Изучение дегрануляции

ней трофилов под дей ствием

лактоферрина из различных
источников
 Лактоферрин
• Лактоферрин – негемовый железосвязывающий гликопротеин,
относящийся к семейству трансферринов.
• Молекула состоит из аминокислотных остатков. Молекулярная
масса составляет
• Полипептидная цепь может быть разделена на две гомологичные
глобулярные доли, в которых совпадают 37% аминокислот.
• Структура поддерживается
16 дисульфидными связями,
6 пар из которых
эквивалентны в обеих
долях, а 4 остальных
находятся в С-доле.
2

Лактоферрин, выделенный из
грудного молока человека
 Роль Лф
антибактериальное
действие
противовирусное действие
противовоспалительное фунгицидное действие
действие
противоопухолевое
действие
участие в связывании и
протеиназная
транспорте ионов железа
активность
транскрипционный Лактоферрин фосфатазная
фактор активность

ингибитор протеиназ амилазная

активность
фактор роста АТФазная
активность
образование
0 комплексов
2 4 ДНКазная
6 РНКазная
8 10 3
с биополимерами активность активность
Источники Лф
• Был найден в секретах практически всех экзокринных
желез (слезы, слюна, желчь, панкреатический сок и т.д.)
• Является наиболее распространенным белком в молоке
после казеинов
• Содержится в специфических гранулах нейтрофилов

4
Синтез Лф
• Рекомбинантный Лф (рЛф) получают с помощью
организмов-реакторов: трансгенные коровы и козы,
куриные яйца, трансгенный рис и т.д.
• В Беларуси были созданы первые опытные стада
трансгенных коз, из молока которых выделяют рЛф человека

5
Цели и задачи
Цель
Исследовать действие рекомбинантного лактоферрина из
молока трансгенных коз и сравнить его действие с
лактоферрином из других источников на функциональные
ответы нейтрофилов.
Задачи:
1. Исследовать дегрануляцию нейтрофилов по выходу эластазы
при действии лактоферринов из разных источников:
а) рЛф из молока трансгенных коз (рЛф)
б) Лф из грудного молока (чЛф)
в) Лф из молока коровы (кЛф)
2. Изучить действие различных Лф на изменение
6
внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция в
нейтрофилах
Материалы и методы
В работе использовали :
• рЛф, выделенный из молока трансгенных коз (предоставлен
сотрудниками кафедры биохимии Белорусского государственного
университета);
• чЛф, выделенный из донорского грудного молока (предоставлен
сотрудниками «НИИ экспериментальной медицины», г. Санкт-Петербург);
• кЛф, выделенный из молока коровы (предоставлен сотрудниками «НИИ
экспериментальной медицины», г. Санкт-Петербург).

7
Основной объект исследования
Нейтрофилы представляют собой основные клетки
врожденного иммунитета, осуществляющие защиту
организма-хозяина от патогенов.
Функциональные ответы нейтрофилов:
• хемотаксис
• адгезия
• продукция активных форм кислорода
• секреторная дегрануляция
• фагоцитоз
• апоптоз

8
 Исследование дегрануляции
ней трофилов при дей ствии Лф из
разных источников
• Дегрануляцию нейтрофилов оценивали по выходу из клеток эластазы.
Активность эластазы в суспензии активированных нейтрофилов
оценивали флуоресцентным методом с применением субстрата
эластазы (MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA) (длина волны возбуждения
флуоресценции – 380 нм, регистрации – 460 нм).
1 - без активатора
2 - fMLP
аминометилкумарина, усл. ед.

30
Интенсивность ФЛ

нейтр.+ СЭ
+ cyth B активатор
20

10

9
0
3 4 5 6 7

Время, мин
 Влияние различных форм Лф на
экзоцитоз эластазы кЛф
рЛф
0,75 *
чЛф
0,70 *

Активность эластазы, усл.ед.

0,65
*
0,60

0,55
* *
0,50

0,45 * *

0,40

0,35
Экзоцитоз эластазы: 0,30

рЛф > кЛф > чЛф 0,25

0,20

0 200 400 600 800 1000

Концентрация белка, мкг/мл

10
Максимальный эффект был получен для рЛф. Максимальная
активность наблюдается при концентрации 250 мкг/мл и выше
Механизмы агонист-индуцированной
дегрануляции ней трофилов

[Lacy P. / Mechanisms of
degranulation in
neutrophils. - Allergy 11
Asthma Clin. Immunol. -
2006. - Vol. 2(3). - P. 98–
108. ]
Исследование влияния Лф из разных
источников на изменение [Ca2+]i в
ней трофилах
• Внутриклеточную концентрацию свободных ионов кальция ([Ca2+]i)
в нейтрофилах определяли с применением флуоресцентного
зонда fura2-АМ. Регистрацию флуоресценции проводили на длине
волны 510 нм (возбуждение – 340 нм и 380нм) при 37 °С.
300
1 - fMLP
250
2 - рЛф

200
[Ca ]i , нМ

150
2+

100

активатор
50
12
0
2 4 6 8 10

Время, мин
 Влияние различных форм Лф на изменение
[Ca2+]i в ней трофилах
300
*
250 *
300
250 мкг/мл
[Ca ]i, нМ

*
200
250
*
2+

[Ca ]i, нМ
150
200

2+
100 150

100
50
базальный уровень
50
0 100 200 300 400 500

Концентрация рЛф, мкг/мл 0

кЛф рЛф чЛф

• рЛф вызывает наибольший эффект. Максимальный рост [Ca2+]i

достигнут при концентрации рЛф 250 мкг/мл. 13
• [Ca2+]i : рЛф > кЛф > чЛф
Выводы по результатам работы:
1. Установлено, что рЛф стимулирует дозозависимое
высвобождение эластазы в процессе дегрануляции
нейтрофилов. Максимальный эффект наблюдается при
концентрации белка 250 мкг/мл.
2. Показано, что способность рЛф активировать
дегрануляцию нейтрофилов выше по сравнению с
эффектом чЛф и кЛф.
3. Выявлено, что рЛф и кЛф вызывают увеличение
внутриклеточной концентрации свободных ионов
кальция в нейтрофилах. Таким образом, ионы кальция
вовлечены в активацию дегрануляции при действии Лф.
14
Спасибо за внимание!

15