используют в том случае, если вирус обладает темадсорбирующими

свойствами. Гемадсорбцией называется адсорбция (прилипание)

эритроцитов к поверхности клеток, зараженных вирусом. Чаще это
явление наблюдают у гемагглютинирующих вирусов. Так,
гемадсорбирующими свойствами обладают вирусы гриппа, вирус
ПГ-3 и некоторые штаммы парвовирусов крупного рогатого скота и
др.
Чтобы наблюдать гемадсорбцию, из пробирки с зараженной
вирусом культурой клеток удаляют культуральную жидкость и
вносят 0,5%-ную взвесь эритроцитов (для вируса ПГ-3 — эритро-
циты морской свинки, для вирусов гриппа — эритроциты кур), ос-
тавляют на 5—10 мин, затем слой клеток споласкивают физиоло-
гическим раствором (чтобы смыть эритроциты). Если в зараженной
культуре клеток идет репродукция вируса, то на таких клетках под
малым увеличением микроскопа можно видеть адсорбировавшие
эритроциты, в контрольных (незараженных) культурах клеток
таковые отсутствуют (цв. вкл., рис. 19).
РТГАд основана на торможении гемадсорбции, если зараженную
вирусом культуру клеток предварительно обработать специ-
фической сывороткой (содержащей антитела к этому вирусу). Так,
для идентификации вируса ПГ-3 крупного рогатого скота широко
используется данная реакция.
Методика постановки РТГАд заключается в следующем:
на 3—7-й день после заражения культур клеток из них удаляют
питательную среду, промывают клетки раствором Хенкса и вносят в
каждые 4 пробирки по 0,5 мл специфической к вирусу ПГ-3 сы-
воротки в разведении 1:10;
пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной
температуре на 30 мин (для контакта клеток с антителами);
во все пробирки вносят по 1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов
морской свинки;
через 30 мин — учет результатов. Отсутствие гемадсорбции в
пробирках со специфической сывороткой и проявление ее в про-
бирках с зараженной культурой клеток, но не обработанной спе-
цифической сывороткой, свидетельствует о наличии вируса ПГ-3 в
культуре клеток.
Чаще всего РТГАд применяют для идентификации вируса и
редко для обнаружения и титрования антител.
Реакция связывания комплемента (РСК). Это — одна из
традиционных серологических реакций, применяемых для
диагностики многих вирусных болезней. Само название в
значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух
отдельных этапов. На первом этапе участвуют антиген и антитело
(один из этих ингредиентов заранее известен), а также определенное
количество предварительно оттитрованного комплемента. При
соответствии антигена и антитела их комплекс связывает
комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью
индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и
14
8
антисыворотки к ним — гемолизина). Если комплемент связался
при взаимодействии антигена и антитела, то лизиса эритроцитов не
происходит (положительная РСК). При отрицательной РСК
несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов (рис.
40). РСК часто используют в диагностической практике для
обнаружения и идентификации вирусов, обнаружения и титрования
антител в сыворотках крови.
Основными компонентами РСК служат антигены (известные или
выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые
сыворотки), комплемент (сыворотка крови морской свинки),
гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве
разбавителя используют изотонический раствор натрия хлорида (pH
7,2—7,4) или различные буферные растворы.
(Методику постановки РСК см. с. 255.)
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), или метод
флуоресцирующих антител (МФА). При данном методе
используют явление люминесценции. Сущность явления
люминесценции заключается в том, что при поглощении различных
видов энергии (световой, электрической и др.) молекулами
некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное состояние,
а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную
энергию в виде светового излучения.
В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции —
это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим
светом и прекращающееся сразу после его окончания.
Многие вещества и живые микроорганизмы обладают соб-
ственной флуоресценцией (так называемой первичной), однако
интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной
первичной флуоресценцией и используемые для придания
флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, по-
лучили название флуорохромы. Такая наведенная флуоресценция
называется вторичной.

Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микро-

скопии чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фио-
14
9
летовую часть спектра (длина волны 300—460 нм). Для этих целей в
лабораториях имеются люминесцентные микроскопы различных
моделей — МЛ-1—МЛ-4, «Люмам» (рис. 41).
В вирусологической практике применяют два основных метода
люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуорес-
цирующих антител (или РИФ).
Флуорохромирование — это обработка препаратов флуоро-
хромом с целью увеличения силы и контрастности свечения их.
Наибольший интерес представляет флуорохром акридиновый
оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию
нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим
флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко
флуоресцирует зеленым цветом, а рибонуклеиновая — рубиново-
красным.
Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с
флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую
связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген
+ антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнару-
живают под люминесцентным микроскопом по характерному све-
чению.
Для получения антител используют высокоактивные гиперим-
мунные сыворотки, из которых выделяют антитела и метят их
флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют
ФИТЦ-флуоресцеин изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-
родамин сульфохлорид (красное свечение). Антитела, меченные
флуорохромом, называют конъюгатом.

Рис. 41. Общий вид люминесцентного микроскопа «Люмам Р-2»:

1— бинокуляр; 2 — объективы; 3 — предметный столик; 4 — кожух осветительной лампы; 5—
основание
Методика приготовления и окрашивания препаратов заключа-
ется в следующем:
готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов пли
на покровных стеклах — инфицированную культуру клеток; можно
15
0
использовать и гисюсрезы;
препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном
ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °C (от 15 мин
до 4—16 ч);
окрашивают по прямому или непрямому методу;
ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности
свечения, оцениваемому в крестах.
Параллельно готовят и окрашивают препараты от здорового
животного — контроль.
Различают два основных метода применения флуоресцирующих
антител: прямой и непрямой (рис. 42).
Прямой метод (одноступенчатый) (рис. 43). На фиксированный
препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к
предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37
°C во влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанного
конъюгата физиологическим раствором (pH 7,2 — 7,5),
подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и
исследуют под микроскопом.
Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать ан-
тиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую
сыворотку.
Непрямой метод (двухступенчатый) (рис. 44). На фиксированный
препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к
предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °C,
отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят
флуоресцирующую антивидовую сыворотку*, соответствующую
виду животного — продуцента гомологичных противовирусных
антител, выдерживают 30 мин при 37 °C. Затем препарат отмывают
от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят
нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным
микроскопом.
Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифи-
цировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме
того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сыворот-
кой антигены различных вирусов, так как он основан на исполь-
ювании антивидовых сывороток. Чаще применяют антикроличьи,
антибычьи, антилошадиные сыворотки и сыворотки против гло-
булинов морской свинки.

* Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя глобулинами животных тех

видов, которые служат продуцентами антивирусных антител. Так, если антивирусные
антитела получали на кроликах, то используют флуоресцирующую анти- кроличью
сыворотку.
15
1
 А. Метод прямой (одноступенчатый)

Вирус Глобулин Флуоресци- (антиген) флуоресци- рующий рующий комплекс (антитело) (антиген-
антитело)
Б. Метод непрямой (двухступенчатый)
1. Обнаружение антигена с помощью флуоресци-
рующего антиглобулина
U этап
/ этап X\3U./Z/
+ (=0=1 4- ОО ► tZSj
Вирус Нефлуорес- Нефлуорес- Амтиглобу- Флуоресци-
(антиген) цирующее цирующий лин флуорес- рующий
антитело, комплекс цирующий комплекс
оно же ан- (антиген- (антитело
тиген №2 антитело) против
(иммунная антигена №2)
сыворотка)
2. Обнаружение антигена с помощью флуоресцентной

Вирус Смесь ком- Нефлуорес- Флуоресци- Флуоресци- (анти

ген) племента цирующий рующий рующий
и нефлуо- комплекс антиком- комплекс
ресцирую- (антиген- плементар-
щих антитело- ный гло-
антител компле- булин
мент)

Рис. 42. Схема вариантов метода флуоресцирующих антител

Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наи-

большего внимания заслуживает метод с использованием компле-
мента. Метод заключается в том, что на фиксированный препарат
наносят инактивированную нефлуоресцирующую специфическую
сыворотку и комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при
37 °C, промывают, и для выявления комплекса антиген + антитело +
комплемент наносят флуоресцирующую антикомпле- ментарную
сыворотку, выдерживают 30 мин при 37 °C, промывают,
подсушивают на воздухе и исследуют под люминесцентным
микроскопом.
Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность;
простота техники постановки; требуется минимальное количество
компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение
нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно
отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к
сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого
качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике
вирусных болезней животных.

15
2
 Рис. 43. Выявление антигена вируса бешенства прямым методом МФА
(препараты Е. В. Клюевой):
а, б, в, г—в культуре клеток; д, е — в отпечатках мозга зараженных мышей

Рис. 44. Выявление непрямым МФА антигена аденовируса КРС в культуре клеток
тестикул бычка (препараты Л. Н. Носач, Р В Белоусовой и др.):
а — внутриядерное включение не светится; б— внутриядерное включение светится: в —
свечение в ядре и в цитоплазме