Федеральное агентство по образованию

Московская государственная академия

тонкой химической технологии
имени М.В. Ломоносова

Кафедра
аналитической химии

Туркельтауб Г.Н., Ищенко А.А.

ВВДЕНИЕ В ХРОМАТОГРАФИЮ

Учебное пособие

Москва
МИТХТ им. М.В.Ломоносова
2008
 ББК24.74.я7
УДК 543.544
Рецензент:
д.х.н., проф. Ларионов О. Г. (ИФХЭ РАН им.
А.Н.Фрумкина).
Рекомендовано к изданию кафедрой аналитической
химии МИТХТ (протокол № от .03.08)
Туркельтауб Г.Н., Ищенко А.А.
ВВЕДЕНИЕ В ХРОМАТОГРАФИЮ
Учебное пособие.
М: МИТХТ им. М.В.Ломоносова, 2008 – 84с.:ил.
Утверждено Библиотечным Издательским Комитетом
МИТХТ им. М.В.Ломоносова в качестве учебного
пособия. Поз.
Учебное пособие знакомит с основными методами
хроматографического анализа. Эти методы широко
используются для качественного и количественного
анализа различных органических и неорганических
веществ. Хроматографические методы применяются
при анализе пищевых продуктов, окружающей среды,
лекарственных препаратов. Особое значение
приобрели эти методы для контроля
производственных процессов. Достоинством этих
методов является высокая чувствительность,
точность, экспрессность анализа.
Это учебное пособие предназначено для
самостоятельной работы студентов по курсу физико-
химических методов анализа и выполнению
практических лабораторных работ.
Пособие подготовлено на кафедре аналитической
химии МИТХТ им. М.В.Ломоносова.
___________________________________________

© МИТХТ им. М.В.Ломоносова, 2008

 Введение

Хроматография была открыта русским ученым М.С.

Цветом 1901-1906 годах при исследовании пигментов
зеленого листа. При этом он получил ряд окрашенных зон.
Он дал название этому методу хроматография (от
греческого слова chroma (chromatos) цвет + grapho - пишу).
Это открытие признано настолько важным, что по
оценке ЮНЕСКО достойно включения в десятку
величайших открытий ХХ века.
Хроматография – метод анализа веществ, основанный
на распределении разделяемых компонентов между двумя
фазами: одна фаза неподвижная, другая — подвижная,
непрерывно протекающая через неподвижную фазу.
Можно дать и другое определение.
Хроматография - метод разделения смесей веществ
или частиц, основанный на различии скоростей их
перемещения по колонке в системе
несмешивающихся и движущихся относительно друг
друга фаз.
1.1. Схема работы хроматографической
колонки
Схема процесса разделения двух веществ в
хроматографической колонке показана на рис.1.
В хроматографическую колонку вводят очень небольшую
пробу анализируемой смеси. Вещество распределяется
между двумя несмешивающимися
 Рисунок 1. Схема разделения компонентов I и II в
хроматографической колонке. Доля сечения колонки,
занятая неподвижной фазой обозначена штриховкой.
Долю сечения колонки, свободную для непрерывного
прохождения газа-носителя - без штриховки.

фазами. Коэффициент распределения равен:

К = Сs /Cm, (1)
где Сs и Cm – концентрации вещества в
неподвижной и подвижной фазах.
Новые порции подвижной фазы, непрерывно
поступающей в колонку, вызовут перераспределение
этих соединений между подвижной и неподвижной
фазами.
Вместе с потоком подвижной фазы вещества
анализируемой пробы будут двигаться по колонке.
Хроматография обеспечивает многократность актов
перераспределения. Это позволяет выявить даже
малейшие различия в коэффициентах
распределения разделяемых веществ. При этом
вещества анализируемой пробы перемещаются по
колонке с различной скоростью в соответствии с их
коэффициентом распределения (Ki).
Будем условно считать, что колонка имеет 4
теоретические тарелки, то есть высота (длина)
каждой секции равна высоте теоретической тарелки.
Теоретическая тарелка это гипотетическая зона,
высота которой соответствует достижению
равновесия между двумя фазами. Чем больше
теоретитических тарелок тем эффективнее колонка.
Теория теоретических тарелок была предложена для
описания процесса ректификации и была
использована Мартином и Сингом для
хроматографии. При этом были приняты некоторые
допущения: колонка состоит из некоторого числа
теоретитических тарелок; равновесие на каждой
тарелке считается достигнутым, до того как
подвижная фаза переместится на следующую
тарелку.
Примем, что коэффициент распределения K1
вещества I равен ½.
То есть концентрации вещества I в неподвижной
фазе CS относится к концентрации вещества I в
подвижной фазе СM как 1/2, а для вещества II
концентрации этого вещества в жидкой фазе
относится к его концентрации в газовой фазе как 2/1.
В позиции 2 показано, что произошло
распределение этих веществ между подвижной
(газовой) и неподвижной (жидкой) фазами, согласно
значений их коэффициентов распределения.
В позиции 3 представлено, что потоком газа-
носителя вещества, которые остались в газовой фазе
передвинуты во вторую теоретическую тарелку.
Из позиции 4 видно, что произошло распределение
этих веществ между подвижной (газовой) и
неподвижной (жидкой) фазами. При этом в первой
тарелке вещества из неподвижной фазы переходят
согласно коэффициенту распределения в подвижную.
Во второй тарелке вещества наоборот сорбируются
(растворяются), переходя из подвижной в
неподвижную фазу.
В позиции 5 показано, что потоком газа-носителя
вещества, которые остались в газовой фазе
передвинуты из первой теоретической тарелки во
вторую, а из второй на третью теоретической тарелки.
В позиции 6 мы видим, что произошло
распределение этих веществ между подвижной и
неподвижной фазами. При этом в первой и второй
тарелках вещества из неподвижной фазы переходят
согласно коэффициенту распределения в подвижную.
В третьей тарелке вещества из подвижной
переходят в неподвижную фазу.
В позиции 7 показано, что потоком газа-носителя
вещества, которые остались подвижной фазе
передвинуты из первой теоретической тарелки
во вторую, из второй на третью теоретическую
тарелку, а из третьей на четвертую теоретическую
тарелку.
В позиции 8 представлено, что вновь произошло
распределение этих веществ между подвижной и
неподвижной фазами. При этом в первой, второй и
третьей тарелках вещества из неподвижной фазы
переходят согласно коэффициентам распределения в
подвижную. В четвертой тарелке вещества,
наоборот, из подвижной переходят в неподвижную
фазу. Соединения, которые остались в газовой фазе
на четвертой тарелке, покидают колонку и их
концентрация фиксируется детектором.
С помощью детектора (прибора записывающего
изменение концентрации в подвижной фазе), мы
увидим картину разделения двух пиков, которая
получила название хроматограммы.
Хроматограмма представляет зависимость сигнала
детектора от объема пропущенного элюента
(времени анализа). Профиль гауссовской кривой на
хроматограмме получили название
хроматографического пика.
Таким образом, на выходе из колонки мы получим
хроматограмму, состоящую из двух пиков (рис.2).
Если в шприце оказался пузырек воздуха, то мы
увидим три пика.
 Время выхода (элюирования) вещества из колонки
называют временем удерживания tR.
Время удерживания воздуха to, (или другого
вещества, которое вообще не удерживается
неподвижной фазой) называют мертвым временем.
Оно представляет собой время нахождения его в
подвижной фазе. Фактически это время, которое
затрачивает молекула подвижной фазы на
прохождение всего пути вдоль колонки.
Если из времени удерживания tR вычесть to, то
мы получим приведенное время удерживания t.
t = tR - to (2)
На выходе из колонки сначала появится
компонент, коэффициент распределения которого
равен 0, а последним выйдет соединение с
наибольшим коэффициентом распределения.

Рисунок 2. Аналитическая хроматограмма. Пик на

хроматограмме с временем удерживания tо соответствует
соединению, которое не сорбируется неподвижной фазой
и имеет коэффициент распределения K = 0. Второй пик с
временем удерживания tR1 соответствует соединению с K =
0,5.Третий пик с tR2 соответствует соединению с K = 2,0.
 1.2 Основные виды и варианты хроматографии
Любая хроматографическая система включает
подвижную и неподвижную фазы,
хроматографическую колонку (пластинку в
планарной хроматографии), в которой происходит
процесс разделения веществ.
Классификация методов хроматографии очень
многообразна и может быть проведена на основании:
 агрегатного состояния подвижной
фазы хроматографической системы:
газовая, жидкостная, сверхкритическая
флюидная;
 используемой неподвижной фазы: газо-
твердофазовая, газо-жидкостная,
жидкостно-твердофазовая, жидкостно-
жидкостная, флюидно-твердофазовая;
 способа перемещения сорбата:
фронтальная, когда разделяемая смесь
подается в колонку непрерывно; элюентная
(элютивная, проявительная), когда
разделяемая смесь подается в колонку
периодически, а элюент - непрерывно,
причем элюент удерживается в колонке
слабее наименее удерживаемого
компонента. Сегодня более 99% всех
анализов проводится элюентной
хроматографией.
 механизма разделения веществ:
адсорбционная, распределительная,
ситовая (эксклюзионная), ионообменная,
лигандообменная, аффинная
(биоселективная);
 цели разделения: аналитическая,
 препаративная, промышленная
хроматография;
 конфигурации разделяющей системы
различают: колоночную, планарную (тонкослойную и
бумажную) хроматографию.
В таблице 1 приведена классификация
хроматографии в зависимости от агрегатного
состояния фаз.
Таблица 1. Варианты хроматографии в
зависимости от агрегатного состояния фаз
Подвижная Неподвижная Наименование
фаза фаза
ГАЗ АДСОРБЕНТ ГАЗО-АДСОРБ-
ЦИОННАЯ
ГАЗ ЖИДКОСТЬ ГАЗОЖИД-
КОСТНАЯ
ЖИДКОСТЬ АДСОРБЕНТ ЖИДКОСТНО-
АДСОРБ-
ЦИОННАЯ
ЖИДКОСТЬ ЖИДКОСТЬ ЖИДКОСТНО-
ЖИДКОСТНАЯ
ВЕЩЕСТВО АДСОРБЕНТ ФЛЮИДНО-
В АДСОРБ-
СВЕХКРИТИ- ЦИОННАЯ
ЧЕКОМ
СОСТОЯНИИ
ВЕЩЕСТВО ЖИДКОСТЬ ФЛЮИДНО-
В ЖИДКОСТНАЯ
СВЕХКРИТИ-
ЧЕКОМ
СОСТОЯНИИ
Объектами хроматографического разделения
являются различные смеси соединений, которые
могут включать инертные газы и высокомолекулярные
полимеры. Вещества с молекулярной массой до 500-
1000 обычно разделяют методом газовой
хроматографии. Флюидная хроматография
позволяет разделять вещества с молекулярной
массой до 5000. Жидкостная хроматография
успешно разделяет соединения с молекулярной
массой до 10 000, а для соединений с молекулярной
массой свыше 10 000 используется ситовая
(эксклюзионная) хроматография.
Если вещества необходимо разделить в форме
ионов, то используются различные варианты
ионообменной хроматографии.
Аффинная хроматография использует
специфическую селективность некоторых
биологических и биохимических процессов.
Лигандообменная хроматография позволяет
разделять даже лево- и право-вращающие изомеры.
Если вещества не удается разделить прямыми
методами, то их можно разделить в виде
производных. Если необходимо исследовать
высокомолекулярное вещество, то его можно
подвергнуть пиролизу.
Хроматограмма, полученная после пиролиза
может позволить охарактеризовать исходный
полимер (дать его “характерный спектр”). Другим
косвенным методом для характеристики подобных
соединений является обращенная хроматография.
В этом случае анализируемое вещество наносится в
качестве неподвижной фазы. Об изменениях,
происходящих в нем, судят по уменьшению
(увеличению) времени удерживания и искажению
формы пика нескольких стандартных веществ.
Далее мы будем иметь дело в основном с
аналитической хроматографией.
Из рис.1 и 2 следует, что время удерживания

(3)

где L – длина колонки, u - средняя линейная

скорость газа-носителя. Соответственно для
несорбирующегося вещества (K = 0)
to = L/u.
Однако уравнение (3) справедливо лишь при
условии, что объем неподвижной фазы VS равен
объему подвижной фазы VM. Если это не так, то
время удерживания:

(4)

где k –фактор удерживания (фактор ёмкости),

равный:
k = K (VS/ VM) (5)
Фактор удерживания можно определить
непосредственно из хроматограммы:
k = (tR – to)/ to (6)
Характеристикой степени разделения двух
веществ служит фактор разделения (коэффициент
селективности) .
 = t2/ t1= k2/k1
(7)
Этот коэффициент тоже можно определить
непосредственно из хроматограммы.
3. Теоретические основы хроматографии
При движении веществ в хроматографической
колонке происходит размывание (уширение) пиков
разделяемых веществ, обусловленное кинетическими
и диффузионными причинами. При этом пик
приобретает форму гауссовой кривой. Поэтому
размывание хроматографического пика может быть
описано через стандартное отклонение  и
дисперсию 2. При рассмотрении рис.1 мы
воспользовались теорией теоретических тарелок,
предложенной Мартином и Сингом. По этой теории
движение вещества вдоль колонки можно
представить как последовательный его перенос c
одной теоретической тарелки на другую.
Число теоретических тарелок n равно отношению
длины колонки к высоте, эквивалентной
теоретической тарелке Н:
n = L/H (8)
Высота, эквивалентная теоретической тарелке
(ВЭТТ), связана с дисперсией пика в колонке 2 ,
которая выражена в единицах длины 2L или времени
2t..

или ( 9)

ВЭТТ имеет размерность длины. Уменьшение

ВЭТТ (8) позволяет, повысить эффективность
колонки.
Для пика гауссовой формы (рис.2)
справедливо равенство . Подставляя  в
уравнение (9), получим:
 . (10)

Число теоретических тарелок равно

. (11)

Эта величина может быть рассчитана

непосредственно из хроматограммы. Однако в этом
случае легче измерить ширину пика на половине
высоты , чем  (смотри рис.2).

. (11a)

Эта величина рассчитывается из хроматограммы и

позволяет оценить качество используемой колонки.
Принято считать, что в реальном
хроматографическом процессе размывание полосы
определяется, совокупностью процессов диффузии и
сопротивления межфазового массообмена. Такой
подход был впервые сформулирован в 1956 году
Ван-Деемтером и получил название теории Ван-
Деемтера. Согласно этой теории зависимость
высоты, эквивалентной теоретической тарелке, H от
скорости газа-носителя описывается уравнением
(12)
В это уравнение входят три константы.
 Рисунок 3. Зависимость высоты эквивалентной
теоретической тарелки H от скорости газа-носителя
U. А – коэффициент, учитывающий вклад вихревой
диффузии, В - молекулярной (продольной) диффузии,
С – сопротивлению массопереносу между фазами.

Константа A описывает вклад в размывание полосы

вихревой диффузии за счет неравномерности потока
подвижной фазы (рис. 4)
A = 2 dр (13)
где dр – средний диаметр зерна твердого
носителя;  - константа, являющаяся мерой
неравномерности заполнения колонки.

Размывание пика по длине колонки 

Рисунок 4. Иллюстрация вихревой диффузии.
Константа В учитывает вклад молекулярной
(продольной) диффузии, т.е. диффузии молекул в
прямом и противоположном направлении движения
подвижной фазы:
B =  Dm , (14)
где  - коэффициент извилистости, учитывающий
ограничение пути в насадочной колонки; Dm –
коэффициент диффузии анализируемого вещества в
подвижной фазе.
Константа Сs учитывает сопротивление
массопередачи в неподвижной фазе.

, (15)

Таблица 2. Параметры, влияющие на высоту

эквивалентную теоретической тарелке
Величина Обозна- Размер-
чение ность
Линейная скорость потока u смс-1
Коэффициент диффузии в Dm см2с-1
подвижной фазе
Коэффициент диффузии в Ds см2с-1
неподвижной фазе
Размер частиц сорбента dp см
Толщина слоя ds см
неподвижной фазы
Внутренний диаметр D см
колонки

Рассмотренный ранее фактор разделения α

показывает только расположение максимумов двух
пиков, но не учитывает их размывание.
Очевидно, что при разделении двух веществ, свой
вклад наряду с коэффициентом селективности
должна вносить и эффективность колонки.
Предложенный критерий разделения (разрешение
пиков) RS включает в себя оба этих критерия.

, (16)

где 2 и 1 – ширина пиков у их оснований, т.е.

расстояние между точками пересечения касательных
в точках перегиба пика с осью абсцисс (рис.2).
Критерий разделения RS непосредственно связан с
чистотой выделяемой пары веществ (при выделении
без промежуточной фракции). Так, концентрация
выделенных веществ будет составлять чуть более
98% при Rs = 1 и около 99,9% при Rs = 1,5.

Рисунок 5. Оценка эффективности и селективности

хроматографического разделения.
На рис.5 представлены три хроматограммы,
соответственно при Rs = 0,75; 1,0 и 1,5. Такое
улучшение разделения достигается при увеличении
эффективности или возрастании фактора разделения
.
Уравнение (16) можно представить в ином виде,
связав критерий разделения Rs c фактором емкости k,
коэффициентом разделения  и числом
теоретических тарелок n.
Примем 12=. Подставим в уравнение (16) ширину
пика у основания , представленную через число
теоретических тарелок n из соотношения (11):

(17)

Подставим в полученное выражение величины

коэффициентов ёмкости из уравнения (6):

(18)

Если в полученное выражение (18)

подставить из уравнения (7) величину коэффициента
селективности , тогда можем записать:
(19)

(20)

Из уравнения (20) следует, что при заданном

значении критерия разделения Rs и коэффициента
селективности , который определяется
свойствами хроматографируемых соединений
необходимо увеличить эффективность колонки. Для
разделения соединений с близкими свойствами надо
увеличить длину колонки или уменьшить ВЭТТ.
Последнее может быть достигнуто уменьшением
размера частиц, увеличением однородности насадки
колонки, уменьшением толщины пленки жидкой фазы
при одновременном снижении адсорбционной
активности поверхности, на которую наносится эта
неподвижная фаза. Помимо этого можно увеличить
фактор разделения . Для этого необходимо
подобрать более селективную неподвижную, а для
жидкостной хроматографии и подвижную фазу. В
газовой хроматографии снизить температуру колонки.
Помимо диффузии и сопротивления
массопередачи размывание пика будет происходить в
случае нелинейности изотермы распределения.
До сих пор мы исходили из теории «идеальных
растворов», когда константа распределения не
зависит от концентрации. При этом, как видно из
рисунка 6 (первый столбец) изотерма
распределения имеет линейный характер, пик
остается симметричным, а время удерживания
постоянным. Если изотерма распределения имеет
выпуклый характер, то с увеличением концентрации
время удерживания уменьшается, а у пика
появляется «хвост». Если изотерма
распределения имеет вогнутую форму, то с
увеличением концентрации время удерживания
увеличивается, а у пика появляется «нос».
При этом происходит дополнительное размывание
полосы (увеличение ширины пика). Для уменьшения
этого в газожидкостной хроматографии проводится
очень тщательная обработка твердого носителя,
который промывается кислотами и затем
обрабатывается парами хлорсиланов.
 Тип изотермы

Линейная Выпуклая Вогнутая

S

Форма пика вещества, элюирующего

из колонки

Концентрация вещества CA
Рисунок 6. Связь изотермы распределения, формы
хроматографического пика и объема удерживания. CA, CB -
концентрация анализируемого вещества в неподвижной и
подвижной фазе соответственно; VR – объем удерживания;
S – сигнал детектора.
4. Общая схема хроматографического анализа.
Несмотря на большое многообразие вариантов
хроматографии, процесс хроматографического
анализа можно представить единой схемой,
состоящей из следующих стадий: подача подвижной
фазы, ввод анализируемой пробы, собственно
хроматографическое разделение, детектирование,
обработка результатов разделения. Каждой из
указанной стадий соответствует определенный узел
или блок хроматографа. На рис.7 показана схема
хроматографа.

Рисунок 7. Схема газового хроматографа.

1 – газ-носитель; 2 – регулятор потока газ-носителя; 3 –
микрошприц для ввода пробы; 4 – испаритель; 5 –
хроматографические колонки; 6 – термостат колонок; 7 –
детектор; 8 – система регистрации.
Газ-носитель из газового баллона через редуктор
поступает в хроматограф (1). Регулятором расхода
устанавливается скорость газа-носителя (2). Ввод
пробы обычно осуществляется с помощью шприца (3)
или дозатора. Автоматические дозаторы позволяют
работать в полностью автоматизированном режиме.
В дозаторе в специальных гнездах располагаются
склянки с образцами анализируемых смесей.
«Механическая рука» вводит шприц в склянку,
промывает его раствором анализируемой смеси и
вводит в испаритель хроматографа. Затем берется
проба из другой склянки для следующего анализа. В
испарителе (4) проба переводится в газообразное
состояние. Затем она захватывается потоком
подвижной фазы и попадает в колонку. В
хроматографической колонке (5) смесь разделяется
на отдельные компоненты. Колонки обычно
помещаются в воздушный термостат (6). Компоненты
анализируемой пробы вместе с потоком подвижной
фазы поступают в детектор (7). В детекторе
изменение концентрации компонента преобразуется в
электрический сигнал, усиливаемый и затем
регистрируемый в виде выходной кривой –
хроматограммы (8). В современных хроматографах
задание и поддержание температуры, скорости
подвижной фазы и всех других параметров
хроматографического опыта берет на себя
компьютер.
Схема высокоэффективного жидкостного
хроматографа (ВЭЖХ) представлена на рис. 20 будет
рассмотрена позже.
Основными техническими характеристиками
хроматографических детекторов являются:
- чувствительность, которую характеризуют
отношением сигнала детектора к количеству
регистрируемого вещества;
- предел детектирования или предел обнаружения
(ПО) - минимальное количество вещества,
соответствующее сигналу детектора, вдвое
превышающему высоте пика, характерного для шума
детектора;
- линейность, представляющая собой диапазон
концентраций, в пределах которого зависимость
«сигнал – концентрация» имеет линейный характер.
- стабильность работы (низкая чувствительность к
колебаниям температуры;
- воспроизводимость. Под воспроизводимостью
работы детектора понимается воспроизводимость его
показаний во времени при постоянных
чувствительности, фоновом токе и других условиях
эксперимента.
Анализ и методы расчета хроматограмм
Аналитическую хроматографию используют для
качественного и количественного анализа простых и
очень сложных смесей, в том числе таких как
пищевые продукты, лекарства, продукты,
загрязняющие окружающую среду. Препаративную
хроматографию применяют для выделения некоторых
веществ с близкими свойствами (например, лево- и
правовращающие изомеры), для очистки
лекарственных препаратов. Промышленную
хроматографию используют для контроля и
регулирования различных технологических
процессов.
Качественный анализ основывается на
сопоставлении времен удерживания компонентов
смеси с веществами, выделенными из данной смеси
(или полученными другим путем), которые затем были
идентифицированы иными независимыми методами.
Успешная идентификация проводится при
сочетании хроматографии с некоторыми
спектральными методами. Большое значение
приобретает хромато-масс-спектрометрия,
соединение хроматографии с УФ и ИК спектроскопией
и некоторыми другими методами.
Широко используется идентификация, основанная
на:
- применении специальных детектирующих систем;
- применении корреляционных зависимостей
параметров удерживания от физических или физико-
химических свойств веществ.
Наиболее полно такие зависимости изучены,
например, для температуры кипения, показателя
преломления, молекулярной рефракции, числа
функциональных групп.
Количественный анализ.
Количественный анализ основывается на
измерении площади хроматографического пика S или
его высоты h, которые пропорциональны
концентрации определяемого вещества.
Обычно используют один из трех методов
обработки результатов анализа. Это методы
нормировки, внешнего и внутреннего стандарта.
Метод нормировки. Нормировка в
хроматографическом анализе представляет собой
расчет массовой доли каждого компонента смеси xi,
путем деления площади соответствующего пика, Si на
сумму площадей всех пиков. При этом считают, что из
хроматографа выходят все компоненты смеси и
чувствительность детектора к каждому их них
одинакова:

где n – число компонентов в смеси.

Часто чувствительность детектора к различным
соединениям неодинакова. Эту особенность
учитывают введением поправочных коэффициентов,
i. В этом случае массовую долю рассчитывают по
формуле:

При анализе многокомпонентных смесей обычно

возникает ситуация, когда провести градуировку по
всем компонентам смеси невозможно. Поэтому
приобретает актуальность априорная оценка
поправочных коэффициентов. Такая оценка основана
на анализе механизма детектирования и учета
особенностей химического строения анализируемых
веществ. Так, для пламенно-ионизационного
детектора экспериментальные наблюдения
позволили установить, что сигнал детектора при
анализе углеводородов пропорционален числу
атомов углерода в молекуле.
Метод внешнего стандарта (абсолютной
калибровки) заключается в построении графической
зависимости площади (высоты) пиков от количества
(концентрации) вещества в смеси (рис. 8). При
анализе смеси из i компонентов, строят число
графиков, равное их числу. Метод является наиболее
точным, надежным при анализе малых концентраций.
При его использовании необходимо точно вводить
пробу и строго соблюдать условия
хроматографирования при калибровке и определении
анализируемого вещества.
 Рисунок 8. Зависимость сигнала (площади пика) S от
содержания компонента % (метод внешнего стандарта)
для соединений 1, 2 и 3.
Метод внутреннего стандарта (относительной
калибровки). По хроматограммам специально
приготовленных смесей с известным соотношением
анализируемого и стандартного веществ находят
площади пиков и рассчитывают их отношение. Для
каждого вещества строят график зависимости этого
отношения (S/Sст) от величины массового
соотношения компонента и стандартного вещества в
смеси. При анализе смеси неизвестного состава к ней
добавляют точное количество стандартного вещества
и хроматографируют.
Измеряют площади. Находят отношение
площадей пиков и рассчитывают массу
определяемого вещества. Этот метод позволяет
получить правильные и воспроизводимые
результаты. Он применим, если на хроматограмме
отсутствует значительная часть пиков компонентов
анализируемой смеси.
 5 Газовая хроматография
Бурное развитие газовой хроматографии началось
с 1952 года, после того как Мартин и Джеймс
осуществили газожидкостной вариант, использовав
смешанную неподвижную фазу, состоящую из
стеариновой кислоты и полиметилфенилсилоксана.
Это позволило сразу включить широкий набор
жидкостей вместо ограниченного круга адсорбентов.
Кроме того, линейность изотермы распределения
анализируемых веществ (постоянство времени
удерживания) позволило проводить надежную
идентификацию даже очень сложных смесей.
Примерно в это же время целый ряд фирм начал
серийный выпуск газовых хроматографов.
Принципиальная схема хроматографической
установки приведена на рис.7.
5.1 Газожидкостная хроматография.
Разделение анализируемой смеси в ГХ
происходит за счет различия констант
распределения K1 и K2, как это показано, например,
на рис.1. При этом приведенный объем
удерживания, V’R прямо зависит от количества
жидкой фазы Vs в колонке.
Приведенный объем удерживания получается, если
из объем удерживания VR вычесть мертвый объем VM.
VR’ = VR - VM = VS K , (21)
где K - коэффициентом распределения.
Объем удерживания VR определяется:
VR = uср  tR , (22)
uср – объемная скорость газа-носителя.
Для сорбентов насадочных колонок количества
жидкой фазы получило название степени пропитки и
задается как процент жидкой фазы от веса всего
сорбента. Выбор степени пропитки зависит от
особенностей решаемых задач и твердого носителя.
Наибольшее распространение получили твердые
носители на основе «диатомитов», которые
образовались в результате отмирания
одноклеточных диатомитовых водорослей. Для
анализа высококипящих соединений используется
малый процент неподвижной фазы - 5% (а иногда 3 и
даже 1%). Часто на упаковках с таким сорбентом
ставится надпись: «для высокотемпературной
хроматографии».
Вообще, можно нанести на твердый носитель
практически любое количество жидкой фазы, но
обычно степень пропитки составляет от 3 до 25%.
Сам процесс приготовления сорбента для
газожидкостной хроматографии предельно прост.
Сначала взвешивают требуемое количество жидкой
фазы и твердого носителя. Взвешенное количество
жидкой фазы (обычно несколько грамм) растворяют в
50-100 мл низкокипящего растворителя. Готовый
раствор выливают в «выпаривательную» чашку. Туда
же помещают взвешенный твердый носитель так,
чтобы полученный раствор полностью покрывал его
поверхность. Затем при слабом нагревании и
медленном перемешивании ждут полного испарения
растворителя. Спустя некоторое время, после того
как приготовленный сорбент вновь приобрел
«сыпучесть», его можно засыпать в колонку.
Поверхность твердого носителя представляет
собой набор узких и широких пор, заполненных
жидкостью и участков поверхности, где жидкая фаза
вовсе отсутствует (рис. 9).
Твердый носитель должен быть инертным,
сохраняя при этом большую удельную поверхность. К
сожалению, диатомитовые твердые носители
содержат ряд примесей, которые приводят к
образованию «хвостов» (смотри рис. 6) и сдвигу
времен удерживания, характерному для выпуклой
изотермы адсорбции.

Рисунок 9. Модель заполнения твердого носителя

неподвижной жидкой фазой. А – поверхность твердого
носителя без неподвижной жидкой фазы. Б – поверхность
твердого носителя, покрытая неподвижной жидкой фазой.
Для уменьшения влияния этого фактора
диатомитовые твердые носители промывают
кислотой и обрабатывают гексаметилдисиланом или
диметилдихлорсиланом.
Понятно, что для различных твердых носителей,
отличающихся по величине площади удельной
поверхности, одинаковая степень пропитки приводит
к различным временам удерживания. Чтобы иметь
возможность сравнения сорбентов на различных
твердых носителях, вводится концепция толщины
слоя (пленки) неподвижной фазы. Толщины «пленки»
рассчитывается делением объема жидкой фазы на
площадь поверхности используемого твердого
носителя.
Газовая хроматография позволяет установить,
например, состав фракции нефти, содержащей
несколько сотен компонентов. При этом температура
кипения повышается от -161ºС для метана до более
чем 800ºС для углеводорода C120H242.
Соответственно, возникает вопрос: как
проанализировать все эти соединения одновременно
в одних и тех же условиях?
Для этого рассмотрим влияние
хроматографических параметров на объем
удерживания.
Коэффициент распределения K зависит от
величины свободной энергии растворения, F0 и
температуры колонки, Т:

, (23)

где R - универсальная газовая постоянная; C –

безразмерная постоянная.
Если принять F  Q - теплоте растворения, то,
выражая теплоту растворения через температуру
кипения по правилу Трутона (Q 21TK;
R = 1,992,0 кал/моль град), получим следующее
соотношение
(24)
Подставим значения приведенного удерживаемого
объема из уравнения (21) в уравнение (22):
Vs K = uср  t. (25)
t - приведенное время удерживания.
Теперь прологарифмируем это уравнение и
подставим в левую часть значение K из соотношения
(23) , и получим уравнение:

(26)
 Если числитель и знаменатель отношения u/VL
разделим на площадь поперечного сечения колонки S, то
получим:

(26a)

где u – средняя линейная скорость газа-носителя;

VL - объем жидкой фазы(VL = VS); L - длина колонки;
 - толщина слоя жидкой фазы; C – постоянная.

Это уравнение позволяет связать параметры

хроматографического опыта с термодинамическими
характеристиками вещества и, в частности с
температурой кипения. Если анализируемые
вещества низкокипящие, то необходимо либо
понижать температуру колонки, либо увеличивать
количество неподвижной фазы. В случае
высококипящих веществ, для элюирования их при
времени удерживания t, можно повысить
температуру колонки, уменьшить процент
неподвижной фазы, сократить длину колонки,
увеличить линейную скорость газа-носителя. Кроме
того, необходимо повысить температуру испарителя,
детектора и т.д.
При повышении температуры колонки возникает
проблема термической устойчивости анализируемых
соединений и стационарных фаз, используемых в
газожидкостной хроматографии. Причем, на
термостойкость влияет материал испарителя и
колонки, присутствие тех или иных примесей в
твердом носителе и неподвижной фазе, состав
анализируемой смеси. Кроме этих причин
термической неустойчивости анализируемых веществ
и стационарных фаз имеются принципиальные
температурные ограничения. Так, при 350оС, исходя
из расчета энергии связи Si – C, должен происходить
отрыв органических радикалов. Экспериментально
установлено, что при температуре 370оС
наблюдается разрыв Si – O – Si связи.
Помимо силиконов , термическая устойчивость
которых достаточно высока, в справочниках и
проспектах ведущих фирм, предлагающих
материалы для хроматографии, предлагаются
стационарные фазы с температурным пределом от
120 до 250 оС. В этом случае температура колонки
должна быть понижена.
Из уравнения (26) следует, что при этом
значительно возрастет время удерживания.
Очевидно, что анализ, на который надо затратить
много часов, нецелесообразен. На практике время
анализа всегда ограничено. Поэтому в
хроматографии число теоретических тарелок n
относят ко времени анализа. Соответственно RS
(смотри уравнение 19) следует разделить на корень
квадратный из времени анализа.
Хроматография обычно применяется при анализе
сложных смесей, когда число компонентов в смеси
значительно превышает количество пиков на
хроматограмме. При этом неважно насколько хорошо
делятся отдельные пики, а желательно оценить
какое максимально-возможное число пиков TZ.
(эффективное число пиков). TZ мы можем определить
на данной колонке (с известным числом
теоретических тарелок).

, (27)
где 2 и 1 – ширина пиков на половине высоты.

Рисунок 10. Оценка эффективности метода

хроматографии числом разделений TZ, т.е. числом
“условных” пиков, которое помещается между двумя
пиками Для выделения высококипящих соединений в
дистилляции используется вакуум. В газовой
хроматографии можно понизить температуру анализа
увеличением скорости газа-носителя, уменьшением
толщины слоя неподвижной фазы, сокращением
длины колонки. Это позволяет анализировать
соединения с температурой кипения 700-800оС при
температуре анализа 350-400оС.
Если интервал температур кипения смеси
анализируемых веществ достигает более 100ºС, то
время анализа резко возрастает. Из сравнения
хроматограмм, приведенных на рис. 11 видно, что при
изотермическом режиме пики низкокипящих
компонентов “налезают” друг на друга. Пики
высококипящих компонентов сильно размыты. Из
рисунка видно, что некоторые из этих пиков в
изотермическом режиме не выходят из колонки вовсе.
При программировании температуры (повышении
температуры в ходе анализа) элюируют все
высококипящие компоненты. При этом эти пики
становятся более узкими и симметричными (рис.11).