Вязкость растворов макромолекул. Вискозиметрия. Рассмотрим эффект вязкости на следующей модельной схеме.
Жидкость помещена между двумя параллельными пластинами, одна из
Движению частиц (молекул) в жидкой фазе препятствует сила трения
об молекулы растворителя и растворенных веществ. Это сила вызывает
эффект, называемый вязкостью. Всем реальным жидкостям и газам
присуща вязкость (внутренне трение). Растворы, содержащие
макромолекулы, имеют большую вязкость, чем чистый растворитель.
Возрастание вязкости является функцией ряда параметров макромолекулы,
каждый из которых увеличивает инкремент вязкости. Такими параметрами
являются объем молекулы (объем раствора, который вытесняет молекула),
осевое соотношение (отношение длины молекулы к ширине), жесткость
структуры макромолекулы. Поэтому определение показателей вязкости
растворов макромолекул позволяет судить об этих параметрах. Удобными
моделями для описания поведения макромолекул в жидкой среде являются
модели правильной сферы, эллипсоида вращения, жесткого стержня
(Рис.1). Так, для глобулярных белков объем макромолекулы можно связать
с массой макромолекулы. В случае тонких длинных молекул (например,
фибриллярные белки, ДНК), основной эффект на вязкость раствора
оказывает осевое соотношение и оно является функцией молекулярной
массы. Следовательно, измерение вязкости растворов макромолекул
(вискозиметрия) может быть использована для определения молекулярной
массы, или, если м.м. известна, то по вязкости раствора можно судить об
общей длине молекулы.
Рис.1. Физические модели макромолекул:
1 - сфера, радиусом r; 2 – вытянутый эллипсоид
вращения, а > в; 3 - сплющенный эллипсоид, а < в; 4-
вытянутый стержень, а< < в
которых неподвижна, а другая движется со скоростью V по направлению Х
(рис. 2 ). Слой жидкости, прилегающий к первой пластине, будет двигаться
со скоростью примерно равной V, слой жидкости, прилегающий к нижней
пластине будет двигаться со значительно меньшей скоростью. Представим,
что жидкость между пластинами состоит из большого количества тонких
(мономолекулярных) слоев, каждый из которых скользит вдоль соседнего.
Возникающее трение между слоями приводит к появлению градиента
скорости. Вид деформации в движущихся жидкостях, вызванный
градиентом скорости, называют сдвигом. И. Ньютон показал, что сила
сопротивления f между соседними слоями пропорциональна градиенту
скорости dV/dY, размеру площади соприкосновения слоев S,
коэффициенту вязкости :
dv
F  S [1]
dx
где dv/dx - изменение скорости отнесенное к расстоянию между слоями
в направлении, перпендикулярном скорости (градиенту модуля скорости),
S - площадь соприкосновения слоев,  - динамическая вязкость жидкости
(коэффициент вязкости - зависит от формы молекул, температуры среды).
Жидкости с постоянными величинами коэффициента вязкости
называются ньютоновыми жидкостям , а вязкость - нормальной.
Жидкости с непостоянными по всему объему значениями  -
неньютоновыми жидкостями, а вязкость их – аномальной. При течении
жидкости с небольшими значениями градиента скорости наблюдается
ламинарное течение. При высоких значениях градиента скорости возникает
явление турбулентности.
Сила сдвига 1
3
2
направление х
направление у
А

Б необходимо, чтобы течение было ламинарным, т.е. таким, при котором
Рис. 2. Модель ламинарного течения жидкости между двумя
пластинами (А) и в цилиндрической трубе (Б) (Фрайфельдер, 361 с)
1. –пластина, движущаяся со скоростью v; 2- неподвижная пластина;
3.- жидкость, состоящая из бесконечно тонких слоев (длина стрелки
отражает скорость движения слоя);
Ньютоновой жидкостью является вода, гомогенные водные растворы
неорганических и органических соединений.
К неньютоновским жидкостям относятся жидкости, состоящие из
сложных и крупных молекул (полимеров). Например, кровь,
представляющая собой раствор молекул неорганических веществ, белков,
углеводов и специализированных клеток. В жидкостях внутреннее трение
обусловлено действием межмолекулярных сил. Расстояния между
молекулами жидкости сравнительно невелики, а силы взаимодействия
значительны. Молекулы жидкости, подобно частицам твердого тела,
колеблются около положения равновесия, но эти положения равновесия не
являются постоянными. По истечении времени “оседлой жизни” молекула
скачком переходит в новое положение. Среднее время “оседлой жизни”
молекул называется временем релаксации . С повышением температуры и
понижением давления время релаксации уменьшается, что обуславливает
подвижность жидкости и ее малую вязкость. Зависимость вязкости от
температуры имеет сложный характер. Чем чаще молекулы меняют свои
положения равновесия, тем более текуча и менее вязка жидкость, т.е.
вязкость жидкости прямо пропорциональна времени релаксации . Если
жидкость течет по цилиндрической трубе, наибольшее трение испытывает
слой у стенок трубки. В этом случае скорость течения максимальна вдоль
центральной оси трубки и минимально вдоль стенок. Градиент скорости
носит не линейный, параболический характер( Рис. 2, Б). Для протекании
жидкости через трубку требуется некоторая разность давлений.
Зависимость между объемом жидкости, протекающей за время t через
трубку длиной l и разностью давлений p на концах трубки, выражается
формулой Пуазейля:
V = r4p t/ 8 l [2]
где r - радиус трубки, l - длина трубки,  - динамическая вязкость
жидкости. Для определения вязкости жидкости по этой формуле
слои жидкости текут не перемешиваясь. Для вихревого (турбулентного)
движения формула Пуазейля несправедлива. Чтобы при обычных
скоростях вихри не появлялись, трубка должна быть достаточно тонкой.
Приборы, с помощью которых определяют вязкость, называются
вискозиметрами. Измерение входящих в формулу Пуазейля величин r, l,
p провести трудно и поэтому прибегают к определению вязкости
жидкости методом сравнения ее движения в данном вискозиметре с
движением эталонной жидкости с известной вязкостью.
Одно колено капиллярного вискозиметра Оствальда представляет
собой капиллярную трубку (рис. 3). В широкое колено вискозиметра
вливают воду, а затем грушей всасывают воду в другое колено так, чтобы
ее уровень был выше отметки А. Сняв грушу, наблюдают за понижением
уровня воды. Когда мениск проходит через отметку А, включают
секундомер, при прохождении метки В - выключают. Так находят время t0
прохождения воды между метками А и В. Оно будет равно времени
прохождения этого объема через капилляр. Также определяют время t
протекания исследуемой жидкости. Объем жидкости берут равным объему
воды. Жидкости в капилляре движутся под действием гидростатического
давления р  gh, где  - плотность жидкости, h - разность уровней
давления жидкости в двух коленах вискозиметра. Для равных объемов
жидкости, протекающих через капилляр, можно записать V =
r4p00/(8n0l), откуда r4p00/(8n0l) = r4p/(8nl), или
 0 0  0  p  [3]
Подставляя p0  0gh, p = gh в формулу [3], получим:
0gh0/ = gh/ или gh0/0 = gh/, откуда
 = 0/0 [4]
где  -кинематическая вязкость исследуемой жидкости ( = /р), 0 -
кинематическая вязкость воды (0,105 10-2 м2/с),  - время истечения
исследуемой жидкости, 0 - время истечения воды.
Обозначим постоянную прибора А =  0/0 [5].
 Тогда формула [4] примет вид  = A.
2 концентрациях, строят график зависимости уд /с от с и экстраполируют к
1 с = 0.
Рис. 3. Каппилярный визкозиметр Оствальда (1),
многошариковый визкозиметр
(описание в тексте)
Вязкость раствора может значительно отличаться от вязкости
растворителя. Добавление молекул к растворителю с вязкостью 0
приводит к повышению вязкости раствора до величины . Изменение
вязкости в этом случае выражают как отношение /0 , называемое
относительной вязкостью отн. Вязкость часто выражают как удельную
вязкость уд , которая является долей изменения вязкости, вызванная
только добавлением растворенного вещества, тогда
уд =  - 0 / 0 = отн –1 [6]
По величине этого показателя можно судить о свойствах молекул
растворенного вещества. Биологические молекулы представляют собой
полимерные молекулы. В растворах этих молекул большую роль играют
них межмолекулярные взаимодействия, которые увеличиваются с ростом
концентрации. Относительная и удельная вязкости растворов
непосредственно не связаны с параметрами макромолекул ( формой,
объемом). Для характеристики макромолекул используют еще один
показатель вязкости, которую называют характеристической (внутренней)
вязкостью []:
 c  0
   lim = lim уд/с  аV [6]
c 0 c  0
где с - вязкость раствора полимера, 0 - вязкость растворителя, а -
константа, зависящая от формы молекулы, V - константа, характеризующая
объем молекулы. Как видно, характеристическая вязкость зависит только
от константы а, связанной с формой молекулы и от удельного объема V.
Для разбавленных растворов характеристическая вязкость запишется так
[] = νVN0/M [7]
где М – молекулярная масса макромолекулы, N0 = число Авагадро, V =
объем макромолекулы, ν- фактор формы макромолекулы (коэффициент
Симхи)
Экспериментально определяют удельную вязкость при нескольких
Гибкие цепи макромолекул в растворе принимают форму
асимметрического клубка, который можно представлять в виде эллипсоида
вращения. Такая молекула вращается вместе с жидкостью, пронизывающий
данный клубок. Характеристическая вязкость такой молекулы зависит от
молекулярной массы. Для полимеров одного гомологичного ряда в
определенном растворителе существует зависимость [] = k0M , где k0 -
постоянный коэффициент, М - молекулярная масса. Показатель степени
ассимитричности зависит от формы молекул. Для шарообразных молекул
а = 0. Чем сильнее асимметрия клубка, тем больше а. Уравнение [5] можно
записать в виде ln[] = ln k + a ln M. Оно представляет собой уравнение
прямой [] = f(M) в логарифмических координатах. Измерив
характеристическую вязкость нескольких растворов полимеров одного
гомологичного ряда с известными М и построив график зависимости [] =
f(M), можно определить неизвестную молекулярную массу вещества.
Для определения характеристической вязкости используется
многошариковый вискозиметр (рис. 4). Он отличается от вискозиметра
Оствальда тем, что имеет более длинный капилляр и позволяет более точно
измерить время протекания жидкости. Наличие трех шариков позволяет 4. Обнаружение синтеза ДНК при ферментативной полимеризации
создавать различные градиенты скорости. нуклеотидов по повышению вязкости.
В системе СИ значения вязкости  (динамической вязкости) выражают
в Паּс (паскаль-секунд), внесистемная единица измерения  - П (пуаз): 1 Диффузия макромолекул.
Паּс = 10 П . Вязкость воды при 20º С составляет 1 мПаּс, большинства
низкомолекулярных жидкостей доходит до 10 мПаּс. Вязкость крови При движении молекул в растворителе возникает сила трения
человека в норме 4-5 мПаּс, при патологии колеблется в пределах 1,7 – 23
мПаּс. Отношение динамической вязкости к плотности жидкости
F = - fv
называется кинематической вязкостью . Единицей измерения  в системе
СИ является м2/с (квадратный метр в секунду), внесистемной единицей –
Ст ( стокс): 1 м2/с =10000 Ст. Кинематическая вязкость полнее, чем где f - фрикционный коэффициент , v – скорость движения
динамическая , учитывает влияние внутреннего трения на характер течения молекулы.
жидкости или газа в трубах. Характер течения жидкости или газа Фрикционный коэффициент макромолекул зависит от их формы и
существенно зависит от размеров трубы. В широких трубах даже при размеров. Для молекул сферической формы (например, для глобулярных
небольших скоростях течения может возникнуть турбулентное движение. белков, ) f = 6 ηπr
Например, в трубке диаметром 2 см течение воды становится Тогда, сила сопротивления при дфижении сферических макромолекл в
турбулентным при скорости 12 см/с, а в трубке с диаметром 2 мм – только жидкости выражается законом Стокса
при скорости 127 см/с. Течение крови в артериях человека является F = - 6 ηπr v
ламинарным, небольшая турбулентность возникает вблизи клапанов. При На поведение макромолекул в растворе основное влияние оказывают
патологии, вследствие уменьшения вязкости крови, движение крови в столкновение с молекулами растворителя. Подсчитано, молекула белка
сосудах может стать турбулентным. Для характеристики движения средних размеров в разбавленном растворе испытывает 1013 - 1015
жидкости в трубах удобно использовать показатель - число Рейнольдса столкновений в секунду, обусловленные тепловыми движениями. Это
Re. определяет статистическое поведение макромолекул- хаотичность
Re = ρvD/ = vD/ движения (броуновское движение).
где ρ - плотность жидкости; D – диаметр трубы; v – скорость течения Согласно законам статистической физики, параметром,
жидкости. описывающим хаотическое движение молекул, является
Если число Рейнольдса больше некоторого критического значения среднеквадратичное смещение х2‫־‬
(Re> Reкр), то течение жидкости в трубах турбулентное. Например, в х2 = 2‫ ־‬К0ТΔ t/ f
трубах с гладкой внутренней поверхностью Reкр для воды составляет где – время наблюдения за хаотическим движением макромолекул.
около 2300. Таким образом, измерив х2‫ ־‬можно определить значение f, следовательно, и
Таким образом, вискозиметрию можно использовать для определения размеры макромолекулы. Однако, невозможно следить за поведением
молекулярной массы, для установления формы и размеров макромолекул. отдельной молекулы, и следовательно, невозможно прямо определить
Ниже приводятся некоторые примеры использования вискозиметрии. значение х2‫־‬. Поэтому определение значений х2‫ ־‬и f проводят косвенными
1. Определение общей формы белковых молекул путем сравнения способами. Один из таких способов – это определение коэффициента
вязкости нативного и денатурированного белка. диффузии D. Диффузия – это самопроизвольное перемещение молекул из
2. Обнаружение дисульфидных связей в белковых молекулах путем области с высокой концентрацией в область с низкой концентрацией в
сравнения вязкости раствора восстановленных (2-меркаптоэтанолом) результате хаотического движения. Поток вещества ( количество молекул
молекул с вязкостью нативного белка. в единицу времени) при поступательной диффузии описывается первым
3. Соотношение кольцевой и линейной форм в молекулах ДНК по законом Фика:
изменению вязкости ДНК после обработки ее ДНКазой. dn/dt = - DAdc/dx,
 где n – число молекул; А – площадь перемещения; с – концентрация (константа седиментации , коэффициент диффузии ,
вещества; D - коэффициент диффузии (м 2 с-1). Знак минус означает, что
парциальный удельный объем V и молекулярная масса М
поток направлен в сторону уменьшения концентрации вещества.
Коэффициент диффузии связан с х2‫ ־‬и f следующей формулой :
D = х2 / 2‫ ־‬Δ t = К0Т/ f Белок S0 1013, с 1011, V, л•кг-1 М, Да
Таким образом, измерив D можно вычислить значение f и, м2 •с-1
соответственно, можно сделать заключение о форме макромолекулы. Цитохром с1 1,71 11,40 0,728 13370
Для сферических макромолекул радиусом r f = 6 ηπr = К0Т/ D, Лизоцим 1,91 11,20 0,703 13930
тогда r = К0Т/ 6 ηπ D. Рибонуклеаза 2,00 13,10 0,707 12640
Миоглобин 2,04 11,3 0,74 16890
Сывороточный 4,60 6,10 0,733 68460
альбумин
Каталаза печени 11,2 4,10 0,735 250000
Рис. 5. Измерение коэффициента Уреаза 18,6 3,46 0,73 480000
диффузии макромолекул: Гемоцианин 98,9 1,38 0,738 6,6•106
a - диффузия макромолекул на
границе раздела раствор-
растворитель; б - изменение во Установленную экспериментальным путем величину коэффициента
времени концентрации (с) диффузии обычно приводят к стандартным условиям (бесконечное
макромолекул и градиента разбавление в воде w, при 293 К) По формуле
концентраций границе = .
раздела раствор–растворитель; 1 – В таблице 1 приведены некоторые физические параметры ряда белков
t = 0; 2 – t2; 3 – t2; H – высота пика с разными молекулярными массами, с различными формами и размерами
молекул. Как видно из таблицы, соотношение М ~1/D3, полученный для
сферических макромолекул не всегда выполняется. Например, при
увеличении молекулярной массы белка в 450 раз (сравниваем гемоцианин
Отсюда следует, что для сферических макромолекул молекулярная с цитохромом с1) коэффициент диффузии уменьшается всего в 9 раз. Это
масса обратно пропорциональна коэффициенту диффузии в кубе: свидетельствует о том, что коэффициент D зависит не только от массы
М ~1/D3 молекул, но и от их формы.
Величину D можно определить экспериментально. Для этого
растворитель наслаивают на концентрированный раствор макромолекул и
измеряют размывание границы между растворителем и раствором. Седиментация макромолекул. Ультрацентрифугирование.
Размывание границы можно регистрировать оптическими методами: по
измерению оптической плотности в УФ- области; по измерению Одним из наиболее точных и широко используемых методов для
показателя преломления растворов. определения параметров макромолекул является метод седиментации
(центрифугирования). Седиментация – это осаждение частиц в жидкости
под действием силы тяжести.
Седиментация макромолекул в обычных условиях невозможна, т.к.
Таблица 1 тепловая энергия молекул значительно выше энергии гравитации. Энергия
Зависимость физических параметров от молекулярной массы белков
гравитации макромолекулы с м.м. 105 составляет Егр = mgh = 1,6 • 10-23 Дж.
Величина ЕQ тепловой энергии составит
ЕQ = K0T = 1,38 • 10-23• 293 K = 4 • 10-21 Дж.
Как видно, тепловая энергия таких молекул почти в 200 раз больше
гравитационной энергии. Таким образом, для макромолекул сила
гравитации настолько мала, что действие случайных соударений с
молекулами растворителя значительно превышает седиментацию
макромолекул.
Осадить макромолекулу молекулы можно, увеличив потенциальную
энергию до величин, превышающих K0T. Это можно сделать в
специальных приборах - ультрацентрифугах. В них, за счет больших
центробежных ускорений, превышающих g в 104–105 раз, создаются
центробежные силы, в результате которых происходит седиментация
макромолекул. При ультрацентрифугировании частицы движутся под
действием центробежной силы и через определенный промежуток времени
распределяются по длине центрифужной пробирки. Измерение движения
молекул вдоль направления действия центробежной силы называется
определением скорости седиментации. Определяемым параметром в этом Рис.9. Устройство препаративной ультрацентрифуги
случае является коэффициент седиментации, который дает информацию о (Фрайфельдер,281 с).
массе и форме макромолекулы. Современные ультрацентрифуги работают 1- ротор; 2 – охлаждающая камера; 3- двигатель; 4 – компрессор; 5 –
при больших ускорениях (до 450000g) с контролем температуры в пределах вакуумный насос; 6 – панель управления.
0,1 С. Для создания таких больших ускорений, необходимы
ультрацентрифуги, со скоростью вращения ротора до 80000 оборотов в
минуту. Число g при центрифугировании указывает, во сколько раз Центрифуги используется преимущественно для фракционирования и
угловое ускорение вращающегося ротора, превышает ускорение земного очистки макромолекул, компонентов клетки (препаративное
притяжения. Значение g зависит от скорости вращения и радиуса ротора. центрифугирование) и для определения массы макромолекул и
Основными частями ультрацентрифуги являются электрический макромолекулярных комплексов (аналитическое центрифугирование).
двигатель, ротор помещенный в защитную камеру, охлаждающее Рассмотрим метод определения массы макромолекулы путем измерения
устройство, вакуумный насос (Рис. 9). Центрифужные роторы бывают скорости седиментации.
двух типов: угловые и подвесными стаканами. Если частица раствора находится в поле центробежной силы,
образующейся при вращении ротора с угловой скоростью w, на нее
действует центробежная сила Fц:
Fц = m w2r,
где m - масса частицы, r - расстояние до центра вращения.
Молекулы растворителя будут вытесняться при движении частицы, и
их сопротивление вызывает выталкивающую силу Fв = m0w2r,
направленную против центробежной силы (m0 = масса вытолкнутой
жидкости). Осаждению частицы будет препятствовать и сила трения
частицы о молекулы растворителя Fс = fv, где f – коэффициент трения; v =
скорость осаждения частицы относительно стенок центрифужного стакана.
Через определенное время после начала вращения ротора силы,
действующие на осаждающуюся частицу, уравновешиваются, и она
двигается с постоянной скоростью v.
Fц = Fв + Fс
Скорость осаждения частицы можно рассчитать по формуле:
v = m w2r (1 – Vρ)/ f,
где V – парциальный объем частицы, V = 1/ρ (л/кг). Эта величина
определяется как возрастание объема растворителя при растворении 1 кг
сухого вещества в фиксированном объеме растворителя; ρ – плотность
растворителя.
Из этой формулы следует что, при центрифугировании соблюдаются
следующие закономерности:
1. Тяжелая частица осаждается быстрее, чем менее тяжелая
2. Более плотная частица также осаждается быстрее, чем
менее плотная
3. Чем больше плотность растворителя, тем медленней будет
скорость осаждения.
4. Чем больше коэффициент трения тем медленнее движется
частица .
Эти четыре положения универсальны и выполняются при осаждении
любых частиц, в т.ч. макромолекул. Поскольку скорость осаждения
молекул пропорциональна величине центробежной силы m w2r, то
седиментационные свойства частицы зависят от скорости
осаждения и выражаются через коэффициент седиментации
S:
S = v/ w2r
Коэффициента седиментации измеряется в секундах – [с]. За единицу
коэффициента седиментации принят 1 сведберг (С) –10-13 с..
Для определения массы частиц, в т. ч. и молекулярной массы
используют следующее соотношение (формула Сведберга):
М = RTS/ D(1 – Vρ),
где V – парциальный объем ( увеличение объема при прибавлении к
раствору определенного количества вещества) ; ρ – плотность
растворителя; D – коэффициент диффузии.
Для определения молекулярной массы необходимо измерить на
центрифуге величину S, определить значение D и знать V. Требуется
высокая точность измерения V, так как для биологических макромолекул
он изменяется в небольших пределах (от 0,6 до 0,75). Ошибка при его
измерении в 1 % дает ошибку в определении молекулярной массы до 3 %.
Для определения молекулярной массы по формуле Сведберга,
необходимо измерить S и D в одинаковых растворителях, при
одинаковых температурах, экстраполируя полученные значения к
бесконечному разбавлению, , S0 .
В таблице 6 приведены значения , S0 s для некоторых молекул
белков и полученные по ним молекулярные массы. Иногда массу
субмолекулярных частиц и макромолекул выражают в единицах Сведберга,
например, 16S –РНК, 80S-рибосома.
Электрофорез макромолекул. Электрофоретические методы.
Движение частиц в жидкой фазе под действием электрического поля
называется, электрофорезом. Скорость движения макромолекул в
электрическом поле можно использовать для определения молекулярной
массы белков, для идентификации макромолекул по заряду, по форме, для
определения изменений в первичной структуре, а также для
количественного разделения различных видов макромолекул.
Рассмотрим коротко теоретические основы электрофореза. На
макромолекулы с суммарным зарядом q в электрическом поле с
напряженностью Е действует электрическая сила
Fэ = qE
Под действием этой силы происходит ускоренное движение
макромолекул. В результате такого движения возникает сопротивление
вязкой среды с силой трения Fc = fv, где v – скорость движения
макромолекул. Через определенное время, когда силы уравновешиваются
(Fэ = Fc), наступает стационарное состояние, и макромолекулы движутся с
постоянной скоростью v . Тогда
qE = fv
Отношение скорости v к напряженности электрического поля Е
называется электрофоретической подвижностью u. Из (3.45)
u =v/E = q/f
Электрофоретическая подвижность измеряется в м2•В-1•с-1. Для
сферических макромолекул f = 6πηr, тогда
u = q/6πηr
где η – вязкость среды; г–радиус макромолекулы.
Как видно, коэффициент электрофоретической подвижности, дает
информацию о радиусе макромолекулы, соответственно, и о ее размерах.
Однако среда, в которой происходит движение заряженных частиц,
является не изолятором, а электролитом, состоящим из различных ионов.
Это обстоятельство вносит большие затруднения для теоретического
описания движения заряженной частицы в электрическом поле.
Макромолекула в растворе электролита окружена ионной оболочкой,
экранирующей ее от приложенного электрического поля. Ионная оболочка
частично нарушается как действием электрического поля, так и при
движении частицы. Существующая теория электрофореза пока не в
состоянии точно описать эти ( ряд других) процессов, и поэтому данные
электрофореза не могут трактоваться с точки зрения информации о
макромолекулярной структуре. Но, тем не менее, различные варианты
электрофореза широко применяются для аналитических и препаративных
целей. Препаративные методики разработаны для получения относительно
больших количеств чистого (гомогенного) материала. Аналитический
электрофорез используется для контроля чистоты препаратов, определения
количества компонентов в смеси, оценки их соотношения и т. д. На
практике оптимальные условия для электрофореза тех или иных
препаратов подбираются в большинстве случаев эмпирическим путем.
Для разделения макромолекул электрофорезом используют
специальные приборы. Существуют три основных типа электрофореза: с
подвижной границей, зональный и непрерывный.
При электрофорезе с подвижной границей макромолекулы
присутствуют во всем обьеме раствора и положение молекул с течением
времени можно определять оптическими методами.
В зональном электрофорезе раствор препарата наносят в виде пятна
или полосы, и частицы мигрируют через растворитель. Растворитель
обычно содержится в гомогенной инертной среде ( бумага, гель).
В непрерывном электрофорезе образец также наносят в виде зоны, но
раствор наносится не однократно, а прибавляется постоянно по мере
проведения электрофореза.
Наибольшее применение на практике нашли различные модификации
зонального электрофореза с различными носителями: на бумаге, на ацетате
целлюлозы, на геле. Два остальных типа электрофореза используются
сравнительно редко. Рассмотрим более подробно один из методов
зонального электрофореза – гель-электрофорез, нашедший наиболее
широкое применение в исследовании макромолекул.
Гель-электрофорез
Лучшие результаты при электрофоретическом разделении белков и
нуклеиновых кислот достигаются при использовании в качестве носителя
гелей из крахмала, полиакриламида, агарозы и комбинированных гелей из
этих веществ. Качественное разделение макромолекул при использовании
этих носителей достигается тем, что эффект электрофоретического
разделения дополняется разделяющим действием гель-проникающей
хромотаграфии (эффект «молекулярного сита»). Первоначально для гель-
электрофореза применяли крахмальный гель, однако, в настоящее время
его заменили полиакриламидные и агарозные гели. Полиакриламид
оказался наиболее эффективным носителем для электрофореза белков и
небольших молекул РНК, например т-РНК. Это связано с тем, что в
полиакриламидном геле можно контролировать эффект молекулярного
сита ( размер пор в геле ) с помощью изменения концентрации геля. Для
нуклеиновых кислот, размер молекул которых больше размеров пор
полиакриламида, используются агарозные или агарозно-полиакриламидные
гели. Полиакриламидный гель получается при сшивании акриламида с
метилен-бис-акриламидом. Такой гель готовят непосредственно перед
экспериментом в контейнере ( стеклянная трубка, пластина) для
проведения электрофореза (Рис. 9). После окончания
электрофоретического разделения, зоны распределения макромолекул в
геле обнаруживают путем окрашивания специфическими красителями и
или другими способами. Например, для обнаружения белков используются
красители амид черный, бромфеноловый синий, Кумасси бриллиантовый
голубой. Если разделяются биологически активные молекулы, положение
молекулы можно идентифицировать по измерению активности, например,
по измерению ферментативной активности. Локализацию нуклеиновых
кислот в гелях определяют после обработки флоуресцентными
красителями (например, бромид этидия) или по радиоактивности
разделенных фрагментов.
Рис.9. Устройство для электрофореза на горизонтальных пластинах
геля ( Фрайфельдер, с.229)
1. Пластина геля; 2. охлаждающая подложка; 3. отсек для буферного
раствора; 4. бумажный электрод между гелем и буфером; 5.
циркуляционный термостат с охлаждающей жидкостью; 6. электроды; 7.
источник электрического тока
Электрофорез в полиакриламидном геле проводят или в колонках
(трубках) с гелем или на пластинах с гелем. Рассмотрим один из
вариантов этого метода, наиболее широко используемых для разделения
белков .
ДСН-гель-электрофорез. Для определения молекулярной массы белков
используют электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия в
полиакриламидном геле. Этот метод предложили в 1969 году Клаус Вебер
и Мери Осборн.
До проведения электрофореза белок обрабатывают 1 % раствором
додецилсульфата натрия (ДСН) с 0,1 М β-меркаптоэтанолом при
нейтральном рН. В таком растворе большинство многоцепочечных белков
связываются с ДСН и диссоциируют, дисульфидные связи разрываются,
вторичная структура белка исчезает.
Рис. 10 Типичная полулогарифмическая зависимость М от
электрофоретической подвижности u при определении
молекулярной массы ДСН-электрофорезом в ПАА-геле.
а – комплекс полипептидной цепи (1) с
молекулами ДСН (2); б– полулогарифмическая
зависимость молекулярной массы М от относительной
электрофоретической подвижности u. Маркерные белки: 1–
фосфолипаза А, 2 – трансферин, 3 – каталаэа, 4 –
овальбумин, 5 – пепсин, 6 – химотрипсиноген
Додецилсульфат натрия совершенно одинаково связывается с
молекулами различных белков: 1,4 кг ДСН связывается с 1 кг белка.
Каждая молекула ДСН несет один отрицательный заряд и, таким образом,
общая плотность заряда примерно одинаковая для разных белков. Таким
образом, поверхностная шуба из молекул ДСН устраняет зарядовые
различия, существующие в нативных белках. После обработки ДСН,
полипептидная цепь представляет вытянутый цилиндр с диаметром 1,8 нм.
Длина таких стержней коррелирует с молекулярной массой белков: чем
длиннее цилиндр, тем больше молекулярная масса (рис. 1, а).
Обработанные таким образом белки имеют одну и ту же форму и
одинаковое отношение заряд/масса. Электрофоретическая подвижность
таких молекул будет зависеть только от молекулярной массы вследствие
движения в молекулярном сите.
В качестве носителя при электрофорезе используют
полиакриламидный гель в концентрации от 5 до 15 %. Экспериментально
установлена линейная связь между электрофоретической подвижностью и
логарифмом молекулярной массы:
u = b–a/lgM
где а и b – постоянные величины, зависящие от свойств
полиакриламидного геля.
Определение молекулярной массы исследуемого белка проводят по
калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой в
идентичных условиях проводится электрофорез маркерных белков с
известной молекулярной массой и строится зависимость u = f (lgM) (рис.
1, б). По значению электрофоретической подвижности на калибровочной
кривой с высокой точностью (до 5 %) находят молекулярную массу
исследуемого белка.
Кроме измерения молекулярной массы, ДСН-гель- электрофорез
позволяет определить и идентифицировать субъединичное строение
сложных белков, имеющих четвертичную структуру.
Изоэлектрическое фокусирование белков.
Белковые молекулы являются амфолитами, т.е. содержат
положительно и отрицательно заряженные группировки. Для таких
молекул характерна зависимость их заряда от рН . При низких значениях
рН отрицательные заряженные группировки молекулы нейтрализуются
ионами Н+ и в целом она имеет положительный заряд. При высоких
значениях рН такие молекулы заряжены отрицательно, т.к. положительно
заряженные группировки молекулы нейтрализуются ионами гидроксила.
Для каждого амфолита существует такое значение рН, при котором заряд
молекулы равен нулю. Это значение рН называется изоэлектрической
точкой рI молекулы. При электрофорезе в градиенте рН молекулы
белков будут двигаться до тех пор, пока не достигнут точки, где рН геля
будет равен значению рI молекулы. В этой точке молекула становится
незаряженным и перестает двигаться. В случае разгонки смеси белков,
каждый белок остановится в той области градиента рН, которая
соответствует его собственной изоэлектрической точке (Рис 11). Такой
метод разделения белков в градиенте рН, основанный на различиях
значений изоэлектрических точек, называется изоэлектрическим
фокусированием. Для создания стабильного градиента рН в состав геля
добавляют синтетические низкомолекулярные полиамфолиты
(многозарядные молекулы с м.м. 300-600). Полиамфолиты представляют
собой смесь полимеров алифатических амино- и карбоновых кислот,
например, амфолины фирмы LKB. Меняя соотношение различных
амфолитов, можно приготовить гель с соответствующим, для
определенных белковых молекул, интервалом градиента рН. При
приложении на гель электрического поля начинается движение
полиамфолитов и через определенное время устанавливается градиент
рН
Изоэлектрическое фокусирование по сравнению с электрофорезом
характеризуется более высокой разрешающей способностью разделения
и возможностью концентрации разделяемых фракций. В последние годы
появились методы, комбинирующие оба способа разделения белковых
молекул. На гелевых пластинах в одном направлении проводят
разделение электрофорезом, в другом, перпендикулярном направлении –
изоэлектрическим фокусированием. За счет такого двумерного
разделения, разрешающая способность метода резко возрастает, что
делает возможным разделение компонентов, которое нельзя осуществить
другими методами.

Рис.11. Разделение заряженных молекул изоэлектрическим

фокусированием в градиенте рН.(Фрайфельдер,240с)

1. – положительно заряженные молекулы с