АҚ «Оңтүстік Қазақстан АО «Южно-Казахстанская

Медициналық Академиясы» Медицинская Академия»

Кафедра фармацевтической и токсикологической химии

Дисциплина: «Инструментальные методы анализа»

Реферат
Тема: Оптимизация хроматографического разделения.

Выполнила: Атырхан.А
Группа: МФО-02-23
Приняла: и.о. проф., к.т.н. Асильбекова А. Д

Шымкент 2024г.
 План:
І.Введение
ІІ.Главная часть
Разрешающая способность как мера совместного влияния
селективности, удерживания и эффективности на результат разделения.
Формулы для расчета параметров. Оптимизация хроматографического
процесса по основным параметрам.
Требования предъявляемые к выбору растворителей.
Способы достижения специфической селективности системы. Процесс
взаимодействия сорбентов с поверхностью сорбента.
ІІІ. Заключение
Литература
 Хроматография – это обширная область физико-химических методов
анализа, которая занимается разработкой методов разделения сложных по
составу многокомпонентных смесей.
Характерными особенностями любых хроматографических методов
являются следующие:
• Высокая разрешающая способность процесса разделения, обусловленная
высокой эффективностью процесса, дающая возможность разделения даже
близких по природе, структуре и свойствам веществ. Этим, во многом,
объясняется широкое распространение хроматографии в различных областях
научных исследований, в лабораторной практике, промышленности. Те
разделения, которые до применения хроматографических методов не могли
быть осуществлены, стали легко осуществимы после их появления. Сюда
относятся, например, разделение смесей аминокислот на индивидуальные
компоненты, разделение смесей углеводородов на индивидуальные вещества,
разделение смесей редкоземельных элементов на отдельные элементы,
выделение ферментов в чистом виде и многие другие разделения.
• Мягкие условия разделения. Можно сравнить процесс
хроматографического разделения смесей с процессом разделения сложных
смесей методом перегонки, но если обычная перегонка осуществляется, как
правило, в достаточно жестких условиях (высокая температура, глубокое
вакуумирование), то хроматографические разделения осуществляются, как
правило, в очень мягких условиях (при атмосферном давлении, при обычных
температурах). Перечислим основные задачи, которые могут быть решены с
помощью хроматографических методов:
• Разделение многокомпонентных по составу смесей на индивидуальные
компоненты, т.е. по существу это качественный и количественный анализ
сложных смесей веществ.
• Концентрирование веществ из их очень разбавленных растворов. Цели
здесь могут быть самые разные: хроматографические методы позволяют
сконцентрировать уран, содержащийся в природных рудах в десятых, а то и
сотых долях процента; сконцентрировать радий, содержащийся в природных
водах в концентрациях 10-5−10-6 г-атом/л. Может стоять задача извлечения
ценных металлов (серебра, золота, платины) из разбавленных
технологических растворов (гидрометаллургия) или производственных
сточных вод (вопросы экологии).
• Очистка технических продуктов, доведение этих продуктов до заданной
степени химической чистоты, получение чистых химических реактивов.
• Проверка вещества на однородность, на чистоту, т.е. идентификация
вещества, доказательство того, что оно соответствует данной химической
формуле.
• Контроль различных производств методами хроматографии.
ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ХРОМАТОГРАФИИ
История возникновения хроматографии как науки относится к 1903 году,
когда в трудах Варшавского университета появилась программная статья
русского ученого Михаила Семеновича Цвета “О новой категории
адсорбционных явлений и их применению к биохимическому анализу”. Как
оказалось впоследствии, именно в этой работе впервые были изложены
основы хроматографического метода.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ПРОЦЕССА
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСЕЙ ВЕЩЕСТВ
Единой стройной теории, количественно описывающей весь процесс
хроматографического разделения, до настоящего времени нет. Установление
теоретической зависимости между химическим строением веществ и его
коэффициентом распределения между фазами, знание которого позволяет
предсказать хроматографическое поведение вещества, является задачей,
которая еще ждет своего решения.
Поэтому в настоящее время предложен ряд теоретических подходов,
использующих некоторые допущения и позволяющих достаточно
удовлетворительно описывать ход хроматографического процесса.
С одной стороны, хроматографический процесс можно рассматривать с
точки зрения формы изотермы распределения, т.е. зависимости между
концентрацией вещества в подвижной фазе и его сорбцией неподвижной
фазой. В этом случае в основу описания будут положены процессы,
ответственные за разделение веществ при хроматографировании.
С другой стороны, хроматографический процесс можно рассматривать
с точки зрения времени установления равновесия в процессе массообмена
между сорбентом и поглощаемым веществом. В этом случае в основу
описания будут положены процессы, влияющие на степень размывания
хроматографических полос и ухудшающие разделение.
В первом случае следует различать хроматографию линейную и
нелинейную, а во втором – идеальную и неидеальную хроматографию.
При этом линейная хроматография предполагает описание
взаимодействия сорбент-сорбат линейной изотермой, а неидеальная
хроматография исходит из того, что скорость установления равновесия
является конечной величиной.
В этой связи вариант линейно-идеальной хроматографии, когда
взаимодействия сорбент-сорбат описываются линейной изотермой, а
равновесие устанавливается мгновенно, является наиболее простым для
теоретического описания вариантом хроматографии, которое детально было
разработано Киселевым А. В
ПАРАМЕТРЫ РАЗДЕЛЕНИЯ. СВЯЗЬ С ПАРАМЕТРАМИ
ЭФФЕКТИВНОСТИ И СЕЛЕКТИВНОСТИ

Для того чтобы разделить бинарную смесь газообразных компонентов,

необходимо, чтобы они находились в колонке разное время. Однако даже
время пребывания отдельных молекул одного и того же вещества в большей
или меньшей степени отличается от среднего значения, характерного для
этого вещества.
Причиной этому являются процессы диффузии, конвекции и
замедленного обмена между подвижной и неподвижной фазами.
 Насадочные колонки независимо от их внутреннего диаметра
представляют собой трубки, заполненные частицами сорбента, которые
образуют стационарный зернистый слой. Поток газа фильтруется через этот
слой, двигаясь по транспортным каналам, образуемым зазорами между
частицами. За счет разных по длине путей перемещения молекул
разделяемых соединений возникает специфический размывающий фактор,
характеризуемый “вихревой” диффузией

В капиллярных колонках имеется единственный транспортный канал

вдоль ее оси. В этой связи в капиллярных колонках “вихревая” диффузия
отсутствует, но возникает другой размывающий фактор, связанный с
параболическим распределением скоростей по сечению канала,
характеризуемый так называемой “тейлоровской” диффузией (рис. 12).
Вследствие такого “рассеяния” времени пребывания в колонке отдельных
молекул концентрация вещества на выходе из колонки изменяется во
времени, при этом профиль концентрации подчиняется уравнению функции
нормального распределения ошибок Гаусса, которое характеризует
распределение концентрации исследуемого соединения “C” в пространстве в
фиксированный момент времени “х” от времени положения максимума
хроматографического пика

Оптимизация разделения: общий аглоритм

Оптимизация разделения может осуществляться как с целью
уменьшения времени, затрачиваемого на разделение (при заданном
разрешении критической пары), так и для достижения лучшего разрешения
пиков на хроматограмме (при заданном времени анализа). Трендом
современной жидкостной хроматографии, безусловно, является сокращение
времени анализа в условиях рутинных измерений. Поэтому с самого начала
сформулируем задачу оптимизации как сокращение времени анализа при
условии сохранении минимально необходимого разрешения критической
пары и при фиксированном (доступном пользователю) давлении в
жидкостной системе.
Подобного рода оптимизацию проводят в несколько этапов, соблюдая
определенный порядок действий:
1. подбирают хроматографические условия с оптимальной селективностью
разделения α; регулируют удерживание k’ и фиксируют его оптимальное
значение;
2. выделяют критическую пару, определяют оптимальное разрешение
критической пары Rmin; определяют минимальную эффективность Nmin,
обеспечивающую заданное разрешение Rmin при данной селективности α и
удерживании k’);
3. подобрирают типоразмер колонки и скорость потока элюента.
Селективность хроматографической системы является ключевым
фактором, влияющим на разделение. Сложность разделения очень быстро
уменьшается с ростом селективности; соответственно, удачно подобранная
селективность значительно снижает требования к минимальной
эффективности, необходимой для обеспечения заданного разрешения.
Заданная селективность, по сути, означает, что выбор
хроматографического режима и хроматографической системы (т.е.
неподвижная фаза плюс состав подвижной фазы) сделан. Регулирование
удерживания k’ на практике означает выбор соотношения компонентов
подвижной фазы, при котором целевые вещества попадают (по возможности)
в наиболее оптимальный диапазон 2 < k’ < 5 (для колонки 250х4.6 мм при
скорости потока 2 мл/мин он примерно соответствует диапазону времен
удерживания 4 мин. < tR < 7 мин.).
Если работу ведут строго по методике (на определенном элюенте и на
определенной неподвижной фазе), то селективность α и удерживание k’
можно считать уже заданными.
На втором этапе необходимо, во-первых, выделить критическую пару
(или критические пары, если их несколько).
Критической парой называется пара пиков, для которых выполняются
два основных условия:
1. по крайней мере один из пиков относится к целевому веществу; природа
второго пика не принципиальна: это может быть другое целевое вещество,
примесь, либо вообще, нередко, системный пик;
2. селективность разделения этих двух веществ невысока, по причине чего
разрешение пары пиков оказывается очень чувствительно к небольшим
изменениям условий хроматографирования.
Соответственно, при выборе условий хроматографирования,
обеспечивающих меньшее время анализа, первым делом от недостаточного
разделения будет страдать именно критическая пара. Игнорировать неполное
разделение этой пары невозможно, так как речь идет о выделении чистого
сигнала целевого вещества. Таким образом, именно разрешение критической
пары лимитирует усилия по сокращению времени всего анализа.
Выбирать минимальное разрешение критической пары следует таким
образом, чтобы отношение площади перекрывания пиков к площади
целевого вещества было меньше допустимой погрешности определения
площади пика. В общем случае минимальное разрешение зависит от
относительной высоты пиков и их симметрии. Для полностью симметричных
пиков равной высоты достаточно строгим требованием является соблюдение
разрешения Rmin ≥ 1.2.
Поскольку селективность и удерживание уже зафиксированы, выбор
минимального разрешения Rmin автоматически определяет требуемую
минимальную эффективность Nmin. Нужно при этом понимать, что речь
здесь идет о реальной эффективности, измеренной по самому широкому пику
критической пары на реальной хроматограмме – а не о числе теоретических
тарелок, взятом из паспорта колонки.
Случается, что начинающие хроматографисты говорят об идеальных
разделениях без критических пар. Такого не может быть в принципе:
критическая пара есть всегда, иначе время любого анализа равнялось бы
нулевому времени. Как правило, видимое отсутствие критических пар
говорит либо об очень неоптимальных условиях (время анализа значительно
больше того, которого можно было бы достичь в результате оптимизации),
либо о том, что первый пик целевого соединения вообще не удерживается –
что является простой хроматографической ошибкой. Даже если на
хроматограмме есть всего один пик целевого вещества, то его необходимо
надежно разделять от системных пиков в районе нулевого времени.
Итак, к выбору типоразмера колонки и скорости потока надо
подходить, уже зная:
- хроматографическую систему (неподвижную и подвижную фазы), то есть
селективность α и удерживание k’,
- критическую пару, ее минимальное требуемое разрешение Rmin и
минимальную необходимую для этого эффективность разделения Nmin,
- также, вообще говоря, надо представлять себе, какое максимальное рабочее
давление ∆P мы можем себе позволить при работе на данном хроматографе.
Про максимальное рабочее давление ∆P: создается такое впечатление,
что этот параметр больше зависит от психологии человека, чем от каких-то
рациональных доводов. В принципе, при верхнем пределе насоса в 400 атм
стараются работать при давлении не выше 250-300 атм; для насоса с
пределом в 600 атм разумное максимальное давление составляет 400 атм.
Переходим к подбору типоразмера колонки и скорости потока. На этом
этапе задача оптимизации будет выглядеть так: предельно сократить время t,
обеспечив необходимую минимальную эффективность Nmin и уложившись в
максимально возможное давление ∆P. Единственный ресурс, которым мы
обладаем – это запас по давлению, то есть ∆P. Последние параметры,
которыми мы можем оперировать: размер частиц адсорбента dp, длина
колонки L и скорость потока u.
Можно составить всего три комбинации действий, которые приведут к
ускорению анализа при фиксированной эффективности. Привожу их в
порядке увеличения потребления ресурса – запаса по давлению:
1. надо уменьшать длину колонки и одновременно уменьшать диаметр
частиц адсорбента;
2. надо увеличивать скорость потока и умеренно увеличивать длину колонки;
3. надо увеличивать скорость потока и умеренно уменьшать диаметр частиц
адсорбента.
Недостаток первого способа состоит в том, что разрешение
критических пар с невысоким удерживанием при сокращении длины колонки
будет в реальности падать, причем невзирая на формально фиксированную
эффективность. Это связано с негативным влиянием таких факторов, как
экстраколочные объемы. По этой причине первый способ применяют либо в
том случае, когда критические пары обладают значительным удерживанием,
либо когда на практике есть некоторый запас по разрешению. Более того, при
наличии значительного запаса по разрешению в первую очередь применяют
именно этот способ сокращения времени анализа.
Второй или третий способы, соответственно, применяют, когда
существенного запаса по разрешению нет, а удерживание критических пар
невелико.
Селективность разделения
Любой процесс распределения вещества между двумя фазами
характеризуется коэффициентом распределения D:
D = Сн.ф. / Сп.ф., 11
где Сн.ф. и Сп.ф. – концентрации вещества в неподвижной и подвижной
фазах соответственно.
Объем удерживания вещества (иона) связан с его коэффициентом
распределения уравнением:
VR = D·Vн.ф. + V0, 12
где Vн.ф. – объем неподвижной фазы (ионита).
Учитывая формулу (6), получаем:
VR= D·Vн.ф. 13
Уравнения (12) и (13) являются основными уравнениями равновесной
хроматографии. Они показывают, что объем или время удерживания иона
пропорциональны его коэффициенту распределения и объему ионита; чем
выше коэффициент распределения иона, тем меньше скорость его
перемещения
по колонке.
Селективность является мерой взаимного распределения двух или
более
определяемых веществ (аналитов) в ходе хроматографического процесса.
Хроматографическое разделение основывается на селективности
сорбента и
термодинамических свойствах аналитов по отношению к
хроматографической системе. Таким образом, селективность является мерой
относительного удерживания или относительной подвижности двух веществ.
Различие во временах удерживания можно представить как расстояние
между центрами хроматографических полос, что соответствует величине ΔV.
Согласно уравнению (12):
ΔV = V2 – V1 = (D2·Vн.ф. + V0) – (D1·Vн.ф. + V0) = (D2 – D1)·Vн.ф. (14)
Таким образом, селективность зависит от различия коэффициентов
распределения определяемых веществ. Если D1 = D2, то хроматографическое
разделение невозможно.
Фактор удерживания (емкости) (k) зависит от произведения коэффициента
распределения (D) и фазового объемного отношения:
k = D·Vн.ф. / Vп.ф., (15)
где Vн.ф. / Vп.ф. – фазовое объемное отношение.
 Фазовое отношение зависит от типа (набивная, капиллярная) колонки,
еѐ диаметра, площади поверхности, пористости сорбента и других факторов.
При малых величинах k вещество элюируются близко к t0 или в объеме
V0 хроматографической системы. Если величина k большая, это означает,
что пик становится широким. На практике приемлемый диапазон изменяется
1 ≤ k ≤ 5.
Два вещества будут разделяться, если фактор разделения (α) > 1. Его
вычисляют по уравнению (16):

Если α = 1, тогда в данной хроматографической системе отсутствует

термодинамическое различие в сорбционных характеристиках обоих
компонентов и их нельзя разделить.
Время удерживания (tR) и фактор разделения (α) относятся к
равновесным
характеристикам хроматографического процесса, поскольку положения
максимумов пиков определяются только равновесными свойствами системы.
Следует отметить, что величина α не зависит от скорости потока элюента и
размеров колонки и поэтому является более фундаментальной
характеристикой сорбентов и компонентов смеси по сравнению со временем
удерживания. На фактор разделения влияют лишь те параметры, которые
изменяют коэффициент распределения (D): природа растворенного вещества,
а также подвижной и неподвижной фаз
Растворители в распределительном методе
Большое влияние на точность хроматографических методов анализа
оказывает выбранный растворитель. В качестве подвижной фазы необходимо
взять жидкость, которая в меньшей степени растворяет обнаруживаемые
компоненты, чем неподвижная фаза. Если пренебречь данным условием,
метод не сработает: при слишком высокой растворимости проба пройдет
вместе с жидкостью, не адсорбируясь на поверхности, при слишком низкой
— останется на начальной линии и не даст требуемую для расшифровки
градацию.
Если с помощью распределительного метода анализируется
водорастворимая смесь, в качестве неподвижной фазы берется очищенная
вода, в качестве подвижной — любой удобный органический растворитель.
Выбранные жидкости не должны смешиваться, менять свои свойства в
процессе исследования, важна их доступность и нетоксичность для человека.
Распределительные хроматографические методы анализа основаны на
использовании смешанных фаз: смесей спиртов друг с другом и
органическими кислотами, аммиаком, водных растворов фенола или крезола
и так далее. Меняя концентрацию, насыщенность и пропорции в растворе
удается плавно менять коэффициент Rf, создавать оптимальные условия для
анализа, и получать дополнительные данные при расшифровке
хроматограммы.
 Как и прочие хроматографические методы анализа, бумажная
хроматография определяет и качественный, и количественный состав пробы.
В первом случае изучается специфическая окраска пятен на хроматограмме и
анализируется числовое значение Rf для каждого обнаруживаемого реактива.
Для определения количественного состава смеси исследуется площадь
образовавшихся пятен, интенсивность их окраски. Также применяют метод
вымывания, при котором каждое цветовое пятно обрабатывают экстрагентом
и затем подсчитывают количество вымытого вещества.
 Список рекомендуемой литературы
1 Долгоносов А.Н., Сенявин М.М., Волощик И.Н. Ионный обмен и
ионная хроматография. М.: Наука, 1993. 222с.
2 Фритц Дж., Гьерде Д., Поланд К.М. Ионная хроматография. М.: Мир,
1984. 224с.
3 Шпигун О.А., Золотов Ю.А. Ионная хроматография и ее применение
в анализе вод. М.: Изд-во МГУ, 1990. 199с.
4 Eith C., Kolb M., Seudert A. Практическая ионная хроматография.
Herisau – Москва, Switzerland – Россия, 2005. 178с.
5 Шаповалова Е.Н., Пирогов А.В. Хроматографические методы
анализа. Методическое пособие для специального курса. М.: Изд-во МГУ,
2007. 204с.
6 Орлов В.И., Аратсков А.А. Теоретические основы ВЭЖХ.
Дзержинск: Научно-техническая компания "Синтеко", 1997. 41с.
7 Сборники научно-информативной терминологии. Вып. 114:
Хроматография. Основные понятия. Терминология / Отв. ред. В.А. Даванков.
Комитет научной терминологии РАН в области фундаментальных наук.
Научный совет по хроматографии. М. 1997. 48с.
8 Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн.1. Общие вопросы. Методы
разделения. Учебник для ВУЗов / Под ред. Ю.А. Золотова.- М.: Высшая
школа, 2002. 351с.
9 Схунмакерс П. Оптимизация селективности в хроматографии. М.:
Мир, 1989. 399с.
10 Риман В., Уолтон Г. Ионообменная хроматография в аналитической
химии. М.: Мир, 1973. 375с.
11 Столяров Б.В. и др. Практическая газовая и жидкостная
хроматография: Уч. пособие. С.-Пб.: Изд-во С.-Петербург. ун-та, 1998. 612с.
12 Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая
высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. 288с.