Ферментативная

Ферментативная
технология
технология
Применение ферментов
• Ферменты (от лат. fermentum - брожение,
закваска), специфические белки,
присутствующие во всех живых клетках и
играющие роль биологических
катализаторов не подвергаясь при этом
химическим превращениям. Через их
посредство реализуется генетическая
информация и осуществляются все
процессы обмена веществ и энергии в
живых организмах.
• Хотя ферменты образуются только в
живых клетках, многие из них
могут быть выделены из клеток без
потери активности и способны
работать в условиях in vitro.
 Ферменты (от лат. fermentum – брожение,
закваска) иногда называют энзимами (от
греч. en – внутри, zyme – закваска).

• Все живые клетки содержат очень

большой набор ферментов, от
каталитической активности которых
зависит функционирование клеток.
Практически каждая из множества
разнообразных реакций, протекающих в
клетке, требует участия специфического
фермента.
• Многие ферменты находятся в клетке в
свободном состоянии, будучи просто
растворены в цитоплазме; другие
связаны со сложными
высокоорганизованными структурами.
Есть и ферменты, в норме находящиеся
вне клетки; так, ферменты,
катализирующие расщепление крахмала
и белков, секретируются поджелудочной
железой в кишечник. Секретируют
ферменты и многие микроорганизмы.
 Энзимология – раздел молекулярной
биологии и биохимии, изучающий
свойства, строение и механизмы
действия ферментов.

• Основная задача инженерной

энзимологии состоит в создании
новых перспективных технологий
на основе использования
ферментов.
Ферменты применяются
в следующих областях:
• В пищевой промышленности – для
производства хлеба, переработки молочных
продуктов, осветления соков и др.
• В медицине – для производства лекарственных
препаратов.
• В животноводстве – для повышения
усвояемости кормов, а также для ускорения
процесса силосования и улучшения
питательных свойств силоса.
• В растениеводстве – для защиты растений от
насекомых - вредителей.
• 1896 г. считается достоверным
началом современной микробной
ферментной технологии с получением
первого коммерческого продукта
новой отрасли – такадиастазы,
представляющей собой грубую
(неочищенную) смесь
гидролитического фермента,
приготавливаемую путем
выращивания гриба Aspergillus oryzae
на отрубях ячменя.
 Источники получения
ферментов.
• Ферменты выделяют из клеток всех видов
живых организмов, но традиционным
источником служат растения.
• Синтез ферментов клетками культуры ткани.
Однако ввиду сложности и дороговизны не
получил широкого распространения, хотя он и
позволяет получить большое количество
необходимого вещества в десятки, а иногда в
сотни раз быстрее, чем путем выделения из
живых организмов.
• Получение ферментов из бактерий.
Примерно в сто раз дешевле
ферментов, выделенных из клеток
растений и животных.
• Высокопродуктивные штаммы
микроорганизмов получают
благодаря использованию
мутационного процесса и методов
генетической инженерии.
Сочетание этих методов позволило
японским исследователям добиться
200 – кратного увеличения синтеза
альфа – амилазы клетками сенной
палочки Bacillus subtilis.
 Выделяемые из клеток
свободные ферменты имеют ряд
недостатков:
• 1. Они растворимы в воде и во
время выделения или при
хранении могут потерять свою
активность.
• 2. Их порой трудно отделить от
продуктов реакции.
• В последнее время были
найдены пути преодоления
этих сложностей – получены
водонерастворимые формы,
так называемые
иммобилизованные
(связанные) ферменты.
• Иммобилизация – это метод,
позволяющий связать молекулу фермента
с природным или синтетическим
носителем. Носитель не смешивается с
растворами реагентов, но позволяет
ферменту взаимодействовать с ними, в
результате чего и образуются
необходимые вещества. Наиболее
распространенным способом получения
иммобилизованных ферментов является
ковалентное связывание
 Мембрана с
иммобилизованными
клетками дрожжей
 Иммобилизованные ферменты обладают
существенными преимуществами по
сравнению с традиционными
ферментативными препаратами:
• Они стабильны и долго сохраняют свою
активность;
• Легко отделяются от реакционной среды, что
повышает качество получаемой продукции.
• Иммобилизованные ферменты технологичны,
что определяется возможностью вести
биотехнологический процесс непрерывно,
регулировать скорость реакции и выход
продукции.
• Сущность иммобилизации
ферментов - прикрепление их к
активной форме к нерастворимой
основе, заключение в гель или в
полунепроницаемую мембранную
систему. Фиксированные таким
образом ферменты обладают
пролонгированным (более
длительным) действием.
• в 1916 году Дж. Нельсон и Е.
Гриффин показали, что сахароза,
сорбированная на угле, сохраняла
свою каталитическую активность,
но лишь в 1953 году Н. Грубхофер
и Д. Шлейт впервые осуществили
ковалентные связывания амилазы,
пепсина и карбоксипептидазы с
этим нерастворимым носителем.
 Клетки пивных дрожжей
Saccharomyces cerevisiae
и Saccharomyces carlsberqensis,
используемые для получения
фермента инвертазы
 Получаемая с помощью инвертазы
фруктоза оказывает благоприятное
действие на организм больного
человека.
• Фруктоза применяется:
• В питании людей, больных диабетом. Ее расщепление
не зависит от инсулина, что способствует нормализации
синтеза гликогена в организме.
• Улучшает усвоение препаратов, содержащих железо,
поэтому ее можно использовать при лечении анемии,
вызванной недостатком ионов железа в организме.
• Улучшает состояние людей, страдающих сердечной
недостаточностью.
• Предотвращает накопление жира в печени.
• Снижает заболеваемость кариесом.
• Лактаза – фермент, который расщепляет
лактозу (сахар, содержащийся в молоке)
на галактозу и глюкозу. Лактоза с
трудом усваивается животными
организмами, не сбраживается
хлебопекарными дрожжами. Слабая
растворимость лактозы мешает
переработке молока.
 Применение
иммобилизованной
лактазы позволяет:
• Получать концентрированные молочные
продукты.
• Избегать добавления химических
стабилизаторов в мороженое.
• Увеличить питательность смесей для детского
питания.
• Осуществлять ферментативный гидролиз
лактозы в молочной сыворотке, что позволяет
применять ее в качестве корма для животных и
птицы.
 Ферменты сохраняют свои уникальные
свойства (эффективность, специфичность
действия) вне клеток, поэтому их
традиционно широко применяют в практике.

• Являются • Используется
нетоксичными доступное сырьё (в
биологическими том числе отходы),
катализаторами, поэтому их
оказывающими получение выгодно
«мягкое» с экономической и
воздействие. экологической
точек зрения.
 По объёму производства ферменты
занимают третье место после
аминокислот и антибиотиков.
• Из более 3000 известных в настоящее время
ферментов в промышленности используется
около 30.
• Основная часть ферментов, поступающих на
мировой рынок, приходится на долю гидролаз,
из которых 60% составляют
пептидогидролазы, использующиеся в качестве
детергентов в производстве синтетических
моющих средств, а 30% – гликозидазы,
применяющиеся в производстве кондитерских
изделий, фруктовых и овощных соков.
 Ферменты широко
применяются в
текстильной, кожевенной,
целлюлозобумажной,
медицинской, химической
промышленности
Область использования
ферментов
Название Химические и Область использования
фермента биотехнологичес
кий процессы.
Амилаза Бактерии, Гидролиз крахмала до
грибы декстринов, мальтозы и
глюкозы. Спиртовая,
(Bacillus sp. пивоваренная
Aspergillus промышленность,
niger хлебопечение, получение
патоки, глюкозы
Глюко- Более 80 видов Изомеризация D- глюкозы в D
изомераза микроорганизм – фруктозу. Кондитерская,
ов (Bacillus sp., ликёроводочная,
Streptomices безалкогольная
промышленность,
albus
хлебопечение
 Липаза Поджелудочные Гидролиз жиров и масел.
железы животных, Пищевая, лёгкая,
семена растений, медицинская
микроорганизмы промышленность, сельское
(Candida lipolitica, хозяйство, коммунальное
Streptomices хозяйство, бытовая химия
flavor-griseus)
Глюко- (Penicillium Удаление кислорода и
оксидаза и chrisogenum, P. глюкозы (из яичного
каталаза casei) порошка, мясных и др.
продуктов). Виноделие,
пивоваренная, консервная,
соковая и безалкогольная
промышленность
Пектиназа Многие Гидролиз галактуронана,
микроорганизмы осветление вина и
(Aspergillus фруктогвых соков
ssp.,Fusarium ssp.,
Penicillium ssp.и др.)
Целлюлаза Микроорганизмы Гидролиз целлюлозы до
: Closnridium ssp., глюкозы. Производство
Trichoderma пищевых и кормовых белковых
reesei, Alternaria препаратов, этанола, глюкозо-
tenuis фруктозных сиропов. Спиртовая,
пивоваренная,
пищеконцентратная
промышленность.
Пептидоги Поджелудочная Лизис белка. Получение
дролаза железа, и аминокислот, производство и
слизистая желудка получение сыра, размягчение
животных; плоды,
мясных и рыбных изделий,
побеги, отходы
переработки выделка кожи, активизация
некоторых пищеварения. Пивоварение,
растений (дыня, виноделие, хлебопечение,
инжир, ананас), пищевая промышленность,
микроорганизмы сельское хозяйство, медицина
(Bacillus ssp.,
Aspergillus ssp.,
Penicillium ssp.,
Streptomices ssp.)
Фрукто- Микроорганизм Инверсия сахарозы.
фурано ы: Кондитерская,
ликёроводочная,
-зидаза Aspergillus ssp., безалкогольная
Penicillium ssp., промышленность
Fusarium ssp., сиропопроизводство
Bacillus subtilis
 По прогнозам учёных, основным
потребителем ферментов в ближайшем
будущем остаётся пищевая
промышленность.
• Главное место среди этих энзимов
занимают глюкоизомераза и
глюкоамилаза, применяющиеся
для приготовления обогащённых
фруктозой кукурузных сиропов и
составляющие около 50% рынка
пищевых энзиматических
препаратов.
 Для деградации и модификации
органических соединений, поступающих в
окружающую среду, используют ферменты
пептидогидролазы (открыта А.Я. Данилевским в
1996 году)
Сущность:
• Сточные воды содержат аминокислоты и
пептиды, концентрация которых возрастает в
результате гидролиза белковых компонентов
отходов под воздействием пептидогидролаз.
Данная технология внедрена в большинстве
стран Европы, нацелена на производство в
промышленных масштабах кормовых белков из
аминокислот и пептидов сточных вод.
 Ферменты широко используют в
медицине, например в составе
лечебных препаратов.
• Амилазу и липазу применяют при
заболеваниях желудочно-кишечного тракта и
печени.
• Протеиназы в лечении злокачественных
новообразований. Это объясняется бóльшей
проницаемостью мембран раковых клеток для
ферментов в сравнении с нормальными
клетками, благодаря чему опухолевые клетки
быстро лизируются при введении смеси
протеиназ (препарат «папайотин»).
• Фермент плазмин используют для
растворения тромбов в кровеносных
сосудах;
• коллагеназу – для рассасывания
рубцовых образований;
• эластазу – для задержки развития
атеросклероза;
• лизоцим – для лечения
конъюнктивитов;
• дезоксирибонуклеазу из стрептококка
(стрептодорназа) – для лечения
заболеваний верхних дыхательных
путей и роговицы глаза.
применения ферментов в
медицине для
диагностики заболеваний
Тестирование патологии того или иного органа
человека по уровню активности фермента или
соотношению его множественных форм и
изоферментов, например :
• аспартатаминотрансфераза служит для выявления
инфаркта миокарда;
• аланинаминотрансфераза – для диагностики
заболеваний печени;
• глутамилтрансфераза – для блокировки отторжения
органов при их пересадке и т. д.
 Резюме
• Производство ферментных препаратов
занимает одно из ведущих мест в современной
биотехнологии и относится к тем её отраслям,
объём продукции которых постоянно растёт, а
сфера применения неуклонно расширяется.
• По объёму производства ферментов лидируют
страны Европы, но в последние годы
активизировались также США и Япония.
 Технология глубинного
культивирования
микроорганизмов – продуцентов
ферментов
• Ферменты присущи всем живым
существам, однако для их
выделения используют те
природные объекты, в которых
содержание искомого энзима
составляет не менее 1%.
 Для крупномасштабного
получения ферментов
пригодны:
• растительные организмы на
определённой фазе их развития:
проросшее зерно злаков и бобовых, сок
зелёной массы растений;
• отдельные органы и ткани животных:
поджелудочная железа, слизистая
оболочка желудочно-кишечного тракта,
сычуг крупного рогатого скота,
семенники половозрелых животных.
 Практически неограниченный
источник ферментов –
микроорганизмы:
• бактерии, грибы, дрожжи,
содержащие набор большинства
известных в настоящее время
энзимов, количество которых
можно повысить в десятки и сотни
раз методами мутагенеза и
индукции биосинтеза
• При извлечении ферментов из
растительного сырья и животных
тканей технология сводится
к экстракции энзимов и очистке их от
сопутствующих балластных
веществ
 Технология
культивирования
микроорганизмов.

• Получение посевного материала;

• Производство культуры
соответствующего микроорганизма;
• Экстракция энзимов и очистка их от
сопутствующих балластных
веществ
Для производства посевного
материала используют исходный
штамм продуцентов, получаемый из
лабораторных чистых культур,
который выращивают разными
способами на предварительно
стерилизованной твёрдой или
жидкой питательной среде до
определённого возраста. Посевной
материал консервируют
(высушиванием или хранением при
низких температурах) до
дальнейшего использования.
 глубинный метод
культивирования
Сначала ферментёр:
• заполняют питательной средой;
• затем автоклавируют;
• засевают чистой культурой, подаваемой
из специального генератора.
Для предотвращения инфекции в
ферментёре поддерживают повышенное
давление наряду с оптимальными
значениями рН и температуры.
 Технологическая схема глубинного культивирования
микроорганизмов:
1 - смеситель питательной среды; 2 - стерилизатор в непрерывном
режиме потока питательной среды; 3 и 4 - теплообменники;
5 - посевные аппараты; 6, 10, 12 - фильтры для очистки воздуха;

7 - ферментёр; 8, 9 - насосы; 11 - компрессор

 Проточный метод
культивирования
микроорганизмов
• Обеспечивает непрерывную подачу
в ферментёр как питательной
среды, так и посевного материала.
• Размножение микроорганизмов и
биосинтез фермента регулируют по
мере поступления питательной
смеси в ферментёр.
 Технологическая схема
непрерывного получения
β-галактозидазы
Такой ферментёр представляет собой
вращающийся трубкообразный реактор, через
один конец которого в него поступает
питательная среда и культура микроорганизмов,
а из другого – выводятся ферменты, продукты
жизнедеятельности и бактериальная масса.
Основное достоинство метода – возможность
длительное время поддерживать в
автоматическом режиме рост культуры
микроорганизма.
Например, культура аценобутиловых бактерий
находится в таком реакторе в состоянии
непрерывного размножения в течение 20 суток.
 Ферментные препараты
получают:
• Путём высушивания в мягком режиме культуры
микроорганизмов вместе с остатками питательной
среды;
• Путём упаривания экстракта из культуры продуцента,
выращенного поверхностным способом;
• Путём глубинного выращивания микроорганизмов, т. е.
из фильтрата культуральной среды;
• Путём применения метода ацетоновых порошков,
состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при
температуре не выше -10 С тканей или вытяжек из них,
содержащих ферменты.
• Препараты ферментов
представляют собой либо
высушенные до
порошкообразного состояния
продукты, либо жидкие
концентраты, характеризующиеся
50% - м содержанием сухой
массы веществ.
• Для выделения фермента из
клеточного содержимого
необходимо очень тонкое
измельчение исходного
материала путём разрушения
клеточных структур: лизосом,
митохондрий, ядер и др.
Для этого используют:
• Специальные мельницы и
гомогенизаторы;
• Ультразвук;
• Метод попеременного
замораживания и оттаивания ткани.
• В настоящее время из 2003
включённых в список известных в
настоящее время ферментов более
1500 выделено и в той или иной
степени очищено. Это служит базой
для дальнейшего изучения физико-
химических основ их химического
производства на промышленном
уровне.