Результаты лабораторных исследований (информация) единственный продукт,

производимый лабораторией. Интерпретация (оценка) результатов исследований в

биохимии производится путем сравнения полученных данных с эталоном (референтной
или нормальной величиной). Важно правильно оценить характер и значимость
полученных отклонений.

Норма не всегда соответствует физиологическому состоянию. Референтные интервалы

периодически пересматриваются и принимаются в зависимости от региона страны, и даже
отдельной области, города или КДЛ и используемой аппаратуры и метода исследования.

Эталонную величину получают путем исследования большой популяции здоровых людей

определенного возраста и пола в равных условиях. Цифровой материал полученный при
этом, затем статистически обрабатывается и проверяется, определяются рефентные
интервалы значений показателей. Все полученные материалы собираются в справочники,
которые должны иметься в каждой лаборатории и указываться в бланках-результатах
исследования. При наличии каких-либо специфических условий эталонные величины
определяются самостоятельно для КДЛ.

Что касается единиц измерения в клинической биохимии, то здесь, как и во всех областях
производства, науки техники в нашей стране, используется система единиц СИ. Это
закреплено документально с 1985 года нормативными актами.

СИ состоит из единиц трех типов – основных, дополнительных и производных.

Универсальна она потому, что 7 основных и 3 дополнительных единицы имеют
постоянный природный эталон, который может быть достоверно измерен. Так, по
скорости движения света в вакууме можно определить длину. Производные единицы
получаются из сочетания двух или более основных единиц путем умножения или деления.
Для каждой отрасли, в том числе и для клинической биохимии, учитывая специфику
размерности величин, определен ряд допустимых правил.

1. В качестве единиц объема следует принять литр. Не рекомендуется в знаменателе

использовать дольные или кратные от литра (1мл, 100 мкл и т.п.)

2. Концентрация измеряемых веществ указывается как молярная (моль/л

) или как массовая концентрация (г/л)

3. Молярная концентрация используется для веществ, относительная молекулярная

масса которых известна. Ионная концентрация указывается в виде молярной.
4. Массовую концентрацию используют для веществ, молекулярная масса которых
неизвестна

5. Плотность указывается в г/л, клиренс в мл/с

6. Активность ферментов выражается количеством исходного вещества или продукта

катализиуемой реакции в единицу времени на объем биологического материала как
моль/с×л или катал в моль/мин×л; мкмоль/с×л; нмоль/с×л.

В ряде случаев, строго ограниченных и определенных используют традиционные

единицы, например, мм рт. ст., так как существующие приборы градуированы в
этих единицах, а переход в Па трудоемок (1 мм рт ст=133,5 Па). Используют и
специальные единицы в ряде методик, где количественный учет невозможен. Так, в
1
тимоловой пробе используют единицы помутнения по шкале S-H), а некоторых
методиках оценка идет по крестам от 1+ до 4+, при этом в методиках
оговаривается: что под этим понимается.

При переводе несистемных единиц в системные существует два подхода:

1. Для когерентных величин не требуется коэффициентов перевода, например, г%

переводятся в граммы умножением на 10.
2. Для некогерентных величин перевод осуществляется с помощью
коэффициентов пересчета. Например, г/л переводятся в моль/л с помощью
коэффициента пересчета, находимого по формуле 1/М вещества. Такие
коэффициенты указываются в инструкциях к набору реагентов.

Моль – единица количества вещества. Моль – это количество вещества,

содержащее столько структурных единиц (молекул, атомов, ионов, электронов
или других) сколько атомов содержится в 0,012 кг изотопа углерода 12С. Зная
массу атомов углерода (1,993 х 10-26 кг), можно вычислить число атомов NA в
0,012 кг углерода: NA=0,012кг/моль:1,993 х 10-26 кг =6,02 х1023 1/моль

Это число называется постоянной Авогадро, показывает число структурных

единиц в моль любого вещества.

Молярная масса – величина, равная отношению массы вещества к количеству

вещества. Обозначается буквой М, имеет размерность кг/ или г/моль.
Молярную массу легко вычислить, зная массу молекулы. Так, масса молекулы
воды равна 2,99 х 10-26 кг, то М(Н2О)=2,99 х 10-26 кг х 6,02 х х1023 1/моль =0,018
кг/моль или18 г/моль

В общем случае молярная масса вещества, выраженная в г/моль, численно

равна относительной атомной молекулярной массе этого вещества, например,
относительные атомные и молекулярные массы: С=12 и молярная 12г/моль;
Fe=56 и 56 г/моль соответственно.

Масса и количество вещества – понятия разные. Масса выражается в кг (г), а

количество вещества в моль. Между массой вещества m (г), количеством
вещества –n (моль) и молярной массой М(г/моль) существуют простые
соотношения:

m=n x M; n=m/М; М=m/n.

по этим формулам легко вычислить массу определенного количества вещества,

или определить число молей вещества в известной его массе или найти
молярную массу вещества. (см. материалы по практике, задачи 1-3)

Молярная концентрация – количество растворенного вещества к объему

раствора. Это способ выражения концентрации раствора (см. материалы по
практике, задачи 4-5).

Моляльность – молярная весовая концентрация – количество растворенного

вещества (число моль) в 1000 г растворителя. Измеряется в молях на кг. Так
раствор с концентрацией 0,5 моль называю 0,5 мольным

2
Массовая концентрация компонента – отношение массы компонента В к
объему смеси =кг/м3

Массовая доля элемента в данном веществе – (w) – отношение относительной

атомной массы данного элемента, умноженной на число его атомов в молекуле
к относительной молекулярной массе вещества:

W(элемента)=(n х Ar (элемента) х 100%):Mr (вещества),

где

W- массовая доля элемента в веществе

n- индекс в химической формуле

Ar – относительная атомная масса

Mr – относительная молекулярная масса вещества.

(см. пример 6 по практике)

Плотность раствора – это отношение массы вещества к объему раствора þ(ро).

Например, плотность раствора соли NaCl равна 1008,5/м3 при концентрации
соли в растворе 1146,2 кг/м3 при концентрации 14%. Т.е., плотность зависит от
концентрации и температуры раствора (смотрим по таблицам в справочниках).

Определение и виды растворов

Раствор – это однородная система в состав которой входят молекулы двух или
более типов, причем доля частиц каждого типа может непрерывно меняться в
определенных пределах. От механической смеси раствор отличается
однородностью, от химического соединения – непостоянством состава.
Растворитель преобладает в растворе растворенных веществ.

Виды растворов

Растворы по состоянию вещества могут быть газовыми, жидкими, твердыми

Концентрация раствора:

- массовая (доля)

-молярная (концентрация)

Концентрация частиц (%)

Объемная концентрация (долевая, например 1:4).

Правила приготовления растворов.

1. Соблюдать чистоту. Посуда должна быть хорошо промыта. Использовать

чистые активы и дистиллированную воду.

3
2. Подлежащие растворению вещества рекомендуется измельчать для
ускорения растворения

3. Некоторые вещества порошкообразной природы могут плохо растворяться и

плавать в виде пленки, не смачиваясь. Такие вещества до растворения
рекомендуется растереть в ступке с небольшим количеством растворителя
(воды) до однородной кашицы, затем растворить

4. Применение горячей воды не рекомендуется, так как это приводит к

испарению части раствора

5. Если растворение идет медленно, можно использовать механическую

мешалку или встряхиватель

6. Легко растворяющиеся твердые вещества и жидкости перемешивают

вручную палочкой, можно в закрытой посуде с помощью переворачивания

7. При растворении сильных кислот приливают кислоту в воду!

8. Растворение сухих щелочей в воде производить, добавляя щелочь в воду

небольшими порциями, осторожно перемешивая

9. Насыщенные растворы готовят добавлением вещества порционного до

полного растворения порции

10. Хранить растворы только в подписанных емкостях. На этикетке указать

название, формулу, концентрацию и дату приготовления

Закон Бугера-Ламберта-Бера – физический закон, определяющий

ослабление параллельного монохроматического пучка света при
распространении его в поглощаемой среде, закон выражается формулой:

L(l)=L0e-Rƛl

Где L- интенсивность света, прошедшего слой вещества

L0- интенсивность света на входе в вещество

Rƛ –
показатель поглощения, не путать с безразмерным показателем
поглощения k, который связан с Rƛ формулой: Rƛ=4πk/ƛ, где ƛ(лямбда)-
длина волны.

Показатель поглощения определяется свойствами вещества и в общем

случае зависит от длины волны. Эта зависимость называется спектром
поглощения вещества. Закон открыт французом Бугером П. в 1729 году,
подробно рассмотрен немецким ученым Ламбертом в1760 и в отношении
концентрации проверен на опыте немцем А. Бером в 1852.

Для растворов поглощающих веществ в не поглощающих свет

растворителях показатель поглощения может быть записан как Kƛ=ϗλ x С,

4
где ϗλ (кси –лямбда) – коэффициент, характеризующий взаимодействие молекулы
поглощающего растворенного вещества со светом с длиной волны λ.

С – концентрация растворенного вещества в моль/л

Утверждение, что ϗλ не зависит от С называется законом Бера (не путать с

Бэра). Этот закон предполагает, что на способность молекулы поглощать
свет не влияют другие окружающие ее молекулы этого же вещества в
растворе. Однако, наблюдаются многочисленные отклонения от этого
закона, особенно при больших концентрациях.

Калибровочная кривая

Качество выполнения лабораторного исследования во многом зависит от

правильно выбранной и осуществленной методики оценки полученных
данных при работе с фотометрической аппаратурой. Она базируется на
использовании градуировочного графика (кривой, факторов пересчета а
также формулы, учитывающей значения абсорбции (экстинции) и
концентрации стандартных проб, обрабатываемых параллельно с опытными
в одинаковых условиях.

Градуировочная (калибровочная) кривая отражает тесную зависимость

между абсорбцией (А), называемой также оптической плотностью (D) или
экстинцией (Е) и концентрацией (С) вещества в сериях стандартных
растворов.

К построению калибровочного графика можно приступать, когда метод

достаточно хорошо отработан на практике. Калибровочные растворы
обычно содержат основные стандартные вещества и добавочно компоненты
биологической жидкости в виде водных растворов сыворотки или плазмы.
Так, например, содержится альбумин, который предохраняет билирубин от
окисления и усиливает интенсивность окраски получаемых в процессе
реакции азопигментов. При определении концентрации ионов калия в
плазме его стандартного раствора присутствуют ионы натрия и кальция, так
как они влияют на интенсивность свечения ионов калия в пламени газовой
горелки пламенного фотометра

Стандартные растворы должны готовиться с особой тщательностью. В

каждом наборе реагентов по определению того или иного аналита или
добавочно к нему (универсальные) поставляются стандартные
(калибровочные) растворы. Готовить их для работы необходимо строго по
инструкции, соблюдая температурный и временной режимы. Для
приготовления растворов используется качественная дистиллированная
вода и желательно отдельные поверенные дозаторные пипетки, имеющие
сертификат проверки точности их дозирования.

Необходимо использовать СОПы по приготовлению стандартных

(калибровочных) растворов и их применению на каждый вид исследования
по определенной методике на определенном анализаторе или приборе. В
СОПе прописан каждый шаг последовательно от извлечения набора
реагентов до получения результата с его использованием на конкретном
анализаторе:

5
 -прогрев реагентов после хранения в холодильнике до комнатной
температуры

-разведение лиофилизированных образцов или точное приготовление

навесок

-выдержка до полного растворения с соблюдением температурных и

временных условий

-раскапывание в специальные пробирки или чистую посуду для постановки

на прибор в определенное место на штативе прибора

-разведения должны охватывать диапазон физиологических значений

(например общий белок в концентрациях от 40 до 120 г/л)

-заказ из меню прибора калибровки определенного теста

Получение результата и его интерпретация и т.д.

Правила работы с калибровочным графиком при выполнении «ручных»

методик. Принятие или отклонение калибровки

10 20 40 80 С

Желательно при ручной методиках для каждой точки сделать несколько

измерений и рассчитать среднюю величину. Измерение начинают с меньшей
концентрации раствора. Полученные средние наносят на график на
миллиметровой бумаге. На оси абсцисс (горизонталь) с соблюдением
интервалов в равномерно нарастающей концентрации откладывают показатели
содержания аналита в стандартных растворах. По оси ординат (вертикаль) -
соответствующие им величины абсорбции (оптической плотности, экстинции).
Зависимость между этими двумя сопоставимыми величинами отражается
линией, которую можно построить уже по трем точкам. Но калибровочный
график строят не менее, чем по пяти точкам. Калибровочная кривая
прокладывается тонко отточенным карандашом желательно с использованием
прозрачной линейки таким образом, чтобы, по-возможности, большее
количество точек (например, три из пяти) лежало на линии, а остальные
располагались близ нее, отклоняясь равномерно по обе стороны от нее.
Значительно отклонившиеся точки из расчетов исключаются.

Расположение кривой определяется так, чтоб она исходила из нулевой отметки

и шла примерно под углом 45 градусов (выбрать для этого крупный масштаб).

6
В правом верхнем углу дают наименование калибровочной кривой, ссылку на
метод (например, определение белка биуретовым методом), номер
светофильтра или его конкретную физическую характеристику: максимум
пропускания, длину оптического пути кюветы (5 или 10мм), дату построения
калибровочной кривой.

Для того, чтобы правильно построить линию, необходимо знать, что может
повлиять на ее расположение:

- если абсорбция опытной пробы оказывается не скорректированной на

экстинцию контрольной пробы, то вы не попадете в нулевую точку по обеим
осям. Причины:

1 присутствие в среде посторонних электролитов, вызывающих деформацию

молекул или комплексных ионов окрашенных веществ

2 гидратация (сольватация), сказывающаяся на поглощение раствором

светового потока – с изменением концентрации раствора этот процесс
протекает неравнозначно

3 неполное взаимодействие исследуемого вещества с реактивом при его

разбавлении

4 изменение взаимодействия частиц при разбавлении раствора

5 сдвиг рН раствора, влияющий на полноту образования и состав молекул

окрашенного соединения

6 изменение степени диссоциации вещества в растворе при разбавлении.

Основное в использовании методов с изменением окраски, то что реакция не

всегда бывает полной.

Другие причины: недостаточная монохроматизация светового потока,

нарушающая прямую пропорциональность между оптической плотностью и
концентрацией.

Что можно сделать?

Как можно больше замеров с введением коэффициента пересчета (f) для каждой
концентрации раствора: f=C/A и построение калибровочного графика, где по
оси абсцисс будет f, а по оси ординат - А. и нахождению искомой концентрации
путем умножения показателя экстинции на найденный по калибровочной
кривой фактор: С=f x A

Таким образом, можно построить простую и точную калибровочные кривые:

1 «простая» – шесть троекратных измерений с вычислением средних (1-

холостая нулевая и пять опытных стандартных растворов.) Если холостое
измерение ушло в сторону, его значение вычитают из средних значений
опытов. Для проверки «простой» калибровочной кривой измеряют 20 значений
для 3-й концентрации. Высчитывают Хср и S. Через «0» и Хср проводят

7
 прямую линию. Основные калибровочные точки не должны смещаться от
график более, чем ±1,2S Если это условие выполнено, то калибровочная кривая
может считаться достаточно точной.

2 «точная» калибровочная кривая. Сначала строят простую. Затем в дополнение

к ее пяти основным точкам находят:

1)точки, расположенные между нулем и первой точкой и разделяют этот

участок эквивалентно (на равные участки)

2)находят необходимое дополнительное количество точек выше верхней

основной точки.

Если «точная» калибровочная кривая удовлетворяет достаточно большим

пределом прямолинейности, то из показателей С и А вычисляют
калибровочный фактор (пример построения калибровочной кривой смотрите в
материалах для практики).

Кинетические и оптические методы.

Кинетические методы измерения – это методы, когда изменения оптической

плотности регистрируются во времени и измеряется скорость изменения, которая
пропорциональна либо концентрации исследуемого вещества, либо активности
этого вещества (например, ферментов). Расчет производится либо по фактору, либо по
стандарту. Активность ферментов обычно вычисляется по фактору:

 1.Измерение «по конечной точке» (одноточечная кинетика). Он заключается в

измерении оптической плотности на линейном участке кинетической кривой по
истечении определенного четко фиксированного отрезка времени от начала реакции
(внесения исследуемой пробы в реакционную смесь). Такой способ называют еще
одноточечной кинетикой. Как правило, по истечении указанного отрезка времени в
реакционную смесь добавляют реагент, останавливающий ферментативную реакцию,
8
 например щелочь или кислоту. Отсюда и название метода – «по конечной точке», т. е. с
остановкой реакции
2.Расчет с калибровкой по стандарту:
В случае калибровки по стандарту, расчет происходит по той же самой формуле, только
здесь фактор не является параметром, заданным в методике на реагенты, а вычисляется
по формуле:

3.Измерение многоточечное, или кинетическое. При этом способе оптическую

плотность на линейном участке кинетической кривой определяют 3–5 и более раз через
четко фиксированные равные интервалы времени. Многоточечная кинетика используется
только для биохимических анализаторов, так как в ручном варианте это достаточно
трудоемко. На этом способе основано, например, определение активности АЛТ и АСТ.
ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
опти́ческие ме́тоды иссле́дования, методы анализа веществ, основанные на изучении их
оптических свойств. К ним относятся: фотометрические методы, нефелометрия и
турбидиметрия, рефрактометрия, поляриметрия, спектральный и люминесцентный
анализы.
К фотометрическим методам относят спектрофотометрию и фотоколориметрию,
основанных на измерении поглощения света определяемым веществом в видимой,
ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра. Фотометрические (абсорбционные)
методы основаны на избирательном поглощении света исследуемым веществом и
подчиняются закону Бугера—Ламберта—Бера (поглощение света пропорционально
концентрации поглощающего вещества и толщине поглощающего слоя). При
фотометрических методах анализ проводят по поглощению моно-хроматического света.
Спектрофотометрия — один из наиболее точных фотометрических методов анализа,
применяемых в биохимии. Её используют для количеств, определения (с большой
точностью): белков, нуклеиновых кислот, витамина А, НАД, НАДФ, 17-
оксикортикостероидов в моче и плазме крови; при изучении многих ферментов.
В биохимических исследованиях применяются специальные приборы —
спектрофотометры типов СФ-4А, СФ-16 и др. Фотоколориметрию используют при
исследовании ферментов (кишечная щелочная фосфатаза, альдолаза и трансаминазы
сыворотки, (3-глюкуронидаза и др.), глюкозы, аминокислот, белков, фосфора, железа и др.
В биохимических лабораториях чаще пользуются фотоэлектроколориметрами типа ФЭК-
М и др., а также фотоэлектрическими фотометрами, снабжёнными светофильтрами.
В основе нефелометрии и турбидиметрии лежит явление рассеяния или поглощения
света твёрдыми или коллоидными частицами, находящимися в растворе. Нефелометрия

9
основана на измерении интенсивности светового потока, рассеянного твёрдыми
частицами, находящимися в растворе; турбидиметрия — на измерении ослабления
интенсивности светового потока, прошедшего через раствор, содержащий твёрдые
частицы (интенсивность уменьшается вследствие поглощения и рассеяния светового
потока). Нефелометранализ осуществляют с помощью фотоэлектрических колориметров-
нефелометров типов ФЭК-Н-57, ФЭК-56 и др. В качестве турбидиметров могут быть
использованы колориметры. Нефелометрические методы используют для определения
малых концентраций веществ в растворе: ртути, мышьяка, сурьмы, серы.
Спектральный анализ — качественный и количественный анализ состава вещества,
основан на исследовании его оптических спектров. Различают атомный, эмиссионный,
спектральный (по оптическим спектрам испускания атомов), атомно-абсорбционный (по
оптическим спектрам поглощения атомов) анализы. Качественный анализ производят по
положению спектральных линий, количественный — по их интенсивности.
В ветеринарных исследованиях для изучения содержания ионов металлов и солей в
организме широко применяют спектрографы (ИСП-28, ИСП-51 и др.), регистрирующие
спектры на фотоплёнке и различающиеся разрешающей способностью, а также атомные
абсорбционные спектрофотометры (модель 207, Япония) для определения концентрации
Ca, Cu, Fe, К, Mg, Na, Pb, Zn в жидкостях и тканях организма. В биохимических
исследованиях применяют и рентгеноспектральный анализ (по рентгеновским спектрам).
Люминесцентные методы анализа состава вещества основаны на люминесценции —
свечении под воздействием облучения светом, электронами, в результате химических
реакций и т. д. В зависимости от длительности свечения различают флюоресценцию и
фосфоресценцию. Количественный анализ осуществляют на основе зависимости
интенсивности флюоресцентного излучения от концентрации вещества. Флюоресцентное
излучение, измеряемое специальными приборами — флюорометрами ФМ-1 и
электронным флюорометром ЭФ-ЗМ, используют для количеств, определения
витаминов B1, B2, фолиевой кислоты, гетероауксина, адреналина, стероидных гормонов,
кодегидрогеназ, триптофана, антибиотиков (ауреомицинов), жёлчных кислот, жиров,
порфиринов и др., а также некоторых лекарственных веществ. Свежесть мяса и рыбы
можно определить специальным флюорометром. Флюоресцентные спектрофотометры
(модель МПФ-2А и модель 203, Хитачи, Япония) позволяют исследовать аминокислоты,
амины, витамины, стероиды, пуриновые и пиримидиновые основания и др. метаболиты.
Применяется также так называемый сортовой люминесцентный анализ, отделяющий
внешне похожие разные объекты (например, нормальные клетки от опухолевых).
Все эти методы мы рассмотрим далее более подробно.

10