Анализ структурных

изменений лактоферрина в
условиях окислительного и
галогенирующего стресса
Лактоферрин и его свойства
Пространственная
структура Лф, цветом
• Лактоферрин (Лф) – негемовый обозначена градация
полярности аминокислотных
железосвязывающий гликопротеин, остатков. Синий цвет –
относящийся к семейству трансферринов. полярные области, красный –
неполярные

• Белок образован одной полипептидной цепью и образует два

гомологичных глобулярных домена. Структура поддерживается 16
дисульфидными связями.

Лф содержится
• в секрете экзокринных желез

• в молоке

• во вторичных гранулах нейтрофилов

2
 Производство
Свойства Лф
рекомбинантного Лф
Микроинъекция
участие в связывании и
ДНК с геном Лф
транспорте ионов железа
противовирусное человека в
действие яйцеклетку
фактор роста фунгицидное
действие
Имплантация
Лактоферрин
яйцеклетки
«приемной»
противоопухолевое антибактериальное матери
действие действие

образование комплексов
с биополимерами противовоспалительное Первичные
действие трансгенные
самцы

Молоко с
Рекомбинантный Лф
человека
рекомбинантным Лф
человека
Трансгенные самки
3
 Функциональная активность нейтрофилов
в очагах воспаления
Патогены
Нейтрофил

я
ци ия
активац
ля
ану
гр
де
Лф
Ак ДФ

До 2,6 мкМ
НА
т Н-

Повреждение
ив ок
ац си

мишени
ия да

Миелопероксидаза
АФК H O
зы

2 2
C= 10-1000 мкМ
АФГ
В основном HOCl
C= 25-50 мМ

Нейтрофилы – иммунные клетки крови

АФК – активные формы кислорода
АФГ – активные формы галогенов 4
Белки – это высокомолекулярные природные полимеры, состоящие из
аминокислотных остатков, соединенных пептидной связью

Структурные уровни белков:

1-чная структура – последовательность аминокислот

2-чная структура – локально упорядоченная трехмерная структура, закрепленная

водородными связями

3-чная структура – пространственная укладка полипептидной цепи

4-чная структура – взаимное расположение элементов 3-чной структуры

5
5
 Цель работы:
Выявить структурные изменения
(аминокислотного состава,
конформации) Лф с помощью методов
флуоресцентного анализа после
модификации HOCl и H2O2.

OCl- H2O2

6
Материалы и методы

• Рекомбинантный лактоферрин человека

Флуоресцентные методы изучения модификации

Лф:

• Собственная триптофановая флуоресценция

λвозб. = 285 нм, λрегистр. = 340 нм

• Использование флуоресцентной метки

флуорескмина
λвозб. = 390 нм, λрегистр. = 490 нм

• Использование флуоресцентного зонда Флуорескамин

Флуорофор
1-анилино-8-нафталин сульфоната (АНС),
чувствительного к микроокружению
λвозб.= 350 нм, λрегистр= 475 нм

7
Изучение модификации аминокислотного
состава
Триптофановая флуоресценция
80

Интенсивность триптофановой
70

флуоресценции, отн. ед.

Лф HOCl 60
80 50
HOCl 40
70 30 1:125
1:10
20
Интенсиность триптофановой

60 10
HOCl
флуоресценции, отн. ед.

0
50 1:20 Нативный Лф Лф:H2O2

Рис. 2. Изменение интенсивности

40 триптофановой флуоресценции Лф под
действием H2O2
30
HOCl
1:50 • Добавление H2O2 к раствору Лф вызывает
уменьшение интенсивности собственной
20 флуоресценции Лф на 4,6±0,2 %

10 1:100 • При стократном избытке HOCl происходит

снижение интенсивности собственной
0 флуоресценции Лф на 91,4±2,5 %

0 2 4 6 8 10 12
Время, мин
Рис. 1. Типичная кинетика изменения интенсивности
триптофановой флуоресценции Лф под действием HOCl 8
Изучение модификации аминокислотного
состава
Использование метки флуорескамин
нативный Лф
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.

1,0 Лф:HOCl
Лф:H2O2
• Добавление Н2О2 в раствор Лф не
вызывает изменений в
0,8 интенсивности флуоресценции
флуорескамина

0,6

флуорескамин
0,4
• Обработка Лф 100-кратным избытком
HOCl приводит к достоверному
снижению интенсивности
0,2 флуоресценции флуорескамина на
50,6±5,4 %,
т.е. уменьшению числа первичных
0,0 аминов за счет образования
хлораминов
0 1 2 3 4 5
Время, мин
Рис. 3. Типичная кинетика изменения интенсивности
флуоресценции флуорескамина в присутствии нативного Лф и
модифицированного HOCl или H2O2 9
Изучение конформационных
изменений

флуоресценции АНС, отн.ед.

4,0
3,5
• При модификации Лф
3,0

Интенсивность
2,5 Н2О2 не происходит
2,0
1:125
достоверного изменения
1,5
1,0
флуоресценции АНС.
0,5
0,0
Интенсивность флуоресценции

нативный Лф Лф:H2O2
5
Рис. 4. Интенсивность флуоресценции АНС
при связывании с нативным и
4 модифицированным H2O2 Лф
АНС, отн. ед.

3
• При действии HOCl на Лф в
1:0 мольном соотношении
2 1:10 Лф:HOCl равном 1:100
1:20
1:25 происходит падение
интенсивности
1 1:50 флуоресценции АНС на
1:100
65,9±2,6 %, что
свидетельствует о
0 разворачивании белковой
Мольное соотношение Лф:HOCl глобулы.

Рис. 5. Интенсивность флуоресценции АНС при связывании с

нативным и модифицированным HOCl Лф в различном мольном
соотношении белок:HOCl 10
Дейсвие HOCl на альбумин и лизоцим

Человеческий 40

сывороточный 35

Инетнеисвность флуоресценции
альбумин
30

зонда АНС, отн. ед.

25

20

15

10

0 100 200 300 400

[HOCl], мкМ

Лизоцим 1,2 Лиз:HOCl 1:10

нативный Лиз

Интенсивность флуоресценции
1,0

зонда АНС, отн. ед.

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

0 2 4 6 8 10
Время, мин 11
11
Выводы
В условиях галогенирующего и окислительного стресса
молекула Лф претерпевает значительные
конформационные перестройки (разворачивание
глобулы) и модификацию аминокислотного состава
преимущественно при действии HOCl. Н2О2 не приводит
к изменению физико-химических свойств Лф.

12
Спасибо за внимание!

13