Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Николаевич
нач. отдела экспериментальных исследований,
экологической безопасности земель и качества
продукции Днепропетровского проектно-
технологического центра
Афлатоксин G1
Mолекулярная масса – 328
Афлатоксин G2: положения 9 и 10
гидрированы
Mолекулярная масса – 330
Следует обратить особое внимание на то, что афлатоксины практически не
разрушаются в процессе обычной кулинарной и технологической обработки
загрязненных пищевых продуктов.
Факторы, влияющие на токсинообразование. Продуценты афлатоксинов -
микроскопические грибы рода Aspergillus могут достаточно хорошо
развиваться и образовывать токсины на различных естественных субстратах
(продовольственное сырье, пищевые продукты, корма), причем не только в
странах с тропическим и субтропическим климатом, как полагали ранее, но
практически повсеместно, за исключением, быть может, наиболее холодных
рай онов Северной Европы и Канады.
Оптимальной температурой для образования токсинов является
температура 27-30°С, хотя синтез афлатоксинов возможен и при более низкой
(12-13°С) или при более высокой (40-42°С) температуре. Например, в условиях
производственного хранения зерна максимальное образование афлатоксинов
происходит при температуре 35-45°С, что значительно превышает
температурный оптимум, установленный в лабораторных условиях. Другим
критическим фактором, определяющим рост микроскопических грибов и
синтез афлатоксинов, является влажность субстрата и атмосферного воздуха.
Максимальный синтез токсинов наблюдается обычно при влажности выше
18% для субстратов, богатых крахмалом (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис,
кукуруза, сорго), и выше 9-10% - для субстратов с высоким содержанием
липидов (арахис, подсолнечник, семена хлопчатника, различные виды орехов).
При относительной влажности атмосферного воздуха ниже 85% синтез
афлатоксинов прекращается.
Механизм действия афлатоксинов.
Афлатоксины или их активные метаболиты дей ствуют практически на все
компоненты клетки. Афлатоксины нарушают проницаемость плазматических
мембран. В ядрах они связываются с ДНК, ингибируют репликацию ДНК,
ингибируют активность ДНК-зависимой -РНК-полимеразы - фермента,
осуществляющего синтез матричной РНК, и тем самым подавляют процесс
транскрипции. В митохондриях афлатоксины вызывают повышение
проницаемости мембран, блокируют синтез митохондриальных ДНК и белка,
нарушают функционирование системы транспорта электронов, вызывая тем
самым энергетический голод клетки. В эндоплазматическом ретикулуме под
воздей ствием афлатоксинов наблюдаются патологические изменения:
ингибируется белковый синтез, нарушается регуляция синтеза триглициридов,
фосфолипидов и холестерина. Афлатоксины оказывают прямое дей ствие на
лизосомы, что приводит к повреждению их мембран и высвобождению
активных гидролитических ферментов, которые, в свою очередь, расщепляют
клеточные компоненты. Все вышеперечисленные нарушения приводят к так
называемому метаболитическому хаосу и гибели клетки.
Одним из важных доказательств реальной опасности афлатоксинов для
здоровья человека явилось установление корреляции между частотой и
уровнем загрязнения пищевых продуктов афлатоксинами и частотой
первичного рака печени среди населения.
В природных условиях чаще и в наибольших количествах афлатоксины
обнаруживаются в арахисе, кукурузе, семенах хлопчатника. Кроме того, в
значительных количествах они могут накапливаться в различных орехах,
семенах масличных культур, пшенице, ячмене, зернах какао и кофе.
В кормах, предназначенных для сельскохозяй ственных животных,
афлатоксины также обнаруживаются достаточно часто и в значительных
количествах. Во многих странах с этим связано и обнаружение афлатоксинов в
продуктах животного происхождения. Например, в молоке и тканях
сельскохозяй ственных животных, получавших корма, загрязненные
микотоксинами, обнаружен афлатоксин М1 . Причем афлатоксин М1 обнаружен
как в цельном, так и в сухом молоке, и даже в молочных продуктах,
подвергшихся технологической обработке (пастеризация, стерилизация,
приготовление творога, й огурта, сыров и т. п.).
Согласно данным ВОЗ, человек при благоприятной гигиенической ситуации
потребляет с суточным рационом до 0,19 мкг афлатоксинов. У нас приняты
следующие санитарно-гигиенические нормативы по афлатоксинам: ПДК
афлатоксина В1 для всех пищевых продуктов, кроме молока, составляет -
5 мкг/кг, для молока и молочных продуктов - 1 мкг/кг (для афлатоксина М 1 - 0,5
мкг/кг). Допустимая суточная доза (ДСД) - 0,005-0,01 мкг/кг массы тела.
Охратоксины.
Охратоксины - соединения высокой токсичности, с ярко выраженным
тератогенным эффектом. В эту группу входят охратоксины А, В , С и
представляют собой группу близких по структуре соединений , являющихся
изокумаринами, связанными с L-фенилаланином пептидной связью.
* - Растворитель
Охратоксин В
метанол. 369 221 218,318 голубой
В ультрафиолетовом свете обладает зеленой флуоресценцией . Охратоксин В
- кристаллическое вещество, аналог охратоксина А, не содержащий атом хлора.
Он примерно в 50 раз менее токсичен, чем охратоксин А. В ультрафиолетом
свете обладает голубой флуоресценцией . Охратоксин С - аморфное вещество,
этиловый эфир охратоксина А, близок к нему по токсичности, но в качестве
природного загрязнителя пищевых продуктов и кормов не обнаружен. В
ультрафиолетовом свете обладает бледно-зеленой флуоресценцией .
Биологическое действие.
Охратоксины входят в группу микотоксинов, преимущественно
поражающих почки. При остром токсикозе, вызванном охратоксинами,
патологические изменения выявляются и в печени, и в лимфоидной ткани, и в
желудочно-кишечном тракте. В настоящее время уже доказано, что охратоксин
А обладает сильным тератогенным дей ствием. Вопрос о канцерогенности
охратоксинов для человека остается нерешенным.
Биохимические, молекулярные, клеточные механизмы дей ствия
охратоксинов изучены недостаточно. В исследованиях in vitro показано, что они
активно связываются с различными белками: альбуминами сыворотки крови,
тромбином, альдолазой , каталазой , аргиназой , карбоксипептидазой А.
Некоторые моменты подтверждены и в исследованиях in vivo. Результаты
изучения влияния охратоксинов на синтез макромолекул свидетельствуют о
том, что охратоксин А ингибирует синтез белка и матричной РНК (токсин
дей ствует как конкурентный ингибитор), но не дей ствует на синтез ДНК.
Основными растительными субстратами, в которых обнаруживаются
охратоксины, являются зерновые культуры и среди них, в первую очередь,
кукуруза, пшеница, ячмень. С сожалением приходится констатировать тот факт,
что уровень загрязнения кормового зерна и комбикормов выше среднего во
многих странах (Канада, Польша, Югославия, Австрия), в связи с чем охратоксин
А был обнаружен в животноводческой продукции (ветчина, бекон, колбасы). С
практической точки зрения весьма важно, что охратоксины являются
стабильными соединениями. Так, например, при длительном прогревании
пшеницы, загрязненной охратоксином А, его содержание снижалось лишь на
32% (при температуре 250-300°С).
Трихотеценовые микотоксины.
В настоящее время известно более 40 трихотеценовых микотоксинов
(ТТМТ). По своей структуре ТТМТ относятся к сесквитерпенам. Они содержат
основное ядро из трех колец, названное трихотеканом. В зависимости от
структуры трихотеценового ядра эти микотоксины подразделяются на 4
группы: А, В, С, Д. Структура различных типов трихотеценовых
микотоксинонов очень сложна и имеет свои характерные особенности.
Продуцируются грибами Fusarium sporotrichiella, Fusarium solani, Fusarium
graminearum и др. ЛД50 для этих микотоксинов (мыши, перорально) варьирует
от 6,7 мг/кг (токсин Т-2) до 46 мг/кг (дезоксиниваленол).
Токсин T-2: R1=OH, R2=R3=OAc, R4=H,
R5=OCOCH2CH(CH3)2
Mолекулярная масса – 424
Токсин HT-2: R1=R2=OH, R3=OAc, R4=H,
R5=OCOCH2CH(CH3)2
Mолекулярная масса – 466
Диацетоксискирпенол (ДАЗ): R1=OH, R2=R3=OAc,
R4=H, R5=CH2
Mолекулярная масса – 366
Ниваленол: R1=R2=R3=R4=OH
Mолекулярная масса – 312
Дезоксиниваленол (ДОН): R1=R3=R4=OH, R2=Н
Mолекулярная масса – 296
3-ацетил-дезоксиниваленол: R1=OAc, R2=Н, R3=R4=OH
Mолекулярная масса – 338
15-ацетил-дезоксиниваленол: R1=R4=OH, R2=Н, R3=OAc
Mолекулярная масса – 338
Фузаренон: R1=R3=R4= OH, R2=OAc
Mолекулярная масса – 354
Мол. t пл., λ макс, Флуоресценция,
Микотоксин
масса °С нм * цвет, нм *
Группа VII
Зеараленон: X= CO
Mолекулярная масса – 318
Зеараленол: X= CHOH
Mолекулярная масса – 312
Биологическое действие
Зеараленон обладает выраженными гормоноподобными (эстрогенными)
свой ствами, что отличает его от других микотоксинов. Кроме этого, в опытах
на различных лабораторных животных было доказано тератогенное дей ствие
зеараленона, хотя он и не обладает острым (летальным) токсическим
эффектом даже при введении его животным в очень больших дозах. Сведения о
влиянии зеараленона на организм человека отсутствуют, но, учитывая его
высокую эстрогенную активность, нельзя полностью исключить негативное
воздей ствие зеараленона на организм человека.
Основным природным субстратом, в котором наиболее часто обнаруживается
зеараленон, является кукуруза. Поражение кукурузы микроскопическими
грибами рода Fusarium - продуцентами зеараленона - происходит как в поле, на
корню, так и при ее хранении. Высока частота обнаружения зеараленона в
комбикормах, а также в пшенице и ячмене, овсе.
Тепловая обработка в ней тральной или кислой среде не разрушает
зеараленон, но в щелочной среде при 100°С за 60 мин разрушается около 50%
токсина. К разрушению зеараленона приводит и обработка загрязненной
кукурузы 0,03% раствором персульфата аммония или 0,01% раствором
пероксида водорода.
С практической точки зрения интересными представляются данные по
влиянию переработки зерна кукурузы на степень загрязнения зеараленоном. В
крупке и муке грубого помола, без удаления отрубей , в муке, полученной при
сухом помоле кукурузы, содержание зеараленона составляло примерно 20% от
его количества в цельном зерне. При влажном помоле загрязненной кукурузы
токсин концентрировался во фракции клей ковины, где его концентрация была
выше, чем в отрубях и зародыше; во фракции крахмала токсин не выявлялся.
Патулин
Микотоксины, продуцируемые микроскопическими грибами рода Penicillium,
распространены повсеместно и представляют реальную опасность для здоровья
человека. Патулин особо опасный микотоксин, обладающий канцерогенными и
мутагенными свой ствами. Он впервые был выделен в 1943 году как антибиотик.
ЛД50 17-36 мг/кг (мыши, перорально). Обладает высокими мутагенными
свой ствами. Ингибирует синтез белка, ДНК, РНК, ферменты, содержащие в
активном центре группы SH. Основными продуцентами патулина являются
микроскопические грибы Penicillium patulum и Penicillium expansum. Но и другие
виды этого рода микроскопических грибов, а также Byssochlamys fulva и В. nivea
способны синтезировать патулин. Максимальное токсинообразование
отмечается при температуре 21-30°С.
По своей химической структуре патулин представляет 4-гидроксифуропиран. Он
имеет один максимум поглощения в ультрафиолетовой области при 276 нм.
Группа VI
Патулин
Mолекулярная масса – 153
Биологическое действие
Биологическое дей ствие патулина проявляется как в виде острых токсикозов,
так и в виде ярко выраженных канцерогенных и мутагенных эффектов.
Биохимические механизмы дей ствия патулина изучены недостаточно.
Предполагают, что патулин блокирует синтез ДНК, РНК и белков, причем
блокирование инициации транскрипции осуществляется за счет
ингибирования ДНК-зависимой -РНК-полимеразы. Кроме этого, микотоксин
активно взаимодей ствует с SH-группами белков и подавляет активность
тиоловых ферментов. Продуценты патулина поражают в основном фрукты и
некоторые овощи, вызывая их гниение. Патулин обнаружен в яблоках, грушах,
абрикосах, персиках, вишне, винограде, бананах, клубнике, голубике, бруснике,
облепихе, ай ве, томатах. Наиболее часто патулином поражаются яблоки, где
содержание токсина может доходить до 17,5 мг/кг. Интересно, что патулин
концентрируется в основном в подгнившей части яблока, в отличие от томатов,
где он распределяется равномерно по всей ткани.
Патулин в высоких концентрациях обнаруживается и в продуктах
переработки фруктов и овощей : соках, компотах, пюре и джемах. Особенно часто
его находят в яблочном соке (0,02-0,4 мг/л). Содержание патулина в других
видах соков: грушевом, ай вовом, виноградном, сливовом, манго - колеблется от
0,005 до 4,5 мг/л.
***
В нашей стране наиболее часто встречаются микотоксины: ДОН, или
вомитоксин, Т-2 токсин, зеараленон и афлатоксин. Нередки случаи
обнаружения охратоксина А. Ими чаще всего бывают контаминированы
зерновые, а также соевые и подсолнечниковые шроты и жмыхи, в том числе
при хранении и продолжительной транспортировке. Причины появления и
интенсивного роста грибов в период вегетации и созревания культур,
особенно за несколько недель до уборки, еще до конца не выяснены.
В последнее десятилетие получены данные о том, что некоторые
фунгициды, в частности тебуконазол и флуконазол, примененные в
недостаточной концентрации, не уменьшали, а наоборот, усиливали
контаминацию зерна вомитоксином (ДОН). А недавние исследования,
проведенные в Великобритании, показали, что фунгицид азоксистробин,
угнетая рост неопасной плесени, одновременно способствовал замещению ее
токсиногенными видами грибов рода Fusarium.
Методические направления идентификации
и количественного определения
микотоксинов
Проблема правильного определения количества микотоксинов
заключается в том, что микотоксины, как правило, крайне неравномерно
распределяются в массе зерна или комбикорма. В местах роста плесени
концентрация микотоксинов может быть очень высокой. Даже самый
лучший современный метод анализа не выявит токсичность, если не
будет соблюдена трудоемкая рутинная процедура отбора проб.
Показателен пример, продемонстрированный на Всемирном форуме
по микотоксинам в Нидерландах. Ниже представлены результаты
анализа 10 проб пищевого арахиса по 5 кг каждая, отобранных из одной
партии.
Содержание афлатоксина В1 в зазных пробах арахиса одной партии
1 0
2 3
3 13
4 0
5 19
6 41
7 43
8 0
9 0
То есть, если специалист будет считать, что образец в 5 кг, отобранный из
одного места, достаточно полно отражает качество партии продукта, анализ
микотоксинов окажется простой тратой денег и времени. Один из наиболее
совершенных и удачных методов отбора проб для анализа на содержание
афлатоксина В1 описан в Директиве ЕС.
АФЛАТОКСИН В1
Или :
Из подготовленной для испытания пробы зерна отбирают навеску массой 25 г и
помещают в колбу вместимостью 500 мл. В колбу вносят 150 мл ацетона и
встряхивают на шуттель-аппарате 1,5 ч (либо оставляют на 18—20 ч при
комнатной температуре). Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу,
а остаток еще раз заливают 100 мл ацетона, вновь встряхивают 30 мин и
фильтруют через тот же фильтр в соответствующую колбу. Фильтр промывают
10 мл ацетона, присоединяя фильтрат к общему ацетоновому экстракту,
который переносят в делительную воронку. К ацетоновому экстракту
добавляют 25 мл гексана, перемешивают и добавляют 50 мл воды. После
разделения слоев гексановую фракцию (верхний слой ) удаляют, а нижний слой
(водно-ацетоновая фракция) повторно экстрагируют 25 мл гексана при
перемешивании растворов. Выделивший ся после отстаивания смеси верхний
гексановый слой снова удаляют.
(Очистка) :
В делительную воронку на 250 мл помещают 70 мл фильтрата, добавляют
50 мл гексана, после встряхивания и разделения слоев верхний гексановый
слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой еще дважды встряхивают с
40 мл гексана, каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой . Если слои
плохо разделяются, добавляют сульфат аммония. К ацетонитрильному слою
добавляют 2 - 3 мл бензола и сульфат аммония на кончике шпателя,
встряхивают и отбрасывают нижний водный слой . Ацетонитрильный слой
помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха с добавлением
изопропанола до объема 1 мл.
Или :
Водно-ацетоновую фракцию экстрагируют 25 мл хлороформа. Содержимое
перемешивают 2 мин и оставляют для разделения слоев. После разделения слоев
хлороформную фракцию (нижний слой ) собирают в отдельную колбу, а затем
пропускают через подготовленную хроматографическую колонку. Очищенный на
колонке от примесей экстракт собирают в колбу для отгона или выпарительную
чашку. Экстракцию водно-ацетоновой фракции хлороформом проводят еще два
раза, экстрагируя каждый раз 20 мл хлороформа и пропуская каждую порцию
экстракта через хроматографическую колонку. Экстракты, очищенные на
колонке, собирают вместе в колбе для отгона или выпарительной чашке. Затем
колонку три раза промывают хлороформом по 30 мл с последующим
присоединением промывных порций к основному экстракту, находящемуся в
колбе для отгона.
Хроматографическую колонку заполняют в следующей последовательности:
вначале помешают тампон гигроскопической ваты, затем 1 г силикагеля, 2 г окиси
алюминия и 2 г окиси кальция. Силикагель и окись алюминия вносят небольшими
порциями, слегка постукивая по колонке. Для удаления пузырьков воздуха
промывают колонку небольшим количеством хлороформа (15—20 мл) при
отсасывании водоструй ным насосом. Окись кальция вносят в колонку в виде
хлороформной суспензии при отсасывании водоструй ным насосом.
ОХРАТОКСИН А
Или :
Экстракция
Подготовка проб для определения афлатоксина В1, зеараленона, дезоксиниваленола и Т-2 токсина
включает единую жидкостную экстракцию указанных соединений водным ацетонитрилом (16:84). Для
повышения эффективности ТФЭ водно-ацетонитрильный экстракт орехов и семян масличных культур, а
также растительного масла необходимо обезжиривать.
25 мл 20 мл
Экстракта Экстракта
Афлатоксин В1 + ДОН + Т-2
зеараленон
Афлатоксин В1 и зеараленон
1. 25 мл экстракта – ПРОПУСТИТЬ
1
Диапак А-3
2. СОБРАТЬ 20 мл элюата
Диапак
+ 20 мл воды,
перемешать
1. Кондиционируют пропусканием
5 мл ацетонитрила и 5 мл воды.
П-
Диапак П-
2. 40 мл экстракта – ПРОПУСТИТЬ
Диапак
4. Элюировать афлатоксин и
зеараленон последовательно
7 мл ацетонитрила + 7 мл
бензол: ацетонтрил (1:2) + 7 мл
бензол: ацетонтрил (1:1).
Элюаты СОБРАТЬ !!!
5. Осушить элюаты 10 г безводного
сульфата натрия.
6. Упарить.
Афлатоксин В1 и зеараленон
В зависимости от типа проб можно
избрать один из результирующих этапов
1. Кондиционировать 5 мл 1. Кондиционировать 5 мл
бензола бензола
3
Диапак Н
2. Сухой остаток растворить в
Диапак С
2. Сухой остаток растворить в
0,5 мл бензола – НАНЕСТИ
Диапак
0,5 мл бензола – НАНЕСТИ
3. Отгонную колбу ополоснуть 3. Отгонную колбу ополоснуть
2х 0,5 мл бензола –НАНЕСТИ 2х 0,5 мл бензола –НАНЕСТИ
4. Элюаты ОТБРОСИТЬ ! 4. Элюаты ОТБРОСИТЬ !
5. Элюировать ЗЕАРАЛЕНОН 5. Элюировать ЗЕАРАЛЕНОН
9 мл бензол : этилацетат (9:1) 6 мл бензол :СН3СООН (49:1)
6. Промыть патрон 3 мл смеси 6. Элюировать Афлатоксин В1
бензол :СН3СООН (19:1)
5 мл бензол:ацетонитрил (8:2)
7. Промыть патрон 4 мл смеси
гексан :диэтиловый эфир (3:1)
8. Элюировать Афлатоксин В1
6мл дихлорметан:ацетон
(9:1)
Диапак АУ-
ацетонитрил:вода (84:16)
3. СОБРАТЬ ВСЕ ЭЛЮАТЫ !!!
Диапак
33
Упарить досуха при
Т= 60-70 °С, добавляя изо-
пропанол.
1. Кондиционировать 5 мл бензола
2. Сухой остаток растворить в 0,5 мл
Диапак Н
Диапак хлороформа – НАНЕСТИ
3. Элюат ОТБРОСИТЬ !
4. Отгонную колбу ополоснуть 2х 0,5
мл хлороформа –НАНЕСТИ
2
5. Элюаты СОБИРАТЬ !
6. Элюировать ТОКСИН Т-2 2 мл
хлороформа.
7. Элюировать ДОН 6 мл 20 %
Упарить при Т=40-45 °С ацетона в хлороформе.
ТСХ, ВЭЖХ,ГЖХ
ПАТУЛИН
1. Весь фильтрат – ПРОПУСТИТЬ
1. Соки просто фильтруют 20 мл. 2. Патрон промыть 10 мл воды –
1
Диапак П-3
2. Соки с мякотью 10 г смешивают с 6 ОТБРОСИТЬ.
мл р-ра Кареза I и р-ра КарезаII. 3. Элюировать 10 мл этилацетата в колбу
Доводят объем до 50 мл,
Диапак
с 5 мл 1,5 % карбоната натрия.
перемешивают и фильтруют. Перемешать, отделить этилацетат в
3. Патрон кондиционировать 5 мл колбу для упаривания. Водный раствор
ацетонитрила а затем 5 мл воды. экстрагировать еще 10 мл этилацетата.
Этилацетатные экстракты объединить,
сушить безводным сульфатом натрия.
Упарить до объема
0,5 мл при
Т= 40 °С, добавить
Диапак С
Диапак 2,5 мл бензола.
1. Кондиционировать 5 мл бензола
2
2. НАНЕСТИ предыдущий элюат. Смыть
колбу 0,5 – 1,0 мл 15% этилацетата в
бензоле и тоже нанести. Все смывы
отбросить.
3. Элюировать ПАТУЛИН 6 мл 30%
Упарить при Т=40 °С этилацетата в бензоле.
ТСХ, ВЭЖХ
Quick: экстракция 8 образцов за 30 минут.
Easy: нет необходимости применения дополнительных способов подготовки и
очистки, что уменьшает риск ошибки.
Cheap: коммерческая доступность и приемлемая цена расходных материалов,
снижение трудовых затрат.
Effective: высокая степень извлечения для широкого спектра пестицидов и
микотоксинов.
Rugged: простота метода обеспечивает высокую надежность и
воспроизводимость.
Safe: уменьшение количества применяемых органических растворителей .
Задействованное оборудование
o Афлатоксин В1
Самым приемлемым вариантом, улучшающим идентификацию микотоксинов
из группы афлатоксинов является метод ТСХ, реализованый в методике,
разработанной CAMAG под шифром А-12.4Е «Determination of aflatoxins B1, B2,
G1, and G2 in foodstuffs». Предел определения афлатоксина В 1 в орехах по
данной технологии составляет 1 ppb (1 мкг/кг), что в принципе, достаточно для
гарантированной идентификации и оценки количества микотоксина, даже если
коэффициент рикавери составляет менее 60 % (хотя и метод декларирует от 70
до 100%).
«Изюминками» этой методологии являются применение ВЭТСХ пластин,
предхроматография в диэтиловом эфире, позволяющая отделить вещества
матрикса и удалить их, а также применение доступных стабилизаторов-
усилителей флуоресценции. При этом достигается высокая чувствительность
определения и практически полное отсутствие мешающих веществ. Применение
предхроматографирования позволяет избавиться от матричных
коэкстрактивных компонентов практически на самой пластинке, что очень
удобно. Фактически колоночную доочистку образцов можно не проводить.
Стандартный раствор афлатоксина В1, согласно метода, содержит 2 нг/мкл
токсина и применяются ВЭТСХ пластинки фирмы Merck 60F254.
Вещества
матрикса
St U U U St U U U St
90 мм St U U U St U U U St
1 Диэтиловый 3
2 эфир
St U U U St U U U St
50 мм
Отрезать
St U U U St U U U St 15 мм ТЭМ или
Хлороформ:
ацетон: вода
(140:20:0,3)
5 6
4
St U U U St U U U St St U U U St U U U St
Выбросить
* St – раствор стандартного образца по 5 мкл U - раствор образца по 100 мкл
Как вариант подтверждения наличия афлатоксина В1 и для увеличения
чувствительности предлагается проведение предхроматографической
дериватизации безводной ТФУ (трифторуксусной кислотой ) непосредственно
на пластинке в точке нанесения образцов капельным методом. Для этого в
точки с нанесенными испытуемыми образцами и стандартными растворами
после предхроматографирования в диэтиловом эфире наносят по 5 мкл ТФУ,
выдерживают 5 минут при комнатной температуре, а затем пластинку
подогревают до 35-40 °С в течение 2 минут. Далее хроматографируют как
обычно
Все, кто так или иначе выполнял анализы по определению ДОНа или Т-2
методом ТСХ, сталкивался с проблемой матричного фона, покрывающего зоны
расположения пятен этих двух токсинов. Проявление ДОНа 20% спиртовым
раствором хлорида алюминия приводит к возникновению голубой
флуоресценции практически всего хроматографического трека, всех
коэкстрактивных веществ, флавоноидов , что чрезвычай но ухудшает
детектируемость токсинов. Аналогичная ситуация возникает и с проявлением
зон локализации токсина Т-2.
В качестве альтернативы предлагается использование более гибкой системы
проявления - анисовый альдегид/серная кислота .
Приготовление раствора для опрыскивания :
0,5 мл анисового альдегида смешать с 8 мл концентрированной кислоты,
охладить и добавить смесь из 85 мл метанола и 10 мл ледяной уксусной
кислоты.
Приготовление раствора для смачивания :
1 мл анисового альдегида и 2 мл концентрированной серной кислоты
растворить в 100 мл ледяной уксусной кислоты.
После обработки этим реактивом и нагревания пластинки при 90-125 °С 1-15
минут пятна ДОН и Т-2 окрашиваются в коричневый цвет. При чем при
просмотре пластинки в УФ-365 нм, наблюдается интенсивная флуоресценция
без матричного эффекта.
Физико-химические свойства некоторых трихотеценовых микотоксинов, относящихся к А и В типам
Цвет после
Эмпирическая Молекулярная Точка плавления, Цвет после обработки
Микотоксины обработки Н2SО4
формула масса °С p-анисовым
альдегидом
Т-2 токсин С24Н34О9 466 150-151 Серое* Пурпурное*
НТ-2 токсин С22Н32О8 424 То же То же
Неосоланиол С19Н26О8 382 150-151 То же То же
Т-2 тетраол С15Н22О6 298 То же То же
Зеараленон в комбикормах
Рецепт приготовления проявителя описан в Россий ском ГОСТ Р 51425-99
«Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Метод определения массовой доли
зеараленона», который в свою очередь является переводом международного
стандарта ISO 6870-85.
o Афлатоксин В1 ОФ - ВЭЖХ
При определении афлатоксинов методом ВЭЖХ традиционно применяется
флуоресцентное детектирование, поскольку практически все афлатоксины
хорошо флуоресциируют при облучении раствора УФ светом с длиной волны
возбуждения 365 нм. Для повышения чувствительности детектирования в
некоторых методиках применяют дериватизацию афлатоксина В 1 чтобы
повысить квантовый выход флуоресценции, а соответственно понизить предел
обнаружения. Связано это бывает часто с применением ТФЭ (твердофазной
экстракции), которая позволяет извлекать лишь определенную часть
микотоксина, например, эквивалентную 10 г образца корма или продукта
вместо 25 или 50 грамм. Это позволяет не перегружать картридж для ТФЭ
коэкстрактивными веществами, но количество извлеченного микотоксина
часто находится на пределе детектирования. Добиться стабильного и надежного
детектирования можно либо увеличив количество наносимого экстракта на
картридж ТФЭ (что за собой влечет увеличение расхода реактивов и
применение картриджей большей емкости) , либо повысив квантовый выход
флуоресценции анализируемых веществ. Одним из решений является прием,
который применяют иногда в ТСХ. Это превращение афлатоксина В1 в
афлатоксин В2а, предколоночной обработкой безводной трифторуксусной
кислотой . Процесс дериватизации чрезвычай но прост. К высушенному образцу
подготовленному к ВЭЖХ анализу в остродонной колбе или виале добавляют
100 мкл безводной ТФУ, закрывают пробкой и подогревают в темноте при
40-45 °С 15 минут, затем высушивают продувкой азотом до удаления ТФУ. Далее
пробу растворяют в необходимом объеме подвижной фазы. Этот принцип
дериватизации положен в основу метода ВЭЖХ, разработанного фирмой Люмэкс
(МВИ М 04-32-2004) . Благодаря дериватизации чувствительность метода
составляет 0,07 мкг/кг.
Из-за заметного гашения флуоресценции в протонных растворителях
чувствительность прямого флуориметрического определения афлатоксинов В 1 и
G1 (в отличие от G2 и B2) оказывается неудовлетворительной (почему более
предпочтительной хроматографией является нормально-фазовая или
адсорбционная) . Для удовлетворительного определения афлатоксинов B 1 и G1 в
методике, разработанной компанией ЗАО«Аквилон», предложено использовать
предколоночную дериватизацию раствором й ода. Время, необходимое для
прохождения реакции дериватизации афлатоксинов B1 и G1, составляет 20 мин.
Для проведения анализа предварительно готовят рабочие растворы из СОП
афлатоксинов в ацетонитриле или из СОП афлатоксинов в бензоле (путем
перерастворения в ацетонитриле), далее готовят градуировочные растворы
путем подкисления рабочих растворов смесью дистиллированная вода – уксусная
кислота (1:1) и дериватизации раствором й ода (рабочий раствор – «кислая вода»
– 0,1 % раствор й ода (1:8:1, по объему)). Чувствительность -2,5 мкг/кг.
Компоненты:
1. Афлатокcин G2
2. Афлатокcин G1 (после дериватизации й одом J2)
3. Афлатокcин B2
4. Афлатокcин B1 (после дериватизации й одом J2)
Подготовка пробы
Подготовка пробы
НО !!!
Метод ГЖХ достаточно трудоемок и приведенные корректировки этого метода
стоит использовать в тех лабораториях, в которых используется данный
стандартный метод определения токсина Т-2.
Имеющиеся свободные гидроксилы у трихотеценовых микотоксинов обеих
групп А и Б могут быть модифицированы гораздо более эффективно и менее
трудоемко путем получения силильных производных. Например издательство
«ELSEVIER» в микрохимическом журнале опубликовало статью о методе
силирования трихотеценовых микотоксинов N,N-диметил-триметилсилил
карбаматом. Технология получения силильных производных достаточно легко
исполнима и не содержит сложностей .
Z.Eke, A.Kende, K.Torkos «Simultaneous detection of A and B trichothecenes by gas
chromatography with flame ionization or mass selective detection».
ЭКСТРАКЦИЯ
2,5 г
4 мл фильтрата
пробы 1. + 10 мл смеси ацетонитрил : вода
(84:16)
2. Встряхивать 30 минут
3. Фильтровать
СCLEAN-UP
вниз) сульфат аммония – целит (HM-N)-оксид
алюминия ней тральный – активированный уголь
(основный ) - С18 (ЕС)
Инжектор ______________________________________________________________
FID 250°С
1. Промыть 8 мл ацетонитрила, затем 8 мл смеси
1μL ацетонитрил : вода (84:16) – ОТБРОСИТЬ.
260°C 2. Нанести 4 мл фильтрата и дать впитаться.
3. Элюировать токсин Т-2 8 мл смеси
ацетонитрил:вода (84:16). – СОБРАТЬ !!!
НАСОС
Mycosep 225
0–10 min, MeOH–H2O
(60:40); 10–40 min, 1. Промыть 8 мл ацетонитрила, затем 8 мл смеси
линей но до MeOH– ацетонитрил : вода (80:20) – ОТБРОСИТЬ.
H2O (80:20); 40–50 2. Нанести фильтрат.
min, MeOH–H2O Инжектор 3. Собрать первые 8 мл элюата !!!
(60:40)-регенерация 25μL
Скорость: 0,2
мл/мин
FLD – ДЕТЕКТОР
виале. Сухой остаток растворить в 0,1 мл
λex = 292 nm and λem = 425 nm ацетонитрила.
S3ODS2 (250
(250 mm
диметиламинопиридина в ацетонитриле 10
мг/мл и 150 мкл раствора кумарин-3-
2.1 mm,
Подготовка пробы
Компоненты:
1. Охратоксин А
Удобной и воспроизводимой методикой является методика , разработанная в
России с применением имуноафинной очистки ( МУК 4.1.2204—07
«Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина А в
продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии»).
Метод включает следующие этапы:
• экстракция охратоксина А из пробы смесью ацетонитрил-вода (60 : 40 %
об.);
• очистка экстракта на иммуноаффинной колонке;
• определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим
детектированием при длине волны возбуждения (λех) 333 нм и длине волны
эмиссии (λem.) 466 нм.
Диапазон определяемых концентраций : 0,001—0,016 мг/кг. Предел
количественного определения: 0,0005 мг/кг.