епитопи по молекулата на ензима към кой­
т о са насочени. Колко висока ще бъде анали­
т и ч н а т а чувствителност на метода зависи
о т е с т е с т в о т о на маркировката - изотоп­
на, флуоресцентна, хемилуминисцентна или
поларизована светлина. Границата на отк-
риваемост на методи с посредничество на ен­
зими (EMIT) е о т порядък на микрограми
(10 G g), на ензимоимунните методи (ELISA) -
нанограми (10'9 g), на изотопните (RIA) - пи-
кограми (10 g) и на хемилуминисцентните
методи - фемтограми ПО"1' g).
Основната отговорност за т о ч н о т о из­
мерване на ензимна маса носят фирмите про­
изводители на тест-набори. Отговорността
по интерпретация на р е з у л т а т и т е обаче, ос­
т а в а за лабораторния специалист и лекува­
щия лекар. Те следва да съпоставят резулта­
т а със индивидуалните условия, защото на­
личието на хетерофилни а н т и т е л а в серума
на пациента м о г а т да интерферират с ан­
т и т е л а т а , участващи в количественото оп­
ределяне. При състояния с висока автоимун-
на реактивност има реална опасност о т не­
верни резултати и погрешна интерпретация.
Визуализиране н а мно^кестОсни
молекулни ф о р м и н а е н з и м и т е
Този подход използва принципите на цвет­
н и т е хистохимични техники. При него се
извършва купелуване на продукта на ензим­
н а т а реакция с багрила, които се превръ­
щ а т в неразтворими утайки. Дехидрогена-
з и т е най-често се визуализират с междинен
електронен преносител феназин метасул-
фат и соли на тетразолий (NBT), а естера-
з и т е - чрез купелуване с т ъ й нар. бързи баг­
рила {Fast Blue Day В х\ др.). Те визуализират
позициите на м н о ж е с т в е н и т е молекулни
форми на даден ензим („изоензими" или „изо-
форми" - молекули с различна електрофоре-
тична подвижност, но със сходна субстрат-
на специфичност) след електрофореза вър­
ху различни носители. Количествено опре­
деляне на ензими по т о з и принцип чрез ден-
зитометрично (или колориметрично измер­
ване след елюиране на фракциите) има ог­
раничено приложение. Изчисление процента
на всяка фракция изисква грижливо опреде­
ляне на оптималното време за инкубация,
защото с удължаване на времето, количес­
т в е н и т е разлики между отделните фракции
се заличават. Най-разпространено е елект-
рофоретичното сепариране на множестве­
н и т е молекулни форми на ензимите, въпре­
ки че се използват и останалите сепараци-
онни техники.
РЕФЕРЕНТНИ ГРАНИЦИ, БИОЛОГИЧНА
ВАРИАЦИЯ И ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Референтните граници на ензимите са за­
висими о т метода, както и о т останали­
т е преданалитични, аналитични и следана-
литични фактори. Това се отнася както при
определяне на активност, т а к а и при иму-
нометрично определяне на маса. Повече о т
десетилетие. Международната Федерация
по Клинична Химия (IFCC) разработва пре­
поръки за измерване на ензимна активност,
които вече се възприемат о т повечето фир­
ми-производители.
На табл. 31.1 са представени референт­
н и т е граници на ензимна активност, изме­
рена на 37 0С, при оптимални условия съг­
ласно препоръките на IFCC , които са ши­
роко възприети.
Ензимите в серума са подложени на зна­
чителни индивидуални колебания. Интра-ин-
дивидуалната им вариация често надхвър­
ля 100% за АсАТ, 170% за АлАТ, 129% за АФ,
62% за АДХ и 356% за ГГГ. Това прави кри­
тичните разлики, които са о т решаващо
значение при мониториране на състояние-
569
Т а б л и ц а 31.1. Р е ф е р е н т н и граници н а ензими с клинично приложение
Референтен интервал
Ензим Мъже Жени Общо

А с п а р т а т амино шрансфераза (АсАГ) U/1 0-36

Аланин амино т р а н с ф е р а з а (АлАТ) U/1 0-49 0-33

Аактатдехидрогена за (АДХ) и/1 230-460

а-Хидрокси-бутиратдехидрогеназа (ХБДХ) и/1 0-197

К р е а т и н к и н а з а (КК) и/1 25-200 25-175

МВ-изоензим н а к р е а т и н к и н а з а (МВ-КК) и/1 до 20
молекулна м а с а н а МВ-КК mg/1 0-10.4
Алкална ф о с ф а т а з а (АФ) и/1 98-279
Кисела ф о с ф а т а з а (КФ) и/1 0-7
у-Глутамил т р а н с ф е р а з а (ГГТ) и/1 0-50
а-Амилаза (серум) и/1 0-96
а-Амилаза (урина) и/1 0-700
Серумна холинестераза (ХЕ) и/1 2100-5000

т о на болния, твърде високи (20-100%). Ин- р е н т н и граници, к а к т о и з н а ч и т е л н и т е

тра-индивидуалната вариация т р у д н о се междулабораторните разлики. Трудности­
поддава на корекция и контрол. Тя обаче т е с подбор на подходящи м а т е р и а л за о т ­
включва а на лит ич н а т а вариация, ч и е т о на­ делните ензими, с ъ с т а в на матрикса, оси­
маляване е предмет на сериозни усилия, за­ гуряване дълговременна с т а б и л н о с т на ак­
щото подобрява с р а в н и м о с т т а на резулта­ т и в н о с т т а и прочие са в процес на преодо­
тите. ляване. фабрични калибратори с д о с т а т ъ ч ­
Хармонизиране на лабораторните резул­ на с т а б и л н о с т на ензимите се о к а з в а т обе­
т а т и о т ензимните определяния и намаля­ щаващо средство за намаляване на между-
ване на междулабораторната вариация се л абора торн ото разсейване на р е з у л т а т и ­
търси чрез унифицирани оптимизирани ме­ т е . Положителните р е з у л т а т и о т използ­
тоди по препоръките на IFCC и ползване на ване на ензимни калибратори за намалява­
ензимни калибратори, к а к т о т о в а се при­ не на междулабораторната вариация са не­
лага при определяне на метаболити. Изпол­ оспорими (табл. 31.2).
зване на ензимни референтни материали ка­ Някои детайли по основните методи за
т о калибратори би о т с т р а н и л о проблема определяне на индивидуални ензими с диаг­
със зависими о т м е т о д а р е з у л т а т и и рефе- ностично значение са представени на т а б л .
31.3-13.
Т а б л и ц а 31.2. Междулабораторни аналитични
коефициенти на вариация преди (CV%) и след (CV%
corr) корекция с калибратори {no Baadenhuijsen
et al.)
Ензим CV% CV% c o r r %*
АсАТ 30.7 5.2 5.1
АлАТ-пируват 29.7 4.6 11.1
ЛДХ 40.2 4.6 11.9
КК 45.4 8.5 15.0
АФ 19.9 4.9 4.3
ГГТ 28.0 9.4 11.9
а-Амилаза (серум) 60.0 10.5 7.9
*допустимо отклонение (%) по европейски изис-
( в англ
о с а к с о н с к и т е с т р а н и изисквани­
я т а са по-строги)
570
 Memog
1.Кинетичен
дбустъпален т е с т
с малатдехидрогеназа
(МДХ) и редуциран
коензим никотинамид
аденин динуклеотид
(NAD.Hj)
2. К о л о р и м е т р и ч е н
дбуточкоба
колориметрия
Таблица 31.4. Аналитични методи за определяне на аланин аминотрансфераза (АлАТ)
Метод
1.Кинетичен
двустъпален т е с т
с лактатдехидрогеназа
(ЛДХ) и редуциран
коензим никотинамид
аденин динуклеотид
(NAD.H 2 )
2. К о л о р и м е т р и ч е н
двуточкова
колориметрия
Принцип ( х и м и ч е с к а р е а к ц и я ) Коментар Оценка на м е т о д а
ЛсАТ
1) 2-оксоглутарат + L-acnapmam - при оптимални условия и 37 0С се измерва оптимиран
(а-кетоглутарат) глутамат + оксалацетат с к о р о с т т а на окисление на NAD.H2; широко използван
измерването на 366 п т е неточно;
МДХ
2) о к с а л а ц е т а т + NAD.H, м а л а т + NAD CV в серия - до 6%, във време - до 10%;
(намаление на абсорбцията. А = 340 (334) п т )
ЛсАТ
2-оксоглутарат + L-acnapmam ниска специфичност; използва се рядко, и з о с т а в я се поради
глутамат + оксалацетат при някои пресяващи изследвания
ниска надеждност на
о к с а л а ц е т а т + 2,4-динитрофенилхидразин р е з у л т а т и т е , въпре­
оксалацетат-хидразон ки н и с к а т а себестой­
(цветен комплекс, Amiiv = 490-520 п т ) ност
Принцип ( х и м и ч е с к а р е а к ц и я ) Коментар Оценка н а м е т о д а
А.и\Т
1) 2-оксоглутарат + L-аланин при оптимални условия и 37 0С се измерва оптимиран
(а-кетоглутарат) глутамат + пируват с к о р о с т т а на окисление на NAD.H2; широко използван
измерването на 366 п т е неточно;
ЛДХ
2) пируват + NAD.H2 л а к т а т + NAD CV в серия - до 10%, във време - до 15%;
(намаление на абсорбцията, А =340 (334) п т )
Л.1ЛТ
2-оксоглутарат + L-аланин • ниска специфичност; използва се рядко, изоставя се поради
глутамат + пируват при някои пресяващи изследвания
ниска надеждност на
п и р у в а т + 2,4-динитрофенилхидразин р е з у л т а т и т е , въпре­
пируват-хидразон ки н и с к а т а себестой­
(цветен комплекс, А тах = 490-520 п т ) ност
 Таблица 31.5. Аналитични м е т о д и з а определяне н а л а к т а т д е х и д р о г е н а з а (ЛДХ)
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а

1. К и н е т и ч е н ЛДХ при оптимални условия и 37 0С се измерва оптимиран

• едностъпален т е с т с
коензим редуциран нико-
тинамид аденин динукле-
omug (NAD.H2)
• едностъпален т е с т с
коензим никотинамид
аденин динуклеотид
(NAD)
2. Колоримешричен
с ц в е т н и хидразинови
продукти
пируват + NAD.Но — >. л а к т а т + NAD скоростта на окисление на NAD.H,,; широко използван
(намаляване на абсорбцията, А тах =340 (334) п т ) CV в серия - до 8.0%, във време - до 10%; из­
мерването на 366 п т е неточно
ЛДХ измерване на о б р а т н а т а реакция - редук­ прилага се предим­
л а к т а т + NAD >• пируват + NAD.H,
ция на NAD; има 2 п ъ т и по-ниска активност но в САЩ
(повишаване на абсорбцията, А тах = 340 п т )
ЛДХ о т ч е т е н а т а абсорбция е обратно пропор­ историческо
пируват + NAD.H2 >> л а к т а т + NAD ционална на а к т и в н о с т т а значение
пируват + 2,4-динитрофенилхидразин >- пируват-хидразон
(излишъка) (цветен комплекс, А,,^ = 490-520 п т )

3. Х и с т о х и м и ч е н * у\дх
л а к т а т + NAD >• пируват + NAD.H,
феназинметосулфат (PMS) редуцира нитро модификации с раз­
PMS
NAD.H„ + NBT >• NAD + неразтворим формазан блау тетразолиум (NBT) в неразтворим фор­ творим формазан
(синьо съединение) мазан и м а т историческо
значение
*Същият принцип се прилага в хистохимията за визуализиране на много дехидрогенази след електрофоретично разделяне на
множествените им молекулни форми (изоензими

Таблица 31.6. Аналитични методи за определяне на а-хидрокси-бутиратдехидрогеназа (ХБДХ)

Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка на м е т о д а

1. К и н е т и ч е н * сърдечните изоензими на ЛДХ окисляват ко­ оптимиран

ХБДХ
вместо л а к т а т , 2-оксобутират + NAD.H2 >• NAD + 2-хидроксибутират ензим NAD.Ho с по-висок а ф и н и т е т откол­ широко използван
за с у б с т р а т се използва (намаляване на абсорбцията, А тах = 340 п т ) к о т о мускулни и чернодробни изоензими;
а-оксобутират CV в серия - до 10%, във време - до 15%
*Молекулата на ЛДХ е т е т р а м е р изграден о т 2 т и п а полипептидни вериги (субединици) - сърдечен (Н) и мускулен (М). В сърдечния мускул превалират т е т р а м е -
рите съдържащи Н субединици (НННН, НННМ и малко ННММ), докато в черен дрб и скелетни мускули - т е т р а м е р и т е , съдържащи М субединици (ММММ, МММН
и малко ММНН). Тъй к а т о Н субединиците и м а т много по-висок а ф и н и т е т към с у б с т р а т а хидроксибутират, кинетичното определяне а к т и в н о с т т а на ХБДХ
илюстрира участието на сърдечните форми при евентуално увеличение на общата а к т и в н о с т на ЛДХ.
Таб.1ица 31.7. Аналитични методи за определяне на креатинкиназа (1м\>
Метод
1. К и н е т и ч е н
тристъпален* т е с т с
у ч а с т и е т о на креатинки­
наза (КК) хексокиназа (ХК)
и глюкозо-6-фосфат дехид-
рогеназата (Гбф-ДХ) коен­
зима NADP-Hj се редуцира
Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
0
р е а к ц и я т а п р о т и ч а при 37- С, NAC** оптимиран
КК а к т и в а т о р и имидазолов буфер; м е т о ­
1) к р еат и н ф о с ф а т + ADP >• к р е а т и н + АТР широко използван
ХК д ъ т е подходящ за а в т о м а т и з и р а н е ;
2) АТР + D-глюкоза >• ADP + D-глюкозо-б-Р CV в серия - до 10%, във време - до 15%
3) D-глюкозо-б-Р + NADP — ^ ^ ^ - ^ г л ю к о н а т - б - Р + NADP.H2
(повишаване на абсорбцията, А ^ = 340 п т )

2. К о л о р и м е т р и ч е н КК изоставя се
к р е а т и н фосфат + ADP >• к р е а т и н + АТР
крайно точков
к р е а т и н + а-нафтол + диацетил >-ц6етен комплекс
(Ата* = 500-540 п т )
•Макроергичният фосфат на к р е а т и н фосфата се прехвърля о т КК върху аденозин т р и ф о с ф а т (АТР), после о т ХК - върху глюкоза; Гбф-ДХ превръща глюкозата в
глюконат и редуцира коензима никотинамид аденин динуклеотид ф о с ф а т (NADP.Hj)
•*NAC - N-ацетилцистеин (инхибитор на миокиназа)

Т а б л и ц а 31.8, Аналитични методи за определяне на МВ-изоензима на креатинкиназа (МВ-КК)

Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а

1. К и н е т и ч е н * а к т и в н о с т т а на М-субединиците се подтиска с моно и по- р е з у л т а т и т е са зависими о т м е т о д а висок брой фалшиво положи­

определяне на а к т и в н о с т
чрез имуно-инхибиране
2. И м у н о м е т р и ч е н - оп­
ределяне на молекулна ма­
са чрез сандвичев принцип
ликлонални а н т и т е л а ; кинетично се измерва а к т и в н о с т ­ поради използването на а н т и т е л а сре­ телни резултати поради ин-
т а на В-субединица щу различни епитопи на молекулата терференция на ВВ-КК изоен-
зима
иммобилизирани моно и поликлонални а н т и т е л а свързват м е т о д ъ т има висока имунологична спе­ автоматизиран метод, удо­
д в е т е субединици. Свързването на в т о р и а н т и т е л а , мар­ цифичност, а в и с о к а т а ч у в с т в и т е л ­ бен, е ниско ниво на интерфе-
кирани с изотопи, ензими или хемилуминисцентни субстан­ н о с т се определя о т вида на маркера ренции, е добра бъзпроизводи-
ции, е право пропорционално на е нзимна т а концентрация. мост и точност

3. Сепарационни: изоензими (или изоформи) на КК се разделят върху различ­ м е т о д и т е са трудоемки и напоследък поддават се на автоматизи­
• електрофоретично ни носители, визуализират се хистохимично и се денсито- се прилагат във все по-малко лаборато­ ране, но изискват подходящи
разделяне метрират рии апарати

• разделяне чрез йоно- изоензими (или изоформи) на КК се разделят върху хрома- препаративните методи се
обменна хроматография тографски мини-колонки, елюират се и а к т и в н о с т т а им основават на този принцип
се определя к а т о о т о б щ а т а а к т и в н о с т на КК
•Молекулата на КК е димер изграден о т 2 т и п а субединици - мозъчен (В, brain) и мускулен (М). В серума, о б щ а т а а к т и в н о с т на КК се дължи на димера ММ-КК (над
70%), димера ВВ-КК (около 20%) и димера МВ-КК (около 5%). В сърдечния мускул димерът МВ-КК е над 20 %.
сл Т а б л и ц а 31.9. Аналитични методи за определяне на алкална фосфатаза (АФ)
•о
Метод
1. К и н е т и ч е н :
определяне на активност
Крайно-точково или
двуточково о т ч и т а н е
използват се различни суб­
с т р а т и , к а т о продукти­
т е се измерват по различ­
ни методи
Т а б л и ц а 31.10. Аналитични методи за определяне на кисела фосфатаза (Кф|
Метод
1. К и н е т и ч е н :
определяне на активност
чрез колометрия
2. К р а й н о - т о ч к о в о или
двуточково о т ч и т а н е
използват се различни суб­
страти
3. И м у н о м е т р и ч е н
*Като туморен маркер п р о с т а т н а кисела фосфатаза се означава PAP (prostatic acid phosphatase)
Принцип ( х и м и ч е с к а р е а к ц и я ) Коментар Оценка н а м е т о д а
АФ >- фосфат + цветен р-нитрофенолат кинетична колориметрия на освободения р-нит­ оптимиран
р-нитрофенил фосфат
(цветно съединение, А тах = 405 п т ) рофенолат при 37 0С, в диетаноламинов буфер, широко използван
pH 9.8; CV в серия - до 10 %, във време - до 15 %;
автоматизиран с готови набори
същият принцип кинетична колориметрия на освободения р-нит-
рофенол при 37 0С, в глицин-NaOH или амино-ме-
тил-пропанолов буфер, pH 10.5; добра надежд­
ност на резутатите; автоматизиран с гото­
ви набори
АФ колориметрия на фосфата историческо значение;
а) ß-глицерофосфат ->• неорганичен фосфат изискват междинна
АФ , спектрофотометрия инкубация и трудно
б) а-нафтол монофосфат >• а-нафтол се автоматизират
(Атах = 340 п т )
АФ
в) фенил фосфат- ->• фенол- ->• хромоген измерван с реактив на Folin-Ciocalteu
Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
КФ кинетична колориметрия на освободения хро­ оптимиран
р-нитрофенил фосфат •>4)осфат + р-нитрофенолат
моген (р-нитрофенол) при 37 0С, в ц и т р а т е н широко използван
(цветно съединение, А ^ = 405 п т )
буфер, pH 4.8; CV в серия - до 10 %, във време -
до 15 %
КФ кинетична колориметрия на освободения поради ниската си специ-
а-нафтол монофосфат ->• а-нафтол
а-нафтол с ф а с т peg TR при 37 0С, в цитра­ фичност добиват вече
т е н буфер, pH 5.2 историческо значение
имобилизирани моно и поликлонални а н т и т е л а свързват спе­ м е т о д ъ т има висока имунологична специфич­ подходящ за измерване
цифични за п р о с т а т н а т а кисела фосфатаза епитопи. Ин­ ност, а високата чувствителност се опреде­ на специфичен проста­
т е н з и т е т ъ т на маркировката (изотопи, ензими или хеми- ля о т вида на маркировката; а в т о м а т и з и ­ т е н изоензим*
луминисценция) на втори а н т и т е л а директно измерва ен­ ран
зимната концентрация
 Memog
1. К и н е т и ч е н
колориметрия на освобо­
дения хромоген
2. К и н е т и ч н и
двуточкови
Таблица 31.12. Аналитични методи за определяне на серумна холинестераза (ХЕ)
Метод
1. К и н е т и ч е н
колориметричен освободе­
н и я т тиохолинйодид дава
жълт продукт с 5,5'-дити-
обис-2-нитро бензоена ки­
селина
2. Х и с т о х и м и ч е н
3. К о л о р и м е т р и ч е н
ся
-а
сл
Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка на м е т о д а
трис-глицил-глициновия буфер (pH 8.25 или оптимиран
Ь-у-глутамил-4-нишроанилид + глицил-глицин 8.10) свързва единия продукт (глутамил) широко използван
L-y- глутамил-глицилглицин + 4-нитроанилид
и изтегля реакцията в дясно при 37 0С; CV
(цветно съединение, = 405 п т ) в серия - до 15 %, във време - до 17 %
също и с глицил-глицин-NaOH буфер, pH 7.7;
г о т о в и т е набори са подходящи за а в т о ­
матизирано определяне
модификация с амино-нитро-бензоаш или с последващо превръ­ подходящи за ръчно определяне на малък по-рядко приложение
щане (в азотно-кисела среда) на освободения 4-нитроанилид в брой изследвания
цветно диазо-съединение
Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
0
ХЕ при 37- С, 5,5'-дитиобис-нитробензоена ки­ оптимиран
бутирил-тиохолинйодид (или ацетил-тиохолинйодид) широко използван
селина (DTBis) в фосфатен буфер, pH 7.7,
тиохолинйодид + DTBis >-5-тио-бензоат
с у б с т р а т бутирил-тиохолинйодид и оп­
(цветно съединение, А тах = 405 п т )
тимални условия има почти 2 п ъ т и по-
висока скорост на хидролиза спрямо аце-
т и л тиохолинйодид; набори, подходящи за
автоматизирано определяне
с различни субстрати и купелуващи багрила, които д а в а т подходящ за визуализиране на електрофо- не се прилага за
неразтворима утайка ретични фракции кинетично измерване
с ацетилхолин не се използва историческо значение
Ч? Т а б л и ц а 31.13. Аналитични м е т о д и за определяне на алфа-амилаза (амилаза)' 1
05
Метод
1. К и н е т и ч е н
многостъпален ензимен
т е с т със с у б с т р а т мал-
т о т е т р а о з а , малто-фос-
фатаза (MP), фосфоглюко-
мутаза (ßPGM), глюкозо-6-
фосфат дехидрогеназа (G-
6-PDH) и NAD
2. К о л о р и м е т р и ч е н
(хромолитичен) много­
стъпален ензимен т е с т
със с у б с т р а т хлорнитро-
пенил-малтохептаозид
флуоресцентна
поляризация
. Н е ф е л о м е т р и я или
турбидиметрия
. Захаро г е н н и
*Методите се нуждаят о т унифициране и по-добра международна стандартизация
Коментар Оценка н а м е т о д а
Принцип ( х и м и ч е с к а р е а к ц и я )
алт-шза измерва се скоростта на редукция на NAD оптимиран
1) малтотетраоза + бода 2-малтоза
при 37 0С, фосфатен буфер, pH 6.6; измер­ широко използван
MP ването на 366 п т е неточно; подходящ, за
2) 2-малтоза + фосфат глюкоза + р-глюкоза-1-фосфат
автоматизация; осигурява задоволител­
ßPGM
3) ß-2AK)ko3o-l-фосфат глюкоза-6-фосфат на надеждност на р е з у л т а т и т е ; CV в
G-6PDH серия 4.8%
4) глюкозо-6-фосфат + NAD >• 6-фосфоглюконат + NAD.H2
(повишаване на абсорбцията, А тах = 340 п т )
сипи-ьаза
1) хлор-нитрофенил-малтохептаозид • подходящ за
2-нитрофенилмалтотриоза + м а л т о т е т р а о з а кинетична колориметрия на освободения автоматизация
хромоген (2-хлор-нитрофенол) при 37 0С,
глюкосипи^тза
2) 2-нитрофени(\малтотриоза — фосфатен буфер, pH 6.8
глюкоза + 2-нитрофенилглюкозид
л , , г*1юкозиааза .
3) 2-нитрофенилглюкозид >• глюкоза +
2-хлор-нитрофенол
(цветно съединение, А тах = 405 п т )
маркираните разпадни продукти и м а т висока ротация и изискват скъпа апаратура рядко се прилагат
поляризират флуоресцентната светлина
с т е п е н т а на хидролиза на нишестето увеличава прозрачност­ ниска надеждност поради неразтворимия историческо значение
т а на средата субстрат
измерване на освободената глюкоза ниска надеждност историческо значение
лшгопис
а н е в С. Р а ц и о н а л и з и р а н е и з с л е д в а н е т о и а някои е н з и м и и
субстрати в клиничната лаборатория. Докторска дисер­
т а ц и я . С., М Л , 1990.
1
e r g m a y e r Н ( e d ) . M e t h o d s o f e n z y m a t i c a n a l y s i s . (З" e d ) .
W e i n h e i m , C h e m i e , vol. S-1V, 1983.
a w A, C o w a n R, O ' R e i l l y D, S t e w a r t M , S h e p h e r d J. Clinical
biochemistry. Ed inburg-London - Madrid-Melbourine-New
York-Tokyo, 1995.
lamoun P, Leroux J-P. B e a u n e P H , M a r s a c C , D e m a u g r e F. Bio­
chemistry. В C D e c k e r Inc, Toronto-Philadelphia, 1986.
laplan L, P e s c h A. Clinical C h e m i s t r y . T h e o r y , analysis a n d
correlation. St. Louis, M o s b y , 1996.
l a t h e w s C h , H o l d e K. Biochemistry. T h e B e n j a m i n / C u m m i n g s
Publishing C o m p a n y , Inc, 1990.
l a y n e Ph. Clinical c h e m i s t r y (6,h ed). L o n d o n - B o s t o n -
Melbourne, 1994.
d o s s D , R o s a l s k i S. E n z y m e tests in d i a g n o s t i c . N e w York,
O x f o r d University P r e s s Inc, 1996.
Tiets N (ed). Textbook o f clinical chemistry. Philadelphia,
Saunders, 1996.
T h o m a s L (ed.). Clinical laboratory diagnostics. (I 51 ed). Main,
Germany, 1998.
* * *
Baadenhuijsen H , Schölten R, Willems H L et al. A model for
harmonization o f routine clinical chemistry results between
clinical laboratories. A n n Clin Biochem, 3 7 , 2000, 330-337.
Erases C G . Generation and application o f analytical goals in labo­
ratory medecinc. Ann 1st S u p e r Sanita, 27, 1991, 369-376.
Mörder M, Elser R C , Gerhardt W, et al. IECC methods for the
m e a s u r e m e n t o f catalitic concentracion o f enzymes. J I F C C ,
1, 1989, 130-142.
M o s s DW. E n z y m e reference materials. J I F C C , 6, 1994, 6-9.
Oueralto J M , B o y d J C , Harris EK. O n the calculation o f refer­
e n c e c h a n g e s values, with e x a m p l e s from a lomg-term study.
Clin C h e m 3 9 , 1993, 1398-1403.
577
 Аналитични принципи
п р и изследване
на електролити
ЕЛЕКТРОЛИТИ - РЕФЕРЕНТНИ
ГРАНИЦИ, ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ
И ВЪЗМОЖНИ ИЗТОЧНИЦИ
НА ГРЕШКИ
Т.Цветкова
Неорганичните вещества в човешкия орга­
низъм и преди всичко в биологичните т е ч
ности, които са обект на клинично-лабора-
торен анализ м о г а т да б ъ д а т групирани в
т р и основни г р у п и , според концентраци­
я т а им в серума;
> М а к р о е л е м е и т и . Тяхното съдържание
е над 10'3g/dl: натрий, хлорид, калий, маг­
незий и др.
> М и к р о е л е м е н т и . Концентрацията им
е о т 10'3g/dl до 10"5g/dl; желязо, цинк, мед,
манган, литий, йод и др.
> У л т р а м и к р о е л е м е и т и . Т я х н а т а кон­
центрация е под 10'5g/dl; з л а т о , олово,
кадмий, ванадий, хром и др.
В клинично-лабораторната п р а к т и к а ,
неорганичните вещества в биологичните
течности обикновено се разделят на д в е ос­
новни г р у п и :
1. М а к р о е л е м е и т и . Най-често се н а р и ч а т
е л е к т р о л и т и : натрий, хлорид, калий,
калций, магнезий, неорганичен фосфат.
2. М и к р о е л е м е н т и . Известни са в клинич­
н а т а практика к а т о о л и г о е л е м е н т и .
Те включват о с т а н а л и т е неорганични
вещества с много по-малка концентрация
в биологичните т е ч н о с т и .
Освен глобалните промени във водноелек-
тролитния баланс на организма к а т о цяло,
които водят до отклонения в осмолалите-
т а или в обема на т е л е с н и т е т е ч н о с т и , о т
значение за клиничната практика са и про­
мените, настъпващи в р е з у л т а т на селек-
578
т и в н а загуба или повишена концентрация
на определени ка ти он и или аниони.
Натрий
В организма н а т р и я т е приблизително око­
ло 55 mmol/kg телесна маса. Той има основ­
но значение за поддържане осмолалитета
на екстрацелуларната т е ч н о с т . При осмо-
т и ч н о налягане в референтен интервал -
около 295 mOsm/kg, над 90% о т него, т . е .
270 mOsm/kg се д ъ л ж а т на натриевия йон.
Н а т р и я т е основният к а т и о н на извънкле­
т ъ ч н а т а т е ч н о с т и съставлява около 98%
о т извънкостния н а т р и й .
Изследването на н а т р и я се провежда в
серум, урина (Д24), ликвор, п о т . Определяне­
т о на екскрецията на н а т р и я в ури н а т а
изисква диетичен режим с т о ч н о определен
дневен прием на н а т р и й в р а м к и т е на 2-6 g,
т . е . до 15 g готварска сол.
Референтни грамици
• Серум
новородени 130-155 mmol/1
кърмачета, деца и
136-151 mmol/1
възрастни
• Урина 40-220 mmol/24 h
• Ликвор 138-153 mmol/1
• Пот около 50 mmol/1
• Клирънс на натрий 0.017 ml/s
Абсолютното количество на н а т р и я в ор­
ганизма може да бъде повишено, намалено
или без отклонения, независимо о т концен­
т р а ц и я т а му в кръвния серум. Това изиск­
ва при преценка на водно-електролитното
състояние на организма освен серумното
ниво на натрия, да се изследват серумен бел­
т ъ к , х е м а т о к р и т , н а т р и й в урина, осмола-
литет.
При промени в а б с о л ю т н а т а фракция на
в о д а т а в серума, к о е т о се наблюдава в слу-
ame c х и п е р п р о т е и н е м и и , п а р а п р о т е и н е -
и и силно и з р а з е н и хипврлипидемии се из-
з в а т фалшиво по-ниски р е з у л т а т и (псев-
:ипонатриемия), т ъ й к а т о кониентраии-
а н а е л е к т р о л и т и т е ( N a + и К + ) се измер-
във в о д н а т а ч а с т . Този проблем о т п а д а
л д и р е к т н и т е йонселективни методи.
лии
л и я т в ч о в е ш к и я о р г а н и з ъ м е около 50
i o l / k g т е л е с н а м а с а . Той е г л а в н и я т к а -
он н а в ъ т р е к л е т ъ ч н о т о п р о с т р а н с т в о
3% о т него се н а м и р а в к л е т к и т е и с а м о
- в и з в ъ н к л е т ъ ч н а т а т е ч н о с т . Изслед-
i e m o н а к а л и я се п р о в е ж д а в серум, плаз-
, у р и н а (Д 24 ).
зферентни г р а н и ц и
Серум
ювородени, недоносени 4.0-8.0 mmol/1
новородени 4.0-6.0 mmol/1
кърмачета 3.8-5.6 mmol/1
}еца и в ъ з р а с т н и 3.5-5.6 mmol/1
/рина (възрастни) 25-125 mmol/24h
Клирънс на калий 0.5 m l / s
П р и н е с п а з в а н е н а с т р и к т н и т е изисква-
я к ъ м у с л о в и я т а з а в з е м а н е н а кръв се о т -
т а т по-високи с т о й н о с т и н а калий в се-
via. Тези и з и с к в а н и я в к л ю ч в а т : пристяга-
на ръката не повече от 30 s, прекратява­
на пристягането веднага след пункти-
не на вената, свободно изтичане на кръв-
I в епруветката, да не се потупва върху
шта, болният да не помпи с юмрук при
жегната с еластичен бинт ръка, отделя­
на серума от съсирека до 1 h след вземане
кръвта, да не се използва калиева сол на
\ТЛ за получаване на плазма, а само хе-
рин.
При с ъ с и р в а н е т о н а к р ъ в т а (in vitro) с е
1деля К + о т к р ъ в н и т е к л е т к и - т р о м б о -
т и , е р и т р о и и т и и л е в к о ц и т и . Това обус-
Зя п о - в и с о к а т а м у к о н ц е н т р а ц и я в серу-
- с около 0.3 mmol/1 в сравнение с пл азма-
I. Псевдохиперкалиемия (in vitro феномен)
наблюдава при п а ц и е н т и с л е в к о ц и т о з а
ад 100.10 9 /1) или т р о м б о ц и т о з а ( н а д
3.109/1), или при повишена п р о п у с к л и в о с т
е р о т р о ц и т н а т а м е м б р а н а . В т е з и слу-
и н и в о т о н а с е р у м н и я калий в а р и р а м е ж -
7 и 9 mmol/1. И с е в д о х и п е р к а л и е м и я т а мо-
ж е д а се о т г р а н и ч и п о с р е д с т в о м едновре­
менно изследване н а калий в серум и в хепа-
ринизирана плазма. К о г а т о р а з л и к а т а
льежду к о н ц е н т р а ц и я т а н а к а л и л в се-
р у л г и п л а з л г а н а д х в ъ р л и 0.2-0.3 m m o l / l
т р я б в а д а се льисли з а п с е в д о х и п е р к а
лиелгия.
Хлорид
Х л о р и д ъ т (СГ) е г л а в н и я т анион н а извънк­
л е т ъ ч н а т а т е ч н о с т . Количеството му е
около 30-35 m m o l / k g т е л е с н а маса. Около 88%
о т т о в а к о л и ч е с т в о се н а м и р а в извънкле­
т ъ ч н а т а т е ч н о с т и с а м о 12% - във в ъ т р е к ­
л е т ъ ч н о т о п р о с т р а н с т в о . Х л о р н и я т ани­
он прониква свободно м е ж д у в ъ т р е с ъ д о в о -
т о и м е ж д у к л е т ъ ч н о т о п р о с т а н с т в о , ка­
т о следва п р о м е н и т е в к о н ц е н т р а ц и я т а н а
н а т р и я . Поради в р ъ з к а т а м у с N a + , основ­
ната функция н а СГ е поддържане н а вод­
н и я баланс и о с м о т и ч н о т о налягане. Извес­
т н а диспропорция в п р о м е н и т е н а СГ спря­
м о N a + се наблюдава при нарушения в ал­
кално-киселинния баланс.
И з с л е д в а н е т о н а хлорида се провежда в
серум, плазма, у р и н а (Д24), ликвор, п о т .
Рсферснтни г р а н и ц и
• Серум
новородени 100-115 mmol/1
к ъ р м а ч е т а , деца,
възрастни 96-110 mmol/1
• Урина
Д24 ( в ъ з р а с т н и ) 110-250 mmol/1
• Ликвор 115-132 mmol/1
• Клирънс на хлорид 0.0117-0.067 m l / s
При м е т о д и т е з а определяне н а СГ, бази-
р а и щ се н а т и т р и м е т р и ч е н или ф о т о м е т ­
ричен принцип се з а л а в я т всички халогени-
ди, к о е т о при обичайни условия се пренеб­
регва, но при бромизъм м о ж е д а се пропусне
е в е н т у а л н а хипохлоридемия.
Калций
В о р г а н и з м а 1% о т калция се н а м и р а в к л е т ­
к и т е и извънклетъчното пространство, а
99% е основен градивен е л е м е н т н а к о с т н а ­
т а т ъ к а н . В п л а з м а т а с а с а м о 0.03% о т об­
ш и я калций в о р г а н и з м а . В б и о л о г и ч н и т е
т е ч н о с т и к а л ц и я т е в две форми - йонизи-
579

ран и свързан калций. В п л а з м а т а 45-55% о т
калция циркулира к а т о свободни калциеви
йони (Са2 + ) - йонизиран калций (Юа), 35-40%
(около 0.9 mmol/1) е свързан с плазмените бел­
т ъ ц и , предимно с албумин и 8-14% образува
комплекс с някои аниони - хидрогенкарбонат
(бикарбонат), фосфат, сулфат, л а к т а т , ци-
т р а т . Й о н и з и р а н а т а ф о р м а (около 1.3
mmol/1) и комплексно свързания калций (око­
ло 0.3 mmol/1) в серума образуват ултрафил-
труемата фракция. В к л е т к и т е к а л ц и я т е
предимно свързан с органични фосфати, нук­
леинови киселини, други органични аниони,
специфично свързващи белтъци и много мал­
ка ч а с т е к а т о свободен, iCa в цитозола. Кон­
ц е н т р а ц и я т а н а iCa в п л а з м а т а е о т 5 000
до 10 000 п ъ т и по-висока, о т к о л к о т о в к л е т ­
к и т е на миокарда или на г л а д к и т е мускули.
Поддържането н а т о з и висок г р а д и е н т е
жизнено важно за осигуряване н а б ъ р з о т о
навлизане (influx) н а к а л ц и е в и т е йони -
[Са2 + ]i при протичане н а биологичните про­
цеси в к л е т к и т е .
Определянето н а калция се извършва в се­
рум, хепаринизирана плазма или урина (Д24)
Референтни г р а н и ц и
• Серум
Общ калций
новородени 1.80-3.20 mmol/1
кърмачета 2.00-3.00 mmol/1
деца 2.20-2.80 mmol/1
възрастни 2.12-2.62 mmol/1
• Урина (възрастни) 2.50-4.36 mmol/24 h
Клирънс на калций 0.003-0.0075 m l / s
Й о н и з и р а н калций (В с е р у м )
^•9 ен 1.30-1.60 mmol/1
3
-9ен 1.20-1.48 mmol/1
^•9 ен
1.20-1.44 mmol/1
над 1 година 1.29-1.38 mmol/1
възрастни 1.06-1.32 mmol/1
Критични граници за общ калций при въз­
растни 1.65-3.25 mmol/1, а за iCa - 0.70-1.58
mmol/1.
Ннтерферспция и и з т о ч н и ц и н а греш­
ки. Интерференция при с п е к т р о ф о т о м е т -
ричния м е т о д о к а з в а т билирубин и някои ле­
карства. Вземането н а к р ъ в т а т р я б в а да
с т а в а без венозна с т а з а (не > 30 s). За полу-
580
.
чаване н а плазма не се използват к а т о ан-
т и к о а г у л а н т и ЕДТА и о к с а л а т , т ъ й като
т е с в ъ р з в а т калция. Препоръчва се литиев
хепарин, за предпочитане в суха форма. Се­
р у м ъ т не бива да п р е с т о я в а дълго време пре­
ди анализа, т ъ й к а т о к а л ц и я т се у т а я в а в
по-долните слоеве, к о е т о може да причини
псевдохипокалциемия.
Определянето н а iCa изисква анаеробно
вземане н а к р ъ в т а ( з а т в о р е н а система),
т ъ й к а т о з а г у б а т а н а COg повишава pH на
п р о б а т а и е причина з а по-ниски резулта­
т и . В хепаринизирана плазма iCa е стаби­
лен в продължение н а 6 h в хладилник и плът­
но з а т в о р е н и е п р у в е т к и .
Три дни преди с ъ б и р а н е т о на урина, из­
с л е д в а н и я т т р я б в а да приема бедна на кал­
ций храна. У р и н а т а се събира в стъклен съд,
п р о п л а к н а т с киселина з а о т с т р а н я в а н е на
евентуално замърсяване с калций. Предва­
р и т е л н о се прибавя к о н с е р в а н т - 5 ml разт­
вор н а т и м о л в изопропанол (100 g/1). След
приключване н а с ъ б и р а н е т о към общото ко­
личество урина се п р и б а в я т 10 ml 6 mmol/1
HCl (1 ml н а 100 ml урина) и се размесва вни­
м а т е л н о в продължение н а 10 min.
Неорганичен ф о с ф а т
В организма н а в ъ з р а с т е н човек с телесна
м а с а около 70 kg се с ъ д ъ р ж а т 500-800g фос­
фор. Той е предимно в ъ т р е к л е т ъ ч е н анион
к а т о к о н ц е н т р а ц и я т а му варира според ти­
п а н а к л е т к и т е : около 80% се намира в кос­
т и т е (х и д р о к си ап ати т), а о с т а н а л и т е 20%
са включени във фосфолипиди, нуклеотиди,
фосфопротеини, нуклеинови киселини, мак-
роергични с ъ е д и н е н и я ( к р е а т и н ф о с ф а т ,
АТР, фосфоенолпируват, 1,3-дифосфоглии,е-
р а т ) и др. обменни продукти. В извънкле­
т ъ ч н а т а т е ч н о с т се намира много малка
ч а с т , к о я т о се означава к а т о неорганичен
ф о с ф а т (Н2Р04" НРО 2 ^ и РО '"Д к о й т о е тран­
с п о р т н а т а форма н а фосфора в организма.
Изследването н а неорганичния фосфат се
извършва в серум, плазма, урина (ДгД
Референтни граници
• Серум
новородени 1.40-2.78 mmol/1
кърмачета 1.30-2.30 mmol/1
деца 1.10-1.90 mmol/1
възрастни 0.77-1.36 mmol/1
• Урина (Д24) 10.90-32.30 mmol/24 h серум, плазма (литиев хепарин к а т о а н т и -
• Клирънс на неорга­ коагулант) за общ и iMg, пълна кръв - за iMg
ничен фосфат 0.140-0.151 m l / s и урина (Д24), подкислена с 6 mol/1 HCl.
П л а з м е н а т а к о н ц е н т р а ц и я и отделяне- Рсферептпи г р а н и ц и
по на ф о с ф а т и през бъбреците п о к а з в а т из-
>азен 24-часов р и т ъ м : в п л а з м а т а максиму­ Общ м а г н е з и й
м ъ т е в 24 часа, а м и н и м у м ъ т - в 12 часа и • Серум
»братно в у р и н а т а - м а к с и м у м ъ т е в 12 ча- кърмачета 0.65-0.95 mmol/1
:а, а м и н и м у м ъ т - в 24 часа. П о з н а в а н е т о деца 0.70-0.90 mmol/1
ш т о з и циркадианен р и т ъ м е о т с ъ щ е с т - възрастни 0.70-1.20 mmol/1
teno значение з а получаване на сравними ре- • Урина (Д24) 7.10-11.70 mmol/24 h
; у л т а т и и з а п р а в и л н о т о т ъ л к у в а н е н а ре- • Клирънс 0.117 m l / s
:ултатите.
З а получаване н а плазма следва да се из- йонизиран лшгнезий
юлзва само хепарин. Други антикоагулан- (преизчислен към pH = 7.4)
пи п о т и с к а т о б р а з у в а н е т о на фосфомолиб-
• Серум
j a m e n комплекс. О т д е л я н е т о н а серум и
деца 0.54-0.70 mmol/1
глазма т р я б в а д а с т а в а до 30 min след взе-
възрастни 0.33-0.57 mmol/1
лане н а к р ъ в т а , з а да се п р е д о т в р а т и пре­
м ина в а нето н а в ъ т р е к л е т ъ ч н и я фосфор в
Хемолизата причинява фалшиво по-висо-
Зиологичния м а т е р и а л . Проби с липемия и
ки с т о й н о с т и , т ъ й к а т о к о н ц е н т р а ц и я т а
семолиза с а неприемливи за анализ. Урина-
на Mg2 + в е р и т р о ц и т и т е е 10 п ъ т и по висо­
п а т р я б в а да бъде предварително подкис-
ка, о т к о л к о т о в и з в ъ н к л е т ъ ч н а т а т е ч н о с т .
vena с 6 mol/1 HCl (1 ml н а 100 ml урина).
Много и разнообразни ф а к т о р и о к а з в а т
въздействие върху о т д е л я н е т о н а магнезий
Магнезий с у р и н а т а . Р е з у л т а т и т е о т изследването
З б щ о т о съдържание н а магнезий в организ­ му в у р и н а т а не винаги м о г а т да б ъ д а т из­
ма на в ъ з р а с т н и е около 1 mol (21-28 g). Приб- ползвани за диагностични цели.
\ и з и т е л н о 50-55% о т т о в а к о л и ч е с т в о е
Зключено в к о с т н о т о в е щ е с т в о н а с к е л е т а ,
зколо 46-48% е във в ъ т р е к л е т ъ ч н о т о прос­
т р а н с т в о и само около 1% - в извънклетъч­
н о т о п р о с т р а н с т в о и к р ъ в т а . В извънкле­ АНАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
т ъ ч н а т а т е ч н о с т магнезият е четвърти ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА НАТРИЙ,
по количество к а т и о н , а в ъ т р е к л е т ъ ч н о -
т о й е по-малко само о т калия. КАЛИЙ, ХЛОРИД, КАЛЦИЙ,
В ъ т р е к л е т ъ ч н и я т магнезий е в о т н о с и ­ НЕОРГАНИЧЕН ФОСФАТ
т е л н о висока к о н ц е н т р а ц и я в с к е л е т н а т а И МАГНЕЗИЙ
мускулатура, черния дроб и миокарда. По­
добно н а калция, м а г н е з и я т в с е р у м а се Е. Н а к о в а
т р а н с п о р т и р а в две форми - у л т р а ф и л т -
р у е л г - 66.70% е йонизиран (iMg) и около 5% - В таб л и ц и 32.1-32.6 са представени анали­
комплексно свързан и н е ф и л т р у е м - бел­ т и ч н и т е м е т о д и за изследване на н а т р и й ,
т ъ ч н о свързан (20-30%). Тези пропорции сил­ калий, хлорид, калций, неорганичен ф о с ф а т
но в а р и р а т при о т д е л н и т е индивиди, спе­ и магнезий в биологичен м а т е р и а л .
циално при различни заболявания или по вре­
ме на лечение. К а к т о при калция, pH на кръв­
т а влияе върху с в ъ р з в а н е т о н а магнезия с
б е л т ъ ц и т е в п л а з м а т а . При увеличаване н а
pH се повишава с в ъ р з в а н е т о му, к о е т о води
до понижаване н а iMg.
Изследването н а магнезий се извършва в
581
сл Т а б л и ц а 32.1. А н а л и т и ч н и м е т о д и з а о п р е д е л я н е н а н а т р и й
00
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а

1.Емисионна атомизиране на с е р у м н а т а проба чрез пулверизиране в пла­ точен, линеен в широки граници; к а т о в ъ т р е ш е н
пламъкоба мък с много висока т е м п е р а т у р а (над 1 300оС); възбуждат се с т а н д а р т може да се използва Li (/. = 671 п т ) ;
фотометрия около 4% о т а т о м и т е и д о б и в а т собствена емисия с опреде­ използва се за определяне и на вътреклетъчен Na.
лена дължина н а в ъ л н а т а (>. за Na = 589 п т ) .
2. Й о н - с е л е к т и б - определя се потенциала между два електрода - референтен теоретично, при директно о т ч и т а н е , стойности- р у т и н е н - клас А
на потенцио- (каломелов) и индикаторен Ag/Ag2Cl в с т ъ к л е н кожух (може и т е са с около 8% по-високи, т . е . влиза в съображение
метрия пластмасов) с мембрана, ч у в с т в и т е л н а за Na + ; о т ч и т а н е т о г р е ш к а т а на принципа на о т ч и т а н е в т е ч н а фаза;
може да с т а н е директно (в серумна проба без разреждане) и при Na се препоръчва и н д и р е к т н а т а потенциоме-
индиректно (в предварително разредена серумна проба) т р и я ; м е т о д ъ т се използува в йонселективни анали­
з а т о р и и в ISE модула на биохимични анализатори
3. А т о м н о - с е р у м н а т а проба се довежда до газообразно с ъ с т о я н и е чрез м е т о д ъ т е с висока ч у в с т в и т е л н о с т и т о ч н о с т референтен
абсорбционна т е р м и ч н а дисоциация (t > 2 300оС). През облака се пропуска метод
спектро-фото- монохроматична с в е т л и н а с п о м о щ т а н а специална к а т о д н а
метрия лампа; по к о л и ч е с т в о т о на п о г ъ л н а т а т а с в е т л и н а се опреде­
ля к о л и ч е с т в о т о на е л е м е н т а
4. Н е у т р о н н о - два начина н а определяне:
актибационен - чрез термален неутронно-активационен анализ - п р о б а т а дефинитивен
анализ и с т а н д а р т ъ т се облъчват, след к о е т о следва радиохимич- метод
но разделяне, изолиране и измерване р а д и о а к т и в н о с т т а на
определяемия и з о т о п
- чрез и н с т р у м е н т а \ е н неутронно-активационен анализ, на­
ричан още н е д е с т р у к т и в е н анализ. П р о б а т а и с т а н д а р т ъ т
се облъчват, след к о е т о се измерва р а д и о а к т и в н о с т т а им
(без разрущаване на п р о б а т а )
Рентгенова рентгенов с п е к т р а л е н а н а ш з на е л е м е н т а изисква специална а п а р а т у р а не е з а с т ъ п е н в
спектроскопия практиката
Колоримет-
рични м е т о д и
• ензимни N a + е а к т и в а т о р на ензима ß-2a\akmo3uga3a в р е а к ц и я т а : линеен в т е с н и граници; включен в а в т о м а т и ч н и все-повече навлиза
анализатори в р у т и н н а т а лабо­
ß-га~1актозидаза
о-нитрофенил^-галактопиранозид раторна практика
Na*
о-нитрофенол + г а л а к т о з а
о -н и т р о ф ен о лъ т се м о н и т о р и р а (кинетично) при к = 405 п т
• неензимни Na преципитира с M g - й о д а ц е т а т ; използува се рядко
(с Mg о с т а н а л и я т свободен й о д а ц е т а т + тиогликолова в рутинната
йодацетат) киселина >• ж ъ л т о к а ф я в комплекс (А т а х = 405 п т ) лаборатория
Утаечни у т а я в а н е на Na с: у р а н и л а ц е т а т , уранилманганов а ц е т а т , трудоемки, неспецифични историческо
методи уранилмагнезиев а ц е т а т ; и з м е р в а н е т о е гравиметрично, значение
т и т р и м е т р и ч н о или колориметрично

-
 Memog Принцип (химическа р е а к ц и я ) Коментар Оценка н а м е т о д а

1. Емисионна (Виж Н а т р и й ) / з а К - Х = 766 пш. точен; използува се Li к а т о в ъ т р е ш е н

пламъкоба с т а н д а р т (Х = 671 п т )
фотометрия
2. Й о н - с е л е к т и б н а биж Н а т р и й
потенциометрия
3. Лтомно-абсорб- биж Н а т р и й референтен
ционна с п е к т р о - метод
фотометрия
4. Н е у т р о н н о - а к т и - биж Н а т р и й дефинитивен
бационен ана.\из метод
5. Р е н т г е н о б а биж Н а т р и й
спектроскопия
6. К о л о р и м е т р и ч н и
методи
• ензимни К + активира ензима пирубаткиназа (ПК), катализиращ прев­ висока специфичност, удобен за мануална р у т и н е н - клас А
ръщането на фосфоенолпируват (ФЕП) в п и р у в а т и автоматична работа
п и р:у б а т к и н а з а
фосфоенолпируват + ADP -гг >• пирув а т + АТР
К
i\nx
пируват + NAD . Нг — — — ^ л а к т а т + NAD ( о т ч и т а н е на 340 п т )
а к т и в и р а щ и я т е ф е к т на Na + върху пируваткиназата, се из­
бягва к а т о , в реакционната микстура се включват Na-свързва-
щи а г е н т и (криптатори) и NH4-консумиращи а г е н т и
GLDH
(NH3 + а-кетоглутарат — >• г л у т а м а т + Н 2 0)

• турбидиметри- извършва се обезбелтъчаване с трихлороцетна киселина сравнително усложнена техника, ниска рядко използван
чен м е т о д К + Ь Т а-тетрафена\борон >• суспензия о т К - т е т р а ф е н ш - специфичност
борон ( о т ч и т а се на 578 п т )

7. У т а е ч н и м е т о д и с кобалтови съединения, хлорплатинат, тетрабромфенол, сравнително ниска т о ч н о с т и специфич­ историческо

дипикриламин; измерването след т о в а е с т и т р и м е т р и ч е н н о с т , бавни и трудоемки значение
ш и колориметричен завършек

ся
00
С
О
g Т а б л и ц а 32.3. А н а л и т и ч н и м е т о д и з а о п р е д е л я н е н а хлорид
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
+ +
1. К у л о н о м е т р и ч н о чрез електролиза о т Ag-анод се освобождават Ag ; Ag +СГ-»АдС1 бърз, т о ч е н и удобен за експресни референтен
титриране (утайка); след свързването на всички хлорни йони и п о я в а т а на анализи метод
• автоматичен свободни сребърни йони п р о т и ч а т о к в и н д и к а т о р н а т а верига
хлортитратор и се изключва т о з и в г е н е р а т о р н а т а верига. О т ч и т а се време­
т о за протичане на процеса
2. Й о н - с е л е к т и б н а С йон-селективен електрод бърз, т о ч е н и удобен за спешни анализи; р у т и н е н - клас А
потенциометрия з а с т ъ п е н в а в т о м а т и ч н и анализатори
3. К о л о р и м е т р и ч н и (вж. Na + )
методи
• с живачен т р и п и - 1. СГ + Hg трипиридил-триазин ->• HgC^ + т рипиридил -т риа зин предимство - с п е к т р о ф о т о м е т р и ч н о използват се в някои
ридил - т р и а з и н 2. Трипиридил-триазин + Fe 3 + -» синьо оцветено съединение определяне във в и д и м а т а о б л а с т а в т о м а т и ч н и анали­
(Атах = 5 9 0 П т
) затори
• с живачен 1. 2СГ + Hg(CSN)2 - HgCl2 + 2(CSN")
тиоцианат 2. 3(CSN") + Fe 3 + -> 4Fe(CSN)3 (червена о ц в е т к а )
(Amax - 440, 480 nm)
4. Р а д и а л н а и м у н о - п л а к а т а агар съдържа Ag н и т р а т . При накапване на серума трудоемък, неудобен за серийна р а б о т а рядко използван
дифузия н а С1 образува преиипитационни зони о т AgCl; о т ч и т а се
Манчини дензитометрично.
5. Е н з и м н и а - а м и л а з а т а се а к т и в и р а в присъствие на С1_ при разцепване­ специфичен, удобен з а мануално и р у т и н е н - клас А
т о н а 2-хлор-4-нитрофенил-р-0-малтохептозит; а в т о м а т и ч н о определяне
получения 2-хлор-4-нитрофенол се о т ч и т а с п е к т р о ф о т о м е -
т р и ч н о (А тах = 405 п т )
6. М е р к у р и м е т р и ч н и Hg (Шз) 2 + NaCl = HgCl2 + 2NaN03 и н д и к а т о р н и я т преход е ясен, р а б о т и удобен за мануални
титриметрични i се с микроколичества серум лаборатории
Hg (КОз)2 + и н д и к а т о р синьо-виолетова о ц в е т к а
(дифенилкарбазон)
7. Й о д о м е т р и ч н и у т а я в а н е със сребърен п е р й о д а т и определяне на освободения т о ч н и , но неудобни за клиничната историческо
• с титриметричен йод а т практика значение
завършек
• с колориметричен
завършек
8. IDMS ( и з о т о п н а м а с - с п е к т р о м е т р и я с и з о т о п н о разреждане; р е г и с т р а ц и я на висока специфичност дефинитивен
д и л у ц и я мас-спек- индекс о т 2 и з о т о п а след разреждане н а п р о б а т а с п о з н а т о метод
трометрия) количество маркиран С1
 Таблица 32.4. Аналитични методи за определяне на калций
Метод
ЬКолориметрични
методи
• с о-крезолфталейн-
комплексон
• с арсеназо III
• с метилтимолблау
2.Колт.\ексонометрич11и
-1 етап: образ^ане на комп­
лекс на Са с комплексон III
- II етап: свързване на Са с
комплексонометричния инди­
катор - калред, мурексид и др.
- III етап: прехвърляне на Са
о т индикаторно-калциевия
комплекс в комплексон-Са
комп-^екс и освобождаване на
индикатора
З.Емисионна пламькова
фотометрия
4.Атолшо-абсорбционна
спектрофотометрия
З.Неутронактивационен
анализ
6.IDMS ( и з о т о п н а дилуция
мас-спектрометрия)
СЛ
оо
СЛ
Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка на м е т о д а
р у т и н е н - клас А
Са + о-крезолфталейн-комплексон -» червено-виолетов цве­ крайноточков, специфичен, удобен за
т е н комп,\екс (а.\ка.\но pH) мануални и а в т о м а т и ч н и анализи
(А,,,«, = 570 п т )
Са + арсеназо III -» цветен комгьчекс специфичен, удобен, т ъ й к а т о опреде­
(Атах = 650 п т ) лянето се извършва във видимата
(за премахване влиянието на Mg се използува 8-хидрокси- област; подлежи на а в т о м а т и з а ц и я
хинолин к а т о маскинг а г е н т )
Са + метилтимолблау —син цветен комплекс удобен в мануалната и а в т о м а т и ч н а
(А та1 = 620 п т ) лаборатория; опростена техника и
о т ч и т а н е във видимата област
Са + NajEDTA -• CaEDTA + Na, високочувствителен, индикаторният удобен за мануални
преход е ясен и се работи с микроколи- лаборатории
Ca + индикатор -• Са-индикаторен комп.\екс чества серум; разработени са вариан­
т и на о т ч и т а н е т о к а т о фотоме­
трично титриране, хелатометрия,
спектрофотометрия; използува се
Са-индикаторен комплекс + NaXDTA -»CaEDTA + индикатор
и в сухата химия
(интерференция на Fe,Cu,Mg)
Определя се специфичната калциева емисия при t0 на пла­ изисква по-висока температура на пламъ­ рядко се използува в
мъка над 2300оС ка (ацетилен въздух - 23250С); зависи о т практиката
съдържанието на другите електролити в
серума, повече о т Na и К.
(вж. Na) референтен м е т о д
(вж. Na) Висока специфичност и чувствителност дефинитивен м е т о д
Слабо застъпен, поради
висока цена
(вж. CI)
g Т а б л и ц а 32.4. продължение
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а

Т.флуориметрични
методи
8.Утаечни м е т о д и
образуване на флуоресцентни комплекси с: екворин, високочувствителни и специфични; изпол­ историческо значение
флуорексон и калцеин з в а т се при търсене на Са в следови кон­
центрации; трудоемки и изискват спе-
циална о т ч и т а щ а апаратура
утаяване на Са с пикролонова, хлоранилинова, оксалова неточни, неспецифични, трудоемки историческо значение
киселина и последващо определяне на у т а й к а т а - гравиме-
трично или колориметрично, или титриметрично след
разтварянето й.

ЙОНИЗИРАН КАЛЦ1Ш
1.Йон-селектибна (вж. Na) високоинформативен; застъпен в комби­ р у т и н е н - клас А
потенциометрия нираните йонселективни анализатори,
к а т о има конструкции само за Са и pH
отчитане
2.Изчислен й о н и з и р а н Са
6Са - Б/З
• по формула Camg% - удобна в случаите на невъзможност за използува се рядко -
Б +6
директно определяне с йон-селективен ниска т о ч н о с т и зави­
Са2 * - йонизиран ка\ций електрод симост о т белтъчното
Са - общ калций съдържание на серума
Б - общ белтък в g%
• по номограма по номограма, включваща нивото на общия калций в mgVc косвена информация, зависеща о т нивото използува се рядко
и общия белтък в gVc. на общия белтък в серума
З.Биологически м е т о д действие на Са йони върху сърдечния мускул на жаба неточен, зависи о т р е а к т и в н о с т т а на историческо значение
биологичния индивид

4.По ЕКГ д а н н и удължаване на QT и RT на ЕКГ. косвена информация рядко използван в кли­

нични условия

б.Физикохимични м е т о д и двувълнова спектрофотометрия с индикатор мурексид. ниска т о ч н о с т и специфичност историческо значение

 Memog
1.Колориметрични
• образ\13ане н а молибденобо
синьо
I етпп;образуване на фосфо-
молибденоба киселина
U етап.-образуване на
молибденобо синьо
• амониев молибдат и
ванадат
- с хиналдиново червено
- 2-р-диметиламиностри-
лиухинолине ти.\су лф а т
• директен UV-метод
2.Ензимни м е т о д и
/ е т я п/образуване на
хипоксантин
U етап/окисление на
хипокс а н т и н а
3.Емиеиошш пламъкоВа
фотометрия
4.Комплексонометрия
сл
00
Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка на м е т о д а
( Р н
1)
неорг. ф о с ф а т + молибденова киселина >• фосфомолиб- специфичен и бърз м е т о д , влияе се о т хемо- р у т и н е н -клас А
денова киселина лиза; използва се в мануални лаборатории
фосфомолибденова киселина ">• молибденобо синьо с п е ц и ф и ч н о с т т а се повишава чрез е к с т р а к ­
редуктор (Ата, = 650 п т ) ция на фосфомолибденовата киселина с ор­
Редуктори:хидрохинон, ейконожен, o.\iugai, аскорбинова ганични р а з т в о р и т е л и (изопропил а ц е т а т ,
киселина, тиоурея, PbCl, изобутанол и др.), к о е т о усложнява техни­
к а т а на изпълнение; за т а з и цел понасто­
ящем се използват редица с ъ р ф а к т а н т и
образува се и в е т е н комгьчекс историческо значение
образува се и в е т е н комплекс историческо значение
в сярнокисела среда неорганичният фосфор образува използва се в редица р у т и н е н - клас А
амониум фосфомолибдатен комплекс, ч и я т о абсорбиия а в т о м а т и ч н и анализатори
се измерва при 340 п т .
висока специфичност и ч у в с т в и т е л н о с т ;
фосфатаза
1
ф о с ф а т + инозин >• хипоксантин + рибозо-1-фосфат удобни за а в т о м а т и з и р а н е
пуриннуклеотйд
ксантиноксидаза
хипоксантин + HjO + 0 , ~ >• пик.киселина + Н_,0,
пероксидаза
Н 2 0 : + безиветен хромоген >юкислен ( ц в е т е н
продукт) + Н 2 0 (Trinder)
о т ч и т а се н а 580 п т ; при мануален а н а и п - на 546 а \ и на 550 п т .
опреде.\я се по влиянието му върху е м и с и я т а на с т р о н ц и я т е о р е т и ч е с к а възможност не се използва в
при >. = 660 п т р у т и н н а т а практика
(вж. Са) 15 п ъ т и по-чувствителен о т колориме- историческо значение
т р и ч н и т е с образуване на молибденобо
синьо; технически усложнен и поради т о в а
не е намери\ широко приложение в прак­
тиката
g Таблица 32.6. А н а л и т и ч н и м е т о д и з а о п р е д е л я н е н а м а г н е з и й
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
1.Атомно-абсорб- (виж. Na) поради образуване на т р а й н и съединения референтен м е т о д
ционна с п е к т р о - използва се калциево-магнезиева кухокатодна лампа на Mg с ф о с ф а т и и др. в с е р у м н а т а ма­
фотометрия (Х = 285.2 шп) т р и ц а , налага се разреждане на п р о б а т а
с 0,5% р а з т в о р на л а н т а н или стронций
2.Колориметрични р у т и н е н - клас А
• с калмагит Mg 2 " + калмагит в алкална среда-(ТРИС и pH = 11) —>-хела- удобен, поради образуване на ц в е т е н комп­
т е н комплекс с розово-червен ц в я т - (А,,^ = 520 п т ) лекс, о т ч и т а щ се във в и д и м а т а о б л а с т ;
(изчерпването н а к а л м а г и т - X = 610 п т ) а в т о м а т и з и р а н (KODAK ЕКТАСНЕМ,
COBAS и др.)
• с магон Mg + магон (ксилидилово синьо) • ->• ц в е т е н комплекс специфичен и чувствителен; използува се
(Ащах = 546 п т ; 520 п т при мануално определяне; изчерпване­ в мануалния и а в т о м а т и ч е н анализ
т о на магона - л = 600 п т )
маскиращ а г е н т за Са е ЕДТА - гликол-emep-mempa о ц е т н а
киселина
• с метилтимолблу образува се ц в е т е н комплекс р е а к ц и я т а се инхибира при хипербилиру- не се използва вече
бинемия
З.Флуориметрични образуване на флуоресцентни комплекси и з и с к в а т флуориметри ма\ко разпространени
в лабораторната
практика
окxi нC3
I-CJ-
4.Ензимни 1.глюкоза + Mg-АТФ >> глюкозо-6-фосфат + Mg-АДФ двустъпално измерване; използва се при
глюкозо-6-фосфат- някои а в т о м а т и ч н и а н а л и з а т о р и
:дехидрогеназа
1
глюкозо-6-фосфат + NADP >• 6-фосфоглю-
к о н а т + NADP.H2 (Ат11Х = 340 п т )
.модифицира/ш изоци-
тратаехиарогеназа
1 : +М:(Г'
2.К-изоцитрат + NADP —— -ХЮ2 + 2-окси- висока специфичност и ч у в с т в и т е л н о с т ; не са намерили практи
г л у т а р а т + NADP.H2 (А т а х = 340 п т ) едностъпално измерване; а в т о м а т и з и р а н ческо приложение, освен
глицеролкиназа т р и с т ъ п а л н а ензимна реакция; високо в предложените о т
3.глицерол + Mg-ATP >- ATP + глицерол-3-фосфат специфичен м е т о д ; скъп Dupont а п а р а т и
глицерол фосфат-
оксидаза
глицерол-3-фосфат >• Н202 + дехидроксиаце-
пероксидаза
i:
тонфосфат
Н2О2 + AAP + HDCBS >• ц в е т е н п р о д у к т
ИОНИЗИРАН MG
1.Йон-селективна директно измерване; п о л з в а т се компютърни алгоритми за магнезиевите ISE са с много к р а т ъ к жи­ р у т и н е н - клас А
потенциометрия корекция спрямо Na, К, Са и pH в о т ; в л иза т в а н а л и т и ч н а т а схема на ре­
дица комбинирани ISE-анализатори
 Аналитични принципи
п р и определяне
на олигоелементи
ОЛИГОЕЛЕМЕНТИ -
РЕФЕРЕНТНИ ГРАНИЦИ,
ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ
И ВЪЗМОЖНИ ИЗТОЧНИЦИ
НА ГРЕШКИ
Т.Цветкова
В с ъ с т а в а н а човешкия организъм у ч а с т в а т
над 60 олигоелементи. Те с а неорганични ве­
щ е с т в а , ч и е т о общо количество в организ­
м а е под 5 g. Независимо о т много н и с к и т е
к о н ц е н т р а ц и и , б о л ш и н с т в о т о о т т я х са
жизнено важни и абсолютно необходими за
организма - е с е п ц и а л п и о л и г о е л е м е н ­
т и : желязо, цинк, мед, манган, йод, молиб­
ден, селен, никел, хром, кобалт, ванадий,
флуор. Те у ч а с т в а т в о б м я н а т а н а в е щ е с т ­
в а т а , и м а т р е ш а в а щ а роля з а поддържане
а к т и в н о с т т а н а редица ензими Сметалоен-
зими), з а с и н т е з а и с т а б и л и з и р а н е т о на ред
макромолекули (ДНК, белтъци), н а субкле-
т ъ ч н и органели (митохондрии, к л е т ъ ч н и
мембрани) и с а необходима с ъ с т а в к а н а ня­
кои хормони. Н е д о и м ъ к ъ т н а някои микро­
е л е м е н т и е причина з а р а з в и т и е т о н а оп­
ределени заболявания у човека, а по-високи­
т е концентрации на повечето о т т я х и м а т
токсично действие, най-вече к а т о ензимни
инхибитори и нарушаващи с т р у к т у р а т а
н а макромолекулите (табл.33.1). Други оли­
гоелементи (неесенциални) се използват с
т е р а п е в т и ч н а ц е л - л и т и й , з л а т о , бром,
б и с м у т . Т р е т а т а група олигоелементи са
с подчертан токсичен и л и канцероге­
н е н ефект: олово, кадмий, арсен, т а л и й ,
живак и др. Т я х н о т о наличие в организма е
р е з у л т а т предимно о т екологични неблаго­
получия, професионална е к с п о н а ц и я или
вредни навици.
Желязо
О б щ о т о съдържание н а желязо при възрас­
т е н човек е около 0.7 mmol/kg т е л е с н а маса
при жени и около 0.9 mmol/kg - при мъже. За
средно т е г л о 70-80 kg т о е 63-72 mmol (3.5-
4.5 g). Преобладаващата ч а с т о т телесно­
т о желязо (62-66%) се намира в червените
кръвни клетки, включено в хемоглобина, а
около 14-16% се съдържа в миоглобина и в
редица ензими: е н з и м и т е н а електронния
т р а н с ф е р (цитохроми, цитохромоксидаза,
сукцинатдехидрогеназа), пероксидаза, глу-
татионпероксидаза, каталаза. Поради учас­
т и е т о си в различни биологични процеси,
т о в а желязо се определя к а т о функцио­
нално. Др у г и те 20-30% о т о б щ о т о желязо
в организма е отложено главно в черния дроб
(1/3), к о с т н и я мозък (1/3), а о с т а н а л о т о - в
далак и други т ъ к а н и . Това е резервно же­
л я з о з а организлш. О т л а г а се или под фор­
м а на ф е р и т и н - р а з т в о р и м ферипротеин,
или к а т о неразтворим хемосидерин (желе­
зен оксид) под ф о р м а т а н а дребни гранули
(1-2 mm), основно при наличие на големи ко­
личества на желязо в оргнизма. Въпреки че
ж е л я з о т о в хемосидерина е в по-висока кон­
ц е н т р а ц и я (с 30-40%) спрямо феритина, т о
се освобождава в по-малко количество в цир­
кулацията. Възможно е да представлява де-
н а т у р и р а н а феритинова молекула. Хемоси-
д е р и н ъ т е с основна роля при патологично
н а т р у п в а н е на желязо (хемохроматоза). За
визуализиране н а хемосидериновите грану­
ли в к л е т к и т е н а к о с т н и я мозък или други
т ъ к а н и се използва ц и т о х и м и ч н а т а реак­
ция с пруско синило.
ф е р и т и н ъ т е основна форма за съхране­
ние н а резервното желязо. Апоферитинът
(апопротеин) във ф е р и т и н о в а т а молекула
обвива разположения в сърцевината комп­
лекс ферихидроксифосфат, включващ 80-4000
а т о м а желязо (около 20% о т молекулната
маса на феритина). По т о з и начин се изоли-
589
Т а б л и ц а 55ЛЛ^линични прояви при недоимък и т о к с и ч н и с и м п т о м и при висока к о н ц е н т р а ц и я
н а някои олигоелемнти

Олигоелементи ЗАБОЛЯВАНЕ/СИМПТОМИ
(референтни
граници в с е р у м ) Недоимък Токсично в ъ з д е й с т в и е

Желязо микроцитна анемия бъбречна недостатъчност,

м. 12.5-26.7 [лто1/1 чернодробна дистрофия,
ж. 10.7-23.4 (imol/1 гърч, кома

Мед микроцитна анемия, смущения в гърч, хемолиза, бъбречна

м. 12.3-22.4 |.imol/l растежа недостатъчност
ж. 13.2-24.6 f.imol/1
Цинк смущения в растежа, косопад, повръщане, белодробен оток,
12.0-24.0 щпо1/1 забавено зарастване на рани, некротизиращи пневмонии
хипогонадизъм, екзематозен
д е р м а т и т , диарии, депресии
Манган смутено образуване на к о с т и т е , паркинсонизъм
кръв 4-14 ng/l стерилитет
Молибден не са познати диария, слабост, обезцветяване
кръв 0.8-3.3 ng/l на к о с а т а
Хром патологичен глюкозен толеранс диария, хеморагична диатеза,
кръв 2.8-45 |.ig/l бъбречна недостатъчност
се/лдм 0.12-2.1 |.ig/l
Кобалт макроцитна анемия витамин В12- колики, хипертермии, аритмии,
0.3-5.0 nmol/1 дефицит токсичен белодробен оток
Селен смущения на растежа, косопад, увреждане на черния дроб,
423-1123 nmol/1 мъртво раждане анемия, повишена склонност към
кървене, нервност, канцероген
Алуминий не са познати остеопатия, миопатия, анемия,
0-10 |ig/l енцефалопатия

р а силно т о к с и ч н о т о желязо о т клетъчно­ трансферин (Тф) - транспортно желязо. Тф

т о съдържимо до м о м е н т а н а използване­
т о му. Изоформите н а ф е р и т и н а о т раз­
личните т ъ к а н и и м а т различна аминокисе-
линна композиция и м о г а т д а се разграни­
ч а т посредством електрофореза. Въпреки
че ф е р и т и н ъ т е предимно в т ъ к а н и т е , м а ­
лък процент о т него се у с т а н о в я в а в плаз­
м а т а , където к о н ц е н т р а ц и я т а му е пропор­
ционална н а т ъ к а н н а т а концентрация. З а
разлика о т в ъ т р е к л е т ъ ч н и я феритин, т о ­
зи в серума е гликопротеин. И з м е р в а н е т о
на серумния ф е р и т и н д и р е к т н о показва ни­
в о т о н а резервното желязо.
В к р ъ в н а т а плазма се съдържа под 0.2%
о т т е л е с н о т о желязо. Свободното желязо е
силно токсично и о т н о с и т е л н о неразтвори­
мо, поради к о е т о ц я л о т о количество в плаз­
м а т а е свързано с т р а н с п о р т н и я б е л т ъ к
590
е б е т а глобулин, к о й т о се с и н т е з и р а в чер­
ния дроб. Една молекула Тф свързва две мо­
лекули т р и в а л е н т н о желязо. Около 1/3 о т
о б щ о т о количество н а Тф е свързан с желя­
зо (обикновено 20-50% о т м е с т а т а за свърз­
ване са наситени). М а к с и м а л н и я т свързващ
к а п а ц и т е т е т р и к р а т н о по-висок. Количес­
т в о т о желязо, к о е т о води до пълно насища­
не н а серумния Тф се нарича т о т а л е н Же-
ллзосвързващ к а п а ц и т е т (тЖСК). То­
т а л н и я т ЖСК е с ъ о т в е т е н на концентраци­
я т а на Тф в кръвния серум и изразява негова­
т а потенциална възможност за свързване на
свободно желязо до пълното си насищане. Раз­
л и к а т а между общия желязосвързващ капа­
ц и т е т и а к т у а л н а т а к о н ц е н т р а ц и я на же­
л я з о т о се означава к а т о свободен (латен­
т е н ) желязосвързващ к а п а ц и т е т (сЖСК).
ж у л и р а щ о т о желязо се оценява най-доб- Феритин
фез изчисляване на т р а н с ф е р и н о в о т о па­ деца 40-80 |ng/l
дане. 1 о е ч у в с т в и т е л н о към скорошен
1ем н а желязо с х р а н а т а и се изчислява при недоьшък на желязо
г л е д н а т а формула: • проявен < 14 |.ig/l
• латентен
серумно желязо
^ Тф-насищане = •х 100 1-6 г 14-23 [ig/l
тЖСК 7-14 г 14-20 [ig/
л я з о т о о т д е п а т а е в н е п р е к ъ с н а т об- 15-21 г 14-39 pig/l
1 с п л а з м е н о т о желязо. В н а с я н е т о му в
мъже 40-280 [xg/1
т к и т е с т а в а посредством т ра н сфе ри -
жени 30-140 ng/1
. и т е р е ц е п т о р и (D71) върху к л е т ъ ч н и т е
лбрани, най-вече н а к л е т к и т е о т хемо- недоимък на желязо
! з а т а к а к т о и н а всички пролифериращи • проявен < 10 ng/l
т к и . След о т д а в а н е н а ж е л я з о т о във в ъ т - • латентен
: л е т ъ ч н о т о п р о с т р а н с т в о , Тф о т н о в о се мъже 15-30 Hg/l
обождава в м е ж д у к л е т ъ ч н а т а т е ч н о с т . жени 15-20 [ig/\
К о н ц е н т р а ц и я т а н а желязо, ЖСК, фери-
н и т р а н с ф е р и н се определя в серум. Кон- П р о м е н и т е в н и в о т о н а т е з и показатели
н п р а ц и я т а н а ж е л я з о т о в кръвния серум при различни заболявания са представени в
а изразен 24-часов р и т ъ м : постепенно на- табл.33.2.
\яване н а н и в о т о му в д н е в н и т е часове с
нимум в 22-24 часа и след т о в а постепен- Пероралните к о н т р а ц е п т и в н и с р е д с т в а
н а р а с т в а н е през н о щ т а с максимум меж- и лечение с естрогени, тироксин и хлорам-
6 и 9 часа с у т р и н т а . Ширина на колеба- феникол в о д я т до повишена концентрация
j - над 25%, а в о т д е л н и случаи и до 100%. н а желязото, а кортикостероиди и а ц е т и ­
блюдава се и о б р а т е н р и т ъ м . зал - до понижено ниво. Р е з у л т а т и т е силно
се в л и я я т о т хемолиза, неправилно в з е т ма­
фсрентпи граници т е р и а л , използване на съдове без осигурена
химическа ч и с т о т а .
злизо В с е р у м Лечение с естрогени, тироксин и прием
ювородени 5-20 ^imol/l на к о н т р а ц е п т и в н и с р е д с т в а води до пови­
:ърмачета 7-23 цто1/1 шена концентрация н а Тф.
|еца 9-25 цто1/1 В началото на лечение с желязо се увелича­
лъже 12.5-26.7 ^mol/1 ва к о н ц е н т р а ц и я т а на феритин в серума.
кени 10.7-23.4 umol/l
Mecj
КСК 44.8-71.6 ^mol/1
В човешкия организъм се с ъ д ъ р ж а т около
1.10-2.40 mmol мед (100-150 mg). Б о г а т и н а
аисферии мед органи са черния дроб, ц е н т р а л н а т а
ювородени 0.2-0.4 g/1 нервна система, с ъ р ц е т о и мускулите. В т ъ ­
к ъ р м а ч е т а до 1 м 1.5-2.0 g/1 к а н и т е м е д т а е свързана стабилно с т ъ к а н -
с ъ р м а ч е т а до 1 г 2.0-2.5 g/1 ни протеини - купреини (еритрокупреин в
^еца 2.5-4.0 g/1 е р и р т о ц и т и , хематокупреин в мозъка и др ).
иъже 2.0-4.0 g/1 М е д т а у ч а с т в а във формирането на кола­
кени < 45 г. - 2.0-3.5 g/1 гена и поддържането на миелиновата обвив­
кени > 45 г. - 2.0-3.0 g/1 к а на неврофибрилите. Тя е о т значение съ­
що за е р и т р о п о е з а т а , р а з в и т и е т о на ске­
Гф-насищане л е т а , функционирането н а и м у н н а т а сис­
иъже 30-40% т е м а , образуването на меланин и пигмен­
•кени 25-40% т а ц и я т а и е с ъ с т а в к а н а ред ензими и ин­
•келезен д е ф и ц и т < 15% дивидуални белтъци - супероксиддисмута-
за, т и р о з и н а з а , делта-аминолевулинова-
591
Габ ш ц а 33.2. Промени 6 нивото на някои показатели при различни заболявания, свързани с наруше­
на обмяна на желязото ( t - повишение, Ф - намаление, р.и. - референтен интервал) I
Серу­ Тъка-
%Тф
Серум­ мен Резорб­ нен
Заболяване тЖСК сЖСК наси­
но Fe фери- ция резерв
щане
шин

Изчерпване на Fe без р.и. р.и. р.и. р.и. Ф t Ф

анемия
Желязонедоимъчна Ф t Ф Ф t
анемия
X
•

Анемия при хронични Ф Ф ф Ф p.u./t р.и./л.ф

t
заболявания
Анемия при туморни
заболявания и тъканна Ф Ф ф Ф t Ф Ф
деструкция
Хемохроматоза t Ф ф t t t t
1 Хеморагична t р.и. ф t t t t
! Сиредобластна t р.и. ф t t t t

дехидратаза, церулоплазмин ( т р а н с п о р т е н 12-25% и л е в к о ц и т и т е - 3%. Около 66% о т

белтък на м е д т а ) и др. Изследването на мед цинка в п л а з м а т а е свързан сравнително по-
се извършва в серум, урина (Д24), коса. слабо с албумин, к о е т о позволява диализи-
р а н е т о му, а 34% е свързан относително
Реферснтни г р а н и ц и здраво с т р а н с ф е р и н и алфа-2-макроглобу-
• Серум лин. Биологичната роля н а цинка е многос­
т р а н н а : т о й е н е о т м е н н а с ъ с т а в к а на над
новородени 6.0-9.5 |.imol/l
70 м е т а л о е н з и м а , включени в основни мета-
деца 15.0-25.0 |дто1/1
мъже 12.3-22.4 |дто1/1 б о л и т н и реакции - карбоанхидраза, уриказа,
жени 13.2-24.6 цто1/1 г л у т а м а т д е х и д р о г е н а з а , алкална фосфата-
за, алкохолдехидрогеназа; образува комплекс
• Урина
с ЛКТХ и инсулин; у ч а с т в а във формиране
мъже 0.24-1.10 ^mol/24 h н а колагена и и м а о т н о ш е н и е към зараст­
жени 0.16-0.95 цто1/24 h в а н е т о н а рани. Важен е з а в ъ з п р и я т и я т а
• Коса 0.012-0.098 [imo\/g (вкус и мирис), о т значение е за клетъчна­
т а репликация, р а с т е ж а и половото съзря­
П л а ц е н т а т а задържа и з в е с т н а ч а с т о т ване, з а и м у н н а т а з а щ и т а .
м е д т а , поради к о е т о новороденото и м а по- Изследването н а цинк се провежда в се­
ниски с т о й н о с т и в к р ъ б т а . П р и е м ъ т н а рум, плазма, к л е т ъ ч н и л и з а т и (еритроцити,
к о н т р а ц е п т и в н и м е д и к а м е н т и причинява левкоцити), урина (Д24), коса.
повишение на церулоплазмина.
Референт п и г р а н и ц и
Цинк
• Серум
Общото количество н а цинка в организма е новородени 11-40 ^imol/1
25-40 mmol (2-3 g).Toü се съдържа във всички к ъ р м а ч е т а , деца 11-31 цто1/1
органи на човешкия организъм к а т о най-бо- възрастни 12-24 |лто1/1
г а т и са черния дроб, бъбреците, ^-клетки-
т е в панкреаса, п р о с т а т а т а , к о с а т а , е р и т ­ • Урина (Д 24 )
мъже 1.5-23.0 цто1/24 h
р о ц и т и т е . В к р ъ в т а ц и н к ъ т се разпределя
между е р и т р о ц и т и т е - 75-85%, п л а з м а т а - жени 1.5-11.0 [лто1/24 h
592
Еритроцити 184-198 [дто1/1 Erys
Коса 1.97-4.63 |.imol/g
В серум с т о й н о с т и т е са с около 10% по-
icoku о т т е з и 6 плазмата, поради осбобож-
ißane на цинк о т т р о м б о ц и т и т е по време
i съсирване на кръвта. Серумната концен-
рация на цинка има подчертана циркади-
ша вариация, чиито пикове са в 9 и 18 ча-
I. Нивото на цинка се понижава постпран-
НАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
А ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЖЕЛЯЗО,
iCK И МЕД
.Накова
таблици 33.3-33.4 са представени анали-
ичните методи и т е х н и т е принципи за из-
кедване на желязо, ЖСК, мед в биологичен
атериал.
диално.
Фалшиво по-високи са с т о й н о с т и т е при
хемолиза (в е р и т р о ц и т и т е цинкът е с 14 пъ­
т и по-висока концентрация спрямо плазма­
та).
Относно изискванията и контрола на за­
мърсяването на използваната стъклария,
реактиви и вода при анализите за определя­
не на олигоелементити вж. гл. 4 и гл. 6.
АНАЛИТИЧНИ МЕТОДИ
ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЦИНК
К. Ц а ч с в
В таблица 33.5 е представен аналитичния
метод за изследване на цинк в биологичен ма­
териал.
593
g Т а б л и ц а 33.3. А н а л и т и ч н и м е т о д и з а о п р е д е л я н е н а ж е л я з о и Ж С К 6 с е р у м *
Метод
Желязо 6 с е р у м
1.Колориметрични
методи
• к а т о Fe2 +
I етап: освобождаване
на ферикатиона о т
връзката с трансферина
П етап: реду кция на
фери- до феройон
Ш е т а п : образуване на
цветен комплекс на
феройона
• к а т о Fe3 +
/ етап: - освобождаване
на ферикатиона о т връз­
ката с трансферина
П е т а п : цветна реакция
2.Каталитични
методи
ЗАтомно-абсорбци-
онна onek m рофо т о-
метрия
4.Други и н с т р у м е н ­
тални методи:
неутрон-активационен
анализ, радиоизотопна
дилуция, рентгенова
спектроскопия
Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
ц в е т н и т е комплекси на Fe2 + с отделните хро- р у т и н е н - клас А
индиректно - с обезбелтъчаване могени и м а т различен моларен екстинкционен
директно - с кисел буфер (pH - 4,5-5,0), гванитидин хлорид коефициент [ о т 11 100 (/. = 510 п т ) - ортофенан­
(ферозинови методи). тролин, до 26 900 (X = 569 п т ) - дипиридил]; най-
често използвани за мануа\ен а н а \ ш са батофе­
Fe3 +-»Fe2 + - аскорбинова киселина, хидроксиламин. нантролин и ферозин; ферозиновите и ференови
хидразин, тиогликолова киселина, сулфит, д и т и о н и т и др.) методи са автоматизирани в най-голям брой
анализатори
образуване на цветно съединение на Fe 2+ с храмогени:
батофенантролин, ортофенантролин, дипиридил, трипи-
ридил, ферозин, ферен и др. ( А ^ = 530-545 п т )
най-често прилагана е т.нар. хромазуролова реак­ предложен е за а в т о ­
индиректно - с обезбелтъчаване ция; висок моларен екстинкционен коефициент матичен анализ в
директно - с кисел буфер (pH - 4,5-5,0) -168 000; силно негативен е ф е к т на серумната гореспоменатите
матрица анализатори
образуване на т р е т и ч е н цветен комплекс на Fe3 + с хрома-
зурол и СТМА (цетииприметиламониев бромид)
Fe се използва к а т о к а т а л и з а т о р на редица окислително- висока т о ч н о с т и чувствителност, концен­ ма\ко използвани в
редукционни реакции т р а ц и я т а на е л е м е н т ъ т е в nmol; трудоемки. практиката поради
някои о т т я х са автоматизирани техническа сложност;
(виж. Na) висока чувствителност, влияе се о т референтен
абсорбцията на други елементи в серума
висока специфичност и т о ч н о с т
 iviemoq Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а

ЖСК
1.Тотален ж е л я з о свър­
зващ к а п а ц и т е т
• директно определяне пробата серум се насища с Fe (РеС1з), след което несвърза­ лъжливо завшиени стойности при
ното Fe се преципитира (най-често с MgCOs); пробата се недобро центрофугиране
центрофугира и Ре се определя в супернаташпа

• изчислен тЖСК По формула: т Ж С К = сЖСК + серумно желязо малка т о ч н о с т

2.Свободен ( л а т е н т е н ) прибавя се в излишък точно количество наситен разтвор на използва се в а в т о м а т и ч н и т е

ж е л я з о свързващ РеС1з (1); свободният трансферин се насища за определено вре­ анализатори
к а п а ц и т е т (сЖСК) ме; определя се о с т а н а \ о т о след насищане количество Ре (2).
Изчисиение: сЖСК = (1) - (2)

З.Определяне н а ЖСК
к а т о белтък-транс-
ферин
• Имунологично имунотурбидиметрия по-точен и специфичен метод
в сравнение с химичните
• Радиоизотопно радиоимунен метод по-точен и специфичен метод
в сравнение с химичните
* Е. Накова

сл
С
Л
2 Т а б л и ц а 33.4. Аналитични м е т о д и за определяне на мед*
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
1.Атомно-абсорбцион- (виж. Na) надежден м е т о д за определяне на референтен
на с п е к т р о ф о т о - серумна мед
метрия

2.Колориметрични надеждни, специфични, о т ч и т а н е във р у т и н е н - клас А

методи видима област; а в т о м а т и з и р а н и
/ е т а п : освобождаване индиректно - с обезбелтъчаване
на куприйона о т връзка­ директно - с кисел буфер (pH _ 4,5-5,0)
т а с церулоплазмина

I I е т а п : редукция на Си2*-» Си+ {редуктори: аскорбинова киселина,

купри- до купройон тиогликол и др. t

III е т а п : образуване на Си+ + хромоген -• ц в е т н о съединение

ц в е т е н комплекс на [хромогени: батокупроин (мол. е к с т . коеф. = 12 000),
купройона купрозин (м.е.к. = 20 000), дифинил-карбохидразид
(м.е.к. = 15 800), натриев/оловен/диетил-дитиокар-
б а м а т (м.е.к. = 8 000] (А тах = 570-590 п т ) .

3.IDMS ( и з о т о п н а ди- (виж. С1) дефинитивен

луция мас-спектро-
метрия)

4.Неутрон-активаи,и- (виж. Na) висока специфичност и слабо застъпен,

онен анализ чувствителност поради висока цена

* Е. Накова
 Mcmog Принцип (химическа реакция Коментар Оценка н а м е т о д а

Атомно- директна пламъчна ЛАС или след обезбел- основен проблем при определяне на Zn в серум и добра чувствителност
абеорбционна тъчабане с ТХОК др. биологични т е ч н о с т и е контрола на конта- и специфичност;
спектрофото- минаиията; всички използвани съдове и реак­ CV под 5%
метрия т и в и вкл. вода т р я б в а предварително да се про­
в е р я в а т за замърсяване с Zn; хемолизата оказва
значителна интерферениия

Описани са и колориметрични методи за определяне на Zn. Те корелират добре с ААС при определяне на Zn в пълна кръв, но т я х н а т а
чувствителност е недостатъчна за определяне на понижени с т о й н о с т и на Zn в серума.

• К. Цачев

Книгопис

B e r r y М М , M a z z a c h i R D . P e j a k o v i c М , P e a k e M J . E n z y m a t i c d e t e r m i n a t i o n o f s o d i u m in s e ­ J a c k s o n G . H e m o g l o b i n a n d iron. In: T i l t o n R C , B a l o w s A , H o h n a d e l D C , R e i s s R F ( e d s ) .
rum. Clin C h e m , 34, 1988, 2295-2298. C l i n i c a l l a b o r a t o r y m e d i c i n e . St. L o u i s , M o s b y , Y e a r B o o k , Inc, 1992, 1 4 5 - 1 5 6 .
B e r r y M N , M a z z a c h i R D , P e j a k o v i c M , P e a k e M J . E n z y m a t i c d e t e r m i n a t i o n o f p o t a s s i u m in K e l l e r H. K l i n i s c h - c h e m i s c h e l a b o r d i a g n o s t i k f u r d i e p r a x i s , S t u t g a r t , T h i e m e Verlag, 1 9 9 1 ,
serum. Clin C h e m , 3 5 , 1989, 817-820. 177-227.
E h r h a r d t V, A p p e l W, P a s c h e n K , Vogt W , Rurali C . E r g e b n i s s e d e r e v a l u i e r u n g e i n e s x i l i d y l b l a u - L a b o r a t o r y m e d i c i n e : A s c i e n t i f i c a n d m a n a g e m e n t I n f o b a s e , N e y York, P e s c e K a p l a n P u b l i s h ­
reagenz zur bestimmung v o n magnesium. G1T Labor Medizin, 14, 1991, 367-368. e r s , Inc, 1 9 9 9 .
E h r h a r d t V, C h . W e r i e , M . T o w n . E v a l u i e r u n g e i n e s e n z y m a t i s c h e n R e a g e n z z u r b e s t i m m u n g L e w e n s t a m A . M a j - Z u r a w s k a M , B l o m q v i s t N , O s t J. I o n i z e d m a g n e s i u m - a n e w p a r a m e t e r in
v o n c h l o r i d . Klin L a b , 3 7 , 1 9 9 1 , 3 0 1 - 3 0 2 . c l i n i c a l a n a l y s i s . C l i n C h e m E n z y m C o m m s , 5, 1993, 9 5 - 1 0 3 .
G r a y TA, Paterson C R . T h e clinical value o f ionized c a l c i u m assays. A n n Clin B i o c h e m , 2 5 . O n o T, T a n i g u c h i J , M i t s u m a k i H , T a k a h a t a F, S h i b u y a A , K a s a h a r a Y, K o s h i m i z u F. A n e w
1988, 210-217. e n z y m a t i c a s s a y o f c h l o r i d e in s e r u m , C l i n C h e m , 34, 1988, 552-553.
G r u b e r Fr.O. S p u r e n e l e m e n t e in d e r m o d e r n e n m e d i z i n . L a b o r a k t u e l l , 1 9 8 6 , 5. 5 - 9 . Tierz N W , T e x t b o o k o f clinical Chemistry, Philadelphia, W.B. Saunders C o m p , 1986.

сл
CO
<1
 Експресни м е т о д и
(суха химия) 6 клинично-
химичния анализ н а с е р у м
Б. Д и ш л я п о в а
ОСНОВНИ ПОЛОЖЕНИЯ
ПРИНЦИПИ
В ъ в е ж д а н е т о н а нови т е х н о л о г и и в л а б а р а -
т о р н а т а п р а к т и к а з н а ч и т е л н о увеличава
д и а г н о с т и ч н и т е в ъ з м о ж н о с т и . Ежегодно с е
о т д е л я т огромни с р е д с т в а з а ф и н а н с и р а н е
н а нови р а з р а б о т к и .
Сухата х и м и я е с р а в н и т е л н о нов м е т о д
- о т около 25 години, к а т о първоначално ре­
з у л т а т ъ т е бил и з р а з я в а н к а ч е с т в е н о или
полукачествено. Определяни с а няко и субс­
т р а т и в серум и урина. С а м о т о п о н я т и е
суха х и м и я е условно, з а щ о т о в суха с р е д а
не може д а се о с ъ щ е с т в и х и м и ч н а р е а к ц и я ,
но т о з и т е р м и н е придобил ш и р о к а попу­
лярност.
C , f/jcama(DRY-slide) т е х н о л о г и я се б а з и р а
н а р е ф л е к т о м е т р и я т а - о т р а ж а т е л н а спек-
т р о м е т р и я , при к о я т о се и з м е р в а и н т е н ­
з и т е т а н а о т р а з е н а т а с в е т л и н а (фиг. 34.1).
Този м е т о д н е о т с т ъ п в а по п р е ц и з н о с т и
т о ч н о с т н а к л а с и ч е с к а т а ф о т о м е т р и я . Ед­
но о т с п е ц и ф и ч н и т е п р е д и м с т в а е обхва­
т ъ т н а и з м е р в а н е т о , к о й т о е много по-ши­
рок в сравнение с ф о т о м е т р и ч н и т е м е т о ­
ди.
Падащ лъч Отразен
I lOBl.pxHOCT
Пречупване
Фиг. 34.1. О т р а ж а т е л н а с п е к т р о м е т р и я
598
И с т о р и я т а на разработването на т а з и тех­
нология д а т и р а о т няколко века. В древността
Плини Младши описва хартиен т е с т , прилаган
за откриване на желязо, к а т о примес на мед в
т е ч е н разтвор (папирусна лентичка се потапя­
ла в е к с т р а к т Gallnuts и след изсушаване е изпол­
звана за различаване на истински и фалшиви рим­
ски монети - истинските са били о т ч и с т а мед,
без примеси). По-късно, през 1962, Техениус изпол­
зва т о з и м е т о д при изследване на човешка ури­
на. Първоначално сухата химия има много ши­
роко приложение в индустриалната химия, и ед­
ва през 50-те години на 20. век нараства ролята
ü в медицинската диагностика. Едно о т главни­
т е ü приложения е било в диагностиката и кон­
трола на захарния диабет чрез хартиени лентич­
ки, потапяни в урина, а по-късно и в серум. Раз­
р а б о т в а т се и други параметри. През 1974 за пър­
ви п ъ т са визуализирани единични еритроцити
върху хартиена лентичка, последвано почти вед­
нага о т идентифициране на левкоцити в урина.
Тъй к а т о човешкото око е субективно, при о т ­
читане на ц в е т о в а т а гама на т е с т а се налага
разработването на а п а р а т , който обективно да
о т ч и т а резултата. Първите рефлектометри са
изисквали значително време за калибрация и под­
готовка на пробата. Навлизането на микропро­
цесорните технологии дава големи възможности
при разработените апарати, к а т о обслужване­
т о им е максимално опростено.
К ъ м к р а я н а с е д е м д е с е т т е години нарас­
т в а н е о б х о д и м о с т т а о т и з м е р в а н е и на
други в а ж н и клинично-химични п о к а з а т е л и
в кръв, п л а з м а или серум. В н а ч а л о т о произ­
в о д с т в о т о н а т е с т о в е с р е щ а големи т р у д ­
н о с т и и проблеми з а р е ш а в а н е , к а т о напр.
с м е с в а н е н а различни с у б с т а н ц и и , някои о т
к о и т о н е с ъ в м е с т и м и , т е х н и к а н а разделя­
не н а с л о е в е т е , и н т е р ф е р е н ц и и , срок н а съх­
р а н е н и е н а т е с т о в е т е и др. През т о з и пе­
риод се р а з р а б о т в а т т р и с и с т е м и н а носи­
т е л и н а р е а к т и в а в сухата хилгия:
1. М н о г о п л а с т о в о Влакно - м а т р и ц а о т
в л а к н а се покрива п о с л е д о в а т е л н о с раз­
лични р е а к т и в и , к о е т о е о т значение за
ieÜHama с т а б и л н о с т във в р е м е т о
ЧногопластоВи филми - реактивите
!е н а н а с я т н а п л а с т о в е и взаимодейст­
вието им с биологичния м а т е р и а л може
ja бъде преиизно контролирано н а ниво хи-
лична реакиия по време н а производство-
по им с краен р е з у л т а т - получаване н а
стабилни и високочувствителни филми.
•Сибрид о т м н о г о п л а с т о в и Влакно-
})илми - комбинаиия о т п р е д и м с т в а т а
i a г о р н и т е две технологии. Хибридната
пехнология в о б л а с т т а н а м е д и и и н а т а се
1рилага за първи п ъ т през 1978 о т KODAK,
i к а ч е с т в о т о си н а лидер във филм-тех-
юлогиите.
Такива хибридни носители, наречени слай-
te, произведени о т EASTMAN KODAK, се
ю л з в а т в п р е д л а г а н и т е о т Johnson &
inson биохимични а н а л и з а т о р и на прин-
аа н а сухата химия. Те в к л ю ч в а т някол-
модела: VITROS DT 60 - п о л у а в т о м а т и -
1 биохимичен а н а л и з а т о р за около 90 про-
'h; VITROS 250 - а в т о м а т и ч е н биохими-
I а н а л и з а т о р з а 250 проби/h; VITROS 950 -
п о м а т и ч е н биохимичен ан а ли зат ор за 950
зби/ h.
П а р а м е т р и т е - директно анализирани и
а в т о м а т и ч н о изчисляеми (производни) са
представени н а т а б л . 34.1 и 34.2.
VITROS EKTACHEM 250 е широкопрофилен
а в т о м а т и ч е н анализатор за повече о т 45
показателя - ензими, с у б с т р а т и , електро­
л и т и и лекарствен мониторинг, к а т о гама­
т а непрекъснато се увеличава. Консумати­
в и т е за т о з и анализатор се н а р и ч а т слай-
дове. Всеки слайд е за един п а р а м е т ъ р на
един паииент. Фирмата-производител пред­
лага два основни т и п а слайдове - потенцио-
метрични (фиг. 34.2) и спектрофотометрич-
ни (фиг. 34.3). Е л е к т р о л и т и т е се измерват
потенииометрично след преминаване на би­
ологичния м а т е р и а л през йон-селективни
електроди, свързани с х а р т и е н м о с т , кой­
т о осигурява образуването на електрохи-
м и ч н о т о съединение. Колориметричният
слайд има р азсти л ащ слой, к о й т о е първи
на слайда, на к о й т о се накапва а в т о м а т и ч ­
но биологичния материал. Различните слое­
ве и м а т различна функиия. На реакционния
слой се извършва химичната реакция, а на
р ег и стр и р ащи я се о т ч и т а или к и н е т и к а
(кинетична рефлектометрия) или промяна­
т а на ц в е т а , к о й т о се формира пропорцио-

б л и ц а 34.1. Меню н а клинично-химичния анализатор Ektachem 250

Биологичен
)ка'зател Биологичен м а т е р и а л Показател материал
щ протеин серум/плазма тЖС серум
бумин серум/плазма Литий серум/плазма
ликвор АсАТ серум/плазма
л т ъ к в ликвор
урина АлАТ серум/плазма
л т ъ к в урина
серум/плазма/урина/ликвор Алкална ф о с ф а т а з а серум/плазма
юкоза
Кисела ф о с ф а т а з а серум/плазма
лестерол серум/плазма
КК серум/плазма
)Ь-холестерол серум/плазма
КК-МВ серум
иглицериди серум/плазма
ХЕ серум/плазма
щ билирубин серум/плазма
конюгиран и ГГТ серум/плазма
серум/плазма
нюгиран билирубин
Амилаза серум/плазма
еатинин серум/плазма/урина
Аипаза серум/плазма
еен а з а т серум/плазма/урина
серум/плазма/урина С-реактибен п р о т е и н серум/плазма
1кочна киселина серум/плазма
С0
юняк плазма 2
Ацетаминофен серум/плазма
трий серум / плазма/урина
фенитонин серум/плазма
лий серум/плазма/урина
Теофилин серум/плазма
лций серум/плазма/урина
Дигоксин серум/плазма
органичен ф о с ф а т серум/плазма/урина
Алкохол серум/плазма
1гнезий серум/плазма/урина
Салицилат серум/плазма
злязо серум / плазма
599
Т а б л и ц а 34.2. Автоматично изчисляеми (дериватни) параметри на Ektachem 250
Съкращение Наименование Формула з а изчисллване -
A/G албумин/глобулин индекс ALB/(TP - ALB)
Agp анионен дефицит без К +
(Na + )-(Cl- + EC02)
AgpK анионен дефицит с К + (Na* + К + )-(С1- + EC02)
B/CR урея/креатинин индекс BUN/CREA
С/Н холестерол/НЦ^-холестерол индекс CHOL/HDLC
Dbil директен бш\ирубун (|.imol/l) TBIL - Bu
DelB д е л т а билирубин (цто1/1) TBIL -(Bu + Bc)
Glob глобулини (g/1) TP - ALB
LDL АРШ (mmol/1) (CHOL - HDLC) - (TRIG/2.2)
Nbil неонатален билирубин (цто1/1) Bu + Bc
OSMO о с м о л а р и т е т (mOsm/1) Na'xl.86 + CLU/18 + BUN/2.8
VLDL АМНП (mmol/1) TRIG/2.2
%MB КК-МВ/КК отношение (6 %) (CK-MB/CK) x 100
%Sat насищане с желязо (6 %) (Fe/TBIC) x 100

нално на к о н ц е н т р а ц и я т а н а получения про­ сеца или максимум на 2 години, ако не се сменя

дукт. Ф и л т ъ р н и я т р о т о р на анализатора
включва 6 ф и л т ъ р а с различна дължина н а
в ъ л н а т а - о т Х = 340 п т д о X= 680 п т .
LOT номера на слайдовете. Осигурен е автома­
тичен качествен контрол с оригинални контрол­
ни серуми в две нива. По предписание на фирма­
та-производител, качественият контрол тряб­
ва да се прави ежеседмично. Оригиналните конт­
роли са о т животински произход.
Цялостната работа на с и с т е м а т а се управ­
лява и следи о т HI-TECH компютър - работна
станция, както по време на работа, а т а к а също
и при профилактика на апарата ежедневно, сед-

1Й10Л01 нчсм
материал

Iii im UftgHWMIM
l' H

Фиг. 34.2. Схема на слайд за потенциометрия

{по материали, на Ortho-Clinical Diagnostics)
I - йонселективна мембрана; I I - рефереитен пласт;
I I I - Ag/AgCl електрод

Анализаторът има висока пропускливост - 250

проби/h. Необходими са 10 я|1 серум, урина, плаз­
ма или ликвор за един показател. Химичните ре­
акции протичат при температура 37 "С. Слайдо­
вете се съхраняват в хладилния модул на апара­
т а , при необходимост се извършва автоматич-
н а
Йилуция (без да се изразходва слайд) и преиз­ ф и г . 34.3. Схема на слайд за спектрофотомеп!-
числяване на резултата. Анализаторът е приго­ рия {по материали на Ortho-Clinical Diagnostics)
ден за непрекъсната р а б о т а (24 часа), режим I - разстилащ слой; II - реактивен пласт; III - полупро­
STAND-BY, рутинна и/или спешна работа. пусклива мембрана; I V - регистриращ пласт; V - н о ­
Анализаторът се калибрира минимум на 6 ме- сещ прозрачен пласт
600
лично, месечно или годишно, което предопределя
ieaoßama изключителна гъвкавост към организа- глицерол — >а-глицерофосфат + ADP
дионно-различни клинични лаборатории. Диалого­ и-глицерофосфат + О., "^"Чгро-лфосфат
у
вият режим с оператора, на базата на най-съв- оксидаза , '
роксиацетон
земенно програмно осигуряване, има за цел опти­ фосфат + Н 2 0 2
мално опростяване на работата, тъй като ра­ Н 2 0 2 + багрило (безцветна форма) ^Ро^идаза ^
ботният лист може да се модифицира според нуж­
багрило (цветна форма)
дите на съответната болница.
= 670 пт)
В паметта на компютъра се съхраняват ре- ( А т а х

1ултатите на 3 000 пациента и 10 000 резулта­ Аф:

та о т провеждания качествен контрол. Вграде- />нитрофенил фосфат — — — р - н и т р о ф е н о л + НзР04
ю т о флопи-дисково устройство позволява архи- 4 0 0 п г п

iupane на неограничен брой резултати, които

( А т а х = )

•федварително могат да бъдат групирани по име ПТ:

ia пациента, или по име на лекуващ лекар, или по у-глутамил-р-нитроанилид + глицилглицин
/7Т
Золнични отделения, по вида на анализа и т.н. р-нитроанилин +
у-глутамил глицилглицин
(Атах =400 пт)
1РИНЦИПИ НА НАЙ-ЧЕСТО
ЛЗСЛЕДВАНИТЕ КАИНИЧНО-ХИМИЧНИ Алиигаза:
_ , амилаза -
багрило-амилопектин — >-захариди-багрило
ЮКАЗАТЕАИ
(Атах = 540 пт)

Калий, н а т р и й и х л о р : ЛДХ:
АДХ
Лзмерва се потенциалната разлика, възник­ пируват + NAD.H2 ->• л а к т а т + NAD
ваща между йон н ат а концентрация в био- (кинетично измерване, Атах - 340 пт)
югичния материал и йонната концентра-
дия на референтния флуид. Във всеки слайд Общ белтък:
На базата на биуретовата реакция, при която
г вградена йон-селективна мембрана. се образува виолетов комплекс между белтъка и
медните йони (Си2 + ) в алкална среда. Измерва се
ХсАТ: АсАТ абсорбцията на цветния комплекс (Атах = 540 пт).
\cnapmam + а - к е т о г л у т а р а т
пиродоксил-5-Р
оксалацетат + глутамат Албумин:
ua iam реакция с бромкрезолгрийн (BCG)
ж с а л а ц е т а т + NAD.H2 - ' > м а л а т + NAD
дехидрогечаза албумин + BCG >• комплекс албумин-ВСО
(кинетично измерване, А тах =340 пт) (цветно съединение)
(Атах =630 пт)
ХлАТ:
аланин + и-кетоглутараггь >• пируват + г л у т а м а т
Глюкоза:
•шруват + NAD.H2 >• л а к т а т + NAD глюкозооксидазна Р е а ^ 1 ^ и я г л ю ^ 0 3 0 0 А с и л о з а
(кинетично измерване, А тах = 340 пт) ß-D-глюкоза + 0 2 + Н 2 0 •
D-глюконова киселина + Н 2 0 2

КК: к к Н 2 0 2 + 4-аминоантипирин +
Creatine phosphate + ADP- > креатин + A I Р 1,7-дихидроксинафтален —— —>-цветен продукт
(Атах =540 пт)
VTP + г ш х х ^ и Ц С р О Л к и ' и 1 > а-глицерофосфат + ADP

. - г л4и » е р о ф о с ф а ш . Г Т ' ^ " ' " и Х и Я ' ю к С и а Ц е т О Н У рея:

^ ^ ^ океидаза фосфат + H202 H 2 NCONH 2 + Н20 - > 2NH3 +со2
пероксиуаза NH3 + специфичен индикатор >. цветен продукт
1 2 0 2 + багрило (безцветна форма) • (Ащах = 670 пт)
багрило (цветна форма)
(Атах = 670 пт)
Креатинин: kpeamunUH w еатин
креатинин т+ iiН2v^ алшнохидролазс
2 0 п^ишхкиаиолазс^

Ш-МВ: а п т и - К К - М антитяло ~ .НО креатин—

<К-ММ + КК-МВ > инхиоиране Саркозин + уреа
креатин +"2" амикахидролаза
на КК-М

;реатин ф о с ф а т + ADP мд с, Mg" ^ к р е а т и н + AI Р

601
 саркозин —>- глицин + • Прецизен качествен контрол;
саркозии + О2 + Н 2 0 оксидаза
формалдехип + • Писка цена на к и т о в е т е за качествен кон­
перокеицача трол;
Н 2 0 2 + багрило (безцветна форма)
багрило ( ц в е т н а форма) • Малки количества биологичен материал -
(Ата* - 6 7 0 П П г ) до 10 л| 1 за показател;
• Трайност на слайдовете - минимум 1 го-
Холсстсрол: дина;
липопротеин ТХИЮ—>холестерол + холестеролови
естери + протеин
• Наличие на вграден хладилен модул;
_ холсстерол • Ц е н а т а на едно изследване се формира о т
холестеролови е с т е р и + Н 2 0 хи,,роЛаза> холестерол +
м а с т н и киселини 1 брой слайд и 1 брой връхче на п и п е т а ;
холестерол + 0л 2
холестерол^> х
холестенон + Н
,~ • Снижаване риска о т зараза на обслужва­
окгш/а:ш 202
щия персонал;
, . пероксидаза
Н 2 0 2 + багрило (безцветна форма) >• • Екологично ч и с т а технология.
багрило ( ц в е т н а форма)
(Лтп_г = 540 пгп) Н е д о с т а т ъ ц и:
• Висока цена на биохимичния анализатор;
Тригл и цсрид и:
• Абсолютно затворена с и с т е м а на рабо­
Липопротеини
^ сърфт—:
а кma иni^-триглицериаи
Г
^ 0 + п гр о т е и н и та;
липаза
триглицерияи + Н 2 0 ^глицерол + м а с т н и киселини • Но-висока цена на един анализ, спрямо
глицеролкии/гза конвенционалните методи.
глицерол + АТР ^ " ^ 7 — • L - а - г л и ц е р о л ф о с ф а т + ADP
„ а -глицеролфосфа т
а-глицеролфосфат + 0 2 оксидаза Други клинично-химични анализатори на
дихидроксиацетон ф о с ф а т + И 2 02 принципа на сухата х и м и я са два т и п а :
тт^
Н 0
^ _
+ багрило (безцветна форма)
, . перокеиоаза >•
2 2 1. О т ч и т а т п о л у ч е н и я п р о д у к т чрез
багрило ( ц в е т н а ()юрма) р е ф л е к т р о м е т ри я :
(Л тах = 540 п т ) - ReOotron - Roche;
- Cobas Ready - Roche;
Калций:
- Seralyzer - Ames.
Са 2+ + арсеназоШ ->.цветен комплекс
рИ5. в (Am(LX =680 пт)
2. О т ч и т а т п о л у ч е н и л п р о д у к т чрез
Фосфор: ф л уорееценци я :
неорганичен ф о с ф а т + амониев м о л и б д а т - - Stratus - Dade Behring;
амониев фосфомолибдатен комплекс
- Opus - Dade Behring.
амониеб Д|пга,пмпл„г;пдтД., Р ^п.ила^.шшфсшл ^
комплекс сулфат Тези анализатори и м а т малък работен
хетерополимолибдат
к а п а ц и т е т (35-70 проби на час) и са подхо­
(А т а х = 680 п т ) дящи за по-малки и ч а с т н и лаборатории. Ос­
н о в н и я т н е д о с т а т ъ к е ви сока та цена на
Калибрационните криВи се интерполи- анализа.
р а т а в т о м а т и ч н о и се съхраняват в про-
дължение на 6 месеца, а при един и същ ЛОТ-
номер me се з а п а з в а т до 18 месеца.

Предимства:
• Много добра аналитична надеждност на
резултатите;
• Изключително лесно и ч и с т о обслужване;
• Стабилна и дълготрайна калибрация;
• Ниска цена на калибраторните китове;
602
ш л я п о в а Б. Н а ш и я т о п и т о т и з п и т а н и е т о н а к л и н и ч н о - х и -
м и ч с н а н а л и з а т о р E k t a c h e m 250. С и м п о з и у м - Н о в и тех­
н о л о г и и в к л и н и ч н а т а л а б о р а т о р и я . С , 15 м а й 1996.
rgi W, Briner М , A u m e r 13. Dry c h e m i s t r y in the clinical labo­
ratory: h o w reliable is it? S c h w e i z M e d Wochenschr. 122,
1992, 5 1 - 5 2 .
l o m b o P. D r y c h e m i s t r y o f r e a g e n t s t r i p s . S c h w e i z M e d
W o c h e n s c h r , 117, 1987, 2 2 , 8 3 3 - 4 0 .
.hlianova B, P a l a v e e v a M . D j a n a m o v a M . U s i n g the E k t a c h e m
2 5 0 analyzer for an e m e r g e n c y analyses. 6lh M e e t i n g o f the
Balkan Clinical Federation, Plovdiv, Bulgaria, 8-10
O c t o b e r 1998, A b s t r a c t - Balkan J Clin Lab, 5, 1998, 2, 4 5
hlianova B. P a l a v e e v a M , D j a n a m o v a M. A n assay for lipase
using the E k t a c h e m dry slide method. IFCC-WordLab, Firenze,
Italy, 6-11 J u n e 1999, A b s t r a c t R e s u m e H 157.
"kenscheid J C , v a n d e r V e n - J o n g e k r i j g J. T w o dry reagent
systems e v a l u a t e d for d e t e r m i n a t i o n s o f e n z y m e activities.
Clin C h e m , 34, 1988, 1, 155-157.
Keller H. Analysis with solid phase reagent carriers. M e d Prog
Technol, 13, 1987, 1, 5-19.
Kulpmann W R , Maibaum P, Sonntag O , Schumann G , Siekmann
L. Analyses with the K O D A K - E k t a c h e m . Accuracy control
using reference method values and the influence o f protein
concentration. Part 11. Substrates. J Clin C h e m Clin Biochem,
28, 1990, 1, 835-43.
Peters H . C o m p a r i s o n o f t w o solid phase chemistry systems:
Reflotron and Ektachem D T 60. Clin C h e m Clin Biochem,
25, 1987, 11, 811-21.
R o m e r M, Ilaeckel R, Henco A, Vogt M , T h o m a s L, Keller H E ,
Appel W. A multicentre evaluation o f the Ektachem DT60-,
Reflotron- and Seralyzer 111 systems. E u r J Clin C h e m Clin
Biochem, 3 0 , 1992, 9, 547-583.
S o n n t a g O. Dry chemistry. Analysis with carrier-bound reagents.
Elsevier- A m s t e r d a m - L o n d o n - N e w York-Tokio, 1993, 623.
603
 Аналитични принципи
п р и определяне
н а хормони
А. Цончева
Хормоните са биологично активни химичес­
ки съединения, които са с разнородна химич­
на с т р у к т у р а , н а м и р а т се 6 много ниски
концентрации в биологичните т е ч н о с т и и
и м а т к р а т ъ к полуживот. Тези им свойст­
ва з а т р у д н я в а т т я х н о т о количествено оп­
ределяне и изискват специализирана техно­
логия и апаратура. По т а з и причина х о р -
м о н а л л и м т а н а л и з с с п р и е м а з а спе­
циализирано изследване в клинична­
т а xujxiuji. В исторически план изследва­
н е т о на хормоните започва с е р а т а на при­
лагане на биологични методи за пептидни-
т е и белтъчни хормони и химични м е т о д и
за групово специфични химични реакции за
някои стероиди. С въвеждането на беляза­
ния имунохимичен анализ се създава възмож­
н о с т за количествено определяне на всички
видове биологично активни вещества. В гл.
13 при разглеждане на принципите за беля­
зан имунохимичен анализ са описани т е х ­
нологиите, к о и т о се използват в имунохи-
мичните анализатори - модулни и а в т о м а ­
тични. В таблици 35.1 - 35.5 са посочени са­
мо съвременните методи за анализ, преце­
нени на б а з а т а на висока аналитична на­
деждност. За улеснение са използвани след­
н и т е съкращения:
РИА - радиоимунологичен анализ
ЕИА - ензимно белязан имуноанализ
ФА - флуоресцентен анализ
ФИА - флуориметричен имунохимичен
анализ (индиректен и директен)
604
ФПИА - флуоресцентно поляризационе!
имуноанализ
ХАИА - хемилуминесцентен имунохими
чен анализ (индиректен и дирек
тен)
ЕХЛИА- електрохемилуминесцентен иму
ноанализ
ГХА - газовохроматографски анализ
МСА - масспектроскопски анализ
ВЕТХ - високоефективна т е ч н а хроматог
рафия.
Таблиците п р е д с т а в я т м е т о д и т е за on
ределяне на най-често използваните хормо­
ни в клиничната п р а к т и к а , подредени пс
групи според т ъ к а н и т е , к о и т о ги секрети-
р а т . Р е ф е р е н т н и т е с т о й н о с т и на всички
хормони са зависими о т м е т о д а на изслед­
ване. Посочени са ориентировъчни данни н£
б а з а т а на л и т е р а т у р н и източници. Всяке
л а б о р а т о р и я си прави свои референтни
с т о й н о с т и в зависимост о т анализа.
Всички хормони се изследват след прек­
р а т я в а н е на а н т и б и о т и ч н а терапия, хор-
моно-заместителна терапия, в серум без хе-
молиза и липемия. При изследване на käme-
холамини в урина се п ре кра тява всякаква
т е р а п и я и приемане на бог ати на незаме­
ними аминокиселини храни.
 r a t K i u u a 35.1. Аналитични метори за определяне на хипоталамични ч хипофизни хормони
Показател Биологичен Ориентировъчни Метод Забележка
материа.\ референтни стойноети
Соматостатин* п.\азма < 10 pmol/1 на гладно • РИА по назначение о т лекар

АКТХ * п.\азма 2 - 1 1 pmol/1 • РИА да се избягва к о н т а к т със стъклени съдове.

• ХЛИА Силиконизирани ЕДТА епруветки, в ледена баня.
Веднага се отделя плазмата и се съхранява на -200С

Адиуретичен хормон плазма 1.85-11.1 pmol/1 • РИА ЕДТА - епруветки в лед. Центрофугиране в хла­
(вазопресин) * при > 290 mosm/kg дилна центрофуга; до 2 h замразяване при -700С

фоликулостимули- серум мъже: < 8 г. I,4-5,9 IU/1 • X.UIA серум в определен период о т цикъла;
ращ хормон (ФСХ) * плазма 8-12 г. 3.6-5.0 IU/1 • ФИА съхранение при -20оС;
/хепарин/ 12-14г. 6.3-9.0 IU/1 • ФПИА фазово излъчване
14-18г. 9.0-13.5 IU/1 • EXiUlA
възр. 2,25-20,0 Ш/1
жени: <8г 2.7-6.8 IU/1
8-12г. 5.4-10.8 IU/1
12-14г. 7.7-12.6 IU/1
14-18г. 9.9-13.5 IU/1
възрастни:
фолик.фаза 5,0-24,0 IU/1
овулат.пик II,7-108 IU/1
менопауза 50-300 IU/1
Лутеинизиращ серум мъже: до 8 г. 9-10.8 IU/1 • ХЛИА Серум се взема в зависимост о т цикъла при жени;
хормон (ЛХ)' 8-12 г. 12,6-15.3 IU/1 • ФИА замразява се при -200С; флуктуиращо излъчване
12-14 г. 13,5-15,3 Ш/1 • ФПИА
14-20 г. 14.4-16.2 Ш/1 • ЕХЛИА
възрастни 3,6-17,1 IU/1
жени: до 8 г. 6,3-8.1 IU/1
8-12 г. 8,0-12,6 IU/1
12-14 г. 8,0-11,7 IU/1
14-16 г. 13.5-17,1 IU/1
16-20 г. 15,3-27,0 IU/1
фолик.фаза 4,5-24,3 IU/1
овул.пик 38-142 Ш/1
менопауза 29-189 IU/1
Растежен хормон* серум деца: < 460 pmol/1 • ХЛИА съхранява се при -200С
на гладно възрастни: < 230 pmol/1 • РИА
Пролактин* серум мъже < 0.7 nmol/1 • ХЛИА серум се взема сутрин 2 часа след ставане о т сън;
жени < 0.9 nmol/1 • ФИА жени - до 10 ден о т началото на цикъла; съхранение
• ФПИА при -200С;
• ЕХЛИА флуктуиращо излъчване

Тиреостимулиращ серум 0,5 - 5.5 mIU/1 • ХЛИА сутрин, без кафе и медикаменти;
хормон** (TCX) • ФИА съхранение при -200С
• ФПИА ч у в с т в и т е л н о с т на м е т о д а - не по-малка
• ЕХЛИА о т 0.01 mIU/1
* Лекарствено повлияване: повишение - фенотиазини, антидепресанти, мепробамат, халоперидол, резерпин, алфа-метил ДОПА, анфетамини, изониазиди; понижение - бромокриптин,
as допаминергични медикаменти.
g ** Повлияване о т хормонотерапия и антибиотична терапия.
g Т а б л и ц а 35.2. А н а л и т и ч н и м е т о д и з а определяне н а х о р м о н и т е н а щ и т о в и д н а т а ж л е з а ( т и р е о и д е я ) и н а п а р а т и р е о и д н а т а жлеза
Показател Биол огиче н Ориентировъчни Метод Забележка
материал референтни стойности
Тироксин * серум 64,4-154,4 nmol/1 • Х.\ИА на гладно;
(Т4) • ФИА съхранение при -200С
• ФПИА
• ЕИА
•ЕХЛИА

Трийодтиронин * серум 1,4-2,6 nmol/1 • Х^\ИА съхранение при -200С

(ТЗ) • ФИА
• ФПИА
• ЕИА
•ЕХЛИА

Свободен Т4 * серум 12-26 pmol/1 • ХЛИА съхранение при -200С

(ГГ4) • ФИА
• ФПИА
•ЕХЛИА

Свободен ТЗ * серум 3-8 pmol/1 • ХЛИА съхранение при -200С

(ГГЗ) • ФИА
• ФПИА
•ЕХЛИА

Калцитонин серум мъже 0.88-7.6 pmol/1 • ХЛИА на гладно, нелипемичен серум;

жени 0.58-5.0 pmol/1 • РИЛ веднага замразен при -20ÜC

Паратхормон серум 1-6 pmol/1 • ХЛИА съхранение при -200С

• РИЛ
* Лекарствена интерференция; повишение - пропранолол, карбамазепин, симетидин, литиеви соли, антибиотици и др.; понижение - андрогени, кортикоиди,
допамин и др. Някои а н т и т е л а също променят концентрациите.
 ^
Показател Биологичен Ориентировъчни Метод Забележка
материал р е ф е р е н т ии с т о й н о с т и

НАД БЪБРЕЧНА КОРА

Кортизол серум с у т р и н 8 ч. 80-550 nmol/1 • ХА ИA бързо о т д е л я н е на серум; съхранение
вечер 16 ч. 70-280 nmol/1 • ЕИА при - 200С

Свободен урина 90 - 320 nmol/24 h • ФА правилно събиране на диуреза, съхранение на

кортизол 24-часова диуреза • ИЕА хладно без консервант; след филтруване
• ХА ИА при -200С

Алдостерон плазма с у т р и н - 83-250 pmol/1 • РИА нива при бременни - т р и до ч е т и р и п ъ т и по-

на гладно високи; съхранение при -200С

НАДБЪБРЕЧНА МЕДУАА
Катехоламини;

Адреналин серум < 0.27 nmol/1 • ВЕТХ венепункция след 2 h покой, бързо отделяне
на серум и обезбелтъчаване с перхлорна
киселина
урина о т 24 h 5,0-109 nmol/24 h • ФА събиране на диуреза с консервант 6 п HCl < 25 ml
• ВЕТХ в т ъ м е н съд на хладно, без медикация

Норадреналин серум 0.65-3.89 nmol/1 • ВЕТХ к а т о адреналин;

урина о т 24 h 59-389 nmol/24 h • ФА диуреза с консервант 6 п HCl

Допамин серум < 0.065 nmol/1 • ВЕТХ к а т о адреналин; диуреза с консервант 6 п HCl
урина 420-2620 nmol/24 h • ФА

Ванилбадемова урина 11,8-41,2 nmol/24 h • ФА урина се събира к а к т о за о с т а н а л и т е КА

киселина 24 h диуреза • ВЕТХ

5-хидрокси-индоло- урина 13.1-52.3 ц то1/24 h • ВЕТХ събиране с консервант 6 п HCl

ц е т н а киселина 4 h диуреза • колорим.

сг>
о
-J
Т а б л и ц а 35.4. А н а л и т и ч н и м е т о д и з а определяне н а р е п р о д у к т и в н и хормони
Показател Биол огиче н Ориентировъчни Метод Забележка
материал референтни стойности

Естрадиол серум мъже; предпубертет < 37 pmol/1 • Xi\MA серум се взема на с ъ о т в е т н и т е дни о т цикъла
12-15 г. < 84 pmol/1 • ФПИА при жени;
> 16 г. 73-184 pmol/1 • ФИА съхранение при -20оС
жени: < 8 г. < 26 pmol/1 • ЕИА
8-12 г. 29-66 pmol/1
12-14 г. 58-125 pmol/1
14-16 г. 75-250 pmol/1
ранна фоликулна фаза 73-367 pmol/1
(4-6 ден на цикъла)
преовулаторна фаза 367-1285 pmol/1
(12-14 ден на цикъла)
менопауза 37-110 pmol/1

Прогестерон серум мъже: 0,8*4,88 nmol/1 • XiUlA съхранение при -200С

жени: фоликулна фаза 1-3 nmol/1 • ФИА
(4-6 ден на цикъла)
лутеална фаза 13-64 nmol/1
(22-24 ден на цикъла )
менопауза 0,0-3,0 nmol/1

Тестостерон серум мъже: предпубертет 0.28-0.49 nmol/1 • ХАИА съхранение при -200С
тотален пубертет 2.91-6.24 nmol/1 • ФИА
възрастни 10.4-34.4 nmol/1
жени: предпубертет 0.17-0.45 nmol/1
пубертет 0.31-0.83 nmol/1
възрастни 1.04-2.43 nmol/1

Тестостерон серум мъже: 174-902 pmol/1 • XiMAA съхранение при -200С

свободен жени: 10.4-45.1 pmol/1

Човешки хорион серум само при бременност ш и трофобластни • XiVHA съхранение при -200С
гонадотропин болести: > 100 mIU/1 • ФИА

Дехидроепи- серум мъже: 5.6-27.8 nmol/1 • ФИА съхранение при -200С

андростерон жени: 5.6-27.8 nmol/1 • ЕИА
(DEA) менопауза 1.05-15.6 nmol/1 • РИА
• ХАИА
• ГХА
• МСА
 Т а б л и ц а 35.4. ( п р о д ъ л ж е н и е )
Показател Биологичен Ориентировъчни Метод Забележка
материал рефсрентни с т о й н о с т и

Дехидроепи- серум мъже: 14-50 г. 3.0-18.7 цто1/1 • ФИА серум на гладно;

андростерон - над 50 г. 1.1-9.0 |лто1/1 • ЕИА съхранение при -20оС
сулфат жени: 14-50 г. 2.2-9.2 цто1/1 • РИА
(DEA-S) менопауза 0.5-2.1 цто1/1 • ГХА
• МСА

Андростендион серум мъже: 14 г. 2.0-8.0 nmol/1 • РИА съхранение при -20оС

жени: 14 г. 2.8-8.0 nmol/1 • ГХА
менопауза 1.0-2.8 nmol/1 • МСА

17-хидрокси- серум мъже: <6.0 nmol/1 • ФИА серум на гладно;

прогестерон жени: фоликулна фаза <3.0 шпо1/1 • ЕИА съхранение при -200С
менопауза < 2.1 nmol/1 • РИА
• ГХА
• МСА

Т а б л и ц а 35.5. А н а л и т и ч н и м е т о д а з а о п р е д е л я н е н а п а н к р е а т и ч н и х о р м о н и и р е н и н
Показател Биологичен Ориентировъчни Метод Забележка
материал референтни с т о й н о с т и

Инсулин серум на гладно: 34-172 pmol/1 • ХЛИА Центрофугиране серума на студено;

• ЕИА съхранение при -20оС
• РИА

Глюкагон плазма 14-57 pmol/1 • РИА вж. инсулин

Ренин плазма при нормална натриева д и е т а • РИА събиране в студени епруветки;

8:00 (75-150 mmol/d) • ХЛИА замразяване до 15 min
0.2-2.3 ng/1/s

КНИГОПИС

Цветкова Т (ред). К л и н и ч н о - л а б о р а т о р н и резултати. II ч а с т П л о в д и в , В М И , 1997,360-392.

Greenspan FS, Strewler GJ (eds). Basic and clinical endocrinology. (5th ed), Stanford, Connecticut, 1997.

Marshall N, Brook C h (eds). Essential endocrinology (3rd ed). Blackwell Science Ltd, 1996.

§ Marshall WJ, Bangert S K (eds). Clinical biochemistry, USA, Churchill Livingstone, 1995
 Аналитични принципи
при определяне п о к а з а т е л и т е ,
характеризиращи
съединителната тъкан
II. Д ук о в а -Пенева
Съединителната т ъ к а н доскоро беше недос­
т ъ п н а за м е т о д и т е на клинично-лабора-
т о р н а т а диагностика. Екстрацелуларният
матрикс, к о й т о осигурява и н т е г р и т е т а и
здравината на о т д е л н и т е органи, експре­
с и я т а на фенотипа и съставлява значител­
на ч а с т о т с т р у к т у р а т а на ж и в и т е орга­
низми беше о б е к т предимно на морфологич­
н а т а диагностика. Запълването на т а з и
празнота започна едва през последните де­
сетилетия, к о г а т о бяха въведени м е т о д и
за изследване на б и о х и л г и ч н и м а р к е р и
н а с ъ е д и н и т е л н а т а т ъ к а н . Значител­
но развитие т о в а направление придоби в из­
следването на к о с т н а т а обмяна. Създадо­
ха се предпоставки за подобряване диагнос­
т и к а т а на к о с т н и т е м е т а б о л и т н и заболя­
вания и остеопорозата, к о я т о по с в о е т о
медико-социално значение се п о с т а в я о т
СЗО на в т о р о м я с т о след сърдечно-съдови-
т е заболявания. Наред със с р е д с т в а т а на
образната и хистоморфологичната диаг­
ностика се въведоха лабораторни показате­
ли, които са а т р а в м а т и ч н и , лесни за изпъл­
нение и с ниска себестойност. Това значи­
телно подобри възможностите за ранна ди­
агностика, правилно т е р а п е в т и ч н о реше­
ние и контрол на е ф е к т а о т лечението. Съз­
дадоха се и предпоставки за своевременна
и адекватна профилактика чрез м е т о д и т е
на лабораторния скрининг. Чрез биохимич­
н и т е маркери може да се получи информа­
ция за а к т и в н о с т т а на всеки един о т про­
цесите на к о с т н о т о преструктуриране -
костно форлгиране и к о с т н а резорб­
ция.
610
МАРКЕРИ
НЛ КОСТНОТО ОБРАЗУВАНЕ
Остеокалцин
Остеокалцинът, наричан оше „костен г л у -
т а м а т е н п р о т е и н " е ниско молекулен
белтък (5 kD) изграден о т 49 аминокисели­
ни. Той съставлява 1-2% о т белтъчното съ­
държание на к о с т и т е и е основният неко-
лагенов белтък в органичния им матрикс.
На 17, 21 и 24 м я с т о в молекулата му са раз­
положени о с т а т ъ ц и о т глутаминова кисе­
лина, к о и т о посттранслационно се карбок-
силират под д е й с т в и е т о на в и т . К go кар-
боксиглутаминови о с т а т ъ ц и . С ъ ш и т е
и м а т висок а ф и н и т е т към калциевите йо­
ни и в ч а с т н о с т към хидроксиапатита. По­
ради т о в а се с ч и т а , че о с т е о к а л ц и н ъ т
и м а решаващозначение за лшнерали-
з а ц ш т г а н а о с т е о и д а , макар че физио­
логичната му роля е все още н е д о с т а т ъ ч н о
проучена. Синтезира се о т о с т е о б л а с т и т е
и в много по-малка с т е п е н о т одонтоблас-
т и т е , к а т о малка ч а с т о т новосинтезира-
н и т е молекули п о с т ъ п в а т в кръвообрагце-
нието. Синтезата на остеокалцина се ре­
гулира от калцшприола директно на ниво
транскрибция. С е р у м н и т е н и в а о т р а ­
зяват интензивността на костния
облген и в ч а с т н о с т н а к о с т н о т о об­
р а з у в а н е , к а т о особено в и с о к и стой­
ности се наблюдават п р и смущения
в к о с т н а т а м и н е р а л и з а ц и я . Серумни­
т е концентрации п о к а з в а т висока корела­
ция с хистоморфометричните данни за кос­
т н о образуване, физиологично покачване на
н и в а т а в серума н а с т ъ п в а по време на рас­
т е ж а . Патологично повишаване на стой­
н о с т и т е се наблюдава при редица състоя­
ния с усилване на к о с т н и я обмен к а т о хи-
пертиреоидизъм, хиперпаратиреоидизъм.
)лест naJBaffet и акромегадщь В серума се
 т а н о б я б а т равни ч а с т и о т следните
и р и и-мунореактивни варианта н а
гтеокалцина: и н т а к т н а м о л е к у л а ,
х с к о - м о л е к у л н и ф р а г м е н т и и N mep-
и н ш е н фрагльент, в к л ю ч в а щ цент-
г - ш а т а част н а молекулата.
етоди
ш е р в а н е т о н а с е р у м н и т е концентраиии
извършва с п о м о щ т а н а конкурентни и
^конкурентни ^адиоимунологични (РИА) u
[зимоимунологични (ЕИА) анализи. При ня-
•и о т м е т о д и к и т е за определяне се изпол-
а т и а н т и т е л а срещу говежди остеокал-
ш поради п ъ л н а т а хомоложност между чо-
•шкия и говеждия остеокалцин, особено в
» л а с т т а 20-49 аминокиселина. Използват
; поликлонални и моноклонални а н т и т е л а ,
лзработени са и неконкурентни (сандвичев
ип) м е т о д и с а н т и т е л а към човешкия ос-
еокалцин, към с и н т е т и ч е н аналог на чо-
!шкия остеокалиин, к а к т о и към и н т а к -
н а т а молекула н а човешкия остеокалиин.
ь щ е с т в е н проблем е н е с р а в н и м о с т т а на
» з у л т а т и т е получени с различните м е т о -
1 поради различия в т я х н а т а спещлфич-
з с т и ч у в с т в и т е л н о с т . Използват се раз-
1чни калибратори, различни антигенни де-
е р м и н а н т и при п р и г о т в я н е т о на а н т и -
з р у м и т е и различни а к т и в а т о р и (Са и
ЦТА), к о и т о повлияват т р е т и ч н а т а струк-
,ура и с ъ о т в е т н о и м е н н а т а р е а к т и в н о с т
а остеокалииновата молекула. Кръстосана-
.а р е а к т и в н о с т и различията в т и п а на иму-
з р е а к т и в н и т е фрагменти при здрави и при
нкои болестни състояния, к а т о например
ьбречната н е д о с т а т ъ ч н о с т , променят ин-
о р м а т и в н а т а с т о й н о с т н а показателя,
с и л и я т а п о н а с т о я щ е м с а насочени към
пандартизиране на анализите.
о с т е н изоензим
а а л к а л н а т а ф о с ф а т а з а (кАФ)
зоензимите н а а л к а л н а т а фосфатаза в кос
ш т е , черния дроб, бъбреиите и плаиента-
ia се к о д и р а т о т един генетичен локус, но
з р а з л и ч а в а т помежду си по с т е п е н т а на
о с т т р а н с л а и и о н н о гликозилиране. В серу
а на здрави в ъ з р а с т н и около 50% о т серум
а т а а к т и в н о с т на АФ е о т к о с т е н произ
ход. К о с т н а т а Аф произхожда о т остеоб-
л а с т и т е и е п о к а з а т е л з а т я х н а т а ак­
тивност, р е с п е к т и в н о з а костното
о б р а з у в а н е и по-точно з а к о с т н а т а
минерализация.
Методи
Техниките за диференциране на кАФ - елек­
трофореза, топлинна инактавация, лекти-
нова преципитация, инактивиране с фени-
л а л а н и н и урея - се б а з и р а т на различията
във физико-химичните свойства на изоензи-
м а и са с ниска специфичност. Освен т о в а
са трудоемки и с неприемлива възпроизво-
димост.
Разработените в последните години иму­
нологични техники са със значително по-доб­
ра специфичност и аналитична надеждност.
Използват се моноклонални а н т и т е л а . Раз­
работени са ЕИА и РИА методи, насочени
към определяне на белтъчния компонент на
ензима или неговата ензимна а к т и в н о с т .
Дори и при т я х обаче, поради високата си
хомоложност, чернодробният изоензим по­
казва кръстосана р е а к т и в н о с т в рамките
на 10-20 % за различните методи. Поради
т о в а при значително повишение на чернод­
робната АФ се установява фалшиво завиша-
ване на кАФ.
Повишаване на кАФ настъпва прихипер-
тиреоза, хиперпаратиреоза, остеомалация,
болест на Paget, ренална остеодастрофия,
остеопороза, остеосаркома и костни метас-
тази.
О б щ а т а а к т и в н о с т на АФ е с ниска ди­
агностична ч у в с т в и т е л н о с т и специфич­
ност.
Колагенови п р о п е п т и д и
К о л а г е н т и п / съставлява 90% о т орга­
ничния к о с т е н матрикс. Намира се също,
м а к а р и в много малки количества в кожа­
т а , дентина, корнеата, съдовата с т е н а ,
хрущялите и сухожилията. Синтезира се о т
о с т е о б л а с т и т е к а т о проколаген (фиг. 36.1).
Колаген т и п I притежава централна, трой­
но спирална ч а с т и два глобулерни участъ­
ка, разположени съотвено в N- и С-терми-
налния край, к о и т о за разлика о т централ­
н а т а ч а с т са силно имуногенни. Екстраце-
луларно д в а т а глобулерни пропептида се
о т ц е п в а т о т централната ч а с т u постъп­
в а т в ц и р к у л а ц и я т а в с т е х и о м е т р и ч н и ко­
личества н а н о в о с и н т е з и р а н и т е колагено-
ви молекули. Поради т о в а се с ч и т а , че сс-
рулиттс концентрации отразяват
с а м и я процес н а костно образуване, а
н е н а к о с т н а т а м и н е р а л и з а ц и я . . Ма­
кар да се с и н т е з и р а т в преобладаващото си
количество в о с т е о и д а , п р о п е п т и д и т е
н а к о л а г е н / се о т д е л я т още о т съедини­
т е л н а т а т ъ к а н на к о ж а т а , мускулите и
т . н . , поради к о е т о не са абсолютно специ­
фични по о т н о ш е н и е н а к о с т т а . Елимини­
р а т се о т кръвообращението през чернод­
робния ендотел, к о е т о също може да пов­
лияе с е р у м н и т е концентрации. Друг недос­
т а т ъ к на т е з и маркери е к р а т к и я т им по-
л у ж и в о т в ц и р к у л а ц и я т а (6-8 мин).
P1NP к о л а т ю в а молекула PICP
Фиг. 36.1. Строеж на проколагена u на хидроли-
тично отцепващите се N-терминален пропеп-
mug (PINP) и С-терминален пропептид (PICP)
Изследването им се препоръчва при вроде­
ни д е ф е к т и в колагеновия с и н т е з и при кон­
тролиране влиянието на д ъ л г о т р а й н а т а
к о р т и к о с т е р о и д н а т е р а п и я върху к о с т н а ­
т а обмяна.
Методи
Разработени са имунологични м е т о д и з а оп­
ределяне и н а д в а т а п р о п е п т и д а . Р е з у л т а ­
т и т е обаче не д а в а т сходни р е з у л т а т и ве­
р о я т н о поради р а з л и ч и я т а в т я х н а т а иму-
нореактивност.
МАРКЕРИ НА КОСТНАТА РЕЗОРБЦИЯ
Приблизително п о л о в и н а т а о т колагена в
човешкия организъм се н а м и р а в к о с т и т е ,
к ъ д е т о о б м я н а т а му е най-интензивна. По­
ради т о в а се с ч и т а , че м а р к е р и т е з а разг­
раждане н а колагена, о т д е л я щ и се в кръво­
обращението и о т т а м в у р и н а т а о т р а з я ­
в а т предимно о б м я н а т а в к о с т и т е .
612
Х и д р о к с и п р о л и п (ОН п р о )
С ъ с т а в л я в а около 13% о т аминокиселинни
с ъ с т а в н а колагена. Образува се в резултас
н а посттранслационното хидроксилиран
на пролиновите остатъци с помощта на ас
корбиновата киселина. У ч а с т в а в укрепва *
н е т о н а к о л а г е н о в а т а с т р у к т у р а с помощ
т а н а водородни връзки. Д е в е т д е с е т процен
т а о т хидроксипролина, о т д е л е н при разг
раждане н а колагена се метаболизира в чер
пия дроб, а 10% се о т д е л я с у р и н а т а . Д е в е т
д е с е т п р о ц е н т а о т о т д е л е н и я с ypunamt
ОН-про е п е п т и д н о свързан, к о е т о налаг?
предварителна хидролиза н а пробите. Извее
т н о количество о т е к с к р е т и р а н и я OH-npi
се о т д е л я о т п р о п е п т и д и т е при колагено
в а т а с и н т е з а , с по-значително покачване т
с т о й н о с т и т е при фибротични процеси. Ек-
с к р е ц и я т а н а ОН-про се повлиява о т съдър­
ж а н и е т о н а колаген в х р а н а т а . Поради
с т р у к т у р н а т а аналогия между колагена i
C l q с ъ с т а в к а т а н а комплемента, повишава­
не н а о т д е л е н и я с у р и н а т а ОН-про се наб­
людава и при в ъ з п а л и т е л н и заболявания.
Всичко т о в а значително понижава диагнос­
т и ч н а т а специфичност н а т о з и показател.
Методи
П р е д л а г а т се два т и п а м е т о д и з а определя­
не н а ОН-про.
1. Високо е ф е к т и в н а т е ч н о с т н а хроматог-
рафия (ВЕТХ) с о б р а т н а фаза. М е т о д ъ т
и м а висока специфичност, но е обременен
със с ъ о т в е т н а т а н а т е з и т е х н и к и тру­
доемкост.
2. Колориметрични - след окисление н а ОН-
про-остатъци до пироли се извършва
ц в е т н а реакция с р е а к т и в а н а Ерлих. Спе­
ц и ф и ч н о с т т а н а р е а к ц и я т а се повишава
чрез е к с т р а к ц и я или йонообменна хрома-
тография.
ХидроксилизшюВи гликозиди
С и н т е з и р а т се в к о л а г е н о в а т а молекула
чрез п о с т т р а н с л а ц и о н н о гликозилиране и се
н а м и р а т под ф о р м а т а н а глюкозилгалакто-
зилхидроксилизин и галактозилхидрокаии-
зин. Последният е по-специфичен за колаген
mun I, koümo се о т к р и в а предимно в к о с т ­
н а т а т ъ к а н . Предимство по отношение на
с п е ц и ф и ч н о с т т а представлява факта, че не
се о т к р и в а т в проколагеновите пропепти-
ди и не се о т д е л я т при процесите на к о с т ­
н о т о образуване. Не се повлияват о т дие­
т а т а , не п о д л е ж а т на п о - н а т а т ъ ш н и ме-
т а б о л и т н и промени и се излъчват непроме­
нени с у р и н а т а .
Memocju
Разработени с а м е т о д и за определяне чрез
ВЕТХ с флуориметрично о т ч и т а н е след съ­
о т в е т н о дериватизиране. Предварителна
хидролиза не се налага, т ъ й к а т о се намира
под ф о р м а т а на свободен аминокиселинен
гликозид. К о л и ч е с т в а т а са в микромоларния
о б х в а т и поради т о в а не е необходимо пред­
в а р и т е л н о к о н ц е н т р и р а н е на п р о б и т е .
К а т о н е у д о б с т в о за използването на т о з и
маркер се и з т ъ к в а л и п с а т а на подходяш,
имунологичен м е т о д за определяне.
ПирицшюИи npoujBocjiiu
Пиридинолинът (ПД) и деоксипиридиноли-
нът (ДПД)са два т и п а ковалентни връзки в
зрелия колаген. Образуват се в екстрацелу-
ларния м а т р и к с чрез кондензация на т р и
хидроксилизинови о с т а т ъ к а , респ. два хид-
роксилизинови и един лизинов о с т а т ъ к при
ДПД. О с ъ щ е с т в я в а т с в ъ р з в а н е т о на N-,
респ. С - т е л о п е п т и д н и я у ч а с т ъ к на една ко-
лагенова молекула със спиралния участък на
с ъ с е д н а т а колагенова молекула и по т о з и на­
чин осигуряват з д р а в и н а т а на колагеновия
полимер (фиг. 36.2). В циркулацията постъп­
в а т вследствие разграждането на колагена.
Тъй к а т о о т н о с и т е л н о т о съдържание на
ДПД в к о с т и т е е най-високо спрямо о с т а ­
н а л и т е т ъ к а н и и с ъ о т в е т с т в а количест­
вено на е к с к р е т и р а н о т о в у р и н а т а , се счи­
т а че о т у с л л н ш т г с у р и н а т а Д П Д о т ­
р а з я в ап р е д и м н о к о с т н а т а резорбция.
В потвърждение на т о в а се изтъква и фак­
т а , че о б м я н а т а в к о с т и т е е значително
по-интензивна о т д р у г и т е тъкани, к о и т о
с ъ д ъ р ж а т малки количества колаген I - хру
щял и сухожилия. ДПД не се открива в кожа­
т а и в Clq с ъ с т а в к а т а на комплемента. Не
постъпва в циркулацията при процесите на
к о с т н о образуване и о т п р и е т а т а храна.
Всичко т о в а обуславя значително по-добра­
т а специфичност на ДПД по отношение на
к о с т н а т а резорбция. Около 40-50% о т екск-
ретираните в урината пиридинови произ­
водни са пептидно свързани, а останалите
са в свободна форма.
СИИМ >• ГГТУП
Фиг. 36.2. Схема на пиридинов пръстен свърз­
ващ две телопептидни вериги с една спирална
верига о т съседни колагенови молекули
Методи
Първоначално за определянето им се изпол­
з в а т м е т о д и т е на ВЕТХ след хидролиза и
след предварително фракциониране върху
целулоза. При о т ч и т а н е т о се използва ес­
т е с т в е н а т а флуоресценция на пиридинови-
т е производни. Хидролизата е необходима
за освобождаване на пептидно свързаните
форми. ПД се о т д е л я т о т ДПД чрез изократ-
на или градиентна хроматография. Мето­
д ъ т е специфичен и със сравнително добра
чувствителност, но е трудоемък и с недоб­
ра възпроизводимост.
Впоследствие са създадени и имунологич­
ни анализи за определяне на свободни ПД и
ДПД, първоначално с поликлонални, а в пос­
ледствие и с моноклонални а н т и т е л а .
ELISA м е т о д и т е с моноклонални а н т и т е ­
ла към свободния ДПД показват добра коре­
лация с ВЕТХ и и м а т висока диагностична
ч у в с т в и т е л н о с т и специфичност.
Наред с т о в а са разработени методи за
определяне на N- и С-телопептидните учас­
т ъ ц и , които съдържат пиридиновите кръс­
т о с а н и връзки. При т я х а н т и т е л а т а раз­
познават различни участъци о т телопеп-
т и д и т е , които се различават помежду си
по своя клирънс и навярно по своето диаг­
н о с т и ч н о т о значение, но т о з и въпрос все
613
още не е получил еднозначен отговор. Разра­
б о т в а т се и м е т о д и з а определяне н а пири-
динови производни в серум. Съотношение­
т о между свободните и п е п т и д н о свързани
кр ъс т осани връзки в серума обаче се разли­
чава о т т о в а в у р и н а т а и по т о з и начин се
с ъ з д а в а т н е я с н о т и о т н о с н о т я х н о т о ин­
формативно значение.
ПРИЛОЖЕНИЕ Н А БИОХИМИЧНИТЕ
КОСТНИ МАРКЕРИ В ПРАКТИКАТА
С въвеждането н а к о с т н и т е маркери в ди­
а г н о с т и ч н а т а п р а к т и к а се създаде възмож­
н о с т за ранно диагностиииране н а паииен-
т и т е , при к о и т о е налиие повишен риск о т
КНИГОПИС
Bellica Р, M o r o L, R o b i n s S P et al. T h e c o m p a r a t i v e p e r f o r m ­
ance o f urinary bone resorption markers: galactosyl
hydroxylysine, pyridinium cross-links, hydroxyproline. Clin
C h e m , 38, 1992, 2 3 1 3 - 2 3 1 8 .
Chrislgau S, Rosenquist C , A l e x a n d e r s e n P, Bjarnason N11, R a v n
P, F l e d e l i u s C , e t a l . C l i n i c a l e v a l u a t i o n o f t h e s e r u m
C r o s s L a p s O n e S t e p E L I S A , a n e w assay m e a s u r i n g the s c ­
rum concentration o f b o n e - d e r i v e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s of
type I collagen C-telopeplides. Clin C h e m . 4 4 . 1998, 2 2 9 0 -
2300.
Colford JW, Lueddecke 13A, Salvati M etc. i m m u n o r a d i o m e t r i c
assay for intact h u m a n osteocalcin ( 1 - 4 9 ) without c r o s s - r e a c ­
tivity to b r e a k d o w n products. Clin C h e m , 4 5 , 1999, 5 2 6 - 5 3 1 .
Deacon A C , H u l m e P, H e s p R e t al. Estimation o f w h o l e b o d y
bone resorption rate: a c o m p a r i s o n o f urinary total h y d r o x y -
proline excretion with t w o radioisotopic tracer m e t h o d s in
osteoporosis. Clin C h i m Acta, 166, 1997, 2 9 7 - 3 0 6 .
D e l m a s P D , Christiansen C , M a n n K O , Price PA. B o n e G l a p r o ­
tein (osteocalcin) assay standardization report. J B o n e M i n e r
Res, 5, 1990, 5-11.
Ayre D R . T h e specificity o f c o l l a g e n cross-links a s m a r k e r s o f
bone a n d connective tissue degradation. A c t a O r t h o p S c a n d
Suppl, 2 6 6 , 1995, 166-170.
G a r n e r o P, G i n e y t s E, Riou JP, D e l m a s PD. A s s e s s m e n t o f b o n e
resorption with a n e w m a r k e r o f c o l l a g e n d e g r a d a t i o n in p a ­
tients with metabolic b o n e disease. J Clin Endocrinol M e t a b ,
79, 1994, 7 8 0 - 7 8 5 .
G a r n e r o P, H a u s h e r r Е , C h a p u y M - C et al. M a r k e r s o f b o n e
resorption predict hip fracture in elderly w o m e n : the E P I D O S
prospective study. J B o n e M i n e r Res, 11, 1996, 1 5 3 1 - 1 5 3 8 .
Gertz BJ, C l e m e n s J D , Holland S D , Yuan W, G r e e n s p a n S. A p ­
plication o l a n e w s e r u m assay for type 1 collagen cross-linked
N-telopeptides: a s s e s s m e n t o f diurnal c h a n g e in b o n e turno­
v e r with a n d w i t h o u t a l e n d r o n a t e t r e a t m e n t . C a l c i f T i s s u e
Int, 63, 1998, 1 0 2 - 1 0 6 .
G o m e z B, Jr, Ardakani S , Ju J et al. M o n o c l o n a l a n t i b o d y a s s a y
lor measuring bone-specific alkaline p h o s p h a t a s e in s e r u m .
Clin C h e m , 41, 1995, 1 5 6 0 - 1 5 6 6 .
614
к о с т н а загуба. Това позволява включването
н а своевременна профилактика, с к о е т о т я
може да бъде п р е д о т в р а т е н а . При паииен-
т и т е , при к о и т о т а к а в а е вече у с т а н о в е ­
на, с помоидта н а к о с т н и т е маркери може
д а се прецени кой о т п р о ц е с и т е н а к о с т н о
п р е с т р у к т у р и р а н е и м а водещо п а т о г е н е -
т и ч н о значение и н а б а з а т а н а т о в а да се
в з е м е правилно т е р а п е в т и ч н о решение.
Проследяването н а к о с т н и т е маркери в хо­
д а н а лечението дава в ъ з м о ж н о с т за адек­
в а т е н к о н т р о л н а неговия е ф е к т . В дългос­
рочни проспективни проучвания бе доказа­
но и п р о г н о с т и ч н о т о значение н а к о с т н и ­
т е м а р к е р и по о т н о ш е н и е н а к о с т н и т е
фрактури.
K ä k ö n e n S - M , H e l l m a n J, K a r p M etc. D e v e l o p m e n t and evalu­
ation o f three i m m u n o f l u o r o m e t r i c a s s a y s that m e a s u r e dif­
ferent f o r m s o f osteocalcin in s e r u m . Clin C h e m , 46, 2 0 0 0 ,
332-337.
K n a p e n M H J , N i e u w e n h u i j z e n K r u s e m a n A C , Wouters R S M E ,
V e r m e e r C . Correlation o f s e r u m osteocalcin fractions with
b o n e mineral density in w o m e n d u r i n g the first 10 years after
m e n o p a u s e . C a l c i f T i s s u e Int, 6 3 , 1998, 3 7 5 - 3 7 9 .
M a s t e r s PVV, J o n e s R G , P u r v e s D A , C o o p e r E H , C o o n e y J M .
C o m m e r c i a l a s s a y s for s e r u m osteocalcin give clinically dis­
c o r d a n t results. Clin C h e m . 4 0 . 1994, 3 5 8 - 3 6 3 .
M i n i s o l a S, R o s s o R. R o m a g n o l i Е etc. S e r u m osteocalcin and
b o n e mineral density at v a r i o u s skeletal sites: a study per­
f o r m e d with three different assays. J L a b Clin M e d , 1 2 9 , 1 9 9 7 ,
422-429.
P e d e r s e n BJ, B o n d e Purification o f h u m a n procollagen type I
c a r b o x y - t e r m i n a l p r o p e p t i d e c l e a v e d a s in v i v o f r o m
procollagen a n d used to calibrate a r a d i o i m m u n o a s s a y o f the
propeptide. Clin C h e m , 4 0 , 1994, 8 1 1 - 8 1 6 .
P o d e n p h a n t J, Larsen N - E , Christiansen C. A n e a s y a n d reliable
m e t h o d for d e t e r m i n a t i o n o f u r i n a r y h y d r o x y p r o l i n e . Clin
C h i m Acta, 142, 1984, 1 4 5 - 1 4 8 .
R o b i n s SP, W o i t g e H , H e s l e y R, J u J, S c y e d i n S, Seibel MJ.
Direct, enzyme-linked immunoassay for urinary
d e o x y p y r i d i n o l i n e a s a s p e c i f i c m a r k e r for m e a s u r i n g bone
resorption. J B o n e M i n e r Res, 9, 1994, 1643-1649.
R o s e n q u i s t C , O u i s t P, B j a r n s o n N , Christiansen C. Measure­
m e n t o f a m o r e stable region o f osteocalcin in serum b y ELISA
with t w o m o n o c l o n a l antibodies. Clin C h e m , 4 1 , 1995, 1439-
1445.
S c a r i a n o J K , G l e w R H , B o u - S e r h a l C E , C l e m e n s J D , Garry PJ,
B a u m g a r t n e r RN. S e r u m levels o f cross-linked N-telopeptides
a n d a m i n o t e r m i n a l p r o p e p t i d e s o f type I collagen indicate low
b o n e mineral density in elderly w o m e n . Bone, 23, 1998, 471-
477.
Seyedin S M , K u n g VT, Daniloff YN, Hesley RP, G o m e z B, Nielsen
LA, etc. Immunoassay for urinary pyridinoline: a new marker
o f bone resorption. J Bone M i n e r Res, 8, 1993, 635-642.
 А н а л и т и ч н и принципи
п р и изследване
н а урина
1зследването н а у р и н а е един от най-ста-
i m e клинично-лабораторни анализи. Спо-
*д международните с т а н д а р т и р у т и н -
и я т а н а л и з н а у р и н а т а се определя
i m o „ и з с л е д в а н е н а у р и н а т а с проце-
ури, най-общо п р е д с т а в е н и к а т о
ърз, н а д с Л д с н и е в т и н с п о с о б в к л и -
и ч н а т а л а б о р а т о р и я " . Чрез термина
у т и н е н в н и к а к ъ в с л у ч а й не се внушава
гкакво д и с к р и м и н и р а н о представяне н а
ш н н и я анализ, т ъ й к а т о това изследване
ироко се използва не само като най-дос-
ъпно, най-евтино, но и носещо значител-
2 информация. Р у т и н н и я т ан ал из на ури-
гта най-общо включва:\макроскопски (ви-
юлен) оглед с о т ч и т а н е н а цвят, прозрач-
)ст, мирис!физикално изследване (обем, ос-
олалитет, специфично тегло}рхимически
•сализ - х и м и ч н и проби с течни реактиви
м о к р а " X U J M U J I ) и експресни („сухи"тес­
тове) и микроскопия след центрофугиране.
Въпреки че вече м и н а в а т в Историята,'
гмическите проби и най-вече принципа на
нализа трябва д а се познават от клинич-
i-лабораторните специалисти (използва-
? евентуално п р и доуточняване на колеб-
1ви р е з у лтати, напр. з а били рубин, уро-
1линоген и л и белтък, и л и като резервен
гриант п р и необходимост). В тази глава
leg експресните тестове са представени
табличен вид н а й - ч е с т и т е х и м и ч н и ана-
хзи на урина, к а т о са и з т ъ к н а т и техни-
е предимства и недостатъци.
Бел. па реда к пгар и т е
ЕКСПРЕСНИ МЕТОДИ
В АНАЛИЗА НА УРИНА
В. Орбецова
ЕКСПРЕСНИ ТЕСТОВЕ -
СЪЩНОСТ, ПРИНЦИПИ
И ТЕХНИКА НА ИЗСЛЕДВАНЕ
Широката употреба на експресни методи
се дължи преди всичко на т о в а , че т е з и на­
ричани „сухи проби? ( т е с т - л е н т и или т а б ­
летки) са лесни за употреба, много чувст-
в и т е л н и и високо специфични, при това
относително евтини. Проведеният с т я х
уринен анализ предоставя полезна информа­
ция за диагнозата, мониторинга, лечение­
т о и прогнозата на многобройни патоло­
гични с ъ с т о я н и я . Експресните лентови
т е с т о в е се използват и в р а з г ъ н а т и т е мно-
гопрофилни лаборатории, и при леглото на
болния, и дори в домашна обстановка к а т о
средство за самоконтрол на пациента. Тях­
н о т о разнообразие непрекъснато р а с т е и
завладява все нови и нови области - профи­
лактична медицина, акушерство и гинеко­
логия, ендокринология, токсикология, лекар­
ствено мониториране. Най-често определя­
ни с експресните т е с т о в е са:.белтък, глю-
коза, били]зубин, уробилиноген, кетонни ве-
шества, н и т р и т и , pH, относително тегло,
кръв, левкоиити. При някои метаболитни
и с и с т е м н и заб о л я ван и я с у р и н а т а се
о т д е л я т абнормни количества о т специ­
фични за даденото заболяване вешества -
междинни или крайни м е т а б о л и т и (фенила-
ланин, фенилпируват, фенилетиламин - при
фенилаланинемията, порфирини - при пор-
фиринемиите, хомогентизинова киселина -
при а л к а п т о н у р и я т а и т.н.), някои о т кои­
т о съшо м о г а т да б ъ д а т у с т а н о в е н и с
тест-ленти.
П о н а с т о я ш е м по-голям брой о т налични-
615
me експресни т е с т о в е са полуколичествени
- обикновено се о п р е д е л я т няколко концен-
т р а ц и о н н и нива, визуализирани с различни
нюанси н а с ъ о т в е т н а т а ц в е т н а реакция.
Химичните м е т о д и , заложени в експрес­
н и т е т е с т о в е о т различни фирми-произво­
дителки са разнообразни, к а к т о и д е т а й л и ­
т е в дизайна н а т е с т - л е н т и т е , но принци­
п ъ т на анализа по с ъ щ е с т в о е с ъ щ и я т как­
т о при класическите химически проби или
модифициран.
Реагентните ленти м о г а т да б ъ д а т
моно-, ди- или м у л т и т е с т о в и ( т . е . за опре­
деляне на едно, две или повече в е щ е с т в а в
една порция урина - о т 1 до 10). Тест-лен-
т и т е са специално конструирани х а р т и е ­
ни или п л а с т м а с о в и л е н т и ч к и , к о и т о н а
определени м е с т а ( т ъ й нар. и н д и к а т о р н и
зони) са импрегнирани с химикали, развива­
щи ц в е т н а реакция със с ъ о т в е т н о т о вещес­
т в о (фиг. 37.1).
покривен слой
р е а г е н т н а ивица
V а б с о р б и р а щ а ивица
н о с е щ а фолиа
Фиг. 37.1. Напречен разрез наТпест-лента
При п о т а п я н е н а и н д и к а т о р н а т а зона в
изследвана биологична т е ч н о с т или при на­
насяне на п о с л е д н а т а върху т а б л е т к а т а се
развива ц в е т н а реакция. За н а л и ч и е т о или
о т с ъ с т в и е т о н а изследваното в е щ е с т в о се
съди*по в р е м е т о з а поява на определена оц-
в е т к а , по н е й н а т а и н т е н з и в н о с т или*голе-
мина н а о ц в е т е н а т а зона.
Импрегниращите реактиви, носещият
материал, идентификацията на пробите,
н а ч и н и т е н а о т ч и т а н е са различни при раз­
л и ч н и т е производители и дори за о т д е л н и
серии о т един и същ производител. Е т о защо
и н с т р у к ц и и т е к ъ м Пенка о п а к о в к а
трябва добре д а се п о з н а в а т и строго
д а се спазват.
К а к т о се вижда о т ф и г у р а т а и н о и к а т о р -
обикновено е четирислойна:/У10^-
ривен слрй^редгентна ивица^ абсорби-
р а щ а и в и ц а ufносеща, фолия. По т о з и
начин р е а г е н т н а т а иВица е предпазена о т
една с т р а н а о т к о н т а к т , замърсяване и
размекване чрез покривния слой, а о т друга
- абсорбиращият подлежащ слой, о т н е м а й ­
ки излишъка урина п р е д о т в р а т я в а неспеци­
фична ц в е т н а реакция. Г а р а н т и р а се рав­
616
номерно и бързо проникване н а у р и н а т а
обуславящо хомогенно р а з в и т и е и н а ц в е т
н а т а реакция. И н д и к а т о р н а т а зона т р я б
ва да бъде д о с т а т ъ ч н о широка, за да се по
лучи добър к о н т р а с т с б я л а т а лента-носи
т е л , а ц в е т н а т а реакция д о с т а т ъ ч н о чув
с т в и т е л н а и специфична, за да се о т р а з я п
и малки промени в к о н ц е н т р а ц и я т а на изс
л е д в а н о т о в е щ е с т в о чрез промени в н ю а н !
с и т е н а о ц в е т к а т а . Чрез сравняване и н т е н р
з и в н о с т т а н а о ц в е т к а т а н а индикаторна­
т а зона със с т а н д а р т и з и р а н а ц в е т н а ска­
ла може да бъде направена и полуколичест-
вена оценка. При някои п а р а м е т р и визуал­
н о т о о т ч и т а н е може д а бъде заменено с
измерваща а п а р а т у р а ( р е ф л е к т о м е т р и я )
к о е т о позволява обективно измерване с дос­
т а голяма н а д е ж д н о с т н а р е з у л т а т и т е
(напр. глюкоза в к р ъ в т а ) .
Т е х н и к а т а н а изследване включва
с л е д н и т е процедури:
> Потапяне на т е с т - л е н т а т а в урината;
> О т ц е ж д а н е на излишъка по ръба н а съда;
> Сравнително о т ч и т а н е на о ц в е т к а т а
спрямо п р и л о ж е н а т а към о п а к о в к а т а цвет­
н а скала, съблюдавайки у к а з а н о т о в инст­
р у к ц и я т а време.
Общи и з и с к в а н и я п р и и з п о л з в а н е
на тест-ленти:
• У р и н а т а д а бъде прясна, нецентрофуги-
р а н а и добре размесена;
• Л е н т а т а да се п о т а п я бързо (максимал­
но до 2 s) в у р и н а т а , т а к а че да се покрие
ц я л а т а р е а г е н т н а зона (или всичките); 1
• Л е н т а т а добре да се о т ц е д и по ръба на
с ъ б и р а т е л н и я съд;
• О т ч и т а н е т о да с т а в а след т о ч н о опре­
деленото време;
• След изваждане н а л е н т а т а о т опаковка­
т а , п о с л е д н а т а т р я б в а веднага да се з а т ­
вори с оригиналната запушалка, к о я т о съ­
държа е к с и к а т о р ;
• При р а б о т а с ц в е т н а скала т р я б в а да се
използва само добре запазена, неповлияна
о т с в е т л и н а и мокрещи т е ч н о с т и скала;
• Експресните т е с т о в е следва да се съхра­
н я в а т съгласно у к а з а н и е т о в добре з а т ­
ворени опаковки, к а т о се п а з я т о т влия­
н и е т о н а влага, т о п л и н а , с в е т л и н а или
 cmyg (не се посггшбягп 6 хладилник)*
• Всяка нова п а р т и д а следва да се проверя­
ва с надежден количествен м е т о д ;
• С т р о г о е забранено докосването на инди­
к а т о р н и т е зони с ръце или т е да се пос­
т а в я т върху п л о т а или друга повърхност
преди използването им;
• У р и н а т а не бива да п р е с т о я в а повече о т
1 h н а с т а й н а т е м п е р а т у р а и да не се из­
лага н а п р я к а слънчева светлина. Ако не
може да се изследва в т о з и интервал, да
се съхранява в хладилник.
Експресните м е т о д и под форма на т а б ­
л е т к и са предназначени за изследване само
н а един п о к а з а т е л , т . е . т е са м о н о т е с т о -
ве. Основното правило - прясна урина, не-
центрофугирана и добре размесена се изис­
ква и при т е з и т е с т о в е . П о - н а т а т ъ ш н и т е
процедури се и з в ъ р ш в а т съгласно с ъ о т в е т ­
н и т е и н с т р у к ц и и (вж. по-долу).
Предимства иа т е с т - л е и т и т е :
• Лесна у п о т р е б а - т е м о г а т да се провеж­
д а т о т персонал без специално клинично-
л а б о р а т о р н о обучение (лекари, с е с т р и ,
акушерки, к а к т о и о т с а м и т е пациенти),
но при с т р о г о съблюдаване на инстукци-
и т е към т е с т о в е т е ;
• Ч у в с т в и т е л н о с т и специфичност, д о с т а ­
т ъ ч н и за клинично-диагностични цели в
с ъ о т в е т с т в и е с у к а з а н и я т а за приложе­
ния диапазон;
• О т н о с и т е л н о ниска цена на изследвания­
та;
• Бързина н а п р е д о с т а в е н а т а информация
- з а няколко секунди, с к о е т о се п е с т и вре­
ме;
• Не и з и с к в а т допълнителни ре акт и ви или
прибори;
• М о г а т д а се и з в ъ р ш в а т при леглото на
болния, в а м б у л а т о р и я т а или дома на бол­
ния;
• Експресните т е с т о в е са устойчиви и при
обикновени условия н а съхранение са с т а ­
билни з а продължителен срок о т време,
удобни са з а т р а н с п о р т и р а н е .
Н е д о с т а т ъ ц и на експресиите
тестоВе:
• П о ч т и е невъзможно да се с т а н д а р т и з и ­
ра визуалната оценка на т е с т - л е н т и т е ;
• К а ч е с т в о т о на р е з у л т а т и т е се влияе о т
осветлението, при което се о т ч и т а цвет­
н а т а реакция;
• О ц в е т к а т а може да се повлияе о т преко­
мерно оцветяване на урината, причине­
но о т билирубин, хемоглобин, лекарства,
ил11
9РУ2и ц ветн и вещества;
• О т ч и т а н е т о на ц в е т а е д о с т а субектив­
но, т о зависи о т индивидуалната способ­
н о с т на о т ч и т а щ и я за диференциране на
цветови нюанси;
• При серийно о т ч и т а н е на голям брой про­
би субективните грешки се увеличават и
поради неспазване на времето за о т ч и т а ­
не, и поради продължително излагане на
директна светлина.
Практическо приложение
на експресните т е с т о В е
Приложението на експресните т е с т о в е об­
хваща различни с т р а н и о т клинично-диаг-
н о с т и ч н а т а дейност в широката практи­
ка.
Р у т и н н и а н а л и з и . Р у т и н н о т о изследва­
не на у р и н а т а позволява с една тест-лен-
т а за многокомпонентен анализ да се о т к ­
р и я т ранни симптоми на 4 големи групи
заболявания: нарушения във въглехидратна­
т а обмяна\ бъбречни и уро-генитални забо­
лявания (уроинфекции, нефролитиаза, тумо­
ри, възпалителни процеси и др.), к а к т о и
жлъчно-чер подробни и хемолитични заболя­
вания.
М о н и ш о р и р а н е н а т е р а п и я т а . Същес-
т в у в а т специфични т е с т - л е н т и за монито-
риране на лечението на някои заболявания,
едновременно определяне н а глюкоза и
кетонни вещества - за контрол на диабета,
pH, глюкоза, белтък, кръв, н и т р и т и - за хода
и лечението на урогениталните заболява
ния; билирубин и уробилиноген - за жлъчно-
чернодробни заболявания и т . н .
С а л г о к о н т р о л . С а м о к о н т р о л ъ т (self-
inomtoring) най-често се използва о т паци­
е н т и със захарен диабет.
С к р и н и н г в п р о ф и л а к т и к а т а . Профи-
лактичнагтГупотреба на експресните т е с ­
т о в е е насочена към рисковите групи паци-
617
е н т и , л и ц а т а с професионални вредности,
лица, отдалечени о т медицински заведения
и т.н.
ОткриМане л а л е к а р с т в е н и в е щ е с т в а
и н а р к о т и ц и . Micur-BT и н х и б и т о р н и я т
т е с т е о т л и ч е н начин з а к о н т р о л върху
страничните ефекти на антибиотичното
лечение, о т к р и в а й к и а н т и б и о т и ц и в урина­
та.
Експресии т е с т - л е н т и
за изследване н а у р и н а
f. 5
О п р е д е л я н е p H н а у р и н а т а Ь- £
pH на^урината е м я р к а з а с п о с о б н о с т т а н а бъб­
река (ja поддържа водородно-йомната х о м е о с т а -
за н а е к с т р а ц е л у л а р н о т о п р о с т р а н с т в о . Урин-
н о т о pH зависи следователно не само о т храни-
т е л н и т е навици, но и о т индивидуалния м е т а -
болитен баланс. pH се променя не само при раз­
лични заболявания, но и под влияние н а различни
медикаменти. p H н а прясна урина н а здрав въз­
р а с т е н човек варира з н а ч и т е л н о - о т 4.5 до 8, но
най-често е между 5 и 6. Б е л т ъ ч н а т а храна под-
кислява, а плодово-зеленчуковата алкализира
у р и н а т а . Уринно pH > 6.5 означава наличие н а би­
карбонат, а pH < 5.5 - о т с ъ с т в и е н а б и к а р б о н а т .
Постоянно { д ю ^ а ^ ш и и з свързана с наличие н а
ксантинова, ц и с т и н о в а или пикочно-киселинна
л и т и а з а . С и с т е м н о а л к а л н а т а реакция е съм-
н и т е л н а за уроинфекция и е свързана с наличие
н а калциево к а р б о н а т н и , калциево ф о с ф а т н и и
особено магнезиево-амониево ф о с ф а т н и камъни.
О к с а л а т н и т е и a n a m n m i l u к а м ъ н и не с а свърза-
ни с нарушения в pH н а у р и н а т а .
Принцип на експресния тест. В т е с т - л е н -
т и т е е използван д в о й н о - и н д и к а т о р н и я
принцип, покриващ pH ранг о т 5 - 9 ± 0.5: в
р е а г е н т н и т е зони са включени п р о т о н о в и
а к ц е п т о р и и п р о т о н о в и д о н а т о р и . Индика­
т о р и т е - метиленово червено и б р о м т и м о -
лово синьо^ се с в ъ р з в а т с т е з и две форми,
променяйки ц в е т а си според к о н ц е н т р а ц и ­
я т а н а Н + (pH) н а у р и н а т а .
Източници на грешки. П р о д ъ л ж и т е л н о т о
престояване на у р и н а т а на с т а й н а т е м п е ­
р а т у р а я алкализира, вследствие н а б а к т е ­
риален р а с т е ж и замърсяване. Определяне­
т о н а pH в т о з и случай губи с в о е т о диаг­
ностично значение. Източници на грешки са:
използването н а недобре п о ч и с т е н и съдове
з а събиране н а у р и н а т а , н е п р а в и л н о т о ü
съхраняване, к а к т о и използването н а лен-
618
т и с просрочена г о д н о с т или недобре съхра­
нявани.
Определяне относителното
т е г л о н а у р и н а т а у.??#
О т н о с и т е л н о т о т е г л о н а у р и н а т а зависи к а к т о
о т приемането на т е ч н о с т , т а к а и о т вида на
заболяването и варира при з д р а в и т е хора о т 1000
TcXecf обилен прием н а вода) до 1040 (след продъл­
ж и т е л н о ограничаване приема на т е ч н о с т и ) . Сис­
т е м н о установено екстремно ниско о т н о с и т е л ­
но т е г л о означава намалена кониентраиионна
способност на бъбрека, срещана при ХБН, инси-
пиден д и а б е т , хипералдостеронизъм. С оглед
обективно о т ч и т а н е на концентрационната спо­
собност н а бъбрека п р и е м ъ т н а вода се ограни­
чава в денонощието преди определянето. О т н о ­
с и т е л н о т о т е г л о не т р я б в а да бъде под 1020. При
е к с т р е м н о разреждане н а у р и н а т а може да се по­
лучи фалшиво-негативен р е з у л т а т за левкоцити
поради лиза н а формените елементи.
Принцип на експресния тест-лентовметод.
С т е с т - л е н т и т е се о т ч и т а ф а к т и ч е с к и
й о н н а т а сила на у р и н а т а , пропорционална
н а о с м о л а л и т е т а , обусловена о т разтворе-
н и т е е л е к т р о л и т и . Р е а г е н т н а т а зона съ­
държа полийонен полимер (напр. полиметил-
..винилов е т е р ) със свързващи м е с т а , наси­
т е н и с водородни йони, к о и т о се и з м е с т в а т
о т н а т р и е в и и калиеви к а т и о н и , намиращи
• се в у р и н а т а . Това води до освобождаване на
Н + , т . е . промяна в pH, последвана о т про­
м я н а в ц в е т а н а и н д и к а т о р а . Следователно
при експресното колориметрично определя­
не на специфичното тегло на урината се
измерва дисоциационната константа рКа
на използвания полиелектролит. Най-често
използван и н д и к а т о р е б р о м т и м о л о в о т о
синьо. Ц в е т ъ т о т синьо преминава през
синьо-зелено в ж ъ л т о .
Източници на грешки. К о л о р и метр и чн о т о
определяне обикновено корелира добре с реф-
р а к т о м е т р и ч н о т о освен в с л у ч а и т е с висо­
ко съдържание н а б е л т ъ к , урея и глюкоза,
при к о и т о се о т ч и т а т р е ф р а к т о м е т р и ч -
но повишени с т о й н о с т и , но т е не повлия­
в а т експресния т е с т , к о й т о измерва само
е л е к т р о л и т и т е . Силно а л к а л н и т е урини
д а в а т с колориметричния т е с т по-ниски о т
р е а л н и т е с т о й н о с т и , а к и с е л и т е - по-
високи. При н о в о р о д е н о т о п о в и ш е н и т е
с т о й н о с т и т р я б в а д а б ъ д а т п о твър д ен и
чрез д и р е к т н о определяне на о с м о л а л и т е т а .
 Използването н а т е с т - л е н т и т е за опре-
ляне о т н о с и т е л н о т о т е з л о поради т е з и
д о с т а т ъ ц и , к а к т о и заради ц е н а т а им, е
с т а оспорвано.
^лптък, Ü у р и н а т а - п р о п ъ с и н у р и л
:рининговото изследване на б е л т ъ к а в ури-
. т а с т е с т"Ленти в п ове че т о лаборато-
и се к о н т р о л и р а чрез щмщипитгщионни
яподи със сулфосалицилова или трихлоро-
Аинз. киселини, т ъ й к а т о т е с т - л е н т и т е
1 ч и т а т предимно албумина и не са чувс-
Зителни к ъ м глобулини, а също и леки ве-
1ги.
оинцип на метода. Екс п ре сн и ят т е с т се
зира н а т . н а р . „ п р о т е и н о в а г р е ш к а ' н а
igukamopume. Р е а г е н т н а т а ивица съдър-
а ц и т р а т е н буфер с pH = 3 и индикатор 3,
Ъ, 5' - т е т р а х л о р ф е н о л - 3, 4, 5, 6 - т е т р а б -
•мсулфофталеин (тетрабромфенолово
ньо). При т о в а pH и н д и к а т о р ъ т е ж ъ л т .
: л т ъ ц и т е се с в ъ р з в а т с индикатора, про-
шяйки (независимо, че рЬ1 о с т а в а п о е т о ­
т о ) с п е к т р а л н а т а абсорбция н а б о я т а
•фотеинова грешка") о т ж ъ л т о в ж ъ л т о -
лено, зелено и синьо, според концентраци-
па н а б е л т ъ к а . А_лбумин в кониентраиия
)6 g/1 причинява видима промяна в ц в е т а .
граничения и източници на грешки. К а т о
и м а предвид, че о т екскретирания с ури-
ima около 150 mg/24h б е л т ъ к само 1/3 е
.бумин, а о с т а н а л и т е 2/3 са ниско-молекул-
1 глобулини ( м о л . т . < 50000), очевидни са
раниченията на т е с т - л е н т о в и я метод,
звен т о в а е к с п р е с н и я т т е с т е чувстви-
елен към о т р и ц а т е л н о н а т о в а р е н и т е бел-
ъци и по-малко ч у в с т в и т е л е н към положи-
елно н а т о в а р е н и т е , з а т о в а не о т к р и в а
Геломните б е л т ъ ц и и Bence Jones белтъ-
I, към к о й т о су^фосалициловата проба е
'вствителна.
Фалшиво-негативни резултати д а в а т
1Лно р а з р е д е н и т е урини. фалшиво-положи-
елни р е з у л т а т и се п о л у ч а в а т при силно
скални или алкализирани урини, при хема-
урия и високо к о н ц е н т р и р а н а урина, след
1фузия н а поливинилпиролидон (кръвоза
з с т и т е л н а т е р а п и я ) , при използване на съ
|инения, съдържащи ч е т в ъ р т и ч н и амони
•и групи или хлорхексидин, к а т о дезинфек
а н т и н а с ъ д о в е т е з а събиране н а урина.
1ервеникаво оцветяване на р е а г е н т н а т а
зона се получава след лечение с феназопири-
динови препарати. Фалшиво-положителни
резултати д а в а т рентгено-контрастните
вещества, т о л б у т а м и д ъ т , парааминосали-
циловата киселина, цефалоспорините. Чув­
с т в и т е л н о с т т а на т е с т - л е н т и т е е недос­
т а т ъ ч н а за откриване на микроалбумину-
р и я т а при диабетна нефропатия. Новоро­
д е н и т е и м а т физиологична протеинурия до
3. ден.
Оценката на резултата при полуколичес-
т в е н о т о о п р е д е л я н е включва няколко
степени: негативна; 0.3; 1; 5 g/1 и повече,
о т ч и т а н и к а т о (-), (±), ( + ) , ( + + ) и повече.'
Глюкоза ß у р и н а т а - глюкозурия.
Принцип. В експресните сухи т е с т о в е (ка­
чествени или полуколичествени) най-често
се използва двустъпален ензимен м е т о д с
^люкозооксидаза и пероксидаза. В първото
стъп ал о глюкозата се окислява до глюконо-
ва киселина и водороден прекис, катализи­
рано о т глюкозооксидазата. Във в т о р о т о -
пероксидазата катализира взаимодействи­
е т о на Я 2 0 2 с КУ-хромоген, променяйки цве­
т а о т ж ъ л т о (нормален р е з у л т а т ) , светло
зелено, т ъ м н о зелено, оранжево, кафяво.
Ц в е т н а т а реакция е специфична, не се пов­
лиява о т интерфериращи фактори и з а т о ­
ва сухите проби се използват и за полуколи-
чествено определяне на глюкозата в урина­
та.
Ч у в с т в и т е л н о с т т а на т е с т а за свобод­
н а о т аскорбинова киселина урина е 2.2
mmol/1 (40 mg%). Това означава, че даже ле­
к а т а глюкозурия може да бъде определяна с
голяма сигурност.
Нормално в у р и н а т а не се открива глю-
коза. Тя се появява, к о г а т о нивото и в кръв­
т а надвиши 10 mmol/1, т ъ й нар. бъбречен
праг, или ко?.пто е Нарушена т у б у л н а т а ре-
абсорбция. Г о р н а т а граница на физиологич­
н а т а глюкозурия е 0.8 mmol/1 в първата с у т ­
решна урина.
Източници на грешки. Над 50 mg% аскорби­
нова киселина може да даде фалшиво-нега-
т и в е н р е з у л т а т . Редуциращи в е щ е с т в а
м о г а т да п о т и с н а т ц в е т н а т а реакиия
(напр. м е т а б о л и т и на салициловата кисе­
лина), но обикновено т е са в ниски концент-
619
рации. И з п о л з в а н и т е з а п о ч и с т в а н е н а за, б е л т ъ к , аскорбинова киселина, консерван
съдове д е т е р г е н т и , с ъ д ъ р ж а щ и Н 2 0 2 или т и к а т о т и м о л , формалин, т о л у е н в обичай
други силни о к и с л и т е л и м о г а т д а д а д а т ни к о н ц е н т р а ц и и н е и н т е р ф е р и р а т с т е с
фалшиво-положителни р е з у л т а т и , ако не с а та.
о т с т р а н е н и при и з м и в а н е т о . Ц в е т н а т а с к а л а з а с р а в н и т е л н о полуко
Един много добър и н а т о в а р е н с м и н и м у м л и ч е с т в е н о определяне с ъ о т в е т с т в а приб
грешки е Diabur-Test 5000, к о й т о и м а 2 т е с т - лизително н а следните концентрации: ( + )
зони с различна ч у в с т в и т е л н о с т к ъ м глю- 0.5-4 mmol/1; ( + + ) - 4-10 mmol/1; ( + + +*7^ >
к о з а т а ( п о - ч у в с т в и т е л н а т а , о ц в е т е н а жъл­ *Г0тто1/1.
т о , п р о м е н я щ а се в с в е т л о и т ъ м н о зелено Източници на грешки и ограничения на тес
и по-слабо ч у в с т в и т е л н а бяла, п р о м е н я щ а та. Високи к о л и ч е с т в а аскорбинова кисели
се през с в е т л о синьо до синьо. Определяни­ на, м е т а б о л и т и н а леводопа, ф т а л е и н и , из
я т к о н ц е н т р а ц и о н е н р а н г е о т 0 до 5%. Keto- ползвани при функционални изследвания ш
Diabur Test 5000 с ъ д ъ р ж а о щ е е д н а и в и ц а з а б ъ б р е ц и т е и ч е р н и я дроб (червена о ц в е т к 1
определяне н а к е т о н н и в е щ е с т в а . в а л к а л н а среда), валпроева киселина, фена-
зопиридин (Pyridium) д а в а т фалшиво-поло­
ж и т е л н и р е з у л т а т и . К а п т о п р и л , nampuet
Определяне н а к е т о т е л а 2 - м е р к а п т о е т а н с у л ф о н а т , N - а ц е т и л цис-
ß урината - кетонурил т е и н и други свободни сулфхидрилни съеди­
В урината се о т д е л я т 3 к е т о т е л а - ацетоаце- н е н и я - също. П р о д ъ л ж и т е л н о п р е с т о я в а ш
т а т , ^-хидроксибутират и ацетон. При кетону- н а с т а й н а т е м п е р а т у р а поради л е т л и в о с т -
рия около 75% о т к е т о т е л а т а са под форма на т а н а а ц е т о а ц е т а т а д а в а фалшиво-нега-
хидрокси б у т и р а т , около 25% - на а ц е т о а ц е т а т , тивни резултати.
а а ц е т о н ъ т е само в следи. Полуколичественият
т е с т за оценка на к е т о н у р и я т а открива кетоа-
цидозата при захарен диабет, алкохолизъм, гла­
Б и л и р у б и н в у р и н а т а - бiui и р у бипурпя
дуване, продължително приемане на изопропанол,
б о г а т а на б е л т ъ ц и и/или м а з н и н и д и е т а , Билирубинът к а т о продукт на хемоглобиновотс
редуциращи т е г л о т о д и е т и , т о к с и к о з а н а разграждане се образува в макроцитно-макрофа-
бременността, ацетонемично повръщане при геалната система, далака и Купферовите клет­
децата, фебрилитет. Определянето на к е т о т е ­ ки на черния дроб. Глюкуронира се в микрозоми-
ла в урината е опГголяма важност за монитори- т е на чернодробните клетки под каталитично-
ране лечението на диабетици и о т 1., и о т 2. т и п , т о действие на глюкуронил трансферазата. Не-
и т р я б в а да с т а в а поне веднъж месечно. Генетич­ конюгираният билирубин е водонеразтворим и ш.
ни аномалии, предизвикващи кетоза, респ. кето- се екскрстира с урината. В урината на здрави
нурия са пропионил-СоА карбоксилаз на т а недои- ' хора не се екскретира билирубин.^илирубинурая^
0
мъчност, метилмалонатурията, някои форми т а е характерна за интра- и ек(?трахепатална-
н а гликогеноза, н а р у ш е н и я в о б м я н а т а н а т а обструктивна жълтеница, хепатоцелуларна*
разклонените аминокиселини (болест с миризма т а жълтеница, острия и хроничен х е п а т и т , чер;
на кленов сироп). Определяне на к е т о т е л а т р я б в а п о д р о б н а т а цироза, и к т е р и ч н и т е с т а д и и на
да се извършва при всички п а ц и е н т и с Dubin-Johnson и Rotor синдромите.
положителна проба за глюкозурия. Принцип на експресните методи. Експрес­
П р и н ц и п н а определянето. Е к с п р е с н и т е н и т е моно- или м у л т и - т е с т о в е използват
т е с т о в е (Multistix, Ketostix или Acetest) с е ц в е т н а т а диазореакция, при к о я т о билиру­
б а з и р а т н а н и т р о п р у с и д н а т а реакция н а б и н ъ т се свързва със с т а б и л н а диазониева
а ц е т о а ц е т а т а {реакция на Легал). А ц е т о а - сол (2,6 дихлорбензен диазониев флуоборат
ц е т а т ъ т реагира с н а т р и е в нитропрусид или 2,4 д и а н и л и н д и а з о н и е в а сол) в кисела
и глицин в а л к а л н а с р е д а до получаване н а среда, налични в р е а г е н т н а т а зона н а т е с т -
в и о л е т о в ц в е т е н комплекс. (Ьхидроксибути- л е н т а т а . П р о д у к т ъ т е червено-виолетоба
р а т ъ т не р е а г и р а с н а т р и е в и я н и т р о п р у - а з о боя, ч и и т о и н т е н з и т е т се увеличава с
си
9- Ч у в с т в и т е л н о с т т а н а т е с т о в е т е е н а р а с т в а н е к о н ц е н т р а ц и я т а н а билируби-
87.5%, с п е ц и ф и ч н о с т т а - 96%. Р е а к ц и я т а с е н а - о т бежово-розово до червено-виолетово.
п о з и т и в и р а п р и к о н ц е н т р а ц и я 0.5 m m o l / 1 Г р а н и ц а т а н а ч у в с т в и т е л н о с т е 9 |Шю1/1 (0.5
а ц е т о а ц е т а т и 7-12 mmol/1 а ц е т о н . Глюко- mg%) в свободна о т аскорбинова киселина

620
JtpUHa. Т е с т ъ т и м а с п е ц и ф и ч н о с т о т 79-89%
89% - н е г а т и в н а п р е д и к т и в н а с т о й н о с т лизъм. ^штравазална хемолиза (отравяния,
а т о спешен т е с т . транефузионни реакции, инфекциозни заболява­
ния), п^ншщозца^ н е м 1 1 Я . полицитемия вера; ре­
Източници н а г р е ш к и и ограничения. Висо- зорбция на големи хематоми; повишена чревна
и т е н и в а н а аскорбинова киселина и н и т - пропускливост на уробилиноген - т е ж к а обсти-
и т и п о н и ж а в а т или н е г а т и в и р а т р е з у л т а - пация, ентероколит, илеус; повишена продукция
ia. И з л а г а н е т о н а п р я к а с в е т л и н а - също. на уробилиноген в жлъчните пътища в резултат
на инфекции (холангити).
)алшиво-положителни р е з у л т а т и причиня-
Нарушена хепатална функция, забавяща ме-
а т л е к а р с т в а , к о и т о о ц в е т я в а т у р и н а т а таболизирането на уробилиногена се развива при;
ервено ( м е ф е н е м о в а киселина, хлорпрома- Вирусен х е п а т и т ; хроничен х е п а т и т и цироза;
ин). P y r i d i u m (феназопиридин), S e r e n i u m токсична хепатопатия (алкохол, органични раз­
з т о к с а з е н хидрохлорид) и м е с т н и а н е с т е - творители, токсини о т инфекциозен произход);
1 и ц и д а в а т червеникаво-оранжево о ц в е т я - хепатална конгеетия след инфаркт на миокар­
а н е н а у р и н а т а , к о е т о м о ж е д а м а с к и р а да, остра сърдечно-съдова недостатъчност; чер-
и а з о р е а к ц и я т а при ниски к о л и ч е с т в а би- нодробна хипоксия (тежка анемия, отравяне с
СО); чернодробен карцином; НРП^ЛНП обструкццр
ирубин в у р и н а т а . И н д о к с и л ъ т също мас- на жлъчните пътища.
и р а р е а к ц и я т а . В т а к и в а случаи се препо- Уробилиногенурия, обусловена о т „заобикаля­
ъ ч в а п о - с п е ц и ф и ч н и я т Ictotest. Повишени- не" на черния дроб има при: цидйзд_на черния дроб
т общ билирубин при х е м о л и т и ч н и т е ане- с портална хипертония; тромбоза на v.portae;
I U U не п о з и т и в и р а т е с т а , т ъ й к а т о пре- запушване на v.hepatica. <'~
а л и р а и н д и р е к т н и я т билирубин. При т е ж - Уробилиногенът липсва в урината, когато
и чернодробни з а б о л я в а н и я също може д а черният дроб не произвежда жлъчка, билиарният
т о к е спрял или чревната редукция на билируби­
м а н е г а т и в е н р е з у л т а т поради неспособ-
на е преустановена. Изясняването на причини­
о с т т а н а х е п а т о ц и т а д а конюгира били- т е за нарушения в уробилиногеновата екскреция
убина. П р и т е ж к и бъбречни заболявания изисква провеждане на редица серумни анализи и
ъ щ о и м а дисоциация м е ж д у високо серум- функционални изследвания.
о и ниско у р и н н о ниво н а билирубина. При П р и н ц и п н а експресните тестове. Обикно­
т а р и хора м о ж е д а и м а фалшиво-положи- вено се използва р е а к ц и я т а на Ehrlich с па-
лелни р е з у л т а т и о т з а м ъ р с я в а н е н а ури- радиметиламинобензалдехид. Импрегнира­
. а т а с фекалии. н и я т в р е а к т и в н а т а зона р е а к т и в н а
Ehrlich реагира с уробилиногена, образувай­
ки съединение с ц в я т о т бледо ж ъ л т о до
'роби^шпогеч в у р и н а т а - орашкево-кафяво. В Bilugen т е с т а се изпол­
уробилиногенурия зва с т а б и л н а диазониева сол - 4-Aiemokcu-
^робилиногенът и стеркобилшюгенът се обра- бензен д и а з о н и е в флуоро борат, к о й т о
)^ в а т предимно в ч е р в а т а nocj действие на бак­ в кисела среда дава червена оцветка. Физио­
т е р и а л н а редукция на билирубина и в малка е т е ­ л о г и ч н и т е нива н а уробилиногена д а в а т
лен - 6 жлъчните канали. При физиологични ус- бледо розова о ц в е т к а . Г р а н и ц а т а н а ч у в с т ­
ювия уробилиногенът, а в по-малка степен и в и т е л н о с т е 7 [.imol/I, д о к а т о г о р н а т а гра­
т е р к о б и л и н о г е н ъ т се реабсорбират и през ница н а физиологичната уробилиногенурия
.portae се в р ъ щ а т в черния дроб за окончателно е 17 [лто1/1. Т е с т о в е т е не са доказателни за
азграждане. Образуваният в колона стеркоби-
липса н а уробилиногенурия при пълна о б с т -
иноген се екскретира с фекалиите и само малка
»ракция заобикаля черния дроб и чрез pi. venosus рукция н а d. choledochus. Т е с т о в е т е , изпол­
ectalis навлиза в с и с т е м н о т о кръвообръщение, зващи р е а к ц и я т а н а Ehrlich са по-чувстви­
а да се появи в у р и н а т а . т е л н и , а Bilugen т е с т ъ т е полуколичествен
Горната граница н а .физиологичиата_^фрби _ и диференцира физиологичната о т патоло­
иногенурия е 17 цто1/1 (1 mg%). Уробилиногену г и ч н а т а уробилиногениурия.
•ията се увеличава, к о г а т о капацитетът_на_ И з т о ч н и ц и н а грешки. Уробилиногенът е
ерния дроб за ентеро-хепатална циркулация t н е с т а б и л е н и з а изследването му т р я о в а да
граничен или к о г а т о чер ният дрбб^^заоои со се използва само прясна урина. Продължи­
ен": т е л н о т о престояване на с т а й н а темпера­
Надвишаване на чернодробния к а п а ц и т е т се
т у р а води до ф а л ш и в о - н е г а т и в н и резулта-
шблюдава при: увеличен хемоглобинов катабо-
621
mu. ф о р м а л д е х и д ъ т (било 6 р е з у л т а т н а
формалин 6 у р и н а т а , било 6 р е з у л т а т о т
приемане н а големи дози мефенамин) п о т и с ­
ка реаюдията. Н и т р и т и т е , п р о д у к т н а уро-
инфекиия ч а с т и ч н о или напълно п о д т и с к а т
реакиията. фалшибо-положителни р е з у л т а ­
т и д а в а т лекарства, оцветяващи у р и н а т а
червено (феназопиридин). Зелено до синьо
оцветяване, в е р о я т н о о т биливердин, може
да се появи з а к р а т к о време, около 60 s след
п о т а п я н е н а л е н т а т а . Bilugen е полуколичес-
т в е н т е с т , о т ч и т а 17; 70; 140 и 200 |.imol/l.
Н о р м а л н и я т ц в я т о т г о в а р я н а 7 цто1/1.
Приемането, особено след обяд, н а б о г а т а
на въглехидрати д и е т а , може да п о з и т и в и -
ра р е а к ц и я т а . А н т и б и о т и ц и , п о д т и с к а щ и
ч р е в н а т а флора също м о ж е д а п р и ч и н я т
много ниски с т о й н о с т и . П а ц и е н т и с порфи-
рия (порфобилиногенемия) д а в а т фалшиво
положителни р е з у л т а т и .
Нитрати в у р и н а т а
Н и т р и т н и я т експресен т е с т се използва
за доказване на^Зактерии, редуциращи н и т -
р а т и до н и т р и т и . Escherichia coli, най-чес­
т а т а причина з а уроинфекция ре д уц и ра
н и т р а т и т е до н и т р и т и . Около 3-8% о т
ж е н и т е и 0.5-2% о т м ъ ж е т е и м а т б а к т е -
риурия, к о я т о з а д в а т а пола се увеличава с
в ъ з р а с т т а . Нормално т е с т ъ т т р я б в а д а
бъде н е г а т и в е н .
Принцип на експресните методи. Използва
се п р и н ц и п ъ т н а Griess т е с т а . А р о м а т н и ­
я т амин - сулфаниламид реагира с н и т р и т
в кисела буферна среда, образувайки диазо-
ниева сол, к о я т о се купелува с 3 - хидрокси -
1, 2, 3, 4 -тетрахидро-7,8-бензоквинолин, да­
вайки азо боя. И н т е н з и т е т ъ т н а червена­
т а оцветка е мярка за концентрацията на
н и т р и т и в у р и н а т а , но не и з а т е ж е с т т а
н а инфекцията. Около 70% о т всички изслед­
вания п о з и т и в и р а т т е с т а , к о е т о налага
специални изисквания;
• Изследване н а първа с у т р е ш н а урина, з а
да има д о с т а т ъ ч н о п р е с т о я в а н е н а ури­
н а т а в пикочния мехур, респ. превръщане
на н и т р а т и в н и т р и т и .
• Нормална д и е т а , включваща зеленчуци и
плодове предишния ден.
• Изследването се извършва след спиране н а
а н т и б а к т е р и а л н а т е р а п и я (антиСшоти-
622
ци, х и м и о т е р а п е в т и ц и ) , з а да се подсигу­
ри б ак тер и ал н о образуване н а н и т р и т и . 11
Фалшиво-негативни резултати: наличие t
н а б а к т е р и и без редуцираща н и т р а т и т е I:
ензимна а к т и в н о с т ; бедна н а н и т р а т и ди-1
е т а ; б а к т е р и и , редуциращи н и т р а т и т е до f
амоняк и а з о т ; п р е с т о я в а н е н а у р и н а т а в
пикочния мехур по-малко о т 4 часа; инхиби-1
ране н а р е а к ц и я т а при наличие на аскорби- i'
нова киселина над 25 mg%; овлажняване на '
лентите.
Фалшиво-положителни резултати: б а к - 1
т е р и а л н о а р т е ф и ц и а л н о з а м ъ р с я в а н е на f
у р и н а т а ; продължително п р е с т о я в а н е на 1
с т а й н а т е м п е р а т у р а ; продължително лече- '
ние с феназопиридин. Nitur т е с т ъ т е спе- -
циално предназначен за изследване н а н и т - I
рити.
К р ъ в в у р и н ат а - х е л ш т у р ш ь
Кръвта в урината може да бъде под форма на
и н т а к т н и еритроцити или хемоглобин. Миог- а
лобинът също позитивира използваната 6 в к с - |
пресните т е с т о в е реакция. Микрохематурията
не променя естествения ц в я т на урината. Чер­
веникаво оцветяване се получава при повече о т
0.5 ml кръв на л и т ъ р урина или 2500 Erys/ul. |
Стойности над 5 Erys/|.il се с ч и т а т за патоло- i
гични. При менструиращи жени следва да се
взема предвид евентуален примес на менстру- •
ална кръв.
Принцип на експресните тестове. В т е с т - 1
л е н т и т е з а експресен анализ се използва
п с е в а о п е р о к с и а а з н а т а или к а т а л а з н а ак­
т и в н о с т н а хема, причиняваща окисление на
няКои и н д и к а т о р н и бои: о р т о т о м щ ц н , бен-_
зидин, 2,5-диметил-2,5-дихидропероксихек-
сан до синьо-зелено ц в е т н о съединение. Pea- f
г е н т н а т а ивица променя ц в е т а си о т жъл- |
т о през зелено до синьо. Ч у в с т в и т е л н о с т - ^
т а н а т е с т - л е н т и т е е 5-20 Erys/pl, з а хе- ъ
моглобина - к о л и ч е с т в о т о , с ъ о т в е т с т в а щ о
н а 10 Erys/pl. Физиологичната х е м а т у р и я е
0-3 Erys/pl. С п е ц и ф и ч н о с т т а е висока.
Източници на грешки и ограничения. В ня- ^
кои т е с т о в е аскорбиновата киселина и фор­
м а л и н ъ т п о т и с к а т р е а к ц и я т а до фалшиво-
негативни р е з у л т а т и , фалшиво-положител­
ни р е з у л т а т и д а в а т йодни концентрации в
у р и н а т а или т р е т и р а н е н а к о ж а т а на
п а ц и е н т а с йодна т и н к т у р а . Б е л и н а т а ,
използвана за п о ч и с т в а н е н а събирателни-
 : съдове, а к о н е е о т с т р а н е н а , д а в а също
л ш и в о - п о л о ж и т е л н а реакция. Н е с т е р о и д -
гпе п р о т и в о в ъ з п а л и т е л н и л е к а р с т в а в
)ва число а с п и р и н , п р и ч и н я в а т х е м а т у -
1Я. Ф о л ш и в о - п о л о Ж и т е л н а р е а к ц и я с е при-
н я в а о т б а к т е р и а л н а пероксидаза (грам
г а т и в н и б а к т е р и и и стафилококи). Изра-
i a m a п р о т е и н у р и я увеличава ф а л ш и в о - н е -
тивните резултати.
Изясняването на причината и м я с т о т о
х е м а т у р и я т а изисква д о п ъ л н и т е л н и ла-
р а т о р н и и функционални изследвания, н а
рво м я с т о микроскопиране н а с е д и м е н т а .
П о л о ж и т е л н а суха проба без наличие н а
и т р о ц и т и в с е д и м е н т а се дължи н а хемог-
бин, миоглобин или порфирини.
Мкоцити в у р и н а т а - левкоцитуршь
в к о ц и т у р и я т а е кардинален п о к а з а т е л з а
з п а л и т е л е н процес н а б ъ б р е ц и т е и / и л и
Р ю ч н и т е п ъ т и щ а . Т я е по-показателна о т
к т е р и у р и я т а . Д в е т е с ъ с т о я н и я ч е с т о , но
винаги, се о т к р и в а т едновременно пора-
. ш и р о к о т о приложение н а а н т и б и о т и ц и -
А но-редуктазния т а б л е т е н т е с т (Clinitest).
Р а з р а б о т в а н е т о н а експресни т е с т о в е з а
к а з в а н е н а л е в к о ц и т и с т а в а н а по-късен
i a n в сравнение с д р у г и т е показатели.
; с т - л е н т и т е и з п о л з в а т е с т е р а з н а т а лев-
• ц и т н а а к т и в н о с т , к а т а л и з и р а щ а хидро-
1 з а т а н а пирозил-М-тозил-Ь-аланиновия
т е р до пиролов алкохол, к о й т о реагира с
i g u k a m o p u a диазониева сол с р а з в и т и е н а
юлетова ц в е т н а реакция и т е с т - з о н а т а
п б е ж о в а с т а в а в и о л е т о в а . В някои т е с -
ове (Cytur т е с т ) в м е с т о диазониева сол се
л п р е г н и р а с п е ц и а л е н найлонов слой, при
» е т о т е с т - з о н а т а при н е г а т и в е н резул-
а т е м н о г о с в е т л а , а при п а т о л о г и ч е н
нпензивно в и о л е т о в а . Т е с т ъ т о т ч и т а и
п и р а н и л е в к о ц и т и , к о е т о н е с т а в а при
и к р о с к о п с к о т о изследване. Специфичност-
а е висока - е р и т р о ц и т и , е п и т е л н и к л е т -
1, с п е р м а т о з о и д и , т р и х о м о н а с не я пози-
ивират.
з т о ч н и ц и н а г р е ш к и . В и с о к а т а билируби-
/ р и я м а с к и р а ц в е т н а т а реакция. Високи-
•е нива н а б е л т ъ к (над 5 g/1), н а глюкоза (над
) g/1), г е н т а м и ц и н ъ т и ц е ф а л е к с и н ъ т
а м а л я в а т р е а к ц и я т а . У р и н н и т е консер-
ш т и к а т о формалдехид д а в а т ф а л ш и в о -
о л о Ж и т е л н и р е з у л т а т и , фалшиво-положи-
т е л н и р е з у л т а т и при жени д а в а замърся­
в а н е т о с вагинален с е к р е т .
Полуколичественото о т ч и т а н е е обикно­
вено с 3 нива: 10-25 Lks/|il; 75 Lks/|il и >500
Lks/jil.
П р о м я н а т а в ц в е т а при ниска левкоци-
шурия, к о я т о не може д а се о т ч е т е к а т о
п о л о ж и т е л н а з а 60 s, се о т ч и т а след 2 min.
П а т а б л . 37.1 с а сумирани м е т о д и ч н и т е
и клинично-лабораторни х а р а к т е р и с т и к и
н а е к с п р е с н и т е уринни т е с т о в е . Основно
изискване з а всички експресни сухи проби е
правилно съхраняване н а т е с т - л е н т и т е - на
хладно и сухо м я с т о в добре з а т в о р е н и
т е с т - о п а к о в к и . И при т я х , к а к т о и при дру­
г и т е лабораторни методи, качественият
к о н т р о л е з а д ъ лж и т е ле н .
Таблетни експресни т е с т о в е
Г л ю к о з а т а и други монозахариди (галакто-
за, ф р у к т о з а ) и невъглехидратни редуцира­
щи в е щ е с т в а (аскорбинова киселина) м о г а т
д а б ъ д а т полуколичествено измерени с мед-
Т а б л е т к а т а е импрегнирана с меден сулфат,
н а т р и е в а основа, н а т р и е в к а р б о н а т и
лимонена киселина.
Начин на приложение. П е т капки урина се
с м е с в а т с 10 капки д е с т и л и р а н а вода в еп­
р у в е т к а , след к о е т о се п о с т а в я т а б л е т к а
Clinitest. М е д н и я т с у л ф а т реагира с реду­
ц и р а щ и т е в е щ е с т в а в у р и н а т а , превръщай­
ки купри-йоните в купро-йони (екзотермич­
н а реакция). След 15 min е п р у в е т к а т а леко
се разклаща и о т ч и т а срещу ц в е т н а скала
о т синьо-зелено до оранжево. ВаЖно е д а
се проследи протичането н а реакци­
я т а , т ъ й к а т о п р и висока концентра­
ц и я о р а ш к е Н и я т цИят с т а в а к а ф я в и
с е в р ъ щ а к ъ м син. Т е с т ъ т е по-слабо чув­
с т в и т е л е н и по-малко специфичен о т лен­
т о в и я . Положителен т а б л е т е н и о т р и ц а т е ­
лен л е н т о в т е с т се получава при наличие и
н а други редуциращи в е щ е с т в а освен
г л ю к о з а т а , к а к в и т о с а с л у ч а и т е с вродени­
т е е н з и м о п а т и и н а в ъ г л е х и д р а т н а т а обмя
на - галактоземия, фруктозна недостатъч­
н о с т и др. При л а к т а ц и я и през последния
т р и м е с т ъ р н а б р е м е н н о с т т а е налице лак-
тозурия.
623
Т а б л и ц а 37.1. Обобщени данни за експресните (сухи) т е с т о в е за изследване на урина
Чувстви­
Тест Реактиви Принцип Повлияващи ф а к т о р и
телност
pH индикатори: метиленово с у б с т а н ц и и т е д е й с т в а т или к а т о 5 -9 бактериалният р а с т е ж и метаболизъм
червено и бромшимолово синьо п р о т о н н и а к ц е п т о р и или к а т о п р о т о н н и м о г а т д а п р е д и з в и к а т изразено увеличение
донори
Относително индикатори: полиелектролити, рК^, п р о м я н а н а п р е д в а р и т е л н о 0 005 и н к р е м е н т и при алкална урина с е прибавя 0.005 з а
тегло бромшимолово синьо, буфери т р е т и р а н и я полиелектролит между 1 000 и 1.030 pH >6.5; б е л т ъ к ъ т води до покачване
Кръв Н.О,,, т е ш р а м е т и л б е н з и д и н к а т а л а з н а или псевдопероксидазна б х 10f Eürya/l З а м ъ р с я в а н е с о к с и д а н т и , > 100 m g / 1
или оршотолидин а к т и в н о с т н а хема, миоглобинът съоцо 0.5 - 3 mg/1 хемо­ аскорбинова киселина м о ж е д а п о д т и с н е
предизвиква окисление н а хромогена глобин реакцията
Белтък ц и т р а т е н буфер п р и p H = 3, „ п р о т е и н о в а грешка" н а и н д и к а т о р и т е ; 0.06 0.3 g/1 силно б у ф е р и р а н а т а алкална урина може да
индикатор: и н д и к а т о р ъ т с е комбинира с п р о т е и н , доведе до фалшиво п о л о ж и т е л н и р е з у л т а т и ;
т е т р а б р о м ф е н о л о в о синьо к о е т о променя н е г о в а т а с п е к т р а л н а нормално при физическо н а т о в а р в а н е и
абсорбция д е х и д р а т а ц и я б е л т ъ к ъ т м о ж е да се повиши
Глюкоза глюкозооксидаза, пероксидаза; глюкоза + 0,-»глюконова
2
киселина + Н„0
2
•
2'
2.2 - 6 mmol/1 > 500 mg/1 аскорбинова киселина може д а
о толуидин, калиев йодид или Н 2 0 2 + хромоген -> окислен хромоген + Н 2 0 по ч у в с т в и т е л е н потисне реакцията
а м и н о пр о п илк ар баз ол о т CÜniteat
Кетони натриев нитропрусид а ц е т о ц е т н а киселина + н а т р и е в н и т р о 0.6 - 1.5 mmol/1 силно л е т л и в и ; б а к т е р и и т е м о г а т
прусид -» пурпурно о ц в е т я в а н е (ацетоацетат) да ги р а з р у ш а т
7 - 12 mmol/1
(ацетон)
Билирубин дихлоранилин или дихлор диазо реакция: билирубин + диазониева сол 4 - 7 /imol/1; n o н е с т а б и л е н н а с в е т л и н а , високи к о л и ч е с т в а
бензен диазониум -•виолетовокафяво до пурпурно о ц в е т я в а н е слабо ч у в с т в и аскорбинова киселина или н и т р и т и
тетрафлуороборат т е л е н о т Ictoteat понижават резултата
Уробилиноген диметиламинобензалдехид уробилиноген + диметиламинобензалдехид 7 - 17 ^ m o l / l уробилиногенът е н е с т а б и л е н в у р и н а т а ;
- • ж ъ л т о до к а ф я в о оранжево о ц в е т я в а н е изисква с е п р я с н а урина
Левкоцити индоксилкарбонатен е с т е р , индоксилкарбонатен е с т е р f левкоцитни 5 10 Lk8//il в и с о к и т е н и в а н а глюкоза и б е л т ъ к
диазониева сол е с т е р а з и -» индокеггл \ диазониева сол -» (интактни п о т и с к а т р е а к ц и я т а , фалшиво п о л о ж и т е л н и
пурпурно о ц в е т я в а н е или л шир а ни) р е з у л т а т и при хистиоцитоза и трихомонас
Нитрити п а р а арсанилова киселина, н и т р и т + п а р а арсанилова киселина 7 /imol/1 б а к т е р и и с липса н а р е д у к т а з а н е р е а г и р а т ,
тетрахидробензо(Ъ) квинолин диазониум f т е т р а хидробензо(Ь) кви (> 10f 6а к т е р и и / ml) > 250 mg/1 аскорбинова киселина може д а по
3 ол нолин 3 ол -»розово о ц в е т я в а н е т и с н е р е а к ц и я т а ; по малко о т 4 ч а с а п р е с т о
я в а н е н а у р и н а т а в пикочния мехур и липса
н а н и т р а т и в д и е т а т а липсва реакция

НгОг - водороден пероксид; р К а - о т р и ц а т е л е н л о г а р и т ъ м н а д и с о ц и а ц и о н н а т а к о н с т а н т а

N tötest
.otest п р е д с т а в л я в а ч у в с т в и т е л е н т а б л е -
ьчен т е с т за о т ч и т а н е н а билирубина. В
на т а б л е т к а с а комбинирани 2,4-дихлоро-
нзен диазониев т е т р а х л о р ц и н а т , н а т р и -
б и к а р б о н а т и сулфосалицилова киселина.
'хника. П е т капки урина се п о с т а в я т в
бесто-целулозно легло. Изчаква се 1 min за
сорбция н а у р и н а т а и след т о в а се добавя
р е а г е н т н а т а б л е т к а върху с у х а т а ч а с т
ге l гнездото. Върху т а б л е т к а т а се капва 1
п к а д е с т и л и р а н а вода, а след 5 s още една.
[ б л е т к а т а се о т с т р а н я в а и след 1 min при
1личие н а билирубин се о т ч и т а виолетово
, в е т я в а н е н а т е с т - м я с т о т о , при липса -
•зово-червено.
Р а з р а б о т е н и с а експресни т е с т о в е и за
•казване н а c u i k a n m o n y p i u i (ферихлори-
н или с р е б ъ р н о - н и т р а т е н ) ; за ф е н и л к е -
о н у р и я (Phenistix с ферихлорид); при на-
1чие н а фенилпируват р е а г е н т н а т а зона
о ц в е т я в а о т сиво-зелено до сиво-синьо.
Разработени са т е с т о в е за доказване и на
други аминокиселини и т е х н и м е т а б о л и т и
- тирозин, триптофан, A K с разклоне­
н и вериги, ц и с т е и н и цистин, хомоцис-
теин, у р и н н и порфирини и др.
ХИМИЧНИ МЕТОДИ
ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА УРИНА
Р.Пашева
В таблици 37.2 - 37.7 са представени прин­
ц и п и т е на химическите методи за изслед­
ване на различни вещества в урината. Въп­
реки че една голяма ч а с т о т т е з и методи
са с историческо значение, т е са включени
не само за пълнота на изложението, но и за
обща осведоменост на обучаващите се спе­
циализанти по клинична лаборатория.
625
аз Т а б л и ц а 37.2. Memogu з а химическо изследване н а глюкоза в у р и н а
to
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а

I. К а ч е с т в е н о д о к а з в а н е
Редукционни
• по Fehling основават се на редукционните свойства на положителна реакция при съдържание на глюкоза историческо
алдехидната група на глюкозата: над 0.1 g7c. Позитивира се и о т други редуциращи значение
CuS04 + 2NaOH > Си(ОН)2 + Na2S04 вещества в урината: пикочна киселина, креати-
загряване до завиране нин, хомогентизинова киселина, лекарства - в и т .
синьозелен ц в я т тъмносин ц в я т С, кофеин, морфин, салицилова киселина, пеници­
0 лин, стрептомицин, фенацетин, тетрациклин
Си(ОН)2 + R—СХ • СиОН (жълт ц в я т ) и др.
Н
загряване до завиране
2СиОН > Си20 + Н 2 0
(керем. червен ц в я т )
образува се цветно съединение, в р е з у л т а т на пре­
връщането на двувалентния куприйон в еднова-
лентен купройон

• по Benedict к а к т о при Fehling, но с разтвор на Benedict позитивира се при глюкоза над 0.05 g%; историческо
(Ка-цитрат, Ка2СОз, CuS04) най-чувствителната редукционна проба; значение
поради по-голямото разреждане на урината, дей­
с т в и е т о на страничните редуциращи вещества
в урината е по-слабо изразено
• модификация суха проба, сходна с т а з и на Benedict (CuS04, NaOH, положителна при глюкоза над 2 g% ориентировъчен
(Clinitest) лимонена киселина и NaHCOg)

• по Frommer, основава се на превръщането на купри- в по-слаба чувствителност историческо

Pavy и Haine купройон (Си+ + в Си + ) значение

• по Nielander бисмутов трихидрат в алкална среда и сегнетова историческо

сол при нагряване и при наличие на глюкоза в ури­ значение
н а т а се превръща в ВЮ (кафяво-черен)

• no Franck редуктивните захари превръщат 6-валентния трудоемък историческо

3-валентен, к а т о ц в е т ъ т се се променя о т значение
хром в ж ъ л т в зелен

Експресни (сухи) т е с т о в е (Clini- разгледан по-горе. О т ч и т а се промяна в оцветя- бързи, удобни полуколичествена
stix, Biophan G, Glucophan и др.) ването след 30-45 s
Та6.1 и ц а 3 7 . 2 . Memogu за химическо изследване на глюкоза в урина (продължение)
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка на м е т о д а

П. К о л и ч е с т в е н о о п р е д е л я н е
Поияр1шетри чен глюкозата в ъ р т и поляризованата светлина и по с т е ­ влияе се о т наличие на б е л т ъ к в у р и н а т а ; несигурни
п е н т а на в ъ р т е н е се определя количеството глюкоза у р и н а т а т р я б в а да се обезцвети и избистри резултати
в урината

Колориметрични
образуване на фурфуролоби дехидрогениране на глюкозата при загряване в кисела неспецифичен, незначителна интерференция доскоро ч е с т о
деривати среда и превръщането ü в хидроксиметилфурфурол; на другите хексози използван
о-тулоидинов м е т о д последният образува ц в е т е н кондензационен комплекс
с о-толуидин в концентрирана оцетнокисела среда

• колориметричен с р е а к т и в на Benedict - ф о т о м е т р и ч е н ориентировъчен историческо

по Моуа и Dewar

Ензимен метод
• колориметрични използва се е н з и м ъ т глюкозооксидаза (ГОД), значителна специфичност; не се пози рутинен - клас А
к о й т о отделя о т глюкозата Н 2 0 " чрез т ив ира о т други редуциращи вещества;
пероксидаза о т Н 2 0 2 се отцепва 0 2 , к о й т о големи количества в и т а м и н С и хлорни
окислява с у б с т р а т а (хромоген) и го превръща препарати за миене м о г а т да попречат
в ц в ет н о съединение на реакцията; а в т о м а т и з и р а н о определяне
ГОД
D-глюкоза + 0 2 — D-глюконова к-на + Н 2 0 2
ПОД
Н Р г + хромоген Н.,0 + окислен хромоген
(безцветен) (цветен комплекс)

• потенциометрични определяне консумацията на О при образуване на Н 0 2 автоматизирано определяне

to
Таблица 37.3. Memogu за химическо изследване на белтък в урина
Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
I. К а ч е с т в е н о опредеАяне пресичане на белтъците с физични (чрез нагрява­
не) или химични (органични киселини) агенти,
поради нарушен колоиден с т а б и л и т е т
• със сулфосалицилова преципитация на белтъците с 20% сулфосали­ чувствителна проба (0.05-0.1 g/1); фалшивополо- широко
киселина цилова киселина жителна е след прием на орални противодиабе- приложение
тични средства и увеличаване концентрацията
на пикочна киселина, хемоглобин, миоглобин
• по Heller бял пръстен след прибавяне на 30% азотна положителна при белтък над 0.033 g/1 неспецифичен
киселина към урина, съдържаща белтък
• с фероцианкалий и помътняване след прибавяне на 30% о ц е т ­ разлика между серумни белтъци и нуклеоалбумин историческо
оиетна киселина на киселина > нук\еоалбумин значение
помътняване след прибавяне на 10% феро­
цианкалий > серумни протеини
• експресни сухи т е с т о в е протеинова грешка на индикатора (вж по-горе) полуколичествени; псевдоположителен р е з у л т а т т о ч н и , бързи,
(Biophan Е, Albuphan, при алкална урина и наличие на хемоглобин в приложими при
albustix и др.) урината всички условия
• белтъчни тела на Bence-Jones вж гл. 13. сигурно доказване
- електрофоретично
- преципшпация при нагряване при 45-60 0С парапротеините доказването е несигурно ориентировъчно
коагулират и образуват преципитат, който
при по-висока температура се разтваря
II. К о л и ч е с т в е н о о п р е д е л я н е
• метод на Esbach - волуме- измерва се обема на образуваната утайка след прост и удобен, но бавен - р е з у л т а т ъ т се дава неточен
тричен преципитация на белтъците с реактива на Esbach след 24 h (грешка до 50%)
• метод на Столников както при Heller - с падагци разреждания о т ури­ неудобен за серийни изследвания, трудоемък сравнително
Brandberg на с физиологичен разтвор до изчезване образува­ точен
н е т о на бял пръстен на Heller
• биуретов метод - коло- белтъците образуват с Си * * в алкална среда р у т и н е н - клас А
риметричен виолетово оцветен комплекс с абсорбционен
максимум при 546 п т
• метод на Lowry реактив на Folin-Ciocalteu висока чувствителност; специфичен за аминоки­ използва се при ниска
селините тирозин и триптофан концентрация на
белтък
• метод на Kjeldahl количеството белтък се определя по количест­ трудоемък, изисква скъпа апаратура, влияе се референтен
вото а з о т (N2 е 16% о т м а с а т а на белтъка) о т амоняк и амониеви соли
• гравиметрични методи не са утвърдени
• рефрактометрични о т ч и т а се по скала рефракцията на светлината изисква се рефрактометър, удобен при деца прилагат се рядко
в зависимост о т количеството на белтъка
 т и л и ц и , oi.**. ivieuiuv-)u Л А AUIVIUMCCIVU U J C N C ^ U C M T - NCI I V P ^ W «J J

Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а

• Бензидинова проба на Adler в р е з у л т а т на псевдопероксидазното действие на ч у в с т в и т е л н о с т т а се повишава, ако се извърши широко използван
хемоглобина някои органични съеинения (бензидин, върху филтърна хартия; положителен р е з у л т а т в миналото, бензиди-
пирамидон, до-толидин, гваякол) в присъствие на Н 2 0 2 при хемоглобин 0.31 mg/1; позитивира се и о т дру­ н ъ т е канцероген
се превръщат се в цветни съединения ги фактори (миоглобин, метални съдове)

• Експресни методи ( т е с т лен­ вж. по-горе чувствителност 5 х 106 Eiys/1 (0.5-3 mg/1, хемогло­ специфична реакция
т и или таблетки) импрегнира­ бин); реакцията се подтиска о т окислители за хемоглобин и
ни с буферирана смес о т орга­ (детергешпи), вит. С и др. миоглобин
ничен пероксид и индикатор

• Спектроскопско доказване на различните хемоглобинови деривати се доказват спек- необходимост о т спеюпрофотометър рядко се използва
хемоглобин 6 урината троскопски по различния си абсорбционен максимум (за определени цели)

Таблица 37.5. Аналитични методи за химично изследване на кетонови т е л а в урина

Метод Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
• По Lange а ц е т о н ъ т и а ц е т о ц е т н а т а киселина образуват с висока чувствителност (пръстен !) - над 41 mmol/1 използва се в
Na-нитропрусид в алкална среда (NHj) изонитро- а ц е т о а ц е т а т фалшиво положителен р е з у л т а т практиката
зоацетон с червено-виолетов ц в я т о т фенолфталеин, алое и др.

• По Legal същият принцип к а т о при Lange при алкална среда добра чувствителност, подобен цветен комплекс използва се в
о т NaOH се образува и с креатинин, който се разрушава практиката
при подкисляване
• По Lestrade Na-нитропрусид, амониев сулфат, безводен натриев използва се в
(сухи реактиви) карбонат >• червено оцветяване при наличие на практиката
кетотела

• Експресни т е с т о в е вж. по-горе работи се само с прясна урна, удобни, бързи,

(Ketostix-mecm ленти, Ketophan, поради летливостта на кетонните т е л а надеждни
Acetest, Ivokai, Keturtest)

• По Gerhard реакция между ацетоцетна киселина и РеС1з > полуколичествена проба (над 0.5 g/1) използва се за
комплексно съединение с червено-виолетов ц в я т определени цели

Oi
ю
to
Таблица 37.6. Аналитични методи за химично изследване на жлъчни пигменти в урина
Метод
• Билирубин no Trousseau-Rosin
• Експресни т е с т о в е Ictotest-
таблетки, Ictostix-ленти
• Диазо-реакция по Ерлих
образува т а к ъ в с черен ц в я т
• Уробшиноген по Neubauer
• Мезобиливиолинова проба на
Niemann и Fischer
• Уробилшюви т е л а
по Schlesinger
• Експресни т е с т о в е - УБГ-фан,
Urobilistix, Ugen-test
Таблица 37.7. Аналитични методи за химично изследване на жлъчни пигменти в урина
Метод
• По Jaksch за меланин
• По Thormaelen за меланин
• По Obermeyer за индикан
Принцип (химическа реакция) Коментар Оценка н а м е т о д а
билирубинът под действие на окислител се пре висока чувствителност (пръстен!) използва се в прак­
връща в бшивердин със смарагденозелен ц в я т тиката
вж по-горе удобни и лесни за
употреба
NaN0 2 + HCl- - > HNO, + NaCl използва се при Трусо, когато вместо зелен има предимство при
сулфаншова к-на + HN02 >• диазобензосулфонова пръстен се
неясно о т ч и т а н е на
к-на + 2Н 2 0 пробата на Трусо
диазо т я л о V азобагрило на диазотялото
реакцията между уробшиноген и а\дехид (р-в на да се спазват изискванията: прясна, охладена широко се използва
Ерлих) завършва с цветно (червено) съединение урина, о т ч и т а н е до 3 min
уробшиногенът и уробилинът се дехидрогенират използва се за специ­
о т FeClj до виолетовочервен мезобиливиолин ални цели
уробшиновите те.ла с ачкохолен разтвор о т Z n - а ц е т а т използва се при
д а в а т зелено флуоресциращи комплексни соли престояла урина
вж по-горе полуколичествено определяне надеждно и лесно
определяне
Принцип ( х и м и ч е с к а ре акция) Коментар Оценка н а м е т о д а
към подкислена урина се прибавя разреден р а з т в о р на удобен за
РеС1з; получава се тъмнокафяво до черно оцветяване практиката
при наличие на меланин
към урина се прибавя пресен н а с и т е н р а з т в о р на неспецифичен
нитропрусид. Na в присъствие на NaOH дава синьо
оцветяване, ако има меланин
и н д и к а н ъ т е безцветно съединение, а по химичен багрила, соли, ж\ъчни пигменти п р е ч а т на реак­ неспецифичен
с ъ с т а в - калиева сол на индоксшсярната киселина; ц и я т а . У р о т р о п и н ъ т негативира положителния
за доказването му т р я б в а да бъде превърнат в индок- р е з у л т а т ; йодни соли в у р и н а т а д а в а т положи­
сил чрез разкъсване на е с т е р н а т а връзка (хидролизи- т е л н а реакция
ране) със силна минерална киселина (k.HCl) и след окис­
ляване с РеС1з образува синьо или червено индиго
нигопис
i c k c r S . U r i n a l y s i s a n d b o d y fluids. In: Hubbard G D (cd). A
c o n c i s e r e v i e w o f c l i n i c a l c h e m ist ry. Baltimore, W i l l i a m s &
Wilkins, 1997, 4 2 5 - 4 6 9 .
innardeaux A , S o m m e r v i l l e P, K a y e M . A study o f reliability
o f d i p s t i c k urinalysis. C l i n N e p h r o l , 4 1 , 1 9 9 4 , 3 , 1 6 7 - 1 7 2 .
3hen HT, S p i e g e l D M . A i r - e x p o s e d urine dipsticks g i v e false-
positive results for g l u c o s e and false-negative results for blood.
A m J C l i n Pathol, 9 6 . 1 9 9 1 , 3 , 3 9 8 - 4 0 0 .
o l d s m i t h B M , C a m p o s J M . C o m p a r i s o n o f urine d i p s t i c k ,
m i c r o s c o p y a n d c u l t u r e f o r the d e t e c t i o n o f bacteriuria in
children. C l i n Pediatr ( P h i l a ) , 2 9 , 1 9 9 0 , 4 , 2 1 4 - 2 1 8 .
a r r i s o n N A , Rainford DJ, W h i t e G A . Proteinuria p - w h a t v a l u e
i s the dipstick? Br J U r o l , 6 3 , 1 9 8 9 , 2 , 2 0 2 - 2 0 8 .
o l c o m b e BJ, H o p k i n s A M , H e i z e r W D . F a l s e - p o s i t i v e tests for
urinary k e t o n e s , N E n g l J M e d , 3 3 0 , 1 9 9 4 , 8 , 5 7 8 .
urlbut, T A , Littenberg B . T h e d i a g n o s t i c accu racy o f rapid dip­
stick tests to predict urinary tract infection. A m J Clin Pathol,
96, 1991, 5, 582-588.
Jacobs D S , D e M o t t W R , Kasten BL, O l s o w k a ES. Urinalysis
and clinical microscopy. ln:Jacobs D S et al (eds). Laboratory
test handbook (4"' ed). L e x i - C o m p Inc, Hudson (Cleveland),
1996, 629-661.
James GP, B e e DE. Glucosuria: accuracy and precision o f labo­
ratory diagnosis by dipstick analysis. Clin Chcm, 25, 1979,
996-1001.
* * *
Д о ч е в Д . К л н м и ч п а л а б о р а т о р и я , C . , М е д и ф и з к , 1985.
Каракашов А , П а н д о в X. Клинична лаборатория, С , М е д и
ф и з к , 1985.
Т о д о р о в Й . Клиническая л а б о р а т о р и а я диагностика в педи­
а т р и и . IV р у с к о и з д а н и е , С . , М е д и ф и з к , 1963.
Ч и ж А С . Н е ф р о л о г и я в т е р а н е в т и ч е с к о й практике, М и н с к ,
В ь п н е й т а я ш к о л а , 1988.
Bonard 1, Weber С Е , Koller P U , Willamowski KD, Bachmann
F. R a t i o n a l i s i e r u n g i m u r i n l a b o r o h n e v e r z i e h t aut
diagnostische Sicherheit. Dtsch med Woschr 107, 1982, 2 4 9 -
251.
631
 МЕТОДИЧНИ ПОДХОДИ
ПРИ ИЗСЛЕДВАНЕ
НАЛИКВОР
Е. Ц в е т а н о в а
ОБЩИ ДАННИ
Изследването на ликвора (гръбначно-мозъчна
т е ч н о с т , cerebrospinal fluid, liquor cere­
brospinalis) се провежда с цел, к о я т о включва:
- уточняване на диагнозата,
- разкриване на отделни п а т о г е н е т и ч н и
звена,
- мониториране на специфична т е р а п и я .
Ликворното изследване има определено
значение, к а к т о за някои първични и в т о ­
рични заболявания на н е р в н а т а с и с т е м а
(НС), т а к а и за откриване на нарушения в
секрецията, циркулацията и резорбцията
на ликвора, оценка на с ъ с т о я н и е т о на кръв-
но-мозъчната и кръвно-ликворната барие­
ра (КМБ и КАБ) и др. Заболяванията на НС
д а в а т отражение в биологичните течно­
с т и , степенувани по значимост в следния
ред - ликвор, к р ъ в и у р и н а , т . е . т е з и т е ч ­
ности са т р и различни нива на информация.
На отделни м е с т а ликворът облива ЦНС и
е в директна комуникация с екстрацелулар-
н о т о пространство на главния и гръбнач­
ния мозък, т ъ й к а т о липсва ликворно-мо-
зъчна бариера. Патологичните процеси на
НС не о с т а в а т изолирани, а в о д я т до функ­
ционално и органично засягане на други сис­
т е м и и органи, к а к т о и обратно. Тази ин­
т и м н а връзка определя с л о ж н о с т т а на ин­
т е р п р е т а ц и я на лабораторните показате­
ли, установени в една о т т е з и биологични
т е ч н о с т и . С ъ с т а в ъ т на ликвора изцяло за­
виси о т д е й н о с т т а на НС и с ъ с т о я н и е т о
на бариерите. Около 70% о т ликвора има хо-
риоидален произход ( о т кръвта) и 30% се об­
разува екстрахориоидално ( о т ЦНС). Мини­
мални промени в ликворния с ъ с т а в значи­
телно променят функциите на НС, к а т о ва­
зомоторна а к т и в н о с т , кръвно налягане,
емоционален стрес, сърдечна ч е с т о т а , рес-
пирация, мозъчния кръвен т о к и мн. др. Осо­
632
беното анатомично у с т р о й с т в о на ликвор-
н а т а с и с т е м а (вентрикули и субарахноид-
но пространство) определят о т къде може
да се вземе ликвор (вентрикули, цистерни,
лумбален сак и др.). За диагностика и т е р а ­
пия (интратекално вкарване на лекарства).
най-често се използва лумбалната пункция
между L3/L4 или L4/L5 и игли за еднократ­
на употреба (20 G - 22 G). Лик в оръ т с е об­
н о в я в а 3 д о 5 п ъ т и з а 24 часа, т.е. сек-
р е т и р а с е о к о л о 500 m l л и к в о р н а дено­
н о щ и е и т о в а е съществено п р и оцен­
к а н а п о к а з а т е л и т е . Има с т р о г а съгла­
суваност между секреция, движение и резор­
бция на ликвора. Той се абсорбира във веноз­
н а т а система през арахноидните вили и по-
малка ч а с т чрез хориоидните плексуси. Пре­
н о с ъ т на компоненти о т к р ъ в т а към лик­
вора е изключително сложен процес, с учас­
т и е т о на а к т и в е н т р а н с п о р т , ултрафил-
т р а ц и я , пасивна дифузия и др. КАБ е с по-
добър пермеабилитет за повечето хидро-
филни кръвни съставки, а КМБ - за лиофил-
ни. КАБ е високорестриктивна и умерено се­
лективна по отношение на плазмените бел­
т ъ ц и . Осъшествява се непрекъсната ак­
т и в н а и пасивна размяна на съставки меж­
ду плазма и ликвор, интерстициална теч­
н о с т на ЦНС и ликвор, клетки и ликвор и
др. С т о в а се обяснява и разликата на ня­
кои компоненти (напр. белтък, глюкоза и
др.) о т краниално (вентрикули) към каудал-
но (лумбален сак).
Аикворът е информация о т първо стъ­
пало (най-бързо и най-точно) по отношение
на заболяванията на НС, к а к т о и за систем­
ни заболявания със засягане на НС. Днес в
с в е т а е възможно изследването на над 750
вида показатели, но за определена болест­
на единица се използват не повече о т 8-10
високоспецифични и чувствителни маркери.
Информацията, получена о т ликвора вина­
ги т р я б в а да се и н т е р п р е т и р а заедно с из-
 с л е д б а н и л т а н а к р ъ в т а . А бно р мал ният лик-
бор сочи за патологичен процес в ЦНС
ОСНОВНИ (ЗЛАТНИ) ПРАВИЛА
П Р И ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЛИКВОР
1 . E p u п у н к т и р а н е л и к б о р ъ т се събира в
т р и порции, п о изключение в д в е и
н и к о г а в е д н а . В п ъ р в а т а порция се съ-
о и р а т само няколко капки за елиминира­
не н а к о н т а м и н а ц и я при п у н к т и р а н е т о .
За цитологичен анализ се използва втора­
т а порция, а з а биохимичен и имунологи­
чен - втората и трета порция. Ликворът
се събира в прозрачни, химически ч и с т и ,
стерилни и запушващи се съдове. При съм­
нение за мозъчен кръвоизлив, т р и т е пор­
ции се и з с л е д в а т поотделно.
2. Ц и т о л о г и ч н и я т и биохимичният с ъ с т а в
н а ликвора е функция на м я с т о т о о т къ­
д е т о е в з е т (лумбален сак, цистерни, вен-
трикули), к а к т о и о т в ъ з р а с т т а на лич­
н о с т т а . Това налага д а с е п о с о ч и т о ч ­
но о т къде е взет ликвора.
3. Взема се максимално малко количество
ликвор в з а в и с и м о с т о т ц е л и т е н а пунк­
ц и я т а (диагностична или т е р а п е в т и ч н а )
и с ъ с т о я н и е т о н а п а ц и е н т а . Е т о защо
л1икрол1етодите з а а н а л и з с а з а
п р е дп о ч и т а н е .
4. Изследването н а ликвора и особено на ци-
т о л и г и ч н и т е маркери т р я б в а да започне
н а й - к ъ с н о д о 30 m i n с л е д п у н к ц и я т а ,
т ъ й к а т о н а с т ъ п в а бърза цитолиза и се
променя морфологията на к л е т к и т е .
5. Всяка т е ч н о с т , извадена о т субарахноид-
н о т о п р о с т р а н с т в о се изследва независи­
мо о т макроскопския и вид, т . е . кървав
ликвор също се изследва (за определени по­
казатели).
6. З а оценка н а и н т р а т е к а л н а с и н т е з а на
б е л т ъ ц и и а н т и т е л а е задължително изс­
л е д в а н е т о н а бариерни маркери (албумин,
алфа-2-макроглобулин и др.) успоредно в
кръвен серум и ликвор.
7. П р а в и л н о т о и н т е р п р е т и р а н е н а всеки
ликворен р е з у л т а т , з а д ъ л ж и т е л н о изиск­
в а о ц е н к а н а с ъ щ и я в п е р и ф е р н а т а кръв и
с ъ с т о я н и е т о н а КАБ. Еквилибрирането
н а л и к в о р н и т е и кръвни п о к а з а т е л и в по­
в е ч е т о случаи н а с т ъ п в а в р а м к и т е н а 4 -
6 часа.
Изследването на ликвора протича в оп­
ределена последователност и най-често
включва:
• Макроскопски вид - ц в я т , прозрачност,
фибринова мрежа, вискозитет, Tyndall oß
е ф е к т и други.
• Ц и т о л о г и ч е н анализ - брой на различ
ни видове клетки и т я х н о т о диференци­
ране
• Биохимичен анализ - белтъци, ензими,
въглехидрати, липиди, електролити, газов
анализ, рП, невротрансмитери, хормони
идр.
• Имунологично изследване - а н т и т е л а ,
антигени, цитокини и др.
• Лекарства
М е т о д и т е за изследване на ликвора са
близки до т е з и за изследване на периферна
кръв, респ. кръвен серум, но изискват много
по-добра ч у в с т в и т е л н о с т и специфичност.
РЕФЕРЕНТНИ СТОЙНОСТИ
Р е ф е р е н т н и т е с т о й н о с т и на о т д е л н и т е
показатели в ликвор са много по-различни
о т т е з и на другите биологични т е ч н о с т и
(табл.1.)
МАКРОСКОПСКО ИЗСЛЕДВАНЕ
НА ЛИКВОР
Л и к в о р ъ т е една о т м а л к о т о биологични
т е ч н о с т и , з а к о и т о може да се получи по­
лезна информация още при макроскопското
изследване. Н о р м а л н и я т ликвор е безцвет­
на, прозрачна, безфибринова мрежа
т е ч н о с т , т р у д н о р а з л и ч и м а о т дес­
т и л и р а н а вода.
П р о з р а ч н о с т . При патологични процеси
п р о м я н а т а може д а бъде о т лека опалесцен-
ция до м ъ т е н и гноен ликвор, със с т е п е н и
о т следи, 1+, 2+, д о 5+. Определя се преди и
след центрофугиране н а ликвора . О т ч и т а
се н а черен фон, к а т о се сравнява с д е с т и ­
лирана вода. Причина за нарушаване на проз­
р а ч н о с т т а е увеличение броя н а к л е т к и т е
или увеличение н а общия белтък. Ако н а р у ­
ш е н а т а прозрачност се дължи н а
633
Т а б л и ц а 1. Референтни с т о й н о с т и на някои ликборни показатели
(посочени са най-често приетите средни стойности)
Показател SI с и с т е м а Показател SI с и с т е м а
Налягане 1.32 кРа Калий 2& mmol/1
Осмоларитет 296 т О н т / 1 Калций 1.06 mmol/1
Водно съдържание 99 % Магнезий 1.46 nimol/1
Сух о с т а т ъ к 1.06 % Натрий 138 mmol/1
в
Еритроцити Зх10 /1 Хлор 120 mmol/1
Левкоцити 4xlOVl
Лимфоцити 0.70 Бикарбонат 23 mmol/1
Моноцити 056 рсо2 6.1 кРа
Неутрофилни pH 7.33
гранулоцити 0.01 0
Р 2 6 5 кРа
Други клетки 0.03 Желязо 2.6 mmol/1
Общ белтък Глюкоза
лумбален 0.36 g/1 лумбален 3.6 mmol/1
вешприкулен 0 2 0 g/1 вентрикулен 4.6 mmol/
цистериален 0.10 g/1 цистернален 4.0 mmol/1
Протеинограма Аа к т а т 1.9 mmol/1
пре албумин 6% Пируват 110 umol/1
албумин 66% Общи липиди 16.0 mg/1
алфа 1 глобулгши 4% Холестерол 13.0 pmol/1
ал ф а- 2 гл обулини 7% Аланин 34.3 pmol/l
б е т а глобулини 1% Окситоцин 12 pg/ml
may глобулгши 6% Соматостатин 72 pg/ml
гама глобулини 8% Ендорфин 16 p g / m l
Албумин 200 mg/1 Мед енкефалин 16 pg/ml
IgG 30 mg/1 Динорфин 14 pg/ml
IgA 3 mg/1 Субстанция Р 36 pg/ml
IgM 0.3 mg/1 цАМФ 20 nmnl
Капа/Ламбда гшдекс 1.0 Хомов анилинова
Преалбумин 17 mg/1 киселина 60 m g / m l
Хаптоглобин 1.6 mg/1 6HIAA 0.04 m g / m l
Трансферин 14 mg/1 Норадреналгш 200 pg/ml
Це рул опл аз мин 1.0 mg/1
Алфа-2-макрогл. 2.0 mg/1 Ацетилхолин 18 mg/1
Фибриноген 0.6 mg/1 Витамин С 232 fimol/1
Бета-липопротеини 0.6 mg/1 Инозитол 472 ^imol/l
Креатинкиназа 16U/1 фолеати 0.068 pmol/1
Лактатдехидрогеназа 26U/1 Ти амин 0.36 цто1/1
Acп ар т а т а м и н о Bum. В6 0.39 цто1/1
т р а н с фераза 10U/1 Rum .Е 26 nmol/l
Аланинамино Глутамат 26.1 umol/1
трансфераза 4 U/l Аспарагин 13.6 umol/1
Бетаглюкоронидаза 20U/1 Глутамин 662 umol/1
Глюкозофосфат Хистидин 12.3 umol/1
изомераза 7 U/l фенил аланин 10 umol/1
Серии 29.6 umol/1 Треонин 36.6 umol/1
ГАМК 3.6 umol/1 Тирозин 9.6 umol/1
АСТН 60 pg/ml Валин 19.9 umol/1

634
 л ет ки. с л е д ц е н т р о ф у г и р а н е н а д с т о
. щ а т а т е ч н о с т с е и з б и с т р я . В npomu-
ен случай се дължи н а увеличение н а общия
елтък.
( в я т . П р о м я н а т а в ц в е т а може да бъде
ай-различна: жълтеникав, кафеникав, розов,
ервеникав ликвор и т . н . К а т о с т е п е н н а из-
а з е н о с т бива от едва забележима ксанто-
:ромия до много силно изразена. Интензи-
• 1 е т ъ т ü се о т ч и т а о т с л е д и , 1+, 2+, з+,
ю 4+. Определя се преди и след центрофуги-
ане н а ликвора, н а бял фон, к а т о се сравня-
а с ч и с т а д е с т и л и р а н а вода. Жълто-кафе-
.икавото о ц в е т я в а н е н а ликвора е извест-
.о к а т о к с а н т о х р о л ь и я . В зависимост о т
фоизхода си т я бива - хеморагична и зас-
юйна. Х е л ю р а г и ч н а т а к с а н т о х р о л ь и я
е дължи н а и н т р а т е к а л н а хеморагия и се
фидружава о т нормо- или лека хиперпроте-
1нрахия. З а с т о й н а т а к с а н т о х р о л г и н е
вързана с повишен п е р м е а б и л и т е т н а КЛБ
I задължително се придружава о т умерена
10 силна хиперпротеинрахия. За идентифи-
щране т и п а н а к с а н т о х р о м и я т а е задъл­
жително д а се о с ъ щ е с т в и н а т и в н а с п е к т -
ю ф о т о м е т р и я (СФМ).
{ ъ р в а в л и к в о р (еритроцитрахия). Може
ia се д е м о н с т р и р а микроскопски или мак-
юскопски. В зависимост о т произхода си би-
»а а р т е ф а к т н а , и с т и н с к а и л и слгесе-
ш . Диференцирането на и с т и н с к о т о о т ар-
п е ф а к т н о кървене е много важно и трудно,
\ налага използването н а специфични пока-
«атели, к а т о макрофагоцитоза, СФМ, кон­
центрация н а калий и други, а не пресни и
;тари еритроцити.
Х)ибриноВа м р е ж а . У с т а н о в я в а н е т о н а
^ибринова м р е ж а изисква п р е с т о й на лик-
Зора на с т а й н а т е м п е р а т у р а поне 25-30 min.
Чоже да бъде по-нежна и по-груба в зависи­
м о с т о т фибриногеновата и общобелтъчна
концентрация в ликвора. За откриване на
^ибринова м р е ж а се използва с т ъ к л е н а пръ­
чица и визуално о т ч и т а н е , или разглеждане
i a ликвора под микроскоп при слабо увели
4ение (120-150 х).
r y n d a i r 0 6 е ф е к т . При брой н а к л е т к и т е
до 400 в 1 И1 л и к в о р ъ т макроскопски е безц-
З е т е н и прозрачен, а Туп(1а11,овият е ф е к т
може да бъде положителен. П р о б а т а ликвор
ze наблюдава н а слънчева светлина на рам­
к а т а на прозореца. При леко почукване по
д ъ н о т о на е п р у в е т к а т а леко увеличеният
брои на клетки в ликвора се о т ч и т а , к а т о
леко разпръскване на светл и н ата. Използва
се за бързо, ориентировъчно установяване
на лека плеоцитоза или еритроцитрахия.
ЦИТОЛОГИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ
НА ЛИКВОРА
Това е едно о т най-капризните изследвания.
Необходимо е да се с п а з в а т няколко о с н о в ­
н и п р а в и л а : а ) при пунктиране ликворът
се събира в посуда, з а щ и т е н а о т адхезия на
клетки към с т е н и т е ; б) изброяването на
к л е т к и т е т р я б в а да започне максимално
бързо (до 3 0 - т а min), а при някои случаи и до
леглото на болния; в) задължително се бро­
я т е р и т р о ц и т и т е и левкоцитите; г) изб­
рояването на к л е т к и т е да с т а в а във в т о ­
р а т а порция в н а т и в е н ликвор; д) при съм­
нение за и н т р а т е к а л н о кървене еритроци­
т и т е и л е в к о ц и т и т е се б р о я т във всяка
порция поотделно. При макроскопски гноен
или кървав ликвор се използва разреждане на
ликвора с физиологичен разтвор. Основните
м е т о д и за изброяване на к л е т к и т е в ликво­
ра са два.
К а м е р е н м е т о д . И з п о л з в а т се различни ви­
д о в е к а м е р и с о б е м о т 3 до 50 ц1. У н а с н а й -
правилно е ползването н а к а м е р а т а н а
F u c k s - R o s e n t h a l . К а м е р а т а се с ъ с т о и о т 16 го­
леми к в а д р а т а , оградени с т р о й н а линия. Всеки
един о т г о л е м и т е к в а д р а т и съдържа 16 малки
к в а д р а т а , оградени о т единична линия. Каме­
р а т а е с обем 3,2 mm 3 или 3 м1. Върху добре по­
ч и с т е н а камера се п о с т а в я покривно стъкло и
се следи за образуване н а Нютонови пръстени.
П о с т а в я се капка добре размесен, н а т и в е н лик­
вор ( о т в т о р а т а пориия), и з ч а к в а т се 2-3 min,
за да се у т а я т к л е т к и т е и се б р о я т по прави­
л о т о н а Вц гкег, с а л ю з а к р а й н и т е т р о й н и
л и н и и . Полученият р е з у л т а т се разделя на 3,
з а д а се получи в 1 или в 106/1. К л е т к и т е се
б р о я т при увеличение 150 - 300. К а м е р а т а на
Barker не се препоръчва поради малкия обем и
г о л я м а т а грешка. Започва се с изброяване н а лев­
к о ц и т и т е , след т о в а н а е р и т р о ц и т и т е , а при
необходимост и н а т р о м б о ц и т и т е .
А в т о м а т и ч н о б р о е н е . Едва през послед­
н и т е 1-2 години на пазара се появи апара­
т у р а , с п е ц и а л н о пригодена за а в т о м а т и ч -
635
но изброяване на е р и т р о ц и т и и левкоцити
в ликвора, при разход на минимален обем.
Изброяването на левкоцити и еритроци­
т и е изключително важно, рутинно изслед­
ване. Всеки един о т изследваните ликворни
параметри трудно се интерпретира, без да
се знае б р о я т на т е з и клетки. В ликвора in
vitro т е се лизират много бързо, напр. не-
у т р о ф и л н и т е гранулоцити л и з и р а т най-
бързо и след 2 часа б р о я т им намалява с 40-
45%. Това лизиране само до известна с т е ­
пен намалява, ако ликворът се запази до из­
брояване на к л е т к и т е при 4-8° С. При камер­
н о т о броене на к л е т к и т е в нативен ликвор,
разграничаването на левкоцити о т е р и т ­
роцити се базира на общоприетите к р и т е ­
рии, използвани и при седимент на урина­
та.
За оценка на и с т и н с к и т е л е в к о ц и т и
(Lks) в ликвора при а р т е ф а к т н о примесена
кръв се използват различни формули. Най-
широко се използва правилото, според кое­
т о на 700-1000 е р и т р о ц и т а (Erys) да се из­
важда по 1 левкоцит, ако к р ъ в н а т а к а р т и ­
на е нормална. Ако в периферията има лев-
коцитоза или анемия е в сила формулата:
Lks 6 кърв. л и к в о р (Lks 6 п е р и ф .
Б
Рой кръв х Erys в ликвор)
ucm.Lks =
Ег
в ликвор У8 в
п е р и ф е р н а кръв
След изброяването на е р и т р о ц и т и и лев­
коцити е задължително диференцирането
на левкоцитите, независимо о т броя им. То­
ва обаче изисква изготвяне на н а т р и в к а с
обогатяване наликворните клетки. В лите­
р а т у р а т а са известни десетки методи о т
рода на центрофугиране, филтриране, седи-
ментиране и др.
Основно п р а в и л о п р и цснтрофуЖни-
т е м е т о д и е нискооборотно (до 500-700 об/
min) щадящо центрофугиране, к о е т о най-
лесно се постига с различните видове ц и т о -
центрофуги. Главен н е д о с т а т ъ к на т е з и ме­
т о д и е загубата на ликвор. Последните го­
дини се появиха цитоцентрофуги със запаз­
ване на ликвора.
Ф и л т р а ц и о н н и т е м е т о д и , вкл. и т е ­
зи с Mllipore в най-различни варианти, во­
д я т в различна степен до морфологични про­
мени на клетките. Изискват специални фил-
т р и , прилагане на строго определено наля­
гане и са трудоемки. Особена т р у д н о с т при
т я х представлява о ц в е т я в а н е т о , т ъ й ка-
636
т о различните филтри абсорбират боите 6
различна степен.
С е д и м е н т а ц и о н н и т е м е т о д и са ши­
роко разпространени и са евтини. Изпълня­
в а т се в много различни модификации. В Ев­
ропа, вкл. и у нас е п о з н а т а к а м е р а т а на
Sayk. Най-подходящи са т е з и с ускорена се-
диментация и запазване на ликвора за по­
следващо биохимично изследване. Веднъж
п р и г о т в е н а т а обогатена ликворна натрив­
ка след т о в а може да се оцветява по различ­
ни м е т о д и в зависимост о т т ъ р с е н и т е
клетки. Метод на избор за оцветяване на
ликворните клетки за рутинно изследване
е т о з и на Pappenheim с May-Grünwald - Gi-
emsa при следната техника:
а) и з с у ш е н а т а н а въздух н а т р и в к а не се
фиксира и се залива с р а з т в о р на May-
Grünwald за 2 min;
б) промива се с вода с неутрално pH за 1 min;
в) залива се с разреден ра зтвор на Giemsa
(1 капка на 2 ml дестилирана вода с не­
утрално pH) за 20 min;
г) изсушаване;
д) микроскопиране.
Ч е с т о използвани м е т о д и за оцветяване са:
а) no Rehm с метиленово синьо (при съмне­
ние за бактериални инфекции);
б) no Papanicolau с хематоксилин (за т ъ р ­
сене на туморни клетки);
в) no Kollmel с метиленово зелено и пиронин
(за нуклеопротеини) за търсене на акти­
вирани лимфоцити и моноцити, плазма-
т и ч н и клетки и др.;
г) по Jager с крезилвиолет (за туморни клет­
ки);
д) по Bischoff със судан и алфа-нафтилаце-
т а т е с т е р а з а (за бластни клетки).
Независимо о т и з к л ю ч и т е л н а т а важ­
н о с т на обикновеното диференциално брое­
не на левкоцитите, досега не са използвани
а в т о м а т и ч н и методи за диференциране. По
правило диференцирането е задължение
н а л а б о р а т о р н и я л е к а р , н е н а лабо­
р а н т а , т ъ й к а т о разграничаването на лев-
к о ц и т н и т е субпопулации е трудно. Много
о т к л е т к и т е и м а т морфологична характе­
ристика, различна о т т а з и в периферията.
Д о с т а т р у д н и за оценка са т в ъ р д е различ­
н и т е по големина, форма и с т р о е ж лимфо-
 mu, моноцити и макрофаги. Много пог-
w ш н о е становището, че когато броят на
ikouumume е малък, диференциалното бро-
з е излишно, т ъ й к а т о нормоцитозата не
^лючва цитопатология.
Норм&ллилтп л и h ( t o p е ц и п ю л о г и ч н о
ден, к а к т о п о о т н о ш е н и е брой н а
и т р о ц и т и , л е в к о ц и т и и трольбоци-
'X, т а к а и н а л е И к о ц и т н и п о п у л а ц и и .
В първата порция б р о я т на еритроцити-
! и т р о м б о ц и т и т е е по-висок, освен в слу-
л т е на интратекално кървене. Е р и т р о -
ь т р а х и я се приема, к о г а т о б р о я т на
п л т р о ц и т и т е е н а д 5 в ц1. За п л е о ц и т о -
(макар т о в а название да е неточно, но
ipoko използвано) говорим, когато броят
левкоцитите в лумбалния ликвор е над
i 8 в ill. Плеоцитозата се степенува к а т о
d к а (10 д о 50), у м е р е н а (51 д о 200), с и л -
I (201 д о 1000) и л т о г о с и л н а - н а д 2001
"вкоцита, с т и г а щ а п о н я к о г а д о
000 - 50 000 в / х / .
Нормално се у с т а н о в я в а т следните ви-
Зе клетки:
шмфоцити - спокойни - 70-75% (В- и Т-лим-
^оцити);
моноцити - спокойни - 15-25%;
ретикулни клетки - 1-5%;
неутрофилни гранулоцити - по изключе­
ние до 1%;
други клетки - плексусни, епендимни, гли-
ални и др до 1%.
При патология м о г а т да се наблюдават
с| 30 вида клетки в т о в а число освен посо-
ните:
активирани В- и Т-лимфоцити (супресо-
ри,хелпери,килери);
лимфоидни клетки (големи стимулирани
лимфоцити);
плазматични клетки;
мононуклеарни фагоцити - активирани
моноцити (хистиоцити);
макрофаги (еритрофаги, сидерофаги, липо
фаги, левкоцитофаги, макромакрофаги,
меланофаги и други);
гигантски клетки;
сегментоядрени гранулоцити (неутро ,
еозино- и базофилни);
LE клетки (lupus erythematosus cell);
• клетки о т костен мозък;
• епителни клетки ( о т кожата);
• туморни клетки (бластни и туморни
клетки);
• дегенеративни клетки.
Понастоящем съществува възможност
да се диференцират голям брой о т ликвор-
н и т е клетки на базата на имунофенотипи-
зирането. Определено място в диагности­
к а т а и за оценка на терапията особено на
демиелинизиращите заболявания вече има
определянето на х е л п е р и и техни субпо-
п у л а ц и и , килъри, с у п р е с о р и и мн. др. И
т у к отново проблемът е броят на левкоци­
т и т е . Това изследване също налага предва­
рително щадящо обогатяване на клетките
в минимален обем ликвор. При здрави броят
на Т-клетките е по-голям о т този на В-лим-
фоцитите.
Н о р л ю ц и т о з а с поява на активирани
лимфоцити и нарушено отношение В/Т лим­
фоцити в полза на Т-клетките характери­
зира началната фаза на локален клетъчно-
медииран имунен отговор. Л е к а плеоци-
т о з а с а к т и в и р а н и лилгфоидни и
п л а з м а т и ч н и к л е т к и е харатерна за де-
миелинизиращи заболявания, невросифилис,
HIV-инфекции, хроничната фаза на тубер­
кулозен менингит и др. Особено пъстра е
лимфоцитната картина при хроничната
фаза на туберкулозен менингит, малигнени
мозъчни тумори, карциноматозна церебрал­
на дегенерация и др. У м е р е н а плеоцито-
з а с л и м ф о ц и т о з а , стигаща до 95% се сре­
ща при лимфоцитарния менингит. Намира­
н е т о на плазматични клетки не е задължи­
телно да се съпровожда с олигоклоналносш
в ликвора.
Клетките на мононуклеарната фагоцит-
на система са представени о т спокойни мо­
ноцити. Тяхното активиране и увеличение
е особено характерно за различните видове
съдови инциденти в мозъка, както и за теж­
ко протичащи дистрофични процеси и др.
Активирането на т е з и клетки е свързано и
с поява на различни макрофаги. Названието
на макрофагите се определя о т фагирания
материал. Е р и т р о ф а г и т е се срещат при
интратекално кървене, като най-ранната
им поява е още между 2-12-я h о т началото
на инцидента и при липса на повторно кър­
вене, т е изчезват на 6 - 7-я ден. След това се
637
 з а м е с т в а т о т сидерофаги. Едновремен­
н о т о намиране н а еритрофаги и сидерофа-
ги говори за о т д а в н а започнало и продължи­
ло кървене. П о я в а т а на различни видове фа-
ги in vitro се с м я т а за невъзможно, освен в
изключително редки случаи, к о г а т о кървав
ликвор е престоял часове или дни до момен­
т а на изследването. Л е в к о ф а г и т с харак­
т е р и з и р а т ф а з а т а след изразена плеоцито-
за. Те се с р е щ а т при различни видове менин­
гити, в т о в а число и мозъчно-съдова болест.
Л и п о ф а г и т е се наблюдават при т е ж к и
дистрофични процеси на ЦНС - енцефалити,
паркинсонизъм, болест на Alzheimer и др.
М е л а и о ф а г и с о ч а т за първичен или в т о ­
ричен меланом.
Особено важна цитологична находка са
г р а н у л о ц и т и т с - неутрофилни, еозино-
филни и базофилни. Висока н е у т р о ф и л и я
характеризира о с т р и т е бактериални ин­
фекции, без инт и мн о да е свързана с вида на
причинителя. При бактериалните менинги­
т и , особено при деца, неутрофилията може
да достигне до 100%. Успоредно с плеоцито-
з а т а , неутрофилията служи за монитори-
ране на е ф е к т а о т а н т и б а к т е р и а л н а т а т е ­
рапия. При вирусните инфекции неутрофи­
л и я т а е лека (до 30%) и бързо преходна, чес­
т о неуловима. При менингит т и п „чуждо
тяло" т я може да достигне 50-60%. Винаги
след и н т р а т е к а л н о кървене в началото се
наблюдава различна по степен неутрофилия,
к о я т о може да корелира с макрофагоцито-
за. При туберкулозния менингит т я е уме­
рена и се засилва при обостряне на процеса.
Еозинофилията в ликвора е в и н а г и патоло­
гична находка. С л а б о и з р а з е н а - до 5% е
много честа и може д а придружава неутро­
филията при туберкулозен м е н и н г и т , нев-
росифилис, паненцефалит, при Coxsackie м е ­
нингит, някои вирусни м е н и н г и т и , Улгсре-
н а е о з и н о ф и л и я е демонстрирана п р и мо­
зъчна хеморагия, хидроцефалия гъбичкови
инфекции и др. С и л н о и з р а з е н а еозино-
ф и л и н до 50-80% се среща п р и п а р а з и т н и
инфекции н а ЦНС в това число трихинело­
за, цистицеркоза, аскаридоза, токсоплазмо-
за, идиопатичен еозинофилен м е н и н г и т и
др. Б а з о ф и л н и г р а н у л о ц и т и се срещат
изключително рядко в ликвора и т я х н а т а
поява, особено п р и деца, се п р и е м а з а л о щ
прогностичен белег.
Б л а с т н и к л е т к и . Този термин, макар
638
и не съвсем точен, е придобил популярносгт
Някои автори използват термини к а т о мщ
фоидни плазмоцити, лимфоидни плазмоблас
т и и др. Тези клетки се с р е щ а т в ликвор
при различни лимфопролиферативни заболя
вания с първично или вторично засягане н,
ЦНС (ретикулосаркоми, лимфосаркоми UAI
неходжкинови лимфоми, лимфобластни и ми
елобластни левкемии и др.). Морфологична
т а характеристика, специалното оцветя
ване и CD-маркерите улесняват тяхнот«
диференциране. При наличие на артефакпА
но кървене намирането на бластни клеткт
се и н т е р п р е т и р а внимателно за произходг
им. В л а с т н и т е клетки с л у ж а т за монито
риране на и н т р а т е к а л н а т а т е р а п и я .
Т у л ю р н и к л е т к и . Намирането даже са
мо на една т у м о р н а к л е т к а в ликвора вери
фицира диагнозата. Важно предварителнс
условие е използването на добре обогатеш
натривка. В т о з и случай цитоцентрофуж-
н и я т м е т о д е за предпочитане. Второтс
важно условие е използването на различш;
методи за оцветяване на б л а с т н и т е и ту-
морните клетки. На т р е т о , но не на послед­
но м я с т о , намирането на туморни клетки
зависи о т о п и т а на лабораторния лекар и
в н и м а т е л н о т о продължително гледане на
н а т р и в к а т а . Установяването на туморни
клетки в ликвора зависи преди всичко о т то­
ва дали е първичен или вторичен тумор, не­
говия вид, експанзивност, локализация, ста­
дий на развитие, близост с ликворните прос­
т р а н с т в а , вид на ликвора (вентрикулен,
лумбален) и мн. др. По прави^ю п р и пър­
в и ч н и т е т у м о р и н а ЦНС делюнстри-
р а н е т о н а т у л ю р н и к л е т к и е много
п о - р я д к о и с е д в и ж и от 0 д о 30%. Значи­
т е л н о по-висок е п р о ц е н т ъ т н а откри-
в а е м о с т н а т у л ю р н и к л е т к и п р и вто­
р и ч н и ( л ь е т а с т а т и ч н и ) т у м о р н и про­
цеси, д о с т и г а щ о п р и к а р ц и н о м а т о з а
н а л ю н и н г и т е д о 100%. Съществено е да
се подчертае, че намирането на туморни
клетки в ликвора може да се срещне както
при нормоцитоза, т а к а и при плеоцитоза.
Х а р а к т е р и с т и к а т а на т у м о р н и т е клетки
с ъ о т в е т с т в а на общоприетата анизоцито-
за, пойкилоцитоза, полихромазия, базофи-
лия, нуклеолизация, голи ядра, митози и дру­
ги.
 БИОХИМИЧНО И ИМУНОЛОГИЧНО
1 ИЗСЛЕДВАНЕ
В ликбора м о г а т д а б ъ д а т анализирани над
750 п о к а з а т е л и , к о и т о се и з с л е д в а т в ъ в
в т о р а т а и т р е т а т а порция след ц е н т р о ­
фугиране н а ликвора. З а д ъ л ж и т е л н о е първо
д а се проведе ц и т о л о г и ч е н анализ. Обикно­
вено се започва с б е л т ъ ц и т е . Ликворът е око­
ло 200 п ъ т и по-беден н а общ б е л т ъ к , в срав­
нение с к р ъ в н и я серум, поради в и с о к а т а рес-
т р и к т и в н о с т и умерена селективност на
КЛБ. М а к а р през п о с л е д н и т е години д а е до­
казано, че е в ъ з м о ж е н с и н т е з и секреция н а
б е л т ъ ц и и н т р а т е к а л н о , с малки изключения
(бета- и гама- trace протеини, may проте­
ин, миелинбазичен п р о т е и н и кисел фибри-
ларен глиален б е л т ъ к ) п о в е ч е т о о т б е л т ъ ­
ц и т е в ликвора и м а т х е м а т о г е н е н произход.
Б е л т ъ ч н и я т с ъ с т а в н а ликвора зависи и о т
м я с т о т о , о т к ъ д е т о е получен. О т крани-
ално к ъ м каудално б е л т ъ ч н а т а к о н ц е н т р а -
I ц и я се увеличава с около 30 %.
И з п о л з в а н и т е в м и н а л о т о полуколи-
чествени проби за общ белтък и о т ­
делни ф р а к ц и и , к а т о проба н а Nonne-
Apelt, Weichbrodt, Р и в а л т а о т д а в н а с а за­
г у б и л и с в о е т о з н а ч е н и е . Само т а з и н а
P a n d y c e използва з а п р е д в а р и т е л н о ориен­
т и р а н е . Важно условие з а правилно провеж­
дане н а т а з и проба е и з п о л з в а н е т о н а наси­
т е н при 37° С р а з т в о р н а карболова кисели-
вм н а и последващ п р е с т о й н а р а з т в о р а з а 24 h
ви н а с т а й н а т е м п е р а т у р а . Р а з т в о р ъ т се раз­
деля н а две фази и з а п р о б а т а н а Pandy се
използва с а м о н а д с т о я щ а т а (горна) бис­
т р а т е ч н о с т . Тази проба не може д а бъде
о т р и ц а т е л н а , поради в и с о к а т а си ч у в с т в и ­
т е л н о с т . Р а з л и ч а в а т се с л е д н и т е степе-
I \ ни: едва д о л о в и м и следи, следи, слабо поло­
жителна, положителна, с и л н о положител­
н а и м н о г о с и л н о положителна. Нормални
я т ликвор д а в а п ъ р в и т е две с т е п е н и . С т е
п е н т а н а и з р а з е н о с т н а т а з и проба опреде
ля к а к щ е се проведе к о л и ч е с т в е н о т о изс
ледване н а о б щ и я б е л т ъ к в ликвора - с или
без п р е д в а р и т е л н о разреждане.
> Общ б е л т ъ к
Много в а ж е н и основен п о к а з а т е л , к о й т о се
определя к а т о с а м о с т о я т е л е н п а р а м е т ъ р
и е необходим при определяне н а всеки друг
п о к а з а т е л . Т р у д н о с т и т е при избор н а ме­
т о д за определяне н а общия б е л т ъ к в ликво­
р а с а свързани с: а) н и с к о т о белтъчно съ­
държание (около 200 п ъ т и по-ниско о т т о в а
в кръвния серум); б) л и к в о р ъ т съдържа раз­
лични т и п о в е б е л т ъ ц и (над 50 вида). Основ­
ни с а албумин и гама-глобулини; в) задължи­
т е л н о е м е т о д ъ т да се изпълнява с минини-
мално количество ликвор (под 20 ц1). Същес­
т в у в а т няколко групи м е т о д и , някои о т ко­
и т о само с историческо значение (табл. 2).
Важно условие е с т а н д а р т и з а ц и я т а на ме­
т о д и т е за определяне н а общия б е л т ъ к в
ликвора. Препоръчително е да се използва
смес о т човешки албумин и човешки глобу­
лини в отношение 70:30. Ликворолозите в све­
т а п р е п о р ъ ч в а т 3 - 5 т о ч к о в а калибрация,
к о я т о да започва о т 50 и с т и г а до 1000 mg/
1. При очакване н а по-висока белтъчна кон­
ц е н т р а ц и я в ликвора съгласно предварител­
н а т а проба н а Pandy е необходимо разреж­
дане н а ликвора.
Х и п е р п р о т е и н р а х и я т а е изключително
ч е с т а неспецифична находка. Тя е р е з у л т а т
н а повишен п е р м е а б и л и т е т н а КЛБ или на
и н т р а т е к а л н а б е л т ъ ч н а с и н т е з а , най-чес­
т о имуноглобулинова. Движи се в граници­
т е о т 0.50 до 35.0 g/1. Лека протеинрахия
има при редица дегенеративни заболявания
н а ЦНС, к а к т о и при голям брой системни
заболявания със засягане на ЦНС. В т е з и слу­
чаи много ч е с т о т я е продължителна и бав-
нопрогресираща. Умерена хиперпротеинра-
хия се среща при различни видове менинги­
т и , в т о в а число и туберкулозен менингит,
HIV - инфекции, някои мозъчни т у м о р и и др.
Тежка хиперпротеинрахия е характерна
преди всичко за спинални процеси о т тумор-
но, гумозно и съдово е с т е с т в о .
Д и с п р о т е и н р а х и я т а е ч е с т а ликворна
находка и се среща к а к т о при нормо- т а к а
и при хиперпротеинрахия. Особено ч е с т о се
среща в случаите, к о г а т о има и н т р а р т е -
кална п р о т е и н о в а с и н т е з а , главно имуног­
лобулинова. У с т а н о в я в а н е т о н а диспроте­
и н р а х и я т а изисква използването н а е ле к т -
рофоретични м е т о д и и/или определянето
н а индивидуални белтъци. О т многобройни­
т е е л е к т р о ф о р е т и ч н и м е т о д и най-широко
приложение и м а т м е т о д и т е с агароза и ка­
пилярна електрофореза (за подробности виж
639
2 Таблица 2. M e m o g u з а о п р е д е л я н е н а о б щ б е л т ъ к 6 л и к б о р

Метод Принцип Ковиенпшр Забелегкка

1. Т урбид и м е т р и ч и и * образуване на преципитати при различно pH различна чувствителност
ССКб% образуване на различни п р е ц и п и т а т и слаба чувствителност, голям обем, мануален историческо значение
с различни белтъци
Т О К 26% / / - / / - / / no-слаба чувствителност о т предходния, голям историческо значение
обем, мануален
ССК 6% и Na,S0 4 14% образуване на едни и същи п р е ц и п и т а т и с по-добра чувствителност и по малък обем о т дълго време пред почитан м е т о д
различни белтъци горните два, мануален
Benzethonium chloride еднакви п р е ц и п и т а т и с различни белтъиц много добра чувствителност и специфичност, предпочитан метод в някои страни,
автоматичен, микрообем сравнително скъп, готови т е с т о в е
2. Б и у р е т о в и 4 *
БиуретоВ биуретоб а реакция слаба чувствител н о с т , голям обем рядко се използва
Биуретоб биуретоб а реакция след предварителна двустъпален, добра чувствителност и в някои с т р а н и се предпочита
прецтитация специфичност, слаба интерференция, голям обем,
трудоемък
S. L o w r y ф ф ф комплексно цветно съединение с р в а много чувствителен, ултрамикрообем, двустъпален, р е ф е р е н т е н м е т о д
на Folin-Ciocalteu мануален
4. Н н т и В и п с п е к т р о - абсорбцля на пептидни връзки при 200 210 много чувствителен и специфичен, мануален, рядко приложим, изисква качествен
ф отгтм е т ри я и 280 п т с п е к т роф о т о м е т ъ р
5. С е л е к т и в н и бои**** образуване на цВетнисъединения с различен много чувствителни, добра специфичност, бьрзи, намират все по широко разпространение
абсорбционен максимум автоматични
Coommassie brilliant и в е т н о съединение с максимум н а абсорбцая много чувствителен, добра специфичност, бърз, предпочитан м етод, широко
blue G 260 при 760 п т автоматичен, ултрамикрообе м разпространен
Ponceau S ц в е т н о съединение с максимум на абсорбеддя много добра чувствителност и специфичност, до преди години широко п р и е т и
при 660 двустъпален, мануален използван
Pyrogaloll red максимум на абсорбция 600 п т бърз .чувствителен, автоматичен, ултрамикрообем п р е д п о ч и т & н м е т о д

* П ъ р в и т е д в а м е т о д а се използваха широко в м и н а л о т о . П о л у ч е н и т е п р е ц и п и т а т и се и з м е р в а т с п е к т р о ф о т о м С т р и ч н о п р и 340, 430 или 540, н о н а й добре при 400- 430 п т . Много се в л и я я т о т п р о м е н и т е в
л и к в о р н о т о p H in vitro. Не д а в а т е д н а и с ъ щ а оценка з а а лбу м и н а и глобулините. И з и с к в а т 3 - 4 т о ч к о в а калибрация. П о к а з в а т слаба и н т е р ф е р е н ц и я . Т р е т и я т м е т о д и з в е с т е н още по с в е т а к а т о м е т о д н а
MeuJemans о т 1960 г. е със 6% сулфосалицилова киселина и 14% н а т р и е в с у л ф а т . Ч у в с т в и т е л н о с т т а м у е по-добра о т т а з и н а п ъ р в и т е д в а и е около 50-80 mg/1 Този м е т о д дълго време служеше к а т о р е ф е р е н т е н
В някои м а л к и л а б о р а т о р и и т о й п р о д ъ л ж а в а д а се използва и сега. Най-добре е о т ч и т а н е т о н а п р е ц и п и т а т и т е д а се о с ъ щ е с т в я в а при 430 - 440 п т . През п о с л е д н о т о д е с е т и л е т и е се п р е д л а г а т и други п р е ц и п и т а -
ционни м е т о д и , к а т о т о з и н а T h o m p s o n с Benzethonium chloride и алкална среда, и о т ч и т а н е при 410 п т . Ч у в с т в и т е л н о с т т а м у д о с т и г а до 30- 50 mg/1.
" Б и у р е т о в и я т м е т о д в различни модификации п р о д ъ л ж а в а д а с е използва в н я к о и Европейски с т р а н и . Р е а к т и в ъ т е с т а б и л е н , ц е н а т а е ниска, и н т е р ф е р е н ц и я т а слаба. Т р у д н о с т и т е п р о и з т и ч а т о т необходи­
м о с т т а л и к в о р н и т е б е л т ъ ц и п р е д в а р и т е л н о д а б ъ д а т п р е ц и п и т и р а н и със ССК или ТОК и след т о в а д а се проведе б и у р е т о в а т а р е а к ц и я Д и р е к т н о т о о п р е д е л я н е н а л и к в о р н и я о б щ б е л т ъ к с б и у р е т о в а т а
реакция с е отрича поради слаба чувствителност.
" ' М е т о д ъ т н а Lowry се използва в м н о г о с т р а н и п о с в е т а главно поради в и с о к а т а си ч у в с т в и т е л н о с т ( 8 - 10 mg/1) и разход н а миним алн о к о л и ч е с т в о ликвор, с т и г а щ о до 1 - 2 М1 при някои модификации.
Р е а к ц и я т а е д в у с т ъ п а л н а , к а т о в п ъ р в а т а с т ъ п к а б е л т ъ ц и т е р е а г и р а т с м е д н и т е йони в а л к а л н а с р е д а . Във в т о р а т а с т ъ п к а о б р а з у в а н и я т комплекс с н а л и ч н и т е т и р о з и н и т р и п т о ф а н редуцира фосфоволфра-
м о в а т а - ф о с ф о м о л и б д е н а т а киселина до ц в е т е н п р о д у к т . А б с о р б ц и о н н и я т м а к с и м у м н а т о з и ц в е т е н п р о д у к т е п р и 750 п т . М е т о д ъ т е д о с т а т р у д о е м ъ к . Р е а к т и в ъ т н а Foün-Ciocalteu се п р и г о т в я т р у д н о и изисква
т и т р и м е т р и ч н а корекция н а pH. Ч и с т о т а т а н а п о с у д а т а е с ъ щ о много в а ж н а . Този м е т о д е т р у д о е м ъ к и все още н е е а в т о м а т и з и р а н . П о к а з в а и н т е р ф е р е н ц и я о т л е к а р с т в а Въпреки т е з и т р у д н о с т и според
някои а в т о р и т о в а е м - е т о д н а и з б о р , п р и е т з а р е ф е р е н т е н .
**** М е т о д и т е със с е л е к т и в н и бои н а м и р а т все по-широко приложение през п о с л е д н и т е години. К о м п л е к с ъ т б е л т ъ к - б о я н а й - ч е с т о и м а висок е к с т и н к ц и о н е н к о е ф и ц и е н т , понякога по-висок о т т о з и при м е т о д ъ т
н а Lewry. П р о б л е м ъ т е доколко в з а и м о д е й с т в и е т о б е л т ъ к - б о я се влияе о т а м и н о г р у п и т е , т е о т р а з л и ч н и т е б е л т ъ ц и , т р а й н о с т т а н а т о з и ц в е т е н комплекс, п о в л и я в а н е т о м у о т p H и л е к а р с т в е н и с р е д с т в а . Н е
по-малък проблем е о ц в е т я в а н е т о н а о т ч и т а щ и т е к ю в е т и и др. П р е д л а г а т с е м е т о д и с много различни бои и буфери при кисело pH. И з п о л з в а т се бои к а т о Coommassie brilliant blue G 250, P o n c e a u S, Pyrogallol red. В
з а в и с и м о с т о т абсорбционния м а к с и м у м н а ц в е т н и я комплекс о т ч и т а н е т о е м е ж д у 550 и 750 п т . О т с е л е к т и в н и т е бои най-широко се п р и е м а м е т о д ъ т с Coommassie brilliant blue G 250.
О т д е л н и ф и р м и п р е д л а г а т различни г о т о в и р е а к т и в и н а б а з а т а н а т у р б и д и м е т р и я или с е л е к т и в н и бои. З а н а ш а т а с т р а н а е п р е п о р ъ ч и т е л н о в л ю л к и т е л а б о р а т о р и и д а с е и з п о л з в а т у р б и д и л г е т р и -
ч е н л г е т о д с Benzethonium chloride и л и с ъ с с е л е к т и в н и б о и , а в п о - г о л е л г и т е л б о р а т о р и и и л ъ е т о д ъ т на. Lowry.
глава 12) Информацията, к о я т о се получава
о т е л е к т р о ф о р е з а т а продължава да има в
много случаи водещо значение за характе­
ризиране на патологичния процес.
Индивидуални б е л т ъ ц и
О т и д е н т и ф и ц и р а н и т е в ликвора 76 инди-
0^9узл^^ о е л т ъ ц и особено значение и м а т
следните:
• npccuiöyAiuH, к а т о показател за п р о т е -
инрахия, секреция и движение на ликвора.
Колкото по-висока е хиперпротеинрахия-
т а , толкова по-силно е намалена релатив-
н а т а концентрация на преалбумините.
И з в е с т н и са две фракции - п е р м е а б и л и -
т е т н о зависилга и независилга.
• с и г б у л т н - т о в а е основния бариерен мар­
кер за с е л е к т и в н о с т , много ч е с т о изпол
зван при определяне на всички индекси и
концентрационни коефициенти на различ­
ни белтъци, поради изключителната си
и н т р а х е п а т а л н а с и н т е з а . Намаление на
к о н ц е н т р а ц и я т а на албумина в ликвора
не се среща. Н е г о в а т а промяна е винаги в
посока на увеличение и е във висока поло­
ж и т е л н а корелация с общия белтък. При
хиперпротеинрахия увеличението на ал­
бумина пропорционално е по-високо о т
т о в а на общия белтък;
• m a y - г л о б у л и н - широко използван бел­
т ъ к при б о л е с т т а на Alzheimer;
• а л ф а - 2 - л 1 а к р о г л о б у л 1 1 н е бариерен мар­
кер за неселективен п е р м е а б и л и т е т на
КЛБ. Необходимо е винаги да се изследват
успоредно с албумина;
• п г р а н с ф с р и н и н е г о в а т а сиалодефицит-
на форма с а маркер за хроничен алкохоли­
зъм и алкохолна енцефалопатия;
• а л ф а ! -кисел г л и к о п р о ш е и н е остро
фазов и т р а н с п о р т е н белтък на а н т и -
епилептични и други лекарства,
• б с т а - 2 - л 1 и к р о г л о б у л и н е установен в
ликвора главно при засягане на ЦНС о т ос­
т р и лимфопролиферативни заболявания,
• C R P ч е с т о се използва за диференциране
на бактериални о т вирусни менингити и
туберкулозен менингит. Неговото увели
чение ч е с т о се с ъ п ъ т с т в а с т о в а на т у
морнекротизиращия фактор (TNF),
• м и е л и н б а з и ч е н п р о т е и н (МВР) е по­
казател за демиелинизация;
• S 100 п р о т е и н се синтезира о т астро-
ц и т и т е и е диагностично важен при ами-
отрофична латерална склероза, остър ен-
цефаломиелит и паркинсонизъм;
• и н т е р ф е р о н / и - нивото на различните
типове е важен диагностичен и терапев­
т и ч е н показател при м н о ж е с т в е н а т а
склероза и HIV-инфекциите;
• ф и б р о н е к т и н е увеличен при астроци-
т о м и и м е т а с т а т и ч н и карциноми;
• е м б р и о н а л н и б е л т ъ ц и , о т които ал-
фа-фетопротеина (AFP), карциноембрио-
налния антиген (СЕА) и човешкия хорион-
гонадотропин (HCG) се изследват при раз­
лични първични и вторични неоплазми на
ЦНС.
Имуноглобулини. Те са важен диагности­
чен и терапевтичен показател в ликвороло-
гията. Приети са к а т о критерии за диаг­
ноза на различни неврологични заболявания.
• IgA - в ликвора преобладава IgAl. IgA ин­
дексът е увеличен при МС (около 20% ), ви­
русни менингити и при ЦНС-лупус, но е
нормален при невроборелиоза.
• IgG - са с най-висока концентрация в лик­
вора. О т ч е т и р и т е подкласа на IgG - 1, 2,
3 и 4 в ликвора нормално преобладава IgG
1 и 2. Определянето на абсолютната им
концентрация изисква и установяване на
техния произход - интратекален или хе-
матогенен. За т а з и цел се изследва ниво­
т о на IgG в серума и ликвора и албумина в
д в е т е биологични т е ч н о с т и . IgG индекс,
както и IgG с и н т е з а т а са увеличени глав­
но при демиелинизиращи и инфекциозни за­
болявания на ЦНС. Ликвор/серумният ко­
ефициент на албумина нормално е 1.230, а
т о з и на IgG 1:369. Средната синтезна ско­
р о с т за IgG за 24 h нормално варира о т
минус 9.9 до плюс 3.3. Увеличена синтеза
се среща между 93 - 99% при болни с МС,
успоредно с олигоклонални ивици. Опреде­
лено клинично значение има изследването
на капа/ламбда леките вериги на IgG. Нор­
мално т о в а отношение е около 1 и е силно
променено при МС, невросифилис и идио
патичен полиневрит.
• IgM са с най-ниска концентрация, ч е с т о
неуловима с използваните методи. IgM ин-
641
 д е к с ъ т може д а бъде променен успоредно
с IgG и/или IgA, или с а м о с т о я т е л н о . Изо­
лирано повишен IgM индекс се среща при
невроборелиоза, т о к с о п л а з м о з а други.
Комбинаиия о т увеличен IgG индекс и/или
IgM индекс с лека плеоиитоза и положи­
т е л н а VDRL се приема в 100 % за присъс­
т в и е т о н а а с и м п т о м а т и ч е н невросифи-
лис. Т и т ъ р ъ т пада ч е т и р и п ъ т и в рам­
к и т е н а т р и месеиа и осем п ъ т и в рамки­
т е н а ш е с т месеиа при успешно лечение.
М е т о д и т е к о и т о най-често се използват
за определяне н а индивидуалните б е л т ъ и и
б и в а т : а) е л е к т р о ш ч у н о д и ф у з и я в ага-
розен гел с 3-4 с т а н д а р т а и о и в е т я в а н е с
Coommassie brilliant blue или р а з т в о р н а среб­
ро, б) к а п и л я р н а е л е к т р о ф о р е з а , 6) н е-
фелольстрия, при к о я т о към о б и ч а й н и т е
нефелометри се използва спеииална прис­
т а в к а . Р е ф е р е н т е н м е т о д за определяне
на албумин в ликвора за сега е е л е к т р о -
и м у н о д и ф у з и я т а , поради ниска йена, мно­
го добра възпроизводимост и о т л и ч н а спе­
цифичност. О с т а в а т в сила препоръките за
3-4 с т а н д а р т а о т човешки албумин и оцве­
т я в а н е с комаси или сребро. З а л и к в о р н и т е
и м у н о г л о б у л и н и , к а т о р е ф е р е н т е н ме­
т о д за сега се приема р а д и а л н а т а иму-
н о д и ф у з и я . Е в р о п е й с к а т а ликворологична
о б щ н о с т препоръчва използване н а висока
антисерумна концентрация в гела, 4-5 с т а н ­
д а р т а о т човешки имуноглобулини, изчак­
ване н а крайна дифузия, о ц в е т я в а н е с кома­
си или сребро. Много ч е с т о п р е д л а г а н и т е
търговски плаки за имуноглобулини в ликво­
ра са с н е д о с т а т ъ ч н а ч у в с т в и т е л н о с т по­
ради ниска а н т и с е р у м н а к о н ц е н т р а ц и я .
Спектрофотометрия на ликвор
Н а т и в н а т а с п е к т р о ф о т о м е т р и я (СФМ) е
съвременен м е т о д за т и п и з и р а н е вида н а
к с а н т о х р о м и я т а и н е й н а т а д а в н о с т . В по­
в е ч е т о с т р а н и СФМ е задължителен м е т о д
за всички ликвори. Това е още по-необходимо
и при най-малко съмнение за съдово наруше­
ние н а м о з ъ ч н о т о кръвообращение. Чрез
СФМ се разкрива не само т и п а и д а в н о с т ­
т а на к с а н т о х р о м и я т а , но ч е с т о се регис­
трира такава, когато визуалното от­
читане д а в а негативни резултати.
Чрез т о з и м е т о д количествено се и д е н т и -
642
ф и ц и р а т всички к о м п о н е н т и водещи до
к с а н т о х р о м и я - б и л и р у б и н (късовълнов и
дълговълнов), а л б у м и н - б и л и р у б и н о в
комплекс, оксихемоглобин и метхе-
л ю г л о б и н . З а СФМ е необходим а п а р а т с
н е п р е к ъ с н а т или п р е к ъ с н а т с п е к т ъ р в рам­
к и т е н а 300 до 700 п т . Всеки о т посочените
п и г м е н т и и м а по един или няколко харак­
т е р н и абсорбционни криви. Изследва се на-
т и в е н ликвор след центрофугиране в мак­
ро- или микрокювета срещу дестилирана или
дейонизирана вода с ч и с т о т а под 1 ^s. При
невъзможност да се изследват всички абсорб­
ционни криви се о п р е д е л я т само абсорбци­
о н н и т е максимуми, к о и т о са к а к т о следва:
- з а оксихемоглобин - 415 п т
- за метхемоглобин - 410 п т
- за билирубин - 455 п т
Много по-пълноценна е и н ф о р м а ц и я т а ,
ако има н е п р е к ъ с н а т запис н а абсорбцията
в г р а н и ц и т е о т 300 до 700 п т . Тогава се о т ­
ч и т а т и т . н а р . в т о р о с т е п е н н и пикове н а
абсорбция. Н о р м а л н и я т л и к в о р н е съ-
дърЖа п о с о ч е н и т е по-горе пигльенти
и а б с о р б ц и я т а е п о д 0.050 в ъ в в с и ч к и
г р а н и ц и о т 300 д о 700 п т .
К о л и ч е с т в е н а т а оценка с т а в а на б а з а т а
н а с т а н д а р т и ( г о т о в и или приготвени в ла­
б о р а т о р и я т а ) и сравнение с нормален лик­
вор. М е т о д ъ т е изключително ч у в с т в и т е ­
лен и с о т л и ч н а възпроизводимост. И н т е р ­
п р е т а ц и я т а е т р у д н а , особено к о г а т о са на­
лице по няколко п и г м е н т а и и м а хиперпро-
теинрахия.
Ензими в ликвор
Е н з и м и т е в ликвор м о г а т да произхождат
о т м о з ъ ч н а т а т ъ к а н , мозъчни т у м о р и , о т
и з л я т а кръв субарахноидно или ликворни кле­
т ъ ч н и е л е м е н т и . Описани са и изследвани
над 50 ензима в ликвора. Значение и м а т ня­
кои гликолитични, митохондриални, нев-
р о т р а н с м и т е р н и ензими, лизозомални и дру­
ги. Повишена а к т и в н о с т н а бета-глюкоро-
н и д а з а т а се среща при 75-80% о т болните с
лептоменингеален аденокарцином и в 30%
о т т е з и с миелогенна левкемия. При л е п т о -
менингеални м е т а с т а з и с п е ц и ф и ч н о с т т а и
ч у в с т в и т е л н о с т т а н а т о з и ензим д о с т и г а
до 95% и служи за разграничаване о т други
 Н С - м е т а с т а з и . Този ензим служи и за
зедсказбане на менингеалната дисемина-
ля на солидни т у м о р и и неходжкинов лим-
ом. А к т и в н о с т т а на ACT е силно повише-
ä при мозъчни инфаркти, особено червени
при субарахноиден кръвоизлив. Креатин-
и н а з а т а и особено ВВ изоензим е увели-
зн при малигнени мозъчни тумори, епилеп-
дя, инсулти, травми и др. А к т и в н о с т т а
а ф о с ф о х е к с о и з о м е р а з а т а и аденозин-
е з с и м и н а з а т а е увеличена при туберку-
ззен менингит и по-слабо при бактериал-
и менингити. А к т и в н о с т т а на неврон-
п е ц и ф и ч н а т а е н о л а з а е повишена при
шални т у м о р и и т е ж к и травми на мозъ-
а. Особено висока ЛДХ-активност се ус-
шновява при пневмококов и менингококов
енингит. При бактериални менингити в
ДХ-изограмата АДХ 4 и АДХ 5, а при вирус-
и менингити АДХ 1 и АДХ 2. Л и з о з и м (лгу-
а л т д а з а ) показва повишена активност
ри неоплазми и особено при хистиоцита-
ен лимфом. Някои автори с ч и т а т , че т о -
j ензим може да служи к а т о маркер за ди-
еренциране на възпалителните о т нео-
ластичните процеси в ЦНС. Наблюдава се
инхронност в промените на АДХ, лакто-
•ерин и бета-2-микроглобулин.
М е т о д и т е за определяне на ензимната
к т и в н о с т в ликвора по принцип не се раз-
ичават о т т е з и за кръвен серум. Необхо-
имо е да се подчертае, че обемните отно-
дения ликвор/реактив са различни. Обичай-
о е о б е м ъ т на ликвора да е 3 - 4 пъти по
исок о т т о з и , използван за кръвен серум,
^руго важно условие е, че налични програми
а кръвен серум в а в т о м а т и ч н и т е анализа-
юри н е с а п р е п о р ъ ч и т е л н и . Изискват
е адаптирани програми с подходяш,0 изб­
рани обемни съотношения, с т а н д а р т н а
рива и контролен серум.
'люкоза
1ажен, много ч е с т о използван показател в
икворологията. В ликвора т я постъпва о т
:ръвта и концентрацията ü зависи о т кръв-
ю т о ниво и мозъчния метаболизъм. О т кра-
шално към каудално намалява с около 25
.0%. Нормално ликвор/кръв отношението
.умбален ликвор е 0.6 и при хипергликемия
шмалява. Транспортът на глюкозата с т а -
а чрез улеснена дифузия и п е т протеинови
преносители, които могат да бъдат увре­
дени самостоятелно. Това обяснява слож­
н о с т т а на интерпретация на промените.
Хипергликорахия се среща при новороде­
ни поради висок пермеабилитет на КАБ и
голяма скорост на мозъчния кръвен ток.
При диабетици повишеното ниво е резул­
т а т на хипергликемията, но поради еле­
м е н т на насищане на пренасящата систе­
ма отношението е толкова по-ниско, кол­
кото по-голямо е увеличението в кръвта (0.5
при 15 и 0.4 при 20 mmol/1). Хипогликора-
хияша, има по-голямо зчанение и се наблю­
дава при карциноматоза на менингите
( < 0.5 mmol /1), бактериални менингити с
изразена плеоцитоза, туберкулозен менин­
гит, гъбичкови менингити, субарахноиден
кръвоизлив и др. Намалението се дължи на
повишено използване о т ликворни и мозъч­
ни клетки, засилена анаеробна гликолиза, на­
рушен мембранен транспорт. Методите за
определяне на глюкозата в ликвора са еднак­
ви с т е з и за кръвта. Тук отново е препоръ­
чително отделна програма, ензимен ме­
т о д , стандартна крива в границите о т 0.1
до 6 mmol/1, контроли особено в границите
1 до 4 mmol/1.
А а к т а т и пируват
Изследването на т е з и два субстрата през
последните години придобива все по-голямо
значение. А а к т а т ъ т е показател за мозъч­
на ацидоза и анаеробна гликолиза. Нормал­
но отношението л а к т а т т и р у в а т е 20:1.
Аикворната концентрация на лактата ди­
ректно отразява мозъчната му продукция.
Съществува известна обратна корелация
между л а кта та и глюкозата в ликвора, глав­
но при силна хиперлактатрахия. Особено ви­
соко ниво има при бактериални менингити
и мозъчни инфаркти. При първичните лак-
т а т н и ацидози, увеличението е много сил­
но и служи за мониториране на терапията.
Умерено повишение се среща при туберку­
лозен менингит, мозъчни тумори, метаста-
зи и др.
Е л е к т р о л и т и - повечето о т електроли­
т и т е в ликвора о с т а в а т в много тесни гра­
ници и когато концентрацията им в серу­
ма варира значително. Натрия прави из-
643
ключение om moßa правило и обикновено съ­ шна разлика между вентрикулния и лумбг
щ е с т в у в а т успоредни промени в ликвора лен ликвор. По-високата ликворна кониенгг
при хипо- и хипернатриемията. Кониент- раиия се обяснява с голямото значение н
раиията на калий о с т а в а в т е с н и граниии АТФ-зависимия активен т р а н с п о р т . Пр
както в норма, т а к а и в патологията. За т е ж к и хипер- и хипомагнеземии може да с
отблелязване е, че при субарахноидна хемо- наблюдават парализи и припадъци. Пр1
рагия след ер и т роиитна хемолиза се наблю­ т е ж к и бактериални менингити, особено ^
дава парадоксално намаление, вме сто увели­ деца, магнезият достига серумното ниво
чение на калий в първите 5 до 10 дни. Това се както и при алкохолизъм. Хлорът е другш
дължи на активно премахване на калий о т електролит, чиято ликворна концентрацш
глиалните и ендотелните клетки. Ч е с т о се е по-висока с 15-20 mmol/1 о т серумната. Бе!
съпровожда с хипогликорахия, поради увели­ о т г о в о р о с т а в а дали т о в а се дължи HI
чена гликолиза о т същите клетки. Значимо Donnan "'1 ефект или на активен транспорт
увеличение на калиевата кониентраиия е Освен активен е налице и пасивен транс
лош прогностичен белег и се наблюдава не­ п о р т на хлора, показател на ко ето е пада
посредствено преди настъпване на с м ъ р т ­ н е т о на неговото ниво при повишаване нг
т а . Калииевата концентраиия в ликвора е белтъка. Хипохлоррахията при туберкуло­
почти еквивалентна на йонизирания калиий зен менингит е р е з у л т а т на хиперпроте-
в серума, който лесно преминава и се к о н т ­ инрахията, повишена секреция на антиди-
ролира о т активен т р а н с п о р т . Даже и при уретичен хормон, д и е т и ч н а т а промяна.
хиперпаратиреоидизъм, когато серумната М е т о д и т е за определяне на електроли­
калииева кониентраиия е променена и се т и т е в ликвора не се различават о т т е з и 6
наблюдава синдром на псевдотумор цереб- кръвния серум.
ри, ликворната кониентраиия о с т а в а поч­ Представени са накратко само малка
т и непроменена. Магнезий в ликвора е око­ ч а с т о т най-често използваните показате­
ло 30% повече, отколкото в серума, с извес- ли в ликворологията.

КНИГОПИС

Цветанова Е М . Лпкворология/Здоровя, Киев, 1986,1-370 L a b o r und D i a g n o s e , L . T h o m a s [ed.] Liquor diagnostik, 1713-

l i i o u D , B e n o i s t J, T h i C e t al. C e r e b r o s p i n a l fluid protein c o n ­ 1 7 3 9 , 1 9 4 4 , D i e M e d i z . V e r l a g s g g e s e l l s c h a f t , Marburg, 1994.

centration in c h i l d r en , C l i n C h e m , 4 6 , 2(K)(), 3 9 9 - 4 0 3 . L i n d s a y K W . B o n e I, C a l l a n d e r R. N e u r o l o g y and Neurosurgery

F i s h m a n R A . Cerebrospinal fluid in d i s e a s e s o f the n e r v o u s s y s ­ illustrated, [ 3 - d ed.JChirchill, N Y , L o n d o n , 1 9 9 7 , 5 4 - 5 0 0 .

tem [ s e c . e d . ] , S a u n d e r s W В c o m . P h i l a d e l p h i a , 1 9 9 2 , 1 - 4 3 0 . L i q u o r s y m p o s i u m , Marburg 5 - 6 . 1 0 . 1 9 9 0 , Labor.Medizin,

Hartog Jager W A . C o l o r A t l a s o f C.S.F. C y t o p a t h o l o g y , E l s e v i e r , Feb. 1991, Lab.Med., 15,1991,1-150.

Amsterdam, 1980, 1-140. M a l m J. C e r e b r o s p i n a l f l u i d d y n a m i c s . , M e d . U n i v . , U m e a ,

H u t c h e s s o n A , P i e e c e M , G r a y G e t al. M e a s u r m a n t o f lactat in 1994,1-118.

cerebrospinal fluid o f inherited m e t a b o l i c d i s e a s e , C l i n C h e m , O h t a M , M a J, S a i d a T et al. C l i n i c a o l and analytical evaluation
43, 1997, 158-161. o f an e n z y m e i m m u n o a s s a y for m y e l i n b a s i c protein. Clin

M c d i c a l N e u r o s i e n c e s [ s e c . e d . ] D a u b e J. R e a g a n T, S a n d o k В Chem, 4б! 2000, 1326-30.

( c d s ] T h c Cerebrospinal fluid, 9 2 - 1 1 3 , M a y o F u n d a t i o n , 1 9 9 6 Peter J M . U s e and interpretation o f laboratory tests in neurol-

Kleine T O , H a d d e r R, Lehmitz R, Meyer-Rienecker H , o g y [sec.ed.]. C A , 1994,1-318.

Liquordiagno stik:Klinisch-chemischen Kenngroben-eine V e r m e u l e n M . S u b a r a c h n o i d h a e m o r r h a g i e : d i a g n o s i s and
kritischeBilanz, D G K l i n i s c h e M i t t e i l u n g e n , 2 5 , 1 9 9 4 , 5 , 1 9 9 - tretmant, J N e u r o l , 2 4 3 , 1 9 9 6 , 7, 4 9 6 - 5 0 1 .
213.

644
 Неинбазибни
клинично-лабораторни
анализи
Cm, Д а н о в
СЪЩНОСТ И ПРЕДИМСТВА
Неинбазибните клинично-лабораторни изс­
ледвания (НИКЛИ) не предизвикват у паци­
е н т а ф и з и ч е с к а (болка, дразнене, позиви
за повръщане) или п с и х и ч е с к а т р а в м а
{страх, неприятни преживявания). Те са
едно о т п р е д и з в и к а т е л с т в а т а на следващи­
т е д е с е т и л е т и я . Т е х н и т е потенциални пре­
д и м с т в а пред с ъ щ е с т в у в а щ и т е понастоя­
щем л а б о р а т о р н и изследвания, в по-голяма
или по-малка с т е п е н инвазивни, включват:
1. Пълна а т р а В м а т и ч н о с т з а пациен­
т а . Не се н а л а г а т инвазивни диагностични
манипулации (венепункция, убождане н а
п р ъ с т а , сондиране н а с т о м а х а и дуодену-
ма, вагинален преглед и др.), к о е т о предот­
в р а т я в а п о я в а т а на болка, инфекция, хема-
т о м и др.
2. П с и х и ч е с к и к о м ф о р т . С о т с т р а н я в а ­
не н а с т р а х а и е м о ц и о н а л н а т а възбуда пре­
ди и по време н а м а н и п у л а ц и я т а се избягва
болестта на бялата престилка, отговор­
н а з а фалшиво патологични с т о й н о с т и на
г л ю к о з а т а и редица други м е т а б о л и т и , хор­
мони и ензими, особено у емоционално ла­
билни п а ц и е н т и и деца.
3. М е д и ц и н с к и е ф е к т . Чрез п р о с т и т е х ­
ники, неизискващи специално обучение и при­
ложими о т б л и з к и т е н а п а ц и е н т а или о т
самия п а ц и е н т ( с а м о т е с т у в а н е ) се п е с т я т
време и с р е д с т в а за възнаграждение на обу­
чен персонал.
4. И к о н о м и и н а р е а к т и в и . Неинвазивни-
т е спектроскопски изследвания в близката
инфрачервена о б л а с т (Near Infraied
Spectroscopy - NIRS) и на (nuclear magnetic
resonance - NMR) практически не консуми­
р а т р е а к т и в и , но з а с м е т к а н а т о в а изиск
в а т прилагането н а сложна и скъпо с т р у
ваща апаратура.
АПАРАТУРА ЗА НЕИНВАЗИВНИ
КАИНИЧНО-ААБОРАТОРНИ
ИЗСЛЕДВАНИЯ
Идеалният апарат на НИКЛИ засега все
още не е произведен. Той т р я б в а да отгова­
р я едновременно на голям брой критерии:
• приемливост о т пациента;
• малки размери, позволяващи лесното му
пренасяне или имплантиране в т я л о т о на
пациента;
• лесна манипулация и поддържане;
• минимална до никаква консумация на ре­
активи;
• липса на интерференции о т т ъ к а н и т е на
п а ц и е н т а и т е х н и т е химически състав­
ки;
• лесна калибрация и валидация;
• висока аналитична надеждност на резул­
татите;
• получаване на р е з у л т а т и , които по въз­
можност са сходни и т я с н о корелират със
с ъ о т в е т н и т е с т о й н о с т и в серума (плаз­
м а т а или к р ъ в т а ) на пациента;
• изследване в реално време;
• ниска цена на а п а р а т а , респ. ниска себес­
т о й н о с т на изследването
Безспорните и много важни предимства
на НИКЛИ а н г а ж и р а т голям брой научни
колективи и фирми в търсене на решения
за изграждане на идеалния а п а р а т . За цел­
т а се прилагат т р и основни, взаимно кон­
куриращи се подхода:
1. И з с л е д в а н е б л и з о д о п а ц и е н т а на не-
инвазивно получени проби в твърдо, т е ч н о
или газообразно състояние.
2. И з с л е д в а н е в п а ц и е н т а - i n vivo с по­
м о щ т а н а м и н и м а л н о и н в а з и в н а тех­
н и к а ГМИТ). За ц е л т а се използва интерс-
тициална т е ч н о с т (ИТ), к о я т о се изследва
645
i n s i t u c п о м о щ т а н а и н п л а н т и р а н и сензор­ о б м я н а т а н а ендогенните и екзогенни (ле­
ни капсули или след засмукването на ИТ през карства, токсини) съставки на к о ж а т а и
микросонда до с ъ о т в е т е н а н а л и з а т о р . т я х н о т о разпределение между два основни
3. И з с л е д в а н е т о н