1. Необходимость регуляции клеточного метаболизма.

Общая
характеристика регуляторных механизмов.
Клетки микроорганизмов находятся в непосредственном контакте с
окружающей средой, зачастую на наш взгляд весьма далекой от оптимальной
для поддержания жизни. Условия среды не являются постоянными,
следовательно, бактерии должны обладать способностью либо быть всегда
готовыми ко всем подстерегающим их неожиданностям, либо
подстраиваться” к изменяющимся условиям. Обмен веществ и энергии
(метаболизм) осуществляется на всех уровнях организма: клеточном,
тканевом и организменном. Он обеспечивает постоянство внутренней среды
организма - гомеостаз - в непрерывно меняющихся условиях существования.
В клетке протекают одновременно два процесса - это пластический обмен
(анаболизм или ассимиляция) и энергетический обмен (фатаболизм или
диссимиляция).
Пластический обмен - это совокупность реакций биосинтеза, или
создание сложных молекул из простых. В клетке постоянно синтезируются
белки из аминокислот, жиры из глицерина и жирных кислот, углеводы из
моносахаридов, нуклеотиды из азотистых оснований и сахаров. Эти реакции
идут с затратами энергии. Используемая энергия освобождается в ходе
энергитического обмена. Энергетический обмен - это совокупность реакций
расщепления сложных органических соединений до более простых молекул.
Часть энергии, высвобождаемой при этом, идет на синтез богатых
энергетическими связями молекул АТФ (аденозин-трифосфорной кислоты).
Расщепление органических веществ осуществляется в цитоплазме и
митохондриях с участием кислорода. Реакции ассимиляции и диссимиляции
тесно связаны между собой и внешней средой. Из внешней среды организм
получает питательные вещества. Во внешнюю среду выделяются
отработанные вещества.
Ферменты (энзимы) - это специфические белки, биологические
катализаторы, ускоряющие реакции обмена в клетке. Все процессы в живом
организме прямо или косвенно осуществляются с участием ферментов.
Фермент катализирует только одну реакцию или действует только на один
тип связи. Этим обеспечивается тонкая регуляция всех жизненно важных
процессов (дыхание, пищеварение, фотосинтез и т.д.), протекающих в клетке
или организме. В молекуле каждого фермента имеется участок,
осуществляющий контакт между молекулами фермента и специфического
вещества (субстрата). Активным центром фермента выступает
функциональная группа (например, ОН - группа серина) или отдельная
аминокислота.
Скорость ферментативных реакций зависит от многих факторов:
температуры, давления, кислотности среды, наличия ингибиторов и т.д.
2. Значение контроля метаболизма клеток продуцентов в
биотехнологических процессах.
Главным звеном биотехнологического процесса, определяющим всю его
сущность, является биологический объект, способный осуществлять
определенную модификацию исходного сырья и образовывать тот или иной
необходимый продукт. В качестве таких объектов биотехнологии могут
выступать клетки микроорганизмов, животных и растений, трансгенные
животные и растения. Основой большинства соврем биотехнологических
производств является микробный синтез. Главным критерием при выборе
биотехнологического объекта (в нашем случае микроорганизма-продуцента)
является способность синтезировать целевой продукт; обладать высокой
скоростью роста; утилизировать необходимые для их жизнедеятельности
дешевые субстраты; быть резистентными к посторонней микрофлоре, т.е.
обладать высокой конкурентоспособностью.Все вышеперечисленное
обеспечивает значительное снижение затрат на производство целевого
продукта.
Изменения скорости бх реакций у бактерий может осуществляться двумя
путями. Один из них очень быстрый (реализующийся в течение секунд или
минут) заключается в изменении каталитической активности
индивидуальных молекул фермента. Второй, более медленный (реализуется в
течение многих минут), состоит в изменении скоростей синтеза ферментов. В
обоих механизмах используется единый принцип управления системами -
принцип обратной связи, хотя существуют и более простые механизмы
регуляции активности метаболизма клетки.
Самый простой способ регуляции любого метаболического пути
основывается на доступности субстрата или наличии фермента. Снижение
кол-ва субстрата (его концентрации в среде) прив к сниж скорости потока в-
ва ч-з данный метаболический путь. Повышение концентрации субстрата
прив к стимулированию метаболического пути. Поэт наличие/доступность
субстрата следует рассматривать как потенциальный механизм любого
метаболического пути. Иногда эффективным средством повышения выхода
целевого продукта является увеличение концентрации в клетке какого-либо
определенного предшественника.Аналогичный эффект может быть получен
и в рез-те повыш концентрации ферментов, что достигается, например,
амплификацией генов, контролирующих синтез соответствующего фермента.
Наиб распространенным способом регуляции активности метаболических
реакций в клетке является регуляция по типу ретроингибирования.
Изменяя рег-цию индуцибельных и репрессибельных оперонов, сущ
возм-ть повышать продукционную активность определенных промышленных
штаммов-продуцентов. Структурные гены одного метаболического пути не
всегда объединены в единый оперон (наподобие лактозному), однако это не
мешает их регуляции с помощью индукции или репрессии. Так, например,
гены E. coli, детерминирующие структуру ферментов, обеспечивающих
биосинтез аргинина, располагаются в различных областях хромосомы, но все
контролируются одним и тем же геном-регулятором. Такая система образует
регулон. Примером является SOS-регулон, гены кот детерминируют стр-ру
более десятка различн Б и Ф, участв в репарации повреждений ДНК клетки.
 3. Уровни регуляции метаболизма у бактерий. Дополнительные
уровни регуляции метаболизма у эукариот.
Метаболитный уровень регуляции. Формы регуляции обмена веществ
при участии метаболитов крайне многообразны. Простейшая из них сводится
к ускорению или замедлению биохимических процессов за счет недостатка
или избытка тех соединений, которые являются участниками
соответствующих реакций. Так, объем белкового синтеза у гетеротрофов
лимитируется поступлением незаменимых аминокислот и интенсивностью
синтеза полузаменимых аминокислот. Более сложный характер носит
регуляция обмена веществ за счет конкурентных взаимоотношений тех
обменных процессов, которые замыкаются на общие метаболиты,
относящиеся, как правило, к категории ключевых: пиро-виноградную,
щевелевоуксусную и а-кетоглутаровую кислоты, ацетил-КоА, глюкозо-6-
фосфат. Многочисленные примеры такого рода приведены в разделе о
взаимосвязи обмена веществ в начале этой главы. Велика роль в регуляции
обменных процессов ряда низкомолекулярных соединений, относящихся к
разряду биологически активных,— витаминов, антивитаминов, коферментов,
гормонов, антигормонов, вторичных посредников и др.
Клеточный уровень регуляции. К регуляторным процессам на уровне
клетки относятся: ядерно-цитоплазменные отношения; осттранскрипционная
и посттрансляционная модификация макромолекул; транспорт веществ через
мембраны субклеточных частиц и мембраны эндоплазматической сети;
макромоле-кулярные (белок-белковые, белково-нуклеиновые, углеводно-
белковые и липид-белковые) взаимодействия и др.
Популяционный уровень регуляции. Суть его сводится к мощному
влиянию химических соединений, вырабатываемых и выделяемых одними
особями, на обмен веществ и поведенческие реакции других особей. Оно
реализуется через рецепторные системы или ткани-мишени организма
реципиента: фитонциды—антибактериальные вещества, вырабатываемые
здоровыми растениями; фитоалексины—защитные соединения,
образующиеся в растениях в ответ на бактериальное или грибковое
заражение; новые виды антибиотиков, фитогормонов, нейрогормонов
 Оперонный. Оперон-упорядоченная совокупность цистронов,
считываемая как единое целое при синезе мРНК на ДНК.В случае
моноцистронного оперона на нем синтезируется мРНК для биосиннтеза
единственного белка. При полицистронном – синтез неск МРНК кодируют
различн Б.На этом уровне проих регуляция синтезагистонов и др негистон Б
I- дотранскрипционный (метилирование ДНК) - cell cycle;
спирализация хроматина у эукариот
II- II – транскрипционный:а) инициация (промоторы+регуляторные
белки)
б) терминация (аттенуация и антитерминация)
III – посттранскрипционный:а) стабильность мРНК (rpoS) б) инициация
трансляции
IV – посттрансляционный: регуляция метаболизма посредством белок-
белковых взаимодействий и модификации белков; аллостерическая
регуляция (хемотаксис)
4. Принципы транскрипционной регуляции
Исторически сложилось так, что первые работы по регуляции
метаболизма были сделаны при изучении утилизации лактозы бактериями
Escherichia coli. Для описания лактозного метаболизма Жакоб и Моно в 1961
г. ввели термин "оперон". Оперон, как вы помните, представляет собой
группу из двух или более структурных генов (иногда говорят и о
моноцистронных, т.е. содержащих один ген,оперонах), кодирующих тесно
связанные между собой функционально белки, совместно транскрибируемых
и находящихся под общим контролем.
Рассмотрим структуру абстрактного оперона подробнее. Он состоит из
следующих элементов:
1. Промотор - участок ДНК, с которым происходит связывание РНК-
полимеразы и который определяет точку начала транскрипции. Типичный
пример - TTGACA - 17 bp - TATAAT. В зависимости от типа промотора (а
точнее, от типа распознающей его сигма - субъединицы РНК полимеразы)
конкретная последовательность промотора варьирует.
2. Operator - участок связывания регуляторного белка. Размер - около 20
bp. Располагается в близости к промотору или перекрывается с ним. В
случае негативных регуляторов, или репрессоров, оператор, как правило,
располагается непосредственно за промотором, или перекрывается с ним. В
случае позитивных регуляторов (активаторов) оператор обычно располаг
перед промотором. В любом случае связывание регуляторного Б с ператором
меняет частоту инициации транскрипции. У многих (возможно, у
большинства) оперонов имеется не один, а неск сайтов связывания с
регуляторн белками, которые не обязательно располагаются рядом и могут
вообще находиться по разные стороны от промотора. В этих случаях термин
"оператор" в классическом смысле становится неудобным, в связи с чем
сейчас чаще просто говорят о сайтах связывания регуляторов.
3. Структурные гены. Кодируют белки, непосредственно производящие
фенотипический эффект.Именно для контроля их экспрессии, собственно, и
существуют оперонные структуры вместе со своими регуляторами.
4. Терминатор транскрипции. Здесь заканчивается синтез мРНК.Не
входит в оперон, но является необходимой частью регуляторной системы
ген-регулятор,кодирующий регуляторный белок, связывающийся с
оператором. Ген-регулятор может находитьсярядом с контролируемым им
опероном, но часто располагается совсем в другом участке хромосомы.Почти
всегда у гена-регулятора свой промотор и терминатор.В регуляции частвуют,
как правило, и низкомолекулярные вещества-эффекторы, являющиеся либо
индукторами, либо корепрессорами структурных генов.
В зависимости от влияния на их работу низкомолекулярных молекул-
эффекторов различают индуцибельные и репрессибельные (-руемые)
опероны. В зависимости от эффекта связывания регуляторного белка с
оператором опероны могут иметь негативный или позитивный контроль.

5. . Единица транскрипции. Опероны у про- и эукариот

Строение оперона прокариот Оперон -- способ организации генетич
материала у прокариот, при котором цистроны (гены, единицы
транскрипции), кодирующие совместно или последовательно работающие
белки, объединяются под одним (или несколькими) промоторами. Такая
функциональная организация позволяет эффективнее регулировать
экспрессию (транскрипцию) этих генов.Концепцию оперона для прокариот
предложили в 1961 году французские ученые Жакоб и Моно, за что получили
Нобелевскую премию в 1965 году.Опероны по количеству цистронов
классифицируют на моно-, олиго- и полицистронные, содержащие,
соответственно, только один, несколько или много цистронов (генов).
В состав оперона прокариот входят структурные гены и регуляторные
элементы. Структурные гены кодируют белки, осуществляющие
последовательно этапы биосинтеза какого-либо вещества. Этих генов может
быть один, два или несколько. Они тесно сцеплены друг с другом и, что
самое главное, в ходе транскрипции работают как один единый ген: на них
синтезируется одна общая молекула иРНК, которая лишь потом
расщепляется на несколько иРНК, соответствующих отдельным генам.
Регуляторными элементами являются следующие:
- промотор -- участок связывания фермента, осуществляющего
транскрипцию ДНК - РНК-полимеразы. Является местом начала
транскрипции. Представляет собой короткую последовательность из
нескольких десятков нуклеотидов ДНК, с которой специфически связывается
РНК-полимераза. Кроме того, промотор определяет, какая из двух цепей
ДНК будет служить матрицей для синтеза иРНК;
- оператор - участок, которому присоединяется репрессор, который не
дает РНК-полимеразе двигаться по ДНК.
- терминатор - участок, в котором РНК-полимераза отсоединяется от
ДНК.
Регуляторные белки бывают двух типов: белок-репрессор или белок-
активатор. Они присоединяются к специфическим нуклеотидным
последовательностям ДНК оператора, что либо препятствует транскрипции
генов (негативная, отрицательная регуляция), либо способствует ей
(позитивная, положительная регуляция); механизмы их работы
противоположны. Кроме того, на работу белков-репрессоров могут влиять
вещества -- эффекторы: соединяясь с репрессором, они влияют на его
взаимодействие с оператором.
У эукариотов известны и другие типы регуляции активности генов, такие
как эффект положения или дозовая компенсация. В первом случае речь идет
об изменении генной активности в зависимости от конкретного окружения:
перемещение гена из одного места хромосомы в другое может приводить к
изменению активности как этого гена, так и близлежащих. Во втором случае
нехватка одной дозы какого-либо гена (в первую очередь это относится к
генам, локализованным в половых хромосомах гетерогаметного пола, когда
одна из гомологичных половых хромосом либо генетически инертна, либо
полностью отсутствует) фенотипически не проявляется за счет
компенсаторного увеличения активности оставшегося гена. В целом же
регуляция активности генов у эукариотов изучена недостаточно.
Активатор,промотор,оператор,терминатор
Единицей транскрипции у прокариот могут быть отдельные гены, но
чаще они организованы в структуры, называемые оперонами. В состав
оперона входят расположенные друг за другом структурные гены, продукты
которых обычно участвуют водном и том же метаболическом пути. Как
правило, оперон имеет один набор регуля-торных элементов (регуляторный
ген, промотор, оператор), что обеспечивает координацию процессов
транскрипции генов и синтеза соответствующих белков.
Промотор - это участок ДНК, ответственный за связывание с РНК-
полимеразой. В случае прокариот, наиболее важными для регуляции
транскрипции являются последовательности, обозначаемые «--35» и «-- 10».
Нуклеотиды, расположенные до инициирующего кодона («вверх по
течению») записываются со знаком «-», а со знаком «+» - все нуклеотиды,
начиная с первого в инициирующем кодоне (стартовая точка). Направление,
в котором продвигается процесс транскрипции, называется «вниз по
течению».
 Последовательность, обозначаемая «-35» (TTGACA), отвечает за
узнавание промотора РНК-полимеразой, а последовательность «-10» (или
бокс Прибнова) является тем участком, с которого начинается раскручивание
двойной спирали ДНК. В состав этого бокса наиболее часто входят
основания ТАТААТ. Такая последовательность оснований чаще всего
встречается в промоторах прокариот, ее называют консенсусной. В состав
ТАТА-бокса входят аденин и тимин, между которыми имеются только две
водородные связи, что облегчает расплетание цепей ДНК в этом районе
промотора. В случае замен пар оснований в указанных последовательностях
промотора нарушается эффективность и правильное определение точки
начала транскрипции, с которой фермент РНК-полимераза начинает синтез
РНК. У прокариот наряду с промотором имеются и другие регуляторные
участки: это активатор и оператор.
Оператор - участок ДНК, с которым связывается белок-репрессор, мешая
РНК-полимеразе начать транскрипцию.
В лактозном опероне левая часть промотора (активатор), связывается с
белком-активатором катаболизма (БАК, или САР в английской
терминологии, catabolite activator protein), а правая часть -- с РНК-
полимеразой. БАК-белок в отличие от белка-репрессора играет позитивную
роль, помогая РНК-полимеразе начать транскрипцию.

6. Инициация и терминация транскрипции как процессы, в наибольшей

степени подверженные контролю.
РНК-полимераза E.coli осуществляет транскрипцию всех бактериальных
генов и состоит из нескольких субъединиц: α-35кДа, β‘-165кДа, β-155кДа, σ-
чаще 70кДа (σ70). РНК-полимераза состава ααββ’σ70 называется holo-
фермент (Еσ70), состава ααββ’- core-фермент (E).
σ - сменный фактор специфичности, который диссоциирует после инициации
транскрипции. Элонгация и терминация осуществляется core-ферментом. У
Е.coli ~10 видов σ-субъединиц. Транскрипция генов теплового шока, σ54 в
составе holo-фермента Eσ54 (54 кДа).Все субъединицы заряжены
отрицательно: σ>α>β>β’ – расположены по убыванию заряда. В каждой
субъединице имеется кластер (+)-заряженных участков, которыми они
связываются с ДНК. Наибольшее число кластеров у – β’, который участвует в
связывании фермента с ДНК, β-субъединица содержит активные центры -
инициации и элонгации, α-субъединицы обеспечивают правильное
взаимодействие фермента с промоторами. Рифампицин – блокирует
инициацию, стрептолидигин – блокирует элонгацию, что говорит о
разнесении активных центров в РНК-полимеразе.
Узнавание и связывание RNA-pol с промотором осуществляется holo-
ферментом. Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул РНК-
полимеразы. Только holo-фермент обладает высоким сродством к
специфической последовательности нуклеотидов - промотору. У core-
фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.
Сам по себе сигма - фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по
сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает
holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным
сродством к промотору. Стадии узнавания и связывания, а также инициации
осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются
core-ферментом. Инициация. Последовательность ДНК, транскриби-
рующаяся в одну иРНК, начинающаяся промотором на 5'-конце и
заканчивающаяся терминатором на 3'-конце, является единицей
транскрипции и соответствует современному понятию «ген». Контроль
экспрессии генов может осуществляться на этапе инициации транскрипции.
На этом этапе РНК-полимераза распознает промотор — фрагмент длиной 41-
44 п.н. Транскрипция ДНК происходит в направлении 5'—3', или слева
направо. Предполагается, что последовательность ТАТА контролирует выбор
стартового нуклеотида, а ЦААТ — первичное связывание РНК-полимеразы с
ДНК-матрицей.
         Терминация. Транскрипция завершается в специфическом участке
ДНК, содержащем терминирующую последовательность. В клетках Е.
сoli выявлен особый белок (ро-фактор), повышающий точность терминации.
Белок присоединяется к 5'-концу растущей иРНК и продвигается по ней,
постепенно приближаясь к ДНК и как бы преследуя РНК-полимеразу. В
момент, когда РНК-полимераза останавливается в сайте-терминаторе,
фермент захватывается ро-фактором и сбрасывается с ДНК. Терминатор
содержит особую последовательность оснований, прочитывающуюся
одинаково в обеих цепях ДНК, но в противоположных направлениях.
7.Регуляторные белки (транскрипционные факторы): структура,
связывание с ДНК, взаимодействие с РНК-полимеразой и между собой
Регуляторные белки бывают двух типов: белок-репрессор или белок-
активатор. Они присоединяются к специфическим нуклеотидным
последовательностям ДНК оператора, что либо препятствует транскрипции
генов (негативная, отрицательная регуляция), либо способствует ей
(позитивная, положительная регуляция); механизмы их работы
противоположны. Кроме того, на работу белков-репрессоров могут влиять
вещества -- эффекторы: соединяясь с репрессором, они влияют на его
взаимодействие с оператором.
У прокариот, если какой-нибудь участок транскрибируется, то он
автоматически транслируется, т. е. регуляция синтеза белка у прокариот
осуществляется на уровне транскрипции.
У эукариот транскрипция и трансляция пространственно разделены
(транскрипция в ядре, трансляция в цитоплазме) , и регуляция синтеза белка
происходит в три этапа

транскрипция
экспорт из ядра
трансляция

Регуляция синтеза белка у эукариот осуществляется в основном на уровне

трансляции, когда регуляторные вещества присоединяются к управляющим
участкам 3’-НТО и 5’-НТО.
5'-НТО отвечает за частоту трансляции
3'-НТО отвечает за время жизни иРНК в цитоплазме.
Транскрипция у эукариот регулируется почти так же, как у прокариот.
Разница: у эукариот транскрипция может не только подавляться
репрессорами, присоединенными к операторам, но и стимулироваться
активаторами, присоединенными к энхансерам опероны у эукариот
пространственные, т. е. участок, к которому присоединен репрессор, может
находиться не в том же участке хромосомы, где лежат промотор и
структурные гены, и приближаться к ним за счет укладки ДНК в
интерфазном ядре.

8. Механизм репрессии и активации транскрипции.

Активность многих генов прокариот регулируется с помощью белковых
факторов, взаимодействующих с регуляторными участками промоторов
генов. При этом происходят как активация транскрипции генов, так и
подавление считывания генетической информации РНК- полимеразами. В
первом случае регуляторные белковые факторы называют активаторами ,
осуществляющими позитивную регуляцию транскрипции , а во втором
- репрессорами . Регуляцию, связанную с подавлением транскрипции,
называют негативной .
Активация промоторов путем образования открытых комплексов является
лимитирующей стадией на пути активации транскрипции в целом. Так, при
действии активирующего комплекса Crp-цАМФ на lac-промотор происходит
десятикратное увеличение равновесной константы ассоциации РНК-
полимеразы с промотором с образованием закрытого комплекса. 
Необходимым условием активации является наличие контакта между
специфическими областями поверхностей молекул активатора и РНК-
полимеразы, часто с ее альфа-субъединицами . Следствием образования
контактов между активаторами и холоферментом РНК-полимеразыявляется
синергизм в связывании обоих белков с соответствующими промоторами. 
Последовательности нуклеотидов промоторных участков генов, с которыми
взаимодействуют молекулы репрессора, получили название операторов . Во
многих случаях репрессор связывается с оператором только в присутствии
низкомолекулярного лиганда, специфически взаимодействующего с
репрессором. Такие низкомолекулярные эффекторы получили название
корепрессоров . Они часто требуются для функционирования белков-
активаторов транскрипции.
Простейший механизм репрессии заключается в блокировании связывания
РНК-полимеразы с промотором. Это происходит в том случае, если
последовательности нуклеотидов мест посадки РНК-полимеразы на
промотор и репрессора на оператор перекрываются.
 У бактерий имеются белки-регуляторы, обладающие активностью как
репрессора, так и активатора транскрипции, например, репрессор cI фага
лямбда.
9. Основные белковые домены, узнающие специфические
последовательности ДНК (спираль-поворот-спираль, спираль-петля-
спираль, гомеодомен, "лейциновая застежка", "цинковые пальцы").

Регуляторные элементы ДНК могут оказывать свое влияние на

транскрипцию гена лишь опосредованно, через регуляторные белки. Белки,
регулирующие транскрипцию благодаря их собственному
высокоспецифическому взаимодействию с ДНК или взаимодействию с
другим ДНК-связывающим белком, называют транскрипционными
факторами (TФ). Регуляторные белки имеют домены для прикрепления к
определенному регуляторному элементу ДНК и домены для белок-белковых
взаимодействий. Для связывания с ДНК регуляторным белкам служат
типичные фрагменты вторичной структуры – ДНК-связывающие мотивы.
Известен целый ряд таких мотивов: “цинковые пальцы”, “спираль-
поворот-спираль”, “лейциновая застежка”, “спираль-петля-спираль” и
другие.
Домены типа "цинковые пальцы". Одним из первых факторов
транскрипции, полученных в виде очищенного рекомбинантного белка, был
фактор TFIIIA, который играет ключевую роль в транскрипции генов 5S
рРНК РНК-полимеразой III. ДНК-связывающий участок полипептидной
цепи этого фактора содержит девять 30-звенных повторов. Каждый из
повторов содержит две строго консервативные пары остатков Cys(цистеин) и
His(гистидин), которые взаимодействуют с одним ионом цинка. Это
приводит к образованию в свернутой полипептидной цепи пространственной
структуры, сформированной несколькими остатками основных аминокислот.
Структура выступает над поверхностью белковой глобулы в виде "пальца".
Домены типа "цинковые пальцы" обнаружены у многих факторов
транскрипции, обеспечивающих функционирование РНК-полимеразы II.
Факторы транскрипции, содержащие мотив "спираль–поворот–
спираль". Другой тип пептидных доменов, специфически распознающих
регуляторные последовательности на ДНК, характерен для белковых
продуктов гомеотических (гомеозисных) генов, впервые обнаруженных у
дрозофилы.
Полипептидные цепи белков, кодируемых этими генами, содержат
высококонсервативную последовательность длиной в 60 аминокислотных
остатков, называемую гомеобоксом, или гомеодоменом, которая определяет
специфичность взаимодействия белков с регуляторными
последовательностями ДНК. Анализ третичной структуры гомеодоменов
показал, что они образуют структуру типа "спираль–поворот–спираль"
(helix–turn–helix), в которой за α-спиральным участком следует β-структура с
последующим еще одним α-спиральным участком.
ДНК-связывающий домен типа "лейциновая застежка". В этой структуре
остатки Leu(лейцин) расположены через каждые шесть аминокислотных
остатков на равном расстоянии друг от друга и оказываются на одной
стороне α-спирали через каждые два витка. Такие домены сами по себе не
связываются с ДНК, однако обеспечивают димеризацию содержащих их
факторов. В результате в димере появляются две правильно расположенные
друг относительно друга полипептидные цепи, составленные
преимущественно из основных аминокислотных остатков, которые и
образуют ДНК-связывающий центр фактора транскрипции.
Спираль-петля-спираль – симметричный элемент третичной
(пространственной) структуры некоторых ДНК-связывающихся белков,
многие из которых участвуют в регуляции экспрессии генов - например,
рилизинг-фактор (нейрогормон) пролактина состоит из 56 аминокислот и
включает 2 “спирали” (в каждой по 14 остатков), соединенные “петлей” из 4
аминокислот.
10. Модули последовательностей ДНК, узнаваемые регуляторными
белками (промоторы и энхансеры, операторы).
Единицей регуляции экспрессии генов у прокариот является оперон. Оперон
– это участок ДНК, ограниченный с одной стороны промотором (это
регуляторный уч-к ДНК, который служит для присоединения РНК-
полимеразы к молекуле ДНК.), с другой – терминатором (это регуляторный
участок ДНК, который служит для отсоединения РНК-полимеразы после
окончания синтеза мРНК.). Оперон кодирует одну молекулу мРНК, на основе
которой позже могут синтезироваться один или несколько белков. В опероне
имеется оператор.
Оператор – это регуляторный уч-к ДНК, который способен присоединять
белок-репрессор, который кодируется соответствующим геном. Если
репрессор присоединен к оператору, то РНК-полимераза не может двигаться
вдоль молекулы ДНК и синтезировать мРНК.
У эукариот регуляторные элементы собраны в регуляторные регионы.
Основной регуляторный элемент эукариот – это коровый (базальный)
промотор. Он обеспечивает сборку базального транскрипционного
комплекса (из основных факторов транскрипции и РНК-полимеразы) и
инициацию транскрипции на базальном (исходном, базовом) уровне. Часто
этот уровень так низок, что приводит к синтезу лишь единичных молекул
РНК и, в дальнейшем, белков. Кроме корового промотора, экспрессия гена
эукариот контролируется энхансерами (усилителями транскрипции – от
англ. enhancer) и сайленсерами (глушителями, успокоителями, от англ.
silencer) – регионами, подавляющими транскрипцию), которые могут быть
расположены на ДНК очень далеко от точки начала транскрипции. На ДНК
также имеются инсуляторы – это “пограничные столбы”, определяющие
зону действия данного энхансера или сайленсера. Транскрипция одного гена
обычно зависит от суммы воздействий целого набора энхансеров,
сайленсеров и других регуляторных районов ДНК.

11. Промоторы эукариот: размеры, положение, структура и механизм

распознавания различными РНК-полимеразами.
 В соответствии с биохимическими критериями промотор представляет
собой последовательность нуклеотидов, обеспечивающую базальный (но не
максимальный) уровень транскрипции соответствующего транскриптона. Он
является той минимальной последовательностью, которая специфически
распознается холоферментом РНК-полимеразы среди случайных
последовательностей нуклеотидов.
Бактериальный промотор содержит две канонические последовательности: в
области -35 и в области -10.
Промотор эукариотических генов, узнающийся РНК-полимеразой
промотор содержит два базовых регуляторных элемента: ТАТА-
последовательность (положение -25) и специфическую нуклеотидную
последовательность, обогащенную пиримидинами в положении -75.
Основной элемент промотора - место связывания РНК-полимеразы,
которое она занимает перед началом синтеза РНК. В состав промоторов
могут входить также участки связывания белков-регуляторов.
У эукариот регуляторные элементы собраны в регуляторные регионы.
Основной регуляторный элемент эукариот – это коровый (базальный)
промотор. Он обеспечивает сборку базального транскрипционного
комплекса (из основных факторов транскрипции и РНК-полимеразы) и
инициацию транскрипции на базальном (исходном, базовом) уровне. Часто
этот уровень так низок, что приводит к синтезу лишь единичных молекул
РНК и, в дальнейшем, белков.
12. Промоторные элементы, контролирующие точку инициации и
интенсивность транскрипции.
Промоторы, узнаваемые РНК-полимеразой II, содержат три различных
семейства регуляторных последовательностей ДНК. Последовательности
первого семейства включают так называемые коровые, или базальные
элементы промотора, расположенные вблизи точки инициации
транскрипции. В настоящее время известны два класса базальных
элементов: TATA-последовательность, расположенная за 25–30
нуклеотидов до точки инициации (каноническая последовательность –
TATAa/tAa/t), и так называемый инициатор (Inr), последовательность
которого обогащена пиримидинами. Элементы TATA-последовательности и
инициатор необходимы для сборки ДНК-белкового инициационного
комплекса и распознаются основными факторами транскрипции. Промоторы
РНК-полимеразы II содержат один или оба регуляторных элемента или же не
имеют их вообще. При этом оба элемента могут функционировать
независимо друг от друга или же в их действии наблюдается синергизм.
К двум другим классам цис-регуляторных промоторных элементов у
эукариот относятся последовательности, расположенные вблизи промотора
(от 50 до нескольких сотен пар оснований перед точкой инициации), а также
дистальные элементы (энхансеры и сайленсеры), расстояние которых от
промотора может превышать 60 т.п.о. Оба класса таких последовательностей
содержат сайты связывания регуляторных белков, модулирующих
транскрипцию.
У некоторых промоторов, в частности ассоциированных с генами
домашнего хозяйства, может отсутствовать явно выраженная TATA-
последовательность. Проксимальные и дистальные регуляторные элементы
промоторов построены из коротких транскрипционных элементов длиной в
10–15 п.о., с которыми непосредственно взаимодействуют факторы
транскрипции. Проксимальные регуляторные элементы, как правило, имеют
простую структуру, включающую один или несколько транскрипционных
элементов (ТЭ).

13. Транскрипционный контроль

Регуляторная часть гена эукариот включает цис-регуляторные элементы
(промотор, который граничит с открытой рамкой считывания гена) и транс-
регуляторные элементы (энхансеры, сайленсеры, аттенюаторы и инсуля-
торы) которые расположены далеко от кодирующей части гена (на
расстоянии миллионов пар нуклеотидов).
В составе генов эукариот есть много регуляторных элементов. Для генов,
которые экспрессируются конститутивно (то есть с постоянной скоростью),
достаточно лишь наличие участков для связывания общих факторов
транскрипции. Для генов, скорость экспрессии которых изменяется,
существуют участки, связывающие регуляторные белки (специфические
факторы транскрипции, репрессоры).
К активирующим элементам генома принадлежат: энхансеры
(усилители транскрипции) – участки ДНК (мотивы, модули), которые
содержат несколько десятков пар нуклеотидов и расположены на
значительном расстоянии от регулируемого ими гена, находясь спереди или
сзади промотора, или в составе интронов. Связывание с энхансером
соответствующих регуляторных белков усиливает в десятки и сотни раз
процесс транскрипции. Среди регуляторных последовательностей
выделяют так называемые элементы ответа, то есть энхансеры, общие
для группы генов. Благодаря, этому один гормон, связавшись с одним
регуляторным белком, может активировать несколько генов.
Некоторые энхансеры после связывания с определенными белками
не усиливают, а наоборот, блокируют транскрипцию генов, тогда они
называются сайленсерами, или ослабляют транскрипцию, тогда они
называются аттенюаторами. Они обеспечивают так называемое генетическое
молчание, или сайленсинг. Благодаря сайленсингу организм может
выключать из работы те гены, которые ему на этом этапе не нужны. Это
явление имеет место во время дифференциации клеток.
Известны также и инсуляторы или изоляторы - регуляторные
элементы ДНК, которые отвечают за блокировку взаимодействия между
энхансером и промотором. Действие инсулятора обеспечивается
присоединением к нему специальных инсуляторных белков. Потребность в
инсуляторе возникает тогда, когда активируется энхансер общий для группы
генов, а активация одного гена из этой группы является нежелательной.

14. Стадии инициации транскрипции.

Инициация транскрипции — сложный процесс, зависящий от
последовательности ДНК вблизи транскрибируемой последовательности и от
наличия или отсутствия различных белковых факторов.
Инициация транскрипции начинается со сборки на промоторе
прединициационного комплекса, в состав которого входят молекулы РНК-
полимеразы и матричной ДНК. Если в случае РНК-полимеразы E. coli и
 других прокариот для осуществления этого процесса нет необходимости в
присутствии других белковых факторов, то механизм сборки
инициационного комплекса с участием РНК-полимеразы II носит более
сложный характер. В настоящее время существуют две модели инициации
транскрипции РНК-полимеразой II. В соответствии с одной из них на
промоторе происходит постепенная (ступенчатая) сборка инициационного
комплекса из отдельных компонентов. Другая модель акцентирует внимание
на то, что Pol II может входить в состав инициационного комплекса в виде
холофермента, состоящего из многих субъединиц. Сборка такого комплекса
начинается с последовательного связывания с промотором основных
факторов транскрипции. Обычно факторами транскрипции называют белки
или белковые комплексы, непосредственно не участвующие в
каталитическом акте образования РНК, но необходимые для прохождения
основных этапов транскрипции и ее регуляции. По функциональному
признаку принято различать три класса факторов транскрипции. К первому
классу относятся основные факторы транскрипции, обеспечивающие
нерегулируемый базальный уровень транскрипции и функционирующие в
клетках всех типов.
Ко второму классу относятся факторы транскрипции, специфически
взаимодействующие с определенными последовательностями ДНК, которые
являются основными регуляторами транскрипции и обеспечивают
тканеспецифическую экспрессию генов. И, наконец, третий класс факторов
14транскрипции (в том числе многочисленные TAF-белки (TAB-associated
factors)) представлен недавно открытыми белками – коактиваторами
транскрипции, которые действуют согласованно с основными и
тканеспецифическими факторами, обеспечивая более тонкую регуляцию
транскрипции.

15 Различия механизмов инициации у про- и эукариот.

 РНК-полимераза прокариот обеспечивает транскрипцию генов, несущих информацию о последовательностях
молекул РНК всех трех классов: рибосомной РНК (рРНК), транспорт-ной РНК (тРНК) и информационной (или
матричной) РНК (мРНК).

В эукариотических клетках имеются три различные РНК-по-лимеразы, каждая из которых специфически узнает
промото-ры, контролирующие транскрипцию трех различных классов молекул РНК. РНК-полимераза I
локализуется в ядрышке и синтезирует основные рибосомные РНК. РНК-полимераза III осуществляет
транскрипцию транспортных РНК и одного ком-понента рибосом - 5SPHK. Транскрипция молекул мРНК, не-
сущих информацию о структуре белков, осуществляется РНК-полимеразой II. Ферменты II и III типа
локализуются в нуклеоплазме. Процессы образования мРНК в прокариотических и эукариотических клетках
характеризуются существенными различиями. В эукариотических клетках после инициации транскрипции
происходит модификация 5'-трифосфата в образующейся цепи за счет присоединения так называемого кэпа –
метилированного остатка гуанозина. Кроме того, у большинства транскриптов происходит также модификация
3'-концов - по окончании транскрипции к ним присоединяется цепочка из остатков аденина, образующая
характерный ро1уА-«хвост» (исключением из этого правила являются мРНК гистонных белков). У всех эукариот
при транскрипции ДНК образуются молекулы РНК трех вышеназванных классов. Все они участвуют в процессе
трансляции - третьей разновидности матричных процессов передачи информации - от РНК к белку.
16. Опероны бактерий. Понятие об индуцибельных и репрессибельных оперонах.
Оперон представляет собой группу из двух или более структурных генов (иногда говорят и о моноцистронных,
т.е. содержащих один ген, оперонах), кодирующих тесно связанные между собой функционально белки,
совместно транскрибируемых и находящихся под общим контролем. Такой контроль осуществляется продуктом
регуляторного гена, действие которого осуществляется через оператор находящийся в непосредственной
близости к промотору. Как промотор, так и оператор являются короткими (пару десятков нуклеотидов)
последовательностями ДНК, предшествующими контролируемым структурным генам.

Оперон состоит из:

1. Промотор - участок ДНК, с которым происходит связывание РНК-полимеразы и который определяет

точку начала транскрипции.

2. Operator - участок связывания регуляторного белка. Размер - около 20 bp. Располагается в

непосредственной близости к промотору или же перекрывается с ним. Связывание регуляторного белка с
оператором меняет частоту инициации транскрипции.

3. Структурные гены. Кодируют белки, непосредственно производящие фенотипический

эффект. Именно для контроля их экспрессии, собственно, и существуют оперонные
структуры вместе со своими регуляторами.
4. Терминатор транскрипции. Здесь заканчивается синтез мРНК.
В зависимости от влияния на работу структурных генов низкомолекулярных молекул-
эффекторов различают индуцибельные и репрессибельные (-руемые) опероны. Опероны,
управляющие катаболизмом лактозы, галактозы и арабинозы, являются
индуцибельными, т. е. максимальная частота их транскрипции достигается только тогда,
когда в питательной среде присутствует внешний эффектор-лактоза, галактоза или
арабиноза. Внешние эффекторы называют также внешними индукторами. Синтез
ферментов индуцибельных оперонов включается посредством индукции. Наоборот,
опероны, управляющие синтезом аргинина, гистидина или триптофана, являются
репрессибельными, т.е. максимальная частота транскрипции достигается только при
отсутствии в клетке соответствующих низкомолекулярных эффекторов - аргинина,
гистидина и триптофана (или в том случае, если их концентрация ниже критического
порогового уровня).
 17. Негативная и позитивная регуляция оперонов бактерий на примере лактозного,
арабинозного и триптофанового оперона
В зависимости от эффекта связывания регуляторного белка с оператором опероны могут иметь негативный или
позитивный контроль. При негативной, или отрицательной, регуляции связывание регуляторного белка с
оператором репрессирует работу оперона, а при позитивной -наоборот, активирует его . В свою очередь
негативной и позитивной могут быть как индукция, так и репрессия. В случае негативной индукции индуктор
делает регуляторный белок неспособным связываться с оператором, и при этом структурные гены
транскрибируются как, например, в лактозном опероне. При негативной же репрессии регуляторный белок
приобретает свойства репрессора после взаимодействия с корепрессором. Таким корепрессором в триптофановом
опероне служит накопленный в клетке триптофан, взаимодействие его с регуляторный белком приводит к
подавлению транскрипции. При позитивной, или положительной, индукции под влиянием индуктора
регуляторный белок (апоиндуктор) связывается с оператором и помогает РНК-полимеразе начать транскрипцию.
В случае же позитивной репрессии корепрессор инактивирует апоиндуктор и тем самым способствует
прекращению транскрипции.

Лактозный оперон. Наиболее хорошо изученный способ регуляции транскрипции у бактерий - негативная
регуляция с использованием белков-репрессоров, которая обычно рассматривается на примере lac-оперона.
Протяженность лактозного оперона вместе с регуляторным геном составляет 6000 п.н. Между регуляторным
геном lac 1 и первым структурным геном lac Z расположены контгролирующие элементы, каждый из которых
состоит из нескольких десятков пар нуклеотидов. Промотор состоит из 85 п.н., оператор - из 26 п.н. Левая часть
промотора связывается с белком-активатором , а правая часть с РНК-полимеразой. Все три гена Z, У, А
транскрибируются на одну полицистронную мРН К, с которой последовательно транслируются соответствующие
белки (галактозидаза, галактозид-пермеаза и трансацетилаза).

Арабинозный оперон. Индукция арабинозного оперона (положительный контроль). Арабинозный оперон Е. coli
подвержен положительной регуляции, так же как рамнозный и мальтозный опероны. Он содержит структурные
геныara В, ara А и ara D для ферментов, участвующих в превращении L-арабинозы в D-ксилулозо-З-фосфат.
Экспрессия оперона индуцируется арабинозой. Как и многие другие системы катаболизма, оперон подвергается
регуляции в области промотора, с которым связан САР, активированный циклическим AMP. Кроме того, в этом
опероне есть еще два регулируемых участка - оператор и инициатор. С оператором связан регуляторный белок,
кодируемый геном ara С. Этот белок действует как репрессор-присоединяясь к оператору, он препятствует
транскрипции. Однако в присутствии арабинозы он становится активатором-присоединяется к промотору и
делает возможной транскрипцию. Таким образом, арабинозный оперон находится под влиянием как
отрицательного, так и положительного контроля со стороны специфического белка-регулятора.

Триптофановый оперон Он содержит 5 структурных генов (цистронов): trpE, trpD, trpC, а также trpB и trpA,
кодирующие субъединицы триптофансинтазы[en]. На значительном расстоянии от оперона находится ген trpR,
кодирующий белок, подавляющий экспрессию триптофанового оперона. Продукт этого гена в присутствии
триптофана связывается с оператором и блокирует транскрипцию оперона. В отличие от lac-оперона, в состав trp-
оперона входит особая последовательность — аттенюатор[en], необходимая для тонкой регуляции транскрипции
оперона. Регуляция триптофаного оперона регулируется двумя способами: с помощью белка-репрессора
(репрессия), а также с помощью особой последовательности — аттенюатора. При этом в каждом из этих случаев
регуляция осуществляется по принципу отрицательной обратной связи.

18. Понятие о регулоне.

Некоторые группы структурных генов объединены в регулоны – совокупности координированно
экспрессирующихся генов, контролирующих одну определенную функцию (этапы расщепления или синтеза
какого-либо вещества). Гены в регулоне пространственно отдалены друг от друга. Каждый ген имеет собственные
промотор, оператор и терминатор транскрипции. В некоторых регулонах часть генов объединена в опероны
(например аргининовый регулон состоит из шести отдельных генов и двух оперонов).
Некоторые опероны (и регулоны), контролирующие синтез аминокислот, содержат ещё один тип регуляторных
элементов – аттенюаторы. Аттенюатор – это нуклеотидная последовательность с инвертированными повторами,
расположенная между промотором и первым геном оперона. Вторичная структура аттенюатора изменяется в
зависимости от наличия или отсутствия в клетке аминокислоты, синтез которой контролируется данным опероном
(или регулоном). В аттенюаторе закодирован пептид, содержащий несколько, расположенных друг за другом,
аминокислотных остатков данной аминокислоты. Когда концентрация аминокислоты в клетке в результате её
синтеза (или поступления извне) достаточно высокая, происходит синтез аттенюаторного пептида. В результате
изменяется вторичная структура ДНК в аттенюаторе таким образом, что транскрипция оперона прекращается.
(Аттенюатор, таким образом, приобретает характер терминатора). При низкой концентрации аминокислоты в
клетке пептид не синтезируется и структура аттенюатора не мешает транскрипции.

19. Регуляторная роль бактериальной фосфотрансферазной системы.

Механизмы катаболитной репрессии.
Бактериальная фосфотрансферазная система (ФТС) - это сложная разветвленная сеть переносящих фосфат
белков, основной функцией которой является поглощение определенных углеводов из внешней среды. Набор
углеводов, поступающих в клетку посредством ФТС, сильно варьирует у разных видов. Механизм работы
ФТС заключается в транспорте углеводов через клеточную мембрану, сопряженном с фосфорилированием
углевода. Наличие соответствующего углевода в среде и его транспорт внутрь клетки ведут к
значительному расходу высокоэнергетического фосфата и снижает концентрацию фосфорилированых
промежуточных переносчиков, взаимодействующих с многими клеточными белками и изменяющие их
активность. Т.о наличие /отсутствие определенных углеводов в среде через ФТС влияет на хемотаксис, индукцию
катаболитных оперонов, метаболизм азота, вирулентность. ФТС катализирует следующий процесс:
фосфоенолпирувал+углевод=пируват+углевод-Р. промежуточным продуктом гликолиза - фосфоенолпируватом
(ФЕП)
Белки ФТС разделяют на три группы: фермент 1, гистидин-протеин(ГП) – они являются цитоплазматическими
белками(общие белки ФТС) и фермент 2 – мембранный белок. ФТС глюкозы у Е.coli. Ф1 димеризуется, потом
автрофосфорилируется перенося фосфат с фосфоенолпирувата на гистидин.затем происходит фосфорилирование
сахарспецифического белка с образованием глюкозо-6фосфата. Транспорт углевода внутрь клетки происходит с
помощью интегрального мембранного белка переносчика. Затем происходит фосфорилирование связанного с
переносчиком субстрата и его освобождение в цитоплазму. Субстрат может отделяться от переносчика на
внутренней стороне мембраны без фосфорилирования, для некоторых ГР+ показана возможность работы
переносчика в обратном направлении, то есть для выброса углевода из клетки. Транспорт через мембрану является
обратимым.
МЕХАНИЗМ КАТАБОЛИТНОЙ РЕПРЕСИИ
Катаболитную репрессию можно рассматривать как приспособление клетки к использованию в первую очередь
наиболее легко доступных источников энергии. В присутствии такого источника энергии потребление других
субстратов, менее "удобных" для клетки, временно приостанавливается, и пути катаболизирования этих субстратов
временно выключаются.
Катаболитная репрессия (глюкозный эффект) играет большую роль в регуляции транскрипции, которая
проявляется в диауксии в процессе роста бактерий. Феномен диауксии обнаруживается, когда в среде
присутствуют два субстрата (например, лактоза и глюкоза), причем ферменты, осуществляющие катаболизм
одного из них (лактозы), индуцибельны-синтезир,когда есть фер-т, а ферменты, осуществляющие катаболизм
другого (глюкозы), конститутивны-синтезируются в клетке непрерывно, в этом случае сначала потребляется
только глюкоза, тогда как индукция лактозных ферментов (р-галакгозидазы) не происходит до тех пор, пока не
будет потреблена основная часть глюкозы. Это отражается во временном замедлении (прекращении) роста
культуры на тот период, который необходим для индукции и синтеза р-галакгозидазы. Таким образом, несмотря на
присутствие в среде индуктора (лактозы), альтернативный субстрат (глюкоза) препятствует
индукции(взаимодействие).
Механизм катаболитной репрессии у ГР+ определяется действием специфических для каждого сахара
регуляторов. Примерами таких регуляторов являются LevR, LicT и LacT, контролирующие синтез
соответственно леваназы, β-глюкозидазы и β-галактозидазы. Такие регуляторы действуют как активаторы
транскрипции или антитерминаторы, а общим между ними является наличие регулируемой ФТС. Активность
этих регуляторов контролируется фосфорилированием белком гистедин-протеин. В отсутствие глюкозы HPr
фосфорилирует один из аминокислотных остатков PRD домена ФТС, что стимулирует активацию транскрипции.
Фосфорилирование HPr HPr-киназой предотвращает фосфорилирование регуляторов.
20 Контроль утилизации галактозы у дрожжей. Дрожжевые двухгибридные системы.
Количественный и качественный состав белков в клетке может регулироваться не только на этапе их биосинтеза
но и на
Дрожжевая двугибридная система — целое, составленное из частей, соединение] — первая из систем,
созданная на основе анализа экспрессии генов в дрожжах для экспериментального выявления белок-белковых
взаимодействий. Д.д.с. основана на том факте, что активация экспрессии отдельных генов осуществляется
транскрипционными факторами, обладающими двумя пространственно разделенными функциональными
доменами: ДНК-связывающим и активирующим. Только при физическом присоединении друг к другу двух
рекомбинантных белков, один из которых «слит» с ДНК-связывающим доменом («приманка»), а другой — с
активирующим доменом («добыча») воссоздается функциональный транскрипционный фактор, который в свою
очередь активирует экспрессию репортерных генов.

21. Модульная организация регуляторных белков.

Регуляторные элементы ДНК могут оказывать свое влияние на
транскрипцию гена лишь опосредованно, через регуляторные белки.
Регуляторные белки, кодируемые транс-элементами (то есть не на той же
самой молекуле ДНК, что и регулируемый ген), называют транс-
действующими регуляторными факторами. Если белок кодируется цис-
элементом, его называют цис-действующим фактором.
Белки, регулирующие транскрипцию благодаря их собственному
высокоспецифическому взаимодействию с ДНК или стехиометрическому
взаимодействию с другим ДНК-связывающим белком, называют
транскрипционными факторами (ТФ). Гистоны не относят к
транскрипционным факторам, так как они при связывании с ДНК проявляют
низкую специфичность.
Регуляторные белки имеют домены для прикрепления к определенному
регуляторному элементу ДНК и домены для белок-белковых
взаимодействий. Для связывания с ДНК регуляторным белкам служат
типичные фрагменты вторичной структуры - ДНК-связывающие мотивы.
В отличие от прокариот, эукариотические регуляторные белки оказывают
свой эффект не по одному, а в сочетаниях (комплексах). В
транскрипционном комплексе число общих и специфических факторов
может доходить до 50, причем замена или отсутствие хотя бы одного из
факторов приводит к изменению способности РНК-полимеразы
инициировать транскрипцию на данном промоторе. Общие белковые
факторы обязательны при сборке транскрипционного комплекса в районе
промотора любого гена и на любой стадии развития, тогда как набор
специфических белковых факторов будет меняться в зависимости от
транскрибируемого гена, типа клеток, фазы жизненного цикла, средовых
условий и т.д.
Транскрипционные факторы, активирующие транскрипцию, называются
позитивными, или активаторами, а подавляющие транскрипцию -
негативными, или репрессорами. И те, и другие могут пребывать в активном
и неактивном состоянии. Переход из неактивного состояния в активное у
разных транскрипционных факторов происходит разными способами.
Перейдя в активное состояние, специфические транскрипционные факторы
могут изменять активность основных транскрипционных факторов
(например, TFIIB или TFIID) или конкурировать с ними за сайты связывания
на ДНК. Например, некоторые эукариотические факторы-репрессоры
связываются с ДНК так близко от промотора, что закрывают доступ к нему
РНК- полимеразы. Другие транскрипционные факторы могут конкурировать
с белками обратного действия. Например, репрессор может занять сайт на
ДНК, предназначенный для белков-активаторов (так называемое “гашение” -
quenching). В этом случае активаторы не могут присоединиться к ДНК и
облегчить инициацию транскрипции.
22. Контроль терминации транскрипции.
 Регуляция терминации транскрипции. Существуют белковые факторы,
одни из которых препятствуют, а другие способствуют терминации. В случае
p-зависимой терминации регуляция синтеза белка возможна через
воздействие на активность ρ-белка. Для прокариот известно два типа
терминации транскрипции: ρ-зависимая и
ρ - независимая. Главным фактором терминации транскрипции у бактерий
является белок ρ, или ρ-фактор, или Rho-фактор, состоящий из шести
субъединиц.
До последнего времени считалось, что ρ-фактор, присоединившись к 5’-
концу РНК, начинает двигаться по ней с той же скоростью, с какой РНК-
полимераза движется по ДНК. В районе p-зависимого терминатора,
отличающегося большим содержанием Г-Ц-пар азотистых оснований, РНК-
полимераза притормаживает, так как ей трудно разрывать по три водородные
связи в парах “гуанин - цитозин”. Поэтому р-белок, скорость которого
осталась прежней, догоняет РНК-полимеразу и взаимодействует с ней,
изменяя ее конформацию. В результате РНК-полимераза отделяется от ДНК.
Согласно данной модели, ρ-фактор первоначально связан только со
строящейся РНК, но не с РНК-полимеразой. Лишь позднее он
взаимодействует с этим ферментом.
По современным представлениям, ρ-фактор сразу связывается с РНК-
полимеразой на старте транскрипции, еще до возникновения какого-либо
фрагмента РНК. Как только строящаяся РНК становится достаточно
длинной, ρ-фактор “продевает” ее сквозь себя, при этом образуя из нее
петлю, и начинает тормозить движение РНК-транскрипта с использованием
энергии АТФ. Из-за образования петли нарастает пространственное
напряжение, которое в районе ρ-зависимого терминатора приводит к
изменению конформации ρ-фактора. Это, в свою очередь, изменяет
конформацию РНК-полимеразы и инактивирует ее. В итоге элонгационный
комплекс останавливается в зоне терминатора, а затем медленно распадается
на составные элементы.
Антитерминация транскрипции - это подавление активности некоторых
терминаторов. Например, у бактериофага X есть специальные белки-
антитерминаторы N и Q. Белок N связывается с определенной структурой на
строящейся мРНК и обеспечивает присоединение к ней четырех белков : S10,
NusA, NusB, NusG. Образуется РНК-белковый комплекс,
взаимодействующий с РНК-полимеразой и мешающей ей завершить
трансляцию на ρ -зависимых и некоторых ρ -независимых терминаторах.
Белок Q подавляет активность терминатора, связываясь не с РНК, а с ДНК.
Аттенюация - это регулируемая терминация, которая происходит лишь в том
случае, если строящаяся мРНК приобретает определенную вторичную
структуру. Смысл этого способа регуляции - остановить синтез ферментов А,
В и С, закодированных в trp-опероне, если в клетке достаточно триптофана
(на примере триптофанового оперона).
23. Антитерминация.
антитерминация - это подавление активности некоторых терминаторов. В
случае антитерминации регуляторную функцию выполняет один белок,
называемый антитерминатором. Этот белок предотвращает терминацию
транскрипции и позволяет считываться генам, расположенным за
терминатором, выполняя, таким образом, активаторную функцию.
Антитерминаторы не взаимодействуют с кофакторами, а либо являются
активными постоянно, либо их активность модулируется
фосфорилированием. Классический пример антитерминации - регуляция
жизненного цикла бактериофага λ. Геном фага лямбда имеет три группы
генов: немедленно ранние (предранние), задержанно ранние и поздние.
Названия групп отражают последовательность "включения", то есть
активации транскрипции, этих генов. Оба этапа активации зависят от
действия белков-антитерминаторов pN и pQ. Два предранних гена, N и cro
транскрибируются "влево" и "вправо" от промоторов PL и PR. В самом
начале литического цикла развития бактериофага транскрипция
останавливается непосредственно после генов N и cro на ρ- зависимых
терминаторах tL1 и tR1. Синтезирующийся в результате предранней
транскрипции белок pN позволяет РНК-полимеразе преодолевать
терминаторы tL1 и tR1 и считывать располагающиеся за ними ранние гены.
Действие фактора ρ. Терминация транскрипции при участии этого белка
происходит, когда Rho, связанный с вновь образованным транскриптом,
взаимодействует с РНК-полимеразой, остановившейся в области
ρ−зависимого терминатора. ДНК в области таких терминаторов не имеет
особой структуры, богата основаниями C и бедна G, первичная
последовательность различных терминаторов не имеет заметного сходства.
Rho обладает РНК-зависимой АТФазной активностью и способствует
отсоединению РНК-полимеразы через взаимодействие с белком NusG. Если в
фаговой ДНК точно в том же месте заменить фаговый терминатор любым ρ-
зависимым бактериальным терминатором, антитерминация по-прежнему
будет происходить. Следовательно, белок pN не опознает не терминатор, а
какой-то сайт, узнаваемый этим белком. Такие участки называются nutL и
nutR для левого и правого терминатора соответственно. Когда pN узнает nut
сайт, он должен подействовать на РНК-полимеразу таким образом, что она
не сможет больше узнавать терминаторный сайт. Сравнение сайтов между
собой показало, что они состоят из 17 н.п. палиндрома (может образовать
небольшую шпильку). Мутации в этом сайте, называемом также boxB,
лишают pN способности предотвращать терминацию. Непосредственно
перед этим сайтом располагается октамерная последовательность,
называемая boxA, также участвующая в антитерминации. Белок pN
действует, скорее всего, опознавая шпилечную структуру, формируемую
BoxB областью, непосредственно после ее синтеза РНК-полимеразой,
одновременно контактируя с субъединицами полимеразы. После такого
узнавания антитерминатор остается в комплексе с РНК- полимеразой,
фактически становясь ее субъединицей и обеспечивая изменение ее
специфичности по отношению к терминаторам.

24. . Посттранскрипционная регуляция

Регуляция экспрессии генов может происходить и после синтеза молекулы
мРНК, в частности во время дозревания (процессинга) первичных мРНК.
Основные способы такой регуляции – альтернативный сплайсинг, РНК-
интерферренция и изменения стабильности РНК (изменения скорости
деградации РНК).
Альтернативный сплайсинг – это вырезание экзонов и их объединение в
разных комбинациях. Поэтому одна пре-РНК может давать несколько разных
мРНК. Один ген может кодировать не один белок, а несколько. Например, во
всех клетках есть ген кальцитонина, но в щитовидной железе он
экспрессируется в виде гормона кальцитонина, в гипофизе - нейропептида
CGRP. Альтернативный сплайсинг широко представлен в геноме человека,
поэтому протеом человека содержит намного большее количество белков,
чем протеомы других организмов.
РНК-интерференция – это торможение экспрессии гена на стадии
трансляции или транскрипции действием малых РНК. Они выключают
роботу тех генов, последовательности которых отвечают цепи молекулы
малой РНК.
Деградация мРНК. Время жизни эукариотических мРНК составляет от
нескольких часов до нескольких дней, а прокариотических – несколько
минут. Продолжительность жизни мРНК является важным механизмом
регуляции синтеза белков. Разрушение мРНК у эукариот осуществляется 3’-
РНК-азами (у прокариот 5’-РНК-азами). мРНК эукариот начинает
разрушаться с некодирующего полиаденилатного фрагмента. Этот фрагмент
подобно теломерным последовательностям ДНК служит буферной зоной,
которая защищает кодирующую часть мРНК от разрушения. В промежутке
между завершением трансляции мРНК одной рибосомой и началом
трансляции следующей 3’-РНК-аза успевает отщепить от ее поли(А)
фрагмент 10-15 нуклеотидов. Когда в этом фрагменте остается около 50
нуклеотидов (критическая длина), быстро наступает полный гидролиз мРНК.
Кратность трансляции мРНК обычно не превышает 10-15 раз. Разница в
продолжительности жизни различных мРНК объясняется как разной длиной
поли-(А) -фрагмента, так и тем, что в короткоживущих мРНК между
кодирующей частью и полиаденилатным фрагментом находятся АУ-багатые
элементы. Наличие последовательностей обогащенных аденином и урацилом
резко усиливает деградацию поли(А) -фрагмента.

25. Контроль процессинга пре-мРНК (транс-сплайсинг, альтернативный

сплайсинг, альтернативное полиаденилирование).
Эукариоты широко используют возможность регулировать синтез белка на
посттранскрипционном уровне. Возникшая при транскрипции пре-мРНК у
эукариот претерпевает процессинг. Регулировать образование зрелых мРНК
можно через изменение активности ферментов и вспомогательных белков,
нужных для кэпирования, образования полиА-хвоста, обычного и
альтернативного сплайсинга.
Альтернативный сплайсинг позволяет получить различные белковые
продукты с одного гена благодаря “сшиванию” разных наборов экзонов и
интронов при построении разных мРНК. Большое значение имеют присущие
эукариотическим клеткам механизмы управления альтернативным
сплайсингом. Характер сплайсинга регулируется белками, способными
связываться с пре-мРНК в районе интронов или на границе “экзон-интрон”.
Присоединение таких регуляторных белков может блокировать удаление
одних интронов, одновременно активируя вырезание других.
На конечный результат - синтез белка - влияет также скорость транспорта
РНК из ядра в цитоплазму, время “полужизни” мРНК, степень ее
стабильности в цитоплазме, скорость поступления на рибосомы и
эффективность связывания с ними.
’’Временем полужизни” называют время, в течение которого популяция
молекул данного типа мРНК уменьшается наполовину. Известно, что время
существования мРНК увеличивается с удлинением ее полиА-хвоста. Время
полужизни большинства мРНК дрожжей составляет 10-20 мин, хотя для
некоторых оно уменьшается до 1 мин, а для других возрастает до 35 мин. У
млекопитающих время полужизни мРНК обычно составляет несколько часов.
Клетка имеет возможность резко снизить время полужизни нежелательных
мРНК (например, вирусных): с помощью особых малых РНК и специальных
белковых комплексов такие мРНК обнаруживаются и расщепляются. Этот
механизм носит название РНК-интерференции, или посттранскрипционного
генного сайленсинга.
Скорость освобождения РНК от сопровождающих белков и поступления на
рибосомы регулируется белками, окружающими ее в информосомах (РНП-
комплексах). В цитоплазме мРНК могут определенное время храниться в
виде нетранслируемых мРНП-комплексов.
Некоторые из белков этих комплексов участвуют в регуляции матричной
активности мРНК. Например, если в РНП-комплексе на одну молекулу мРНК
приходится 5 - 10 молекул белка p50, трансляция этой РНК ингибируется,
если 1-4 молекулы - активируется. Предполагают, что при более высоком
содержании белка его С-концевые части освобождаются от контактов с РНК
и начинают взаимодействовать между собой. Это приводит к
мультимеризации белка и переходу мРНП в конденсированное
(нетранслируемое) состояние.
 В процессе транс-сплайсинга сплайсома выбирает для объединения 5'-сайт и
3'- сайт сплайсинга, которые располагаются на разных молекулах РНК.
Транс-сплайсинг обнаружен у простейших (трипаносом), евглен, нематод и
плоских червей, а также в митохондриях, хлоропластах и безрибосомных
пластидах высших растений. Наиболее хорошо изучен механизм транс-
сплайсинга у нематоды.
Полиаденилирование- присоединение аденина к 3'-концу мРНК- это один из
вариантов посттранскрипционного процессинга (модификации) мРНК,
играющий значение, в том числе и в регуляции экспрессии генов.
Процессинг 3'-конца является важным этапом в созревании мРНК у всех
эукариот. Полиаденилирование необходимо для терминации транскрипции,
для транспорта мРНК из ядра, стабильности (защищает мРНК от деградации
нуклеазами) и инициации трансляции.
Полиаденилирование- двухэтапная реакция:
1)сайт-специфичное разрезание пре-мРНК
2)синтез поли-А хвоста определенной длины на 3'-конце порезанного
продукта.

26. Регуляция стабильности мРНК.

Стабильность мРНК обычно не зависит напрямую от ее размера, а
определяется многими факторами:
Наличие элементов вторичной структуры стабилизирует РНК, поскольку
препятствует работе многих РНКаз. Большинство мРНК имеют на своем
нетранслируемом 3'-конце достаточно стабильные шпилечные структуры.
Это в первую очередь терминаторы, однако имеются и другие.
Немаловажным для стабильности мРНК является наличие хорошего
рибосомсвязывающего сайта (на надлежащем расстоянии перед старт-
кодоном). Рибосома, транслирующая мРНК, защищает 35-50 нуклеотидов от
атаки рибонуклеаз, которые могут разрушить РНК. Если мРНК эффективно
транслируется, она фактически полностью будет покрыта рибосомами, что
существенно уменьшит вероятность её деградации рибонуклеазами.
Если деградация мРНК уже началась, процесс ее разрушения завершается
очень быстро.
Деградация мРНК у E. coli осуществляется совместно эндо- и
экзорибонуклеазами. Две экзонуклеазы, РНКаза II и
полинуклеотидфосфорилаза (ПНФаза), разрушают РНК в направлении 3'->5'.
РНКаза II - гидролитический фермент, дающий при расщеплении РНК
нуклеотидмонофосфаты. ПНФаза использует при гидролизе неорганический
фосфат, генерируя нуклеотиддифосфаты.
3' концы многих мРНК образуют стабильные шпилечные структуры,
которые защищают РНК от деградации экзорибонуклеазами. Расщепление
мРНК "в середине" при помощи эндорибонуклеазы может убрать шпильку,
образуя незащищенный 3' конец, доступный для экзорибонуклеаз.
Эндонуклеазное расщепление РНК менее важно у эукариот, где основная
деградация мРНК обеспечивается экзонуклеазами. У дрожжей описано два
экзонуклеолитических механизма, работающих в направлениях 5'->3' и 3'->5'.
Эукариотические мРНК защищены от деградации кэпом на 5' конце и
поли(А) хвостом в комплексе с поли(А)-связывающим белком (PAB) на 3'
конце. На 5' конце эубактериальных мРНК находится трифосфат, и его
присутствие ингибирует действие эндорибонуклеаз. После первого
расщепления мРНК эндорибонуклеазой на вновь образованном 5' конце РНК
остается монофосфат, уже неспособный блокировать дальнейшее
эндонуклеолитическое расщепление.
Бактериальные РНКазы, участвующие в деградации мРНК
РНКаза Е - крупный белок, активен в виде гомодимера. Белок можно
разделить на три домена. В центре расположен богатый аргинином РНК-
связывающий домен. N-концевой каталитический домен.
РНКаза III обнаружена у E. coli как эндорибонуклеаза, разрезающая
двухцепочечные молекулы РНК. Разрез может быть одно- или двунитевым.
РНКаза III участвует в процессинге рРНК и деградации ряда мРНК.
Полинуклеотидфосфорилаза - катализирует обратимый фосфоролиз
полирибонуклеотидов с освобождением нуклеозиддифосфатов..
РНКаза II деградирует однонитевую РНК с 3' конца путем гидролиза мРНК,
освобождая нуклеозидмонофосфаты.
27. Факторы, влияющие на стабильность мРНК. РНКазы, участвующие
в деградации мРНК.
Стабильность мРНК обычно не зависит напрямую от ее размера, а
определяется многими факторами, основными из которых являются ее
вторичная структура, элементы первичной последовательности (сайты
узнавания для специфических рибонуклеаз) и эффективность трансляции.
Бактериальные РНКазы, участвующие в деградации мРНК
РНКаза Е
Описана у E. coli. Кодируется геном rne. Продукт гена – крупный белок (1061
аминокислотный остаток). активен в виде гомодимера. Белок можно
разделить на три домена. В центре расположен богатый аргинином РНК-
связывающий домен. N-концевой каталитический домен имеет слабую
гомологию с рибосомным белком S1. Имеется также некоторая гомология
между РНКазой Е и миозином.Специфичность РНКазы Е по отношению к
субстрату не очень четкая. В качестве консенсус последовательности сайта
предпочтительного узнавания был предложен пентануклеотид
(A/G)AUU(A/U), однако по другим данным единственным ограничением по
отношению к последовательности РНК является разрезание "слева" от
динуклеотида AU в однонитевых участках молекулы. Еще одним
ограничением является то, что РНКаза Е наиболее активно действует только
в непосредственной близости от свободного 5' конца, причем это должен
быть конец с монофосфатом. Наконец, двухцепочечная РНК резистентна к
деградации РНКазой Е. Таким образом, для успешного расщепления
субстрата РНКаза Е должна распознать специфический внутренний сайт и
свободный 5' нуклеозидмонофосфат.
Экспрессия РНКазы Е находится под негативным контролем, причем
регулятором является сама РНКаза Е, и контроль осуществляется за счет ее
собственной РНКазной активности. В условиях эксперимента можно
добиться 40-кратногоразличия в количествах rne-транскрипта за счет
изменения клеточной концентрации функциональной РНКазы Е.
РНКаза III
РНКаза III (кодируемая геном rnc) была обнаружена у E. coli как
эндорибонуклеаза, разрезающая двухцепочечные молекулы РНК. Разрез
может быть одно или двунитевым, что частично зависит от степени
спаренности оснований вокруг сайта разрезания. Специфичность по
отношению к конкретной последовательности контролируется негативно, т.е.
присутствие ряда оснований в определенных позициях сильно ингибирует
разрезание. РНКаза III участвует в процессинге рРНК и деградации ряда
мРНК, хотя стабильность большинства клеточных мРНК не изменяется у
мутанта по РНКазе III. Инактивация rnc летальна у B. subtilis, но не летальна
у E. coli. РНКаза III - гомодимер из субъединиц размером 25.4 кДа. Фермент
содержит четко выраженные РНК-связывающий и РНКазный домен.
Экспрессия rnc авторегулируется (как и в случае РНКазы Е , каталитическая
активность РНКазы III напрямую участвует в авторегуляции). Активность
РНКазы III регулируется также и на посттрансляционном уровне путем
фосфорилирования.
Полинуклеотидфосфорилаза
Кодируется геном pnp. Гомотример из субъединиц размером 77.1 кДа.
Катализирует обратимый фосфоролиз полирибонуклеотидов с
освобождением нуклеозиддифосфатов. Содержит два РНКсвязывающих
домена – один гомологичен некоторым эукариотическим гяРНК, а второй –
рибосомному белку S1. Фермент широко распространен у бактерий.
Экспрессия полинуклеотидфосфорилазы, как и описанных выше РНКаз,
находится под автоконтролем.
РНКаза II
Кодируется геном rnb. Как и полинуклеотидфосфорилаза, процессивно
деградирует однонитевую РНК с 3' конца, однако делает это путем
гидролиза, а не фосфоролиза мРНК, освобождая нуклеозидмонофосфаты.
Мономер с молекулярной массой 72.3 кДа. Содержит карбоксиконцевой
РНКсвязывающий S1 домен. Экспрессия РНКазы II находится в обратной
корреляции с уровнем полинуклеотидфосфорилазы, что предполагает
участие этих двух РНКаз в деградации матричных РНК друг друга
Активность обеих экзорибонуклеаз ингибируется элементами вторичной
структуры, однако полинуклеотидфосфорилаза к такому ингибированию
значительно менее чувствительна.

28.Мультибелковые комплексы деградации РНК.

При очистке РНКазы Е из E. coli был обнаружен крупный мультибелковый
комплекс – РНКдеградосома. Основными компонентами этого комплекса
являются РНКаза Е, ПНФаза иРНК-хеликазаRhlB. Ассоциация РНКазы Е с
ПНФазой в одном комплексе дает прямое доказательство их кооперации при
деградации мРНК. В составе комплекса также выделяется енолаза
(гликолитический фермент) и (в субстехиометрических количествах)
полифосфаткиназа PPK и шапероны DnaK и GroEL; роль этих компонентов в
деградации мРНК неясна.
РНКаза Е – крупный мультидоменный белок. Эндонуклеазная активность
связана с N-концевым доменом. Этот же домен обладает дополнительной
активностью, отвечающей за деградацию поли(А) и поли(U) хвостов. C-
концевая половина белка взаимодействует с тремя основными компонентами
деградосомы, RhlB, PNPазой и енолазой. Таким образом, РНКаза Е –
сложный мультидоменный белок, N-конец которого является
каталитическим, а C-конец выполняет роль каркаса, на котором собираются
остальные компоненты деградосомы.
Несколько мультибелковых РНК- деградирующих комплексов, структурно
и функционально гомологичных бактериальной РНК-деградосоме, описано у
эукариот. Все эти комплексы отвечают за деградацию РНК в 3'-
>5'направлении.Комплекс, содержащий гомологи PNPазы и РНКазы Е,
участвует в процессинге и деградации мРНК в хлоропластах шпината. Еще
два комплекса описаны у дрожжей. Комплекс mtEXO, содержащий
экзонуклеазу, сходную с РНКазой II из E. coli, деградирует интроны мРНК
в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. Экзосома S. cerevisiae,
участвующая как в процессинге рибосомной РНК, так и в деградации
мРНК, содержит пять3'->5' экзорибонуклеаз, четыре из которых
гомологичны РНКазеII илиPNPазе из E. coli. Человеческий гомолог
дрожжевой экзонуклеазы Rpr4p был обнаружен в составе большого
комплекса, что свидетельствует в пользу наличия экзосомы и в клетках
животных.

29. РНК-хеликазы в деградации РНК.

Идентификация РНК-хеликазы RhlB в составе бактериальной деградосомы
явилась первым свидетельством активной роли РНК-хеликаз в деградации
РНК. RhlB принадлежит к классу DEAD-бокс белков. Это семейство АТФ-
зависимых РНК-хеликаз, имеющих 8 консервативных мотивов, включая
аминокислоты аспартат (D), глутамат (E), аланин (A) и опять аспартат
(D).Белки-члены этого семейства участвуют в разнообразных процессах,
включая сборку рибосом, инициацию трансляции и сплайсинг РНК. В
экспериментах in vitro функция RhlB в составе деградосомы была четко
показана. Элементы вторичной структуры в РНК часто создают препятствия
для продвижения таких ферментов, как ПНФаза. Показано, что присутствие
RhlB в составе деградосомы стимулирует в АТФ-зависимой манере
деградацию при помощи ПНФазы субстрата с выраженной вторичной
структурой. RhlB "раскручивает" двухцепочечные участки РНК, что
позволяет экзорибонуклеазе продвинуться дальше по субстрату. RhlB сильно
активируется взаимодействием с C-концевой частью РНКазы Е. Дрожжевые
экзосома и комплекс mtEXO также имеют в своем составе хеликазы,
подобные RhlB.
30.Действие полиаденилирования на стабильность бактериальных и
эукариотических мРНК.
Полиаденилирование оказывает противоположный эффект на стабильность
бактериальных и эукариотических мРНК.
Поли(А)-полимераза I (PAP I) из E. coli кодируется геном pcnB (plasmid copy
number), который был первоначально идентифицирован по его действию на
копийность плазмид с ColEI репликоном. PAP I участвует в деградации РНК
I – небольшой регуляторной РНК, которая взаимодействует с РНК II –
праймером, инициирующим репликацию ДНК ColEI. РНК I, время
полужизни которой составляет 2 минуты, первоначально укорачивается
РНКазой Е на 5 нуклеотидов с 5' конца. Время полужизни полученного
интермедиата (РНКI-5)возрастает в 10 раз в pcnB штамме (у которого
отсутствует PAP I активность). E. coli имеет еще один белок с поли(A)-
полимеразной активностью (PAP II). Инактивация обеих поли(A)-полимераз
летальна. PAP I из E. coli гомологичен эукариотическим поли(A)-
полимеразам.
Степень полиаденилирования бактериальных мРНК невысока, и у E. coli
только небольшой процент всех транскриптов полиаденилирован. Однако,
несмотря на низкую степень полиаденилирования, оно выполняет
существенную функцию при деградации РНК. Добавление поли(А)
способствует деградации РНК, чьи концы защищены от действия экзонуклеаз
вторичной структурой. Такие экзорибонуклеазы, как ПНФаза и РНКаза I,
нуждаются в одноцепочечном "хвосте", за который можно "ухватить" 3'
конец мРНК и начать ее деградацию. Полиаденилирование 3' конца как раз и
создает сайт связывания для экзорибонуклеаз.
Открытие дестабилизирующего влияния 3' поли(А)-хвостов на мРНК у
бактерий явилось сюрпризом, поскольку у эукариот функция
полиаденилирования противоположная (стабилизирующая). Такое отличие
объясняется тем, что поли(А)-хвосты эукариот значительно длиннее и, кроме
того, защищены особым белком PAB(poly(A)-binding).Короткие не связанные
с белком поли(А) последовательности и у эукариот оказывают
дестабилизирующее действие на мРНК.
31-32.
31. Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции контроля
инициации репликации ДНК.
32. Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции процессинга
РНК и ее трансляции.
В регуляции разных этапов синтеза белка как многостадийного процесса
задействованы различные типы нетранслируемых РНК. Так, инициация
репликации ДНК невозможна без праймеров РНК-овой природы.
Инициация транскрипции может регулироваться специальными малыми РНК
через их воздействие на процесс метилирования ДНК.
В регуляции “дозревания” - процессинга пре-мРНК эукариот особенно
значительна роль малых ядерных РНК (мяРНК) U1 - U6, входящих в состав
сплайсосомы и избирательно распознающих сайты сплайсинга.
В контроле трансляции белковых молекул принимают участие особые
антисмысловые РНК (antisense RNA, micRNA). Их название подчеркивает
тот факт, что эти РНК комплементарны к “смысловой” мРНК - той, на
которой закодирован белок. Антисмысловые РНК были сначала обнаружены
у бактерий, затем - у эукариот. По принципу антисмысловых строятся РНК,
регулирующие синтез белка по механизму РНК-интерференции или
посттранскрипционного генного сайленсинга. На сегодняшний день
известны два класса малых регуляторных РНК, способных вызвать
устранение мРНК-матрицы или репрессию трансляции - siРНК и miРНК.
33. Антисмысловая РНК. МикроРНК как регулятор. РНК-
интерференция.
В контроле трансляции белковых молекул принимают участие особые
антисмысловые РНК. Их название подчеркивает тот факт, что эти РНК
комплементарны к“смысловой” мРНК– той, на которой закодирован белок.
Антисмысловые РНК были сначала обнаружены у бактерий, затем– у
эукариот. Бактериофаги используют антисмысловые РНК для регуляции
своего жизненного цикла.
У бактерий антисмысловые РНК используются в регуляции:
– репликации и поддержания плазмид(например, инициации репликации
плазмидыColE I);
– транскрипции(например, гена белка, являющегося рецептором цАМФ)
– трансляции(например, при подавлении экспрессии одного из белков
внешней мембраны E. coli).
У эукариот также было обнаружено участие антисмысловых РНК в
регуляции синтеза белка. Мутации, нарушающие нормальное протекание
посттранскрипционного сайленсинга у них приводят к возрастанию
восприимчивости к вирусной инфекции, повышенной подвижности
транспозонов, дефектам в митозе, мейозе, к стерильности и другиМ
нарушениям развития.
РНК-интерференция(“препятствие”)–это недопущение мРНК до
трансляции на рибосомах с помощью маленьких антисмысловых РНК и
специальных белковых комплексов. Известно два основных класса малых
РНК, способных вызвать РНК-интерференцию:
– siРНК– малые интерферирующие РНК(small interfering RiboNucleic Acids ),
длиной19 – 25 нуклеотидов;
– miРНК– микроРНК, обычная длина которых– 21-22 нуклеотида.
Эти два класса малых РНК схожи по строению и механизму действия, но
отличаются по происхождению, консервативности и группам
регулируемых генов: – miРНК закодированы в ДНК клетки в
специальных геномных локусах, отличных от других генов, тогда как
siRNA могут иметь два источника– “собственные” транспозоны клетки или
проникающие извне вирусы. – miРНК синтезируются из одноцепочечной
РНК, сложившейся вдвойне с образованием короткой“шпильки”, а siРНК–
из длинных двуцепочечных РНК или протяженных“шпилек”. – из одной
молекулы-предшественника в случае miРНК формируется единственная
двуспиральная структура“miРНК: miРНК”, а в случае siРНК– много
двуцепочечных siРНК;
МикроРНК способны вызывать не только расщепление мРНК– РНК-
интерференцию(аналогичноsiРНК), но и другой эффект– трансляционную
репрессию.
34. Посттрансляционная регуляция. Участие молекулярных шаперонов
в регуляторных процессах.
После завершения трансляции большинство белков подвергается
дальнейшим химическим модификациям, которые называются
посттрансляционными модификациями. Посттрансляционные модификации
могут регулировать продолжительность существования белков в клетке, их
ферментативную активность и взаимодействия с другими белками. Иногда
посттрансляционные модификации являются обязательным этапом
созревания белка, в противном случае он оказывается функционально
неактивным. Посттрансляционные модификации могут быть как широко
распространёнными, так и уникальными. Универсальная модификация
-убиквитинирование (присоединение к белку цепи из нескольких молекул
короткого белка убиквитина), которое служит сигналом к расщеплению этого
белка протеасомой. Другой распространённой модификацией является
гликозилирование. К редким модификациям относят
тирозинирование/детирозинирование и полиглицилирование тубулина.
Один и тот же белок может подвергаться многочисленным модификациям.
Посттрансляционные модификации делят на: модификации главной цепи;
отщепление N-концевого остатка метионина; ограниченный протеолиз —
удаление фрагмента белка, которое может происходить с концов
(отщепление сигнальных последовательностей) или, в отдельных случаях, в
середине молекулы; присоединение различных химических групп к
свободным амино- и карбоксильной группам (N-ацилирование,
миристоилирование); модификации боковых цепей аминокислот;
присоединение или отщепление небольших химических групп
(гликозилирование, фосфорилирование);
присоединение липидов и углеводородов; изменение стандартных
аминокислотных остатков на нестандартные (образование цитруллина);
образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина;
присоединение небольших белков (сумоилирование и убиквитинирование).
Шапероны. В клетках существует группа белков, функция которых —
обеспечение правильного сворачивания других белков после их синтеза на
рибосоме, восстановление структуры белков после их повреждения, а также
создание и диссоциация белковых комплексов. Эти белки
называются шаперонами. Концентрация многих шаперонов в клетке
возрастает при резком повышении температуры окружающей среды, поэтому
они относятся к группе Hsp (англ. heat shock proteins — белки теплового
шока).
35. Фолдинг и деградация белков как компоненты регуляторных
систем.
Деградация белков в клетке. Белки выполняют в клетке закреплённую за
ним функцию, а затем, в определённый момент, клетке необходимо от него
избавиться. Необходимость избавиться от белка обусловлена рядом причин:
во-первых, дальнейшая активность белка может навредить клетке, во-вторых,
нужно синтезировать новые белки, а перегрузка цитоплазмы полипептидами
является источником апоптоза. Переставшие быть необходимыми, белки
подвергаются протеолитической деградации.
Фо́лдингом белка называют процесс спонтанного сворачивания 
полипептидной цепи в уникальную нативную пространственную структуру
(так называемая третичная структура).
Каждая молекула белка начинает формироваться
как полипептид, транслируемый из последовательности мРНК в виде
линейной цепочки аминокислот. У полипептида нет устойчивой трёхмерной
структуры. Однако все аминокислоты в цепочке имеют определённые
химические свойства: гидрофобность, гидрофильность, электрический заряд.
При взаимодействии аминокислот друг с другом и клеточным окружением
получается хорошо определённая трёхмерная структура — конформация. В
результате на внешней поверхности белковой глобулы формируются
полости активных центров, а также места контактов субъединиц
мультимерных белков друг с другом и с биологическими мембранами.
В редких случаях нативными могут быть сразу две конформации белка. Они
могут сильно различаться, и даже выполнять различные функции. Для этого
необходимо, чтобы в разных областях фазового пространства белковой
молекулы существовали два примерно равных по энергии состояния, каждое
из которых будет встречаться в нативной форме с соответствующей
вероятностью. Для стабилизации третичной структуры многие белки в клетке
подвергаются посттрансляционной модификации. Часто
встречаются дисульфидные мостики между пространственно близкими
участками полипептидной цепи. В фолдинге участвуют белки-шапероны.
Существует четыре типа молекул, которые играют роль таких шаперонов.
1. Молекулы, обеспечивающие правильный фолдинг белков.
2. Молекулы, созданные для удержания частично свернутой молекулы белка
в определенном положении. Это необходимо, чтобы система имела
возможность закончить фолдинг.
3. Шапероны, разворачивающие белки с неправильной формой.
4. Шапероны, сопровождающие белки, транспортируемые через клеточную
мембрану.
36. Формирование нативной трехмерной структуры белков.

Трехмерная структура белка играет важную роль в обеспечении его

специфической функциональной активности. Она формируется в результате
взаимодействия структур более низких уровней. Третичная структура —
пространственное строение полипептидной цепи. Структурно состоит из
элементов вторичной структуры, стабилизированных различными типами
взаимодействий, в которых гидрофобные взаимодействия играют
важнейшую роль. В стабилизации третичной структуры принимают участие:
ковалентные связи (между двумя остатками цистеина — дисульфидные
мостики); ионные связи между противоположно заряженными боковыми
группами аминокислотных остатков; водородные связи; гидрофобные
взаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды
белковая молекула сворачивается так, чтобы неполярные боковые группы
аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности
молекулы оказываются полярные гидрофильные боковые группы.
Между уровнем вторичной структуры и атомарной пространственной
выделяют ещё один уровень — мотив укладки. Мотив укладки определяется
взаимным расположением элементов вторичной структуры (α-спиралей и β-
тяжей) в пределах белкового домена — компактной глобулы, которая может
существовать или сама по себе или входить в состав более крупного белка.
37. . Молекулярные шапероны семейств Hsp60 и Hsp70 у про- и
эукариот.
Фолдинг растущего в процессе трансляции полипептида обеспечивается его
взаимодействием сначала с фактором TF, а затем, при достаточном
удлинении полипептидной цепи – с системой шаперона Hsp70, включающей
собственно шаперон, кошаперон Hsp40 и факторы нуклеотидного обмена
(NEF). Наиболее изученной является Hsp70-система Escherichia coli.
Образование временных комплексов Hsp70 с ненативными белками-
мишенями предотвращает неспецифическую агрегацию и деградацию
последних внутриклеточными протеиназами и способствует правильному
фолдингу диссоциированной мишени, происходящему либо спонтанно, либо
с участием других шаперонов. Шапероны Hsp70 состоят из трех доменов:
высококонсервативный N-концевой нуклеотидсвязывающий домен
объединен чувствительным к действию протеиназ линкерным участком с
вариабельным субстратсвязывающим доменом; короткий С-концевой домен
способен к взаимодействию с различными партнерными белками и
модулированию шапероновой функции Hsp70; АТФ-форма Hsp70 обладает
низким сродством к белкам-мишеням и высокой скоростью обмена
субстратов, в то время как его AДФ-форма проявляет высокую аффинность к
субстратам и демонстрирует низкую скорость их обмена.
Двудоменные кошапероны Hsp40 служат регуляторами АТФ-азной и
шапероновой активностей Hsp70. Связывание полипептидных субстратов-
мишеней с Hsp70 опосредовано предварительным образованием комплексов
мишень–кошаперон с участием С-концевого домена Hsp40. Считается, что от
10 до 20% вновь синтезирующихся белков как в прокариотах, так и в
эукариотах подвергаются правильному фолдингу с участием системы Hsp70–
Hsp40–NEF.
Шаперонины (или шапероны Hsp60) – это двухкамерные бочкообразные
структуры, сформированные двумя состыкованными олигомерными
кольцами Hsp60, которые способны на своих противоположных
поверхностях попеременно связывать и инкапсулировать белки, подлежащие
рефолдингу. При этом шаперонины узнают гидрофобные кластеры белковых
мишеней, находящихся в состоянии «расплавленной глобулы»–
промежуточной между нативным и развернутым состояниями белка,
характеризующимся ослаблением взаимодействий между боковыми
группами в аминокислотной цепи. Наиболее изученным является шаперонин
GroEL E. coli, функционирующий в комплексе с кошаперонином GroES.
Каждая субъединица гептамерного «кольца» GroEL состоит из трех доменов:
апикального, содержащего общий центр связывания ненативных белков и
кошаперонина, шарнирного промежуточного и С-концевого
экваториального, несущего АТФ-азный центр. Экваториальные
домены обеспечивают бóльшую часть межсубъединичных контактов как
внутри гептамерного кольца, так и между кольцами шаперона.
38. . Участие молекулярных шаперонов в регуляторных процессах.
Рабочий цикл шаперонных комплексов GroELS и DnaKJ-GrpE.

Молекулярные шапероны – группа вспомогательных специализированных

белков, предохраняющих растущую цепь от
ошибочных внутренних и внешних контактов. Биологические функции
молекулярных шаперонов - коррекция структуры и конформации других
белков клетке, предотвращение агрегации неправильно свернутых или
частично развернутых белков, разрушение и солюбилизация стабильных
белковых агрегатов, разворачивание нативных белковых субстратов для
транслокации их через мембраны, разборке активных олигомерных структур
и поддерживании их в состоянии неактивных мономеров, разворачивании
активных мономеров для их последующей деградации. Шапероны
контролируют процессы ремоделирования нативного состояния
регуляторных и сигнальных белков в клетке. Молекулярные шапероны
являются основными компонентами системы контроля качества клеточного
протеома.
Hsp70-система Escherichia coli, состоит из шаперона DnaK, кошаперона DnaJ
и NEF-белка GrpE, причем, белки DnaJ и GrpE функционируют в системе в
форме димеров. Гомологом Hsp60 у E. coli является GroEL, формирующий
гигантский комплекс с GroES. Комплекс GroEL- GroES имеет сходство с
эукариотической протеосомой 26S, ответственной за деградацию меченных
убихитином белков.
При фолдинге белки проходят через ряд промежуточных конформаций,
имеющих более высокую энергию, чем конечная конформация. Поэтому для
многих белков существуют локальные энергетические минимумы, в которых
частично свернутый белок может задержаться надолго. Белки, требующие
помощи в фолдинге, опознаются аппаратом DnaK-DnaJ-GrpE, через
гидрофобные участки. Молекулярный шаперон, гидролизуя АТФ,
"перетасовывает" конформацию многих оснований, разворачивая белок и
позволяя ему свернуться заново. Если нативная конформация не достигается
таким путем, белок переходит в ведение шаперонина GroES-GroEL. Полость
шаперонина защищает белок от контакта с раствором и другими
субъединицами, предотвращая агрегацию и позволяя белку спокойно
свернуться.
39. Деградация белков: АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26S-
протеасома эукариот. АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26S-
протеасома эукариот

АТФ-зависимые протеазы. За распознавание субстрата у прокариот отвечают

протеазы, поэтому их в клетке несколько. АТФзависимые протеазы-крупные
олигомерные комплексы. Протеазные сайты располагаются во внутренней
камере олигомера. Поступление субстрата в такую полость обеспечивается
АТФазными доменами (субъединицами). Поскольку распознавание субстратов
осуществляется регуляторными АТФазами, свойства субстратов, приводящие к
их деградации, не зависят от свойств, необходимых для разрезания пептидных
связей. Как только белок распознается и связывается регуляторным АТФазным
доменом, начинается последовательная деградация полипептидной цепи с
разрезами через каждые 5-10 аминокислот. У E.coli 4 АТФ-зависимые протеазы.
ClpAP ClpXP. У этих протеаз АТФазная и протеазная активность принадлежат
разным субъединицам, эти субъединицы способны действовать самостоятельно.
ClpA и ClpX могут действовать как шапероны. Гены clpX и clpP составляют
оперон, clpA расположен отдельно в моноцистронном опероне. Оба оперона
имеют типичные промоторы теплового шока. ClpYQ/HslUV. HflB(FtsH). Zn и
АТФ-зависимая протеаза, участвующая в деградации цитоплазматических и
мембранных белков, включая RpoH, SecY (часть аппарата секреции).
Единственная АТФ-зависимая протеаза, существенная для жизни E. coli. В
опероне с RpoH-зависимым промотором. Lon. Деградирует белок N фага λ,
ингибитор клеточного деления SulA, позитивный регулятор биосинтеза капсулы
RcsA и др. Кроме специфических мишеней, Lon деградирует большинство
аномальных белков E. coli. Белок – гомотетрамер, имеет сайты связывания с
АТФ и ДНК, причем связывание с ДНК стимулирует протеазную активность.
Транскрибируется с промотора теплового шока. В белке можно выделить два
домена – собственно протеазный с карбоксильного конца с сериновым остатком
в активном сайте
и следующий за ним АТФазный. Эти два домена могут быть экспрессированы
как отдельные полипептиды, смесь которых функционально соответствует
интактной протеазе Lon. 26S ПРОТЕАСОМА. Протеасома, осуществляющая
убиктивин-зависимую деградацию белков, состоит из двух основных
субкомплексов: коровой 20S протеасомы и активатора РА700 или 19S
регуляторной частицы. 20S протеасома содержит протеазные субъединицы, а
19S протеасома включает субъединицы, способные связывать полиубиктиновые
цепи и субстрат, а также изопептидазы, отщепляющие убиктивин, и АТФазы,
которые обеспечивают разворачивание субстрата и транслокацию его в канал
коровой протеасомы. 19S протеасомы могут присоединяться к 20S протеасоме с
одного или обоих концов, в результате образуются 26S и 30S протеасомы
соответственно. Помимо 19S RP, в состав 26S протеасомы могут входить
альтернативные регуляторные частицы: PA28α/β (или 11S REG), PA28γ (или
REGγ), PA200, PI31. Встречаются асимметричные изоформы 26S протеасомы,
содержащие разные регуляторные частицы на концах 20S протеасомы. Кроме
того, обнаружены изоформы протеасомы, в которых регуляторные частицы
замещены мультисубъединичным белковым комплексом PC530 или COP9
сигналосомой.
40.  Механизм распознавания аномальных белков.
Аномальные белки возникают в результате ошибок при синтезе, когда в
цепь встраивается неправильная аминокислота, или в результате химических
повреждений, таких, как окисление боковых цепей аминокислот.
Разнообразные мутантные формы обычных белков также распознаются в
качестве аномальных. Механизм «узнавания» аномальных или
нефункциональных белков неизвестен, скорее всего, важную роль в нем
играют особенности третичной структуры белков, и замена даже одной
аминокислоты сильно снижает устойчивость белка к внутриклеточному
протеолизу. Последнее обстоятельство может существенно мешать
получению микроорганизмов-сверхпродуцентов, у которых повышенное
образование целевого продукта обусловлено мутациями по
соответствующим ферментам. Такие ферменты будут восприниматься
системой узнавания как аномальные и подвергаться протеолизу, что
тормозит биосинтетические процессы, а иногда и рост микроорганизма.
Специфический протеолиз может дополнять регуляцию по механизму
катаболитной репрессии. Решающую роль играет протеолиз в так
называемой SOS-регуляции, т.е. активации SOS-регулона, включающего
около 20 генов, которые индуцируются в ответ на некоторые повреждения
ДНК и образуют продукты, участвующие в ее репарации. Среди этих
продуктов присутствует белок RecA, участвующий в ряде клеточных
процессов является более «быстродействующим» механизмом
и раньше откликается на изменение внешних условий, чем регуляция
биосинтеза этих посредников. Оба уровня регуляции необходимы для
координированного управления биохимическими процессами в клетке. В
свою очередь, процессы регуляции активности белковых посредников можно
разделить на две большие группы: регуляция активности путем обратимой
ковалентной модификации посредника и регуляция активности без
ковалентной модификации посредника.
41.Система убиквитинирования белков
Убиквитинлигаза (англ. E3 ubiquitin ligase) — фермент-лигаза, ковалентно
присоединяющий убиквитин к белку-мишени изопептидной связью.
Убиквитинлигазы являются частью системы убиквитинопосредованного
распада белка в протеасомах. Известно, что протеасома расщепляет не любые
белки, а только те, которые были «помечены» убиквитином.
Убиквитинлигазы специфично узнают белки-субстраты и участвуют в их
полиубиквитинировании (присоединении цепочек из молекул убиквитина),
которое, в конечном счёте, приводит к деградации последних в протеасомах.
Кроме этого, убиквитинлигазы осуществляют и другие модификации белков
убиквитином, такие как моноубиквитинирование и
мультиубиквитинирование, которые имеют регуляторное значение.
Механизм убиквитинирования белков. Процесс убиквитинирования белков
происходит в несколько стадий, ферменты, катализирующие отдельные его
этапы, получили условные названия Е1 (убиквитинактивирующий фермент),
Е2 (убиквитинконъюгирующий фермент) и Е3 (убиквитинлигаза). Фермент
Е1 АТФ-зависимо активирует убиквитин с формированием
высокоэнергетической тиоэфирной связи между карбоксильной группой С-
концевого остатка глицина убиквитина и остатком цистеина в молекуле Е1.
Затем активированный убиквитин переносится на молекулу Е2 с
формированием сходной тиоэфирной связи. Убиквитинлигазы
взаимодействуют одновременно с Е2 благодаря Е2-связывающему домену и
с белком-субстратом благодаря субстратсвязывающему домену. Они
осуществляют перенос активированного убиквитина с Е2 на субстрат либо
напрямую, либо через образование промежуточного тиоэфирного
соединения.Чаще всего убиквитин-лигазы катализируют образование
изопептидной связи между карбоксильной группой С-концевого остатка
глицина убиквитина и ε-аминогруппой одного из остатков лизина в белке-
мишени, реже связь образуется между убиквитином и N-концевой
аминогруппой или боковой цепью цистеина белка. После присоединения
первой молекулы убиквитина к субстрату Е3-ферменты последовательно
добавляют ещё несколько молекул, так же соединяя их изопептидной связью.
Эта модификация называется полиубиквитинированием. В молекуле
убиквитина присутствуют 7 остатков лизина, каждый из которых, как
считают, может участвовать в образовании изопептидной связи. Последствия
полиубиквитинирования зависят от того, какой из этих остатков был
задействован в формировании цепочки. Так, полиубиквитиновые цепи,
соединённые при участии Lys-48, чаще всего являются сигналом к
протеасомальной деградации (минимальная длина цепочки — 4 молекулы
убиквитина), а образованные через Lys-63 играют регуляторную роль в
эндоцитозе белков(процесс транспорта макромолекул внутрь клетки
( белков , полисахаридов , полинуклеотидов и т. д. ) и репарации ДНК. Также
выделяют и другие типы модификаций, катализируемых Е3-ферментами:
моноубиквитинирование (присоединение единственного остатка убиквитина)
и мультиубиквитинирование, или множественное моноубиквитинирование.
Моноубиквитинирование — довольно распространённая регуляторная
посттрансляционная модификация, которая может влиять на способность
белка взаимодействовать с другими молекулами, на его внутриклеточную
локализацию, а также может служить сигналом к его деградации в
лизосомах. Мультиубиквитинирование мембранных белков приводит к их
эндоцитозу и расщеплению в лизосомах. Убиквитинлигазы разделяют на три
семейства в зависимости от структуры домена, связывающего
убиквитинконъюгирующий фермент (E2): убиквитинлигазы, содержащие
HECT-домен(homologous to E6-AP carboxyl terminus), RING-домен (англ.
really interesting new gene) или U-бокс.
42. Роль контролируемого протеолиза в регуляции метаболизма у про- и
эукариот.
Протеолиз (проте [ины] + lysis разложение, распад) — ферментативный
гидролиз белков и пептидов, катализируется протеолитическими ферментами
(пептид-гидролазами, протеазами) и играет важную роль в регуляции обмена
веществ в организме.
Протеолитические ферменты играют ключевую роль в жизненном цикле
клеток всех организмов, представляющих три основных эволюционных
клеточных домена жизни - бактерии, эукариоты и археи.
Клетки эукариот содержат широкий спектр различных протеиназ,
локализованных практически во всех структурных компанентах клетки и
цитоплазме. Цитоплазматические долгоживущие белки, переносятся
эукариотическими клетками для деградации в лизосомы, а короткоживущие
цитоплазматические белки подвергаются деградации цитоплазматическими
протеолитическими системами. Таким образом, в клетках эукариот
интенсивная протеолитическая деградация белков
и пептидов осуществляется как в лизосомах, так и в цитоплазме. Деградации
белков в лизосомах.Лизосомы являются классическим компартментом
протеолиза, они содержат множество неспецифических протеиназ
различного типа. Во внутриклеточные процессы деградации белков в
значительной степени вовлечены цистеиновые протеиназы, а также
аспартатные, сериновые, металлопротеиназы и их ингибиторы. Лизосомы,
которые находят почти во всех клетках эукариот, крайне гетерогенны.
Существует множество путей, которыми внутриклеточные белки могут
доставляться в лизосомы для последующего протеолиза. Микро- и
макроаутофагии не проявляют селективности и различные белки, как и
другие субстраты, захватываются и доставляются в лизосомы с одинаковой
скоростью. Эндоцитоз, напротив, высоко селективен как в интернализации
белков плазматических мембран, так в последующем попадании их в
лизосомы. Путь импорта белков с участием АТФ для протеолиза в лизосомах
также высокоселективен и поставляет только цитозольные белки,
содержащие пептидный мотив, который биохимически родственен
следующей последовательности аминокислот Lys-Phe-Glu-Arg-Gln.
Деградация белков в цитоплазме. В отличии от лизосом цитоплазма
содержит протеиназы, высокоспецифичные по отношению к белкам, которые
отбираются в клетке для деградации. Открыты пути деградации белков, в
которых в различных комбинациях принимают участие олигопептид
убиквитин и убиквитиновая система, способная узнавать и метить белки,
подлежащие деградации, АТФ и полиферментный комплекс, называемый
протеасомой, который кроме нескольких типов протеолитической
активности обладает еще и АТФ-азной активностью, а также шапероны,
специфические белки, контролирующие свертывание (фолдинг)
полипептидных цепей, их миграцию и протеолиз. Изменение скоростей
синтеза и распада белков может играть решающую роль в адаптационных
процессах, связанных с дифференцировкой, ростом, гормональными
эффектами, питанием, атрофией и болезнями.
Прокариоты. Внутриклеточный селективный гидролиз белков, направленный
на поддержание низкого базального уровня регуляторных белков и быстрое
удаление мутантных, поврежденных и других опасных для клетки белков,
выполняется специфическими ферментами - АТР-зависимыми протеиназами.
Они объединяют в своей структуре АТРазные и протеолитические
компоненты и относятся к выявленному в 1990-х гг. суперсемейству ААА+-
белков. Исторически первой обнаруженной энергозависимой протеиназой
явилась Lon-протеиназа Escherichia coli. К настоящему времени в
бактериальных клетках выявлено четыре группы АТР-зависимых протеиназ:
Lon (подсемейство LonA), FtsH, ClpAP/XP и HslUV/CodWX.
43. Межклеточные коммуникации.
Есть данные о том, что «бактерии, как и все живые организмы, в процессе
жизнедеятельности получают, обрабатывают и используют информацию об
окружающем мире… Обмен информацией или ее получение от других
живых объектов называется коммуникацией» Микроорганизмы, и в их числе
бактерии, используют следующие каналы коммуникации:
Контактная коммуникация предполагает наличие межклеточных
контактов различных типов – цитоплазматических мостиков (плазмодесм),
участков слияния наружных мембран (у грамотрицательных бактерий) или
пептидогликановых клеточных стенок (у грамположительных бактерий).
Контактная коммуникация между клетками микобактерий Myxococcus
xanthus необходима для реализации поздних стадий формирования плодовых
тел. Межклеточные контакты формируются за счет многообразных
поверхностных структур, включая микрофибриллы, шишковидные
выступы, гликокаликс(клеточная оболочка).
Дистантная химическая коммуникация между пространственно
разделенными клетками. Многие из участвующих в дистантной химической
коммуникации веществ отвечают за координацию в масштабах колонии
(биопленки) процессов роста и развития клеток. Такие сигнальные вещества
обозначаются в литературе как ауторегуляторные вещества, или
ауторегуляторы и определяются как “микробные метаболиты, выделяемые
всей популяцией клеток или ее частью в окружающую среду, играющие
важную сигнальную роль и влияющие на физиологическое состояние и
репродуктивные способности организмов». Так, установлено , что в период
лаг-фазы и экспоненциальной фазы роста культура E. coli выделяет в среду
вещества, стимулирующие рост другой культуры E. coli (аутостимуляторы), а
в период замедления роста и в стационарную фазу – вещества,
ингибирующие рост другой культуры этой бактерии (аутоингибиторы).
Детально изучены так называемые кворум-зависимые (quorum-sensing, QS)
системы, ставящие под контроль плотности микробной популяции (кворума),
оцениваемой по концентрации вырабатываемых всеми клетками популяции
сигнальных веществ – феромонов (или аутоиндукторов), многие важные
процессы. К этим процессам относятся: люминесценция, синтез
антибиотиков и ферментных комплексов, межклеточный перенос
генетической информации (трансформация, конъюгация), клеточная
агрегация, секреция белков, формирование биоплёнок, споруляция,
образование факторов вирулентности и др. «Бактерии образуют малые, легко
диффундирующие молекулы, называемые аутоиндукторами, и когда эти
сигнальные вещества достигают критической концентрации,
соответствующие QS-системы активируются или репрессируются. У
некоторых, но не у всех объектов, сами QS-системы регулируются по
принципу положительной обратной связи (аутоиндукция)».
Так, у грамотрицательных бактерий в большинстве кворум-зависимых
систем аутоиндукторами (феромонами) служат ацилированные
гомосеринлактоны(АГЛ). Эти вещества связываются c R-белками, и
полученный комплекс активирует транскрипцию генов, отвечающих за
кворум-зависимые процессы. Если плотность бактериальных клеток
достаточно высокая, то бактерии предпринимают те или иные коллективные
действия. Например, морские бактерии Vibrio fischeri и V. harveyi начинают
светиться.
У грамположительных бактерий распространены quorum-sensing системы, в
которых роль феромонов (аутоиндукторов) играют пептиды, которые могут
быть линейными или включать в себя тиолактоновое кольцо. Эти QS-
системы являются двухкопонентными: содержат сенсорную гистидиновую
киназу, которая в ответ на связывания феромона фосфорилирует второй
компонент системы – белковый регулятор ответа. Запускается каскад киназ, в
конечном счете фосфорилирующий и тем самым активирующий белок,
который индуцирует транскрипцию определенного оперона ДНК.
Многие из изученных бактерий одновременно содержат несколько QS-
систем. QS-системы вступают в разнообразные взаимоотношения между
собой. Они могут функционировать параллельно или последовательно, могут
конкурировать или противодействовать друг другу.
Дистантная физическая коммуникация. В дистантной передаче
информации между клетками бактерий предполагается участие
электромагнитных и звуковых волн разных диапазонов. Еще в 20-30-е годы
ХХ века изучали «митогенетические лучи» (ультрафиолетовое излучение),
кванты которого испускаются живыми клетками и стимулируют деление
других клеток, в том числе и бактериальных. При изучении этих процессов
одни предполагали вклад электромагнитных волн разных диапазонов, другие
- роль ультразвуковых волн. В последующих изучениях было
продемонстрировано синергидное (взаимоусиливающее) действие различных
каналов межклеточной коммуникации, а именно химических сигналов и
физических полей.

44. Регуляция синтеза экзоферментов и антибиотиков у Erwinia.

Фитопатогенные бактерии Erwinia carotovora продуцируют довольно
широкий спектр гидролитических ферментов, деградирующих клеточные
стенки растений. К таким ферментам относятся пектатлиазы, целлюлазы,
полигалактуроназы и протеазы. Развитие этого патогена в растениях ведет к
индукции этих ферментов, результатом чего является мацерация
растительных тканей и развитие симптомов мягкой гнили. Продукция
внеклеточных ферментов зависит от накопления N-3-оксогексаноил-L-
гомосерин лактона, синтез которого детерминируется гомологами LuxI,
которые у разных штаммов называются ExpI, CarI и HslI. Рядом с геном expI
находится expR - гомолог luxR. Мутанты по гену expI имеют сниженную, а
по гену expR – повышенную продукцию экзоферментов.
Кроме того, некоторые штаммы Erwinia carotovora продуцируют β-лактамные
антибиотики широкого спектра действия - карбапенемы. Синтез
карбапенемов координирован с экспрессией экзоферментов и может служить
для ингибирования других бактерий при конкуренции за питательные
вещества, высвобождающиеся при мацерации растительных тканей. Синтез
карбапенемов контролируется парой белков CarR и CarI, гомологичных, но
не идентичных по своим функциям ExpR и ExpI. CarR и ExpR не
взаимозаменяемы, но АГСЛ (ацилированный гомосеринлактон),
продуцируемый CarI, идентичен таковому ExpI. Продукция экзоферментов у
Erwinia контролируется дополнительно еще несколькими регуляторными
системами.

45.Сенсорные системы
Для бактерий (как, впрочем, и для любого другого организма) способность
координировать экспрессию генов с изменениями условий окружающей
среды дает существенное селективное преимущество. Адаптация бактерий к
изменяющимся условиям среды контролируется белковыми системами
передачи сигнала. Такие системы состоят из белковых модулей-доменов,
собранных в несколько молекул, количество которых варьирует в
зависимости от вида бактерии и конкретного фактора среды. Основными
компонентами сенсорных систем являются:
 сенсоры (трансмембранные или цитоплазматические), детектирующие
изменения окружающих условий;
 внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и
передающие ее на эффекторы;
 эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа
(как правило, на уровне транскрипции).
Трансмембранные рецепторы.
Механизм детекции сигнала не совсем ясен. Детектируемый сигнал может
быть как вне-, так и внутриклеточным. В некоторых случаях показано, что
сигнал детектируется периплазматическим доменом. Так, PhoQ - регулятор
экспрессии факторов вирулентности у Salmonella typhimurium, - является
сенсором дивалентных катионов, которые, связываясь непосредственно с
периплазматическим доменом, стабилизируют неактивную конформацию
PhoQ. Сигнал может быть внутриклеточным. Рецептор Aer, участвующий в
регуляции аэротаксиса, детектирует внутриклеточный запас энергии,
связываясь с FAD. Еще один пример – детекция внутриклеточной
концентрации глутамина при регуляции азотного метаболизма. В ряде
случаев показано, что сенсором является трансмембранный домен. Так, Cpx-
путь активирован у мутантов E. coli, лишенных фосфатидилэтаноламина -
таким образом, простое нарушение мембранной структуры приводит к
активации этого сигнального пути. У белка EnvZ E. coli - гистидинкиназы,
участвующей в осморегуляции, периплазматический домен может быть
делетирован без потери сенсорной функции.
Механизм передачи сигнала.
Многие бактериальные рецепторы имеют периплазматический домен-
детектор (P) и
цитоплазматический сигнальный домен (C), заякоренные в мембране двумя
α-спиральными трансмембранными сегментами. Линейная структура таких
белков может быть представлена как TM1–P–TM2–L–C, где L -
цитоплазматический линкер. Сигнальный домен либо сам является
гистидинкиназой (EnvZ) либо с гистидинкиназой
взаимодействует (MCP рецепторы хемотаксиса).
Механизм передачи сигнала с сенсорного на сигнальный домен неясен.
Рецепторы обычно являются мембранными белками, гомодимерами.
Предполагалось, что конформационные изменения, возникающие при
связывании субстрата, передаются через мембрану на цитоплазматические
домены рецептора, что влияет на взаимодействие сигнальных доменов между
собой. Однако делеция одного из двух сигнальных доменов (равно как и
удаление всех трансмембранных сегментов) у димера не лишает его
активности.
Двухкомпонентная система состоит из двух белков –гистидиновой
протеинкиназы
(ГК), содержащей консервативный киназный домен и регулятора ответа (РО),
содержащего консервативный регуляторный домен.
Внеклеточные сигналы детектируются ГК, что приводит к изменению ее
активности.
Затем ГК передает фосфогруппу на РО (реакцию катализирует сам РО).
Перенос фосфата на РО приводит к активации эффекторного домена этого
белка, что и вызывает в конечном итоге специфический физиологический
ответ.
46. Общие принципы сенсорной регуляции.
Все живые организмы нуждаются в информации об окружающей среде.
Бактерии способны улавливать и определять малейшие изменения в
окружающей среде. Эту возможность обеспечивают сенсорные (от лат.
sensus — чувство, ощущение, восприятие) системы. Сенсорные системы
бактерий похожи на подобные системы в клетках высших организмов.
Основными компонентами сенсорных систем являются:
 сенсоры (трансмембранные или цитоплазматические), детектирующие
изменения окружающих условий;
 внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и
передающие ее на эффекторы;
 эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа
(как правило, на уровне транскрипции).
У бактерий преобладают двухкомпонентные сенсорные системы, в них 2
белка регулируют передачу сигнала:
1-й белок сенсор;
2-й белок регулятор.
Белок-сенсор реагирует на изменения определенных параметров
окружающей среды (напр., на концентрацию веществ), передаёт сигнал на
белок-регулятор, который координирует поведение бактерий в зависимости
от условий окружающей среды.
Механизм действия 2-ухкомпонентных сенсорных систем. После
поступления сигнала извне на белок-сенсор он автофосфорилируеся.
Воздействует на белок-регулятор, в котором при этом фосфорилируется
аспарагиновый участок. После фосфорилирования белок-регулятор действует
на определенные участки генома, регулируя активность определенных генов.
Белок-регулятор может выступать в роли активатора, а также в роли
репрессора.
47. . Передача информации через клеточную мембрану.
Важное свойство мембран - способность воспринимать и передавать внутрь
клетки сигналы из внешней среды. "Узнавание" сигнальных молекул
осуществляется с помощью белков-рецепторов, встроенных в клеточную
мембрану клеток-мишеней или находящихся в клетке. Клетку-мишень
определяют по способности избирательно связывать данную сигнальную
молекулу с помощью рецептора.

Если сигнал воспринимается мембранными рецепторами, то схему

передачи информации можно представить так:

 взаимодействие рецептора с сигнальной молекулой (первичным

посредником);
 активация мембранного фермента, ответственного за образование
вторичного посредника;
 образование вторичного посредника цАМФ, цГМФ, ИФ3, ДАТ или
Са2+;
 активация посредниками специфических белков, в основном
протеинкиназ, которые, в свою очередь, фосфорилируя ферменты,
оказьюают влияние на активность внутриклеточных процессов.

Несмотря на огромное разнообразие сигнальных молекул, рецепторов и

процессов, которые они регулируют, существует всего несколько механизмов
трансмембранной передачи информации: с использованием
аденилатциклазной системы, инозитолфосфатной системы, каталитических
рецепторов, цитоплазматических или ядерных рецепторов.
48. Белковые каналы, транспортеры и рецепторы. Рецепторная
функция воротных каналов.
Воротный механизм белковых каналов обеспечивает способ регуляции
ионной проницаемости каналов. Полагают, что некоторые ворота фактически
являются удлинением транспортной белковой молекулы, которое может
закрывать или открывать отверстие канала при кон-формационном
изменении формы самой белковой молекулы. Открытие и закрытие ворот
регулируется двумя основными способами. Электроуправляемые ворота. В
этом случае молекулярная конформация ворот или их химических связей
соответствует электрическому потенциалу на клеточной мембране.
Напротив, когда внутренняя сторона мембраны теряет отрицательный заряд,
эти ворота могут внезапно открываться, позволяя громадному числу ионов
натрия проходить через натриевые поры. Это основной механизм генерации
в нервах потенциалов действия, ответственных за проведение нервных
сигналов.Открытие этих ворот частично обусловливает завершение
потенциала действия. 2. Хемоуправляемые (лигандуправляемые) ворота.
Некоторые ворота белковых каналов открываются при связывании с белком
химического вещества лиганда. Это ведет к конформационному или
химическому изменению в белковой молекуле, что открывает или закрывает
ворота. Такой воротный механизм называют химическим, или лигандным.
Одним из наиболее важных примеров химического воротного механизма
является действие ацетилхолина на так называемый ацетилхолиновый канал.
Ацетилхолин открывает ворота этого канала, в результате появляется
отрицательно заряженная пора диаметром около 0,65 нм, через которую
могут проходить незаряженные молекулы или положительные ионы
меньшего диаметра. Эти ворота исключительно важны для передачи нервных
сигналов от одной нервной клетки к другой и от нервных клеток к
мышечным, что необходимо для мышечного сокращения. Открытое и
закрытое состояние воротных каналов. Примечательно, что канал проводит
ток по принципу «все или ничего». Это значит, что ворота канала резко
открываются и затем также резко закрываются, причем в открытом
состоянии канал находится от долей миллисекунды до нескольких
миллисекунд. При одном уровне потенциала канал может оставаться
практически все время закрытым, а при другом уровне — почти все время
открытым. Как показано при промежуточных уровнях мембранного
потенциала ворота натриевого канала имеют склонность периодически
быстро открываться и закрываться, обеспечивая среднее значение тока.
Метод «пэтч-кламп» для регистрации ионного тока, протекающего через
одиночные каналы. Показанную на рис. 4-5А регистрацию ионного тока,
протекающего через одиночные белковые каналы, технически осуществляют
с помощью метода «пэтч-кламп». Микропипетку с диаметром кончика не
более 1-2 мкм подводят вплотную к мембране с наружной стороны. Затем
изнутри пипетки создают отрицательное давление, благодаря чему
расположенный напротив участок мембраны подсасывается к кончику
пипетки, формируя плотный контакт с его краями. В результате можно
регистрировать электрический ток, протекающий через очень маленький
кусочек («пэтч») мембраны у верхушки пипетки. Кроме того маленький
кусочек клеточной мембраны на конце пипетки можно вырвать из клетки.
Затем пипетку с герметически сцепленным с ней кусочком помещают в
любой раствор. Это позволяет, по желанию экспериментатора, изменять
состав раствора как внутри пипетки, так и снаружи, а также поддерживать на
любом заданном уровне разность потенциалов между двумя сторонами
мембраны, т.е. фиксировать («кламп») напряжение. Можно выделить такой
малый участок мембраны, что в нем обнаруживается лишь один белковый
канал, доступный для изучения. Путем изменения концентраций разных
ионов и напряжения по обе стороны мембраны можно определять
транспортные характеристики одиночного канала и свойства его воротных
механизмов.
49. Двухкомпонентные сенсорные системы
Типичная двухкомпонентная система состоит из двух белков –
гистидиновой протеинкиназы (ГК), содержащей консервативный киназный
домен и регулятора ответа (РО), содержащего консервативный
регуляторный домен. Внеклеточные сигналы детектируются ГК, что
приводит к изменению ее активности. Затем ГК передает фосфогруппу на
РО (реакцию катализирует сам РО). Перенос фосфата на РО
приводит к активации эффекторного домена этого белка, что и вызывает в
конечном итоге специфический физиологический ответ. В основе работы
двухкомпонентной системы лежат три реакции, дающие два
фосфорилированных продукта. Хоть ГК и похожи по своей основной
функции (фосфорилирование белков) на "классические" Ser/Thr/Tyr
киназы, химизм реакции принципиально отличается – ГК образует не
фосфоэфирную, а фосфоамидную связь. Реакция гидролиза фосфоамидной
связи имеет гораздо большее отрицательное значение ∆G по сравнению с
гидролизом фосфоэфирной связи, поэтому равновесие р-и сдвинуто в
сторону нефосфорилированного белка ГК. Следовательно, только очень
небольшой процент ГК существует в фосфорилированном виде => не
фосфорилирование ГК как таковое, а перенос фосфата является основным в
работе этого фермента. Богатая энергией связь N~P идеально подходит для
передачи фосфата. Именно поэтому такая же связь используется хорошо
знакомыми вам ферментами I и II ФТС, основной функцией которых
является также не фосфорилирование как таковое, а передача фосфата "по
цепочке" в направлении его конечного акцептора – фосфорилируемого
сахара. В молекуле РО фосфорилируется остаток аспартата.
Предположительно, именно этот остаток используется, т.к.
фосфорилирование его длинной ацильной цепи вызывает протяженные
конформационные изменения в молекуле РО, необходимые для изменения
эффекторной активности. Еще одним важным свойством фасфоаспартата
является быстрый гидролиз ацилфосфата как в кислой, так и в щелочной
среде. К тому же, многие РО имеют автофосфатазную активность, еще более
уменьшающую время полужизни фосфоаспартата. Таким образом, основным
результатом выбора для фосфорилирования специфических остатков в
молекулах ГК и РО является высокая мобильность системы. При отсутствии
стимула оба компонента будут дефосфорилированы. Детекция стимула
гистидинкиназой вызовет ее фосфорилирование и очень быструю передачу
фосфата молекуле регулятора ответа, что приведет к быстрому ответу
бактерии на изменившиеся условия. В свою очередь, легкость
дефосфорилирования молекулы РО приведет к быстрому возвращению всей
регуляторной системы, а вместе с ней и метаболизма бактериальной
клетки, в исходное (нефосфорилированное) состояние при исчезновении
стимула, вызвавшего первоначальное фосфорилирование ГК.

50. Регуляторы:
Регуляторный домен.
Наиболее консервативная часть белка, содержит кластер остатков аспартата,
которые связывают Mg2+ и формируют активный сайт для переноса фосфата
Эффекторный домен
Эффекторным доменам сложно дать общую характеристику по причине их
большогоразнообразия. Большинство эффекторных доменов имеет ДНК-
связывающую активность и действиет путем активации или репрессии
транскрипции специфических генов. Тем не менее, узнаваемые
последовательности ДНК, расположение сайтов связывания и механизм
транскрипционной регуляции существенно различаются, даже у РО из
одного подсемейства.
Сенсоры:
Линкерный домен
У трансмембранных ГК периплазматический сенсорный домен соединяется с
цитоплазматическим киназным ядром при помощи трансмембранной α-
спирали и цитоплазматического линкера. Линкерные домены совершенно
необходимы для нормального функционирования сенсорных ГК, однако об
их функциях известно немного. Размер линкеров варьирует в пределах 40-
180 АК. Многие из них имеют характерный α-спиральный coiled coil мотив, в
большинстве случаев предшествующий фосфорилируемому гистидиновому
остатку киназного ядра. Две наиболее вероятные функции линкерных
доменов – правильное расположение мономеров в димере ГК и передача
сигнала от сенсорной к киназной части белка.
Каталитическое киназное ядро.
Унифицирующим структурным свойством семейства ГК является
характерное киназное ядро, состоящее из домена димеризации и АТФ/АДФ-
связывающего фосфотрансферного или каталитического домена.
Киназное ядро имеет размер ~350 АК и отвечает за связывание АТФ и
осуществление киназной реакции. Консервативный остаток гистидина,
являющийся субстратом киназной реакции, располагается в домене
димеризации.
HPt-домены у прокариот встречаются исключительно в составе гибридных
киназ, тогда как у эукариот – как отдельные белки. Эти домены имеют
размер около 120 АК и содержат остаток гистидина, способный
участвовать в фосфотрансферных реакциях. HPt-домены не имеют ни
киназной, ни фосфатазной активности, поэтому они идеально приспособлены
для коммуникации между различными белками. При всем разнообразии
первичных последовательностей HPt-доменов их третичная структура очень
схожа и напоминает таковую домена димеризации киназного ядра, включая
расположение консервативного гистидинового остатка.
Сенсорный домен
Изменения в окружающей среде детектируются непесредственно (или
опосредованно) аминоконцевым сенсорным доменом ГК. Между
разнообразными мембранными сенсорными доменами практически
полностью отсутствует сходство на уровне первичной последовательности,
что поддерживает идею о специфичности детектируемых ими
взаимодействий. В большинстве случаев специфический стимул и механизм
его детекции остаются неизвестными. Информация о трехмерной структуре
этих доменов начинает появляться только сейчас, поэтому как сигнал
передается к киназному ядру, пока не ясно.

51. Архитектура регуляторных систем

Элегантность двухкомпонентных систем заключается в их модулярности.
Простейшая сигнальная система может состоять из одной пары
ГК(гистидиновая протеинкиназа)-РО(регулятор ответа). В более сложных
случаях домены, входящие в состав ГК и РО, а также HPt-домены могут
комбинироваться, образуя уже сигнальную цепочку или даже сеть,
известную под названием фосфотрансляционная система (система передачи
фосфата). Классические двухкомпонентные системы доминируют у
прокариот, тогда как фосфотрансляционные системы чаще встречаются у
эукариот (хотя прокариотические примеры тоже имеются). Дополнительная
сложность фосфотрансляционных систем позволяет ввести дополнительные
стадии контроля а также возможность взаимодействия между различными
сигнальными путями. Большинство регуляторных систем устроены просто.
Трансмембранная сенсорная ГК посредством одной реакции передачи
фосфата активирует цитоплазматический РО, который вызывает
соответствующий адаптивный ответ. Фосфотрансляционные системы
Еще более усложненные версии двухкомпонентных систем используют более
одного акта передачи фосфата. Такие сигнальные пути называют
фосфотрансляционными системами (системами передачи фосфата). В
простейшем случае фосфотрансляционная система удлиняет цепочку
передачи фосфата на два шага, Asp -> His и His -> Asp. Таким образом,
базовая фосфотрансляционная система имеет уже четыре
фосфорилированных белковых продукта и пять реакций переноса фосфата.
Множественные фосфорилируемые домены фосфотрансляционных систем
создают возможность альтернативных путей передачи фосфата. В гибридной
ГК ArcB любой из имеющихся His-содержащих доменов (димеризационный
или же HPt) может получить фосфат от АТФ и передать его РО ArcA. Два
различных варианта используются в аэробных и анаэробных условиях.
Еще более сложная организация может достигаться за счет интеграции
различных сигнальных цепочек в сигнальные сети. У B. subtilis практически
каждая двухкомпонентная система взаимодействует с как минимум еще
одной цепочкой передачи фосфата. В качестве примера такой
интеграции можно привести взаимодействие путей, контролирующих
утилизацию фосфата аэробного и анаэробного дыхания и споруляцию.
Дыхание и утилизация фосфата регулируются совместно – фосфо-PhoP
активирует экспрессию ResD и наоборот. Однако, когда клетка вступает на
путь споруляции, и дыхание, и утилизация фосфата репрессируются,
поскольку фосфо-Spo0A негативно регулирует фосфорилированные ResD и
PhoP.
52. Распространенность двухкомпонентных систем
Двухкомпонентные сигнальные системы с участием фосфорилируемых
остатков гистидина и аспартата наиболее часто встречаются у бактерий.
Несмотря на обнаружение таких систем у эукариот, здесь в сигнальных цепях
доминируют сигнальные каскады с переносом фосфата между остатками
серина, треонина и тирозина. С друкой стороны, Ser/Thr/Tyr киназы у
прокариот тоже имеются. Пока нет удовлетворительного объяснения
предпочтительному использованию той или иной системы у про- и эукариот.
Количество генов, кодирующих белки двухкомпонентных систем,
значительно варьирует в геномах различных организмов – от 0 у Mycoplasma
genitalium до 2.5% генома у Synechocystis sp.
У эукариот пока описаны лишь единичные примеры ГК(гистидиновая
протеинкиназа) и РО(регулятор ответа), однако у некоторых организмов их
число больше – так, у слизевика Dictyostelium discoideum имеется как
минимум 11 ГК. Кроме того, эукариотические системы имеют ряд отличий
от прокариотических. Прежде всего, гибридные ГК, - 29 - содержащие и РО
домен, редки у прокариот (5 из 30 ГК у E. coli), тогда как у эукариот все
описанные ГК гибридные (с пока единственным исключением).
Прокариотические РО являются, как правило,
транскрипционными факторами, тогда как только один из описанных пока
эукариотических РО имеет ДНК-связывающий домен.

53. Хемотаксис у бактерий

Хемотаксис - способность бактерий двигаться по направлению к
аттрактантам (зачастую питательным веществам) и от репеллентов
(например,токсинов). В качестве аттрактантов выступают практически все
сахара и аминокислоты, в качестве репеллентов - жирные кислоты, спирты и
другие потенциально вредоносные вещества. Чувствительность бактерий
впечатляет - они легко детектируют изменение концентрации на 0.1% при
микромолярных концентрациях веществ, а диапазон детектируемых
концентраций перекрывает пять порядков. Аттрактанты и репелленты
детектируются за счет непосредственного взаимодействия со
специфическими хеморецепторами, а не за счет каких-либо внутриклеточных
эффектов детектируемого вещества. Мембранные рецепторы группируются в
кластеры, как правило расположенные на полюсах клетки, однако это не
может помочь бактерии уловить разницу концентраций между полюсами,
поскольку она будет слишком маленькой из-за малого размера самой клетки.
Вместо этого бактерии ориентируются в химических градиентах путем
измерения временных изменений концентраций при движении. Обычно
скорость движения эшерихии составляет 10-20 своих длин в секунду.
Сравнивая текущую загруженность хеморецепторов специфическими
лигандами с таковой несколько секунд назад, клетка фактически может
"измерить" разницу концентраций определенного вещества на расстоянии, во
много раз превышающем длину самой клетки. Такое измерение
концентрации лиганда во времени возможно за счет адаптивного
метилирования хеморецепторов, которое зависит от загруженности их
лигандами. Задержка во времени между связыванием лиганда и
метилированием рецептора представляет собой своеобразную молекулярную
"память", которая и позволяет измерять изменение концентраций лиганда.
Если выбранное направление движения соответствует увеличению
концентрации аттрактанта (снижению концентрации репеллента), время до
следующего кувыркания увеличивается. К сожалению, из-за своего малого
размера клетка постоянно сбивается с "верного" пути броуновским
движением и поэтому просто не может продолжительно двигаться прямо.
Такой механизм поэтому только в общем обеспечивает движение бактерии
по градиенту концентрации в нужном направлении, но для бактерий является
достаточно эффективным. Механизм, основанный на переключении
направления вращения жгутиков, приводящий к прямолинейному движению,
которое через варьирующие промежутки времени сменяется кувырканием
на месте, не является единственным. У Rhodobacter sphaeroides вращение
единственного жгутика сменяется его полной остановкой, а у Rhizobium
meliloti вращение жгутика никогда не прекращается – изменяется только его
скорость. Но во всех этих случаях результат работы сенсорной системы
хемотаксиса один и тот же – если бактерия движется в "нужном"
направлении, продолжительность такого движения увеличивается.
Сенсорный механизм хемотаксиса более сложен, чем рассмотренные нами
ранее. Это объясняется прежде всего двумя причинами. Во-первых,
поскольку броуновское движение может очень быстро изменить ориентацию
бактериальной клетки, клетки должны обрабатывать хемотаксические
сигналы очень быстро, и, действительно, от стимула до переключения
"моторов" у клетки проходит не более 0.2 секунды. Во-вторых, для
правильного сравнения пространственных градиентов клеткам необходимо
такое устройство сенсорного механизма, которое "гасило" бы сенсорную
стимуляцию в статических условиях, т.е. в отсутствии градиента
концентрации, как бы много какого-то аттрактанта или репеллента ни
присутствовало бы в среде.

4. Устройство и принцип действия двигательного аппарата бактерий

Движение бактерий рассмотрим на примере E. coli .Эта бактерия
передвигается за счет вращения своих жгутиков, которые действуют как
винты корабля.Каждая бактерия может иметь 6 или более "винтов",
разбросанных по поверхности клетки случайным образом. Хотя каждый
"винт" вращается независимо, но при вращении против часовой стрелки нити
жгутиков сближаются за счет гидродинамических сил и образуют пучок,
вращающийся в одну сторону позади клетки. Вращение против часовой
стрелки приводит к более-менее прямолинейному поступательному
движению бактерии, тогда как вращение по часовой стрелке заставляет
бактерию кувыркаться на месте. В результате при последующем
переключении направления вращения жгутика бактерия начнет двигаться в
случайном направлении. В однородной среде бактерия кувыркается
примерно раз в секунду.Нить жгутика является тонкой ровной трубкой,
созданной из уложенных спирально молекул одного единственного белка –
флагеллина. Длина жгутикового филамента варьирует и может достигать10
длин тела бактерии. Нить жгутика прикрепляется к базальному телу при
помощи полого гибкого крюка. Крюк прикреплен к оси – полой прямой
трубке, составляющей основу ротора жгутика. Ось окружена тремя кольцами
– двойным MS кольцом, находящимся в цитоплазматической мембране
ислегка выступающим из нее, P кольцом в слое пептидогликана и L кольцом
в наружной мембране.Специфическая для компонентов жгутика система
секреции III типа, располагающаяся в базальном теле, транспортирует через
мембрану белки оси,крюка и нити в правильной последовательности и
внужных количествах. Секретируемые компоненты поступают к месту
сборки формирующегося жгутика через полость в его центре.Вращение
жгутика обеспечивается молекулярным мотором, способным
переключатьнаправление вращения.Источником энергии для работы мотора
служит трансмембранный протонный градиент. Моторно-переключательный
комплекс крепится на цитоплазматической стороне MS кольца и
образуетколоколообразную структуру, известную как C-кольцо. Этот
комплекс содержит три белка (FliG,FliM и FliN), участвующие в генерации
вращательного монента и переключении направления вращения. Считается,
что этот комплекс вращается вместе с MS кольцом, осью,крюком и нитью.
Статор мотора сделан из двух белков, окружающих MS кольцо.
Карбоксиконцевой домен одного из этих белков, MotB, закреплен в
клеточной стенке, а четыре гидрофобных спирали MotA взаимодействуют с
аминоконцевой мембранной α-спиралью, образуя проводящий протоны канал
через цитоплазматическую мембрану.

55. Регуляция синтеза жгутикового аппарата

Более 40 генов, кодирующих белки,необходимые для биосинтеза
жгутиков,организованы в несколько оперонов. Естественно,что экспрессия
такого количества генов находится под строгим контролем. Контроль в
данном случае организован иеархически. На вершине иерархии находится
flhDC оперон, кодирующий два белка, из которых собирается
гетеротетрамерный активации транскрипции генов второго "уровня". Многие
глобальные регуляторы, такие, например, как БАК, DnaA, связанный с
нуклеоидом белок H-NS,влияют на уровень экспрессии оперона flhDC и на
образование жгутиков.Транскрипция генов первых двух уровней
обеспечивается РНК-полимеразой с основным сигма-фактором (RpoD).
Продуктами генов второго уровня являются белки,входящие в
составбазального тела жгутика и крюка, а также регуляторные белки FlgM и
FliA. FliA кодирует альтернативный сигма-фактор σ28 или σ F,необходимый
для экспрессии генов третьего, и последнего уровня , а FlgM является анти-
сигма фактором, ингибирующим активность FliA. Когда секреторный
аппарат (базальное тело жгутика) и крюк собираются, FlgM экспортируется
из клетки и освобождает FliA, который наконец может активировать поздние
гены жгутика.

56. Белковый аппарат хемотаксиса. Рецепторы хемотаксиса.

Три класса белков участвуют в хемотаксисе: трансмембранные рецепторы,
цитоплазматические сигнальные белки и ферменты адаптивного
метилирования.
Рецепторы хемотаксиса. Многие бактерии детектируют хемотаксические
стимулы при помощи рецепторов, известных как метилируемые белки
хемотаксиса. Эти белки являются мембранными сенсорами, в принципе
аналогичными по своей структуре EnvZ, с тем только отличием,что
цитоплазматический сигнальный домен не является автокиназой. Функцию
автокиназы выполняет другой белок - CheA, а сигнальные домены
MCP(моноцитарный хемотаксический протеин) обеспечивают
взаимодействие с CheA. Еще одно отличие от типичного сенсора - по обе
стороны сигнального домена располагаются сайты метилирования,
необходимые для адаптации рецепторов. MCP белки состоят из ок. 550 ак, и
явл. димерами. Хорошо изучены 4 MCP из E. coli, реагирующие на серин
(Tsr), аспартат и мальтозу (Tar),рибозу, глюкозу и галактозу (Trg) и
дипептиды (Tap). У сальмонелл нет Tap, но есть сенсор цитрата Tcp. Серин,
аспартат и цитрат связываются непосредственно с рецепторами, тогда как
сахара и дипептиды сначала связываются с соответствующими
периплазматическими белками, а уже эти комплексы взаимодействуют с
рецепторами. Кроме того, MCP реагируют наизменения температуры и pH, а
также являются рецепторами для различных репеллентов.
Классический рецептор состоит из
• аминоконцевой трансмембранной спирали,
• периплазматического собственно сенсорного домена, сложенного из
четырех α−спиральных участков,
• второй трансмембранной спирали
• большого цитоплазматического сигнального
и адаптационного домена.
Цитоплазматические домены сенсоров содержат 4 или 5 остатков глутамата,
доступных для метилирования.

57. Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм

хемотаксиса
Взаимодействие между рецепторами и переключателем жгутика
осуществляется 4 белками:
♦ CheA – ГК(гистидиновая протеинкиназа)
♦ CheY – РО(регулятор ответа)
♦ CheW - "адаптор" между рецептором и CheA
♦ CheZ - белок, способствующий дефосфорилированию CheY~Ф
Пара белков CheA-CheY представляет собой двухкомпонентную
регуляторную систему. CheY не является транскрипционным фактором и у
него отсутствует ДНК- связывающий домен. ГК CheA функционирует в виде
димера, с которым связываются два мономера CheW, и уже этот комплекс
вступает в ассоциацию с димерным рецептором. В составе такого комплекса
автокиназная активность резко возрастает, что усиливает перенос фосфата от
CheА~Ф к CheY. CheY~Ф связывается с FliM моторно-переключательного
комплекса базального тела, что приводит к вращению жгутика по часовой
стрелке. CheZ предотвращает накопление CheY~Ф, стимулируя
автофосфатазную активность CheY. При отсутствии аттрактанта
концентрация CheY~Ф поддерживается на уровне, способствующем
вращению жгутика преимущественно по часовой стрелке и отсутствию
упорядоченного движения бактерии. Связывание аттрактанта с рецептором
индуцирует конформационное изменение, которое передается через
мембрану и подавляет автокиназную активность CheA. Концентрация
CheY~Ф падает, и жгутики бактерии более продолжительное время
вращаются против часовой стрелки. Поэтому клетки будут дольше двигаться
прямолинейно, если они попадают в среду с более высокой концентрацией
аттрактанта. Однако этот механизм не объясняет, как клетка может
реагировать на постоянно возрастающую концентрацию аттрактанта.

58. Компоненты сигнальных путей (рецепторы, G-белки, адаптеры,

эффекторы, вторичные мессенджеры).
Рецептор воспринимает экстраклеточный сигнал и запускает каскадный
сигнальный механизм внутри клетки. Клетки обладают разными типами
специализированных рецепторов, распознающих определенный вид сигнала.
G-белки — особые сигнальные молекулы, обладающие GTPазной
активностью,были обнаружены и исследованы А.Гилманом и М. Родбеллом,
которые получили за это открытие Нобелевскую премию по физиологии и
медицине.G-белки делятся на две основных группы — гетеротримерные
(«большие») и «малые». Гетеротримерные G-белки — это белки с
четвертичной структурой, состоящие из трёх субъединиц: альфа(α), бета (β) и
гамма (γ). Малые G-белки — это белки из одной полипептидной цепи. Обе
группы G-белков участвуют во внутриклеточной сигнализации.
Гетеротримерные G-белки.У всех гетеротримерных G-белков сходный
механизм активации: они активируются при взаимодействии со
специфическими рецепторами, сопряженными с G-белками, при этом
обменивая ГДФ на ГТФ и распадаясь на α- и βγ-субъединицы.
Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров
рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с
адаптерами . Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во
взаимодействие с эффекторами.Адаптерные белки организуют белок-
белковые взаимодействия через входящие в их состав SH2 и SH3 домены ,
передавая сигнал от рецепторов факторов роста к последующим эффекторам.
Эффектор формирует конечные сигналы управления и посылает их
к объекту управления системы.
Вторичные мессенджеры — это низкомолекулярные органические
соединения или ионы, способные обеспечивать дальнейшую передачу
сигнала путем аллостерической регуляции. Активация последующих
компонентов сигнальной цепи вторичными мессенджерами осуществляется
при достижении ими определенной концентрации. На уровне эффекторов
обеспечивается усиление сигнала, так как они синтезируют большое
количество вторичных посредников, которые могут активировать множество
последующих сигнальных посредников или конечных мишеней.

59. Киназы как компоненты сигнальных путей, типы протеинкиназ.

Сигнальные пути MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа) —
группа мультифункциональных внутриклеточных сигнальных путей,
содержащих одну из митоген-активируемых протеинкиназ и
контролирующих транскрипцию генов, метаболизм, пролиферацию и
подвижность клеток и другие процессы. Сигнальные пути MAPK
консервативны у эукариот и содержат характерный модуль, состоящий из
трёх протеинкиназ. Эти пути активируются внеклеточными сигналами,
такими как гормоны, факторы роста, хемокины и нейротрансмиттеры,
которые распознаются
соответствующими рецепторными тирозинкиназами или рецепторами,
ассоциированными с G-белками. Рецепторы
активируют ГТФазы семейств Ras и Rho. ГТФазы передают сигнал на
модуль, состоящий из киназы киназы митоген-активируемой киназы,
которая фосфорилирует и активирует киназу митоген-активируемой киназы,
которая, в свою очередь, активирует митоген-активируемую киназу. MAPK
фосфорилируют белки-мишени по остаткам серина и треонина и таким
образом передают сигнал дальше. Кроме киназ, в состав сигнальных путей
входят протеинфосфатазы и белки, которые обеспечивают сборку белковых
комплексов.
Существует три типа протеинкиназ: Тирозинкиназы, серин/треонин
протеинкиназы, которые обычно локализуются в цитоплазме, и
протеинкиназы, которые могут фосфорилировать белки как по тирозину, так
и по серину с треонином. Помимо рецепторных тирозин киназ существуют и
тирозинкиназы, которые располагаются в цитоплазме клетки.
Тирозиновые протеинкиназы — ферменты, которые переносят фосфатную
группу от АТФ наостаток аминокислоты тирозина в белке. Большинство
тирозиновых киназ имеют сопряженные тирозинфосфатазы. Тирозиновые
киназы классифицируют на две группы: цитоплазматические и
трансмембранные (связанные с рецептором). Структура: АТФ-связывающий
сайт, три АК-остатка,ассоциируемых со связыванием третьей фосфатной
группы молекулы АТФ, связанной с энзимом, и возможный каталитический
сайт, являющийся аминокислотой. Серин-треониновые протеинкиназы
фосфоририруют гидроксильную группу в остатках серина или треонина.
Активность этих протеинкиназ регулируется несколькими событиями
(например, повреждениями ДНК), а также некоторыми химическими
сигналами, в том числе, cAMP, cGMP, диацилглицеролом,
Ca2+кальмодулином.

60. Способы передачи сигнала через клеточную мембрану

Важнейшим этапом, контролирующим функцию клеток, является момент
превращения внеклеточных сигналов во внутриклеточные. Существует две
группы механизмов, обеспечивающих трансмембранную передачу сигнала.
Они различаются по способности связываться с рецепторами наружной
мембраны клетки: ряд сигнальных молекул связывается с ними, другие – нет.
Передача сигнала, не требующая наличия рецепторов на поверхности
клетки. Относительно небольшое количество сигнальных молекул
представлено веществами с низкой молекулярной массой или высокой
степенью гидрофобности. В результате они достаточно легко преодолевают
плазматическую мембрану за счет диффузии. Их классификация основана на
особенностях взаимодействия с внутриклеточными компонентами.
Выделяют две основные группы сигнальных молекул:
1. Сигнальные молекулы, взаимодействующие с внутриклеточными
рецепторами. Наиболее известными представителями являются стероидные
(кортизол, эстрадиол, тестостерон) и тиреоидные (тироксин) гормоны.
Пройдя через плазматическую мембрану, они связываются с белками,
находящимися в цитозоле или ядре. Указанные рецепторные молекулы
представляют собой генные регуляторные белки (gene regulatory
proteins),изначально находящиеся в клетке в неактивном состоянии. Под
действием гормонов они претерпевают большие конформационные
изменения, что приводит к их связыванию с регуляторными участ-
ками цепочки ДНК. Как следствие, инициируется или прекращается
транскрипция определенных генов. Характерными особенностями данной
группы веществ являются: • большой латентный период действия: видимый
эффект развивается спустя некоторое время (от 30 минут до нескольких
часов), затрачиваемое на синтез новых белков; • продолжительное действие:
развившийся эффект может сохраняться в течение нескольких часов (дней),
даже после того, как концентрация действующего вещества во внеклеточной
жидкости снижается до нуля.
2. Сигнальные молекулы, напрямую изменяющие ферментативную
активность белка. Самым известным представителем является монооксид
азота (NO), относящийся к группе газообразных медиаторов. За счет своих
малых размеров NO быстро пересекает мембрану и, попадая в цитозоль,
взаимодействует с гуанилатциклазой, катализирующей образование цГМФ,
важнейшего внутриклеточного посредника . В отличие от гормонов, эффект
развивается в течение нескольких секунд и сохраняется не столь
продолжительное время.Передача сигнала, требующая наличия рецепторов
на поверхности клетки. Большинство сигнальных молекул относится к
гидрофильным высокомолекулярным веществам, неспособным пересекать
цитоплазматическую мембрану ни путем диффузии, ни за счет каких-либо
других систем транспорта. В этом случае рецепторы пронизывают мембрану,
что дает им возможность распознать сигнал на ее наружной поверхности со
стороны внеклеточного пространства и обеспечить его передачу внутрь
клетки. При этом сигнальная молекула не переносится через мембрану.
61. Типы трансмембранных рецепторов и механизмы их активации.
ТР.— мембранные Б., которые размещаются, и работают не только во
внешней клеточной мембране, но и в мембранах
компартментов и органелл клетки. Связывание с сигнальной молекулой
(гормоном или медиатором) происходит с одной стороны от мембраны, а
клеточный ответ формируется на другой стороне от мембраны. Т.о, они
играют уникальную и важную роль в межклеточных связях и передаче
сигнала.
Многие ТР. состоят из 2-х или нескольких субъединиц, которые действуют в
совокупности и могут диссоциировать при связывании с лигандом или
менять свою конформацию и переходить на следующую стадию цикла
активации. Зачастую они классифицируются на основе их молекулярной
структуры. Полипептидные цепи простейших из этих рецепторов пересекают
липидный бислой лишь один раз, между тем как многие — семь раз
(например, связанные с G-белками рецепторы).
Большинство ТР. относится к одному из трёх классов, выделяемых по
основному механизму трансдукции сигнала. Классифицируют ионотропные
и метаботропные трансмембранные рецепторы. Ионотропные рецепторы,
или рецепторы, сопряжённые с ионными каналами, участвуют, например, в
быстрой передаче синаптических сигналов между нейронами и другими
клетками-мишенями, которые могут воспринимать электрические сигналы.
Метаботропные рецепторы передают химические сигналы. Они
подразделяются на два больших класса: рецепторы, сопряжённые с G-
белками, ирецепторы, сопряжённые с ферментами.
Рецепторы, сопряжённые с G-белками, также называются 7TM-
рецепторами (seven-transmembrane domain receptors, рецепторы с семью
трансмембранными доменами). Это трансмембранные белки с внешним
сегментом для связывания лиганда, мембранным сегментом и цитозольным
сегментом, связанным с G-белком. В них выделяют шесть классов на
основании подобия структуры и функций рецепторов, классы A—F (или 1—
6), которые, в свою очередь, подразделяются на множество семейств. К этому
классу относятся рецепторы органов чувств и адренорецепторы.
Как и GPCR, рецепторы, сопряжённые с ферментами — это ТБ., у кот-х
домен связывания с лигандом расположен снаружи мембраны. В отличие от
GPCR, их цитозольный домен не сопряжён с G-белком, а сам обладает
ферментативной активностью или связывает фермент напрямую. Обычно
вместо семи сегментов, как у GPCR, такие рецепторы имеют только один
трансмембранный сегмент. Эти рецепторы могут включать те же сигнальные
пути, что и GPCR. К этому классу относится, например, инсулиновый
рецептор.
Выделяют шесть основных классов рецепторов, сопряжённых с
ферментами:
Рецепторные тирозиновые киназы — могут непосредственно
фосфорилировать тирозиновые остатки, как собственные, так и для
небольшого набора внутриклеточных сигнальных белков.
Р., сопряжённые с тирозинкиназами — сами по себе не является активными
ферментами, но непосредственно связывают цитоплазматические
тирозинкиназы для передачи сигнала.
Рецепторные серин-треониновые киназы — могут непосредственно
фосфорилировать сериновые или треониновые остатки, как собственные, так
и для белков регуляции генов, с которыми они связываются.
Р., связанные с гистидиновыми киназами — активируют двухстадийный
сигнальный путь, в котором киназа фосфорилирует собственный гистидин и
немедленно передаёт фосфат второму внутриклеточному сигнальному белку.
Рецепторные гуанилатциклазы — прямо катализируют производство
молекул цГМФ в цитозоле, которые действуют как небольшой
внутриклеточный посредник по механизмам, во многом схожим с цАМФ.
Рецептороподобные тирозинфосфатазы — удаляют фосфатные группы с
тирозинов внутриклеточных сигнальных белков. Они называются
рецептороподобными, потому что механизм их действия как рецепторов
остается невыясненным.

62. Механизм адаптации к-ки к стрессовым условиям.

На клеточно-молекулярном уровне под стрессом понимается угроза
нарушения динамического гармонического баланса активных компонентов
внутренней среды организма. В этом заключается представление о
гомеостазе (в широком смысле этого понятия) и о количественной градации
стресса в зависимости от степени угрозы нарушений внутреннего баланса.
Клеточная адаптация — приспос-ние к-к к условиям окруж-щей среды,
направленное на выживаемость и воспроизведение.
Клеточная адаптация условно разделяется на гено- и фенотипическую.
Генотипическая А. возникает вследствие отбора клеток с определенным
генотипом, обусловливающим выносливость; фенотипическая А. возникает
как защитная реакция на действие повреждающего фактора.
Скорость изменения резистентности клетки, как и длительность А.,
значительно варьирует. Степень А. клетки — повышение или понижение
порога чувствительности — обеспечивает уровень активной функции (напр.,
функции рецепторов).
Механизмы, лежащие в основе А., зависят от природы к-к и характера
повреждающего ф-ра. В нек-рых случаях к-ки способны изменять
повреждающее вещество путем физ.-хим. связывания агента или путем
химического превращения его в менее токсическую форму. Бактериальные
клетки могут синтезировать специальные ферменты, расщепляющие
токсическое вещество (индукция пенициллиназы в культуре стафилококков,
устойчивых к пенициллину). Повышение устойчивости клетки к стрессу
может быть обусловлено повышением устойчивости самих белков
цитоплазмы за счет изменений конформации цепей белка либо путем обр-ния
комп-са фермент — субстрат, или за счет синтеза новых белков.
Биофизические механизмы адаптации. Биофизика рассматривает
приспособительную реакцию клетки как системы, открытой по отношению к
внешней среде, т. е. свободно обменивающейся с последней энергией и
веществом. Для поддержания стационарного состояния живая система
использует принцип обратной связи (см.), или динамической
аутостабилизации, что позволяет живой системе как бы автоматически
выбирать тот режим скоростей обменных реакций, к-рый обеспечивает
оптимальный вариант приспособления к внешней среде. Напр., при
возрастании функциональной активности клетки (повышение
теплопродукции, производство осмотической или механической работы и
др.) в ее митохондриях возникает дефицит АТФ и накапливаются АДФ и
фосфор, к-рые в свою очередь ускоряют процесс биосинтеза АТФ в
дыхательной цепи.
Адаптационная реакция живой системы представляет собой переход с одного
Механизмы стресса на клеточном уровне проходят три фазы: фазу
реакции, фазу адаптации и, наконец, в случае продолжительного
губительного действия отрицательных воздействий – фазу гибели
(истощения ресурсов надежности, повреждения), в течение которой
наблюдаются необратимые деструктивные изменения (Пахомова, 1999).
В целом реакция растения на изменившиеся условия является комплексной,
включающей изменения биохимических и физиологических процессов. Эти
изменения могут носить как неспецифический, так и специфический
характер.
Неспецифическими являются однотипные реакции организма на действие
разнородных стрессоров или разных организмов на один и тот же стресс-
фактор. К специфическим относят ответные реакции, качественно
отличающиеся в зависимости от фактора и генотипа.
К первичным неспецифическим процессам, происходящим в клетках при
действии любых стрессоров, относятся следующие:
1. Повышение проницаемости мембран, деполяризация мембранного
потенциала плазмалеммы.
2. Вход ионов кальция в цитоплазму из клеточных стенок и внутриклеточных
компартментов (вакуоль, эндоплазматическая сеть, митохондрии).
3. Сдвиг рН цитоплазмы в кислую сторону.
4. Активация сборки актиновых микрофиламентов цитоскелета, в результате
чего возрастает вязкость и светорассеяние цитоплазмы.
5. Усиление поглощения кислорода, ускоренная трата АТФ, развитие
свободнорадикальных процессов.
6. Повышение содержания аминокислоты пролина, которая может
образовывать агрегаты, ведущие себя как гидрофильные коллоиды и
способствующие удержанию воды в клетке. Пролин может связываться с
белковыми молекулами, защищая их от денатурации.
7. Активация синтеза стрессовых белков.
8. Усиление активности протонной помпы в плазмалемме и, возможно, в
тонопласте, препятствующей неблагоприятным сдвигам ионного гомеостаза.
9. Усиление синтеза этилена и абсцизовой кислоты, торможение деления и
роста, поглотительной активности клеток и других физиологических
процессов, осуществляющихся в обычных условиях.
63. Контроль стрессовых регулонов бактерий

Наиболее изученными системами стрессовых ответов бактерий явл-ся:

теплового и холодового шока, стресса клет. стенки, направл-ми на
адаптацию к темп-му стрессу, с-ми общего и жесткого ответа, направл-ми
на адаптацию к пищевому стрессу, и SOS-ответа, защищающего клетки от
мутагенного влияния повреждающих ДНК в-в. Р-ция теплового шока явл-ся
ответом клетки не только на повышенную темп-ру окр. среды, но и на возд-
ие ряда хим. в-в, т. е. на те факторы, кот-ые м/т приводить к образ-ию
некорректно собранных / поврежденных Б в кл., имеющих тенденцию к
образованию белковых агрегатов, угрожающих функц-ию всех клет-ых
компартментов. Во избежание этой угрозы при р-ии теплового шока
происходит усиленная экспрессия белковых шаперонов и АТФ-зависимых
протеаз, т. е. Б, уч-щих в орг-ии третичной стр-ры и в деградации
некорректно собранных клеточных Б. Весь регулон (с-ма генов,
разбросанных по всему геному, но подчиняющихся общему регуляторному
Б.) теплового шока (более 30 белков) нах-ся под контролем альтернативного
сигма-фактора транскрипции σ32. Релаксация ДНК (проц. превращения
суперскрученных мол-л ДНК в мол-лы, не сод-ие супервитков,) под
действием ингибиторов гиразы / темп-ры ведет к активации транскрипции
регулона теплового шока.
Условия окр. среды, нарушающие пространство грамотриц. бактерий,
состоящее из внутр. мембраны, периплазма и внеш. мембраны, вызывают р-
ию стресса клет. стенки: одно из таких усл. – темп-ра, еще более высокая,
чем та, которая индуцирует регулон теплового шока (45–50 °С). У E. coli
сущ-ют, как мин-м, 2 с-мы стресса клет. стенки, одна зависит от
альтернативного сигма-фактора транскрипции σE, др. контрол-ся
мембранной сигнальной гистидинкиназой CpxA. σE-ответ запускается в
первую очередь неправильно свернутыми Б внеш. мембраны, а CpxA-ответ –
Б периплазмы и внутр.й мембраны. Оба регулона увел-ют с-з
экстрацитоплазматических протеаз, фолдаз и шаперонов для восста-ия
целостности клет. стенки.
ХШ. вызывает несколько проблем на клет. ур.: при снижении темп-ры ниже
20 °С ингибируется трансляция на рибосомах, РНК и ДНК образуют
стабильные втор. Стр-ры, кроме того, снижается текучесть мембраны. Этим
негативным для кл. эффектам противодействует ответ холодового шока, в
ходе которого индуцируется синтез белков CspA, CspB, CspG и CspI – ДНК-
и РНК-связывающих Б, действ-их как активаторы транскрипции / РНК-
шапероны, препят-ие стабилизации вторич. стр-р РНК. С-з др. Б холодового
шока обесп-ет акт-ть рибосом даже при низких темп-ах, а сохр-ние оптим-ой
текучести мембраны достигается за счет увел-ия сод-ия в ней ненасыщенных
жирных к-т. Когда кл. E. coli входят в стационарную фазу / испытывают
ограничение в пит-ных в-вах, у них индуцируется р-ия общего стрессового
ответа, главным регулятором которой явл-ся сигма-фактор σS, кодируемая
геном rpoS, под контролем которого находится около 200 генов. Кроме
ограничений в пит-ых в-вах и голодания, общий стрессовый ответ индуц-ся
замедлением скорости роста, высоким осмот-им давлением, низким pH,
резкими скачками температуры и окислительным стрессом. Регулон общего
стрессового ответа во многом перекрывается с др. стрессовыми регулонами,
что делает кл. готовыми к одновременному возд-ию многих стрессовых
факторов. Клетки E. сoli, испытывающие дефицит АК / пониж-ый ур.ь пит-
ых в-в, м/т отвечать на этот стресс посредством р-ии строгого ответа, кот-
рая запускается нетипичными гуанозин-полифосфатными нуклеотидами и
выр-ся в быстром прекращении с-за транспортных и рибосомных РНК,
снижении ур. с-за Б и активации биосинтеза АК.

64. Физиологические функции, находящиеся под контролем

альтернативных сигма-факторов.
Альтернативный σ-фактор контрол-ет бол-во генов азотного мет-ма.
Альтернативные σ-факторы σ70 этого семейства, в свою очередь, могут быть
сгруппированы в три подсемейства, контролирующих споруляцию,
подвижность и разнообразные внецитоплазматические ф-ии (с-з
секретируемых Б, тр-т железа, р-ия на различные стрессовые возд-
ия).Представители сем-ва σ54 также присутствуют у многих бактерий и
контролируют азотный метаболизм, синтез ряда гидролаз и жгутиковых
белков.
Альтернативный сигма фактор 54 уч-ет в транскрипции генов с различными
физиол-ми ф-ми: гены ассимиляции азота Е. coli и S. typhimurium, гены с-мы
жгутиков P. aeruginosa, V. cholerae и Caulobacter crescentus, и гены пилинов,
необх-ые для вирулентности Р. aeruginosa и Neisseria gonorrhea.

65. Промоторы и регуляторные белки, участвующие во взаимодействии

с альтернативными сигма-факторами
Узнавание промотора у бактерий требует ассоциации кор-фермента РНК-
полимеразы с сигма (σ) субъед-ей, что дает активный холофермент. Все
свободноживущие бактерии сод-ат множественные сигма-факторы (у
некот. описано до 10-20). К числу таковых относятся основной сигма-
фактор, контрол-ий гомеостатические ф-ии, и альтернативные сигма-
факторы, активируемые специфич-ми сигналами / стрессовыми условиями.
Только один σ-фактор обесп-ет транскрипцию всех жизненно важных
генов, обеспеч-их гомеостат-ие клеточные процессы (репликацию ДНК,
транскрипцию, трансляцию и т.д.). Этот сигма-фактор называют
основным, а все остальные – альтернативными.
Инактивация основного σ-фактора летальна, альтернативных, как правило,
– нет. Послед-ти промоторов, опознаваемых альтернативными сигма-
факторами, существенно различаются и, как правило, не м/б распознаны
более чем одной сигма-субъед-ей.
Будучи глобальными регуляторами, сигма факторы, как правило, не
детектируют изменение условий сами, а полагаются в этом на др. Б. Сигма-
факторы обычно являются конечным либо (реже) промеж-ым звеном
какого-либо регуляторного каскада. Именно поэтому сигма-факторы
обычно сами подвержены регуляции, причем осущ-ся она м/т на
транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях.

66. Общий стресс: регулон RpoS.

RpoS
Буква S в названии σs происходит от стационарной фазы роста, на
протяжении которой этот фактор был впервые обнаружен. Затем присутствие
этого сигма-фактора было обнаружено в других стрессовых условиях, и
сейчас считается, что присутствие σs является свидетельством т.н. «общего
стрессового ответа». Этот ответ наблюдается, когда клетка сталкивается с
рядом стрессовых ситуаций, видимым признаком чего является снижение
скорости роста вплоть до вхождения в стационарную фазу.
Голодание, повышение осмолярности среды или понижение pH,
неоптимальная температура – эти и другие стрессовые воздействия могут
индуцировать общий стрессовый ответ. Физиологические последствия
общего стрессового ответа включают устойчивость к многим стрессовым
воздействиям, накопление запасных питательных веществ, изменения
структуры клеточной стенки (увеличение частоты кросс-сшивок в
пептидогликане) и изменение морфологии клетки (уменьшение общего
размера и укорачивание клеток – они становятся почти сферическими).
Когда клетки E. coli входят в стационарную фазу или испытывают
ограничение в питательных веществах, у них индуцируется реакция общего
стрессового ответа, главным регулятором которой является сигма-фактор
RpoS, кодируемая геном rpoS, под контролем которого находится около 200
генов. Кроме ограничений в питательных веществах (фосфоре, азоте,
углероде, аминокислотах) и голодания, общий стрессовый ответ
индуцируется замедлением скорости роста, высоким осмотическим
давлением, низким pH, резкими скачками температуры и окислительным
стрессом.
Индукция RpoS осуществляется на нескольких уровнях рядом cis- и
trans-регуляторных элементов, а сам регулон общего стрессового ответа во
многом перекрывается с другими стрессовыми регулонами, что делает
клетки готовыми к одновременному воздействию многих стрессовых
факторов. К настоящему времени показано участие RpoS в транспозициях и
индуцированных транспозициями хромосомных перестройках при голодании
у E. coli и P. putida, хотя точная его роль в механизмах этих транспозиций
пока не определена.
Многие гены регулона общего стрессового ответа нуждаются в
(p)ppGpp- гуанозинполифосфатном нуклеотиде для своей индукции, таким
образом, регулоны жесткого и общего стрессового ответа коиндуцируются и
перекрываются.

67. Периплазматический стресс: регулон RpoE

rpoE
Рассмотрим принцип действия сигма-фактора E. coli, RpoE. Этот белок
принадлежит к большому семейству ECF (extracytoplasmic factors) сигма-
факторов. Свое название эти сигма-факторы получили в связи с их участием
в регуляции экспрессии внецитоплазменных белков (периплазматических,
внешней мембраны и секретируемых во внешнюю среду). Основная функция
RpoE - обеспечивать синтез белков, ответственных за нормальный фолдинг
(сворачивание) белков внешней мембраны, но, кроме того, RpoE усиливает
транскрипцию генов теплового шока (путем активации еще oдного сигма-
фактора, σ32), а у патогенных бактерий родственные сигма-факторы
активируют гены вирулентности.
RpoE реагирует на белки внешней мембраны и периплазматические
белки, утратившие нормальную конформацию. Но поскольку сигма-фактор,
естественно, является цитоплазматическим, а сигнал для его активации
находится в периплазме, должен быть какой-то переносчик сигнала между
двумя клеточными компартментами. Эту функцию выполняет мембранный
белок RseA. В отсутствие сигнала RpoE инактивирован путем связывания с
RseA. Эта инактивация усиливается за счет взаимодействия RseA с
периплазматическим белком RseB. При нарушениях внешней мембраны,
предотвращающих нормальный фолдинг ее белков, RseB связывается с
неправильно свернутыми белками, освобождая RseA. Это ведет к
ослабеванию связи RseA с RpoE, а дополнительное взаимодействие
неправильно свернутых белков с RseA окончательно освобождает RpoE,
который связывается с РНК-полимеразой и активирует транскрипцию ряда
генов . В число этих генов входят:
fkpA, кодирующий периплазматический шаперон (необходимый для
нормального фолдинга периплазматических белков и белков внешней
мембраны);
degP - периплазматическая протеаза, деградирующая ненормальные
или неправильно свернутые белки;
rpoH - сигма-фактор, активирующий транскрипцию генов теплового
шока;
собственный оперон rpoE rseABC;
гены вирулентности у ряда бактерий
Поскольку RpoE активирует транскрипцию своего собственного
оперона, первоначальная индукция по механизму положительной обратной
связи резко усиливается за счет дополнительного синтеза RpoE. А поскольку
одновременно с RpoE происходит сверхпродукция негативных регуляторов
RseA и RseB, вся система быстро выключается, как только периплазма
оказывается очищенной от неправильно свернутых белков.
68. Температурный шок.
Условия окружающей среды, нарушающие экстрацитоплазматическое
пространство грамотрицательных бактерий, состоящее из внутренней
мембраны, периплазма и внешней мембраны, вызывают реакцию стресса
клеточной стенки: одним из таких условий является температура, еще более
высокая, чем та, которая индуцирует регулон теплового шока (45–50 °С). У
E. coli существуют, как минимум, две системы стресса клеточной стенки,
одна зависит от альтернативного сигма-фактора транскрипции σE, другая
контролируется мембранной сигнальной гистидинкиназой CpxA. Эти два
стрессовых ответа различны как в отношении спектров стрессорных
факторов, на которые они отвечают, так и генов, которые они активируют:
так, σE-ответ запускается в первую очередь неправильно свернутыми
белками внешней мембраны, а CpxA-ответ – белками периплазма и
внутренней мембраны.
Холодовой шок, с которым нередко приходится сталкиваться
бактериям, вызывает несколько проблем на клеточном уровне: в первую
очередь при снижении температуры ниже 20°С ингибируется трансляция на
рибосомах, РНК и ДНК образуют стабильные вторичные структуры, кроме
того, снижается текучесть мембраны. Именно этим негативным для клетки
эффектам противодействует ответ холодового шока, в ходе которого
индуцируется синтез белков CspA, CspB, CspG и CspI – ДНК- и РНК-
связывающих белков, действующих как активаторы транскрипции или РНК-
шапероны, препятствующие стабилизации вторичных структур РНК. По-
следнее ведет к антитерминации транскрипции прочих белков холодового
шока и к устранению вторичных структур РНК, препятствующих
трансляции. Синтез других белков холодового шока обеспечивает активность
рибосом даже при низких температурах, а сохранение оптимальной
текучести мембраны достигается за счет увеличения содержания в ней
ненасыщенных жирных кислот.

Тепловой шок является гомеостатическим ответом клетки на

индуцированное стрессовыми условиями изменение конформации белков.
Этот феномен свойственен всем организмам, и его молекулярный
механизм практически идентичен у бактерий, архей и эукариот. При
повышении температуры клетка начинает синтезировать т.н. белки
теплового шока, к которым прежде всего относятся молекулярные
шапероны (DnaK, GroEL) и АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP). Эти
белки выполняют две основные функции - обеспечивают фолдинг
(сворачивание в нативную конформацию) и деградацию поврежденных
белков. Несмотря на полную противоположность этих двух функций
результат их осуществления один - ликвидация поврежденных (и
потенциально опасных для клетки) белков.
69. Контроль регулона теплового шока у различных бактерий.
Тепловой шок является гомеостатическим ответом клетки на
индуцированное стрессовыми условиями изменение конформации белков.
Этот феномен свойственен всем организмам, и его молекулярный
механизм практически идентичен у бактерий, архей и эукариот. При
повышении температуры клетка начинает синтезировать т.н. белки
теплового шока, к которым прежде всего относятся молекулярные
шапероны (DnaK, GroEL) и АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP). Эти
белки выполняют две основные функции - обеспечивают фолдинг
(сворачивание в нативную конформацию) и деградацию поврежденных
белков. Несмотря на полную противоположность этих двух функций
результат их осуществления один - ликвидация поврежденных (и
потенциально опасных для клетки) белков.
Регуляция синтеза белков теплового шока. Белки теплового шока (БТШ,
Hsp – heat shock protein) были открыты в 1974 году. Они синтезируются в
клетках всех живых организмов в ответ:
- на увеличение температуры;
- на ряд других неблагоприятных внешних факторов.
Основная роль этих специфических белков – помочь клетке выжить в
условиях температурного (или иного) стресса, а после его прекращения
вернуться к нормальной жизни.
Шапероны и клеточные протеазы входят в состав регулона σ32 вместе с
другими белками теплового шока. В состав регулона σE входят
периплазматическая протеаза и шаперон. Эти два регулона взаимосвязаны,
т.к. комплекс кора РНК-полимеразы с σE активирует транскрипцию гена
rpoH, кодирующего σ32, при экстремальных температурах (напр, 50°C).
Многие протеобактерии имеют гомологи RpoH, и у них механизмы
регуляции теплового шока являются схожими, тогда как
грамположительные бактерии выработали другие, причем достаточно
разнообразные, регуляторные стратегии для конкретных генов теплового
шока. У клеток E. coli, перемещенных с 30° на 42°, уровень
внутриклеточного σ32 резко (хотя и ненадолго) возрастает, усиливая
транскрипцию с промоторов теплового шока. Возрастание концентрации
σ32 является результатом стабилизации обычно весьма нестабильного
σ32 и активации трансляции уже существующей мРНК rpoH. Поскольку
быстрая деградация σ32 зависит от шаперонного комплекса DnaK-DnaJ-
GrpE, стабилизация происходит из-за того, что шаперон загружается
огромным количеством индуцированных стрессом неправильных белков и
его уже не хватает для обработки σ32. Количество шаперона DnaK-DnaJ в
клетке невелико, поэтому он является весьма чувствительным средством
мониторинга стрессов. В деградации σ32 наибольшую роль играет,
вероятно, связанная с мембраной АТФ-зависимая протеаза HflB. Таким
образом внутриклеточные протеазы вместе с шапероном DnaK-DnaJ
способны регулировать тепловой шок, контролируя внутриклеточную
концентрацию аномальных белков. Шапероны, конечно, не деградируют σ32
непосредственно. Вступая в ассоциацию с РНК-полимеразой, σ32
стабилизируется и становится нечувствительной к протеолизу. Роль
шаперонов заключается в предотвращении связывания σ32 с РНК-
полимеразой, что позволяет протеазам ее деградировать. Когда клетки E. coli
подвергаются воздействию очень высоких температур, синтез почти всех
белков в клетке прекращается. Исключения составляют лишь несколько
белков, включая членов регулона σЕ (σ32- один из таких белков). Как
уже говорилось выше, активность σE контролируется парой белков, RseA и
RseB. Белок цитоплазматической мембраны RseA является анти-сигма
фактором и репрессирует σE регулон, связываясь с σE и предотвращая его
взаимодействие с промоторами. Кроме того, важным результатом
повышения температуры является изменение свойств мембраны - она
становится более лабильной (становится "жиже"), что также способствует
изменению конформации RseA.
Регуляция теплового шока у грамположительных бактерий. Регуляторные
стратегии у этих бактерий существенно отличаются от таковых E. coli,
хотя некоторые принципы остаются. У B. subtilis гены теплового шока
могут быть разделены по крайней мере на три класса. Гены первого класса
(регулон CIRCE/HrcA) кодируют синтез основных шаперонов DnaKJ-GrpE и
GroEL-GroES, и их экспрессия негативно контролируется репрессором
HrcA, первым геном оперона dnaK. Действие этого репрессора
осуществляется через связывание с оператором - инвертированным
повтором CIRCE. Контроль этого регулона осуществляется при участии
шаперонов, но, в отличии от контролируемой шапероном DnaKJ-GrpE
деградации σ32у E. coli, здесь регуляторную функцию выполняет GroEL-
GroES.
Таким образом, у грамположительных бактерий GroE, а не DnaK играет
основную роль в регуляции теплового шока. Репрессор HrcA и CIRCE-
элементы быки обнаружены не только у грамположительных, но и у
альфа-протеобактерий, цианобактерий, хламидий и спирохет, однако их
роль в регуляции теплового шока варьирует.
Кo второму классу относится большая группа (50-100) генов, позитивно
контролируемых сигма-фактором общего стресса σB, которые кроме тепла
индуцируются еще и голоданием по глюкозе или кислороду. Этот
сигма-фактор регулируется сложным каскадом белок-белковых
взаимодействий (включая фосфорилирование).
К третьему классу относятся все остальные гены, не имеющие общей
системы регуляции.
70. Кислородный стресс и редокс контроль.
Метаболизм клеток существенно различается в аэробных и анаэробных
условиях. В аэробных условиях клетка может получить гораздо больше
энергии, но это не дается ей бесплатно – кислород окисляет не только
источники энергии, но и многие жизненно важные клеточные компоненты.
Поэтому в аэробных условиях в клетке при помощи регуляторов OxyR и
SoxR индуцируются белки, защищающие ее от кислорода, такие как
супероксиддисмутаза и каталаза. С другой стороны, клетка вынуждена
существенно перестраивать свой метаболизм если она попадает в
бедные энергией анаэробные условия – теперь она уже не может себе
позволить многие "роскоши". Такая метаболическая перестройка
контролируется регуляторными белками – гистидиновой сенсорной
киназой ArcB и регулятором транскрипции FNR. Эти два белка
контролируют такие разнообразные процессы, как дыхание и фотосинтез,
утилизация углерода и азота. Эти два регулятора реагируют на разные
концентрации кислорода, позволяя точно подстраивать контроль
различных генов к условиям полного или частичного анаэтобиоза.
Все формы жизни сохраняют восстанавливающую среду внутри своих
клеток. Клеточный «редокс-статус» поддерживается специализированными
ферментами в результате постоянного притока энергии. Нарушение этого
статуса вызывает повышенный уровень токсичных реактивных форм
кислорода, таких как пероксиды и свободные радикалы. В результате
действия реактивных форм кислорода такие важные компоненты клетки как
липиды и ДНК окисляются.
У человека оксидативный стресс является причиной или важной
составляющей многих серьёзных заболеваний, таких как атеросклероз,
гипертензия, болезнь Альцгеймера, диабет , а также является одной из
составляющих процесса старения. В некоторых случаях, однако,
оксидативный стресс используется организмом как защитный механизм.
Иммунная система человека использует оксидативный стресс для борьбы с
патогенами, а некоторые реактивные формы кислорода могут служить
посредниками в передаче сигнала.
С химической точки зрения оксидативный стресс представляет собой
значительное увеличение клеточного редокс-потенциала или существенное
снижение восстановительной способности клеточных редокс-пар, таких как
окисленный/восстановленный глутатион. Эффект оксидативного стресса
зависит от силы его выраженности. Клетки могут вернуться в исходное
состояние при небольших нарушениях. Однако, более выраженный
оксидативный стресс вызывает клеточную смерть.
Наиболее опасная часть кислородного стресса-это образование реактивных
форм кислорода (РФК), в которые входят свободные радикалы и пероксиды.
Один из наименее реактивных РФК, супероксид, спонтанно или в
присутствии переходных металлов превращается в более агрессивные
(гидроксильный радикал и др.), что может вызвать повреждение многих
клеточных компонентов — липидов, ДНК и белков (как результат их
окисления). Большинство РФК постоянно образуются в клетке, но их уровень
в норме настолько небольшой, что клетка либо инактивирует их с помощью
антиоксидантной системы, либо заменяет повреждённые молекулы. Таким
образом РФК, образующиеся в качестве побочных продуктов нормального
клеточного метаболизма (в основном из-за небольшой утечки электронов в
дыхательной цепи митохондрий, а также других реакций в цитоплазме), не
вызывают повреждения клетки. Однако уровень РФК, превышающий
защитные возможности клетки, вызывает серьёзные клеточные нарушения
(например, истощение АТФ) и как результат разрушение клетки. В
зависимости от силы стресса клетки могут погибнуть в результате апоптоза,
когда внутреннее содержимое клетки успевает деградировать до
нетоксичных продуктов распада, или в результате некроза, когда сила
оксидативного стресса слишком велика. При некрозе клеточная мембрана
нарушается и содержимое клетки высвобождается в окружающую среду, что
может в результате повредить окружающие клетки и ткани.
Для защиты от окислительного стресса клетка использует целый ряд
антиоксидантных ферментов и систем репарации, большинство которые
экспрессируется на низком базальном уровне в нормальных условиях. При
воздействии супероксида и перекиси водорода экспрессия многих
антиоксидантных белков индуцируется, что зависит в основном от действия
двух регуляторов - SoxRS и OxyR.
SoxRS в ответ на супероксид регулирует экспрессию не менее 10
белков, включая супероксиддисмутазу (SodA), участвующую в репарации
ДНК эндонуклеазу IV (Nfo) и резистентные к супероксиду изоформы
фумаразы (FumC) и аконитазы (AcnA).
Другой транскрипционный фактор, OxyR, в ответ на H2O2 активирует синтез
примерно 30 белков (четко показан контроль через OxyR только для 9 из
них), в том числе каталазы (гидропероксидазы I, KatG), двух субъединиц
алкилгидропероксид редуктазы (AhpCF), глутаредоксина (GrxA), глутатион
редуктазы (GorA), Mn-супероксиддисмутазы и Fur-репрессора.

71. Активные формы кислорода: их повреждающее действие и механизм

инактивации.
Кислородный стресс вызван действием активных кислородных
интермедиатов, таких как анион супероксида (O2•-), перекись водорода
H2O2 и гидроксил-радикал HO•, которые способны повреждать белки,
нуклеиновые кислоты и клеточные мембраны. Кроме того, повреждающее
действие на клеточные структуры имеют производные этих активных
соединений гипохлорная кислота (HOCl) и активные азотные
интермедиаты - азотистый оксид (NO•). пероксинитрит (HOONO) и
нитрозотиолы (RSNO). Для предотвращения повреждений клетка
вынуждена постоянно синтезировать ферменты, инактивирующие
активные радикалы и устраняющие вызванные ими повреждения.
Супероксид-анион (радикал)
Ключевой активной формой кислорода является супероксид анион - радикал
(О2-), образующейся при присоединении одного электрона к молекуле
кислорода в основном состоянии. Супероксид радикал сам по себе обладает
малой реакционной способностью. Он может действовать как окислитель
(акцептор электрона), как восстановитель (донор электрона). В водной среде
может спонтанно дисмутировать (один атом может выступать в качестве
акцептора электрона, а другой в качестве донора).
Время его жизни в биологических субстратах составляет около 10-6 с.
Супероксид анион-радикал представляет опасность тем, что способен
повреждать белки, содержащие железо-серные кластеры, такие как
аконитаза, сукцинатдегидрогеназа и НАДН-убихинон оксидоредуктаза.
H2O2 (перекись водорода)
Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона
к супероксид-аниону приводит к образованию перекиси водорода, которая
является окислителем умеренной силы. Однако из перекиси водорода может
образовываться гидроксид-радикал (ОН.), который является весьма сильным
окислителем. ОН радикал может образовываться при трехэлектронном
восстановлении кислорода или при взаимодействии перекиси водорода с
супероксид радикал - анионом - реакция Габера-Вейса.
OH (гидроксил, гидроксид - радикалы.)
Гидроксид-радикал практически не участвует в образовании других АФК, но
является важным фактором окислительной модификации многих клеточных
структур. Он может окислять молекулы белков и липидов, особенно активно
атакуя мембранные липиды, которые содержат ненасыщенные двойные
связи. Этот процесс приводит к образованию липидных гидроперекисей и
изменению свойств клеточных мембран. Гидроксид-радикал вызывает
разрыв связей в молекуле ДНК, что может вызывать глубокие повреждения
генетического аппарата клеток. Константы скоростей его взаимодействия с
большинством биологически важных молекул близки к диффузионным.
Негативное воздействие АФК
Выделение АФК считается нормальным процессом и у организма есть
механизмы их обезвреживания. Но когда его количество достигает
критической точки, АФК в силу своей высокой реакционной способности,
становится достаточно опасным соединением, пагубно влияющим на клетку.
Например избыточное выделение АФК может привести к окислительному
стрессу.
Окислительный стресс, являющийся следствием дисбаланса про - и
антиоксидантных систем (речь пойдет ниже) клетки и отражающийся в
избыточном образовании в клетке активных форм кислорода, может являться
причиной повреждения различных структур: ДНК, белков и липидов, и
может приводить к клеточной смерти. Окислительный стресс сопровождает
многие нейродегенеративные заболевания, по этой причине АФК принято
считать вестниками клеточной смерти.
Механизмы инактивации.Все АФК являются окислителями клеточных
компонентов и в больших количествах необратимо повреждают клетки.
Защита организма от АФК осуществляется функционированием системы
антиоксидантной системы (АОС). АОС включает низкомолекулярные
антиоксиданты (АО) и систему ферментов. Среди антиоксидантных
ферментов выделяют три линии защиты: 1) СОД, каталаза, пероксидаза, 2)
глутатион-пероксидаза и глутатионтрансфераза, 3) селеновая
глутатионтрансфераза.
СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗА (СОД) является важным ферментом
антиоксидантной защиты, переводящим супероксидные радикалы в
перекись водорода, которая уже менее активна и разлагается при участии
других ферментов.
Каталаза прерывает этот процесс, расщепляя Н2О2 до Н2О и О2. В клетках
каталаза в основном сосредоточена в пероксисомах, в которых содержатся
и ферменты, продуцирующие перекись водорода, необходимую в ряде
процессов жизнедеятельности организма, в частности, в системах
неспецифической иммунной защиты.
Пероксидаза участвует в восстановлении Н2О2 и органических
гидропероксидов свободных жирных кислот, нуклеотидов, нуклеиновых
кислот и, вероятно, белков, переводя восстановленный глутатион в
окисленный.
В инактивации АФК в организме участвуют также многие другие молекулы
и ферментные системы. Классические в настоящее время антиоксиданты —
витамины А, С, Е и каротиноиды, активны почти ко всем АФК без участия
ферментов. антиоксиданты перехватывают АФК и восстанавливают их.
72. Причина кислородного стресса.
Бактерии постоянно подвергаются воздействию разного рода
стрессов, которые могут быть следствием резких изменений, параметров
окружающей среды. К их числу относится окислительный стресс. В обычных
условиях уровень активных форм кислорода (АФК)  способных повреждать
практически все молекулярные компоненты клеток поддерживается на
безопасном уровне благодаря активности антиоксидантных систем. В
определенных условиях уровень оксидантов может превышать способность
антиоксидантных систем к их детоксикации, следствием чего может быть
снижение активности клеток, вплоть до полной гибели. Бактерии
конституитивно синтезируют антиоксидантные ферменты, а также обладают
механизмами адаптивного ответа, благодаря которым предварительное
действие малых доз оксидантов вызывает повышенную устойчивость к
последующему действию больших доз.
Одним из главных внутриклеточных источников Н2О2 может быть
дыхательная цепь, продуцирующая их, как побочные продукты в процессе
аэробного метаболизма. Повышение концентрации активных форм
кислорода до уровня, вызывающего окислительный стресс, происходит в
результате нарушения нормального метаболизма при экстримальных
воздействиях.
Т.е Окислительный стресс является неизбежным побочным продуктом
аэробного стиля жизни, поскольку O2- и H2O2 формируются каждый раз,
когда молекулярный кислород химически окисляет переносчики электронов.
Особенно активны в этом отношении восстановленные флавопротеины. У
быстро растущих бактерий E. coli O2- и H2O2 образуются при автоокислении
компонентов дыхательной цепи. Флавин NADH дегидрогеназы II является
основным местом переноса электронов к кислороду.
Фумаратредуктаза - терминальная оксидаза, индуцируемая при
анаэробном росте, - очень активно взаимодействует с кислородом и,
возможно, является основной причиной стресса, возникающего при переходе
от анаэробных к аэробным условиям. Растущие в аэробных условиях E. coli
производят достаточно супероксиддисмутазы, чтобы поддерживать
концентрацию O2- на уровне порядка 10-10 M. Это около половины той
концентрации, которая могла бы уменьшить активность жизненно важных
ферментов и подавлять/ингибировать рост. Концентрация H2O2 на порядок
меньше ингибирующей. Таким образом, защитные системы бактериальной
клетки поддерживают концентрацию активных производных кислорода на
уровне, лишь слегка более низком, чем токсичный.
73. Механизмы окислительных повреждений клетки, защита от окисл.
стресса.
Механизмы окислительных повреждений клетки. (H2O2 –
перекись/пероксид водорода)
Наиболее чувствительными к окислительным повреждениям являются
различные дегидратазы, использующие железо-серные кластеры [4Fe-4S] для
связывания и дегидрирования субстратов. Окисление таких дегидратаз
супероксид-ионом вызывает разрушение Fe-S кластеров и потерю
активности. Кроме того, побочным продуктом такого окисления являются
многочисленные ионы железа, высвобождаемые в цитоплазму, где они
совместно с H2O2 катализируют окисление ДНК. H2O2 эффективно окисляет
тиолы, поэтому повреждает множество дегидрогеназ, использующих остатки
цистеина в каталитическом центре. Кроме того, взаимодействие H2O2 с
ионами Fe2+ дает сильнейший окислитель HO• (гидроксил), способный
взаимодействовать практически со всеми биомолекулами, в первую очередь с
ДНК, с чем и связана в первую очередь летальность действия H2O2.
Защита от окислительного стресса.
Для защиты от окислительного стресса клетка использует целый ряд
антиоксидантных ферментов и систем репарации, большинство которые
экспрессируется на низком базальном уровне в нормальных условиях. При
воздействии супероксида и перекиси водорода экспрессия многих
антиоксидантных белков индуцируется, что зависит в основном от действия
двух регуляторов – SoxRS и OxyR.
SoxRS регулон
SoxRS в ответ на супероксид регулирует экспрессию не менее 10 белков,
включая
супероксиддисмутазу (SodA), участвующую в репарации ДНК эндонуклеазу
IV (Nfo) и резистентные к супероксиду изоформы фумаразы (FumC) и
аконитазы (AcnA).
SoxRS обеспечивает увеличение концентрации глюкозо-6-фосфат
дегидрогеназы (Zwf), что усиливает восстановительную силу клетки, и
увеличение количества репрессора метаболизма железа Fur, что снижает
поглощение железа и, следовательно, снижает выработку гидроксила.
Индукция регулона происходит в два этапа. Сначала редокс-сенсорный белок
SoxR под влиянием супероксид-иона индуцирует транскрипцию soxS, а затем
уже SoxS непосредственно активирует гены- мишени, связываясь с их
промоторными областями.
OxyR регулон
Другой транскрипционный фактор, OxyR, в ответ на H2O2 активирует синтез
примерно 30 белков (четко показан контроль через OxyR только для 9 из
них), в том числе каталазы (гидропероксидазы I, KatG), двух субъединиц
алкилгидропероксид редуктазы (AhpCF), глутаредоксина (GrxA), глутатион
редуктазы (GorA), Mn-супероксиддисмутазы и Fur-репрессора.
Регулируемые OxyR неспецифический ДНК-связывающий белок Dps (DNA-
binding protein from starved cells) и регуляторная РНК OxyS защищают от
мутагенеза. Активируется также синтез ряда генов теплового шока и
регулятора синтеза капсульных полисахаридов.
74. Адаптация к анаэробиозу.
Основные регуляторы - FNR (fumarate and nitrate reduction) и ArcA (aerobic
respiratory control) Оба белка являются транскрипционными факторами,
активирующимися в анаэробных условиях и инактивирующихся при
взаимодействии с кислородом. FNR детектирует кислород непосредственно
через редокс-чувствительный Fe-S кластер, входящий в его структуру, тогда
как активность ArcA зависит от его фосфорилирования, контролируемого
мембранной гистидинкиназой ArcB. В отличие от FNR ArcB не детектирует
содержание кислорода непосредственно, а реагирует на общее состояние
клетки. В связи с этим два регулятора реагируют на различные концентрации
кислорода и контролируют разные, но частично перекрывающиеся наборы
генов. Это позволяет бактерии быстро и эффективно приспосабливаться к
широкому диапазону концентраций кислорода.
FNR как сенсор кислорода
FNR – глобальный регулятор, контролирующий экспрессию более 120 генов
у E. coli. Белок был идентифицирован путем изоляции мутантов,
неспособных восстанавливать нитрат и фумарат. Позже было показано, что
белок отвечает за индукцию в анаэробных условиях таких ферментов цикла
Кребса как сукцинат дегидрогеназа, фумараза, изоцитрат дегидрогеназа,
участвующих в производстве энергии. Активация транскрипции белком
OxyR путем окислительного фосфорилирования. FNR также активирует
экспрессию ферментов анаэробного дыхания, которые используют
альтернативные конечные акцепторы электронов, такие как DMSO, фумарат
или нитрат. Помимо активации экспрессии необходимых в анаэробных
условях белков FNR также репрессирует такие аэробные респираторные
ферменты как цитохромоксидаза и NADH дегидрогеназа.
Интересно то, что по аминокислотной последовательности FNR похож на
БАК (белковый активатор катаболизма). Mеханизм активации транскрипции
обеими белками тоже одинаков - оба активируют транскрипцию,
контактируя с α-субъединицей РНК-полимеразы. Единственным
существенным отличием FNR является дополнительный участок на амино-
конце этого белка, несущий ферредоксинообразный кластер из четырех
цистеиновых остатков (Cys-X3-Cys-X2-Cys-X5-Cys), что привело к
предположению о детекции кислорода при помощи железо-серных
кластеров.
При взаимодействии с кислородом два [4Fe-4S]2+ кластера димера
FNR быстро (за пару минут) превращаются в два [2Fe-2S]2+ кластера,
причем железо остается связанным с окисленным FNR, скорее всего в виде
сульфида (Рис. 9.4). Если клетку быстро вернуть в анаэробные условия, [2Fe-
2S]2+ центры быстро возвращаются в исходное [4Fe-4S]2+ состояние.
Широкий диапазон концентраций кислорода детектируется клетками
E. coli.
Анаэробное дыхание у этой бактерии происходит в диапазоне концентраций
кислорода 1-5 µМ (при наличии соответствующих акцепторов электронов),
при более низкой концентрации бактерия переключается на брожение.
Именно в этом диапазоне концентраций и происходит переход FNR из
неактивной в активную форму.
ArcB реагирует на изменения концентрации кислорода на границе
микроанаэробной и анаэробной зоны. Этот белок скорее всего реагирует на
изменения электронтранспортной цепи (трансмембранного протонного
потенциала или же степени окисления какого-то переносчика электронов).
Вторым сигналом, на который может реагировать ArcB, является
концентрация анаэробных метаболитов.
ArcB работает в паре с РО ArcA. На сегодняшний день регулон ArcA
насчитывает более 30 генов, кодирующих ферменты цикла Кребса
(флавопротеиновые дегидрогеназы, цитохромоксидазы и т.д.),
глиоксилатного шунта и деградации жирных кислот. Регуляция в основном
заключается в репрессии при анаэробиозе синтеза ферментов аэробного
дыхания, хотя ArcA также активирует несколько генов в микроанаэробных
условиях.

75. Утилизация азота. & 76. Детекция внутриклеточной концентрации

азота, компоненты регуляторной системы.
Бактерии могут использовать множество азотсодержащих соединений
в качестве источника клеточного азота - от простейших неорганических
(азот, нитрат) до сложных соединений включая аминокислоты и нуклеозиды.
Аммиак является наиболее предпочтительным источником азота
практически для всех бактерий. Однако бактериям чаще приходится
утилизировать альтернативные источники азота, для чего они синтезируют
множество белков, необходимых для транспорта внутрь клетки и
последующего метаболизма азотсодержащих соединений.
Практически у всех бактерий глутамат и глутамин служат как
основные доноры азота в биосинтетических реакциях. За образование этих
аминокислот практически у всех бактерий отвечают два фермента. Первый,
глутамин синтетаза, продуцирует глутамин из глутамата и аммиака, тогда как
второй, глутамат синтетаза, переносит аминогруппу с глутамина на 2-
кетоглутарат с образованием двух молекул глутамата.
Суммарным результатом этих двух реакций является продукция
глутамата из аммиака и 2-кетоглутарата. Эти реакции катализируются двумя
ферментами: Глутаминсинтетаза (GlnA) и Глутаматсинтетаза.
Глутаминсинтетаза (GlnA). Додекамерный фермент, состоящий из 12
идентичных субъединиц.. Субъединицы организованы в два шестичленных
кольца, лежащих друг на друге и сдерживаемых гидрофобными
взаимодействиями и водородными связями. Активность фермента
регулируется путем аденилирования. Аденилирование происходит в ответ на
увеличение внутриклеточной концентрации аммония - чем выше его
концентрация, тем больше субъединиц GlnA инактивировано. Этот процесс
катализируется аденилилтрансферазой (GlnE), основной функцией которой
является преодоление последствий "аммонийного шока", происходящего при
попадании бактерий из бедной азотом среды в богатую.
Глутаматсинтетаза - гетеродимер, субъединицы которого кодируются
генами gltBD. Синтез глутаматсинтетазы находится под контролем Lrp
(leucine-responsive regulatory protein), что приводит к репрессии синтеза
фермента в богатой среде.
У бактерий семейства Enterobacteriaceae система регуляции
метаболизма азота кодируется четырьмя генами:
1.glnD, кодирующим уридилтрансферазу/деуридилазу (UTase/UR).
2.glnB, кодирующим малый регуляторный белок PII.
3.ntrB, кодирующим гистидинкиназу.
4.ntrC, кодирующим регулятор ответа - транскрипционный энхансер.
Белок NtrB (продукт гена glnL) является типичной сенсор-киназой.
Цитоплазматическим сигналом, детектируемым NtrB, является белок PII,
который в уридилированной форме сигнализирует о недостатке, а в
немодифицированной форме - об избытке азота. При нехватке азота NtrB
катализирует фосфорилирование и, следственно, активацию регулятора
ответа NtrC.
У кишечных бактерий подвержены регуляции через NtrC многие гены
- glnA ntrBC; гены, кодирующие транспорт глутамина (glnHPQ), аргинина
(argT) и гистидина (hisJQMP); гены, необходимые для ассимиляции нитрита
и нитрата (nasFEDCBA); регуляторные гены фиксации азота nifLA у K.
pneumoniae и nac у K. aerogenes.
 Уридилтрансфераза (GlnD). Этот белок отвечает как за присоединение
уридинмонофосфата к PII (GlnB), так и за его отсоединение. Количество
внутриклеточного азота отражается на соотношении концентраций
глутамина и 2-кетоглутарата (высокое при избытке и низкое при недостатке
азота), что влияет на активность уридилтрансферазы. Активность этого
фермента стимулируется 2-кетоглутаратом и АТФ и ингибируется
глутамином. Следовательно, степень уридилирования PII (GlnB) зависит от
соотношения концентраций глутамина и 2-кетоглутарата. PII (GlnB).

77. Контроль клеточного цикла.

Клеточный цикл: события в клетке от деления до деления
Большинство бактерий размножаются путем деления клетки на 2 части.
Деление грамположительной бактериальной клетки осуществляется после
репликации ДНК. Мезосомы формируют поперечную перегородку в клетке
бактерии от периферии к центру. Особенность бесполого способа
размножения грамотрицательных бактерий состоит в том, что деление
происходит путем формирования перетяжки (септального кольца) при
втягивании мембраны и клеточной стенки внутрь клетки.
Некоторые размножаются почкованием. Почкование представляет собой
процесс образования и роста почки на одном из полюсов материнской
клетки, которая проявляет признаки старения и не дает более четырех
дочерних клеток.
Половой процесс отмечен лишь в немногих случаях (у кишечной палочки).
Половое размножение у бактерий осуществляется в примитивной форме. У
бактерий не образуются гаметы, и нет слияния клеток. Однако самое важное
событие полового процесса происходит – это обмен генетическим
материалом, что именуется генетической рекомбинацией. Одна клетка в этом
случае служит донором («мужская» клетка), другая — реципиентом
(«женская» клетка). Способность клетки служить донором определяется
генами, содержащимися в особой плазмиде, называемой половым фактором
или F-фактором (F от англ. fertility — плодовитость). В этих генах
закодирован белок специфических пловых пилей. Пили — структуры полые
и предполагается, что именно по этим пилям осуществляется перенос ДНК от
донора (F+) к реципиенту (F-). Новообразованная рекомбинантная ДНК
бактерии содержит гены обеих родительских клеток.
Для бактерий характерен высокий темп размножения: деление происходит
быстро (через 20-30 минут). При такой интенсивности потомство одной
бактерии за 5 суток заполнило бы бассейны всех морей и океанов.
Однако размножение их ограничено климатическими условиями, действием
солнечного света, борьбой между видами, накопления продуктов обмена
веществ и т. д. При неблагоприятных условиях палочковидные бактерии
способны образовывать споры. Спорообразование не является
размножением, т.к. из каждой клетки формируется одна спора и число особей
при этом не возрастает. Спора развивается внутри клетки бактерии: до 60%
воды переходит в связанное состояние, протопласт сжимается и покрывается
очень плотной оболочкой. Оболочка бывшей клетки разрушается и спора
освобождается. Она способна сохранять жизнеспособность в течении многих
лет (устойчива против высушивания, высоких и низких температур,
ядовитых веществ). При наступлении благоприятных условий споры
набухают, оболочки разрываются и молодые сформировавшиеся клетки
выходят наружу. Таким образом, спора (у бактерий) - стадия переживания
неблагоприятных условий.
78. Взаимосвязь инициации репликации и деления клетки.
Регуляция процесса репликации ДНК наиболее строго осуществляется
на этапе инициации. Репликация находится под положительным и
отрицательным контролем, причем оба они скоординированы с клеточным
делением.
В общих чертах принцип такой регуляции можно сформулировать
следующим образом. При положительном контроле происходит накопление
активатора репликации до порогового, достаточного для инициации нового
цикла репликации уровня. Пороговый уровень достигается при удвоении
клеточной массы так, чтобы во вновь образовавшихся клетках процесс
репликации был бы уже запущен и успел завершиться к моменту нового
деления. При отрицательном контроле происходит накопление ингибитора
инициации репликации, который должен синтезироваться лишь в
ограниченном количестве вскоре после начала предыдущего цикла
репликации. Такой ингибитор может быть продуктом гена, локализованного
вблизи от точки начала репликации, транскрипция которого осушествляется
только в период репликации данного участка ДНК. В процессе роста клетки
ингибитор «разбавляется», а к моменту удвоения массы клетки уровень его
падает ниже критического, что позволяет клетке инициировать новый цикл
репликации. Взаимодействие этих двух механизмов и должно
координировать процессы репликации ДНК и деления клетки.
Реальные механизмы регуляции репликации еще не расшифрованы.

79. Роль протеолиза в контроле клеточного цикла .

 Протеолиз — ферментативный гидролиз белков и пептидов, катализируется
протеолитическими ферментами (пептид-гидролазами, протеазами) и играет
важную роль в регуляции обмена веществ в организме. С протеолизом
связаны такие фундаментальные процессы жизнедеятельности, как
внутриклеточный распад белков и регуляция их кругооборота, пищеварение,
оплодотворение, морфогенез, защитные реакции, адаптационные
перестройки обмена. Нарушение протеолиза и его регуляции лежит в основе
развития многих патологических состояний.

    Различают два типа протеолиза: приводящий к полному расщеплению

белковых молекул до отдельных аминокислот и частичный, так называемый
ограниченный протеолиз, при котором избирательно гидролизуется одна или
несколько пептидных связей в молекуле белка.Протеолиз первого типа
происходит в результате согласованного действия различных
протеолитических ферментов, тогда как реакции
ограниченного П. катализируются отдельными специфическими протезами.
Полный протеолиз осуществляется при внутриклеточном распаде белков под
влиянием тканевых протеаз (часто называемых катепсинами). Он протекает
во многих случаях внутри лизосом — клеточных органелл, содержащих
набор гидролитических ферментов. Путем полного П. происходит удаление
из организма аномальных белков, образующихся в результате мутаций и
ошибок биосинтеза. Полное расщепление белковых молекул наблюдается
также при различных морфогенетических превращениях и адаптационных
перестройках обмена. В процессах пищеварения под влиянием
протеолитических ферментов желудочно-кишечного
тракта пепсина, трипсина, химотрипсина и ряда пептидаз происходит
полный протеолиз белков пищи.

80. Деление бактериальной клетки и его регуляция

Деление бактериальных клеток называется “бинарным”, во время которого
удвоенные нуклеоиды связаны с плазматической мембраной и расходятся за
счет растяжения мембраны между нуклеоидами, а затем образуется
перетяжка, делящая клетку надвое. Нуклеоид же представляет собой
циклическую молекулу ДНК, образующую многочисленные петлевые
домены в состоянии сверхспирализации.
Время между делениями бактериальных клеток в среднем составляет 20-30
мин. За это время происходят репликация ДНК нуклеоида, сегрегация,
отделение сестринских нуклеоидов и их дальнейшее расхождение,
образования септы и цитотомия, делящей исходную клетку ровно пополам.
Параллельно с синтезом ДНК происходит деспирализация петлевых доменов
за счет работы ряда ферментов (топоизомеразы, гиразы, лигазы и др), что
приводит к физическому обособлению двух дочерних хромосом-нуклеоидов,
которые еще находятся в тесном контакте друг с другом. После такой
сегрегации нуклеоидов происходит их расхождение от центра клетки, места
их бывшего расположения, на четверть длины клетки в двух
противоположных направлениях. В результате этого в клетке располагаются
два нуклеоида. Было устанволено, что в процессе расхождения нуклеоидов
принимают участие несколько групп специальных белков. Один из них Muk
В, представляет собой гигантский белок, состоящий из центрального
спирального участка, и концевых глобулярных участков, напоминающий по
структуре нитевидные белки эукариот. На N-конце Muk В связывается с ГТФ
и АТФ, а на С-конце – с молекулой ДНК. На этом основании белок Muk В
считают моторным белком, участвующим в расхождении нуклеоидов.
Кроме белка Muk В в расхождении нуклеоидов участвуют пучки фибрилл,
содержащих белок Caf A, который может связываться с тяжелыми цепями
миозина, подобно актину.
Образование перетяжки, или септы напоминает цитотомию животных
клеток. В образовании септ принимают участие фибриллярные
термочувствительные белки. Это группа из нескольких белков, среди
которых наиболее изучен белок FtsZ. Во время деления клетки весь этот
белок локализуется в зоне септы, образует сократимое кольцо напоминающее
акто-миозиновое при делении клеток животных.Параллельно образованию
септы происходит наращивание муреинового слоя бактериальной клеточной
стенки за счет работы полиферментативного комплекса РВР-3,
синтезирующего пептидогликаны.
Таким образом, при делении бактериальных клеток наблюдаются процессы
сходные с делением эукариот: расхождение хромосом (нуклеоидов) за счет
взаимодействия моторных и фибриллярных белков, образование перетяжки
за счет фибриллярных белков, образующих сократимое кольцо. В отличие от
эукариот у бактерий в этих процессах принимают участие совсем другие
белки.
81. Особенности организации генов, участвующих в делении клеток и их функции.

Если говорить о гене, который является абсолютно необходимым для

деления каждой бактерии, то единственный ген из известных в настоящее
время соответствует этому определению - ftsZ (даже этот ген вероятно
отсутствует в по крайней мере одной бактерии - недавно сиквенированный
геном Chlamydia trachomatis не имеет узнаваемого гомолога ftsZ). Но ftsZ в
одиночку оказывается достаточным для деления только самых простых
бактерий, например M. genitalium, живущих в идеальной богатой
питательными веществами окружающей среде при постоянной температуре и
постоянном осмотическом давлении и следовательно не нуждающихся (и не
имеющих) муреиновой клеточной стенки. Другие бактерии должны иметь
дополнительные структуры, чтобы выживать в своих местообитаниях. Одна
из этих дополнительных структур – муреиновая клеточная стенка, типичная
для огромного большинства Eubacteria. Присутствие клеточной стенки
немедленно создает серьезные проблемы при делении. Жесткой и
находящейся под постоянным осмотическим давлением изнутри муреиновой
клеточной стенке требуется набор белков для правильного разделения
пополам при делении клетки без нарушения целостности структуры, и эти
белки должны действует координированно с другими белками,
необходимыми для деления как такового. ftsZ - ген клеточного деления,
которому уделяется наибольшее внимание в последнее время, после
обнаружения того, что его продукт образует кольцо на внутренней стороне
цитоплазматической мембраны в центре клетки. Ген ftsZ, расположенный в
кластере mra на 2.5 минуте хромосомной карты, кодирует наиболее
многочисленный белок клеточного деления, который присутствует в
количестве от 5,000 до 20,000 копий на клетку. FtsZ белок разделяет
некоторое сходство последовательности с эукариотическими тубулинами,что
согласуется с его слабой ГТФазной активностью. Недавнее определение
кристаллических структур FtsZ и тубулина подтвердило, что трехмерные
структуры этих белков очень похожи несмотря на низкий уровень сходства
первичной последовательности. N-концевые ГТФ-связывающие домены этих
белков являются фактически идентичными, и C-концевые домены также
очень схожи, хотя гомология первичных последовательностей C-концевых
доменов не детектируется. Функциональное сходство FtsZ с тубулинами
подтверждается его способностью собираться in vitro в протофиламенты и
мини-кольца, которые близко напоминают структуры, формируемые
тубулином. Учитывая диаметр этих протофиламентов и диаметр клетки,
количество FtsZ в клетке достаточно, чтобы образовать протофиламент,
окружающий клетку 20 раз. Способность FtsZ полимеризоваться
(димеризоваться), была недавно демонстрирована in vivo. В настоящее время
считается, что сокращение кольца, образованного молекулами FtsZ, приводит
к продвижению молекулярных машин, синтезирующих клеточную
перегородку в месте деления. Формирование этого кольца является самым
ранним видимым признаком деления и может быть обнаружено очень рано в
клеточном цикле.
82. Регуляция клеточного цикла у Escherichia coli и Caulobacter
crescentus.

Бактерия Caulobacter crescentus интересна в плане изучения клеточного цикла

потому, что, по крайней мере на первый взгляд, клеточный цикл этой
бактерии наиболее близок к эукариотическому: имеются четко выраженные
G1, S и G2 периоды ( у прокариот сложно пока говорить о М фазе); более
того, в результате деления образуются неравноценные клетки (т.е.
наблюдается некоторая дифференцировка) – одна из дочерних клеток имеет
жгутик и аппарат хемотаксиса, а другая неподвижна и остается
прикрепленной к субстрату. В подвижной клетке репликация ДНК и деление
клетки полностью заблокированы (т.е. имеет место четко выраженная G1
фаза клеточного цикла, которой не наблюдается у быстро растущих
энтеробактерий). Через некоторое время бактерия утрачивает свой
единственный полярный жгутик (а вместе с ним и аппарат хемотаксиса) и на
этом же полюсе клетки формирует стебелек, которым прикрепляется к
субстрату. Такое морфологическое изменение совпадает с инициацией
репликации ДНК (началом S фазы). Во время этой фазы прикрепленная к
субстрату клетка удлиняется и формирует новый жгутик на полюсе клетки,
противоположном стебельку. По завершении репликации ДНК хромосомы
перемещаются к полюсам (фаза G2), за чем следует деление клетки. Таким
образом, в каждом цикле деления два типа морфологически и
физиологически различных типа клеток сменяют друг друга: подвижная
неспособная делиться клетка и неподвижная (прикрепленная) способная к
росту и делению. Очевидно, что такая четкая смена поведения клеток должна
строго контролироваться, и некоторая информация об этом контроле
имеется. Центральным регулятором клеточного цикла является белок CtrA,
принадлежащий к уже хорошо нам знакомому классу регуляторов ответа.
Этот белок контролирует синтез жгутиков, метилирование ДНК и ее
репликацию, деление клетки. Контроль репликации ДНК осуществляется
путем ее метилирования. CtrA активирует транскрипцию гена ccrM,
кодирующего ДНК-метилтрансферазу, жизненно необходимую для роста C.
crescentus.
Клеточный цикл E.Coli: Процесс клеточного деления у прокариот включает
следующие события в определенной очередности: 
1) накопление «критической» клеточной массы; 2) репликация ДНК генома; 
3) построение новой клеточной оболочки;  4) построение клеточной
перегородки; 5) расхождение дочерних клеток.  Некоторые из этих событий
протекают одновременно, другие строго последовательно или вообще могут
отсутствовать.  Регуляция клеточного деления складывается из регуляции
каждого из этих событий и организации их взаимодействия, при котором в
клеточном делении устанавливается последовательность процессов и
вырабатываются сигналы для инициации следующего по порядку процесса. 
Накопление критической клеточной массы и репликация ДНК 
Это необходимые подготовительные этапы собственно клеточного деления.
Следует отметить, что размер клеток каждого микроорганизма, растущего
сбалансированно в стандартных условиях, является достаточно постоянной
величиной, чтобы служить одним из таксономических признаков.
В.Д. Донаши даже ввел понятие элементарной клетки, т.е. наименьшей,
возможной для данного микроорганизма. Таким образом, существуют
механизмы, включающие процесс деления клетки при накоплении ее
пороговой массы.  Построение новой клеточной оболочки 
Необходимо различать пролиферацию цитоплазматической мембраны и
клеточной стенки и сегрегацию поверхностных структур. 
При изучении пролиферации используют, как правило, синхронные культуры
микроорганизмов и изучают включение меченных радиоизотопами
соединений путем равновесного или импульсного введения этих
соединений.  Таким путем установлено, что включение белков в
цитоплазматическую мембрану Escherichia coli и Bacillus subtilis следует
сложной кинетике, свидетельствующей о запасании предобразованных
белков в цитоплазме, в период подготовки клеточного деления и быстрой их
мобилизации – в процессе построения клеточной перегородки. В период
деления возрастает активность некоторых литических ферментов,
участвующих в образовании «брешей» в предсуществующем каркасе
клеточной стенки, необходимых для включения новых ее фрагментов. Таким
образом, регуляция активности этих ферментов осуществляется путем
временного перевода их в скрытое состояние с последующей мобилизацией в
необходимый момент. Точных данных о механизмах такой регуляции нет, но
можно полагать, здесь имеет место взаимодействие ферментов с
мембранами. 

83 Споруляция.
.Одной из особенностей микроорганизмов является их способность к
спорообразованию. Споры образуются при неблагоприятных условиях
существования (высушивание, недостаток питательных веществ, изменение
рН среды и т. д.), причем из одной клетки формируется только одна спора.
Таким образом, образование спор не связано с процессом размножения, а
является своеобразным приспособлением к переживанию в неблагоприятных
условиях. По принятой номенклатуре спорообразующие аэробы носят
название бацилл, а спорообразующие анаэробы — клостридии. Процесс
спорообразования проходит ряд стадий, в течение которых в определенном
месте клетки цитоплазма, нуклеоид, рибосомы концентрируются,
уплотняются, покрываются мембраной, а затем плотной, плохо проницаемой
многослойной оболочкой, включающей кальциевые соли дипиколиновой
кислоты, обусловливающей термоустойчивость спор. Споры длительное
время могут сохраняться в покое, оставаясь жизнеспособными. Так, в почве
споры патогенных микроорганизмов (возбудителя сибирской язвы, столбняка
и др.) могут сохраняться десятками лет. При попадании в благоприятную
среду споры очень быстро прорастают — из 1 споры возникает 1
бактериальная клетка, которая начинает размножаться. Спорообразование —
видовое свойство палочек, а форма и расположение формирующейся споры
по отношению к вегетативной части клетки является дифференциально-
диагностическим признаком.Форма спор может быть овальной или круглой,
расположение центральное (возбудитель сибирской язвы), субтерминальное
— ближе к концу палочки (возбудители газовой гангрены, ботулизма)
итерминальное — на конце (возбудитель столбняка).В зрелой споре
различимы: центральный, плохо окрашиваемый участок (спороплазма),
двухслойная ЦПМ и оболочка споры.Спороплазма (протопласт споры)
включает цитоплазму, бактериальную хромосому, системы белкового
синтеза и некоторые другие (например, анаэробного
энергообразования).Оболочка споры двухслойная: пространство между
слоями заполняют гликопептидные полимеры, сходные с пептидогликанами,
образующие сетчатую структуру (кортекс), проявляющую высокую
чувствительность к лизоциму. Внутренний слой (стенка споры) образован
пептидогликанами, аналогичными таковым \ вегетирующей клетки. Внешний
слой (собственно оболочка) образуют кератиноподобные белковые
структуры с низкой проницаемостью.Процесс споруляции
(спорообразования) начинается сразу после возникновения дефицита
питательных веществ и продолжается приблизительно 8 ч. Никаких внешних
источников питания или энергии при этом не требуется. Споруляцию
стимулирует внесение в среду глюкозы, фосфора и NH4; угнетает внесение
пептона, лактозы, NaCl, CaCl2(у бактерий рода Bacillus— DL-аланина).
84. Механизм принятия решения о начале споруляции
Бактерии достаточно сложно принять решение о начале споруляции,
поскольку этот процесс, будучи запущенным, уже необратим. А поскольку
это решение коренным образом меняет метаболизм клетки, ошибка может
иметь для нее печальные последствия. Поэтому для принятия этого решения
бактерия должна проанализировать множество сигналов от внешней среды от
внутриклеточных метаболических систем, от клеточного цикла. Сигналы
могут происходить от нехватки питательных веществ, плотности популяции,
синтеза ДНК, повреждений ДНК, цикла Кребса. Все эти сигналы
интегрируются на уровне одного регуляторного белка (Spo0A). Сигналы
передаются на Spo0A в виде его фосфорилирования через цепь переносчиков
фосфата. Spo0A принадлежит к классу регуляторов ответа из семейства
двухкомпонентных регуляторных систем, которые вам уже хорошо знакомы.
И той информации, ктотрой вы уже обладаете, наверное, достаточно, чтробы
сделать вывод о том, что в данном случае сложно будет обойтись простой
двукомпонентной системой. И действительно, основу регуляторной системы
споруляции составляет сложная разветвленная фосфотрансляционная сеть. В
качестве источника сигнала могут выступать несколько сенсорных белков
(гистидинкиназ), сигнал от которых (фосфат) поступает на ключевой
регулятор через несколько переносчиков. Такая сложная система создает
много точек, в которых можно осуществлять контроль передачи сигнала, что
позволяет тесно координировать многие клеточные события. Поэтому
практически каждая стадия передачи сигнала по фосфотрансляционной сети
в той или иной степени подвержена регуляции. Фосфат в сигнальную
фосфотрансляционную систему поступает от двух сенсорных киназ,
цитоплазматической KinA и мембранной KinB, а в качестве получателей
этого фосфата выступают два РО. Первый из них, Spo0F непосредственнно
фосфорилируется киназами, тогда как фосфат на второй РО, Spo0A, попадает
от Spo0F через переносчик Spo0B. Spo0A~Ф является транскрипционным
фактором и выступает в роли репрессора либо активатора по отношению к
тем генам, чьи функции являются критическими при переключении клетки с
вегетативного роста на споруляцию. Один из таких генов кодирует репрессор
AbrB, который предотвращает экспрессию ряда генов, необходимых при
переключении на споруляцию. Накопление Spo0A~Ф в клетке снижает
уровень AbrB и активирует ранние гены споруляции. Кроме того, Spo0A~Ф
является непосредственным активатором генов и оперонов, таких как spoIIA
и spoIIG, кодирующих сигма факторы σ F и σ Е, ответственные за локальную
экспрессию генов споруляции соответственно в преспоре и материнской
клетке.
85. . Споруляция у Bacillus subtilis: каскадная активация
альтернативных сигма-факторов на разных стадиях споруляции
Процесс споруляции у Bacillus subtilis прох-ит ч-з серию четко выраж-ых -их
стадий, и его результ явл-ся превр-ние растущей кл-ки в двухкамерный
спорангий, в котором и форм-ся спора. Изв-но более 125 генов, участв-их в
этом процессе. Их транскрипция контр-ся во времени и пространстве 4-мя
ДНК-связываю-ми белками и 5 сигма факторами, а сигнал для запуска всего
процесса поступает от сенсорных систем и путем переноса фосфатной
группы по сложной фосфотрансляционой сети.
Стадии споруляции:
Стадия 0 соотв-ет кл-ам, еще не ставшим на путь споруляции
стадия I – начавшим споруляцию и сформ-шим аксиальный филамент,
стадии II и III соотв-ют спорангиям на стадиях полярного деления и
обволакивания преспоры материнской кл-ой и т.д.
Будучи активированным путем фосфорилирования, Spo0A индуцирует
транскрипцию как минимум семи генов, управляющих вступлением бактерии
на путь споруляции и превращением вегетативной клетки в
двухкомпатрментный спорангий. Spo0A~P(неорганический фосфор)
активирует транскрипцию, связываясь с промоторами соответствующих
генов и оперонов, контактируя с РНK-полимеразой основной сигма фактор
σA или альтернативный σH. σH обеспечивает транскрипцию неизвестного
пока гена (или генов), контролирующего полярное деление.
После разделения клетки на две части в каждом из образовавшихся
компартментов происходит активация компартмента специфического сигма-
фактора - σF в преспоре и σE в материнской клетке. σF синтезируется до
полярного деления, его активность проявляется в преспоровом
компартменте, определяется регуляцией на уровне активности белка. Эта
регуляция осуществляется тремя белками, SpoIIE,SpoIIAB и SpoIIAA - эти
белки синтезируются в исходной клетке еще до ее полярного деления.
SpoIIAB является антисигма фактором, который связывается с σF и
ингибирует транскрипцию с его участием.
После образования перегородки в действие вступает фермент являющийся
фосфатазой, специфически дефосфорилирующей.
дефосфорилирование идет с одинаковой скоростью в обоих компартментах.
Но поскольку объем преспоры в 5-7 раз меньше объема материнской клетки,
концентрация дефосфорилированого SpoIIAA в преспоре будет в несколько
раз выше, следовательно, в этом компартменте σF будет активирован раньше.
после активации σF в преспоровом компартменте происходит активация
другого сигма-фактора, σЕ , в материнской клетке.
Таким образом, появление σЕ в материнской клетке привязано к отделению
преспоры перегородкой, поскольку транскрипция зависимых от σF генов
происходит только в преспоровом компартменте.
В σЕ регулон входят гены, разрушающие пептидогликан септы,отделяющей
преспору от материнской клетки, а гены, контролируемые σF, отвечают за
обволакивание преспоры материнской клеткой. К моменту окончания
поглощения преспоры материнской клеткой в преспоре начинается
транскрипция нового гена, spoIIIG, кодирующего сигма-фактор, σG. Этот
сигма-фактор активирует транскрипцию поздних генов преспоры,
необходимых для завершения процесса споруляции.
Экспрессия поздних генов в материнской клетке находится под контролем
сигма-фактора σK - синтезируется в виде неактивного предшественника пре-
σK, который превращается в активную форму после отщепления амино-
концевой последовательности из 20 АК остатков.
Экспрессия двух сигма-факторов в материнской клетке запускает
последовательную цепь регуляторных событий, ведущую к поочередной
активации и инактивации комплекса генов, результатом работы которого
является синтез споровых покровов, кортекса и внешней оболочки споры

86. Секреция белков. Сходство и различия секреторных аппаратов

про- и эукариот.
87. Сигналы секреции и внутриклеточной локализации белков:
общие принципы.
88.Секреция белков у прокариот: Sec-аппарат, системы секреции I-
IV типов (организация, субстратспецифичность, регуляция).
89.Отличие секреции белков у прокариот и эукариот.
секреция – транспорт белка в окружающую среду.
Секретируемые белки могут оказываться в различных местах:
• быть полностью встроенными в цитоплазматическую мембрану
(интегральные мембранные белки, каковыми является большинство
мембранных транспортеров);
• быть "заякоренными" в цитоплазматической мембране при помощи
трансмембранного гидрофобного сегмента (практически всегда N-
концевого), к этому классу принадлежит большинство периплазматических
белков;
• полностью находиться в периплазме;
• быть полностью встроенными во внешнюю мембрану (порины);
• заякориваться во внешней мембране так, что основная масса белка
располагается либо снаружи (чаще всего) либо в периплазматическом
пространстве;
• во внешней среде (собственно секретируемые белки, к которым
принадлежит большинство гидролитических ферментов патогенов);
• ассоциированными с мембраной эукариотической клетки (некоторые
компоненты аппарата секреции III типа)
• внутри другой клетки, как правило эукариотической (большинство
субстратов секреции III и IV типов)
место конечной дислокации белка определяется его аминокислотной
последовательностью – секреторные системы распознают определенные
консервативные последовательности (мотивы) и направляют секретируемый
белок в соответствии с записанной в этих мотивах информацией.
В клетках млекопитающих все секретируемые белки направляются в
эндоплазматический ретикулум при помощи одного механизма,
SRP("частица, распознающая сигналы"). Эукариотическая SRP –
крупный рибонуклеопротеидный комплекс, состоящий из 6 полипептидов и
молекулы РНК Сначала 54 kDa субъединица SPR узнает специфические
гидрофобные сигналы сразу после того, как они выходят с транслирующей
рибосомы. Такими сигналами являются либо N-концевые отрезаемые
сигнальные последовательности либо первый трансмембранный сегмент. Как
только SPR связывается с сигналом локализации, комплекс рибосома-мРНК-
полипептид мигрирует к эндоплазматическому ретикулуму, где
взаимодействие между SPR и гетеродимером рецептора SPR катализирует
высвобожбение синтезирующегося полипептида из комплекса и его
инсерцию в транслокационный канал.
У прокариот интегральные мембранные и прочие секретируемые белки
движутся к внутренней мембране по различным путям. Интегральные
мембранные белки направляются к внутренней мембране при помощи
бактериального варианта "частица, распознающая сигналы" (SPR). У
бактерий SRP состоит всего из двух компонентов: белка Ffh - гомолога
SPR54 и более короткой РНК.
многие секретируемые белки направляются к аппарату секреции
молекулярными шаперонами, такими как DnaK или (чаще) SecB.
Первая стадия реакции требует присутствия специфичных для секреции
шаперонов - SecB и рибонуклеотидного комплекса SRP, который состоит из
белка Ffh и 4.5S РНК.
SecB и SRP узнают каждый свою часть секретируемых белков. Функция SRP
наиболее существенна при экспорте интегральных мембранных белков.
Выбор SRP или SecA/SecB пути происходит "на выходе" синтезирующейся
белковой цепи из рибосомы. Бактериальная SRP распознает белки
внутренней мембраны по их протяженным трансмембранным сегментам.
Секреторные шапероны распознают более короткие и менее гидрофобные
трансмембранные сегменты сигнальных пептидов и направляют содержащий
их белок к секреторному аппарату.
секреторная системама – обеспечивает прохождение через гидрофобную
мембрану длинной полипептидной цепи, содержашей значительные
гидрофильные участки, в нативном состоянии свертутой в громоздкую
структуру. транспорт идет по градиенту концентрации, и поэтому все
секреторные системы расходуют энергию АТФ. Секреторные шапероны
GroE/DnaK участвуют только в процессе секреции, и их функцией является
задержка фолдинга секретируемых белков. Большинство секретируемых
белков являются глобулярными и в полностью свернутом виде они просто не
в состоянии преодолеть мембрану.
Секреторные шапероны, связываются с предназначенным для секреции
белком сразу же после его схода с рибосомы и не дают ему принять
окончательную конформацию. Секреторный шаперон фактически доставляет
белок с рибосомы к секреторному аппарату. Секреторыные шапероны
экономят энергию для разворачивания белка.
эукариоты не имеют секреторных шаперонов потому что,секреция белка у
них сопряжена с трансляцией – синтезируемая белковая цепь сразу, не успев
принять свою нативную конформацию, попадает в секреторный канал.
Прокариоты не могут воспользоваться таким механизмом, поскольку у них
рибосомы присутствуют в огромном избытке по отношению к мембранным
транслоказам (у эукариот такого избытка нет из-за большей поверхности
эндоплазматического ретикулума).
Секреторный аппарат первого типа
Белки, секретируемые по первому пути, не имеют сигнальных пептидов и не
используют т.н. общий секреторный путь (GSP). Эти белки в процессе
секреции полностью минуют периплазму и секретируются непосредственно
во внешнюю среду. Секреторный аппарат первого типа устроен просто. Во
всех случаях он состоит из трех белков. Первый принадлежит к классу
АТФаз, называемых ABC транспортерами и обеспечивает энергозависимые
стадии процесса транспорта. Этот белок является цитоплазматическим и
ассоциированным с димерным белком, обеспечивающим слияние
цитоплазматической и наружной мембраны и фактически образующим
канал, через который и транспортируется секретируемый белок. И третий
белок-швейцар (gatekeeper) локализован во внешней мембране. Его функция
- запирать мембранный канал, когда субстрат отсутствует.
Секреторный аппарат второго типа (GSP)
Через секреторный аппарат II типа транспортируются разнообразные белки,
такие как пектатлиазы, полигалактуроназы, пектинметилэстеразы и
целлюлазы у эрвиний ( по нескольку изоферментов каждого класса);
полигалактуроназа, целлюлаза, протеаза и амилаза; липаза, фосфолипаза,
эластаза, энтеротоксин А и щелочная фосфатаза у Pseudomonas aeruginosa;
пуллуланаза. Именно в связи с большим числом и разнообразием субстратов,
секретируемых через аппарат II типа его зачастую называют "общим
секреторным путем" (General Secretory Pathway, GSP).
Характерной чертой аппарата второго типа является секреция белков в две
стадии. Сначала они экспортируются через цитоплазматическую мембрану,
где в случае Грам-положительных бактерий их секреция и заканчивается. В
случае Грам-отрицательных бактерий белки оказываются в периплазме, и
либо остаются там (и тогда говорят не о секреции, а об экспорте), либо
встраиваются во внешнюю мембрану, либо секретируются во внешнюю
среду посредством одной из терминальных ветвей GSP.
Sec система.
Sec системы можно разделить на три стадии: - направление белка на
транспорт
- собственно транслокация белка через мембрану
- освобождение транспортированного белка на периплазматической стороне
мембраны.
На первой стадии пребелки направляются к точкам секреции в
цитоплазматической мембране (местам, где собран транслокационный
комплекс). На второй стадии полипептидная цепочка пересекает липидный
бислой. На третьей стадии транслоцированный полипептид освобождается и
либо принимает свою нативную конформацию, либо направляется для
дальнейшей секреции в одну из терминальных ветвей GSP.
Секреторный аппарат третьего типа
Системы секреции III типа жизненно необходимы для многих патогенов
животных и растений, таких как Erwinia amylovora, Erwinia crysanthemi,
энтеропатогенные Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri,
Xanthomonas campestri, и три вида Yersinia.
Отличительными чертами этих систем секреции являются доставка факторов
вирулентности непосред- ственно в клетку эукариотического хозяина (хотя
часть белков, секретируемых по этому пути, остается связанной с
поверхностными структурами бактерии или попадает в среду), а также
использование большого количества специфических секреторных
шаперонов.
Повышение температуры до 37°C, происходящее, например, при попадании
бактерии в организм человека, индуцирует экспрессию секреторного
аппарата III типа.
Система секреции III типа не зависит от sec-белков. Соответственно,
секретируемые белки не имеют сигнального пептида, характерного для
системы секреции II типа.
Секреторный аппарат четвертого типа
Система секреции IV типа имеет выраженное сходство с аппаратом
конъюгации ряда плазмид и скорее всего произошла от него. Эта экспортная
система характеризуется чрезвычайно широкой специфичностью как по
отношению к субстратам (крупные нуклеопротеидные комплексы,
мультикомпонентные белковые токсины и мономерные белки), так и по
отношению к мишеням секреции, каковыми могут служить бактерии, грибы,
растения и животные (иными словами, клетки представителей всех царств за
исключением архей).
Многие системы IV типа переносят ДНК, но необходимо отметить, что
переносится не ДНК сама по себе, а однонитевая ДНК, связанная с одним
или несколькими белками. Эти белки участвуют в процессинге ДНК в точке
начала переноса (oriT), ведущем к образованию конъюгационного
интермедиата.
90. Транспорт белков через мембраны и его контроль.
У всех клеток есть мембрана, состоящая из двойного слоя липидов. В клетку
должны поступать многие необходимые для жизни вещества
(сахара, аминокислоты, ионы щелочных металлов), но липидный бислой для
них практически непроницаем. Поэтому в состав мембраны входят
транспортные белки, которые и осуществляют перенос полярных или
заряженных соединений. Транспорт этих соединений в клетку делится на
активный и пассивный. Пассивный транспорт — транспорт веществ из
области с высокой концентрацией в область низкой без затрат энергии, то
есть диффузия. Она делится на 2 варианта: простая и облегчённая.
В облегчённой диффузии участвуют белки-переносчики. Этот вариант может
сопровождаться конформационными изменениями белка. Есть несколько
путей переноса веществ в этом случае: когда участвует один белок и когда
участвуют несколько. Если участвует одинбелок(транслоказа), то он
связывает вещество, потом сближается с другой стороной мембраны, отдаёт
связанное вещество и возвращается в исходное состояние. Если участвуют
несколько белков, то один связывается с веществом, потом передаёт его
другому и так далее, пока вещество не дойдёт по цепи до противоположной
стороны мембраны.
Пассивный транспорт обеспечивают также белки-каналы.
Каналообразующие белки образуют в мембране водные поры, через которые
(когда они открыты) могут проходить вещества. особые семейства
каналообразующих белков (коннексины и паннексины) формируютщелевые
контакты, через которые низкомолекулярные вещества могут
транспортироваться из одной клетки в другую (через паннексины и в клетки
из внешней среды).
Активный транспорт происходит против градиента концентрации и
протекает с затратой энергии. В активном транспорте участвуют белки-
переносчики. Энергия, которая требуется для осуществления активного
транспорта, обычно получается транспортными белками при
расщеплении АТФ. Один из наиболее изученных белков, осуществляющих
активный транспорт — Na+/K+-аденозинтрифосфатаза. За полный цикл
работы этого насоса в клетку попадают из внешней среды 2 иона K+ и
выбрасывается наружу 3 иона Na+.
Ещё один путь попадания веществ внутрь клетки — их поглощение
путем эндоцитоза. В этом процессе также могут участвовать специальные
транспортные белки. Например, гастромукопротеид (внутренний фактор
Касла), который синтезируется в клетках слизистой оболочки желудка,
обеспечивает поглощение путем эндоцитоза клетками подвздошной кишки
витамина B1