Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Для цитирования: Батаева Д.С., Соколова О.В., Зайко Е.В., Пашкова В.В. Оценка бактериоциногенности индигенных молочнокислых бактерий,
полученных с туш крупного рогатого скота. Теория и практика переработки мяса. 2018;3(2):22–32.DOI 10.21323/2414–
438X‑2018–3–2–22–32
For citation: Bataeva D. S., Sokolova O. V., Zaiko E. V., Pashkova V.V. Assessment of the bacteriocinogenicity of indigen lactobacillus onto cattle
carcasses. Theory and practice of meat processing. 2018;3(2): 22–32. (In Russ.) DOI 10.21323/2414–438X‑2018–3–2–22–32
22
2018 | № 2 теория и практика переработки мяса
23
Theory and Practice of Meat Processing № 2 | 2018
оценка каждого выделенного штамма, предположи- второго слоя агара с тест-штаммом Salmonella ty-
тельно относящегося к молочнокислым бактериям: phimurium, бактериоцин должен препятствовать ро-
рост на среде MRS при 30 °C; образование каталазы; сту патогена.
оценка микроскопического препарата: по Граму и на
спорообразование. Молочнокислые микроорганиз- Результаты и обсуждение
мы характеризуются способностью расти на плотных Молочнокислые бактерии обладают большим по-
и жидких питательных средах MRS при 30 °C, они не тенциалом использования в связи с их широким спек-
образуют каталазу и по Граму окрашиваются поло- тром потенциальной антагонистической активности.
жительно, при этом в микроскопическом препарате Применение бактериоцинов, продуцируемых молоч-
могут быть как кокки так и палочки, последние их нокислыми бактериями, позиционируют как агенты,
которых не образуют спор. Культуры, идентифици- способные заменить антибиотики и повысить без-
рованные как молочнокислые — пересевали на по- опасность мяса [13,14,15].
лужидкую среду MRS с целью дальнейшего хранения Наиболее перспективными молочнокислыми бак-
и дальнейшего изучения. Остальные микроорганиз- териями с точки зрения их потенциала применения
мы выбраковывали. как ингибиторов патогенов, считают индигенные
Для определения бактериоциногенности отобран- молочнокислые бактерии, то есть изолированные из
ных культур микроорганизмов, использовали моди- естественной среды. Как правило, бактерии, облада-
фицированную методику двухслойных агаров Ульри- ющие потенциалом бактериоциногенности выделяют
ха Шиллингера и Фридриха-Карл Люки [12]. из пищевых продуктов [16,17,18,19].
Согласно методике, предложенной этими иссле- Логично предположить, что мясоперерабатыва-
дователями, необходимо было вносить бактериоцин ющей отрасли целесообразнее всего применять бак-
в лунки зараженного патогенными микроорганизма- териоцины, изолированные из индигенной микроф-
ми, агара. Бактериоцин диффундировал в агар, в ре- лоры мяса. Поскольку микроорганизмы с мяса могут
зультате чего визуализировалась зона ингибирования быть наиболее приспособлены к нему и быть наибо-
роста патогенного микроорганизма. Из-за небольшой лее конкурентноспособны, чем выделенные из других
площади визуализации результатов, мы модифициро- источников, было проведено исследование его.
вали методику. Для этого использовали две специали- Как правило, молочнокислые бактерии выделяют
зированные питательные среды. Первая среда — мо- из ферментированных мясных продуктов [20,21], то
дифицированный MRS-агар (MRS-mod), следующего есть из уже готовых к употреблению. В нашей работе
состава: неселективная жидкая среда MRS; глюкозы — предпосылкой к исследованию индигенной микроф-
0,2 %; агар-агара — 0,3 %; вторая среда — мягкий агар лоры туш служило предположение, что молочнокис-
(МА) имеющий в своем составе: пептон — 15 г, дрож- лая микрофлора попадает в мясные продукты на пер-
жевой экстракт — 3 г, NaCl — 6 г, глюкоза — 1 г, агар- воначальных стадиях переработки, то есть на этапе
агар — 7 г. убоя, нутровки и обвалки туш.
Для проведения исследования подготавливали су- В результате мониторинга латеральной и медиаль-
точную культуру молочнокислых бактерий на бульоне ной сторон туш крупного рогатого скота на наличие
MRS, которую с помощью бактериологической петли молочнокислых бактерий, с плотной питательной сре-
наносили касанием на поверхность MRS-mod в опре- ды MRS было выбрано 36 колоний микроорганизмов
деленной точке. Затем чашки инкубировали вверх для дальнейшего исследования. Из них были отобра-
крышками при температуре (30±2) °C в течение 3 сут, ны только те, формы колоний которых, на селектив-
для максимального накопления и диффузии бактери- ном агаре, являлись типичными для молочнокислых
оцина в питательную среду. По окончании инкубиро- микроорганизмов: в форме трехлучевой звезды или
вания поверх MRS-mod заливали тонкий слой мягко- линзы (Рис. 1). На этом этапе из исследования было
го агара, инокулированного тест-штаммом. В качестве исключено 15 образцов. Из оставшихся 21 штаммов
тест-штамма была выбрана культура Salmonella ty- все окрашивались положительно по Граму, однако 2
phimurium АТСС 14028, являющаяся распространен- оказались каталазоположительными, предположи-
ным возбудителем токсикоинфекций. Мягкий агар тельно Brochothrix thermosphacta, и не имели типичную
заражали тест-штаммом Salmonella typhimurium АТСС для молочнокислых микроорганизмов микроскопи-
14028 с титром 106 КОЕ/см3, и вновь помещали термо- ческую картину. Согласно исследованиям канадских
стат для инкубирования крышками вверх. Образцы ученых, бактерии Brochotrix thermosphacta способны
инкубировали при температуре (37±1) °C в течение развиваться совместно с молочнокислыми бактерия-
24–48 ч. ми, достигая высоких титров [22].
Согласно рабочей гипотезе, за период инкубирова- Дальнейшие исследования 19 штаммов проводили
ния в среде MRS-mod молочнокислые микроорганиз- культивируя на бульоне MRS. При оценке характе-
мы должны размножаться, вырабатывая бактериоцин, ра роста отобранных колоний на этой жидкой пита-
который диффундирует в агар, а затем при нанесении тельной среде, не все микроорганизмы проявили рост
24
2018 | № 2 теория и практика переработки мяса
25
Theory and Practice of Meat Processing № 2 | 2018
26
2018 | № 2 теория и практика переработки мяса
27
Theory and Practice of Meat Processing № 2 | 2018
for the purpose of long storage and further study. Other As a rule, lactabacilus are isolated from fermented meat
microorganisms were culled. products [20,21], that is, from ready-to-use. In our work,
To determine bacteriocinogenic selected cultures of the premise of the study of the indigenous microflora of
microorganisms used a modified two-layer technique agar carcasses was the assumption that the lactic microflora en-
Ulrich Shillinger и Frededich-Karl Lücke [12]. ters the meat products at the initial stages of processing,
According to the method proposed by these research- that is, at the stage of slaughter, nutration and boning of
ers, it was necessary to introduce bacteriocin into the wells carcasses.
of the infected pathogenic microorganisms, agar. Bacterio- As a result of monitoring the lateral and medial sides of
cin diffused to agar, resulting in a visualized zone of inhibi- cattle carcasses for the presence of lactic acid bacteria, with
tion of growth of the pathogen. Due to the small area of vi- a dense nutrient medium, MRS36 microbial colonies were
sualization of the results, we have modified the technique. selected for further research. Only those forms of colonies
Two specialized nutrient media were used for this purpose. of which, on selective agar, were typical for lactic acid mi-
The first medium-modified MRS-agar (MRS-mod), the croorganisms: in the form of a three-beam star or a lens
following composition: non-selective liquid medium MRS; (Figure 1). At this stage, 15 samples were excluded from the
glucose‑0,2 %; agar-agar‑0,3 %; the second medium-soft study. Of the remaining 21 strains, all were positively gram-
agar (MA) having in its composition: pepton — 15 g, yeast stained, but 2 were catalozopositive, presumably Brocho-
extract — 3 g, NaCl — 6 g, glucose — 1 g, agar-agar — 7 g. thrix thermosphacta, and did not have a typical lactic acid
To conduct the study, daily culture of lactabacilus was micro-organisms microscopic picture. According to stud-
prepared on the MRS broth, which was applied by touch- ies by canadian scientists, the bacteria Brochotrix thermo-
ing the surface of the MRS-mod at a certain point using a sphacta can develop together with lactabacilus, reaching
bacteriological loop. The cups were then incubated with high titers [22].
the lids upwards at a temperature of (30±2) °C for 3 days,
for maximum accumulation and diffusion of bacteriocin
into the culture medium. At the end of incubation, a thin
layer of soft agar, inoculated with a test strain was poured
over the MRS-mod. As a test strain was chosen culture
Salmonella typhimurium ATSS14028, which is a common
causative agent of toxicoinfections. Soft agar was infected
with a test strain of Salmonella typhimurium ATSS14028
with a titer of 10 6 KOE / cm3, and the thermostat was again typical colonies
placed for incubation with lids up. The samples were incu-
bated at a temperature (37±1)°C for 24–48 h.
According to the working hypothesis, during the incuba-
tion period in the MRS-mod environment, lactic acid mi-
croorganisms must multiply, producing bacteriocin, which
diffuses into the agar, and then when applying the second
layer of agar with the test strain Salmonella typhimurium,
bacteriocin should prevent the growth of the pathogen.
28
2018 | № 2 теория и практика переработки мяса
Figure 3. Photo of Salmonella typhimurium growth in CS (control Figure 5. Photograph of Petri dishes with growth of Salmonella ty-
sample) phimurium on top of the growth of lactobacillus
29
Theory and Practice of Meat Processing № 2 | 2018
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Юшина, Ю.К., Батаева, Д.С., Соколова, О.В. (2017). Микроб‑ 8. Nissen-Meyer, J., Holo, H., Havarstein, L.S., Sletten, K., Nes,
ные контаминанты мяса: что нового? Всё о мясе, 4, 37–39 I.F. (1992). A novel lactococcal bacteriocin whose activity de‑
2. Anany, H., Brovko, L.Y., El Arabi, T., Griffiths, M.W. Taylor, pends on the complementary action of two peptides. Journal of
T.M. (2015). Bacteriophages as antimicrobials in food products: Bacteriology, 174(17), 5686–5692
Applications against particular pathogens. Handbook of Natural 9. Nissen-Meyer, J., Granly Larsen, A., Sletten, K., Daeschel, M.,
Antimicrobials for Food Safety and Quality. Chapter 5. Woodhead Nes, I.F. (1993). Purification and characterization of plantaricin
Publishing, 89–116. A, a Lactobacillus plantarum bacteriocin whose activity depends
3. Akhtar, M., Viazis, S., Christensen, K., Kraemer, P., Diez- on the action of two peptides. Journal of General Microbiology,
Gonzalez, F. (2017). Isolation, characterization and evaluation of 139(9), 1973–1978
virulent bacteriophages against Listeria monocytogenes. Food 10. Cleveland, J., Montville, T.J., Nes, I.F., Chikindas, M.L. (2001).
Control, 75, 108–115 Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation.
4. Yeh, Y., Purushothaman, P., Gupta, N., Ragnone, M., Verma, International Journal of Food Microbiology, 71(1), 1–20
S.C., de Mello, A.S. (2017). Bacteriophage application on red 11. Сарафанова, Л.А. (2011). Пищевые добавки. Энциклопе‑
meats and poultry: Effects on Salmonella population in final дия. М, Профессия. — 776 с. ISBN: 978–5–904757–25–0
ground products. Meat science, 127, 30–34 12. Schillinger, U., Lücke, F.K. (1989). Antibacterial activity of
5. Кудлай, Д.Г., Лиходец, В.Г. (1966). Бактериоциногения. Lactobacillus sake isolated from meat. Applied and Environmen-
Л., Медицина. — 203 c. tal Microbiology, 55(8),1901–1906
6. Venema, K., Venema, G., Kok, J. (1995). Lactococcal bacte‑ 13. Chikindas, M.L., Weeks, R., Drider, D., Chistyakov, V.A., Dicks,
riocins: mode of action and immunity. Trends Microbiology, 3(8), L.M. (2018). Functions and emerging applications of bacterio‑
299–303 cins. Current Opinion in Biotechnology, 49, 23–28
7. Enfedaque, J., Ferrer, S., Guasch, J.F., Tomás, J., Regué, M. 14. Woraprayote, W., Malila, Y., Sorapukdee, S., Swetwiwathana,
(1996). Identification of E.coli surface components involved in A., Benjakul, S., Visessanguan, W. (2016). Bacteriocins from lac‑
bacteriocin binding and translocation. Canadian Journal of Mi- tic acid bacteria and their applications in meat and meat prod‑
crobiology, 42(1), 19–26 ucts. Meat Science, 120, 118–132
30
2018 | № 2 теория и практика переработки мяса
15. Ahmad, V., Khan, M.S., Jamal, Q.M.S., Alzohairy, M.A., Al lactic acid bacteria from «Gueddid» a traditionally Tunisian fer‑
Karaawi, M.A., Siddiqui, M.U.. (2017). Antimicrobial potential of mented meat. Meat Science, 78(4), 513–521
bacteriocins: in therapy, agriculture and food preservation. Inter- 22. Collins-Thompson, D.L., Lopez, G.R. (1982). Control of Bro‑
national Journal of Antimicrobial Agents. 49(1), 1–11 chothrix thermosphacta by Lactobacillus Species in Vacuum
16. Barman, S., Ranjan Ghosh, R., Mandal, N.C. (2018). Produc‑ Packed Bologna. Canadian Institute of Food Science and Tech-
tion optimization of broad spectrum bacteriocin of three strains nology Journal, 15(4), 307–309
of Lactococcus lactis isolated from homemade buttermilk. An- 23. Quested, T.E., Cook, P.E., Gorris, L.G.M., Cole, M.B. (2010).
nals of Agrarian Science. in press. https://doi.org/10.1016/j. Trends in technology, trade and consumption likely to impact on
aasci.2018.05.004 microbial food safety. International Journal of Food Microbiology,
17. An, Y., Wang, Y., Liang, X., Yi, H., Zuo, Z., Xu, X., Zhang, D, Yu, 139(SUPPL. 1), S29-S42
C., Han, X. (2017). Purification and partial characterization of M1- 24. Mills, J., Donnison, A., Brightwell, G. (2014). Factors affect‑
UVs300, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum ing microbial spoilage and shelf-life of chilled vacuum-packed
isolated from fermented sausage. Food Control, 81, 211–217 lamb transported to distant markets: A review. Meat Science,
18. Mohammadi, F., Eshaghi, M., Razavi, S., Sarokhalil, D.D., 98(1), 71–80
Talebi, M., Pourshafie, M.R. (2018). Characterization of bacterio‑ 25. Domínguez-Manzano, J., Jiménez-Díaz, R. (2013). Suppres‑
cin production in Lactobacillus spp. isolated from mother’s milk. sion of bacteriocin production in mixed-species cultures of lactic
Microbial Pathogenesis. 118. 242–246 acid bacteria. Food Control, 30(2), 474–479
19. Devi Avaiyarasi, N., David Ravindran, A., Venkatesh, P., Arul, 26. Fegan, N., Jenson, I. (2018). The role of meat in foodborne
V. (2016). In vitro selection, characterization and cytotoxic ef‑ disease: Is there a coming revolution in risk assessment and man‑
fect of bacteriocin of Lactobacillus sakei GM3 isolated from goat agement? Meat Science, in press https://doi.org/10.1016/j.
milk. Food Control, 69, 124–133 meatsci.2018.04.018
20. Swetwiwathana, A., Visessanguan, W. (2015). Potential of 27. Castro, S.M., Kolomeytseva, M., Casquete, R., Silva, J., Teix‑
bacteriocin-producing lactic acid bacteria for safety improve‑ eira, P., Castro, S.M., Queirós, R., Saraiva, J.A. (2017). Biopreser‑
ments of traditional Thai fermented meat and human health. vation strategies in combination with mild high pressure treat‑
Meat Science, 109, 101–105 ments in traditional Portuguese ready-to-eat meat sausage. Food
21. Ben Belgacem, Z., Ferchichi, M., Prévost, H., Dousset, X., Ma‑ Bioscience, 19, 65–72
nai, M. (2008). Screening for anti-listerial bacteriocin-producing
REFERENCES
1. Yushina, Y.K., Bataeva, D.S., Sokolova, O.V. (2017). Micro‑ bacteriocins: in therapy, agriculture and food preservation. Inter-
bial meat containments: what’s new? Vsyo o myase, 4, 37–39. national Journal of Antimicrobial Agents. 49(1), 1–11
(in Russian) 16. . Barman, S., Ranjan Ghosh, R., Mandal, N.C. (2018). Produc‑
2. Anany, H., Brovko, L.Y., El Arabi, T., Griffiths, M.W. Taylor, T.M. tion optimization of broad spectrum bacteriocin of three strains
(2015). Bacteriophages as antimicrobials in food products: Ap‑ of Lactococcus lactis isolated from homemade buttermilk. An-
plications against particular pathogens. Handbook of Natural An‑ nals of Agrarian Science. in press. https://doi.org/10.1016/j.
timicrobials for Food Safety and Quality. Chapter 5. Woodhead aasci.2018.05.004
Publishing, 89–116. 17. An, Y., Wang, Y., Liang, X., Yi, H., Zuo, Z., Xu, X., Zhang, D, Yu,
3. Akhtar, M., Viazis, S., Christensen, K., Kraemer, P., Diez- C., Han, X. (2017). Purification and partial characterization of M1-
Gonzalez, F. (2017). Isolation, characterization and evaluation of UVs300, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum
virulent bacteriophages against Listeria monocytogenes. Food isolated from fermented sausage. Food Control, 81, 211–217
Control, 75, 108–115 18. Mohammadi, F., Eshaghi, M., Razavi, S., Sarokhalil, D.D.,
4. Yeh, Y., Purushothaman, P., Gupta, N., Ragnone, M., Verma, Talebi, M., Pourshafie, M.R. (2018). Characterization of bacterio‑
S.C., de Mello, A.S. (2017). Bacteriophage application on red cin production in Lactobacillus spp. isolated from mother’s milk.
meats and poultry: Effects on Salmonella population in final Microbial Pathogenesis. 118. 242–246
ground products. Meat science, 127, 30–34 19. Devi Avaiyarasi, N., David Ravindran, A., Venkatesh, P., Arul,
5. Kudlay, D.G., Likhodetc, V.G. (1966). Bacteriocinogeny. Lenin‑ V. (2016). In vitro selection, characterization and cytotoxic ef‑
grad: Meditcina. — 203 p. fect of bacteriocin of Lactobacillus sakei GM3 isolated from goat
6. Venema, K., Venema, G., Kok, J. (1995). Lactococcal bacterio‑ milk. Food Control, 69, 124–133
cins: mode of action and immunity. Trends Microbiology, № 3(8), 20. Swetwiwathana, A., Visessanguan, W. (2015). Potential of
299–303 bacteriocin-producing lactic acid bacteria for safety improve‑
7. Enfedaque, J., Ferrer, S., Guasch, J.F., Tomás, J., Regué, M. ments of traditional Thai fermented meat and human health.
(1996). Identification of E.coli surface components involved in Meat Science, 109, 101–105
bacteriocin binding and translocation. Canadian Journal of Mi- 21. Ben Belgacem, Z., Ferchichi, M., Prévost, H., Dousset, X., Ma‑
crobiology, 42(1), 19–26 nai, M. (2008). Screening for anti-listerial bacteriocin-producing
8. Nissen-Meyer, J., Holo, H., Havarstein, L.S., Sletten, K., Nes, lactic acid bacteria from «Gueddid» a traditionally Tunisian fer‑
I.F. (1992). A novel lactococcal bacteriocin whose activity de‑ mented meat. Meat Science, 78(4), 513–521
pends on the complementary action of two peptides. Journal of 22. Collins-Thompson, D.L., Lopez, G.R. (1982). Control of Bro‑
Bacteriology, 174(17), 5686–5692 chothrix thermosphacta by Lactobacillus Species in Vacuum
9. Nissen-Meyer, J., Granly Larsen, A., Sletten, K., Daeschel, M., Packed Bologna. Canadian Institute of Food Science and Tech-
Nes, I.F. (1993). Purification and characterization of plantaricin nology Journal, 15(4), 307–309
A, a Lactobacillus plantarum bacteriocin whose activity depends 23. Quested, T.E., Cook, P.E., Gorris, L.G.M., Cole, M.B. (2010).
on the action of two peptides. Journal of General Microbiolo- Trends in technology, trade and consumption likely to impact on
gy,139(9), 1973–1978 microbial food safety. International Journal of Food Microbiology,
10. Cleveland, J., Montville, T.J., Nes, I.F., Chikindas, M.L. (2001). 139(SUPPL. 1), S29-S42
Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. 24. Mills, J., Donnison, A., Brightwell, G. (2014). Factors affect‑
International Journal of Food Microbiology,71(1), 1–20 ing microbial spoilage and shelf-life of chilled vacuum-packed
11. Sarafanova, L.A. (2011). Nutritional supplements. Encyclope‑ lamb transported to distant markets: A review. Meat Science,
dia. М: Profession. — 776 p. ISBN: 978–5–904757–25–0 98(1), 71–80
12. Schillinger, U., Lücke, F.K. (1989). Antibacterial activity of 25. Domínguez-Manzano, J., Jiménez-Díaz, R. (2013). Suppres‑
Lactobacillus sake isolated from meat. Applied and Environmen- sion of bacteriocin production in mixed-species cultures of lactic
tal Microbiology, 55(8),1901–1906 acid bacteria. Food Control, 30(2), 474–479
13. Chikindas, M.L., Weeks, R., Drider, D., Chistyakov, V.A., Dicks, 26. Fegan, N., Jenson, I. (2018). The role of meat in foodborne
L.M. (2018). Functions and emerging applications of bacterio‑ disease: Is there a coming revolution in risk assessment and man‑
cins. Current Opinion in Biotechnology, 49, 23–28 agement? Meat Science, in press https://doi.org/10.1016/j.
14. Woraprayote, W., Malila, Y., Sorapukdee, S., Swetwiwathana, meatsci.2018.04.018
A., Benjakul, S., Visessanguan, W. (2016). Bacteriocins from lac‑ 27. Castro, S.M., Kolomeytseva, M., Casquete, R., Silva, J., Teix‑
tic acid bacteria and their applications in meat and meat prod‑ eira, P., Castro, S.M., Queirós, R., Saraiva, J.A. (2017). Biopreser‑
ucts. Meat Science, 120, 118–132 vation strategies in combination with mild high pressure treat‑
15. Ahmad, V., Khan, M.S., Jamal, Q.M.S., Alzohairy, M.A., Al ments in traditional Portuguese ready-to-eat meat sausage. Food
Karaawi, M.A., Siddiqui, M.U.. (2017). Antimicrobial potential of Bioscience, 19, 65–72
31
Theory and Practice of Meat Processing № 2 | 2018
32