магглютинации (РТГА); реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА);

реакцию торможения гемадсорбции (РТГАд); реакцию связывания

комплемента (РСК); реакцию диффузионной преципитации (РД.П);
реакцию иммунофлуоресценции (РИФ); реакцию иммуноферментного
анализа (ИФА). Они различаются между собой методом определения —
образовался комплекс антиген + + антитело или нет. В связи с этим и
техника постановки каждой их них разная.
Реакция нейтрализации (РН). Это универсальная реакция служит
эталоном при оценке других серологических реакций. Принцип ее состоит
в том, что при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными
антителами образуется комплекс антиген + антитело, в результате
нейтрализуется инфекционность вируса. Индикатором свободного (не
связавшегося с антителами) вируса является чувствительная к вирусу
живая система: животные, куриные эмбрионы или культура клеток.
При постановке реакции в пробирке смешивают равные объемы вируса
и сыворотки, смесь выдерживают при соответствующей температуре (4, 22
или 37 °C) в течение одного часа или 16—18 ч (зависит от вируса и
условий опыта). Затем этой смесью заражают чувствительную к вирусу
живую систему, наблюдают за состоянием живых объектов и через
соответствующий срок (в зависимости от вируса) учитывают результат
нейтрализации вируса по отсутствию:
1) гибели, развития клинической картины болезни и патологических
изменений в органах и тканях лабораторных животных;
2) гибели, патологических изменений в оболочках, тканях зародыша и
отсутствию гемагглютининов в жидкостях полостей куриных эмбрионах;
3) цитопатического действия (ЦПД) или бляшкообразования в
культуре клеток.
Сыворотки, используемые в РН, должны быть предварительно
освобождены от термолабильных неспецифических ингибиторов путем
прогревания. Как чувствительную систему, так и метод ее заражения
подбирают с учетом наилучшей возможности культивирования данного
вируса.
Так как для нейтрализации определенного количества вируса требуется
определенное количество антител, а один из этих компонентов все еще
неизвестен, то РН можно ставить в двух вариантах:
1) к разным дозам (разведениям) сыворотки (обычно в виде
последовательных 2-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы
вируса (обычно 100—1000 ЕД50). В этом варианте определяют титр
вируснейтрализующих антител в сыворотке, показателем которого служит
разведение сыворотки, защищающее от действия вируса 50 % зараженных
биологических систем;
2) к разным дозам (разведениям) вируса (обычно в виде последо-
вательных 10-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы сыворотки
(обычно в разведениях I : 10 или 1 : 20). При постановке данного варианта
РН кроме исследуемой (или специфической) сыворотки используют и
нормальную (отрицательную) сыворотку. В этом случае определяют
10-7241 144
индекс нейтрализации (IN), который показывает, во сколько раз иммунная
(специфическая) или исследуемая сыворотка снижает титр вируса по
сравнению с нормальной сывороткой*.
Необходимо помнить, что любая серологическая реакция (в том числе и
РН) должна сопровождаться контролями на каждый компонент,
участвующий в реакции.
РН позволяет решить следующие диагностические задачи: обнаружить
и определить титр вируснейтрализующих антител с помощью известного
вируса;
идентифицировать неизвестный (выделенный) вирус путем ис-
следования его с различными заведомо известными сыворотками
(антителами).
Достоинствами РН являются ее универсальность и высокая
специфичность; недостатки — большая трудоемкость; необходимость
строго соблюдать стерильность материалов, посуды и инструментов;
высокая стоимость живых биологических систем; относительная
длительность биопробы и необходимость проведения математических
расчетов.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Широко исполь-
зуется при исследовании гемагтлютинирующих вирусов. Основана на том,
что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном)
нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемаг- глютинируюшую
активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за
гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело.
Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают
равные объемы сыворотки крови и вируса и после экспозиции (30—40
мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного†.
Эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси.
Агглютинация эритроцитов указывает на наличие вируса в смеси, а
отсутствие гемагглютинации — на его отсутствие, так как антитела
полностью нейтрализовали гемагглютинирующую активность вируса.
РТГА можно ставить в двух вариантах:
1) к разным разведениям сыворотки (обычно 2-кратным) добавляют
одинаковые дозы вируса (4—8 ГАЕ);
2) к разным разведениям вируса (обычно 2-кратным) добавляют
одинаковые дозы сыворотки.
Сыворотки, используемые в РТГА, должны быть предварительно
освобождены от термолабильных и термостабильных ингибиторов.
Постановку РТГА по первому варианту проводят по следующим
этапам:
титруют вирус в РГА и определяют его гемагглютинирующий титр;

* lN-титр вируса с нормальной сывороткой/титр вируса с иммунной (или ис-

следуемой) сывороткой. Установлено, что IN = <10— результат РН отрицательный; IN =
10—50 — результат РН сомнительный; IN = 100 и более — результат РН
положительный.
† Выбор эритроцитов зависит от вируса, используемого в РТГА. Так, для вирусов
гриппа используют эритроциты кур, для ПГ-3 КРС — эритроциты морской спинки.
Обычно используют 0,5—1%-ную взвесь эритроцитов.

14
5
 приготовляют и контролируют рабочую дозу вируса (4 или 8 ГАЕ);
ставят главный опыт РТГА;
учитывают результаты. Оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в
крестах и определяют титр антител. За титр антител в сыворотке
принимается наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью
тормозит гемагглютинацию.
РТГА ставят в пробирках, специальных полистироловых планшетах
макро- или микрометодом.
РГТА позволяет решить следующие диагностические задачи:
обнаружить и определить титр антител в сыворотке крови с помощью
известного вируса;
идентифицировать неизвестный вирус путем исследования его с
различными заведомо известными сыворотками (антителами).
Достоинства РТГА — простота техники постановки и быстрый
результат. Однако эту реакцию можно использовать только для ге-
магглютинирующих вирусов.
Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА), или реакция пассив-
ной гемагглютинации (РПГА). Основана на том, что эритроциты, на
которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают
способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток
(антител). Эритроциты при этом выполняют роль носителей со
специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в
результате реакции антиген + антитело (цв. вкл., рис. 18).
Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены,
называют эритроцитарным антигенным диагностику- мом, или
эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.
Другой тип РИГА — на поверхности эритроцитов адсорбированы
антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии
гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют
эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами,
сенсибилизированными антителами.
На основе этих двух принципиальных методических подходов
разработаны и используются многие модификации РИГА. Так, в качестве
носителей применяют мелкие стандартные частички ла-

10-7241 146
гекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации
(РЛА) или используют золотистый стафилококк — реакция
коагглютинации ит.д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на
предприятиях биологической промышленности, а в диагностических
лабораториях ставят уже главный опыт РИГА.
Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие
этапы:
фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или
акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно
сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана,
человека, кур и др.;
обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате
эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей
поверхности белки (вирусы и антитела);
сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или
антителами.
Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных
диагностикумов для вирусных инфекций различна.
Методика постановки РИГА для обнаружения и определения титра
антител заключается в следующем:
к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют
равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
смесь оставляют на 2—3 ч при комнатной температуре или на 16—18 ч
при 4 °C;
учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к
вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают
гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.
За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение
сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на
два креста.
РИГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно
ставят реакцию микрометодом (цв. вкл., рис. 18).
РИГА позволяет решать следующие диагностические задачи:
обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью
известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью
известного эритроцитарного антительного диагностикума.
Достоинства РИГА: высокая чувствительность, простота техники
постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают
большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных
диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых
компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и
сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).
Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд). При диагностических
исследованиях в практике применяют РТГАд. Эту реакцию вс

14
7
используют в том случае, если вирус обладает темадсорбирующими
свойствами. Гемадсорбцией называется адсорбция (прилипание)
эритроцитов к поверхности клеток, зараженных вирусом. Чаще это явление
наблюдают у гемагглютинирующих вирусов. Так, гемадсорбирующими
свойствами обладают вирусы гриппа, вирус ПГ-3 и некоторые штаммы
парвовирусов крупного рогатого скота и др.
Чтобы наблюдать гемадсорбцию, из пробирки с зараженной вирусом
культурой клеток удаляют культуральную жидкость и вносят 0,5%-ную
взвесь эритроцитов (для вируса ПГ-3 — эритроциты морской свинки, для
вирусов гриппа — эритроциты кур), оставляют на 5—10 мин, затем слой
клеток споласкивают физиологическим раствором (чтобы смыть
эритроциты). Если в зараженной культуре клеток идет репродукция
вируса, то на таких клетках под малым увеличением микроскопа можно
видеть адсорбировавшие эритроциты, в контрольных (незараженных)
культурах клеток таковые отсутствуют (цв. вкл., рис. 19).
РТГАд основана на торможении гемадсорбции, если зараженную
вирусом культуру клеток предварительно обработать специфической
сывороткой (содержащей антитела к этому вирусу). Так, для
идентификации вируса ПГ-3 крупного рогатого скота широко используется
данная реакция.
Методика постановки РТГАд заключается в следующем:
на 3—7-й день после заражения культур клеток из них удаляют
питательную среду, промывают клетки раствором Хенкса и вносят в
каждые 4 пробирки по 0,5 мл специфической к вирусу ПГ-3 сыворотки в
разведении 1:10;
пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной
температуре на 30 мин (для контакта клеток с антителами);
во все пробирки вносят по 1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов морской
свинки;
через 30 мин — учет результатов. Отсутствие гемадсорбции в
пробирках со специфической сывороткой и проявление ее в пробирках с
зараженной культурой клеток, но не обработанной специфической
сывороткой, свидетельствует о наличии вируса ПГ-3 в культуре клеток.
Чаще всего РТГАд применяют для идентификации вируса и редко для
обнаружения и титрования антител.
Реакция связывания комплемента (РСК). Это — одна из тради-
ционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих
вирусных болезней. Само название в значительной мере отражает суть
метода, состоящего из двух отдельных этапов. На первом этапе участвуют
антиген и антитело (один из этих ингредиентов заранее известен), а также
определенное количество предварительно оттитрованного комплемента.
При соответствии антигена и антитела их комплекс связывает комплемент,
что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь
бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним — гемолизина). Если
комплемент связался при взаимодействии антигена и антитела, то лизиса
эритроцитов не происходит (положительная РСК). При отрицательной РСК
несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов (рис. 40).

14
8
РСК часто используют в диагностической практике для обнаружения и
идентификации вирусов, обнаружения и титрования антител в сыворотках
крови.
Основными компонентами РСК служат антигены (известные или
выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые
сыворотки), комплемент (сыворотка крови морской свинки),
гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя
используют изотонический раствор натрия хлорида (pH 7,2—7,4) или
различные буферные растворы.
(Методику постановки РСК см. с. 255.)
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), или метод флуоресциру-
ющих антител (МФА). При данном методе используют явление
люминесценции. Сущность явления люминесценции заключается в том,
что при поглощении различных видов энергии (световой, электрической и
др.) молекулами некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное
состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют
поглощенную энергию в виде светового излучения.
В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции — это
свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и
прекращающееся сразу после его окончания.
Многие вещества и живые микроорганизмы обладают собственной
флуоресценцией (так называемой первичной), однако интенсивность ее
очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной
флуоресценцией и используемые для придания флуоресцирующих свойств
нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы. Такая
наведенная флуоресценция называется вторичной.

Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии

чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть
спектра (длина волны 300—460 нм). Для этих целей в лабораториях
имеются люминесцентные микроскопы различных моделей — МЛ-1—МЛ-
4, «Люмам» (рис. 41).
В вирусологической практике применяют два основных метода
люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих
антител (или РИФ).

14
9
 Флуорохромирование — это обработка препаратов флуорохромом с
целью увеличения силы и контрастности свечения их. Наибольший
интерес представляет флуорохром акридиновый оранжевый, который
вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так,
при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая
кислота ярко флуоресцирует зеленым цветом, а рибонуклеиновая —
рубиново-красным.
Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с
флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с
гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело в
связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под
люминесцентным микроскопом по характерному свечению.
Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные
сыворотки, из которых выделяют антитела и метят их флуорохромом. В
качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ-флуоресцеин
изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ- родамин сульфохлорид (красное
свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.

Рис. 41. Общий вид люминесцентного микроскопа «Люмам Р-2»:

1 — бинокуляр; 2 — объективы; 3 — предметный столик; 4 — кожух осветительной лампы; 5—
основание
Методика приготовления и окрашивания препаратов заключается в
следующем:
готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов пли на
покровных стеклах — инфицированную культуру клеток; можно
использовать и гисюсрезы;
препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном
ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °C (от 15 мин до 4—
16 ч);
окрашивают по прямому или непрямому методу;
ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности
свечения, оцениваемому в крестах.
Параллельно готовят и окрашивают препараты от здорового животного
— контроль.

15
0
 Различают два основных метода применения флуоресцирующих
антител: прямой и непрямой (рис. 42).
Прямой метод (одноступенчатый) (рис. 43). На фиксированный
препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к
предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37 °C во
влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанного конъюгата
физиологическим раствором (pH 7,2 — 7,5), подсушивают на воздухе,
наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.
Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать антиген. Для
этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку.
Непрямой метод (двухступенчатый) (рис. 44). На фиксированный
препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к
предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °C, отмывают
несвязанные антитела. На препарат наносят флуоресцирующую
антивидовую сыворотку‡, соответствующую виду животного —
продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30
мин при 37 °C. Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител,
подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют
под люминесцентным микроскопом.
Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать
антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим
методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены
различных вирусов, так как он основан на исполь- ювании антивидовых
сывороток. Чаще применяют антикроличьи, антибычьи, антилошадиные
сыворотки и сыворотки против глобулинов морской свинки.

‡ Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя глобулинами животных тех

видов, которые служат продуцентами антивирусных антител. Так, если антивирусные
антитела получали на кроликах, то используют флуоресцирующую анти- кроличью
сыворотку.

15
1
 А. Метод прямой (одноступенчатый)

Вирус Глобулин Флуоресци- (антиген) флуоресци- рующий рующий комплекс (антитело) (антиген-
антитело)
Б. Метод непрямой (двухступенчатый)
1. Обнаружение антигена с помощью флуоресци-
рующего антиглобулина
U этап
/ этап X\3U./Z/
+ (=0=1 4- ОО ► tZSj
Вирус Нефлуорес- Нефлуорес- Амтиглобу- Флуоресци-
(антиген) цирующее цирующий лин флуорес- рующий
антитело, комплекс цирующий комплекс
оно же ан- (антиген- (антитело
тиген №2 антитело) против
(иммунная антигена №2)
сыворотка)
2. Обнаружение антигена с помощью флуоресцентной

Вирус Смесь ком- Нефлуорес- Флуоресци- Флуоресци- (анти

ген) племента цирующий рующий рующий
и нефлуо- комплекс антиком- комплекс
ресцирую- (антиген- плементар-
щих антитело- ный гло-
антител компле- булин
мент)

Рис. 42. Схема вариантов метода флуоресцирующих антител

Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего

внимания заслуживает метод с использованием комплемента. Метод
заключается в том, что на фиксированный препарат наносят
инактивированную нефлуоресцирующую специфическую сыворотку и
комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при 37 °C, промывают,
и для выявления комплекса антиген + антитело + комплемент наносят
флуоресцирующую антикомпле- ментарную сыворотку, выдерживают 30
мин при 37 °C, промывают, подсушивают на воздухе и исследуют под
люминесцентным микроскопом.
Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность;
простота техники постановки; требуется минимальное количество
компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение
нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно отнести
субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда
флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее
время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней жи-
вотных.

15
2
 Рис. 43. Выявление антигена вируса бешенства прямым методом МФА
(препараты Е. В. Клюевой):
а, б, в, г—в культуре клеток; д, е — в отпечатках мозга зараженных мышей

Рис. 44. Выявление непрямым МФА антигена аденовируса КРС в культуре клеток
тестикул бычка (препараты Л. Н. Носач, Р В Белоусовой и др.):
а — внутриядерное включение не светится; б— внутриядерное включение светится: в —
свечение в ядре и в цитоплазме
 Иммуноферментный анализ (ИФА). В диагностике вирусных бо-
лезней человека и животных широко применяют методы, основанные на
использовании ферментов в качестве метки антигенов и антител. Это
группа методов носит название иммуноферментно- го анализа.
ИФА применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном.
Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазную реакцию,
используют редко. Он аналогичен методу иммунофлуоресценции, но
отличается тем, что для постановки реакции используют антитела,
меченные не флуорохромом, а ферментом§ **. Таким образом, в комплекс
антиген + антитело включаются антитела, меченные ферментом, и для
обнаружения этого комплекса вносят субстрат'* (фермент-чувствительное
вещество), которое под действием фермента разлагается, образуя цветной
продукт ферментативной реакции, хорошо видимый в световом
микроскопе.
Материалом для выявления вирусных антигенов при этом варианте
могут быть: мазки; отпечатки различных органов; парафиновые срезы;
культуры клеток. При этом можно использовать как прямой, так и
непрямой метод.
Прямой метод (рис. 45, А). На фиксированный препарат наносят
конъюгат (антитела к предполагаемому вирусу, меченные ферментом),
выдерживают при 37 °C в течение 1—2 ч во влажной камере, затем
препарат отмывают физиологическим раствором от несвязанного
конъюгата, подсушивают на воздухе, наносят несколько капель раствора
субстрата, инкубируют 5— 10 мин и промывают физиологическим
раствором. Затем споласкивают дистиллированной водой, и результат
учитывают с помощью светового микроскопа. В положительных случаях,
т. е. при наличии антигена в исследуемом материале, видны или
диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-
черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не обнаруживают.
Непрямой метод (рис. 45, Б). На фиксированный препарат наносят
специфическую к предполагаемому вирусу сыворотку, выдерживают при
37 °C в течение 1—2 ч во влажной камере, промывают физиологическим
раствором, подсушивают на воздухе и наносят меченную ферментом
антивидовую сыворотку, выдерживают при 37 °C 1—6 ч. Далее следует
процедура, как в прямом методе.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА, РЭМА— реакция
энзиммеченых антител, ELISA — enzyme-linked

§ Для метки антител обычно применяют ферменты: пероксидазу хрена (чаще),

щелочную фосфатазу, галактозидазу и др.
** В качестве субстрата используют ортофенилендиамин, 5-аминосалицило- вую
кислоту или бензидин. К ним добавляют пероксид водорода (Н2О2).
15
4
 Рис. 45. Схемы методов выявления антигена:
/( — прямого пероксидазного: а — срез ткани, содержащей антиген; б— антитела, меченные
ферментом; в — комплекс антиген + антитело + фермент; г —субстрат; д— комплекс антиген +
антитело + фермент, проявленный при помощи субстрата; Ф — фермент; Б — непрямого
иммунопероксидазного; а — срез ткани, содержащей антиген; б — специфические антитела к
антигену; в — комплекс антиген + антитело; г — вторичные антитела, меченные ферментом; д —
комплекс антиген + антитело + вторичное антитело, меченное ферментом; е — субстрат; ж —
комплекс, проявленный при помощи субстрата; Ф — фермент

immunosorbent assay) в последние годы широко используют в биологии, в

том числе и в вирусологии. Характерная особенность метода в том, что
один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксируют на
твердом носителе. В качестве носителей используют полистироловые
микропанели, шарики, палочки и др.
Этим методом можно обнаружить и идентифицировать антиген, а
также выявить антитела и определить их титр в сыворотках крови.
Существует много вариантов метода. Наиболее часто для обнаружения
антигенов используют прямой метод («сандвич»-метод, рис. 47). Для этого
специфические к предполагаемому антигену антитела фиксируют в лунках
микропанелей, в которые вносят исследуемый антиген и выдерживают при
37 °C 1—2 ч. Затем микропанели промывают буферным раствором и
вносят в лунки меченные ферментом к предполагаемому антигену
антитела, выдерживают при 37 °C 1—2 ч, промывают микропанели, вносят
раствор субстрата и выдерживают 5—30 мин. Реакцию останавливают до-
бавлением раствора серной кислоты и учитывают визуально по разности в
окраске опытных и контрольных образцов или при по-

15
5
 Рис. 46. Схема определения антигена
непрямым методом твердофазного ИФА:
1 — адсорбция антигена в лунках; 2— внесе-
ние исследуемого раствора. Специфические
антитела фиксируются на антигене; 3— внесе-
ние ферментомеченого антивидового глобули-
на, фиксирующегося на антителах; 4— вне-
сение субстрата и появление цветного про-
дукта ферментативной реакции; Ф — фермент
Рис. 47. Схема определения антигена
методом двойных антител («сандвич»- метод)
в твердофазном ИФА:
1 — адсорбция в лунках специфических ан-
тител; 2—внесение исследуемого раствора,
который соединяется с антителами; 3 — до-
бавление ферментомеченых специфических
антител; 4— внесение субстрата и появление
цветного продукта ферментативной реакции; Ф
—фермент
 Рис. 48. РДП
Слева в центральной лунке — преципитирующая сы-
воротка, по периферии — 4 лунки с антигеном, вид
линии преципитации. Справа в центральной лунке —
нормальная сыворотка, по периферии — те же антигены,
линий преципитации нет

мощи спектрофотометрии. Положи-

тельные образцы имеют окраску от желтой
до оранжево-коричневой.
Обнаружение и определение титра
антител проводят непрямым твер-
дофазным методом (см. рис. 46).
В крупных диагностических ла-
бораториях применяют полностью автоматизированные установки для
проведения твердофазного ИФА, позволяющие анализировать от 1000 до
4000 проб ежедневно.
Достоинства ИФА: высокая чувствительность; специфичность;
простота техники постановки; требуется минимальное количество
компонентов; не требуется специальных приборов; оценку можно
проводить визуально; возможность автоматизации, что позволяет его
применять для массовых исследований; исследуемые сыворотки не
требуют предварительной обработки. Это — экспресс-метод диагностики,
так как в течение нескольких часов можно получить ответ.
Радиоиммунный метод (РИМ). Отличие этого метода от ИФА
заключается в том, что в качестве метки антигенов и антител используют
не фермент, а радиоактивный изотоп, как 1251 или др. Результаты реакции
учитывают путем определения радиоактивности исследуемых образцов.
Это очень чувствительный и надежный метод, но требует специального
оборудования и условий работы с радиоизотопами.
Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП). Основана на
способности к диффузи膆 в гелях‡‡ антител и растворимых антигенов (рис.
48). При создании условий, в которых они будут диффундировать
навстречу друг другу, при их встрече образуется комплекс антиген +
антитело. Этот комплекс не обладает способностью диффундировать в
толще агарового геля и выпадает в осадок (в участках, где создаются их
эквивалентные концентрации) в виде полосы преципитации, видимой
невооруженным глазом. Если же диффундирующие антигены и антитела
не гомологичны друг другу, то полосы преципитации не образуется.

†† Диффузией называют проникновения молекул одного вещества между моле-

кулами другого, обусловленные тепловыми движениями молекул.
‡‡ Гелями называют такие дисперсные системы, в которых жидкая фаза рас-
пределена равномерно среди твердой. В лабораторной практике очень часто используют
агаровый гель.
15
7
 Рис. 49. Схема РДП для обнаружения
и титрования антител:
AS — антиген специфический; 5,КС1| — исследуемая
сыворотка крови; SN — сыворотка отрицательная;
55—сыворотка специфическая;
1:2, 1:4, 1:8, 1 : 16 — титры антител

Для создания условий диффузии в

слое агара делают лунки, в которые
заливают компоненты. Количество и
взаимное расположение лунок зависит
от решаемой задачи.
РДП позволяет решить следующие
диагностические задачи: обнаружить и идентифицировать неизвестный
выделенный ви
рус путем исследования его с различными заведомо известными
сыворотками (антителами);
обнаружить и определить титр антител в сыворотках с помощью
известного антигена (рис. 49).
РДП может быть поставлена в чашках Петри (макрометод) и на
предметных стеклах (микрометод).
(Методику постановки РДП микрометодом см. с. 335).
Методика постановки макрометода по технике принципиально не
отличается от постановки микрометода, только в этом случае в чашку
Петри наливают 20—25 мл расплавленного агара и в застывшем геле
делают лунки диаметром 5—6 мм по специальной схеме (расстояние
между лунками 4—5 мм ) и вносят соответствующие компоненты.
При постановке РДП на предметных стеклах препарат можно через 48
—72 ч высушить и окрасить раствором амидного черного, что позволит
его сохранить и сфотографировать.
Достоинства РДП: простота техники постановки; быстрота получения
ответа; не требует стерильной работы, особой чистоты компонентов;
возможность документирования результата путем фотографирования.
Недостаток РДП — низкая чувствительность.
Иммунодиффузия в электрическом поле (встречный электрофорез,
ракетный электрофорез) позволяет повысить чувствительность метода в 10
—20 раз и более.
Одна из разновидностей РДП — реакция радиальной иммуно-
диффузии (РРИД). (Методику постановки см. с. 259.)
Иммуноблоттинг (от англ, blot — пятно) — высокочувствительный
метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА
или РИА. Принцип метода заключается в том, что антигены возбудителя
разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем
переносят их из геля на активированную бумагу (/) или нитроцеллюлозную
мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски
с «бло- тами» антигенов. На эти полоски наносят исследуемую сыворотку
(2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител и
наносят сыворотку против иммуноглобулинов того вида животного,
15
8
который был донором исследуемой сыворотки, меченную ферментом (5).
Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело исследуемой
сыворотки + меченое антитело против иммуноглобулинов животного
исследуемого вида) выявляют добавлением хромогенного субстрата (4),
изменяющего окраску под действием фермента (цв. вкл., рис. 20).

Контрольные вопросы

1. Какова суть серологических реакций? 2. Что такое антигены и каковы их природа

и основные свойства? 3. Что такое антитела, каковы их виды (полные, неполные,
авидные и др.) и свойства? 4. Каков принцип взаимодействия антигена и антител? 5.
Какие серологические реакции применяют в вирусологии? 6. Какие серологические
реакции можно отнести к экспресс-методам диагностики вирусных болезней? 7. Каков
принцип реакции нейтрализации, ее варианты и какие диагностические задачи можно
решать с ее помощью? 8. Каковы принципы РИФ и ИФА и их варианты? 9. Каков
принцип реакции торможения гемагглютинации, каковы ее варианты и какие
диагностические задачи можно решать с ее помощью? 10. Что такое иммуноблоттинг?

1.12. ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Диагностика играет одну из решающих ролей в системе мероприятий

по борьбе с болезнями животных вирусной этиологии. Быстрый и
правильно поставленный диагноз обеспечивает успех в ликвидации
вспышки болезни, так как позволяет четко выяснить эпизоотическую
ситуацию и своевременно принять целенаправленные меры по
оздоровлению поголовья животных с наименьшими потерями.
Для постановки диагноза требуются сбор, изучение, анализ и
сопоставление целого комплекса различных данных. Поэтому диагноз —
это результат кропотливой и вдумчивой работы.
На первом этапе диагностики используют данные, которые можно
быстро собрать непосредственно в хозяйстве. К таковым относятся:
эпизоотологические данные, включающие сведения об охвате
болезнью данного поголовья животных, скорости и территориальном
распространении болезни, видах заболевших животных, динамике
выявления больных и т. д.;
клинические признаки болезни. Они включают определение (по
сравнению с нормой) температуры тела, частоты и формы дыхания,
частоты пульса, нарушения аппетита, поведения, состояния кожных
покровов и слизистых оболочек, функционирования органов пищеварения,
выделения и т. д.;

15
9