Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Утверждены Директором
Гематологического
Научного Центра РАМН
Академиком А.И. Воробьевым
27.04.1999
Кровь каждого человека принадлежит к какой-либо из 4-х групп системы АВО в зависимости
от присутствия на эритроцитах антигенов А и В и соответствующих антител анти-А и анти-В в
плазме. В группе 0(1) отсутствуют оба антигена, в группе А(II) - на эритроцитах присутствует
только антиген А, в группе В(III) - на эритроцитах присутствует только антиген В и в группе
АВ(IV) - на эритроцитах одновременно присутствуют оба антигена - А и В. В норме у
неиммунизированных людей в плазме имеются естественные антитела к отсутствующему
антигену: у лиц группы 0(I) обнаруживаются антитела против обоих антигенов, А и В; у лиц
группы А(II) - анти-В антитела; при группе В(III) - антитела анти-А и, наконец, при группе
АВ(IV) антитела этой системы в плазме отсутствуют. В связи с тем, что совместимость по
системе АВО наиболее важна при осуществлении гемотрансфузий, определение группы крови
системы АВО необходимо определять перекрестным методом, т.е. по антигенам эритроцитов и
по антителам в плазме (сыворотке). Параллельное исследование антигенов эритроцитов и
агглютининов в сыворотке обязательно и у доноров, и у реципиентов. В случае переливания
крови по жизненным показаниям можно определять группу реципиента только по антигенам
эритроцитов, однако при этом обязательно проводится проба на индивидуальную
совместимость сыворотки реципиента с эритроцитами донора. Следует иметь в виду, что
существуют разновидности как антигена В, так и, в большей степени, антигена А. Наиболее
частыми разновидностями А антигена являются А1 и А2. Антиген А2 встечается примерно у
20% среди людей групп А(II) и АВ(IV). При рутинном типировании нет необходимости в
специальном выделении подгрупп А2(II) и А2В(IV), так как обычно у людей с антигеном А2
отсутствуют антитела против антигена А1 и им можно переливать кровь согласно общим
правилам. Наличие таких “избыточных” антител выявляется при перекрестном определении
группы крови и в пробе на индивидуальную совместимость. Частота встречаемости анти-А1
антител составляет у людей группы А2(II) 1-8% и у людей А2В(IV) - 22-35%. При обнаружении
анти-А1 антител у таких лиц полезно подтвердить наличие антигена А2 специальными
реагентами (моноклональный реагент против антигена А1 или лектин Dolichos biflorus),
агглютинирующими только А1 эритроциты. Лицам групп А2(II) и А2В(IV) с анти-А1
антителами можно переливать эритроциты только с антигенами А2 или А2В, соответственно.
Группа крови у доноров определяется врачом или лаборантом 2 раза: один раз при первичном
обращении донора и второй раз при зачислении в доноры. Результаты обоих определений
записываются на лицевой стороне донорского журнала с указанием даты и за подписью лиц,
определявших группу крови. В дальнейшем группа крови определяется перед каждой
кроводачей.
Типирование крови должно проводиться двумя сериями реагентов анти-А и анти-В, либо одной
серией каждого реагента, если используется и реагент анти-АВ, который является
дополнительным контролем правильности определения группы крови АВО реагентами анти-А
и анти-В.
Определение проводится в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25о. Для
исследования используют цельную кровь, отмытые эритроциты, эритроциты в плазме,
сыворотке или физиологическом растворе.
1. Отмаркируйте секции на пластинке или планшете, указав название реагента.
2. Нанесите по 1 большой капле (около 0,1 мл) каждого реагента: анти-А, анти-В и анти-АВ.
3. Нанесите по 1 маленькой капле (около 0,03 мл) исследуемой крови (эритроцитов) рядом с
каждым реагентом.
4. Смешайте отдельными чистыми стеклянными палочками каждую каплю крови (эритроциты)
с соответствующим реагентом.
5. Мягко покачивайте пластинку. Несмотря на то, что при использовании стандартных
реагентов четкая агглютинация наступает уже в первые секунды, результаты реакции
учитывайте через 3 минуты после окончания смешивания, чтобы не пропустить слабые формы
антигенов.
6. Запишите результаты реакции немедленно после определения.
*Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) - отсутствие
агглютинации.
Если результаты двух тестов не совпадают при исследованнии крови донора, то эта кровь не
может быть использована для трансфузии, пока не будут установлены причины расхождения.
Антиген D имеет слабые варианты, объединяемые в группу Du, которая составляет около 1%
популяции. Эритроциты Du слабо или вообще не агглютинируются полными анти-резус
антителами в реакции прямой агглютинации. Для их определения следует использовать
неполные анти-резус антитела в реакции агглютинации с антиглобулиновым реагентом
(непрямая проба Кумбса). Кровь доноров и реципиентов тестируются по-разному на
присутствие Du антигена.
Доноры, содержащие Du, должны быть отнесены к резус-положительным, так как переливание
их крови сенсибилизированным к D-антигену резус-отрицательным реципиентам может
вызывать тяжелые трансфузионные реакции. Кровь доноров должна обязательно тестироваться
на присутствие Du и, в случае его обнаружения, быть отнесенной к резус-положительной.
Большинство резус-отрицательных лиц имеет фенотип dce, однако 2-5% лиц, не несущих на
эритроцитах антигена D и резус-отрицательных по определению, имеют фенотип dCe илиdcE.
Такие эритроциты могут вызывать иммунный ответ при переливании их реципиентам с
группой dce, поэтому рекомендуется проводить тестирование крови резус-отрицательных
доноров с анти-С и анти-Е (или анти-СЕ) реагентами.
а) Нанесите большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет.
б) Нанесите рядом маленькую каплю (около 0,03 мл) исследуемой крови (эритроцитов).
в) Тщательно смешайте реагент с кровью чистой стеклянной палочкой.
г) Через 10-20 секунд мягко покачайте пластинку. Несмотря на то, что четкая агглютинация
наступает в первые 30 секунд, результаты реакции учитывайте через 3 минуты после
смешивания.
д) Запишите результаты реакции немедленно после определения.
а) Внесите 1 каплю (около 0,05 мл) исследуемой крови или взвеси эритроцитов (примерно 50%)
в сыворотке.
б) Добавьте 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого до
разжижения при 46-48о.
в) Добавьте 2 капли (0,1 мл) реагента анти-D и смешайте.
г) Поместите пробирку в водяную баню при температуре 46-48о на 5-10 минут или в
суховоздушный термостат при той же температуре на 30 минут.
д) Долейте в пробирку 5-8 мл физраствора и осторожно 1-2 раза переверните закрытую пробкой
пробирку для перемешивания.
е) Определите наличие агглютинатов, просматривая пробирку на свет невооруженым глазом
или через лупу.
ж) Немедленно запишите результаты определения.
III. Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса) с помощью неполных анти-D
антител.
Во всех случаях, кроме срочных трансфузий, проба проводится в два этапа: первый - без
использования антиглобулинового реагента, второй - с антиглобулиновым реагентом или с
использованием желатина. В случае использования желатина метод менее чувствителен. В
случаях срочных трансфузий двухэтапное определение рекомендуется проводить с раствором
низкой ионной силы (LISS).
Первый этап
1. Поместите 2 капли сыворотки реципиента в маркированную пробирку.
2. Добавьте 1 каплю 5% суспензии трижды отмытых эритроцитов донора в физиологическом
растворе или в растворе низкой ионной силы LISS (фиксация антител происходит лучше в
среде с низкой ионной силой, поэтому предпочтительнее взвесить эритроциты в растворе LISS,
обычно поставляемом изготовителем вместе с антиглобулиновым реагентом).
3. Немедленно центрифугируйте при 2000 об/мин в течение 15-20 секунд.
4. Просмотрите супернатант на наличие гемолиза. Мягко покачивая пробирку, отделите
клеточный осадок от дна пробирки и определите наличие агглютинатов. Наличие гемолиза
и/или агглютинатов на этой стадии могут означать: а) несовместимость по системе АВО; б)
присутствие в сыворотке реципиента полных антител не АВО специфичности, активных при
комнатной температуре (анти-S, анти-Р1 , анти-M и др).
Второй этап с антиглобулиновым реагентом
5. Если гемолиз отсутствовал, а после встряхивания пробирки эритроциты образовали
гомогенную суспензию, инкубируйте пробирку 30-45 минут (при использовании LISS время
инкубации составляет 10-15 минут) при 37оС.
6. Центрифугируйте пробирку, как в пункте 3, и просмотрите супернатант на наличие гемолиза
и агглютинатов. Наличие гемолиза и/или агглютинатов (после встряхивания пробирки) говорит
о присутствии у реципиента полных тепловых антител против эритроцитов донора.
7. Если гемолиз и агглютинация отсутствуют, отмойте эритроциты 3-4 раза большим объемом
(не менее 5 мл) физраствора (недостаточное отмывание может привести к инактивации
антиглобулинового реагента остатком сыворотки и ложноотрицательному результату); удалите
полностью физраствор после последнего отмывания.
8. Добавьте 1-2 капли антиглобулиновой сыворотки и тщательно смешайте.
9. Центрифугируйте пробирку, как в пункте 3, мягко разбейте осадок и просмотрите пробирку
на наличие агглютинатов.
Качество антиглобулинового реагента гарантируется изготовителем. Не используйте реагент с
истекшим сроком годности или после повторного замораживания-оттаивания. Полезно в
качестве контроля (если у вас возникли сомнения в качестве реагента) провести
антиглобулиновый тест со стандартными резус-положительными и резус-отрицательными
эритроцитами (см. Методические указания по определению резус-принадлежности крови).
При необходимости срочной трансфузии можно ограничиться только стадиями 1-4 пробы на
совместимость. В этом случае допускается также проведение теста на индивидуальную
совместимость на плоскости, путем смешивания 1 капли сыворотки реципиента с каплей
эритроцитов донора (соотношение сыворотки и крови должна быть около 5:1). В такой
постановке проба на индивидуальную совместимость сводится фактически к выявлению
совместимости только по системе АВО.